JP2005112848A - Polymer complex containing calcium phosphate and physiologically active substance, method for producing the same, and medical care material obtained by using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体適合性、生体組織に対する密着性あるいは接着性を有する、医療用材料、特に経皮端子として有用な燐酸カルシウム−生理活性物質−高分子複合体及び、その製造法、該高分子複合体を素材とする経皮端子などの医療用材料に関する。 The present invention relates to a calcium phosphate-bioactive substance-polymer complex, which is useful as a medical material, particularly a transdermal terminal, having biocompatibility, adhesion or adhesion to a living tissue, a method for producing the same, and the polymer The present invention relates to a medical material such as a percutaneous terminal made of a composite.
医療用デバイス、たとえば皮膚を経由して人体内に薬剤などを導入したり人体外へ体液等を排出する際の人体の内と外の連通路に使用する経皮端子の素材として、生体不活性、長期安定性、強度、柔軟性等の特性を持つシリコーンゴムなどの高分子材料が古くから用いられている。
しかし、これらの高分子基材は、生体親和性に劣り、経皮部における生体組織との接着・密着性が十分ではなく、皮膚のｄｏｗｎ ｇｒｏｗｔｈ（上皮組織がデバイス表面に沿って皮膚内部へ陥入していく現象）などによる細菌感染の危険性が問題となっている。
Bioactive as a material for transdermal terminals used in medical devices such as the inside and outside of the human body when introducing drugs into the human body via the skin or discharging body fluids outside the human body In addition, polymer materials such as silicone rubber having characteristics such as long-term stability, strength, and flexibility have been used for a long time.
However, these polymer base materials are inferior in biocompatibility and do not have sufficient adhesion / adhesion to the living tissue in the percutaneous part, and skin down growth (the epithelial tissue falls into the skin along the device surface). The risk of bacterial infection due to the phenomenon of entering) is a problem.
このため、（１）生体親和性に優れるハイドロキシアパタイトを始めとする燐酸カルシウム系化合物の焼結体を用いる方法（非特許文献１）や（２）シリコーン表面にアパタイトを共有結合させた材料を用いる方法（非特許文献２）などが提案されている。 For this reason, (1) a method using a sintered body of a calcium phosphate compound such as hydroxyapatite having excellent biocompatibility (Non-patent Document 1) and (2) a material in which apatite is covalently bonded to the silicone surface is used. A method (Non-Patent Document 2) has been proposed.
（１）の方法は、セラミックスであるアパタイトを直接利用するものであることから、得られる材料が脆く、衝撃で破損する恐れがある上、成型加工が困難であり、しかも経皮端子として使用すると、応力が直接身体にかかり皮膚組織の破壊を招く恐れがある等といった多くの問題点があった。 The method (1) uses apatite, which is a ceramic, directly, so that the resulting material is brittle, may be damaged by impact, is difficult to mold, and is used as a percutaneous terminal. There are many problems such as the possibility that the stress is directly applied to the body and the skin tissue may be destroyed.
（２）の方法では、（１）のような問題が少なく、シリコーン樹脂とアパタイトの接着性に優れるものの、材料と上皮組織等との接着性が必ずしも十分とは言えず、その界面から細菌感染の生じる可能性がある。 In the method (2), although there are few problems as in (1) and the adhesion between the silicone resin and the apatite is excellent, the adhesion between the material and the epithelial tissue is not necessarily sufficient, and bacterial infection is caused from the interface. May occur.
また、高分子材料と上皮組織との接着性を高める手法として、たとえば、高分子材料をラミニンで被覆する方法が示されている（特許文献１）。しかし、この文献には、高分子基材表面にラミニンを強固に固定化する手法、更には、ラミニンとアパタイトの複合層を高分子基材表面に強固に固定化する方法については何ら示唆されていない。
したがって、上皮組織等とより高い接着性を有する高分子系経皮端子の素材の開発が強く望まれているのが現状である。
Moreover, as a technique for improving the adhesion between the polymer material and the epithelial tissue, for example, a method of coating the polymer material with laminin has been shown (Patent Document 1). However, this document does not suggest any method for strongly immobilizing laminin on the surface of the polymer substrate, and further, a method for firmly immobilizing the composite layer of laminin and apatite on the surface of the polymer substrate. Absent.
Accordingly, the present situation is that development of a material for a polymer-based transdermal terminal having higher adhesion with epithelial tissue or the like is strongly desired.
本発明の第１の目的は、生体適合性、生体組織に対する密着性、接着性に優れた、経皮カテーテル、経皮端子等の経皮医療器具、人工血管、人工気管等の人工臓器等の医療用材料として好適に使用することができ、特に経皮端子の素材として使用した場合にも、生体組織との密着特性に優れ、界面からの細菌感染を防止し得る、燐酸カルシウムと生理活性物質を含有する高分子複合体を提供することにあり、第２の目的は、該高分子複合体を効率的に製造し得る方法を提供することにあり、第３の目的は、上記高分子複合体を素材とする、経皮端子などの医療用材料を提供することにある。 The first object of the present invention is excellent in biocompatibility, adhesion to living tissue, adhesiveness, transdermal medical devices such as percutaneous catheters and percutaneous terminals, artificial organs such as artificial blood vessels and artificial tracheas, etc. Calcium phosphate and physiologically active substance that can be suitably used as a medical material, and has excellent adhesion properties with living tissue and can prevent bacterial infection from the interface even when used as a material for a transdermal terminal. The second object is to provide a method capable of efficiently producing the polymer composite, and the third object is to provide the polymer composite. The object is to provide medical materials such as percutaneous terminals using the body as a raw material.
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 高分子基材の表面に燐酸カルシウム捕捉層を設け、その上に燐酸カルシウムと生理活性物質の複合層を設けたことを特徴とする生理活性物質と燐酸カルシウムを含有する高分子複合体。
（２） 高分子基材が、シリコーンポリマーなどの珪素含有ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン等の含酸素ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリスルフォン、ポリアミン、ポリウレア、ポリイミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル等の合成高分子、こられの共重合体、セルロース、アミロース、アミロペクチン、キチン、キトサン等の多糖類、コラーゲン等のポリペプチド、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸等のムコ多糖類等の天然高分子から選ばれた少なくとも１種の高分子であることを特徴とする上記（１）に記載の高分子複合体。
（３） 燐酸カルシウム捕捉層が、Si-OH基、Ti-OH基、カルボキシル基、燐酸基、硫酸基、水酸基などの官能基（末端にこれらの官能基を有するシランカップリング剤やグラフト鎖、金属酸化物ゲル等も包含される）や、それらの官能基にアルカリ金属またはアルカリ土類金属イオンを結合させたものや、炭酸カルシウム、アパタイトなど、リン及び／又はカルシウムを含む化合物から選ばれた少なくとも一種から形成されていることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の高分子複合体。
（４） 生理活性物質が、タンパク質、ペプチド、及び抗生物質から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする上記（１）乃至（３）何れかに記載の複合体。
（５） タンパク質が、成長因子、アルブミン及び細胞接着因子から選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする上記（１）乃至（４）何れかに記載の複合体。
（６） ペプチドが、少なくとも一つ以上の酸性アミノ酸を含むことを特徴とする上記（１）乃至（４）何れかに記載の複合体。
（７） 抗生物質が、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、またはその塩を有することを特徴とする上記（１）乃至（４）何れかに記載の複合体。
（８） 表面に燐酸カルシウム捕捉層を有する高分子基材と、生理活性物質を含む燐酸カルシウム過飽和溶液とを接触させ、該基材表面に生理活性物質と燐酸カルシウムを共沈させることを特徴とする上記（１）乃至（７）何れかに記載の複合体の製造方法。
（９）上記（１）乃至（７）何れかに記載の生理活性物質と燐酸カルシウムを含有する高分子複合体を素材とする医療用材料。
（１０） 医療用材料が経皮端子であることを特徴とする上記（９）に記載の医療用材料。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A polymer composite containing a physiologically active substance and calcium phosphate, wherein a calcium phosphate capturing layer is provided on the surface of the polymer substrate, and a composite layer of calcium phosphate and the physiologically active substance is provided thereon. .
(2) The polymer base material is a silicon-containing polymer such as a silicone polymer, an oxygen-containing polymer such as polyethylene glycol, polyalkylene glycol, polyether or polyether ether ketone, polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene, polyglycolic acid, Synthetic polymers such as polylactic acid, polyester, polyamide, polyurethane, polysulfone, polyamine, polyurea, polyimide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, polystyrene, polyvinyl alcohol, polyvinyl chloride, etc. Copolymers, cellulose, amylose, amylopectin, chitin, chitosan and other polysaccharides, collagen and other polypeptides, hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate and other mucos The polymer composite as described in (1) above, which is at least one polymer selected from natural polymers such as polysaccharides.
