JP2005170796A - タンパク質間の新規相互作用及び新規相互作用を利用した廃用性筋萎縮治療剤又は廃用性筋萎縮に係わる方法。 - Google Patents
タンパク質間の新規相互作用及び新規相互作用を利用した廃用性筋萎縮治療剤又は廃用性筋萎縮に係わる方法。 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 タンパク質間の新規な相互作用の提供。
【解決手段】 プロテアソームとＺＮＦ２１６（又は、ＡＷＰ１）との間にタンパク質間相互作用があることがわかった。また、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）との間にもタンパク質間相互作用があることがわかった。この新規なタンパク質間相互作用を利用して、廃用性筋萎縮の治療剤、及び、廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法、疾病診断用マーカー、発症リスク評価方法等を提供する。
【解決手段】 プロテアソームとＺＮＦ２１６（又は、ＡＷＰ１）との間にタンパク質間相互作用があることがわかった。また、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）との間にもタンパク質間相互作用があることがわかった。この新規なタンパク質間相互作用を利用して、廃用性筋萎縮の治療剤、及び、廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法、疾病診断用マーカー、発症リスク評価方法等を提供する。
Description
本発明は、タンパク質間の新規な相互作用に関する。また、タンパク質間の新規な相互作用に基づいた廃用性筋萎縮治療剤、及び、廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法、疾病診断用マーカー、発症リスク評価方法に関する。
ヒトゲノム（全遺伝情報）のＤＮＡ塩基配列の解析がほぼ終了し、今後の研究課題は、ＤＮＡにコードされる遺伝子の機能を解明するという方向に移ってきている。ＤＮＡにコードされる遺伝情報の多くは、タンパク質に関するものであり、タンパク質の構造、機能、役割等を明らかにすることにより、遺伝子の機能を解明しようとする研究が、各研究機関で行われている。
生体内では、遺伝情報に基づいて、多くのタンパク質が発現し、それらのタンパク質が相互作用を起こすことにより、生命活動が維持されている。例えば、細胞内の代表的な代謝経路であるクエン酸回路は、複数の酵素（タンパク質）が相互作用することにより、ピルビン酸を分解し、ＡＴＰ産生のためのエネルギーを供給する。
また、生体に引き起こされる疾患の多くは、細胞内のタンパク質間の相互作用に異常が生じて、発生すると考えられる。例えば、遺伝性疾患の場合、正常なタンパク質が発現しないため、必要なタンパク質間相互作用が欠損したり、タンパク質間相互作用に異常が生じたりして、代謝異常を起こし、疾患が発生する。
従って、生体内で発現する各種タンパク質について、タンパク質間の相互作用を明らかにすることは、細胞内の反応経路を解明したり、各タンパク質の機能や役割を明らかにしたりする上で、重要である。また、タンパク質間の相互作用を明らかにすることにより、各種疾患の発生機序を解明したり、治療剤を開発したりする上で、有効な情報を提供することができる。
ここで、本発明に関連する４つのタンパク質、プロテアソーム、ユビキチン、ＺＮＦ２１６、ＡＷＰ１について、説明する。
プロテアソームは、核及び細胞質に局在する高分子のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）で、２８個のサブユニットからなる分子量７０〜８０万のタンパク質である。プロテアソームの両端にそれぞれＰＡ７０（活性化因子）が結合した「２６Ｓプロテアソーム」は、ＡＴＰ依存的に、タンパク質を分解する機能を持ち、ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系の中心的な役割を担っている。２６Ｓプロテアソームは、ポリユビキチン化（ポリユビキチン鎖によって修飾）されたタンパク質を選択的に分解する（非特許文献１）。
また、プロテアソームは、廃用性筋萎縮の発症機序にも関与している（非特許文献２、非特許文献３）。廃用性筋萎縮とは、例えば、寝たきり状態が続き、筋肉を使わない状態が持続する場合に、筋肉の大きさが減少し、筋力低下が起こってくることをいう。筋肉を使わない状態が続くと、ミオシン等の筋肉を構成するタンパク質が、ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系において分解されるため、筋肉の大きさが減少して発症するものと考えられる。
ユビキチンは、真核生物に普遍的に存在する、アミノ酸７６個からなるタンパク質で、ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系において、分解するタンパク質（標的タンパク質）を標識する役割を持つ。ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系では、ポリユビキチン鎖が標的タンパク質を標識する役割を果たす。ポリユビキチン鎖は、ユビキチンが多数枝状に結合したもので、標的タンパク質の特定部位に結合している。標的タンパク質にポリユビキチン鎖が結合していると、２６Ｓプロテアソームが標的タンパク質を認識して、標的タンパク質を分解する（非特許文献１参照）。
ＺＮＦ２１６は、１９９８年に、Ｄ．Ａ．Ｓｃｏｔらによって、ジンクフィンガータンパク質として、遺伝子が同定されたタンパク質である（非特許文献４）。また、ＡＷＰ１は、２０００年にＷ．Ｄｕａｎらによって単離された新規なタンパク質である（非特許文献５）。いずれのタンパク質も、生体内における具体的な機能、役割は、まだわかっていない。
