JP2005087129A - Metallothionein gene derived from seashore panalum to which resistance to salt stress is imparted - Google Patents

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Yoshio Akiyoshi
美穂 秋吉
Noboru Endo
昇 遠藤
Mitsutake Yoshida
光毅 吉田
Akira Yaneshita
亮 屋祢下
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new gene capable of imparting resistance to salt stress to plants over a long period and a salt stress-resistant transgenic plant to which the gene is introduced. <P>SOLUTION: The gene encodes (a) a protein composed of a specific amino acid sequence and (b) a protein composed of an amino acid sequence in which one or several amino acids are lost, substituted or added in a specific amino acid sequence and having activity imparting resistance to salt stress. The salt stress-resistant transgenic plant is obtained by introducing the gene. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、塩ストレス耐性を付与する遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換植物等に関する。   The present invention relates to a gene that imparts salt stress tolerance, a transformed plant into which the gene has been introduced, and the like.

植物が受ける環境ストレスには、塩、乾燥、高温、低温、強光、空気汚染等があるが、農業生産の観点から最も問題となっているのが、塩害及び乾燥である。塩害はもともと塩分の高い地域のみならず、灌漑を行うことによりそれまで問題のなかった農地においても発生している。現在、アジアでは1200万ヘクタールの耕地が塩害や干ばつの被害を受けており、実際に950万ヘクタールの耕地が塩害のため未使用のままになっている。特に、イネはアジアにおける主要穀物であるのでイネに塩ストレス耐性が付与できれば未使用の農地も食料生産の場に変えられて、世界の穀物生産の安定化に貢献できる。これまで、劣悪環境下や不良土壌でも栽培可能な環境ストレス耐性植物を遺伝子組換え技術を駆使して作出する種々の試みが検討されている。例えば、塩ストレスによって誘導される遺伝子を単離し、該遺伝子を発現させることで、塩ストレス耐性植物の作出が可能になると考えられる。塩ストレス耐性付与遺伝子としてこれまでコウライシバ由来のベタイン合成酵素遺伝子(特許文献1)、Arthrobacter globiformis由来のコリンオキシダーゼ遺伝子(非特許文献1)、イネ由来の葉緑体型グルタミンシンターゼ(非特許文献2)、イネ由来の転写活性因子(Os DREB)(非特許文献3)、ホソバノハマアカザ由来のNa+/H+アンチポーター遺伝子(特許文献2)等が知られている。また、糖代謝・合成に関与する酵素遺伝子では、大腸菌由来のトレハロース合成関連遺伝子(非特許文献4)、UDPガラクトースからガラクチノールを合成するガラクチノール合成酵素(AtGolS)遺伝子が、乾燥・塩・低温といった水ストレス耐性付与に関与することがシロイヌナズナにおいて報告されている(非特許文献5、非特許文献6)。双子葉植物では、シロイヌナズナ由来のNa+/H+アンチポーター遺伝子にて形質転換したトマト(非特許文献7)やBrassica植物(非特許文献8)において200mMで10週間にわたって塩ストレス耐性を評価した例があり、果実や種子の収穫が報告されている。しかしながら、単子葉形質転換植物では移植から種子を収穫するまでという長期間の塩ストレス耐性を付与した遺伝子はない。例えば、形質転換イネで塩ストレス耐性を示した条件としては100mMで13日間、150mMで2週間、300mMで3日間と短期である。従って、苗の移植から種子の収穫までといった数週間から数カ月にわたる実際の生産工程に対応した塩ストレス耐性形質を上記の遺伝子群が付与できるとは判断し難いのが現状である。
従って、長期間にわたり塩ストレス耐性を示す植物を作出することが望まれている。
There are salt, dryness, high temperature, low temperature, strong light, air pollution, and the like as environmental stresses to plants, but salt damage and dryness are the most problematic from the viewpoint of agricultural production. Salt damage occurs not only in areas with high salinity, but also in farmland that had no problems until now due to irrigation. Currently, 12 million hectares of cultivated land in Asia have been damaged by salt damage and drought, and 9.5 million hectares of arable land are actually left unused due to salt damage. In particular, rice is a major grain in Asia, so if salt tolerance can be imparted to rice, unused farmland can be converted into a place for food production, contributing to the stabilization of global grain production. Until now, various attempts to produce environmental stress-resistant plants that can be cultivated even in poor environments or in poor soils using gene recombination techniques have been studied. For example, it is considered that a salt stress-tolerant plant can be produced by isolating a gene induced by salt stress and expressing the gene. Soybean-derived betaine synthase gene (patent document 1), arthrobacter globiformis-derived choline oxidase gene (non-patent document 1), rice-derived chloroplast glutamine synthase (non-patent document 2), Rice-derived transcriptional activator (Os DREB) (Non-patent Document 3), Na + / H + antiporter gene (Patent Document 2) derived from Hosowana Akaza and the like are known. The enzyme genes involved in sugar metabolism and synthesis are trehalose synthesis-related genes derived from Escherichia coli (Non-patent Document 4), and the galactinol synthase (AtGolS) gene that synthesizes galactinol from UDP galactose contains water such as dry, salt, and low temperature. It has been reported in Arabidopsis that it is involved in imparting stress tolerance (Non-Patent Documents 5 and 6). In the case of dicotyledonous plants, salt stress tolerance was evaluated for 10 weeks at 200 mM in tomato (Non-patent Document 7) and Brassica plant (Non-patent Document 8) transformed with Na + / H + antiporter gene derived from Arabidopsis thaliana There have been reports of fruit and seed harvesting. However, there is no gene that imparted long-term salt stress tolerance from transplanting to harvesting seeds in monocotyledonous transformed plants. For example, the conditions of salt stress tolerance in transformed rice are as short as 13 days at 100 mM, 2 weeks at 150 mM, and 3 days at 300 mM. Therefore, it is difficult to judge that the above gene group can impart a salt stress tolerance trait corresponding to an actual production process from several weeks to several months from seedling transplantation to seed harvesting.
Therefore, it is desired to produce plants that exhibit salt stress tolerance over a long period of time.

一方、メタロチオネインは、重金属に結合する能力があるシステインの多い低分子量タンパク質であり、メタロチオネイン遺伝子は、広範囲の動物及び植物に存在することが知られ、遺伝子ファミリーを形成している。従来、動物細胞においてメタロチオネインにより核が活性酸素から防御される可能性が示唆されているが(非特許文献9〜11)、植物における塩ストレス耐性については報告されていない。   On the other hand, metallothionein is a cysteine-rich low molecular weight protein capable of binding heavy metals, and the metallothionein gene is known to exist in a wide range of animals and plants and forms a gene family. Conventionally, it has been suggested that nuclei may be protected from active oxygen by metallothionein in animal cells (Non-Patent Documents 9 to 11), but salt stress tolerance in plants has not been reported.

特開2001-309789号JP 2001-309789 特開2000-157287号JP 2000-157287 A Mohanty A., et al., Theor. Appl. Genet., 106, pp.51-57 (2002)Mohanty A., et al., Theor. Appl. Genet., 106, pp. 51-57 (2002) Hoshida H., et al., Plant Mol. Biol., 43, pp.103-111 (2000)Hoshida H., et al., Plant Mol. Biol., 43, pp.103-111 (2000) Dobouzet J. G., et al., Plant J. 33, pp.751-763 (2003)Dobouzet J. G., et al., Plant J. 33, pp.751-763 (2003) Jang I.C., et al., Plant Physiol., 131, pp. 516-524 (2003)Jang I.C., et al., Plant Physiol., 131, pp. 516-524 (2003) 細胞工学, Vol.21, No.12, pp.1455-1459 (2002)Cell Engineering, Vol.21, No.12, pp.1455-1459 (2002) Teruaki T., et al., The Plant Journal, 29(4), pp.417-426 (2002)Teruaki T., et al., The Plant Journal, 29 (4), pp.417-426 (2002) Zhang H.X., Blumwald E., Nature Biotechnol., 19, pp.765-768 (2001)Zhang H.X., Blumwald E., Nature Biotechnol., 19, pp.765-768 (2001) Zhang H.X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 98, pp.12832-12836 (2001)Zhang H.X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA., 98, pp.12832-12836 (2001) Chubatsu, L.S. and R. Meneghini, Biochem. J. 291, pp.193-198 (1993)Chubatsu, L.S. and R. Meneghini, Biochem. J. 291, pp.193-198 (1993) Sogawa, C.A. et al., Brain Res. 853, pp.310-316 (2000)Sogawa, C.A. et al., Brain Res. 853, pp.310-316 (2000) Miura, T. et al., Life Sci. 60, pp.301-309 (1997)Miura, T. et al., Life Sci. 60, pp. 301-309 (1997)

本発明の課題は、長期間に渡って植物に塩ストレス耐性を付与することが可能な新規な遺伝子、及びその遺伝子を導入した塩ストレス耐性形質転換植物等を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a novel gene capable of imparting salt stress tolerance to a plant over a long period of time, a salt stress resistant transformed plant into which the gene is introduced, and the like.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、海水耐性シバ(seashore paspalum)に塩ストレスによって誘導される遺伝子があることに着目し、そのクローニングを試みたところ、その遺伝子がメタロチオネインをコードし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有する遺伝子であることを見出し、本発明を完成させるに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have focused on the fact that there is a gene induced by salt stress in seashore paspalum and attempted cloning thereof. Has been found to be a gene that encodes metallothionein and has an activity of imparting salt stress tolerance, thereby completing the present invention.