(3) Calcium phosphate capture layer has a functional group such as Si-OH group, Ti-OH group, carboxyl group, phosphoric acid group, sulfuric acid group, hydroxyl group (a silane coupling agent or graft chain having these functional groups at the terminal, Selected from compounds containing phosphorus and / or calcium, such as those obtained by binding alkali metal or alkaline earth metal ions to their functional groups, calcium carbonate, apatite, etc. The polymer composite as described in (1) or (2) above, wherein the polymer composite is formed of at least one kind.
(4) The complex according to any one of (1) to (3) above, wherein the physiologically active substance is at least one selected from proteins, peptides, and antibiotics.
(5) The complex according to any one of (1) to (4) above, wherein the protein is at least one selected from a growth factor, albumin, and a cell adhesion factor.
(6) The complex according to any one of (1) to (4) above, wherein the peptide comprises at least one acidic amino acid.
(7) The complex according to any one of (1) to (4) above, wherein the antibiotic has a carboxyl group, a phosphate group, a sulfonate group, or a salt thereof.
(8) A polymer base material having a calcium phosphate capturing layer on the surface is brought into contact with a calcium phosphate supersaturated solution containing a physiologically active substance, and the physiologically active substance and calcium phosphate are coprecipitated on the surface of the base material. The method for producing a composite according to any one of (1) to (7) above.
(9) A medical material comprising a polymer complex containing the physiologically active substance according to any one of (1) to (7) and calcium phosphate.
(10) The medical material as described in (9) above, wherein the medical material is a percutaneous terminal.
本発明の複合体の構成成分であるアパタイトなどの燐酸カルシウムは骨の主要無機成分であり、硬組織だけでなく、軟組織とも高い親和性を示し、また、他方の構成成分であるラミニン等の生理活性物質は、血管内皮細胞や歯肉上皮細胞等の上皮系細胞の生物学的能動接着を促す性質を有するものであり、しかもこれらの構成成分は、燐酸カルシウム捕捉層を介して高分子基材表面に強固に固定されているので、本発明に係る高分子複合体は、柔軟性、強度、生体に対する密着性、生体適合性に優れるため、経皮カテーテル、経皮端子等の経皮医療器具、人工血管、人工器官等の人工臓器等の医療用材料として好適に適用することができる。また、本発明の製造法では、上記複合体を効率よく容易に得ることができる。 Calcium phosphate such as apatite, which is a constituent component of the complex of the present invention, is a main inorganic component of bone, exhibits high affinity not only with hard tissue but also with soft tissue, and other components such as laminin, etc. The active substance has the property of promoting biologically active adhesion of epithelial cells such as vascular endothelial cells and gingival epithelial cells, and these constituent components are attached to the surface of the polymer substrate via the calcium phosphate capturing layer. Since the polymer composite according to the present invention is excellent in flexibility, strength, adhesion to a living body, and biocompatibility, a percutaneous medical device such as a percutaneous catheter, a percutaneous terminal, It can be suitably applied as a medical material for artificial organs such as artificial blood vessels and artificial organs. In the production method of the present invention, the complex can be obtained efficiently and easily.
本発明の燐酸カルシウムと生理活性物質を含有する高分子複合体は、高分子基材の表面に燐酸カルシウム捕捉層を設けられ、その上に燐酸カルシウムと生理活性物質の複合層が設けられていることを特徴としている。
本発明の高分子複合体は、上記のような特有な構造を有することから、燐酸カルシウム由来の生体適合性、骨結合性と、生理活性物質由来の生理活性を併せ示す特性を有するものである。
In the polymer composite containing calcium phosphate and a physiologically active substance of the present invention, a calcium phosphate capturing layer is provided on the surface of the polymer substrate, and a composite layer of calcium phosphate and the physiologically active substance is provided thereon. It is characterized by that.
Since the polymer composite of the present invention has the unique structure as described above, it has the characteristics of combining biocompatibility and bone-binding properties derived from calcium phosphate and physiological activity derived from a physiologically active substance. .
高分子基材としては、この種の分野で通常用いられている有機高分子材料が全て使用でき、例えば、シリコーンポリマーなどの珪素含有ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン等の含酸素ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリスルフォン、ポリアミン、ポリウレア、ポリイミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル等の合成高分子、こられの共重合体、セルロース、アミロース、アミロペクチン、キチン、キトサン等の多糖類、コラーゲン等のポリペプチド、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸等のムコ多糖類等の天然高分子を好ましく挙げることができる。 As the polymer base material, all organic polymer materials usually used in this kind of field can be used, for example, silicon-containing polymers such as silicone polymers, polyethylene glycol, polyalkylene glycol, polyether, polyether ether ketone. Oxygen-containing polymers such as polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene, polyglycolic acid, polylactic acid, polyester, polyamide, polyurethane, polysulfone, polyamine, polyurea, polyimide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl methacrylate, Synthetic polymers such as polyacrylonitrile, polystyrene, polyvinyl alcohol and polyvinyl chloride, these copolymers, polysaccharides such as cellulose, amylose, amylopectin, chitin and chitosan, collagen, etc. Ripepuchido, hyaluronic acid, chondroitin, can be preferably exemplified a natural polymer mucopolysaccharide such as chondroitin sulfate.
本発明で用いる上記基材の形状は限定されない。例えば、平板状、フィルム状、膜状、棒状、筒状、メッシュ状、繊維状、多孔体状、粒子状等が好ましく挙げられる。 The shape of the base material used in the present invention is not limited. For example, a flat shape, a film shape, a film shape, a rod shape, a cylindrical shape, a mesh shape, a fiber shape, a porous shape, a particle shape, and the like are preferable.
この高分子基材表面に設けられる燐酸カルシウム捕捉層とは、燐酸カルシウム過飽和水溶液中において燐酸カルシウムの形成を促し、該燐酸カルシウムを基材表面に堅固に固定化できる層を意味する。
燐酸カルシウム捕捉層を構成する物質としては、Si-OH基、Ti-OH基、カルボキシル基、燐酸基、硫酸基、水酸基などの官能基（末端にこれらの官能基を有するシランカップリング剤やグラフト鎖、金属酸化物ゲル等も包含される）や、それらの官能基にアルカリ金属またはアルカリ土類金属イオンを結合させたものや、炭酸カルシウム、アパタイトやアパタイトの前躯体など、少なくともリン及び／又はカルシウムを含む化合物が有効である。
The calcium phosphate capturing layer provided on the surface of the polymer substrate means a layer that promotes the formation of calcium phosphate in a calcium phosphate supersaturated aqueous solution and can firmly fix the calcium phosphate on the substrate surface.
Substances that make up the calcium phosphate capture layer include Si-OH groups, Ti-OH groups, carboxyl groups, phosphate groups, sulfate groups, hydroxyl groups and other functional groups (silane coupling agents and grafts having these functional groups at the ends) Chains, metal oxide gels, and the like), those in which an alkali metal or alkaline earth metal ion is bonded to their functional group, calcium carbonate, apatite or apatite precursor, etc., at least phosphorus and / or Compounds containing calcium are effective.
この中でも、燐酸カルシウムの形成を誘起する速度の観点から、アパタイトや、アモルファス燐酸カルシウム等のアパタイトの前躯体が好ましく使用される。 Among these, from the viewpoint of the speed for inducing the formation of calcium phosphate, an apatite precursor such as apatite or amorphous calcium phosphate is preferably used.
本発明に係る燐酸カルシウムと生理活性物質からなる複合体層とは、燐酸カルシウムマトリックス層と、同層の内部、及び表面に存在する生理活性物質とからなる複合体層と定義される。このような複合体層中においては、生理活性物質は周囲の燐酸カルシウムマトリックス中に物理的に担持されているだけでなく、生理活性物質表面に存在する官能基と燐酸カルシウムとの相互作用により、化学的にも燐酸カルシウムに強固に結合固定化されている。 The complex layer composed of calcium phosphate and the physiologically active substance according to the present invention is defined as a complex layer composed of the calcium phosphate matrix layer and the physiologically active substance existing in and on the surface of the same layer. In such a composite layer, the physiologically active substance is not only physically supported in the surrounding calcium phosphate matrix, but also due to the interaction between the functional groups present on the physiologically active substance surface and calcium phosphate, It is chemically bonded and fixed to calcium phosphate.
