JP2005211079A - NEW METHOD FOR PRODUCING SUBSTANCE IN TRANSGENIC ANIMAL MAMMARY GLAND BY USING mC26 GENE MANIFESTATION CONTROL REGION - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生物体内において所望の異種遺伝子を発現させることを可能ならしめる染色体DNA由来の遺伝子の発現制御領域を導入するトランスジェニック生物の生産方法に関する。特定すれば、本発明はmC26蛋白質をコードする構造遺伝子の一部および該構造遺伝子の上流および下流に位置する該遺伝子の発現を制御する制御領域配列からなるDNA断片を用いて大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを用いてmC26遺伝子の遺伝子制御領域を生物体内に導入して遺伝子発現制御実験モデル動物を創造し、所望の物質を哺乳動物の乳腺その他の組織において生産させることを可能ならしめるトランスジェニック技術に関する。 The present invention relates to a method for producing a transgenic organism into which an expression control region of a chromosomal DNA-derived gene that enables expression of a desired heterologous gene in an organism is introduced. Specifically, the present invention uses Escherichia coli and other hosts using a DNA fragment comprising a part of a structural gene encoding mC26 protein and a control region sequence that controls the expression of the gene located upstream and downstream of the structural gene. A recombinant expression vector for amplifying the gene, and the gene control region of the mC26 gene is introduced into the organism using the vector to create a model animal for controlling gene expression, and a desired substance is introduced into the mammary gland of a mammal. The present invention relates to a transgenic technique that enables production in other tissues.
遺伝子工学により作製した組換え体遺伝子から物質を生産するための宿主系として、大腸菌、枯草菌、酵母をはじめとする微生物および各種の培養動植物細胞が利用されている。さらに、DNAを生物体内に導入し、トランスジェニック生物を作製し、組換え体遺伝子を発現させて組換え体蛋白質を生産させることが可能である（非特許文献１）。 As a host system for producing a substance from a recombinant gene produced by genetic engineering, microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast and various cultured animal and plant cells are used. Furthermore, it is possible to introduce a DNA into an organism, create a transgenic organism, and express a recombinant gene to produce a recombinant protein (Non-patent Document 1).
例えば、マイクロインジェクション法により、組換え体DNAを含む溶液を胚（受精卵）に注入し、創造したトランスジェニック動物体内において導入遺伝子を発現させて蛋白質を合成させることが一般的である（非特許文献２）。レトロウィルスを中間ベクターとして利用する方法も開発されている（非特許文献３）が、このようなウイルスの使用は、オンコジーンの活性化または不所望な転写等の危険性を少なからず有する。また、組換え体DNAを直接、動物体内に注射して遺伝子を発現させる方法も開発されているが、発現効率および導入遺伝子の安定性の点で工業的規模の使用における信頼性に欠ける。 For example, in general, a solution containing recombinant DNA is injected into an embryo (fertilized egg) by microinjection, and a transgene is expressed in the created transgenic animal to synthesize a protein (non-patented). Reference 2). A method of using a retrovirus as an intermediate vector has also been developed (Non-Patent Document 3). However, the use of such a virus has a considerable risk of oncogene activation or undesired transcription. A method for expressing a gene by directly injecting recombinant DNA into an animal body has also been developed, but lacks reliability in industrial scale use in terms of expression efficiency and transgene stability.
トランスジェニック動物の作製において導入する組換え遺伝子は、ゲノミックDNAでもmRNAに相補的なcDNAでもよい。さらに、該DNAの前後に任意のプロモーター、エンハンサーおよび転写終結シグナルなどの遺伝子の発現制御領域を付加した組換え体DNAも用いられる。 The recombinant gene introduced in the production of the transgenic animal may be genomic DNA or cDNA complementary to mRNA. Furthermore, a recombinant DNA in which an expression control region of a gene such as an arbitrary promoter, enhancer and transcription termination signal is added before and after the DNA is also used.
プロモーター、エンハンサーには、特定の臓器・組織でのみ発現する性質を備えたもの（組織特異的発現）、生物の成長過程の一定の時期にのみ発現する性質を備えたもの（時期特異的発現）、細胞内外の環境による刺激に反応する性質を備えたもの（刺激反応性）等があるので、所望の遺伝子本来のプロモーターおよびエンハンサーとは異なる性質をもつ、他の生物あるいは他の遺伝子由来の発現制御領域配列を用いて組換え体を作製し、そして生物体内に導入することにより、トランスジェニック生物体内で所望の時期および位置に所望の異種遺伝子を発現させることが可能である（特許文献１）。 Promoters and enhancers can only be expressed in specific organs / tissues (tissue-specific expression), and can only be expressed at certain times during the growth process of organisms (time-specific expression) Because it has a property that responds to stimulation by the environment inside and outside the cell (stimulation reactivity), etc., expression from other organisms or other genes having properties different from the promoter and enhancer of the desired gene By producing a recombinant using the control region sequence and introducing it into the organism, it is possible to express a desired heterologous gene at a desired time and position in the transgenic organism (Patent Document 1). .
天然のミルク蛋白質遺伝子、例えばアルファ・カゼイン遺伝子は、プロラクチン、インシュリン、グルココルチコイド、プロジェステロン、エストロジェンなどの各種ホルモンの刺激に反応する遺伝子領域すなわちホルモン反応性エレメントを持ち、泌乳期の乳腺において、時期特異的かつ組織特異的に発現するように調節される。ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加した組換え遺伝子は、これを導入したトランスジェニック動物の乳腺において、天然のミルク蛋白質遺伝子と同様に転写および翻訳され、そして組換え遺伝子がコードする蛋白質を分泌させることができる（特許文献２）。また、乳清蛋白質（WAP、βラクトグロブリン）遺伝子を含む発現ベクターを利用した、外来遺伝子産物のミルク中への分泌技術も開示されている（特許文献２、及び３）。 Natural milk protein genes, such as the alpha-casein gene, have gene regions that respond to stimulation of various hormones such as prolactin, insulin, glucocorticoid, progesterone, and estrogen, that is, hormone-responsive elements. It is regulated to express specifically and tissue-specifically. The recombinant gene to which the expression control region of the milk protein gene is added is transcribed and translated in the same manner as the natural milk protein gene in the mammary gland of the transgenic animal into which the milk protein gene is introduced, and the protein encoded by the recombinant gene is secreted. (Patent Document 2). In addition, a technique for secreting a foreign gene product into milk using an expression vector containing a whey protein (WAP, β-lactoglobulin) gene is also disclosed (Patent Documents 2 and 3).
mC26遺伝子産物は、乳腺で泌乳期特異的かつ組織特異的に多量に発現する遺伝子として同定され（非特許文献４）、また、その後、ドーベンコ（Dowbenko）らにより白血球接着分子として同定され（非特許文献５）、GLYCAM-1と呼ばれている分子である。該遺伝子座はマウスにおいてマップされており、該遺伝子の構造遺伝子部分および周辺の一部のヌクレオチド配列は既に決定されている（非特許文献５）。 The mC26 gene product has been identified as a gene that is expressed in lactation-specific and tissue-specifically in the mammary gland (Non-patent Document 4), and subsequently identified as a leukocyte adhesion molecule by Dowbenko et al. Reference 5), a molecule called GLYCAM-1. The gene locus has been mapped in the mouse, and the structural gene portion of the gene and a part of the nucleotide sequence in the vicinity have already been determined (Non-patent Document 5).
mC26遺伝子をクローン化してグルココルチコイドレセプターを持つマウス線維芽細胞由来のＬ細胞に導入し、遷移性発現および形質転換細胞中での発現が検討されたが、該遺伝子に対するホルモンの作用が従来の知見とは異なることが明らかとなり、さらに、該遺伝子の転写産物が従来公知のmRNAとは異なる異常なRNAであることが判明した。即ち、mC26遺伝子が従来公知の他のカゼイン遺伝子とは異なった発現制御機構を有することが明らかになった（非特許文献６）。 The mC26 gene was cloned and introduced into mouse fibroblast-derived L cells with a glucocorticoid receptor, and its transitional expression and expression in transformed cells were examined. Further, it was found that the transcript of the gene is an abnormal RNA different from the conventionally known mRNA. That is, it was revealed that the mC26 gene has a different expression control mechanism from other conventionally known casein genes (Non-patent Document 6).
この事実に基づき、mC26の発現系、特に転写エンハンサー／プロモーター領域の機能を解明し、異種遺伝子の効果的発現を達成してmC26遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝子発現制御実験モデル動物を創造し、さらに、所望の物質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とするトランスジェニック技術を確立すべく研究を行った。即ち、本発明の目的は、mC26の構造遺伝子およびその発現に関与する周辺の制御領域を含むゲノミックDNAを用いて、大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを利用してmC26遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝子発現制御実験モデル動物を創造し、そして所望の物質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とするトランスジェニック技術を提供することである。 Based on this fact, the expression system of mC26, in particular, the function of transcription enhancer / promoter region, was elucidated, and the model animal for controlling gene expression that introduced the expression control region of mC26 gene into the body by achieving the effective expression of heterologous gene Research has been conducted to establish a transgenic technique that allows creation and further production of the desired substance in the mammary gland of mammals. That is, an object of the present invention is to produce a recombinant expression vector for amplification in Escherichia coli and other hosts using genomic DNA containing the structural gene of mC26 and the surrounding regulatory region involved in its expression, and To provide a transgenic technique that creates a gene expression control experimental model animal in which an mC26 gene expression control region is introduced into the body using a vector, and allows a desired substance to be produced in a mammary gland of a mammal It is.
本発明者らは、上記課題を解決するために、mC26の構造遺伝子およびその周辺の発現制御領域、特に5'上流領域に位置するエンハンサー／プロモーター領域を含む、ゲノミックDNAの塩基配列を決定し、該DNAを含む組換え発現ベクターを作製した。そして該ベクターを利用してmC26遺伝子の発現制御領域が動物細胞中で発現制御されることを確認し、さらに、該ベクターを導入した動物の乳腺において所望の外来異種遺伝子が導入され、かつ、該遺伝子産物が発現されることを確認して本発明を完成するに至った。 In order to solve the above problems, the present inventors have determined the base sequence of genomic DNA including the structural gene of mC26 and its surrounding expression control region, particularly an enhancer / promoter region located in the 5 ′ upstream region, A recombinant expression vector containing the DNA was prepared. Then, confirming that the expression control region of the mC26 gene is controlled in animal cells using the vector, and further, a desired foreign heterologous gene is introduced into the mammary gland of the animal into which the vector has been introduced, and It was confirmed that the gene product was expressed, and the present invention was completed.
