JP2005176767A - Hot-start real time pcr method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子の研究やその応用に重要な核酸増幅技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する。本発明は、遺伝子発現解析や塩基多型解析等に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。 The present invention relates to a nucleic acid amplification technique important for gene research and its application, in particular, polymerase chain reaction (PCR). The present invention is particularly useful for gene expression analysis, nucleotide polymorphism analysis, and the like, and can be used not only for research but also for clinical diagnosis and environmental testing.
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、２種類のプライマーを用いて特定配列を増幅する手法である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５年）。原理的には１コピー、現実でも数コピー相当の核酸サンプルから増幅できる感度、特定部分のみを増幅する特異性などの特徴から、広く医学・生物学の研究や臨床診断等に利用されてきた。一方、増幅された核酸を検出する手法として、広く電気泳動法やプローブハイブリダイゼーション法が用いられてきた。 The polymerase chain reaction (PCR) is a technique for amplifying a specific sequence using two kinds of primers (Science, 230, 1350-1354, 1985). In principle, it has been widely used for medical and biological research, clinical diagnosis, and the like because of its characteristics such as sensitivity that can be amplified from nucleic acid samples equivalent to several copies even in reality, and specificity that amplifies only a specific portion. On the other hand, electrophoresis and probe hybridization methods have been widely used as methods for detecting amplified nucleic acids.
近年、ＰＣＲを実施する工程において、同時に増幅された核酸を検出する「リアルタイムＰＣＲ」が広く実施されるようになってきた。その理由として、検出時間の短縮とともに、定量性の確保が挙げられる。ＰＣＲでは最終の増幅核酸量は基質量などで上限が規定されるが、ＰＣＲは極めて効率よく核酸を増幅させるため、一定以上の標的核酸では上限に達してしまい、最終の増幅核酸の量がもとの標的核酸の量に必ずしも比例しない事態が発生する。そこでＰＣＲを実施しながら増幅核酸を検出し、一定量以上の増幅核酸が検出されたサイクル数を指標とする定量方法が考案された。この方法によれば、４０サイクルのＰＣＲでは、理論上は最大２の３９乗（１０桁以上）のダイナミックレンジを確保することができる。 In recent years, in the process of performing PCR, “real-time PCR” for detecting simultaneously amplified nucleic acids has been widely practiced. The reason is that the detection time is shortened and the quantitativeness is ensured. In PCR, the upper limit of the amount of final amplified nucleic acid is defined by the base mass, etc., but since PCR amplifies nucleic acid very efficiently, the upper limit is reached with a target nucleic acid above a certain level, and the amount of final amplified nucleic acid is too high. A situation that is not necessarily proportional to the amount of target nucleic acid occurs. Thus, a quantitative method has been devised in which amplified nucleic acid is detected while PCR is performed, and the number of cycles in which a certain amount or more of amplified nucleic acid is detected is used as an index. According to this method, in a 40-cycle PCR, a dynamic range of a maximum of 2 to the 39th power (10 digits or more) can be secured in theory.
現在実施されている主なリアルタイムＰＣＲに、各種蛍光プローブを用いる手法と、インターカレーター蛍光色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｒ ｄｙｅ）を用いる手法がある。プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（たとえば、特許文献１を参照。）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ、Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅなど、いくつかの方法が提案されている。その多くが蛍光エネルギー転移などの技術を利用して、増幅核酸の量に相関して蛍光が増減するように工夫されており、結合体と遊離体の分離をすることなく検出が可能であることから、リアルタイムＰＣＲに使用されるようになった。
一方、インターカレーター蛍光色素には、一般的にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）などが用いられている。２本鎖核酸に結合したときに強い蛍光を発するインターカレーターを共存させておくことで、増幅核酸の検出が可能になる。 On the other hand, SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) or the like is generally used as an intercalator fluorescent dye. The presence of an intercalator that emits strong fluorescence when bound to a double-stranded nucleic acid makes it possible to detect the amplified nucleic acid.
