JP2005192538A - New creatinine amidinohydrolase, method for producing the same and use of the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、その製法及び該酵素を使用するクレアチンまたはクレアチニン定量用試薬に関する。 The present invention relates to a novel creatine amidinohydrolase, a method for producing the same, and a reagent for quantification of creatine or creatinine using the enzyme.
クレアチニンおよびクレアチンは血液または尿中に見い出され、その量を迅速かつ正確に検出測定することは、疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨人症、強直性筋異栄養症などを診断するのに非常に重要である。このような診断を行うために、血液または尿中のクレアチン及びクレアチニンを定量することは頻繁に行われている。
従来のクレアチンの定量法としては、試料中のクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレアチンを定量する。また、クレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレアチニンを定量する方法などがある。
一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼは微生物界に広く見い出されており、既に工業的に製造され、臨床検査薬として使用されている。
Creatinine and creatine are found in the blood or urine, and the rapid and accurate detection and measurement of the amount diagnoses diseases such as uremia, chronic nephritis, acute nephritis, giantism, ankylosing myopathy Very important to. In order to make such a diagnosis, quantification of creatine and creatinine in blood or urine is frequently performed.
As a conventional method for quantifying creatine, creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase are allowed to act on creatine in a sample, and the generated hydrogen peroxide is measured by hydrogen peroxide measuring means to quantify creatine in the sample. In addition, there is a method in which creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase and sarcosine oxidase are allowed to act on creatinine, and the generated hydrogen peroxide is measured by a hydrogen peroxide measuring means to quantify creatinine in a sample.
On the other hand, creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, and sarcosine oxidase are widely found in the microbial community, and are already industrially produced and used as clinical diagnostics.
しかしながら、公知の各種菌体から製造されたクレアチンアミジノヒドロラーゼは熱安定性が低く、またクレアチンに対するKm値も大きかった。例えばバチルス属由来の酵素(特公昭61−17465号公報)は、熱安定性は40℃以下と低い。さらにシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチンに対する見かけのKm値は1.33mMと小さいが(ArchivesBiochemistry and Biophysics 177, 508-515 (1976))、活性測定法が異なっており、臨床検査薬で汎用されているザルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼを共役酵素として用いた活性測定法でのクレアチンに対するKm値は不明であった。コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、アクチノバチルス属、バチルス属由来の酵素(特公平3−76915号公報)は、熱安定性は50℃以下であるが、クレアチンに対するKm値は約20mMと大きかった。
上記の問題点を解決するため、本発明者らは既にアルカリゲネス(Alcaligenes)属に属する細菌が熱安定性に優れ、かつ、クレアチンに対するKm値が比較的小さい(Km値:約15.2)クレアチンアミジノヒドロラーゼを生産することを見い出した(特願平6−63363号)。さらに、該菌株よりクレアチンに対するKm値の比較的小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を単離し、グラム陰性細菌を宿主として、大量に該酵素を生産する技術を確立した(特願平7−117283号)。
また、同じアルカリゲネス属細菌から、高pH領域において安定であり、また、Km値の小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼが報告されている(特開平7−170979号公報)。
However, creatine amidinohydrolase produced from various known microbial cells has low heat stability and a large Km value for creatine. For example, an enzyme derived from the genus Bacillus (Japanese Patent Publication No. 61-17465) has a low thermal stability of 40 ° C. or lower. Furthermore, the apparent Km value for Pseudomonas putida is as low as 1.33 mM for creatine (ArchivesBiochemistry and Biophysics 177, 508-515 (1976)), but the activity measurement method is different and is widely used in clinical diagnostics. The Km value for creatine in an activity measurement method using sarcosine oxidase and peroxidase as a conjugate enzyme was unknown. The enzymes derived from Corynebacterium, Micrococcus, Actinobacillus, and Bacillus (Japanese Patent Publication No. 3-76915) have a thermal stability of 50 ° C. or less, but the Km value for creatine was as large as about 20 mM. .
In order to solve the above problems, the present inventors have already demonstrated that bacteria belonging to the genus Alcaligenes are excellent in thermal stability and have a relatively small Km value for creatine (Km value: about 15.2). It has been found that amidinohydrolase is produced (Japanese Patent Application No. 6-63363). Furthermore, a creatine amidinohydrolase gene having a relatively low Km value for creatine was isolated from the strain, and a technique for producing the enzyme in large quantities using a gram-negative bacterium as a host was established (Japanese Patent Application No. 7-117283).
Further, a creatine amidinohydrolase that is stable in a high pH range and has a small Km value has been reported from the same Alkagenes bacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 7-170979).
しかし、これらのクレアチンアミジノヒドロラーゼは、一般的な臨床検査薬である酵素としては、まだKm値が大きく、更にKm値の小さい、望ましくは約15.0以下のクレアチンアミジノヒドロラーゼが要望されていた。 However, these creatine amidinohydrolases have been demanded as creatine amidinohydrolase having a large Km value and a small Km value, preferably about 15.0 or less, as an enzyme that is a general clinical test drug.
本発明者らは上記目的を達成するために、鋭意検討した結果、アルカリゲネス属由来の上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用い、蛋白工学的手法により、クレアチンに対するKm値のより小さい新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを創出することに成功した。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have created a novel creatine amidinohydrolase having a smaller Km value for creatine by a protein engineering technique using the creatine amidinohydrolase gene derived from the genus Alkagenes. Succeeded in doing.
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。 That is, the present invention is a novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties.
