JP2005185291A - Recombinant candida rugosa lipase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般的な宿主細胞において異種C. rugosa （カンジダ・ルゴサ）リパーゼを機能的に発現させるために使用されうる核酸、工業的用途のための特定の性質を有するリパーゼ、および前記リパーゼを産生しうる微生物に関する。 The present invention relates to a nucleic acid that can be used to functionally express a heterologous C. rugosa lipase in a general host cell, a lipase having specific properties for industrial use, and said lipase. It relates to microorganisms that can be produced.
リパーゼ（EC 3.1.1.3）は、非特異的および立体特異的な加水分解、エステル化、エステル転移反応およびエステル交換反応を含む広範囲にわたる化学反応を触媒することができる。また、前記リパーゼは、水−脂質界面でのエステル結合の加水分解を触媒する。例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５を参照のこと。 Lipase (EC 3.1.1.3) can catalyze a wide range of chemical reactions including non-specific and stereospecific hydrolysis, esterification, transesterification and transesterification. The lipase catalyzes the hydrolysis of ester bonds at the water-lipid interface. For example, see Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4, and Non-Patent Document 5.
市販のリパーゼの中でもCandida rugosa（カンジダ・ルゴサ）リパーゼは、その触媒能ゆえに、バイオ産業で広く使用されている。一般的には、ほとんど全ての生体触媒用途に粗製Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼが利用されるが、種々の供給者から入手した酵素は、それらの触媒効率および立体特異性にばらつきを示すと報告されている。非特許文献６を参照のこと。粗製Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼからはいくつかの異性体（すなわちアイソザイム）が単離されており、それらリパーゼアイソザイムは、触媒効率および特異性が異なることが明らかになった。非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９を参照のこと。 Among commercially available lipases, Candida rugosa lipase is widely used in the bio industry due to its catalytic ability. Generally, crude C.I. for almost all biocatalytic applications. Although rugosa lipase is utilized, enzymes obtained from various suppliers have been reported to vary in their catalytic efficiency and stereospecificity. See Non-Patent Document 6. Crude C.I. Several isomers (ie, isozymes) have been isolated from rugosa lipase and these lipase isozymes have been shown to differ in catalytic efficiency and specificity. See Non-Patent Document 7, Non-Patent Document 8, and Non-Patent Document 9.
現在までに、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ由来の５つのリパーゼ−コードゲノム配列が特徴づけられている。例えば、非特許文献１０および非特許文献１１を参照のこと。これら５つのリパーゼ−コード遺伝子（LIP1、２、３、４、および５）は、酵母Ｃ．ｒｕｇｏｓａのSacIゲノムライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションによって単離されている。これら５つの遺伝子は、それぞれ（LIP1、３、４、および５において）１５アミノ酸長および（LIP2において）１４アミノ酸長の推定シグナルペプチドを有する５３４残基の成熟タンパク質をコードしている。５つの推定アミノ酸配列は６６％の全体的同一性および８４％の類似性を有する。前記推定アミノ酸配列中における高い配列相同性およびこれら５つのリパーゼ遺伝子における発現レベルの差異のための（非特許文献１２）、Ｃ．ｒｕｇｏｓａの培養物から工業的用途のための製造スケールで各アイソザイムを精製することは困難である。 To date, C.I. Five lipase-encoding genomic sequences from rugosa have been characterized. For example, see Non-Patent Document 10 and Non-Patent Document 11. These five lipase-encoding genes (LIP1, 2, 3, 4, and 5) are the yeast C.I. It has been isolated from a Rugosa SacI genomic library by colony hybridization. These five genes encode a mature protein of 534 residues with a putative signal peptide 15 amino acids long (in LIP1, 3, 4, and 5) and 14 amino acids long (in LIP2), respectively. The five deduced amino acid sequences have 66% overall identity and 84% similarity. C. due to high sequence homology in the deduced amino acid sequence and differences in expression levels in these five lipase genes (Non-Patent Document 12). It is difficult to purify each isozyme from a rugosa culture on a production scale for industrial use.
さらに、これらのアイソザイムは、触媒三つ組残基（アミノ酸S209、H449およびE341を含む）ならびにジスルフィド結合形成に関与する部位（アミノ酸C60 、C97 およびC268、C277を含む）が保存されているが、Ｎ−グリコシル化部位、等電点および疎水性プロファイルの他のいくつかの特徴が異なっている。また、各アイソザイムは、触媒効率および特異性などの特定の性質を説明されるであろう。非特許文献１３を参照のこと。したがって、工業的用途のための特定の性質を有する単一のアイソザイムを製造するには、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼアイソザイムのクローニングおよび機能的発現が望ましい。 Furthermore, these isozymes conserve the catalytic triad residues (including amino acids S209, H449 and E341) and the sites involved in disulfide bond formation (including amino acids C60, C97 and C268, C277), but N- The glycosylation site, isoelectric point and several other features of the hydrophobic profile are different. Each isozyme will also be described with specific properties such as catalytic efficiency and specificity. See Non-Patent Document 13. Thus, to produce a single isozyme with specific properties for industrial use, C.I. Cloning and functional expression of a rugosa lipase isozyme is desirable.
しかしながら、Ｃ．ｒｕｇｏｓａは、ロイシンのユニバーサルコドンであるトリプレットＣＴＧがセリンとして解読される二形性酵母である。このため、（ＣＴＧがロイシンとして解読される）一般的な宿主細胞ではＣ．ｒｕｇｏｓａアイソザイムの機能的発現は不可能になる。非特許文献１４を参照のこと。
本発明の目的は、一般的な宿主細胞において、異種Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを機能的に発現させ得る手段、および工業的用途に適した特定の性質を有する実質的に単一であり、かつ単離されたＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼアイソザイムまたはその誘導体を提供することにある。 The object of the present invention is to provide heterologous C. cerevisiae in general host cells. a means by which rugosa lipase can be functionally expressed, and a substantially single and isolated C. cerevisiae having specific properties suitable for industrial use. The object is to provide a rugosa lipase isozyme or a derivative thereof.
本発明は、一般的な宿主細胞において異種Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを機能的に発現させるために使用できる核酸に関する。 The present invention relates to heterologous C.I. It relates to nucleic acids that can be used to functionally express rugosa lipase.
一つの側面として、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するCandida rugosaリパーゼをコードする単離された核酸、およびコードされるアミノ酸配列を提供する。 In one aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid encoding Candida rugosa lipase containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and the encoded amino acid sequence.
別の側面として、本発明は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡを含む単離された核酸を特徴とする。前記変異型ＤＮＡは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）同一であり、野生型ＤＮＡ中のＣＴＧコドンに対応する少なくとも１２（例えば、１３、１５、１７、または全て）のユニバーサルセリンコドンを含む。各ＣＴＧコドンは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａにおいてセリンとして解読される。前記ユニバーサルセリンコドンのそれぞれは、独立してTCT
、TCC 、TCA 、TCG 、AGT またはAGC である。本明細書で使用する用語「Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ」は、単一のアイソザイムをいい、天然のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２、３、５および８ならびにそれらのバリアントおよびリパーゼ４バリアントを含む。前記単離された核酸の例としては、限定されないが、配列番号：３、５、９および１１が挙げられ、対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４、６、１０および１２である。
In another aspect, the present invention provides a C.I. Characterized by an isolated nucleic acid comprising a mutant DNA encoding rugosa lipase. The mutant DNA is C.I. At least 12 (eg, 13, 15, 17) that is at least 80% (eg, at least 85%, 90%, or 95%) identical to wild-type DNA encoding rugosa lipase and that corresponds to a CTG codon in the wild-type DNA. Or all) universal serine codons. Each CTG codon is C.I. Decoded as serine in rugosa. Each of the universal serine codons is independently TCT
, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC. As used herein, the term “C. rugosa lipase” refers to a single isozyme and is a natural C. including rugosa lipase 2, 3, 5 and 8 and variants and lipase 4 variants thereof. Examples of said isolated nucleic acids include, but are not limited to, SEQ ID NOs: 3, 5, 9 and 11, and the corresponding amino acid sequences are SEQ ID NOs: 4, 6, 10 and 12, respectively.
変異型ＤＮＡは、配列番号：３、５、９および１１のＤＮＡまたはその縮重バリアントもしくは配列番号：７バリアントであることができる。縮重バリアントとは、ユニバーサルコドンに基づき、配列番号：３、５、７、９および１１によってコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをコードするいかなる他のＤＮＡ配列をもいう。また、変異型ＤＮＡは、配列番号：４、６、１０および１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９５％、９８％または１００％）同一であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡでもありうる。実際には、ポリペプチド配列は、そのポリペプチド中の目的とする触媒能が完全には消失しているものであれば、前記アミノ酸配列の全長である必要はない。例えば、変異型ＤＮＡは、配列番号：３、５、９および１１のヌクレオチド配列の少なくとも１０７０ヌクレオチド（例えば、１２００または１５００ヌクレオチド）を含む機能的断片、または配列番号：４、６、１０および１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的断片であって少なくとも３５０アミノ酸（例えば、４００または５００アミノ酸）を含むものである断片をコードする配列である。 The mutant DNA can be DNA of SEQ ID NOs: 3, 5, 9 and 11 or a degenerate variant thereof or SEQ ID NO: 7 variant. A degenerate variant refers to any other DNA sequence that encodes the same polypeptide as that encoded by SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9 and 11 based on universal codons. The mutant DNA can also be a DNA encoding a polypeptide sequence that is at least 90% (eg, 95%, 98% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 4, 6, 10, and 12. Actually, the polypeptide sequence need not be the full length of the amino acid sequence as long as the target catalytic ability in the polypeptide is completely lost. For example, the mutant DNA is a functional fragment comprising at least 1070 nucleotides (eg, 1200 or 1500 nucleotides) of the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 3, 5, 9, and 11, or of SEQ ID NOs: 4, 6, 10, and 12. A sequence that encodes a functional fragment of a polypeptide comprising an amino acid sequence, the fragment comprising at least 350 amino acids (eg, 400 or 500 amino acids).
「単離された核酸」という用語は、天然に存在する核酸の構造と、または独立した３個を超える遺伝子にまたがる天然に存在するゲノム核酸の断片の構造とは同一でない構造である核酸をいう。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在している生物のゲノム内で分子の部分に隣接するコード配列の両方が隣接していないＤＮＡ、（ｂ）得られた分子が天然に存在する任意のベクターまたはゲノムＤＮＡとは同一でないような形式でベクターに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）によって生成された断片、または制限断片などの独立した分子、および（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である組換ヌクレオチド配列などを含む。本発明の前記単離された核酸は、微生物に導入してその中で発現させることができ、これも本発明の範囲である。微生物の例は、細菌（例えば、大腸菌）または酵母（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris ）である。 The term “isolated nucleic acid” refers to a nucleic acid that is not identical to the structure of a naturally occurring nucleic acid or to the structure of a fragment of a naturally occurring genomic nucleic acid that spans more than three independent genes. . Thus, this term includes, for example, both (a) a sequence of a part of a naturally occurring genomic DNA molecule, but both coding sequences that flank a part of the molecule in the genome of the organism in which it naturally occurs. (B) incorporated into a vector or in a prokaryotic or eukaryotic genomic DNA in such a manner that the resulting molecule is not identical to any naturally occurring vector or genomic DNA. (C) an independent molecule such as a cDNA, genomic fragment, polymerase chain reaction (PCR) or restriction fragment, and (d) part of a hybrid gene (ie, a gene encoding a fusion protein) A recombinant nucleotide sequence or the like. The isolated nucleic acid of the present invention can be introduced into a microorganism and expressed therein, and this is also within the scope of the present invention. Examples of microorganisms are bacteria (eg E. coli) or yeasts (eg Pichia pastoris).