即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質
(2)以下の(c)又は(d)に示すDNAからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(3)上記(1)又は(2)の遺伝子を含む組換えベクター。
(4)上記(1)若しくは(2)に記載の遺伝子、又は上記(3)の組換えベクターを導入した塩ストレス耐性形質転換植物。
(5)植物が単子葉植物である、上記(4)の塩ストレス耐性形質転換植物。
(6)単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、上記(5)の塩ストレス耐性形質転換植物。
(7)イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、上記(6)の塩ストレス耐性形質転換植物。
(8)上記(1)若しくは(2)の遺伝子、又は上記(3)の組換えベクターを植物に導入することを含む、塩ストレス耐性植物の作出方法。
(9)植物が単子葉植物である、上記(8)の作出方法。
(10)単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、上記(9)の作出方法。
(11)イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、上記(10)の作出方法。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A gene encoding a protein shown in (a) or (b) below.
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(b) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having an activity to impart salt stress tolerance (2) A gene comprising the DNA shown in (c) or (d).
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(d) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and has an activity to impart salt stress tolerance DNA
(3) A recombinant vector comprising the gene of (1) or (2) above.
(4) A salt stress-tolerant transformed plant into which the gene according to (1) or (2) above or the recombinant vector of (3) above is introduced.
(5) The salt stress-tolerant transformed plant of (4) above, wherein the plant is a monocotyledonous plant.
(6) The salt stress resistant transformed plant according to (5) above, wherein the monocotyledonous plant is a plant belonging to the family Gramineae, Lilyaceae, or Gingeraceae.
(7) The salt stress-tolerant transformed plant according to (6) above, wherein the plant belonging to the family Gramineae is selected from the group consisting of rice, barley, wheat, corn, sugarcane, buckwheat, sorghum, millet and millet.
(8) A method for producing a salt stress tolerant plant, comprising introducing the gene of (1) or (2) above or the recombinant vector of (3) above into a plant.
(9) The production method according to (8) above, wherein the plant is a monocotyledonous plant.
(10) The production method according to (9) above, wherein the monocotyledonous plant is a plant belonging to the family Gramineae, Lilyaceae, or Gingeraceae.
(11) The production method according to the above (10), wherein the plant belonging to the family Gramineae is selected from the group consisting of rice, barley, wheat, corn, sugarcane, buckwheat, sorghum, millet and millet.

本発明によれば、塩ストレス耐性を付与できる遺伝子が提供される。本遺伝子をイネなどの植物に導入することにより、塩ストレスの環境下で長期間生育し、種子をつけることのできる塩ストレス耐性植物を作出することができる。   According to the present invention, a gene capable of imparting salt stress tolerance is provided. By introducing this gene into plants such as rice, it is possible to produce a salt-stress-tolerant plant that can grow for a long time in a salt-stressed environment and can be seeded.

以下、本発明を詳細に説明する。
1.遺伝子のクローニング
(1)cDNAライブラリーの作製及びスクリーニング
本発明の塩ストレス耐性を付与する遺伝子は、例えば以下のようにして取得することができる。まず、海水又は塩ストレスを加えた状態(塩処理区)と加えない状態(未処理区)でそれぞれ栽培した海水耐性シバ(Seashore Paspalum;Duedck A. E. and Peacock C. H., Agronomy Journal vol. 77, pp. 47-50 (1985)などに記述)からトータルRNAを調製し、オリゴdTを用いて作成した一本鎖cDNAを鋳型としてPCRを行い、塩処理プローブと対照区プローブを作成する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Gene Cloning (1) Preparation and Screening of cDNA Library The gene conferring salt stress tolerance of the present invention can be obtained, for example, as follows. First, seawater resistant sea buckwheat (Seashore Paspalum; Duedck AE and Peacock CH, Agronomy Journal vol. 77, pp. 47) cultivated with seawater or salt stress applied (salt-treated) and not (untreated), respectively. -50 (1985)), total RNA is prepared, and PCR is performed using a single-stranded cDNA prepared using oligo dT as a template to prepare a salt-treated probe and a control probe.

次に、これらの2種のプローブ(塩処理プローブと対照区プローブ)を用いて、seashore paspalum cDNAライブラリーからディファレンシャルスクリーニング法によって塩処理区プローブでのみ特異的に検出されるクローンを選抜する。次に、そのクローンに含まれるcDNAの部分配列を基に作成したプローブを用いてノーザン解析を行い、塩ストレスによって海水耐性シバでは誘導されるがイネでは誘導されないクローンを二次選抜する。最後にこのクローンをプローブとして用いて塩ストレスを加えた海水耐性シバから調製したcDNAライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを得る。   Next, using these two types of probes (salt treatment probe and control group probe), a clone that is specifically detected only with the salt treatment group probe is selected from the seashore paspalum cDNA library by the differential screening method. Next, Northern analysis is performed using a probe prepared on the basis of the partial sequence of cDNA contained in the clone, and a clone that is induced in seawater-resistant shiba by salt stress but not in rice is secondarily selected. Finally, using this clone as a probe, a clone containing the gene of interest is obtained from a cDNA library prepared from seawater-resistant shiba with salt stress.

海水耐性シバからのmRNAの抽出及びcDNAライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。mRNAの供給源としては、例えば海水耐性シバの成葉が挙げられるが、これに限定されるものではない。mRNAの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記供給源から、グアニジウムチオシアネート-トリフルオロ酢酸セシウム法などによりトータルRNAを抽出した後、オリゴdT-セルロースやポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ(A)+RNA(mRNA)を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ(A)+RNAを分画してもよい。   Extraction of mRNA from seawater-resistant shiba and preparation of a cDNA library can be performed according to conventional methods. Examples of mRNA supply sources include, but are not limited to, seawater-resistant shiba adult leaves. mRNA can be prepared by a commonly used technique. For example, after extracting total RNA from the above-mentioned source by guanidinium thiocyanate-cesium trifluoroacetate method or the like, by an affinity column method using oligo dT-cellulose or poly U-sepharose or by a batch method, A) + RNA (mRNA) can be obtained. Furthermore, poly (A) + RNA may be fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.

次いで、得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAからDNA合成酵素I、DNAリガーゼ及びRnaseH等を用いて二本鎖cDNAを合成する。合成した二本鎖cDNAをT4DNA合成酵素によって平滑化後、アダプター(例えば、EcoRIアダプター)の連結、リン酸化等を経て、λgt11等のベクターに組み込んでin vitroパッケージングすることによってcDNAライブラリーを作製することができる。また、λファージ以外にもプラスミドを用いてcDNAライブラリーを作製することもできる。   Next, using the obtained mRNA as a template, a single-stranded cDNA was synthesized using oligo dT primer and reverse transcriptase, and then double-stranded from the single-stranded cDNA using DNA synthase I, DNA ligase, RnaseH, etc. Synthesize strand cDNA. The synthesized double-stranded cDNA is smoothed by T4DNA synthase, then ligated with an adapter (for example, EcoRI adapter), phosphorylated, etc., and incorporated into a vector such as λgt11 to create a cDNA library in vitro. can do. In addition to λ phage, a cDNA library can also be prepared using a plasmid.

上記のようにして得られる形質転換体から目的のDNAを有する株を選択するには、例えば、λファージ(λgt11等)を用いた場合は、λgt11インサート増幅用のプライマーを用いてPCRを行う方法を採用することができる。   To select a strain having the target DNA from the transformant obtained as described above, for example, when λ phage (λgt11 or the like) is used, PCR is performed using a primer for λgt11 insert amplification. Can be adopted.

ここで用いられる鋳型DNAとしては、前記mRNAから逆転写反応により合成されたcDNAが挙げられる。また、プライマーとしては、市販のランダムヘキサマー等が使用できる。   Examples of the template DNA used here include cDNA synthesized from the mRNA by a reverse transcription reaction. Moreover, a commercially available random hexamer etc. can be used as a primer.

mRNAの抽出、cDNAライブラリーの作製、プローブの作製、cDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングについては実施例1に具体例を示した。また、クローニングされた遺伝子がシバ(paspalum)で塩ストレス処理により誘導されることは、発現解析手法であるノーザンブロット解析法又はRT-PCR法などにより確認することができる。その確認については、実施例1及び3に具体例を示した。   Specific examples of mRNA extraction, cDNA library preparation, probe preparation, and cDNA library differential screening are shown in Example 1. In addition, it can be confirmed that the cloned gene is induced by salt stress treatment in a barn (paspalum) by Northern blot analysis or RT-PCR, which is an expression analysis technique. Specific examples of the confirmation are shown in Examples 1 and 3.

