JP2005083784A - Laser desorption ionization mass spectrometry - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析技術、特にレーザー脱離イオン化質量分析法とそのサンプルの作成方法に関する。 The present invention relates to a mass spectrometry technique, in particular, a laser desorption ionization mass spectrometry method and a sample preparation method thereof.
二次元電気泳動などのクロマトグラフィーにより分離された生体分子等の解析方法として、レーザー脱離イオン化質量分析法（LDI-MS）の有用性が認められている。そして、対象サンプルの保存性、あるいはピエゾ素子等インクジェット技術を用いた微量分注・解析システムへの応用という観点から、対象物質をメンブレン上に固相化（ブロット）し、直接メンブレン上で解析する系が提唱されている（特表２００１−５２１６２３号公報またはMolecular & Cellular Proteomics (2002) vol. 1, pp. 490-499）。メンブレンとしては、ニトロセルロースやPVDF (ポリビニリデンジフルオリド)が主に用いられるが、量的及び質的なタンパク質保持性能の優位性からPVDFが好まれている。またPVDFメンブレンは、強い疎水性を示す特性を持つ点でも好まれている。 The usefulness of laser desorption ionization mass spectrometry (LDI-MS) is recognized as a method for analyzing biomolecules separated by chromatography such as two-dimensional electrophoresis. From the viewpoint of storage of the target sample or application to a micro-dispensing / analysis system using inkjet technology such as piezo elements, the target substance is solid-phased (blotted) on the membrane and analyzed directly on the membrane. A system has been proposed (Japanese Patent Publication No. 2001-521623 or Molecular & Cellular Proteomics (2002) vol. 1, pp. 490-499). Nitrocellulose and PVDF (polyvinylidene difluoride) are mainly used as the membrane, but PVDF is preferred because of its superior quantitative and qualitative protein retention performance. PVDF membranes are also preferred because of their strong hydrophobic properties.
上記メンブレン上における質量分析系においては、サンプルの大部分はメンブレンの内部に分布している。しかしながら、LDI-MSではレーザー照射されるのがメンブレン表面に限られるため、通常のMSプレート、すなわち金属プレート上での解析に比して検出感度は大きく減じていた。これと同様の問題がマトリックスを添加する場合（MALDI）にも生じていた。例えば、従来、MSプレートにサンプルを添加する際に用いられているマトリックス溶液は、通常５０体積％以上のアセトニトリル等の有機溶媒を含む組成を有する。この組成は、マトリクス溶液の乾燥が速くなることや、マトリックスやその他の溶質の溶解を助けることの利点を有する。しかしながら、メンブレンに添加したマトリックス溶液はメンブレン内部に浸透・拡散してしまうため、メンブレン表面に十分な結晶を形成させることが困難であった。 In the mass spectrometry system on the membrane, most of the sample is distributed inside the membrane. However, in LDI-MS, the laser irradiation is limited to the membrane surface, so the detection sensitivity is greatly reduced compared to analysis on a normal MS plate, that is, a metal plate. A similar problem occurred when adding a matrix (MALDI). For example, a matrix solution that is conventionally used when adding a sample to an MS plate usually has a composition containing 50% by volume or more of an organic solvent such as acetonitrile. This composition has the advantage of faster drying of the matrix solution and helping to dissolve the matrix and other solutes. However, since the matrix solution added to the membrane permeates and diffuses inside the membrane, it is difficult to form sufficient crystals on the membrane surface.
近年、MALDIに四重極イオントラップが組み合わされた装置が開発された。しかしこの場合、生成イオンの引き出しにかかる電位差が小さく、本来の測定位置である金属MSプレート面から空間的に距離を隔て、電気的に絶縁であるメンブレン表面からのイオン検出はさらに困難であった。このため、レーザー強度を大幅に上げて解析する方法が用いられてきたが、この方法はノイズの増大を招く問題がある。また、メンブレン内のサンプルをいったん抽出した上で金属プレートに移し変える方法も用いられてきたが、この方法は工程が煩雑になる問題がある。 In recent years, MALDI and quadrupole ion traps have been developed. However, in this case, the potential difference required to extract the generated ions is small, and it is more difficult to detect ions from the electrically insulating membrane surface at a spatial distance from the metal MS plate surface, which is the original measurement position. . For this reason, a method of analyzing by greatly increasing the laser intensity has been used, but this method has a problem of increasing noise. In addition, a method in which a sample in a membrane is once extracted and then transferred to a metal plate has been used, but this method has a problem that the process becomes complicated.
そこで本発明の目的は、サンプル液をメンブレンに滴下して直接メンブレン上で質量分析を行う場合に、滴下されたサンプル液のメンブレン内への過度な浸透・拡散を抑え、メンブレン表面上及び／又は表層の限局した領域に効率よくサンプルの結晶を形成させ、質量分析を行う方法を提供することにある。また本発明の目的は、上記ブロットサンプルのようにサンプルがメンブレン内に保持されている場合にも、保持されたサンプルをメンブレン表面上及び／又は表層にその局在を移動させることでその結晶を効率よく形成させ、質量分析を行う方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to suppress excessive permeation / diffusion of the dropped sample liquid into the membrane when the sample liquid is dropped directly on the membrane and mass spectrometry is performed directly on the membrane, and on the membrane surface and / or It is an object of the present invention to provide a method for performing mass spectrometry by efficiently forming a crystal of a sample in a limited area of a surface layer. Further, the object of the present invention is that even when a sample is held in a membrane like the above-described blot sample, the crystal is obtained by moving the held sample on the membrane surface and / or on the surface layer. An object of the present invention is to provide a method for efficiently performing formation and performing mass spectrometry.
