JP2005080508A - Method for testing lipid metabolism improving agent - Google Patents

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Iichiro Shimomura
伊一郎 下村
Shizuya Yamashita
静也 山下
Keita Kouno
圭太 河野
Tetsuya Shimizugawa
哲也 清水川
Takafumi Furuhama
孝文 古濱
Mitsuru Shimamura
満 島村
Hiroaki Yasukumo
浩明 安雲
Ryuta Koishi
龍太 小石
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening a substance causing lowering of an activity of endothelial lipase, a method for testing therapeutic or prophylactic effects on one or two or more diseases selected from hyperlipemia, hypoHDLemia (hypo-high-density lipoproteinemia), arteriosclerosis and hyperglycemia, a method for determining HDL cholesterol, phosholipids, ANGPTL3 (angiopoietin-like 3) and ANGPTL4 (angiopoietin-like 4) and a medicinal composition for treatment or prophylaxis of the one or two or more diseases selected from the hyperlipemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia. <P>SOLUTION: The method for screening, etc., of the substance causing the lowering of the activity of endothelial lipase [hereinafter referred to as EL] comprises the following steps (1) and (2). (1) a step of bringing a test substance into contact with the ANGPTL3 or the ANGPTL4 and the EL and a substrate thereof and assaying the activity of the EL and (2) a step of selecting the substance causing the lowering of the activity of the EL. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法、該方法によって得られる物質、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、該方法によって得られる物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４又の定量方法等の技術分野に関する。   The present invention relates to a method for screening a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, a substance obtained by the method, one or more selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia The present invention relates to a technical field such as a method for testing the therapeutic or prophylactic effect of a disease, a substance obtained by the method, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4 or a quantification method.

血清脂質の大部分はアポリポタンパク質と複合体をなして、血清リポタンパク質として存在しており、それらは密度の違いにより、カイロミクロン、ＶＬＤＬ（超低比重リポタンパク質）、ＬＤＬ（低比重リポタンパク質）、ＨＤＬ（高比重リポタンパク質）などに分類される。なかでもＨＤＬコレステロールは末梢組織の余剰なコレステロールを引き抜き肝臓へ転送する作用（所謂、コレステロール逆転送作用）を有し、抗動脈硬化作用のある脂質として広く認識されている。その血中ＨＤＬコレステロール濃度が臨床的に低い病態すなわち低HDLコレステロール血症は高ＬＤＬコレステロール血症と並び、虚血性心疾患などの動脈硬化性疾患を発症させる明確な危険因子として知られている。低HDLコレステロール血症と虚血性心疾患発症との関係については、その因果関係は明確にされており（例えば、非特許文献１参照。）、虚血性心疾患に対する独立した危険因子としての位置が確立され、その予防や治療が積極的に行なわれている。   Most of the serum lipids are complexed with apolipoproteins and exist as serum lipoproteins, which are different in density due to their different density, chylomicron, VLDL (very low density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein) And HDL (high density lipoprotein). Among them, HDL cholesterol has an action of extracting excess cholesterol from peripheral tissues and transferring it to the liver (so-called reverse cholesterol transfer action), and is widely recognized as a lipid having an anti-arteriosclerotic action. The pathological condition in which the blood HDL cholesterol concentration is clinically low, that is, low HDL cholesterolemia, along with high LDL cholesterolemia, is known as a clear risk factor for developing arteriosclerotic diseases such as ischemic heart disease. Regarding the relationship between low HDL cholesterolemia and the onset of ischemic heart disease, the causal relationship has been clarified (see, for example, Non-Patent Document 1), and the position as an independent risk factor for ischemic heart disease is It has been established and its prevention and treatment are actively conducted.

代表的な低ＨＤＬコレステロール血症治療剤としては、ニコチン酸誘導体、例えば、アシピモクスなどが医薬に供されているが、フラッシング等の副作用を高頻度で生じる。血中ＬＤＬコレステロール値を低下させ、ＨＤＬコレステロールを上昇させる薬剤として、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ ＣｏＡ）還元酵素を阻害するプラバスタチン、シンバスタチン等が医薬に供されている。またフィブリン酸系化合物、例えば、クロフィブラート、フェノフィブラートなども血中ＬＤＬコレステロール値を低下させ、ＨＤＬコレステロールを上昇させる薬剤として医薬に供されているが、これら薬剤のＨＤＬ上昇作用は十分ではなく、またフィブリン酸系化合物と一部のスタチン系化合物との併用は横紋筋融解のリスクが増加することが知られている。したがって、より副作用が少なく、かつ効果的なHDLコレステロール上昇作用を示す薬剤を得ることは、動脈硬化の治療及び・または予防により有用な薬剤を提供することになる。   As a typical therapeutic agent for low HDL cholesterolemia, nicotinic acid derivatives such as acipimox are used in medicine, but side effects such as flushing occur frequently. Pravastatin, simvastatin, and the like that inhibit 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG CoA) reductase are used as pharmaceuticals as drugs that lower blood LDL cholesterol and raise HDL cholesterol. Fibric acid compounds such as clofibrate and fenofibrate are also used in medicine as drugs that lower blood LDL cholesterol levels and raise HDL cholesterol, but these drugs do not have sufficient HDL raising action, Further, it is known that the combined use of fibric acid compounds and some statin compounds increases the risk of striated muscle melting. Therefore, obtaining a drug with fewer side effects and showing an effective HDL cholesterol raising action provides a useful drug for the treatment and / or prevention of arteriosclerosis.

エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase、以下「ＥＬ」ということもある。）は、主として血管内皮細胞にて産生され、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合しているリパーゼで、主としてＨＤＬコレステロール中のリン脂質を加水分解する活性を有しており、HDLコレステロールの代謝調節に関与している(例えば、特許文献１、２、３、４、非特許文献２及び３参照。)。本酵素の遺伝子を欠失させたモデルマウスは血中のＨＤＬコレステロールおよびそのアポタンパク質であるApo-AIが上昇すること(例えば、非特許文献４及び５参照。)、中和抗体投与により本酵素活性を阻害するとHDLコレステロールおよびApo-AIが上昇すること(例えば、非特許文献６参照。)、逆に本酵素の遺伝子を過剰発現させたモデルマウスはHDLコレステロールおよびApo-AIが低下すること(例えば、非特許文献４参照。)、アデノウィルス投与によって本酵素の発現を上昇させるとHDLコレステロールおよびApo-AIが低下すること等が知られている(例えば、非特許文献３参照。)。さらに、ヒト臨床検体の解析においてＥＬの遺伝子変異とＨＤＬコレステロールとの関連をつける報告も存在し(例えば、非特許文献５参照。)、ＥＬは抗動脈硬化作用のあるＨＤＬコレステロールの代謝調節に関与し、冠動脈硬化症の発症に寄与している可能性がある。   Endothelial lipase (hereinafter also referred to as “EL”) is a lipase produced mainly in vascular endothelial cells and bound to heparan sulfate proteoglycans on the cell surface, and mainly contains phospholipids in HDL cholesterol. It has a hydrolytic activity and is involved in the regulation of HDL cholesterol metabolism (see, for example, Patent Documents 1, 2, 3, and 4, Non-Patent Documents 2 and 3). In model mice lacking the gene of this enzyme, HDL cholesterol in the blood and Apo-AI, which is an apoprotein thereof, increase (for example, see Non-patent Documents 4 and 5), and the enzyme is administered by neutralizing antibody administration. Inhibiting the activity increases HDL cholesterol and Apo-AI (see, for example, Non-Patent Document 6), and conversely, HDL cholesterol and Apo-AI decrease in model mice overexpressing the gene of this enzyme ( For example, see Non-patent Document 4), and it is known that HDL cholesterol and Apo-AI decrease when the expression of the enzyme is increased by adenovirus administration (see Non-Patent Document 3, for example). Furthermore, there are reports that relate the relationship between EL gene mutations and HDL cholesterol in the analysis of human clinical specimens (see, for example, Non-Patent Document 5), and EL is involved in the metabolic regulation of HDL cholesterol that has anti-arteriosclerotic action. And may contribute to the development of coronary atherosclerosis.

「アンジオポエチン関連タンパク質３」（以下、「ＡＮＧＰＴＬ３」ということもある。）及び「アンジオポエチン関連タンパク質４」（以下、「ＡＮＧＰＴＬ４」、ということもある。）は血中の中性脂肪の濃度を上昇させる機能を有する蛋白質である（例えば、特許文献５参照。）。   “Angiopoietin-related protein 3” (hereinafter sometimes referred to as “ANGPTL3”) and “Angiopoietin-related protein 4” (hereinafter sometimes referred to as “ANGPTL4”) increase the concentration of neutral fat in the blood. It is a protein having a function (for example, see Patent Document 5).

また、リポタンパク質リパーゼ（以下、ＬＰＬという）および／または肝性リパーゼ（以下、ＨＴＧＬ）のリパーゼ活性がＡＮＧＰＴＬ３により阻害されることが報告されている（例えば、特許文献６参照。）。ＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４はアミノ末端側のコイル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインを有し、ＬＰＬ阻害活性はアミノ末端側のコイル構造を有する部分ポリペプチドだけでよいことも報告されている（例えば、特許文献６参照。）。   Moreover, it has been reported that the lipase activity of lipoprotein lipase (hereinafter referred to as LPL) and / or hepatic lipase (hereinafter referred to as HTGL) is inhibited by ANGPTL3 (for example, see Patent Document 6). It has also been reported that ANGPTL3 and ANGPTL4 have a coil structure on the amino terminal side, a fibrinogen-like domain on the carboxyl terminal side, and LPL inhibitory activity may be only a partial polypeptide having a coil structure on the amino terminal side (for example, patents). Reference 6).

一方、ＡＮＧＰＴＬとＥＬとの関係は明らかになっていない。
国際公開第９８／２４８８８号パンフレット 国際公開第９９／３２６１１号パンフレット 国際公開第０２／１６３９７号パンフレット 国際公開第０２／７９４９２パンフレット 国際公開第０１／４２４９９号パンフレット 国際公開第０２／１０１０３９号パンフレット 「アメリカン・ジャーナル・オブ・メディスン（American Journal of Medicine）」、１９７７年、第６２、ｐ.７０７−７１４ 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）」、１９９９年、第２７４巻、ｐ.１４１７０−１４１７５ 「ネイチャー・ジェネティックス（Nature Genetics）」、１９９９年、第２１巻、ｐ．４２４−４２８ 「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）」、２００３年、第１１１巻、ｐ．３４７−３５５ 「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、２００３年、第１００巻、ｐ．２７４８−２７５３ 「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation）」、２００３年、第１１１巻、ｐ．３５７−３６２ On the other hand, the relationship between ANGPTL and EL is not clear.
International Publication No. 98/24888 Pamphlet International Publication No. 99/32611 Pamphlet International Publication No. 02/16397 Pamphlet International Publication No. 02/79492 Pamphlet International Publication No. 01/42499 Pamphlet International Publication No. 02/101039 Pamphlet “American Journal of Medicine”, 1977, 62, pp. 707-714. “The Journal of Biological Chemistry”, 1999, Vol. 274, pp. 14170-14175 “Nature Genetics”, 1999, Vol. 21, p. 424-428 “The Journal of Clinical Investigation”, 2003, Vol. 111, p. 347-355 "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 2003 100, p. 2748-2754 “The Journal of Clinical Investigation”, 2003, Vol. 111, p. 357-362

本発明はＥＬ阻害剤の新規スクリーニング方法、脂質代謝改善剤のスクリーニング方法及びＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含むＥＬ阻害剤、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む脂質代謝改善剤を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a novel screening method for EL inhibitors, a screening method for lipid metabolism improving agents, and an EL inhibitor including ANGPTL3 or ANGPTL4, and a lipid metabolism improving agent including ANGPTL3 or ANGPTL4.

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究を行ったところ、ヒト血漿においてアンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）の量とＨＤＬコレステロールの量に正の相関があることを見出した。また、本発明者らはアンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）及びアンジオポエチン関連タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）がＥＬ阻害活性を有することを見出し、ＥＬ阻害活性を促進する物質は脂質代謝改善剤（高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防剤）となり得ることを見出し本発明を完成させた。   The present inventors conducted extensive research to solve the above-mentioned problems, and found that there is a positive correlation between the amount of angiopoietin-related protein 3 (ANGPTL3) and the amount of HDL cholesterol in human plasma. Furthermore, the present inventors have found that Angiopoietin-related protein 3 (ANGPTL3) and Angiopoietin-related protein 4 (ANGPTL4) have EL inhibitory activity, and substances that promote EL inhibitory activity are lipid metabolism improving agents (hyperlipidemia, The present invention has been completed by finding that it can be an agent for the treatment or prevention of one or more diseases selected from hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia.