本発明で用いる燐酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイト、オキシアパタイト、ピロ燐酸アパタイト、ハイドロキシアパタイトのイオンの一部が炭酸イオン、塩化物イオン、フッ化物イオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン等で置換された化合物、アモルファス燐酸カルシウム、燐酸三カルシウム、燐酸四カルシウム、燐酸八カルシウム、二燐酸カルシウム、メタ燐酸カルシウム、二燐酸二水素カルシウム、ホスフィン酸カルシウム、燐酸水素カルシウム二水和物、燐酸二水素カルシウム一水和物、ホスホン酸カルシウム一水和物、ビス(燐酸二水素)カルシウム一水和物、これらの無水物、又はこれらの混合物等からなる燐酸カルシウム系化合物を挙げることができる。特に、生体組織との親和性、体内環境における安定性からハイドロキシアパタイトを好ましく挙げることができる。 As calcium phosphate used in the present invention, hydroxyapatite, oxyapatite, pyrophosphate apatite, a compound in which some of the ions of hydroxyapatite are substituted with carbonate ion, chloride ion, fluoride ion, sodium ion, magnesium ion, etc., Amorphous calcium phosphate, tricalcium phosphate, tetracalcium phosphate, octacalcium phosphate, calcium diphosphate, calcium metaphosphate, calcium dihydrogen phosphate, calcium phosphinate, calcium hydrogen phosphate dihydrate, calcium dihydrogen phosphate monohydrate Calcium phosphate compounds composed of calcium phosphonate monohydrate, bis (dihydrogen phosphate) calcium monohydrate, anhydrides thereof, or mixtures thereof. In particular, hydroxyapatite can be preferably mentioned from the viewpoint of affinity with living tissue and stability in the body environment.
本発明で用いる生理活性物質としては、タンパク質、ペプチド、抗生物質等を、水溶性であればいずれも使用することができる。ここで生理活性物質とは、生物に対して活性を有する、すなわち生物に作用することで生物体に何らかの変化を誘起し得る物質をいう。生理活性物質には、生体機能を調節、または変化させ得るサイトカイン、ホルモン等が含まれ、例えば成長因子や細胞接着因子を挙げることができる。 As the physiologically active substance used in the present invention, proteins, peptides, antibiotics and the like can be used as long as they are water-soluble. Here, the physiologically active substance refers to a substance that has an activity on a living organism, that is, can induce some change in the living organism by acting on the living organism. Physiologically active substances include cytokines, hormones, etc. that can regulate or change biological functions, and examples include growth factors and cell adhesion factors.
水溶性生理活性物質には、本来は非水溶性の生理活性物質を、アルブミンなどの水溶性担体タンパク質またはポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリピニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマ）などの水溶性ポリマーに結合させることで水可溶性とした非水溶性生理活性物質も含む。非水溶性の生理活性物質と上記水溶性担体タンパク質または水溶性ポリマーとの結合には両者の官能基を利用すればよく、種々の公知の方法で結合させることができる。 Water-soluble physiologically active substances include originally water-insoluble physiologically active substances, water-soluble carrier proteins such as albumin or polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polypinylpyrrolidone. , Poly-1,3-dioxolane, poly 1,3,6-trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymer, polyamino acids (homopolymer or random copolymer), etc. Also includes water-soluble physiologically active substances. The functional groups of the water-insoluble physiologically active substance and the water-soluble carrier protein or water-soluble polymer may be used for the binding, and they can be bound by various known methods.
生理活性を持つタンパク質の例としては、塩基性繊維芽細胞成長因子、IL−1（インターロイキン１）、IL−2、ＩＬ−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、IL−17、IL−18、GM−CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、G−CSF（顆粒球コロニー刺激因子）、エリスロポエチン、CSF−1（コロニー刺激因子）、SCF（幹細胞因子）、トロンボポエチン、EGF（上皮増殖因子）、TGF−α（トランスフォーミング増殖因子−α）、HB−EGF（へパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子）、エピレグリン、ニューレグリン１，２，３、PDGF（血小板由来増殖因子）、インスリン、HGF（肝細胞増殖因子）、VEGF（血管内皮増殖因子）、NGF（神経成長因子）、GDNF（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ミッドカイン、TGF−β（トランスフォーミング増殖因子−β）、ベータグリカン、アクチビン、BMP（骨形成因子）、TNF（腫瘍壊死因子）、IFN−α／β（インターフェロン−α／β）、IFN−γ（インターフェロン−γ）、フィブロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチンなどを挙げることができるが、これらに限定はされない。 Examples of physiologically active proteins include basic fibroblast growth factor, IL-1 (interleukin 1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7. IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), G -CSF (granulocyte colony stimulating factor), erythropoietin, CSF-1 (colony stimulating factor), SCF (stem cell factor), thrombopoietin, EGF (epidermal growth factor), TGF-α (transforming growth factor-α), HB- EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), epiregulin, neuregulin 1,2,3, PDGF (platelet-derived growth factor), insulin, HGF (hepatocyte growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), NGF ( Nerve growth factor), GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), midkine, TGF-β (trans Forming growth factor-β), beta glycan, activin, BMP (bone morphogenetic factor), TNF (tumor necrosis factor), IFN-α / β (interferon-α / β), IFN-γ (interferon-γ), fibronectin, Although laminin, cadherin, integrin, selectin, etc. can be mentioned, it is not limited to these.
生理活性ペプチドの例としては、YIGSR、RGD、LDV, REDV、IKVAV、LRE、RNIAEIIKDI、PDSGR、RYVVLPR、LGTIPG、DEGA、EILDV、GPRP、及びKQAGDVなどを挙げることができるが、これらに限定はされない。また、これらのペプチドの片方または両方の末端に、一つまたは複数のアミノ酸を結合させたペプチドを用いることもできる。ただし、燐酸カルシウムとの親和性の点から、グルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）を使用するのが好ましい。 Examples of bioactive peptides include, but are not limited to, YIGSR, RGD, LDV, REDV, IKVAV, LRE, RNIAEIIKDI, PDSGR, RYVVLPR, LGTIPG, DEGA, EILDV, GPRP, and KQAGDV. A peptide in which one or a plurality of amino acids are bonded to one or both ends of these peptides can also be used. However, it is preferable to use glutamic acid (E) or aspartic acid (D) from the viewpoint of affinity with calcium phosphate.
抗生物質の例としては、アジスロマイシン、アボパルシン、アモキシシリン、アルベカシン、アンピシリン、イミペネム、エペレゾリド、エリスロマイシン、エンロフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、オフロキサシン、オーレオマイシン、カナマイシン、キノロン、キヌプリスチン、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、クロロマイセチン、ゲンタマイシン、サラフロキサシン、シプロフロキサシン、ストレプトマイシン、スピラマイシン、スペクチノマイシン、スルバクタム、セファゾリン、セファロスポリン、セフタジジム、セフトリアキソン、セフトリアゾン、タゾバクタム、ダプトマイシン、ダルホプリスチン、チロシン、テイコプラニン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、バシトラシン、バージニアマイシン、バンコマイシン、ピペラシリン、プリスチナマイシン、ペニシリン、ポリミキシン、マゲイニン、ミノサイクリン、メチシリン、リネゾリド、リンコマイシンなどを挙げることができるが、これらに限定はされない。ただし、燐酸カルシウムとの親和性の点から、酸性官能基、中でも、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、またはその塩を有する抗生物質を使用するのが好ましい。 Examples of antibiotics include azithromycin, avoparcin, amoxicillin, arbekacin, ampicillin, imipenem, eperezolide, erythromycin, enrofloxacin, oxacillin, oxytetracycline, ofloxacin, aureomycin, kanamycin, quinolone, quinudamycin, clondamicin, Lambphenicol, chlortetracycline, chloromycetin, gentamicin, sarafloxacin, ciprofloxacin, streptomycin, spiramycin, spectinomycin, sulbactam, cefazolin, cephalosporin, ceftazidime, ceftriaxone, ceftriazone, tazobactam, daptomycin, dalfopristin , Teicoplanin, Tetracycline, Doxycycline , Tobramycin, trimethoprim, nafcillin, nalidixic acid, neomycin, bacitracin, virginiamycin, vancomycin, piperacillin, pristinamycin, penicillin, polymyxin, magainin, minocycline, methicillin, linezolid, lincomycin, etc. Not done. However, from the viewpoint of affinity with calcium phosphate, it is preferable to use an antibiotic having an acidic functional group, especially a carboxyl group, a phosphate group, a sulfonate group, or a salt thereof.
本発明の高分子複合体を作成するには、たとえば、高分子基材表面に燐酸カルシウム捕捉層を設けた後（第１工程）、該捕捉層と生理活性物質を含有させた燐酸カルシウム過飽和水溶液とを接触させ、基材表面に生理活性物質−燐酸カルシウム複合層を形成させる（第２工程）ことにより行われる。 In order to prepare the polymer composite of the present invention, for example, a calcium phosphate capturing layer is provided on the surface of a polymer substrate (first step), and then a calcium phosphate supersaturated aqueous solution containing the capturing layer and a physiologically active substance is included. And a physiologically active substance-calcium phosphate composite layer is formed on the surface of the substrate (second step).