ここでは、目的核酸に依存しない増幅という意味で、他の配列での反応やプライマー同士の反応によるプライマーダイマーの発生等を「非特異反応」と呼ぶが、上記のようなリアルタイムＰＣＲでは、分離操作を行うことなく検出するため、増幅後に検出する従来の方法に比べてより非特異反応を抑える必要がある。特にインターカレーター法では、非特異反応産物も検出してしまうので、目的核酸のみの特異的な増幅は必須条件となる。非特異反応を抑制するために、温度等で特異的な反応のみが発生する条件を厳守することが重要であるが、こと温度に関しては、試薬調製時はどうしてもＰＣＲ時より低温に晒されざるを得ない。 Here, in the sense of amplification independent of the target nucleic acid, the reaction with other sequences or the generation of primer dimers due to the reaction between primers is called a “non-specific reaction”. Therefore, it is necessary to suppress the nonspecific reaction more than the conventional method of detecting after amplification. In particular, in the intercalator method, non-specific reaction products are also detected, so that specific amplification of only the target nucleic acid is an essential condition. In order to suppress non-specific reactions, it is important to strictly observe the conditions under which only specific reactions occur due to temperature, etc. However, with regard to temperature, it is unavoidable to be exposed to a lower temperature when preparing reagents than during PCR. I don't get it.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、リアルタイムＰＣＲ法において非特異反応を抑制する手法を開発し、本発明を完成させるに至った。 In view of the above circumstances, the present inventors have developed a technique for suppressing non-specific reactions in the real-time PCR method as a result of intensive studies, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）標的核酸の特定配列の増幅に必要なプライマー対の存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程において、ＰＣＲのいずれかのステップで増幅された核酸を複数回検出する工程を含むリアルタイムＰＣＲであって、使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする方法。
（２）使用するＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体とコンジュゲイトを形成した状態である、（１）記載の方法。
（３）使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用試薬キット。
（４）使用するＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体とコンジュゲイトを形成した状態である、（３）記載のリアルタイムＰＣＲ用試薬キット。
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A step of performing a polymerase chain reaction (PCR) in the presence of a primer pair necessary for amplification of a specific sequence of a target nucleic acid, including a step of detecting the nucleic acid amplified in any step of the PCR a plurality of times. A method for real-time PCR, in which a DNA polymerase to be used exhibits DNA polymerase activity and exonuclease activity only after being exposed to a high temperature for a certain period of time.
(2) The method according to (1), wherein the DNA polymerase to be used is in a state of forming a conjugate with an anti-DNA polymerase antibody.
(3) A reagent kit for real-time PCR, which exhibits DNA polymerase activity and exonuclease activity only when the DNA polymerase to be used is exposed to a high temperature for a certain period of time.
(4) The reagent kit for real-time PCR according to (3), wherein the DNA polymerase to be used is in a state of forming a conjugate with an anti-DNA polymerase antibody.
本発明により、リアルタイムＰＣＲにおいて非特異増幅反応を抑制し、検出感度や定量性を向上させることが明らかとなった。本発明の方法は従来の方法に比べて極めて迅速、簡便に実施することができ、リアルタイムＰＣＲを実施するものに経済的に多大の利益をもたらす。 According to the present invention, it has been clarified that non-specific amplification reaction is suppressed in real-time PCR, and detection sensitivity and quantification are improved. The method of the present invention can be carried out extremely quickly and simply as compared with the conventional method, and brings a great economic advantage to those carrying out real-time PCR.