「実験医学」，羊土社，２００３年２月，第２１巻，第３号，ｐ．３３０−３３２ Gomes et al" Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol.98,No.25,pp14440-14445 Bodine et al"Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy"，Science，2001，Vol.294,pp.1704-1708 D.A.Ccott et al"Identification and mutation analysis of a cochlear-expressed, zinc finger protein gene at the DFNB7/11 and dn hearing-loss-loci on human chromosome 9q and mouse chromosome 19",AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES AND GENOMES,Elsevier Science B.V.,1998,p461-469 W.Duan et al "Cloning and characterization of AWP1, a novel protein that associates with serine/threonine kinase PRK1 in vivo", AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES, GENOMES AND EVOLUTION, Elsevier Science B.V.,2000,p113-121
「実験医学」，羊土社，２００３年２月，第２１巻，第３号，ｐ．３３０−３３２ Gomes et al" Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol.98,No.25,pp14440-14445 Bodine et al"Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy"，Science，2001，Vol.294,pp.1704-1708 D.A.Ccott et al"Identification and mutation analysis of a cochlear-expressed, zinc finger protein gene at the DFNB7/11 and dn hearing-loss-loci on human chromosome 9q and mouse chromosome 19",AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES AND GENOMES,Elsevier Science B.V.,1998,p461-469 W.Duan et al "Cloning and characterization of AWP1, a novel protein that associates with serine/threonine kinase PRK1 in vivo", AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES, GENOMES AND EVOLUTION, Elsevier Science B.V.,2000,p113-121
生体内に発現するタンパク質の多くは、どのタンパク質と相互作用し、どのような機能、役割を担っているのか、未解明なままである。そこで、本発明は、タンパク質間相互作用の網羅的な解析を行うことによって、タンパク質間の新規な相互作用を提供する。また、機能未知のタンパク質と、特定の疾病の発症に関与することが知られているタンパク質と、の相互作用を見出すことにより、その疾患の治療剤を提供する。さらに、この新規な相互作用に基づいて、前記特定疾患に関するスクリーニング方法、診断用マーカー、発症リスク評価方法を提供する。
今回、タンパク質間相互作用に網羅的な解析より、タンパク質分解系において中心的な役割を果たすプロテアソームと、生体内における機能の未知なＺＮＦ２１６（配列番号１からなるタンパク質）又はＡＷＰ１（配列番号２からなるタンパク質）との間に、相互作用があることを、新規に見出した。即ち、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１は、プロテアソームと相互作用する性質を有し、プロテアソームは、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１と相互作用する性質を有する。
前記のとおり、プロテアソームは、廃用性筋萎縮の発生機序に関与していることがわかっている。ある個体が寝たきり等の状態になった場合、その個体の生活環境の変化に対応するため、その個体の各細胞内では、様々な細胞内応答が引き起こされていると考えられる。その細胞内応答は、タンパク質間の相互作用によって次々と伝達され、最終的には、プロテアソームとの相互作用によって、筋肉を構成するタンパク質を分解する反応が起きる。従って、ある個体が寝たきり等の状態になった場合に、細胞内応答によって生じる多くのタンパク質間相互作用のうちの、一つのタンパク質間相互作用の結合特性を変化させれば、筋萎縮（プロテアソームによる筋肉構成タンパク質の分解）を止めることができる。
そこで、本発明では、プロテアソームと相互作用する性質を有するＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現を抑制する廃用性筋萎縮治療剤を提供する。ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現を抑制することにより、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とプロテアソームとの間の相互作用による情報伝達が抑えられるため、プロテアソームによる筋肉構成タンパク質の分解が抑制される。従って、筋肉が減少せず、廃用性筋萎縮を予防、治療することができる。
ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現を抑制する手段として、ＲＮＡ干渉を応用することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、二本鎖ＲＮＡによって、その配列に特異的なｍＲＮＡが分解され、その結果、遺伝子の発現が抑制される現象をいい、短いＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いることにより、哺乳類にも応用が可能である。
本発明に係る二本鎖ＲＮＡは、ＺＮＦ２１６をコードするＤＮＡ配列（配列番号３）又はＡＷＰ１をコードするＤＮＡ配列（配列番号４）の一部分（１８〜２４塩基）に対応する配列を持つものを用いる。この二本鎖ＲＮＡは、短いもの（１８〜２４塩基）であれば、標的配列（配列番号３又は配列番号４の配列）のどの部分に対応していても、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現をある程度抑制できると考えられるが、二本鎖ＲＮＡの作製の際には、ＴＴＴＴ又はＡＡＡＡの配列を含まず、ＲＮＡの二次構造が開いていると予想される箇所の配列を選ぶ方が、発現を効果的に抑制できるので、より好適である。
その他、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とプロテアソームとの間の相互作用が起きないようにするため、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１自体の機能を阻害又は抑制する廃用性筋疾患用治療剤を用いてもよい。また、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とプロテアソームの間の相互作用自体を阻害又は抑制することにより、筋萎縮を予防、治療することもできる。
また、今回、タンパク質分解系において標識の役割をするポリユビキチン鎖と、生体内における機能の未知なＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間にも、相互作用があることがわかった。即ち、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１は、ポリユビキチン鎖と相互作用する性質を有し、ポリユビキチン鎖は、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１と相互作用する性質を有する。
廃用性筋萎縮の場合、プロテアソームは、ポリユビキチン鎖の結合している筋肉構成タンパク質を分解していると考えられる。ポリユビキチン鎖は、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との相互作用によって情報が伝達されて、筋肉構成タンパク質と結合するため、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用が抑制されると、情報伝達が抑制されて、筋肉構成タンパク質との結合が抑制される。また、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用が抑制された場合、情報伝達が阻害されて、ポリユビキチン鎖とプロテアソームとの間の相互作用を抑制することも考えられる。この場合も、プロテアソームによる筋肉構成タンパク質の分解が抑制される。
そこで、前記と同様に、本発明では、ポリユビキチン鎖と相互作用する性質を有するＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現を阻害する廃用性筋萎縮治療剤を提供する。ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とポリユビキチン鎖との間の相互作用による情報伝達が行われないようにするため、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１自体の機能を直接阻害又は抑制する治療剤を用いてもよい。また、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とポリユビキチン鎖の間の相互作用自体を阻害又は抑制することにより、筋萎縮を予防、治療することもできる。
次に、本発明では、廃用性筋萎縮治療剤製造のために、プロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を直接的に又は間接的に使用することができる。
例えば、廃用性筋萎縮治療剤製造工程の過程において、前記相互作用を利用したスクリーニング方法を用いて目的の物質を選別し、この物質を廃用性筋萎縮治療剤製造に利用することができる。あるいは、治療剤の候補となる物質が正しく活性を持っているか否かを品質検査する場合に、前記相互作用を利用することができる。その他、この相互作用を、廃用性筋萎縮の疾病診断用マーカーとして利用したり、発症リスクを評価する手段に応用したりすることもできる。
そこで、まず、本発明では、プロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を利用する廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法によって、対象とするタンパク質間の相互作用の結合特性を変化（阻害又は増進）させ得る化合物のスクリーニングを実施することができる。かかる化合物は、対象とするタンパク質間相互作用が関連する疾病（疾患）に対する治療薬又は予防薬の候補となり得る。