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約3.5〜10.0mM
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5
また、本発明は下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生物を栄養培地にて培養し、新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とする新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼの製造法である。
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 3.5 to 10.0 mM
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
The present invention also provides a novel creatine amidinohydrolase production method characterized by culturing a microorganism that produces a novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties in a nutrient medium and collecting the novel creatine amidinohydrolase: is there.
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約3.5〜10.0mM
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5
本発明は、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチン定量用試薬である。
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 3.5 to 10.0 mM
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
The present invention is a reagent for quantifying creatine in a sample, comprising the creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and a composition for detecting hydrogen peroxide.
また、本発明はクレアチニンアミドヒドロラーゼ、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチニン定量用試薬である。 The present invention also provides a reagent for quantifying creatinine in a sample, comprising creatinine amide hydrolase, the creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, and a composition for detecting hydrogen peroxide.
本発明により診断薬用酵素として有用な、Km値の小さい新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを創出し、工業的に大量に該クレアチンアミジノヒドロラーゼを生産できる。 According to the present invention, a novel creatine amidinohydrolase having a small Km value that is useful as an enzyme for diagnostic drugs can be created, and the creatine amidinohydrolase can be produced industrially in large quantities.
本発明の一実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。 One embodiment of the present invention is a novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties:
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約4.5±1.0
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5
また、別な実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 4.5 ± 1.0
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
Another embodiment is a novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties.
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約6.5±1.0
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5
さらに、別な実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 6.5 ± 1.0
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
Furthermore, another embodiment is a novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties:
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約9.0±1.0
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5
本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法の1つは、野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白工学的手法により、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べてクレアチンに対するKm値の小さくなった新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法である。
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 9.0 ± 1.0
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
One of the methods for producing the creatine amidinohydrolase of the present invention is to introduce a mutation into a gene encoding wild type creatine amidinohydrolase, and to increase the Km value for creatine as compared with wild-type creatine amidinohydrolase by a protein engineering technique. This is a method for producing a reduced novel creatine amidinohydrolase.
変異を導入するための野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一実施態様では、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes
faecalis)TE3581(FERM P−14237)由来の配列表・配列番号2のクレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用いた。
The gene encoding wild-type creatine amidinohydrolase for introducing the mutation is not particularly limited, but in one embodiment of the present invention, Alcaligenes faecalis (Alcaligenes
faecalis) The creatine amidinohydrolase gene of SEQ ID NO: 2 derived from TE3581 (FERM P-14237) was used.
本発明の別な実施態様は、配列表・配列番号1に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入して、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べてクレアチンに対するKm値の小さくなった新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する。 Another embodiment of the present invention is a novel creatine having a reduced Km value for creatine as compared to wild-type creatine amidinohydrolase by introducing a mutation into the gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 Amidinohydrolase is produced.
野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は、既知のいかなる方法でも用いることができる。例えば、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子DNAと変異源となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などから、蛋白工学的な手法、例えばPCR法や部位特異的変異などの方法を用いることができる。また、遺伝子修復機構が欠損されたため、高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸菌を用いたinvivoでの変異の導入も可能である。 Any known method can be used for introducing a mutation into the wild-type creatine amidinohydrolase gene. For example, protein engineering techniques such as PCR and site-specific mutagenesis can be used, such as a method of contacting wild-type creatine amidinohydrolase gene DNA with a drug as a mutation source or a method using ultraviolet irradiation. In addition, since the gene repair mechanism is deficient, it is also possible to introduce mutations in vivo using E. coli, in which mutations occur frequently in genes.
上記のようにして得られた変異クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を例えば大腸菌に形質転換した後、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地(J.Ferment. Bioeng.,Vol.76 No.2 77-81(1993)) に塗布し、発色の強いコロニーを選抜する。選抜したコロニーは、栄養培地、例えばLB培地や2×YT培地に接種し、37℃で一晩培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。
菌体を破砕する方法は、公知のいかなる手法を用いても良く、例えば超音波処理やガラスビーズ破砕の様な物理的破砕法やリゾチームの様な溶菌酵素を用いる方法が利用できる。この粗酵素液を用いて、2種類の基質濃度の異なる活性測定反応液によりクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定し、両者の活性比率を野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼと比較することにより、クレアチンに対するKm値の小さくなったクレアチンアミジノヒドロラーゼをスクリーニングすることができる。
上記方法により選抜された菌株から精製クレアチンアミジノヒドロラーゼを取得する方法は、公知のいかなる手法を用いても良く、例えば下記方法がある。
栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から硫安沈澱によりクレアチンアミジノヒドロラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスG−25(ファルマシア・バイオテク)ゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
この操作の後、オクチルセファロースCL−6B(ファルマシア・バイオテク)カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化される。
本発明において使用する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生物としては、エシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M1)(FERM BP−5374)、エシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M2)(FERM BP−5375)、エシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M3)(FERM BP−5376)が例示される。
これらの微生物を培養し、該培養物から本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを採取する方法は特に限定されるものではなく、通常の方法に従う。
本発明の上記製法により得られた新規クレアチンアミジノヒドロラーゼは、下記理化学的性質を有する。
After transforming the mutant creatine amidinohydrolase gene obtained as described above into, for example, E. coli, an agar medium for detecting creatine amidinohydrolase activity (J. Ferment. Bioeng., Vol. 76 No. 2 77-81 (1993) ) And select colonies with strong color development. The selected colonies are inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 × YT medium, cultured at 37 ° C. overnight, and then disrupted to extract the crude enzyme solution.
Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells. For example, a physical crushing method such as ultrasonic treatment or glass bead crushing or a method using a lytic enzyme such as lysozyme can be used. Using this crude enzyme solution, the creatine amidinohydrolase activity was measured with two types of activity measurement reaction solutions with different substrate concentrations, and the ratio of both was compared with that of wild-type creatine amidinohydrolase, thereby reducing the Km value for creatine. The resulting creatine amidinohydrolase can be screened.
As a method for obtaining purified creatine amidinohydrolase from a strain selected by the above method, any known method may be used, for example, the following method.
After collecting the cells obtained by culturing in a nutrient medium, the crude enzyme solution is obtained by crushing and extraction by enzymatic or physical crushing methods. A creatine amidinohydrolase fraction is recovered from the obtained crude enzyme extract by ammonium sulfate precipitation. This crude enzyme solution can be desalted by a method such as Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) gel filtration.
After this operation, separation and purification can be performed by octyl sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. This purified enzyme preparation is purified to such an extent that it shows an almost single band by SDS-PAGE.
Examples of microorganisms that produce a novel creatine amidinohydrolase used in the present invention include Escherichia coli JM109 (pCRH273M1) (FERM BP-5374), Escherichia coli JM109 (pCRH273M2) (FERM BP-5375), and Escherichia coli JM109. pCRH273M3) (FERM BP-5376).
The method for culturing these microorganisms and collecting the creatine amidinohydrolase of the present invention from the culture is not particularly limited, and follows a normal method.
The novel creatine amidinohydrolase obtained by the above production method of the present invention has the following physicochemical properties.
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約3.5〜10.0mM
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5
本発明におけるKm値は、ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対するKm値である。従来のシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチンに対する見かけのKm値は1.33mMと小さいが(ArchivesBiochemistry and Biophysics 177, 508-515
(1976))、活性測定法は、反応液中の残存したクレアチンをα−ナフトールとジアセチルにより定量する方法であり、臨床検査薬で汎用されているザルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼを共役酵素として用いた活性測定法でのクレアチンに対するKm値は不明であった。
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 3.5 to 10.0 mM
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
The Km value in the present invention is a Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and activity is measured. The conventional enzyme derived from Pseudomonas putida has a small apparent Km value for creatine of 1.33 mM (ArchivesBiochemistry and Biophysics 177, 508-515).
(1976)), the activity measurement method is a method for quantifying the remaining creatine in the reaction solution with α-naphthol and diacetyl, and the activity using sarcosine oxidase and peroxidase, which are widely used in clinical test drugs, as a conjugate enzyme The Km value for creatine in the measurement method was unknown.
本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼは、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成物を組み合わせて、クレアチンの測定に使用することができる。またクレアチニンアミドヒドロラーゼを共存させて、クレアチニンを定量することができる。 The creatine amidinohydrolase of the present invention can be used for measuring creatine by combining sarcosine oxidase and a composition for detecting hydrogen peroxide. Creatinine can be quantified in the presence of creatinine amide hydrolase.
本発明の試料中のクレアチン定量用試薬は、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有する。 The creatine quantification reagent in the sample of the present invention contains the creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and the composition for detecting hydrogen peroxide.
本発明の試料中のクレアチニン定量用試薬は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有する。 The reagent for quantifying creatinine in the sample of the present invention contains creatinine amide hydrolase, the above creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, and a composition for detecting hydrogen peroxide.
本発明のクレアチンまたはクレアチニンの定量に使用するザルコシンオキシダーゼは、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、マイクロコッカス属、バチルス属等の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販されている。 The sarcosine oxidase used for quantification of creatine or creatinine of the present invention can be obtained from microorganisms of origin such as Arthrobacter, Corynebacterium, Alkagenes, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, etc. Some of these are already on the market.
クレアチニンアミドヒドロラーゼとしては、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、ペニシリウム属等の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販されている。 Creatinine amide hydrolase can be obtained from microorganisms of the genus Pseudomonas, Flavobacterium, Alkagenes, Penicillium, and some of these are already commercially available.
過酸化水素検出用組成物はペルオキシダーゼ活性を有する酵素及び色原体、緩衝液を含む。ペルオキシダーゼ活性を有する酵素としては、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ブロムペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ等が挙げられる。色原体は更に水素受容体およびカプラーよりなる。水素受容体は過酸化水素、ペルオキシダーゼ、カプラーとの反応に際し、水素を受容する化合物であれば良く、例えば4−アミノアンチピリン、3−メチル−2−ベンソチアゾリン−ヒドラジン誘導体等が挙げられる。またカプラーとしては、アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トルイジン(TOOS)などのアニリン誘導体、フェノール、p−クロロフェノールなどのフェノール誘導体が挙げられる。 The composition for detecting hydrogen peroxide includes an enzyme having peroxidase activity, a chromogen, and a buffer. Examples of the enzyme having peroxidase activity include peroxidase, haloperoxidase, bromoperoxidase, lactoperoxidase, myeloperoxidase and the like. The chromogen further comprises a hydrogen acceptor and a coupler. The hydrogen acceptor may be a compound that accepts hydrogen in the reaction with hydrogen peroxide, peroxidase, or a coupler, and examples thereof include 4-aminoantipyrine, 3-methyl-2-benzthiazoline-hydrazine derivatives, and the like. Examples of the coupler include aniline derivatives such as aniline and N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS), and phenol derivatives such as phenol and p-chlorophenol.