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「同一率」（または「相同率」）は、Thompsonらのアルゴリズム（CLUSTAL W 、1994 Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）を用いて決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を「クエリー配列」として使用して、例えば、関連配列を同定するために目的で公開データベースに対する検索を行なうこともできる。かかる検索は、KarlinおよびAltschul（1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）に記載されているように改変されたKarlinおよびAltschulのアルゴリズム（1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268）を用いて行なわれうる。そのようなアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラム（1990 J. Mol. Biol. 215:403-410）に組み込まれている。BLAST ヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア（score ）＝100 、語長（wordlength）＝12で行なわれる。BLAST タンパク質検索はXBLASTプログラム、スコア＝50、語長＝３で行なわれる。２つの配列間にギャップが存在する場合は、Altschulら（1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）に記載されているように、Gapped BLASTを使用する。BLAST プログラムおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合は、各プログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用する。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照のこと。 The “identity ratio” (or “homology ratio”) between two amino acid sequences or two nucleic acids can be determined using the algorithm of Thompson et al. (CLUSTAL W, 1994 Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). An amino acid sequence or nucleotide sequence can be used as a “query sequence” to search a public database for purposes of identifying related sequences, for example. Such a search is based on the algorithm of Karlin and Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA) modified as described in Karlin and Altschul (1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). 87: 2264-2268). Such an algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs of Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403-410). BLAST nucleotide searches are performed with the NBLAST program, score = 100, wordlength = 12. BLAST protein searches are performed with the XBLAST program, score = 50, word length = 3. If there is a gap between the two sequences, use Gapped BLAST as described in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program (eg, XBLAST and NBLAST) are used. See http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
別の側面として、本発明は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡの作製方法を特徴とする。本方法は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡを提供し、該野生型ＤＮＡと、ＤＮＡポリメラーゼと、野生型ＤＮＡ全体を網羅する一対の外部プライマーと野生型ＤＮＡの断片を網羅する多数の内部プライマー対とを混合し、PCR 増幅を行なうことを含む。「外部プライマー」は、変異型ＤＮＡ全体を増幅するように設計されたPCR プライマーであり、「内部プライマー」は、変異型ＤＮＡの断片を増幅するように設計されたPCR プライマーである；プライマーは、外部プライマーとしても内部プライマーとしても機能できる。内部プライマーのそれぞれは、TCT 、TCC 、TCA 、TCG 、AGT 、AGC 、AGA 、GGA 、TGA 、CGA 、ACT およびGCT から選択された１またはそれ以上のセリンのユニバーサルコドンおよびアンチコドンを含み、ユニバーサルコドンおよびアンチコドンは、野生型ＤＮＡ中の少なくとも１２個のCTG コドンに対応する。さらに、各内部プライマーは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡが得られるような形式で別の内部プライマーまたは外部プライマーと部分的に重なり合っている。 In another aspect, the present invention provides a C.I. A method for producing a mutant DNA encoding rugosa lipase is characterized. This method is described in C.I. Providing wild-type DNA encoding rugosa lipase, and mixing the wild-type DNA, DNA polymerase, a pair of external primers covering the whole wild-type DNA, and a large number of internal primer pairs covering the wild-type DNA fragments And performing PCR amplification. An “external primer” is a PCR primer designed to amplify the entire mutant DNA, and an “internal primer” is a PCR primer designed to amplify a fragment of the mutant DNA; It can function as both an external primer and an internal primer. Each of the internal primers includes one or more universal codons and anticodons of serine selected from TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC, AGA, GGA, TGA, CGA, ACT and GCT, Anticodons correspond to at least 12 CTG codons in wild type DNA. Furthermore, each internal primer is C.I. It partially overlaps with another internal or external primer in such a way that a mutant DNA encoding rugosa lipase is obtained.
さらなる一側面として、本発明は、第１のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの基質相互作用ドメインと第２のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの非基質相互作用ドメイン（例えば、カルボキシルエステラーゼドメイン）とを含むキメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを特徴とする。例えば、第２のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼは、配列番号：８のポリペプチドであり、第１のＣ．ｒｕｇｏｓａは、配列番号：４、６、１０または１２のポリペプチドである。 As a further aspect, the present invention provides a first C.I. A substrate interaction domain of rugosa lipase and a second C.I. chimera containing a non-substrate interaction domain (eg, a carboxylesterase domain) of rugosa lipase. Characterized by rugosa lipase. For example, the second C.I. rugosa lipase is the polypeptide of SEQ ID NO: 8, and the first C.I. rugosa is the polypeptide of SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12.
生体触媒用途のためのＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの製造のための前記核酸の使用も本発明の範囲に包含される。 C. for biocatalytic applications. The use of said nucleic acid for the production of rugosa lipase is also encompassed within the scope of the present invention.
本発明の他の特徴、目的および利点は特許請求の範囲と以下の説明から明らかであろう。 Other features, objects, and advantages of the invention will be apparent from the claims and from the following description.
すなわち、本発明の要旨は、
（１） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８０％同一であり、かつ野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧに対応する少なくとも１２コドンを含み、該１２コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである変異型ＤＮＡであって、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする変異型ＤＮＡを含有してなる単離核酸、
（２） 少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（１）記載の核酸、
（３） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（２）記載の核酸、
（４） 全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（２）記載の核酸、
（５） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（４）記載の核酸、
（６） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（５）記載の核酸、
（７） 変異型ＤＮＡが、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８５％同一である、前記（１）記載の核酸、
（８） 少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（７）記載の核酸、
（９） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（８）記載の核酸、
（１０） 全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（８）記載の核酸、
（１１） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（１０）記載の核酸、
（１２） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（１１）記載の核酸、
（１３） 変異型ＤＮＡが、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも９０％同一である、前記（１）記載の核酸、
（１４） 少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（１３）記載の核酸、
（１５） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（１４）記載の核酸、
（１６） 全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（１４）記載の核酸、
（１７） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（１６）記載の核酸、
（１８） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（１７）記載の核酸、
（１９） 前記（１）記載の核酸を含有し、かつ細菌または酵母である微生物、
（２０） 細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、前記（１９）記載の微生物、
（２１） 酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（１９）記載の微生物、
（２２） 変異型ＤＮＡが、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８５％同一である、前記（１９）記載の微生物、
（２３） 細菌が、大腸菌である、前記（２２）記載の微生物、
（２４） 酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（２２）記載の微生物、
（２５） 変異型ＤＮＡが、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも９０％同一である、前記（１９）記載の微生物、
（２６） 細菌が、大腸菌である、前記（２５）記載の微生物、
（２７） 酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（２５）記載の微生物、
（２８） 配列番号：３、５、９、もしくは１１のＤＮＡまたはその縮重バリアントまたは配列番号：７バリアントのＤＮＡを含有してなる単離核酸、
（２９） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡを提供する工程；および
野生型ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼと該野生型ＤＮＡの全体を網羅する外部プライマー対と野生型ＤＮＡの断片をそれぞれ網羅する内部プライマー対とを混合して、ＰＣＲ増幅を行なう工程
を含み、ここで、内部プライマーのそれぞれが、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴおよびＧＣＴからなる群より選ばれたセリンに対する１以上のユニバーサルコドンおよびアンチコドンであって、野生型ＤＮＡにおける少なくとも１２個のＣＴＧコドンに対応するユニバーサルコドンおよびアンチコドンを含み、各内部プライマーが、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする変異型ＤＮＡが得られる様式で別の内部プライマーまたは外部プライマーとオーバーラップするものであり、ただし、該カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼが、カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ４ではないものである、
カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする変異型ＤＮＡの製造方法、
（３０） 少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（２９）記載の方法、
（３１） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（３０）記載の方法、
（３２） 全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（３０）記載の方法、
（３３） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（３２）記載の方法、
（３４） カンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（３３）記載の方法、
（３５） 変異型ＤＮＡが、配列番号：３、５、９もしくは１１のＤＮＡ、またはその縮重バリアント、または配列番号：７バリアントのＤＮＡである、前記（２９）記載の方法、
（３６） 第１のカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼの基質相互作用ドメインと、第２のカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼの非基質相互作用ドメインとを含有してなるキメラカンジダ
ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、
（３７） 第２のカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼが、配列番号：８である、前記（３６）記載のリパーゼ、
（３８） 第１のカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼが、配列番号：４、６、１０、または１２である、前記（３７）記載のリパーゼ、
（３９） 配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有したカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードしてなる単離核酸、
（４０） 配列番号：１の配列を含有してなる、前記（３６）記載の単離核酸、
（４１） 配列番号：２のアミノ酸配列を含有してなるカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、
（４２） 前記（４０）記載の単離ポリヌクレオチドを含有し、かつ細菌または酵母である微生物、
（４３） 細菌が、大腸菌である、前記（４２）記載の微生物、ならびに
（４４） 酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（４２）記載の微生物、
である。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) at least 80% identical to the wild-type DNA encoding Candida rugosa lipase and comprising at least 12 codons corresponding to CTG in the wild-type DNA, each of the 12 codons independently An isolated nucleic acid comprising a mutant DNA that is TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, or AGC, the mutant DNA encoding Candida rugosa lipase,
(2) At least 15 codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the 15 codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC. Nucleic acid,
(3) the nucleic acid according to (2) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12,
(4) The nucleic acid according to (2), wherein all codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, or AGC.
(5) the nucleic acid according to (4) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12,
(6) The nucleic acid according to (5), wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12.
(7) The nucleic acid according to (1), wherein the mutant DNA is at least 85% identical to wild-type DNA encoding Candida rugosa lipase,
(8) The at least 15 codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the 15 codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC. Nucleic acid,
(9) The nucleic acid according to (8), wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12,
(10) The nucleic acid according to (8), wherein all codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, or AGC.
(11) the nucleic acid according to (10), wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12,
(12) The nucleic acid according to (11) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is SEQ ID NO: 4, 6, 10, or 12.
(13) The nucleic acid according to (1), wherein the mutant DNA is at least 90% identical to wild-type DNA encoding Candida rugosa lipase,
(14) The at least 15 codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the 15 codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC. Nucleic acid,
(15) The nucleic acid according to (14), wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10, or 12.
(16) The nucleic acid according to (14), wherein all codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, or AGC.
(17) The nucleic acid according to (16) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12,
(18) The nucleic acid according to (17), wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12.