このようなスクリーニングは、上記相互作用を検出するための反応条件に候補化合物を適切な濃度で添加して、相互作用に対する影響を調べる手法を含む。この手法は、従来の酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）と同様の手法としてスクリーニング可能である。そして９６ウェルプレート上にプロテアソームあるいはＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１を結合固定化し、そこにスクリーニング対象分子を添加し、さらにＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１（ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１を固定化した場合はプロテアソーム）、標識抗体、基質の順で反応させ、スクリーニング対象物質が存在下でどのくらいプロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の結合が変化するかを調べる。基質の発色が強い方が両者の結合は強いことになる。
なお、薬物のスクリーニングは、ＮＭＲ分光学やＸ線結晶解析や電子顕微鏡等による一分子直接観察によっても可能である。また表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲ）を用いても効率よくスクリーニング可能で、プロテアソームかＺＮＦ２１６のいずれかをやはりＳＰＲのセンサーチップ上に固定化し、スクリーニング対象分子を添加したＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１（ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１を固定化した場合はプロテアソーム）をセンサーチップ上に送液する。両者の結合は表面プラズモン共鳴によりリアルタイムに結合曲線が観察され、両者の結合が強まれば結合曲線は増高し、弱まれば減弱あるいは消失する。
また、本発明では、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる廃用性筋萎縮用の疾病予防、診断用マーカーを提供する。
ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１が、廃用性筋萎縮に関与することが明らかであるプロテアソームと相互作用を示すという、本願発明者らの鋭意研究の結果によって得られた全くの新知見に基づいて、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１、又はこのタンパク質をコードする遺伝子は廃用性筋疾患の発症に関与することが判明した。このことから、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現状態や、このタンパク質をコードする遺伝子の変異（一塩基多型等）を調べることによって、廃用性筋疾患の診断に役立てることができる。即ち、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１をコードする遺伝子は、廃用性筋疾患診断用マーカーとなる。
さらに、本発明では、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１、又はこのタンパク質をコードする遺伝子を用いる廃用性筋疾患の発症リスク評価方法を提供する。
廃用性筋疾患にプロテアソームを介して関与することがわかったＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現状態を調べたり、このタンパク質のコードする遺伝子の変異や一塩基多型等を調べたりすることによって、将来に例えば寝たきり等になった場合の廃用性筋疾患の発症リスク評価を行うことができる。
続いて、上述したプロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を利用する場合と同様に、本発明では、廃用性筋萎縮治療剤製造のために、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を直接的に又は間接的に使用することもできる。
例えば、廃用性筋萎縮治療剤製造工程の過程において、前記相互作用を応用したスクリーニング方法を用いて目的の物質を選別し、この物質を廃用性筋萎縮治療剤製造に利用することができる。あるいは、治療剤の候補となる物質が正しく活性を持っているか否かを品質検査する場合に、前記相互作用を利用することができる。その他、この相互作用を、廃用性筋萎縮の疾病診断用マーカーとして利用したり、発症リスクを評価する手段に応用したりすることもできる。
そこで、まず、本発明では、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を利用する廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法についても提供する。上述したプロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を利用する場合と同様に、本発明に係るスクリーニング方法によって、対象とするタンパク質間の相互作用の結合特性を変化（阻害又は増進）させ得る化合物のスクリーニングを実施することができる。かかる化合物は、対象とするタンパク質間相互作用が関連する疾病（疾患）に対する治療薬又は予防薬の候補となり得る。
また、本発明では、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１、又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる廃用性筋萎縮用の疾病予防、診断用マーカーを提供する。
即ち、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１が、廃用性筋萎縮に関与することが明らかであるポリユビキチン鎖と相互作用を示すという、本願発明者らの鋭意研究の結果によって得られた全くの新知見に基づいて、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１、又はこのタンパク質をコードする遺伝子は廃用性筋疾患の発症に関与することが判明した。このことから、上述したプロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を利用する場合と同様に、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現状態や、このタンパク質をコードする遺伝子の変異（一塩基多型等）を調べることによって、廃用性筋疾患の診断に役立てることができる。即ち、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１をコードする遺伝子は、廃用性筋疾患診断用マーカーとなる。