本発明によれば、以下に示すDNA：（ｉ）図４に示す2304bpのmC26遺伝子の5'上流発現制御領域；（ii）図５に示す2320bpのmC26構造遺伝子部分；および（iii）図６に示す770bpのmC26遺伝子の3'下流発現制御領域；を転写方向に順番に含む発現カセットとしてのDNAが提供される。 According to the present invention, the following DNA: (i) 5 ′ upstream expression control region of the 2304 bp mC26 gene shown in FIG. 4; (ii) the 2320 bp mC26 structural gene portion shown in FIG. 5; and (iii) FIG. A DNA as an expression cassette comprising the 770 bp mC26 gene 3 ′ downstream expression control region shown in FIG.
本発明の一つの態様として、上記（ii）の全部または一部を外来異種遺伝子に置換するか、または（ii）のいずれか１カ所に外来異種遺伝子を挿入した発現カセットが提供される。そのような異種遺伝子は、特に限定されない。 As one embodiment of the present invention, there is provided an expression cassette in which all or part of the above (ii) is replaced with a foreign heterologous gene, or a foreign heterologous gene is inserted into any one of (ii). Such a heterologous gene is not particularly limited.
上記発現カセットの作製においては、（１）図５中の第１エクソン（配列番号１中、第2305ヌクレオチド〜第2418ヌクレオチド）を含ませることにより、下流に連結された異種遺伝子蛋白質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列を付加すること、および（２）図５中の第２エクソン（配列番号１中、第3145ヌクレオチド〜第3188ヌクレオチド）、第３エクソン（配列番号１中、第3928ヌクレオチド〜第4143ヌクレオチド）、および第４エクソン（配列番号１中、第4372ヌクレオチド〜第4624ヌクレオチド）を分断または削除して、スプライシングに関与すると考えられる第１イントロン（配列番号１中、第2419ヌクレオチド〜第3144ヌクレオチド）、第２イントロン（配列番号１中、第3189ヌクレオチド〜第3927ヌクレオチド）、および第３イントロン（配列番号１中、第4144ヌクレオチド〜第4371ヌクレオチド）を全てまたは一部連結した形で含ませることにより、発現の効率をさらに増加させること；等が好ましいが、異種遺伝子産物の分泌効率、異種遺伝子の種類、および組換えDNAの連結の容易性等を考慮して、各々の場合において、これらのファクターを適宜選択することが好ましい。 In the production of the above expression cassette, (1) the first exon in FIG. 5 (SEQ ID NO: 1, 2305 to 2418 nucleotides) is included, so that the heterologous gene protein ligated downstream is extracellularly introduced. Adding a signal sequence for secretion, and (2) the second exon in FIG. 5 (SEQ ID NO: 1, 3145 to 3188 nucleotides), third exon (SEQ ID NO: 1, 3928 nucleotides to 4143 nucleotides), and the 4th exon (SEQ ID NO: 1, 4372 to 4624 nucleotides) are disrupted or deleted, and the first intron (SEQ ID NO: 1, 2419 to 2419) is considered to be involved in splicing. 3144 nucleotides), second intron (3189 to 3927 nucleotides in SEQ ID NO: 1), and third intron ( It is preferable to further increase the efficiency of expression by including all or part of the 4144 nucleotides to 4371 nucleotides in column number 1 in a linked form; In each case, it is preferable to appropriately select these factors in consideration of the type of the DNA and the ease of ligation of the recombinant DNA.
本発明は、さらに、上記発現カセットを含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを哺乳動物の胚細胞に導入することからなる、トランスジェニック動物の生産方法に関する。該生産方法において、上記（i）および（iii）の領域に代えて、（ｉ）のさらに5'上流領域、および（iii）のさらに3'下流領域を含むDNA断片も使用することができる。例えば、図１中の約12.7kbのEcoRI断片、または図２中の約6.7kbのEcoRI断片を用いることができる。 The present invention further relates to a method for producing a transgenic animal, comprising constructing an expression vector comprising the above expression cassette and introducing the expression vector into a mammalian embryo cell. In the production method, a DNA fragment containing a further 5 ′ upstream region of (i) and a further 3 ′ downstream region of (iii) can be used in place of the regions (i) and (iii). For example, an approximately 12.7 kb EcoRI fragment in FIG. 1 or an approximately 6.7 kb EcoRI fragment in FIG. 2 can be used.
本発明の別の側面においては、図４または図６に示す配列を有するDNA断片の全てまたは一部を、それぞれ、従来公知のあらゆる遺伝子を発現するための発現制御領域として用いうることは、当業者であれば認識されるであろう。 In another aspect of the present invention, it is possible to use all or part of the DNA fragment having the sequence shown in FIG. 4 or FIG. 6 as an expression control region for expressing any conventionally known gene. It will be recognized by a contractor.
本明細書において使用されるベクターなる用語は、プラスミド由来のもの、バクテリオファージ由来のものを含むように意図するものとして使用され、本発明においては大腸菌由来のものが好ましく、特にλファージが好ましいが、これらに限定されない。 The term vector used in the present specification is intended to include plasmid-derived and bacteriophage-derived ones, and in the present invention, those derived from E. coli are preferable, and λ phage is particularly preferable. However, it is not limited to these.
本明細書において、「EcoRI断片」なる記載は、両末端がEcoRI認識配列であるDNA断片を意味し、また、「EcoRI-HindIII断片」なる記載は、一方の末端がEcoRI認識配列であり他方の末端がHindIII認識配列であるDNA断片を意味する。他の制限酵素による同様の表記も、同等の意味をなすものとして用いられる。 In the present specification, the description “EcoRI fragment” means a DNA fragment whose both ends are EcoRI recognition sequences, and the description “EcoRI-HindIII fragment” means that one end is an EcoRI recognition sequence and the other end. It means a DNA fragment whose terminal is a HindIII recognition sequence. Similar notation by other restriction enzymes is also used as equivalent meaning.
本明細書において使用されるDNA断片の大きさの表示に関して、下一桁までを明記してある配列を除き、0.1kb単位にて表示されている配列は、電気泳動によるおおよそのサイズを示す。従って、実際のヌクレオチド数と表示塩基対（bp）数には多少の誤差があることは、当業者には認識されるであろう。 Regarding the display of the size of the DNA fragment used in the present specification, the sequence displayed in units of 0.1 kb indicates the approximate size by electrophoresis, except for the sequence specified up to the last digit. Accordingly, those skilled in the art will recognize that there is some error between the actual number of nucleotides and the number of displayed base pairs (bp).
mC26遺伝子の5'上流発現制御領域（図４）および3'下流発現制御領域（図６）のヌクレオチド配列は一部公表されているが［ドーベンコ（Dowbenko）ら、上記文献］、本発明において初めて明らかにされた配列を含む上記領域が異種遺伝子の大量発現に必須であることが明らかとなった。 Although the nucleotide sequences of the 5 ′ upstream expression control region (FIG. 4) and the 3 ′ downstream expression control region (FIG. 6) of the mC26 gene have been partially published [Dowbenko et al., the above-mentioned document], this is the first time in the present invention. It was revealed that the above-mentioned region containing the revealed sequence is essential for mass expression of heterologous genes.
以下の記載において、当業界において常法として用いられる組換えDNA技術は、特筆しない限り以下の文献：Molecular Cloning、サムブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fristch）、マニアティス（Maniatis）著、Cold Spring Harbour Press (1989); Basic Methods in Molecular Biology、デービス（Davis）、ディブナー（Dibner）、バッテイ（Battey）著、Elsevier New York (1986)；等に記載されている技術を使用して実施することが可能である。 In the following description, unless otherwise specified, recombinant DNA techniques commonly used in the art include the following documents: Molecular Cloning, Sambrook, Fristch, Maniatis, Cold Spring Harbor Can be performed using techniques described in Press (1989); Basic Methods in Molecular Biology, Davis, Divner, Battey, Elsevier New York (1986); It is.
（１）DNA断片の調製
本発明のmC26構造遺伝子（図５）、該構造遺伝子の5'上流発現制御領域（図４）、および該構造遺伝子の3'下流発現制御領域（図６）各々のDNA断片は一緒にあるいは別々に、公知の方法を利用してマウスゲノミックDNAライブラリーから取得することができる。
(1) Preparation of DNA fragment Each of the mC26 structural gene of the present invention (FIG. 5), the 5 ′ upstream expression control region of the structural gene (FIG. 4), and the 3 ′ downstream expression control region of the structural gene (FIG. 6). DNA fragments can be obtained together or separately from a mouse genomic DNA library using known methods.
本発明では、従来のオリゴマープローブを用いる方法、またはメッセンジャーRNAからcDNAプローブを作製して用いる２種類の方法［オリゴ（dT）プライマー法およびランダムプライマー法］に加えて、mRNAを直接プローブとする方法を好ましい方法として記載するが、これらの方法に限定されない。 In the present invention, in addition to the conventional method using an oligomer probe, or two types of methods used by preparing a cDNA probe from messenger RNA [oligo (dT) primer method and random primer method], a method using mRNA directly as a probe Are described as preferred methods, but are not limited to these methods.
（ｉ）オリゴマーDNAプローブによる方法
オリゴマーDNAプローブ法に用いるプローブは２０塩基前後またはそれ以上の長さであり、かつ、染色体DNA中に高頻度に反復する配列を含まないことが好ましい。
(I) Method using oligomer DNA probe It is preferable that the probe used in the oligomer DNA probe method has a length of about 20 bases or more and does not contain a frequently repeated sequence in the chromosomal DNA.
例えば、mC26遺伝子の第１エクソン中の配列、例えば、下記配列番号３、４、５及び６の配列の内の少なくとも一つを用いることが好ましいが、これらに限定されない。
5'GTGCCACCATGAAATTCTTC 3' （配列番号３）
5'TGGCTTGCTTCCTGGTCTAA 3' （配列番号４）
5'TTGCTTCCTGGTCTAATCTC 3' （配列番号５）
5'CTCTGCTTCCCAGGGAAAGC 3' （配列番号６）
For example, it is preferable to use at least one of the sequences in the first exon of the mC26 gene, for example, the following SEQ ID NOs: 3, 4, 5, and 6, but is not limited thereto.
5'GTGCCACCATGAAATTCTTC 3 '(SEQ ID NO: 3)
5'TGGCTTGCTTCCTGGTCTAA 3 '(SEQ ID NO: 4)
5'TTGCTTCCTGGTCTAATCTC 3 '(SEQ ID NO: 5)
5'CTCTGCTTCCCAGGGAAAGC 3 '(SEQ ID NO: 6)
合成DNAの標識法は特に限定されないが放射性標識による方法が一般的である。標識プローブを用いてマウスゲノミックDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによりmC26遺伝子DNAを取得する方法は、公知の方法を用いることができる［Molecular Cloning、サムブルックら、前記］。ヒトあるいはマウスなどのゲノミックDNAライブラリーは市販品を利用できる。 The method for labeling the synthetic DNA is not particularly limited, but a method using a radioactive label is common. A known method can be used for obtaining mC26 gene DNA from a mouse genomic DNA library by hybridization using a labeled probe [Molecular Cloning, Sambrook et al., Supra]. Commercially available genomic DNA libraries such as humans and mice can be used.
