JP2005082903A - Nanostrand and method for treating nucleic acid using the same - Google Patents
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Abstract
Description
この出願の発明は、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドおよびこれを利用した核酸処理方法に関するものである。 The invention of this application relates to a nanostrand capable of binding to a nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, and a nucleic acid processing method using the nanostrand.
さらに詳しくは、この出願の発明は、ナノストランドの表面が、DNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有していることを特徴としており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドおよびこれを利用した核酸処理方法に関するものである。 More specifically, in the invention of this application, the surface of the nanostrand is positively charged with a charge density equivalent to that of a nucleic acid such as DNA or RNA, the nanostrand is rigid, and the diameter of the polystrand constituting the nucleic acid. The present invention relates to a nanostrand capable of binding to a nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, and a nucleic acid processing method using the same, characterized by having a very thin structure like a nucleotide chain .
DNAやRNA等の核酸の分離や精製技術は、バイオテクノロジーを支える重要な基盤技術となっている。生体組織からのDNAの抽出では、タンパク質を化学的に処理して遠心分離に
より除去した後、アルコールを添加してDNAのみを取り出す。高分子電解質であるDNAは、溶媒の極性を低下させることで、容易に沈殿する。極微量のDNA試料の場合、ビーズやガ
ラスパウダー等の固体表面に吸着させて、分離や精製等の核酸処理が行われている。血液や各種細胞からRNAを抽出する場合には、界面活性剤により不溶化して分離後、水溶液中
に再溶解させる手法が用いられる（たとえば、非特許文献１）。これらの抽出操作の前処理として、クロロホルム等の有機溶媒を用いることも多い。
Separation and purification technologies for nucleic acids such as DNA and RNA have become an important fundamental technology that supports biotechnology. In extraction of DNA from living tissue, protein is chemically treated and removed by centrifugation, and then alcohol is added to extract only DNA. DNA, which is a polyelectrolyte, is easily precipitated by reducing the polarity of the solvent. In the case of an extremely small amount of DNA sample, it is adsorbed on a solid surface such as beads or glass powder, and nucleic acid treatment such as separation or purification is performed. When RNA is extracted from blood or various cells, a method of insolubilizing with a surfactant and separating it and then re-dissolving in an aqueous solution is used (for example, Non-Patent Document 1). As a pretreatment for these extraction operations, an organic solvent such as chloroform is often used.
また、上記のような方法により精製されたDNAは、PCR法より増幅されて電気泳動に用いられたり、直接、DNAチップを用いて診断に利用されたりする。最近では、金ナノ粒子を
用いたマイクロハイブリダイゼーション法（たとえば、非特許文献２）により凝集性を制御することで、遺伝子診断を行うことも可能となりつつある。
In addition, DNA purified by the above method is amplified by PCR and used for electrophoresis, or directly used for diagnosis using a DNA chip. Recently, it is becoming possible to perform genetic diagnosis by controlling aggregation by a microhybridization method using gold nanoparticles (for example, Non-Patent Document 2).
一方、近年のナノテクノロジーの発展とともに、マイクロ流路と組み合わせたDNAチッ
プの研究も盛んに行われている。DNAは、剛直な高分子電解質に特徴的な電場応答あるい
は流体力学的な特性を有しており、これらは、マイクロ流路中でのDNAの捕捉・結合や濃
縮に利用されつつある。また、光ピンセットを用いて、単一DNA鎖をマニピュレーション
する技術も、特に基礎研究分野において活発に利用されている。
On the other hand, with the development of nanotechnology in recent years, research on DNA chips combined with microchannels has been actively conducted. DNA has an electric field response or a hydrodynamic characteristic characteristic of a rigid polyelectrolyte, and these are being used for capturing / binding and concentrating DNA in a microchannel. In addition, a technique for manipulating a single DNA strand using optical tweezers is actively used particularly in the basic research field.
このように、DNAやRNA等の核酸を対象とする分離や精製、濃縮の核酸処理方法は、近年、著しく発達したように見える。しかしながら、実用面で広く普及している方法は、ポリアニオンとしての溶解性を利用した抽出、遠心分離、ビーズ等の固体表面への吸着、ゲル電気泳動などの技術を巧みに組み合わせることで、多様な要求に対応させているに過ぎない。また、DNAやRNA等の核酸に結合させる物質としては、ビーズ等の固体表面、DNAやRNA自身（ハイブリダイゼーション等）、結合性タンパク質、そしてカチオン性の界面活性剤に限られている。 Thus, separation, purification, and concentration of nucleic acid treatment methods for nucleic acids such as DNA and RNA appear to have developed significantly in recent years. However, methods that are widely used in practical use are variously combined by skillfully combining techniques such as extraction using the solubility as a polyanion, centrifugation, adsorption to solid surfaces such as beads, and gel electrophoresis. It is only responding to requests. In addition, substances that bind to nucleic acids such as DNA and RNA are limited to solid surfaces such as beads, DNA and RNA itself (such as hybridization), binding proteins, and cationic surfactants.
ポリアニオンであるDNAやRNA等の核酸（以下、「核酸」とする場合がある）が、正に荷電した物質と強く相互作用することは、容易に予想できる。しかしながら、溶液中で核酸との効率的な結合を実現するには、いくつかの構造上の特徴を必要とする。 It can be easily predicted that nucleic acids such as DNA and RNA which are polyanions (hereinafter sometimes referred to as “nucleic acids”) strongly interact with positively charged substances. However, to achieve efficient binding with nucleic acids in solution requires several structural features.
カチオン性界面活性剤が形成する棒状ミセルは、高い表面電荷密度を有し、核酸と強く結合する。しかしながら、このようなミセルは、一般に数mM以上の濃度条件においてのみ形成される。また、分子設計により剛直なロット状ミセルを形成させることも可能であるが、この場合、核酸と強固な凝集体を形成してしまうという問題があった。一方、カチオ
ン性の高分子は、DNA鎖に不必要に絡みつき、そのコンフォメーションに重大な影響を与
える。さらに、一旦絡み合って吸着したカチオン性高分子を核酸から取り除くことは、極めて難しい。
The rod-like micelle formed by the cationic surfactant has a high surface charge density and binds strongly to the nucleic acid. However, such micelles are generally formed only under a concentration condition of several mM or more. Further, it is possible to form a rigid lot micelle by molecular design, but in this case, there is a problem that a strong aggregate is formed with the nucleic acid. On the other hand, cationic polymers are unnecessarily entangled with DNA strands and have a significant effect on their conformation. Furthermore, it is extremely difficult to remove the cationic polymer once entangled and adsorbed from the nucleic acid.
剛直、かつ、正に荷電した無機物のナノファイバーであれば、核酸と絡み合いを最小限に抑え、かつ強力な相互作用が得られるものと期待できる。たとえば、ある種の金属塩は、アルカリ性にすることで金属酸化物のナノファイバーを形成し、その表面は正に荷電していることが知られている（特許文献１）。
DNA等の核酸との強い相互作用を実現するためには、ナノファイバーの表面が、少なく
ともDNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電している必要がある。また、核酸との相補
的な静電相互作用により効率的な補足を達成するには、ナノファイバーが剛直で、かつ、直径2nmのDNA鎖と同様に非常に細い構造であることが望まれる。さらに、核酸の抽出や精製を行うためには、上記ナノファイバーを核酸から取り除く技術が必要になる。しかしながら、このような条件を満たすことのできるナノファイバーは、いまだ見つかっておらず、生物由来の物質を利用する方法（ハイブリダイゼーション等）を用いない限り、水溶液中の核酸を効率的に処理することができなかった。
In order to realize a strong interaction with a nucleic acid such as DNA, the surface of the nanofiber needs to be positively charged with at least a charge density equivalent to that of a nucleic acid such as DNA. In order to achieve efficient supplementation by complementary electrostatic interaction with nucleic acid, it is desirable that the nanofiber is rigid and has a very thin structure like a DNA strand having a diameter of 2 nm. Furthermore, in order to perform extraction and purification of nucleic acid, a technique for removing the nanofiber from the nucleic acid is required. However, nanofibers that can satisfy these conditions have not yet been found, and unless nucleic acid-based methods (hybridization, etc.) are used, nucleic acids in aqueous solutions can be processed efficiently. I could not.
