JP2005198530A - Glycine lyase, method for measuring glycine lyase activity and method for screening cell growth inhibitor using glycine lyase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質にポリグリシンを翻訳後修飾するポリグリシン付加酵素、及びその使用方法に関するものである。さらに詳しく述べると、細胞微小管を構成するタンパク質であるチューブリンにポリグリシンを付加する、ポリグリシン付加酵素、該ポリグリシン付加酵素の活性測定方法、及び細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う細胞増殖の促進、又は該細胞増殖の抑制に関与する物質を、該ポリグリシン付加酵素を用いてスクリーニング方法に関するものである。 The present invention relates to a polyglycine-adding enzyme for post-translationally modifying polyglycine on a protein, and a method for using the same. More specifically, polyglycine addition enzyme for adding polyglycine to tubulin, which is a protein constituting cell microtubules, a method for measuring the activity of polyglycine addition enzyme, and polyglycine addition to tubulin in cell microtubules. The present invention relates to a screening method using the polyglycine-adding enzyme for a substance involved in the promotion of the accompanying cell growth or the suppression of the cell growth.
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序ある翻訳後修飾、それによる各種タンパク質の寿命の調節、さらにそのタンパク質機能の発現による細胞機能によって受け渡しされる情報に基づいて起きる細胞の応答といった一連の生命現象の時系列制御が極めて重要であると考えられている（非特許文献１，２及び３）。また、多細胞生物に生じる癌には多くの成因が存在するが、その多くは不明であり、該翻訳後修飾、それによる各種タンパク質の寿命の調節、及び該タンパク質機能の発現による細胞の応答の異常が、重要な因子であると考えられている。
特に、これら翻訳後修飾に伴うタンパク質発現による細胞機能には、細胞骨格の微小管を構成するタンパク質、チューブリンに対するポリグリシン付加による動態が深く関与していると予測され、この酵素の解明がタンパク質機能の発現による細胞機能、及び癌のメカニズムの解明に必須であると考えられている。
しかし、これまで該チューブリンにポリグルタミン酸を付加する酵素、ポリグルタミレース(Polyglutamylase)、及びその活性測定方法は報告されているが（非特許文献４）、ポリグリシンを付加酵素の活性測定方法はなく、該ポリグリシン付加酵素は見出されていなかった。
Maintenance of normal functions of humans and other multicellular organisms involves orderly post-translational modification, thereby regulating the lifespan of various proteins, and cells that are generated based on information passed through cell functions through the expression of the protein functions. It is considered that time series control of a series of life phenomena such as the response of is very important (Non-Patent Documents 1, 2, and 3). In addition, there are many causes of cancer occurring in multicellular organisms, but many of them are unknown, and the post-translational modification, thereby regulating the life span of various proteins, and the response of cells by the expression of the protein function. Anomalies are considered to be an important factor.
In particular, it is predicted that the cellular function by protein expression associated with these post-translational modifications is deeply related to the dynamics of polyglycine addition to the protein, tubulin, which constitutes the microtubules of the cytoskeleton. It is considered essential for elucidation of the cell function by expression of the function and the mechanism of cancer.
However, an enzyme that adds polyglutamic acid to tubulin, polyglutamylase, and a method for measuring its activity have been reported (Non-patent Document 4). In addition, the polyglycine adduct was not found.
本発明は、これまで知られていなかったポリグリシン付加酵素、ポリグリシン付加酵素活性の測定方法、及び該ポリグリシン付加酵素を用いる細胞増殖制御物質のスクリーニング法を提供することを目的とする。
さらに詳細に述べると、本発明は、ヒトの細胞の形成や分裂、癌の発生、増殖のメカニズムの解明、細胞分化の機能的、又は構造的障害を原因とする各種疾患の診断、予防、及び治療のための技術開発などに有用なポリグリシン付加酵素、及び該グリシン付加酵素を利用したスクリーニング法を提供することを目的とする。
An object of the present invention is to provide a polyglycine addition enzyme, a method for measuring polyglycine addition enzyme activity, and a screening method for a cell growth regulator using the polyglycine addition enzyme, which have not been known so far.
More specifically, the present invention relates to the formation and division of human cells, the development of cancer, the elucidation of the mechanism of proliferation, the diagnosis and prevention of various diseases caused by functional or structural disorders of cell differentiation, and It is an object of the present invention to provide a polyglycine addition enzyme useful for technological development for treatment and the like, and a screening method using the glycine addition enzyme.
本発明者が前記課題を達成するため研究を行った結果、細胞微小管のチューブリンにポリグルタミンを付加するポリグルタミレースの活性を測定する公知の方法（＊１）を改良し、ＴＣＡ沈殿、すなわちトリクロロ酢酸(TCA)でチューブリンを含む試料を処理することにより、ポリグリシン付加酵素、及びチューブリン・ポリグリシン付加酵素を安定させ、該ポリグリシン付加酵素の活性を測定できるという知見を得た。
＊１：Regnard et al., :Tubulin Polyglutamilase: Partial Purification and
Enzymatic Properties., Biochemistry, 37, 8395-8404, 1998.
本発明者は、該知見に基づき、ポリグリシン付加酵素活性の測定方法を確立し、本発明のポリグリシン付加酵素、及び該ポリグリシン付加酵素を用いる細胞増殖制御物質のスクリーニング法を完成したのである。なお、特に断らない限り、本明細書において、該ポリグリシン付加酵素をポリグリシレースという。
As a result of studies conducted by the present inventors to achieve the above-mentioned problems, a known method (* 1) for measuring the activity of polyglutamylase, which adds polyglutamine to tubulin of cell microtubules, has been improved, TCA precipitation, That is, by treating a sample containing tubulin with trichloroacetic acid (TCA), polyglycine adductase and tubulin / polyglycine adductase were stabilized and the activity of the polyglycine adductase was measured. .
* 1: Regnard et al.,: Tubulin Polyglutamilase: Partial Purification and
Enzymatic Properties., Biochemistry, 37, 8395-8404, 1998.
Based on this finding, the present inventor has established a method for measuring polyglycine adductase activity, and has completed the polyglycine adduct of the present invention and a screening method for cell growth control substances using the polyglycine adduct. . Unless otherwise specified, in the present specification, the polyglycine-adding enzyme is referred to as polyglycylase.
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と所定の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素を提供する。また、該相同性は７０％以上、好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
また、本発明は配列番号２、又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素を提供する。
また、本発明は、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニング方法であって：
前記ポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、被検物質、及び標準試料に加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法を提供する。
Therefore, the present invention provides a polyglycine-adding enzyme for tubulin comprising a polypeptide having a predetermined homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The homology is 70% or more, preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more.
The present invention also provides a polyglycine addition enzyme for tubulin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
The present invention also relates to a screening method for a cell growth promoter or a cell growth inhibitor associated with addition of polyglycine to tubulin in a cell microtubule:
Adding the polyglycine-adding enzyme, labeled glycine, a test substance, and a standard sample; and detecting the promotion or suppression of the polyglycine addition reaction in the standard sample. Provide a method.
また、本発明は、該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程がTCA沈殿を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、前記ポリグリシン付加酵素を含むことを特徴とする、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の増進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニングキットを提供する。
さらに、本発明は、チューブリン、ポリグリシン付加酵素及び標識されたグリシンを含む反応液をインキュベートし、回収した反応液を固定した後、トリクロロ酢酸で該チューブリンを含む試料を処理することにより、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させ、次いで標識されたポリグリシンの量を測定することを特徴とする、ポリグリシン付加酵素の活性測定方法を提供する。
The present invention also provides the screening method, wherein the step of detecting the promotion or suppression of the polyglycine addition reaction in the standard sample comprises TCA precipitation.