マウス以外の動物種のmC26に相当する遺伝子を得る場合は、種間の塩基配列の変異を考慮する必要がある。即ち、ハイブリダイゼーションにおける温度または反応溶液の組成を変更することにより選択度を下げることが望ましい。別法としては、コドンの縮重を考慮することが好ましい。上記は全て市販の試薬および機械・装置を利用して、常法に従って実施することができる。 When obtaining a gene corresponding to mC26 of an animal species other than mice, it is necessary to consider the variation in the nucleotide sequence between species. That is, it is desirable to lower the selectivity by changing the temperature in hybridization or the composition of the reaction solution. Alternatively, it is preferable to consider codon degeneracy. All of the above can be carried out according to a conventional method using commercially available reagents and machines / equipment.
（ii）メッセンジャーRNA法
メッセンジャーRNA法に用いるmRNAは常法に従って単離する。使用する動物は限定されないが、ヒト、ヤギおよびマウスが好ましく、そして組織は特に限定されないが泌乳最盛期の乳腺が好ましい。通常、mRNAからcDNAプローブを作製する際のプライマーは、オリゴdTプライマーおよびランダム（ヘキサマー）プライマーが用いられ、共に市販品を利用することができる。そして、これらプライマーを常法に従って標識する。これら２種類のプライマーを用いて調製されたcDNAプローブに加えて、さらにmRNAのキャップ構造部分を標識したプローブ、即ち、キャップラベル・プローブを作製してスクリーニングに使用することができる。該プローブの標識は市販の放射標識キャップ類縁体、およびグアニリル・トランスフェラーゼ（例えば、ベセスダリサーチ社）などを利用して使用説明書に従って実施することができる。
(Ii) Messenger RNA method mRNA used for the messenger RNA method is isolated according to a conventional method. The animals to be used are not limited, but humans, goats and mice are preferable, and tissues are not particularly limited, but mammary glands at the peak of lactation are preferable. Usually, oligo dT primer and random (hexamer) primer are used as primers for preparing a cDNA probe from mRNA, and commercially available products can be used for both. These primers are labeled according to a conventional method. In addition to cDNA probes prepared using these two kinds of primers, a probe in which the cap structure portion of mRNA is labeled, that is, a cap label probe can be prepared and used for screening. Labeling of the probe can be performed according to the instruction manual using a commercially available radiolabeled cap analog, guanylyltransferase (for example, Bethesda Research) and the like.
上記cDNAプローブによるスクリーニングは常法を用いることが可能であるが、エクソンが数十bp程度の長さしかない遺伝子が多数報告されていることを考慮して、プローブの全長は長い方が良いとは限らず、比較的長いプローブ（約500bp）と比較的短いプローブ（約30bp）に分けて結果を比較することが好ましい。 Although screening with the above cDNA probe can be performed using a conventional method, considering that many exons have been reported that have only a few tens of bp in length, the longer probe length is better. However, it is preferable to compare the results for a relatively long probe (about 500 bp) and a relatively short probe (about 30 bp).
ゲノミックDNAライブラリーの作製に用いる動物は哺乳類が好ましく、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラットおよびマウスが特に好ましい。ヒトおよびマウス等では市販品ゲノミックDNAライブラリーも利用することができる。使用する組織は特に限定されないが肝臓が好ましい。次に、このDNAを制限酵素で完全または部分消化することにより15〜20kbpのDNA断片を分画する。制限酵素は特に限定されないがEcoRIが好ましい。染色体DNAの抽出、制限酵素分解および超遠心分画は、常法により行うことができ、ライブラリー作製に用いるベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミッドの何れを用いてもよいが、λファージが特に好ましく、市販品を利用できる。 Mammals are preferably used for the preparation of the genomic DNA library, and humans, cows, goats, rabbits, rats and mice are particularly preferred. Commercially available genomic DNA libraries can also be used for humans and mice. The tissue to be used is not particularly limited, but the liver is preferable. Next, the DNA fragment of 15 to 20 kbp is fractionated by completely or partially digesting this DNA with a restriction enzyme. The restriction enzyme is not particularly limited, but EcoRI is preferable. Extraction of chromosomal DNA, restriction enzyme digestion and ultracentrifugation can be carried out by conventional methods, and any of plasmid, bacteriophage, and cosmid may be used as a vector for library preparation. Preferably, a commercially available product can be used.
比活性の低いプローブを用いる場合、および／またはシグナル／ノイズ比（S／N比）が低い場合は、コロニーの形成またはファージプラークの形成にあたり、高濃度にカザミノ酸を含有するスーパーブロス等、高栄養価の培地を用いる。宿主として大腸菌を用いる場合はLE392またはJM系の菌株が好ましい。ハイブリダイゼーションに用いるフィルターは特に限定されないが、ニトロセルロースフィルター（S&S社製BA85など）が好ましい。 When a probe with low specific activity is used and / or when the signal / noise ratio (S / N ratio) is low, a high concentration such as super broth containing casamino acid at a high concentration is required for colony formation or phage plaque formation. Use a nutrient medium. When E. coli is used as a host, LE392 or JM strains are preferred. The filter used for hybridization is not particularly limited, but a nitrocellulose filter (such as BA85 manufactured by S & S) is preferred.
挿入されるべきDNAのサイズによってはベクターが不安定になるために、期待される信号強度が得られない場合がある。このような場合は、１枚のプレートから３枚のフィルターにブロットし、プラークを選別する際、各スポットの信号強度を強度、中度、弱度の３段階にクラス分けすることが好ましい。 Depending on the size of the DNA to be inserted, the vector becomes unstable, and the expected signal strength may not be obtained. In such a case, it is preferable to classify the signal intensity of each spot into three levels of intensity, medium, and weakness when blotting from one plate to three filters and selecting plaques.
得られたクローン遺伝子が乳腺で組織特異的に発現することを確認するためには、乳腺以外の組織、例えば肝臓から上記操作により作製されたプローブを対照とする。 In order to confirm that the obtained clone gene is expressed in a tissue-specific manner in the mammary gland, a probe prepared by the above operation from a tissue other than the mammary gland, such as the liver, is used as a control.
また、得られたクローン遺伝子が、乳腺中で、しかも時期特異的に発現することを確認するためには、泌乳期以外の乳腺、例えば、未経産成熟動物の乳腺から上記操作により作製されたプローブを対照とする。 In addition, in order to confirm that the obtained clone gene is expressed in the mammary gland in a time-specific manner, it was prepared from the mammary gland other than the lactating period, for example, from the mammary gland of a heparous adult animal by the above operation The probe is the control.
以上の操作によって得られる乳腺特異的に発現する遺伝子クローン群中には、動物種により差異があるが、一般に、α、β、γ、δ、εなどのカゼイン蛋白質遺伝子群［特開昭63-309192］、WAP、αラクトアルブミン、βラクトグロブリン［特開平3-505674］などのホェー蛋白質遺伝子群［特開昭63-291］などの複数の既知のミルク蛋白遺伝子が存在する。これらは、ノーザン・ハイブリダイゼーションによるほか、それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を参考にして作製したオリゴマーDNAプローブを用い、常法を用いてハイブリダイゼーションを行うことにより判別することができる。あるいは、それぞれのクローンDNAの一部の塩基配列を決定することによっても判別できる。特に、βカゼインのmRNAの大きさはmC26蛋白質遺伝子のmRNAの大きさに近いので、塩基配列決定により確認することが好ましい。 The gene clone group specifically expressed in the mammary gland obtained by the above operation varies depending on the animal species. Generally, casein protein gene groups such as α, β, γ, δ, and ε [JP-A 63- 309192], WAP, α-lactalbumin, β-lactoglobulin [JP-A-3-505674] and other whey protein gene groups [JP-A-63-291]. These can be discriminated by performing hybridization using a conventional method using an oligomer DNA probe prepared by referring to the nucleotide sequence of each gene in addition to Northern hybridization. Alternatively, it can also be determined by determining a partial base sequence of each clone DNA. In particular, the size of β casein mRNA is close to the size of mRNA of the mC26 protein gene, so it is preferable to confirm by sequencing.
（２）構造遺伝子の決定
得られたmC26蛋白質遺伝子の発現制御領域と構造遺伝子部分を決定するためには、以下の方法により実施することができる。
(2) Determination of structural gene In order to determine the expression control region and the structural gene portion of the obtained mC26 protein gene, the following method can be used.
得られたクローンDNAを各種の制限酵素により、それぞれ完全消化あるいは部分消化することにより、制限酵素マップを作製する。このとき、それぞれの分解産物を各々３等分し、３枚のゲルに同時に電気泳動した後、それぞれのゲル中の断片を計３枚のフィルターにサザーン・トランスファーする。クローンのスクリーニングに用いた３種のプローブの各々を上記の３枚のフィルターのうちの一枚にそれぞれ反応させ、サザーン・ハイブリダイゼーションを行う。これにより、構造遺伝子部分のうち、5'末端、中間のエクソン、3'末端を含む断片がそれぞれ決定できる。以上は常法および本発明に記載された方法を用いて行うことができる。 A restriction enzyme map is prepared by completely or partially digesting the obtained clone DNA with various restriction enzymes. At this time, each degradation product is divided into three equal parts and electrophoresed simultaneously on three gels, and then the fragments in each gel are Southern transferred to a total of three filters. Each of the three types of probes used for screening the clones is reacted with one of the above three filters, and Southern hybridization is performed. Thereby, the fragment | piece containing 5 'terminal, an intermediate exon, and 3' terminal can be determined among structural gene parts, respectively. The above can be performed using conventional methods and the methods described in the present invention.
次に、それぞれの制限酵素による消化断片DNAと乳腺から抽出して精製したmRNAあるいは市販されている発現ベクター、例えばpBlueScriptII（プロメガ社）のプロモーターを利用して作製したリボプローブとを用いて、S1マッピング法により、5'末端、中間のエクソン、3'末端の正確な位置をそれぞれ決定することが可能である。正確を期するために、必要に応じてプライマーエクステンション法またはPCR法を併用する。 Next, S1 using digested fragment DNA by each restriction enzyme and mRNA extracted from the mammary gland or purified using a commercially available expression vector, for example, a pBlueScriptII (Promega) promoter. By mapping methods, it is possible to determine the exact positions of the 5 ′ end, the intermediate exon, and the 3 ′ end, respectively. For accuracy, use the primer extension method or PCR method as necessary.