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）疎水的性質を有するメンブレン上に、解析すべきサンプルを含み且つ前記メンブレンに対して非浸透性であるサンプル液を滴下し、前記メンブレンの表面上に前記サンプル液の液滴を存在させ、前記メンブレンの表面上において前記サンプル液を乾燥させることにより、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、レーザー脱離イオン化質量分析法。
（２）前記サンプル液が、有機溶媒を全く含まないか、又は２５体積％以下の有機溶媒を含む、前記（１）に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
（３）前記サンプル液の液滴が、前記メンブレンの表面上に隆起して存在している、前記（１）又は（２）に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
The present invention includes the following inventions.
(1) A sample solution containing a sample to be analyzed and impermeable to the membrane is dropped on a membrane having hydrophobic properties, and a droplet of the sample solution is allowed to exist on the surface of the membrane. The sample liquid is dried on the surface of the membrane to form crystals of the sample to be analyzed on the membrane surface and / or the surface layer, and the sample is analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry. Laser desorption ionization mass spectrometry.
(2) The laser desorption ionization mass spectrometry method according to (1), wherein the sample solution contains no organic solvent or contains 25% by volume or less of an organic solvent.
(3) The laser desorption ionization mass spectrometry method according to (1) or (2), wherein the droplets of the sample liquid are raised and exist on the surface of the membrane.
（４）前記サンプル液がさらにマトリックスを含み、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を前記マトリックスの結晶と共に形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
（５）前記サンプル液がさらに内部標準物質を含み、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を前記内部標準物質の結晶と共に形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
(4) The sample solution further includes a matrix, and crystals of the sample to be analyzed are formed on the membrane surface and / or on the surface layer together with the crystals of the matrix, and the sample is analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry. The laser desorption / ionization mass spectrometry method according to any one of (1) to (3).
(5) The sample solution further contains an internal standard substance, and the crystal of the sample to be analyzed is formed on the membrane surface and / or the surface layer together with the crystal of the internal standard substance, and the sample is analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry. The laser desorption ionization mass spectrometry method according to any one of (1) to (3), wherein the analysis is performed.
（６）前記サンプル液がさらにマトリックス及び内部標準物質を含み、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を前記マトリックス及び前記内部標準物質の結晶と共に形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
（７）前記サンプル液を滴下する前に、界面活性剤及び／又は有機溶媒を含む溶液によって前記メンブレンを処理しておく、前記（１）〜（６）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
(6) The sample solution further contains a matrix and an internal standard substance, and crystal of the sample to be analyzed is formed on the membrane surface and / or on the surface layer together with the matrix and the crystal of the internal standard substance, and laser desorption ionization is performed. The laser desorption ionization mass spectrometry method according to any one of (1) to (3), wherein the sample is analyzed by mass spectrometry.
(7) The laser desorption ionization according to any one of (1) to (6), wherein the membrane is treated with a solution containing a surfactant and / or an organic solvent before the sample solution is dropped. Mass spectrometry.
（８）疎水的性質を有し、解析すべきサンプルが保持されたメンブレンの上に、前記メンブレンに対して非浸透性である液体を滴下し、前記メンブレンの表面上に前記液体の液滴を存在させ、前記メンブレンの表面上において、前記メンブレンに保持された前記解析すべきサンプルを前記液体中に抽出しながら前記液体を乾燥させることにより、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、レーザー脱離イオン化質量分析法。
（９）前記液体が、有機溶媒を全く含まないか、又は２５体積％以下の有機溶媒を含む、前記（８）に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
(8) A liquid having hydrophobic properties and impermeable to the membrane is dropped on the membrane holding the sample to be analyzed, and the liquid droplet is dropped on the surface of the membrane. The analysis should be performed on the surface of the membrane and / or on the surface layer by drying the liquid while extracting the sample to be analyzed held in the membrane into the liquid on the surface of the membrane. Laser desorption ionization mass spectrometry, in which a sample crystal is formed and the sample is analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry.
(9) The laser desorption / ionization mass spectrometry method according to (8), wherein the liquid contains no organic solvent or contains 25% by volume or less of an organic solvent.
（１０）前記液体の液滴が、前記メンブレンの表面上に隆起して存在している、前記（８）又は（９）に記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
（１１）前記液体がマトリックスを含み、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を前記マトリックスの結晶とともに形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
（１２）前記液体が内部標準物質を含み、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を前記内部標準物質の結晶と共に形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
(10) The laser desorption / ionization mass spectrometry method according to (8) or (9), wherein the liquid droplet is raised on the surface of the membrane.
(11) The liquid contains a matrix, the crystal of the sample to be analyzed is formed on the membrane surface and / or on the surface layer together with the crystal of the matrix, and the sample is analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry, The laser desorption ionization mass spectrometry method according to any one of (8) to (10).