The present invention also provides a screening kit for an agent for promoting cell proliferation or an inhibitor for inhibiting cell proliferation accompanying polyglycine addition to tubulin of a cell microtubule, comprising the polyglycine-adding enzyme. To do.
Furthermore, the present invention comprises incubating a reaction solution containing tubulin, polyglycine addition enzyme and labeled glycine, fixing the recovered reaction solution, and then treating the sample containing the tubulin with trichloroacetic acid, There is provided a method for measuring the activity of a polyglycine-added enzyme, comprising stabilizing a tubulin-polyglycine complex and then measuring the amount of labeled polyglycine.
（定義）
本明細書において、「ポリグリシレース」とは、タンパク質の翻訳後修飾において、タンパク質に特異的にポリグリシンを付加する酵素を意味する。本明細書において特に指摘しない限り、該ポリグリシレースとは、細胞微小管の構造タンパク質であるチューブリンに、特異的にポリグリシンを付加する酵素、すなわちポリグリシン付加酵素を意味する。
また、本明細書において「ポリグリシン」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基に結合した単独のグリシン残基、又はグリシン残基２〜５０個を有するアミノ酸重合体をいい、特に断らない限り、細胞微小管のチューブリンのＣ末端近傍のアミノ酸残基に結合しているものをいう。
(Definition)
In the present specification, “polyglycylace” means an enzyme that specifically adds polyglycine to a protein in post-translational modification of the protein. Unless otherwise specified in the present specification, the polyglycylace means an enzyme that specifically adds polyglycine to tubulin, which is a structural protein of cell microtubules, that is, a polyglycine adduct.
In the present specification, the term “polyglycine” refers to a single glycine residue bonded to an amino acid residue constituting a protein, or an amino acid polymer having 2 to 50 glycine residues. This refers to those bound to the amino acid residues near the C-terminus of tubulin in cell microtubules.
本発明により、新規なポリグリシン付加酵素、ポリグリシン付加酵素活性の測定方法、及び該ポリグリシン付加酵素を用いる細胞増殖制御物質のスクリーニング法が得られる。
本発明により、ヒトの細胞の形成や分裂、癌の発生、増殖のメカニズムの解明、細胞分化の機能的、又は構造的障害を原因とする各種疾患の診断、予防、及び治療のための技術開発などに有用な新規ポリグリシン付加酵素が提供される。また、該ポリグリシン付加酵素を標的として利用する、本発明のスクリーニング法により、制ガン剤を含む、細胞増殖制御物質の効率的なスクリーニングが可能になる。
According to the present invention, a novel polyglycine-adding enzyme, a method for measuring polyglycine-adding enzyme activity, and a screening method for a cell growth regulator using the polyglycine-adding enzyme are obtained.
Development of technology for diagnosis, prevention, and treatment of various diseases caused by functional or structural disorders of cell differentiation, elucidation of mechanisms of human cell formation and division, cancer development, proliferation, and cell differentiation A novel polyglycine adductase useful for the above is provided. In addition, the screening method of the present invention using the polyglycine-adding enzyme as a target enables efficient screening of cell growth regulators including anticancer agents.
(ポリグリシン付加酵素の活性測定方法）
前記Regnardらが報告した、細胞微小管のチューブリンにポリグルタミン酸を付加するポリグルタミレースの活性を測定する公知の方法では、ポリグリシン付加酵素の活性を正確に測定することはできかったが、本発明者らは、ＴＣＡ沈殿、すなわちトリクロロ酢酸(TCA)でチューブリンを含む試料を処理することにより、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させ、該ポリグリシン付加酵素の活性を測定する方法を確立した。本発明の活性測定方法を図１の工程図に基づき説明する。
(Method for measuring the activity of polyglycine addition enzyme)
In the known method for measuring the activity of polyglutamylase that adds polyglutamic acid to tubulin of cell microtubules reported by Regnard et al., The activity of polyglycine adductase could not be accurately measured. The present inventors have developed a method for stabilizing a tubulin-polyglycine complex by treating a sample containing tubulin with TCA precipitation, ie, trichloroacetic acid (TCA), and measuring the activity of the polyglycine adductase. Established. The activity measuring method of the present invention will be described based on the process diagram of FIG.
反応液の調製
まず、チューブリン、ポリグリシン付加酵素を含む試料、及び標識されたグリシンを含む反応液を調製する。該試料は、多細胞生物の細胞の抽出液、抽出液を精製した分画、又は既にポリグリシン付加酵素とチューブリンとを含む細胞溶解液などを用いることができる。また、グリシンは精製された単品を標識して使用する。該標識は、チューブリンへのポリグリシンの結合量を測定するのに用いるもので、例えば、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕及び〔35Ｓ〕などの放射性元素、及び蛍光色素がある。
また、チューブリンとポリグリシンの付加反応を行うために、Tris-HClなどの緩衝液、ＡＴＰ、MgCl2などのマグネシウム塩、及びＤＴＴを加える。通常、該付加反応を行うためには、pH７〜１０，好ましくは８〜１０とし、かつ塩濃度を２〜１２mmol程度にするのが好ましい。該反応液を調製した後、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、１５〜４５分間、好ましくは２５〜３５分間、インキュベートする。
Preparation of reaction solution First, a sample containing tubulin, polyglycine addition enzyme, and a reaction solution containing labeled glycine are prepared. As the sample, a cell extract of a multicellular organism, a fraction obtained by purifying the extract, or a cell lysate that already contains polyglycine-added enzyme and tubulin can be used. Glycine is used after labeling a purified single product. The label is used to measure the amount of polyglycine bound to tubulin. For example, radioactive elements such as [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C] and [ 35 S], and fluorescence There is a pigment.
In addition, in order to perform an addition reaction between tubulin and polyglycine, a buffer solution such as Tris-HCl, a magnesium salt such as ATP and MgCl 2 , and DTT are added. Usually, in order to carry out the addition reaction, it is preferable that the pH is 7 to 10, preferably 8 to 10, and the salt concentration is about 2 to 12 mmol. After the reaction solution is prepared, it is incubated at 20 to 40 ° C., preferably 25 to 35 ° C., for 15 to 45 minutes, preferably 25 to 35 minutes.
反応液の固定
ポリグリシンの付加反応終了後、反応液を支持体上に固定する。該支持体として、例えば、グラスファイバー、又はニトロセルロースのフィルター、ワットマンろ紙などを用いることができる。また、反応液の固定は、反応液を支持体上にスポットすることにより行うことができる。
ＴＣＡ沈殿
該ＴＣＡ沈殿は、支持体に固定した反応液を、トリクロロ酢酸溶液中でインキュベートすることにより行う。該インキュベートは、常温で行うこともできるが、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させるため、低温、例えば、０〜１０℃で、１〜３０分間、好ましくは５〜１５分間で行う。また、該トリクロロ酢酸は、濃度１〜３０％、好ましくは５〜２０％のトリクロロ酢酸溶液として用いるのが好ましい。
ポリグリシン付加酵素を固定した支持体の洗浄
ＴＣＡ沈殿を行った後、まず、遊離の標識されたグリシンを除去するため、前記支持体を、固定されたチューブリン・ポリグリシン複合体の安定を損なわない溶媒で数回洗浄する。本発明では、フィルターなどの支持体を吸引状態で、適量の５％トリクロロ酢酸溶液により２〜５回程度洗浄するのが好ましい。ついで、残留トリクロロ酢酸を除去するため、固定されたポリグリシン・ポリグリシン付加酵素複合体の安定を損なわない溶媒で数回洗浄する。例えば、該支持体を吸引状態で、適量のメチルアルコール、又はエチルアルコールなどで２〜５回程度洗浄するのが好ましい。次いで、該支持体を無水硫酸などの乾燥剤、又は６０〜９０℃の温度で５〜３０分間乾燥させる。
Immobilization of reaction solution After completion of the addition reaction of polyglycine, the reaction solution is immobilized on a support. As the support, for example, glass fiber, nitrocellulose filter, Whatman filter paper or the like can be used. The reaction solution can be fixed by spotting the reaction solution on a support.