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ナノストランドの表面が、少なくともDNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、ナノストランドが剛直で、かつ、直径が核酸を構成するポリヌクレオチド鎖と同様に非常に細い構造を有していることを特徴としており、核酸と結合し、、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドを提供することを課題としている。 Accordingly, the invention of this application has been made in view of the circumstances as described above, and the surface of the nanostrand is positively charged at least with a charge density equal to that of a nucleic acid such as DNA or RNA. It is characterized in that the strand is rigid and has a very thin structure in the same way as the polynucleotide chain constituting the nucleic acid, and binds to the nucleic acid and releases the bound nucleic acid. It is an object to provide a nanostrand that can be produced.
また、この出願の発明は、DNAやRNA等の核酸の抽出や精製等を行うために、上記ナノストランドを核酸から解放することに基づいた新しい核酸処理方法を提供することも課題としている。 Another object of the invention of this application is to provide a new nucleic acid processing method based on releasing the nanostrands from nucleic acids in order to extract or purify nucleic acids such as DNA and RNA.
この出願の発明は、前記の課題を解決するために、発明者が鋭意研究を行った結果として、以下の(1)から(12)の発明を提供する。
(1) 金属酸化物を主成分とするナノストランドにおいて、少なくとも5%以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、ナノストランドは結晶性構造を有しており、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することができることを特徴とするナノストランド。
(2) 金属酸化物が、2価の金属イオンの塩の水溶液と塩基性水溶液との混合液から形成さ
れることを特徴とする前記発明(1)のナノストランド。
(3) 2価の金属イオンの塩が、カドミウム塩であることを特徴とする前記発明(2)のナノストランド。
(4) 混合液の液性が、pH 5.0-pH 9.0の範囲であることを特徴とする前記発明(2)のナノストランド。
(5) 結晶性構造において、円相当径が1.0-3.0nmの範囲であり、長さが円相当径の少なく
とも100倍以上であり、曲率半径が少なくとも20nm以上であることを特徴とする前記発明(1)から(4)いずれかのナノストランド。
(6) ナノストランドが、ナノストランドを含有する水溶液に配位性化合物を添加されることにより、消失されることを特徴とする前記発明(1)から(5)いずれかのナノストランド。
(7) 配位性化合物が、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、イミノ二酢酸、または、大環状ポリアミンのいずれかであることを特徴とする前記発明(6)のナノストランド。
(8) ナノストランドが、酸性水溶液の添加により、ナノストランドを含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とすることで、消失されることを特徴とする前記発明(1)から(7)いずれかのナノストランド。
(9) 前記発明(1)から(8)いずれかのナノストランドを、核酸と接触させることにより結合させ、生じるナノストランドと核酸とを含むことを特徴とするナノ複合体。
(10) 前記発明(9)のナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範囲とすることで、ナノ複合体中に含まれるナノスト
ランドを消失させて、核酸が解放されることを特徴とする核酸処理方法。
(11) 前記発明(9)のナノ複合体をフィルター濾過して取り除くことにより、核酸が除去されることを特徴とする核酸処理方法。
(12) 前記発明(9)のナノ複合体をフィルター濾過により分取して、このナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性をpH 3.0-pH 5.0の範
囲とすることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランドを消失させて、核酸が分離、精製または濃縮されることを特徴とする核酸処理方法。
The invention of this application provides the following inventions (1) to (12) as a result of intensive studies by the inventors to solve the above-mentioned problems.
(1) In a nanostrand mainly composed of a metal oxide, at least 5% or more of metal atoms are positively charged, and the nanostrand has a crystalline structure, binds to a nucleic acid, and Nanostrands characterized in that they can release bound nucleic acids.
(2) The nanostrand of the invention (1), wherein the metal oxide is formed from a mixed solution of an aqueous salt solution of a divalent metal ion and a basic aqueous solution.
(3) The nanostrand of the invention (2), wherein the salt of the divalent metal ion is a cadmium salt.
(4) The nanostrand of the invention (2), wherein the liquid property of the mixed solution is in the range of pH 5.0 to pH 9.0.
(5) In the crystalline structure, the equivalent circle diameter is in the range of 1.0 to 3.0 nm, the length is at least 100 times the equivalent circle diameter, and the curvature radius is at least 20 nm or more. (1) to (4) any nanostrand.
(6) The nanostrand according to any one of the inventions (1) to (5), wherein the nanostrand is eliminated by adding a coordination compound to the aqueous solution containing the nanostrand.
(7) The nanostrand according to the invention (6), wherein the coordinating compound is ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), iminodiacetic acid, or a macrocyclic polyamine.
(8) From the invention (1), wherein the nanostrand is eliminated by adding the acidic aqueous solution to make the liquidity of the aqueous solution containing the nanostrand within the range of pH 3.0 to pH 5.0 ( 7) Any nanostrand.
(9) A nanocomposite characterized in that the nanostrand of any one of the inventions (1) to (8) is bound by bringing it into contact with a nucleic acid, and the resulting nanostrand and the nucleic acid are contained.
(10) By adding a coordinating compound to the nanocomposite of the invention (9), or by adjusting the liquidity of the aqueous solution containing this nanocomposite to the range of pH 3.0 to pH 5.0, A nucleic acid treatment method characterized in that the nucleic acid is released by eliminating the nanostrands contained in.
(11) A method for treating nucleic acid, wherein nucleic acid is removed by removing the nanocomposite of the invention (9) by filtering.
(12) The nanocomposite of the invention (9) is collected by filtration, and a coordination compound is added to the nanocomposite, or the liquidity of the aqueous solution containing the nanocomposite is adjusted to pH 3.0- A nucleic acid treatment method characterized in that the nanostrands contained in the nanocomplex are eliminated and the nucleic acid is separated, purified or concentrated by adjusting the pH to 5.0.
上記第１の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、DNAやRNA等の核酸と同等の電荷密度で正に荷電しており、また、ナノストランドが剛直な構造を有しているため、核酸とを効率よく結合し、かつ、結合した核酸を解放することを実現することができる。 According to the nanostrand that binds to the first nucleic acid and can release the bound nucleic acid, the nanostrand is positively charged at a charge density equivalent to that of a nucleic acid such as DNA or RNA. Since it has a rigid structure, it is possible to efficiently bind to a nucleic acid and release the bound nucleic acid.
上記第２の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１のナノストランドと同様な効果が得られ、核酸との結合能と解放能とがバランスよく保持させることができる。 According to the nanostrand capable of binding to the second nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effect as that of the first nanostrand can be obtained, and the binding ability and release ability of the nucleic acid can be improved. It can be kept in good balance.
上記第３の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第２のナノストランドと同様な効果が得られ、核酸との結合能および解放能を向上させることができる。 According to the nanostrand capable of binding to the third nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effect as the second nanostrand can be obtained, and the binding ability and release ability with the nucleic acid can be improved. Can be made.
上記第４の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１から第３のナノストランドと同様な効果が得られ、核酸との結合能および解放能をより向上させることができる。 According to the nanostrand capable of binding to the fourth nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effects as those of the first to third nanostrands can be obtained, and the binding ability and release of the nucleic acid can be achieved. Performance can be further improved.
上記第５の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１から第４のナノストランドと同様な効果が得られ、高い剛直性を有することとなり、特に核酸との結合能を向上させることができる。 According to the nanostrand capable of binding to the fifth nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effects as those of the first to fourth nanostrands can be obtained and have high rigidity. In particular, the ability to bind to nucleic acids can be improved.
上記第６の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第１から第５のナノストランドと同様な効果が得られ、特にナノストランドから核酸を効率よく解放することができる。 According to the nanostrand capable of binding to the sixth nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effects as those of the first to fifth nanostrands can be obtained. Can be released well.
上記第７の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第６のナノストランドと同様な効果が得られ、ナノストランドから核酸を、さらに効率よく解放することができる。 According to the nanostrand capable of binding to the seventh nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effect as the sixth nanostrand can be obtained, and the nucleic acid can be more efficiently released from the nanostrand. can do.
上記第８の核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドによれば、上記第６のナノストランドと同様な効果が得られ、ナノストランドから核酸を効率よく解放することができる。 According to the nanostrand capable of binding to the eighth nucleic acid and releasing the bound nucleic acid, the same effect as the sixth nanostrand can be obtained, and the nucleic acid can be efficiently released from the nanostrand. Can do.