第１工程は、具体的には、例えば次のように行えばよい。高分子基材を、２００ｍＭの塩化カルシウム水溶液に１０秒間、次いで超純水に１秒間浸漬した後、風乾する。続いて、基材を２００ｍＭの燐酸水素二カリウム・三水和物水溶液に１０秒間、次いで超純水に１秒間浸漬した後、風乾する。以上の操作を交互に３回繰り返す。同処理によって、基材表面にアモルファス燐酸カルシウム（ＡＣＰ）よりなる燐酸カルシウム補足層が形成される。燐酸カルシウム捕捉層の厚みに特別な制限はないが、０．１ｎｍ〜１μｍ、好ましくは１〜３００ｎｍである。 Specifically, the first step may be performed as follows, for example. The polymer substrate is immersed in a 200 mM aqueous solution of calcium chloride for 10 seconds, then in ultrapure water for 1 second, and then air-dried. Subsequently, the substrate is immersed in 200 mM dipotassium hydrogen phosphate trihydrate aqueous solution for 10 seconds, then in ultrapure water for 1 second, and then air-dried. The above operation is repeated three times alternately. By this treatment, a calcium phosphate supplement layer made of amorphous calcium phosphate (ACP) is formed on the substrate surface. The thickness of the calcium phosphate capturing layer is not particularly limited, but is 0.1 nm to 1 μm, preferably 1 to 300 nm.
第２工程は、表面に燐酸カルシウム捕捉層を有する高分子基材と、生理活性物質を含む燐酸カルシウム過飽和溶液とを接触させることにより、基材表面に生理活性物質と燐酸カルシウムを共沈させる方法が好ましく採用される。 The second step is a method of coprecipitation of a physiologically active substance and calcium phosphate on the surface of a substrate by contacting a polymer substrate having a calcium phosphate capturing layer on the surface with a calcium phosphate supersaturated solution containing the physiologically active substance. Is preferably employed.
ここで、燐酸カルシウム過飽和溶液とは、燐酸カルシウムの溶解度以上にカルシウム、及びリン成分が溶けている溶液のことを意味し、安定燐酸カルシウム過飽和溶液と、不安定燐酸カルシウム過飽和溶液の２つに分けることができる。 Here, the calcium phosphate supersaturated solution means a solution in which calcium and a phosphorus component are dissolved more than the solubility of calcium phosphate, and is divided into a stable calcium phosphate supersaturated solution and an unstable calcium phosphate supersaturated solution. be able to.
安定燐酸カルシウム過飽和溶液とは、溶液調整完了後から少なくとも8日間は、燐酸カルシウムを析出しない溶液のことである。このような安定燐酸カルシウム過飽和溶液には、ハンクス溶液や、ヒトの体液とほぼ等しい無機イオン濃度を有する水溶液（擬似体液）などがある。また、不安定燐酸カルシウム過飽和溶液とは、溶液調整完了後７日以内に、自発的核形成によって燐酸カルシウムを析出する溶液のことである。 A stable calcium phosphate supersaturated solution is a solution that does not precipitate calcium phosphate for at least 8 days after completion of solution preparation. Examples of such a stable calcium phosphate supersaturated solution include Hank's solution and aqueous solution (pseudo body fluid) having an inorganic ion concentration substantially equal to human body fluid. The unstable calcium phosphate supersaturated solution is a solution in which calcium phosphate is precipitated by spontaneous nucleation within 7 days after completion of the solution preparation.
共沈とは、単独では析出または沈殿しないはずの目的物質が、主沈殿または主析出物とともに同時に沈殿または析出することである。 The coprecipitation means that a target substance that should not precipitate or precipitate by itself precipitates or precipitates together with the main precipitate or the main precipitate.
燐酸カルシウム過飽和溶液は、少なくともカルシウムを含む試薬粉末／溶液、少なくともリンを含む試薬粉末／溶液、少なくともカルシウムとリンの両者を含む試薬粉末／溶液、さらに必要であればｐＨ緩衝剤を順次水に溶解してゆくことで調整することができる。これらの試薬粉末／溶液の添加順序は、該過飽和溶液調整中または調整後１０秒以内に燐酸カルシウムの自発的核形成を誘起しない限り、特に制限はない。 Calcium phosphate supersaturated solution is a reagent powder / solution containing at least calcium, a reagent powder / solution containing at least phosphorus, a reagent powder / solution containing at least both calcium and phosphorus, and if necessary, a pH buffering agent dissolved in water sequentially. It can be adjusted by doing. The order of addition of these reagent powders / solutions is not particularly limited as long as spontaneous nucleation of calcium phosphate is not induced during the supersaturated solution preparation or within 10 seconds after the preparation.
燐酸カルシウム過飽和溶液中には、燐酸カルシウムの自発的核形成までに要する時間を遅延する１種または２種以上の成分を含む試薬粉末／溶液をさらに混合してもよい。 In the calcium phosphate supersaturated solution, a reagent powder / solution containing one or more components that delay the time required for spontaneous nucleation of calcium phosphate may be further mixed.
少なくともカルシウムを含む粉末／溶液、及び少なくともリンを含む粉末／溶液、及び、少なくともカルシウムとリンの両者を含む粉末／溶液は限定されない。少なくともカルシウムを含む粉末／溶液の例としては、塩化カルシウム粉末／溶液、乳酸カルシウム粉末／溶液、酢酸カルシウム粉末／溶液、グルコン酸カルシウム粉末／溶液、クエン酸カルシウム粉末／溶液などが挙げられる。少なくともリンを含む粉末／溶液の例としては、リン酸緩衝生理的食塩水、リン酸溶液、リン酸水素二カリウム粉末／溶液、リン酸二水素カリウム粉末／溶液、リン酸水素二ナトリウム粉末／溶液、リン酸二水素ナトリウム粉末／溶液などが挙げられる。少なくともカルシウムとリンの両者を含む溶液としては、ハンクス溶液や擬似体液のような安定燐酸カルシウム過飽和溶液や、燐酸カルシウム不飽和溶液を挙げることもできる。燐酸カルシウム不飽和溶液の例としては、例えば、塩化カルシウム濃度２．５ｍＭ、リン酸水素二カリウム濃度１．０ｍＭ、ｐＨ５未満の溶液を挙げることができる。 The powder / solution containing at least calcium, the powder / solution containing at least phosphorus, and the powder / solution containing at least both calcium and phosphorus are not limited. Examples of the powder / solution containing at least calcium include calcium chloride powder / solution, calcium lactate powder / solution, calcium acetate powder / solution, calcium gluconate powder / solution, calcium citrate powder / solution, and the like. Examples of powders / solutions containing at least phosphorus include phosphate buffered saline, phosphoric acid solution, dipotassium hydrogen phosphate powder / solution, potassium dihydrogen phosphate powder / solution, disodium hydrogen phosphate powder / solution And sodium dihydrogen phosphate powder / solution. Examples of the solution containing at least both calcium and phosphorus include a stable calcium phosphate supersaturated solution such as Hank's solution and simulated body fluid, and a calcium phosphate unsaturated solution. Examples of the calcium phosphate unsaturated solution include a solution having a calcium chloride concentration of 2.5 mM, a dipotassium hydrogen phosphate concentration of 1.0 mM, and a pH of less than 5.
燐酸カルシウムの自発的核形成までに要する時間を遅延する成分としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等の無機塩、ポリビニルアルオール、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマー等を挙げることができる。 Examples of the component that delays the time required for spontaneous nucleation of calcium phosphate include inorganic salts such as potassium chloride, sodium chloride, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, magnesium chloride, zinc chloride, and polyvinyl alcohol. And water-soluble polymers such as polyethylene glycol.
少なくともカルシウムを含む粉末／溶液、少なくともリンを含む粉末／溶液、少なくともカルシウムとリンを含む粉末／溶液、燐酸カルシウムの自発的核形成までに要する時間を遅延する成分を含む粉末／溶液は、各々１種類の粉末／溶液でも良いし、組成の異なる複数種の粉末／溶液から成っていても良い。 A powder / solution containing at least calcium, a powder / solution containing at least phosphorus, a powder / solution containing at least calcium and phosphorus, and a powder / solution containing components that delay the time required for spontaneous nucleation of calcium phosphate are each 1 It may be a kind of powder / solution, or may be composed of a plurality of kinds of powders / solutions having different compositions.
ｐＨ緩衝剤としては、ｐＨ５〜９の間でｐＨを緩衝するものであれば、限定されない。そのようなｐＨ緩衝剤としては具体的には、トリスヒドロキシルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ{2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Acid}、中性リン酸カリウム緩衝液などを挙げることができる。 The pH buffering agent is not limited as long as it buffers the pH between pH 5 and 9. Specific examples of such pH buffering agents include trishydroxylaminomethane, HEPES {2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid}, neutral potassium phosphate buffer, and the like. Can do.