すなわち、本発明は、
（１）以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase）の活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３（angiopoietin-like 3）又はアンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（２）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、並びにその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｄ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（３）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｄ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（４）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｄ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（５） 以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（ｃ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（６） 以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｃ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（７） 以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性が低下した被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロール、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールの活性を測定する工程、
（ｄ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（８） 以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程：
（ｂ）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程、
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質とエンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（ｄ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程、
（９） 以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（ｂ）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質であって、かつ以下の性質を有する被験物質を選択する工程；
リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質、
（１０） 以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(viii)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、１種又は２種以上のポリペプチド、及び被験物質を投与する工程；
(i)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列、
(ii)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列、
(iii)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(iv)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列、
(v)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列、
(vi)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(vii)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(viii)上記(i)乃至(vii)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。
（１１） 以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(vi)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる工程；
(i)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(ii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iv)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(v)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(vi)上記(i)乃至(v)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物に被験物質を投与する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程、
（１２）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１３）以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する、
（１４）以下の（ａ）及び（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する、
（１５） エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定することを、特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１６） リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１７） 被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、
（１８） 下記の（ａ）及び（ｂ）を含む、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量方法：
（ａ）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４を定量する；
（ｂ）（ａ）で定量されたアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の濃度から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の濃度を計算する。
（１９） 下記の（ａ）及び（ｂ）を含む、ＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量方法：
（ａ）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３を定量する；
（ｂ）（ａ）で得られたアンジオポエチン関連タンパク質３の定量値から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の量を計算する。
（２０） 下記の（ａ）及び（ｂ）を含む、アンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法：
（ａ）試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質を定量する；
（ｂ）（ａ）で得られたＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量値から、試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の量を計算する、
（２１） （１）乃至（９）のいずれか１つに記載されたスクリーニング方法によって高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された選択されたエンドセリアルリパーゼの活性の低下を阻害する物質、
（２２） （１０）乃至（１７）のいずれか１つに記載された方法によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、
（２３） （２１）又は（２２）に記載された物質を有効成分として含有する、エンドセリアルリパーゼ阻害剤、
（２４）（２１）又は（２２）に記載された物質を有効成分として含有する、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果用、医薬組成物、
（２５）以下の（ａ）乃至（ｅ）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（２６） 以下の（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
（２７） 以下の（ａ）乃至（ｈ）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、エンドセリアルリパーゼ阻害剤：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｈ）上記（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列、
（２８） 以下の（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（ｈ）上記（ａ）乃至（ｇ）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列、
からなる。 That is, the present invention
(1) A screening method for a substance that causes a decrease in activity of Endothelial Lipase, comprising the following steps (a) to (b):
(A) contacting the test substance, angiopoietin-like protein 3 (angiopoietin-like 3) or angiopoietin-like protein 4 (angiopoietin-like 4), endothelial lipase, and its substrate, and measuring the activity of endothelial lipase;
(B) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(2) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (d):
(A) a step of contacting the test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, endocelial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of endothelial lipase;
(B) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase.
(C) The test substance selected in (b), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Measuring the activity of the active triacylglycerol lipase;
(D) a test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that did not change the activity of the sex triacylglycerol lipase,
(3) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (d):
(A) Contact with test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measuring
(B) a test substance in which the activity of lipoprotein lipase is increased or a test substance in which the activity of lipoprotein lipase is not changed, and / or a test substance or liver in which the activity of hepatic triacylglycerol lipase is increased Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase;
(C) a step of contacting the test substance selected in (b), an endothelial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of the endocelial lipase;
(D) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(4) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (d):
(A) Contact with test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measuring
(B) a test substance in which the activity of lipoprotein lipase is increased or a test substance in which the activity of lipoprotein lipase is not changed, and / or a test substance or liver in which the activity of hepatic triacylglycerol lipase is increased Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase;
(C) contacting the test substance selected in (b), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, endocelial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of endocelial lipase;
(D) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(5) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (c):
(A) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(B) The test substance selected in (a), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Measuring the activity of the active triacylglycerol lipase;
(C) a test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that did not change the activity of the sex triacylglycerol lipase,
(6) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (c):
(A) A substance that increases the activity of lipoprotein lipase or a substance that does not change the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or hepatic triacylglycerol lipase that causes an increase in the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that does not change the activity of
(B) contacting the test substance selected in (a), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, endocelial lipase, and its substrate, and measuring the activity of endocelial lipase;
(C) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(7) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (d):
(A) a step of contacting a test substance, endocerial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of endocerial lipase;
(B) selecting a test substance in which the activity of endothelial lipase is reduced;
(C) The test substance selected in (b), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or hepatic Measuring the activity of triacylglycerol;
(D) a test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that did not change the activity of the sex triacylglycerol lipase,
(8) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (d):
(A) A step of contacting a test substance with lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase and its substrate, and measuring the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase:
(B) a test substance in which the activity of lipoprotein lipase is increased or a test substance in which the activity of lipoprotein lipase is not changed, and / or a test substance or liver in which the activity of hepatic triacylglycerol lipase is increased Selecting a test substance that did not change the activity of the sex triacylglycerol lipase,
(C) A step of contacting the test substance selected in (b) with an endothelial lipase and its substrate, and measuring the activity of the endothelial lipase:
(D) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(9) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (a) to (b):
(A) a test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, its substrate, endothelial lipase, and its substrate are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Measuring the activity of the active triacylglycerol lipase and the activity of the endothelial lipase:
(B) selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase and has the following properties;
Test substance that caused increased activity of lipoprotein lipase or did not change the activity of lipoprotein lipase, and / or test substance that caused increased activity of hepatic triacylglycerol lipase or hepatic triacylglycerol lipase A test substance whose activity was not changed,
(10) Treatment of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, comprising the following steps (a) and (b) To test the preventive effect:
(A) administering to a non-human mammal one or more polypeptides comprising an amino acid sequence selected from the following (i) to (viii) and a test substance;
(i) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(ii) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(iii) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus,
(iv) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(v) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(vi) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the Sequence Listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus,
(vii) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence,
(viii) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (i) to (vii), and inhibits lipoprotein lipase inhibition and / or endosial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity;
(B) A step of measuring the neutral fat concentration and HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration in the blood of the animal in the step (a).
(11) Treatment of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, comprising the following steps (a) to (c) To test the preventive effect:
(A) a step of infecting a non-human mammal with an adenovirus carrying an adenoviral vector comprising the polynucleotide according to any one of (i) to (vi) below:
(i) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 25 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1407 is the 3 ′ end;
(ii) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 645 is the 3 ′ end. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(iii) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 609 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(iv) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 173 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1393 is the 3 ′ end;
(v) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide at nucleotide number 173 is the 5 ′ end and nucleotide number 601 is the 3 ′ end.
(vi) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide selected from (i) to (v) above, and has lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endothelial A polynucleotide encoding a polypeptide having lipase inhibitory activity;
(B) a step of administering a test substance to the animal of the above step (a);
(C) measuring the neutral fat concentration in the blood of the animal of the above step (b), and the HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration,
(12) a test substance, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4, an endothelial lipase, and a substrate thereof, and the activity of the endothelial lipase is measured; A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia;
(13) Treatment or prevention of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, including the following (a) and (b) How to test the effect:
(A) Contact the test substance, Angiopoietin-related protein 3 or Angiopoietin-related protein 4, endothelial lipase, and its substrate, and measure the activity of endothelial lipase;
(B) The test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measuring,
(14) Treatment or prevention of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, including the following (a) and (b) How to test the effect:
(A) Contact with test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measure
(B) contacting the test substance, endosial lipase, and its substrate, and measuring the activity of endosial lipase;
(15) A test substance that has reduced the activity of endothelial lipase, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and One or two or more selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance characterized by measuring the activity of hepatic triacylglycerol lipase A method for testing the therapeutic or preventive effect of a disease,
(16) A test substance that causes an increase in the activity of lipoprotein lipase or a test substance that does not change the activity of the lipoprotein lipase and / or a test substance that causes an increase in the activity of hepatic triacylglycerol lipase or hepatic triacyl A test substance that does not change the activity of glycerol lipase, an angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, an endothelial lipase, and a substrate thereof, and the activity of the endothelial lipase is measured. A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from lipemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia;
(17) A test substance, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4, a lipoprotein lipase and / or a hepatic triacylglycerol lipase, a substrate thereof, an endothelial lipase, and a substrate thereof are contacted, and the lipoprotein lipase and / or the liver One or two selected from the group consisting of hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia, characterized by measuring the activity of a natural triacylglycerol lipase and the activity of endothelial lipase A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of two or more diseases,
(18) A method for quantifying HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration, comprising the following (a) and (b):
(A) quantifying Angiopoietin-related protein 3 or Angiopoietin-related protein 4 in a sample;
(B) The concentration of HDL cholesterol and / or phospholipid in the sample is calculated from the concentration of Angiopoietin-related protein 3 and / or Angiopoietin-related protein 4 determined in (a).
(19) A method for quantifying HDL cholesterol and / or phospholipid, including the following (a) and (b):
(A) quantifying angiopoietin-related protein 3 in the sample;
(B) The amount of HDL cholesterol and / or phospholipid in the sample is calculated from the quantitative value of the angiopoietin-related protein 3 obtained in (a).
(20) A method for quantifying Angiopoietin-related protein 3 and / or Angiopoietin-related protein 4 comprising the following (a) and (b):
(A) quantifying HDL cholesterol and / or phospholipid in a sample;
(B) Calculate the amount of angiopoietin-related protein 3 and / or angiopoietin-related protein 4 in the sample from the quantitative value of HDL cholesterol and / or phospholipid obtained in (a).
(21) One or two or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia by the screening method described in any one of (1) to (9) A substance that inhibits a decrease in the activity of selected endothelial lipase that has been confirmed to have a therapeutic or prophylactic effect;
(22) By the method described in any one of (10) to (17), one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia Substances that have been confirmed to have therapeutic or prophylactic effects,
(23) An endothelial lipase inhibitor containing the substance described in (21) or (22) as an active ingredient,
(24) One or two or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia containing the substance described in (21) or (22) as an active ingredient A therapeutic or prophylactic effect, a pharmaceutical composition,
(25) Hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide selected from the following (a) to (e), and having lipoprotein lipase inhibitory activity and endothelial lipase: A polynucleotide encoding a polypeptide having inhibitory activity:
(A) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 25 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1407 is the 3 ′ end;
(B) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 645 is the 3 ′ end. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(C) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 609 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(D) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, having nucleotide number 173 as the 5 ′ end and nucleotide number 1393 as the 3 ′ end;
(E) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide at nucleotide number 173 is the 5 ′ end and nucleotide number 601 is the 3 ′ end;
(26) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the following (a) to (g), and has lipoprotein lipase inhibitory activity and endothelial lipase: A polypeptide comprising an amino acid sequence encoding a polypeptide having inhibitory activity.
(A) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(C) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(D) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(E) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(F) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(G) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence,
(27) An endothelial lipase inhibitor comprising one or more polypeptides comprising an amino acid sequence selected from the following (a) to (h):
(A) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(C) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(D) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(E) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(F) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(G) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(H) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (a) to (g), and has lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endosial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity,
(28) Hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis, and at least one polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (a) to (g): Pharmaceutical composition for treating or preventing one or more diseases selected from hyperglycemia:
(A) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(B) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(C) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(D) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(E) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(F) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(G) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(H) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (a) to (g), and has lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endosial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity,
Consists of.

本発明により、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を用いたＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法、該方法によって得られる物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を用いた、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法、該方法によって得られる物質、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＨＤＬ−コレステロール及びリン脂質の定量方法、ＥＬ阻害剤、及び、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物が提供された。   According to the present invention, a method for screening a substance causing a decrease in EL activity using ANGPTL3 or ANGPTL4, a substance obtained by the method, hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hypertension using ANGPTL3 or ANGPTL4 A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from blood glucose, a substance obtained by the method, a method for quantifying ANGPTL3, ANGPTL4, HDL-cholesterol and phospholipid, an EL inhibitor, and There has been provided a pharmaceutical composition for treating or preventing one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia.

本明細書中における、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。   In the present specification, the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA and cRNA thereof. In this specification, the term “polynucleotide” is used interchangeably with nucleic acid, and includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers. In the present specification, “polypeptide” and “protein” are used without distinction. In the present specification, “RNA fraction” refers to a fraction containing RNA. Further, in the present specification, “cell” includes a cell in an animal individual and a cultured cell.

本明細書中における、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。   In the present specification, “hybridize under stringent conditions” means to hybridize at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech), or After hybridization at 68 ° C. in the presence of 0.7-1.0 M NaCl using a fixed filter, a 0.1-2 fold concentration SSC solution (1 fold concentration SSC is 150 mM NaCl, 15 mM citric acid). And hybridizing under conditions that can be identified by washing at 68 ° C. or equivalent conditions.

１．アンジオポエチン関連タンパク質
アンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）及びアンジオポエチン関連タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）はアミノ末端側のコイル構造、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインを特徴とする分泌タンパク質である。 1. Angiopoietin-related protein Angiopoietin-related protein 3 (ANGPTL3) and Angiopoietin-related protein 4 (ANGPTL4) are secretory proteins characterized by an amino-terminal coil structure and a carboxyl-terminal fibrinogen-like domain.

ヒト・ＡＮＧＰＴＬ３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は国立遺伝学研究所（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＡＦ１５２５６２で登録されており、また、配列表の配列番号１にはヌクレオチド配列が示されており、配列番号２にはアミノ酸配列が示されている。   The nucleotide sequence of human ANGPTL3 cDNA is registered with the National Institute of Genetics (GenBank) under accession number AF152562, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Indicates the amino acid sequence.

ヒト・ＡＮＧＰＴＬ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は国立遺伝学研究所（ＧｅｎＢａｎｋ）のデータベースにアクセッション番号ＡＦ２０２６３６で登録されており、また、配列表の配列番号３にはヌクレオチド配列が示されており、配列番号４にはアミノ酸配列が示されている。   The nucleotide sequence of the human ANGPTL4 cDNA is registered in the database of the National Institute of Genetics (GenBank) with accession number AF202636, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. 4 shows the amino acid sequence.

ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びその部分ポリペプチドは、例えば、国際公開０２／１０１０３９号パンフレットに記載の方法によって取得することができる。   ANGPTL3, ANGPTL4 and partial polypeptides thereof can be obtained, for example, by the method described in WO 02/101039.

本発明で用いるＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４はその全長ポリペプチドの他、シグナル配列が切断されたポリペプチド、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインが切断された部分ポリペプチドも用いることができる。   As ANGPTL3 and ANGPTL4 used in the present invention, a polypeptide in which the signal sequence is cleaved, and a partial polypeptide in which the carboxyl-terminal fibrinogen-like domain is cleaved can also be used.

なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型の、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びその部分ポリペプチドと同等に、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型の、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びその部分ポリペプチドと同等のＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。   In addition, if the person has ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs, a part of the nucleotide sequence of the polynucleotide can be replaced with other nucleotides, nucleotide deletions, additions, etc. A polynucleotide encoding a polypeptide having LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity can be prepared in the same manner as ANGPTL3, ANGPTL4, and partial polypeptides thereof. As described above, the natural nucleotide sequence has a nucleotide sequence in which nucleotides are substituted, deleted, or added, and has the same LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity as those of natural type ANGPTL3, ANGPTL4, and partial polypeptides thereof. Polynucleotides encoding peptides are also included in the polynucleotides of the present invention. Examples of nucleotide sequence modification include deletion introduction by restriction enzymes or DNA exonuclease, mutation introduction by site-directed mutagenesis, modification of nucleotide sequence by PCR using mutation primers, direct introduction of synthetic mutant DNA, etc. It can be done by a method.

本発明におけるＡＮＧＰＴＬ３とは具体的には以下の(a)乃至(d)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(a)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
(c)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(d)上記(a)乃至(c)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。 Specifically, ANGPTL3 in the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (a) to (d).
(a) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(b) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(c) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(d) a polypeptide code comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from (a) to (c) above and having LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity Amino acid sequence.

本発明におけるＡＮＧＰＴＬ４とは具体的には以下の(e)乃至(i)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(e)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
(f)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
(g)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(h)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(i)上記(e)乃至(h)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。
上記、(a)乃至(i)に記載のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドは例えば、以下の(a)乃至(ｆ)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを取得し、次いで該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを通常の遺伝子組換えの手法を用いて宿主細胞に生産させることにより得ることができる：
(a)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(c)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(d)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(e)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(f)上記(a)乃至(e)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 Specifically, ANGPTL4 in the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (e) to (i).
(e) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(f) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(g) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(h) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence,
(i) a polypeptide code comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (e) to (h) and having LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity Amino acid sequence.
The polypeptide comprising the amino acid sequence described in (a) to (i) above, for example, obtains the polynucleotide described in any of the following (a) to (f), and then to the polynucleotide The encoded polypeptide can be obtained by producing it in a host cell using conventional genetic recombination techniques:
(a) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 25 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1407 is the 3 ′ end;
(b) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 645 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(c) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 609 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(d) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 173 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1393 is the 3 ′ end;
(e) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide at nucleotide number 173 is the 5 ′ end and nucleotide number 601 is the 3 ′ end.
(f) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide selected from the above (a) to (e) and has LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity A polynucleotide encoding a peptide.