(19) A microorganism that contains the nucleic acid according to (1) and is a bacterium or yeast,
(20) The microorganism according to (19), wherein the bacterium is E. coli,
(21) The yeast is p. The microorganism according to (19), which is P. pastoris,
(22) The microorganism according to (19), wherein the mutant DNA is at least 85% identical to wild-type DNA encoding Candida rugosa lipase,
(23) The microorganism according to (22), wherein the bacterium is Escherichia coli,
(24) The yeast is p. The microorganism according to the above (22), which is P. pastoris,
(25) The microorganism according to (19) above, wherein the mutant DNA is at least 90% identical to wild-type DNA encoding Candida rugosa lipase,
(26) The microorganism according to (25), wherein the bacterium is Escherichia coli,
(27) The yeast is p. The microorganism according to (25), which is P. pastoris,
(28) an isolated nucleic acid comprising DNA of SEQ ID NO: 3, 5, 9, or 11 or a degenerate variant thereof or DNA of SEQ ID NO: 7;
(29) a step of providing a wild type DNA encoding Candida rugosa lipase; and a wild type DNA, a DNA polymerase, an external primer pair covering the whole of the wild type DNA, and a fragment of the wild type DNA, respectively. Mixing internal primer pairs to perform PCR amplification, wherein each of the internal primers is TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC, AGA, GGA, TGA, CGA, ACT and GCT One or more universal codons and anticodons for serine selected from the group consisting of: universal codons and anticodons corresponding to at least 12 CTG codons in wild-type DNA, wherein each internal primer is Candida (Candida ugosa) which overlaps with another internal or external primer in a manner that yields mutant DNA encoding lipase, provided that the Candida rugosa lipase is Candida rugosa lipase 4 Is not,
A method for producing a mutant DNA encoding Candida rugosa lipase;
(30) The above (29), wherein at least 15 codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the 15 codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC. Method,
(31) The method according to (30) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12,
(32) The method according to (30), wherein all codons correspond to CTG codons in wild-type DNA, and each of the codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, or AGC.
(33) The method according to (32) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12.
(34) The method according to (33) above, wherein the amino acid sequence of Candida rugosa lipase is SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12.
(35) The method according to (29) above, wherein the mutant DNA is the DNA of SEQ ID NO: 3, 5, 9 or 11, or a degenerate variant thereof, or the DNA of SEQ ID NO: 7 variant,
(36) A chimeric Candida rugosa lipase comprising a substrate interaction domain of a first Candida rugosa lipase and a non-substrate interaction domain of a second Candida rugosa lipase ,
(37) The lipase according to (36), wherein the second Candida rugosa lipase is SEQ ID NO: 8,
(38) The lipase according to (37) above, wherein the first Candida rugosa lipase is SEQ ID NO: 4, 6, 10, or 12.
(39) an isolated nucleic acid encoding a Candida rugosa lipase containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(40) the isolated nucleic acid according to (36), comprising the sequence of SEQ ID NO: 1,
(41) Candida rugosa lipase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(42) A microorganism comprising the isolated polynucleotide according to (40) and being a bacterium or yeast,
(43) The microorganism according to (42), wherein the bacterium is Escherichia coli, and (44) the yeast is P. aeruginosa. The microorganism according to (42), which is P. pastoris,
It is.
本発明は、一般的な宿主細胞における工業的用途のための特定の性質を有するカンジダ ルゴサリパーゼの単一のアイソザイムの製造及び工業的用途に有用である。本発明は、カンジダ ルゴサリパーゼをコードする、カンジダ ルゴサリパーゼをコードする野生型ＤＮＡと８０％同一であり、かつ野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応する少なくとも１２個（例えば、１３個、１５個、１７個または全部）のユニバーサルセリンコドンを含む変異型ＤＮＡを含む単離核酸を特徴とする。ユニバーサルコドンのそれぞれは、独立して、TCT 、TCC 、TCA 、TCG、AGT またはAGC である。カンジダ ルゴサリパーゼは、カンジダ ルゴサリパーゼ２、３、５または８でありうる。また、本発明は、新規リパーゼ８と命名された新規カンジダ ルゴサリパーゼ８をコードする単離核酸およびコードされたリパーゼを特徴とする。
The present invention is useful for the production and industrial application of a single isozyme of Candidalosalipase having specific properties for industrial use in general host cells. The present invention is at least 12% (eg, 13, 15, 17) corresponding to CTG codons in wild-type DNA, which is 80% identical to wild-type DNA encoding Candida rugosa lipase, which encodes Candida rugosa lipase. Characterized by an isolated nucleic acid comprising a mutant DNA containing one or all of the universal serine codons. Each of the universal codons is independently TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC. The Candida rugosa lipase can be Candida rugosa lipase 2, 3, 5 or 8. The invention also features an isolated nucleic acid encoding a novel Candidosa lipase 8, designated as novel lipase 8, and the encoded lipase.
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有したCandida rugosaリパーゼに関する。本発明の発明者らは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８と命名された、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有した新規Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを見出した。本発明の新規リパーゼ８遺伝子は、リパーゼ生産能を有する微生物Candida rugosaから得られる。好ましくは、前記リパーゼ８遺伝子は、配列番号：１の核酸配列を有する。 The present invention relates to a Candida rugosa lipase containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The inventors of the present invention have described C.I. A novel C. elegans containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, designated as rugosa lipase 8. A rugosa lipase was found. The novel lipase 8 gene of the present invention is obtained from the microorganism Candida rugosa having the ability to produce lipase. Preferably, the lipase 8 gene has the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
以下にＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８の核酸配列とコードされたアミノ酸配列とを示す。 C. 2 shows the nucleic acid sequence of rugosa lipase 8 and the encoded amino acid sequence.
本発明は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡと少なくとも８０％同一である変異型ＤＮＡを含む単離核酸に関する。 The present invention relates to C.I. The present invention relates to an isolated nucleic acid comprising a mutant DNA that is at least 80% identical to wild-type DNA encoding rugosa lipase.
以下に、野生型ＤＮＡにおけるセリンに対応する全てのＣＴＧコドンが、ユニバーサルセリンコドンにより置換されている、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ３、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ４、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ５、およびＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８の変異型核酸配列を示す。変異ヌクレオチドを黒色バックグラウンドで示す。また、コードされたアミノ酸配列を示す。 Below, all CTG codons corresponding to serine in wild-type DNA are replaced by universal serine codons. rugosa lipase 2, C.I. rugosa lipase 3, C.I. rugosa lipase 4, C.I. rugosa lipase 5, and C.I. The mutant nucleic acid sequence of rugosa lipase 8 is shown. Mutant nucleotides are shown with a black background. The encoded amino acid sequence is also shown.
以下に、Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol.387, March 1, pp93-98, 2001に発表された、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ４の変異型核酸配列およびコードされたアミノ酸配列を示す。 The following was published in Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol.387, March 1, pp93-98, 2001, C.I. The mutant nucleic acid sequence of rugosa lipase 4 and the encoded amino acid sequence are shown.
各変異型ＤＮＡと、対応する野生型ＤＮＡとの間の差異は、ユニバーサルセリンコドンによるＣＴＧコドンの置換によるものであり、それに加えて、ユニバーサルコドンに基づき野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼまたはその機能的に同等なアミノ酸配列をコードするＤＮＡバリアントをもたらす遺伝子コドンの縮重によるものである。このような変異型ＤＮＡを含む単離された核酸は、一般的な宿主細胞においてＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをクローン化し、発現させるために使用されうる。ＤＮＡバリアントは、特定の原核宿主または真核宿主により優先されるコドンを保持することができる。宿主によりコドンが使用される頻度に従って、原核宿主または真核宿主において、ポリペプチドの発現が生じる速度が増加するように、コドンを選択してもよい。変異型ＤＮＡは、野生型ＤＮＡ上のヌクレオチドの置換、欠失、逆位または挿入などのバリエーションをさらに含むことができる。前記バリエーションは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼのクローニング、プロセシングおよび発現を改変しうる。 The difference between each mutant DNA and the corresponding wild type DNA is due to the replacement of the CTG codon with a universal serine codon, in addition to the wild type C.I. This is due to the degeneracy of the gene codon resulting in a DNA variant encoding rugosa lipase or a functionally equivalent amino acid sequence thereof. Isolated nucleic acids containing such mutated DNA are C.I. It can be used to clone and express rugosa lipase. A DNA variant can retain codons that are preferred by a particular prokaryotic or eukaryotic host. Depending on the frequency with which the codon is used by the host, the codon may be selected to increase the rate at which expression of the polypeptide occurs in a prokaryotic or eukaryotic host. Mutant DNA can further include variations such as nucleotide substitutions, deletions, inversions or insertions on the wild-type DNA. The variation is C.I. The cloning, processing and expression of rugosa lipase can be modified.
前記変異型ＤＮＡは、核酸配列中における所定の位置に極めて特異的なヌクレオチド置換（すなわち変異）を導入する部位特異的変異導入法に基づいて作製されうる。例えば、ZollerおよびSmith （1983）Meth. Enzymol. 100:468ならびにMolecular Cloning, A Laboratory Manual、（1989）、Sambrook、Fritsch およびManiatis、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、第１５章などを参照のこと。他方、当該技術分野で周知の化学的方法を用いて変異型ＤＮＡを、全部または部分的に合成してもよい。Caruthers ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223 およびHornら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232 を参照のこと。特に、多重変異の導入は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)、リガーゼ連鎖反応（LCR ）またはオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応などに基づく種々の方法によって達成できる。GeおよびRudolph （1997）BioTechniques 22:28-30を参照のこと。 The mutant DNA can be prepared based on a site-specific mutagenesis method that introduces a very specific nucleotide substitution (ie, mutation) at a predetermined position in a nucleic acid sequence. See, for example, Zoller and Smith (1983) Meth. Enzymol. 100: 468 and Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (1989), Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, NY, Chapter 15. On the other hand, mutant DNA may be synthesized in whole or in part using chemical methods well known in the art. See Caruthers et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223 and Horn et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. In particular, introduction of multiple mutations can be achieved by various methods based on, for example, polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR) or overlap extension polymerase chain reaction. See Ge and Rudolph (1997) BioTechniques 22: 28-30.
変異型ＤＮＡは、配列番号：４、６、１０または１２のポリペプチドをコードすることができる。他方、変異型ＤＮＡは、配列番号：４、６、１０または１２と９０％同一であるか、１、５、１０、５０またはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド変異体をコードすることができる。この比較に整列が必要な場合は、最大相同性になるように配列を整列させるべきである。ポリペプチドバリアントは、配列番号：４、６、１０または１２によってコードされるポリペプチドの少なくとも１つの触媒活性（例えば、エステル結合加水分解またはエステル化など）と関連づけられる。ポリペプチドバリアントは、置換アミノ酸が類似した構造的または化学的性質を有する「保存的」変化を有しうる。当該技術分野では類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義づけられている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。ある態様では、ポリペプチドバリアントは、「非保存的」変化、例えば、メチオニンによるロイシンの置換を有してもよい。さらに、ポリペプチドバリアントは、アミノ酸の欠失または挿入もしくはその両方を含んでもよい。どのアミノ酸残基が、触媒活性の消失なしに置換、挿入または削除できるかを決定する際の指針は、当該技術分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、DNASTAR ソフトウェアなど）を用いて見出されるであろう。 The mutant DNA can encode the polypeptide of SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12. On the other hand, the mutant DNA is a polypeptide variant having an amino acid sequence that is 90% identical to SEQ ID NO: 4, 6, 10, or 12, or that differs in 1, 5, 10, 50 or more amino acid residues. Can be coded. If alignment is required for this comparison, the sequences should be aligned for maximum homology. The polypeptide variant is associated with at least one catalytic activity (eg, ester bond hydrolysis or esterification, etc.) of the polypeptide encoded by SEQ ID NO: 4, 6, 10 or 12. Polypeptide variants may have “conservative” changes in which the substituted amino acid has similar structural or chemical properties. The art defines a family of amino acid residues that have similar side chains. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains (eg, glycine) , Asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), amino acids with β-branched side chains (eg , Threonine, valine, isoleucine) and amino acids having aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). In certain embodiments, a polypeptide variant may have “nonconservative” changes, eg, replacement of leucine with methionine. In addition, polypeptide variants may include amino acid deletions and / or insertions. Guidance in determining which amino acid residues can be substituted, inserted or deleted without loss of catalytic activity will be found using computer programs well known in the art (eg, DNASTAR software, etc.) .
