JP2005192420A - Nucleic acid amplification primer, nucleic acid amplification primer set and method for inspecting cancer therewith - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply and accurately detecting the presence or absence of the codon 12 and codon 13 of KRAS gene in one operation in good repeatability, to provide a nucleic acid amplification primer used for the detection method, to provide a nucleic acid amplification primer set, and to provide a reagent kit for detecting the mutation of the codon 12 and codon 13 of KRAS gene. <P>SOLUTION: The KRAS gene is amplified with a nucleic acid amplification primer set containing a nucleic acid amplification primer acting on the KRAS gene and having a mismatch-introduced base sequence. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、癌の臨床検査の分野において用いられる、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の突然変異（以下、適宜「変異」という。）の有無を一度の操作で判定する方法、これに用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を判定するためのキットに関する。   INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is a method for determining the presence or absence of mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene (hereinafter referred to as “mutation” where appropriate), which is used in the field of clinical laboratory tests for cancer, in one operation. And a kit for determining the presence or absence of mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene.

ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ−ＭＡＰをカスケードとするリン酸化酵素の経路は、細胞の分化や成長、増殖を調節する重要な経路であることが知られている。ＲＡＳタンパク質をコードするＲＡＳ遺伝子は、ヒトの様々な腫瘍で突然変異が認められている遺伝子である。ＲＡＳ遺伝子に変異が起こると、細胞内のリン酸化が異常に亢進し、細胞の分化や成長、増殖等の調節機能が不全となることが知られている。ＲＡＳ遺伝子の変異は、ヒトの総ての腫瘍の１５％の頻度で起こっていることが報告されている。このように、ＲＡＳ遺伝子の変異は、ヒトの腫瘍の形成に深い関連があることが推測される。ＫＲＡＳ遺伝子の変異ではコドン１２及びコドン１３の変異は合わせて９０％以上を占めることが報告されている。従来、このコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法として、ダイレクトシーケンス法、ＭＡＳＡ法、ＲＦＬＰ法等が知られているが、いずれも、検出感度、検出に要する時間・コスト、その両方の点で問題がある。
また、近時、コドン１２の変異を再現性よく、高感度で検出する方法として、非特許文献１に記載される技術が知られている。
“Oncogene” 1991 Jun, 6 (6), 1079-1083 It is known that the pathway of phosphorylation enzyme that cascades RAS-RAF-MEK-ERK-MAP is an important pathway that regulates cell differentiation, growth, and proliferation. The RAS gene encoding RAS protein is a gene that has been mutated in various human tumors. It is known that when a mutation occurs in the RAS gene, phosphorylation in the cell is abnormally increased, and regulatory functions such as cell differentiation, growth, and proliferation are impaired. It has been reported that mutations in the RAS gene occur at a frequency of 15% of all human tumors. Thus, it is speculated that mutations in the RAS gene are closely related to the formation of human tumors. It has been reported that in the KRAS gene mutations, the codon 12 and codon 13 mutations account for 90% or more. Conventionally, the direct sequence method, the MASA method, the RFLP method, and the like are known as methods for detecting the mutations of codon 12 and codon 13, but all of them are in terms of detection sensitivity, detection time and cost, and both. There's a problem.
Recently, a technique described in Non-Patent Document 1 is known as a method for detecting a mutation of codon 12 with high reproducibility and high sensitivity.
“Oncogene” 1991 Jun, 6 (6), 1079-1083

しかし、上述の技術は、コドン１２の変異しか検出できず、コドン１３の変異を検出しようとすると、もう１回同様の検出操作が必要となり、検査の効率が低くなるという問題がある。そのため、コドン１２とコドン１３の変異を、同時に、再現性よく、高感度で検出する方法が求められている。   However, the above-described technique can detect only the mutation of codon 12, and if the mutation of codon 13 is to be detected, the same detection operation is required once more, and there is a problem that the efficiency of the test is lowered. Therefore, there is a need for a method for detecting codon 12 and codon 13 mutations simultaneously with high reproducibility and high sensitivity.

そこで、本発明の課題は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく検出する方法を提供することである。
さらに、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出キットを提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for detecting the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene in a simple operation with good reproducibility and high accuracy.
Furthermore, the present invention provides a nucleic acid amplification primer, a nucleic acid amplification primer set, and a mutation detection kit for codons 12 and 13 of the KRAS gene for use in this detection method.

かかる実情において、本発明者は、ＫＲＡＳ遺伝子に作用し、塩基配列にミスマッチを導入した核酸増幅プライマーを含む核酸増幅用プライマーセット用いて、ネステッドＰＣＲ法、セミネステッドＰＣＲ法、ダブルＰＣＲ法のいずれかを用いてＫＲＡＳ遺伝子を増幅することにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく判定することができることを見出した。   In such a situation, the present inventor uses any of a nested PCR method, a semi-nested PCR method, and a double PCR method using a nucleic acid amplification primer set including a nucleic acid amplification primer that acts on the KRAS gene and introduces a mismatch in the base sequence. It was found that the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene can be determined simply, with good reproducibility, and with high accuracy by amplifying the KRAS gene using.

即ち、この核酸増幅用プライマー、又はこの核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットによれば、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、特定の第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を当該特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該特定の第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該特定の第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識する。   That is, according to the primer for nucleic acid amplification or the primer set for nucleic acid amplification containing the primer for nucleic acid amplification, if there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene, the KRAS gene of the specific first nucleic acid amplification primer set If the specific first restriction enzyme does not recognize the amplification product and there is a mutation in codon 13 of the KRAS gene, the amplification product of the KRAS gene by the specific first nucleic acid amplification primer set is identified by the second Is not recognized, and there is no mutation in codon 12 or codon 13 of the KRAS gene, the amplified product of the KRAS gene by the specific first nucleic acid amplification primer set is used as the specific first And the specific second restriction enzyme.

そうすると、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、当該特定の第１の核酸増幅用プライマーセットが異なる配列のＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を生成することから、当該特定の第１の制限酵素は、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に基づいて、異なる長さの制限酵素断片を生成し、当該特定の第２の制限酵素は、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に基づいて、異なる長さの制限酵素断片を生成する。よって、その制限酵素断片を制限酵素断片長多型を用いて検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出でき、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で判定できる。   Then, since the specific first nucleic acid amplification primer set generates an amplified product of the KRAS gene having a different sequence depending on the presence or absence of the codon 12 and the codon 13 of the KRAS gene, the specific first restriction The enzyme generates restriction enzyme fragments having different lengths based on the presence or absence of a mutation in codon 12 of the KRAS gene, and the specific second restriction enzyme is based on the presence or absence of a mutation in codon 13 of the KRAS gene. To produce restriction enzyme fragments of different lengths. Therefore, by detecting the restriction enzyme fragment using the restriction enzyme fragment length polymorphism, mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene can be detected by a single operation, and the mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene can be detected. Presence / absence can be determined with a single operation.

また、この核酸増幅用プライマーを用いたＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法では、
（１）第１の工程：第１の核酸増幅用プライマーセットを用いて当該ＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を前記特定の第１の制限酵素又は前記特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（２）第２の工程：１）第１の工程において当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、当該特定の第１の制限酵素で処理した反応液に対して、第２の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第１の制限酵素で処理する工程と、
２）第１の工程において当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、第３の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（３）第３の工程：当該第２の工程で得られたＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物の制限酵素断片を、制限酵素断片長多型を用いて検出する工程とを有し、
当該第１の工程において、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる増幅産物を当該特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる増幅産物を当該特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識することにより、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成し、 その制限酵素断片を制限酵素断片長多型を用いて検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で判定することができる。 Further, in the method for detecting mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene using this nucleic acid amplification primer,
(1) First step: Nucleic acid amplification of the KRAS gene is performed using a first nucleic acid amplification primer set, and the amplification product of the KRAS gene is used as the specific first restriction enzyme or the specific second Treating with a restriction enzyme;
(2) Second step: 1) When treated with the specific first restriction enzyme in the first step, the reaction solution treated with the specific first restriction enzyme has a second Performing nucleic acid amplification of the KRAS gene using the primer set for nucleic acid amplification, and then treating with the specific first restriction enzyme;
2) When treated with the specific second restriction enzyme in the first step, nucleic acid amplification of the KRAS gene is performed using the third nucleic acid amplification primer set, and then the specific second restriction enzyme is used. A step of treating with an enzyme;
(3) a third step: a step of detecting a restriction enzyme fragment of the amplification product of the KRAS gene obtained in the second step using a restriction enzyme fragment length polymorphism,
In the first step, if there is a mutation in the codon 12 of the KRAS gene, the specific first restriction enzyme does not recognize the amplification product of the first nucleic acid amplification primer set, and the codon 13 of the KRAS gene If there is a mutation in the first nucleic acid amplification primer set, the specific second restriction enzyme does not recognize the amplification product, and if there is no mutation in codon 12 or codon 13 of the KRAS gene, By recognizing both the specific first restriction enzyme and the specific second restriction enzyme, the amplification product obtained by the first nucleic acid amplification primer set, depending on the presence or absence of mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene Generating restriction enzyme fragments of different lengths, and detecting the restriction enzyme fragments using restriction enzyme fragment length polymorphisms, the codon 12 of the KRAS gene and The presence or absence of the codon 13 mutation can be determined by a single operation.

さらに、この核酸増幅プライマーセットを用いたＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法では、
前記第２の工程において、前記第１の工程で用いる核酸増幅用プライマーのミスマッチとは異なるミスマッチを導入した核酸増幅用プライマーを含む前記第２の核酸増幅用プライマーセットを用いることにより、当該第２の工程においてコドン１２の変異に有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２以外の箇所を前記特定の第１の制限酵素が認識し、前記第２の工程において、前記第１の工程で用いる核酸増幅用プライマーのミスマッチとは異なるミスマッチを導入した核酸増幅用プライマーを含む前記第３の核酸増幅用プライマーセットを用いることにより、当該第２の工程においてコドン１３の変異に有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３以外の箇所を前記特定の第１の制限酵素が認識する。 Furthermore, in the method for detecting mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene using this nucleic acid amplification primer set,
In the second step, by using the second nucleic acid amplification primer set including a nucleic acid amplification primer into which a mismatch different from the mismatch of the nucleic acid amplification primer used in the first step is used, the second nucleic acid amplification primer is used. The specific first restriction enzyme recognizes a portion other than codon 12 of the KRAS gene regardless of the presence or absence of codon 12 mutation in the step, and the nucleic acid amplification used in the first step in the second step. By using the third nucleic acid amplification primer set containing a nucleic acid amplification primer into which a mismatch different from the primer primer mismatch is introduced, the KRAS gene The specific first restriction enzyme recognizes a portion other than codon 13.