以下、本発明を詳細に説明する。
プライマーなどの核酸は、低温になるほど一致した配列でなくとも結合しやすくなることから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において非特異反応を低減するためには、温度などの条件を厳密に調整する必要がある。しかしながら、ＰＣＲは通常、５０℃以上の高温で実施するのに対し、試薬調製時はどうしても室温に晒さざるを得ず、この際に発生した非特異反応が増幅するため問題になっていた。これを防ぐため、ＰＣＲの直前まで氷上で操作して、ポリメラーゼの活性を抑制するなどの対策が採られていたが、操作が困難になる上、完全ではなかった。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Nucleic acids such as primers are more likely to bind at lower temperatures, even if they do not have the same sequence. Therefore, in order to reduce non-specific reactions in the polymerase chain reaction (PCR), it is necessary to strictly adjust conditions such as temperature. is there. However, PCR is usually carried out at a high temperature of 50 ° C. or higher, but it must be exposed to room temperature at the time of reagent preparation, which causes a problem because the nonspecific reaction generated at this time is amplified. In order to prevent this, measures such as suppressing the polymerase activity by operating on ice until immediately before PCR have been taken, but the operation becomes difficult and is not perfect.
そこで、ＤＮＡポリメラーゼを化学修飾し、事前にポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性をブロックする方法が開発された（欧州特許７７１８７０、米国特許５６７７１５２、米国特許５７７３２５８）。この方法では、９５℃に１０分程度晒すことによって酵素活性が回復するので、試薬調製後、ＰＣＲ反応の前に９５℃で１０分インキュベートする工程を加えることで、ＰＣＲまでポリメラーゼによる反応を抑制することができる。ただ、特に迅速性が特徴のリアルタイムＰＣＲでは、更にこの１０分の工程を短縮することが重要となっていた。 Accordingly, methods have been developed in which DNA polymerase is chemically modified to block the polymerase activity and exonuclease activity in advance (European Patent 771870, US Pat. No. 5,677,152, US Pat. No. 5,773,258). In this method, since the enzyme activity is recovered by exposing to 95 ° C. for about 10 minutes, the reaction by polymerase is suppressed until PCR by adding a step of incubating at 95 ° C. for 10 minutes before the PCR reaction after the reagent preparation. be able to. However, especially in real-time PCR characterized by rapidity, it has become important to further shorten this 10-minute process.
本発明者らは鋭意研究の結果、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体でＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインやエキソヌクレアーゼ活性ドメインをブロックすることでリアルタイムＰＣＲの非特異反応を抑制する方法を確立し、本発明を完成させるに至った。本発明の優位点は、ほぼ１００％酵素活性をブロックすることができることと、ごく短時間で酵素活性を回復させることである。９０℃で３０秒もインキュベートすれば交代は完全に変性し、酵素活性はほぼ完全に回復する。したがって、酵素再活性化の工程を特に設ける必要はなく、ＰＣＲの変性工程で十分に酵素活性は回復できるので、時間が節約され、酵素のダメージを少なくできるので使用量も減らすことができる。本技術は通常のＰＣＲでは既に使用されていたが、本発明者らは初めてリアルタイムＰＣＲにこれを適用することに成功した。 As a result of diligent research, the present inventors have established a method for suppressing non-specific reaction of real-time PCR by blocking the polymerase activity domain and exonuclease activity domain of DNA polymerase with an anti-DNA polymerase antibody, thereby completing the present invention. It came to. The advantage of the present invention is that it can block the enzyme activity almost 100% and restore the enzyme activity in a very short time. Incubation at 90 ° C. for 30 seconds completely alters the alternation and almost completely restores the enzyme activity. Therefore, it is not necessary to provide an enzyme reactivation step, and the enzyme activity can be sufficiently recovered by the PCR denaturation step. This saves time and reduces the amount of enzyme damage, thereby reducing the amount of use. Although this technique has already been used in ordinary PCR, the present inventors have succeeded in applying it to real-time PCR for the first time.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１ インターカレーター検出によるリアルタイムＰＣＲへの適用
（１）ヒトベータアクチン遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
Example 1 Application to real-time PCR by detection of intercalator (1) Synthesis of primer for detecting human beta actin gene Oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as primer 1) and SEQ ID NO: 2 An oligonucleotide having the indicated base sequence (hereinafter referred to as primer 2) was synthesized. The synthesis was requested from Proligo Japan Co., Ltd.