本発明のクレアチン定量用試薬中、各成分の好ましい量はクレアチンアミジノヒドロラーゼ約5〜300U/ml、ザルコシンオキシダーゼ約1〜100U/ml、ペルオキシダーゼ約0.01〜50U/ml、水素受容体約0.1〜10mM、カプラー約0.1〜50mMである。 In the reagent for quantifying creatine of the present invention, preferred amounts of each component are about 5 to 300 U / ml of creatine amidinohydrolase, about 1 to 100 U / ml of sarcosine oxidase, about 0.01 to 50 U / ml of peroxidase, about 0 of hydrogen acceptor. 1 to 10 mM, coupler about 0.1 to 50 mM.
本発明のクレアチニン定量用試薬中、各成分の好ましい量はクレアチニンアミドヒドロラーゼ約10〜300U/ml、クレアチンアミジノヒドロラーゼ約10〜300U/ml、ザルコシンオキシダーゼ約1〜100U/ml、ペルオキシダーゼ約0.01〜50U/ml、水素受容体約0.1〜10mM、カプラー約0.1〜50mMである。 In the reagent for quantifying creatinine of the present invention, preferable amounts of each component are about 10 to 300 U / ml of creatinine amide hydrolase, about 10 to 300 U / ml of creatine amidinohydrolase, about 1 to 100 U / ml of sarcosine oxidase, about 0.01 of peroxidase. ˜50 U / ml, hydrogen acceptor about 0.1-10 mM, coupler about 0.1-50 mM.
本発明のクレアチンまたはクレアチニン定量用試薬は、通常、pH約6〜8の緩衝液とともに使用する。例えばリン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。 The creatine or creatinine quantification reagent of the present invention is usually used together with a buffer solution having a pH of about 6-8. For example, phosphate buffer, Good buffer, Tris buffer and the like can be mentioned.
本発明の試薬には必要によりアスコルビン酸オキシダーゼまたはカタラーゼを添加してもよい。更に本発明の試薬には酵素反応または呈色反応を円滑に行わせるために他の化合物を添加しても良い。このような化合物としては、例えば安定化剤、界面活性剤、賦形剤等が挙げられる。 Ascorbate oxidase or catalase may be added to the reagent of the present invention as necessary. Furthermore, other compounds may be added to the reagent of the present invention in order to smoothly perform an enzyme reaction or a color reaction. Examples of such compounds include stabilizers, surfactants, excipients and the like.
本発明は以下の測定反応を利用する。 The present invention utilizes the following measurement reaction.
生成したキノンイミン色素は通常、500〜650nmの波長で吸光度測定を行う。クレアチンの定量法としては、エンド法およびレート法で行われるが、エンド法を用いるのが一般的である。 The produced quinoneimine dye is usually subjected to absorbance measurement at a wavelength of 500 to 650 nm. The creatine is quantified by the endo method and the rate method, but the endo method is generally used.
本発明のKm値が小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼは、従来の酵素に比べて、クレアチンまたはクレアチニンの定量において、検査試薬中の使用酵素量を約1/3〜1/4に減少させることが可能であり、かつ、反応後半の反応性が良好となる。 The creatine amidinohydrolase having a small Km value according to the present invention can reduce the amount of enzyme used in a test reagent to about 1/3 to 1/4 in the quantification of creatine or creatinine as compared with conventional enzymes. And the reactivity in the second half of the reaction is improved.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
実施例中、クレアチンアミジノヒドロラーゼの活性測定は以下のようにして行った。なお、本発明の酵素活性の定義は、下記条件下に1分間に1μモルのザルコシンを生成する酵素量を1単位(U)とする。
反応混液組成
0.3M HEPES pH7.6
0.005% 4アミノアンチピリン
0.015% フェノール
1.8 % クレアチン
6U/ml ザルコシンオキシダーゼ
6U/ml ペルオキシダーゼ
上記反応混液3mlをキュベット(d=1cm)に取り、37℃で約3分間予備加温する。次に酵素液0.1mlを加え、緩やかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計で500nmの吸光度変化を5分間記録し、その2〜5分の直線部分から1分間あたりの吸光度変化を求める(△ODテスト)。
In the examples, the activity of creatine amidinohydrolase was measured as follows. In addition, the definition of the enzyme activity of this invention makes the amount of enzyme which produces | generates 1 micromol sarcosine in 1 minute on the following conditions as 1 unit (U).
Reaction mixture composition 0.3M HEPES pH 7.6
0.005% 4-aminoantipyrine 0.015% phenol 1.8% creatine 6 U / ml sarcosine oxidase 6 U / ml peroxidase 3 ml of the above reaction mixture is placed in a cuvette (d = 1 cm) and preheated at 37 ° C. for about 3 minutes. To do. Next, add 0.1 ml of the enzyme solution, mix gently, and record the change in absorbance at 500 nm for 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control. Absorbance change per unit is obtained (ΔOD test).
盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液(50mM リン酸カリウム緩衝液,pH7.5)0.1mlを加え上記と同様に操作を行って、1分間当たりの吸光度変化を求める(△ODブランク)。
計算式
In the blind test, 0.1 ml of an enzyme diluent (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5) is added instead of the enzyme solution, and the same operation as above is performed to determine the change in absorbance per minute (ΔOD blank). .
a formula
13.3:キノンイミン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
(cm2 /μM)
1/2 :酵素反応で生成した過酸化水素1分子から形成するキノンイミン色素は1/2分子であることの係数
1.0 :光路長(cm)
0.1 :添加酵素液量(ml)
参考例1 染色体DNAの分離
アルカリゲネス・フェカリスTE3581の染色体DNAを次の方法で分離した。
13.3: mmol extinction coefficient of quinoneimine dye under the above measurement conditions
(Cm 2 / μM)
1/2: Coefficient of quinoneimine dye formed from one molecule of hydrogen peroxide generated by enzyme reaction being 1/2 molecule 1.0: Optical path length (cm)
0.1: Amount of added enzyme solution (ml)
Reference Example 1 Separation of Chromosomal DNA Chromosomal DNA of Alcaligenes faecalis TE3581 was isolated by the following method.