この第２の工程では、当該第１の工程で当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に起因して生成される、異なる制限酵素断片長のＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を増幅し、前記第１の工程で当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に起因して生成される、異なる制限酵素断片長の増幅産物を増幅することになる。   In this second step, when treated with the specific first restriction enzyme in the first step, different restriction enzyme fragment lengths generated due to the presence or absence of a mutation in codon 12 of the KRAS gene When the amplified product of the KRAS gene is amplified and treated with the specific second restriction enzyme in the first step, a different restriction is generated due to the presence or absence of a mutation in codon 13 of the KRAS gene. The amplification product of the enzyme fragment length will be amplified.

この第２の工程では、前記第１の工程で当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に起因して生成される、異なる長さの制限酵素断片を増幅することになる。その結果、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に起因して、異なる長さの増幅産物が多量に生成される。
そして、第３の工程で、この増幅産物を制限酵素で切断した制限酵素断片を制限酵素断片長多型により検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無をさらに高精度で判定することができる。
また、前記第２の工程を経る場合には、第１の工程のみ行った場合よりも、検出感度がより高いことから、癌の細胞、組織を直接採取する以外にも、癌細胞の比率が比較的低い、患者の血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等を由来とする細胞や組織を採取して、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無を判定することができる。そのため、低侵襲の（患者への負担が小さい）診断が可能になる。 In this second step, restriction of different lengths generated due to the presence or absence of mutation in codon 12 of the KRAS gene when treated with the specific first restriction enzyme in the first step. Enzyme fragments will be amplified. As a result, a large amount of amplification products having different lengths are generated due to the presence or absence of mutation in codon 12 of the KRAS gene.
In the third step, the presence or absence of a mutation in codon 12 of the KRAS gene is determined with higher accuracy by detecting the restriction enzyme fragment obtained by cleaving this amplification product with a restriction enzyme, using restriction enzyme fragment length polymorphism. Can do.
Moreover, since the detection sensitivity is higher when the second step is performed than when only the first step is performed, the ratio of cancer cells is not limited to directly collecting cancer cells and tissues. It is possible to determine the presence or absence of a mutation in codon 12 of the KRAS gene by collecting relatively low cells or tissues derived from patient blood, pancreatic juice, serum, feces, semen, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, etc. it can. Therefore, minimally invasive diagnosis (the burden on the patient is small) becomes possible.

また、この第２の工程では、前記第１の工程で当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に起因して生成される、異なる長さの制限酵素断片を増幅することになる。その結果、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に起因して、異なる長さの増幅産物が多量に生成される。
そして、第３の工程で、この増幅産物を制限酵素で切断した制限酵素断片を制限酵素断片長多型により検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無をさらに高精度で判定することができる。
また、前記第２の工程を経る場合には、第１の工程のみ行った場合よりも、検出感度がより高いことから、癌の細胞、組織を直接採取する以外にも、癌細胞の比率が比較的低い、患者の血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等を由来とする細胞や組織を採取して、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無を判定することができる。そのため、低侵襲の（患者への負担が小さい）診断が可能になる。
このように、本発明では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、高精度で判定することができる。 Further, in this second step, when treated with the specific second restriction enzyme in the first step, different lengths are generated due to the presence or absence of mutation of codon 13 of the KRAS gene. Of the restriction enzyme fragment. As a result, a large amount of amplification products having different lengths are generated due to the presence or absence of mutation in codon 13 of the KRAS gene.
In the third step, the presence or absence of a mutation in codon 13 of the KRAS gene can be determined with higher accuracy by detecting the restriction enzyme fragment obtained by cleaving this amplification product with a restriction enzyme, using restriction enzyme fragment length polymorphism. Can do.
Moreover, since the detection sensitivity is higher when the second step is performed than when only the first step is performed, the ratio of cancer cells is not limited to directly collecting cancer cells and tissues. It is possible to determine the presence or absence of a mutation in codon 13 of the KRAS gene by collecting relatively low cells or tissues derived from patient blood, pancreatic juice, serum, feces, semen, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, etc. it can. Therefore, minimally invasive diagnosis (the burden on the patient is small) becomes possible.
Thus, in the present invention, the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene can be determined with high accuracy by a single operation.

本発明では、上述の核酸増幅用プライマーセットと、制限酵素と、ＤＮＡポリメラーゼを含むキットにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で精度よく判定することができる。   In the present invention, the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene can be accurately determined by a single operation using the above-described primer set for nucleic acid amplification, a restriction enzyme, and a kit containing DNA polymerase.

本発明の検出方法、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出キットによれば、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく検出することができ、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく判定することができる。   According to the detection method of the present invention, the primer for nucleic acid amplification for use in this detection method, the primer set for nucleic acid amplification, and the mutation detection kit for codon 12 and codon 13 of the KRAS gene, the codon 12 and codon 13 of the KRAS gene Mutation can be detected easily, reproducibly and accurately with a single operation, and the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene can be easily and reproducibly with one operation. Can be determined with high accuracy.

（検出原理）
前述の通り、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子に作用し、塩基配列にミスマッチを導入した核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットを用いることにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出する。
核酸増幅用プライマーにミスマッチを導入し、遺伝子の２箇所の（コドンの）変異を一度の操作で検出する方法の一例を示す。
元々ある遺伝子を増幅する核酸増幅用のプライマーがある場合、その塩基配列の１又は２以上の塩基を変換する。そして、当該核酸増幅用のプライマーを含む核酸増幅用プライマーセット（第１の核酸増幅用プライマーセット）を用いて当該遺伝子を増幅したときに、当該遺伝子の特定の第１のコドンに変異があれば、当該核酸増幅用のプライマーセットは、その変異を伴った塩基配列に基づいて当該遺伝子を増幅するようにする。また、当該核酸増幅用のプライマーを含む核酸増幅用プライマーセットを用いて当該遺伝子を増幅したときに、当該遺伝子の特定の第２のコドンに変異があれば、当該核酸増幅用のプライマーセットは、その変異を伴った塩基配列に基づいて当該遺伝子を増幅するようにする。一方、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンにも当該特定の第２のコドンにも変異がなければ、当該核酸増幅用のプライマーセットは、その変異を伴わない塩基配列に基づいて当該遺伝子を増幅するようにする。
そうすると、当該特定の第１のコドンの変異の有無及び、当該特定の第２のコドンの変異の有無に基づいて、当該遺伝子の増幅産物は、塩基配列を異にするようになる。 (Detection principle)
As described above, the present invention uses the nucleic acid amplification primer set that includes a nucleic acid amplification primer that acts on the KRAS gene and introduces a mismatch in the base sequence, thereby allowing mutations of codons 12 and 13 of the KRAS gene to be performed once. Detect by operation.
An example of a method for introducing mismatches into nucleic acid amplification primers and detecting two (codon) mutations of the gene in one operation is shown.
When there is a primer for nucleic acid amplification that originally amplifies a gene, one or more bases in the base sequence are converted. If the gene is amplified using a nucleic acid amplification primer set (first nucleic acid amplification primer set) including the nucleic acid amplification primer, and there is a mutation in the specific first codon of the gene The nucleic acid amplification primer set is configured to amplify the gene based on the base sequence accompanied by the mutation. In addition, when the gene is amplified using a nucleic acid amplification primer set including the nucleic acid amplification primer, and there is a mutation in the specific second codon of the gene, the nucleic acid amplification primer set is The gene is amplified based on the base sequence accompanied by the mutation. On the other hand, if there is no mutation in the specific first codon or the specific second codon of the gene, the primer set for nucleic acid amplification uses the gene sequence based on the base sequence without the mutation. Try to amplify.
Then, based on the presence or absence of the mutation of the specific first codon and the presence or absence of the mutation of the specific second codon, the amplification product of the gene has a different base sequence.

次いで、こうして得られた当該遺伝子の増幅産物に対し、特定の第１の制限酵素又は特定の第２の制限酵素を作用させる。
このとき、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、ある特定の第１の制限酵素は認識せず、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、その増幅産物の特定の第１の１箇所の回文構造を、当該特定の第１の制限酵素が認識するようになる。 Next, the specific first restriction enzyme or the specific second restriction enzyme is allowed to act on the amplification product of the gene thus obtained.
At this time, the specific first restriction enzyme is not recognized for the amplification product of the gene when the specific first codon of the gene has a mutation, and the specific first codon of the gene is not recognized. For a gene amplification product in the case where there is no mutation in the codon, the specific first restriction enzyme recognizes the palindromic structure of the specific first one place of the amplification product.

そうすると、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は１つになるが、当該遺伝子の当該第１の特定のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この２つの断片の合計の断片長は、上の１つの断片長とほぼ等しくなる。
同様に、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、ある特定の第２の制限酵素は認識せず、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、その増幅産物の特定の第２の１箇所の回文構造を、当該特定の第２の制限酵素が認識するようになる。 Then, when there is a mutation in the specific first codon of the gene, there is one restriction enzyme fragment of the amplification product of the gene, but there is a mutation in the first specific codon of the gene. In some cases, there are two restriction enzyme fragments of the gene amplification product. At this time, the total fragment length of the two fragments is substantially equal to the above one fragment length.
Similarly, a specific second restriction enzyme is not recognized for the amplification product of a gene when the specific second codon of the gene has a mutation, and the specific second codon of the gene is not recognized. For a gene amplification product in the case where there is no mutation in the codon, the specific second restriction enzyme recognizes the palindromic structure of a specific second one position of the amplification product.