TCA precipitation The TCA precipitation is performed by incubating the reaction solution fixed on the support in a trichloroacetic acid solution. The incubation can be performed at room temperature, but in order to stabilize the tubulin / polyglycine complex, the incubation is performed at a low temperature, for example, 0 to 10 ° C. for 1 to 30 minutes, preferably 5 to 15 minutes. The trichloroacetic acid is preferably used as a trichloroacetic acid solution having a concentration of 1 to 30%, preferably 5 to 20%.
After washing TCA precipitation of the support on which the polyglycine-added enzyme is immobilized, the support is first used to remove the free labeled glycine, so that the stability of the immobilized tubulin-polyglycine complex is impaired. Wash several times with no solvent. In the present invention, it is preferable to wash a support such as a filter about 2 to 5 times with an appropriate amount of 5% trichloroacetic acid solution in a suction state. Subsequently, in order to remove residual trichloroacetic acid, it is washed several times with a solvent that does not impair the stability of the immobilized polyglycine / polyglycine adductase complex. For example, the support is preferably washed about 2 to 5 times with an appropriate amount of methyl alcohol or ethyl alcohol in a sucked state. The support is then dried for 5-30 minutes at a drying agent such as sulfuric anhydride or at a temperature of 60-90 ° C.
標識されたポリグリシンの測定
トリチウムなどの放射性元素で標識された場合、乾燥させた支持体に含まれる放射線量を測定し、取り込まれたグリシンの量をコントロールと比較し、ポリグリシン付加酵素の活性を測定する。例えば、標識がトリチウムの場合、シンチレーションバイアルに支持体を入れ、トルエン系シンチレーションカクテルを加えて、液体シンチレーションカウンターで測定することができる。
(ポリグリシン付加酵素）
本発明のポリグリシン付加酵素（ポリグリシレース）は、配列番号２のアミノ酸配列と所定の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素である。該相同性はチューブリンに対するポリグリシン付加を維持できる範囲であり、例えば、７０％以上、特に８０％以上、好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは９５％以上である。また、本発明のポリグリシン付加酵素には、マウスのポリグリシン付加酵素のアミノ酸配列（配列番号４）、及びヒトのポリグリシン付加酵素のアミノ酸配列（配列番号２）を有するポリグリシン付加酵素が含まれる。
Measurement of labeled polyglycine When labeled with a radioactive element such as tritium, the amount of radiation contained in the dried support is measured, the amount of glycine incorporated is compared with the control, and the activity of polyglycine adductase Measure. For example, when the label is tritium, the support can be placed in a scintillation vial, a toluene-based scintillation cocktail can be added, and measurement can be performed with a liquid scintillation counter.
(Polyglycine addition enzyme)
The polyglycine addition enzyme (polyglycylase) of the present invention is a polyglycine addition enzyme for tubulin, which contains a polypeptide having a predetermined homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The homology is within a range where the addition of polyglycine to tubulin can be maintained, for example, 70% or more, particularly 80% or more, preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more. Further, the polyglycine addition enzyme of the present invention includes a polyglycine addition enzyme having the amino acid sequence of mouse polyglycine addition enzyme (SEQ ID NO: 4) and the amino acid sequence of human polyglycine addition enzyme (SEQ ID NO: 2). It is.
本発明のポリグリシン付加酵素は、前記ポリグリシン付加酵素の活性測定方法を用いて、ブタ脳組織の細胞抽出液を分画し、ポリグリシン付加酵素を多く含む画分を特定して該酵素を採取し、次いで該酵素をプロテアーゼで断片とし、該断片のアミノ酸配列情報を用いてデータベース（ＮＣＢＩ）を検索することにより特定したものである。具体的な手順は後述する実施例２に記載されている。
該データベース検索の結果、得られたポリグリシン付加酵素は、ヒト、及びマウスホスホグリセレートカイネース(PGK)と同じ配列を有することが判った。すなわち、従来、ＰＧＫとして知られていた酵素は、同時にポリグリシン付加酵素であること判明した。
The polyglycine-adding enzyme of the present invention is obtained by fractionating a cell extract of porcine brain tissue using the method for measuring the activity of polyglycine-adding enzyme, identifying a fraction rich in polyglycine-adding enzyme, Then, the enzyme is fragmented with a protease and identified by searching a database (NCBI) using the amino acid sequence information of the fragment. A specific procedure is described in Example 2 described later.
As a result of the database search, it was found that the obtained polyglycine-added enzyme has the same sequence as human and mouse phosphoglycerate kinase (PGK). That is, it has been found that an enzyme conventionally known as PGK is a polyglycine addition enzyme at the same time.
(ポリグリシン付加酵素の製造）
本発明のポリグリシン付加酵素は、所望の動物、又は植物の細胞から、常法で細胞溶解液を作り、分画し、本発明の活性測定方法により、該ポリグリシン付加酵素に富む画分を選び、塩析、沈殿、アフィニティカラムなどにより精製することで製造することができる。また、本発明のポリグリシン付加酵素は、所望の多細胞生物のＰＧＫ１と同じアミノ酸配列を有するものであるから、入手しようとする多細胞生物のＰＧＫ１をコードするポリヌクレオチドを、cDNAライブラリーから調製して、常法により該ポリヌクレオチドを発現することで調製することができる。
例えば、本発明の配列番号２、又は配列番号４のアミノ酸配列を含むポリグリシン付加酵素は、配列番号１、又は配列番号３のポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより適当な宿主細胞を形質転換して培養することにより製造することができる。
(Production of polyglycine addition enzyme)
The polyglycine-added enzyme of the present invention is prepared by preparing a cell lysate from desired animal or plant cells by a conventional method, fractionating the fraction, and the fraction rich in the polyglycine-added enzyme by the activity measuring method of the present invention. It can be produced by selecting and purifying by salting out, precipitation, affinity column or the like. In addition, since the polyglycine addition enzyme of the present invention has the same amino acid sequence as PGK1 of a desired multicellular organism, a polynucleotide encoding PGK1 of the multicellular organism to be obtained is prepared from a cDNA library. Then, it can be prepared by expressing the polynucleotide by a conventional method.
For example, the polyglycine addition enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 of the present invention incorporates the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 into an appropriate expression vector, and an appropriate host is obtained by the expression vector. It can be produced by transforming and culturing cells.
ここで用いる発現ベクターは、本発明のポリグリシン付加酵素をコードするcDNA断片を作成し、該cDNA断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することで製造することができる。
ここで用いるベクターには、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどがある。
また、該プロモーターは、使用する宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがある。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどがあり、該宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、該宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどがあり、さらに該宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどである。
The expression vector used here can be produced by preparing a cDNA fragment encoding the polyglycine addition enzyme of the present invention and ligating the cDNA fragment downstream of the promoter in an appropriate vector.
The vectors used here include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ Examples include bacteriophages such as phages, animal viruses such as retroviruses, vaccinia viruses, and baculoviruses, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like.
The promoter may be any promoter as long as it is suitable for the host to be used. For example, when animal cells are used as the host, there are SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like. When the host is Escherichia, there are trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, T7 promoter and the like. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP When the host is yeast, such as a promoter, there are PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like. When the host is an insect cell, there are polyhedrin promoter, P10 promoter and the like.