クチナーゼは、三次元構造が決定された最も小さい脂肪分解酵素であり、脂質をも含む、より広い活性を有するエステラーゼであると考えられうることが周知である。二次構造（例えば、αヘリックスまたはβ鎖）の整列に基づき、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼポリペプチド鎖のトポロジーは、クチナーゼのトポロジーと似ている（LIP1およびLIP3の三次元構造は決定されている。例えば、Grochulskiら（1993）J. Biol. Chem. 268:12843-12847；およびGhosh ら（1995）Structure 3:279-288 を参照のこと）。したがって、リパーゼに共通する折り畳みパターン（Cyglerら（1997）Methods in Enzymol 284:3-37 ）に従って、残基１００〜４５６の範囲内のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの最小機能断片を決定することができる（例えば、β２鎖〜α８，９ヘリックス、全体として約350 アミノ酸および1070ヌクレオチド）。 Cutinase is the smallest lipolytic enzyme whose three-dimensional structure has been determined and is well known to be considered an esterase with a broader activity, including lipids. Based on the alignment of secondary structures (eg, α helix or β chain), C.I. The topology of the rugosa lipase polypeptide chain is similar to that of cutinase (the three-dimensional structure of LIP1 and LIP3 has been determined. For example, Grochulski et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12843-12847; and (See Ghosh et al. (1995) Structure 3: 279-288). Thus, a C. cerevisiae in the range of residues 100-456 according to the folding pattern common to lipases (Cygler et al. (1997) Methods in Enzymol 284: 3-37). The minimal functional fragment of rugosa lipase can be determined (eg, β2 chain to α8,9 helix, about 350 amino acids and 1070 nucleotides overall).
配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２とはＮ末端ペプチド（すなわち、SMNSRGPAGRLGS ）および４アミノ酸（すなわち、 A1V；T35S；R78L；H79D）が異なる。配列番号：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ３とはＮ末端ペプチドおよび５アミノ酸（すなわち、 A1V；P148H ；I395V ；F396L ；I399L ）が異なる。配列番号：１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ５とはＮ末端ペプチドおよび５アミノ酸（すなわち、A1V 、K147E 、T256A 、G346D 、S492Y ）が異なる。配列番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ１とはＮ末端ペプチドおよび１７アミノ酸（すなわち、A1V ；L184M ；I253V ；N265D ；Y320F ；N330S ；I331V ；Q357E ；E360Q ；K363T ；I374L ；G383Q ；I395V ；G414A ；T416I ；L417H ；F517S ）（全アミノ酸の約３％）が異なり、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ１およびＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８とは全アミノ酸の３．４％が異なる。 The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is a wild-type C.I. It differs from rugosa lipase 2 in the N-terminal peptide (ie, SMNSRGPAGRLGS) and 4 amino acids (ie, A1V; T35S; R78L; H79D). The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is a wild-type C.I. It differs from rugosa lipase 3 in the N-terminal peptide and 5 amino acids (ie, A1V; P148H; I395V; F396L; I399L). The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 is a wild-type C.I. It differs from rugosa lipase 5 in the N-terminal peptide and 5 amino acids (ie, A1V, K147E, T256A, G346D, S492Y). The polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 is a wild-type C.I. rugosa lipase 1 is an N-terminal peptide and 17 amino acids (ie, A1V; L184M; I253V; N265D; Y320F; N330S; I331V; Q357E; E360Q; K363T; I374L; G383Q; I395V; G414A; 417; 417; About 3% of the amino acids) and the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is wild-type C.I. rugosa lipase 1 and C.I. It differs from rugosa lipase 8 by 3.4% of all amino acids.
前記ポリペプチドは、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターを用いて製造されうる。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、そのベクターと連結された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子をいい、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターなどが挙げられうる。ベクターは、自己複製し得、本発明の核酸を宿主細胞における当該核酸の発現に適した形で含む。ベクターは、発現対象の核酸配列に作動可能に連結された１またはそれ以上の調節配列を含む。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）などを含む。調節配列としては、ヌクレオチド配列の構成的発現を支配するものおよび組織特異的調節配列または誘導性配列が挙げられる。ベクターは、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞（例えば、P. pastoris （ピキア・パストリス））または哺乳類細胞などの原核もしくは真核細胞におけるＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの発現のために設計されうる。Goeddel （1990）Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 （Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ）には適切な宿主細胞がさらに記載されている。Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの発現は、融合リパーゼまたは非融合リパーゼの発現を支配する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行なわれうる。融合リパーゼは、可溶性ポリペプチドの精製を容易にするであろう。融合ベクターはそこにコードされているポリペプチド（通常はそのポリペプチドのアミノ末端）にいくつかのアミノ酸を付加する。典型的な融合発現ベクターにはpGEX（Pharmacia Biotech Inc.；Smith およびJohnson （1988）Gene 67:31-40 ）、pMAL（New England Biolabs 、マサチューセッツ州ビバリー）およびpRIT5 （Pharmacia 、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられ、これらのベクターはそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST ）、マルトースE 結合タンパク質またはプロテインA を標的ポリペプチドに融合させる。 The polypeptide can be produced using an expression vector comprising the isolated nucleic acid of the invention. As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid linked to the vector, and may include a plasmid, cosmid, or viral vector. The vector can be self-replicating and contains a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell. The vector includes one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed. The term “regulatory sequence” includes promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals) and the like. Regulatory sequences include those that govern constitutive expression of nucleotide sequences and tissue-specific regulatory or inducible sequences. Vectors can be prokaryotic or eukaryotic, such as bacterial cells (eg, E. coli), insect cells (eg, using baculovirus expression vectors), yeast cells (eg, P. pastoris (Pichia pastoris)) or mammalian cells. C. in cells Can be designed for expression of rugosa lipase. Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, Calif.) Further describes suitable host cells. C. The expression of rugosa lipase can be performed using vectors containing constitutive or inducible promoters that govern the expression of fused or non-fused lipase. The fusion lipase will facilitate the purification of the soluble polypeptide. A fusion vector adds several amino acids to the polypeptide encoded therein (usually the amino terminus of the polypeptide). Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Inc .; Smith and Johnson (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) And pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ). These vectors each fuse glutathione S-transferase (GST), maltose E binding protein or protein A to the target polypeptide.
ベクターは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法を介して宿主細胞に導入されうる。本明細書で使用する用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどを含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための技術として当該技術分野で認識されている種々の技術をいう。本発明の宿主細胞はＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを発現させるために用いられ得る。発現されたＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼは、宿主細胞または培養培地から単離することができる。 Vectors can be introduced into host cells via conventional transformation or transfection methods. The terms “transformation” and “transfection” as used herein refer to foreign nucleic acids (eg, DNA, including, for example, calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran mediated transfection, lipofection or electroporation, etc. ) Refers to various techniques recognized in the art as a technique for introducing a host cell. The host cell of the present invention is C.I. It can be used to express rugosa lipase. Expressed C.I. The rugosa lipase can be isolated from the host cell or from the culture medium.
本発明は、アイソザイムの基質相互作用ドメインと、別のアイソザイムの非基質相互作用ドメインとを含むキメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼも提供する。「基質相互作用ドメイン」とは、およそ３２アミノ酸の配列（例えば、配列番号：４、６、８、１０または１２のアミノ酸６３〜９４など）を特徴とし基質相互作用に参加する断片をいう。「非基質相互作用ドメイン」は、カルボキシルエステラーゼドメインなどの少なくとも１つの触媒ドメインを含む。基質相互作用ドメインは、全長のアミノ酸配列に沿って広く分散していて脂肪族アシル鎖などと相互作用するトンネルを形成する基質結合領域の一部でありうる。Cyglerら（1999）Biochim. Biophys. Acta 1441:205-214 を参照のこと。 The present invention relates to a chimeric C. coli comprising a substrate interaction domain of an isozyme and a non-substrate interaction domain of another isozyme. A rugosa lipase is also provided. A “substrate interaction domain” refers to a fragment characterized by a sequence of approximately 32 amino acids (eg, amino acids 63-94 of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, or 12) and that participates in substrate interactions. A “non-substrate interaction domain” includes at least one catalytic domain, such as a carboxylesterase domain. The substrate interaction domain may be part of a substrate binding region that forms a tunnel that is widely dispersed along the full length amino acid sequence and that interacts with aliphatic acyl chains and the like. See Cygler et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1441: 205-214.
カルボキシルエステラーゼドメインはカルボン酸エステルの加水分解を触媒し、触媒三つ組残基、すなわちセリン、グルタミン酸（またはアスパラギン酸）およびヒスチジンを含む。活性部位セリン付近の配列はよく保存されており、シグネチャーパターンとして利用できる。例えば、Krejciら（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6647-6651 （1991）またはCyglerら（1993）Protein Sci. 2:366-382を参照のこと。本発明のキメラポリペプチドは、ドメインシャフリング法によって作製できる。例えば、前記方法には、SphI(184)-BstXI(304)制限酵素ＤＮＡ断片を交換して、成熟キメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする組換核酸を得ることが含まれる。この成熟リパーゼは、あるアイソザイムの基質相互作用ドメインと、別のアイソザイム（例えば、LIP4）の非基質相互作用配列とを含む。次に、前記の組換核酸を、ベクター（例えば、pET-23a(+)大腸菌T7発現ベクター（Novagen ）のNdeI部位とEcoRI 部位の間）に連結する。 The carboxylesterase domain catalyzes the hydrolysis of carboxylic esters and includes catalytic triad residues, ie, serine, glutamic acid (or aspartic acid) and histidine. The sequence near the active site serine is well conserved and can be used as a signature pattern. See, for example, Krejci et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6647-6651 (1991) or Cygler et al. (1993) Protein Sci. 2: 366-382. The chimeric polypeptide of the present invention can be produced by the domain shuffling method. For example, in the method described above, a mature chimera C. cerevisiae is obtained by exchanging SphI (184) -BstXI (304) restriction enzyme DNA fragments. It includes obtaining a recombinant nucleic acid encoding a rugosa lipase. This mature lipase contains a substrate interaction domain of one isozyme and a non-substrate interaction sequence of another isozyme (eg, LIP4). Next, the recombinant nucleic acid is ligated to a vector (for example, between the NdeI site and the EcoRI site of pET-23a (+) E. coli T7 expression vector (Novagen)).