該菌体(FERM P−14237)を150mlの普通ブイヨン培地で30℃一晩振盪培養した後、遠心分離(8000rmp,10分間)により集菌した。10%シュークロース、50mMトリス塩酸(pH8.0)、50mM EDTAを含んだ溶液5mlに懸濁し、1mlのリゾチーム溶液(10mg/ml)を加えて37℃15分間保温し、次いで1mlの10%SDS溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フェノール溶液(1:1)を加え、攪拌混合し、10,000rpm、3分間の遠心分離で水層と溶媒層に分離し、水層を分取した。この水層に2倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌しながら、DNAをガラス棒に巻き付かせて分離した。 The cells (FERM P-14237) were cultured with shaking in 150 ml of ordinary bouillon medium at 30 ° C. overnight, and then collected by centrifugation (8000 rpm, 10 minutes). Suspend in 5 ml of a solution containing 10% sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, add 1 ml of lysozyme solution (10 mg / ml) and incubate at 37 ° C. for 15 minutes, then 1 ml of 10% SDS The solution was added. An equal amount of chloroform / phenol solution (1: 1) was added to this solution, mixed with stirring, separated into an aqueous layer and a solvent layer by centrifugation at 10,000 rpm for 3 minutes, and the aqueous layer was separated. This aqueous layer was gently overlaid with twice the amount of ethanol, and while slowly stirring with a glass rod, the DNA was wrapped around the glass rod and separated.
このDNAを1mM EDTAを含んだ10mMトリス塩酸、pH8.0溶液(以下、TEと略記)で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取し、2倍量のエタノールを加えて上記方法で、もう一度DNAを分離し、2mlのTEで溶解した。
参考例2
クレアチニンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するDNA断片および該DNA断片を有する組換えベクターの調製
参考例1で得たDNA20μgを制限酵素Sau3AI(東洋紡製)で部分分解し、シュークロース密度勾配遠心分離法により2〜10kbpの断片を回収した。一方、制限酵素BamHI(東洋紡製)で切断したpBluescriptKS(+)をバクテリアルアルカリホスファターゼ(東洋紡製)により脱リン酸化処理した後、両DNAをT4DNAリガーゼ(東洋紡製)1ユニットで16℃、12時間反応させ、DNAを連結した。連結したDNAはエシェリヒア・コリーJM109のコンピテントセル(東洋紡製)を用いて形質転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地〔0.5%酵母エキス、0.2%肉エキス、0.5%ポリペプトン、0.1%NaCl、0.1%KH2PO4 、0.05%MgSO4 /7H2 O、1.15%クレアチン、10U/mlザルコシンオキシダーゼ(東洋紡製)、0.5U/mlペルオキシダーゼ(東洋紡製)、0.01%o−ジアニシジン、50μg/mlアンピシリン、1.5%寒天〕に塗布した。クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。使用したDNA1μg当たり約1×105個の形質転換体のコロニーが得られた。
This DNA was dissolved in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 solution (hereinafter abbreviated as TE) containing 1 mM EDTA. After treating this with an equal volume of chloroform / phenol solution, the aqueous layer was separated by centrifugation, and twice the amount of ethanol was added to separate the DNA again by the above method and dissolved in 2 ml of TE.
Reference example 2
Preparation of DNA fragment containing gene encoding creatinine amidinohydrolase and recombinant vector having the DNA fragment 20 μg of DNA obtained in Reference Example 1 was partially decomposed with restriction enzyme Sau3AI (manufactured by Toyobo) and sucrose density gradient centrifugation To recover fragments of 2-10 kbp. On the other hand, pBluescript KS (+) cleaved with the restriction enzyme BamHI (Toyobo) was dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (Toyobo), and then both DNAs were treated with 1 unit of T4 DNA ligase (Toyobo) at 16 ° C. for 12 hours. The DNA was ligated by reacting. Ligated DNA was transformed using Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo Co., Ltd.) and agar medium for detecting creatine amidinohydrolase activity [0.5% yeast extract, 0.2% meat extract, 0.5% Polypeptone, 0.1% NaCl, 0.1% KH 2 PO 4 , 0.05% MgSO 4 / 7H 2 O, 1.15% creatine, 10 U / ml sarcosine oxidase (Toyobo), 0.5 U / ml Peroxidase (Toyobo Co., Ltd., 0.01% o-dianisidine, 50 μg / ml ampicillin, 1.5% agar). The detection of creatine amidinohydrolase activity was performed using colonies that grew in the above medium and stained brown as an index. Approximately 1 × 10 5 transformant colonies were obtained per μg of DNA used.
約12,000個のコロニーをスクリーニングした結果、6株茶色に染色されるコロニーを見いだした。これらの株をLB液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、50μg/mlアンピシリン)で培養し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定したところ、いずれの株からもクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性が検出された。これらの株のうち、最もクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の高かった株の保有するプラスミドには、約5kbpの挿入DNA断片が存在しており、このプラスミドをpCRH17とした。 As a result of screening about 12,000 colonies, 6 strains of colonies stained brown were found. These strains were cultured in LB liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 50 μg / ml ampicillin), and creatine amidinohydrolase activity was measured. Hydrolase activity was detected. Among these strains, a plasmid possessed by the strain having the highest creatine amidinohydrolase activity has an inserted DNA fragment of about 5 kbp, and this plasmid was designated as pCRH17.