さらに該発現ベクターには、さらに所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含むものを用いることができる。該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがある。また、必要に応じて、宿主に適したシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡシグナル配列、OmpＡシグナル配列などが、該宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、該宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、該宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用できる。このように構築したポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。 Furthermore, the expression vector may further contain an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin, and the like as desired. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene. If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention. When the host is an Escherichia bacterium, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, etc., and when the host is a Bacillus genus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc. When the host is an animal cell, an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, or the like can be used. A transformant can be produced using a vector containing a DNA encoding the polypeptide thus constructed.
ここで用いる宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、及び動物細胞などがある。
該バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法がある。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などの方法がある。昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6,47-55(1988）などに記載の方法がある。また、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法がある。このようにして、本発明のポリグリシン付加酵素をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を作製することができる。
Examples of the host used here include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
For transforming the Bacillus genus, there is a method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979). To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of There are methods such as The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978). Insect cells or insects can be transformed by, for example, a method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). In addition, in order to transform animal cells, for example, cell engineering separate volume 8 new cell engineering experiment protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Volume 52, 456 (1973). In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding the polyglycine addition enzyme of the present invention can be prepared.
該宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含くまれている。ここで炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など、また無機栄養分としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどある。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕が好ましい。
また、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
When cultivating a transformant whose host is an Escherichia or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is included therein. , Nitrogen sources, inorganics and others. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract. In addition, examples of inorganic nutrients include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
As a medium for culturing Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431] -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
Moreover, in order to make a promoter work efficiently, chemical | medical agents, such as 3 (beta) -indolyl acrylic acid, can be added, for example. When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added. When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K.L.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G.A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕がある。該培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する場合、グレイスインセクト培地(Grace's Insect Medium：Grace, T.C.C., Nature, 195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を加えた倍地などを用いる。該培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
As a medium for cultivating a transformant whose host is yeast, for example, Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA, et al., Proceedings of the National Academy -Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an insect cell, Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) plus a non-immobilized additive such as 10% bovine serum Use the ground. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
また、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などを用いる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。このようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明のポリペプチドを産生させることができる。 Moreover, when cultivating a transformant whose host is an animal cell, as a medium, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary. In this way, the polypeptide of the present invention can be produced inside the cell, the cell membrane, or extracellularly of the transformant.
上記培養物からの該ポリグリシン付加酵素の分離精製は、常法に従って行うことができる。例えば、本発明の付加酵素を培養菌体、細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体又は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などである。該緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に該付加酵素が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体又は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、又は抽出液中に含まれる該付加酵素の精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行う。これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがある。このようにして製造した本発明のポリグリシン付加酵素は、本発明の活性測定方法により活性を測定するか、又は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。 Separation and purification of the polyglycine-adding enzyme from the culture can be performed according to a conventional method. For example, when the additional enzyme of the present invention is extracted from cultured cells and cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freezing. For example, a method of obtaining a crude extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by thawing or the like. The buffer may contain a denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™. When the additional enzyme is secreted into the culture solution, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method after completion of the culture, and the supernatant is collected. Purification of the additional enzyme contained in the thus obtained culture supernatant or extract is performed by appropriately combining known separation / purification methods. These known separation / purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography And a method using the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing method. The thus produced polyglycine-added enzyme of the present invention can be confirmed by measuring the activity by the activity measuring method of the present invention, or by enzyme immunoassay or Western blotting using a specific antibody.
（細胞増殖の促進剤、又は抑制剤のスクリーニング方法）
さらに本発明は、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニング方法であって：ポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、被検物質、及び標準試料に加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法を提供する。なお、該スクリーニング方法は、前述のポリグリシン付加酵素の活性測定方法を基本的に同じ工程により行われる。
本発明の方法でスクリーニングする細胞増殖の促進剤は、特に制限されるものではなく、例えば、毛髪生育促進剤、外傷治療薬、角膜外傷治療薬など動物組織の再生を促す薬剤、神経細胞の再生剤、植物組織の選択的増殖促進剤、多細胞生物の選択的細胞分化の促進剤などを挙げることができる。また、該細胞増殖の抑制剤としては、例えば、イボの治療剤、特定の細菌、又はウイルス感染細胞の増殖抑制剤、神経変性疾患であるアルツハイマー病やパーキンソン病の治療薬、及び抗ガン剤を挙げることができる。
(Screening method for cell growth promoter or inhibitor)
Furthermore, the present invention relates to a screening method for a cell growth promoter or a cell growth inhibitor accompanying polyglycine addition to tubulin of a cell microtubule, comprising: a polyglycine addition enzyme, a labeled glycine, a test sample And a step of adding a substance and a standard sample; and a step of detecting the promotion or inhibition of the polyglycine addition reaction in the standard sample. The screening method is basically performed by the same steps as the method for measuring the activity of polyglycine-adding enzyme described above.
The cell growth promoter to be screened by the method of the present invention is not particularly limited. For example, agents that promote the regeneration of animal tissues such as hair growth promoters, trauma therapeutic agents, corneal trauma therapeutic agents, and nerve cell regeneration. Agents, selective growth promoters for plant tissues, promoters for selective cell differentiation of multicellular organisms, and the like. The cell growth inhibitor includes, for example, a wart therapeutic agent, a specific bacterial or virus-infected cell growth inhibitor, a neurodegenerative disease Alzheimer's disease or Parkinson's disease therapeutic agent, and an anticancer agent. Can be mentioned.
該スクリーニング方法で用いるポリグリシン付加酵素は、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、特に８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素である。特に、ヒト細胞、又はその抽出物を標準試料とする場合は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素が、また、マウス細胞、又はその抽出物を標準試料とする場合は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素が好ましい。
また、本発明のスクリーニング方法で用いる被検物質は、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進、又は抑制に関与する物質であれば特に制限することなく用いることができる。例えば、被検物質として、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などを挙げることができ、これら被検物質は新規な化合物であっても、公知の化合物であってもよい。
A tube containing a polypeptide having homology of 70% or more, particularly 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 used in the screening method It is a polyglycine addition enzyme for phosphorus. In particular, when a human cell or an extract thereof is used as a standard sample, a polyglycine-adding enzyme for tubulin containing a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is also used as a standard for mouse cells or an extract thereof. When a sample is used, a polyglycine addition enzyme for tubulin containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is preferable.
Moreover, the test substance used in the screening method of the present invention can be used without particular limitation as long as it is a substance involved in the promotion or suppression of cell proliferation accompanying the addition of polyglycine to tubulin in cell microtubules. . Examples of test substances include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. Even a known compound may be used.
なお、近年発展しているコンビナトリアルケミストリー（Combinatrial Chemistry、コンビケム）の手法を用い、特定の基本骨格(scaffold)に、複数の置換基を組合せて導入することで、短時間で多数かつ多様な化合物のライブラリーを形成することができる。該コンビケムで得られた化合物ライブラリーを被検物質として、本発明のスクリーニング方法を適用することにより、非常に多数の候補化合物を効率的、かつ大規模にスクリーニングすることができる。また、該化合物ライブラリーは合成分子、及び天然分子双方を含むことができる。
例えば、１０００個の化合物からなるライブラリーをスクリーニングする場合、原理的には、１０００個の化合物のすべてをマイクロタイタープレートのウエルに入れて、同時に試験することができる。このような合成分子に由来する大きなライブラリーの作製、及び同時スクリーニングを、コンビナトリアル化学の公知の方法により行うことができる（Van Breemen、Anal．Chem．69(1997)、2159〜2164、又はLam、Anticancer Drug Des．12(1997)、145〜167）。
By using combinatorial chemistry (Combinatrial Chemistry), which has been developed in recent years, a combination of multiple substituents can be introduced into a specific basic framework (scaffold) in a short time. A library can be formed. By applying the screening method of the present invention using the compound library obtained by the combichem as a test substance, a large number of candidate compounds can be screened efficiently and on a large scale. In addition, the compound library can contain both synthetic molecules and natural molecules.