上記第９のナノストランドと核酸とを含むナノ複合体によれば、核酸の効率よい回収、分離、精製等の処理に用いることができる。 According to the nanocomposite containing the ninth nanostrand and the nucleic acid, it can be used for efficient recovery, separation, purification and the like of the nucleic acid.
上記第１０の核酸処理方法によれば、ナノストランドが消失し、ナノ複合体に含まれる核酸を解放し、回収することができる。 According to the tenth nucleic acid treatment method, the nanostrand disappears, and the nucleic acid contained in the nanocomposite can be released and recovered.
上記第１１の核酸処理方法によれば、ナノ複合体を除去することにより、ナノストランドとともに核酸を効率よく除去することができる。 According to the eleventh nucleic acid treatment method, the nucleic acid can be efficiently removed together with the nanostrand by removing the nanocomposite.
上記第１２の核酸処理方法によれば、ナノ複合体を効率よく分取することができ、このナノ複合体を構成するナノストランドを消失させることにより、効率よく核酸を分離、精製、さらには濃縮することができる。 According to the twelfth nucleic acid treatment method, the nanocomposite can be efficiently separated, and the nucleic acid is efficiently separated, purified, and concentrated by eliminating the nanostrands constituting the nanocomposite. can do.
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものである。以下にその実施の形態について説明する。 The invention of this application has the characteristics as described above. The embodiment will be described below.
この出願の発明において、核酸と結合し、かつ、結合した核酸を解放することのできるナノストランドは、金属酸化物を主成分としている。このナノストランドは、構成成分全体のうち、少なくとも5%以上の金属原子が正に荷電しており、かつ、ナノストランドは結晶性構造を有していることを特徴としている。なお、この出願の発明における、核酸としては、二本鎖型DNA、一本鎖型DNA、様々なRNA（mRNA、tRNA、rRNA等）、PCR法等に利用されるオリゴヌクレオチド、あるいは、これらの混合物等を例示することができる。 In the invention of this application, the nanostrand capable of binding to a nucleic acid and releasing the bound nucleic acid is based on a metal oxide. This nanostrand is characterized in that at least 5% or more of metal atoms in the entire constituent components are positively charged, and the nanostrand has a crystalline structure. The nucleic acids in the invention of this application include double-stranded DNA, single-stranded DNA, various RNAs (mRNA, tRNA, rRNA, etc.), oligonucleotides used in PCR methods, etc., or these A mixture etc. can be illustrated.
この出願の発明のナノストランドは、発明者が、様々な金属酸化物のナノファイバーを研究する過程で、「金属原子が正に荷電」および「結晶性構造」の2つの特徴を同時に有
することが、核酸の効率的な捕捉（結合）に重要であることを見出したことに基づくものである。すなわち、このナノストランドは、正に荷電した原子の割合が極めて高く、数ナノメートル以下の極めて細長い構造であり、さらに、結晶性の高い構造であることから剛直性をも有しているものである。なお、発明者は、ナノストランドの幅が2nm程度であっ
ても結晶性であり得ることを高分解能電子顕微鏡の観察により確認している（図示せず）。
The nanostrand of the invention of this application may have two characteristics of “metal atom is positively charged” and “crystalline structure” at the same time, as the inventor researches nanofibers of various metal oxides. This is based on the finding that it is important for efficient capture (binding) of nucleic acids. In other words, this nanostrand has a very high proportion of positively charged atoms, has a very long and narrow structure of several nanometers or less, and also has rigidity due to its highly crystalline structure. is there. The inventor has confirmed by observation with a high-resolution electron microscope that the nanostrand can be crystalline even if the width of the nanostrand is about 2 nm (not shown).
この出願の発明のナノストランドは、一般に、金属イオンの塩の水溶液と塩基性水溶液との混合液から形成される。特に2価の金属イオンの塩の水溶液から形成させることが好
ましい。さらに、2価の金属イオンの塩の中でも、カドミウム塩であることが特に好まし
い。代表的な例としては、硝酸カドミウム（Cd(NO3)2）等が挙げられる。ナノストランドの形成には、2価の金属イオンの塩を他の金属イオンの塩と組み合わせて用いることもで
きる。
The nanostrands of the invention of this application are generally formed from a mixture of an aqueous solution of a metal ion salt and a basic aqueous solution. In particular, it is preferably formed from an aqueous solution of a divalent metal ion salt. Further, among the divalent metal ion salts, a cadmium salt is particularly preferable. A typical example is cadmium nitrate (Cd (NO 3 ) 2 ). For the formation of nanostrands, a salt of a divalent metal ion can be used in combination with a salt of another metal ion.
ランタノイド等の3価の金属イオンは、一般に、中性条件下で柔軟なナノファイバーを
形成することが知られている。しかし、このようなナノファイバーは、ファイバーを構成する3価の金属イオンと比較して、核酸との結合力が弱い。また、3価の金属イオンは、核酸を強力に凝集してしまい、このように凝集した核酸は、再び分散させることが困難となる。一方、1価の金属イオンでは、ナノストランド全体の5％以上の金属原子が正に荷電したナノストランドを形成することができない。
Trivalent metal ions such as lanthanoids are generally known to form flexible nanofibers under neutral conditions. However, such nanofibers have a weaker binding force with nucleic acids than trivalent metal ions constituting the fibers. In addition, trivalent metal ions strongly aggregate nucleic acid, and it is difficult to disperse the aggregated nucleic acid again. On the other hand, monovalent metal ions cannot form nanostrands in which 5% or more of metal atoms in the entire nanostrand are positively charged.
この出願の発明は、ナノストランドの水溶液に酸（たとえば、塩酸や硫酸等）を添加すると、ナノストランドは消失して金属イオンとなる。このことを利用して、ナノストラン
ドに捕捉、結合された核酸をナノストランドから解放することが可能となる。ナノストランドは、核酸との効率的な結合のために、中性付近で形成されるものが好ましい。この中性付近とは、液性がpH 5.0〜pH 9.0の範囲のこと指す。
In the invention of this application, when an acid (for example, hydrochloric acid or sulfuric acid) is added to an aqueous solution of nanostrands, the nanostrands disappear and become metal ions. Utilizing this fact, it becomes possible to release the nucleic acid captured and bound to the nanostrand from the nanostrand. Nanostrands are preferably formed in the vicinity of neutrality for efficient binding to nucleic acids. “Neutral” means that the liquidity is in the range of pH 5.0 to pH 9.0.
前述の「金属原子が正に荷電」および「結晶性構造」の2つの特徴は、ナノストランド
の形態によって明記することができる。すなわち、この出願の発明のナノストランドの結晶性構造において、円相当径が1.0〜3.0nmの範囲であることが好ましく、長さが少なくとも円相当径の100倍以上であり、さらに曲率半径が少なくとも20nm以上であるものが特に
好ましい。
The above two characteristics of “metal atom positively charged” and “crystalline structure” can be specified by the form of nanostrands. That is, in the crystalline structure of the nanostrand of the invention of this application, the equivalent circle diameter is preferably in the range of 1.0 to 3.0 nm, the length is at least 100 times the equivalent circle diameter, and the radius of curvature is at least Particularly preferred is 20 nm or more.
また、この出願の発明に係るナノストランドは、配位性化合物の添加により消失することが望ましい。配位性化合物としては、特に限定されるものではないが、金属イオンとの大きな錯形成定数を有するものが好ましい。このため、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、チオール基、スルフィド基などの配位性基を有する化合物が好ましく、これらの配位性基を複数有するキレート型の化合物がより好ましい。もちろん、上記の配位性基を組み合わせて有するものであってもよい。たとえば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、イミノ二酢酸、大環状ポリアミン等が挙げられる。また、金属イオンに配位し、不溶性あるいは難溶性の無機塩を作るようなイオンを添加してもよい。 Moreover, it is desirable that the nanostrand according to the invention of this application disappears by the addition of a coordination compound. Although it does not specifically limit as a coordinating compound, The thing which has a big complex formation constant with a metal ion is preferable. For this reason, a compound having a coordinating group such as an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a phosphoric acid group, a thiol group, or a sulfide group is preferable, and a chelate type compound having a plurality of these coordinating groups is more preferable. Of course, you may have combining the said coordinating group. For example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), iminodiacetic acid, macrocyclic polyamine and the like can be mentioned. In addition, an ion that coordinates to a metal ion to form an insoluble or hardly soluble inorganic salt may be added.
