JP2005083965A - Enzymatic functional electrode and cholesterol sensor - Google Patents

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健司 加納
Tokuji Ikeda
篤治 池田
Yoko Hayashi
陽子 林
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an enzymatic functional electrode accurately quantify cholesterol and easy to manufacture. <P>SOLUTION: This enzymatic functional electrode is constituted so as to quantify the concentration of cholesterol in a specimen solution 3, and includes a solid electrode 1 and the enzyme layer 2 fixed to the solid electrode 1. The enzyme layer 2 has cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase and an electron transmission mediator reacting with the solid electrode 1 corresponding to the reaction with peroxidase. In this enzymatic functional electrode, a surfactant is not permeated into the solid electrode 1, nor electrochemical reaction is produced in the solid electrode 1. Accordingly, a current value produced by electrode reaction is not affected by electrochemical reaction, and cholesterol is quantified accurately. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、酵素機能電極及びコレステロールセンサに関するものである。   The present invention relates to an enzyme functional electrode and a cholesterol sensor.

血清などの試料溶液中のコレステロール濃度は、一般に酵素反応を用いた比色法によって測定されている。しかし、比色法は溶液の濁度の影響による誤差を生じ易い。そのため、比色法の代わりに電気的にコレステロールを定量する方法が提案されている。電気的にコレステロールを定量する方法として、例えばカーボンペースト電極を利用した過酸化水素電極によるコレステロールの定量法が非特許文献１に開示されている。非特許文献１に記載のコレステロールの定量法では、カーボンペースト電極に電子伝達メディエータであるフェロセンが練り込まれており、さらにカーボンペースト電極の表面にペルオキシダーゼが固定されている。診断指針として用いられるコレステロール値は、コレステロール濃度とコレステロールエステル濃度とを合計することにより得られる。よって、コレステロールセンサによりコレステロール濃度を定量する際には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾したコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）及びコレステロールエステラーゼ（ＣＨＥＲ）を、測定対象である試料溶液に添加する。このとき、コレステロールエステラーゼは、コレステロールエステルを特異的に認識し、コレステロールエステルのコレステロールへの反応を触媒する。また、コレステロールオキシダーゼは、コレステロールを特異的に認識しコレステロールのコレステノンへの反応を触媒する。ここで、一般的にPEG修飾されていないCHODおよびCHERを使用する場合、試料溶液中にさらに界面活性剤を添加する必要がある。これは、次のような理由からである。試料溶液中のコレステロールエステルは、偽性ミセルの一種であるリポ蛋白中に包摂されているため、コレステロールエステラーゼとの接触確率が低い。よって、コレステロールエステルからコレステロールへ変化する反応の進行が非常に遅い。そこで、試料溶液中にさらに界面活性剤を添加することで、コレステロールエステラーゼとコレステロールエステルとの接触確率を向上し、酵素の活性を向上させる。   The cholesterol concentration in a sample solution such as serum is generally measured by a colorimetric method using an enzymatic reaction. However, the colorimetric method is prone to error due to the turbidity of the solution. Therefore, a method for electrically quantifying cholesterol instead of the colorimetric method has been proposed. As a method for electrically quantifying cholesterol, for example, Non-Patent Document 1 discloses a cholesterol quantification method using a hydrogen peroxide electrode utilizing a carbon paste electrode. In the cholesterol determination method described in Non-Patent Document 1, ferrocene, which is an electron transfer mediator, is kneaded into a carbon paste electrode, and peroxidase is immobilized on the surface of the carbon paste electrode. The cholesterol level used as a diagnostic guide is obtained by summing the cholesterol concentration and the cholesterol ester concentration. Therefore, when the cholesterol concentration is quantified with the cholesterol sensor, polyethylene glycol (PEG) -modified cholesterol oxidase (CHOD) and cholesterol esterase (CHER) are added to the sample solution to be measured. At this time, cholesterol esterase specifically recognizes cholesterol ester and catalyzes the reaction of cholesterol ester to cholesterol. Cholesterol oxidase specifically recognizes cholesterol and catalyzes the reaction of cholesterol to cholesterol. Here, when CHOD and CHER which are not generally PEG-modified are used, it is necessary to add a surfactant to the sample solution. This is for the following reason. Since the cholesterol ester in the sample solution is encapsulated in lipoprotein, which is a kind of pseudo micelle, the probability of contact with cholesterol esterase is low. Therefore, the progress of the reaction changing from cholesterol ester to cholesterol is very slow. Therefore, by adding a surfactant to the sample solution, the contact probability between cholesterol esterase and cholesterol ester is improved, and the activity of the enzyme is improved.

この非特許文献１に記載の過酸化水素センサを用いたコレステロールの検知を、電極を試料溶液中に浸漬し、次のように定量を行う。コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは、試料溶液中のコレステロールエステル及びコレステロールのコレステノンへの反応を触媒する。この反応で、試料溶液中の溶存酸素が過酸化水素に還元される。そして、ペルオキシダーゼは、還元型フェロセンによる過酸化水素の還元反応を触媒する。さらに、酸化されたフェロセンが電極で再還元される。このときの還元電流を測定することによりコレステロール濃度を定量する。   Cholesterol detection using the hydrogen peroxide sensor described in Non-Patent Document 1 is performed by immersing the electrode in a sample solution and quantifying it as follows. Cholesterol esterase and cholesterol oxidase catalyze the reaction of cholesterol esters and cholesterol in the sample solution to cholesterol. By this reaction, dissolved oxygen in the sample solution is reduced to hydrogen peroxide. And peroxidase catalyzes the reduction reaction of hydrogen peroxide by reduced ferrocene. Furthermore, the oxidized ferrocene is re-reduced at the electrode. Cholesterol concentration is quantified by measuring the reduction current at this time.

また、同様にカーボンペースト電極を利用したコレステロールセンサが特許文献１に開示されている。特許文献１に記載のコレステロールセンサは、カーボンペースト電極、親水性高分子層及び酵素類を含む層から形成されている。カーボンペースト電極は、基板上に銀ペースト及びカーボンペーストがスクリーン印刷されて形成されている。このカーボンペースト電極上に親水性高分子層が形成され、その上に酵素類を含む層が形成されている。酵素類を含む層には、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼ等の酵素類、界面活性剤及び電子伝達メディエータが含有されている。このコレステロールセンサの酵素類を含む層上にコレステロールを含む試料溶液を滴下すると、コレステロールがコレステロールオキシダーゼの存在下でコレステノンに酸化される。その反応で、電子伝達メディエータが還元される。還元型電子伝達メディエータは、電極で再酸化され、このときに生じる酸化電流を電極で測定することによりコレステロール濃度を定量する。特許文献１のコレステロールセンサでは、電極表面が親水性高分子によって覆われているため、界面活性剤がカーボンペースト電極表面に接触しない。よって、高精度のセンサ応答を有するセンサを得ることができる。   Similarly, Patent Document 1 discloses a cholesterol sensor using a carbon paste electrode. The cholesterol sensor described in Patent Document 1 is formed of a carbon paste electrode, a hydrophilic polymer layer, and a layer containing enzymes. The carbon paste electrode is formed by screen-printing silver paste and carbon paste on a substrate. A hydrophilic polymer layer is formed on the carbon paste electrode, and a layer containing enzymes is formed thereon. The layer containing enzymes contains enzymes such as cholesterol oxidase and cholesterol esterase, a surfactant, and an electron transfer mediator. When a sample solution containing cholesterol is dropped on the layer containing the enzymes of the cholesterol sensor, the cholesterol is oxidized to cholestenone in the presence of cholesterol oxidase. In the reaction, the electron transfer mediator is reduced. The reduced electron transfer mediator is reoxidized at the electrode, and the cholesterol concentration is quantified by measuring the oxidation current generated at this time with the electrode. In the cholesterol sensor of Patent Document 1, since the electrode surface is covered with a hydrophilic polymer, the surfactant does not contact the carbon paste electrode surface. Therefore, a sensor having a highly accurate sensor response can be obtained.

さらに、金電極上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を作製し、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼをグルタルアルデヒド架橋により固定したコレステロールセンサが非特許文献２に開示されている。非特許文献２のコレステロールセンサは、電極として金電極を用いているため、電極が有機溶媒や界面活性剤の影響を受け難く高精度のセンサ応答を得ることができる。
特開平１０−２３２２１９号公報 H.Kinoshita et al. /Ann Clin Biochem 1998; 35: 739-744 T.Nakaminami et al. /Anal Chem 1999; 71: 1068-1076 Further, Non-Patent Document 2 discloses a cholesterol sensor in which a self-assembled monolayer (SAM) is prepared on a gold electrode, and cholesterol oxidase and cholesterol esterase are immobilized by glutaraldehyde crosslinking. Since the cholesterol sensor of Non-Patent Document 2 uses a gold electrode as an electrode, the electrode is hardly affected by an organic solvent or a surfactant, and a highly accurate sensor response can be obtained.
JP-A-10-232219 H. Kinoshita et al./Ann Clin Biochem 1998; 35: 739-744 T.Nakaminami et al./Anal Chem 1999; 71: 1068-1076

しかし、非特許文献１に記載のコレステロールの定量法では、カーボンペースト電極を界面活性剤を含有する試料溶液中に浸漬するため、電流応答が不正確になってしまう。つまり、試料溶液中の界面活性剤がカーボンペースト電極に接触すると、界面活性剤がカーボン層に湿潤しカーボン層の下地層である銀電極に接触する。そして、銀電極が電気化学反応を生じることにより酸化電流が発生し、測定される酸化電流値が増加してコレステロール濃度の定量に誤差が生じてしまう。さらに、カーボンペースト電極に界面活性剤が浸潤すると、カーボン層自体の変成により、電極活性の低下、すなわち電極／溶液界面での電子伝達速度の低下が生じ、応答性の低下をもたらす。また、カーボンペースト電極上にコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等の酵素が固定されておらず、検知可能な応答電流を得るためには大量の酵素が必要となってしまう。   However, in the cholesterol quantification method described in Non-Patent Document 1, since the carbon paste electrode is immersed in a sample solution containing a surfactant, the current response becomes inaccurate. That is, when the surfactant in the sample solution contacts the carbon paste electrode, the surfactant wets the carbon layer and contacts the silver electrode that is the underlayer of the carbon layer. And an oxidation current generate | occur | produces when a silver electrode produces an electrochemical reaction, the oxidation current value measured will increase, and an error will arise in determination of cholesterol concentration. Further, when the surfactant is infiltrated into the carbon paste electrode, the carbon layer itself is transformed, resulting in a decrease in electrode activity, that is, a decrease in electron transfer speed at the electrode / solution interface, resulting in a decrease in responsiveness. Further, enzymes such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and peroxidase are not fixed on the carbon paste electrode, and a large amount of enzyme is required to obtain a detectable response current.