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、コードＴＡＰ−２０１）、抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、蛍光インターカレーターとしてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。その際、（Ａ）はそのままだが、（Ｂ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。
プライマー１ ２ｐｍｏｌ
プライマー２ ２ｐｍｏｌ
×１０緩衝液 １μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．２μＬ
２ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（３０００倍希釈） １μＬ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
サンプル １μＬ
サンプルは、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを５倍毎に希釈した溶液（５本）と、ブランクとしての蒸留水（２本）である。ｃＤＮＡの作製にはＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成キット（「ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ -α−」、東洋紡、コードＦＳＫ−１０１）を用い、手順は取扱説明書に従った。
(2) Preparation of real-time PCR reagent Taq DNA polymerase (Toyobo, code TAP-201), anti-Taq DNA polymerase antibody (Toyobo, code TCP-101), and SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) as a fluorescent intercalator. Then, a 10 μL solution containing the following reagents was prepared. At that time, although (A) is kept as it is, 1 μg of anti-Taq DNA polymerase antibody per 2.5 U is added to the Taq DNA polymerase of (B) and mixed gently.
× 10 buffer 1μL
25 mM MgCl2 1.2 μL
2 mM
SYBR Green I (3000 times dilution) 1μL
Taq DNA polymerase 0.5U
Sample 1μL
Samples are a solution prepared by diluting cDNA prepared from HeLa cell (human-derived cell) RNA every 5 times (5) and distilled water (2) as a blank. A cDNA synthesis kit (“ReverTra Ace-α-”, Toyobo, code FSK-101) using reverse transcriptase derived from MMLV was used for the preparation of cDNA, and the procedure was in accordance with the instruction manual.
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９５℃・３０秒
９５℃・０秒、６０℃・０秒、７２℃・３０秒（４０サイクル）
(3) Execution of real-time PCR Real-time PCR was performed using LightCycler ™ (Roche Diagnostics) under the following conditions. For details, follow the instruction manual of the equipment.
Amplification conditions 95 ° C for 30 seconds 95 ° C for 0 seconds, 60 ° C for 0 seconds, 72 ° C for 30 seconds (40 cycles)
（４）結果
図１および図２に示すような結果が得られた。
(4) Results Results as shown in FIGS. 1 and 2 were obtained.
抗体を加えていない（Ａ）では、図１の増幅曲線ようにブランクサンプルでもシグナルの上昇が見られた。図３の融解曲線解析で、本来のＰＣＲ産物が９２℃付近にピークを形成するのに対し、ブランクサンプルでは８４℃付近にピークが見られ、これが非特異反応産物であるプライマーダイマーであることが確認された。また、陽性サンプルでも一部にプライマーダイマーのピークが見られた。これに対して、本発明を適用した（Ｂ）では図２のようにブランクサンプルでシグナルの上昇が見られず、図４融解曲線解析でもブランクサンプル、陽性サンプルともにプライマーダイマーのピークが見られなかった。これらの結果から、非特異反応を完全に抑制したことがわかる。更に、希釈系列の増幅曲線が（Ａ）では不均一であるのに対し、（Ｂ）では等間隔に並んでいることは、核酸定量アッセイに必須の「直線性」が優れていることを示している。本発明が、非特異反応の抑制と、直線性の向上に大きく寄与することが示された。 In the case where no antibody was added (A), an increase in signal was observed even in the blank sample as shown in the amplification curve of FIG. In the melting curve analysis of FIG. 3, the original PCR product forms a peak around 92 ° C., whereas the blank sample shows a peak around 84 ° C., which is a primer dimer that is a non-specific reaction product. confirmed. In addition, a primer dimer peak was partially observed even in the positive sample. On the other hand, in (B) to which the present invention was applied, no signal increase was observed in the blank sample as shown in FIG. 2, and no primer dimer peak was observed in both the blank sample and the positive sample in FIG. 4 melting curve analysis. It was. From these results, it can be seen that the non-specific reaction was completely suppressed. Furthermore, the amplification curve of the dilution series is not uniform in (A), but in (B) it is aligned at equal intervals, indicating that the “linearity” essential for nucleic acid quantification assays is excellent. ing. It was shown that the present invention greatly contributes to suppression of non-specific reactions and improvement of linearity.