(2)塩基配列の決定
上記で得られたcDNAのクローンについて、PCR産物を鋳型にしてcDNAの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置(例えばApplied Biosystems社製ABI373シークエンサー、同社310 DNAシークエンサー等)を用いて配列決定が行われる。得られた塩基配列を、DNASIS(日立ソフトウエアエンジニアリング社)等のDNA解析ソフトによって解析し、得られたDNA鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出すことができる。
(2) Determination of base sequence The cDNA base sequence of the cDNA clone obtained above is determined using the PCR product as a template. The base sequence can be determined by a known technique such as a chemical modification method of Maxam-Gilbert or a dideoxynucleotide chain termination method using M13 phage. Usually, an automatic base sequencer (for example, ABI373 sequencer manufactured by Applied Biosystems, Sequencing is performed using the company's 310 DNA sequencer). The obtained base sequence can be analyzed by DNA analysis software such as DNASIS (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), and the protein coding portion encoded in the obtained DNA strand can be found.

配列番号1に、本発明の塩ストレス耐性を付与する遺伝子(以下、メタロチオネイン遺伝子ともいう)の塩基配列を、配列番号2に本発明のメタロチオネイン遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質が塩ストレス耐性を付与する活性を有する限り、そのアミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。   SEQ ID NO: 1 exemplifies the nucleotide sequence of a gene imparting salt stress tolerance of the present invention (hereinafter also referred to as a metallothionein gene), and SEQ ID NO: 2 illustrates the amino acid sequence of the protein encoded by the metallothionein gene of the present invention. As long as the protein comprising an amino acid sequence has an activity to impart salt stress tolerance, a plurality of, preferably one or several amino acids may have mutations such as deletion, substitution and addition in the amino acid sequence.

例えば、配列番号2で表されるアミノ酸配列の1〜10個、好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号2で表わされるアミノ酸配列に1〜10個、好ましくは1〜5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列の1〜10個、好ましくは1〜5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。   For example, 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 may be deleted, and 1 to 10, preferably 1 may be deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. ˜5 amino acids may be added, or 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 may be substituted with other amino acids.

また、配列番号2に記載のアミノ酸配列と65%以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質もまた本発明の範囲に含まれる。上記65%以上の相同性は、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上の相同性をいう。   Further, a protein encoding a protein having 65% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having an activity of imparting salt stress tolerance is also included in the scope of the present invention. The homology of 65% or more preferably means 70% or more, more preferably 80% or more.

上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製))などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。   The amino acid deletion, addition, and substitution can be performed by modifying a gene encoding the protein by a technique known in the art. Mutation can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto, for example, a mutation introduction kit (for example, Mutant-K using site-directed mutagenesis). (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)) or the like, or a TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit is used to introduce the mutation.

ここで、「塩ストレス耐性を付与する活性」とは、塩ストレス存在下において生育し、また場合によっては着稔可能であるという塩ストレス耐性を植物に付与することができる活性をいう。ここで、「塩ストレス」とは、土壌に蓄積した塩類により土壌の水分ポテンシャルが低下して植物体が水分を吸収できなくなるなど、塩類が植物体の生理機能に損傷を与えるストレスをいう。塩類には、植物に生育阻害、収量低下、枯死を引き起こすあらゆる塩が含まれ、例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩等が含まれる。ある遺伝子(例えば、変異遺伝子)が「塩ストレス耐性を付与する活性」を有するか否かは、該遺伝子を導入した植物が、野生型植物では生育不可能な塩ストレス存在下において生育又は着粒できるかどうかを確認することにより判断することができる。   Here, the “activity that imparts salt stress tolerance” refers to an activity that can impart salt stress tolerance to a plant that grows in the presence of salt stress and that can be attached in some cases. Here, “salt stress” refers to a stress that damages the physiological function of a plant body, such as the salt water accumulated in the soil lowers the water potential of the soil and prevents the plant body from absorbing water. Salts include all salts that cause plant growth inhibition, yield reduction, and death, such as sodium salts and magnesium salts. Whether a gene (for example, a mutated gene) has an “activity that imparts salt stress tolerance” depends on whether the plant into which the gene is introduced grows or granulates in the presence of salt stress that cannot be grown in a wild type plant. Judgment can be made by confirming whether or not it is possible.

上記の「塩ストレス耐性を付与する活性を有する」とは、上記活性が、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。   The above “having an activity of imparting salt stress tolerance” means that the activity is substantially equivalent to the activity of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

本発明の遺伝子はまた、配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号1で表わされる塩基配列と約65%以上、好ましくは約75%以上、より好ましくは約85%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましく65℃での条件をいう。   The gene of the present invention also has an activity of hybridizing with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing under stringent conditions and imparting salt stress tolerance. Contains DNA encoding the protein. Here, stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a complementary strand of a nucleic acid having a high homology, that is, a DNA comprising a base sequence having a homology of about 65% or more, preferably about 75% or more, more preferably about 85% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. May be hybridized, and a complementary strand of a nucleic acid having a lower homology than that may not be hybridized. More specifically, the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the temperature is 60 to 68 ° C, preferably 65 ° C.

いったん本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいはその塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって取得することができる。さらに部位特異的誘発等によって前記遺伝子をコードする修飾されたDNAを合成することができる。   Once the base sequence of the gene of the present invention has been determined, it is obtained by chemical synthesis, by PCR using the cloned cDNA as a template, or by hybridizing with a DNA fragment having the base sequence as a probe. be able to. Furthermore, modified DNA encoding the gene can be synthesized by site-specific induction or the like.

2.組換えベクター及び形質転換植物の作製
(1)組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、本発明の上記遺伝子を適当なベクターに挿入することによって作成できる。本発明の遺伝子を植物細胞へ導入し、発現させるためのベクターとしては、pBI系のベクター、pUC系のベクター、pTRA系のベクターが好適に用いられる。pBI系及びpTRA系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる。pBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カルフラワーモザイクウイルス(CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス(BGMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
2. Production of Recombinant Vector and Transformed Plant (1) Production of Recombinant Vector The recombinant vector of the present invention can be prepared by inserting the above gene of the present invention into an appropriate vector. As vectors for introducing and expressing the gene of the present invention into plant cells, pBI vectors, pUC vectors, and pTRA vectors are preferably used. The pBI and pTRA vectors can introduce a target gene into a plant via Agrobacterium. A pBI binary vector or an intermediate vector system is preferably used, and examples thereof include pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3 and the like. A pUC vector can directly introduce a gene into a plant, and examples thereof include pUC18, pUC19, and pUC9. Plant virus vectors such as calflower mosaic virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), and tobacco mosaic virus (TMV) can also be used.

ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。   In order to insert the gene of the present invention into a vector, first, the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA, and linked to the vector. Adopted.

本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーター、メタロチオネイン遺伝子のほか、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。   The gene of the present invention needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene is exhibited. Therefore, in addition to a promoter and a metallothionein gene, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a 5′-UTR sequence, a selection marker gene, and the like can be linked to the vector as desired.

「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるDNAであれば、植物由来のものであってもよいし、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター(Pnos)、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。   The “promoter” may be a plant-derived or plant-derived DNA as long as it functions in plant cells and can induce expression in a specific plant tissue or in a specific developmental stage. It does not have to be. Specific examples include a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, a promoter of nopaline synthase gene (Pnos), a corn-derived ubiquitin promoter, a rice-derived actin promoter, a tobacco-derived PR protein promoter, and the like.

「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。具体例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(Tnos)、カリフラワーモザイクウイルスポリAターミネーター等が挙げられる。   The “terminator” may be any sequence that can terminate the transcription of the gene transcribed by the promoter. Specific examples include terminator (Tnos) of nopaline synthase gene, cauliflower mosaic virus poly A terminator, and the like.

「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばCaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。   The “enhancer” is used to increase the expression efficiency of the target gene. For example, an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter is preferable.

「選択マーカー」は、形質転換体の選抜を容易にするために用いられ、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。   The “selection marker” is used for facilitating selection of transformants, and examples thereof include a hygromycin resistance gene, a bialaphos resistance gene, and a neomycin resistance gene.

(2)形質転換植物の作製
本発明の形質転換植物は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子(メタロチオネイン遺伝子)が自己の遺伝子中に組み込まれ、発現し得るように植物中に導入することにより得ることができる。
(2) Production of transformed plant The transformed plant of the present invention is the introduction of the recombinant vector of the present invention into the plant so that the target gene (metallothionein gene) can be incorporated and expressed in its own gene. Can be obtained.

本発明において形質転換に用いられる植物としては単子葉植物、例えばイネ科(イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等)、ユリ科(アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等)、ショウガ科(ショウガ、ミョウガ、ウコン等)に属する植物が挙げられるが、これらに限定はされない。   Plants used for transformation in the present invention include monocotyledonous plants, for example, Gramineae (rice, barley, wheat, corn, sugarcane, buckwheat, sorghum, millet, barnyard etc.), lily family (asparagus, lily, onion, leek). ), Plants belonging to the family Ginger (ginger, ginger, turmeric, etc.), but are not limited thereto.

本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。   Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, sieve parts, soft tissues, xylem, vascular bundles, A fence-like tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant cultured cell is meant. When plant cultured cells are targeted, in order to regenerate a transformant from the obtained transformed cells, an organ or an individual may be regenerated by a known tissue culture method.