For example, when screening a library of 1000 compounds, in principle, all 1000 compounds can be placed in wells of a microtiter plate and tested simultaneously. Generation of large libraries derived from such synthetic molecules and simultaneous screening can be performed by known methods of combinatorial chemistry (Van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164, or Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167).
本発明のスクリーニング方法に用いる標準試料は、動物細胞、又は植物細胞など多細胞生物由来の細胞微小管の構造タンパク質であるチューブリンを含む試料をいう。該標準試料は、使用するポリグリシン付加酵素が反応するチューブリンを含む限り特に制限なく使用することができるが、使用するポリグリシン付加酵素と同じ由来の多細胞生物から由来したものを用いるのが好ましい。また、該標準試料は、多細胞生物由来のチューブリンを含む試料であって、例えば、細胞溶解液、細胞微小管を含む特定の細胞溶解溶液の画分、又は精製されたチューブリンを含む画分のいずれであってもよい。
本発明のスクリーニング方法における、ポリグリシン付加酵素と、標識されたグリシン、標準試料に含まれるチューブリンの割合は、特に制限されないが、通常、ポリグリシン付加酵素（２unit/l）２〜８l、好ましくは約４〜６l、標識されたグリシン（１６Ci/mmol）１〜５l、好ましくは２〜４l、及びチューブリン（１mg/ml）１〜７l、好ましくは１〜３lとする。また、被検物質の適用量は、該被検物質の性質により変化するが、通常１〜１０gとすることが好ましい。
The standard sample used in the screening method of the present invention refers to a sample containing tubulin, which is a structural protein of cell microtubules derived from multicellular organisms such as animal cells or plant cells. The standard sample can be used without particular limitation as long as it contains tubulin that reacts with the polyglycine addition enzyme to be used, but it is preferable to use one derived from a multicellular organism having the same origin as the polyglycine addition enzyme to be used. preferable. The standard sample is a sample containing tubulin derived from a multicellular organism, for example, a cell lysate, a fraction of a specific cell lysis solution containing cell microtubules, or a fraction containing purified tubulin. It can be any minute.
In the screening method of the present invention, the ratio of polyglycine-adding enzyme, labeled glycine, and tubulin contained in the standard sample is not particularly limited, but usually 2 to 8 l of polyglycine-adding enzyme (2 units / l), preferably Is about 4-6 l, labeled glycine (16 Ci / mmol) 1-5 l, preferably 2-4 l, and tubulin (1 mg / ml) 1-7 l, preferably 1-3 l. Moreover, although the application amount of the test substance varies depending on the properties of the test substance, it is usually preferably 1 to 10 g.
また、本発明のスクリーニング方法においても、標準試料に含まれるチューブリンとグリシンの付加反応を行うために、Tris-HClなどの緩衝液、ＡＴＰ、MgCl2などのマグネシウム塩、及びＤＴＴを加える。通常、該付加反応を行うためには、pH７〜１０，好ましくは８〜１０とし、かつ塩濃度を２〜１２mmol程度にするのが好ましい。該反応液を調製した後、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、１５〜４５分間、好ましくは２５〜３５分間、インキュベートする。
さらに、本発明のスクリーニング方法は、前記標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程に、ポリグリシン付加酵素の反応後、支持体に固定した標準試料をトリクロロ酢酸で処理する工程を含む。該工程は、前述のＴＣＡ沈殿に相当する工程であり、支持体に固定した標準試料を、トリクロロ酢酸溶液中でインキュベートすることにより行う。該インキュベートは、常温で行うこともできるが、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させるため、低温、例えば、０〜１０℃で、１〜３０分間、好ましくは５〜１５分間で行う。また、該トリクロロ酢酸は、濃度１〜３０％、好ましくは５〜２０％のトリクロロ酢酸溶液として用いるのが好ましい。
このようにして標準試料のチューブリンに付加されたポリグリシンを固定し、標識されたポリグリシンの量を測定することにより、ポリグリシン付加酵素に対する被検物質の影響を測定することができる。なお、該スクリーニング方法で用いる標識、及びその測定方法は、前記ポリグリシン付加酵素の活性測定方法と同様なものである。
Also in the screening method of the present invention, a buffer solution such as Tris-HCl, a magnesium salt such as ATP and MgCl 2 , and DTT are added in order to perform an addition reaction between tubulin and glycine contained in a standard sample. Usually, in order to carry out the addition reaction, it is preferable that the pH is 7 to 10, preferably 8 to 10, and the salt concentration is about 2 to 12 mmol. After the reaction solution is prepared, it is incubated at 20 to 40 ° C., preferably 25 to 35 ° C., for 15 to 45 minutes, preferably 25 to 35 minutes.
Furthermore, in the screening method of the present invention, the step of detecting the promotion or suppression of the polyglycine addition reaction in the standard sample, the step of treating the standard sample immobilized on the support with trichloroacetic acid after the reaction of the polyglycine addition enzyme including. This step is a step corresponding to the above-mentioned TCA precipitation, and is performed by incubating a standard sample fixed on a support in a trichloroacetic acid solution. The incubation can be performed at room temperature, but in order to stabilize the tubulin / polyglycine complex, the incubation is performed at a low temperature, for example, 0 to 10 ° C. for 1 to 30 minutes, preferably 5 to 15 minutes. The trichloroacetic acid is preferably used as a trichloroacetic acid solution having a concentration of 1 to 30%, preferably 5 to 20%.
Thus, the influence of the test substance on the polyglycine-added enzyme can be measured by immobilizing the polyglycine added to the standard sample tubulin and measuring the amount of the labeled polyglycine. The label used in the screening method and the measurement method thereof are the same as the method for measuring the activity of the polyglycine-added enzyme.
（参考例１） ポリグルタミレース(Polyglutamylase)の活性測定法
細胞微小管のチューブリンにポリグルタミンを付加する、Regnardらが既に報告したポリグルタミレースの活性測定法１）を用いて、ポリグリシン付加酵素、ポリグリシレース活性の測定を試みた。その測定法を以下に記す。
50mM Tris-HCL(pH9.0),２mM ATP(pH7),８mM MgCl2,２．５mM DTT,１０M taxotere, L-[3H]グルタミン酸(45-55Ci/mmol),適当な濃度の未標識L-グルタミン酸、0.1mg/mlのマイクロチューブルを混合し、30℃で30分間インキュベートした。5%トリクロロ酢酸と10mMグルタミン酸を各5倍量加えることで反応を停止させ、吸引状態下でニトロセルロースにフィルターした。1%酢酸で過渡に洗浄した後、0.5mlの0.1M NaOHに浸してからシンチレーションカクテル6mlに入れて液体シンチレーターで測定した。
この測定法によりポリグルタミレース活性、ポリグリシレース活性を測定してみたところ、ポリグルタミレース活性は再現性が得られたが、ポリグリシレース活性に関しては再現性が得られないことから、上記の従来技術の活性測定方法は、ポリグリシレース活性の測定方法としては使用できないと判断した。
Using Reference Example 1 Poly-Glu Tamil race adding tubulin polyglutamic activity assay cell microtubules (Polyglutamylase), polyglutarimide Tamil race activity measuring method 1 Regnard et al previously reported), poly-glycine added Attempts were made to measure enzyme and polyglycylace activity. The measuring method is described below.