(12) The liquid contains an internal standard substance, the crystal of the sample to be analyzed is formed on the membrane surface and / or the surface layer together with the crystal of the internal standard substance, and the sample is analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry. The laser desorption ionization mass spectrometry method according to any one of (8) to (10), wherein:
（１３）前記液体がマトリックス及び内部標準物質を含み、前記メンブレン表面上及び／又は表層に前記解析すべきサンプルの結晶を前記マトリックス及び前記内部標準物質の結晶と共に形成させ、レーザー脱離イオン化質量分析によって前記サンプルの解析を行う、前記（８）〜（１０）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
（１４）前記液体を滴下する前に、界面活性剤及び／又は有機溶媒を含む溶液によって前記メンブレンを処理しておく、前記（８）〜（１３）のいずれかに記載のレーザー脱離イオン化質量分析法。
(13) The liquid contains a matrix and an internal standard substance, and crystal of the sample to be analyzed is formed on the surface of the membrane and / or on the surface layer together with the crystal of the matrix and the internal standard substance, and laser desorption ionization mass spectrometry The laser desorption / ionization mass spectrometry method according to any one of (8) to (10), wherein the sample is analyzed by:
(14) The laser desorption ionization mass according to any one of (8) to (13), wherein the membrane is treated with a solution containing a surfactant and / or an organic solvent before the liquid is dropped. Analytical method.
本発明によると、サンプル液をメンブレンに滴下して直接メンブレン上で質量分析を行う場合に、滴下されたサンプル液のメンブレン内への過度な浸透・拡散を抑え、メンブレン表面上及び／又は表層の限局した領域に効率よくサンプルの結晶を形成させ、質量分析を行う方法を提供することができる。また本発明によると、サンプルがメンブレン内に保持されている場合にも、保持されたサンプルをメンブレン表面上及び／又は表層にその局在を移動させることでその結晶を効率よく形成させ、質量分析を行う方法を提供することができる。 According to the present invention, when a sample solution is dropped on the membrane and mass spectrometry is performed directly on the membrane, excessive penetration and diffusion of the dropped sample solution into the membrane is suppressed, and the surface of the membrane and / or the surface layer is suppressed. It is possible to provide a method for efficiently forming a crystal of a sample in a limited region and performing mass spectrometry. Further, according to the present invention, even when the sample is held in the membrane, the crystals are efficiently formed by moving the location of the held sample on the membrane surface and / or the surface layer, and mass spectrometry is performed. Can provide a way to do this.
本発明は、メンブレンの表面上及び／又は表層に解析すべきサンプルの結晶を形成させ、形成した結晶をメンブレン上で直接質量分析することによって、効率よくサンプルを質量分析する方法である。本発明においては、サンプル及び場合によりマトリックスなどを含む、メンブレンに対して非浸透性のサンプル液をメンブレン上に滴下してサンプルの結晶を形成させる方法と、サンプルを保持したメンブレン上に、場合によりマトリックスなどを含む、メンブレンに対して非浸透性の液体を滴下してサンプルの結晶を形成させる方法とを含む。 The present invention is a method for efficiently mass-analyzing a sample by forming a crystal of a sample to be analyzed on the surface and / or surface layer of the membrane and directly performing mass analysis on the formed crystal on the membrane. In the present invention, a method of forming a sample crystal by dropping a non-permeable sample solution containing a sample and optionally a matrix on the membrane, and a membrane holding the sample, depending on circumstances. And a method of forming a crystal of a sample by dropping a liquid that is impermeable to a membrane, including a matrix and the like.
本発明においては、前記サンプル及び前記液体が非浸透性であるため、それらは滴下後、メンブレンの表面上で液滴として存在している。すなわち、液滴はメンブレン表面上において、液滴の液相と気相との界面が表面張力により曲面を形成する状態で存在している。例えば、液滴はメンブレン表面上で隆起して存在している。そして、液滴として存在する状態を保持しながら液滴が乾燥することにより、メンブレンの表面上及び／又は表層にサンプルの結晶が形成する。ここでメンブレンの表層とは、メンブレンの表面近傍の層をいう。 In the present invention, since the sample and the liquid are impermeable, they are present as droplets on the surface of the membrane after dropping. That is, the droplet exists on the membrane surface in a state where the interface between the liquid phase and the gas phase of the droplet forms a curved surface due to surface tension. For example, the droplets are raised on the membrane surface. And a crystal | crystallization of a sample forms on the surface and / or surface layer of a membrane by drying a droplet, maintaining the state which exists as a droplet. Here, the surface layer of the membrane refers to a layer near the surface of the membrane.
サンプル固相担体としてのメンブレンは、疎水的性質を有するものを用いる。強疎水性（撥水性）を示すメンブレンであればより好ましい。このようなメンブレンとしては、例えば、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）、ポリプロピレンなどが挙げられる。このようなメンブレンを用いることによって、メンブレン上に滴下された液滴がメンブレン内に過度に浸透することを抑制することができる。 A membrane having a hydrophobic property is used as a sample solid phase carrier. A membrane exhibiting strong hydrophobicity (water repellency) is more preferable. Examples of such a membrane include PVDF (polyvinylidene difluoride) and polypropylene. By using such a membrane, it is possible to prevent the liquid droplets dropped on the membrane from penetrating excessively into the membrane.
まず、サンプル液をメンブレン上に滴下しサンプルの結晶を形成させる方法について説明する。サンプル液には、解析すべきサンプル、及び場合によりマトリックス及び／又は内部標準物質が含まれる。解析すべきサンプルの量は、例えばサンプル液全体に対して２×１０-6〜１重量％の濃度で使用することができる。 First, a method for dropping a sample solution onto a membrane to form a sample crystal will be described. The sample solution includes a sample to be analyzed, and optionally a matrix and / or an internal standard. The amount of the sample to be analyzed can be used, for example, at a concentration of 2 × 10 −6 to 1% by weight with respect to the entire sample solution.