この配位性化合物によりナノストランドを消失させる場合においては、液性が中性付近、すなわちpH 5.0〜pH 9.0の範囲で行われることが好ましい。 When the nanostrand is eliminated by the coordination compound, the liquid property is preferably near neutral, that is, in the range of pH 5.0 to pH 9.0.
さらに、酸性水溶液の添加により、ナノストランドを含有する水溶液の液性を弱酸性とすることで、ナノストランドを消失させてもよい。この弱酸性とは、pH 3.0-pH 5.0の範
囲であることが好ましい。
Furthermore, you may make a nanostrand lose | disappear by making the liquidity of the aqueous solution containing a nanostrand weak acidity by addition of acidic aqueous solution. This weak acidity is preferably in the range of pH 3.0 to pH 5.0.
次に、この出願の発明におけるナノストランドを用いた核酸の処理方法を以下に説明する。 Next, a method for treating nucleic acid using nanostrands in the invention of this application will be described below.
この出願の発明のナノストランドは、金属塩の水溶液に激しく攪拌しながら塩基性水溶液を一気に加えることで形成される。金属塩の濃度は、0.1〜10mM程度が好ましい。また
、塩基性水溶液としては、たとえば0.1〜10 mM程度の水酸化ナトリウム水溶液が好適に用いられるが、塩基性水溶液は、この例示に限定されるものではない。上記水溶液の温度は、0〜40℃の範囲内が好ましく、室温付近がより好ましい。添加に要する時間は、水溶液
の量にも依存するが、１分以内であることが好ましい。
The nanostrand of the invention of this application is formed by adding a basic aqueous solution all at once to a metal salt aqueous solution with vigorous stirring. The concentration of the metal salt is preferably about 0.1 to 10 mM. As the basic aqueous solution, for example, a sodium hydroxide aqueous solution of about 0.1 to 10 mM is preferably used, but the basic aqueous solution is not limited to this example. The temperature of the aqueous solution is preferably in the range of 0 to 40 ° C, more preferably around room temperature. The time required for the addition depends on the amount of the aqueous solution, but is preferably within 1 minute.
金属イオンと水酸化物イオンの組成比は、ナノストランドの形成において、重要である。たとえば、硝酸カドミウムと水酸化ナトリウムから水酸化カドミウムのナノストランドを形成する場合には、水酸化物イオンの添加量は、カドミウムイオンに対して、0.5〜1.5倍の範囲が好ましく、0.5〜1.0の範囲がさらに好ましい。水酸化物イオンの添加量が少ない後者の範囲では、表面に多くの正電荷を有するナノストランドが形成される。ナノストランドの表面の電荷量は、複数のスルホン酸基を有する色素分子で滴定することができる。また、ナノストランドの長さ、円相当径、曲率半径ならびに結晶性は、高分解能電子顕微鏡より評価できる。 The composition ratio of metal ions and hydroxide ions is important in the formation of nanostrands. For example, in the case of forming a cadmium hydroxide nanostrand from cadmium nitrate and sodium hydroxide, the amount of hydroxide ions added is preferably 0.5 to 1.5 times the cadmium ions, and 0.5 to 1.0. A range is further preferred. In the latter range where the addition amount of hydroxide ions is small, nanostrands having many positive charges are formed on the surface. The amount of charge on the surface of the nanostrand can be titrated with a dye molecule having a plurality of sulfonic acid groups. Further, the length, equivalent circle diameter, radius of curvature, and crystallinity of the nanostrand can be evaluated with a high-resolution electron microscope.
このようにして形成されたナノストランドと核酸とを接触させることで、核酸をナノストランドに静電的に捕捉、結合させることができる。接触は、通常、ナノストランドと核酸の水溶液を混合することで行われる。混合は室温で行うことが好ましい。 By bringing the nanostrand thus formed into contact with the nucleic acid, the nucleic acid can be electrostatically captured and bound to the nanostrand. Contact is usually performed by mixing nanostrands and an aqueous solution of nucleic acid. Mixing is preferably performed at room temperature.
ナノストランドは、ビーズやガラスパウダー等の固体の表面に固定化することができ、
このような状態で核酸と接触させることも可能である。
Nanostrands can be immobilized on solid surfaces such as beads and glass powder,
It is also possible to contact the nucleic acid in such a state.
上記の混合して接触させる際、ナノストランドの濃度は、ナノストランドを構成している金属原子の濃度に換算して、0.05〜5mMの範囲が適当である。また、核酸の水溶液の濃
度は、0.1mg/mL以下が適当である。さらに、ナノストランドを構成している金属原子の濃度は、核酸を構成している核酸塩基の濃度に換算して、その20倍以上あることが好ましい。ナノストランドの濃度に対する核酸の濃度の下限は、たとえば、DNAの濃度が4.0×10-5mg/mlの場合で、95%以上のDNAを捕捉することが可能であることが確認されている。すな
わち、この出願の発明のナノストランドは、極めて低濃度の核酸を捕捉することができる。
When mixing and contacting, the concentration of nanostrands is suitably in the range of 0.05 to 5 mM in terms of the concentration of metal atoms constituting the nanostrands. The concentration of the aqueous nucleic acid solution is suitably 0.1 mg / mL or less. Further, the concentration of metal atoms constituting the nanostrand is preferably 20 times or more in terms of the concentration of the nucleobase constituting the nucleic acid. It has been confirmed that the lower limit of the nucleic acid concentration relative to the nanostrand concentration is, for example, that 95% or more of DNA can be captured when the DNA concentration is 4.0 × 10 −5 mg / ml. That is, the nanostrand of the invention of this application can capture an extremely low concentration of nucleic acid.
上記のようにナノストランドと核酸を接触させることによって、核酸を捕捉（結合）して、ナノ複合体を形成させることができる。このナノ複合体は、遠心分離や濾過等で分離することが可能である。ナノ複合体は、核酸の濃度が高い場合、ゲル状の物質として得られ、核酸の濃度が低い場合、水溶液に分散したまま存在する。いずれの場合においても、ナノ複合体は、0.2μｍ程度の細孔を有するフィルターで濾過、分離することが可能であ
る。
By contacting the nanostrand and the nucleic acid as described above, the nucleic acid can be captured (bound) to form a nanocomposite. This nanocomposite can be separated by centrifugation or filtration. The nanocomposite is obtained as a gel-like substance when the concentration of nucleic acid is high, and exists in a dispersed state in an aqueous solution when the concentration of nucleic acid is low. In any case, the nanocomposite can be filtered and separated with a filter having pores of about 0.2 μm.
このナノ複合体を形成させた後、上記に例示した各種の配位性化合物の添加、または、液性を弱酸性（pH 3.0-pH 5.0の範囲が好ましい）とすることにより、ナノストランドが
消失する。前者の場合、ナノストランドを構成している金属原子に錯化させるのに十分な量の配位性化合物を加えればよい。配位性化合物は、水溶液として添加することが好ましく、ナノ複合体の水溶液に近いpHに調製して添加することがより好ましい。たとえば、水酸化カドミウムのナノストランドとDNAとのナノ複合体からDNAを解放させるためには、EDTA・3NaOH水溶液（90ｍM、pH 7.7）を用いることが好ましい。ナノ複合体からの核酸の解放の程度は、先の0.2μｍ程度の細孔を有すフィルターによる分離実験から評価すること
が可能である。
After forming this nanocomposite, nanostrands disappear by adding various coordination compounds exemplified above or making the liquid property weakly acidic (preferably in the range of pH 3.0-pH 5.0) To do. In the former case, a sufficient amount of the coordinating compound may be added to complex the metal atoms constituting the nanostrand. The coordination compound is preferably added as an aqueous solution, and more preferably prepared by adding a pH close to that of the aqueous solution of the nanocomposite. For example, in order to release DNA from a nanocomplex of cadmium hydroxide nanostrands and DNA, it is preferable to use an EDTA · 3NaOH aqueous solution (90 mM, pH 7.7). The degree of nucleic acid release from the nanocomposite can be evaluated from the separation experiment using the filter having pores of about 0.2 μm.