次いでpCRH17の挿入DNAの制限酵素EcoRV(東洋紡製)とPstI(東洋紡製)にて切り出し、同制限酵素で切断したpBluescript KS(+)に連結してpCRH173を作成した。
実施例1 組換えプラスミドpCRH273の作製
参考例2の組換えプラスミドpCRH173を用い、ベクター由来のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子から挿入DNAのクレアチンアミジノヒドロラーゼ構造遺伝子上流部分を、配列番号3に記載した合成DNAと市販の変異導入キット(TransformerTM ; Clonetech 製)により削除して、組換えプラスミドpCRH173Mを作製した。なお、変異の導入の詳細な方法については、キット添付のプロトコールに準拠した。
Next, the inserted DNA of pCRH17 was excised with restriction enzymes EcoRV (Toyobo) and PstI (Toyobo) and ligated to pBluescript KS (+) cleaved with the same restriction enzyme to prepare pCRH173.
Example 1 Preparation of Recombinant Plasmid pCRH273 Using the recombinant plasmid pCRH173 of Reference Example 2, the upstream part of the creatine amidinohydrolase structural gene in the inserted DNA from the structural gene of β-galactosidase derived from the vector was a synthetic DNA described in SEQ ID NO: 3. And a commercially available mutagenesis kit (Transformer ™; manufactured by Clonetech) to prepare a recombinant plasmid pCRH173M. The detailed method for introducing the mutation was in accordance with the protocol attached to the kit.
更にpCRH173Mを制限酵素EcoRI(東洋紡製)で切断した後、セルフライゲーションさせてpCRH273を作製した(図1)。
実施例2 クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子への変異の導入
実施例1で作製したpCRH273で市販の大腸菌コンピテントセル(E. coli
XLI−Red;Clonetech製)形質転換した後、全量をアンピシリンを含んだ(50μg/ml;ナカライテスク製)3mlのLB液体培地(1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、1.0%NaCl)に接種し、37℃で一晩振盪培養した。この培養液全量から常法によりプラスミドを回収した。このプラスミドで再度市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli JM109;東洋紡製)を形質転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地に塗布して37℃一晩培養した。こうして得られた変異クレアチンアミジノヒドロラーゼライブラリーからクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を強く発現している株(着色の強い株)を選抜した。
実施例3 Km値の減少したクレアチンアミジノヒドロラーゼのスクリーニング
実施例2で選抜した候補株をアンピシリンを含んだ(200μg/ml)3mlのTB培地(1.2%ポリペプトン、2.4%酵母エキス、0.4%グリセロール、0.0231%KH2PO4 、0.1254%K2 HPO4 )に接種し、37℃で一晩振盪培養した。その培養液1mlから遠心分離により菌体を回収し、ガラスビーズ破砕により粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を用いて前述した活性測定法によりクレアチンアミジノヒドロラーゼを測定した。 また、基質濃度のみを1/10に減らした活性測定試薬を用いて、同様にクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定した。この2種類の活性値の比率(1/10基質濃度の活性÷常法の活性)が野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ上昇した株をKm値の減少した変異体として選抜した。
Further, pCRH173M was cleaved with a restriction enzyme EcoRI (manufactured by Toyobo) and then self-ligated to prepare pCRH273 (FIG. 1).
Example 2 Introduction of Mutation into Creatine Amidinohydrolase Gene Commercially available E. coli competent cells (E. coli) with pCRH273 prepared in Example 1
After transformation, XLI-Red (manufactured by Clonetech) 3 ml of LB liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0% NaCl) containing ampicillin in total (50 μg / ml; manufactured by Nacalai Tesque) And incubating overnight at 37 ° C. The plasmid was recovered from the whole culture broth by a conventional method. This plasmid was again transformed into a commercially available E. coli competent cell (E. coli JM109; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), applied to an agar medium for detecting creatine amidinohydrolase activity, and cultured overnight at 37 ° C. From the mutant creatine amidinohydrolase library thus obtained, a strain that strongly expressed creatine amidinohydrolase activity (a highly colored strain) was selected.
Example 3 Screening for Creatine Amidinohydrolase with Reduced Km Value The candidate strain selected in Example 2 was ampicillin-containing (200 μg / ml) 3 ml TB medium (1.2% polypeptone, 2.4% yeast extract, 0 4% glycerol, 0.0231% KH 2 PO 4 , 0.1254% K 2 HPO 4 ), and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. The cells were collected from 1 ml of the culture solution by centrifugation, and a crude enzyme solution was prepared by crushing glass beads. Using the obtained crude enzyme solution, creatine amidinohydrolase was measured by the activity measuring method described above. In addition, creatine amidinohydrolase activity was measured in the same manner using an activity measurement reagent in which only the substrate concentration was reduced to 1/10. Strains whose ratio of these two types of activity values (activity of 1/10 substrate concentration ÷ ordinary activity) was increased compared to wild type creatine amidinohydrolase were selected as mutants with decreased Km values.