50 mM Tris-HCL (pH 9.0), 2 mM ATP (pH 7), 8 mM MgCl 2 , 2.5 mM DTT, 10 M taxotere, L- [ 3 H] glutamic acid (45-55 Ci / mmol), unlabeled L at appropriate concentration -Glutamic acid, 0.1 mg / ml microtubules were mixed and incubated at 30 ° C for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 5% each of 5% trichloroacetic acid and 10 mM glutamic acid, and filtered to nitrocellulose under suction. After transient washing with 1% acetic acid, the sample was immersed in 0.5 ml of 0.1 M NaOH, placed in 6 ml of a scintillation cocktail, and measured with a liquid scintillator.
When polyglutamylase activity and polyglycylace activity were measured by this measurement method, reproducibility of polyglutamylase activity was obtained, but reproducibility was not obtained with respect to polyglycerase activity. It was determined that the activity measuring method of the prior art cannot be used as a method for measuring polyglycylace activity.
（実施例１） ポリグリシレースの活性測定法
参考例１に記した測定方法を改良し、本発明のポリグリシレースの活性測定法を確立した。そして、下記のとおり本発明の活性測定方法によりポリグリシレースの活性を測定した。
50mM Tris-HCL(pH8.0),２mM ATP(pH7),８mM MgCl2,２．５mM DTT,１０M taxotere, L-[3H]グルタミン酸(45-55Ci/mmol)、0.1mg/mlのマイクロチューブルを混合し、30℃で30分間インキュベートした。変更点は50mM Tris-HClのpHを9.0から8.0とし、未標識のL-グルタミン酸を省いたことである。その後、該混合液をガラスフィルター（GF/Fフィルター、Whatman）にスポットし、冷却した10%トリクロロ酢酸(TCA)を適量入れたビーカーを氷水中に置き、フィルターを浸すことでTCA沈殿を起こさせた。10分間放置した後で該混合液を棄てた。このTCA沈殿を3回行った後、濾紙を敷いたブフナーロートにフィルターを乗せ、さらにその上に濾紙を敷き、吸引状態下で冷却した5%TCAを適量入れ、遊離のL-[3H]グリシンを洗い流した。この作業を3回繰り返した。次に100%エタノールを適量入れ、TCAを洗い流す作業を2回繰り返した。この洗浄したフィルターを濾紙上から取り出しアルミホイルの上に乗せ、80℃に設定したオーブンの中で10分間乾燥させた。乾燥したフィルターをシンチレーションバイアルに入れ、5mlのトルエン系シンチレーションカクテルを加え液体シンチレーターで測定した。その結果、ポリグリシレースの活性を測定することができた。
(Example 1) Polyglycylace activity measurement method The measurement method described in Reference Example 1 was improved to establish a polyglycylace activity measurement method of the present invention. And the activity of polyglycylace was measured by the activity measuring method of this invention as follows.
50 mM Tris-HCL (pH 8.0), 2 mM ATP (pH 7), 8 mM MgCl 2 , 2.5 mM DTT, 10 M taxotere, L- [ 3 H] glutamic acid (45-55 Ci / mmol), 0.1 mg / ml microtube The mixture was mixed and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. The change was that the pH of 50 mM Tris-HCl was adjusted to 9.0 to 8.0 and unlabeled L-glutamic acid was omitted. Then, the mixture is spotted on a glass filter (GF / F filter, Whatman), a beaker containing an appropriate amount of cooled 10% trichloroacetic acid (TCA) is placed in ice water, and the filter is immersed to cause TCA precipitation. It was. The mixture was discarded after standing for 10 minutes. After performing this TCA precipitation three times, place the filter on a Buchner funnel on which filter paper has been laid, lay the filter paper on it, put an appropriate amount of 5% TCA cooled under suction, and release free L- [ 3 H] Glycine was washed away. This operation was repeated three times. Next, the operation of adding an appropriate amount of 100% ethanol and washing away TCA was repeated twice. The washed filter was taken out from the filter paper, placed on an aluminum foil, and dried in an oven set at 80 ° C. for 10 minutes. The dried filter was placed in a scintillation vial, 5 ml of a toluene scintillation cocktail was added, and measurement was performed with a liquid scintillator. As a result, the activity of polyglycylace could be measured.
（実施例2） ポリグリシレースの製造
（実施例2−1） ブタ由来チューブリンの調製
ブタ脳6個（620g）をA液（5mM PIPES, 50M EGTA, 50M MgSO4）１リットルで洗浄した。脳の総量と等量の20×A液を加え、プロテアーゼインヒビターであるPMSFとロイペプチンを最終濃度0.1mMと10g/ml、さらにATPを最終濃度1mMとなるように加え、ホモゲナイズした（細胞溶解物）。60,000×g、２℃で60分間遠心分離し、分取した上清（S1）を計量した。4分の1量のグリセロールと最終濃度が1mMとなるようにATPを加え混合し、37℃の恒温水槽で35分間インキュベートすることでチューブリンを重合させた。次に27,400×g、37℃で40分間遠心分離し、分取した沈殿（P2）を計量した。4倍量の20×A液と最終濃度が0.5mMとなるようにATPを加えホモゲナイズし、氷中でインキュベートすることでチューブリンを脱重合させた。
これに最終濃度が1mMとなるようにGTPを加えてから、27,400×g、4℃で40分間遠心分離し、分取した上清（S3）を計量した。4分の1量のグリセロールと最終濃度が1mMとなるようにGTPを加え混合し、37℃の恒温水槽で35分間インキュベートした。その後、27,400×g、37℃で40分間遠心分離し、分取した沈殿を計量した。3倍量の20×A液と最終濃度が1mMとなるように還元剤DTTを加えホモゲナイズすることでブタ由来チューブリンの粗精製物（P4）を得た。
(Example 2) Production of polyglycylace (Example 2-1) Preparation of pig-derived tubulin Six pig brains (620 g) were washed with 1 liter of solution A (5 mM PIPES, 50 M EGTA, 50 M MgSO 4 ). A 20xA solution equal to the total amount of the brain was added, and protease inhibitors PMSF and leupeptin were added to a final concentration of 0.1 mM and 10 g / ml, and ATP was added to a final concentration of 1 mM, and homogenized (cell lysate). . Centrifugation was performed at 60,000 × g and 2 ° C. for 60 minutes, and the collected supernatant (S1) was weighed. One-fourth volume of glycerol and ATP were added to a final concentration of 1 mM, mixed, and incubated in a constant temperature water bath at 37 ° C. for 35 minutes to polymerize tubulin. Next, centrifugation was performed at 27,400 × g and 37 ° C. for 40 minutes, and the collected precipitate (P2) was weighed. Tubulin was depolymerized by adding ATP to a 4-fold amount of 20 × A solution and ATP to a final concentration of 0.5 mM, homogenizing, and incubating in ice.
GTP was added to this so that the final concentration was 1 mM, followed by centrifugation at 27,400 × g and 4 ° C. for 40 minutes, and the collected supernatant (S3) was weighed. GTP was added to a quarter amount of glycerol and a final concentration of 1 mM, mixed, and incubated for 35 minutes in a 37 ° C. constant temperature water bath. Thereafter, the mixture was centrifuged at 27,400 × g and 37 ° C. for 40 minutes, and the collected precipitate was weighed. A roughly purified porcine-derived tubulin (P4) was obtained by adding 3 times the amount of 20 × A solution and homogenizing the reducing agent DTT to a final concentration of 1 mM.