さらに、増幅曲線からＣｔ値（増幅曲線が閾値を越えた点のサイクル数）を算出し、表１に示した。空欄は増幅曲線が閾値を越えなかったことを示す。また、図１、図２に示された横線が閾値を示している。Ｃｔ値は一般的にリアルタイムＰＣＲで核酸の定量を行う場合の指標として使用され、重要な数値である。表１に示す通り、本発明を採用しなかった（Ａ）では、ブランクサンプルでもＣｔ値が算出され、陽性サンプルも本来一定であるはずの希釈系列のＣｔ値の間隔がばらついているのに対し、本発明を採用した（Ｂ）では、ブランクサンプルではＣｔ値が算出されず、陽性サンプルもＣｔ値の間隔が一定である。これらの結果から、本発明の効果が明らかとなった。 Furthermore, the Ct value (the number of cycles at which the amplification curve exceeded the threshold value) was calculated from the amplification curve and is shown in Table 1. A blank indicates that the amplification curve did not exceed the threshold. Moreover, the horizontal line shown in FIGS. 1 and 2 indicates the threshold value. The Ct value is generally used as an index when quantifying nucleic acids by real-time PCR, and is an important numerical value. As shown in Table 1, in the case of not adopting the present invention (A), the Ct value was calculated even in the blank sample, whereas the interval between the Ct values of the dilution series, which should be originally constant, also varies. In (B) in which the present invention is adopted, the Ct value is not calculated for the blank sample, and the interval of the Ct value is also constant for the positive sample. From these results, the effect of the present invention became clear.
実施例２ 化学修飾ポリメラーゼとの比較
（１）ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー３と示す）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー４と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
Example 2 Comparison with chemically modified polymerase (1) Synthesis of primer for detecting human G3PDH gene Oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 (hereinafter referred to as primer 3) and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 Was synthesized (hereinafter referred to as primer 4). The synthesis was requested from Proligo Japan Co., Ltd.
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
（Ａ）では、化学修飾Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた他社キットでＰＣＲ試薬を調製した。詳細は取扱説明書に従った。（Ｂ）では、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、コードＴＡＰ−２０１）、抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。この際、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。
プライマー３ ２ｐｍｏｌ
プライマー４ ２ｐｍｏｌ
×１０緩衝液 １μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １．２μＬ
２ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（３０００倍希釈） １μＬ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
サンプル １μＬ
サンプルは、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを３倍毎に希釈した溶液（３本）と、ブランクとしての蒸留水（１本）である。ｃＤＮＡの作製にはＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成キット（「ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ -α−」、東洋紡、コードＦＳＫ−１０１）を用い、手順は取扱説明書に従った。
(2) Preparation of real-time PCR reagent In (A), a PCR reagent was prepared with a kit of another company using chemically modified Taq DNA polymerase. For details, follow the instruction manual. In (B), Taq DNA polymerase (Toyobo, code TAP-201), anti-Taq DNA polymerase antibody (Toyobo, code TCP-101), SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) are used, and the following reagents are included. A 10 μL solution was prepared. At this time, 1 μg of anti-Taq DNA polymerase antibody per 2.5 U is added to Taq DNA polymerase and mixed gently.
Primer 4 2 pmol
× 10 buffer 1μL
25 mM MgCl2 1.2 μL
2 mM
SYBR Green I (3000 times dilution) 1μL
Taq DNA polymerase 0.5U
Sample 1μL
Samples are a solution (three) in which cDNA prepared from HeLa cell (human-derived cells) RNA is diluted every three times, and distilled water (one) as a blank. A cDNA synthesis kit (“ReverTra Ace-α-”, Toyobo, code FSK-101) using reverse transcriptase derived from MMLV was used for the preparation of cDNA, and the procedure was in accordance with the instruction manual.