この出願の発明は、ナノ複合体を前記のフィルターを用いて、濾過することによりナノ複合体を取り除くことができ、その結果、ナノ複合体を構成している核酸も除去することができる。すなわち、この出願の発明は、核酸を除去するための方法として用いることができる。 In the invention of this application, the nanocomposite can be removed by filtering the nanocomposite using the above-mentioned filter, and as a result, the nucleic acid constituting the nanocomposite can also be removed. That is, the invention of this application can be used as a method for removing nucleic acids.
さらには、核酸を効率よく分離、精製、あるいは、濃縮することのできる核酸処理方法として、ナノ複合体を前記フィルターを用いた濾過により分取し、このナノ複合体に配位性化合物の添加、または、このナノ複合体を含有する水溶液の液性を弱酸性（pH 3.0-pH 5.0の範囲が好ましい）とすることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランド
を消失させることに基づいた核酸処理方法としても活用することができる。
Furthermore, as a nucleic acid treatment method capable of efficiently separating, purifying, or concentrating nucleic acid, the nanocomposite is separated by filtration using the filter, and a coordinating compound is added to the nanocomposite. Alternatively, a nucleic acid based on eliminating the nanostrands contained in the nanocomposite by making the liquidity of the aqueous solution containing the nanocomposite weakly acidic (preferably in the range of pH 3.0-pH 5.0) It can also be used as a processing method.
なお、ナノ複合体の分取には、上記のフィルターを利用する以外に、遠心分離処理によって行うことも可能である。 In addition, the nanocomposite can be separated by centrifugation other than using the above-described filter.
次に、実施例を示して、この出願の発明の特徴をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、適宜変更することができる。したがって、この出願の発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。
（実施例１）
実施例１として、カドミウム塩の水溶液のpHを適当な範囲に設定することで、水酸化カドミウムのナノストランドが形成されることを示すために、透過型電子顕微鏡による観察を行った。
Next, the features of the invention of this application will be described more specifically with reference to examples. In addition, the material, usage-amount, ratio, processing content, processing procedure, etc. which are shown in the following Examples can be changed suitably. Therefore, the invention of this application is not limited by the following examples.
(Example 1)
As Example 1, observation with a transmission electron microscope was performed to show that nanostrands of cadmium hydroxide were formed by setting the pH of an aqueous solution of a cadmium salt to an appropriate range.
16mMの水酸化ナトリウム水溶液の所定量に純水を加えて20mLにする。この水溶液を、4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液20mLに激しく攪拌しながら一気に加える。図
１には、16mMの水酸化ナトリウム水溶液の使用量に対し、硝酸カドミウムの水溶液との混合後のpHをプロットした。水溶液のpHは、水酸化ナトリウムの使用量とともに変化する。硝酸カドミウム単独の水溶液は、pH 5.44であるが、水酸化ナトリウムの使用量が2mLでは、pH 8.19となる。pH値は、水酸化カドミウムの使用量が硝酸カドミウムに対して2倍量（すなわち、10mL）になるまで緩やかに上昇し、その後、急激に上昇する。pH 9以上の水溶液では、暫くして白色の沈殿が生じてくる。なお、実施例１での全ての溶液には、混合の際のpHの局所的な上昇を緩和するため、少量のポリアクリルアミン塩酸塩（モノマーの濃度として0.2mM）を加えてある。
Add pure water to a predetermined amount of 16 mM sodium hydroxide solution to make 20 mL. This aqueous solution is added all at once to 20 mL of an aqueous solution of 4 mM cadmium nitrate (Cd (NO 3 ) 2 ) with vigorous stirring. In FIG. 1, the pH after mixing with an aqueous solution of cadmium nitrate is plotted against the amount of 16 mM aqueous sodium hydroxide used. The pH of the aqueous solution varies with the amount of sodium hydroxide used. The aqueous solution of cadmium nitrate alone has a pH of 5.44, but when the amount of sodium hydroxide used is 2 mL, the pH is 8.19. The pH value gradually increases until the amount of cadmium hydroxide used is double that of cadmium nitrate (ie, 10 mL), and then increases rapidly. In an aqueous solution having a pH of 9 or more, a white precipitate is formed after a while. A small amount of polyacrylamine hydrochloride (monomer concentration of 0.2 mM) was added to all the solutions in Example 1 in order to alleviate the local increase in pH during mixing.
図中の矢印で示したpHにおいて、約1mLの水溶液を清浄なガラス基板上に展開し、透過
型電子顕微鏡用のマイクログリットを浮かべて1分間放置し、過剰に吸着した水溶液を濾
紙で拭った後、常温で乾燥させた。
At the pH indicated by the arrow in the figure, about 1 mL of the aqueous solution was spread on a clean glass substrate, and the microgrit for a transmission electron microscope was floated and left for 1 minute, and the excessively adsorbed aqueous solution was wiped with filter paper. Then, it was dried at room temperature.
図２から４には、このようにして得られた試料の透過型電子顕微鏡像を合わせて示す。なお、図１中に示した矢印aは図２と、矢印bは図３と、矢印cは図４とそれぞれ対応して
いる。pH 8.43の試料（図２）では、極めて細いナノストランドが形成されており、その
長さは、数マイクロメートルを超えるものもある。pH 8.59の試料（図３）では、直径200nm程度の球状の塊が見られる。この塊は、pH 8.75（図４）で六角形の微結晶へと成長す
る。この微結晶は、六方晶系の水酸化カドミウムである。
FIGS. 2 to 4 also show transmission electron microscope images of the samples thus obtained. 1 corresponds to FIG. 2, arrow b corresponds to FIG. 3, and arrow c corresponds to FIG. In the sample of pH 8.43 (FIG. 2), extremely thin nanostrands are formed, and the length thereof may exceed several micrometers. In the sample of pH 8.59 (FIG. 3), a spherical lump with a diameter of about 200 nm is seen. This mass grows into hexagonal microcrystals at pH 8.75 (FIG. 4). This microcrystal is hexagonal cadmium hydroxide.
本実施例では、カドミウム塩の水溶液のpHを適当な範囲に設定することで、幅が3nm以
下の水酸化カドミウムのナノストランドを優先的に形成できることを示している。また、図１から明らかなように、ナノストランドの長さは直径の100倍以上であり、曲率半径は20nm以上である。
（実施例２）
実施例２として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが形成されることを示すために、高分解能透過型電子顕微鏡による観察を行った。
This example shows that cadmium hydroxide nanostrands having a width of 3 nm or less can be preferentially formed by setting the pH of an aqueous solution of a cadmium salt to an appropriate range. As is clear from FIG. 1, the length of the nanostrand is 100 times or more of the diameter, and the radius of curvature is 20 nm or more.
(Example 2)
As Example 2, observation with a high-resolution transmission electron microscope was performed to show that rigid nanostrands of cadmium hydroxide were formed.
4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液20mLに、2mMの水酸化ナトリウム水溶液20mLを激しく攪拌しながら一気に加えた。この水溶液を5日間室温で放置した。溶液のpHは
、7.95であった。この水溶液の約1mLを清浄なガラス基板上に展開し、高分解能電子顕微
鏡観察用のマイクログリットを浮かべて1分間放置し、過剰に吸着した溶液を濾紙で拭っ
た後、常温で乾燥させた。図５から図７には、このようにして得られた試料の透過型電子顕微鏡像を示す。図５、図６、図７は、それぞれ異なる倍率（各図中のスケールバーを参照）で撮影されたものである。
To 20 mL of an aqueous solution of 4 mM cadmium nitrate (Cd (NO 3 ) 2 ), 20 mL of a 2 mM sodium hydroxide aqueous solution was added all at once with vigorous stirring. This aqueous solution was left at room temperature for 5 days. The pH of the solution was 7.95. About 1 mL of this aqueous solution was spread on a clean glass substrate, and the microgrit for high-resolution electron microscope observation was floated and left for 1 minute. The excessively adsorbed solution was wiped with filter paper, and then dried at room temperature. 5 to 7 show transmission electron microscope images of the samples thus obtained. 5, 6, and 7 are taken at different magnifications (see the scale bar in each figure).