そうすると、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は１つになるが、当該遺伝子の当該第２の特定のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この２つの断片の合計の断片長は、上の１つの断片長とほぼ等しくなる。
こうして、この遺伝子の特定の第１のコドンと特定の第２のコドンの２箇所の変異を一度の操作で検出でき、この遺伝子の特定の第１のコドンと特定の第２のコドンの２箇所の変異の有無を一度の操作で判定することができる。 Then, when there is a mutation in the specific second codon of the gene, there is one restriction enzyme fragment of the amplification product of the gene, but there is a mutation in the second specific codon of the gene. In some cases, there are two restriction enzyme fragments of the gene amplification product. At this time, the total fragment length of the two fragments is substantially equal to the above one fragment length.
In this way, two mutations of a specific first codon and a specific second codon of this gene can be detected by one operation, and two specific first codons and a specific second codon of this gene can be detected. The presence or absence of mutation can be determined by a single operation.

（２次ＰＣＲ）
本発明では、上記のようにして、前記遺伝子の前記特定の第１のコドン、又は前記特定の第２のコドンのコドンに変異がある場合には、１つの長い制限酵素断片を生成し、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンにも当該特定の第２のコドンのコドンにも変異がない場合には、２つの短い制限酵素断片を生成するが、これらの制限酵素断片を、別の組み合わせの核酸増幅用プライマーセットを用いて増幅する。このとき、通常は、前記特定の第１の制限酵素で処理した制限酵素断片を増幅するための核酸増幅用プライマーセット（第２の核酸増幅用プライマーセット）と、前記特定の第２の制限酵素で処理した制限酵素断片を増幅するための核酸増幅用プライマーセット（第３の核酸増幅用プライマーセット）とは、異なる核酸増幅用プライマーセットとする。 (Secondary PCR)
In the present invention, as described above, when there is a mutation in the specific first codon of the gene or the codon of the specific second codon, one long restriction enzyme fragment is generated, If there is no mutation in the specific first codon of the gene or the codon of the specific second codon, two short restriction enzyme fragments are generated, but these restriction enzyme fragments are combined in another combination. Amplification is performed using the primer set for nucleic acid amplification. At this time, usually, a nucleic acid amplification primer set (second nucleic acid amplification primer set) for amplifying a restriction enzyme fragment treated with the specific first restriction enzyme, and the specific second restriction enzyme A nucleic acid amplification primer set (a third nucleic acid amplification primer set) for amplifying the restriction enzyme fragment treated in step 1 is a nucleic acid amplification primer set different from the nucleic acid amplification primer set.

前記第２の核酸増幅用プライマーセットの１の核酸増幅用プライマーにミスマッチを導入する。今回は、その遺伝子の特定の第１のコドンの変異の有無によらず、前記特定の第１の制限酵素が、その増幅産物の中の前記特定の第１の１箇所とは別の１箇所の回文構造を認識するように、ミスマッチを導入する。
同様に、前記第３の核酸増幅用プライマーセットの１の核酸増幅用プライマーにミスマッチを導入する。今回は、その遺伝子の特定の第２のコドンの変異の有無によらず、前記特定の第２の制限酵素が、その増幅産物の中の前記特定の第２の１箇所とは別の１箇所の回文構造を認識するように、ミスマッチを導入する。 A mismatch is introduced into one nucleic acid amplification primer of the second nucleic acid amplification primer set. This time, regardless of the presence or absence of the mutation of the specific first codon of the gene, the specific first restriction enzyme is one place different from the specific first place in the amplification product. Introduce mismatch to recognize the palindrome structure of.
Similarly, a mismatch is introduced into one nucleic acid amplification primer of the third nucleic acid amplification primer set. This time, regardless of the presence or absence of the mutation of the specific second codon of the gene, the specific second restriction enzyme is one place different from the specific second place in the amplification product. Introduce mismatch to recognize the palindrome structure of.

そうすると、前記遺伝子の前記特定の第１のコドンに変異がある場合には、当該遺伝子の増幅産物の前記特定の第１の制限酵素による断片は３つになるが、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がない場合には、当該遺伝子の増幅産物の当該特定の第１の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この３つの断片の合計の断片長は、上の２つの断片長とほぼ等しくなる。
同様に、前記遺伝子の前記特定の第２のコドンに変異がある場合には、当該遺伝子の増幅産物の前記特定の第２の制限酵素による断片は３つになるが、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がない場合には、当該遺伝子の増幅産物の当該特定の第２の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この３つの断片の合計の断片長は、上の２つの断片長とほぼ等しくなる。 Then, when there is a mutation in the specific first codon of the gene, there are three fragments of the amplification product of the gene by the specific first restriction enzyme, but the specific first codon of the gene When there is no mutation in one codon, there are two fragments of the amplification product of the gene by the specific first restriction enzyme. At this time, the total fragment length of the three fragments is substantially equal to the above two fragment lengths.
Similarly, when there is a mutation in the specific second codon of the gene, there are three fragments of the amplification product of the gene by the specific second restriction enzyme, but the specific gene of the gene When there is no mutation in the second codon, there are two fragments of the amplification product of the gene by the specific second restriction enzyme. At this time, the total fragment length of the three fragments is substantially equal to the above two fragment lengths.

この方法では、もとの遺伝子の特定の第１のコドンの変異の割合、もとの遺伝子の特定の第２のコドンの変異の割合によらず、変異の有無に基づいて生成される、異なる制限酵素断片を多量に増幅する。
従って、もとの遺伝子の特定のコドンの変異の割合が低くても、当該遺伝子の特定のコドンの変異の有無に基づく、増幅産物の差異が顕著になり、当該遺伝子の特定のコドンの変異を高感度で検出できる。
そのため、癌の細胞、組織を直接採取する以外にも、癌細胞の比率が比較的低い、患者の血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等を由来とする細胞や組織を採取して、当該遺伝子の第１のコドン及び第２のコドンの変異の有無を判定することができる。そのため、低侵襲の（患者への負担が小さい）診断が可能になる。
さらに、これら特定の第１のコドンの変異と、特定の第２のコドンの変異とを一度の操作で検出でき、これら特定の第１のコドンの変異の有無と、特定の第２のコドンの変異の有無とを一度の操作で判定できる。 In this method, regardless of the rate of mutation of the specific first codon of the original gene and the rate of mutation of the specific second codon of the original gene, the difference is generated based on the presence or absence of the mutation. Amplify restriction enzyme fragments in large quantities.
Therefore, even if the ratio of the specific codon mutation of the original gene is low, the difference in the amplification product based on the presence or absence of the specific codon mutation of the gene becomes significant, and the specific codon mutation of the gene It can be detected with high sensitivity.
Therefore, in addition to directly collecting cancer cells and tissues, the ratio of cancer cells is relatively low, cells derived from patient blood, pancreatic juice, serum, feces, semen, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, etc. The tissue can be collected to determine the presence or absence of mutations in the first and second codons of the gene. Therefore, minimally invasive diagnosis (the burden on the patient is small) becomes possible.
Furthermore, the mutation of the specific first codon and the mutation of the specific second codon can be detected by one operation, and the presence or absence of the mutation of the specific first codon and the specific second codon. The presence or absence of mutation can be determined by a single operation.

ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異、及びコドン１３の変異を一度の操作で検出する方法の一例を図１に示す。
配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３を含む領域（ＫＲＡＳ遺伝子の４５４番目の塩基から６１３番目の１６０塩基で、コドン１の１番目の塩基からコドン５４の１番目の塩基）を２つの核酸増幅用プライマーからなる核酸増幅用プライマーセットで増幅する（図１（ａ））。ここに、１２＆１３ＳＰは、配列番号２で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の４５７番目から４８６番目に対応する部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列に対応する部位（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列の相補鎖の部位）に結合し、ａ）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｍｖａ１（エム・ブイ・エー・ワン）は認識せず、ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｂｇｌ１（ビー・ジー・エル・ワン）は認識せず、ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、その増幅産物の特定の第１の１箇所の回文構造（ＫＲＡＳ遺伝子の４８４番目から４８８番目のＣＣＷＧＧ／ＧＧＷＣＣ）を、制限酵素Ｍｖａ１が認識するように設計され、その増幅産物の特定の第２の１箇所の回文構造（ＫＲＡＳ遺伝子の４８２番目から４９２番目のＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ／ＣＧＧＮＮＮＮＮＣＣＧ）を、制限酵素Ｂｇｌ１が認識するように設計されている。 An example of a method for detecting a mutation in codon 12 and a mutation in codon 13 of the KRAS gene in one operation is shown in FIG.
A region containing codon 12 and codon 13 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1 (from the 454th base of the KRAS gene to the 613th 160 base, from the first base of codon 1 to the first base of codon 54) Is amplified with a primer set for nucleic acid amplification comprising two primers for nucleic acid amplification (FIG. 1 (a)). Here, 12 & 13SP is a primer for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NO: 2, and corresponds to positions 457 to 486 of the KRAS gene, that is, codon 12 and codon 13 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1. The region corresponding to the 4th to 33rd sequence in the region containing (actually, the region of the complementary strand of the 4th to 33rd sequence in the region containing codons 12 and 13 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1 ) And a) the amplification product of the gene in the case where there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene, the restriction enzyme Mva1 is not recognized; b) the codon of the KRAS gene No restriction enzyme Bgl1 is recognized for the gene amplification product in the case where there is a mutation in 13 and c) at codon 12 of the KRAS gene Restriction of the specific first palindromic structure of the amplified product (CCWGG / GGWCCC from the 484th to the 488th of the KRAS gene) for the amplification product of the gene when there is no mutation at codon 13 Designed to be recognized by the enzyme Mva1 and designed so that the restriction enzyme Bgl1 recognizes the specific second palindromic structure of the amplification product (482 to 492th GCCNNNNNGGC / CGGNNNNCCG of the KRAS gene) Has been.