なお、配列表の、配列番号１に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１−１６に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去される（国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報）ので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号４のアミノ酸配列においても、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、シグナル配列が除去されたポリペプチドを得ることができる。配列表の配列番号４のアミノ酸配列においてアミノ酸番号１−２５に示されるアミノ酸配列は哺乳動物細胞では翻訳後にシグナルペプチドとして除去されると推定されるので、上記生産方法において、宿主が哺乳動物細胞由来である場合は、配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６をアミノ末端とするポリペプチドを得ることができる。   In the sequence listing, the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, that is, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1-16 is translated in mammalian cells Since it is removed as a signal peptide (International Patent Application International Publication Number WO01 / 42499), in the above production method, when the host is derived from a mammalian cell, amino acid number 17 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is amino-terminal. Can be obtained. In the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, that is, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, when the host is derived from a mammalian cell, the polypeptide from which the signal sequence is removed Can be obtained. In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, it is presumed that the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-25 is removed as a signal peptide after translation in mammalian cells. Therefore, in the above production method, the host is derived from mammalian cells In this case, a polypeptide having amino terminal at amino acid number 26 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing can be obtained.

また、原核細胞のような、哺乳動物のタンパク質のシグナルペプチドを切断する機能を有さない宿主を用いて本発明のポリペプチドを生産する方法としては、例えば、(a)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号４６０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(b)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(c)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(d)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(e)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、(f)上記(a)乃至(f)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列、(a)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結している、アミノ酸配列からなる融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質を、特定の化合物との親和性を利用して精製した後に、前記プロテアーゼによって、アミノ末端側の上記特定の化合物との親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を除去する方法を挙げることができる。このような特定の化合物との親和性を利用した精製例としては、例えば、グルタチオン・Ｓ−トランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）のアミノ酸配列が連結している融合タンパク質を大腸菌に生産させ、次いで該融合タンパク質をグルタチオンとＧＳＴとの親和性を利用して精製した後、プロテアーゼによってＧＳＴ配列を除去する方法を挙げることができる。また、アミノ末端側(シグナルペプチド内)に、精製を容易にするためのヒスチジンタグが挿入されたポリペプチドを用いることもできる。   Moreover, as a method of producing the polypeptide of the present invention using a host that does not have a function of cleaving a signal peptide of a mammalian protein such as a prokaryotic cell, for example, (a) SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be used. In which the amino acid number 17 is the amino terminus and the amino acid number 460 is the carboxyl terminus, and (b) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. An amino acid sequence having amino acid number 17 as the amino terminus and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 as a carboxyl terminus, (c) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, An amino acid sequence having amino acid number 26 as the amino terminus and amino acid number 406 as the carboxyl terminus, (d) sequence (A) an amino acid sequence having amino acid number 26 as the amino terminus and amino acid number 143 as the carboxyl terminus, and (e) SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. One continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxyl terminus, (f) (a) An amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from (f) and encoding a polypeptide having LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity, (a) To the amino terminal side of any one of the amino acid sequences of (f), specifically by a protease that does not cleave the amino acid sequence A fusion protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequence to be cleaved is linked and the amino acid sequence of a protein having specific affinity with a specific compound is linked to the amino terminal side thereof, Examples include a method of purifying a fusion protein using affinity with a specific compound and then removing the amino acid sequence of the protein having affinity with the specific compound on the amino terminal side using the protease. . As an example of purification using affinity with such a specific compound, for example, a fusion protein in which the amino acid sequence of glutathione S-transferase (hereinafter referred to as “GST”) is linked is produced in E. coli, and then A method of purifying the fusion protein using the affinity between glutathione and GST and then removing the GST sequence with a protease can be mentioned. In addition, a polypeptide in which a histidine tag for facilitating purification is inserted on the amino terminal side (within the signal peptide) can also be used.

配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチドは、例えばヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・「アンジオポエチン関連タンパク質３」をコードするｃＤＮＡ、または独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに国際寄託されている組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドを鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行うことにより得ることができる。あるいは、組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４１）が保持する組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１（国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報参照）に挿入されているｃＤＮＡのヌクレオチド配列中の所望の位置に、該ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームと同一のリーディングフレーム上で終止コドンとなるヌクレオチド配列が挿入されるような部位特異的人工突然変異を施すことにより得ることもできる。   The nucleotide having nucleotide number 25 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as the 5 ′ end and any one of nucleotide numbers 465 to 645 as the 3 ′ end is, for example, a human “angiopoietin-related protein cloned from a human liver cDNA library. 3 "or a recombinant Escherichia coli strain E. coli deposited internationally at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST). polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “polymerase chain reaction”) using an oligonucleotide primer designed to amplify a DNA comprising a desired nucleotide sequence using a recombinant phagemid retained by E. coli pTrip / h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) as a template. (Referred to as “PCR”). Alternatively, recombinant E. coli strain E. coli in the nucleotide sequence of the cDNA inserted in the recombinant phagemid pTrip / h55-1 (see International Patent Application Publication No. WO01 / 42499) held by E. coli pTrip / h55-1 SANK 72299 (FERM BP-6941) It can also be obtained by performing a site-specific artificial mutation at a desired position so that a nucleotide sequence serving as a stop codon is inserted on the same reading frame as the open reading frame of the cDNA.

なお、大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９９は平成１１年（１９９９）年１１月１９日付で独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４１で国際寄託されている。   E. coli strain E. coli E. coli pTrip / h55-1 SANK 72299 has been deposited internationally with the accession number FERM BP-6941 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center on November 19, 1999.

ヒトの適当な臓器由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたヒト・ＡＮＧＰＴＬ４をコードするｃＤＮＡ、または、市販のｃＤＮＡクローン（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入できる）を鋳型とし、所望のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが増幅されるように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行なうことにより得ることができる。   A cDNA encoding human ANGPTL4 cloned from a cDNA library derived from an appropriate organ of human or a commercially available cDNA clone (for example, commercially available from IMG AG Consortium) as a template, and a desired nucleotide It can be obtained by performing PCR using oligonucleotide primers designed to amplify DNA consisting of sequences.

しかしながら、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡはこれらに限定されず、例えば上記した遺伝子組換えの手法において用いられる宿主のコドン使用頻度を考慮して適宜改変したＤＮＡでもよい。   However, the DNA encoding the above polypeptide is not limited to these, and may be DNA appropriately modified in consideration of the codon usage of the host used in the above-described gene recombination technique.

そのような、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを、適当なベクターＤＮＡに組み込んで得られた組換えベクターは、原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換することができる。さらにこれらのベクターに適当なプロモーター、および形質発現に関わる配列を導入することにより、それぞれの宿主において導入した遺伝子を発現することが可能である。   Such a recombinant vector obtained by incorporating a DNA having a nucleotide sequence encoding a polypeptide into an appropriate vector DNA can transform a prokaryotic or eukaryotic host cell. Furthermore, by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors, the introduced gene can be expressed in each host.

原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）などが挙げられる。   Examples of the prokaryotic host include Escherichia coli and Bacillus subtilis.

真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。   Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeasts. Examples of vertebrate cells include COS cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175- 182, ATCC CRL-1650) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase deficient strain (Urlaub, G. and Chasin, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220), etc. are often used, but are not limited thereto.

宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。   For example, when a COS cell is used as a host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, and can self-propagate in the COS cell. Furthermore, a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site Can be used. The expression vector includes diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845), etc. Thus, a desired transformed cell can be obtained.

また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。   When a CHO cell is used as a host cell, a vector capable of expressing a neo gene that functions as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning A Laboratory Manual “Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2-neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) etc. By selecting resistant colonies, transformed cells that stably produce the polypeptide of interest can be obtained.

上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。   The transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the desired polypeptide is produced intracellularly or extracellularly by the culture. As the medium used for the culture, various commonly used media can be appropriately selected depending on the employed host cells. For example, in the case of the COS cells, RPMI1640 medium and Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”). A medium supplemented with a serum component such as fetal calf serum can be used if necessary.

上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で上記ポリペプチドを大量に製造できる。   Recombinant protein produced inside or outside of the transformant by the above culture can be separated and purified by various known separation procedures utilizing the physical and chemical properties of the protein. it can. Specific examples of the method include treatment with an ordinary protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography ( Examples thereof include various liquid chromatography such as HPLC), dialysis methods, and combinations thereof. Further, by connecting histidine consisting of 6 residues to a recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified with a nickel affinity column. By combining the above methods, the polypeptide can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.

また、該ポリペプチドは、上記の方法に従って得られる他、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを利用して動物細胞に産生させることもできる。そのような組換えアデノウイルスベクターを構築する方法として、市販のキット（例えば、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、宝酒造（株）社製）を用いる方法を例示できる。本発明のポリペプチドが哺乳動物の血中中性脂肪濃度と密接に相関していることは、例えば上記のようにして得られる組換えアデノウイルスベクターを有する組換えアデノウイルスを哺乳動物、例えばマウスに感染させて、該組換えアデノウイルスベクターが保持する遺伝子を発現させると、血中中性脂肪（トリグリセリド）濃度の上昇が観察されることから証拠付けられる。   In addition to being obtained according to the above method, the polypeptide can also be produced in animal cells using an adenoviral vector incorporating a DNA having a nucleotide sequence encoding the polypeptide. Examples of a method for constructing such a recombinant adenovirus vector include a method using a commercially available kit (for example, an adenovirus expression vector kit, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). The fact that the polypeptide of the present invention is closely correlated with the blood triglyceride concentration in mammals means that, for example, a recombinant adenovirus having a recombinant adenovirus vector obtained as described above can be used in mammals such as mice. This is evidenced by an increase in blood neutral fat (triglyceride) concentration observed when the recombinant adenovirus vector is expressed by the infection.

２．血中コレステロール量とＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の量との関連
ヒトの血漿中のＡＮＧＰＴＬ３濃度、ＨＤＬコレステロール濃度、リン脂質濃度を測定すると、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度とＨＤＬコレステロール濃度の間に正の相関があることが確認できる。同様にＡＮＧＰＴＬ３の濃度とリン脂質濃度にも正の相関があることが確認できる。 2. Relationship between blood cholesterol level and ANGPTL3 or ANGPTL4 level When measuring ANGPTL3, HDL cholesterol, and phospholipid levels in human plasma, it is confirmed that there is a positive correlation between ANGPTL3 and HDL cholesterol levels it can. Similarly, it can be confirmed that there is a positive correlation between the concentration of ANGPTL3 and the phospholipid concentration.

同様にＡＮＧＰＴＬ４の濃度とＨＤＬコレステロール濃度の間に正の相関があることが確認できる。同様にＡＮＧＰＴＬ４の濃度とリン脂質濃度も相関する傾向が観察される。   Similarly, it can be confirmed that there is a positive correlation between the concentration of ANGPTL4 and the concentration of HDL cholesterol. Similarly, a tendency of correlating the concentration of ANGPTL4 and the phospholipid concentration is also observed.

以下、ヒト血漿中のＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質の濃度を測定する方法を具体的に説明する。   Hereinafter, a method for measuring the concentrations of ANGPTL3 or ANGPTL4, HDL cholesterol, total cholesterol and phospholipid in human plasma will be specifically described.

（１）ヒト血漿の取得
適正な実験指針の下にヒトより採取された血液より血漿を調製することができる。食事による影響を避けるために絶食状態の被験者より採取した血漿を用いるのが好ましい。 (1) Acquisition of human plasma Plasma can be prepared from blood collected from humans under appropriate experimental guidelines. In order to avoid the effects of meals, it is preferable to use plasma collected from fasted subjects.

（２）ヒト血漿中のＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４濃度の測定
血漿中のＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の定量方法はＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の量を測定することができる限りにおいて特に制限はない。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の定量はＡＮＧＰＴＬ３に対する抗体を利用したＥＬＩＳＡ法を挙げることができる（国際公開０２／１０１０３９パンフレット及び参考例４参照）。本方法を用いればＡＮＧＰＴＬ３の定量ができる。ＡＮＧＰＴＬ４についても同様の方法によって定量することができる。 (2) Measurement of ANGPTL3 or ANGPTL4 concentration in human plasma The method for quantifying ANGPTL3 or ANGPTL4 in plasma is not particularly limited as long as the amount of ANGPTL3 or ANGPTL4 can be measured. For example, quantification of ANGPTL3 can include an ELISA method using an antibody against ANGPTL3 (see International Publication 02/101039 Pamphlet and Reference Example 4). Using this method, ANGPTL3 can be quantified. ANGPTL4 can also be quantified by the same method.

（３）ヒト血漿中のＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質濃度の測定
ヒト血漿中のＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質濃度は当業者が通常行う方法によって測定することができるが、例えば、以下の方法によっても測定することができる。 (3) Measurement of HDL cholesterol, total cholesterol and phospholipid concentrations in human plasma The HDL cholesterol, total cholesterol and phospholipid concentrations in human plasma can be measured by methods commonly used by those skilled in the art. It can also be measured by a method.

ＨＤＬコレステロール濃度はＬタイプワコーＨＤＬ−Ｃ（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。総コレステロール濃度はＬタイプワコーＣＨＯ・Ｈ（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。リン脂質濃度はＬタイプワコーリン脂質（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。   The HDL cholesterol concentration can be measured using L-type Wako HDL-C (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The total cholesterol concentration can be measured using L-type Wako CHO · H (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The phospholipid concentration can be measured using L-type Wako phospholipid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

（４）ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４の量とＨＤＬコレステロール及びリン脂質との関係
血漿中におけるＨＤＬコレステロール濃度、総コレステロール濃度、およびリン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３の濃度との相関をThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて解析する。ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べると、ＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３の濃度との間に有意な正の相関が認められる。また、リン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３との間にも有意な正の相関が得られる。 (4) Relationship between the amount of ANGPTL3 or ANGPTL4 and HDL cholesterol and phospholipid The plasma HDL cholesterol concentration, the total cholesterol concentration, and the correlation between the phospholipid concentration and the ANGPTL3 concentration are shown in The SAS® System Release 6.12 (TS045). ) Analyze using for Windows. When examined with the Pearson correlation coefficient (r) and the test p-value for correlation coefficient 1, a significant positive correlation is observed between HDL cholesterol concentration and ANGPTL3 concentration. A significant positive correlation is also obtained between the phospholipid concentration and ANGPTL3.

同様に、ＡＮＧＰＴＬ４についてもＨＤＬコレステロール濃度、総コレステロール濃度、およびリン脂質濃度との相関を調べることができる。   Similarly, ANGPTL4 can be examined for correlation with HDL cholesterol concentration, total cholesterol concentration, and phospholipid concentration.

（５）ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を使用したＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量
血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３とＨＤＬコレステロールの濃度には正の相関があるので、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度を測定することによって血漿中のＨＤＬコレステロール濃度を計算することができる。逆に血漿中のＨＤＬコレステロールの濃度を測定すれば、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度を計算することもできる。 (5) Determination of HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration using ANGPTL3 or ANGPTL4 Since there is a positive correlation between the concentrations of ANGPTL3 and HDL cholesterol in plasma, plasma is measured by measuring the concentration of ANGPTL3 in plasma. The HDL cholesterol concentration in can be calculated. Conversely, if the concentration of HDL cholesterol in plasma is measured, the concentration of ANGPTL3 can also be calculated.