特許文献１に記載のコレステロールセンサでは、界面活性剤のカーボンペースト電極への影響を防止するためカーボンペースト電極上に親水性高分子膜を設ける必要があり、製造工程が複雑になる。
また、非特許文献２に記載のコレステロールセンサでは、界面活性剤の影響を受けない材料を電極に用いる必要があるため、電極材料が金などに限定されてしまう。また、電極上に酵素を固定するために、電極の洗浄やＳＡＭを作製するなどの前処理が必要であり工程数が多い。さらに、酵素をＳＡＭにより電極表面上に固定した場合にも酵素がその作用を維持していることが必要であるため、電極表面とＳＡＭとの相互作用等を考慮したＳＡＭの作製が必要である。また、非特許文献２では、電子伝達メディエータが溶存酸素によって自動酸化されてしまうので、測定の際には酸素を除かなければならない。 In the cholesterol sensor described in Patent Document 1, it is necessary to provide a hydrophilic polymer film on the carbon paste electrode in order to prevent the surfactant from affecting the carbon paste electrode, which complicates the manufacturing process.
In addition, in the cholesterol sensor described in Non-Patent Document 2, since it is necessary to use a material that is not affected by the surfactant for the electrode, the electrode material is limited to gold or the like. In addition, in order to immobilize the enzyme on the electrode, pretreatment such as washing of the electrode and preparation of SAM is necessary, and the number of steps is large. Furthermore, since it is necessary for the enzyme to maintain its action even when the enzyme is immobilized on the electrode surface by SAM, it is necessary to prepare a SAM in consideration of the interaction between the electrode surface and the SAM. . In Non-Patent Document 2, since the electron transfer mediator is auto-oxidized by dissolved oxygen, oxygen must be removed during measurement.

そこで、本発明は、正確にコレステロールを定量することができ、かつ製造が容易な酵素機能電極を得ることを目的とする。
また、本発明は、正確にコレステロールを定量することができ、かつ製造が容易なコレステロールセンサを得ることを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to obtain an enzyme functional electrode that can accurately quantify cholesterol and is easy to manufacture.
Another object of the present invention is to obtain a cholesterol sensor that can accurately quantify cholesterol and is easy to manufacture.

本願第１発明は、上記の課題を解決するために、試料溶液中のコレステロール濃度を定量する酵素機能電極であって、固体電極と、前記固体電極に固定された酵素層とを含み、前記酵素層は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、前記ペルオキシダーゼとの反応に応じて前記固体電極と反応する電子伝達メディエータとを有する酵素機能電極を提供する。
コレステロールエステル、コレステロールを含む試料溶液中に上記の酵素機能電極を浸漬すると、コレステロールエステラーゼが、界面活性剤の存在下でコレステロールエステルをコレステロールに変化させる。一方、コレステロールオキシダーゼは、コレステロールエステラーゼにより生成されたコレステロール及び試料溶液中に既に存在するコレステロールの酸素による酸化反応を触媒する。この反応で、試料溶液中の溶存酸素が過酸化水素に還元される。そして、ペルオキシダーゼは、この反応により生じる過酸化水素の還元型電子伝達メディエータによる還元反応を触媒する。最後に、ペルオキシダーゼ反応で生成した酸化型電子伝達メディエータは、固体電極で再還元される。この還元電流値を測定することによりコレステロールを定量する。 In order to solve the above-mentioned problem, the first invention of the present application is an enzyme functional electrode for quantifying a cholesterol concentration in a sample solution, comprising a solid electrode and an enzyme layer fixed to the solid electrode, The layer provides an enzyme functional electrode having cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase, and an electron transfer mediator that reacts with the solid electrode in response to the reaction with the peroxidase.
When the enzyme functional electrode is immersed in a sample solution containing cholesterol ester and cholesterol, cholesterol esterase changes the cholesterol ester to cholesterol in the presence of a surfactant. On the other hand, cholesterol oxidase catalyzes the oxidation reaction of cholesterol produced by cholesterol esterase and cholesterol already present in the sample solution with oxygen. By this reaction, dissolved oxygen in the sample solution is reduced to hydrogen peroxide. The peroxidase catalyzes the reduction reaction of hydrogen peroxide generated by this reaction by the reduced electron transfer mediator. Finally, the oxidized electron transfer mediator generated by the peroxidase reaction is re-reduced at the solid electrode. Cholesterol is quantified by measuring this reduction current value.

上記の酵素機能電極の電極基板は、固体電極であり、固体電極に固定された電子伝達メディエータと固体電極とが電極反応を生じる構成である。よって、界面活性剤が固体電極に浸透せず、固体電極部において電気化学反応が生じない。そのため、電極反応により生じる電流値が電気化学反応により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。
さらに、上記の酵素機能電極では、電子伝達メディエータの還元電流を測定するため、電極電位が低電位である。そのため、その電位において酸化または還元される物質によるノイズが生じ難く正確に定量対象物質を定量することができる。例えば、高電位であると、血中に存在する尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等が酸化される可能性があるが、低電位であるとそれらの物質の酸化されず測定電流に誤差が生じない。 The electrode substrate of the enzyme functional electrode is a solid electrode, and an electron reaction between the electron transfer mediator fixed to the solid electrode and the solid electrode causes an electrode reaction. Therefore, the surfactant does not penetrate into the solid electrode, and no electrochemical reaction occurs in the solid electrode portion. Therefore, the current value generated by the electrode reaction is not affected by the electrochemical reaction, and cholesterol can be accurately quantified.
Further, in the enzyme functional electrode, the electrode potential is low because the reduction current of the electron transfer mediator is measured. Therefore, it is difficult to generate noise due to a substance that is oxidized or reduced at the potential, and the target substance can be accurately quantified. For example, if the potential is high, uric acid, ascorbic acid, acetaminophen, etc. present in the blood may be oxidized, but if the potential is low, these substances are not oxidized and an error occurs in the measurement current. Absent.

さらに、上記の酵素機能電極においては、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び電子伝達メディエータが固体電極に固定され、固体電極表面または固体電極表面近傍に位置している。よって、酵素反応及び電極反応の反応性を高め、生じる電流を固体電極において即時に測定することができる。また、効率良く酵素反応及び電極反応が起こるため、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び電子伝達メディエータの量が少なくても酵素反応及び電極反応の応答性を確保することができる。   Furthermore, in the above-mentioned enzyme functional electrode, peroxidase, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and electron transfer mediator are fixed to the solid electrode and are located on the solid electrode surface or in the vicinity of the solid electrode surface. Therefore, the reactivity of the enzyme reaction and the electrode reaction can be increased, and the resulting current can be measured immediately at the solid electrode. In addition, since the enzyme reaction and the electrode reaction occur efficiently, the responsiveness of the enzyme reaction and the electrode reaction can be ensured even if the amount of peroxidase, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and electron transfer mediator is small.

本願第２発明は、前記第１発明において、前記酵素層は、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜をさらに有する酵素機能電極を提供する。
固体電極及び電子伝達メディエータ間の電極反応において生じる電流の電流値に誤差を生じさせる妨害物質を隔膜により阻害することができるので、応答電流の誤差を低減することができる。よって、さらに正確にコレステロール濃度を定量することができる。
本願第３発明は、前記第１発明において、前記酵素層は、前記電子伝達メディエータ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを前記固体電極に固定するポリマーをさらに有する酵素機能電極を提供する。 According to a second invention of the present application, in the first invention, the enzyme layer further includes a diaphragm that inhibits an interfering substance that gives an error in a current value of a current generated by an electrode reaction between the solid electrode and the electron transfer mediator. An enzyme functional electrode is provided.
Interference substances that cause an error in the current value of the current generated in the electrode reaction between the solid electrode and the electron transfer mediator can be inhibited by the diaphragm, so that the error in the response current can be reduced. Therefore, the cholesterol concentration can be quantified more accurately.
A third invention of the present application provides the enzyme functional electrode according to the first invention, wherein the enzyme layer further includes a polymer that fixes the electron transfer mediator, peroxidase, cholesterol oxidase, and cholesterol esterase to the solid electrode.