前記ドメインのそれぞれは、キメラポリペプチドにおいて目的とする機能が保たれているものであれば、対応する野生型配列と少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、９５％または１００％）の相同性を有する。キメラポリペプチドは、融合キメラポリペプチド、例えば、キメラポリペプチドのＮ末端に融合したチオレドキシンなどとして製造されうる。 Each of the domains is at least 70% (eg, 80%, 90%, 95% or 100%) homologous to the corresponding wild type sequence, provided that the desired function is maintained in the chimeric polypeptide. Have sex. The chimeric polypeptide can be produced as a fusion chimeric polypeptide, such as thioredoxin fused to the N-terminus of the chimeric polypeptide.
以下の具体的な実施例は、単なる例示に過ぎず、決して本明細書の他の部分を制限するものではないと解釈すべきである。さらに詳述することなく、本明細書の説明に基づいて、当業者は、本発明を最大限に利用できると考えられる。本明細書で引用する全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。 The following specific examples are merely illustrative and should not be construed as limiting the rest of the specification in any way. Without further elaboration, based on the description herein, one of ordinary skill in the art will be able to utilize the present invention to its fullest extent. All publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２（LIP2）の発現
材料および方法
菌株およびプラスミド プラスミド含有形質変換体は、主にアンピシリン（100 μg/mL）を追加したルリア- ベルターニ（LB）ブロスで生育させた。P. pastoris 発現ベクターpGAPZ αC （Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）は、ゼオシン（25μg/mL）を追加した低塩ルリア- ベルターニ（LB）ブロス（１％トリプトン、0.5 ％酵母エキスおよび0.5 ％NaCl、pH7.5 ）で生育した大腸菌TOP10'株中で操作した。LIP2の発現にはP. pastoris X-33（野生型）を使用し、その形質転換体は、100 μg/mLのゼオシンを含むYPD （0.1 ％酵母エキス、0.2
％ペプトンおよび0.2 ％ブドウ糖、pH7.2 ）中、26℃で培養した。
C. Expression of rugosa lipase 2 (LIP2) Materials and methods Strains and plasmids Plasmid-containing transformants were grown primarily in Luria-Bertani (LB) broth supplemented with ampicillin (100 [ mu ] g / mL). The P. pastoris expression vector pGAPZ αC (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Is a low salt Luria-Bertani (LB) broth (1% tryptone, 0.5% yeast extract and 0.5% NaCl, pH 7.10 supplemented with zeocin (25 μg / mL). The operation was performed in E. coli TOP10 'grown in 5). P. pastoris X-33 (wild type) was used for LIP2 expression, and the transformant was YPD (0.1% yeast extract, 0.2% containing 100 μg / mL zeocin).
The cells were cultured at 26 ° C. in% peptone and 0.2% glucose, pH 7.2).
発現ベクターの構築 LIP2は、以前、配列決定されている（EMBLデータバンクアクセッション番号X64704）。5'末端にKpnI制限部位および3'末端にNotI部位を有する、全LIP2コード領域を含むPCR 産物を調製し、P. pastoris 発現ベクターｐGAPZαC のKpnI-NotI 部位にクローン化して、pGAPZ α-LIP2 を得た。 Construction of the expression vector LIP2 has been previously sequenced (EMBL databank accession number X64704). A PCR product containing the entire LIP2 coding region with a KpnI restriction site at the 5 ′ end and a NotI site at the 3 ′ end was prepared and cloned into the KpnI-NotI site of the P. pastoris expression vector pGAPZαC to obtain pGAPZ α-LIP2 Obtained.
プラスミドＤＮＡのP. pastoris への形質転換 遺伝子工学的に作製されたリパーゼ遺伝子を保持するプラスミドＤＮＡ（10μg ）を、EcoRV により、総液量20μL にて２時間消化した。エレクトロポレーション法によって直鎖状プラスミドをP. pastoris に形質転換した。パルスコントローラー（Pulse Controller；Bio-Rad Laboratories）を装備したGene Pulser （登録商標）を用いて、0.2cm
電極間隙キュベット（Bio-Rad Laboratories）中の試料100 μL に高電圧パルス（1.5kV ）を印加した。形質転換体の個々のコロニーを選び、トリブチリンエマルションYPD 平板にパッチした。リパーゼ分泌形質転換体を、不透明なトリブチリンエマルション上の透明な領域によって同定した。PGAPZ αC により形質転換されたP. pastoris を陰性対照として使用した。
Transformation of plasmid DNA into P. pastoris Plasmid DNA (10 μg) carrying a genetically engineered lipase gene was digested with EcoRV for a total of 20 μL for 2 hours. The linear plasmid was transformed into P. pastoris by electroporation. Using Gene Pulser (registered trademark) equipped with pulse controller (Bio-Rad Laboratories), 0.2cm
A high voltage pulse (1.5 kV) was applied to 100 μL of a sample in an electrode gap cuvette (Bio-Rad Laboratories). Individual colonies of transformants were picked and patched to tributyrin emulsion YPD plates. Lipase secreting transformants were identified by a clear area on the opaque tributyrin emulsion. P. pastoris transformed with PGAPZ αC was used as a negative control.
組換LIP2の精製 P. pastoris の培養培地を分子量30,000カットオフの膜における限外ろ過により濃縮した。次にこれらの試料をHiPrepＴＭ 16/10オクチルFFカラム（Pharmacia Biotech ）に供した。前記カラムを５カラム体積のTE緩衝液＋1mM CHAPS 、次いでTE緩衝液＋4mM CHAPS で洗浄した。次に、30mM CHAPSを含む５カラム体積のTE緩衝液により、結合しているタンパク質を溶出した。溶出した物質をTE緩衝液に対して透析した。 Purification of recombinant LIP2 P. pastoris culture medium was concentrated by ultrafiltration on a 30,000 molecular weight cut-off membrane. These samples were then applied to a HiPrep ™ 16/10 octyl FF column (Pharmacia Biotech). The column was washed with 5 column volumes of TE buffer + 1 mM CHAPS followed by TE buffer + 4 mM CHAPS. Next, the bound protein was eluted with 5 column volumes of TE buffer containing 30 mM CHAPS. The eluted material was dialyzed against TE buffer.
次に、溶出したタンパク質を、TE緩衝液で平衡化したHiPrepＴＭ 16/10 Q XLカラム（Pharmacia Biotech ）に供し、0mM 〜300mM の５カラム体積の(NH４)２SO４ の直線勾配を用いてタンパク質を溶出させた。Bio-Rad アッセイキットを用いて、各画分のタンパク質濃度を測定し、p-ニトロフェニルブチレートを基質として、エステラーゼ活性を測定した。精製タンパク質を、貯蔵緩衝液（60mM KCl、10mM Tris-HCl 、1.25mM EDTA 、１％トリトンX-100 および17％グリセロール、pH7.5 ）中、−20℃で保存した。 The eluted protein is then applied to a HiPrep ™ 16/10 Q XL column (Pharmacia Biotech) equilibrated with TE buffer, using a linear gradient of (NH 4 ) 2 SO 4 in 5 column volumes from 0 mM to 300 mM. The protein was eluted. The protein concentration of each fraction was measured using a Bio-Rad assay kit, and esterase activity was measured using p-nitrophenyl butyrate as a substrate. The purified protein was stored at −20 ° C. in storage buffer (60 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.25 mM EDTA, 1% Triton X-100 and 17% glycerol, pH 7.5).
酵素の特徴づけ 精製組換LIP2と市販リパーゼ（リパーゼ、タイプVII 、Sigma ）の分子量を、SDS-PAGE解析により決定した。リパーゼの熱安定性を解析するために、37℃〜100 ℃の種々の温度で試料を10分間インキュベートし、残存活性を分光測光法（Redondo ら（1995）Biochim. Biophys. Acta 1243:15-24 ）により、p-ニトロフェニルカプリルレート(caprylrate)を基質として37℃で決定した。リパーゼに関する至適反応温度を10℃から60℃までの種々の温度で調べ、分光測光法によりp-ニトロフェニルブチレートを基質として用い、pH7.0 で活性を測定した。リパーゼの至適反応pHを3.0 から9.0 までのpHで調べ、分光測光法によりp-ニトロフェニルブチレートを基質として用い、37℃で活性を測定した。 Enzyme characterization The molecular weights of purified recombinant LIP2 and commercial lipase (lipase, type VII, Sigma) were determined by SDS-PAGE analysis. To analyze the thermal stability of lipase, samples were incubated for 10 minutes at various temperatures from 37 ° C. to 100 ° C. and the residual activity was measured spectrophotometrically (Redondo et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1243: 15-24 ) Was determined at 37 ° C. using p-nitrophenyl caprylrate as a substrate. The optimum reaction temperature for lipase was examined at various temperatures from 10 ° C to 60 ° C, and the activity was measured at pH 7.0 using p-nitrophenylbutyrate as a substrate by spectrophotometry. The optimum reaction pH of lipase was examined at a pH of 3.0 to 9.0, and the activity was measured at 37 ° C. using p-nitrophenyl butyrate as a substrate by spectrophotometry.
種々の鎖長の脂肪酸を有するトリグリセリドを基質として用い滴定測定によりリパーゼ活性を測定した。Wangら（1988）Biotechnol. Bioeng. 31:628-633を参照のこと。pHスタット(pH-Stat) における1mM NaOHによる滴定により、遊離脂肪酸の放出を連続的にモニターした。37℃におけるエステラーゼ活性は、p-ニトロフェニルエステルを基質として用い、分光光学的に決定した。活性の１単位は、１分あたり１μmol のp-ニトロフェノールを放出できる酵素の最小量として定義された。 Lipase activity was measured by titration using triglycerides having fatty acids of various chain lengths as substrates. See Wang et al. (1988) Biotechnol. Bioeng. 31: 628-633. Free fatty acid release was continuously monitored by titration with 1 mM NaOH in a pH-Stat. The esterase activity at 37 ° C. was determined spectrophotometrically using p-nitrophenyl ester as a substrate. One unit of activity was defined as the minimum amount of enzyme capable of releasing 1 μmol of p-nitrophenol per minute.
結果
組換LIP2の発現プラスミドの構築および過剰発現 LIP2遺伝子の全17個のCTG
コドンを、同時多重部位特異的変異導入法によってユニバーサルSer コドン（TCT ）と置換した。GeおよびRudolph （1997）BioTechniques 22:28-30を参照のこと。エレクトロポレーションにより、遺伝子工学的に作製されたLIP2を保持するプラスミドをP. pastoris に形質転換した。形質転換体細胞を、200mL のYPD 培地が入っている500mL フラスコで３日間生育させた。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAP ）の強力な構成的プロモーターは、LIP2の高レベルでの発現を可能にする。発現したLIP2の多くは、培養培地中に分泌され、LIP2の推定量は、2.3mg/L であった。形質転換体は、高く安定であり、高細胞密度発酵では生産されたLIP2が著しく増加するだろう。Cereghino およびCregg （2000）FEMS Microbiol. Rev. 24:45-66 を参照のこと。
Results Construction and overexpression of recombinant LIP2 expression plasmid All 17 CTG of LIP2 gene
The codon was replaced with the universal Ser codon (TCT) by simultaneous multiple site-directed mutagenesis. See Ge and Rudolph (1997) BioTechniques 22: 28-30. By electroporation, a genetically engineered plasmid carrying LIP2 was transformed into P. pastoris. Transformant cells were grown for 3 days in 500 mL flasks containing 200 mL of YPD medium. The strong constitutive promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAP) allows high level expression of LIP2. Much of the expressed LIP2 was secreted into the culture medium, and the estimated amount of LIP2 was 2.3 mg / L. Transformants are high and stable, and high cell density fermentation will significantly increase the LIP2 produced. See Cereghino and Cregg (2000) FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66.