さらに、本発明では、上述したプロテアソームとＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間の相互作用を利用する場合と同様に、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１、又はこのタンパク質をコードする遺伝子を用いる廃用性筋疾患の発症リスク評価方法を提供する。
廃用性筋疾患にポリユビキチン鎖を介して関与することがわかったＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１の発現状態を調べたり、このタンパク質のコードする遺伝子の変異や一塩基多型等を調べたりすることによって、将来に例えば寝たきり等になった場合の廃用性筋疾患の発症リスク評価を行うことができる。
なお、本発明におけるＺＮＦ２１６及びＡＷＰ１は、配列表の配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示されたアミノ酸配列を有するタンパク質それ自体のみに狭く限定されるのではなく、プロテアソーム又はポリユビキチン鎖との間に相互作用があり、前記のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されたタンパク質である場合も含むものとする。また、本発明におけるＺＮＦ２１６及びＡＷＰ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示したが、この塩基配列についても、前記の相互作用を失わないものであって、塩基配列の一部が欠失、置換、付加あるいは挿入されたものを含むものとし、コードするタンパク質それ自体のみに狭く限定されない。
以上のように、廃用性筋萎縮に関与するタンパク質として知られているプロテアソームが、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）と相互作用することが明らかになった結果、本発明は、この相互作用並びにＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）又は該タンパク質をコードする遺伝子が、廃用性筋萎縮向けの医薬の創薬技術、診断技術、検査技術、発症リスクの評価技術等に役立つという技術的意義を有する。また、プロテアソームのタンパク質分解系に関与するポリユビキチン鎖が、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）と相互作用することが明らかになった結果、本発明は、この相互作用並びにＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）又は該タンパク質をコードする遺伝子が、廃用性筋萎縮向けの医薬の創薬技術、診断技術、検査技術、発症リスクの評価技術等に特に役立つという技術的意義も有する。
本発明によって、プロテアソームとＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）の２つのタンパク質の間に、相互作用があることが明らかになった。また、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）の間にも、相互作用があることが明らかになった。この、新規に見出されたタンパク質間相互作用に関する知見を利用することにより、廃用性筋萎縮治療剤を提供することができる。また、本発明で明らかになった新規の相互作用は、廃用性筋萎縮に関する創薬、診断、検査、発症リスクの評価等に特に有用である。
本願発明者らは、ＺＮＦ２１６（配列番号1に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質）及びＡＷＰ１（配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質）を認識して、相互作用を示す「パートナータンパク質」を、以下の方法によって効率的に探索した。
ＺＮＦ２１６（及びＡＷＰ１）は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、このタンパク質をコードするｃＤＮＡを準備した。そして、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ（プラスミド）に制限酵素的に組み込み、発現ベクターを作製した。ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧは、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）が発現する際に、Ｎ末端側に翻訳開始メチオニン残基に続きＦＬＡＧ認識配列が配列されるように、本願発明者がｐｃＤＮＡ３（プラスミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を元に独自に改変したものである。そして、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧに組み込む時には、制限酵素処理をする際に、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）の翻訳開始メチオニンも切断して、翻訳開始メチオニンをコードする配列を除いたＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ（プラスミド）に導入するようにした。なお、「ＦＬＡＧ認識配列」とは、アミノ酸配列「ＤＹＫＤＤＤＤＫ」のことをいい、このアミノ酸配列を目的のタンパク質（本実験ではＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１）の末端配列にあらかじめ組み込んでおくことにより、ＦＬＡＧ認識配列が、その目的タンパク質を認識するためのタグ（標識）として機能する。