具体的には、１２＆１３ＳＰのうち、ＫＲＡＳ遺伝子の４８４番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号２のプライマーの２８番目の塩基）に変換し、ＫＲＡＳ遺伝子の４８３番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号２のプライマーの２７番目の塩基）に変換している。
前者の変換により、コドン１２の変異の有無に伴う増幅産物の相違をＭｖａ１（又はＢｓｔＮ１（ビー・エス・ティー・エヌ・ワン））で識別でき、後者の変換により、コドン１３の変異の有無に伴う増幅産物の相違をＢｇｌ１で識別することができる。
また、ＷｉｌｄＡＳは、配列番号３で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の５４９番目から５７６番目の部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の９６番目から１２３番目の部位に結合する（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目から１２３番目の配列の部位であって、配列番号３の１番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の１２３番目に結合し、配列番号３の２８番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目に結合する）。
そして、１２＆１３ＳＰによるヌクレオチド（塩基）の連結は上流から下流に向かって行われ、、ＷｉｌｄＡＳによるヌクレオチド（塩基）の連結は下流から上流に向かって行われ、ＰＣＲ反応によりＫＲＡＳ遺伝子を増幅する。 Specifically, in 12 & 13 SP, the base corresponding to the 484th base of the KRAS gene is converted to cytosine (the 28th base of the primer of SEQ ID NO: 2), and the base corresponding to the 483th base of the KRAS gene is changed. It is converted into cytosine (the 27th base of the primer of SEQ ID NO: 2).
By the former conversion, the difference in the amplification product due to the presence or absence of the codon 12 mutation can be identified by Mva1 (or BstN1 (BSTN1)). The accompanying amplification product differences can be distinguished by Bgl1.
WildAS is a primer for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NO: 3, and is located at the 549th to 576th sites of the KRAS gene, that is, at the 96th to 123rd sites of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1. (Actually a portion of the 96th to 123rd sequence of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1, wherein the first base of SEQ ID NO: 3 is the region of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1) It binds to the 123rd position, and the 28th base of SEQ ID NO: 3 binds to the 96th position of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1).
Then, nucleotide (base) ligation by 12 & 13SP is performed from upstream to downstream, and nucleotide (base) ligation by WildAS is performed from downstream to upstream, and the KRAS gene is amplified by PCR reaction.

そうすると、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、１２０ｂｐの１つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、２９ｂｐと、９１ｂｐの２つの制限酵素断片が生成される（図１（ｂ））。
一方、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を制限酵素Ｂｇｌ１で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、１２０ｂｐの１つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、３２ｂｐと、８８ｂｐの２つの制限酵素断片が生成される（図１（ｃ））。 Then, when this KRAS gene amplification product is treated with the restriction enzyme Mva1 (or BstN1), one restriction enzyme fragment of 120 bp is added to the gene amplification product when there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene. Two restriction enzyme fragments of 29 bp and 91 bp are generated for the amplified product of the gene generated when there is no mutation in codon 12 of the KRAS gene (FIG. 1 (b)).
On the other hand, when this amplification product of the KRAS gene is treated with the restriction enzyme Bgl1, a restriction enzyme fragment of 120 bp is generated for the amplification product of the gene when there is a mutation in the codon 13 of the KRAS gene, and KRAS Two restriction enzyme fragments of 32 bp and 88 bp are generated for the gene amplification product in the case where there is no mutation in codon 13 of the gene (FIG. 1 (c)).

（第１の制限酵素による断片の増幅）
次いで、前記の工程により、制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）で処理したことにより生成された、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の１つの制限酵素断片と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がない場合の２つの制限酵素断片を、前記の核酸増幅用プライマーセットとは異なる核酸増幅用プライマーセット（（００１７）の段落の「第２の核酸増幅用プライマーセット」に相当）で増幅する（図１（ｄ））。ここに、１２＆１３ＳＰは、前述の配列番号２で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の４５７番目から４８６番目に対応する部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列に対応する部位（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列の相補鎖の部位）に結合する。
一方、１２ｍｔＡＳは、配列番号４で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の５４９番目から５７６番目の部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の９６番目から１２３番目の部位に結合し（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目から１２３番目の配列の部位であって、配列番号３の１番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の１２３番目に結合し、配列番号３の２８番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目に結合する）、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）が前記特定の第１の１箇所とは違う１箇所の回文構造を認識するように設計されている。 (Amplification of fragment by first restriction enzyme)
Next, one restriction enzyme fragment in the case where there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene, which is generated by the treatment with the restriction enzyme Mva1 (or BstN1) by the above process, and there is no mutation in the codon 12 of the KRAS gene In this case, the two restriction enzyme fragments are amplified with a nucleic acid amplification primer set (corresponding to the “second nucleic acid amplification primer set” in the paragraph (0017)) different from the above-described nucleic acid amplification primer set (FIG. 1). (D)). Here, 12 & 13SP is a primer for nucleic acid amplification represented by the above-mentioned SEQ ID NO: 2 and corresponds to the portion corresponding to the 457th to 486th positions of the KRAS gene, that is, the codon 12 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1. A site corresponding to the 4th to 33rd sequences in the region containing codon 13 (actually the complementary strand of the 4th to 33rd sequences in the region containing codon 12 and codon 13 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1) ).
On the other hand, 12mtAS is a primer for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NO: 4, and is located in the 549th to 576th sites of the KRAS gene, that is, the 96th to 123rd sites of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1. (Actually, a portion of the 96th to 123rd sequence of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1, wherein the first base of SEQ ID NO: 3 is the region of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1) And the 28th base of SEQ ID NO: 3 binds to the 96th position of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1), and the amplification of the KRAS gene regardless of the presence or absence of the mutation in codon 12 of the KRAS gene For the product, the restriction enzyme Mva1 (or BstN1) is designed to recognize one palindrome structure different from the specific first one place.

具体的には、１２ｍｔＡＳのうち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１０３番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号３のプライマーの２１番目の塩基）に変換し、ＫＲＡＳ遺伝子の１０４番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号３のプライマーの２０番目の塩基）に変換している。
そして、１２＆１３ＳＰによるヌクレオチド（塩基）の連結は上流から下流に向かって行われ、１２ｍｔＡＳによるヌクレオチド（塩基）の連結は下流から上流に向かって行われ、ＰＣＲ反応によりＢＲＡＦ遺伝子を増幅する。 Specifically, in 12 mtAS, the base corresponding to the 103rd base of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1 is converted into cytosine (the 21st base of the primer of SEQ ID NO: 3), and the 104th KRAS gene is converted to the 104th base. Is converted into cytosine (the 20th base of the primer of SEQ ID NO: 3).
Then, nucleotide (base) ligation by 12 & 13SP is performed from upstream to downstream, and nucleotide (base) ligation by 12mtAS is performed from downstream to upstream, and the BRAF gene is amplified by PCR reaction.

そうすると、増幅産物を制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、９９ｂｐと、２１ｂｐの２つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、２９ｂｐと、６０ｂｐと、２１ｂｐの３つの制限酵素断片が生成される（図１（ｆ））。
これらの制限酵素断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）を用いて検出すると、変異がない試料においては、６０ｂｐの制限酵素断片が検出され、変異がある試料においては、９９ｂｐの制限酵素断片が検出され、この相違に基づいて、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無を判定することができる（図２（ａ））。
また、上記コドン１２に変異があるバンドについて塩基配列を調べると、コドン１２に変異があるものは、コドン１２の２番目のグアニンがアデニンに変換していることが分かる（図２（ｂ））。 Then, when the amplified product is treated with the restriction enzyme Mva1 (or BstN1), two restriction enzyme fragments of 99 bp and 21 bp are generated for the gene amplification product when there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene. Then, for the gene amplification product when there is no mutation in the codon 12 of the KRAS gene, three restriction enzyme fragments of 29 bp, 60 bp, and 21 bp are generated (FIG. 1 (f)).
When these restriction enzyme fragments are detected using restriction enzyme length polymorphism (RFLP), a 60 bp restriction enzyme fragment is detected in a sample having no mutation, and a 99 bp restriction enzyme fragment is detected in a sample having a mutation. Based on this difference, the presence or absence of a mutation in codon 12 of the KRAS gene can be determined (FIG. 2 (a)).
Further, when the nucleotide sequence of the band having a mutation in codon 12 is examined, it is found that the second guanine of codon 12 is converted to adenine in those having a mutation in codon 12 (FIG. 2 (b)). .

（第２の制限酵素による断片の増幅）
次いで、前記の工程により、制限酵素Ｂｇｌ１で処理したことにより生成された、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の１つの制限酵素断片と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がない場合の２つの制限酵素断片を、前記の核酸増幅用プライマーセットとは異なる核酸増幅用プライマーセット（（００１７）の段落の「第３の核酸増幅用プライマーセット」に相当）で増幅する（図１（ｅ））。ここに、１２＆１３ＳＰは、前述の配列番号２で表される核酸増幅用プライマーでり、ＫＲＡＳ遺伝子の４５７番目から４８６番目に対応する部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列に対応する部位（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列の相補鎖の部位）に結合する。
一方、１３ｍｔＡＳは、配列番号５で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の５４９番目から５７６番目の部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の９６番目から１２３番目の部位に結合し（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目から１２３番目の配列の部位であって、配列番号３の１番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の１２３番目に結合し、配列番号３の２８番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目に結合する）、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｂｇｌ１が前記特定の第２の１箇所とは違う１箇所の回文構造を認識するように設計されている。 (Amplification of fragment by second restriction enzyme)
Next, one restriction enzyme fragment in the case where there is a mutation in codon 13 of the KRAS gene and two cases in the case where there is no mutation in codon 13 of the KRAS gene, which are generated by the treatment with the restriction enzyme Bgl1 by the above-mentioned steps. The restriction enzyme fragment is amplified with a nucleic acid amplification primer set (corresponding to the “third nucleic acid amplification primer set” in the paragraph of (0017)) different from the nucleic acid amplification primer set (FIG. 1 (e)). . Here, 12 & 13SP is a primer for nucleic acid amplification represented by the above-mentioned SEQ ID NO: 2 and corresponds to the 457th to 486th sites of the KRAS gene, that is, the codon 12 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1. A site corresponding to the 4th to 33rd sequences in the region containing codon 13 (actually the complementary strand of the 4th to 33rd sequences in the region containing codon 12 and codon 13 of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1) ).
On the other hand, 13mtAS is a primer for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NO: 5, and is located at the 549th to 576th sites of the KRAS gene, that is, the 96th to 123rd sites of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1. (Actually, a portion of the 96th to 123rd sequence of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1, wherein the first base of SEQ ID NO: 3 is the region of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1) And the 28th base of SEQ ID NO: 3 binds to the 96th position of the KRAS gene region represented by SEQ ID NO: 1), regardless of the presence or absence of mutation in codon 13 of the KRAS gene. For the product, the restriction enzyme Bgl1 is designed to recognize a palindrome structure at one place different from the specific second one place.