以上により決定した構造遺伝子の位置に基づき、常法により染色体DNAの塩基配列を決定する。この結果得られた情報に基づき、該塩基配列の一部を含むオリゴマーDNAを合成し、これをプライマーとしてプライマーエクステンション法またはPCR法を行うことにより、遺伝子の構造を再度確認する。 Based on the position of the structural gene determined as described above, the base sequence of chromosomal DNA is determined by a conventional method. Based on the information obtained as a result, an oligomer DNA containing a part of the base sequence is synthesized, and the primer extension method or PCR method is used as a primer to confirm the gene structure again.
配列番号１は、マウスmC26蛋白質遺伝子の全構造遺伝子とその5'上流域および3'下流域に位置する制御領域DNAを含むEcoRI認識部位からHindIII認識部位までの5394bpの塩基配列を示す（図４、図５および図６をこの順序で連結したものが配列番号１に相当する）。 SEQ ID NO: 1 shows the 5394 bp nucleotide sequence from the EcoRI recognition site to the HindIII recognition site including the entire structural gene of the mouse mC26 protein gene and the control region DNA located in the 5 ′ upstream region and 3 ′ downstream region (FIG. 4). FIG. 5 and FIG. 6 connected in this order correspond to SEQ ID NO: 1).
（３）発現ベクターの構築
最初に、上記方法に従って調製されたmC26構造遺伝子を含むEcoRI断片を、適当なベクターのEcoRI切断部位に挿入し、該ベクターの宿主内でDNAを増幅した後回収する。用いるベクターは特に限定されない。
(3) Construction of expression vector First, an EcoRI fragment containing the mC26 structural gene prepared according to the above method is inserted into an EcoRI cleavage site of an appropriate vector, and DNA is amplified in the host of the vector and then recovered. The vector to be used is not particularly limited.
図５に示すとおり、mC26構造遺伝子は第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第３イントロンからなる。第１エクソンは蛋白質の分泌に関与し、各イントロンはスプライシングに関与することが予測されるので、異種遺伝子の種類あるいは組換えDNAの作製容易性等を考慮して、適宜、これらの領域を分断、除去あるいは残して異種遺伝子をmC26構造遺伝子部分のいずれかに挿入することが好ましい。 As shown in FIG. 5, the mC26 structural gene consists of first to fourth exons and first to third introns. The first exon is involved in protein secretion and each intron is predicted to be involved in splicing. Therefore, these regions are appropriately divided in consideration of the type of heterologous gene or the ease of production of recombinant DNA. Preferably, the heterologous gene is inserted into any of the mC26 structural gene parts, either removed or left.
以下において、mC26構造遺伝子部分を全てまたは一部除去するための方法：簡易な発現ベクター構築法（構築法Ａ）；およびmC26構造遺伝子の転写開始点または第１エクソンから転写終結点までを正確に除去するための方法（構築法Ｂ）；を例示するが、これらの方法に限定されない。 In the following, a method for removing all or part of the mC26 structural gene part: a simple expression vector construction method (construction method A); and exactly the transcription start point or first exon to the transcription termination point of the mC26 structural gene Although the method for removing (construction method B) is illustrated, it is not limited to these methods.
構築法Ａ
（ｉ）制限酵素断片の作製
mC26遺伝子の転写開始点あるいは第１エクソンの終端を切断する制限酵素（酵素Ａ１とする。以下同様）ならびに転写終結点の近傍を切断する制限酵素（酵素Ａ２）により、上記の増幅したDNAを切断する。一方、乳腺中で生産することを希望する遺伝子を含むインサートDNA断片を同様の方法で調製する（酵素Ａ３および酵素Ａ４）。
Construction method A
(I) Preparation of restriction enzyme fragments
The above amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme that cleaves the transcription start point of the mC26 gene or the end of the first exon (referred to as enzyme A1, hereinafter the same) and a restriction enzyme that cleaves near the transcription termination point (enzyme A2). To do. On the other hand, an insert DNA fragment containing a gene desired to be produced in the mammary gland is prepared by the same method (enzyme A3 and enzyme A4).
酵素Ａ１およびＡ３、および酵素Ａ２およびＡ４がそれぞれ同一で、かつ、生じた断片の末端が平滑末端でない場合は、常法によりベクターおよびインサートの２つのDNA断片をそのまま連結でき、DNAリガーゼにより１つの環状DNAとして回収できる。 When the enzymes A1 and A3 and the enzymes A2 and A4 are the same and the ends of the resulting fragments are not blunt ends, the two DNA fragments of the vector and the insert can be ligated as they are by a conventional method. It can be recovered as circular DNA.
酵素Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のそれぞれが相異なる場合および生じた断片の末端が平滑末端である場合は、ベクターおよびインサートの２つの断片を適切に結合するために、後述する合成リンカー法またはブラントエンド法の２つの方法のいずれかを利用する。 If each of the enzymes A1, A2, A3 and A4 is different and the ends of the resulting fragments are blunt ends, the synthetic linker method or blunt described below can be used to properly join the two fragments of the vector and insert. One of two methods of the end method is used.
（ii）使用に適する制限酵素
上記（ｉ）で使用するのに適する制限酵素の例を下記に示すが、これらに限定されない。
(Ii) Restriction enzymes suitable for use Examples of restriction enzymes suitable for use in the above (i) are shown below, but are not limited thereto.
酵素Ａ１（mC26遺伝子の転写開始点の5'末端あるいは第１エクソンの終端の近傍を切断する酵素）
第１群 GsuI、BsmI、ApyI、EcoRII、BstNI、MvaI、ScrFI、BsaJI；
第２群 AluI；
第３群 BsrI、XmnI、MboII；
第４群 ApyI、EcoRII、BstNI、MvaI、ScrFI；
第５群 Alw44I、ApaLI、Bsp1286I、SduI、HgiAI、DdeI、BsmAI；
Enzyme A1 (enzyme that cleaves at the 5 ′ end of the transcription start site of mC26 gene or near the end of the first exon)
Group 1 GsuI, BsmI, ApyI, EcoRII, BstNI, MvaI, ScrFI, BsaJI;
Group 2 AluI;
Group 3 BsrI, XmnI, MboII;
Group 4 ApyI, EcoRII, BstNI, MvaI, ScrFI;
Group 5 Alw44I, ApaLI, Bsp1286I, SduI, HgiAI, DdeI, BsmAI;
酵素Ａ２（mC26遺伝子の転写終結点の3'末端の近傍を切断する酵素）
第１群 DdeI、BslI；
第２群 BcnI、CauII、NciI、ScrFI；
第３群 BsaJI、BcnI、CauII、NciI、ScrFI；
第４群 XbaI；
Enzyme A2 (enzyme that cuts near the 3 'end of the transcription termination point of mC26 gene)
Group 1 DdeI, BslI;
Group 2 BcnI, CauII, NciI, ScrFI;
Group 3 BsaJI, BcnI, CauII, NciI, ScrFI;
Group 4 XbaI;
（iii）合成リンカー法
ベクターDNAおよびインサートDNAの両断片中に存在する制限酵素認識部位等を考慮の上、双方のDNAの末端が互いに粘着性末端となるべく設計した合成DNAすなわちリンカーDNAを両DNA断片にそれぞれ共有結合により連結する。
(Iii) Synthetic linker method Considering the restriction enzyme recognition sites present in both the vector DNA and insert DNA fragments, synthetic DNA, that is, the linker DNA designed so that the ends of both DNAs are mutually sticky ends, ie, both linker DNAs Each fragment is linked by a covalent bond.
実際に使用されるリンカーDNAの配列および共有結合反応の方法の詳細は、挿入しようとする遺伝子の塩基配列によりそれぞれ異なるが、多くの場合は市販品を利用でき、また、希望する配列のリンカーDNAを設計し、常法により合成することができる。 The actual sequence of the linker DNA and the details of the covalent bond reaction method vary depending on the base sequence of the gene to be inserted. In many cases, commercially available products can be used, and the linker DNA of the desired sequence can be used. Can be designed and synthesized by conventional methods.
この結果得られたDNA断片をDNAリガーゼにより連結する。この粘着性末端の結合によって生じる二本鎖DNA部分が、制限酵素の認識部位となるように塩基配列を選ぶことにより、同部位をふたたび制限酵素で正確に切断されるように設計することも可能である。以上は全て常法により行うことができる。 The resulting DNA fragments are ligated by DNA ligase. By selecting the base sequence so that the double-stranded DNA part generated by this sticky end bond becomes a restriction enzyme recognition site, it can also be designed so that the same site can be cleaved again with the restriction enzyme. It is. All of the above can be performed by conventional methods.
（iv）ブラントエンド法
インサートDNAの制限酵素切断部位が平滑末端であるか、または5'末端あるいは3'末端突出型の切断端でありかつその形状がそのままベクターDNA側の切断端に直接結合できない場合は、突出した一本鎖部分を酵素処理により除去する。用いる酵素は一本鎖DNAを特異的に切断する酵素、例えばS1ヌクレアーゼよびP1ヌクレアーゼなどを利用することができ、別法としては、大腸菌DNAポリメラーゼＩを用いて突出一本鎖部分の相補鎖を合成することも可能である。この後、DNAリガーゼを用いて平滑端同士を結合することができる。DNAリガーゼはT4バクテリオファージ由来のリガーゼが広く用いられている。以上は常法により行うことができ、上記酵素等は市販されているものを使用することができる。
(Iv) Blunt end method The restriction enzyme cleavage site of the insert DNA is a blunt end, or is a 5 ′ end or 3 ′ end protruding type cut end, and its shape cannot be directly bonded to the cut end on the vector DNA side. In some cases, the protruding single-stranded portion is removed by enzymatic treatment. As the enzyme used, an enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA, such as S1 nuclease and P1 nuclease, can be used. Alternatively, the complementary strand of the protruding single-stranded portion can be obtained using E. coli DNA polymerase I. It is also possible to synthesize. After this, the blunt ends can be joined using DNA ligase. As a DNA ligase, a ligase derived from T4 bacteriophage is widely used. The above can be performed by conventional methods, and commercially available enzymes can be used.
構築法Ｂ
mC26遺伝子の構造遺伝子部分を転写開始点から転写終結点まで、あるいは、第１エクソンの終端から転写終結点までを正確に切断、除去し、所望の遺伝子のDNAをインサート断片として挿入する方法を記載する。
Construction method B
Describes the method of accurately cutting and removing the structural gene part of the mC26 gene from the transcription start point to the transcription termination point, or from the end of the first exon to the transcription termination point, and inserting the DNA of the desired gene as an insert fragment. To do.
上記Ａ法で記載した方法により調製したmC26遺伝子ベクターDNAに対し、緩徐な条件下でエキソヌクレアーゼを作用させて一定時間ごとに反応を停止して一連のDNA調製物を得る。これら各々の調製物に対して、図３に記載された各制限酵素の消化の有無を観察することにより、求める長さのDNAが得られたことを確認する。 An exonuclease is allowed to act on the mC26 gene vector DNA prepared by the method described in the above Method A under slow conditions to stop the reaction at regular intervals to obtain a series of DNA preparations. By observing the presence or absence of digestion of each restriction enzyme described in FIG. 3 for each of these preparations, it is confirmed that the DNA having the desired length was obtained.