本発明の遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合と組織片を用いる場合がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法(スフェロプラスト法)、組織片を用いる場合は、リーフディスクにより対象植物の無菌培養葉片に感染させる方法(リーフディスク法)やカルス(未分化培養細胞)に感染させる等により行うことができる。   Examples of methods for introducing the gene or recombinant vector of the present invention into plants include the Agrobacterium method, the PEG-calcium phosphate method, the electroporation method, the liposome method, the particle gun method, and the microinjection method. For example, when the Agrobacterium method is used, a protoplast may be used or a tissue piece may be used. When using protoplasts, co-culture with Agrobacterium with Ti plasmid, fusing with spheroplasted Agrobacterium (spheroplast method), or when using tissue pieces, use leaf disc for target plant The method can be carried out by infecting a sterile cultured leaf piece (leaf disc method) or infecting callus (undifferentiated cultured cells).

遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。   Whether or not a gene has been incorporated into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like. For example, DNA is prepared from a transformed plant, PCR is performed by designing DNA-specific primers. After PCR, the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplification product is detected as a single band. By doing so, it can confirm that it transformed. Moreover, PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, the amplification product may be bound to a solid phase such as a microplate, and the amplification product may be confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.

上記のようにして得られる形質転換植物は、塩ストレスに対して耐性を獲得する。すなわち、本発明のメタロチオネイン遺伝子を導入することにより、植物に塩ストレス耐性を付与することができる。従って、当該形質転換植物は、塩ストレス耐性植物として使用することができる。   The transformed plant obtained as described above acquires resistance to salt stress. That is, salt stress tolerance can be imparted to a plant by introducing the metallothionein gene of the present invention. Therefore, the transformed plant can be used as a salt stress tolerant plant.

塩ストレス耐性植物は、メタロチオネイン遺伝子が組み込まれた形質転換植物(トランスジェニック植物)を、上記塩ストレス耐性植物として使用し得る程度に育種することにより作出することができる。この場合、植物にとって上記塩ストレスが生じる条件において、生理機能に損傷を与えず、かつ成長阻害や枯死等をせずに耐性を示す植物を選抜すればよい。ストレス耐性植物としての使用開始時期は、耐性を示す植物を選抜した後であればいつでもよい。   A salt stress-tolerant plant can be produced by breeding a transformed plant (transgenic plant) into which a metallothionein gene has been incorporated to such an extent that it can be used as the salt stress-tolerant plant. In this case, it is only necessary to select a plant exhibiting tolerance without causing damage to physiological functions and without causing growth inhibition or death under the conditions that cause salt stress. The start of use as a stress-tolerant plant may be any time after selecting a plant exhibiting resistance.

本発明により、従来生育が不可能であった塩ストレス環境下において生育可能な塩ストレス耐性植物が提供される。例えば、実施例2で用いたイネの中で50mM NaClにおいて生存可能な品種はごく限られたものであり、コシヒカリはこの塩濃度において枯れてしまう。これに対し本発明の遺伝子を導入したコシヒカリの塩ストレス耐性は向上していた。このように、本発明のメタロチオネイン遺伝子を導入した場合には、全生育期間(発芽時期を除く)を通じた長期的な塩ストレス耐性向上効果が達成できるため、土壌に塩水が混入する地域(例えばNaCl 3000ppmの汽水域)において該植物(特にコメ)を栽培することが可能となり、また、塩汚染土壌における植生を回復(環境修復)することが可能となる。   According to the present invention, a salt stress-tolerant plant that can grow in a salt stress environment that could not be grown conventionally is provided. For example, among the rice used in Example 2, the varieties that can survive in 50 mM NaCl are very limited, and Koshihikari dies at this salt concentration. On the other hand, the salt stress tolerance of Koshihikari introduced with the gene of the present invention was improved. Thus, when the metallothionein gene of the present invention is introduced, a long-term salt stress tolerance improving effect can be achieved throughout the entire growth period (except for the germination period). The plant (especially rice) can be cultivated in a brackish water area of 3000 ppm, and the vegetation in the salt-contaminated soil can be restored (environmental restoration).

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited by the following Example.

(実施例1) 塩ストレス下誘導シバ遺伝子のクローニング
一般的なRNA及びDNAの実験方法は、Molecular cloning-a laboratory manual-second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York(1989)に従いこれを常法とした。また、実験中に使用したキットの使用方法はメーカーの示すプロトコールに従った。
(Example 1) Cloning of Shiba Gene Induced Under Salt Stress General RNA and DNA experimental methods are based on Molecular cloning-a laboratory manual-second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York (1989). did. Moreover, the usage method of the kit used during experiment followed the protocol which a manufacturer shows.

(1)植物材料の調製
海水耐性シバ(Seashore Papalum:Duedck A. E. and Peacock C. H., Agronomy Journal vol. 77, 47-50 (1985))を砂の入った1/5000a ワグネルポットに植え付け、東京湾から採水した塩分濃度2.3〜2.7%の海水で灌水し、温室内で3〜6ケ月間栽培した。毎日一回、海水をポット上面からかけて、ワグネルポットの排水口より海水がしみ出るまで灌水を行った。この海水灌水処理により、最低5年間この海水耐性シバは生育維持し、海水耐性を示した。
(1) Preparation of plant material Seashore Papalum (Duedck AE and Peacock CH, Agronomy Journal vol. 77, 47-50 (1985)) was planted in a 1 / 5000a Wagner pot containing sand and collected from Tokyo Bay. Water was irrigated with seawater having a salt concentration of 2.3 to 2.7% and cultivated in a greenhouse for 3 to 6 months. Once a day, seawater was sprinkled from the top of the pot and irrigated until the seawater oozed from the drain of the Wagner pot. This seawater irrigation treatment maintained and maintained the seawater-resistant shiba growth for at least 5 years.

この材料の分枝より、第1葉から第3葉、茎、及び節を含む切片(図1)を採取し、砂へ挿し芽を行い、発根させてクローン苗を温室内にて育成した。このクローン苗を以下の海水ストレスまたは水耕による塩ストレス実験に使用した。   From the branches of this material, sections (Fig. 1) including the first to third leaves, stems, and nodes were collected, sprouting into the sand, rooted, and cloned seedlings were grown in the greenhouse. . This clone seedling was used for the following seawater stress or salt stress experiment by hydroponics.

海水ストレスは以下の通りに与えた。まず、育成した苗を1/5000a ワグネルポット(作土壌深15cm)で、水道水にて温室内で4ヶ月通常栽培した。土壌は、イネ用培土と赤玉を1:1に混合したものを用いた。苗がポット栽培で順調に生育した段階(植え付け4ヶ月後)で、上記の方法で海水灌水処理を開始した。   Seawater stress was applied as follows. First, the grown seedlings were cultivated in a 1 / 5000a Wagner pot (soil depth 15 cm) for 4 months in a greenhouse with tap water. The soil used was a 1: 1 mixture of rice soil and red balls. Seawater irrigation treatment was started by the above-described method at the stage where seedlings grew smoothly in pot cultivation (4 months after planting).

対照区となる材料は、海水灌水処理を開始する前(水道水栽培)にサンプリングし、−80℃に保存した。塩ストレス条件の材料は、海水灌水処理14日でサンプリングし、−80℃に保存した。サンプリング部位は地上部の葉とした。後述(3)のディファンレンシャルスクリーニング用のcDNAライブラリーおよびプローブ作成のためのRNAは、この海水栽培した材料から抽出した。   The material used as a control group was sampled before starting the seawater irrigation treatment (tap water cultivation) and stored at -80 ° C. The material under salt stress conditions was sampled at 14 days of seawater irrigation and stored at −80 ° C. The sampling site was the above-ground leaves. The cDNA library for differential screening and RNA for probe preparation (3) described later were extracted from this seawater-grown material.

水耕による塩ストレス実験は以下のようにして行った。まず、上述の水道水栽培したクローン苗より、図1に示した切片を採取して水耕(蒸留水)で、挿し芽を行った。これを明期(照度5000 lx、温度30℃)16時間、暗期(照度:0lx、温度22℃)8時間の条件で、植物育成装置(トミー製、Cultivation Chamber、CU-251)にて1週間育成し発根させた。発根後、蒸留水を下記表1に示す改変・吉田水耕培地(S. Yoshida, et al., Laboratory Manual For Physiological Studies of Rice 3rd. Ed., The International Rice Research Institute, pp.61-66 (1976); 微量要素はD.R. Hoagland & Arnon, D.I., Univ. Calif. Coll. Agri. c. Exp. Sta. Circ., p.347 (1936)、 鉄分は、Murashige T. & Skoog F., Physiologia Plant., pp.473-497 (1962)のFeEDTAに改変)に置き換え、更に1週間、明期(照度10000 lx、温度30℃)16時間、暗期(照度:0lx、温度22℃)8時間の条件で育成した。   The salt stress experiment by hydroponics was performed as follows. First, from the above-mentioned clonal seedlings cultivated in tap water, the sections shown in FIG. 1 were collected and sown by hydroponics (distilled water). This is 1 in the plant growing device (Tomy, Cultivation Chamber, CU-251) under the conditions of light period (illuminance 5000 lx, temperature 30 ° C) 16 hours, dark period (illuminance: 0 lx, temperature 22 ° C) 8 hours. Raised and rooted for a week. After rooting, distilled water was added to the modified Yoshida hydroponic medium shown in Table 1 below (S. Yoshida, et al., Laboratory Manual For Physiological Studies of Rice 3rd. Ed., The International Rice Research Institute, pp. 61-66). (1976); Trace elements are DR Hoagland & Arnon, DI, Univ. Calif. Coll. Agri. C. Exp. Sta. Circ., P.347 (1936), iron is Murashige T. & Skoog F., Physiologia Replaced with Plant., Pp.473-497 (1962) FeEDTA), 1 week, light period (illuminance 10000 lx, temperature 30 ° C) 16 hours, dark period (illuminance: 0 lx, temperature 22 ° C) 8 hours It was brought up on the condition of.