具体的には、１３ｍｔＡＳのうち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１１３番目の塩基に対応する塩基をグアニン（配列番号５のプライマーの１１番目の塩基）に変換し、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１０５番目の塩基に対応する塩基をグアニン（配列番号５のプライマーの１９番目の塩基）に変換し、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１０３番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号５のプライマーの２１番目の塩基）に変換している。
そして、１２＆１３ＳＰによるヌクレオチド（塩基）の連結は上流から下流に向かって行われ、１３ｍｔＡＳによるヌクレオチド（塩基）の連結は下流から上流に向かって行われ、ＰＣＲ反応によりＫＲＡＳ遺伝子を増幅する。 Specifically, in 13mtAS, the base corresponding to the 113th base of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1 is converted to guanine (the 11th base of the primer of SEQ ID NO: 5), and represented by SEQ ID NO: 1. The base corresponding to the 105th base of the KRAS gene is converted to guanine (the 19th base of the primer of SEQ ID NO: 5), and the base corresponding to the 103rd base of the KRAS gene represented by SEQ ID NO: 1 is converted It is converted into cytosine (the 21st base of the primer of SEQ ID NO: 5).
Then, nucleotides (bases) are linked by 12 & 13SP from upstream to downstream, nucleotides (bases) are linked by 13mtAS from downstream to upstream, and the KRAS gene is amplified by PCR reaction.

そうすると、増幅産物を制限酵素Ｂｇｌ１で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、１０６ｂｐと、１４ｂｐの２つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、３２ｂｐと、７４ｂｐと、１４ｂｐの３つの制限酵素断片が生成される（図１（ｇ））。
これらの制限酵素断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）を用いて検出すると、変異がない試料においては、７４ｂｐの制限酵素断片が検出され、変異がある試料においては、１０６ｂｐの制限酵素断片が検出され、この相違に基づいて、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無を判定することができる（図２（ｃ））。
また、上記コドン１３に変異があるバンドについて塩基配列を調べると、コドン１３に変異があるものは、コドン１３２の２番目のグアニンがアデニンに変換していることが分かる（図２（ｄ））。 Then, when the amplified product is treated with the restriction enzyme Bgl1, two restriction enzyme fragments of 106 bp and 14 bp are generated for the gene amplification product when there is a mutation in codon 13 of the KRAS gene, and the KRAS gene For the gene amplification product in the case where there is no mutation in codon 13 of the above, three restriction enzyme fragments of 32 bp, 74 bp, and 14 bp are generated (FIG. 1 (g)).
When these restriction enzyme fragments are detected using restriction enzyme length polymorphism (RFLP), a 74 bp restriction enzyme fragment is detected in a sample having no mutation, and a 106 bp restriction enzyme fragment is detected in a sample having a mutation. Based on this difference, the presence or absence of mutation in codon 13 of the KRAS gene can be determined (FIG. 2 (c)).
Further, when the nucleotide sequence of the band having a mutation in codon 13 is examined, it can be seen that the second guanine of codon 132 is converted to adenine in those having a mutation in codon 13 (FIG. 2 (d)). .

（検査方法）
本発明における検査方法は、試料の準備、ＫＲＡＳ遺伝子の抽出、プライマーを用いた遺伝子増幅、増幅産物の制限酵素による切断、ＫＲＡＳ遺伝子の制限酵素断片の検出の過程からなる。 (Inspection method)
The test method in the present invention comprises the steps of sample preparation, KRAS gene extraction, gene amplification using primers, amplification product cleavage with restriction enzymes, and detection of KRAS gene restriction enzyme fragments.

（検査用試料・病理検体の準備）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料はＫＲＡＳタンパク質をコードする遺伝子（ＫＲＡＳ遺伝子）を含むものであればよく、特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織が挙げられ、手術により切除した癌の組織や、手術前の内視鏡検査等に用いる生体検査材料等が、試料の有効利用の点で好適に用いられる。その他、血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等も試料として挙げられる。 (Preparation of test samples and pathological specimens)
The human sample used for the test method of the present invention is not particularly limited as long as it contains a gene encoding KRAS protein (KRAS gene). Specific examples include tissues collected from living bodies, and cancer tissues excised by surgery, biopsy materials used for endoscopy before surgery, and the like are preferably used in terms of effective use of samples. . In addition, blood, pancreatic juice, serum, feces, semen, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, and the like can be mentioned as samples.

（ＫＲＡＳ遺伝子の抽出）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料は、ブレンダーを用いて組織を破砕し、次いで、フェノール・クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、ＫＲＡＳ遺伝子を抽出し、検査用試料として用いる。 (Extraction of KRAS gene)
The human sample used in the test method of the present invention is disrupted by using a blender, and then the KRAS gene is extracted by a known gene extraction method such as the phenol / chloroform method and used as a test sample. .

（遺伝子・核酸増幅）
本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。 (Gene / Nucleic acid amplification)
In the present invention, a known method can be used as the gene amplification method, and examples thereof include the PCR method.

（ネステッドＰＣＲ法）
本発明において、第１の工程と、第２の工程において、ＰＣＲで核酸を増幅する場合のＰＣＲは、ネステッドＰＣＲ法という。
ネステッドＰＣＲでは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行う方法であり、目的とする領域から最初のＰＣＲ産物を鋳型にして、最初に使用したプライマー位置より、両方とも内側にプライマーを設定して行う。
ＰＣＲは、２つのプライマー対が適当な間隔で向き合って存在することによる特異性に基づいて特定の断片を増幅する手法であるが、プライマーの類似配列によってミススプライシングがときどき起こり、標的配列の増幅とともに非特異的な増幅が起こってしまう。この非特異的断片を含むＰＣＲ生成物を鋳型にしてネステッドＰＣＲを行うと、非特異的な断片のなかにネステッドプライマーに類似した配列が存在する確立が極めて低くなるため、非特異的増幅の“ノイズの海”から標的配列のみをうまく拾い出してくることが可能になる。したがって、ネステッドＰＣＲ法は、バックグラウンドが出やすいＰＣＲの場合に有効な方法である。
ネステッドＰＣＲ法において、検出したい点変異を含むＰＣＲ領域を第１の工程で増幅するものは、エンリッチＰＣＲ法ともいう。
本発明においては、ネステッドＰＣＲの他、セミネストテッドＰＣＲ、ダブルＰＣＲを用いても良い。 (Nested PCR method)
In the present invention, PCR when a nucleic acid is amplified by PCR in the first step and the second step is called a nested PCR method.
Nested PCR is a method of performing two-step PCR using an outer primer and an inner primer, and using the first PCR product from the target region as a template, both are located on the inner side from the primer position used first. Set the primer.
PCR is a method of amplifying a specific fragment based on the specificity due to the presence of two primer pairs facing each other at an appropriate interval, but mis-splicing sometimes occurs due to the similar sequences of the primers, along with amplification of the target sequence. Non-specific amplification occurs. When nested PCR is performed using a PCR product containing this non-specific fragment as a template, the probability that a sequence similar to a nested primer exists in the non-specific fragment is extremely low. Only the target sequence can be successfully picked up from the “Sea of Noise”. Therefore, the nested PCR method is an effective method in the case of PCR that tends to generate a background.
In the nested PCR method, what amplifies a PCR region containing a point mutation to be detected in the first step is also called an enriched PCR method.
In the present invention, semi-nested PCR and double PCR may be used in addition to nested PCR.

（制限酵素）
前記ＫＲＡＳ遺伝子増幅による増幅産物は、コドン１２の変異の検出には制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）により処理する。Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）の至適温度は３７℃付近である。コドン１３の変異の検出には制限酵素Ｂｇｌ１（又はＢｓｔＮ１）により処理する。Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）の至適温度は３７℃付近である。 (Restriction enzyme)
The amplification product obtained by the KRAS gene amplification is treated with a restriction enzyme Mva1 (or BstN1) for detection of a mutation in codon 12. The optimum temperature of Mva1 (or BstN1) is around 37 ° C. Detection of the mutation at codon 13 is performed with the restriction enzyme Bgl1 (or BstN1). The optimum temperature of Mva1 (or BstN1) is around 37 ° C.

（ＫＲＡＳ遺伝子の制限酵素断片の検出）
前記制限酵素で処理した断片は、制限酵素断片長多型を用いて検出する。 (Detection of restriction enzyme fragment of KRAS gene)
The fragment treated with the restriction enzyme is detected using a restriction enzyme fragment length polymorphism.

（変異検出試薬・変異検出試薬キット）
本発明はまた、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出のための方法に用いられる変異検出試薬及び変異検出試薬キットを含む。変異検出試薬としては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３を含む領域を増幅する核酸増幅用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレア−ゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。 (Mutation detection reagent / mutation detection reagent kit)
The present invention also includes a mutation detection reagent and a mutation detection reagent kit used in a method for detecting a mutation in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene. Examples of the mutation detection reagent include any reagent used in the method of the present invention, such as a nucleic acid amplification primer that amplifies the region containing codons 12 and 13 of the KRAS gene, DNA polymerase, exonuclease, and a label for nucleic acid detection. Either may be sufficient.

また、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出のための方法に用いられる変異検出試薬キットは、本発明の検出方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであればよい。また、蛍光標識をプローブしたＤＮＡも本キットに含めてもよい。   Moreover, the mutation detection reagent kit used in the method for detecting the mutation of codon 12 and codon 13 of the KRAS gene uses at least two or more of all reagents used in the detection method of the present invention as a kit. I just need it. Further, DNA probed with a fluorescent label may also be included in the kit.