例えば、下記実施例１で示すように日本人１００名から得られた血漿中のＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度の相関をThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて、ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べたところ、ＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との間に、r=0.52,p=0.0001の正の相関が得られた。得られた１００名分のデータに基づいて線型回帰直線を求めると以下の式が得られる。
{HDLコレステロール濃度（mg/dl)｝=0.0617x{ANGPTL3濃度（ng/ml)}+32.865
本計算式を用いれば、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度が400ng/mlのときHDLコレステロールの濃度は57.5mg/dlと計算できる。 For example, as shown in Example 1 below, the correlation between plasma HDL cholesterol concentration and ANGPTL3 concentration obtained from 100 Japanese people was analyzed using The SAS (R) System Release 6.12 (TS045) for Windows. When examined by the test p value for the relationship number (r) and the correlation coefficient 1, a positive correlation of r = 0.52, p = 0.0001 was obtained between the HDL cholesterol concentration and the ANGPTL3 concentration. When a linear regression line is obtained based on the obtained data for 100 persons, the following expression is obtained.
{HDL cholesterol concentration (mg / dl)} = 0.0617x {ANGPTL3 concentration (ng / ml)} + 32.865
Using this calculation formula, for example, when the concentration of ANGPTL3 is 400 ng / ml, the concentration of HDL cholesterol can be calculated as 57.5 mg / dl.

また、同様に、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度については、以下の線型回帰直線が得られる。
{ANGPTL3濃度（ng/ml）}=4.44x{HDLコレステロール濃度（mg/dl）}+197.44
本計算式を用いればHDLコレステロール濃度が50mg/dlのときANGPTL3濃度は419ng/mlと計算できる。 Similarly, the following linear regression line is obtained for the concentration of ANGPTL3 in plasma.
{ANGPTL3 concentration (ng / ml)} = 4.44x {HDL cholesterol concentration (mg / dl)} + 197.44
Using this formula, when the HDL cholesterol concentration is 50 mg / dl, the ANGPTL3 concentration can be calculated as 419 ng / ml.

同様に、リン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度とのThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて、ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べたところ、r=0.28,p=0.0052という値が得られた。得られた１００名分のデータの基づいて、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度から、リン脂質の濃度は、線型回帰直線を求めると、以下の計算式が得られる。
{リン脂質濃度（mg/dl）}=0.0715x{ANGPTL3濃度（ng/ml）}+169.58
本計算式を用いれば、ANGPTL3濃度が400ng/mlのとき、リン脂質濃度は198.2mg/dlと計算できる。 Similarly, using the SAS (R) System Release 6.12 (TS045) for Windows between the phospholipid concentration and the ANGPTL3 concentration, the pearson correlation coefficient (r) and the test p value for the correlation coefficient 1 were examined. The values r = 0.28 and p = 0.0052 were obtained. Based on the obtained data for 100 persons, the concentration of phospholipids can be calculated from the concentration of ANGPTL3 in plasma by calculating a linear regression line.
{Phospholipid concentration (mg / dl)} = 0.0715x {ANGPTL3 concentration (ng / ml)} + 169.58
Using this formula, when the ANGPTL3 concentration is 400 ng / ml, the phospholipid concentration can be calculated as 198.2 mg / dl.

また、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３の濃度は以下の計算式で求めることができる。
{ANGPTL3濃度（ng/ml）}=1.08x{リン脂質濃度（mg/dl）}+253.87
本計算式を用いれば、リン脂質濃度が200mg/dlのとき、ANGPTL3濃度は470ng/mlと計算できる。 Moreover, the concentration of ANGPTL3 in plasma can be determined by the following calculation formula.
{ANGPTL3 concentration (ng / ml)} = 1.08x {phospholipid concentration (mg / dl)} + 253.87
Using this formula, when the phospholipid concentration is 200 mg / dl, the ANGPTL3 concentration can be calculated as 470 ng / ml.

同様にＨＤＬコレステロールの濃度とＡＮＧＰＴＬ４濃度との相関を調べれば、ＨＤＬコレステロール濃度からＡＮＧＰＴＬ４の濃度を計算することができるし、ＡＮＧＰＴＬ４の濃度からＨＤＬコレステロール濃度を計算することができる。   Similarly, if the correlation between the HDL cholesterol concentration and the ANGPTL4 concentration is examined, the ANGPTL4 concentration can be calculated from the HDL cholesterol concentration, and the HDL cholesterol concentration can be calculated from the ANGPTL4 concentration.

また、リン脂質の濃度とＡＮＧＰＴＬ４濃度との相関を調べれば、同様に、リン脂質の濃度からＡＮＧＰＴＬ４の濃度を計算することができるし、ＡＮＧＰＴＬ４の濃度からリン脂質の濃度を計算することができる。   Further, if the correlation between the phospholipid concentration and the ANGPTL4 concentration is examined, the ANGPTL4 concentration can be calculated from the phospholipid concentration, and the phospholipid concentration can be calculated from the ANGPTL4 concentration.

本発明による、測定方法の例を示すと以下の（Ａ）又は（Ｂ）のようになるが、本発明はこれらに限定されない。   Examples of the measurement method according to the present invention are as shown in (A) or (B) below, but the present invention is not limited to these.

（Ａ）下記の（a）及び（b）を含む、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量方法：
（a）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４を定量する；
（b）（a）で定量されたアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の濃度から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の濃度を計算する。 (A) Quantitative determination method of HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration, including the following (a) and (b):
(A) quantifying Angiopoietin-related protein 3 or Angiopoietin-related protein 4 in a sample;
(B) The concentration of HDL cholesterol and / or phospholipid in the sample is calculated from the concentration of Angiopoietin-related protein 3 and / or Angiopoietin-related protein 4 determined in (a).

（Ｂ）下記の（a）及び（b）を含む、アンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法：
（a）試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質を定量する；
（b）（a）で得られたＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量値から、試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の量を計算する。 (B) A method for quantifying Angiopoietin-related protein 3 and / or Angiopoietin-related protein 4 comprising the following (a) and (b):
(A) quantifying HDL cholesterol and / or phospholipid in a sample;
(B) The amount of angiopoietin-related protein 3 and / or angiopoietin-related protein 4 in the sample is calculated from the quantitative value of HDL cholesterol and / or phospholipid obtained in (a).

３．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）
エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）は主として血管内皮細胞で発現しているので、血管内皮細胞より取得することができる。また、ＥＬは以下の方法によって、ＥＬ遺伝子をクローニングした後、動物細胞等で発現させ、組換え蛋白質として取得することもできる。 3. Endothelial lipase (EL)
Since endocelial lipase (EL) is mainly expressed in vascular endothelial cells, it can be obtained from vascular endothelial cells. EL can also be obtained as a recombinant protein by cloning the EL gene and expressing it in animal cells or the like by the following method.

本発明におけるＥＬの活性とは、エンドセリアルリパーゼが有する活性をいい、具体的には、リン脂質またはトリアシルグリセロールを加水分解する活性として測定することができる。   The activity of EL in the present invention refers to the activity of endothelial lipase, and specifically can be measured as the activity of hydrolyzing phospholipid or triacylglycerol.

（１）ＥＬの取得
本発明で用いるヒト・ＥＬのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＦ１１８７６７で登録されている。 (1) Acquisition of EL The nucleotide sequence of human EL used in the present invention is registered in GenBank with accession number AF118767.

ヒト・ＥＬ遺伝子は例えば、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記データベースに登録されているヌクレオチド配列に基づいて設計したセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことによって取得することができる。   The human EL gene can be obtained, for example, by performing a PCR reaction using a sense primer and an antisense primer designed based on the nucleotide sequence registered in the above database using a human cDNA library as a template.

例えば、ＰＣＲセンスプライマーとして、
5'-aagctagcatgagcaactccgttcctctgctctgt-3'（hEL-ms1：配列表の配列番号５）;
アンチセンスプライマーとして、
5'- ttaagcttgggaagctccacagtgggact -3'（hEL-mas2：配列表の配列番号６）
を用いてヒトｃＤＮＡライブラリー（（Marathon-Ready human testis（クロンテック社製））を用いてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動を行うと、、約１５００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が観察される。このバンドをｐｃＤＮＡ３．１（−）／Myc-His(A)ベクター（インビトロゲン社）等の適当なベクター挿入しＥＬ遺伝子をクローニングすることができる。 For example, as a PCR sense primer,
5'-aagctagcatgagcaactccgttcctctgctctgt-3 '(hEL-ms1: SEQ ID NO: 5 in the sequence listing);
As an antisense primer,
5'-ttaagcttgggaagctccacagtgggact-3 '(hEL-mas2: SEQ ID NO: 6 in the sequence listing)
When a PCR reaction is performed using a human cDNA library (Marathon-Ready human testis (manufactured by Clontech)) and agarose gel electrophoresis is performed, amplification of a DNA fragment of about 1500 bp is observed. The EL gene can be cloned by inserting a band into a suitable vector such as pcDNA3.1 (−) / Myc-His (A) vector (Invitrogen).

発現するベクターとして動物細胞で発現するベクターを用いれば、ＥＬ遺伝子は動物細胞で発現することが可能となる。   If a vector that is expressed in animal cells is used as the expression vector, the EL gene can be expressed in animal cells.

（２）ＥＬの動物細胞での発現
例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Myc-His(A)ベクターにＥＬ遺伝子を挿入したベクターをヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３にトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによってＥＬ蛋白質を発現する形質転換細胞株を得ることができる。 (2) Expression of EL in animal cells For example, a vector obtained by inserting an EL gene into pcDNA3.1 (-) / Myc-His (A) vector is transfected into human embryonic kidney cells HEK293, and colonies resistant to G418 are selected. By doing so, a transformed cell line expressing the EL protein can be obtained.

（３）ＥＬの活性測定
ＥＬの活性測定方法はＥＬの活性を測定できる限りにおいて特に制限はないが具体的には以下の方法を挙げることができる。 (3) Measurement of EL activity The EL activity measurement method is not particularly limited as long as EL activity can be measured, but specific examples thereof include the following methods.

ａ）ＥＬ蛋白質
活性測定に用いるＥＬはＥＬを含んでいるサンプルであれば特に制限はないが、例えば、血管細胞、血管細胞の抽出液、血管細胞より精製したＥＬ蛋白質のほか、ＥＬ蛋白質を発現する形質転換細胞株、該形質転換細胞の細胞抽出液、ＥＬを分泌している培養上清等を用いることができる。 a) EL protein There is no particular limitation as long as the EL used for the activity measurement is a sample containing EL. For example, in addition to vascular cells, vascular cell extracts, EL proteins purified from vascular cells, EL proteins are expressed. A transformed cell line, a cell extract of the transformed cell, a culture supernatant secreting EL, and the like can be used.

ｂ）放射標識基質を用いたＥＬの活性測定
ＥＬの活性は放射標識基質を使用した方法で測定することができる。放射標識基質を使用した活性測定方法としては、例えば、以下の文献（Nilsson-Ehle, P. and Schotz, M. C.(1976) J. Lipid Res. 17, 536-541）を挙げることができる。 b) Measurement of EL activity using radiolabeled substrate The activity of EL can be measured by a method using a radiolabeled substrate. Examples of the activity measurement method using a radiolabeled substrate include the following documents (Nilsson-Ehle, P. and Schotz, MC (1976) J. Lipid Res. 17, 536-541).

例えば、ＥＬと基質溶液（例えば、グリセロール・トリオレイン酸、1,2−ジ[1-14C]オレオイル・ホスファチジルコリン、ウシ血清アルブミン、グリセロールを適当量含む、Tris-塩酸バッファー）にＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を加え以下に記載する条件でＥＬの活性測定を行う：
温度条件：２７℃〜４２℃、好適には３７℃；
反応液のｐＨ７．５〜８．５、好適には８．０
反応時間：１５〜１２０分、好適には９０分
反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層とを分離させ、前者の遊離脂肪酸の量を放射活性で測定する。 For example, EL and substrate solution (e.g., glycerol trioleate, 1,2-di [1- 14 C] oleoyl-phosphatidylcholine, containing bovine serum albumin, glycerol appropriate amount, Tris-hydrochloric acid buffer) to ANGPTL3 or ANGPTL4 And measure the EL activity under the conditions described below:
Temperature conditions: 27 ° C. to 42 ° C., preferably 37 ° C .;
PH of the reaction solution is 7.5 to 8.5, preferably 8.0.
Reaction time: 15 to 120 minutes, preferably 90 minutes After completion of the reaction, an organic solvent is added and mixed in the reaction solution, and then the layer containing free fatty acid and the layer containing unreacted substrate are separated, and the former release The amount of fatty acid is measured by radioactivity.

ＥＬの活性は例えば以下のように定義できる。単位時間（min）、単位蛋白質量（mg）あたりに産生される生成物（遊離脂肪酸）由来の放射活性(dpm)より、dpm/min/mgと定義できる。生成する遊離脂肪酸の放射活性が高いときにはＥＬの活性も高いと判断でき、逆に生成する遊離脂肪酸の放射活性が低下しているときにはＥＬの活性が低下していると判断できる
放射性標識基質に代わるものとして、他のクラスの標識基質（例えば蛍光性の基質またはチオ含有基質等）をスクリーニング方法で使用することが出来る。蛍光性基質の例として、ホスファチジルコリンの蛍光標識体、具体的にはC6NBD-PC{1-アシル-2-[6-(ニトロ-2,1,3-ベンズオキサジアゾール-4-イル)アミノ]カプロイルホスファチジルコリン：N-3786,モレキュラー・プローブ社製}が挙げられる。またチオ含有基質には1,2-ビス（ヘキサノイチルチオ）-1,2-ジデオキシ-sn-グリセロ-3-ホスホリルコリンが含まれる。しかしながら、エンドセリアルリパーゼの活性を測定できる限りにおいて、これらの基質に制限されない。 The activity of EL can be defined as follows, for example. From the radioactivity (dpm) derived from the product (free fatty acid) produced per unit time (min) and unit protein mass (mg), it can be defined as dpm / min / mg. It can be judged that the activity of EL is high when the radioactivity of the generated free fatty acid is high, and conversely, the activity of EL can be judged to be lowered when the radioactivity of the generated free fatty acid is lowered. As such, other classes of labeled substrates (eg, fluorescent substrates or thio-containing substrates) can be used in the screening method. As an example of a fluorescent substrate, a fluorescent label of phosphatidylcholine, specifically C 6 NBD-PC {1-acyl-2- [6- (nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) Amino] caproylphosphatidylcholine: N-3786, manufactured by Molecular Probes Co., Ltd.}. Thio-containing substrates also include 1,2-bis (hexanoylthio) -1,2-dideoxy-sn-glycero-3-phosphorylcholine. However, it is not limited to these substrates as long as the activity of endothelial lipase can be measured.

４．ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４のＥＬ阻害活性
上記１で取得されたＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びそれらの部分ポリペプチドはＥＬの活性を用量依存的に阻害する。 4). ELGPTL3 or ANGPTL4 EL inhibitory activity ANGPTL3, ANGPTL4 and partial polypeptides obtained in 1 above inhibit EL activity in a dose-dependent manner.

ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４及びそれらの部分ポリペプチドのＥＬ阻害活性は具体的には以下のように調べることができる。   Specifically, the EL inhibitory activity of ANGPTL3, ANGPTL4 and their partial polypeptides can be examined as follows.

ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４としては以下の(a)〜(e)のアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができる。
(a)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号４６０をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(c)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号４０６をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(d)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(e)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(f)(a)〜(e)のいずれかのアミノ酸配列のアミノ末端側に、該アミノ酸配列を切断しないプロテアーゼによって特異的に切断されるアミノ酸配列が連結し、さらにそのアミノ末端側に特定の化合物と特異的な親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列が連結している、アミノ酸配列。 Examples of ANGPTL3 or ANGPTL4 include polypeptides containing the following amino acid sequences (a) to (e).
(a) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, amino acid sequence having amino acid number 17 as the amino terminus and amino acid number 460 as the carboxyl terminus;
(b) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(c) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 406 is the carboxyl terminus;
(d) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(e) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(f) an amino acid sequence that is specifically cleaved by a protease that does not cleave the amino acid sequence is linked to the amino terminal side of any one of the amino acid sequences of (a) to (e), An amino acid sequence in which amino acid sequences of proteins having specific affinity for a compound are linked.

これらのポリペプチドを添加したバッファーを用いて上記３に記載したＥＬの活性の測定を行うことによってＥＬの活性に対する、上記ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４又はそれらの部分ポリペプチドの影響を調べると、ポリペプチドの濃度依存的にＥＬの活性が阻害されることが確認される。   When the effect of the ANGPTL3, ANGPTL4 or their partial polypeptides on the EL activity was measured by measuring the EL activity described in 3 above using a buffer to which these polypeptides were added, the concentration of the polypeptide It is confirmed that the EL activity is inhibited in a dependent manner.

５．ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性の測定方法
ＬＰＬの活性は例えば、以下の方法で測定することができるが、ＬＰＬの活性を測定することができる限りにおいて本測定方法に制限されない。 5). Method for Measuring LPL and / or HTGL Activity The LPL activity can be measured, for example, by the following method, but is not limited to this measurement method as long as the LPL activity can be measured.

（１）ＬＰＬを含む材料
ＬＰＬを含む材料としては、ＬＰＬを産生している、哺乳動物脂肪細胞由来または脂肪細胞の前駆細胞由来の細胞株の培養上清を用いることができる。細胞株が未分化である場合は、脂肪細胞に分化させてから材料を調製することが好ましい。ＬＰＬを産生している細胞株としては例えば、マウス細胞株３Ｔ３−Ｌ１（大日本製薬（株）より購入可能）、同３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、同Ｏｂ１７等を挙げることができる。あるいは、ラット白色前駆脂肪細胞（初代培養細胞）を脂肪細胞に分化させた細胞も好適に用いることができるが、本発明はこれらに限定されない。 (1) Material containing LPL As a material containing LPL, a culture supernatant of a mammalian adipocyte-derived or adipocyte precursor cell line producing LPL can be used. When the cell line is undifferentiated, it is preferable to prepare the material after differentiation into adipocytes. Examples of cell lines producing LPL include mouse cell line 3T3-L1 (available from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 3T3-F442A, and Ob17. Alternatively, cells obtained by differentiating rat white preadipocytes (primary cultured cells) into adipocytes can be preferably used, but the present invention is not limited thereto.

また、ＬＰＬを含む材料として、精製ＬＰＬや組換えＬＰＬ（Methods Enzymol. (1996) 263, 319-26参照）を使用することもできる。例えば、牛乳由来のＬＰＬ（シグマ社製）を本発明の方法に使用することが可能である。   Moreover, purified LPL or recombinant LPL (see Methods Enzymol. (1996) 263, 319-26) can also be used as a material containing LPL. For example, LPL derived from milk (manufactured by Sigma) can be used in the method of the present invention.

（２）ＬＰＬ及びＨＴＧＬを含む材料
ＬＰＬ及びＨＴＧＬを含む材料としては、体重１ｋｇあたり１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０乃至１００単位のヘパリンを静注して１０分乃至１５分経過後の哺乳動物から採取した末梢血由来の血漿が好適である。 (2) Material containing LPL and HTGL As a material containing LPL and HTGL, 10 to 100 units of heparin per 1 kg of body weight is intravenously injected, and 10 to 100 units of heparin are intravenously injected, and after 10 to 15 minutes have passed. Plasma derived from peripheral blood collected from these mammals is preferred.

（３）ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの基質を含む材料
ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの基質を含む材料は、これらリパーゼの触媒により脂肪酸を遊離することが知られている物質を含み、かつこれらリパーゼの活性を阻害したり不活性化する成分が含まれていないものであればよいが、例えばグリセロール・トリ［９，１０（ｎ）−3Ｈ］オレイン酸のようにＬＰＬの触媒により遊離される脂肪酸が放射性同位元素で標識してある化合物や、同様に特定の励起波長下で蛍光を発する物質で標識された化合物が特に好適である。また、遊離脂肪酸の量を生化学的な方法で測定する場合には、標識されていない基質（例えばグリセロール・トリオレイン酸）も用いられ得る。 (3) Material containing LPL and / or HTGL substrate The material containing LPL and / or HTGL substrate contains a substance known to liberate fatty acids by the catalyst of these lipases, and exhibits the activity of these lipases. inhibition or the present invention may be one which does not contain a component to inactivate, for example, glycerol tri [9,10 (n) - 3 H ] fatty acids liberated by the catalyst of the LPL radioactive as oleic acid A compound labeled with an isotope or a compound labeled with a substance that similarly emits fluorescence under a specific excitation wavelength is particularly suitable. In addition, when the amount of free fatty acid is measured by a biochemical method, an unlabeled substrate (for example, glycerol / trioleic acid) can be used.

その他、反応液には、必要に応じ、ｐＨ調整のための緩衝液や、アルブミンなどのタンパク質成分が添加され得る。   In addition, a buffer solution for pH adjustment and protein components such as albumin can be added to the reaction solution as necessary.

（４）ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性の測定
これらの材料を混合し、以下に記載する条件でＬＰＬ及び／ＨＴＧＬの反応を行うことによってＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定することができる：
温度条件： ２７〜３７℃、好適には３７℃；
反応液のｐＨ： ８．０〜８．５、好適には８．０；
反応液中の塩化ナトリウム濃度： ０．１〜０．１５Ｍ、好適には０．１５Ｍ；
反応時間： １５〜１２０分、好適には１２０分。 (4) Measurement of the activity of LPL and / or HTGL These materials are mixed and the activity of LPL and / or HTGL can be measured by carrying out the reaction of LPL and / HTGL under the conditions described below:
Temperature conditions: 27-37 ° C, preferably 37 ° C;
PH of the reaction solution: 8.0 to 8.5, preferably 8.0;
Sodium chloride concentration in the reaction solution: 0.1 to 0.15M, preferably 0.15M;
Reaction time: 15 to 120 minutes, preferably 120 minutes.

なお、ヘパリン投与した哺乳動物由来の血漿のように、ＬＰＬとＨＴＧＬの両方を含む材料を用いる場合は、上記条件でＬＰＬとＨＴＧＬとを合わせたリパーゼ活性が測定できる。ＨＴＧＬ活性のみを測定する場合は、他の条件を変えずに塩化ナトリウム濃度を１Ｍにすることによリ、ＬＰＬが不活性化された条件でリパーゼ反応を進行させる。ＬＰＬ活性は総リパーゼ活性からＨＴＧＬ活性を差し引いた値となる。   In addition, when using the material containing both LPL and HTGL like the plasma derived from the mammal which administered heparin, the lipase activity which combined LPL and HTGL on the said conditions can be measured. When measuring only the HTGL activity, the lipase reaction is allowed to proceed under the condition that LPL is inactivated by changing the sodium chloride concentration to 1 M without changing other conditions. The LPL activity is a value obtained by subtracting the HTGL activity from the total lipase activity.

反応終了後、反応液に有機溶媒を添加、混合してから遊離脂肪酸を含む層と未反応の基質を含む層とを分離させ、前者に集まった遊離脂肪酸の量を測定する。   After completion of the reaction, an organic solvent is added to and mixed with the reaction solution, and then the layer containing free fatty acid and the layer containing unreacted substrate are separated, and the amount of free fatty acid collected in the former is measured.

また、標識されていない基質を用いた場合の試験方法の例を以下に示す（Clin.Chem. 30,748(1984)）。   An example of a test method using an unlabeled substrate is shown below (Clin. Chem. 30,748 (1984)).

基質溶液０．５ｍｌ（７．５μｍｏｌ グリセロール・トリオレイン酸、２２．５ｍｇ アラビアゴム、１００μｍｏｌ トリス−塩酸（ｐＨ８．２）、５０μｍｏｌ 塩化ナトリウム、２５ｍｇ アルブミン、１４０μｌ ヒト血漿）を３７℃で８０分間インキュベートした後、脂肪細胞培養上清を加え、また同時に本発明のポリペプチドと被験物質を添加して、２８℃で６０分間反応させる。次に反応液に２．５ｍｌのイソプロパノール：ヘプタン：硫酸（２．５ｍｏｌ／Ｌ）＝４０：１０：２（ｖ／ｖ）を加え、１０分間混合し、室温で４０分放置後、有機層を１ｍｌ採取し、窒素乾固する。得られたものを５％ トリトン Ｘ−１００溶液にて溶解し、市販の脂肪酸測定キット（例えばＮＥＦＡ−テストワコー（和光純薬（株）社製））等を利用して脂肪酸量を測定する。   0.5 ml of substrate solution (7.5 μmol glycerol / trioleic acid, 22.5 mg gum arabic, 100 μmol tris-hydrochloric acid (pH 8.2), 50 μmol sodium chloride, 25 mg albumin, 140 μl human plasma) was incubated at 37 ° C. for 80 minutes. Thereafter, the adipocyte culture supernatant is added, and at the same time, the polypeptide of the present invention and the test substance are added and reacted at 28 ° C. for 60 minutes. Next, 2.5 ml of isopropanol: heptane: sulfuric acid (2.5 mol / L) = 40: 10: 2 (v / v) was added to the reaction solution, mixed for 10 minutes, allowed to stand at room temperature for 40 minutes, and then the organic layer was removed. Take 1 ml and dry to nitrogen. The obtained product is dissolved in a 5% Triton X-100 solution, and the amount of fatty acid is measured using a commercially available fatty acid measurement kit (for example, NEFA-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).

ＬＰＬの活性は例えば、以下のように定義できる。単位時間（min）、単位蛋白質量（mg）あたりに産生される生成物（遊離脂肪酸）由来の放射活性(dpm)より、dpm/min/mgと定義できる。生成する脂肪酸量が多いときにはＬＰＬの活性が高く、逆に脂肪酸量が低いときにはＬＰＬの活性が低いと判断できる。   The activity of LPL can be defined as follows, for example. From the radioactivity (dpm) derived from the product (free fatty acid) produced per unit time (min) and unit protein mass (mg), it can be defined as dpm / min / mg. It can be determined that the activity of LPL is high when the amount of fatty acid produced is high, and conversely, the activity of LPL is low when the amount of fatty acid is low.

６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法
ＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４はＥＬの活性を阻害する。本方法によって取得されるＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下を抑える作用を有する物質となり、脂質代謝異常、例えば、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防剤となり得る。 6). Screening method for substances that cause decrease in EL activity ANGPTL3 and ANGPTL4 inhibit EL activity. Substances that cause a decrease in the activity of EL obtained by this method become substances having an action of suppressing a decrease in HDL cholesterol concentration, such as lipid metabolism abnormalities such as hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia. It can be a therapeutic or prophylactic agent for one or more diseases selected from

なお、各スクリーニング方法においては、必要に応じてコントロールとして被験物質を入れない実験を同時にあるいは別に行い、被験物質を入れた場合と入れない場合の差に基づいて被験物質の作用を判断することが望ましい。   In addition, in each screening method, if necessary, an experiment without the test substance can be performed simultaneously or separately as a control, and the effect of the test substance can be determined based on the difference between the case where the test substance is added and the case where it is not added desirable.

ＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ４を利用した以下の（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法によって取得することができる。   A substance that causes a decrease in EL activity can be obtained by the method described in any of (1) to (4) below using ANGPTL3 or ANGPTL4.

（１）以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
。 (1) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (b):
(A) contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4 and its substrate, and measuring the activity of EL;
(B) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity.
.

以下、詳しく説明する。   This will be described in detail below.

（ａ）について
（i）被験物質
本発明のスクリーニング方法における被験物質は、特に限定されず、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等の核酸、それらの塩、それらの誘導体、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などがいずれも用いられ得る。 About (a) (i) Test substance The test substance in the screening method of the present invention is not particularly limited, and is an extract from a culture solution of microorganisms or tissue of animals or plants, an extract from a culture solution of cultured cells, or artificially. Synthetic inorganic or organic compounds, recombinant proteins, antibodies or fragments thereof, antisense nucleic acids, nucleic acids such as siRNA, salts thereof, derivatives thereof, or a composition in which plural kinds of substances are mixed. Either can be used.

被験物質の添加量および濃度は、適宜設定するかまたは希釈系列を作成する等により複数種の添加量を設定することができる。   The addition amount and concentration of the test substance can be appropriately set, or a plurality of addition amounts can be set by preparing a dilution series.

（ii）ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４
ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４はその全長ポリペプチドの他、シグナル配列が切断されたポリペプチド、カルボキシル末端側のフィブリノーゲン様ドメインが切断された部分ポリペプチドも用いることができ、上記、「１．アンジオポエチン関連タンパク質」の項に記載した方法によって取得したものを用いることができる。 (Ii) ANGPTL3 or ANGPTL4
ANGPTL3 or ANGPTL4 can be used in addition to its full-length polypeptide, a polypeptide in which the signal sequence is cleaved, and a partial polypeptide in which the carboxyl-terminal fibrinogen-like domain is cleaved. Those obtained by the method described in the item can be used.

ＡＮＧＰＴＬ３は具体的には以下の(a)乃至(d)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(a)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
(b)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
(c)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(d)上記(a)乃至(c)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。 Specifically, ANGPTL3 is a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (a) to (d).
(a) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(b) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(c) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(d) a polypeptide code comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from (a) to (c) above and having LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity Amino acid sequence.

ＡＮＧＰＴＬ４は具体的には以下の(e)乃至(i)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、ポリペプチドである。
(e)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
(f)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
(g)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
(h)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(i)上記(e)乃至(h)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＰＬ阻害活性及びＥＬ阻害活性を有するポリペプチドコードするアミノ酸配列。 Specifically, ANGPTL4 is a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (e) to (i).
(e) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(f) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(g) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(h) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence,
(i) a polypeptide code comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (e) to (h) and having LPL inhibitory activity and EL inhibitory activity Amino acid sequence.

ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む材料としては、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を産生している、哺乳動物由来の細胞株の培養上清を用いることができる。また、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を発現している細胞を直接用いても良い。ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む材料として、精製したＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４や組換えＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を使用することもできる。   As a material containing ANGPTL3 or ANGPTL4, for example, a culture supernatant of a mammalian cell line producing ANGPTL3 or ANGPTL4 can be used. Alternatively, cells expressing ANGPTL3 or ANGPTL4 may be used directly. As the material containing ANGPTL3 or ANGPTL4, purified ANGPTL3 or ANGPTL4 or recombinant ANGPTL3 or ANGPTL4 can also be used.