一度このように工作してベクターDNAを得た後は、前出の合成リンカー法の項で述べたように、制限酵素の認識部位となるべく計画した小DNA断片を上記DNA断片に付加する。以後利用する際には、希望する制限酵素で切断され、さらに付加した小DNA断片をも同時に取り除かれるよう設計することも可能である。このような目的には、平滑末端を生じる制限酵素が望ましく、具体的にはEcoRV、PvuIIなどを挙げることができる。 Once the vector DNA is obtained by working in this way, a small DNA fragment designed as a restriction enzyme recognition site is added to the DNA fragment as described in the section of the synthetic linker method described above. In subsequent use, it is possible to design such that a small DNA fragment that has been cleaved with a desired restriction enzyme and further added is simultaneously removed. For such purposes, restriction enzymes that generate blunt ends are desirable, and specific examples include EcoRV and PvuII.
上記の方法で作製したmC26遺伝子ベクターに、希望する遺伝子のDNA断片をインサートとして結合する。この目的には、上記構築法Ａに記載した、合成リンカー法またはブラントエンド法のいずれかを用いることができる。発現すべき蛋白質をより正確に設計するためにはブラントエンド法が好ましい。 The DNA fragment of the desired gene is linked as an insert to the mC26 gene vector prepared by the above method. For this purpose, either the synthetic linker method or the blunt end method described in the above construction method A can be used. The blunt end method is preferred in order to design the protein to be expressed more accurately.
（４）骨形成誘導蛋白質をコードするDNA断片の単離
骨形成誘導蛋白質のcDNAクローンは、その両端が制限酵素EcoRVの切断点となるように設計し、同酵素により一段階操作で切り出せることが好ましい。該クローンを前記したブラントエンド法により、上記mC26遺伝子DNAベクターに挿入する。この際、挿入位置の両端となる部分の塩基配列は、構築法Ａの内、酵素Ａ１ならびに酵素Ａ２として記載した制限酵素の認識部位となるべく設計することにより、ベクター作製の工程を簡略化することができる。
(4) Isolation of a DNA fragment encoding an osteogenesis-inducing protein A cDNA clone of an osteogenesis-inducing protein should be designed so that both ends are cleavage points for the restriction enzyme EcoRV, and can be excised in one step with the enzyme. Is preferred. The clone is inserted into the mC26 gene DNA vector by the blunt end method described above. At this time, the base sequence at the both ends of the insertion position should be designed to be a recognition site for the restriction enzymes described as enzyme A1 and enzyme A2 in construction method A, thereby simplifying the vector production process. Can do.
上記工程により作製したDNAをそのまま遺伝子導入生物の作製に用いることができる。また、上記ベクター中に、微生物、例えば、大腸菌内でプラスミドあるいは溶原性ファージとして増殖することができる塩基配列を含むことにより、必要に応じて、常法を用いて大腸菌等により容易にベクターを増幅および回収することができる。 The DNA produced by the above steps can be used as it is for producing a transgenic organism. In addition, if the vector contains a base sequence that can be propagated as a plasmid or lysogenic phage in a microorganism, for example, E. coli, the vector can be easily introduced into E. coli or the like using a conventional method, if necessary. Can be amplified and recovered.
（５）遺伝子導入生物の生産法
上記発現ベクターに挿入した組換え体DNAを制限酵素により切断し、原核細胞内で増殖させるのに用いた大腸菌等の発現ベクター由来のDNAと、mC26遺伝子のDNAおよび発現を希望する遺伝子のDNAとからなる真核生物由来DNAとを分離する。用いる制限酵素は特に限定されないが、プラスミド部分とmC26遺伝子の構造遺伝子部分の5'上流末端および3'下流末端とが接続する部分は何れも制限酵素EcoRIの認識・切断部位になるよう設計して、本酵素を用いることにより上記の工程を簡略化することができる。
(5) Production method of transgenic organism DNA derived from an expression vector such as Escherichia coli used to cleave the recombinant DNA inserted into the above expression vector with a restriction enzyme and propagate in prokaryotic cells, and DNA of mC26 gene And eukaryotic DNA comprising the DNA of the gene desired to be expressed. The restriction enzyme to be used is not particularly limited, but the part where the plasmid part and the 5 'upstream end and 3' downstream end of the structural gene part of the mC26 gene are connected is designed to be a recognition / cleavage site for the restriction enzyme EcoRI. By using this enzyme, the above steps can be simplified.
制限酵素により切断したDNA断片をアガロースゲル電気泳動法によりそれぞれ単一のバンドとして分離した後、発現を希望する遺伝子DNAのバンドを含む部分のアガロースゲルを切り出してDNAを抽出回収する。 The DNA fragments cleaved by the restriction enzymes are separated into single bands by agarose gel electrophoresis, respectively, and then a portion of the agarose gel containing the gene DNA band desired to be expressed is cut out and the DNA is extracted and recovered.
上記の方法により単離精製した真核生物由来DNAをマイクロインジェクション法により、ガラスピペットを用いて受精卵の雄性前核に注入する。この受精卵を、一定時間培養後、あるいは直ちに、予め用意した偽妊娠動物すなわち代理母の子宮に移植する。これらは常法により行うことができる［新生化学実験講座１９、動物実験法（東京化学同人社刊、1991）；ゴードン（Gordon）とラドル（Ruddle）、Methods in Enzymology, 101, 411-442 (1983)；ジオメック（Ziomek）とジョンソン（Johnson）、Cell 21, 935-942 (1980)；ゴードン（Gordon）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77: 7380-7384 (1980)；ゴードン（Gordon）とラドル（Ruddle）、Science 214, 1244-1246 (1981)；ホーガン（Hogan）ら（翻訳：山内ら）、マウス胚の操作マニュアル、近代出版］。用いる生物種は、特に限定されないが、例としてマウスを挙げることができ、特にCD-1マウスが好ましい。 Eukaryotic DNA isolated and purified by the above method is injected into the male pronucleus of a fertilized egg using a glass pipette by the microinjection method. This fertilized egg is transplanted to a pre-prepared pseudopregnant animal, that is, a surrogate mother's uterus after culturing for a certain time or immediately. These can be performed by conventional methods [Seminar in Experimental Chemistry 19, Animal Experiments (Tokyo Chemical Dojinsha, 1991); Gordon and Ruddle, Methods in Enzymology, 101, 411-442 (1983) Ziomek and Johnson, Cell 21, 935-942 (1980); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon ) And Ruddle, Science 214, 1244-1246 (1981); Hogan et al. (Translation: Yamauchi et al.), Mouse embryo operation manual, modern publication]. The species to be used is not particularly limited, and examples include mice, and CD-1 mice are particularly preferable.
偽妊娠動物の作製方法は動物種により異なるが、各々既に獣医畜産技術として確立している。マウス、ラット、ウサギをはじめとする囓歯類動物は、膣刺激により容易に偽妊娠状態を誘起できる。また、ウシ、ヤギ、ヒツジなど反芻類家畜およびウマ、イヌ、ネコについては、ホルモン剤の投与により、偽妊娠を誘起する。また常法により、必要に応じて、動物にホルモン剤を投与し過排卵を誘起して、採卵数を増加させることができる［実験生物学講座１、生物材料調製法（1982）、江上信雄ら編、哺乳動物の初期発生、丸善出版株式会社］。 The method for producing pseudopregnant animals differs depending on the animal species, but each has already been established as a veterinary animal husbandry technique. Rodents such as mice, rats and rabbits can easily induce pseudopregnancy by vaginal stimulation. In addition, for ruminant livestock such as cattle, goats and sheep, and horses, dogs and cats, pseudopregnancy is induced by administration of hormonal agents. Moreover, it is possible to increase the number of eggs collected by administering a hormonal agent to animals and inducing superovulation, if necessary, by an ordinary method [Experimental Biology Course 1, Biomaterial Preparation Method (1982), Nobuo Egami et al. Hen, early development of mammals, Maruzen Publishing Co., Ltd.].
代理母により出産された産仔のうち、組換え遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を判別するため、産仔の体組織の一部から抽出したゲノムDNAを分析する。 Genomic DNA extracted from a part of the body tissue of the offspring is analyzed in order to discriminate the transgenic animals introduced with the recombinant gene among the offspring born by the surrogate mother.
一般には、導入した組換えDNAをプローブとしてゲノムDNAのサザン・ハイブリダイゼーションにより証明する。また、組換えDNAの塩基配列から設計した合成DNAをプライマーとしてPCR法により微量のDNAからも証明することができる。以上は全て常法に従って行うことができる［ディチュリオら、前記文献］。産仔の体組織としては、マウス、ラットでは尾の先端が、また、ウシ、ヤギなどの中・大動物では耳朶などが、広く用いられるが、口内の粘膜も試料として利用できる。 In general, genomic DNA is proved by Southern hybridization using the introduced recombinant DNA as a probe. It can also be proved from a small amount of DNA by PCR using synthetic DNA designed from the base sequence of recombinant DNA as a primer. All of the above can be carried out according to conventional methods [Ditulio et al., The above-mentioned document]. As the body tissue of the litter, the tip of the tail is widely used for mice and rats, and the earlobe is used for medium and large animals such as cattle and goats. The mucous membrane in the mouth can also be used as a sample.
また、所望の異種遺伝子産物の生産を確認するためには、ウエスタンブロット等により実施することが可能であるが、これに限定されない。 Moreover, in order to confirm production of a desired heterologous gene product, it can be carried out by Western blotting or the like, but is not limited thereto.
トランスジェニック動物もまた、通常の生物同様に自己増殖能力をもつことが期待できる。このことにより、一度希望するトランスジェニック動物が得られた後は、もはや、以上に述べた操作によらず、トランスジェニックである動物を育成し、他のトランスジェニック動物または非トランスジェニック動物と交配し、新たな子孫を出生せしむることにより、親となるトランスジェニック動物と同等の、あるいは雑種のトランスジェニック動物を得ることができる。 Transgenic animals can also be expected to have the ability to self-grow as normal organisms. As a result, once the desired transgenic animal is obtained, the transgenic animal can be bred and crossed with other transgenic or non-transgenic animals, regardless of the operations described above. By giving birth to new offspring, it is possible to obtain a transgenic animal equivalent to or hybrid to the parent transgenic animal.
本発明の上記技術は、以下に述べる利点を有する。 The above technique of the present invention has the following advantages.
（１）乳腺は、組換え遺伝子に由来する物質を大量に生産させる組織として優れている。
乳腺は、本来の性質上、蛋白質等の各種物質を大量生産することのできる器官であり、さらにミルク成分物質の大量生産を指標として育種改良されてきたウシ、ヤギなどの家畜を利用することができる点で有利である。
(1) The mammary gland is excellent as a tissue that produces a large amount of a substance derived from a recombinant gene.