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.

（実施例１）
大腸癌患者の外科手術より得られた癌部及び正常粘膜部より抽出・精製したゲノム遺伝子を準備した。 (Example 1)
Genomic genes extracted and purified from cancer and normal mucosa obtained from surgery for colon cancer patients were prepared.

ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を検出する１次ＰＣＲでは、図１中の１２＆１３ＳＰ（配列番号２）とＷｉｌｄＡＳ（配列番号３）のプライマーを用いた：
１２＆１３ＳＰ：ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴ
ＷｉｌｄＡＳ：ＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡ
この実施例では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２より４塩基上流に存在するＡ（アデニン）に対応する部分の１２＆１３ＳＰのプライマーをＣ（シトシン）に変換し、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２より３塩基上流に存在するＧ（グアニン）に対応する部分の１２＆１３ＳＰのプライマーをＣ（シトシン）に変換するミスマッチを導入することにより、コドン１２に変異がない遺伝子増幅産物の制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）による認識部位を作り出し、コドン３に変異がない遺伝子増幅産物の制限酵素Ｂｇｌ１による認識部位を作り出すこととした。 In the primary PCR for detecting mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene, primers 12 & 13SP (SEQ ID NO: 2) and WildAS (SEQ ID NO: 3) in FIG. 1 were used:
12 & 13SP: ACTGAATATAAACTTGTGGGTAGTGGCCCCT
WildAS: AACAGAGATTTACCTCTATTGTTGGATCA
In this example, the 12 & 13SP primer corresponding to A (adenine) present 4 bases upstream from codon 12 of the KRAS gene is converted to C (cytosine) and present 3 bases upstream from codon 12 of the KRAS gene. By introducing a mismatch that converts the 12 & 13SP primer corresponding to G (guanine) into C (cytosine), a recognition site by the restriction enzyme Mva1 (or BstN1) of the gene amplification product without mutation at codon 12 is created, A recognition site by the restriction enzyme Bgl1 of a gene amplification product having no mutation at codon 3 was created.

この１次ＰＣＲによる遺伝子増幅産物を、コドン１２及びコドン１３の変異検出用にそれぞれ５μｌ用いて、コドン１２の変異検出用にはＭｖａ１により、最初の制限酵素処理（１次制限酵素処理）を行い、コドン１３の変異検出用にはＢｇｌ１により、最初の制限酵素処理（１次制限酵素処理）を行った。   5 μl each of the gene amplification product by primary PCR is used for detection of mutations in codon 12 and codon 13, and the first restriction enzyme treatment (primary restriction enzyme treatment) is performed with Mva1 for detection of mutation in codon 12. In order to detect the mutation of codon 13, the first restriction enzyme treatment (primary restriction enzyme treatment) was performed with Bgl1.

次に２次ＰＣＲでは、コドン１２の変異検出用には、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と１２ｍｔＡＳ（配列番号４）のプライマーを用いた：
１２＆１３ＳＰ：ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴ
１２ｍｔＡＳ：ＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡ
コドン１３の変異検出用には、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と１３ｍｔＡＳ（配列番号５）のプライマーを用いた：
１２＆１３ＳＰ：ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴ
１３ｍｔＡＳ：ＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡ
本実施例では、セミネステッドＰＣＲ又はダブルＰＣＲを用いた。この実施例では、コドン１２の変異検出用には、１２ｍｔＡＳの１９番目と２０番目の塩基をＣ（シトシン）にに変換するミスマッチを導入することにより、コドン１２の変異の有無によらず、コドン１２以外の部位で遺伝子増幅産物の制限酵素Ｍｖａ１よる認識部位を作り出すこととした。これにより、１次ＰＣＲの増幅産物が増幅されるので、コドン１２の変異の有無がより顕著に判定でき、かつ、制限酵素反応を確認することができる。また、この実施例では、コドン１３の変異検出用には、１３ｍｔＡＳの１１番目と１９番目の塩基をＧ（グアニン）に、２１番目の塩基をＣ（シトシン）に変換するミスマッチを導入することにより、コドン１３の変異の有無によらず、コドン１３以外の部位で遺伝子増幅産物の制限酵素Ｂｇｌ１よる認識部位を作り出すこととした。これにより、１次ＰＣＲの増幅産物が増幅されるので、コドン１３の変異の有無がより顕著に判定でき、かつ、制限酵素反応を確認することができる。 The secondary PCR then used 12 & 13SP (SEQ ID NO: 2) and 12mtAS (SEQ ID NO: 4) primers for detection of codon 12 mutations:
12 & 13SP: ACTGAATATAAACTTGTGGGTAGTGGCCCCT
12mtAS: AACAAGATTTACCTCTATTTCCTGGATCA
For the detection of codon 13 mutations, 12 & 13SP (SEQ ID NO: 2) and 13mtAS (SEQ ID NO: 5) primers were used:
12 & 13SP: ACTGAATATAAACTTGTGGGTAGTGGCCCCT
13mtAS: AACAAGATTTGCCCTCTATGGCTGGATCA
In this example, semi-nested PCR or double PCR was used. In this example, for detecting the mutation of codon 12, by introducing a mismatch that converts the 19th and 20th bases of 12mtAS into C (cytosine), the codon 12 can be detected regardless of the presence or absence of the codon 12 mutation. It was decided to create a recognition site for the gene amplification product restriction enzyme Mva1 at a site other than 12. Thereby, since the amplification product of the primary PCR is amplified, the presence / absence of the codon 12 mutation can be determined more remarkably, and the restriction enzyme reaction can be confirmed. Also, in this example, for mutation detection of codon 13, by introducing a mismatch that converts the 11th and 19th bases of 13mtAS into G (guanine) and the 21st base into C (cytosine). Regardless of whether or not the codon 13 is mutated, a recognition site by the restriction enzyme Bgl1 of the gene amplification product is created at a site other than the codon 13. As a result, the amplification product of the primary PCR is amplified, so that the presence or absence of the codon 13 mutation can be determined more remarkably, and the restriction enzyme reaction can be confirmed.

（１次ＰＣＲ）
１０倍濃度のＰＣＲ緩衝溶液、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭの１２＆１３ＳＰ（配列番号２）、０．２μＭのＷｉｌｄＡＳ（配列番号３）、１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とほぼ１００ｎｇのＫＲＡＳ遺伝子（ＤＮＡ）を用いＰＣＲ溶液を２５μｌとした。ＰＣＲの温度条件は９５℃で１１分の後、９５℃で３０秒→５８℃で３０秒→７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返して遺伝子を増幅した。その結果、１２０ｂｐの増幅産物が得られた（図１（ａ））。 (Primary PCR)
10-fold concentrated PCR buffer solution, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1 mM deoxynucleotide triphosphate, 0.2 μM 12 & 13SP (SEQ ID NO: 2), 0.2 μM WildAS (SEQ ID NO: 3), 1.25 U Taq polymerase (Ampli-TaqGold; Perkin-Elmer, Foster City, CA) and approximately 100 ng of KRAS gene (DNA) were used to make the PCR solution 25 μl. The PCR temperature condition was 95 ° C for 11 minutes, and then the gene was amplified by repeating a cycle of 95 ° C for 30 seconds → 58 ° C for 30 seconds → 72 ° C for 30 seconds 30 times. As a result, an amplification product of 120 bp was obtained (FIG. 1 (a)).

上記ＰＣＲにより得られた増幅産物の含まれる増幅産物液２５μｌのうち５μｌを用いて、コドン１２の変異検出用には制限酵素Ｍｖａ１（Ｔａｋａｒａ社）による切断を行い、コドン１３の変異検出用には制限酵素Ｂｇｌ１（Ｔａｋａｒａ社）による切断を行った。   Using 5 μl of 25 μl of the amplification product solution containing the amplification product obtained by the above PCR, cleaving with the restriction enzyme Mva1 (Takara) for detecting the mutation of codon 12, and for detecting the mutation of codon 13 Cleavage with restriction enzyme Bgl1 (Takara) was performed.

（コドン１２の変異検出のための１次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ２μｌ、制限酵素Ｍｖａ１（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、蒸留水３．５μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれる遺伝子増幅液２５μｌのうち５μｌを用い合計２０μｌとした。切断反応はＭｖａ１の至適温度である３７℃で２時間行った（図１（ｂ））。 (Primary restriction enzyme treatment for codon 12 mutation detection)
A total of 20 μl was used using 5 μl of 25 μl of a gene amplification solution containing 10 μl concentration NEbuffer 2 μl, restriction enzyme Mva1 (5 U / μl) 0.5 μl, distilled water 3.5 μl, and amplification product obtained by primary PCR. The cleavage reaction was carried out at 37 ° C., which is the optimum temperature for Mva1, for 2 hours (FIG. 1 (b)).

（コドン１３の変異検出のための１次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ２μｌ、制限酵素Ｂｇｌ１（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、蒸留水３．５μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれる遺伝子増幅液２５μｌのうち５μｌを用い合計２０μｌとした。切断反応はＢｇｌ１の至適温度である３７℃で２時間行った（図１（ｃ））。 (Primary restriction enzyme treatment for codon 13 mutation detection)
A total of 20 μl was used using 5 μl of 25 μl of gene amplification solution containing 10 μl concentration of NE buffer 2 μl, restriction enzyme Bgl1 (5 U / μl) 0.5 μl, distilled water 3.5 μl, and amplification product obtained by primary PCR. The cleavage reaction was carried out at 37 ° C., which is the optimum temperature for Bgl1, for 2 hours (FIG. 1 (c)).