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００TM（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９５℃・１分あるいは１０分
９５℃・１５秒、６０℃・６０秒（４０サイクル）
(3) Execution of real-time PCR Real-time PCR was performed under the following conditions using ABI PRISM7700 ™ (Applied Biosystems). For details, follow the instruction manual of the equipment.
Amplification conditions 95 ° C for 1 minute or 10 minutes 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 60 seconds (40 cycles)
（４）結果
下記表２に示すような結果が得られた。本実施例では、増幅曲線と融解曲線の提示は省略する。
(4) Results Results shown in Table 2 below were obtained. In this example, presentation of amplification curves and melting curves is omitted.
表２では、増幅曲線からＣｔ値（増幅曲線が閾値を越えた点のサイクル数）を算出し、示した。空欄は増幅曲線が閾値を越えなかったことを示す。Ｃｔ値は一般的にリアルタイムＰＣＲで核酸の定量を行う場合の指標として使用され、重要な数値である。化学修飾Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを採用した（Ａ）では、ＰＣＲサイクル前の工程（ｐｒｅＰＣＲ）が９５℃・１分では十分にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが活性化されず、低濃度域ではＣｔ値が算出すらされなかった。９５℃・１０分では活性化されて、増幅が確認できた。これに対して本発明を適用した（Ｂ）では、９５℃・１分でも１０分でも全く問題なく希釈系列に比例した増幅が確認され、極めて短時間でも十分に活性化されていることが示された。実施例１に示すように９５℃・３０秒でも全く問題なく使用できることから、その迅速性は明らかである。 In Table 2, the Ct value (the number of cycles at which the amplification curve exceeded the threshold) was calculated from the amplification curve and shown. A blank indicates that the amplification curve did not exceed the threshold. The Ct value is generally used as an index when quantifying nucleic acids by real-time PCR, and is an important numerical value. In the case of adopting chemically modified Taq DNA polymerase (A), Taq DNA polymerase is not sufficiently activated at the pre-PCR cycle (prePCR) at 95 ° C. for 1 minute, and the Ct value cannot be calculated even at a low concentration range. It was. It was activated at 95 ° C. for 10 minutes, and amplification could be confirmed. On the other hand, in (B) to which the present invention was applied, amplification proportional to the dilution series was confirmed without any problem at 95 ° C. for 1 minute or 10 minutes, indicating that it was sufficiently activated even in a very short time. It was done. As shown in Example 1, it can be used without any problem even at 95 ° C. for 30 seconds, so that its rapidity is clear.
実施例３ ワンステップＲＴ−ＰＣＲへの適用
（１）ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー３と示す）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー４と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
Example 3 Application to one-step RT-PCR (1) Synthesis of primer for detecting human G3PDH gene Oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 (hereinafter referred to as primer 3) and SEQ ID NO: 4 An oligonucleotide having a base sequence (hereinafter referred to as primer 4) was synthesized. The synthesis was requested from Proligo Japan Co., Ltd.
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットである「ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ Ｐｌｕｓ」（東洋紡、コードＰＣＲ−３０１）、抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。この際、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体（本品はＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼにも不完全ながら効果があることを確認している）を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。
プライマー３ ４ｐｍｏｌ
プライマー４ ４ｐｍｏｌ
×５緩衝液 １μＬ
２５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２ １μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ １．２μＬ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（３０００倍希釈） １μＬ
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ １Ｕ
サンプル １μＬ
サンプルは、キットに添付されたコントロールＲＮＡを５倍毎に希釈した溶液（４本）と、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡを５倍毎に希釈した溶液（３本）、ブランクとしての蒸留水（１本）である。
(2) Preparation of Real-Time PCR Reagent One-step RT-PCR kit “RT-PCR high Plus” (Toyobo, code PCR-301), anti-Taq DNA polymerase antibody (Toyobo, code TCP-101), SYBR Green I ( (Molecular Probes, Inc.) was used to prepare a 10 μL solution containing the following reagents. At this time, 1 μg of anti-Taq DNA polymerase antibody (this product has been confirmed to be incomplete but effective against Tth DNA polymerase) is added to Tth DNA polymerase per 2.5 U and mixed gently. .