続いて、ＺＮＦ２１６遺伝子（又はＡＷＰ１遺伝子）が組み込まれた、ＦＬＡＧ認識配列の付いた発現ベクター（組換えｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ）を培養細胞に導入した（トランスフェクション）。遺伝子導入する培養細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞，トランスフェクション試薬はキアゲン（株）のＰｏｌｙＦｅｃｔを用いた．遺伝子導入の手順は同製品のプロトコールに従った。
トランスフェクションした培養細胞内では、タグが融合した組み換えタンパク質が発現する。そして、発現した一部組換えＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）は、細胞内に存在する未知のパートナータンパク質と相互作用し複合体を形成する。そして、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）と未知パートナータンパク質との複合体を、ＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）に付したタグに対する抗体を用いた公知の「免疫沈降法」によって、細胞内から抽出した。
抽出方法は、次の通りである。遺伝子導入した細胞を可溶化バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．５,１５０ｍＭＮａＣｌ,５０ｍＭＮａＦ,１ｍＭＮａ3ＶＯ4,１ｍＭＰＭＳＦ,１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を用いて可溶化した。この可溶化バッファーを加えたのち細胞を掻き取り、遠心管に回収し超遠心（５５，０００回転，４℃，２０分）した。
遠心後の細胞抽出液（上清）にＦＬＡＧペプチド抗体を固定化したアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ社から購入）を加え４℃で３時間撹拌した。．撹拌後のビーズを遠心（1，０００回転，４℃，１分）して集め可溶化バッファーで洗浄後，ＦＬＡＧペプチドを含むバッファーを加えることによりビーズに結合したＺＮＦ２１６（ＡＷＰ１）を溶出し，ＺＮＦ２１６（ＡＷＰ１）と目的のパートナータンパク質が結合したタンパク質複合体を回収した。
タンパク質複合体の回収後は、相互作用の相手となるたんぱく質を、公知のタンデム質量計(ＭＳ／ＭＳ)を用いる「質量タグ法」と称される公知の方法（羊土社「プロテオーム解析法」、磯辺俊明、高橋信弘編、Ｐ１２９〜Ｐ１４２）によって同定した。具体的な手順は以下の通りである。
まず、回収したサンプルを、遠心濃縮後、酵素反応用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ,ｐＨ８．８）に溶解した。次に、特定のアミノ酸を認識し切断する酵素である「トリプシン」あるいは「リジルエンドペプチダーゼ」により消化分解した。なお、本実験では、リジルエンドペプチダーゼを用いた。酵素基質比（重量比）が１／１００から１／５０になるようにリジルエンドペプチダーゼを加え３７℃で１２時間反応させ、消化物を得た。そして、その消化物をタンデム質量計で測定し、分解された各ペプチドの質量値と内部アミノ酸配列情報を得た。
酵素消化されたペプチド断片の質量値を用いて、データベース上から候補アミノ酸シークエンスを自動検索して選び出し、かつその配列が各アミノ酸でフラグメント化したときの質量値セットを計算した。
なお、前記データベースは、既に公開されているタンパク質データベースである「ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ」（インターネットアドレス：ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/sp_tr_nrdb/fasta/sprot.fas.Z）と核酸データベースである「ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ」（インターネットアドレス：ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/mRNA_Prot/hs.faa.gz）を使用した。
この計算値と実測のフラグメントイオン（MS/MSスペクトラム）を比較することによって、ＺＮＦ２１６及びＡＷＰ１のパートナータンパク質を同定したところ、両方とも、「プロテアソーム」を構成するタンパク質群であることが判明した。これにより、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とプロテアソームは相互反応を示すことが明らかになった。また、「ポリユビキチン鎖」についても、ＺＮＦ２１６及びＡＷＰ１のパートナータンパク質として同定された。これにより、ＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１とポリユビキチン鎖の間にも相互反応があることが明らかになった。
実施例２では、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を用いて、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６又はＡＷＰ１との間に相互作用があることを確認する実験を行った。
まず、ＺＮＦ２１６とＧＳＴとの融合タンパク質を、遺伝子工学的に大腸菌で生産した。そして、その融合タンパク質をグルタチオンカラム（グルタチオンセファロースビーズ）を使って、精製した。カラム内では、ＧＳＴとグルタチオンが特異的に結合するため、ＧＳＴと融合したＺＮＦ２１６のみが、カラム内で捕捉される。その捕捉された融合タンパク質を、溶出バッファーを用いて回収した。