上記の方法により約20,000株についてスクリーニングした結果、3株のクレアチンに対するKm値の小さくなった変異体を取得することができ、それぞれの有する組換えプラスミドをpCRH273M1(FERM BP−5374)、pCRH273M2(FERM BP−5375)、pCRH273M3(FERM BP−5376)と命名した。
実施例4 エシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M1)からのクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造
6LのTB培地を10L−ジャーファーメンターに分注し、121℃、15分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した50mg/mlアンピシリン(ナカライテスク製)、及び200mM IPTG(日本精化製)をそれぞれ6ml添加した。この培地にLB培地であらかじめ30℃24時間振盪培養したエシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M1)(FERM BP−5374)の培養液60mlを接種し、37℃で24時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は8.7U/mlであった。
As a result of screening about 20,000 strains by the above-mentioned method, mutants with reduced Km values for 3 strains of creatine can be obtained. Recombinant plasmids possessed by each of them are pCRH273M1 (FERM BP-5374), pCRH273M2 (FERM BP-5375) and pCRH273M3 (FERM BP-5376).
Example 4 Production of creatine amidinohydrolase from Escherichia coli JM109 (pCRH273M1) 6 L of TB medium was dispensed into a 10 L-jar fermenter, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, and then separately sterile filtered 50 mg 6 ml each of / ml ampicillin (manufactured by Nacalai Tesque) and 200 mM IPTG (manufactured by Nippon Seika) were added. This culture medium was inoculated with 60 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pCRH273M1) (FERM BP-5374) that had been shaken and cultured in an LB medium at 30 ° C. for 24 hours in advance and cultured at 37 ° C. for 24 hours with aeration and agitation. The creatine amidinohydrolase activity at the end of the culture was 8.7 U / ml.
上記菌体を遠心分離にて集菌し、50mM リン酸緩衝液,pH7.0に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画後セファデックスG−25(ファルマシア バイオテク)ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロースCL−6B(ファルマシア バイオテク)カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は18.4U/mg−proteinであった。
表1にこれまでの精製のまとめを示す。また表2に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼの理化学的性質を示す。
The cells were collected by centrifugation and suspended in 50 mM phosphate buffer, pH 7.0.
The cell suspension was crushed with a French press and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained crude enzyme solution was fractionated with ammonium sulfate, desalted by Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) gel filtration, and purified by octyl Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. . The creatine amidinohydrolase preparation obtained by this method showed an almost single band by SDS-PAGE, and the specific activity at this time was 18.4 U / mg-protein.
Table 1 shows the summary of purification so far. Table 2 shows the physicochemical properties of creatine amidinohydrolase obtained by the above method.
実施例5 エシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M2)からのクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造
6LのTB培地を10L−ジャーファーメンターに分注し、121℃、15分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した50mg/mlアンピシリン(ナカライテスク製)、及び200mM IPTG(日本精化製)をそれぞれ6ml添加した。この培地にLB培地であらかじめ30℃24時間振盪培養したエシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M2)(FERM BP−5375)の培養液60mlを接種し、37℃で24時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は5.6U/mlであった。
Example 5 Production of creatine amidinohydrolase from Escherichia coli JM109 (pCRH273M2) 6 L of TB medium was dispensed into 10 L-jar fermenter, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, and then separately sterile filtered 50 mg 6 ml each of / ml ampicillin (manufactured by Nacalai Tesque) and 200 mM IPTG (manufactured by Nippon Seika) were added. This culture medium was inoculated with 60 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pCRH273M2) (FERM BP-5375) previously shake-cultured in LB medium at 30 ° C. for 24 hours, and cultured at 37 ° C. for 24 hours with aeration and agitation. The creatine amidinohydrolase activity at the end of the culture was 5.6 U / ml.
上記菌体を遠心分離にて集菌し、50mM リン酸緩衝液,pH7.0に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画後セファデックスG−25(ファルマシア バイオテク)ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロースCL−6B(ファルマシア バイオテク)カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は14.3U/mg−proteinであった。
表3にこれまでの精製のまとめを示す。また表4に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼの理化学的性質を示す。
The cells were collected by centrifugation and suspended in 50 mM phosphate buffer, pH 7.0.
The cell suspension was crushed with a French press and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained crude enzyme solution was fractionated with ammonium sulfate, desalted by Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) gel filtration, and purified by octyl Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. . The creatine amidinohydrolase preparation obtained by this method showed an almost single band in SDS-PAGE, and the specific activity at this time was 14.3 U / mg-protein.
Table 3 shows the summary of purification so far. Table 4 shows the physicochemical properties of creatine amidinohydrolase obtained by the above method.
実施例6 エシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M3)からのクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造
6LのTB培地を10L−ジャーファーメンターに分注し、121℃、15分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した50mg/mlアンピシリン(ナカライテスク製)、及び200mM IPTG(日本精化製)をそれぞれ6ml添加した。この培地にLB培地であらかじめ30℃24時間振盪培養したエシェリヒア・コリーJM109(pCRH273M3)(FERM BP−5376)の培養液60mlを接種し、37℃で24時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は8.3U/mlであった。
Example 6 Cres from Escherichia coli JM109 (pCRH273M3)
Manufacture of atine amidinohydrolase 6 L of TB medium was dispensed into a 10 L-jar fermenter, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, and then separately filtered aseptically, 50 mg / ml ampicillin (manufactured by Nacalai Tesque), and 200 mM IPTG ( 6 ml each of Nippon Seika Co., Ltd. was added. This medium was inoculated with 60 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pCRH273M3) (FERM BP-5376) that had been shaken and cultured in advance at 30 ° C. for 24 hours in LB medium, and cultured at 37 ° C. for 24 hours with aeration and agitation. The creatine amidinohydrolase activity at the end of the culture was 8.3 U / ml.