（コドン１２の変異検出のための２次ＰＣＲ）
コドン１２の変異検出のための１次ＰＣＲの増幅産物を増幅するプライマーとして、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と、１２ｍｔＡＳ（配列番号４）を用いた。
１０倍濃度のＰＣＲ緩衝溶液、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭの１２＆１３ＳＰ（配列番号２）、０．２μＭの１２ｍｔＡＳプライマー（配列番号４）、１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とコドン１２の変異検出のための１次制限酵素処理による切断された増幅産物を鋳型にして（１μｌ）、ＰＣＲ溶液を合計２５μｌとした。ＰＣＲの温度条件は９５℃で１１分の後、９５℃で３０秒→５３℃で３０秒→７２℃で３０秒のサイクルを２６〜３０回繰り返して遺伝子を増幅した（図１（ｄ））。 (Secondary PCR for codon 12 mutation detection)
12 & 13SP (SEQ ID NO: 2) and 12mtAS (SEQ ID NO: 4) were used as primers for amplifying the primary PCR amplification product for detecting the mutation of codon 12.
10-fold concentration of PCR buffer solution, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1 mM deoxynucleotide triphosphate, 0.2 μM 12 & 13SP (SEQ ID NO: 2), 0.2 μM 12mtAS primer (SEQ ID NO: 4), 1.25 U Taq Amplification product cleaved by primary restriction enzyme treatment for detection of mutation in polymerase (Ampli-TaqGold; Perkin-Elmer, Foster City, CA) and codon 12 was used as a template (1 μl), and the PCR solution was made up to 25 μl in total. . PCR temperature condition was 95 ° C. for 11 minutes, and then the gene was amplified by repeating a cycle of 95 ° C. for 30 seconds → 53 ° C. for 30 seconds → 72 ° C. for 30 seconds 26-30 times (FIG. 1 (d)). .

（コドン１３の変異検出のための２次ＰＣＲ）
コドン１３の変異検出のための１次ＰＣＲの増幅産物を増幅するプライマーとして、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と、１３ｍｔＡＳ（配列番号５）を用いた。
１０倍濃度のＰＣＲ緩衝溶液、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭの１２＆１３ＳＰ（配列番号２）、０．２μＭの１３ｍｔＡＳプライマー（配列番号５）、１．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とコドン１２の変異検出のための１次制限酵素処理による切断された増幅産物を鋳型にして（１μｌ）、ＰＣＲ溶液を合計２５μｌとした。ＰＣＲの温度条件は９５℃で１１分の後、９５℃で３０秒→５３℃で３０秒→７２℃で３０秒のサイクルを２６〜３０回繰り返して遺伝子を増幅した（図１（ｅ））。 (Secondary PCR for codon 13 mutation detection)
12 & 13SP (SEQ ID NO: 2) and 13mtAS (SEQ ID NO: 5) were used as primers for amplifying the primary PCR amplification product for detecting the mutation of codon 13.
10-fold concentration of PCR buffer solution, 1.5 mM MgCl 2 , 0.1 mM deoxynucleotide triphosphate, 0.2 μM 12 & 13SP (SEQ ID NO: 2), 0.2 μM 13mtAS primer (SEQ ID NO: 5), 1.25 U Taq Amplification product cleaved by primary restriction enzyme treatment for detection of mutation in polymerase (Ampli-TaqGold; Perkin-Elmer, Foster City, CA) and codon 12 was used as a template (1 μl), and the PCR solution was made up to 25 μl in total. . PCR temperature conditions were 95 ° C. for 11 minutes, and then the gene was amplified by repeating a cycle of 95 ° C. for 30 seconds → 53 ° C. for 30 seconds → 72 ° C. for 30 seconds 26-30 times (FIG. 1 (e)). .

（コドン１２の変異検出のための２次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ３μｌ、制限酵素Ｍｖａ１（５Ｕ／μｌ）１μｌ、蒸留水１μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれるコドン１２の変異検出のための２次ＰＣＲによる遺伝子増幅液２５μｌを用い合計３０μｌとした。切断反応はＭｖａ１の至適温度である３７℃で６時間以上行った（図１（ｆ））。 (Secondary restriction enzyme treatment for codon 12 mutation detection)
Using 10 μl concentration of NE buffer 3 μl, restriction enzyme Mva1 (5 U / μl) 1 μl, distilled water 1 μl, 25 μl of gene amplification solution by secondary PCR for detecting mutation of codon 12 contained in amplification product obtained by primary PCR The total volume was 30 μl. The cleavage reaction was performed at 37 ° C., which is the optimum temperature for Mva1, for 6 hours or longer (FIG. 1 (f)).

（コドン１３の変異検出のための２次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ３μｌ、制限酵素Ｂｇｌ１（５Ｕ／μｌ）１μｌ、蒸留水１μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれるコドン１３の変異検出のための２次ＰＣＲによる遺伝子増幅液２５μｌを用い合計３０μｌとした。切断反応はＢｇｌ１の至適温度である３７℃で６時間以上行った（図１（ｇ））。 (Secondary restriction enzyme treatment for codon 13 mutation detection)
Using 10 μl concentration of NE buffer 3 μl, restriction enzyme Bgl1 (5 U / μl) 1 μl, distilled water 1 μl, 25 μl of gene amplification solution by secondary PCR for detecting mutation of codon 13 contained in amplification product obtained by primary PCR The total volume was 30 μl. The cleavage reaction was performed at 37 ° C., which is the optimum temperature for Bgl1, for 6 hours or longer (FIG. 1 (g)).

上記、制限酵素で処理した制限酵素断片を制限酵素断片長多型により検出した。   The restriction enzyme fragment treated with the restriction enzyme was detected by restriction enzyme fragment length polymorphism.

（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２の変異の検出）
２次制限酵素処理により、コドン１２に変異がない場合には、６０ｂｐ、２９ｂｐ、２１ｂｐの３種類の断片が検出される。一方、総てのコドン１２に変異がある場合は、９９ｂｐ、２１ｂｐの２種類の断片が検出されるが、実際には、総てのコドン１２のうちの一部に変異があることが殆んどであり、この場合、９９ｂｐ、６０ｂｐ、２９ｂｐ、２１ｂｐの４種類の断片が検出される。実際には、１２０ｂｐ、９１ｂｐの断片も認められる場合があるが、これは、制限酵素処理が不良であるか、鋳型量が過剰の場合である。
基本的に、９９ｂｐの断片が６０ｂｐの断片と同等か、より強く認められた場合に、コドン１２に変異があると判定する。
結果を図２（ａ）に示す。 (Detection of mutation in KRAS gene codon 12)
When codon 12 is not mutated by the secondary restriction enzyme treatment, three types of fragments of 60 bp, 29 bp, and 21 bp are detected. On the other hand, when all the codons 12 are mutated, two kinds of fragments of 99 bp and 21 bp are detected, but in fact, most of all the codons 12 are mutated. In this case, four types of fragments of 99 bp, 60 bp, 29 bp, and 21 bp are detected. In practice, fragments of 120 bp and 91 bp may be observed, but this is a case where the restriction enzyme treatment is poor or the amount of the template is excessive.
Basically, if the 99 bp fragment is equal to or stronger than the 60 bp fragment, it is determined that there is a mutation in codon 12.
The results are shown in FIG.

この例によれば、右から２から４番目のレーンには９９ｂｐ、６０ｂｐの断片が検出され、コドン１２の変異ありと判定され、最右のレーンでは６０ｂｐの断片のみが検出され、コドン１２の変異なしと判定された。   According to this example, 99 bp and 60 bp fragments are detected in the 2nd to 4th lanes from the right, and it is determined that there is a mutation of codon 12, and only the 60 bp fragment is detected in the rightmost lane. It was determined that there was no mutation.

（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１３の変異の検出）
２次制限酵素処理により、コドン１３に変異がない場合には、７４ｂｐ、３２ｂｐ、１４ｂｐの３種類の断片が検出される。一方、総てのコドン１３に変異がある場合は、１０６ｂｐ、１４ｂｐの２種類の断片が検出されるが、実際には、総てのコドン１３のうちの一部に変異があることが殆んどであり、この場合、１０６ｂｐ、７４ｂｐ、３２ｂｐ、１４ｂｐの４種類の断片が検出される。実際には、１２０ｂｐ、８８ｂｐの断片も認められる場合があるが、これは、制限酵素処理が不良であるか、鋳型量が過剰の場合である。
基本的に、１０６ｂｐの断片が７４ｂｐの断片と同等か、より強く認められた場合に、コドン１３に変異があると判定する。
結果を図２（ｃ）に示す。 (Detection of mutation in KRAS gene codon 13)
When codon 13 is not mutated by the secondary restriction enzyme treatment, three types of fragments of 74 bp, 32 bp, and 14 bp are detected. On the other hand, when all codons 13 are mutated, two types of fragments of 106 bp and 14 bp are detected. In practice, however, most of all codons 13 are mutated. In this case, four types of fragments of 106 bp, 74 bp, 32 bp, and 14 bp are detected. In practice, 120 bp and 88 bp fragments may also be observed, but this is a case where the restriction enzyme treatment is poor or the amount of the template is excessive.
Basically, when the 106 bp fragment is equal to or stronger than the 74 bp fragment, it is determined that there is a mutation in codon 13.
The results are shown in FIG.

この例によれば、右から３から４番目のレーンには１０６ｂｐ、７４ｂｐの断片が検出され、コドン１３の変異ありと判定され、最右のレーンでは７４ｂｐの断片のみが検出され、コドン１３の変異なしと判定された。   According to this example, 106 bp and 74 bp fragments are detected in the 3rd to 4th lanes from the right, and it is determined that there is a mutation in codon 13, and only a 74 bp fragment is detected in the rightmost lane. It was determined that there was no mutation.

このように、本実施例によれば、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で行うことにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、再現性よく、精度よく行うことができることが確認された。   As described above, according to this example, the codon 12 and codon 13 of the KRAS gene are mutated by a single operation, so that the presence or absence of the mutation of codons 12 and 13 of the KRAS gene can be reproducibly performed by a single operation. Well, it was confirmed that it can be performed accurately.

本発明の核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出試薬キットの製造は、製薬業界、バイオテクノロジーの分野などで利用することができる。本発明のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出試薬キットは、医療業において有用に利用することができる。   The production of the nucleic acid amplification primer, nucleic acid amplification primer set, and mutation detection reagent kit for codon 12 and codon 13 of the KRAS gene of the present invention can be used in the pharmaceutical industry, biotechnology field, and the like. The method for detecting the mutation of codon 12 and codon 13 of the KRAS gene of the present invention, the primer for nucleic acid amplification used for this detection method, the primer set for nucleic acid amplification, and the mutation detection reagent kit for codon 12 and codon 13 of the KRAS gene are as follows: It can be used effectively in the medical industry.