マトリックスとしては、通常のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法に用いられるイオン化剤を、特に限定することなく用いることができる。例えば、ニコチン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸などが挙げられる。マトリックスの量としては、例えば重量基準でサンプルの１〜１００万倍程度使用することができる。これらの量は、当業者が適宜決定することができる。 As the matrix, an ionizing agent used in a normal matrix-assisted laser desorption / ionization method can be used without any particular limitation. For example, nicotinic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid and the like can be mentioned. As a quantity of a matrix, it can be used about 1 to 1 million times of a sample on a weight basis, for example. These amounts can be appropriately determined by those skilled in the art.
内部標準物質としては、質量分析においてキャリブレーションとして用いられるものが特に限定することなく用いられる。内部標準物質の量としては、例えばサンプル液全体に対して１０〜１００ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で使用することができる。 As the internal standard substance, those used as calibration in mass spectrometry are used without particular limitation. As the amount of the internal standard substance, for example, it can be used at a concentration of 10 to 100 pmol / ml with respect to the whole sample solution.
このようなサンプル液は、非浸透性、すなわち、メンブレンに対する浸透性をほぼ抑制することができるような組成に調製する必要がある。例えば、有機溶媒を全く含まないか、又はサンプル液全体に対して２５体積％以下、好ましくは１０〜２０体積％の有機溶媒含量となるように調製する必要がある。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。 Such a sample liquid needs to be prepared to have a composition that is non-permeable, that is, can substantially suppress the permeability to the membrane. For example, it is necessary to prepare such that it does not contain any organic solvent or has an organic solvent content of 25% by volume or less, preferably 10 to 20% by volume, based on the entire sample solution. Examples of the organic solvent include acetonitrile, methanol, isopropanol, butanol and the like.
上記範囲の量の有機溶媒を含むことは、メンブレン表面上の液滴の表面張力を適度に減じ、メンブレン表面と液滴との接面積すなわち湿潤領域を適度に確保する効果、液滴中の溶媒成分の除去を助ける効果、或いはマトリックスの溶解を助ける効果などを有する点で好ましい。また、有機溶媒を全く含まなくとも、上記範囲の有機溶媒を含んでいても、メンブレン表面上及び／又は表層に十分な結晶を形成することができる点では同様の効果を有する。一方、有機溶媒の量が２５体積％を超えると、メンブレンに対する親和性が大きくなりすぎ、液滴がメンブレン内に容易に浸透・拡散するため、メンブレン表面上及び／又は表層に十分な結晶を形成することができない。なお、本発明においてはサンプル液中の上記以外の成分は水である。 Including the amount of the organic solvent in the above range appropriately reduces the surface tension of the droplet on the membrane surface, and has an effect of appropriately securing the contact area between the membrane surface and the droplet, that is, the wet region, the solvent in the droplet. This is preferable in that it has an effect of helping to remove the components or an effect of helping to dissolve the matrix. Moreover, even if it does not contain an organic solvent at all, even if it contains the organic solvent of the said range, it has the same effect in the point that a sufficient crystal | crystallization can be formed on a membrane surface and / or a surface layer. On the other hand, if the amount of the organic solvent exceeds 25% by volume, the affinity for the membrane becomes too high, and the droplets easily penetrate and diffuse into the membrane, so that sufficient crystals are formed on the membrane surface and / or on the surface layer. Can not do it. In the present invention, the other component in the sample solution is water.
また、上記サンプル液が瞬時にメンブレン内に浸透・乾燥しないよう、一時的にメンブレン表面上に液滴が存在する状態を保つことができる程度の液量を滴下することも必要である。このような液量としては、２ｎｌ〜２μｌが好ましく、１００ｎｌ〜１μｌがより好ましい。また、液滴とメンブレン表面との接面積は、直径１００μｍ〜２ｍｍが好ましく、２００μｍ〜１ｍｍがより好ましい。 Also, it is necessary to drop the amount of the liquid so that the liquid droplets can be temporarily maintained on the membrane surface so that the sample liquid does not instantaneously permeate and dry in the membrane. Such a liquid volume is preferably 2 nl to 2 μl, more preferably 100 nl to 1 μl. Further, the contact area between the droplet and the membrane surface is preferably 100 μm to 2 mm in diameter, and more preferably 200 μm to 1 mm.
また本発明においては、上記サンプル液の滴下の前に、あらかじめ有機溶媒及び／又は界面活性剤を含む溶液によってメンブレンを処理しておくことができる。この処理によって、メンブレンを湿潤状態にし、後に滴下するサンプル液がメンブレン内に過度に浸透することを防ぐことができる。処理の形態としては、例えば、メンブレン表面の滴下位置に前記有機溶媒及び／又は界面活性剤を含む溶液を滴下してメンブレン上の微小領域を湿潤状態にすることができる。このことによって、後に滴下するサンプル液の湿潤領域を限定することができる。このときの有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。また、界面活性剤としては、ポリビニルピロリドン、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどが挙げられる。また、このときの有機溶媒の量は、前記溶液全体に対して５０〜１００体積％程度が好ましく、界面活性剤の量は、０．２５〜１体積％程度が好ましい。また、湿潤させるメンブレン上の領域の面積としては２００μｍ〜１ｍｍが好ましく、滴下する量としては、１ｎｌ〜０．２μｌが好ましい。 In the present invention, the membrane can be treated in advance with a solution containing an organic solvent and / or a surfactant before dropping the sample solution. By this treatment, the membrane can be in a wet state, and the sample solution to be dropped later can be prevented from excessively penetrating into the membrane. As a form of treatment, for example, a solution containing the organic solvent and / or surfactant may be dropped at a dropping position on the membrane surface to make a minute region on the membrane wet. By this, the wet area | region of the sample liquid dripped later can be limited. Examples of the organic solvent at this time include methanol, ethanol, and isopropanol. Examples of the surfactant include polyvinyl pyrrolidone and n-octyl-β-D-glucopyranoside. Further, the amount of the organic solvent at this time is preferably about 50 to 100% by volume with respect to the whole solution, and the amount of the surfactant is preferably about 0.25 to 1% by volume. Further, the area of the region on the membrane to be wetted is preferably 200 μm to 1 mm, and the amount to be dropped is preferably 1 nl to 0.2 μl.