The mammary gland is an organ capable of mass-producing various substances such as proteins due to its inherent properties, and it is also possible to use livestock such as cattle and goats that have been bred and improved using mass production of milk component substances as an indicator. This is advantageous.
また、乳腺は外分泌腺であるため、搾乳により極めて短時間のうちに体外に取り出すことができる。したがって、生産物質の細胞内での過剰蓄積による凝集塊の形成およびそれに伴う炎症反応等の悪影響を最小限に抑えることができる。 Moreover, since the mammary gland is an exocrine gland, it can be taken out of the body in a very short time by milking. Therefore, adverse effects such as formation of aggregates due to excessive accumulation of the product substance in cells and the accompanying inflammatory reaction can be minimized.
さらに、ミルクは乳腺においてのみ大量生産されるため組織特異性を考慮する必要がない。動物体内で天然に生産される物質であっても、生産量が過大であったり、生産組織が本来と異なる場合には、動物に疾病を引き起こすことは頻繁に観察されている。よって、生体に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。なお、組織特異性から、ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加した組換え遺伝子を単に受精卵に注入するだけで、所望の生成物が乳腺からミルク中にのみ分泌される点も有利である。 Furthermore, milk is produced only in the mammary gland, so there is no need to consider tissue specificity. Even substances that are naturally produced in the animal body are frequently observed to cause disease in animals if the production amount is excessive or the production tissue is different from the original one. Therefore, the influence on the living body can be minimized. From the viewpoint of tissue specificity, it is also advantageous that a desired product is secreted only into milk from the mammary gland simply by injecting a recombinant gene added with a milk protein gene expression control region into a fertilized egg.
そして、乳腺におけるミルクの大量生産は時期特異的、即ち、動物が妊娠して分娩した時にのみおこり、成長期にはおこらないため、トランスジェニック動物の正常な成長に害をもたらさない。一方、幼若または成体トランスジェニック動物のミルクの合成は、ホルモンを外部から投与して人為的にミルク蛋白質の合成を開始させて維持させる誘起泌乳も可能なため、人為的に制御することもできる。このことを利用して、メタロチオネイン遺伝子のように、所望の時期に組換え遺伝子のスイッチ・オン／オフを行えるトランスジェニック生物を創製し、生物学研究の実験モデル生物として利用することが可能である。 And mass production of milk in the mammary gland is time-specific, that is, it occurs only when the animal is pregnant and delivered, and does not occur during the growth period, so it does not harm the normal growth of the transgenic animal. On the other hand, the synthesis of milk in young or adult transgenic animals can be controlled artificially because induced lactation is also possible, in which hormones are externally administered to artificially initiate and maintain milk protein synthesis. . Using this, it is possible to create a transgenic organism that can switch on / off a recombinant gene at a desired time, such as a metallothionein gene, and use it as an experimental model organism for biological research. .
（２）哺乳動物細胞の蛋白質生産機構を利用するため、哺乳動物由来の外来遺伝子の発現において利点を有する。
蛋白質への糖鎖の付加、リン酸基あるいはイオウ等が結合する複雑な修飾、およびジスルフィド結合の形成の仕方等は哺乳動物に特有な様式による場合が多く、例えば大腸菌等の細菌を用いた場合に本来の生理活性が認められる蛋白質が生産されることは稀である。このような欠点の解決策として培養動物細胞の利用が挙げられるが、費用および労力がかかるにもかかわらず成功例は少なく、信頼性に欠ける。
(2) Since it utilizes the protein production mechanism of mammalian cells, it has an advantage in the expression of foreign genes derived from mammals.
Addition of sugar chains to proteins, complex modifications involving binding of phosphate groups or sulfur, and the formation of disulfide bonds are often in a manner specific to mammals. For example, when using bacteria such as Escherichia coli It is rare to produce a protein with the original physiological activity. The solution to such drawbacks includes the use of cultured animal cells, but despite the high cost and labor, there have been few successful cases and lack of reliability.
（３）トランスジェニック動物は自己複製能力をもち、生産システムの更新、規模拡大が極めて容易かつ安価である。
交配により新たな子孫を出生せしめ、親となるトランスジェニック動物と同等あるいは雑種のトランスジェニック動物を得ることができる。この際、当初のトランスジェニック動物を創製するにあたって行った遺伝子工学を初めとする人為的操作は何ら必要ない。生産設備の拡大をきわめて安価かつ容易に行うことが可能である。このことは、培養細胞プラントまたは化学工場には望み得ない点である。
(3) Transgenic animals have a self-replicating ability and are extremely easy and inexpensive to update and scale up the production system.
A new offspring can be born by crossing, and a transgenic animal that is equivalent to or hybrid to the parent transgenic animal can be obtained. At this time, no artificial manipulation such as genetic engineering performed in creating the original transgenic animal is required. It is possible to expand the production facility very cheaply and easily. This is a point that cannot be expected from a cultured cell plant or chemical plant.
また、トランスジェニック動物は、安全かつ低廉に維持できる。大腸菌をはじめとする微生物のDNA複製機構は高等動物に比して原始的で精度が低いため、菌株を一定の性状に維持することが困難であり、醸造業などで製品の品質を維持するために高度の技術を必要とする。培養細胞についても、組換えDNAを導入した場合、長期間その遺伝子発現の性状を維持することが困難である。これに対し、高等動物個体は、きわめて安定といえる。物質生産能力についても、ウシでは１０年程度まで経済性良く一定の品質のミルク生産を維持、あるいは産次に従ってむしろ増大することは公知である。トランスジェニック動物についても、同様の結果が期待できる。 Moreover, the transgenic animals can be maintained safely and inexpensively. Since the DNA replication mechanism of microorganisms such as E. coli is primitive and less accurate than higher animals, it is difficult to maintain the strain to a certain property, and to maintain the quality of the product in the brewing industry, etc. It requires advanced technology. Also for cultured cells, when recombinant DNA is introduced, it is difficult to maintain the gene expression properties for a long time. In contrast, higher animal individuals are extremely stable. It is well known that the production capacity of bovine can maintain milk production of a certain quality with good economic efficiency for about 10 years, or rather increase according to the production order. Similar results can be expected for transgenic animals.
さらに、動物個体は、免疫系をはじめとする生体防御機構を備えており、微生物や動物細胞の培養に必須である無菌的環境設備は必要としない。反対に、感染、すなわち人体内部への侵襲による危害は発生し得ず、バイオハザードの点で極めて有利である。 Furthermore, the animal individual is provided with a biological defense mechanism including the immune system, and does not require aseptic environmental facilities essential for culturing microorganisms and animal cells. On the other hand, no harm can be caused by infection, that is, invasion into the human body, which is extremely advantageous in terms of biohazard.
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するように意図するものではない。 The following examples are intended to illustrate the present invention and are not intended to limit the present invention.
以下において、異種遺伝子として骨形成誘導蛋白質遺伝子（ハムスター−ヒトの融合遺伝子：haBIP）を用いて本発明を例示するが、これらに限定されるものではなく、他の異種遺伝子も使用可能なことは当業者であれば認識されるであろう。 In the following, the present invention is exemplified using a bone formation-inducing protein gene (hamster-human fusion gene: haBIP) as a heterologous gene, but the present invention is not limited thereto, and other heterologous genes can be used. Those skilled in the art will recognize.
なお、以下に記載する発現ベクターは何れも微生物中において増幅可能なベクターであり、例として大腸菌ベクターを示すが、これらに限定されるものではない。また、これら発現ベクターの増幅は常法にしたがって実施することが可能である［前記文献：Molecular CloningおよびBasic Methods in Molecular Biology等を参照せよ］。 In addition, all of the expression vectors described below are vectors that can be amplified in microorganisms, and examples include E. coli vectors, but are not limited thereto. In addition, amplification of these expression vectors can be carried out according to a conventional method [see the above literature: Molecular Cloning, Basic Methods in Molecular Biology, etc.].
（実施例１） mC26構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の単離
（ｉ）プローブの作製
マウスの必乳最盛期の乳腺を用いて、常法に従い［サトウ（Satow）ら、J. Biochem. 99, 1639-1643 (1986)］、全mRNAをポリ（Ａ）RNA画分として単離した。10μgの全mRNAに関して、オリゴ（dT）プライマー（バイオテックインターナショナル（Biotech International）社／コスモバイオ社）およびランダムヘキサマー（バイオテックインターナショナル）をプライマーとして、アマシャム社またはNEN社の標識キットを用いて３２Ｐ標識した。
(Example 1) Isolation of mC26 structural gene and expression control region of the gene (i) Preparation of probe Using the mammary gland of the mouse's essential milk peak, according to a conventional method [Satow et al., J. Biochem. 99, 1639-1643 (1986)], and the total mRNA was isolated as a poly (A) RNA fraction. For 10 μg of total mRNA, using oligo (dT) primers (Biotech International / Cosmo Bio) and random hexamers (Biotech International) as primers, 32 using Amersham or NEN labeling kits. P-labeled.
mRNAのキャップ部分を標識するに際しては、常法［ミズモト（Mizumoto）とリップマン（Lipmann）、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 4961 (1979)］に従い、オリゴ（dT）セルロースカラム（ベセスダリサーチ（Bethesda Research）社、米国／コスモバイオ社）を用いてmRNAをポリ（Ａ）RNA画分として精製し、ワクシニアウイルスのグアリニルトランスフェラーゼ（ベセスダリサーチ社）により標識した。標識後、そのまま、またはRNaseA（シグマ社、米国）を用いて部分消化し（10〜100ng/mlのRNaseAを加え、１分間、37℃処理後、等容のホルムアミドを加えて反応停止）、６Ｍ〜８Ｍの尿素を含む６％アクリルアミドゲル電気泳動に供し、大きさを確認した。 When labeling the cap portion of mRNA, an oligo (dT) cellulose column (Bethesda) was used according to a conventional method [Mizumoto and Lipmann, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 4961 (1979)]. MRNA was purified as a poly (A) RNA fraction using Bethesda Research (USA / Cosmo Bio) and labeled with vaccinia virus guanylyltransferase (Bethesda Research). After labeling, digestion as it is or partially using RNaseA (Sigma, USA) (10-100 ng / ml RNaseA was added, treated at 37 ° C. for 1 minute, and then the reaction was stopped by adding an equal volume of formamide), 6M The size was confirmed by subjecting to 6% acrylamide gel electrophoresis containing ˜8 M urea.