組換LIP2の生化学的特徴づけ LIP2の至適pHは７であり、本酵素は、pH6 で90％の活性を示した。これに対して、LIP4および市販Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ（CRL ）の至適pHは、それぞれpH７〜８およびpH８であった。LIP2は、p-ニトロフェニルブチレートに対して、試験した全てのpHで（また特にpH6 で）LIP4およびCRL よりも、より高い比活性を示した。LIP2、LIP4およびCRL の比活性の比は、pH6 では100 ：４：３であったが、pH８では100 ：80：25であった。したがって、LIP2は、弱酸性〜中性のpHで工業的用途にとりわけ有用である。 Biochemical characterization of recombinant LIP2 The optimum pH of LIP2 was 7, and the enzyme showed 90% activity at pH6. In contrast, LIP4 and commercially available C.I. The optimum pH of rugosa lipase (CRL) was pH 7-8 and pH 8, respectively. LIP2 showed higher specific activity for p-nitrophenylbutyrate than LIP4 and CRL at all tested pHs (and especially at pH 6). The ratio of the specific activities of LIP2, LIP4 and CRL was 100: 4: 3 at pH 6 but 100: 80: 25 at pH 8. Therefore, LIP2 is particularly useful for industrial applications at mildly acidic to neutral pH.
さらに、LIP2、LIP4およびCRL の至適温度は、それぞれ40〜50、40および37℃であった。LIP2は30〜50℃の広い至適温度範囲を示し、試験された全ての温度（10〜60℃）でLIP4およびCRL よりはるかに高い比活性を示した。予想外なことにLIP2は低温で極めて高い活性を示し、例えば、10℃における比活性は1000U/mgで、これは至適温度における比活性の50％であった。これは、本酵素が不安定な化合物および低沸点化合物の低温での合成に応用できることを示唆した。 Furthermore, the optimum temperatures for LIP2, LIP4 and CRL were 40-50, 40 and 37 ° C., respectively. LIP2 showed a wide optimum temperature range of 30-50 ° C. and showed much higher specific activity than LIP4 and CRL at all temperatures tested (10-60 ° C.). Unexpectedly, LIP2 showed very high activity at low temperatures, for example, the specific activity at 10 ° C. was 1000 U / mg, which was 50% of the specific activity at the optimum temperature. This suggested that the enzyme can be applied to the synthesis of unstable and low-boiling compounds at low temperatures.
また、種々の温度で10分間加熱した後の酵素活性を比較した。LIP2は、50〜70℃におけるLIP4またはCRL よりも安定であった。70℃で10分間の加熱後に、LIP2、LIP4およびCRL の残存活性は、それぞれ80％、50％および35％であった。 In addition, enzyme activities after heating at various temperatures for 10 minutes were compared. LIP2 was more stable than LIP4 or CRL at 50-70 ° C. After heating at 70 ° C. for 10 minutes, the residual activities of LIP2, LIP4 and CRL were 80%, 50% and 35%, respectively.
種々の鎖長の脂肪酸のp-ニトロフェニルエステルの加水分解（表１）に関して、LIP2、LIP4およびCRL はエステル基質に対して異なる選択性を示した。LIP2、LIP4およびCRL の最もよい基質は、それぞれ、p-ニトロフェニルパルミテート、p-ニトロフェニルパルミテート、およびp-ニトロフェニルカプリレートであった。LIP2およびLIP4の両方が、中〜長鎖脂肪酸エステル (C１２ 〜C１８)に、より高い活性を示したが、LIP2は、LIP4より２〜３倍高い活性を有した。p-ニトロフェニルブチレート、p-ニトロフェニルカプリレート、p-ニトロフェニルカプレート、p-ニトロフェニルラウレート、p-ニトロフェニルミリステート、p-ニトロフェニルパルミテートおよびp-ニトロフェニルステアレートを含む多くのp-ニトロフェニルエステルに関して、比活性は、LIP2＞LIP4＞CRL の順序であった。 With respect to the hydrolysis of p-nitrophenyl esters of fatty acids of various chain lengths (Table 1), LIP2, LIP4 and CRL showed different selectivity for ester substrates. The best substrates for LIP2, LIP4 and CRL were p-nitrophenyl palmitate, p-nitrophenyl palmitate, and p-nitrophenyl caprylate, respectively. Both LIP2 and LIP4 showed higher activity on medium to long chain fatty acid esters (C 12 -C 18 ), but LIP2 had 2-3 times higher activity than LIP4. Contains p-nitrophenyl butyrate, p-nitrophenyl caprylate, p-nitrophenyl caprate, p-nitrophenyl laurate, p-nitrophenyl myristate, p-nitrophenyl palmitate and p-nitrophenyl stearate For many p-nitrophenyl esters, the specific activity was in the order LIP2>LIP4> CRL.
トリグリセリドの加水分解活性 リパーゼの重要な工業的用途の一つは、トリグリセリドとして自然界に存在する脂肪および植物油の加水分解による脂肪酸の製造である。例えば、Shawら（1990）Biotechnol. Bioeng. 35:132-137を参照のこと。表２は、LIP2、LIP4およびCRL がトリグリセリド基質に対して異なる選択性を有することを示した。LIP2、LIP4およびCRL の最もよいトリグリセリド基質は、それぞれ、トリブチリン、トリカプリリンおよびトリカプリリンであった。 Hydrolysis activity of triglycerides One important industrial application of lipases is the production of fatty acids by hydrolysis of naturally occurring fats and vegetable oils as triglycerides. See, for example, Shaw et al. (1990) Biotechnol. Bioeng. 35: 132-137. Table 2 showed that LIP2, LIP4 and CRL have different selectivity for the triglyceride substrate. The best triglyceride substrates for LIP2, LIP4 and CRL were tributyrin, tricaprylin and tricaprylin, respectively.
トリブチリン、トリラウリン、トリパルミチン、トリステアリンおよびトリオレインに関して、加水分解の比活性はLIP2＞LIP4＞CRL の順序であった。トリアセチンおよびトリカプロインに関して、順序は、LIP2＞CRL ＞LIP4であった。トリカプリリンに関して、順序は、LIP4＞CRL ＞LIP2であった。トリカプリンとトリミリスチンに関して、順序は、CRL ＞LIP2＞LIP4であった。したがって、トリグリセリド加水分解において、異なる工業的用途には、異なるLIP アイソフォームを使用すべきである。 With respect to tributyrin, trilaurin, tripalmitin, tristearin and triolein, the specific activity of hydrolysis was in the order LIP2> LIP4> CRL. For triacetin and tricaproin, the order was LIP2> CRL> LIP4. For tricaprylin, the order was LIP4> CRL> LIP2. For tricaprin and trimyristin, the order was CRL> LIP2> LIP4. Therefore, different LIP isoforms should be used for different industrial applications in triglyceride hydrolysis.
コレステロールエステラーゼ活性 表３に示すように、試験した３つのコレステリルエステルでは、LIP2はLIP4およびCRL よりも、より高いコレステロールエステラーゼ比活性を示した。種々のコレステリルエステルのなかで、コレステリルラウリレートは、LIP2によって加水分解される最もよい基質であった。したがって、LIP2は、臨床化学、生化学および食品分析における用途に有用なコレステロールエステラーゼとして用いられ得る。血清コレステロールの約70〜80％は種々の鎖長の飽和脂肪酸でエステル化されているので（Roeschlau ら（1974）12:403-407）、コレステロールエステラーゼ活性を有するLIP2は、コレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼとカップリングして、血清コレステロールを酵素的に測定するために用いられ得る。種々のコレステリルエステルに対するLIP2の高い比活性は、血清および食品中のコレステロールエステルの高効率かつ正確な測定を可能にする。 Cholesterol esterase activity As shown in Table 3, for the three cholesteryl esters tested, LIP2 showed higher cholesterol esterase specific activity than LIP4 and CRL. Of the various cholesteryl esters, cholesteryl laurate was the best substrate hydrolyzed by LIP2. Thus, LIP2 can be used as a cholesterol esterase useful for applications in clinical chemistry, biochemistry and food analysis. Since about 70-80% of serum cholesterol is esterified with saturated fatty acids of various chain lengths (Roeschlau et al. (1974) 12: 403-407), LIP2 with cholesterol esterase activity is coupled with cholesterol oxidase and peroxidase. Can be used to enzymatically measure serum cholesterol. The high specific activity of LIP2 for various cholesteryl esters allows highly efficient and accurate determination of cholesterol esters in serum and food.
エステルの合成 リパーゼは、果物風味の製品（例えば、飲料、キャンディー、ゼリーおよびジャム）、焼き菓子、ワイン、乳製品（例えば、発酵バター、サワークリーム、ヨーグルト、およびチーズなど）、乳化剤、滑沢剤および化粧品などの工業用途のための種々のエステルの合成を効率よく触媒することができる。例えば、Kim ら（1998）J. Am. Oil Chem. Soc. 75:1109-1113；ShawおよびLo（1994）J. Am. Oil Chem. Soc. 71:715-719；またはShawら（1991）Enzyme Microb. Technol. 3:544-546 を参照のこと。表４は、LIP2がオクタデシルミリステートのヘキサデシルミリステート(hexadecyl of octadecyl myristae) の合成においてLIP4またはCRL よりも、より優れていることを示し、異なるアルコールの等モル混合物によるミリスチン酸のエステル化において、LIP2が長鎖アルコールに有利に働くことを示唆する。これに対して、ヘキシルミリステート、オクチルミリステートおよびドデシルミリステートの合成にはCRL が最もよく、ミリスチン酸エステル合成に関してCRL は中〜短鎖アルコールに有利に働くことが示唆された。 Synthesis of esters Lipases are made from fruit flavored products (eg beverages, candies, jelly and jam), baked goods, wine, dairy products (eg fermented butter, sour cream, yogurt and cheese), emulsifiers, lubricants and The synthesis of various esters for industrial applications such as cosmetics can be efficiently catalyzed. For example, Kim et al. (1998) J. Am. Oil Chem. Soc. 75: 1109-1113; Shaw and Lo (1994) J. Am. Oil Chem. Soc. 71: 715-719; or Shaw et al. (1991) Enzyme See Microb. Technol. 3: 544-546. Table 4 shows that LIP2 is superior to LIP4 or CRL in the synthesis of the hexadecyl of octadecyl myristae and in the esterification of myristic acid with equimolar mixtures of different alcohols. This suggests that LIP2 favors long-chain alcohols. In contrast, it was suggested that CRL is the best for the synthesis of hexyl myristate, octyl myristate and dodecyl myristate, and that CRL favors medium to short chain alcohols for myristate ester synthesis.