本発明においては、上記サンプル液の液滴がメンブレン表面上に液滴として存在する状態で保持され、時間経過と共に主には液滴表面のみにおける溶媒成分の揮発、或いはメンブレンへの微小な浸透を伴って徐々に液滴体積を減じ、最後に乾燥する。この過程で液滴中のサンプル及びマトリックスの濃度は上昇し、一方では液滴の大部分はメンブレン内に浸透せず表面に保持され続けることから、効率よくメンブレン表面上及び／又は表層にサンプルとマトリックスとの結晶を形成することができる。なお、本明細書においては、サンプルを含む２種以上の物質について結晶を形成させる場合、形成した結晶は、２種以上の共結晶状態又は２種以上の結晶の混合状態となっている。 In the present invention, the liquid droplets of the sample liquid are held as liquid droplets on the membrane surface, and with the passage of time, the solvent component mainly volatilizes only on the surface of the liquid droplets or minutely penetrates the membrane. Accompanying this, the droplet volume is gradually reduced and finally dried. During this process, the concentration of the sample and matrix in the droplets increases, while the majority of the droplets do not penetrate into the membrane and remain on the surface. Crystals with the matrix can be formed. Note that in this specification, when crystals are formed for two or more kinds of substances including a sample, the formed crystals are in a state of two or more co-crystals or a mixed state of two or more kinds of crystals.
次に、サンプルを保持したメンブレン上に液体を滴下してサンプルの結晶を形成させる方法について説明する。 Next, a method for forming a crystal of a sample by dropping a liquid on the membrane holding the sample will be described.
サンプルを保持したメンブレンとしては、タンパク質などのサンプルが転写・固定されたブロッティング膜などが挙げられる。このようなメンブレン内には、高密度でサンプル分子が局在している。この場合は、サンプルの局在部分のメンブレン上の位置に適当な液体を滴下する。この液体には、例えば、マトリックスや内部標準物質などを含むことができる。これらは、単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良い。 Examples of the membrane holding the sample include a blotting membrane on which a sample such as protein is transferred and fixed. In such a membrane, sample molecules are localized at high density. In this case, an appropriate liquid is dropped at a position on the membrane where the sample is localized. This liquid can contain, for example, a matrix or an internal standard substance. These may be used alone or in combination.
マトリックスを用いる場合は、前述と同様、通常のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法に用いられるイオン化剤を、特に限定することなく用いることができる。例えば、ニコチン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸などが挙げられる。マトリックスの量としては、メンブレン中に局在するサンプルの量にもよるが、例えば、前記液体全体に対して０．５〜２重量％程度用いることができる。また、内部標準物質を用いる場合は、例えば前記液体全体に対して１０〜１００ｐｍｏｌ／ｍｌ程度用いることができる。 When using a matrix, the ionizing agent used for the normal matrix-assisted laser desorption / ionization method can be used without particular limitation, as described above. For example, nicotinic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid and the like can be mentioned. Although the amount of the matrix depends on the amount of the sample localized in the membrane, for example, about 0.5 to 2% by weight can be used with respect to the whole liquid. Moreover, when using an internal standard substance, about 10-100 pmol / ml can be used with respect to the said whole liquid, for example.
このような液体は、非浸透性、すなわち、メンブレンに対する浸透性をほぼ抑制することができるような組成に調製する必要がある。例えば、有機溶媒を全く含まないか、又は前記液体全体に対して２５体積％以下、好ましくは１０〜２０体積％の有機溶媒含量となるように調製する必要がある。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。上記範囲の量の有機溶媒を含むことは、メンブレン表面上の液滴の表面張力を適度に減じ、メンブレン表面と液滴との接面積を適度に確保する効果、液滴中の溶媒成分の除去を助ける効果、或いはマトリックスなどを使用する場合はその溶解を助ける効果などを有する点で好ましい。また、有機溶媒を全く含まなくとも、上記範囲の有機溶媒を含んでいても、メンブレン表面上及び／又は表層に十分な結晶を形成することができる点では同様の効果を有する。一方、有機溶媒の量が２５体積％を超えると、メンブレンに対する親和性が大きくなりすぎ、液滴がメンブレン内に容易に浸透・拡散するため、メンブレン表面上及び／又は表層に十分な結晶を形成することができない。なお、本発明においては液体中の上記以外の成分は水である。 Such a liquid needs to be prepared to have a composition that is non-permeable, that is, can substantially suppress permeability to the membrane. For example, it is necessary to prepare such that it does not contain any organic solvent or has an organic solvent content of 25% by volume or less, preferably 10 to 20% by volume, based on the entire liquid. Examples of the organic solvent include acetonitrile, methanol, isopropanol, butanol and the like. Including the amount of the organic solvent in the above range appropriately reduces the surface tension of the droplets on the membrane surface, ensures an appropriate contact area between the membrane surface and the droplets, and removes solvent components in the droplets. When using a matrix or the like, it is preferable in that it has an effect of helping its dissolution. Moreover, even if it does not contain an organic solvent at all, even if it contains the organic solvent of the said range, it has the same effect in the point that a sufficient crystal | crystallization can be formed on a membrane surface and / or a surface layer. On the other hand, if the amount of the organic solvent exceeds 25% by volume, the affinity for the membrane becomes too high, and the droplets easily penetrate and diffuse into the membrane, so that sufficient crystals are formed on the membrane surface and / or on the surface layer. Can not do it. In the present invention, the other component in the liquid is water.