Primer 4 4 pmol
× 5 buffer 1μL
25 mM Mn (OAc) 2 1 μL
2.5 mM dNTPs 1.2 μL
SYBR Green I (3000 times dilution) 1μL
Tth DNA polymerase 1U
Sample 1μL
Samples were prepared by diluting a control RNA attached to the kit every 5 times (4), a HeLa cell (human-derived cell) RNA diluted every 5 times (3), and distillation as a blank. Water (1 bottle).
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９０℃・３０秒
６０℃・３０分
９５℃・３０秒
９５℃・０秒、６０℃・０秒、７２℃・３０秒（４０サイクル）
(3) Implementation of real-time PCR Using LightCycler ™ (Roche Diagnostics), real-time PCR was performed under the following conditions. For details, follow the instruction manual of the equipment.
Amplification conditions 90 ° C, 30 seconds 60 ° C, 30 minutes 95 ° C, 30 seconds 95 ° C, 0 seconds, 60 ° C, 0 seconds, 72 ° C, 30 seconds (40 cycles)
（４）結果
下記表３に示すような結果が得られた。本実施例では、増幅曲線と融解曲線の提示は省略する。
(4) Results Results shown in Table 3 below were obtained. In this example, presentation of amplification curves and melting curves is omitted.
表３では、増幅曲線からＣｔ値（増幅曲線が閾値を越えた点のサイクル数）を算出し、示した。空欄は増幅曲線が閾値を越えなかったことを示す。Ｃｔ値は一般的にリアルタイムＰＣＲで核酸の定量を行う場合の指標として使用され、重要な数値である。本発明を使用しなかった（Ａ）では、プライマーダイマーと思われる非特異増幅産物が検出されるため、ブランクサンプル、陽性サンプルともに１４〜１５のＣｔ値が算出され、濃度依存的な数値が得られなかったのに対し、本発明を採用した（Ｂ）では、濃度依存的なＣｔ値が得られ、実質的に定量が可能となった。ブランクサンプルで３２．５５と、非特異反応を完全に抑制するにはいたらなかったが、本発明がＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼにも効果を発揮し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲへも適用が可能であることが示された。 In Table 3, the Ct value (the number of cycles at which the amplification curve exceeded the threshold) was calculated from the amplification curve and shown. A blank indicates that the amplification curve did not exceed the threshold. The Ct value is generally used as an index when quantifying nucleic acids by real-time PCR, and is an important numerical value. In (A) where the present invention was not used, a non-specific amplification product that seems to be a primer dimer was detected, so Ct values of 14 to 15 were calculated for both blank samples and positive samples, and concentration-dependent numerical values were obtained. On the other hand, in the case of (B) in which the present invention was adopted, a concentration-dependent Ct value was obtained, and quantification was substantially possible. The blank sample was 32.55, which did not completely suppress the non-specific reaction, but the present invention also exerts an effect on Tth DNA polymerase and can be applied to one-step RT-PCR. Indicated.
本発明によって、ＲＮＡの定量や一塩基多型のタイピングなどを迅速・正確に実施することが可能となり、ポストゲノムの生物学研究に貢献することができるばかりでなく、臨床検査や食品分析など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。 The present invention enables rapid and accurate RNA quantification and single nucleotide polymorphism typing, and contributes to post-genomic biological research, as well as a wide range of clinical tests and food analysis. It can be used in application fields and contributes greatly to industry.
Claims (4)
The reagent kit for real-time PCR according to claim 3, wherein the DNA polymerase to be used is in a state of forming a conjugate with an anti-DNA polymerase antibody.
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|---|---|---|---|---|
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