（実施例2−2） ブタ由来チューブリン分画を用いたポリグリシレースの活性測定法
実施例2−1で得たP2をP4と同様に懸濁し、細胞溶解物、S1、P2、S3、P4について、実施例１と同じ方法でポリグリシレース活性を測定した。すなわち、ポリグリシレース活性測定用の混合液に所定量の各分画を加え、30分間、30℃でインキュベートし、実施例１の測定方法に従い活性を測定した。その結果、図２、及び表１に示すように精製が進んだP4においても十分な比活性が得られていることが明らかとなった。なお、ここで精製の進んだP４は、全画分を含む細胞溶解物と比較しても同様の比活性を有していた。
(Example 2-2) Polyglycylace activity measurement method using porcine-derived tubulin fraction P2 obtained in Example 2-1 was suspended in the same manner as P4, and cell lysate, S1, P2, S3, About P4, the polyglycylace activity was measured by the same method as Example 1. That is, a predetermined amount of each fraction was added to the mixture for measuring polyglycylace activity, incubated at 30 ° C. for 30 minutes, and the activity was measured according to the measurement method of Example 1. As a result, as shown in FIG. 2 and Table 1, it was clarified that sufficient specific activity was obtained even in P4 which had been purified. In addition, P4 which refine | purified here had the same specific activity also compared with the cell lysate containing all the fractions.
（実施例2−3） 高比活性を有する分画(P4)からのポリグリシレースの精製
ブタ由来チューブリン粗精製物P4に、0.1% TX-100を加え、50mM BICINE（pH9.0）,１mM 2-メルカプトエタノールを外液として一晩透析した。予めA液（50mM BICINE（pH9.0）,１mM EGTA,１mM MgSO4,１mM DTT,０．０１% TX-100,０．１M NaCl）で平衡化しておいたホスホセルロースカラム（ベッドボリューム3ml）に注入し、A液3mlでカラムを6回洗浄した。次に0.3M NaClを加えたA液1mlで5回溶出した。そして1.0M NaCl溶液を加えたA液1mlで5回溶出した。これらの溶出された分画についてポリグリシレース活性を測定したところ、1.0M NaClにより溶出された分画において高い活性が得られた。また図３に示すように電気泳動ゲルで50kDa付近にチューブリンの濃いバンドが見られた。前記５回溶出分画から3つの分画を選んだ。
また、図４に示すように、0.3M NaCl、及び1.0M NaClのそれぞれの濃度で５０kDa付近にバンドが見られるが、0.3M NaClのバンドの抽出物では、117cpmの活性しか見られなかったのに対し、0.1M NaClのバンドの抽出物では608cpmと極めて高い活性が得られた。なお、電気泳動には12%ポリアクリルアミドゲルを用い、染色には和光純薬製のクイックCBB（クーマシーブリリアントブルー）を使用した。
(Example 2-3) Purification of polyglycylace from fraction (P4) having high specific activity To crude porcine tubulin P4, 0.1% TX-100 was added, and 50 mM BICINE (pH 9.0), Dialyzed overnight with 1 mM 2-mercaptoethanol as an external solution. A phosphocellulose column (bed volume 3 ml) equilibrated with solution A (50 mM BICINE (pH 9.0), 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4 , 1 mM DTT, 0.01% TX-100, 0.1 M NaCl) in advance. The column was washed 6 times with 3 ml of solution A. Next, elution was performed 5 times with 1 ml of solution A supplemented with 0.3 M NaCl. Elution was performed 5 times with 1 ml of solution A supplemented with 1.0 M NaCl solution. When polyglycylace activity was measured for these eluted fractions, high activity was obtained in the fraction eluted with 1.0 M NaCl. In addition, as shown in FIG. 3, a dark band of tubulin was observed around 50 kDa on the electrophoresis gel. Three fractions were selected from the five fractions eluted.
In addition, as shown in FIG. 4, bands were observed in the vicinity of 50 kDa at respective concentrations of 0.3 M NaCl and 1.0 M NaCl, but the extract of the 0.3 M NaCl band showed only 117 cpm activity. In contrast, an extract with a band of 0.1 M NaCl showed an extremely high activity of 608 cpm. In addition, 12% polyacrylamide gel was used for electrophoresis, and Quick CBB (Coomassie Brilliant Blue) manufactured by Wako Pure Chemical Industries was used for staining.
これらの分画をNAP-10カラムにより脱塩、及びB液（10mM KH2PO4（pH6.8）,０．０１% TX-100,１mM DTT）に交換し、予めB液で平衡化しておいたハイドロキシアパタイトカラム（ベッドボリューム1ml）に注入し、B液250lで4回洗浄した。そしてリニアーグラジエントによりB液のKH2PO4濃度を10mMから100mMへ上昇させることにより溶出された分画を1mlずつ分取した。これらの溶出された分画についてポリグリシレース活性を測定したところ、KH2PO4濃度が90mM前後で溶出された分画において高い活性が得られたため3つの分画を選んだ。図５に示すように、KH2PO4濃度が90mM前後で溶出された分画において、矢印→で示す42kDa付近のバンドをポリグリシレースと判断した。この電気泳動では10.5%ポリアクリルアミドゲルを用い、染色は第一化学薬品(株)の銀染色キットを使用した。
選んだ分画を予めC液（100mM KH2PO4（pH6.8）,０．０１% TX-100,１mM DTT）で平衡化しておいたブルーセファロースカラム（ベッドボリューム300l）に注入し、リニアーグラジエントによりC液に1M NaCl溶液を加えていくことにより溶出された分画を500lずつ分取した。これらの溶出された分画についてポリグリシレース活性を測定したところ、図６に示すように、電気泳動したゲル上の矢印→で示される0.3M NaCl前後で溶出された分画で高いポリグリシレース活性が得られたため2つの分画を選んだ。
選んだ分画を1つにまとめアセトン沈殿、そして引き続きTCA沈殿を行い、作製した10.5%ポリアクリルアミドゲルのウェルに注入し、SDS-PAGE電気泳動を行い、銀染色した。その結果42kDa付近にバンドが得られた。
These fractions were desalted with a NAP-10 column, exchanged with B solution (10 mM KH 2 PO 4 (pH 6.8), 0.01% TX-100, 1 mM DTT), and equilibrated with B solution in advance. The solution was poured into a placed hydroxyapatite column (bed volume 1 ml) and washed 4 times with 250 l of solution B. The fraction eluted by raising the KH 2 PO 4 concentration of solution B from 10 mM to 100 mM by a linear gradient was fractionated by 1 ml. When polyglycylace activity was measured for these eluted fractions, three fractions were selected because high activity was obtained in fractions eluted at a KH 2 PO 4 concentration of around 90 mM. As shown in FIG. 5, in the fraction eluted at a KH 2 PO 4 concentration of about 90 mM, a band around 42 kDa indicated by an arrow → was judged as polyglycylace. In this electrophoresis, 10.5% polyacrylamide gel was used, and staining was performed using a silver staining kit of Daiichi Chemicals Co., Ltd.
The selected fraction is injected into a blue sepharose column (bed volume 300 l) that has been equilibrated with solution C (100 mM KH 2 PO 4 (pH 6.8), 0.01% TX-100, 1 mM DTT) in advance. The fraction eluted by adding a 1M NaCl solution to C solution by a gradient was fractionated 500 l each. When the polyglycylase activity was measured for these eluted fractions, as shown in FIG. 6, the fraction eluted at around 0.3 M NaCl indicated by the arrow → on the electrophoresed gel showed high polyglycerase. Two fractions were chosen because activity was obtained.