また、上記液体が瞬時にメンブレンに浸透・乾燥しないよう、一時的にメンブレン表面上に液滴が存在する状態を保つことができる程度の液量を滴下することも必要である。このような液量としては、２ｎｌ〜２μｌが好ましく、１００ｎｌ〜１μｌがより好ましい。また、液滴とメンブレン表面との接面積は、直径１００μｍ〜２ｍｍが好ましく、２００μｍ〜１ｍｍがより好ましい。 Further, it is also necessary to drop a liquid amount that can temporarily maintain a state in which droplets exist on the membrane surface so that the liquid does not instantaneously permeate and dry into the membrane. Such a liquid volume is preferably 2 nl to 2 μl, more preferably 100 nl to 1 μl. Further, the contact area between the droplet and the membrane surface is preferably 100 μm to 2 mm in diameter, and more preferably 200 μm to 1 mm.
また、本発明においては、上記液体の滴下の前に、あらかじめ有機溶媒及び／又は界面活性剤を含む溶液によってメンブレンを処理しておくことができる。この処理によって、メンブレンを湿潤状態にし、後に滴下する液体がメンブレン内に過度に浸透することを防ぐことができる。処理の形態としては、例えば、メンブレン表面の滴下位置に前記有機溶媒及び／又は界面活性剤を含む溶液を滴下してメンブレン上の微小領域を湿潤状態にすることができる。このことによって、後に滴下するサンプル液の湿潤領域を限定することができる。このときの有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。また、界面活性剤としては、ポリビニルピロリドン、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどが挙げられる。また、このときの有機溶媒の量は、前記溶液全体に対して５０〜１００体積％程度が好ましく、界面活性剤の量は、０．２５〜１体積％程度が好ましい。また、湿潤させるメンブレン上の領域の面積としては直径２００μｍ〜１ｍｍが好ましく、滴下する量としては、１ｎｌ〜０．２μｌが好ましい。 In the present invention, the membrane can be treated in advance with a solution containing an organic solvent and / or a surfactant before dropping the liquid. By this treatment, the membrane can be in a wet state, and liquid that is dropped later can be prevented from penetrating excessively into the membrane. As a form of treatment, for example, a solution containing the organic solvent and / or surfactant may be dropped at a dropping position on the membrane surface to make a minute region on the membrane wet. By this, the wet area | region of the sample liquid dripped later can be limited. Examples of the organic solvent at this time include methanol, ethanol, and isopropanol. Examples of the surfactant include polyvinyl pyrrolidone and n-octyl-β-D-glucopyranoside. Further, the amount of the organic solvent at this time is preferably about 50 to 100% by volume with respect to the whole solution, and the amount of the surfactant is preferably about 0.25 to 1% by volume. In addition, the area of the region on the membrane to be wetted is preferably 200 μm to 1 mm in diameter, and the amount to be dropped is preferably 1 nl to 0.2 μl.
本発明においては、上記液体の液滴がメンブレン表面上に液滴として存在する状態で保持され、時間経過と共に、液体のメンブレンへの微小な浸透によってメンブレン中に高密度で局在していたサンプル分子がメンブレン内を拡散現象により液滴中へと移動する。そして、液滴体積の減少と共にメンブレン表面上及び／又は表層での濃度が増加し、効率よくサンプルの結晶を形成することができる。このとき、マトリックスを含む液体を使用した場合は、サンプルとマトリックスとの結晶を形成することができる。また、内部標準物質を含む液体を使用した場合は、サンプルと内部標準物質との結晶を形成することができる。なお内部標準試料は、例えば、メンブレン上におけるＰＭＦ解析の際のマスキャリブレーションに用いられる。さらに、マトリックス及び内部標準物質を含む液体を使用した場合は、サンプル、マトリックス及び内部標準物質の結晶を形成することができる。 In the present invention, the liquid droplets are held in the state of being present as droplets on the membrane surface, and the sample was localized at a high density in the membrane due to minute penetration of the liquid into the membrane over time. Molecules move through the membrane into the droplets due to diffusion. As the droplet volume decreases, the concentration on the membrane surface and / or on the surface layer increases, and the crystal of the sample can be efficiently formed. At this time, when a liquid containing a matrix is used, crystals of the sample and the matrix can be formed. Moreover, when the liquid containing an internal standard substance is used, the crystal | crystallization of a sample and an internal standard substance can be formed. The internal standard sample is used for mass calibration at the time of PMF analysis on the membrane, for example. Further, when a liquid containing a matrix and an internal standard is used, crystals of the sample, matrix and internal standard can be formed.