生理活性物質の変成や失活を生じなければ、調整前の水、または上述のいずれかの溶液に生理活性物質を添加溶解しても良いし、複数の溶液に生理活性物質を添加溶解しても良いし、全ての試薬又は溶液が混合された後に生理活性物質を添加溶解しても良い。添加溶解する生理活性物質は、固体状でも良いし、すでに溶液に溶解しているものでも良い。 If there is no denaturation or deactivation of the physiologically active substance, the physiologically active substance may be added and dissolved in water before adjustment or any of the above solutions, or the physiologically active substance may be added and dissolved in a plurality of solutions. Alternatively, the bioactive substance may be added and dissolved after all the reagents or solutions are mixed. The physiologically active substance to be added and dissolved may be solid or may be already dissolved in the solution.
燐酸カルシウム過飽和溶液とは具体的には、例えばＣａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｃｌ系及び、Ｃａ−Ｐ−Ｋ−Ｃｌ系のある特定組成範囲の水溶液である。安定燐酸カルシウム過飽和溶液になるか不安定燐酸カルシウム過飽和溶液になるかは、各成分濃度、ｐＨによってきまる。 Specifically, the calcium phosphate supersaturated solution is an aqueous solution having a specific composition range such as Ca-P-Na-K-Cl system and Ca-P-K-Cl system. Whether it becomes a stable calcium phosphate supersaturated solution or an unstable calcium phosphate supersaturated solution depends on the concentration and pH of each component.
Ｃａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｃｌ系の燐酸カルシウム過飽和溶液の成分濃度は、Ｃａ成分０．１〜５．０ｍＭ、好ましくは１．５〜４．０ｍＭ、Ｐ成分０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭ、Ｋ成分０〜２０ｍＭ、好ましくは０〜１０ｍM、Ｎa成分０〜２００ｍＭ、好ましくは１００〜１５０ｍＭ、Ｃｌ成分０〜２００ｍＭ、好ましくは１００〜１５０ｍＭであり、ｐＨは５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０である。 The component concentration of Ca-P-Na-K-Cl-based calcium phosphate supersaturated solution is Ca component 0.1-5.0 mM, preferably 1.5-4.0 mM, P component 0.1-10 mM, preferably 0.5-2 mM, K component 0-20 mM, preferably 0-10 mM, Na component 0-200 mM, preferably 100-150 mM, Cl component 0-200 mM, preferably 100-150 mM, pH is 5.0- 9.0, preferably 6.0 to 8.0.
Ｃａ−Ｐ−Ｋ−Ｃｌ系の燐酸カルシウム過飽和溶液の成分濃度は、Ｃａ成分０．１〜５．０ｍＭ、好ましくは１．５〜４．０ｍＭ、Ｐ成分０.１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭ、Ｋ成分０〜２５０ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍM、Ｃｌ成分０〜２５０ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭであり、ｐＨは５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０である。 The component concentration of the Ca-P-K-Cl-based calcium phosphate supersaturated solution is such that the Ca component is 0.1 to 5.0 mM, preferably 1.5 to 4.0 mM, and the P component is 0.1 to 10 mM, preferably 0.00. 5-2 mM, K component 0-250 mM, preferably 50-100 mM, Cl component 0-250 mM, preferably 50-100 mM, pH 5.0-9.0, preferably 6.0-8.0 is there.
燐酸カルシウム過飽和溶液は、医療用輸液剤、透析・腹膜灌流液、輸液の補正用製剤、カルシウム製剤、透析・腹膜灌流液の補充液の中から選ばれた１種又は２種以上の粉末または溶液を混合することで調整することもできる。 The calcium phosphate supersaturated solution is one or more powders or solutions selected from medical infusions, dialysis / peritoneal perfusate, infusion correction preparations, calcium preparations, dialysis / peritoneal perfusion replenisher It can also be adjusted by mixing.
以上に示した方法を用い、生理活性物質を含む燐酸カルシウム過飽和溶液と、アパタイト捕捉層を有する高分子基材とを接触させると、高分子基材の表面に設けられているアパタイト捕捉層上に生理活性物質と燐酸カルシウムが共沈析出し、生理活性物質と燐酸カルシウムを含有する高分子複合体を得ることができる。
Using the method described above, when a calcium phosphate supersaturated solution containing a physiologically active substance is brought into contact with a polymer substrate having an apatite capturing layer, the apatite capturing layer provided on the surface of the polymer substrate is contacted. A physiologically active substance and calcium phosphate are co-precipitated, and a polymer complex containing the physiologically active substance and calcium phosphate can be obtained.
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明はこの実施例に限定されるものではない。
実施例１
Hereinafter, the present invention will be described based on examples. The present invention is not limited to this embodiment.
Example 1
［高分子基板表面への燐酸カルシウム捕捉層の固定］
大きさ10×10×1 mm3のエチレンビニルアルコール共重合体基板を#2000のSiC研磨紙で研磨し、アセトン及びエタノールで超音波洗浄した後、100℃で24時間真空乾燥させた。以後、同基板をEVと略記する。
EV を、20 mLの200mM CaCl2水溶液に10秒間、同量の超純水に1秒間浸した後乾燥させ、次いで、20mLの200mM K2HPO4・3H2O水溶液に10秒間、同量の超純水に1秒間浸浸した後乾燥させた。同操作を３回繰り返した。以後、上記処理を交互浸漬処理と呼ぶ。また、交互浸漬処理後の基板をEVCPと略記する。
[Immobilization of calcium phosphate capture layer on polymer substrate surface]
An ethylene vinyl alcohol copolymer substrate having a size of 10 × 10 × 1 mm 3 was polished with # 2000 SiC polishing paper, subjected to ultrasonic cleaning with acetone and ethanol, and then vacuum-dried at 100 ° C. for 24 hours. Hereinafter, the substrate is abbreviated as EV.
The EV is immersed in 20 mL of 200 mM CaCl 2 aqueous solution for 10 seconds and the same amount of ultrapure water for 1 second, then dried, and then in 20 mL of 200 mM K 2 HPO 4 / 3H 2 O aqueous solution for 10 seconds. It was dipped in ultrapure water for 1 second and then dried. The same operation was repeated three times. Hereinafter, the above process is referred to as an alternating dipping process. Further, the substrate after the alternate immersion treatment is abbreviated as EVCP.
（表面構造の解析）
前記で得た各基板の表面構造をX線光電子分光法（XPS）により調べた。EV表面のスペクトルには、EVの構成元素であるCに帰属されるピークのみが検出されたのに対し、EVCP表面のスペクトルには、Cに加え、Ca及びPに帰属されるピークが検出された（図１）。この結果から、交互浸漬処理によって、基板表面に燐酸カルシウムが固定されたことが分かる。
次に、EV及びEVCPよりウルトラミクロトームを用いて超薄切片を切り出し、その微細構造を透過型電子顕微鏡（TEM）により調べた。その結果、EVCP表面には、直径数十ナノメートルの多数の球状粒子からなる析出物が観察された（図２）。同析出物の結晶構造を電子線回折により調べたところ、カーボン支持膜由来の２本のリングの他に、面間隔 3.0〜3.2 Åに相当するブロードなリングが認められた（図２）。この結果、及びXPSの結果から、交互浸漬処理後に基材表面に固定された燐酸酸カルシウムは、主としてアモルファスリン酸カルシウム（ACP）であると考えられる。なお、ACPはアパタイトの前躯体である。
(Surface structure analysis)
The surface structure of each substrate obtained above was examined by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). Only peaks attributed to C, which is a constituent element of EV, were detected in the spectrum on the EV surface, whereas peaks attributed to Ca and P in addition to C were detected in the spectrum on the EVCP surface. (FIG. 1). From this result, it can be seen that calcium phosphate was fixed to the substrate surface by the alternate dipping treatment.
Next, ultrathin sections were cut out from EV and EVCP using an ultramicrotome, and the microstructure was examined by a transmission electron microscope (TEM). As a result, precipitates composed of many spherical particles having a diameter of several tens of nanometers were observed on the EVCP surface (FIG. 2). When the crystal structure of the precipitate was examined by electron beam diffraction, a broad ring corresponding to a surface separation of 3.0 to 3.2 mm was recognized in addition to the two rings derived from the carbon support film (FIG. 2). From this result and the result of XPS, it is considered that the calcium phosphate fixed on the substrate surface after the alternate dipping treatment is mainly amorphous calcium phosphate (ACP). ACP is an apatite precursor.