次に、回収したＺＮＦ２１６とＧＳＴとの融合タンパク質とポリユビキチン鎖を混合し、混合した溶液を、再び、グルタチオンカラムを使って、精製し、溶出バッファーを用いて回収した。
回収した溶液には、ＧＳＴと融合したＺＮＦ２１６とともに、ポリユビキチン鎖も回収された。このことは、ＺＮＦ２１６とポリユビキチン鎖が結合親和性を有し、相互作用することを示している。
また、ＡＷＰ１とＧＳＴとの融合タンパク質を、前記と同様に生産し、同様に、相互作用があることを確認する実験を行った。その結果、ＡＷＰ１とポリユビキチン鎖は、ＺＮＦ２１６と同様に、結合親和性があり、相互作用することが示された。
実施例３は、筋萎縮とＺＮＦ２１６との間に関連性があることを示す実験である。
マウスの坐骨神経を切除した筋萎縮モデルマウスと、マウスを絶食させることにより筋萎縮を起こした絶食誘導性筋萎縮モデルマウスを用意した。そして、これらのマウスで筋萎縮が見られる骨格筋組織におけるＺＮＦ２１６をコードする遺伝子のｍＲＮＡ量と、同組織におけるＺＮＦ２１６タンパク質の発現量を測定した。その結果、筋萎縮を起こしたマウスでは、ＺＮＦ２１６をコードする遺伝子のｍＲＮＡ量及びＺＮＦ２１６タンパク質発現量が顕著に増加した。このことは、筋萎縮が起こる機序において、ＺＮＦ２１６が関与していることを示している。
実施例４では、ＲＮＡ干渉を応用し、配列番号５に示された塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いて、ＡＷＰ１（配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質）の発現を抑制する実験を行った。
この実験では、（１）配列番号５に示した配列を設計してＤＮＡを合成し、（２）制限酵素とライゲーション反応により、配列番号５に対応するＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、（３）トランスフェクションにより、そのプラスミドベクターからウイルスベクター（レトロウイルス）を作製し、（４）標的細胞（マウス培養細胞）へその組換えウイルスを感染させて、（５）ＲＮＡ干渉の効果を判定する、という方法を用いた（羊土社「ＲＮＡｉ実験プロトコール」、多比良和誠ら編、Ｐ１１６〜Ｐ１２８を参照）。具体的な手順は、以下の通りである。
配列番号５の配列は、次のように設計されている。最初の「ＧＧＡＴＣＣ」配列は、プラスミドベクターに導入する際に、制限酵素（今回の設計ではＢａｍＨ１）によって切断される部位である。次の「ＡＴＧＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＡＴＧ」配列（１９塩基）は、センス鎖であり、ＡＷＰ１をコードする塩基配列の一部分に対応した配列である。次の、「ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ」配列は、リンカー配列であり、センス鎖と後述のアンチセンス鎖が二本鎖を形成した時に、ヘアピン状にカーブして、ステム＝ループ構造を形成させるために設計された配列である。続く「ＣＡＴＡＣＴＧＡＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡＴ」配列（１９塩基）は、アンチセンス鎖であり、前記のセンス鎖と相補的になっている。次の「ＴＴＴＴＴ」配列は、ターミネーター配列（ｍＲＮＡ転写終結部分）で、後に、組換えレトロウイルスの３’末端のＬＴＲ（繰り返し配列）にあるＨ１プロモーターの配列の部分から、このターミネーター配列の部分までが、ＲＮＡポリメラーゼ３によって転写され、目的のｍＲＮＡが発現する。最後の「ＧＴＣＧＡＣ」配列も、プラスミドベクターに導入する際に、制限酵素（今回の設計ではＳａｌ１）によって切断される部位である。後に、二本鎖ＲＮＡが合成される際には、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に結合して、二本鎖が形成され、リンカー配列の部分は、ヘアピン状にカーブして、センス鎖とアンチセンス鎖が結合できるようにする。以上のように、配列番号５の配列を設計し、配列番号５の配列を持つＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）を合成した。
次に、本実験では、合成したＤＮＡを制限酵素とライゲーション反応を用いてプラスミドベクターに組み込んだ。プラスミドベクターは、本願発明者が独自に作製したもので、組換えレトロウイルスをコードする配列があらかじめ組み込まれたものである。組換えレトロウイルスをコードする配列は、レトロウイルスから逆転写されたｃＤＮＡ配列と同じ配列のもので、そのうち、ウイルスの感染から宿主細胞のＤＮＡに組み込まれるまでに必要な遺伝子はそのまま残し、ウイルスゲノムの発現やウイルスタンパク質の発現に関与する配列部分は除去した配列を有している。また、この組換えレトロウイルスをコードする配列には、薬剤（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子の発現ユニットを挿入しており、ウイルス感染細胞のみをｐｕｒｏｍｙｃｉｎ処理により選択できる設計となっている。そして、組換えレトロウイルスをコードする配列のうち、３’ＬＴＲ配列の中に、Ｈ１プロモーター配列と、それに続く、二箇所の制限酵素によって切断される配列の部分（今回の設計では、Ｂｇｌ２とＳａｌ１）がある。なお、Ｂｇｌ２は、ＢａｍＨ１と切断端が一致する制限酵素である。