育成後、塩ストレスを4週間与えた。塩ストレスの条件は上述の改変・吉田水耕培地に500mMのNaClを添加したものを用いた。塩ストレスを与えて4週間後に地上部の葉を採取した。後記(4)のノーザン解析および後記(5)の全長cDNA単離のためのcDNAライブラリーは水耕した切片より抽出したRNAを使用した。   After the growth, salt stress was applied for 4 weeks. The salt stress condition was the above-mentioned modified Yoshida hydroponic medium with 500 mM NaCl added. Four weeks after applying salt stress, leaves on the aerial part were collected. RNA extracted from hydroponic sections was used as a cDNA library for Northern analysis (4) and full length cDNA isolation (5).

Figure 2005087129
Figure 2005087129

尚、上記水耕培地は5N NaOHを用いてpH5.5に調整した。2日ごとに水耕液の体積を調べ、体積が減ったら、蒸留水を加えて初期の体積(ワグネルポットの場合、4L)に戻した。また、2週間に1回、水耕液を新鮮なものと交換した。   The hydroponic medium was adjusted to pH 5.5 using 5N NaOH. The volume of the hydroponic solution was examined every two days, and when the volume decreased, distilled water was added to restore the initial volume (in the case of Wagner pot, 4 L). The hydroponic solution was replaced with a fresh one once every two weeks.

(2)RNAの調製とcDNAライブラリーの構築
生重量で2gの葉からトータルRNA約1mg をRneasy Mini Kit(キアゲン社製)、又はChang, S. ら(1993)の方法(Plant Mol. Biol. Report, 11, pp.113-116)を用いて抽出した。両法の場合ともに、Dnase I(タカラバイオ社製、Rnaseフリー、5mM MgSO4存在下、25℃、11時間)処理を追加した。さらに、トータルRNAからBioMag SelectaPure, mRNA Purification System(Polysciences, Inc. 社製)を用いてmRNAを10μg精製した。このmRNA5μgからオリゴ(dT)12-18によりTime Saver cDNA合成キット(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて1st strand cDNAさらに2nd strand cDNAを合成した。次に、cDNAをクローニングするためDirectional Cloning Kit(アマシャムバイオサイエンス社製)を用い、λgt11のファージ用ベクターへ挿入したものを、Ready-To-Go Lambda Packaging Kit(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いてパッケージングを行った。E.coli Y1088 を宿主として、タイターチェックの後、ディファレンシャルスクリーニングに供した。
(2) Preparation of RNA and construction of cDNA library About 1 mg of total RNA from 2 g of leaf by raw weight was added to the Rneasy Mini Kit (Qiagen) or the method of Chang, S. et al. (1993) (Plant Mol. Biol. Report, 11, pp. 113-116). In both cases, treatment with Dnase I (manufactured by Takara Bio Inc., Rnase-free, 5 mM MgSO 4 in the presence of 25 ° C., 11 hours) was added. Furthermore, 10 μg of mRNA was purified from the total RNA using BioMag SelectaPure, mRNA Purification System (manufactured by Polysciences, Inc.). From 5 μg of this mRNA, 1st strand cDNA and 2nd strand cDNA were synthesized using Oligo (dT) 12-18 using Time Saver cDNA synthesis kit (Amersham Biosciences). Next, using the Directional Cloning Kit (Amersham Biosciences) to clone the cDNA, inserted into the λgt11 phage vector using the Ready-To-Go Lambda Packaging Kit (Amersham Biosciences) Packaging was done. E.coli Y1088 was used as a host and subjected to differential screening after titer check.

(3)プローブの調製とディファレンシャルスクリーニング
上述の海水耐性シバを水道水栽培で挿し芽の状態から4ヶ月育成したもの(対照区)と4ヶ月育成後から海水を灌水しつづけて2週間経過したもの(塩処理区)から、それぞれトータルRNAをそれぞれ調製し、オリゴ(dT)12-18によりTime Saver cDNA合成キット(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて1st strand cDNAを作成した。この1st strand cDNAを鋳型として、同キットに添付されているランダムヘキサマー(pdN6)を用い、PCRを行った(PCR条件:Premix ExTaq(タカラバイオ社製)を用いてcDNAを94℃5分熱変性、(94℃30秒、55℃1分、72℃1分)×25サイクル、72℃1分、Gene Amp PCRシステム9600を使用)。得られたPCR産物をゲル電気泳動で確認の後、ECL direct labeling kit(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて2種類のプローブ(対照区と塩処理区)を作成した。
(3) Probe preparation and differential screening The above seawater-resistant shiba was cultivated for 4 months from the state of buds by tap water cultivation (control group), and 2 weeks after seawater was continuously irrigated after 4 months ( Total RNA was prepared from each of the salt treatment groups, and 1st strand cDNA was prepared using Oligo (dT) 12-18 using Time Saver cDNA synthesis kit (Amersham Biosciences). Using this 1st strand cDNA as a template, PCR was performed using the random hexamer (pdN 6 ) attached to the kit (PCR conditions: Premix ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) and the cDNA at 94 ° C. for 5 minutes. Thermal denaturation (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute) × 25 cycles, 72 ° C. for 1 minute, using Gene Amp PCR system 9600). After confirming the obtained PCR product by gel electrophoresis, two types of probes (control group and salt-treated group) were prepared using ECL direct labeling kit (manufactured by Amersham Bioscience).

cDNAライブラリーを直径14.5cmのシャーレに撒き、2000プラークからディファレンシャルスクリーニングした。Hybond N(アマシャムバイオサイエンス社製)を使用してプラークブロッティングを行い、プラークのシグナルの検出にはECL detection system(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いた。上述の2種類のプローブで1枚のシートをそれぞれ検出し、塩処理区プローブで検出されるが、対照区プローブでは検出されないプラークを塩処理区で特異的なものとして選抜した。   The cDNA library was spread on a petri dish with a diameter of 14.5 cm and differentially screened from 2000 plaques. Plaque blotting was performed using Hybond N (Amersham Bioscience), and an ECL detection system (Amersham Bioscience) was used to detect plaque signals. One sheet was detected with the two types of probes described above, and plaques that were detected with the salt-treated group probe but not detected with the control group probe were selected as specific in the salt-treated group.

選抜したクローンのインサート領域をプラスミドベクターへ移すため、ファージDNAを抽出した。ファージDNA を94℃10分処理して、急冷したものを鋳型とし、λgt11のフォワードプライマー(5'-GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG-3':配列番号3)とリバースプライマー(5'-TTG ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3':配列番号4)(タカラバイオ社製)を用いてPremix ExTaq(タカラバイオ社製)でPCRを行った(95℃1分、(94℃1分、55℃2分、72℃2分)×25サイクル、72℃2分)。得られたPCR産物をpT7 Blue T-ベクターへPerfectly Blunt Cloning Kit(Novagen社製)を用いてサブクローニングした。選抜された5個のクローンをdRhodamine dye-terminator法(AmpliTaq DNA polymerase FS;Applied Biosystems社製)によりシーケンス反応を行った後、ABI 310ジェネティックアナライザー(Applied Biosystems社製)を用いて両鎖方向からDNA配列を決定した。   In order to transfer the insert region of the selected clone to a plasmid vector, phage DNA was extracted. The phage DNA was treated at 94 ° C for 10 minutes and rapidly cooled, using the template as a template, λgt11 forward primer (5'-GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG-3 ': SEQ ID NO: 3) and reverse primer (5'-TTG PCR was performed with Premix ExTaq (manufactured by Takara Bio Inc.) using ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3 ′ (SEQ ID NO: 4) (manufactured by Takara Bio Inc.) (95 ° C. for 1 minute, 94 ° C. for 1 minute, 55 2 minutes, 72 2 minutes) x 25 cycles, 72 2 minutes). The obtained PCR product was subcloned into pT7 Blue T-vector using Perfectly Blunt Cloning Kit (Novagen). The selected 5 clones were sequenced by dRhodamine dye-terminator method (AmpliTaq DNA polymerase FS; manufactured by Applied Biosystems), and then DNA was analyzed from both strands using ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). The sequence was determined.