［高分子複合体の作成］
超純水に、NaCl 142 mM、CaCl23.75 mM、K2HPO4・3H2O 1.5 mMとなるように各試薬を溶解し、その後トリスヒドロキシメチルアミノメタンと塩酸を用いて25℃でpH7.40となるように調整した。以後この溶液をCP溶液と呼ぶ。また、CP溶液に40μg/mLの濃度となるようラミニンを加えた溶液をLCP溶液と呼ぶ。
25℃に保った3 mLのCP溶液またはLCP溶液に、EV及びEVCPを24時間浸漬した。以後、上記処理を、過飽和溶液処理と呼ぶ。また、過飽和溶液処理後の試料をそれぞれ次のように略記する。
EV-LCP（LCP溶液に浸漬されたEV）
EVCP-CP（CP溶液に浸漬されたEVCP）
EVCP-LCP（LCP溶液に浸漬されたEVCP）
[Creation of polymer composite]
Each reagent is dissolved in ultrapure water to become NaCl 142 mM, CaCl 2 3.75 mM, K 2 HPO 4・ 3H 2 O 1.5 mM, and then pH 7 at 25 ° C using trishydroxymethylaminomethane and hydrochloric acid. Adjusted to 40. Hereinafter, this solution is referred to as a CP solution. A solution obtained by adding laminin to a CP solution to a concentration of 40 μg / mL is called an LCP solution.
EV and EVCP were immersed in 3 mL of CP solution or LCP solution kept at 25 ° C. for 24 hours. Hereinafter, the treatment is referred to as supersaturated solution treatment. The samples after the supersaturated solution treatment are abbreviated as follows.
EV-LCP (EV immersed in LCP solution)
EVCP-CP (EVCP immersed in CP solution)
EVCP-LCP (EVCP immersed in LCP solution)
（表面構造の解析１）
前記で得た各試料の表面構造を薄膜X線回折（TF-XRD）により調べた。EV、及びEV-LCP表面のパターンには、EVの結晶部分由来のピークのみが検出された（図３）。一方、EVCP-CP、及びEVCP-LCP表面のXRDパターンには、EV由来のピークの他、アパタイトに帰属されるピークが検出された。以上の結果から、交互浸漬処理の後過飽和溶液処理された基板表面には、アパタイト層が形成されたことが分かった。交互浸漬処理によって基板表面に固定されたACPが、過飽和溶液中でアパタイトに相転移、成長したものと考えられる。
(Surface structure analysis 1)
The surface structure of each sample obtained above was examined by thin film X-ray diffraction (TF-XRD). Only peaks derived from the crystal part of EV were detected in the EV and EV-LCP surface patterns (FIG. 3). On the other hand, in the XRD pattern on the EVCP-CP and EVCP-LCP surfaces, a peak attributed to apatite was detected in addition to the peak derived from EV. From the above results, it was found that an apatite layer was formed on the surface of the substrate that was subjected to the supersaturated solution treatment after the alternate immersion treatment. It is considered that the ACP fixed on the substrate surface by the alternate dipping process has undergone phase transition and growth to apatite in the supersaturated solution.
（表面構造の分析２）
次に、前記で得た各試料の表面構造をXPSにより調べた。EV-LCP表面のスペクトルには、Cの他、ラミニンの構成元素であるNに帰属されるピークが検出された（図４）。この結果から、LCP溶液を用いた過飽和溶液処理によって、基板表面にラミニン層が形成されたことが分かった。ラミニンは、基板表面に物理的に吸着していると考えられる。
EVCP-CP表面のスペクトルには、Cの他、Ca及びPに帰属されるピークが検出された。Cに対するCa及びPのピーク強度は、過飽和溶液処理前（図1中のEVCP）に比べ増大していた。これは、EVCP-CP表面でのアパタイト層の成長によるものと考えられる。
EVCP-LCP表面のスペクトルには、Cの他、Ca、P、及びラミニンの構成元素であるNに帰属されるピークが検出された。また、Cに対するCa及びPのピーク強度は、過飽和溶液処理前（図1中のEVCP）に比べ増大していた。これは、EVCP-LCP表面でのラミニン-アパタイト複合層の成長によるものと考えられる。
図３及び図４の結果から、EV-LCP表面には吸着ラミニン層が、EVCP-CP表面にはアパタイト層が、EVCP-LCP表面にはラミニン-アパタイト複合層が形成されていることが分かった。
(Surface structure analysis 2)
Next, the surface structure of each sample obtained above was examined by XPS. In addition to C, a peak attributed to N, which is a constituent element of laminin, was detected in the spectrum of the EV-LCP surface (FIG. 4). From this result, it was found that a laminin layer was formed on the substrate surface by the supersaturated solution treatment using the LCP solution. Laminin is considered to be physically adsorbed on the substrate surface.
In addition to C, peaks attributed to Ca and P were detected in the spectrum of the EVCP-CP surface. The peak intensities of Ca and P with respect to C increased compared to before the supersaturated solution treatment (EVCP in FIG. 1). This is thought to be due to the growth of the apatite layer on the EVCP-CP surface.
In addition to C, peaks attributed to N, which are constituent elements of Ca, P, and laminin, were detected in the spectrum of the EVCP-LCP surface. In addition, the peak intensities of Ca and P with respect to C were increased as compared with those before the supersaturated solution treatment (EVCP in FIG. 1). This is thought to be due to the growth of the laminin-apatite composite layer on the EVCP-LCP surface.
From the results of FIGS. 3 and 4, it was found that an adsorbed laminin layer was formed on the EV-LCP surface, an apatite layer was formed on the EVCP-CP surface, and a laminin-apatite composite layer was formed on the EVCP-LCP surface. .
（過飽和溶液処理前後のCP、及びLCP溶液中のカルシウム、リン及びラミニン濃度の測定）
過飽和溶液処理前後のCP、及びLCP溶液中のカルシウム及びリンの元素濃度を高周波結合誘導プラズマ発光分光分析により、ラミニン濃度を紫外可視分光光度計により測定した。
EV-LCPでは、LCP溶液中のカルシウム、リン及びラミニン濃度は、過飽和溶液処理前後でほぼ同じであった（図５）。この結果から、EV-LCP表面のラミニン吸着量は極めて少ないことが分かる。また、過飽和溶液処理中に、LCP溶液中における燐酸カルシウムの自発的均一核形成や、EV表面または容器壁面における燐酸カルシウムの析出は生じていないことが確認された。EVCP-CPでは、過飽和溶液処理後のCP溶液中のカルシウム及びリン濃度は処理前に比べ減少したが、ラミニン濃度は不変であった。カルシウム及びリン濃度の減少は、基板表面におけるアパタイト層の形成によるものと考えられる。EVCP-LCPでは、過飽和溶液処理後のLCP溶液中のカルシウム、リン、及びラミニン濃度はいずれも、処理前に比べ減少していた。これは、基板表面でのラミニン-アパタイト複合層の形成によるものと考えられる。以上の結果より、過飽和溶液処理において、アパタイト層あるいはラミニン-アパタイト複合層は、交互浸漬処理された基板（EVCP）表面においてのみ選択的に形成されることが確かめられた。
また、EVCP に過飽和溶液処理によるCPまたはLCP溶液中のカルシウム、リン、及びラミニン濃度の経時変化を調べたところ、CP溶液中ではカルシウム、及びリン濃度が単調に減少した。LCP溶液中では、カルシウム及びリン濃度だけでなく、ラミニン濃度も単調に減少した（図６）。以上の結果から、EVCP-CP表面にアパタイト層が、EVCP-LCP表面にラミニン-アパタイト複合層が形成されるメカニズムは、以下の通りと推定される。過飽和溶液処理で用いられたCP、及びLCP溶液はアパタイトに対して過飽和になっている。従って、交互浸漬処理により基板表面に形成されたACPは、CP溶液中では、周囲の燐酸及びカルシウムイオンを取り込んで自発的にアパタイト層へと成長していく。LCP溶液中では、溶液中のラミニンが、アパタイト層の成長と同時にアパタイト中に取り込まれていくことにより、ラミニン-アパタイト複合層となる。
(Measurement of calcium, phosphorus and laminin concentrations in CP and LCP solutions before and after supersaturated solution treatment)
The elemental concentrations of calcium and phosphorus in the CP and LCP solution before and after the supersaturated solution treatment were measured by high-frequency coupled induction plasma emission spectrometry, and the laminin concentration was measured by an ultraviolet-visible spectrophotometer.
In EV-LCP, the calcium, phosphorus and laminin concentrations in the LCP solution were almost the same before and after the supersaturated solution treatment (FIG. 5). This result shows that the amount of laminin adsorbed on the EV-LCP surface is extremely small. In addition, it was confirmed that, during the treatment with the supersaturated solution, neither spontaneous nucleation of calcium phosphate in the LCP solution nor precipitation of calcium phosphate on the EV surface or the container wall occurred. In EVCP-CP, the calcium and phosphorus concentrations in the CP solution after the supersaturated solution treatment decreased compared with those before the treatment, but the laminin concentration was unchanged. The decrease in calcium and phosphorus concentration is considered to be due to the formation of an apatite layer on the substrate surface. In EVCP-LCP, the concentrations of calcium, phosphorus, and laminin in the LCP solution after treatment with the supersaturated solution were all reduced compared to before treatment. This is thought to be due to the formation of a laminin-apatite composite layer on the substrate surface. From the above results, it was confirmed that in the supersaturated solution treatment, the apatite layer or the laminin-apatite composite layer was selectively formed only on the surface of the alternately immersed substrate (EVCP).