（ii）ライブラリーの作製
Balb/cマウスのゲノミックDNAライブラリー（クローンテック社）を制限酵素EcoRIで部分消化または完全消化したのち、部分消化物に関しては消化物をλCharon4Aに、また完全消化物に関してはpSP64（プロメガバイオテック（Promega Biotech）社、米国）に連結してライブラリーを作製した。
(Ii) Library preparation
After partial or complete digestion of the genomic DNA library of Balb / c mice (Clontech) with the restriction enzyme EcoRI, the digest was converted to λCharon4A for the partial digest and pSP64 (Promega Biotech ( Promega Biotech), USA) to create a library.
ウシ、ニワトリ、イヌ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ヒト、カンガルー、サル、マウス、ハト、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物種については、λ由来のファージベクター、例えばλgt10、λgt11、EMBL3またはλCharon4Aの各ベクターに挿入されたcDNAおよびゲノミックDNAのライブラリーが市販品として購入可能である（クロンテック（Clontech）社／TOYOBO社）。なお、pSP64（プロメガ社）および市販ゲノミックDNA（クローンテック社）の組み合わせによっても、これらと同等のライブラリーを作製することは、当業者であれば容易に可能であろう。 For animal species such as cattle, chickens, dogs, goats, guinea pigs, hamsters, humans, kangaroos, monkeys, mice, pigeons, pigs, rabbits, rats, sheep, etc., λ-derived phage vectors such as λgt10, λgt11, EMBL3, Libraries of cDNA and genomic DNA inserted into each of the vectors are commercially available (Clontech / TOYOBO). A person skilled in the art can easily prepare a library equivalent to these by combining pSP64 (Promega) and commercially available genomic DNA (Clontech).
（iii）陽性クローンのスクリーニング
このライブラリーの中から、上記（ｉ）において作製したプローブを用いてスクリーニングを行った。
(Iii) Screening for positive clones From this library, screening was performed using the probe prepared in (i) above.
その結果、λCharon4AのライブラリーからはλMC26が、そして、pSP64のライブラリーからはpSmC26が乳腺特異的に発現する陽性クローンとして同定された。これら構築物のマップを、それぞれ図１および図２に示す。 As a result, λMC26 was identified from the library of λCharon4A, and pSmC26 was identified as a positive clone specifically expressing the mammary gland from the library of pSP64. The maps of these constructs are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
（実施例２） mC26構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の特徴
（ｉ）陽性クローンの特徴
λMC26クローンおよびpSmC26クローンの制限酵素地図を作製して比較したところ、λMC26は約12.7kbの挿入断片（EcoRI断片）を、そしてpSmC26は約6.7kbの挿入断片（EcoRI断片）を含むことがわかった。そして、約6.7kbの断片は約12.7kbの断片内に含まれるものであることが、制限酵素マッピングにより明らかとなった。これらの結果は図１および図２の制限酵素認識部位の比較から明らかである。
(Example 2) Characteristics of mC26 structural gene and expression control region of the gene (i) Characteristics of positive clones When restriction enzyme maps of λMC26 clone and pSmC26 clone were prepared and compared, λMC26 was an insert fragment of about 12.7 kb ( EcoRI fragment) and pSmC26 was found to contain an approximately 6.7 kb insert (EcoRI fragment). It was revealed by restriction enzyme mapping that the fragment of about 6.7 kb is contained within the fragment of about 12.7 kb. These results are clear from the comparison of restriction enzyme recognition sites in FIGS.
（ii）塩基配列決定
pSmC26の約6.7kbのEcoRI断片を切り出し、さらにHindIIIで消化することにより約5.4kbpのEcoRI-HindIII断片をpBlueScriptIISK+（プロメガ社）に挿入してサブクローン化した。このサブクローンに関して、デリーションキット（TaKaRa社）を用いて欠失変異体のシリーズを作製した。約5.4kbの断片の制限酵素マップを図３に示す。これらのシリーズの配列は、ジデオキシ法［サンガー（Sanger, F.）ら、Proc. Matl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)］により、DNA塩基配列決定機（ABI社、モデル373A、およびファルマシア社、A. L. F.モデル）を使用して決定された。決定された塩基配列を配列番号１とする。
(Ii) Base sequence determination
An approximately 6.7 kb EcoRI fragment of pSmC26 was excised, and further digested with HindIII, so that an approximately 5.4 kbp EcoRI-HindIII fragment was inserted into pBlueScriptIISK + (Promega) and subcloned. For this subclone, a deletion mutant series was prepared using a deletion kit (TaKaRa). FIG. 3 shows a restriction enzyme map of a fragment of about 5.4 kb. The sequences of these series were analyzed by the dideoxy method [Sanger, F. et al., Proc. Matl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]. , And Pharmacia, ALF model). The determined base sequence is represented by SEQ ID NO: 1.
配列番号１中、ヌクレオチド番号2305〜2307のAGCから始まり、ヌクレオチド番号4622〜4624のCCTで終わる構造遺伝子部分が存在する（図５）。 In SEQ ID NO: 1, there is a structural gene portion starting from AGC of nucleotide numbers 2305 to 2307 and ending with CCT of nucleotide numbers 4622 to 4624 (FIG. 5).
図５に示すとおり、mC26構造遺伝子内には第１ないし第３イントロンが存在しており、スプライシングに関与していることが予測されるので、異種遺伝子発現のためのカセットとして用いる場合は、これらの配列を含ませることが好ましい。しかし、下記実施例から明らかなとおり、異種遺伝子の種類によってはこれらは必要でない場合もある。よって、発現カセットを作製するための連結の複雑さも考慮して、これらの配列を含ませるか否かを検討する必要がある。 As shown in FIG. 5, since the first to third introns are present in the mC26 structural gene and are expected to be involved in splicing, when used as a cassette for heterologous gene expression, It is preferable to include these sequences. However, as is clear from the examples below, these may not be necessary depending on the type of heterologous gene. Therefore, it is necessary to consider whether or not to include these sequences in consideration of the complexity of ligation for preparing the expression cassette.
該構造遺伝子部分の上流および下流領域のヌクレオチド配列には、公知のカゼイン遺伝子との間で相同性は認められない。また、上記文献［ドーベンコら、前記］において開示されていない部分、即ち、配列番号１中の第1439ヌクレオチド〜第1522に存在するGAAトリプレットの連続重複配列部分（以下、MboIIリピートと称する）は、いわゆるトリプルリピートと称される発現制御配列と同等のものと考えられ、この部分が発現制御に関与している可能性は高い（図４、下線部分）。マウスIgH遺伝子においてもMboIIリピートが発見されており、発現制御エンハンサーとして機能していると考えられている。 The nucleotide sequences in the upstream and downstream regions of the structural gene portion do not show homology with known casein genes. Further, the portion not disclosed in the above document [Dobenco et al., Supra], that is, the continuous overlapping sequence portion (hereinafter referred to as MboII repeat) of the GAA triplet existing from nucleotide 1439 to nucleotide 1522 in SEQ ID NO: 1, It is considered to be equivalent to an expression control sequence called a so-called triple repeat, and it is highly likely that this part is involved in expression control (FIG. 4, underlined part). An MboII repeat has also been found in the mouse IgH gene and is thought to function as an expression control enhancer.
配列番号１のヌクレオチド配列は、一方の末端がEcoRI認識部位であり、そして他方の末端がHindIIIの認識部位であるDNA断片として、λMC26クローンおよびpSmC26クローンから容易に分離され、発現カセットとして以後の実験に使用された。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was easily separated from the λMC26 clone and pSmC26 clone as a DNA fragment having one end serving as an EcoRI recognition site and the other end serving as a HindIII recognition site. Used for.
（実施例３） マウス骨形成誘導蛋白質を発現するトランスジェニック動物の作製
実施例１において単離したpSmC26の約6.7kb断片のうち配列を決定した5394bpのDNA断片を発現カセットとして用いて、mC26構造遺伝子部分に、外来異種遺伝子を連結した組換えDNAを作製した。以下にその概要を記載する。
(Example 3) Production of transgenic animal expressing mouse bone formation-inducing protein Using the 5394 bp DNA fragment determined from the approximately 6.7 kb fragment of pSmC26 isolated in Example 1 as an expression cassette, the mC26 structure A recombinant DNA in which a foreign heterologous gene was linked to the gene portion was prepared. The outline is described below.
（ｉ）組換えDNAの作製
最初に、pSmC26から約6.7kb断片のEcoRI断片を切り出し、さらにHindIIIにより部分消化し、ゲル電気泳動法により5394bpのDNA断片を回収した。該断片をpBlueScriptSK+のEcoRI／HindIII二重消化物に連結してpBmC26EHを作製した。pBmC26EHのマップを図７に示す。
(I) Preparation of recombinant DNA First, an EcoRI fragment of about 6.7 kb fragment was cut out from pSmC26, further partially digested with HindIII, and a 5394 bp DNA fragment was recovered by gel electrophoresis. The fragment was ligated to pBlueScriptSK + EcoRI / HindIII double digest to generate pBmC26EH. A map of pBmC26EH is shown in FIG.
一方、外来異種遺伝子としては、ハムスター−ヒトの融合遺伝子である骨形成誘導蛋白質遺伝子を用いた。このヌクレオチド配列を配列番号２として示す。 On the other hand, a bone formation-inducing protein gene, which is a hamster-human fusion gene, was used as the foreign heterologous gene. This nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO: 2.
該融合遺伝子は、以下の工程により取得した：
ヒト骨形成誘導蛋白質（BIP）遺伝子の一部の配列（配列番号７）を有するDNAを5'側プライマーとし、そして、配列番号８の配列 を有するDNAを3'側（逆のストランド）プライマーとした。
GACGAGAAGACGATGCAGA （配列番号７）
GCACAGGTGTCCACGGACA （配列番号８）
The fusion gene was obtained by the following steps:
A DNA having a partial sequence (SEQ ID NO: 7) of a human bone formation-inducing protein (BIP) gene is used as a 5'-side primer, and a DNA having the sequence of SEQ ID NO: 8 is used as a 3'-side (reverse strand) primer. did.