(4)ノーザン解析による第二次スクリーニング(イネとの比較)
得られた5クローンから二次選抜用プローブを作成した。作成したプローブを用いて海水耐性シバとイネ(品種ポッカリ)での遺伝子発現の塩誘導性の比較を行い、海水耐性シバでは発現が塩ストレスにより誘導されるが、イネでは誘導されないクローンを第二次選抜した。海水耐性シバ及びイネ(ポッカリ)は上述の改変・吉田水耕培地を用い、対照区(0mM NaCl)と、海水耐性シバでは塩処理区(400 mM NaCl)及びイネ(ポッカリ)では塩処理区(50 mM NaCl)において1週間育成し、1週間後の茎葉部からトータルRNAを抽出した。トータルRNAの電気泳動、ノーザンブロッテイング及びハイブリダイゼーションを常法に従って行った。
(4) Secondary screening by Northern analysis (comparison with rice)
A probe for secondary selection was prepared from the obtained 5 clones. Using the prepared probe, we compared the salt-inducibility of gene expression in seawater-resistant shiba and rice (variety Pokkari), and in the seawater-resistant shiba, the expression was induced by salt stress but not in rice. Next selected. The seawater-resistant shiba and rice (pokkari) use the above-mentioned modified Yoshida hydroponic medium, the control group (0 mM NaCl), the salt-treated area (400 mM NaCl) for seawater-resistant shiba and the salt-treated area (poccari) In 50 mM NaCl), the cells were grown for 1 week, and total RNA was extracted from the foliage part after 1 week. Total RNA electrophoresis, Northern blotting and hybridization were performed according to conventional methods.

5クローンのノーザン分析を行った結果、ABA誘導性のタンパクと相同性が高かったクローンなどは、海水耐性シバでもイネでも発現していたので単離対象から除外した。海水耐性シバでのみ発現し、イネでは発現していなかったクローンが2つあり、これらは海水耐性関連遺伝子である可能性が高いと考えた。そのうちの1クローン(Ps2)を、以下の実施例2における遺伝子導入対象とした。   As a result of Northern analysis of 5 clones, clones that had high homology with ABA-inducible proteins were excluded from the isolation because they were expressed in seawater-resistant shiba and rice. There were two clones that were expressed only in seawater-resistant shiba but not in rice, and we thought that these were likely seawater-resistance related genes. One clone (Ps2) was selected as a gene transfer target in Example 2 below.

(5)全長cDNAの単離と配列決定
吉田・水耕培地により塩ストレス(400mM NaCl)を1週間与えた海水耐性シバよりmRNA 10μgを取得し、ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning kit(Stratagene社製)を用いて、cDNA合成、Zap Express ベクターへのクローニング、及びパッケージングを行った。cDNAライブラリーを14×9cmの角形シャーレ10枚に撒き、約100,000プラークから選抜を行った。Hybond N(アマシャムバイオサイエンス社製)を使用したプラークブロッティングを行い、前記(4)でノーザン解析に使用したPs2プローブをECL direct labeling kit(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて標識し、プラークのシグナルの検出にはECL detection system(アマシャムバイオサイエンス社製)を用いた。1〜3次スクリーニングの結果、Ps2プローブで検出されるプラークを単離した。in vivo excisionにより、それぞれのcDNAをpBK-CMV phagemid vector(Stratagene社製)に移した。選抜されたcDNAをdRhodamine dye-terminator法(AmpliTaq DNA polymerase FS : Applied Biosystems社製)によりシーケンス反応を行った後、ABI 310ジェネティックアナライザー(Applied Biosystems社製)を用いて両鎖方向からDNA配列を決定した。シーケンスにはT7 とT3のプライマー、及び各cDNAに特異的なプライマーを用いた。配列の解析は、Genentyx Mac.Ver.11(Soft ware Development Co. LTD, 2000)を用いた。
(5) Isolation and sequencing of full-length cDNA 10 μg of mRNA was obtained from seawater-resistant shiba that had been subjected to salt stress (400 mM NaCl) for 1 week using Yoshida's hydroponic medium. ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning kit ) Was used for cDNA synthesis, cloning into a Zap Express vector, and packaging. The cDNA library was spread on 10 14 × 9 cm square petri dishes and selected from about 100,000 plaques. Plaque blotting using Hybond N (Amersham Biosciences), labeling the Ps2 probe used in Northern analysis in (4) above with ECL direct labeling kit (Amersham Biosciences) ECL detection system (manufactured by Amersham Bioscience) was used for detection. As a result of the 1st to 3rd screening, plaques detected by the Ps2 probe were isolated. Each cDNA was transferred to pBK-CMV phagemid vector (Stratagene) by in vivo excision. The selected cDNA is sequenced by the dRhodamine dye-terminator method (AmpliTaq DNA polymerase FS: Applied Biosystems), and then the DNA sequence is determined from both strands using ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). did. For sequencing, T7 and T3 primers and primers specific to each cDNA were used. For analysis of the sequence, Genentyx Mac. Ver. 11 (Software Development Co. LTD, 2000) was used.

シーケンスの結果、Ps2の配列とほぼ一致するcDNAクローン(Ps2)が得られた。Ps2の塩基配列を配列番号1に、それよりコードされるアミノ酸配列を配列番号2に示す。このPs2は、タイプIIのメタロチオネインと相同性が高かった(約85%)。   As a result of sequencing, a cDNA clone (Ps2) almost identical to the sequence of Ps2 was obtained. The base sequence of Ps2 is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 2. This Ps2 was highly homologous to type II metallothionein (about 85%).

(実施例2) 形質転換体の作製及び導入遺伝子の確認
(1)遺伝子導入用ベクターの構築
実施例1で得られたPs2の全長cDNAを、アクチンプロモーター及びNosターミネーターと連結し、遺伝子導入用ベクターを構築し、以下のように形質転換体を作製した。
(Example 2) Production of transformant and confirmation of transgene (1) Construction of vector for gene introduction The full-length cDNA of Ps2 obtained in Example 1 is linked to an actin promoter and Nos terminator, and a vector for gene introduction And a transformant was prepared as follows.

(2)Ps2形質転換イネの作製
イネ(品種:日本晴、滋賀県農協より種籾を入手可能)の完熟種子由来の再分化能を有する液体培養系からプロトプラストを単離し供試材料とした。プロトプラストの調製およびエレクトロポレーションの方法は経塚らの方法(Kyozuka et al., Mol. Gen. Gnet., 206, pp. 408-413, 1987)、鳥山らの方法(Toriyama et al., Bio/Technology 6, pp.1072-1074)、赤木らの方法(Akagi et al., Mol. Gen. Gnet., 215, pp.501-506, 1989)等に準じて行った。
(2) Production of Ps2-transformed rice A protoplast was isolated from a liquid culture system capable of redifferentiation derived from a mature seed of rice (variety: Nipponbare, available from Shiga Prefectural Agricultural Cooperative). Protoplast preparation and electroporation were performed by the method of Kyozuka et al. (Kyozuka et al., Mol. Gen. Gnet., 206, pp. 408-413, 1987) and the method of Toriyama et al. (Toriyama et al., Bio / Technology 6, pp. 1072-1074) and Akagi et al. (Akagi et al., Mol. Gen. Gnet., 215, pp. 501-506, 1989).

プロトプラストを2×106/mL、上記(1)で構築した遺伝子導入用ベクターDNAを50μg/mLになるように0.4Mマンニトール、70mMアスパラギン酸カリウム、5mMグルコン酸カルシウム、5mM MESの導入バッファーに懸濁しエレクトロポレーションを行った。電気パルスは電界強度450V/cm、時定数約40msの減衰波とした。なお導入装置には島津社製のGTE-10を、導入チャンバーにはFTC-54を使用した。 Suspend in the introduction buffer of 0.4 M mannitol, 70 mM potassium aspartate, 5 mM calcium gluconate, 5 mM MES so that the protoplast is 2 × 10 6 / mL and the vector DNA for gene introduction constructed in (1) above is 50 μg / mL. Turbid and electroporated. The electric pulse was an attenuation wave having an electric field intensity of 450 V / cm and a time constant of about 40 ms. Note that GTE-10 manufactured by Shimadzu Corporation was used for the introduction device, and FTC-54 was used for the introduction chamber.

R2P培地(伊藤紀美子、1996、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール、秀潤社、pp.82-88)を基本としたアガロース培地により包埋したプロトプラストを、液体培地を加えナース細胞と共に培養した。導入14日後ナース細胞および液体培地を除きハイグロマイシン50μg/mLを添加したR2P培地を加え形質転換体の選抜を開始した。耐性カルスが1〜2mmに成長後、選抜された形質転換カルスをハイグロマイシン50μg/mLのRS2A培地(伊藤紀美子、同上)に移植した。10〜14日間培養し増殖させた後、ハイグロマイシン50μg/mLの再分化培地(西村哲と島本功、1996、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール、pp.78-81、秀潤社)にカルスを移植し、植物体を再生させた。   Protoplasts embedded in agarose medium based on R2P medium (Kimiko Ito, 1996, Plant Cell Engineering Series, Model Plant Experiment Protocol, Shujunsha, pp.82-88) are cultured with nurse cells by adding liquid medium. did. 14 days after introduction, the selection of transformants was started by adding R2P medium supplemented with hygromycin 50 μg / mL except for nurse cells and liquid medium. After the resistant callus grew to 1 to 2 mm, the selected transformed callus was transplanted into RS2A medium (Kimiko Ito, ibid.) Of hygromycin 50 μg / mL. After growing for 10-14 days, hygromycin 50 μg / mL redifferentiation medium (Tetsu Nishimura and Isao Shimamoto, 1996, Plant Cell Engineering Series, Experimental Protocol for Model Plants, pp. 78-81, Shujunsha) The callus was transplanted to regenerate the plant body.