表５は、LIP2が、プロリルブチレートの合成に関して、LIP4またはCRL よりも、より高い活性を有することを示し、鎖長の異なる脂肪酸の等モル混合物によるn-プロパノールのエステル化において、LIP2が短鎖の酸に有利に働くことが示唆された。これに対して、プロピルドデカノエート、プロピルヘキサデカノエートおよびプロピルオクタデカノエートの合成にはLIP4が最もよく、プロピルエステル合成に関してLIP4は中〜長鎖脂肪酸に有利に働くことを示唆した。 Table 5 shows that LIP2 has a higher activity for the synthesis of prolyl butyrate than LIP4 or CRL. In esterification of n-propanol with equimolar mixtures of fatty acids of different chain lengths, LIP2 It was suggested that it works favorably for short-chain acids. In contrast, LIP4 was the best for the synthesis of propyldodecanoate, propylhexadecanoate and propyloctadecanoate, suggesting that LIP4 favors medium to long chain fatty acids for propyl ester synthesis.
キメラタンパク質の発現
材料および方法
発現ベクターの構築 大腸菌発現ベクターpET23a-LIP4-S19 およびpET23a-trx-LIP4-S19 を、Tangら（2000）Protein Exp. Purif. 20:308-313に記載のように構築した。リーダー配列をもたないLIP1、LIP2、LIP3、およびLIP5のオープンリーディングフレームを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって得た。Longhiら（1992）Biochim. Biophy. Acta 1131:227-232およびLotti ら（1993）Gene 124:44-55を参照のこと。キメラＤＮＡ配列を、LIP4のSphI(184)-BstXI(304)制限ＤＮＡ断片とLIP1、LIP2、LIP3またはLIP5の対応する断片とをそれぞれ置換することによって構築した。得られた配列は、それぞれTrX-LIP4/lid1 、TrX-LIP4/lid2 、TrX-LIP4/lid3 、およびTrX-LIP4/lid5 と呼ばれる成熟キメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードし、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
Expression of chimeric proteins Materials and methods Construction of expression vectors The E. coli expression vectors pET23a-LIP4-S19 and pET23a-trx-LIP4-S19 are described in Tang et al. (2000) Protein Exp. Purif. 20: 308-313 Built like that. Open reading frames of LIP1, LIP2, LIP3, and LIP5 without a leader sequence were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). See Longhi et al. (1992) Biochim. Biophy. Acta 1131: 227-232 and Lotti et al. (1993) Gene 124: 44-55. A chimeric DNA sequence was constructed by replacing the SphI (184) -BstXI (304) restriction DNA fragment of LIP4 with the corresponding fragment of LIP1, LIP2, LIP3 or LIP5, respectively. The resulting sequences were mature chimera C., which were designated as TrX-LIP4 / lid1, TrX-LIP4 / lid2, TrX-LIP4 / lid3 and TrX-LIP4 / lid5, respectively. It encodes rugosa lipase and was confirmed by DNA sequencing.
大腸菌からの組換LIP4の製造 組換プラスミドを保持する大腸菌AD494(DE3)株（Novagen 、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を、50μg/mLアンピシリンと15μg/mLカナマイシンとを追加したルリア−ベルターニ（LB）ブロス中、37℃で終夜生育させた。次に、細胞を新しい培地に20倍希釈し、25℃で振盪培養した。最終濃度0.05mMになるようにIPTGを添加した後、OD600 が1.0 に達するまで細胞を10℃でインキュベートした。 Production of recombinant LIP4 from E. coli E. coli AD494 (DE3) strain (Novagen, Milwaukee, Wis.) Carrying the recombinant plasmid in Luria-Bertani (LB) broth supplemented with 50 μg / mL ampicillin and 15 μg / mL kanamycin And grown overnight at 37 ° C. Next, the cells were diluted 20-fold in fresh medium and cultured with shaking at 25 ° C. After adding IPTG to a final concentration of 0.05 mM, the cells were incubated at 10 ° C. until OD600 reached 1.0.
組換LIP4の精製 誘導後に、AD494(DE3)形質転換体を4000g 、４℃、10分間での遠心分離によって回収した。細胞ペレットをTE緩衝液（20mM Tris-HCl および2.5mM EDTA、pH8.0 ）に再懸濁した。細胞を超音波処理装置で破砕し、ついで、細胞溶解物の可溶性画分を15,000g 、４℃、30分間の遠心分離によって回収した。可溶性画分を分子量10,000カットオフの膜での限外ろ過によって濃縮した。ついで、これらの試料を、TE緩衝液で平衡化したDEAE- セファロースCL-6B （Pharmacia Biotech ）カラムに供した。0mM 〜100mM の５カラム体積の(NH４)２SO４ の直線勾配を用いて組換リパーゼを溶出した。 Purification of recombinant LIP4 After induction, AD494 (DE3) transformants were recovered by centrifugation at 4000 g, 4 ° C. for 10 minutes. The cell pellet was resuspended in TE buffer (20 mM Tris-HCl and 2.5 mM EDTA, pH 8.0). The cells were disrupted with a sonicator, and then the soluble fraction of the cell lysate was collected by centrifugation at 15,000 g, 4 ° C. for 30 minutes. The soluble fraction was concentrated by ultrafiltration on a 10,000 molecular weight cut-off membrane. These samples were then applied to a DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech) column equilibrated with TE buffer. Recombinant lipase was eluted using a linear gradient of (NH 4 ) 2 SO 4 in 5 column volumes from 0 mM to 100 mM.
ついで、溶出されたタンパク質をButyl-Sepharose 4 Fast Flow （Pharmacia
Biotech ）疎水相互作用カラムに供した。前記カラムを、５ベッド体積のTE緩衝液＋1mM CHAPS 、ついでTE緩衝液＋4mM CHAPS で洗浄した。次に、結合したタンパク質を30mM CHAPSを含有する５ベッド体積のTE緩衝液で溶出させた。溶出した試料をTE緩衝液に対して透析し、貯蔵緩衝液（60mM KCl、10mM Tris-HCl 、1.25mM EDTA 、１％トリトンX-100 および17％グリセロール、pH7.5 ）中、−20℃で保存した。画分におけるタンパク質濃度を、Bio-Rad アッセイキットを用いて測定し、エステラーゼ活性をp-ニトロフェニルブチレートを基質として用いて測定した。精製組換リパーゼと市販リパーゼ（リパーゼ、タイプVII 、Sigma L1754）との分子量を、SDS-PAGE解析によって決定した。
Next, the eluted protein was subjected to Butyl-Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia
Biotech) applied to a hydrophobic interaction column. The column was washed with 5 bed volumes of TE buffer + 1 mM CHAPS followed by TE buffer + 4 mM CHAPS. The bound protein was then eluted with 5 bed volumes of TE buffer containing 30 mM CHAPS. The eluted sample is dialyzed against TE buffer and stored at -20 ° C in storage buffer (60 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.25 mM EDTA, 1% Triton X-100 and 17% glycerol, pH 7.5). saved. The protein concentration in the fractions was measured using a Bio-Rad assay kit and esterase activity was measured using p-nitrophenyl butyrate as a substrate. The molecular weights of purified recombinant lipase and commercial lipase (lipase, type VII, Sigma L1754) were determined by SDS-PAGE analysis.
キメラタンパク質の発現 基質相互作用ドメインが別の異性体のものと交換されたキメラタンパク質を前記のように調製した。 Chimeric protein expression A chimeric protein in which the substrate interaction domain was exchanged for that of another isomer was prepared as described above.
酵素アッセイ トリブチリンを基質として用いて滴定測定によってリパーゼ活性を測定した。pH−スタットでの10mM NaOH を使った滴定によって遊離脂肪酸の放出を連続的にモニターした。37℃におけるエステラーゼ活性は、p-ニトロフェニルエステルを基質として用いる分光光学的に決定した。活性の１単位は、１分あたり１μmol のp-ニトロフェノールを放出できる酵素の量として定義された。 Enzyme assay Lipase activity was measured by titration using tributyrin as a substrate. Free fatty acid release was continuously monitored by titration with 10 mM NaOH on a pH-stat. The esterase activity at 37 ° C. was determined spectrophotometrically using p-nitrophenyl ester as a substrate. One unit of activity was defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 μmol of p-nitrophenol per minute.
結果
タンパク質の溶解性を向上させ、精製を容易にするために、大腸菌チオレドキシン（Trx ）をLIP4のN 末端に融合して、融合タンパク質Trx-LIP4を作製した。Trx-LIP4は、より良好な溶解性を有し、天然LIP4と同様の活性を保っていた。LIP4と比較したLIP1、LIP2、LIP3およびLIP5の全アミノ酸配列の各ペアの同一性は、それぞれ81、83、84および78％であったが、基質相互作用ドメイン（すなわち、lid 領域）のアミノ酸同一性は、それぞれ50、53、50および56％であった（表６）。
Results To improve protein solubility and facilitate purification, E. coli thioredoxin (Trx) was fused to the N-terminus of LIP4 to produce the fusion protein Trx-LIP4. Trx-LIP4 had better solubility and maintained the same activity as natural LIP4. The identity of each pair of LIP1, LIP2, LIP3 and LIP5 amino acid sequences compared to LIP4 was 81, 83, 84 and 78%, respectively, but the amino acid identity of the substrate interaction domain (ie, the lid region) Sex was 50, 53, 50 and 56%, respectively (Table 6).
リパーゼ活性におけるlid 領域の影響を調べるために、他の４つのＣ．ｒｕｇｏｓａアイソフォーム（LIP1、２、３、および５；それぞれlid1、2 、3 および5 ）由来のlid 領域をLIP4のlid 領域と交換し、それぞれキメラタンパク質Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid2 、Trx-LIP4/lid3 およびTrx-LIP4/lid5 として発現させた。表７に示すように、Trx-LIP4/lid2 およびTrx-LIP4/lid3 のリパーゼ加水分解活性は、トリブチリンを基質とした天然LIP4と比較してそれぞれ14％および32％増加したが、Trx-LIP4/lid1 とTrx-LIP4/lid5 は、それぞれ85％および20％減少した。 To examine the effect of the lid region on lipase activity, four other C.I. The lid region from the rugosa isoforms (LIP1, 2, 3, and 5; lid1, 2, 3 and 5 respectively) is exchanged with the lid region of LIP4, and the chimeric proteins Trx-LIP4 / lid1, Trx-LIP4 / lid2, It was expressed as Trx-LIP4 / lid3 and Trx-LIP4 / lid5. As shown in Table 7, the lipase hydrolysis activity of Trx-LIP4 / lid2 and Trx-LIP4 / lid3 increased by 14% and 32%, respectively, compared to natural LIP4 using tributyrin as a substrate. lid1 and Trx-LIP4 / lid5 decreased by 85% and 20%, respectively.