合成したＤＮＡをプラスミドベクターに組み込む際には、合成ＤＮＡの制限酵素の切断部位とプラスミドのクローニングサイトを、それぞれ二種類の制限酵素で二箇所切断した後、ライゲーションキットを用いて合成ＤＮＡとプラスミドベクターを結合させた。なお、今回の実験では、合成ＤＮＡは、ＢａｍＨ１とＳａｌ１で、プラスミドは、Ｂｇｌ２とＳａｌ１で、それぞれ切断した。ＢａｍＨ１とＢｇｌ２は、切断端が同じなので、合成ＤＮＡのＢａｍＨ１切断部位とプラスミドのＢｇｌ２の切断部位、合成ＤＮＡのＳａｌ１切断部位とプラスミドのＳａｌ１切断部位を、それぞれ連結反応（ライゲーション）させて、合成ＤＮＡをプラスミドに組み込んだ。そして、合成ＤＮＡを組み込んだプラスミドベクターを、コンピテント細胞を用いてサブクローニングしたのち、クローン化した組換えプラスミドベクターを精製した。
次に、前記の手順で精製した組換えプラスミドベクターを、培養細胞にトランスフェクションして、組換えレトロウイルスを作製した。ここで、組換えプラスミドベクターには組換えレトロウイルスをコードする配列が含まれているが、この配列には、レトロウイルスが完成し、細胞外に放出するために必要な遺伝子がすべてあらかじめ除去されているため、組換えレトロウイルスは産生されない。そこで、トランスフェクションに際しては、レトロウイルスの完成に必要なタンパク質をコードする遺伝子をあらかじめ組み込んだプラスミドも同時にトランスフェクションして、培養細胞内で、組換えレトロウイルスが完成し、細胞外に放出されるようにした。そして、培養細胞の外に放出された、合成ＤＮＡの配列が組み込まれた組換えレトロウイルスを回収した。
そして、マウス培養細胞に組換えレトロウイルスを感染させた。この組換えレトロウイルスは、感染後、逆転写されてｃＤＮＡが合成され、そのｃＤＮＡが宿主細胞のＤＮＡ配列の中に組み込まれるが、レトロウイルスの発現に必要な配列は除去してあるため、レトロウイルスは発現しない。そして、宿主細胞に組み込まれた配列のうち、Ｈ１プロモーター配列からその転写終結配列の部分までが、宿主細胞にあるＲＮＡポリメラーゼ３の作用により転写される。以上の手順により、合成ＲＮＡが安定的に発現するマウス培養細胞を作製した。なお、この合成ＲＮＡは、宿主細胞内でリンカー配列が除去される等の修飾を受け、ＲＮＡ干渉をおこす二本鎖ＲＮＡとなる。この二本鎖ＲＮＡが、マウス培養細胞内にあることにより、対応するｍＲＮＡが特異的に分解され、対応するタンパク質の発現を阻害する。
二本鎖ＲＮＡによって、ＲＮＡ干渉が引き起こされているかどうかの判定は、ＡＷＰ１をコードするｍＲＮＡに対するノーザンブロット法によって行った。組換えレトロウイルスが感染したマウス培養細胞からＲＮＡを抽出し、ＡＷＰ１をコードするｍＲＮＡの発現量を調べた結果、ＡＷＰ１の発現が抑えられていることがわかった。
以上の結果から、ＲＮＡ干渉を応用することにより、ＡＷＰ１の発現を抑制できることがわかった。ＡＷＰ１の発現が抑制されることにより、ＡＷＰ１とプロテアソームとの相互作用、又は、ＡＷＰ１とポリユビキチン鎖との相互作用が抑えられる。これらの相互作用が抑えられることによって、ある個体が寝たきりなどの長期臥床、神経麻痺、四肢の長期固定、宇宙環境に長期間滞在することなどにより筋肉への付加が著しく低下した状態で発症する廃用性筋萎縮、等になっている場合にも、その情報がプロテアソームに伝達されないため、プロテアソームによる筋肉構成タンパク質の分解はおこらない。従って、ＲＮＡ干渉を応用した二本鎖ＲＮＡは、廃用性筋萎縮の治療剤として有効である。
なお、この実施例は、ＲＮＡ干渉を応用した二本鎖ＲＮＡが、廃用性筋萎縮治療剤として有効であることを示した実施例の一つに過ぎず、この実施例に狭く限定されない。特に、実験の方法や手段、及び、ＲＮＡ干渉に用いる二本鎖ＲＮＡの配列部位の選択について、狭く限定されない。
Claims (13)
- プロテアソームと相互作用する性質を有することを特徴とする配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質。
- ポリユビキチン鎖と相互作用する性質を有することを特徴とする配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質の発現又は機能を抑制することを特徴とする廃用性筋萎縮治療剤。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とプロテアソームとの相互作用を抑制することを特徴とする廃用性筋萎縮治療剤。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とポリユビキチン鎖の相互作用を抑制することを特徴とする廃用性筋萎縮治療剤。
- 廃用性筋萎縮治療剤製造のための、配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とプロテアソームとの間の相互作用の使用。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とプロテアソームとの間の相互作用を利用することを特徴とする廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とプロテアソームとの間の相互作用を利用することを特徴とする廃用性筋萎縮の疾病診断用マーカー。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とプロテアソームとの間の相互作用を利用することを特徴とする廃用性筋萎縮の発症リスク評価方法。
- 廃用性筋萎縮治療剤製造のための、配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とポリユビキチン鎖との間の相互作用の使用。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とポリユビキチン鎖との間の相互作用を利用することを特徴とする廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とポリユビキチン鎖との間の相互作用を利用することを特徴とする廃用性筋萎縮の疾病診断用マーカー。
- 配列番号１又は配列番号２からなるタンパク質とポリユビキチン鎖との間の相互作用を利用することを特徴とする廃用性筋萎縮の発症リスク評価方法。
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