再分化植物体をカルス塊からはずし、50μg/Lハイグロマイシンを含むホルモンフリー培地(西村と島本、同上)に置床し、発根してくる個体を選抜し、シャーレの蓋を開けて滅菌水をシャーレの培地上に注ぎ、1週間馴化を行った。この時、培地が乾かないように2日に1回滅菌水を供給した。馴化後、選抜された植物体(日本晴To世代とする)をイネ育成用土壌(三菱化学製):赤玉(1:1)を入れたジフィーポット(縦×横×高さ:5cm×5cm×6cm)に植え付け、1〜2ヶ月後にプラスチック製のポット(幅×奥行き×高さ:15cm×5.5cm×9.5cm)へ移植してさらに4〜10ヶ月育成し、自殖又は交配し、種子を得た。育成は隔離温室にて行った。T1世代は、Ps2導入遺伝子組換え系統T0世代の自殖により作出し、またBC1F1世代は、T1世代とコシヒカリとを交配したF1世代に、もう一度コシヒカリを戻し交配して作出した。 Remove the redifferentiated plant from the callus mass, place it on a hormone-free medium (Nishimura and Shimamoto, same as above) containing 50 μg / L hygromycin, select the rooting individuals, open the petri dish lid, and apply sterile water. Pour onto a petri dish medium and acclimatize for 1 week. At this time, sterilized water was supplied once every two days so as not to dry the medium. After acclimatization, selected plant bodies (Nippon Hare To generation) are rice-growing soil (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.): Jiffy pot (red x wide x height: 5cm x 5cm x 6cm) containing red balls (1: 1) ), Transplanted to a plastic pot (width x depth x height: 15 cm x 5.5 cm x 9.5 cm) after 1 to 2 months, further grown for 4 to 10 months, self-bred or mated to obtain seeds It was. The cultivation was carried out in an isolated greenhouse. T 1 generation, out of work by selfing of Ps2 introduced transgenic lines T 0 generation, also BC 1 F 1 generation, the F 1 generation were crossed and the T 1 generation and Koshihikari, and backcrossed again Koshihikari Created.

(3)Ps2遺伝子導入及び発現の確認
形質転換イネ当代(T0)、T1世代及びBC1F1世代を用いて、PCR法によりPs2遺伝子の確認を行った。形質転換イネからのゲノムDNAの抽出は、若葉を1〜3cmの長さに切り、滅菌したエッペンドルフチューブに入れ、100μLのTE 緩衝液(10mM Tris HCl、pH8.0、1mM EDTA)を更に添加し、エッペンドルフチューブ用のホモジェナイザーで1〜3分磨砕することによって行った。磨砕後は氷上に保管し、4℃、15,000rpmで2分間遠心し、上清を新しい滅菌チューブに移した。この上清をゲノムDNA画分とした。
(3) Ps2 gene introduction and confirmation of expression Ps2 gene was confirmed by PCR using the transgenic rice generation (T 0 ), T 1 generation and BC 1 F 1 generation. To extract genomic DNA from transformed rice, cut young leaves into 1- 3 cm lengths, put them in a sterilized Eppendorf tube, and add 100 μL TE buffer (10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA). This was carried out by grinding with a homogenizer for Eppendorf tubes for 1 to 3 minutes. After grinding, it was stored on ice, centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was transferred to a new sterile tube. This supernatant was used as a genomic DNA fraction.

Ps2遺伝子の存在を確認するために、ゲノムPCRを5'- CTC ACA AAG CAA AGG CAA TC -3'(配列番号5)をセンスプライマー、5'- GGA TCA GGA GGC TAC TAT TC -3'(配列番号6)をアンチセンスプライマーとし、1.25Uの酵素KOD-Dash(東洋紡社製)、10pmoleのプライマー、0.2mMのdNTP、反応用緩衝液(終濃度:20mM Tris-HCl (pH7.5)、8mM MgCl2、7.5mM DTT、2.5μg/50μL BSA)を用いて行った。上述したゲノムDNAは20μLのPCR反応液全量に対して10μLを使用した。反応装置は、ABI社製のGene Amp PCRシステム9600又はGene Amp PCRシステム9700を使用し、PCR条件は98℃2分、(98℃30秒、55℃2秒、74℃30秒)×30サイクル、74℃5分、4℃∞で保持とした。 In order to confirm the presence of the Ps2 gene, genomic PCR was performed using 5′-CTC ACA AAG CAA AGG CAA TC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) as a sense primer, and 5′-GGA TCA GGA GGC TAC TAT TC-3 ′ (sequence). No. 6) as an antisense primer, 1.25 U enzyme KOD-Dash (Toyobo), 10 pmole primer, 0.2 mM dNTP, reaction buffer (final concentration: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM) MgCl 2 , 7.5 mM DTT, 2.5 μg / 50 μL BSA). The genomic DNA described above was used in an amount of 10 μL for a total volume of 20 μL PCR reaction solution. The reaction apparatus uses Gene Amp PCR System 9600 or Gene Amp PCR System 9700 manufactured by ABI, and PCR conditions are 98 ° C for 2 minutes (98 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 2 seconds, 74 ° C for 30 seconds) x 30 cycles. , 74 ° C. for 5 minutes and 4 ° C. ∞.

また、47個体についてはRT-PCRを行って遺伝子発現を確認した。RT-PCRは、配列番号5(同上)をセンスプライマー、配列番号6(同上)をアンチセンスプライマーとし、1.25Uの酵素KOD-Dash(東洋紡社製)、10pmoleのプライマー、0.2mMのdNTP、反応用緩衝液(終濃度:20mM Tris-HCl (pH7.5)、8mM MgCl2、7.5mM DTT、2.5μg/50μL BSA)を用いて行った。上述したトータルRNAより1st strand cDNA合成キット(Life Science社製)を用いて作成した1st strand cDNAを20μLのPCR反応液全量に対して0.2〜10μLを使用した。反応装置は、ABI社製のGene Amp PCRシステム9600又はGene Amp PCRシステム9700を使用し、PCR条件は98℃2分、(98℃30秒、55℃2秒、74℃30秒)×30サイクル、74℃5分、4℃∞で保持とした。 For 47 individuals, RT-PCR was performed to confirm gene expression. RT-PCR uses SEQ ID NO: 5 (same as above) as a sense primer, SEQ ID NO: 6 (same as above) as an antisense primer, 1.25 U enzyme KOD-Dash (manufactured by Toyobo), 10 pmole primer, 0.2 mM dNTP, reaction Buffer solution (final concentration: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2 , 7.5 mM DTT, 2.5 μg / 50 μL BSA). 0.2 to 10 μL of 1st strand cDNA prepared from the above total RNA using a 1st strand cDNA synthesis kit (manufactured by Life Science) was used for 20 μL of the total PCR reaction solution. The reaction apparatus uses Gene Amp PCR System 9600 or Gene Amp PCR System 9700 manufactured by ABI, and PCR conditions are 98 ° C for 2 minutes (98 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 2 seconds, 74 ° C for 30 seconds) x 30 cycles. , 74 ° C. for 5 minutes and 4 ° C. ∞.

以上のPCR及びRT-PCRの結果、試験した87.5%の個体において発現を確認することができた。また、ゲノムPCRを用いて、これらの個体をPs2保有個体(Ps2+)とPs2非保有個体(Ps-)に分類した。   As a result of the above PCR and RT-PCR, expression could be confirmed in 87.5% of the tested individuals. Moreover, these individuals were classified into Ps2-bearing individuals (Ps2 +) and Ps2-non-bearing individuals (Ps-) using genomic PCR.

(実施例3) Ps2遺伝子を導入した形質転換イネの塩ストレス耐性の評価
(1)遺伝子組換え系統(T1系統)及び非組換え系統の塩ストレス耐性の評価
塩ストレス耐性試験は、横浜市戸塚区に設置した隔離温室で行った。試験期間は10月〜1月で、平均気温は28℃、最高気温は32℃、最低気温24℃、平均湿度60〜80%であった。日長は平均9時間で照度は5000〜10000 lxであった。
Evaluation salt stress tolerance test (Example 3) Ps2 gene evaluation of the introduced salt stress tolerance of transgenic rice was (1) transgenic lines (T 1 strain) and the non-recombinant strains of salt stress tolerance, Yokohama I went in an isolated greenhouse in Totsuka Ward. The test period was from October to January. The average temperature was 28 ° C, the maximum temperature was 32 ° C, the minimum temperature was 24 ° C, and the average humidity was 60 to 80%. The day length was 9 hours on average and the illuminance was 5000 to 10,000 lx.