(iii)ＥＬ
ＥＬは上記、「３．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）」の項に記載した方法によって取得したものを用いることができる。ＥＬを含む材料としては、ＥＬを産生している、哺乳動物由来の細胞株の培養上清を用いることができる。また、ＥＬを発現している細胞を直接用いても良い。ＥＬを含む材料として、精製したＥＬや組換えＥＬを使用することもできる。ＥＬの活性は上記「３．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）」の項に記載した方法によって測定することができる。 (iii) EL
As the EL, those obtained by the method described in the section “3. Endothelial lipase (EL)” can be used. As a material containing EL, a culture supernatant of a mammal-derived cell line producing EL can be used. Moreover, you may use directly the cell which is expressing EL. As a material containing EL, purified EL or recombinant EL can also be used. The activity of EL can be measured by the method described in the above section “3. Endoceral lipase (EL)”.

（iv）基質
ＥＬの基質は、上記「３．エンドセリアルリパーゼ」の項に記載したものを用いることができる。例えば、放射標識基質としてはグリセロール・トリオレイン酸、1,2−ジ[1-14C]オレオイル・ホスファチジルコリン、蛍光基質としてはC6NBD-PC[1-アシル-2-[6-(ニトロ-2,1,3-ベンズオキサジアゾール-4-イル)アミノ]カプロイルホスファチジルコリン：N-3786,モレキュラー・プローブ社製]を用いることができるが、エンドセリアルリパーゼの活性を測定できる限りにおいて、これらの基質に制限されない。 (Iv) Substrate As the substrate of EL, those described in the above section “3. Endoceral lipase” can be used. For example, radiation as the labeled substrate glycerol trioleate, 1,2-di [1-14 C] oleoyl-phosphatidylcholine, as the fluorescent substrate C6NBD-PC [1- acyl-2- [6- (-nitro-2 , 1,3-Benzoxadiazol-4-yl) amino] caproyl phosphatidylcholine: N-3786, manufactured by Molecular Probes, Inc., as long as the activity of endothelial lipase can be measured. It is not limited to the substrate.

（v）接触
本工程における被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、及びＥＬの接触とは、被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、及びＥＬが接触している状態であれば特に制限はないが、例えば、被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、及びＥＬをそれぞれ適当な濃度で適当なバッファーに溶解して混合状態とすることを挙げることができる。 (V) Contact The contact of the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, and EL in this step is not particularly limited as long as the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, and EL are in contact with each other. ANGPTL3 or ANGPTL4, and EL can be dissolved in an appropriate buffer at an appropriate concentration to form a mixed state.

（ｂ）について
被験物質を添加しないコントロールに比べ、被験物質を添加した場合に、ＥＬの活性が低下している場合、被験物質はＥＬの活性を阻害する物質と判断することができる。 About (b) Compared with the control which does not add a test substance, when a test substance is added and EL activity has fallen, it can be judged that a test substance inhibits the activity of EL.

例えば、放射性ラベルした基質を用いてＥＬの活性を測定したときに、コントロールに比べて生成する遊離脂肪酸の放射活性が増加しているときにはＥＬの活性が増加していると判断でき、逆に生成する遊離脂肪酸の放射活性が低下しているときにはＥＬの活性が低下していると判断できる。   For example, when the activity of EL is measured using a radioactively labeled substrate, it can be judged that the activity of EL is increased when the radioactivity of the free fatty acid produced is increased compared to the control. It can be judged that the activity of EL is reduced when the radioactivity of the free fatty acid is reduced.

蛍光基質を用いたときには、コントロールに比べて蛍光強度が強ければＥＬの活性が増加していると判断でき、蛍光強度が低いときにはＥＬの活性が低下していると判断できる。   When a fluorescent substrate is used, it can be determined that the EL activity is increased if the fluorescence intensity is stronger than the control, and it can be determined that the EL activity is decreased if the fluorescence intensity is low.

本方法によって取得されるＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下を抑える作用を有する物質となり、脂質代謝改善剤となり得る。   A substance that causes a decrease in EL activity obtained by this method becomes a substance having an action of suppressing a decrease in HDL cholesterol concentration, and can be a lipid metabolism improving agent.

以下の（２）乃至（９）に示すスクリーニング方法によって、
(a)ＥＬの活性の低下を起こす性質とともに、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が増加した物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を増加する性質を有し、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
また、
(b)また、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が変化しなかった物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又ＨＴＧＬの活性に影響を及ぼさず、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。 By the screening method shown in the following (2) to (9),
(a) A test substance selected as a substance having an increased activity of LPL and / or HTGL together with a property of causing a decrease in the activity of EL has a property of increasing the activity of LPL and / or HTGL; It is a substance that has the property of causing a decrease in activity.
Also,
(b) In addition, a test substance selected as a substance whose LPL and / or HTGL activity did not change does not affect the activity of LPL and / or HTGL, and has the property of causing a decrease in EL activity. It is a substance that has.

（２）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。 (2) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (d):
(A) a step of contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, EL, and a substrate thereof, and measuring the activity of EL;
(B) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity.
(C) contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and its substrate selected in (b), and measuring the activity of LPL and / or HTGL;
(D) a test substance that has increased LPL activity or a test substance that has not changed LPL activity, and / or a test substance that has increased HTGL activity, or a test substance that has not changed HTGL activity The process of selecting.

以下、詳しく説明する。
本方法において、（ａ）及び（ｂ）は前記（１）と同様である。（ｃ）におけるＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの調製、基質、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性測定、は上記、「５．ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性の測定方法」の項にしたがって行うことができる。 This will be described in detail below.
In this method, (a) and (b) are the same as (1) above. The preparation of LPL and / or HTGL and measurement of the activity of the substrate, LPL and / or HTGL in (c) can be carried out according to the above section “5. Method for measuring LPL and / or HTGL activity”.

（３）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 (3) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (d):
(A) contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and a substrate thereof, and measuring the activity of LPL and / or HTGL;
(B) a test substance that has increased LPL activity or a test substance that has not changed LPL activity and / or a test substance that has increased HTGL activity or a test substance that has not changed HTGL activity Selecting
(C) contacting the test substance selected in (b), EL, and its substrate, and measuring the activity of EL;
(D) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity.

本方法における工程（ａ）乃至（ｄ）は、上記（１）又は（２）の記載に準じて行うことができる。   Steps (a) to (d) in this method can be performed according to the description in (1) or (2) above.

（４）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 (4) A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of EL, comprising the following steps (a) to (d):
(A) contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and a substrate thereof, and measuring the activity of LPL and / or HTGL;
(B) a test substance that has increased LPL activity or a test substance that has not changed LPL activity and / or a test substance that has increased HTGL activity or a test substance that has not changed HTGL activity Selecting
(C) contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, EL, and its substrate selected in (b), and measuring the activity of EL;
(D) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity.

本方法における工程（ａ）乃至（ｄ）は、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法に準じて行うことができる。   Steps (a) to (d) in this method can be performed according to the method described in any one of (1) to (3) above.

（５）以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｃ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。 (5) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (c):
(A) selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity;
(B) contacting the test substance selected in (a), ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and a substrate thereof, and measuring the activity of LPL and / or HTGL;
(C) a test substance that has increased LPL activity or a test substance that has not changed LPL activity and / or a test substance that has increased HTGL activity or a test substance that has not changed HTGL activity The process of selecting.

上記、工程（ａ）において用いるＥＬの活性の低下を起こした物質としては、ＥＬの活性の低下を起こすことが確認されていうる物質であればどの様な物質でも用いることができ、そのような物質としては例えば、Orlistat (Biochem. J. 368, p69-79, 2002)を挙げることができる。 Any substance that has been confirmed to cause a decrease in the activity of EL can be used as the substance that causes a decrease in the activity of EL used in step (a). Examples of the substance include Orlistat (Biochem. J. 368 , p69-79, 2002).

本方法における工程（ａ）乃至（ｃ）は、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法に準じて行うことができる。   Steps (a) to (c) in this method can be performed according to the method described in any one of (1) to (4) above.

（６）以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）ＬＰＬの活性の増加を起こす物質又はＬＰＬの活性を変化させない物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させない被験物質を選択する工程；
（ｂ）（ａ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｃ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 (6) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (c):
(A) selecting a substance that causes an increase in LPL activity or a substance that does not change the activity of LPL, and / or a test substance that causes an increase in HTGL activity or a test substance that does not change the activity of HTGL;
(B) contacting the test substance selected in (a), ANGPTL3 or ANGPTL4, EL, and its substrate, and measuring the activity of EL;
(C) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity.

本方法における工程（ａ）における、ＬＰＬの活性の増加を起こす物質又はＬＰＬの活性を変化させない物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させない被験物質はこのような性質が既に知られているものを任意に選択することができる。（ｂ）及び（ｃ）は、上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法に準じて行なうことができる。   In step (a) of the present method, a substance that causes an increase in LPL activity or a substance that does not change the activity of LPL, and / or a test substance that causes an increase in HTGL activity or a test substance that does not change the activity of HTGL Those having such properties can be arbitrarily selected. (B) and (c) can be performed according to the method described in any one of (1) to (5) above.

（７）以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程；
（ｂ）ＥＬの活性が低下した被験物質を選択する工程；
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程；
（ｄ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。 (7) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (d):
(A) contacting the test substance, EL, and its substrate, and measuring the activity of EL;
(B) selecting a test substance having decreased EL activity;
(C) contacting the test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and its substrate selected in (b), and measuring the activity of LPL and / or HTGL;
(D) a test substance that has increased LPL activity or a test substance that has not changed LPL activity, and / or a test substance that has increased HTGL activity, or a test substance that has not changed HTGL activity The process of selecting.

本方法における工程（ａ）乃至（ｄ）は、上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法に準じて行うことができる。   Steps (a) to (d) in this method can be performed according to the method described in any one of (1) to (6) above.

（８） 以下の工程（ａ）乃至（ｄ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する工程：
（ｂ）ＬＰＬの活性の増加を起こした被験物質又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
（ｃ）（ｂ）で選択された被験物質とＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する工程：
（ｄ）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 (8) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (d):
(A) A step of bringing a test substance into contact with LPL and / or HTGL and its substrate and measuring the activity of LPL and / or HTGL:
(B) a test substance that has increased LPL activity or a test substance that has not changed LPL activity and / or a test substance that has increased HTGL activity or a test substance that has not changed HTGL activity The process of selecting.
(C) A step of contacting the test substance selected in (b) with EL and its substrate, and measuring the activity of EL:
(D) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity.

（９） 以下の工程（ａ）乃至（ｂ）を含む、ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、その基質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性、及びＥＬの活性を測定する工程：
（２）ＥＬの活性の低下を起こした被験物質であって、かつ以下の性質を有する被験物質を選択する工程；
ＬＰＬの活性の増加を起こす又はＬＰＬの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させなかった被験物質。 (9) A screening method for a substance that causes a decrease in EL activity, comprising the following steps (a) to (b):
(A) A step of contacting a test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, its substrate, EL, and its substrate, and measuring the activity of LPL and / or HTGL, and the activity of EL:
(2) a step of selecting a test substance that has caused a decrease in EL activity and has the following properties;
A test substance that causes an increase in LPL activity or does not change the LPL activity, and / or a test substance that causes an increase in HTGL activity or a test substance that does not change the HTGL activity.

７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法
以下の方法によって、被験物質の脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験することができる。そのような物質は具体的には、以下の（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法によって取得することができる。なお、下記の（１）乃至（８）の各方法は、上記、「６．ＥＬの活性を阻害する物質のスクリーニング方法」に記載の方法に準じて行うことができる。また、各試験方法においては、必要に応じてコントロールとして被験物質を入れない実験を同時にあるいは別に行い、被験物質を入れた場合と入れない場合の差に基づいて被験物質の作用を判断することが望ましい。 7). Method for testing therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia Specifically, the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia can be tested. Specifically, such a substance can be obtained by the method described in any of (1) to (8) below. The following methods (1) to (8) can be carried out in accordance with the method described in “6. Screening method for substances that inhibit EL activity” above. In addition, in each test method, if necessary, an experiment without the test substance can be performed simultaneously or separately as a control, and the effect of the test substance can be judged based on the difference between the case where the test substance is added and the case where it is not added desirable.

なお、被験物質は上記「６．ＥＬの活性を阻害する物質のスクリーニング方法」の項に記載したもののほか、上記「６．ＥＬの活性を阻害する物質のスクリーニング方法」の項のスクリーニング方法によってＥＬの活性の低下を起こす物質として取得されたものや、すでに脂質代謝改善効果、例えば高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果が知られているものも用いることができる。   In addition to the test substance described in the above section “6. Screening Method for Substance Inhibiting EL Activity”, the test substance is EL by the screening method in section “6. Screening Method for Substance Inhibiting EL Activity”. Treatment of one or more diseases selected as substances that cause a decrease in the activity of the substance or an effect of improving lipid metabolism, such as hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia Alternatively, those having a known preventive effect can be used.

以下の（１）または（２）においては、被験物質を投与しない場合に比べ、血中の中性脂肪濃度が上昇せずにＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が低下していない被験物質、及び、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質から選択される被験物質は脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。   In the following (1) or (2), when the test substance or test substance in which the HDL cholesterol level is increased without increasing the blood triglyceride concentration compared with the case where the test substance is not administered, is not administered Compared to the test substance in which the blood triglyceride concentration is decreased and the HDL cholesterol concentration is not decreased, and the blood triglyceride concentration is decreased and the HDL cholesterol concentration is increased compared with the case where the test substance is not administered. The test substance selected from the test substances is an effect of improving lipid metabolism, more specifically, treatment of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia Alternatively, it can be determined that the substance has a preventive effect.

（１） 以下の（ａ）乃至（ｃ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(viii)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、１種又は２種以上のポリペプチド、及び被験物質を投与する工程；
(i)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列、
(ii)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列、
(iii)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(iv)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列、
(v)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列、
(vi)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(vii)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(viii)上記(i)乃至(vii)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。 (1) Treatment or prevention of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of a test substance, including the following (a) to (c) How to test the effect:
(A) administering to a non-human mammal one or more polypeptides comprising an amino acid sequence selected from the following (i) to (viii) and a test substance;
(i) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(ii) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(iii) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus,
(iv) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(v) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(vi) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the Sequence Listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus,
(vii) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence,
(viii) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (i) to (vii), and inhibits lipoprotein lipase inhibition and / or endosial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity;
(B) A step of measuring the neutral fat concentration and HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration in the blood of the animal in the step (a).

（ｂ）の工程において、被験物質を投与しない場合に比べ、血中の中性脂肪濃度が上昇せずにＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が低下していない被験物質、及び、被験物質を投与しない場合に比べ血中の中性脂肪濃度が低下しＨＤＬコレステロール濃度が上昇している被験物質から選択される被験物質は脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。   In the step (b), compared to the case where the test substance is not administered, the test substance in which the HDL cholesterol concentration is increased without increasing the blood neutral fat concentration, compared with the case where the test substance is not administered. Select from test substances whose triglyceride level is low and HDL cholesterol level is not low, and test substances whose blood triglyceride level is low and HDL cholesterol level is high compared to when no test substance is administered The test substance has an effect of improving lipid metabolism, more specifically, an effect of treating or preventing one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia It can be judged as a substance.