本発明に係るＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法の概要を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the outline | summary of the detection method of the variation | mutation of the codon 12 and the codon 13 of the KRAS gene based on this invention. 本発明によるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出を示す図である。It is a figure which shows the detection of the variation | mutation of the codon 12 and the codon 13 of the KRAS gene by this invention.

Claims (11)

ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出するために用いられる核酸増幅用プライマーであって、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が特定の第１の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が特定の第２の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該核酸増幅用プライマー含む核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が、当該特定の第１の制限酵素にも当該特定の第２の制限酵素にも認識されることにより、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成することを特徴とする核酸増幅用プライマー。 A nucleic acid amplification primer used for detecting mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene in a single operation,
If there is a mutation in the codon 12 of the KRAS gene, the amplification product of the KRAS gene by the nucleic acid amplification primer set including the nucleic acid amplification primer is not recognized by the specific first restriction enzyme, and the codon 13 of the KRAS gene If there is a mutation, the amplification product of the KRAS gene by the nucleic acid amplification primer set including the nucleic acid amplification primer is not recognized by the specific second restriction enzyme, and neither the codon 12 nor the codon 13 of the KRAS gene If there is no mutation, the amplification product of the KRAS gene by the nucleic acid amplification primer set including the nucleic acid amplification primer is recognized by the specific first restriction enzyme and the specific second restriction enzyme. ,
A primer for nucleic acid amplification characterized in that it produces restriction enzyme fragments of different lengths depending on the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene. 配列番号２で表され、前記特定の第１の制限酵素がＭｖａ１又はＢｓｔＮ１であり、前記特定の第２の制限酵素がＢｇｌ１であることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅用プライマー。   The primer for nucleic acid amplification according to claim 1, represented by SEQ ID NO: 2, wherein the specific first restriction enzyme is Mva1 or BstN1, and the specific second restriction enzyme is Bgl1. ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出するために用いられる核酸増幅用プライマーセットであって、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が前記特定の第１の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が前記特定の第２の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が、当該特定の第１の制限酵素にも当該特定の第２の制限酵素にも認識されることにより、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成することを特徴とする核酸増幅用プライマーセット。 A nucleic acid amplification primer set used for detecting mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene in a single operation,
If there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene, the amplified product of the KRAS gene by the primer set for nucleic acid amplification is not recognized by the specific first restriction enzyme, and there is a mutation in codon 13 of the KRAS gene. If the amplification product of the KRAS gene by the primer set for nucleic acid amplification is not recognized by the specific second restriction enzyme and there is no mutation in codon 12 or codon 13 of the KRAS gene, the primer for nucleic acid amplification The amplification product of the KRAS gene by the set is recognized by the specific first restriction enzyme and the specific second restriction enzyme,
A primer set for nucleic acid amplification, wherein restriction enzyme fragments having different lengths are generated depending on the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene. 配列番号２及び３で表される核酸増幅用プライマーを含み、前記特定の第１の制限酵素がＭｖａ１又はＢｓｔＮ１であり、前記特定の第２の制限酵素がＢｇｌ１であることを特徴とする請求項３記載の核酸増幅用プライマーセット。   A primer for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NOs: 2 and 3, wherein the specific first restriction enzyme is Mva1 or BstN1, and the specific second restriction enzyme is Bgl1 The primer set for nucleic acid amplification according to 3. ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出する方法であって、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識することにより、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成し、
その制限酵素断片を、制限酵素断片長多型を用いて検出することを特徴とするＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。 A method of detecting mutations in codons 12 and 13 of a KRAS gene in a single operation,
If there is a mutation in codon 12 of the KRAS gene, the specific first restriction enzyme does not recognize the amplification product of the KRAS gene by the first nucleic acid amplification primer set, and there is a mutation in codon 13 of the KRAS gene. For example, if the specific second restriction enzyme does not recognize the amplification product of the KRAS gene by the first nucleic acid amplification primer set, and there is no mutation in codon 12 or codon 13 of the KRAS gene, the first By recognizing the specific first restriction enzyme and the specific second restriction enzyme, the amplification product of the KRAS gene by the nucleic acid amplification primer set of 1
Generating restriction enzyme fragments of different lengths depending on the presence or absence of mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene;
A method for detecting mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene, wherein the restriction enzyme fragment is detected using a restriction enzyme fragment length polymorphism. 請求項３又は４記載の核酸増幅用プライマーセットを使用し、前記特定の第１の制限酵素としてＭｖａ１又はＢｓｔＮ１を用い、前記特定の第２の制限酵素としてＢｇｌ１を用いることを特徴とする請求項５記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。   The primer set for nucleic acid amplification according to claim 3 or 4, wherein Mva1 or BstN1 is used as the specific first restriction enzyme, and Bgl1 is used as the specific second restriction enzyme. 6. A method for detecting a mutation in codons 12 and 13 of the KRAS gene according to 5. 以下の工程からなるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法：
（１）第１の工程：第１の核酸増幅用プライマーセットを用いて当該ＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第１の制限酵素又は特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（２）第２の工程：１）第１の工程において当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、当該特定の第１の制限酵素で処理した反応液に対して、第２の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第１の制限酵素で処理する工程と、
２）第１の工程において当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、第３の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（３）第３の工程：当該第２の工程で得られたＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物の制限酵素断片を、制限酵素断片長多型を用いて検出する工程とからなり、
当該第１の工程において、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を当該特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を当該特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識することを特徴とするＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。 A method of detecting mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene comprising the following steps:
(1) First step: A nucleic acid amplification of the KRAS gene is performed using a first nucleic acid amplification primer set, and the amplification product of the KRAS gene is used as a specific first restriction enzyme or a specific second restriction enzyme. In the process of processing,
(2) Second step: 1) When treated with the specific first restriction enzyme in the first step, the reaction solution treated with the specific first restriction enzyme has a second Performing nucleic acid amplification of the KRAS gene using the primer set for nucleic acid amplification, and then treating with the specific first restriction enzyme;
2) When treated with the specific second restriction enzyme in the first step, nucleic acid amplification of the KRAS gene is performed using the third nucleic acid amplification primer set, and then the specific second restriction enzyme is used. A step of treating with an enzyme;
(3) Third step: a step of detecting a restriction enzyme fragment of the amplification product of the KRAS gene obtained in the second step using a restriction enzyme fragment length polymorphism,
In the first step, if there is a mutation in the codon 12 of the KRAS gene, the specific first restriction enzyme does not recognize the amplification product of the KRAS gene by the first nucleic acid amplification primer set, and the KRAS gene If there is a mutation in the codon 13 of the KRAS gene, the specific second restriction enzyme does not recognize the amplification product of the KRAS gene by the first nucleic acid amplification primer set, and neither the codon 12 nor the codon 13 of the KRAS gene If there is no mutation, the KRAS gene amplification product by the first nucleic acid amplification primer set recognizes both the specific first restriction enzyme and the specific second restriction enzyme. A method for detecting a mutation in codon 12 and codon 13. 前記第２の工程において、前記ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２以外の箇所を前記特定の第１の制限酵素が認識し、前記ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３以外の箇所を前記特定の第２の制限酵素が認識することを特徴とする請求項７記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。   In the second step, the specific first restriction enzyme recognizes a part other than the codon 12 of the KRAS gene, and the specific second restriction enzyme recognizes a part other than the codon 13 of the KRAS gene. The method for detecting mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene according to claim 7. 前記第１の工程及び前記第２の工程における前記ＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅に、ネステッドＰＣＲ法、セミネステッドＰＣＲ法、ダブルＰＣＲ法のいずれかを用い、当該第１の工程において配列番号２及び３で表される核酸増幅用プライマーセットを用い、
当該第１の工程において前記特定の第１の制限酵素で処理した場合には、当該第２の工程において、配列番号２及び４で表される核酸増幅用プライマーセットを用い、
当該第１の工程において前記特定の第２の制限酵素で処理した場合には、当該第２の工程において、配列番号２及び５で表される核酸増幅用プライマーセットを用い、
当該特定の第１の制限酵素にＭｖａ１又はＢｓｔＮ１を用い、当該特定の第２の制限酵素にＢｇｌ１を用いることを特徴とする請求項７又は８記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。 For the nucleic acid amplification of the KRAS gene in the first step and the second step, any one of a nested PCR method, a semi-nested PCR method, and a double PCR method is used, and in the first step, SEQ ID NOs: 2 and 3 are used. Using the nucleic acid amplification primer set shown,
When treated with the specific first restriction enzyme in the first step, using the primer set for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NOs: 2 and 4 in the second step,
When treated with the specific second restriction enzyme in the first step, using the primer set for nucleic acid amplification represented by SEQ ID NOs: 2 and 5 in the second step,
The mutation of codons 12 and 13 of the KRAS gene according to claim 7 or 8, wherein Mva1 or BstN1 is used as the specific first restriction enzyme and Bgl1 is used as the specific second restriction enzyme. Detection method. 前記ＫＲＡＳ遺伝子が、血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液から選択されるいずれか１つに由来することを特徴とする請求項７から９のいずれか１項記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。   10. The KRAS gene is derived from any one selected from blood, pancreatic juice, serum, stool, semen, saliva, sputum, and cerebrospinal fluid, according to any one of claims 7 to 9. A method for detecting mutations in codon 12 and codon 13 of the KRAS gene. 配列番号２、３、４、及び５で表される核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットと、制限酵素Ｍｖａ１、ＢｔｓＮ１、Ｂｇｌ１と、ＤＮＡポリメラーゼを含むＫＲＡＳ遺伝子コドン１２及び１３の変異検出試薬キット。   Nucleic acid amplification primer set including nucleic acid amplification primers represented by SEQ ID NOs: 2, 3, 4, and 5; restriction enzyme Mva1, BtsN1, Bgl1, and mutation detection reagent for KRAS gene codons 12 and 13 including DNA polymerase kit.
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