電子伝達メディエータ及び各酵素をポリマーにより固体電極に固定するため、固体電極の材料が金属電極に限定されない。また、例えば固体電極の前処理や洗浄などの工程を省略できるため、容易に酵素機能電極を作製することができる。
本願第４発明は、前記第３発明において、前記電子伝達メディエータはフェロセン誘導体であり、前記ポリマーはポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンである酵素機能電極を提供する。
電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体は、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンの側鎖に結合される。よって、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンを固体電極に結合することにより、電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体を固体電極表面又は固体電極近傍に固定することができる。また、これらのポリマーはアミノ基を有しているため、架橋剤を介してポリマー同士を結合して網目構造を形成することによりペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを固定することができる。あるいは、架橋剤を介してポリマー骨格と、ペルオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを架橋させることで、これらの酵素をポリマーに固定することができる。 Since the electron transfer mediator and each enzyme are fixed to the solid electrode by the polymer, the material of the solid electrode is not limited to the metal electrode. Further, for example, steps such as pretreatment and washing of the solid electrode can be omitted, so that an enzyme functional electrode can be easily produced.
A fourth invention of the present application provides the enzyme functional electrode according to the third invention, wherein the electron transfer mediator is a ferrocene derivative and the polymer is polyallylamine or poly-L-lysine.
Ferrocene derivatives that are electron transfer mediators are bound to the side chain of polyallylamine or poly-L-lysine. Therefore, by binding polyallylamine or poly-L-lysine to the solid electrode, the ferrocene derivative that is an electron transfer mediator can be immobilized on the surface of the solid electrode or in the vicinity of the solid electrode. Moreover, since these polymers have an amino group, peroxidase, cholesterol esterase, and cholesterol oxidase can be fixed by bonding polymers via a crosslinking agent to form a network structure. Alternatively, these enzymes can be immobilized on the polymer by crosslinking the polymer backbone with peroxidase, cholesterol esterase and cholesterol oxidase via a crosslinking agent.

本願第５発明は、前記第３発明において、前記酵素層は、前記ポリマーを架橋する架橋剤をさらに含み、前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、スベリン酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、及びジメチルスベリミデートからなる群から選ばれる酵素機能電極を提供する。
上記の架橋剤を用いることにより、固体電極に特別な前処理をすることなく、電子伝達メディエータ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼを固体電極に固定することができる。 A fifth invention of the present application is the third invention, wherein the enzyme layer further includes a crosslinking agent for crosslinking the polymer, and the crosslinking agent comprises glutaraldehyde, polyethylene glycol diglycidyl ether, suberic acid (N-hydroxysuccinimide ester). And an enzyme functional electrode selected from the group consisting of dimethylsuberimidate.
By using the cross-linking agent, the electron transfer mediator, peroxidase, cholesterol oxidase and cholesterol esterase can be immobilized on the solid electrode without any special pretreatment on the solid electrode.

本願第６発明は、前記第１発明において、前記酵素層において、前記固体電極を覆うように前記電子伝達メディエータ及びペルオキシダーゼからなる第１層が形成され、前記第１層を覆うようにコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる第２層が形成されている酵素機能電極を提供する。
上記の酵素機能電極では、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる第２層が酵素機能電極の最表面に形成されているため、試料溶液中のコレステロールまたはコレステロールエステルとの接触確率が高くなり反応が生じやすい。また、電子伝達メディエータ及びペルオキシダーゼからなる第１層を固体電極側の最表面に固定することで、電子伝達メディエータとペルオキシダーゼとが凝集する。よって、電子伝達メディエータとペルオキシダーゼとの間の反応性が高まり、かつ電子伝達メディエータと固体電極との電極反応が高まる。よって、固体電極において即時に電流を測定することができる。さらに、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼが同一層に位置するように固体電極に固定されているため、コレステロールエステラーゼにより分解されて生じたコレステロールが、コレステロールオキシダーゼにより即時に分解されやすい。これは、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼ間の距離が短いため、コレステロールエステラーゼからコレステロールオキシダーゼへのコレステロールの移動距離が短いためである。また、物質移動速度の観点から、コレステロールの移動速度がＨ2Ｏ2の移動速度よりも小さい場合、前述のようにコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを酵素機能電極の最表面に固定すると、高い応答電流を得ることができる。これは、コレステロールが第１層及び第２層を移動するよりも、酵素機能電極の最表面に固定したコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼによりコレステロールをＨ2Ｏ2に変えてから第１層及び第２層中を移動させたほうが、移動速度が速いためである。 The sixth invention of the present application is the first invention, wherein in the enzyme layer, a first layer comprising the electron transfer mediator and peroxidase is formed so as to cover the solid electrode, and cholesterol oxidase and so on are covered so as to cover the first layer. Provided is an enzyme functional electrode in which a second layer made of cholesterol esterase is formed.
In the enzyme functional electrode, since the second layer composed of cholesterol oxidase and cholesterol esterase is formed on the outermost surface of the enzyme functional electrode, the probability of contact with cholesterol or cholesterol ester in the sample solution increases and reaction is likely to occur. . In addition, the electron transfer mediator and peroxidase are aggregated by fixing the first layer composed of the electron transfer mediator and peroxidase to the outermost surface on the solid electrode side. Therefore, the reactivity between the electron transfer mediator and peroxidase increases, and the electrode reaction between the electron transfer mediator and the solid electrode increases. Therefore, the current can be measured immediately in the solid electrode. Furthermore, since the cholesterol oxidase and the cholesterol esterase are fixed to the solid electrode so as to be located in the same layer, the cholesterol generated by being decomposed by the cholesterol esterase tends to be immediately decomposed by the cholesterol oxidase. This is because the distance of cholesterol transfer from cholesterol esterase to cholesterol oxidase is short because the distance between cholesterol oxidase and cholesterol esterase is short. From the viewpoint of the mass transfer rate, when the cholesterol transfer rate is smaller than the H 2 O 2 transfer rate, when the cholesterol oxidase and cholesterol esterase are immobilized on the outermost surface of the enzyme functional electrode as described above, a high response current is obtained. Can be obtained. Rather than moving cholesterol through the first layer and the second layer, the cholesterol is changed to H 2 O 2 by cholesterol oxidase and cholesterol esterase immobilized on the outermost surface of the enzyme functional electrode, and then the first layer and the second layer. This is because the moving speed is faster when the inside is moved.

本願第７発明は、前記第６発明において、前記第１層と前記第２層との間に、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜がさらに形成されている酵素機能電極を提供する。
固体電極及び電子伝達メディエータ間の電極反応において生じる電流の電流値に誤差を生じさせる妨害物質を隔膜により阻害することができるので、応答電流の誤差を低減することができる。よって、さらに正確にコレステロール濃度を定量することができる。
本願第８発明は、前記第１発明〜第７発明のいずれかに記載の酵素機能電極を有するコレステロールセンサを提供する。 A seventh invention of the present application provides an error in a current value of a current generated by an electrode reaction between the solid electrode and the electron transfer mediator between the first layer and the second layer in the sixth invention. Provided is an enzyme functional electrode in which a diaphragm that inhibits an interfering substance is further formed.
Interference substances that cause an error in the current value of the current generated in the electrode reaction between the solid electrode and the electron transfer mediator can be inhibited by the diaphragm, so that the error in the response current can be reduced. Therefore, the cholesterol concentration can be quantified more accurately.
The eighth invention of the present application provides a cholesterol sensor having the enzyme functional electrode according to any one of the first to seventh inventions.

本発明による酵素機能電極の電極基板は、固体電極であり、固体電極に固定された電子伝達メディエータと固体電極とが電極反応を生じる構成である。よって、界面活性剤が固体電極に浸透しないため、酵素反応に由来する電流が界面活性剤により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。   The electrode substrate of the enzyme functional electrode according to the present invention is a solid electrode, and has a structure in which an electron transfer mediator fixed to the solid electrode and the solid electrode cause an electrode reaction. Therefore, since the surfactant does not penetrate into the solid electrode, the current derived from the enzyme reaction is not affected by the surfactant, and cholesterol can be accurately quantified.

＜第１実施形態例＞
図１は、第１実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図である。第１実施形態例に係る酵素機能電極では、酵素層２が固体電極１に固定されている。酵素層２は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥＲ）、電子伝達メディエータ（Ｍ）、ポリマー１５及び架橋剤１７を有している。酵素層２内のＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータは、ポリマー１５及び架橋剤１７を介して固体電極１に固定されている。図１の酵素機能電極では、ポリマー１５のポリマー分子同士が架橋剤１７により互いに架橋され、網目構造体を形成している。その網目構造体中にＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及びＰＯＤの酵素が包含され、包含された酵素は架橋剤１７を介して共有結合によりポリマー１５に結合されている。網目構造体を形成したポリマー１５は、主に疎水性相互作用により固体電極１表面に固定されている。この酵素機能電極が、酸素（Ｏ2）と、定量対象であるコレステロール及び／またはコレステロールエステルとを含む試料溶液３に浸漬される。そして、コレステロールの定量が行われる。また、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼとの接触確率を高めるために、界面活性剤が試料溶液３中に含まれている。界面活性剤を酵素機能電極に担持するようにしても良い。ここで、試料溶液３中のコレステロールエステルは、偽性ミセルの一種であるリポ蛋白中に包摂されているため、ＣＨＥＲとの接触確率が低い。そこで、試料溶液３中にさらに界面活性剤を添加することで、ＣＨＥＲとコレステロールエステルとの接触確率を向上し、酵素の活性を向上させる。そして、コレステロールエステルからコレステロールへの反応を促進させる。 <First embodiment>
FIG. 1 is a schematic view showing a state in which an enzyme functional electrode according to a first embodiment is immersed in a sample solution. In the enzyme functional electrode according to the first embodiment, the enzyme layer 2 is fixed to the solid electrode 1. The enzyme layer 2 has peroxidase (POD), cholesterol oxidase (CHOD), cholesterol esterase (CHER), electron transfer mediator (M), polymer 15 and cross-linking agent 17. The POD, CHOD, CHER, and electron transfer mediator in the enzyme layer 2 are fixed to the solid electrode 1 through the polymer 15 and the crosslinking agent 17. In the enzyme functional electrode of FIG. 1, polymer molecules of the polymer 15 are cross-linked with each other by a cross-linking agent 17 to form a network structure. The network structure includes CHOD, CHER, and POD enzymes, and the included enzymes are covalently bonded to the polymer 15 via the crosslinking agent 17. The polymer 15 forming the network structure is fixed to the surface of the solid electrode 1 mainly by hydrophobic interaction. This enzyme functional electrode is immersed in a sample solution 3 containing oxygen (O 2 ) and cholesterol and / or cholesterol ester to be quantified. Then, cholesterol is quantified. In addition, a surfactant is included in the sample solution 3 in order to increase the contact probability between cholesterol ester and cholesterol esterase. A surfactant may be supported on the enzyme functional electrode. Here, since the cholesterol ester in the sample solution 3 is included in lipoprotein which is a kind of pseudo micelle, the contact probability with CHER is low. Therefore, by adding a surfactant to the sample solution 3, the contact probability between CHER and cholesterol ester is improved, and the enzyme activity is improved. And the reaction from cholesterol ester to cholesterol is promoted.