上記菌体を遠心分離にて集菌し、50mM リン酸緩衝液、pH7.0に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画後セファデックスG−25(ファルマシア バイオテク)ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロースCL−6B(ファルマシア バイオテク)カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品は、SDS−PAGE的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は14.8U/mg−proteinであった。
表5にこれまでの精製のまとめを示す。また表6に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼの理化学的性質を示す。
The cells were collected by centrifugation and suspended in 50 mM phosphate buffer, pH 7.0.
The cell suspension was crushed with a French press and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained crude enzyme solution was fractionated with ammonium sulfate, desalted by Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech) gel filtration, and purified by octyl Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. . The creatine amidinohydrolase preparation obtained by this method showed an almost single band in terms of SDS-PAGE, and the specific activity at this time was 14.8 U / mg-protein.
Table 5 shows a summary of the purification so far. Table 6 shows the physicochemical properties of creatine amidinohydrolase obtained by the above method.
下記表7に本発明の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼと野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼのクレアチンに対するKm値をまとめた。表7からも明らかなように本発明の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼが野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べて、Km値が低下したことが判る。 Table 7 below summarizes the Km values for creatine of the novel creatine amidinohydrolase and wild type creatine amidinohydrolase of the present invention. As is apparent from Table 7, it can be seen that the Km value of the novel creatine amidinohydrolase of the present invention was lower than that of the wild type creatine amidinohydrolase.
実施例7
実施例5にて調製した精製クレアチンアミジノヒドロラーゼと野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを用いて、下記組成を有するクレアチニン測定用試液を調製し、クレアチンアミジノヒドロラーゼのクレアチニン測定用試液での必要量を比較した。
Example 7
Using the purified creatine amidinohydrolase and wild type creatine amidinohydrolase prepared in Example 5, preparation solutions for creatinine having the following composition were prepared, and the required amounts of creatine amidinohydrolase in the creatinine measurement test solution were compared.
実施例5のクレアチンアミジノヒドロラーゼ 20,40,60U/ml
または野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼ
クレアチニンアミドヒドロラーゼ 150U/ml
ザルコシンオキシダーゼ 7U/ml
ペルオキシダーゼ 3PU/ml
MOPSバッファー 0.1M、pH8.0
トリトンX−100 0.1%
4−アミノアンチピリン 0.15mM
TOOS(アニリン誘導体) 0.2mM
クレアチニン100mg/dlを含有する試料60μlに、上記試液3mlを添加し、吸光度変化を37℃、波長546nmで測定した。その測定結果(タイムコース)を図2に示す。図中、Wildは野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを示し、pCRH273M2は本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを示す。
Creatine amidinohydrolase of Example 5, 20, 40, 60 U / ml
Or wild type creatine amidinohydrolase creatinine amide hydrolase 150 U / ml
Sarcosine oxidase 7U / ml
Peroxidase 3PU / ml
MOPS buffer 0.1M, pH 8.0
Triton X-100 0.1%
4-Aminoantipyrine 0.15 mM
TOOS (aniline derivative) 0.2 mM
3 ml of the above test solution was added to 60 μl of a sample containing 100 mg / dl of creatinine, and the change in absorbance was measured at 37 ° C. and a wavelength of 546 nm. The measurement result (time course) is shown in FIG. In the figure, Wild represents wild type creatine amidinohydrolase, and pCRH273M2 represents the creatine amidinohydrolase of the present invention.
図2から明らかなように、5分間で測定反応を終結させるとすると、本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼは野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べて、少ない酵素量(約1/3量)で測定が可能であった。また、測定後半の反応性、つまり試料中のクレアチニン量が少なくなった時の反応性が良好であることが確認された。 As is apparent from FIG. 2, when the measurement reaction is completed in 5 minutes, the creatine amidinohydrolase of the present invention can be measured with a smaller amount of enzyme (about 1/3 amount) than the wild type creatine amidinohydrolase. there were. In addition, it was confirmed that the reactivity in the latter half of the measurement, that is, the reactivity when the amount of creatinine in the sample decreased was good.
(配列表) (Sequence Listing)
Claims (7)
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約3.5〜10.0mM
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5 A novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties:
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 3.5 to 10.0 mM
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約4.5±1.0
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5 A novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties:
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when measuring activity using sarcosine oxidase and peroxidase as conjugate enzymes: about 4.5 ± 1.0
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約6.5±1.0
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5 A novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties:
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 6.5 ± 1.0
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約9.0±1.0
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5 A novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties:
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 9.0 ± 1.0
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
作用:クレアチン + H2 O → ザルコシン + 尿素
至適温度:約40℃〜50℃
至適pH:約8.0〜9.0
熱安定性:約50℃以下(pH7.5、30分間)
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するKm値:約3.5〜10.0mM
分子量:約43,000(SDS−PAGE)
等電点:約4.5 A method for producing a novel creatine amidinohydrolase, comprising culturing a microorganism producing a novel creatine amidinohydrolase having the following physicochemical properties in a nutrient medium and collecting the novel creatine amidinohydrolase.
Action: Creatine + H 2 O → Sarcosine + Urea Optimal temperature: about 40 ° C to 50 ° C
Optimum pH: about 8.0 to 9.0
Thermal stability: about 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
Km value for creatine when sarcosine oxidase and peroxidase are used as conjugate enzymes and the activity is measured: about 3.5 to 10.0 mM
Molecular weight: about 43,000 (SDS-PAGE)
Isoelectric point: about 4.5
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JP2019195300A (en) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | 東洋紡株式会社 | Biogenic substance measurement kit and method in which measurement sensitivity is improved |
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2004
- 2004-01-09 JP JP2004004863A patent/JP2005192538A/en active Pending
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