（２） 以下の工程（ａ）乃至（ｃ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）非ヒト哺乳動物に以下の(i)乃至(vi)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる工程；
(i)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(ii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iii)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(iv)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(v)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(vi)上記(i)乃至(v)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）上記工程（ａ）の動物に被験物質を投与する工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。 (2) Treatment of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, comprising the following steps (a) to (c): To test the preventive effect:
(A) a step of infecting a non-human mammal with an adenovirus carrying an adenoviral vector comprising the polynucleotide according to any one of (i) to (vi) below:
(i) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 25 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1407 is the 3 ′ end;
(ii) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 645 is the 3 ′ end. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(iii) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 609 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(iv) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 173 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1393 is the 3 ′ end;
(v) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide at nucleotide number 173 is the 5 ′ end and nucleotide number 601 is the 3 ′ end.
(vi) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide selected from (i) to (v) above, and has lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endothelial A polynucleotide encoding a polypeptide having lipase inhibitory activity;
(B) a step of administering a test substance to the animal of the above step (a);
(C) A step of measuring the neutral fat concentration, HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration in the blood of the animal in the step (b).

以下の、（３）においては、被験物質を添加しない場合に比べＥＬの活性の低下を起こす物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下を抑える作用を有する物質となり、脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。   In the following (3), a substance that causes a decrease in EL activity compared to the case where no test substance is added becomes a substance having an action of suppressing a decrease in HDL cholesterol concentration, and more specifically, an effect of improving lipid metabolism. It can be determined that the substance has an effect of treating or preventing one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia.

（３）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。   (3) a test substance, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4, an endothelial lipase, and a substrate thereof, and the activity of the endothelial lipase is measured; A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia.

以下の（４）乃至（８）においては、
(a)ＥＬの活性の低下を起こす性質とともに、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が増加した物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を増加する性質を有し、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
(b)また、本方法によってＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性が変化しなかった物質として選択された被験物質は、ＬＰＬ及び／又ＨＴＧＬの活性に影響を及ぼさず、しかも、ＥＬの活性の低下を起こす性質を有する物質である。
そして、(a)及び(b)の物質はともに、脂質代謝改善効果、より具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有する物質であると判断できる。 In the following (4) to (8),
(a) A test substance selected as a substance having an increased activity of LPL and / or HTGL together with a property of causing a decrease in the activity of EL has a property of increasing the activity of LPL and / or HTGL; It is a substance that has the property of causing a decrease in activity.
(b) In addition, the test substance selected as a substance whose LPL and / or HTGL activity did not change by this method does not affect the activity of LPL and / or HTGL, and further decreases the EL activity. It is a substance that has the property to wake up.
The substances (a) and (b) are both lipid metabolism improving effects, more specifically, one or more selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia. It can be determined that the substance has a therapeutic or prophylactic effect on other diseases.

（４）以下の（ａ）乃至（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定する。 (4) Treatment or prevention of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, including the following (a) to (b) How to test the effect:
(A) contacting a test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, EL, and its substrate, and measuring the activity of EL;
(B) A test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and a substrate thereof are contacted, and the activity of LPL and / or HTGL is measured.

（５）以下の（ａ）乃至（ｂ）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（ａ）被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する；
（ｂ）被験物質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定する。 (5) Treatment or prevention of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, including the following (a) to (b) How to test the effect:
(A) Contact with a test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and a substrate thereof, and measure the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase;
(B) Contact the test substance, EL, and its substrate, and measure the activity of EL.

（６） ＥＬの活性の低下を起こした被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性を測定することを、特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。   (6) A test substance characterized by measuring the activity of LPL and / or HTGL by contacting a test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, and a substrate thereof that have caused a decrease in EL activity A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia.

（７） ＬＰＬの活性の増加を起こす被験物質又はＬＰＬの活性を変化させない被験物質、及び／又は、ＨＴＧＬの活性の増加を起こした被験物質又はＨＴＧＬの活性を変化させない被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＥＬの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。   (7) a test substance that causes an increase in LPL activity or a test substance that does not change the activity of LPL, and / or a test substance that causes an increase in HTGL activity or a test substance that does not change the activity of HTGL, ANGPTL3 or ANGPTL4, One or two or more selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of a test substance, characterized by contacting EL and its substrate and measuring the activity of EL Of testing the therapeutic or prophylactic effect of the disease.

（８） 被験物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬ、その基質、ＥＬ、及びその基質を接触させ、ＬＰＬ及び／又はＨＴＧＬの活性、及びＥＬの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。   (8) A test characterized by contacting a test substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, LPL and / or HTGL, its substrate, EL, and its substrate, and measuring the activity of LPL and / or HTGL, and the activity of EL A method for testing the therapeutic or preventive effect of a substance on one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia.

８．エンドセリアルリパーゼ（ＥＬ）阻害剤
「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３、及び、ＡＮＧＰＴＬ４はＥＬ阻害剤となり得る。また、これらの物質は、ＨＤＬコレステロール濃度の低下抑制及び／又は増加作用を有し、脂質代謝改善効果、具体的には、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物となり得る。 8). Endothelial lipase (EL) inhibitor Substance selected by the method described in the section “6. Screening method for substances causing decrease in EL activity”, “7. Hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteries” One selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia according to the section `` Method for testing therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from sclerosis and hyperglycemia '' Substances that have been confirmed to have a therapeutic or prophylactic effect for one or more diseases, ANGPTL3, and ANGPTL4 can be EL inhibitors. In addition, these substances have the action of suppressing and / or increasing the HDL cholesterol level, and are selected from lipid metabolism improving effects, specifically hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia. Or a pharmaceutical composition for treating or preventing one or more diseases.

上記、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」のに項よって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質を含むＥＬ阻害剤並びに高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物としては、微生物の培養液や動植物の組織からの抽出物、培養細胞の培養液からの抽出物、人工的に合成された無機または有機化合物、組換えタンパク質、抗体またはその断片、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等の核酸、それらの塩、それらの誘導体、もしくはそれらの中の複数種類の物質を混合した組成物などを挙げることができる。   A substance selected by the method described in the above section "6. Screening method for substances causing a decrease in EL activity", "7. Selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia" One or more selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia according to the section of `` Method for testing therapeutic or preventive effect of one or more diseases to be performed '' EL inhibitors containing substances that have been confirmed to have a therapeutic or prophylactic effect on other diseases and treatment of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia Or as a preventive pharmaceutical composition, an extract from a culture solution of microorganisms or tissue of animals or plants, an extract from a culture solution of cultured cells, an artificially synthesized inorganic or organic compound, a recombinant protein, an antibody or its Fragment, antisense nucleic acid, siRNA, etc. Nucleic acid, salts thereof, and the like derivatives or a plurality of types of composition materials were mixed in them.

ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む、ＥＬ阻害剤及びＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４を含む高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物は具体的には、以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上有効成分として含む：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。 Pharmaceutical composition for treatment or prevention of one or more diseases selected from EL inhibitors containing ANGPTL3 or ANGPTL4 and hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia containing ANGPTL3 or ANGPTL4 Specifically, it comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (1) to (8) as one or more active ingredients:
(1) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(2) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(3) One continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(4) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(5) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(6) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(7) One continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(8) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (1) to (7), and lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endocelial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity.

本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。   The substance used in the preparation acceptable in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably non-toxic to the person receiving the pharmaceutical composition at the dose or concentration.

本発明の医薬組成物は、ｐH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、色、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、維持したり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素、トリス−塩酸（Tris-Hcl）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノースまたはデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸または過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコールまたはポリエチレン・グリコール等の溶媒、マンニトールまたはソルビトール等の当アルコール、懸濁剤、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルビテート20やポリソルビテート80等ポリソルビテート、トリトン（triton）、トロメタミン（tromethamine）、レシチンまたはコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗ヒト・カルシンテンイン−２抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention changes or maintains pH, osmotic pressure, viscosity, transparency, color, isotonicity, color, sterility, stability, dissolution rate, sustained release rate, absorption rate, and penetration rate. , And can contain a formulation substance for holding. Substances for formulation may include, but are not limited to: amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, antibacterial agents, ascorbic acid, sodium sulfate or sodium bisulfite Antioxidants, phosphoric acid, citric acid, boric acid buffer, hydrogen carbonate, buffer such as Tris-HCl (Tris-Hcl) solution, filler such as mannitol and glycine, chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Caffeine, polyvinylpyrrolidine, complexing agents such as β-cyclodextrin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin, bulking agents such as glucose, mannose or dextrin, monosaccharides, disaccharides and glucose, other carbohydrates such as mannose and dextrin , Colorants, flavoring agents, diluents, emulsifiers and poly Preservatives such as hydrophilic polymers such as vinylpyrrolidine, low molecular weight polypeptides, salt-forming counterions, benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide, Solvents such as glycerin, propylene glycol or polyethylene glycol, alcohols such as mannitol or sorbitol, suspensions, PEG, sorbitan esters, polysorbites such as polysorbate 20 and polysorbate 80, triton, tromethamine (Tromethamine), surfactants such as lecithin or cholesterol, stabilization enhancers such as sucrose and sorbitol, elasticity enhancers such as sodium chloride, potassium chloride and mannitol / sorbitol, transport agents, dilution Agents, excipients and / or pharmaceutical auxiliaries. The addition amount of these substances for preparation is preferably 0.01 to 100 times, particularly preferably 0.1 to 10 times the weight of the anti-human calcintenin-2 antibody. The composition of a suitable pharmaceutical composition in the preparation can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the disease to be applied, the route of administration and the like.

医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐH7.0−8.5のTrisバッファーやpH4.0-5.5の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。   Excipients and carriers in the pharmaceutical composition may be liquid or solid. Appropriate excipients and carriers may be water for injection, physiological saline, artificial cerebrospinal fluid and other substances commonly used for parenteral administration. Neutral physiological saline or physiological saline containing serum albumin can also be used as a carrier. The pharmaceutical composition may contain Tris buffer with pH 7.0-8.5, acetate buffer with pH 4.0-5.5, and sorbitol and other compounds. The pharmaceutical composition of the present invention is prepared as a lyophilized product or liquid as an appropriate drug in the purity required for the selected composition.

本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４に対する親和性、即ち、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、「６．ＥＬの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法」の項に記載された方法によって選択された物質、「７．高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法」の項によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質、ＡＮＧＰＴＬ３又はＡＮＧＰＴＬ４をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。   The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared for parenteral administration or can be prepared for oral digestive tract absorption. The composition and concentration of the preparation can be determined by the administration method, and can be selected by the method described in the section “6. Screening method for substances causing a decrease in EL activity” contained in the pharmaceutical composition of the present invention. High fat according to the section “7. Method for testing therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia” Affinity to a substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, which has been confirmed to have a therapeutic or prophylactic effect for one or more diseases selected from blood glucose, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia, ie, “6 A substance selected by the method described in the section “Methods for screening substances causing a decrease in EL activity”, one selected from “7. Hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia” Or two or more According to the section “Method for testing the therapeutic or prophylactic effect of a disease of the present invention”, it has a therapeutic or prophylactic effect on one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia As a result, the higher the affinity (lower Kd value) for the dissociation constant (Kd value) for the substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, which is confirmed to be, the smaller the dose to humans, the more effective the drug. Based on the above, the dose of the pharmaceutical composition of the present invention to a person can be determined. The dosage was selected by the method described in the section “6. Screening method for substances causing a decrease in EL activity”, “7. Hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia”. One or two selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia according to the section `` Method for testing therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from When administering a substance, ANGPTL3 or ANGPTL4, that has been confirmed to have a therapeutic or preventive effect on the above-mentioned diseases, about 0.1 to 100 mg / kg should be administered once every 1 to 30 days. Good.

本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。   Examples of the form of the pharmaceutical composition of the present invention include injectable preparations including drips, suppositories, nasal preparations, sublingual agents, and transdermal absorption agents.

以下、参考例及び実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」［Sambrook, J.,Fritsch, E.F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference examples and examples, but the present invention is not limited thereto. In the following examples, unless otherwise specified, each operation relating to gene manipulation is “Molecular Cloning” [Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Published in the year], or when using commercially available reagents and kits, they were used according to the instructions for commercial products.

参考例１ モノクローナル抗体の精製
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００２年３月１３日付で、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９６３として寄託されている、抗アンジオポエチン関連タンパク質３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ４５Ｂ１株を１０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を含むＴＩＬ培地（免疫生物研究所社製）で培養した。培養上清を回収して、０．２２μｍのフィルター(ミリポア社)にて濾過滅菌した後、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩ（ファルマシア社）を用いて抗体を精製した。以上の工程を経て抗アンジオポエチン関連タンパク質３モノクローナル抗体ＭＡｂ４５Ｂ１を得た。この抗体は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体であると同定されている。 Reference Example 1 Purification of Monoclonal Antibody Anti-Angiopoietin-related Protein 3 Monoclonal Antibody-Producing Hybridoma 45B1 Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of March 13, 2002 under the deposit number FERM BP-7963 The strain was cultured in a TIL medium (manufactured by Immunobiological Laboratories) containing 10% FCS (manufactured by GibcoBRL). The culture supernatant was collected and sterilized by filtration through a 0.22 μm filter (Millipore), and then the antibody was purified using MAbTrap GII (Pharmacia). Through the above steps, anti-angiopoietin-related protein 3 monoclonal antibody MAb45B1 was obtained. This antibody has been identified as an antibody of the IgG1 subclass.

参考例２ ＡＮＧＰＴＬ３ ｃＤＮＡのクローニング
１）プローブの調製
ＡＮＧＰＴＬ３ ｃＤＮＡを取得するため、下記のヌクレオチド配列：
5'- tcctctagtt atttcctcca g -3'（配列表の配列番号２０）；および
5'- tggtttgcca gcgatagatc -3'（配列表の配列番号２１）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 Reference Example 2 Cloning of ANGPTL3 cDNA 1) Preparation of Probe In order to obtain ANGPTL3 cDNA, the following nucleotide sequence:
5'-tcctctagtt atttcctcca g-3 '(SEQ ID NO: 20 of the Sequence Listing); and
5'-tggtttgcca gcgatagatc-3 '(SEQ ID NO: 21 in the sequence listing)
An oligonucleotide primer was synthesized.

次に、ヒトゲノムＤＮＡ（ベーリンガーマンハイム社製、２００ｍｇ／ｍｌ）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（ｒＴａｑ、宝酒造（株）社製、５単位／μｌ）１μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液（宝酒造（株）社製）１０μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）１６μｌ、２０μＭのプライマー各２μｌ、および滅菌水６８μｌを混合した。この反応液を、９４℃で５分間加熱した後、引き続き９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温してから、４℃に保存した。この反応液を２％ アガロースゲルにて電気泳動した後、増幅されたＤＮＡバンド部分のゲルを切り出して精製した。このようにして得られたＤＮＡをＤＮＡ標識キット（BcaBestラベリングキット、宝酒造（株）社製）を用いて３２Ｐで標識したものを下記２）においてプローブとして用いた。   Next, human genomic DNA (Boehringer Mannheim, 200 mg / ml) 1 μl, Taq polymerase (rTaq, Takara Shuzo Co., Ltd., 5 units / μl) 1 μl, 10 × PCR buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.) 10 μl, dNTP mixed solution (2.5 mM each) 16 μl, 20 μM primer 2 μl each, and sterile water 68 μl were mixed. The reaction solution was heated at 94 ° C. for 5 minutes, and then the temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds was repeated 30 times, and finally the temperature was kept at 72 ° C. for 10 minutes. And stored at 4 ° C. This reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel, and then the amplified DNA band gel was cut out and purified. The DNA thus obtained was labeled with 32P using a DNA labeling kit (BcaBest labeling kit, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and used as a probe in the following 2).