In addition, when the time-dependent changes in calcium, phosphorus, and laminin concentrations in CP or LCP solutions after EVCP treatment with supersaturated solutions were examined, the concentrations of calcium and phosphorus in the CP solution decreased monotonously. In the LCP solution, not only the calcium and phosphorus concentrations, but also the laminin concentration decreased monotonously (FIG. 6). From the above results, the mechanism by which the apatite layer is formed on the EVCP-CP surface and the laminin-apatite composite layer is formed on the EVCP-LCP surface is estimated as follows. The CP and LCP solutions used in the supersaturated solution treatment are supersaturated with respect to apatite. Therefore, the ACP formed on the substrate surface by the alternate dipping process spontaneously grows into the apatite layer by taking in the surrounding phosphoric acid and calcium ions in the CP solution. In the LCP solution, laminin in the solution is taken into the apatite simultaneously with the growth of the apatite layer, thereby forming a laminin-apatite composite layer.
（ラミニン-アパタイト複合層の構造解析）
EVCP-LCPより、ウルトラミクロトームを用いて超薄切片を切り出し、その微細構造をTEMにより調べた。ラミニン分子を検出するために、TEM観察に先立ち免疫染色を行った。免疫染色においては、一時抗体としてanti-laminin (mouse IgG1, isotype)を、二次抗体として直径 5 nmの金コロイドを結合させたgoat anti-mouse IgGを用いた。TEM観察の結果、ラミニンを標識する直径5 nmの金コロイド粒子が、切片のほぼ全面に観察された（図７）。このことから、ラミニン-アパタイト複合層中において、ラミニン分子は層の表面だけでなく内部にも存在し、アパタイト結晶よりなるマトリックス中に分子スケールで担持されていることが分かった。
(Structural analysis of laminin-apatite composite layer)
An ultrathin section was cut out from EVCP-LCP using an ultramicrotome, and its microstructure was examined by TEM. In order to detect laminin molecules, immunostaining was performed prior to TEM observation. In immunostaining, anti-laminin (mouse IgG1, isotype) was used as a temporary antibody, and goat anti-mouse IgG to which a gold colloid with a diameter of 5 nm was bound as a secondary antibody. As a result of TEM observation, colloidal gold particles with a diameter of 5 nm that label laminin were observed on almost the entire surface of the section (FIG. 7). From this, it was found that in the laminin-apatite composite layer, laminin molecules exist not only on the surface of the layer but also inside, and are supported on a molecular scale in a matrix made of apatite crystals.
（EV、EV-LCP、EVCP-CP、及びEVCP-LCPの細胞接着性試験）
EV、EV-LCP、EVCP-CP、及びEVCP-LCPの4種類の試料を、12ウェルの細胞培養用マイクロプレート上に静置した。血清を含まないDMEM細胞培養液に、ヒト熱傷後瘢痕より生じた上皮様細胞 BSCC93を15×104 cell/mLとなるように懸濁させた。同細胞懸濁液2 mLを各ウェルに注いだ後、37℃、5 % CO2雰囲気に保ったインキュベーター中で2時間培養を行った。培養終了後、各ウェルより培養液を吸引した後、試料をPBS(-)で二回洗浄した。次いで、試料表面に接着した細胞を、0.25 %トリプシン、0.02 %EDTA混合溶液を用いて剥がし、これを0.3 %のトリパンブルーで染色した。染色された細胞の数をタタイ式細胞計数盤で計数した。ANOVA統計処理により解析したところ、EVCP-LCP表面には、他の試料よりも統計的に有意に多数の細胞が接着していたことが分かった。（図８）。以上の結果より、4種類の試料の中で、EVCP-LCPが細胞の初期接着性に最も優れていることが分かった。EVCP-LCP表面に形成されたラミニン-アパタイト複合層中のラミニンが、細胞の接着を促進したためと考えられる。EV-LCP表面にはラミニンが吸着していたにも関わらず（図４参照）、同基板の細胞接着性が低かったのは、基板表面に吸着されたラミニンの量が少なく、しかも同層が洗浄によって容易に剥がされてしまうためと推察される。すなわち、物理的にラミニンを吸着させただけの基板表面には、細胞を強固に接着させることはできなかった。一方、交互浸漬、及び過飽和溶液処理によって表面にラミニン-アパタイト複合層を形成させた基板表面には、細胞を強固に接着させることができた。
実施例２
(Cell adhesion test of EV, EV-LCP, EVCP-CP, and EVCP-LCP)
Four types of samples, EV, EV-LCP, EVCP-CP, and EVCP-LCP, were placed on a 12-well cell culture microplate. Epithelial cells BSCC93 generated from scars after human burn were suspended in DMEM cell culture medium without serum so as to be 15 × 10 4 cells / mL. After pouring 2 mL of the same cell suspension into each well, the cells were cultured for 2 hours in an incubator maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 atmosphere. After completion of the culture, the culture solution was aspirated from each well, and the sample was washed twice with PBS (−). Next, the cells adhering to the sample surface were peeled off using a mixed solution of 0.25% trypsin and 0.02% EDTA, and stained with 0.3% trypan blue. The number of stained cells was counted with a Tatai cell counter. When analyzed by ANOVA statistical processing, it was found that a larger number of cells were attached to the EVCP-LCP surface statistically significantly than other samples. (FIG. 8). From the above results, it was found that EVCP-LCP was the most excellent in initial cell adhesion among the four types of samples. This is probably because laminin in the laminin-apatite composite layer formed on the EVCP-LCP surface promoted cell adhesion. Despite the fact that laminin was adsorbed on the EV-LCP surface (see Fig. 4), the cell adhesion of the substrate was low because of the small amount of laminin adsorbed on the substrate surface and the same layer. It is assumed that it is easily peeled off by washing. That is, cells could not be firmly adhered to the substrate surface on which laminin was physically adsorbed. On the other hand, the cells could be firmly adhered to the substrate surface on which the laminin-apatite composite layer was formed on the surface by alternate soaking and supersaturated solution treatment.
Example 2
大きさ0.05×7×17 mm3のエチレンビニルアルコール共重合体基板をアセトン及びエタノールで超音波洗浄した後、100℃で24時間真空乾燥させた（EV）。これに、プラズマエッチング装置を用いて30 Paの酸素雰囲気下、30秒間グロー放電処理を施した。なお、電力密度は0.50 W/cm2とした。上記処理した試料に、実施例１と同様にして交互浸漬処理を施した後、25℃に保ったLCP溶液 6 mL中に24時間浸漬した（EVCP-LCP）。得られた試料の表面構造をTF-XRD、及びXPSにより調べたところ、EVCP-LCP表面にはラミニン-アパタイト複合層が形成されていることが分かった。
以上のことから、本処理法は種々の形状の基材に有効であることが分かる。
An ethylene vinyl alcohol copolymer substrate having a size of 0.05 × 7 × 17 mm 3 was ultrasonically cleaned with acetone and ethanol and then vacuum-dried at 100 ° C. for 24 hours (EV). This was subjected to a glow discharge treatment for 30 seconds in an oxygen atmosphere of 30 Pa using a plasma etching apparatus. The power density was 0.50 W / cm 2 . The treated sample was subjected to alternate dipping treatment in the same manner as in Example 1 and then dipped in 6 mL of LCP solution kept at 25 ° C. for 24 hours (EVCP-LCP). When the surface structure of the obtained sample was examined by TF-XRD and XPS, it was found that a laminin-apatite composite layer was formed on the EVCP-LCP surface.
From the above, it can be seen that this treatment method is effective for substrates of various shapes.
（EV、及びEVCP-LCPの上皮組織接着性試験）
実施例２で作製された試料を、ヌードラットのヘテロ（F344/NJcL-rnu/+、7週齢、♀）の頭部に埋植した。飼育3日後にラットを屠殺し、試料周囲の皮膚組織を切り出し、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。同皮膚組織と試料の接着部位を光学顕微鏡により観察したところ、EV周囲の上皮組織は試料表面に沿ってダウングロウスしていたのに対し、EVCP-LCP周囲の上皮組織はダウングロウスせず、試料表面に直接接着していた（図９）。EVCP-LCP表面のラミニン-アパタイト複合層中のラミニンが、上皮組織の接着を促進したためと考えられる。以上のことから、本処理法により得られる材料は、上皮組織に対して優れた接着性を有することが確かめられた。
実施例３〜４
(EV and EVCP-LCP epithelial tissue adhesion test)
The sample prepared in Example 2 was implanted in the head of a nude rat hetero (F344 / NJcL-rnu / +, 7 weeks old, rabbit). Three days after breeding, the rats were sacrificed, and the skin tissue around the sample was cut out and stained with hematoxylin-eosin. When the adhesion site of the skin tissue and the sample was observed with an optical microscope, the epithelial tissue around the EV was down-growth along the sample surface, whereas the epithelial tissue around the EVCP-LCP was not down-growth, and the sample It was directly adhered to the surface (FIG. 9). This is probably because laminin in the laminin-apatite composite layer on the EVCP-LCP surface promoted epithelial tissue adhesion. From the above, it was confirmed that the material obtained by this treatment method has excellent adhesion to epithelial tissues.