図５および図６から明らかなように、ナノストランドは、約2nmの一定の幅を有する。
図５および図６より高倍率で撮影した図７では、幅1.9nmのナノストランドに沿って斜め
に0.26nmの周期構造を確認することができる。
As is apparent from FIGS. 5 and 6, the nanostrand has a constant width of about 2 nm.
In FIG. 7 taken at a higher magnification than FIGS. 5 and 6, a periodic structure of 0.26 nm can be confirmed obliquely along a nanostrand having a width of 1.9 nm.
図８には、水酸化カドミウムの結晶学的データ（Structure axes：hexagonal、ａ：3.496Å、ｃ：4.702Å、Space group：P-3m1）を用いて計算されたナノストランドの推定構
造の模式図を例示した。まず、ナノストランドの直径（1.9nm）から、水酸化カドミウム
のユニットセルが7つ配列していることを推定し、その断面が六角形であると仮定した。
この37個のユニットセルのプレートを1ユニットづつずらしてパッキングした。このよう
にして得られた推定構造では、ナノストランドの成長方向に対して斜めの0.26nmの周期構造が完全に再現できている。
Fig. 8 is a schematic diagram of the estimated structure of nanostrands calculated using crystallographic data of cadmium hydroxide (Structure axes: hexagonal, a: 3.496 mm, c: 4.702 mm, Space group: P-3m1). Was illustrated. First, it was estimated from the nanostrand diameter (1.9 nm) that seven unit cells of cadmium hydroxide were arranged, and the cross section was assumed to be hexagonal.
The 37 unit cell plates were packed by shifting one unit at a time. In the estimated structure obtained in this way, a periodic structure of 0.26 nm oblique to the nanostrand growth direction can be completely reproduced.
以上の結果から、本実施例のナノストランドが水酸化カドミウムと同じ単位格子から形成されており、1.9nmという極めて細い構造にも関わらず、結晶性の剛直なナノストラン
ドであることが確認できた。
（実施例３）
実施例３として、ナノストランド全体の5%以上の金属原子が正に荷電している水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが形成できることを示すために、色素分子（Evans Blue）による滴定を行った。
From the above results, it was confirmed that the nanostrands of this example were formed from the same unit cell as cadmium hydroxide and were crystalline rigid nanostrands despite the extremely thin structure of 1.9 nm. .
(Example 3)
As Example 3, titration with a dye molecule (Evans Blue) was performed to show that a rigid nanostrand of cadmium hydroxide in which 5% or more of metal atoms in the entire nanostrand are positively charged can be formed.
4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液200mLに、4mMの水酸化ナトリウム水溶液200mLを激しく攪拌しながら一気に加えた。この水溶液の所定量に純水を加えて24mLにし、1mMのEvans Blue水溶液（1mL）を攪拌しながら加え、1時間室温で放置した。Evans Blue
の最終的な濃度は、0.04mMである。また、水酸化カドミウムのナノストランドの使用量（すなわち、前述の所定量）は、カドミウム原子の最終的な濃度に換算して、0mM、0.16mM
、0.32mM、0.48mM、0.64mM、0.80mM、0.96mMとなるようにした。
To 200 mL of an aqueous solution of 4 mM cadmium nitrate (Cd (NO 3 ) 2 ), 200 mL of an aqueous 4 mM sodium hydroxide solution was added all at once with vigorous stirring. Pure water was added to a predetermined amount of this aqueous solution to 24 mL, 1 mM Evans Blue aqueous solution (1 mL) was added with stirring, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Evans Blue
The final concentration of is 0.04 mM. In addition, the amount of cadmium hydroxide nanostrand used (that is, the above-mentioned predetermined amount) is 0 mM and 0.16 mM in terms of the final concentration of cadmium atoms.
0.32 mM, 0.48 mM, 0.64 mM, 0.80 mM, and 0.96 mM.
次に、上記７つの水溶液をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。 Next, each of the seven aqueous solutions was filtered with a Whatman PVDF filter having 0.2 μm pores, and the ultraviolet and visible absorption spectra of the filtrate were measured.
図９に例示したように、608nmに位置するEvans Blueの吸収ピークは、ナノストランド
の混合量を段階的に増やすことで、化学量論的に減少した。このことは、ナノストランドとEvans Blueからなる一定組成の沈殿が得られていることを意味する。全ての色素分子を沈殿させるのに必要なナノストランドの使用量は、カドミウム原子数に換算してEvans Blue分子の24倍であった。図中に示すように、この色素が4つのアニオン電荷を有すること
を考慮すると、ナノストランドを構成するカドミウム原子の約6分の1が正に荷電しているものと考えられる。
As illustrated in FIG. 9, the absorption peak of Evans Blue located at 608 nm was decreased stoichiometrically by increasing the amount of nanostrand mixed stepwise. This means that a precipitate with a constant composition consisting of nanostrands and Evans Blue is obtained. The amount of nanostrand used to precipitate all the dye molecules was 24 times that of Evans Blue molecules in terms of cadmium atoms. As shown in the figure, considering that this dye has four anionic charges, it is considered that about one-sixth of the cadmium atoms constituting the nanostrand are positively charged.
図１０は、実施例２での推定構造において、六角形のプレートの頂点が正に荷電していると仮定した場合の構造を例示した模式図である。この場合、断面の37個のカドミウム原子の中で6個のカドミウム原子が正に荷電しており、全体のカドミウム原子数の約6分の1
が正に荷電していることを説明することができる。
FIG. 10 is a schematic view illustrating the structure when it is assumed that the apex of the hexagonal plate is positively charged in the estimated structure in the second embodiment. In this case, of the 37 cadmium atoms in the cross section, 6 cadmium atoms are positively charged, approximately 1/6 of the total number of cadmium atoms.
Can be explained as being positively charged.
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムによる剛直なナノストランドにおいて、ナノストランド全体の5%以上の金属原子が正に荷電していることを確認することができた。
（実施例４）
実施例４として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがDNAを捕捉（結合）し、
配位性化合物の添加によりナノストランドが消失し、DNAが解放されることを示すために
、紫外・可視吸収スペクトルの測定を行った。
Salmon sperm DNA（200〜2500bp、1mg/mL）とHoechst 33342（0.04mg/mL）を含む溶液（DNA混合溶液）を調製し、4℃で2日間放置した。この溶液1mLを24mLの純水に希釈した（溶
液1）。一方、4mMの硝酸カドミウムの水溶液20mLに、2mM水酸化ナトリウム水溶液40mLを
激しく攪拌しながら一気に加えた。この溶液24mLに、先のDNA混合溶液1mLを加えると、瞬時に白色のゲルが形成した（溶液2）。図１１に、溶液1と溶液2の様子を写真として例示
した。さらに、別に準備した白色のゲルを含む溶液2に、90mMのEDTA・3NaOH水溶液（pH 7.72）を１mL加えると、ゲルが完全に消失した（溶液3）。また、コントロール実験として、先のDNA混合溶液1mLを1.33mMの硝酸カドミウム水溶液24mLと混合した（溶液4）。
From the above results, it was confirmed that 5% or more of metal atoms in the whole nanostrand were positively charged in the rigid nanostrand made of cadmium hydroxide in this example.
Example 4
As Example 4, rigid cadmium hydroxide nanostrands capture (bind) DNA,
In order to show that nanostrands disappear and DNA is released by the addition of a coordinating compound, ultraviolet and visible absorption spectra were measured.
A solution (DNA mixed solution) containing Salmon sperm DNA (200-2500 bp, 1 mg / mL) and Hoechst 33342 (0.04 mg / mL) was prepared and allowed to stand at 4 ° C. for 2 days. 1 mL of this solution was diluted in 24 mL of pure water (Solution 1). On the other hand, 40 mL of a 2 mM sodium hydroxide aqueous solution was added to 20 mL of an aqueous solution of 4 mM cadmium nitrate all at once with vigorous stirring. When 1 mL of the previous DNA mixed solution was added to 24 mL of this solution, a white gel was instantaneously formed (Solution 2). FIG. 11 illustrates the state of Solution 1 and Solution 2 as photographs. Furthermore, when 1 mL of 90 mM EDTA · 3NaOH aqueous solution (pH 7.72) was added to Solution 2 containing a white gel prepared separately, the gel completely disappeared (Solution 3). As a control experiment, 1 mL of the above DNA mixed solution was mixed with 24 mL of 1.33 mM cadmium nitrate aqueous solution (solution 4).