固体電極材料としては、界面活性剤が染み込んだり、界面活性剤によって溶出したりしない材料が選択され、例えば、金属電極、およびグラッシーカーボンなどの炭素電極が挙げられる。
電子伝達メディエータ及びポリマーとしては、電子伝達メディエータが結合した電子伝達メディエータ結合ポリマーが挙げられる。電子伝達メディエータ結合ポリマーとしては、例えば電子伝達メディエータがフェロセン誘導体であるフェロセン結合ポリアリルアミンまたはフェロセン結合ポリ−Ｌ−リジンを用いる。これらのポリマーは、電子伝達メディエータであるフェロセン誘導体が、ポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンの側鎖に結合されている。よって、電子伝達メディエータ結合ポリマーを固体電極１に結合することにより、電子伝達メディエータを固体電極１表面又は固体電極１表面近傍に固定することができる。ポリマーと固体電極１とは、例えば疎水性相互作用により結合されている。 As the solid electrode material, a material that does not soak in or elute with the surfactant is selected, and examples thereof include metal electrodes and carbon electrodes such as glassy carbon.
Examples of the electron transfer mediator and polymer include an electron transfer mediator binding polymer to which an electron transfer mediator is bonded. As the electron transfer mediator-binding polymer, for example, ferrocene-bonded polyallylamine or ferrocene-bonded poly-L-lysine whose electron transfer mediator is a ferrocene derivative is used. In these polymers, a ferrocene derivative that is an electron transfer mediator is bonded to a side chain of polyallylamine or poly-L-lysine. Therefore, by binding the electron transfer mediator binding polymer to the solid electrode 1, the electron transfer mediator can be fixed on the surface of the solid electrode 1 or in the vicinity of the surface of the solid electrode 1. The polymer and the solid electrode 1 are bonded by, for example, hydrophobic interaction.

また、ポリマーはアミノ基を有しているため、架橋剤１７を介してポリマー同士を結合して網目構造を形成することによりＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを固定することができる。また、架橋剤１７を介してポリマー骨格とＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲとを架橋させることで、酵素をポリマーに固定することができる。フェロセン結合ポリアリルアミンの合成方法は、例えばE.J.Calvo et al, / Anal.Chem. 1996,68,4186-4193に記載されている。フェロセン結合ポリ−Ｌ−リジンの合成方法は、例えばS.Iijima et al, / Anal.Chem.Acta, 1993,281,438-487に記載されている。   Further, since the polymer has an amino group, POD, CHOD and CHER can be fixed by bonding the polymers to each other via the crosslinking agent 17 to form a network structure. In addition, the enzyme can be fixed to the polymer by crosslinking the polymer skeleton with POD, CHOD and CHER via the crosslinking agent 17. A method for synthesizing ferrocene-linked polyallylamine is described, for example, in E.J. Calvo et al, / Anal. Chem. 1996, 68, 4186-4193. A method for synthesizing ferrocene-linked poly-L-lysine is described in, for example, S. Iijima et al, / Anal. Chem. Acta, 1993, 281, 438-487.

架橋剤１７としては、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、スベリン酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、及びジメチルスベリミデートなどが挙げられる。これらの架橋剤のアルデヒド基またはエポキシ基が、ポリアリルアミン、ポリ−Ｌ−リジンあるいは酵素のアミノ基とシッフ塩基を形成し結合する。
架橋する際に、ポリアリルアミン、ポリ−Ｌ−リジン等のポリマーまたは牛血アルブミン（ＢＳＡ）をさらに添加すると、ポリマーと架橋剤との反応により網目構造が形成され、酵素の固定が容易である。 Examples of the crosslinking agent 17 include glutaraldehyde, polyethylene glycol diglycidyl ether, suberic acid (N-hydroxysuccinimide ester), and dimethylsuberimidate. The aldehyde group or epoxy group of these cross-linking agents forms a Schiff base with polyallylamine, poly-L-lysine or the amino group of the enzyme and binds them.
When cross-linking, when a polymer such as polyallylamine or poly-L-lysine or bovine blood albumin (BSA) is further added, a network structure is formed by the reaction between the polymer and the cross-linking agent, and the enzyme is easily fixed.

図２は、第１実施形態例に係る酵素機能電極を有するコレステロールセンサを用いた場合の反応の様子を示す模式図である。血中総コレステロール濃度は、コレステロール濃度とコレステロールエステル濃度とを合計することにより得られるため、次の反応によりコレステロールを定量する。
コレステロールエステル及びコレステロールを含む試料溶液３中に上記の酵素機能電極を浸漬すると、ＣＨＥＲが、界面活性剤の存在下でコレステロールエステルがコレステロールと脂肪酸に分解される。一方、ＣＨＯＤは、ＣＨＥＲにより生成されたコレステロール及び試料溶液３中に既に存在するコレステロールのコレステノンへの酸化を触媒する。この反応で、試料溶液３中の溶存酸素（Ｏ2）が過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に還元される。次に、ＰＯＤの存在下でＨ2Ｏ2が水（Ｈ2Ｏ）に還元され、この反応で還元型電子伝達メディエータ（Ｍｒｅｄ）は酸化型電子伝達メディエータ（Ｍｏｘ）に酸化される。最後にＭｏｘが、固体電極１から電子を受け取りＭｒｅｄに還元される。この電極反応により生じる還元電流値を測定することによりコレステロールを定量する。ここで、溶存酸素（Ｏ2）は、ＣＨＯＤとコレステロールとの反応で、ＣＨＯＤによりＨ2Ｏ2に還元される。 FIG. 2 is a schematic diagram showing a reaction in the case of using a cholesterol sensor having an enzyme functional electrode according to the first embodiment. Since the blood total cholesterol concentration is obtained by adding the cholesterol concentration and the cholesterol ester concentration, cholesterol is quantified by the following reaction.
When the enzyme functional electrode is immersed in the sample solution 3 containing cholesterol ester and cholesterol, CHER is decomposed into cholesterol and fatty acid in the presence of a surfactant. On the other hand, CHOD catalyzes the oxidation of cholesterol produced by CHER and cholesterol already present in sample solution 3 to cholesterol. By this reaction, dissolved oxygen (O 2 ) in the sample solution 3 is reduced to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). Next, H 2 O 2 is reduced to water (H 2 O) in the presence of POD, and the reduced electron transfer mediator (Mred) is oxidized to an oxidized electron transfer mediator (Mox) by this reaction. Finally, Mox receives electrons from the solid electrode 1 and is reduced to Mred. Cholesterol is quantified by measuring the reduction current value generated by this electrode reaction. Here, dissolved oxygen (O 2 ) is reduced to H 2 O 2 by CHOD by the reaction between CHOD and cholesterol.

上記の酵素機能電極の電極基板は、固体電極１であり、固体電極１に固定された電子伝達メディエータと固体電極１とが電極反応を生じる構成である。よって、界面活性剤が固体電極１に浸透せず、固体電極部において電気化学反応が生じない。そのため、電極反応により生じる電流値が電気化学反応により影響を受けず、正確にコレステロールを定量することができる。
さらに、上記の酵素機能電極の固体電極では、電子伝達メディエータの還元電流を測定するため、電極電位が低電位である。そのため、その電位において酸化または還元される物質によるノイズが生じ難く正確に定量対象物質を定量することができる。例えば、高電位であると、血中に存在する尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等が酸化される可能性があるが、低電位であるとそれらの物質の酸化されず測定電流に誤差が生じない。また、電子伝達メディエータとしてフェロセンを用いると、フェロセンが溶存酸素により酸化されにくい性質を有しているため、低電位で測定する測定することができる。 The electrode substrate of the enzyme functional electrode is the solid electrode 1 and has a configuration in which the electron transfer mediator fixed to the solid electrode 1 and the solid electrode 1 cause an electrode reaction. Therefore, the surfactant does not penetrate into the solid electrode 1 and no electrochemical reaction occurs in the solid electrode portion. Therefore, the current value generated by the electrode reaction is not affected by the electrochemical reaction, and cholesterol can be accurately quantified.
Further, in the solid electrode of the enzyme functional electrode, the electrode potential is low because the reduction current of the electron transfer mediator is measured. Therefore, it is difficult to generate noise due to a substance that is oxidized or reduced at the potential, and the target substance can be accurately quantified. For example, if the potential is high, uric acid, ascorbic acid, acetaminophen, etc. present in the blood may be oxidized, but if the potential is low, these substances are not oxidized and an error occurs in the measurement current. Absent. In addition, when ferrocene is used as an electron transfer mediator, since ferrocene has a property that is not easily oxidized by dissolved oxygen, measurement can be performed at a low potential.