GACGAGAAGACGATGCAGA (SEQ ID NO: 7)
GCACAGGTGTCCACGGACA (SEQ ID NO: 8)
これらのプライマーを用いて、ハムスター由来のBaby Hamster kidney（BHK）細胞株から常法（チオシアン酸グアニジン法：前記のMolecular Cloning、サムブルックらを参照）により抽出したRNA（10μg）から逆転写酵素RAV-2（TaKaRa社）およびrTthDNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社／TaKaRa社）を用い、添付の緩衝液によりパーキンエルマー社の装置（Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler480）を用いて添付の使用説明書に従ってRT-PCR反応を実施し、ハムスターBIPに相補的な二本鎖を得た。該二本鎖DNAを電気泳動により確認後（図８、レーン３〜５）、ゲルから回収し、pBlueScriptIIベクターのEcoRV切断部位に挿入してDNAを増幅し、ファルマシア社ALF自動シークエンサーにより塩基配列を決定した。上記操作により、該DNAは、ヒトBIP DNA（配列番号７および８）および新規遺伝子であるハムスターBIPのヒト遺伝子に相似する部分のDNAが結合したヒト−ハムスター融合遺伝子DNAとして得られた。 Using these primers, reverse transcriptase RAV from RNA (10 μg) extracted from a hamster-derived Baby Hamster kidney (BHK) cell line by a conventional method (guanidine thiocyanate method: see Molecular Cloning, Sambrook et al.) RT-PCR using the Perkin Elmer device (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480) with the attached buffer and the Perkin Elmer device (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480) using -2 (TaKaRa) and rTthDNA polymerase (Perkin Elmer / TaKaRa) The reaction was performed to obtain a duplex complementary to hamster BIP. After confirming the double-stranded DNA by electrophoresis (FIG. 8, lanes 3 to 5), it is recovered from the gel, inserted into the EcoRV cleavage site of the pBlueScriptII vector, amplified, and the nucleotide sequence is determined by a Pharmacia ALF automatic sequencer. Decided. By the above operation, the DNA was obtained as a human-hamster fusion gene DNA in which human BIP DNA (SEQ ID NOs: 7 and 8) and a novel gene, hamster BIP, similar to the human gene were combined.
pBmC26EH中の配列番号１の第2305ヌクレオチドから第4624ヌクレオチドまでを除去したDNAに、T4DNAリガーゼ（TaKaRa社）を用いて上記DNAを連結して得た組換えDNAを、大腸菌JM109株にトランスフェクションして増幅した。増幅された該組換えDNAの塩基配列を決定して確認し、制限酵素BssHII（TaKaRa社）で切断して直鎖状DNAとしてアガロースゲル電気泳動によりpBlueScriptII由来のDNA部分と、haBIPを挿入されたmC26発現カセット部分を分離してゲルから回収した。このDNAの1〜5μg/ml溶液を以下の実施例に用いた。 Recombinant DNA obtained by ligating the above DNA with T4DNA ligase (TaKaRa) to DNA from nucleotides 2305 to 4624 of SEQ ID NO: 1 in pBmC26EH was transfected into Escherichia coli JM109 strain. Amplified. The base sequence of the amplified recombinant DNA was determined and confirmed, cleaved with the restriction enzyme BssHII (TaKaRa), and the DNA portion derived from pBlueScriptII and haBIP were inserted as a linear DNA by agarose gel electrophoresis. The mC26 expression cassette part was separated and recovered from the gel. A 1 to 5 μg / ml solution of this DNA was used in the following examples.
（ii）受精卵の採取
マウスの性周期（４日間）を考慮して、毎日、メスのマウス膣内をガラスピペットにより水で洗浄し、細胞診により性周期を調べた（スメアチェック）。マウスを同調群に分けて、群飼し、オスのマウスと交配後、翌朝の膣栓（プラグ）形成を確認して妊娠マウスを得た。母群頭数が少ない場合は、ゴナドトロピン腹腔内注射により過排卵処置を行った。塩酸ケタミンまたはペントバルビタールの５０倍希釈液を腹腔内注射して導入麻酔し、エーテル麻酔下に手術を行い、輸卵管ないし子宮角を移動中の卵を回収した。
用いたマウスはチャールズリバー（Chirles River）社のCD-1マウスを用いた。
(Ii) Collection of fertilized eggs Considering the sexual cycle (4 days) of mice, the female vagina was washed with water with a glass pipette every day, and the sexual cycle was examined by cytology (smear check). The mice were divided into entrained groups, housed in groups, mated with male mice, and then confirmed to form vaginal plugs (plugs) the next morning to obtain pregnant mice. When the number of mothers was small, superovulation treatment was performed by intraperitoneal injection of gonadotropin. A 50-fold diluted solution of ketamine hydrochloride or pentobarbital was injected intraperitoneally to induce anesthesia, and surgery was performed under ether anesthesia, and eggs moving through the oviduct or uterine horn were collected.
The mouse used was a CD-1 mouse manufactured by Charles River.
（iii）受精卵へのDNAの注入
上記（ｉ）において作製したpBmC26EHを大腸菌JM109株内で増幅後、制限酵素EcoRIおよびKpnIの認識部位において切断して直鎖状にし、該直鎖状DNAをマウスの受精卵前核に注入した。上記DNAを1〜5μg/mlの濃度に溶解した溶液をマイクロインジェクションした。この方法により操作された胚を子宮頸管刺激により偽妊娠させたメスまたは性周期同調群より選択した代理母（受容メス）の卵管腹腔口に適切な大きさのシリコンチューブカテーテルを挿入して移し、妊娠へと進展させた。
(Iii) Injection of DNA into fertilized eggs After amplification of pBmC26EH prepared in (i) above in E. coli strain JM109, it is cleaved at the recognition sites of restriction enzymes EcoRI and KpnI to form a linear form. The mice were injected into the pronucleus of the fertilized egg. A solution in which the above DNA was dissolved at a concentration of 1 to 5 μg / ml was microinjected. Embryos manipulated by this method are transferred by inserting a silicon tube catheter of appropriate size into the abdominal cavity of the surrogate mother (receptive female) selected from the females who were pseudopregnant by cervical stimulation or the sexual cycle synchronization group. Made progress to pregnancy.
マイクロインジェクション後の卵の１時間生存率は52％であった。 The one-hour survival rate of eggs after microinjection was 52%.
上記遺伝子導入卵を１頭につき２０個ずつ４０頭の代理母に移入したところ、５４頭の産子を得た。 When 20 transgenic eggs were transferred to 40 surrogate mothers, 54 litters were obtained.
上記５４頭の産仔のうち、DNA診断によりトランスジェニックと判明したものは７頭（13％）であった。 Of the 54 pups, 7 (13%) were found to be transgenic by DNA diagnosis.
（iv）DNA診断
トランスジェニックマウスの口内粘膜細胞または培養白血球細胞から常法により得たDNAに関して、PCR法のキット（Perkin Elmer社の使用説明書に従った）を用いて実施した。結果を図８に示す。
(Iv) DNA diagnosis With respect to DNA obtained from oral mucosal cells or cultured white blood cells of transgenic mice by a conventional method, PCR was performed using a kit for PCR (according to instructions for use by Perkin Elmer). The results are shown in FIG.
図８は、培養細胞株および組換え動物細胞により抽出した各RNA 10μgについて、ヒト−ハムスター融合遺伝子であるhaBIPのmRNAの発現の有無をRT-PCR法により確認した。レーン４、５および６は、ハムスター由来のBHK細胞から抽出したRNA；レーン２は、ヒト由来細胞株であるNamalwa細胞RNA；レーン１は、組換え動物細胞から抽出したRNA；に対するRT-PCRの結果を示す。5'および3'のプライマーはヒトBIP遺伝子DNAの構造遺伝子部分の配列からオリゴマー一本鎖DNAを合成して使用したものであり、各PCR反応産物のDNA配列は同一となると予想される。図８は、PCR反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色した結果を示すが、各バンドのアガロース部分を切り出してNaIにより溶解後、DNAをガラスパウダーに吸着させて回収し、全塩基配列を決定したところ、同一の配列を有することが確認された。 FIG. 8 confirmed the presence or absence of expression of mRNA of haBIP, which is a human-hamster fusion gene, for 10 μg of each RNA extracted from cultured cell lines and recombinant animal cells. Lanes 4, 5 and 6 are RNA extracted from BHK cells derived from hamsters; Lane 2 is Namalwa cell RNA which is a human cell line; Lane 1 is RNA extracted from recombinant animal cells; Results are shown. The 5 ′ and 3 ′ primers were prepared by synthesizing oligomer single-stranded DNA from the sequence of the structural gene portion of human BIP gene DNA, and the DNA sequences of each PCR reaction product are expected to be the same. FIG. 8 shows the results of 2% agarose gel electrophoresis after PCR reaction and ethidium bromide staining. The agarose part of each band was cut out and dissolved with NaI, and then DNA was adsorbed on glass powder and recovered. When the base sequence was determined, it was confirmed to have the same sequence.
（配列表の説明）
本明細書に添付した配列表について以下説明する。
（配列番号：１）
配列の長さ：5394
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mus musculus
株名：Balb/c
組織の種類：liver
配列の特徴
特徴を表す記号：CAAT signal
存在位置：2234-2243
特徴を決定した方法：S
(Explanation of sequence listing)
The sequence listing attached to this specification will be described below.
(SEQ ID NO: 1)
Sequence length: 5394
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA
Origin organism name: Mus musculus
Stock name: Balb / c
Organization type: liver
Sequence features Symbols representing features: CAAT signal
Location: 2234-2243
How the features were determined: S
配列の特徴
特徴を表す記号：TATA signal
存在位置：2275-2281
特徴を決定した方法：S
Characteristic of sequence Symbol representing characteristic: TATA signal
Location: 2275-2281
How the features were determined: S
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：2305-4624
特徴を決定した方法：P
Sequence features Symbols for features: CDS
Location: 2305-4624
How the features were determined: P
配列の特徴
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：4607-4612
特徴を決定した方法：S
Sequence features Symbols for features: polyA signal
Location: 4607-4612
How the features were determined: S
（配列番号：２）
配列の長さ：357
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..357
特徴を決定した方法：E
(SEQ ID NO: 2)
Sequence length: 357
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA
Sequence features Symbols for features: CDS
Location: 1..357
How the features were determined: E
（配列番号：３）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
(SEQ ID NO: 3)
Sequence length: 20
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA
Sequence features Symbols representing features: unsure
Location: 1..20
How the features were determined: S
（配列番号：４）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
(SEQ ID NO: 4)
Sequence length: 20
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA
Sequence features Symbols representing features: unsure
Location: 1..20
How the features were determined: S
（配列番号：５）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
(SEQ ID NO: 5)
Sequence length: 20
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA
Sequence features Symbols representing features: unsure
Location: 1..20
How the features were determined: S
（配列番号：６）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
(SEQ ID NO: 6)
Sequence length: 20
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA
Sequence features Symbols representing features: unsure
Location: 1..20
How the features were determined: S
（配列番号：７）
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..19
特徴を決定した方法：E
(SEQ ID NO: 7)
Sequence length: 19
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA
Sequence features Symbols for features: CDS
Location: 1..19
How the features were determined: E
（配列番号：８）
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..19
特徴を決定した方法：E
(SEQ ID NO: 8)
Sequence length: 19
Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA
Sequence features Symbols for features: CDS
Location: 1..19
How the features were determined: E
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103330719A (en) * | 2013-04-27 | 2013-10-02 | 南京优而生物科技发展有限公司 | Kangaroo bone extract and extraction method thereof |
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2005
- 2005-04-04 JP JP2005107185A patent/JP2005211079A/en active Pending
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|---|---|---|---|---|
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