上記4つの水溶液をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、
濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図１２に示す。溶液1のスペク
トルは、フィルターで濾過する前と全く同じであった。すなわち、Salmon sperm DNAは、0.2μmの細孔のPVDFフィルターを通過することができる。溶液1のスペクトルにおいて、258nmでの吸収ピークは、主にDNA鎖の複素環に、353nmの吸収ピークは、DNA鎖にインター
カレートしたHoechst 33342に由来する。ナノストランドと混合した溶液2では、DNA鎖やHoechst 33342に由来する吸収ピークが全く観察されない。即ち、全てのDNA鎖は、ナノス
トランドと結合してゲル化し、フィルターで除去されている。一方、EDTAを加えた溶液3
では、これらピーク強度が完全に回復する。この結果は、ナノストランドを構成していたカドミウムイオンがEDTA-Cd2+錯体を形成し、ナノストランド自身が消失したため、ナノ
ストランドに拘束されていたDNAが解放されたことを示している。
The above four aqueous solutions are filtered through Whatman PVDF filters each having 0.2 μm pores.
The ultraviolet / visible absorption spectrum of the filtrate was measured. The result is shown in FIG. The spectrum of Solution 1 was exactly the same as before filtering through a filter. That is, Salmon sperm DNA can pass through a PVDF filter with 0.2 μm pores. In the spectrum of Solution 1, the absorption peak at 258 nm is mainly derived from the heterocycle of the DNA strand, and the absorption peak at 353 nm is derived from Hoechst 33342 intercalated into the DNA strand. In solution 2 mixed with nanostrands, no absorption peaks derived from DNA strands or Hoechst 33342 are observed. That is, all the DNA strands are combined with nanostrands to be gelled and removed with a filter. Meanwhile, EDTA added solution 3
Then, these peak intensities are completely recovered. This result indicates that the cadmium ions constituting the nanostrands formed an EDTA-Cd 2+ complex, and the nanostrands themselves disappeared, so that the DNA bound to the nanostrands was released.
また、コントロール実験として調製した溶液4では、溶液1と比較して吸収ピークの強度がやや減少した。この結果は、DNA鎖がカドミウムイオンによって僅かに凝集しているこ
とを示している。しかしながら、カドミウムイオンによる凝集の効果は、ナノストランドによるゲル化の効果より著しく小さい。
Further, in Solution 4 prepared as a control experiment, the intensity of the absorption peak was slightly reduced as compared with Solution 1. This result indicates that the DNA strand is slightly aggregated by cadmium ions. However, the effect of aggregation by cadmium ions is significantly smaller than the effect of gelation by nanostrands.
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが、DNAを捕捉
（結合）し、配位性化合物の添加により消失し、DNAを解放することが確認できた。
（実施例５）
実施例５として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがDNAを効率的に捕捉する
ことを示すために、蛍光スペクトルの測定を行った。
From the above results, it was confirmed that the cadmium hydroxide rigid nanostrand of this example captured (bonded) DNA, disappeared by addition of a coordination compound, and released DNA.
(Example 5)
As Example 5, fluorescence spectra were measured to show that rigid cadmium hydroxide nanostrands capture DNA efficiently.
Salmon sperm DNA（200〜2500bp、1mg/mL）とHoechst 33342（0.04mg/mL）を含む溶液
（DNA混合溶液）を調製し、4℃で2日間放置した。この溶液を純水で10分の1に希釈した（希釈溶液）。この希釈溶液10μLを24.99mLの純水に希釈した（溶液1）。一方、4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液20mLに、2mM水酸化ナトリウム水溶液40mLを激しく攪
拌しながら一気に加えた。この溶液24.99mLに、先の希釈溶液10μLを加えた（溶液2）。
溶液1と溶液2をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、濾液の蛍光スペクトルを測定した。その結果を図１３に示す。溶液1では、360nmの励起光を照射すると、450nmにピークをもつHoechst 33342の蛍光スペクトルが得られた。一方、溶液2
では、この蛍光が確認できない。この実験条件では、DNAとHoechst 33342の濃度は、それぞれ、4.0×10-5mg/mL、1.6×10-6mg/mLである。このような条件でもDNAの少なくとも95
％は、PVDFフィルターによって濾過されている。
A solution (DNA mixed solution) containing Salmon sperm DNA (200-2500 bp, 1 mg / mL) and Hoechst 33342 (0.04 mg / mL) was prepared and allowed to stand at 4 ° C. for 2 days. This solution was diluted 1/10 with pure water (diluted solution). 10 μL of this diluted solution was diluted in 24.99 mL of pure water (Solution 1). Meanwhile, 40 mL of a 2 mM sodium hydroxide aqueous solution was added to 20 mL of an aqueous solution of 4 mM cadmium nitrate (Cd (NO 3 ) 2 ) at a stretch while vigorously stirring. To 24.99 mL of this solution, 10 μL of the previous diluted solution was added (Solution 2).
Solution 1 and solution 2 were each filtered through Whatman PVDF filters having 0.2 μm pores, and the fluorescence spectra of the filtrates were measured. The result is shown in FIG. In solution 1, when the excitation light of 360 nm was irradiated, a fluorescence spectrum of Hoechst 33342 having a peak at 450 nm was obtained. Meanwhile, solution 2
Then, this fluorescence cannot be confirmed. Under these experimental conditions, the concentrations of DNA and Hoechst 33342 are 4.0 × 10 −5 mg / mL and 1.6 × 10 −6 mg / mL, respectively. At least 95% of DNA under these conditions
% Is filtered by PVDF filter.
図１４には、実施例５でのHoechst 33342を含んだDNA鎖と水酸化カドミウムのナノストランドから形成されたゲルの構造を模式的に例示した。本実施例のナノストランドは、DNA鎖（直径2nm）とほぼ同じ幅をもち、結晶性で剛直であり、かつ表面に正電荷が高密度にかつ周期的に配列していると考えられる。このため、DNA鎖との相補的な静電相互作用が
可能となり、低濃度のDNAを効率的に捕捉、結合する。この図１４に示すように、DNA鎖とナノストランドは、多くの部分で平行に配向しており、静電的に強く吸着しているものと考えられる。また、DNA鎖とナノストランドは、互いに橋架することで、ゲルを形成する
。この結果、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドは、DNAを効率的に捕
捉、結合することが可能となる。
（実施例６）
実施例６として、水酸化カドミウムの剛直なナノストランドがRNAを結合し、弱酸性に
することでナノストランドが消失し、RNAが解放されることを示すために、紫外・可視吸
収スペクトルの測定を行った。
FIG. 14 schematically illustrates the structure of a gel formed from a DNA strand containing Hoechst 33342 and a nanostrand of cadmium hydroxide in Example 5. The nanostrands of the present example are considered to have substantially the same width as the DNA strand (diameter 2 nm), are crystalline and rigid, and have positive charges periodically and densely arranged on the surface. This enables complementary electrostatic interaction with the DNA strand, and efficiently captures and binds low concentrations of DNA. As shown in FIG. 14, DNA strands and nanostrands are oriented in parallel in many parts, and are considered to be strongly adsorbed electrostatically. Further, the DNA strand and the nanostrand form a gel by bridging each other. As a result, the rigid nanostrand of cadmium hydroxide of this example can efficiently capture and bind DNA.
(Example 6)
As Example 6, a cadmium hydroxide rigid nanostrand binds RNA and makes it weakly acidic so that the nanostrand disappears and the RNA is released. went.