上記の酵素機能電極においては、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータが固体電極１に固定され、固体電極１表面または固体電極１表面近傍に位置している。よって、酵素反応及び電極反応の反応性を高め、生じる電流を固体電極１において即時に測定することができる。また、効率良く酵素反応及び電極反応が起こるため、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータの量が少なくても酵素反応及び電極反応の応答性を確保することができる。
また、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲ及び電子伝達メディエータの固体電極１への固定が、ポリマー１５や架橋剤１７により行われているため、固体電極１の材料が金属電極に限定されない。さらに、固体電極１の前処理や洗浄などの工程を省略できるため、容易に酵素機能電極を作製することができる。例えば、ＳＡＭを用いて酵素を電極に固定する場合には、共有結合を利用して金属電極に酵素を固定するため、電極が金などの金属電極に限定されてしまう。また、ＳＡＭを用いる場合には、固体電極の洗浄や前処理などの工程が必要である。さらに、電子伝達メディエータや酵素がポリマー１５や架橋剤１７により固体電極１に固定されているため、例えば強力な対流に曝されても固体電極１から脱難することがない。よって、酵素機能電極を繰り返し使用したり、酵素量や電子伝達メディエータ量を低減することが可能である。例えば、酵素が固定された酵素機能電極を試料溶液から引き上げ、軽く洗浄して再度測定することができる。
＜第２実施形態例＞
図３は、第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図である。固体電極１には、ＰＯＤと電子伝達メディエータからなる第１層２２が形成され、第１層２２を覆うようにＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層２４が形成されている。第１層２２のＰＯＤ及び電子伝達メディエータ間、第２層２４のＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ間は、ポリマー１５及び架橋剤１７により結合されている。また、第１層２２及び第２層２４間は、主に架橋剤１７を介した共有結合により固定されている。ここで、第２層２４のＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ間は、架橋剤１７のみにより結合されていても良い。この酵素機能電極を、第１実施形態例と同様に、定量対象であるコレステロール及び／またはコレステロールエステルとを含む試料溶液３に浸漬し、コレステロールの定量を行う。また同様に、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼとの接触確率を高めるために、界面活性剤が試料溶液３中に含まれている。界面活性剤を酵素機能電極に担持するようにしても良い。 In the enzyme functional electrode, POD, CHOD, CHER, and electron transfer mediator are fixed to the solid electrode 1 and are located on the surface of the solid electrode 1 or in the vicinity of the surface of the solid electrode 1. Therefore, the reactivity of the enzyme reaction and the electrode reaction can be increased, and the generated current can be immediately measured at the solid electrode 1. Further, since the enzyme reaction and the electrode reaction occur efficiently, the responsiveness of the enzyme reaction and the electrode reaction can be ensured even if the amount of POD, CHOD, CHER and electron transfer mediator is small.
Further, since the POD, CHOD, CHER, and electron transfer mediator are fixed to the solid electrode 1 by the polymer 15 or the crosslinking agent 17, the material of the solid electrode 1 is not limited to the metal electrode. Furthermore, since steps such as pretreatment and washing of the solid electrode 1 can be omitted, an enzyme functional electrode can be easily produced. For example, when an enzyme is immobilized on an electrode using SAM, the enzyme is immobilized on a metal electrode using a covalent bond, so that the electrode is limited to a metal electrode such as gold. Moreover, when using SAM, processes, such as washing | cleaning of a solid electrode and pre-processing, are required. Furthermore, since the electron transfer mediator and the enzyme are fixed to the solid electrode 1 by the polymer 15 and the cross-linking agent 17, for example, even if exposed to strong convection, the solid electrode 1 does not escape. Therefore, the enzyme functional electrode can be used repeatedly, and the amount of enzyme and the amount of electron transfer mediator can be reduced. For example, the enzyme functional electrode on which the enzyme is immobilized can be lifted from the sample solution, washed lightly, and measured again.
<Second Embodiment>
FIG. 3 is a schematic view showing an enzyme functional electrode according to the second embodiment. On the solid electrode 1, a first layer 22 made of POD and an electron transfer mediator is formed, and a second layer 24 made of CHOD and CHER is formed so as to cover the first layer 22. The POD and the electron transfer mediator in the first layer 22 and the CHOD and CHER in the second layer 24 are bonded by the polymer 15 and the crosslinking agent 17. Further, the first layer 22 and the second layer 24 are fixed mainly by a covalent bond via the crosslinking agent 17. Here, the CHOD and CHER of the second layer 24 may be bonded only by the crosslinking agent 17. As in the first embodiment, this enzyme functional electrode is immersed in a sample solution 3 containing cholesterol and / or cholesterol ester to be quantified, and cholesterol is quantified. Similarly, a surfactant is included in the sample solution 3 in order to increase the contact probability between cholesterol ester and cholesterol esterase. A surfactant may be supported on the enzyme functional electrode.

第１層２２と第２層２４とを別々の層に固定することで、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータを電極に固定するためのポリマーとＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを電極に固定するためのポリマーとを別々のポリマーとすることができる。例えば、ＰＯＤ及び電子伝達メディエータを固定するために最適なポリマーとＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを固定するために最適なポリマーとが異なる場合であっても、それぞれの酵素に対して最適なポリマーを用いてそれぞれの酵素を固定することができる。
さらに、第２実施形態例の酵素機能電極では、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層２４が酵素機能電極の最表面に形成されているため、試料溶液３中のコレステロールまたはコレステロールエステルとの接触確率が高くなり反応が生じやすい。また、電子伝達メディエータ及びＰＯＤからなる第１層２２を固体電極１側の最表面に固定することで、電子伝達メディエータとＰＯＤとが凝集する。よって、電子伝達メディエータとＰＯＤとの間の反応性が高まり、かつ電子伝達メディエータと固体電極１との電極反応が高まる。よって、固体電極１において即時に電流を測定することができる。さらに、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが同一層に位置するように固体電極１に固定されているため、コレステロールエステラーゼにより分解されて生じたコレステロールが、コレステロールオキシダーゼにより即時に分解されやすい。これは、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼ間の距離が短いため、コレステロールエステラーゼからコレステロールオキシダーゼへのコレステロールの移動距離が短いためである。また、物質移動速度の観点から、コレステロールの移動速度がＨ2Ｏ2の移動速度よりも小さい場合、前述のようにＣＨＯＤ及びＣＨＥＲを酵素機能電極の最表面に固定すると、高い応答電流を得ることができる。これは、コレステロールが第１層２２及び第２層２４を移動するよりも、酵素機能電極の最表面に固定したＣＨＯＤ及びＣＨＥＲによりコレステロールをＨ2Ｏ2に変えてから第１層２２及び第２層２４中を移動させたほうが、移動速度が速いためである。 By fixing the first layer 22 and the second layer 24 to different layers, the polymer for fixing the POD and the electron transfer mediator to the electrode and the polymer for fixing the CHOD and CHER to the electrode are different polymers. It can be. For example, even if the optimal polymer for immobilizing POD and electron transfer mediator is different from the optimal polymer for immobilizing CHOD and CHER, the optimal polymer for each enzyme is used. Enzymes can be immobilized.
Furthermore, in the enzyme functional electrode of the second embodiment, since the second layer 24 made of CHOD and CHER is formed on the outermost surface of the enzyme functional electrode, the contact probability with cholesterol or cholesterol ester in the sample solution 3 is high. It becomes high and reaction is likely to occur. Further, by fixing the first layer 22 made of the electron transfer mediator and the POD to the outermost surface on the solid electrode 1 side, the electron transfer mediator and the POD are aggregated. Therefore, the reactivity between the electron transfer mediator and the POD increases, and the electrode reaction between the electron transfer mediator and the solid electrode 1 increases. Therefore, the current can be measured immediately in the solid electrode 1. Furthermore, since CHOD and CHER are fixed to the solid electrode 1 so as to be located in the same layer, cholesterol generated by being decomposed by cholesterol esterase tends to be immediately decomposed by cholesterol oxidase. This is because the distance of cholesterol transfer from cholesterol esterase to cholesterol oxidase is short because the distance between cholesterol oxidase and cholesterol esterase is short. In addition, from the viewpoint of mass transfer rate, when the transfer rate of cholesterol is smaller than the transfer rate of H 2 O 2 , a high response current can be obtained by fixing CHOD and CHER to the outermost surface of the enzyme functional electrode as described above. Can do. Rather than moving cholesterol through the first layer 22 and the second layer 24, the cholesterol is changed to H 2 O 2 by CHOD and CHER immobilized on the outermost surface of the enzyme functional electrode, and then the first layer 22 and the second layer 2 are changed. This is because the movement speed is faster when the layer 24 is moved.

また、固体電極を覆うように層状に電子伝達メディエータ、各酵素を固定する方法としては、例えば図４〜図６の模式図に示すような固定方法もある。図４では、固体電極１上に電子伝達メディエータからなる第１層２６が結合され、第１層２６を覆うようにＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが混在した第２層２７が結合されている。図５では、固体電極１上に電子伝達メディエータからなる第１層３０が結合され、第１層３０を覆うようにＰＯＤからなる第２層３１が結合され、さらに第２層３１を覆うようにＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが混在した第３層３２が結合されている。図６では、固体電極１上に電子伝達メディエータからなる第１層３３が結合され、第１層３３を覆うようにＰＯＤからなる第２層３４が結合され、第２層３４を覆うようにＣＨＯＤ第３層３５が結合され、さらに第３層３５を覆うようにＣＨＥＲからなる第４層３６が結合されている。
＜第３実施形態例＞
図７は、第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図である。固体電極１には、ＰＯＤと電子伝達メディエータからなる第１層３７が形成され、第１層３７を覆うように隔膜３８が設けられている。隔膜３８の上にはＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層３９が形成されている。第１層３７のＰＯＤ及び電子伝達メディエータ間は、ポリマー１５及び架橋剤１７により結合されている。第２層３９のＣＨＯＤ及びＣＨＥＲ間は、架橋剤１７により結合されている。また、第１層３７及び隔膜３８の間、第２層３９及び隔膜３８の間は、主に架橋剤１７を介した共有結合により固定されている。 Moreover, as a method of fixing the electron transfer mediator and each enzyme in a layer so as to cover the solid electrode, there is also a fixing method as shown in the schematic diagrams of FIGS. In FIG. 4, a first layer 26 made of an electron transfer mediator is bonded onto the solid electrode 1, and a second layer 27 in which POD, CHOD, and CHER are mixed is bonded so as to cover the first layer 26. In FIG. 5, a first layer 30 made of an electron transfer mediator is bonded onto the solid electrode 1, a second layer 31 made of POD is bonded so as to cover the first layer 30, and further the second layer 31 is covered. The third layer 32 in which CHOD and CHER are mixed is coupled. In FIG. 6, a first layer 33 made of an electron transfer mediator is bonded onto the solid electrode 1, a second layer 34 made of POD is bonded so as to cover the first layer 33, and CHOD is covered so as to cover the second layer 34. A third layer 35 is bonded, and a fourth layer 36 made of CHER is bonded so as to cover the third layer 35.
<Third Embodiment>
FIG. 7 is a schematic view showing an enzyme functional electrode according to the second embodiment. The solid electrode 1 is formed with a first layer 37 made of POD and an electron transfer mediator, and a diaphragm 38 is provided so as to cover the first layer 37. A second layer 39 made of CHOD and CHER is formed on the diaphragm 38. The POD and the electron transfer mediator of the first layer 37 are bonded by the polymer 15 and the crosslinking agent 17. The CHOD and CHER of the second layer 39 are bonded by the crosslinking agent 17. Further, the space between the first layer 37 and the diaphragm 38 and the space between the second layer 39 and the diaphragm 38 are fixed mainly by a covalent bond via the crosslinking agent 17.