上述のよう本発明においては、メンブレンの表面上及び／又は表層に効率的にサンプルの結晶を形成させることができるため、従来の方法よりも容易にサンプルの位置を観察することができ、サンプルの結晶のどの部分にレーザーを照射しても、容易にシグナルを得ることができる。また、得られる解析結果においては、従来の方法よりもノイズが少なく、目的ピークが感度よく検出される。すなわち、従来解析に困難を伴った、メンブレン上のサンプルに対する質量分析の効率及び解析感度を上げることが可能となる。従って、特に微量のサンプルを解析する場合に有効であり、その観点から、例えばメンブレンに固定化したサンプルにインクジェット法により試薬を微量分注する系に応用が可能である。また、本発明ではマトリックス溶液をメンブレン上に一度に滴下することが可能であるため、従来法のように、液の拡散を抑えるために微量ずつ滴下していく必要がなく、実験者が操作に拘束される時間を低減できる。 As described above, in the present invention, since the crystal of the sample can be efficiently formed on the surface of the membrane and / or on the surface layer, the position of the sample can be observed more easily than the conventional method. A signal can be easily obtained regardless of which part of the crystal is irradiated with a laser. Further, in the obtained analysis result, the target peak is detected with high sensitivity with less noise than the conventional method. That is, it is possible to increase the efficiency and analysis sensitivity of mass spectrometry for the sample on the membrane, which has been difficult in the conventional analysis. Therefore, it is particularly effective when analyzing a very small amount of sample, and from that viewpoint, for example, it can be applied to a system in which a reagent is dispensed in a minute amount by an ink jet method onto a sample immobilized on a membrane. Further, in the present invention, since the matrix solution can be dropped on the membrane at a time, it is not necessary to drop the solution little by little in order to suppress the diffusion of the liquid as in the conventional method. Time to be restrained can be reduced.
［実施例１］
マトリックスと測定サンプルとの混合溶液として、以下の２種類を用意した。
（A：比較用）1 pmol/ml ACTH（測定サンプル）、5 mg/ml DHB（マトリックス）、50体積%アセトニトリル、0.05体積%トリフルオロ酢酸
（B）1 pmol/ml ACTH、5 mg/ml DHB、25体積%アセトニトリル、0.05体積%トリフルオロ酢酸
ここでACTHはAdrenocorticotropic hormone fragment 18-39（モノアイソトピック質量： 2465.1989）であり、DHBは２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。
[Example 1]
The following two types of mixed solutions of matrix and measurement sample were prepared.
(A: For comparison) 1 pmol / ml ACTH (measurement sample), 5 mg / ml DHB (matrix), 50 vol% acetonitrile, 0.05 vol% trifluoroacetic acid (B) 1 pmol / ml ACTH, 5 mg /
PVDFメンブレン（Immobilon-PSQ、ミリポア社製）をMSプレートに導電性両面テープを介して貼り付けた。貼り付けられたメンブレン上に、それぞれの溶液各１μlを滴下した。このとき、（A）の場合はメンブレンにおける液の拡散を極力抑えるべく、液の乾燥を待ちながら少しずつ多数回に分け滴下した。一方、（B）の場合は溶液の全量を一度に滴下してメンブレン上に液滴が存在する状態にし、その状態を保ったまま乾燥を待った。 PVDF membrane (Immobilon-P SQ , manufactured by Millipore) was attached to the MS plate via a conductive double-sided tape. 1 μl of each solution was dropped onto the affixed membrane. At this time, in the case of (A), in order to suppress the diffusion of the liquid in the membrane as much as possible, it was dropped in small portions a little while waiting for the liquid to dry. On the other hand, in the case of (B), the entire amount of the solution was dropped at a time so that the droplets existed on the membrane, and the drying was awaited while maintaining the state.
それぞれのMSプレートを直接MALDI-MS解析に供した。この解析にはMALDI四重極イオントラップ飛行時間型質量分析計AXIMA-QIT（島津製作所製）を使用した。（A）の場合、質量分析計のモニター画面において結晶形成位置が判然とせず、また滴下領域内においてシグナルを与えるポイントを見出すのに困難を要したが、（B）では容易に結晶の位置を観察することができ、その結晶の任意のどの部分にレーザー照射しても、直ちに特異的シグナルを得ることが可能であった。 Each MS plate was directly subjected to MALDI-MS analysis. For this analysis, a MALDI quadrupole ion trap time-of-flight mass spectrometer AXIMA-QIT (manufactured by Shimadzu Corporation) was used. In the case of (A), the crystal formation position is not clear on the monitor screen of the mass spectrometer, and it was difficult to find the point that gives a signal in the dropping region, but in (B) the position of the crystal was easily It was possible to observe, and it was possible to immediately obtain a specific signal when any portion of the crystal was irradiated with laser.
図１Ａに、上記（A）の溶液を用いた場合の解析結果を示し、図１Ｂに溶液（B）を用いた場合の解析結果を示す。図１の両図において、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)を表し、縦軸は分子イオンピークの相対強度を表す。両図を比較すると明らかに、Ｂ図のほうがノイズが低く、目的ピークを感度よく検出できていた。 FIG. 1A shows an analysis result when the solution (A) is used, and FIG. 1B shows an analysis result when the solution (B) is used. In both figures of FIG. 1, the horizontal axis represents mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of the molecular ion peak. Obviously, comparing the two figures, the figure B had lower noise and the target peak could be detected with high sensitivity.