Examples 3-4
実施例１の基板であるＥＶを、ポリエチレンテレフタレート（PET）（実施例３）、ポリ乳酸（PLA）（実施例４）に代えた以外は実施例１と同様にして、交互浸漬及び過飽和溶液処理を行った。なお、PETについては、交互浸漬処理に先立ち、基板を1M-NaOH水溶液に10分間浸漬することにより、親水化処理を施した。
過飽和溶液処理後の試料表面をTF-XRDにより調べたところ、いずれの基板にもアパタイトに帰属されるピークが認められた。従って、いずれの基板表面にもアパタイトが形成されたことがわかった。また、過飽和溶液処理前後のLCP溶液中のラミニン濃度を紫外可視分光光度計により測定したところ、処理後のラミニン濃度は、いずれの基板についても処理前に比べ減少していた（図１０）。以上より、PET及びPLAもEVと同様に、本処理法により、その表面にラミニン-アパタイト複合層を形成すると考えられる。以上のことから、本処理法は、エチレン‐ビニルアルコール共重合体だけでなく他の高分子材料にも有効であることが分かる。
実施例５
Alternate immersion and supersaturated solution treatment in the same manner as in Example 1 except that the substrate EV of Example 1 was replaced with polyethylene terephthalate (PET) (Example 3) and polylactic acid (PLA) (Example 4). Went. In addition, prior to the alternate dipping treatment, PET was hydrophilized by dipping the substrate in a 1M-NaOH aqueous solution for 10 minutes.
When the surface of the sample after the supersaturated solution treatment was examined by TF-XRD, a peak attributed to apatite was observed on any substrate. Therefore, it was found that apatite was formed on any substrate surface. Further, when the laminin concentration in the LCP solution before and after the supersaturated solution treatment was measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer, the laminin concentration after the treatment was decreased for all the substrates compared with that before the treatment (FIG. 10). From the above, it is considered that PET and PLA also form a laminin-apatite composite layer on the surface by this treatment method in the same manner as EV. From the above, it can be seen that this treatment method is effective not only for the ethylene-vinyl alcohol copolymer but also for other polymer materials.
Example 5
CP溶液に40 μg/mLの濃度となるようアルブミンを加えた溶液（ACP溶液）を調整した。25℃に保った3 mLのLCPまたはACP溶液に、EVCPを24時間浸漬した（過飽和溶液処理）。過飽和溶液処理後の基板表面をTF-XRDにより調べたところ、いずれの基板にもアパタイトに帰属されるピークが認められた。従って、いずれの基板表面にもアパタイトが形成されたことが分かった。また、過飽和溶液処理前後のACP及びLCP溶液中のラミニン及びアルブミン濃度を紫外可視分光光度計により測定したところ、処理後のラミニン及びアルブミン濃度は、処理前に比べ減少していた（図１１）。従って、アルブミンもラミニンと同様、基板表面に形成されたアパタイト中に担持されることが分かった。以上のことから、本処理法は、ラミニンだけでなく他のタンパク質にも有効であることが分かる。
実施例６
A solution (ACP solution) in which albumin was added to the CP solution to a concentration of 40 μg / mL was prepared. EVCP was immersed in 3 mL of LCP or ACP solution kept at 25 ° C. for 24 hours (supersaturated solution treatment). When the surface of the substrate after the supersaturated solution treatment was examined by TF-XRD, a peak attributed to apatite was observed in any substrate. Therefore, it was found that apatite was formed on any substrate surface. Further, when the concentrations of laminin and albumin in the ACP and LCP solutions before and after the treatment with the supersaturated solution were measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer, the laminin and albumin concentrations after the treatment were reduced as compared with those before the treatment (FIG. 11). Therefore, it was found that albumin is also supported in apatite formed on the substrate surface, like laminin. From the above, it can be seen that this treatment method is effective not only for laminin but also for other proteins.
Example 6
CP溶液に、0.1、1、10または50μMの濃度となるようEEEEEEEYIGSRの配列を有するペプチドを加えた溶液（それぞれ、01E7Y、1E7Y、10E7Y及び50E7Y溶液と略記）を調整した。25℃に保った3 mLのCP、01E7Y、1E7Y、10E7Y、及び50E7Y溶液に、EVCPを24時間浸漬した（過飽和溶液処理）。過飽和溶液処理後の基板表面をTF-XRDにより調べたところ、いずれの基板にもアパタイトに帰属されるピークが認められた。従って、いずれの基板表面にもアパタイトが形成されたことがわかった。また、同基板表面をXPSにより調べたところ、01E7Y、1E7Y、10E7Y及び50E7Y溶液に浸漬された基板にはNに帰属されるピークが検出され、そのピーク強度は溶液中のペプチドの濃度が高くなるに従って強くなった（図１２）。NはCP溶液に添加されたペプチドの構成元素のひとつである。従って、01E7Y、1E7Y、10E7Y及び50E7Y溶液に浸漬された基板表面に形成されたアパタイトにはペプチドが担持されていること、またその担持量は溶液中のペプチド濃度が高くなるに従って増加することが分かった。以上のことから、本処理法は、タンパク質だけでなく、ペプチドにも有効であることが分かる。
実施例７
A solution in which a peptide having an EEEEEEEYIGSR sequence was added to a CP solution to a concentration of 0.1, 1, 10 or 50 μM (abbreviated as 01E7Y, 1E7Y, 10E7Y and 50E7Y, respectively) was prepared. EVCP was immersed in 3 mL of CP, 01E7Y, 1E7Y, 10E7Y, and 50E7Y solutions kept at 25 ° C. for 24 hours (supersaturated solution treatment). When the surface of the substrate after the supersaturated solution treatment was examined by TF-XRD, a peak attributed to apatite was observed in any substrate. Therefore, it was found that apatite was formed on any substrate surface. Further, when the surface of the substrate was examined by XPS, a peak attributed to N was detected in the substrates immersed in the 01E7Y, 1E7Y, 10E7Y, and 50E7Y solutions, and the peak intensity increased in the concentration of the peptide in the solution. (Fig. 12). N is one of the constituent elements of the peptide added to the CP solution. Therefore, it can be seen that the apatite formed on the surface of the substrate immersed in the 01E7Y, 1E7Y, 10E7Y and 50E7Y solutions carries the peptide, and that the loaded amount increases as the peptide concentration in the solution increases. It was. From the above, it can be seen that this treatment method is effective not only for proteins but also for peptides.
Example 7
CP溶液に、抗生物質の一種であるテトラサイクリンを0.01、0.05、または0.10 mMの濃度で加えた溶液（それぞれ、T001、T005、及びT010溶液と略記）を調整した。25℃に保った3 mLのT001、T005、及びT010溶液に、EVCPを24時間浸漬した（過飽和溶液処理）。過飽和溶液処理後の基板表面をTF-XRDにより調べたところ、いずれの基板にもアパタイトに帰属されるピークが認められた。従って、いずれの基板においてもその表面にアパタイトが形成されていることがわかった。また、過飽和溶液処理前後の各溶液中のテトラサイクリン濃度を紫外可視分光光度計により測定したところ、処理後のテトラサイクリン濃度は処理前に比べ減少していた（図１３）。従って、T001、T005、及びT010溶液に浸漬された基板表面に形成されたアパタイトにはテトラサイクリンが担持されていることが分かった。以上のことから、本処理法は、タンパク質、ペプチドだけでなく、抗生物質にも有効であることが分かる。
Solutions were prepared by adding tetracycline, a kind of antibiotic, at a concentration of 0.01, 0.05, or 0.10 mM to the CP solution (abbreviated as T001, T005, and T010, respectively). EVCP was immersed in 3 mL of T001, T005, and T010 solutions maintained at 25 ° C. for 24 hours (supersaturated solution treatment). When the surface of the substrate after the supersaturated solution treatment was examined by TF-XRD, a peak attributed to apatite was observed in any substrate. Therefore, it was found that apatite was formed on the surface of any substrate. Moreover, when the tetracycline density | concentration in each solution before and behind a supersaturated solution process was measured with the ultraviolet visible spectrophotometer, the tetracycline density | concentration after a process was reducing compared with before a process (FIG. 13). Therefore, it was found that tetracycline was supported on the apatite formed on the substrate surface immersed in the T001, T005, and T010 solutions. From the above, it can be seen that this treatment method is effective not only for proteins and peptides but also for antibiotics.
Claims (10)
The medical material according to claim 9, wherein the medical material is a percutaneous terminal.
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