ここで、隔膜３８は、固体電極１及び電子伝達メディエータ間の電極反応により生じる電流の電流値を増加または減少させる妨害物質が固体電極１に到達するのを防ぐ。つまり、コレステロール濃度に応じて電子伝達メディエータと固体電極１との間に生じる固体電極１における電流の電流値が、妨害物質が固体電極１で生じる酸化電流または還元電流により誤差を受けるのを隔膜３８が防ぐ。隔膜３８としては、妨害物質を固体電極１側へ通さないが、過酸化水素は固体電極１側に通す隔膜や、マイナスまたはプラスに帯電した妨害物質を静電気的に固体電極１に近づけない隔膜が挙げられる。妨害物質を通さない隔膜３８としては、例えばポリイオンコンプレックス膜がある。また、静電気的に妨害物質を固体電極１に近づけない隔膜３８としては、例えばアニオン性またはカチオン性の隔膜がある。また、このような電流値に誤差を生じさせる妨害物質としては、例えば尿酸、アスコルビン酸及びアセトアミノフェン等がある。   Here, the diaphragm 38 prevents the interfering substance that increases or decreases the current value of the current generated by the electrode reaction between the solid electrode 1 and the electron transfer mediator from reaching the solid electrode 1. That is, the current value of the current in the solid electrode 1 generated between the electron transfer mediator and the solid electrode 1 in accordance with the cholesterol concentration is affected by the diaphragm 38 receiving an error due to the oxidation current or the reduction current generated in the solid electrode 1. Prevent. As the diaphragm 38, there is a diaphragm that does not pass the interfering substance to the solid electrode 1 side, but hydrogen peroxide passes the solid electrode 1 side, or a diaphragm that does not allow the negatively or positively charged interfering substance to approach the solid electrode 1 electrostatically. Can be mentioned. An example of the diaphragm 38 that does not allow the interfering substance to pass is a polyion complex film. Examples of the diaphragm 38 that prevents electrostatic interference from approaching the solid electrode 1 include an anionic or cationic diaphragm. Examples of interfering substances that cause an error in the current value include uric acid, ascorbic acid, and acetaminophen.

この酵素機能電極を、第１実施形態例と同様に、定量対象であるコレステロール及び／またはコレステロールエステルとを含む試料溶液に浸漬し、コレステロールの定量を行う。また同様に、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼとの接触確率を高めるために、界面活性剤が試料溶液中に含まれている。界面活性剤を酵素機能電極に担持するようにしても良い。
このような第２実施形態例に係る酵素機能電極は、例えば次のように作製される。直径３ｍｍのグラッシーカーボンからなる固体電極１上において、ＰＯＤ＝０．８ユニット及び電子伝達メディエータ結合ポリマーとしてＦｃ−ＰＡＡ＝０．８ｍｇを混合して乾燥する。その上に、隔膜３８として４０ｍｇ／ｍｌのポリアリルアミン５μｌを滴下して乾燥させることによりポリアリルアミンからなるカチオン性膜を形成する。さらに、隔膜３８上にＣＨＯＤ＝０．２ユニット、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット及びＰＥＧＤＥ＝１０μｇを滴下して乾燥して、上記酵素機能電極を作製する。上記の隔膜３８としては、４０ｍｇ／ｍｌのポリビニルスルホン酸５μｌを滴下して乾燥させたポリビニルスルホン酸からなるアニオン性膜、あるいは４０ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン５μｌ及び４０ｍｇ／ｍｌのポリビニルスルホン酸５μｌを滴下して乾燥したポリ−Ｌ−リジンとポリビニルスルホン酸のポリイオンコンプレックス膜を用いることができる。 As in the first embodiment, this enzyme functional electrode is immersed in a sample solution containing cholesterol and / or cholesterol ester to be quantified, and cholesterol is quantified. Similarly, a surfactant is included in the sample solution in order to increase the contact probability between cholesterol ester and cholesterol esterase. A surfactant may be supported on the enzyme functional electrode.
Such an enzyme functional electrode according to the second embodiment is produced, for example, as follows. On the solid electrode 1 made of glassy carbon having a diameter of 3 mm, POD = 0.8 unit and Fc-PAA = 0.8 mg as an electron transfer mediator binding polymer are mixed and dried. On top of that, 5 μl of 40 mg / ml polyallylamine is dropped as a diaphragm 38 and dried to form a cationic membrane made of polyallylamine. Further, CHOD = 0.2 unit, CHER = 0.2 unit and PEGDE = 10 μg are dropped on the diaphragm 38 and dried to prepare the enzyme functional electrode. The diaphragm 38 may be an anionic membrane made of polyvinyl sulfonic acid obtained by dripping and drying 5 μl of 40 mg / ml polyvinyl sulfonic acid, or 5 μl of 40 mg / ml poly-L-lysine and 40 mg / ml polyvinyl sulfonic acid. A polyion complex membrane of poly-L-lysine and polyvinyl sulfonic acid, which is dried by dropping 5 μl, can be used.

第３実施形態例に係る酵素機能電極では、第１及び第２実施形態例の酵素機能電極にさらに隔膜３８が設けられている。この隔膜３８により、固体電極１及び電子伝達メディエータ間の電極反応において生じる電流の電流値に誤差を生じさせる妨害物質を阻害することができるので、応答電流の誤差を低減することができる。よって、さらに正確にコレステロール濃度を定量することができる。
また、隔膜３８は、前記図４〜図６に示す各層の間、例えば固体電極１と第１層２６との間、第１層２６と第２層２７との間のいずれにも設けることができる。ただし、図７に示すように、図７の第１層３７と第２層３９との間に設けるようにすると好ましい。これは、妨害物質の影響を防止できる上に、分子集合体であるミセルとして存在するコレステロールが隔膜３８を通過せずにＣＨＯＤに接触できるからである。また、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層３９が酵素機能電極の最表面に形成されているため、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲと試料溶液３中のコレステロールまたはコレステロールエステルとの接触確率が向上するからである。また、電子伝達メディエータは、固体電極１と電子の授受を行うため、固体電極１の近傍にいることが望ましいからである。さらに、物質移動速度の観点からコレステロールをＨ2Ｏ2変えてから第１層３７及び第２層３９を移動させた方が良いからである。
＜実験例１＞
再び図１を用いて実験例１を説明する。実験例１に係るコレステロールセンサの固体電極部は以下の構成から成る。固体電極１は直径３ｍｍのグラッシーカーボンであり、固体電極１にＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが固定されている。ＰＯＤ、ＣＨＯＤ、ＣＨＥＲが、電子伝達メディエータがフェロセンであり、ポリマー１５がポリアリルアミンであるフェロセン結合ポリアリルアミン（Ｆｃ−ＰＡＡ）及び架橋剤１７であるPoly（ethylene glycol）diglycidyl ether（ＰＥＧＤＥ）により架橋されて固定されている。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。 In the enzyme functional electrode according to the third embodiment, a diaphragm 38 is further provided in the enzyme functional electrode of the first and second embodiments. Since the diaphragm 38 can inhibit a disturbing substance that causes an error in the current value of the current generated in the electrode reaction between the solid electrode 1 and the electron transfer mediator, the error in the response current can be reduced. Therefore, the cholesterol concentration can be quantified more accurately.
The diaphragm 38 is provided between the layers shown in FIGS. 4 to 6, for example, between the solid electrode 1 and the first layer 26 and between the first layer 26 and the second layer 27. it can. However, as shown in FIG. 7, it is preferable to provide between the first layer 37 and the second layer 39 of FIG. This is because the influence of interfering substances can be prevented, and cholesterol present as micelles that are molecular aggregates can contact CHOD without passing through the diaphragm 38. In addition, since the second layer 39 made of CHOD and CHER is formed on the outermost surface of the enzyme functional electrode, the contact probability between CHOD and CHER and cholesterol or cholesterol ester in the sample solution 3 is improved. In addition, the electron transfer mediator is preferably in the vicinity of the solid electrode 1 in order to exchange electrons with the solid electrode 1. Furthermore, it is better to move the first layer 37 and the second layer 39 after changing the cholesterol to H 2 O 2 from the viewpoint of mass transfer speed.
<Experimental example 1>
Experimental example 1 will be described with reference to FIG. 1 again. The solid electrode part of the cholesterol sensor according to Experimental Example 1 has the following configuration. The solid electrode 1 is glassy carbon having a diameter of 3 mm, and POD, CHOD, and CHER are fixed to the solid electrode 1. POD, CHOD, and CHER are crosslinked by ferrocene as the electron transfer mediator, ferrocene-linked polyallylamine (Fc-PAA) in which polymer 15 is polyallylamine, and poly (ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDE) as crosslinking agent 17. Is fixed. Each is fixed to the solid electrode 1 at the following optimum concentration.

ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝１６μｇ、ＰＥＧＤＥ＝１０μｇで調整されている。
図８は、実験例１に係るコレステロールセンサの系の一例を示す。攪拌子４０が入れられた恒温ガラスセル４２がスターラマシン４４上に載置されている。恒温ガラスセル４２には、電子伝達メディエータ、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが固体電極に固定された酵素機能電極４６、対極４８及び参照極５０が電極固定部５２により固定されている。酵素機能電極４６は、グラッシーカーボン電極、対極は白金線、参照極は銀／塩化銀電極で構成されている。これらの電極は、それぞれ定電位設定装置５４を介して測定された電流等を記録する記録装置５６に接続されている。恒温ガラスセル４２には、試料溶液６０を満たし、３７℃で攪拌子４０により２０００ｒｐｍで攪拌した。試料溶液６０としては、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）および所定濃度のコレステロールまたはコレステロールエステルを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。 POD = 0.8 unit, CHOD = 0.2 unit, Fc-PAA = 16 μg, PEGDE = 10 μg.
FIG. 8 shows an example of a cholesterol sensor system according to Experimental Example 1. A constant temperature glass cell 42 in which a stirrer 40 is placed is placed on a stirrer machine 44. In the constant temperature glass cell 42, an enzyme functional electrode 46, a counter electrode 48, and a reference electrode 50 in which an electron transfer mediator, POD, CHOD, and CHER are fixed to a solid electrode are fixed by an electrode fixing portion 52. The enzyme functional electrode 46 is a glassy carbon electrode, the counter electrode is a platinum wire, and the reference electrode is a silver / silver chloride electrode. Each of these electrodes is connected to a recording device 56 that records the current measured through the constant potential setting device 54. The constant temperature glass cell 42 was filled with the sample solution 60 and stirred at 37 ° C. with a stirrer 40 at 2000 rpm. As the sample solution 60, a buffer solution (pH 7.0) of 0.1M Tris hydrochloride containing 1% Triton (registered trademark) and a predetermined concentration of cholesterol or cholesterol ester was used.

前述のコレステロールセンサを用いて次のように定量を行った。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位を印加した。このとき、ＣＨＥＲは、試料溶液６０中のコレステロールエステルがコレステロールに分解される反応を触媒する。分解後のコレステロール及び既に試料溶液６０中に存在するコレステロールは、ＣＨＯＤの触媒反応によりコレステノンに酸化される。この反応で、Ｏ2がＨ2Ｏ2に還元される。次に、ペルオキシダーゼが、生成されたＨ2Ｏ2の水への還元反応を触媒する。この反応で電子伝達メディエータであるフェロセンが酸化され、フェリシニウムイオンが生成される。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位が印加されているため、フェリシニウムイオンは、酵素機能電極４６から電子を受け取りフェロセンに還元される。酵素機能電極４６での還元電流を測定することにより、試料溶液中のコレステロール濃度を測定した。 Quantification was performed as follows using the cholesterol sensor described above. A potential of 0 mV was applied to the enzyme functional electrode 46 with respect to the reference electrode 50. At this time, CHER catalyzes a reaction in which the cholesterol ester in the sample solution 60 is decomposed into cholesterol. Cholesterol after decomposition and cholesterol already present in the sample solution 60 are oxidized to cholestenone by the catalytic reaction of CHOD. In this reaction, O 2 is reduced to H 2 O 2 . Next, peroxidase catalyzes the reduction reaction of the produced H 2 O 2 to water. In this reaction, ferrocene, which is an electron transfer mediator, is oxidized and ferricinium ions are generated. Since a potential of 0 mV is applied to the enzyme functional electrode 46 with respect to the reference electrode 50, ferricinium ions receive electrons from the enzyme functional electrode 46 and are reduced to ferrocene. The cholesterol concentration in the sample solution was measured by measuring the reduction current at the enzyme functional electrode 46.

実験例１における測定結果を図９及び図１０に示す。図９は、酵素機能電極４６において測定された還元電流の変化量とコレステロール濃度との関係図、図１０は、酵素機能電極４６において測定された還元電流の変化量とコレステロールエステル濃度との関係図である。図９及び図１０より、還元電流の変化量とコレステロール濃度及びコレステロールエステル濃度は、良好な比例関係を示した。よって、実験例１のコレステロールセンサでは、コレステロール及びコレステロールエステルを正確に定量できた。
＜実験例２＞
実験例２では、以下の３種類の酵素機能電極を有するコレステロールセンサを作製し、各コレステロールセンサの応答電流を測定した。以下に、３種類の酵素機能電極Ａ〜Ｃを示す。
１）酵素機能電極Ａ
前記図１に示す、フェロセン、ＰＯＤ、ＣＨＯＤ及びＣＨＥＲが混在した層を固体電極１に固定した酵素機能電極を作製した。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。 The measurement results in Experimental Example 1 are shown in FIGS. FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the amount of change in the reduction current measured at the enzyme functional electrode 46 and the cholesterol concentration. FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the amount of change in the reduction current measured at the enzyme function electrode 46 and the cholesterol ester concentration. It is. From FIG. 9 and FIG. 10, the change amount of the reduction current, the cholesterol concentration, and the cholesterol ester concentration showed a good proportional relationship. Therefore, in the cholesterol sensor of Experimental Example 1, cholesterol and cholesterol ester could be accurately quantified.
<Experimental example 2>
In Experimental Example 2, a cholesterol sensor having the following three types of enzyme functional electrodes was prepared, and the response current of each cholesterol sensor was measured. Three types of enzyme functional electrodes A to C are shown below.
1) Enzyme functional electrode A
An enzyme functional electrode in which the layer containing ferrocene, POD, CHOD and CHER shown in FIG. Each is fixed to the solid electrode 1 at the following optimum concentration.

ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝０．４ｍｇ、ＰＥＧＤＥ＝２０μｇを混合・乾燥して作製。
２）酵素機能電極Ｂ
フェロセン、ＰＯＤ及びＣＨＯＤが混在した第１層を固体電極１上に形成し、第１層の上にＣＨＥＲからなる第２層を固定して酵素機能電極を作製した。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。
ＰＯＤ＝０．８ユニット、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝０．４ｍｇを混合・乾燥した後、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット、ＰＥＧＤＥ＝２０μｇを混合・乾燥して作製。
３）酵素機能電極Ｃ
前記図３に示す、フェロセン及びＰＯＤが混在した第１層を固体電極１上に形成し、第１層の上にＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層を固定して酵素機能電極を作製した。それぞれ以下の最適の濃度により固体電極１に固定されている。 Prepared by mixing and drying POD = 0.8 units, CHOD = 0.2 units, CHER = 0.2 units, Fc-PAA = 0.4 mg, PEGDE = 20 μg.
2) Enzyme functional electrode B
A first layer containing ferrocene, POD, and CHOD was formed on the solid electrode 1, and a second layer made of CHER was fixed on the first layer to produce an enzyme functional electrode. Each is fixed to the solid electrode 1 at the following optimum concentration.
POD = 0.8 unit, CHOD = 0.2 unit, Fc-PAA = 0.4 mg mixed and dried, then CHER = 0.2 unit, PEGDE = 20 μg mixed and dried.
3) Enzyme functional electrode C
A first layer mixed with ferrocene and POD as shown in FIG. 3 was formed on the solid electrode 1, and a second layer made of CHOD and CHER was fixed on the first layer to produce an enzyme functional electrode. Each is fixed to the solid electrode 1 at the following optimum concentration.

ＰＯＤ＝０．８ユニット、Ｆｃ−ＰＡＡ＝０．４ｍｇを混合・乾燥した後、ＣＨＯＤ＝０．２ユニット、ＣＨＥＲ＝０．２ユニット、ＰＥＧＤＥ＝２０μｇを混合・乾燥して作製。
酵素機能電極Ａ〜Ｃを有するコレステロールセンサを用い、実験例１と同様に前記図８の系により応答電流を測定した。試料溶液６０としては、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、２％イソプロパノール及び１４ｍＭコール酸ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸塩の緩衝水溶液（ｐＨ７．０）を用いた。この試料溶液６０に、前述の酵素機能電極４６を有するコレステロールセンサを浸漬し、攪拌子４０で攪拌しながら定常電流が得られたところでコレステロールエステル溶液を添加して反応を開始した。そして、反応前の定常電流値と反応後の定常電流値との差を応答電流として読みとった。酵素機能電極４６には、参照極５０に対して０ｍＶの電位を印加した。 POD = 0.8 unit, Fc-PAA = 0.4 mg mixed and dried, then CHOD = 0.2 unit, CHER = 0.2 unit, PEGDE = 20 μg mixed and dried.
Using a cholesterol sensor having enzyme functional electrodes A to C, the response current was measured by the system of FIG. As the sample solution 60, a buffered aqueous solution of 0.1 M Tris hydrochloride (pH 7.0) containing 1% Triton (registered trademark), 2% isopropanol and 14 mM sodium cholate was used. The cholesterol sensor having the enzyme functional electrode 46 was immersed in the sample solution 60, and when a steady current was obtained while stirring with the stirrer 40, the cholesterol ester solution was added to start the reaction. Then, the difference between the steady current value before reaction and the steady current value after reaction was read as a response current. A potential of 0 mV was applied to the enzyme functional electrode 46 with respect to the reference electrode 50.