［実施例２］
二次元分離タンパク質ブロットを、メンブレン上で酵素消化を行い、PMF (Peptide Mass Fingerprinting)解析を行った。
ヒト血漿タンパク質を二次元電気泳動により分離し、Immobilon-PSQメンブレンに転写後Direct Blue 71（アルドリッチ社製）によってタンパク質スポットを染色した。このようにして得られたメンブレンを実施例１と同様にしてMSプレートに貼り付けた。貼り付けられたメンブレンのSerum Albuminスポットを解析目的とした。目的スポット上に、親水性を与える目的で0.25体積%ポリビニルピロリドン（界面活性剤）を含む50体積%メタノール溶液0.14μlを滴下し、さらに、200μg/mlのトリプシンを含む25mM炭酸水素アンモニウム溶液1μlを重ねて滴下した。これを湿潤環境下にて３０℃で終夜インキュベートし、タンパク質のトリプシン酵素消化反応を行った。
[Example 2]
The two-dimensional separated protein blot was subjected to enzyme digestion on the membrane, and PMF (Peptide Mass Fingerprinting) analysis was performed.
Human plasma proteins were separated by two-dimensional electrophoresis, transferred to an Immobilon-P SQ membrane, and then stained with Direct Blue 71 (Aldrich). The membrane thus obtained was attached to an MS plate in the same manner as in Example 1. The Serum Albumin spot on the attached membrane was used for analysis. On the target spot, 0.14 μl of 50 volume% methanol solution containing 0.25 volume% polyvinylpyrrolidone (surfactant) is added dropwise for the purpose of imparting hydrophilicity, and then 1 μl of 25 mM ammonium bicarbonate solution containing 200 μg / ml trypsin is added. It was dripped repeatedly. This was incubated overnight at 30 ° C. in a humid environment to carry out a trypsin enzyme digestion reaction of the protein.
目的スポット上に、以下の組成の液体をそれぞれ2μl滴下した。
（A：比較用）、5 mg/ml DHB（マトリックス）、50体積%アセトニトリル、0.05体積%トリフルオロ酢酸
（B）5 mg/ml DHB、25体積%アセトニトリル、0.05体積%トリフルオロ酢酸
このとき、（A）の場合は液の拡散を極力抑えるべく、液の乾燥を待ちながら少しずつ多数回に分けて滴下した。一方、（B）の場合は溶液の全量を一度に滴下してメンブレン上に液滴が存在する状態にし、その状態を保ったまま乾燥を待った。（A）の溶液は容易に拡散する傾向にあり直径2 mm程度の領域に浸潤したが、（B）の溶液の場合はあらかじめポリビニルピロリドンを滴下した約直径1 mmの領域のみに浸潤し、それ以外の領域に液が広がることはなかった。
2 μl of each liquid having the following composition was dropped on the target spot.
(A: for comparison), 5 mg / ml DHB (matrix), 50 vol% acetonitrile, 0.05 vol% trifluoroacetic acid (B) 5 mg / ml DHB, 25 vol% acetonitrile, 0.05 vol% trifluoroacetic acid, In the case of (A), in order to suppress the diffusion of the liquid as much as possible, the liquid was dropped in small portions in several portions while waiting for the liquid to dry. On the other hand, in the case of (B), the whole amount of the solution was dropped at a time so that the droplets existed on the membrane, and drying was waited while maintaining the state. The solution of (A) tends to diffuse easily and infiltrates the area of about 2 mm in diameter, but in the case of the solution of (B), it infiltrates only the area of about 1 mm in diameter where polyvinylpyrrolidone has been previously dropped. The liquid did not spread to other areas.
それぞれのMSプレートをAXIMA-QIT（島津製作所製）を用いて直接MALDI-MS解析に供した。（A）の場合は滴下領域内においてシグナルを与えるポイントを見出すのが困難であったが、（B）の場合は容易に結晶を観察しシグナルを得ることが可能であった。 Each MS plate was directly subjected to MALDI-MS analysis using AXIMA-QIT (manufactured by Shimadzu Corporation). In the case of (A), it was difficult to find a point giving a signal in the dropping region, but in the case of (B), it was possible to easily observe a crystal and obtain a signal.
図２Ａに、上記（A）の溶液を用いた場合の解析結果を示し、図２Ｂに溶液（B）を用いた場合の解析結果を示す。図２の両図において、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)を表し、縦軸は分子イオンピークの相対強度を表す。Ａ図では非常に高いバックグラウンドを伴っているのに対し、Ｂ図ではノイズが抑えられタンパク質消化断片がより効率よく観察された。またこれらのペプチドフラグメントの質量データをMascotシステム（Matrix Science）により解析した結果、いずれの場合もSerum Albuminに有意に一致したが、Ｂ図の場合のほうが一致率においてより高いスコアを導いた。 FIG. 2A shows an analysis result when the solution (A) is used, and FIG. 2B shows an analysis result when the solution (B) is used. 2, the horizontal axis represents mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of the molecular ion peak. In FIG. A, with very high background, in FIG. B, noise was suppressed and protein digested fragments were observed more efficiently. Moreover, as a result of analyzing the mass data of these peptide fragments by Mascot system (Matrix Science), in all cases, it matched significantly with Serum Albumin, but the case of FIG.
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