Baker's Yeast RNA（1mg/mL）を含む溶液（RNA溶液）を調製し、4℃で2日間放置した。この溶液1mLを24mLの純水に希釈した（溶液1）。一方、4mMの硝酸カドミウム（Cd（NO3）2）の水溶液5mLに、0.211mM水酸化ナトリウム水溶液95mLを激しく攪拌しながら一気に加
えた。この溶液24mLに、先のRNA溶液1mL を加えた（溶液2）。さらに、別に準備した溶液2に、160mMの塩酸水溶液を50μLを加えた（溶液3）。また、コントロール実験として、先のRNA溶液1mLを0.2mMの硝酸カドミウム水溶液24mLと混合した（溶液4）。
A solution (RNA solution) containing Baker's Yeast RNA (1 mg / mL) was prepared and left at 4 ° C. for 2 days. 1 mL of this solution was diluted in 24 mL of pure water (Solution 1). On the other hand, 95 mL of 0.211 mM sodium hydroxide aqueous solution was added all at once to 5 mL of 4 mM cadmium nitrate (Cd (NO 3 ) 2 ). To 24 mL of this solution, 1 mL of the above RNA solution was added (Solution 2). Further, 50 μL of 160 mM hydrochloric acid aqueous solution was added to Solution 2 separately prepared (Solution 3). As a control experiment, 1 mL of the RNA solution was mixed with 24 mL of a 0.2 mM cadmium nitrate aqueous solution (solution 4).
上記4つの水溶液をそれぞれ0.2μmの細孔を有するWhatman PVDFフィルターで濾過し、
濾液の紫外・可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図１５に示した。溶液1のスペ
クトルは、フィルターで濾過する前と全く同じであった。すなわち、Baker's Yeast RNA
は、0.2μmの細孔のPVDFフィルターを通過することができる。溶液1のスペクトルにおい
て、258nmでの吸収ピークは、RNA鎖の複素環に由来する。ナノストランドと混合した溶液2では、DNA鎖の複素環に由来する吸収ピークが47％減少した。すなわち、一部のRNA鎖は
、ナノストランドと結合し、フィルターで除去されている。一方、HCLを加えた溶液3では、このピークの強度が増加する。この結果は、ナノストランドを構成していたカドミウムイオンが再溶解し、ナノストランド自身が消失したため、ナノストランドに拘束されていたRNAが解放されたことを示している。
The above four aqueous solutions are filtered through Whatman PVDF filters each having 0.2 μm pores.
The ultraviolet / visible absorption spectrum of the filtrate was measured. The results are shown in FIG. The spectrum of Solution 1 was exactly the same as before filtering through a filter. That is, Baker's Yeast RNA
Can pass through a PVDF filter with 0.2 μm pores. In the spectrum of Solution 1, the absorption peak at 258 nm is derived from the heterocycle of the RNA strand. In solution 2 mixed with nanostrands, the absorption peak derived from the heterocycle of the DNA strand was reduced by 47%. That is, some RNA strands are bonded to nanostrands and removed by a filter. On the other hand, in the solution 3 to which HCL is added, the intensity of this peak increases. This result indicates that the cadmium ions constituting the nanostrand were redissolved and the nanostrand itself disappeared, so that the RNA bound to the nanostrand was released.
そして、コントロール実験として調製した溶液4では、溶液1と比較して吸収ピークの強度がやや減少した。この結果は、RNA鎖がカドミウムイオンによって僅かに凝集すること
を示している。
In Solution 4 prepared as a control experiment, the intensity of the absorption peak was slightly reduced as compared with Solution 1. This result indicates that the RNA strand is slightly aggregated by cadmium ions.
以上の結果から、本実施例の水酸化カドミウムの剛直なナノストランドが、RNAを捕捉
（結合）し、弱酸性にすることで消失され、RNAを解放することを確認することができた
。
From the above results, it was confirmed that the rigid cadmium hydroxide nanostrands of this example were eliminated by capturing (binding) RNA and making it weakly acidic to release RNA.
なお、実施例６では、ナノストランドの濃度を実施例４の15%に設定している。この値
は、カドミウム元素の濃度として0.2mMに対応し、正に荷電したカドミウムイオンの濃度
として、0.033mMに対応する。一方、実施例６の実験条件下のRNAの濃度は、0.04mg/mLで
ある。この値は、RNAのユニット分子量を350とすると、0.114mMに対応することとなる。
したがって、混合溶液中のナノストランドが有する正の荷電量は、RNAの負の荷電量の約30％に相当する。実施例６におけるRNAの結合率は47％であり、RNAを効率的に捕捉・結合
していると言える。
In Example 6, the concentration of nanostrands is set to 15% of Example 4. This value corresponds to 0.2 mM as the concentration of the cadmium element and corresponds to 0.033 mM as the concentration of the positively charged cadmium ions. On the other hand, the concentration of RNA under the experimental conditions of Example 6 is 0.04 mg / mL. This value corresponds to 0.114 mM when the unit molecular weight of RNA is 350.
Therefore, the positive charge amount of the nanostrand in the mixed solution corresponds to about 30% of the negative charge amount of RNA. The binding rate of RNA in Example 6 is 47%, and it can be said that RNA is efficiently captured and bound.
この出願の発明は、金属酸化物を主成分とし、核酸を効率的に捕捉（結合）するための優れた化学的、構造的な特徴を有するナノストランドを提供する。また、このナノストランドは、配位性化合物の添加、あるいは弱酸性にすることで消失し、核酸を解放することができる。このため、微量な生体試料からの核酸の抽出あるいは除去、核酸の分離や精製や濃縮などを効率的に行うことが可能となる。その結果、この出願の発明のナノストランドは、遺伝子診断やDNA鑑定、核酸に関連する医学的、生物学的な研究や治療等に役立ち
、また、水溶液中の核酸の機能を一時的に抑制することにも利用できる。
The invention of this application provides a nanostrand having an excellent chemical and structural characteristic for containing (capturing) nucleic acids efficiently based on a metal oxide as a main component. Further, the nanostrand can be eliminated by adding a coordinating compound or by making it weakly acidic to release nucleic acids. For this reason, it becomes possible to efficiently perform extraction or removal of nucleic acid from a very small amount of biological sample, separation, purification and concentration of nucleic acid. As a result, the nanostrand of the invention of this application is useful for genetic diagnosis, DNA identification, medical and biological research and treatment related to nucleic acids, and temporarily inhibits the function of nucleic acids in aqueous solutions. It can also be used.
この出願の発明のナノストランドと核酸との結合により精製されるナノ複合体は、DNA
の保存、安定化、あるいは固定化手法としても魅力的であり、核酸の新しいマニピュレーション手法として期待することができる。
The nanocomplex purified by the combination of the nanostrand of the invention of this application and the nucleic acid is DNA
It is also attractive as a storage, stabilization, or immobilization technique for nucleic acids, and can be expected as a new manipulation technique for nucleic acids.
Claims (12)
ることを特徴とする請求項１のナノストランド。 The nanostrand according to claim 1, wherein the metal oxide is formed from a mixed solution of an aqueous solution of a salt of a divalent metal ion and a basic aqueous solution.
ンド。 The nanostrand according to claim 2, wherein the salt of the divalent metal ion is a cadmium salt.
ンド。 The nanostrand according to claim 2, wherein the liquid property of the mixed solution is in the range of pH 5.0 to pH 9.0.
も100倍以上であり、曲率半径が少なくとも20nm以上であることを特徴とする請求項１か
ら４いずれかのナノストランド。 The crystalline structure has an equivalent circle diameter in the range of 1.0-3.0 nm, a length of at least 100 times the equivalent circle diameter, and a radius of curvature of at least 20 nm. Any nanostrand.
れかのナノストランド。 8. The nanostrand according to any one of claims 1 to 7, wherein the nanostrand is eliminated by adding an acidic aqueous solution to adjust the liquidity of the aqueous solution containing the nanostrand to a range of pH 3.0 to pH 5.0. .
を消失させて、核酸が解放されることを特徴とする核酸処理方法。 A nanostrand contained in the nanocomposite by adding a coordinating compound to the nanocomposite of claim 9 or by setting the liquidity of the aqueous solution containing the nanocomposite to a range of pH 3.0 to pH 5.0. A method for treating nucleic acid, wherein the nucleic acid is released by eliminating the nucleic acid.
ることにより、このナノ複合体中に含まれるナノストランドを消失させて、核酸が分離、精製または濃縮されることを特徴とする核酸処理方法。 The nanocomposite according to claim 9 is separated by filtration, and a coordinating compound is added to the nanocomposite, or the liquidity of the aqueous solution containing the nanocomposite is adjusted to a range of pH 3.0 to pH 5.0. By doing so, the nanostrand contained in this nanocomplex is lose | disappeared, A nucleic acid is separated, refine | purified or concentrated, The nucleic acid processing method characterized by the above-mentioned.
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