図１１は、コレステロールエステル濃度に対する応答電流の測定結果である。コレステロールエステル濃度に対する応答電流の大きさは、酵素機能電極Ｃ＞酵素機能電極Ａ＞酵素機能電極Ｂであった。よって、酵素機能電極としては、フェロセン及びＰＯＤが混在した第１層を固体電極１上に形成し、第１層の上にＣＨＯＤ及びＣＨＥＲからなる第２層を固定した酵素機能電極Ｃが最適であることが分かった。
これは、物質移動速度の観点から説明できる。すなわち、コレステロールエステルおよびコレステロールは分子の大きさが比較的大きいため、固体電極上に固定された酵素を含む層の中における移動速度が遅い。また、酸素が還元された過酸化水素の分子は比較的小さく移動速度が速いことを考慮すると、コレステロールの移動距離が小さい、つまり、ＣＨＥＲとＣＨＯＤとの間の距離が小さいほど応答電流は大きくなる。各酵素機能電極について考察すると次のようになる。酵素機能電極Ｃでは、ＣＨＥＲ及びＣＨＯＤがコレステロールセンサの最表面、つまり試料溶液６０からの距離が近い位置に固定されており、かつ同一層に固定されているため、ＣＨＥＲとＣＨＯＤとの間の距離が小さい。また、酵素機能電極Ａでは、ＣＨＥＲ及びＣＨＯＤとが同一層に固定されているので距離は小さいが、固体電極１の表面に固定されたＣＨＥＲまでコレステロールエステルが移動し難い。つまり、試料溶液６０に接しているコレステロールセンサの最表面からコレステロールセンサの深層にまでコレステロールエステルが移動しにくい。酵素機能電極ＢではＣＨＥＲ及びＣＨＯＤとが異なる層に位置しているため、ＣＨＥＲとＣＨＯＤとの間の距離が大きい。以上から、ＣＨＥＲ及びＣＨＯＤが試料溶液に近い位置に固定されており、かつＣＨＥＲ及びＣＨＯＤ間の距離が短い酵素機能電極Ｃが一番応答電流が大きいと分かった。 FIG. 11 shows measurement results of response current with respect to cholesterol ester concentration. The magnitude of the response current with respect to the cholesterol ester concentration was enzyme functional electrode C> enzyme functional electrode A> enzyme functional electrode B. Therefore, as the enzyme functional electrode, the enzyme functional electrode C in which the first layer mixed with ferrocene and POD is formed on the solid electrode 1 and the second layer made of CHOD and CHER is fixed on the first layer is optimal. I found out.
This can be explained in terms of mass transfer speed. That is, cholesterol ester and cholesterol have a relatively large molecular size, so that the moving speed in the layer containing the enzyme immobilized on the solid electrode is slow. In addition, considering that the hydrogen peroxide molecules in which oxygen is reduced are relatively small and have a high moving speed, the response current increases as the distance of cholesterol movement decreases, that is, the distance between CHER and CHOD decreases. . Each enzyme functional electrode is considered as follows. In the enzyme functional electrode C, CHER and CHOD are fixed at the outermost surface of the cholesterol sensor, that is, at a position where the distance from the sample solution 60 is close, and fixed in the same layer, so the distance between CHER and CHOD. Is small. In the enzyme functional electrode A, CHER and CHOD are fixed in the same layer, so the distance is small, but the cholesterol ester hardly moves to CHER fixed on the surface of the solid electrode 1. That is, the cholesterol ester hardly moves from the outermost surface of the cholesterol sensor in contact with the sample solution 60 to the deep layer of the cholesterol sensor. In the enzyme functional electrode B, since CHER and CHOD are located in different layers, the distance between CHER and CHOD is large. From the above, it was found that the CER and CHOD are fixed at positions close to the sample solution, and the enzyme functional electrode C having a short distance between the CHER and CHOD has the largest response current.

本発明を用いれば、正確にコレステロールが定量可能なコレステロールセンサを容易に製造することができる。   By using the present invention, a cholesterol sensor capable of accurately quantifying cholesterol can be easily produced.

第１実施形態例に係る酵素機能電極が試料溶液に浸漬されている様子を示す概略図。Schematic which shows a mode that the enzyme functional electrode which concerns on the example of 1st Embodiment is immersed in the sample solution. 第１実施形態例に係る酵素機能電極を有するコレステロールセンサを用いた場合の反応の様子を示す模式図。The schematic diagram which shows the mode of reaction at the time of using the cholesterol sensor which has the enzyme functional electrode which concerns on the example of 1st Embodiment. 第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図。Schematic which shows the enzyme function electrode which concerns on the example of 2nd Embodiment. 第２実施形態例に係る別の酵素機能電極を示す概略図（１）。Schematic (1) which shows another enzyme functional electrode which concerns on 2nd Embodiment. 第２実施形態例に係る別の酵素機能電極を示す概略図（２）。Schematic (2) which shows another enzyme functional electrode which concerns on the example of 2nd Embodiment. 第２実施形態例に係る別の酵素機能電極を示す概略図（３）。Schematic (3) which shows another enzyme functional electrode which concerns on the example of 2nd Embodiment. 第２実施形態例に係る酵素機能電極を示す概略図。Schematic which shows the enzyme function electrode which concerns on the example of 2nd Embodiment. 実験例１に係るコレステロールセンサの系の一例。An example of the system of the cholesterol sensor which concerns on Experimental example 1. FIG. 酵素機能電極において測定された還元電流の変化量とコレステロール濃度との関係図。The relationship figure of the variation | change_quantity of the reduction current measured in the enzyme functional electrode, and cholesterol concentration. 酵素機能電極において測定された還元電流の変化量とコレステロールエステル濃度との関係図。The relationship figure of the variation | change_quantity of the reduction current measured in the enzyme functional electrode, and cholesterol ester density | concentration. コレステロールエステル濃度に対する応答電流の測定結果。Measurement result of response current to cholesterol ester concentration.

符号の説明Explanation of symbols

１：固体電極
２：酵素層
３、６０：試料溶液
１５：ポリマー
１７：架橋剤
２２、２６、３０、３３、３７：第１層
２４、２７、３１、３４、３９：第２層
３２、３５：第３層
３６：第４層
３８：隔膜
４０：攪拌子
４２：恒温ガラスセル
４６：酵素機能電極
４８：対極
５０：参照極 1: Solid electrode
2: Enzyme layer
3, 60: Sample solution
15: Polymer
17: Crosslinker
22, 26, 30, 33, 37: First layer
24, 27, 31, 34, 39: Second layer
32, 35: Third layer
36: Fourth layer
38: Diaphragm
40: Stir bar
42: Constant temperature glass cell
46: Enzyme functional electrode
48: Counter electrode
50: Reference electrode

Claims (8)

試料溶液中のコレステロール濃度を定量する酵素機能電極であって、
固体電極と、
前記固体電極に固定された酵素層とを含み、
前記酵素層は、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、前記ペルオキシダーゼとの反応に応じて前記固体電極と反応する電子伝達メディエータとを有する酵素機能電極。 An enzyme functional electrode for quantifying cholesterol concentration in a sample solution,
A solid electrode;
An enzyme layer fixed to the solid electrode,
The enzyme functional electrode, wherein the enzyme layer includes cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase, and an electron transfer mediator that reacts with the solid electrode in response to a reaction with the peroxidase. 前記酵素層は、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜をさらに有する、請求項１に記載の酵素機能電極。   The enzyme functional electrode according to claim 1, wherein the enzyme layer further includes a diaphragm that inhibits an interfering substance that gives an error in a current value of a current generated by an electrode reaction between the solid electrode and the electron transfer mediator. 前記酵素層は、前記電子伝達メディエータ、ペルオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼを前記固体電極に固定するポリマーをさらに有する、請求項１に記載の酵素機能電極。   The enzyme functional electrode according to claim 1, wherein the enzyme layer further includes a polymer that fixes the electron transfer mediator, peroxidase, cholesterol oxidase, and cholesterol esterase to the solid electrode. 前記電子伝達メディエータはフェロセン誘導体であり、
前記ポリマーはポリアリルアミンまたはポリ−Ｌ−リジンである、請求項３に記載の酵素機能電極。 The electron transfer mediator is a ferrocene derivative,
The enzyme functional electrode according to claim 3, wherein the polymer is polyallylamine or poly-L-lysine. 前記酵素層は、前記ポリマーを架橋する架橋剤をさらに含み、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、スベリン酸（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、及びジメチルスベリミデートからなる群から選ばれる、請求項３に記載の酵素機能電極。 The enzyme layer further includes a cross-linking agent that cross-links the polymer,
The enzyme functional electrode according to claim 3, wherein the cross-linking agent is selected from the group consisting of glutaraldehyde, polyethylene glycol diglycidyl ether, suberic acid (N-hydroxysuccinimide ester), and dimethyl suberimidate. 前記酵素層において、前記固体電極を覆うように前記電子伝達メディエータ及びペルオキシダーゼからなる第１層が形成され、前記第１層を覆うようにコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼからなる第２層が形成されている、請求項１に記載の酵素機能電極。   In the enzyme layer, a first layer composed of the electron transfer mediator and peroxidase is formed so as to cover the solid electrode, and a second layer composed of cholesterol oxidase and cholesterol esterase is formed so as to cover the first layer. The enzyme functional electrode according to claim 1. 前記第１層と前記第２層との間に、前記固体電極と前記電子伝達メディエータとの間の電極反応により生じる電流の電流値に誤差を与える妨害物質を阻害する隔膜がさらに形成されている、請求項６に記載の酵素機能電極。   A diaphragm is formed between the first layer and the second layer to inhibit an interfering substance that gives an error in a current value of a current generated by an electrode reaction between the solid electrode and the electron transfer mediator. The enzyme functional electrode according to claim 6. 請求項１〜７に記載の酵素機能電極を有するコレステロールセンサ。
A cholesterol sensor having the enzyme functional electrode according to claim 1.
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