塩ストレス耐性評価は、コシヒカリが枯死する50mM NaCl相当に対する耐性とし、人工海水(NaCl 500mM)を10倍希釈して用いた。真水で発芽させた供試個体であるPs2遺伝子組換え系統(T1系統)のPs2発現有系統及び発現無系統、並びに非組換え系統(ポッカリ、IR28、及び日本晴)を2〜3葉期まで通常栽培(湛水水田状況)した。2葉期に個体別・系統別に移植し、一週間真水湛水状態で養生栽培した。培土は肥料入りのイネ用育苗土(みまき培土)を用い、ジフィーポット(3cm×3cm)に1本植えした。養生栽培1週間で、真水を10倍希釈海水に換え、湛水栽培を継続した。ポットを入れたステンレス水槽を希釈海水で冠水し、ポンプ攪拌で水槽内塩分を0.3%(50mM NaCl)に保った。 In the salt stress tolerance evaluation, artificial seawater (NaCl 500 mM) was diluted 10 times and used as resistance against 50 mM NaCl corresponding to the death of Koshihikari. 2 to 3 leaf stages of Ps2 transgenic lines (T 1 line) with Ps2 expressing and non-expressing lines and non-recombinant lines (Pokkari, IR28, and Nipponbare) Normal cultivation (flood paddy field situation). Transplanted by individual and line at the 2nd leaf stage and cultivated under fresh water flooded condition for one week. The cultivation soil was planted in a jiffy pot (3 cm x 3 cm) using rice seedling soil (Makiki soil) containing fertilizer. In one week of curing cultivation, fresh water was changed to 10-fold diluted seawater and flooded cultivation was continued. The stainless steel tank containing the pot was submerged with diluted seawater, and the salt content in the water tank was kept at 0.3% (50 mM NaCl) by pump stirring.

その結果を図2に示す。図2において、非組換え系統(1〜3)は、コントロールと比較して、塩ストレス存在下において枯れた部分が多かった。一方、Ps2導入遺伝子組換え系統−発現有(4)は、発現無の系統(5)と比較して、枯死していない部分が多く、塩ストレス存在下においても生育可能であった。   The result is shown in FIG. In FIG. 2, the non-recombinant lines (1 to 3) had more portions withered in the presence of salt stress than the control. On the other hand, Ps2 transgene recombinant line-expressed (4) had more parts that were not dead compared to the non-expressed line (5) and could grow even in the presence of salt stress.

また、遺伝子組換え系統(T1世代)6系統33個体と、非組換え系統3系統30個体(コシヒカリ、日本晴及びポッカリ)を用いて、塩ストレス負荷後6週目及び10週目における塩ストレス耐性評価を行った結果を表2に示す。 In addition, using 6 genetically modified lines (T 1 generation) of 33 individuals and 3 non-recombinant lines of 30 individuals (Koshihikari, Nipponbare and Pokkari) The results of the resistance evaluation are shown in Table 2.

Figure 2005087129
Figure 2005087129

表2において、コシヒカリは10週目において完全枯死(生存率0%)しているが、Ps2(+)系統は生存率25.0%から50.0%まで、様々な塩ストレス耐性程度を示し、Ps2遺伝子導入による塩ストレス耐性向上効果が示唆された。   In Table 2, Koshihikari died completely at the 10th week (survival rate 0%), but the Ps2 (+) line showed various salt stress tolerance levels ranging from 25.0% to 50.0%. It was suggested that the salt stress tolerance improvement effect by.

(2)遺伝子組換え系統BC1F1世代の塩ストレス耐性の評価
続いて、T1//コシヒカリのBC1F1世代13系統149個体を用いた塩ストレス耐性評価を行った。BC1F1個体集団は、Ps2(+)グループ82個体、Ps2(-)グループ67個体であり1:1の比に適合した。希釈海水処理2週間目、4週間目及び8週間目の生存率を図3に示した。Ps2(-)及びPs2(+)の両グループでは、コシヒカリが完全枯死した4週目で10〜20%の生存率を示し、8週間目ではPs2(-)グループがほとんど枯死したのに対し、Ps(+)グループの生存率は11%と有意に高かった(χ2=4.95)。
(2) Evaluation of salt stress tolerance of genetically modified line BC 1 F 1 generation Subsequently, salt stress resistance evaluation was performed using 13 BC 1 F 1 generation 13 lines of T 1 // Koshihikari. The BC 1 F 1 population was 82 individuals in the Ps2 (+) group and 67 individuals in the Ps2 (−) group, which matched a 1: 1 ratio. The survival rates at the second, fourth and eighth weeks after the diluted seawater treatment are shown in FIG. In both Ps2 (-) and Ps2 (+) groups, the survival rate was 10-20% at 4 weeks when Koshihikari was completely dead, whereas the Ps2 (-) group was almost dead at 8 weeks, The survival rate of Ps (+) group was significantly high at 11% (χ 2 = 4.95).

さらに、塩ストレス存在下における植物の着粒を表3にまとめた。Ps2を導入した組換え系統(Ps2+)において、8週間目まで生存した9個体中6個体で出穂が認められ、50〜100%の稔実率を示した。   Further, Table 3 summarizes the plant granulation in the presence of salt stress. In the recombinant line (Ps2 +) into which Ps2 was introduced, heading was observed in 6 out of 9 individuals that survived up to the 8th week, and showed a fertilization rate of 50 to 100%.

Figure 2005087129
Figure 2005087129

本発明によれば、塩ストレス耐性を付与できる遺伝子が提供される。本遺伝子をイネなどの植物に導入することにより、塩ストレスの環境下で長期間生育し、種子をつけることのできる塩ストレス耐性植物を作出することができる。   According to the present invention, a gene capable of imparting salt stress tolerance is provided. By introducing this gene into plants such as rice, it is possible to produce a salt-stress-tolerant plant that can grow for a long time in a salt-stressed environment and can be seeded.

海水耐性シバの第1葉から第3葉、及び茎と節を含む切片を示す図である。It is a figure which shows the section | slice containing the 1st to 3rd leaf of a seawater tolerance shiba, and a stem and a node. Ps2遺伝子組換え系統の塩ストレス耐性評価試験の結果を示す写真である。It is a photograph which shows the result of the salt stress tolerance evaluation test of Ps2 gene recombination system. Ps2遺伝子組換え系統の交配集団(BC1F1世代)における塩ストレス耐性評価試験の結果を示すグラフである。It is a graph showing the results of a salt stress tolerance evaluation test in Ps2 transgenic lines of breeding populations (BC 1 F 1 generation).

配列番号3〜6:合成オリゴヌクレオチド SEQ ID NOs: 3-6: Synthetic oligonucleotides

Claims (11)

以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質
A gene encoding the protein shown in the following (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having an activity of imparting salt stress tolerance
以下の(c)又は(d)に示すDNAからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNA
(d) 配列表の配列番号1に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
The gene consisting of DNA shown in the following (c) or (d).
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(d) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and has an activity to impart salt stress tolerance DNA
請求項1又は2に記載の遺伝子を含む組換えベクター。   A recombinant vector comprising the gene according to claim 1 or 2. 請求項1若しくは2に記載の遺伝子、又は請求項3に記載の組換えベクターを導入した塩ストレス耐性形質転換植物。   A salt stress-tolerant transformed plant into which the gene according to claim 1 or 2 or the recombinant vector according to claim 3 has been introduced. 植物が単子葉植物である、請求項4に記載の塩ストレス耐性形質転換植物。   The salt stress-tolerant transformed plant according to claim 4, wherein the plant is a monocotyledonous plant. 単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、請求項5に記載の塩ストレス耐性形質転換植物。   The salt stress resistant transformed plant according to claim 5, wherein the monocotyledonous plant is a plant belonging to the family Gramineae, Lilyaceae, or Gingeraceae. イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、請求項6に記載の塩ストレス耐性形質転換植物。   The salt stress-tolerant transformed plant according to claim 6, wherein the plant belonging to the family Gramineae is selected from the group consisting of rice, barley, wheat, corn, sugarcane, buckwheat, sorghum, millet, and barnyard millet. 請求項1若しくは2に記載の遺伝子、又は請求項3に記載の組換えベクターを植物に導入することを含む、塩ストレス耐性植物の作出方法。   A method for producing a salt stress tolerant plant, comprising introducing the gene according to claim 1 or 2 or the recombinant vector according to claim 3 into a plant. 植物が単子葉植物である、請求項8に記載の作出方法。   The production method according to claim 8, wherein the plant is a monocotyledonous plant. 単子葉植物がイネ科、ユリ科、又はショウガ科に属する植物である、請求項9に記載の作出方法。   The production method according to claim 9, wherein the monocotyledonous plant is a plant belonging to the family Gramineae, Lilyaceae, or Gingeraceae. イネ科に属する植物が、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエから成る群から選択される、請求項10に記載の作出方法。   The production method according to claim 10, wherein the plant belonging to the family Gramineae is selected from the group consisting of rice, barley, wheat, corn, sugarcane, buckwheat, sorghum, millet and millet.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102771303A (en) * 2012-08-21 2012-11-14 江苏海景园林发展有限公司 Method for selecting and changing seeds of saline-alkali-resistant ditch millet lawn

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