リパーゼ特異性におけるlid の影響は使用される基質に著しく依存した。表８に示すように、lid が変化しているキメラタンパク質は全て未改変のTrx-LIP4と比較して種々の程度に活性の低下を示したが、鎖長が異なる脂肪酸の種々のコレステロールエステルに関する相対活性は本質的な変化を示した。例えば、Trx-LIP4、Trx-LIP4/lid2 およびTrx-LIP4/lid3 の最もよい基質は、コレステロールカプレートであるが、Trx-LIP4/lid1 とTrx-LIP4/lid5 にとって最もよい基質はコレステロールステアレートであった。これに対して、p-ニトロフェニルエステルを基質として使用した場合は、p-ニトロフェニルカプレートとp-ニトロフェニルステアレートとの両方がTrx-LIP4およびTrx-LIP2の最もよい基質であったが、Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid3 およびTrx-LIP4/lid5 の最もよい基質は、p-ニトロフェニルカプレートのみであった。またlid の変化は、種々の不飽和脂肪酸のコレステロールエステルの選択性における酵素の基質特異性にも影響を及ぼした。表９に示すように、Trx-LIP4の最もよい基質は、コレステリルオレエート（18：１）であり、それに続いてコレステリルリノレエート（18：２、相対活性68％）であるが、コレステリルステアレート（18：０）は悪い基質であった（相対活性７％）。Trx-LIP4/lip2 およびTrx-LIP4/lid3 は、よく似た基質選択性パターンを有していた。 The effect of lid on lipase specificity was highly dependent on the substrate used. As shown in Table 8, all of the chimeric proteins with varying lids showed reduced activity to varying degrees compared to unmodified Trx-LIP4, but with different cholesterol esters of fatty acids with different chain lengths. The relative activity showed an essential change. For example, the best substrate for Trx-LIP4, Trx-LIP4 / lid2 and Trx-LIP4 / lid3 is cholesterol caprate, but the best substrate for Trx-LIP4 / lid1 and Trx-LIP4 / lid5 is cholesterol stearate there were. In contrast, when p-nitrophenyl ester was used as the substrate, both p-nitrophenyl caprate and p-nitrophenyl stearate were the best substrates for Trx-LIP4 and Trx-LIP2. The best substrate for Trx-LIP4 / lid1, Trx-LIP4 / lid3 and Trx-LIP4 / lid5 was only p-nitrophenyl caprate. The change in lid also affected the substrate specificity of the enzyme in the selectivity of cholesterol esters of various unsaturated fatty acids. As shown in Table 9, the best substrate for Trx-LIP4 is cholesteryl oleate (18: 1) followed by cholesteryl linoleate (18: 2, relative activity 68%), but cholesteryl stearate. The rate (18: 0) was a bad substrate (7% relative activity). Trx-LIP4 / lip2 and Trx-LIP4 / lid3 had a similar substrate selectivity pattern.
さらに、Trx-LIP4/lid1 の最もよい基質は、コレステリルステアレートであり、それに続いてコレステリルリノレエート、次がコレステリルオレエートであった。Trx-LIP4/lid5 については、基質選択性の順序が、コレステリルオレエート、コレステリルステアレート、およびコレステリルリノレエートであった。コレステリルリノレエートとの種々の組換LIP4キメラタンパク質の反応速度パラメーターを解析した。表10に示すように、融合タンパク質Trx-LIP4は、VmaxおよびKmの両方が増加したが、天然LIP4と同様のKcat/Km を示した。Trx-LIP4/lid2 がTrx-LIP4と同様の触媒効率を保っていたのに対し、Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid3 およびTrx-LIP4/lid5 は、著しく低下したKcat/Km を示した。触媒効率の低下はKcatの著しい減少によるものと思われた。 In addition, the best substrate for Trx-LIP4 / lid1 was cholesteryl stearate, followed by cholesteryl linoleate, followed by cholesteryl oleate. For Trx-LIP4 / lid5, the order of substrate selectivity was cholesteryl oleate, cholesteryl stearate, and cholesteryl linoleate. The kinetic parameters of various recombinant LIP4 chimeric proteins with cholesteryl linoleate were analyzed. As shown in Table 10, the fusion protein Trx-LIP4 showed similar Kcat / Km as native LIP4, although both Vmax and Km increased. Trx-LIP4 / lid2 maintained the same catalytic efficiency as Trx-LIP4, whereas Trx-LIP4 / lid1, Trx-LIP4 / lid3 and Trx-LIP4 / lid5 showed significantly reduced Kcat / Km . The decrease in catalyst efficiency was thought to be due to a significant decrease in Kcat.
また、lid ドメインは、リパーゼのエナンチオ選択性に影響を及ぼした。表11に示すように、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼは、d-メンチルアセテートよりもl-メンチルアセテートの加水分解に有利であった。組換Trx-LIP4および全キメラLIP4は、市販のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ（リパーゼ、タイプVII 、Sigma ）よりも、よりよいエナンチオ選択性を示した。Trx-LIP4/lid3 のエナンチオ選択性だけがTrx-LIP4と同様であった。他のキメラタンパク質（Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid2 およびTrx-LIP4/lid5 ）は、酢酸メチルを基質とするエナンチオ選択性における本質的な低下を示した。他のキラル基質を使用した場合、エナンチオ選択性の順序が変化した可能性はかなり高い。 The lid domain also affected the enantioselectivity of lipases. As shown in Table 11, C.I. Rugosa lipase favored hydrolysis of l-menthyl acetate over d-menthyl acetate. Recombinant Trx-LIP4 and all chimeric LIP4 are commercially available C.I. It showed better enantioselectivity than rugosa lipase (lipase, type VII, Sigma). Only the enantioselectivity of Trx-LIP4 / lid3 was similar to Trx-LIP4. Other chimeric proteins (Trx-LIP4 / lid1, Trx-LIP4 / lid2 and Trx-LIP4 / lid5) showed a substantial decrease in enantioselectivity using methyl acetate as a substrate. When other chiral substrates are used, it is quite likely that the order of enantioselectivity has changed.
リパーゼの触媒作用にlid ドメインが及ぼす影響の構造上の根拠は何か コンピューター解析によれば、天然LIP4のlid ドメイン（lid4）中の正に荷電したLys75 は、タンパク質表面に存在する負に荷電したAsp292と水素結合および静電相互作用を形成して、開口型コンフォメーション（疎水性基質に対するリパーゼの活性状態）にあるlid4を安定化する。したがって、これが中および長鎖脂肪酸エステルなどの疎水性基質に対するLIP4の高い活性の一因になった（表8-10）。lid2ドメインは、開口型コンフォメーションの安定化においてlid4に類似したlid コンフォメーションおよびアミノ酸残基を有するので（表６）、Trx-LIP4/lid2 キメラタンパク質はTrx-LIP4に近い触媒効率を示した。これに対し、Lys75-Asp292相互作用はlid1、3 および5 におけるGlu71 によって中断されるので、これらのキメラタンパク質は、疎水性基質に関して触媒効率の著しい低下を示した。 What is the structural basis for the effect of the lid domain on lipase catalysis? According to computer analysis, the positively charged Lys75 in the lid domain of natural LIP4 (lid4) is negatively charged on the protein surface. Forms hydrogen bonds and electrostatic interactions with Asp292 to stabilize lid4 in an open conformation (the lipase active state for hydrophobic substrates). Thus, this contributed to the high activity of LIP4 against hydrophobic substrates such as medium and long chain fatty acid esters (Table 8-10). Since the lid2 domain has a lid conformation and amino acid residues similar to lid4 in stabilizing the open conformation (Table 6), the Trx-LIP4 / lid2 chimeric protein showed catalytic efficiency close to Trx-LIP4. In contrast, because the Lys75-Asp292 interaction was interrupted by Glu71 in lid1, 3 and 5, these chimeric proteins showed a marked decrease in catalytic efficiency with respect to hydrophobic substrates.
短鎖親水性基質の場合、この開口型安定化の効果はそれほど重要でない。したがって、Trx-LIP4よりも、トリブチリン加水分解において、さらによいTrx-LIP4/lid3 のリパーゼ活性（表７）は、活性部位または基質結合部位のコンフォメーションが異なるためであろう。また、Trx-LIP4/lid3 は、Trx-LIP4と同様のエナンチオ選択性を示し（表11）、同様の触媒機構が第２アルコールに対するキラルなエナンチオ選択性を呈したのかもしれない。Cyglerら（1994）J. Am. Chem. Soc. 116:3180-3186 を参照のこと。これらのケースにおいて、lid ドメイン交換の影響はコンフォメーション変化によるものであり、そのコンフォメーション変化が活性部位領域に対して微妙な影響を持ち、基質特異性および触媒効率の変化をもたらしたのだろう。 In the case of short-chain hydrophilic substrates, the effect of this open type stabilization is less important. Therefore, the better lipase activity of Trx-LIP4 / lid3 (Table 7) in tributyrin hydrolysis than Trx-LIP4 may be due to the different conformation of the active site or substrate binding site. Trx-LIP4 / lid3 also showed enantioselectivity similar to Trx-LIP4 (Table 11), and the same catalytic mechanism may have exhibited chiral enantioselectivity for secondary alcohols. See Cygler et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 3180-3186. In these cases, the effect of lid domain exchange was due to conformational changes that would have a subtle effect on the active site region, resulting in changes in substrate specificity and catalytic efficiency. .
結論として、lid ドメインは、組換LIP 酵素の触媒効率、エステル基質の脂肪酸鎖長および不飽和度選択性、ならびにエナンチオ選択性に対して有意な影響を有する。したがって、lid ドメインは、所望の工業的用途のためにＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの生体触媒特性を合理的に設計する上で、タンパク質工学にとってよい選択肢である。基質特異性、触媒効率、エナンチオ選択性、さらには酵素安定性を担うアミノ酸残基を特定するために、LIP4のlid 領域での部位特異的変異導入を現在行なっているところである。 In conclusion, the lid domain has a significant effect on the catalytic efficiency of the recombinant LIP enzyme, the fatty acid chain length and unsaturation selectivity of the ester substrate, and the enantioselectivity. Therefore, the lid domain is a C.I. It is a good option for protein engineering in rationally designing the biocatalytic properties of rugosa lipase. Site-specific mutagenesis in the lid region of LIP4 is currently underway to identify amino acid residues responsible for substrate specificity, catalytic efficiency, enantioselectivity, and enzyme stability.
他の態様
本明細書において開示された特徴の全てを、いかなる組合せで組み合わせてもよい。本明細書において開示された各特徴は、同じ目的、均等な目的または類似の目的を行なう他方の特徴により置き換えられてもよい。したがって、開示された各特徴は、他に特別に述べることなく、均等な特徴または類似の特徴の一般的な系列の一例にすぎない。
Other Embodiments All of the features disclosed herein may be combined in any combination. Each feature disclosed in this specification may be replaced by another feature serving the same purpose, equivalent purpose, or similar purpose. Thus, each disclosed feature is only an example of a generic series of equivalent or similar features, unless expressly stated otherwise.
上記記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、その精神および範囲を逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合するように種々の変更及び改変をなしうる。したがって、他の態様も請求の範囲の範囲内である。 From the above description, those skilled in the art can readily ascertain the essential features of the present invention and make various changes and modifications to suit various uses and conditions without departing from the spirit and scope thereof. Accordingly, other aspects are within the scope of the claims.
本発明は、一般的な宿主細胞における工業的用途のための特定の性質を有するカンジダ ルゴサリパーゼの単一のアイソザイムの製造及び工業的用途に有用である。 The present invention is useful for the production and industrial application of a single isozyme of Candidalosalipase having specific properties for industrial use in general host cells.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021522843A (en) * | 2018-05-18 | 2021-09-02 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．Ｄｓｍ Ｉｐ Ａｓｓｅｔｓ Ｂ．Ｖ． | Mutant lipase and its use |
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2005
- 2005-02-28 JP JP2005053906A patent/JP2005185291A/en active Pending
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