The selected fractions were combined into one and subjected to acetone precipitation, followed by TCA precipitation, injected into the prepared 10.5% polyacrylamide gel well, subjected to SDS-PAGE electrophoresis, and silver stained. As a result, a band was obtained around 42 kDa.
該バンドを切り出し、プロテアーゼ消化を行い、切断されたポリペプチドをHPLCにより分離・分取し、プロテインシークエンサーにより分析した。検出されたポリペプチド断片のアミノ酸配列は下記の通りであった。
(1) YSLEPVAVELK （配列番号：５）
(2) LGDVYVNDAFGT （配列番号：６）
(3) DVLFK （配列番号：７）
これらのアミノ酸配列を、データベース(NCBI)で検索した結果、ホスホグリセレートカイネース（PGK）であることが判明した。PGKは生体内全体に多く発現しているPGK1と精子に特異的に発現しているPGK2が存在するが、今回はブタの脳を用いていることからPGK1であると判断した。すなわち、これまでホスホグリセレートカイネース１（PGK1）が、同時に、翻訳後修飾において、細胞微小管のチューブリンに特異的にポリグリシンを付加する酵素であることが明らかになった。
The band was cut out, digested with protease, and the cleaved polypeptide was separated and collected by HPLC and analyzed by a protein sequencer. The amino acid sequence of the detected polypeptide fragment was as follows.
(1) YSLEPVAVELK (SEQ ID NO: 5)
(2) LGDVYVNDAFGT (SEQ ID NO: 6)
(3) DVLFK (SEQ ID NO: 7)
As a result of searching these amino acid sequences in the database (NCBI), it was found to be phosphoglycerate kinase (PGK). PGK1 is highly expressed throughout the body and PGK2 is specifically expressed in sperm, but this time, it was judged to be PGK1 because pig brain was used. That is, it has been clarified that phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) is an enzyme that specifically adds polyglycine to tubulin of cell microtubules at the same time in post-translational modification.
本発明によりポリグリシレースの活性測定法を確立したことで、チューブリンC末端側に存在するグルタミン酸へのグリシン付加を行う現象であるポリグリシン付加反応を検出することが可能となった。該チューブリンは細胞内で分子を輸送するモータータンパク質に対する、いわばレール的な働きをするタンパク質である。したがって、該ポリグリシン付加反応は、そのモータータンパク質の方向性を決定するものと考えられる。
該ポリグリシンの活性測定法を確立したことから、今後、ポリグリシレースの活性を制御する薬剤などの開発に利用することが可能となった。これにより細胞内における分子輸送の方向性の制御が可能となる。
例えば、現在、死亡原因の上位にあるガン治療に有用である。ガン治療に用いられている薬剤の多くはガン細胞だけを攻撃するのではなく、全身を攻撃するものであり、その中でガン細胞に特異的に攻撃する薬剤は今のところわずかである。今回確立したポリグリシレースの活性測定法を用いて、ポリグリシン付加反応を制御する薬剤がガン細胞を特異的に攻撃することができれば、ガンの治療に関して大変有用である。
このように、本発明は、癌を含む細胞増殖制御物質を検索する上で、すなわち創薬において、極めて重要な標的ポリペプチド、及びスクリーニング方法を提供するものである。
By establishing a method for measuring polyglycylace activity according to the present invention, it has become possible to detect a polyglycine addition reaction, which is a phenomenon of adding glycine to glutamic acid present on the tubulin C-terminal side. Tubulin is a protein that functions like a rail for motor proteins that transport molecules in cells. Therefore, the polyglycine addition reaction is considered to determine the directionality of the motor protein.
Since the method for measuring polyglycine activity has been established, it has become possible to use it for the development of drugs that control the activity of polyglycylace. This makes it possible to control the direction of molecular transport within the cell.
For example, it is useful for the treatment of cancer that is currently the top cause of death. Many of the drugs used for cancer treatment do not attack only cancer cells, but attack the whole body, and only a few drugs specifically attack cancer cells so far. If the drug that controls the polyglycine addition reaction can specifically attack cancer cells using the established method for measuring polyglycylase activity, it will be very useful for cancer treatment.
Thus, the present invention provides a target polypeptide and a screening method that are extremely important in searching for cell growth regulators including cancer, that is, in drug discovery.
(配列番号の示す配列の説明）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
(配列番号１) 本発明のヒトチューブリンをコードするヌクレオチド配列を示す。該配列は、NCBI Accession No．NM_000291(Version NM_000291.2)のヒトPGK１(Phosphoglycerate kinase１)のヌクレオチド配列に対応する。
(配列番号２) 本発明のヒトチューブリンのアミノ酸配列を示す。該配列は、NCBI Accession No．NM_000291(Version NM_000291.2)のヒトPGK１(Phosphoglycerate kinase１)のアミノ酸配列に対応する。
(配列番号３) 本発明のマウスチューブリンをコードするヌクレオチド配列を示す。該配列は、NCBI Accession No．NM_008828(Version NM_000291.1)のマウスPGK１(Phosphoglycerate kinase１)のヌクレオチド配列に対応する。
(配列番号４) 本発明のマウスヒトチューブリンのアミノ酸配列を示す。該配列は、NCBI Accession No．NM_008828(Version NM_000291.1)のマウスPGK１(Phosphoglycerate kinase１)のアミノ酸配列に対応する。
(配列番号５) 実施例２−３で得られた、ブタ由来チューブリンのポリペプチドフラグメント(1)のアミノ酸配列である。
(配列番号６) 実施例２−３で得られた、ブタ由来チューブリンのポリペプチドフラグメント(2)のアミノ酸配列である。
(配列番号７) 実施例２−３で得られた、ブタ由来チューブリンのポリペプチドフラグメント(3)のアミノ酸配列である。
(Description of the sequence indicated by the sequence number)
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
(SEQ ID NO: 1) This shows the nucleotide sequence encoding human tubulin of the present invention. The sequence is NCBI Accession No. This corresponds to the nucleotide sequence of human PGK1 (Phosphoglycerate kinase 1) of NM_000291 (Version NM_000291.2).
(SEQ ID NO: 2) This shows the amino acid sequence of human tubulin of the present invention. The sequence is NCBI Accession No. This corresponds to the amino acid sequence of human PGK1 (Phosphoglycerate kinase 1) of NM_000291 (Version NM_000291.2).
(SEQ ID NO: 3) This shows the nucleotide sequence encoding mouse tubulin of the present invention. The sequence is NCBI Accession No. This corresponds to the nucleotide sequence of mouse PGK1 (Phosphoglycerate kinase 1) of NM_008828 (Version NM_000291.1).
(SEQ ID NO: 4) This shows the amino acid sequence of mouse human tubulin of the present invention. The sequence is NCBI Accession No. This corresponds to the amino acid sequence of mouse PGK1 (Phosphoglycerate kinase 1) of NM_008828 (Version NM_000291.1).
(SEQ ID NO: 5) This is the amino acid sequence of the polypeptide fragment (1) of porcine tubulin obtained in Example 2-3.
(SEQ ID NO: 6) This is the amino acid sequence of the polypeptide fragment (2) of porcine tubulin obtained in Example 2-3.
(SEQ ID NO: 7) This is the amino acid sequence of the polypeptide fragment (3) of porcine tubulin obtained in Example 2-3.
Claims (18)
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、被検物質、及び標準試料に加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法。 A method of screening for an agent for promoting cell growth or an inhibitor for inhibiting cell proliferation associated with addition of polyglycine to tubulin in a cell microtubule:
A step of adding to the polyglycine addition enzyme according to any one of claims 1 to 5, a labeled glycine, a test substance, and a standard sample; and the promotion or suppression of the polyglycine addition reaction in the standard sample is detected. A screening method comprising the steps of:
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