２）ｃＤＮＡライブラリーの１次スクリーニング
市販のヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー（Human Liver 5'-STRETCH cDNA Library、クロンテック社製）のうち、１×１０６プラークのＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを感染させた大腸菌を直径９ｃｍの培養シャーレに作製した寒天培地プレート２０枚に、１枚あたり５×１０４個のプラークが形成されるように分散させ、３７℃で８時間培養した。このプラーク形成された寒天培地上に、シャーレ内径に合わせた円形のナイロンメンブレン（アマシャム・ファルマシア社製、ハイボンドＮ＋）をのせて、４℃にて５分間放置することによりプラークを移しとった。１８Ｇの注射針を用いてメンブレンの３ヶ所を寒天培地まで貫通することにより位置合わせ用の目印をつけた後、メンブレンを剥がしてアルカリ溶液（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ 水酸化ナトリウム）に２分間、次いで中和溶液（１．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０））に５分間、さらに２×ＳＳＣ、０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む溶液に３０秒間浸した後、室温で完全に風乾させた。次いで、クロスリンク用紫外線照射装置（スペクトロリンカーＸＬ−１０００、トミー精工（株）社製）で紫外線を照射（１２００Ｊ／ｃｍ２）してＤＮＡを固定した。 2) Primary screening of cDNA library From a commercially available human liver-derived cDNA library (Human Liver 5'-STRETCH cDNA Library, manufactured by Clontech), 1 × 10 6 plaque DNA was immobilized on a nylon membrane. That is, E. coli infected with the cDNA library was dispersed in 20 agar plates prepared in a 9 cm diameter culture dish so that 5 × 10 4 plaques were formed per plate, and cultured at 37 ° C. for 8 hours. did. On this plaque-formed agar medium, a circular nylon membrane (Amersham Pharmacia, High Bond N +) matched to the inner diameter of the petri dish was placed and left at 4 ° C. for 5 minutes to transfer the plaque. After marking the alignment points by penetrating three locations of the membrane to the agar medium using an 18G injection needle, the membrane is peeled off to obtain an alkaline solution (1.5 M sodium chloride, 0.5 M sodium hydroxide). 2 minutes, then neutralized solution (1.5 M sodium chloride, 0.5 M Tris-hydrochloric acid (pH 8.0)) for 5 minutes, and further 2 × SSC, 0.2 M Tris-hydrochloric acid (pH 7.5) After soaking for 30 seconds, it was completely air-dried at room temperature. Subsequently, DNA was immobilized by irradiation with ultraviolet rays (1200 J / cm 2) with an ultraviolet irradiation device for cross-linking (Spectrolinker XL-1000, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.).

このようにして調製されたメンブレンを、上記１）で得られた標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（ExpressHyb solution、クロンテック社製）中で６５℃で一晩インキュベーションした。その後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳを含む溶液で１５分ずつ３回、室温で洗浄してから、さらに０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む溶液で３０分ずつ３回、５０℃で洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。   The membrane thus prepared was incubated overnight at 65 ° C. in a hybridization solution (ExpressHyb solution, manufactured by Clontech) containing the labeled probe obtained in 1) above. Thereafter, the membrane was washed 3 times for 15 minutes each with a solution containing 2 × SSC and 0.05% SDS at room temperature, and further 3 times for 30 minutes each with a solution containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS. After washing at 50 ° C., autoradiography was performed.

その結果判明した陽性のシグナルの位置にあったプラークを、上記寒天培地プレートから培地ごと採取し、それぞれ１００μｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ 塩化ナトリウム、８ｍＭ 硫酸マグネシウム、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％ ゼラチン）中に入れてよく懸濁してから４℃で２時間放置した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収した。   Plaques at the position of positive signals that were found as a result were collected from the agar medium plate together with the medium, and each 100 μl of SM buffer (0.1 M sodium chloride, 8 mM magnesium sulfate, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ), 0.01% gelatin) and well suspended, allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours, and then centrifuged at 12000 × g for 5 minutes to recover the supernatant.

このようにして得られた１次陽性ファージ液を再び大腸菌に感染させたものを、直径９ｃｍの培養用シャーレに作製した寒天培地上に、シャーレ１枚あたり５００個のプラークが形成されるように培養し、上記の手法を繰り返すことにより２次スクリーニングを行った。得られた２次陽性クローンファージを大腸菌株ＢＭ２５．８（クロンテック社製）に感染させたものを寒天培地上で３７℃で培養して、ファージミドを含む大腸菌コロニーを形成させた。コロニーを単離し、液体培地で少量培養してファージミドを抽出し、制限酵素消化による挿入断片の解析を行った結果、１．６ｋｂｐの挿入断片を有する、クローン＃ｈ５−１を有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９９を単離した。なお、このファージミド＃ｈ５−１を保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ ＳＡＮＫ ７２２９９は、１９９９年１１月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４１が付されている。   The plaque obtained by infecting Escherichia coli again with the primary positive phage solution thus obtained is formed on agar medium prepared in a culture dish having a diameter of 9 cm so that 500 plaques per petri dish are formed. The secondary screening was performed by culturing and repeating the above procedure. The obtained secondary positive clone phage infected with E. coli strain BM25.8 (Clontech) was cultured at 37 ° C. on an agar medium to form an E. coli colony containing phagemid. Colonies were isolated, cultured in a small amount in a liquid medium, phagemid was extracted, and the insert fragment was analyzed by digestion with restriction enzyme. As a result, E. coli having clone # h5-1 having the insert fragment of 1.6 kbp was isolated. E. coli pTrip / h55-1 SANK 72299 was isolated. It should be noted that the transformed Escherichia coli E. coli harboring this phagemid # h5-1. E. coli pTrip / h55-1 SANK 72299 was deposited internationally at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center) on November 19, 1999, with the accession number FERM BP-6941 is attached.

３） ｐＭＥｈ５５−１の取得
上記２）で得られた＃ｈ５−１ファージミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、ｃＤＮＡを含む約１．６ｋｂの断片を単離、精製した。一方、高発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（Hara, T. et al.(1992) EMBO.J. 11, 1875-、横田崇、新井賢一編集、バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社、p18-20）を同様にＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、末端を脱リン酸化した後、上記ｃＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（バージョン２、宝酒造（株）社製）を用いて連結した。このＤＮＡで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換株についてそれが保有するプラスミドＤＮＡの制限酵素による解析を行い、１．６ｋｂのＤＮＡ断片を有する株を選択してｐＭＥｈ５５−１と命名した。 3) Acquisition of pMEh55-1 The # h5-1 phagemid DNA obtained in 2) above was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and subjected to 8% polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a fragment of about 1.6 kb containing cDNA. Was isolated and purified. On the other hand, high expression vector pME18S (Hara, T. et al. (1992) EMBO.J. 11, 1875-, Takashi Yokota, edited by Kenichi Arai, Biomanual Series 3, Gene Cloning Experiment Method, Yodosha, p18-20 ) Was similarly digested with EcoRI and XbaI, and the ends were dephosphorylated, and then ligated with the above cDNA fragment and a DNA ligation kit (version 2, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Escherichia coli was transformed with this DNA, and the obtained transformant was analyzed by restriction enzyme of plasmid DNA possessed by the strain. A strain having a 1.6 kb DNA fragment was selected and named pMEh55-1.

参考例３ アンジオポエチン関連タンパク質３の調製
１）アンジオポエチン関連タンパク質３生産ＣＨＯ細胞株の作製
参考例２によって取得されているＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を含むプラスミドｐＭＥｈ５５−１とｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）−１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン-１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地でジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）に共導入し、核酸除去培地において定常株を取得した。次に、本定常株をメトトレキセート０．０８μＭ濃度で生育可能な耐性株を取得し、遺伝子重複による発現量の増加が確認された株を取得した。以後、１．２８、３０、６０μＭのメトトレキセート入り核酸除去ＭＥＭα培地で生育可能な株を取得していき、最終的にコンフルエントな無血清培養の細胞培養用フラスコ上で、５乃至１０ｍｇ／ｌ／３日の生産能を有するＡＮＧＰＴＬ３生産ＣＨＯ細胞株を取得した。 Reference Example 3 Preparation of Angiopoietin Related Protein 3 1) Preparation of Angiopoietin Related Protein 3 Producing CHO Cell Line Plasmid pMEh55-1 and pSV2-dhfr (ATCC) containing ANGPTL3 gene obtained in Reference Example 2 were treated with 10% FCS (GibcoBRL). Co., Ltd.)-MEMα (GibcoBRL) -10 units / ml penicillin-10 μg / ml streptomycin (GibcoBRL) medium was co-introduced into dihydrofolate reductase-deficient CHO cells (ATCC) to obtain a stationary strain in a nucleic acid removal medium did. Next, a resistant strain capable of growing this constant strain at methotrexate concentration of 0.08 μM was obtained, and a strain in which an increase in the expression level due to gene duplication was confirmed was obtained. Thereafter, strains capable of growing on 1.28, 30, 60 μM methotrexate-containing nucleic acid-removed MEMα medium were obtained, and finally 5 to 10 mg / l / 3 on a confluent serum-free culture cell culture flask. An ANGPTL3-producing CHO cell line having a daily production ability was obtained.

このように作製したＡＮＧＰＴＬ３生産ＣＨＯ細胞株をコンフルエントまで培養後、無血清ＭＥＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地に交換し、３日間培養して無血清培養上清を得た。   The thus-prepared ANGPTL3-producing CHO cell line was cultured until confluent, then replaced with serum-free MEMα (GibcoBRL) medium, and cultured for 3 days to obtain a serum-free culture supernatant.

２）脱塩、小分子除去
１）で得られた培養上清をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）１.６リットルのゲルに対して６００ｍｌの割合で２０ｍｌ／ｍｉｎで１０回に分けてチャージして、脱塩と小分子の除去を行い、次いでＦＰＬＣ（Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分画した。 2) Desalting and removal of small molecules The culture supernatant obtained in 1) was divided into 10 times at a rate of 600 ml with respect to 1.6 liter gel of Sephadex G25 (Amersham Pharmacia Biotech) at 20 ml / min. Then, desalting and removal of small molecules were performed, followed by fractionation by ion exchange chromatography using FPLC (Biopilot system, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).

３）分画ＳｔｅｐＩ
カラム：Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＸＫ５０（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１００ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ａ）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）−０.０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｂ）２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）−０.０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
フラクション溶液：１０ml／ｔｕｂｅ
温度：４℃
溶出条件：溶離液Ａ→ 溶離液Ｂ（直線濃度勾配、６０分間）
得られたフラクションについて、各々０.３乃至０．４５Ｍ ＮａＣｌ濃度で溶出されてくる画分を回収した後、一つの溶液にまとめた。まとめた溶液をサンプルとして、以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて、群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。 3) Fraction StepI
Column: 100 ml of Qsepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech) was packed into XK50 (Amersham Pharmacia Biotech).
Elution buffer:
A) 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) -0.01% NaN3 (manufactured by SIGMA) -0.005% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) -0.005% Tween 20 (manufactured by SIGMA)
B) 20 mM Tris-HCl-1M NaCl (pH 7.5) -0.01% NaN3 (manufactured by SIGMA) -0.005% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) -0.005% Tween 20 (manufactured by SIGMA)
Flow rate: 10 ml / min
Fraction solution: 10 ml / tube
Temperature: 4 ° C
Elution condition: Eluent A → Eluent B (Linear concentration gradient, 60 minutes)
For the obtained fractions, fractions eluted at a concentration of 0.3 to 0.45 M NaCl were collected and combined into one solution. Using the collected solution as a sample, group-specific affinity chromatography was performed under the following conditions using FPLC (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) under the following conditions.

４）分画ＳｔｅｐＩＩ
カラム：Ａｆｆｉ Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
Ｄ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を６０ｍｌを流す。
溶出条件：Ｄ）液を１００ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。回収した溶液を等量（１００ｍｌ）のＡ）液と混濁し、作製した２００ｍｌの溶液をサンプルとして以下の条件で、ＦＰＬＣ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いた群特異的アフィニティークロマトグラフィーを以下の条件で実施した。 4) Fraction StepII
Column: 10 ml of Affi Gel Blue (BioRad) was packed into KX16 (Amersham Pharmacia Biotech).
Elution buffer:
C) 20 mM Tris-HCl-0.5 M NaCl (pH 7.5) -0.01% NaN3 (manufactured by SIGMA) -0.005% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) -0.005% Tween 20 (SIGMA) Made)
D) 20 mM Tris-HCl-1M NaCl (pH 7.5) -0.01% NaN3 (manufactured by SIGMA) -0.005% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) -0.005% Tween 20 (manufactured by SIGMA)
Flow rate: 1.5 ml / min
Temperature: 4 ° C
After applying the sample, 60 ml of C) solution is allowed to flow.
Elution conditions: D) 100 ml of the solution was flowed and collected as one solution. The collected solution was turbid with an equal volume (100 ml) of A) solution, and the group-specific affinity chromatography using FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) was performed under the following conditions using the prepared 200 ml solution as a sample. It implemented on condition of the following.

５）分画ＳｔｅｐＩＩＩ
カラム：Ｌｅｎｔｉｌ ｌｅｃｔｉｎ ｓｅｐｈａｒｏｓｅTM（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）をＫＸ１６（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に１０ｍｌ充填した。
溶離緩衝液：
Ｃ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）−０.０１％ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０.００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
Ｆ）２０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−０．５Ｍ ＮａＣｌ−０．３M Ｍｅｔｈｙｌｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＨ７．５）−０．０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）−０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製））
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４℃
サンプルをアプライ後、Ｃ）液を５０ｍｌ流す。
溶出条件：Ｆ）液を５０ｍｌ流し、一つの溶液として回収した。 5) Fraction StepIII
Column: 10 ml of Lentil lectin sepharose ™ (Amersham Pharmacia Biotech) was packed into KX16 (Amersham Pharmacia Biotech).
Elution buffer:
C) 20 mM Tris-HCl-0.5 M NaCl (pH 7.5) -0.01% NaN3 (manufactured by SIGMA) -0.005% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) -0.005% Tween 20 (SIGMA) Made))
F) 20 mM Tris-HCl-0.5M NaCl-0.3M Methylmannopyranoside (pH 7.5) -0.01% NaN3 (manufactured by SIGMA) -0.005% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) -0.005 % Tween20 (made by SIGMA))
Flow rate: 1 ml / min
Temperature: 4 ° C
After applying the sample, flow 50 ml of C) solution.
Elution conditions: F) 50 ml of the solution was flowed and collected as one solution.

６）透析
回収した液をＤｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ−１−７／８ ｉｎ Ｄｕａｍｅｔｅｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に移し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ＰＢＳ（−）（日水製薬社製）、０．０１％ ＮａＮ3（ＳＩＧＭＡ社製）−０．１％ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液２リットルで一晩、４℃で透析した。 6) The solution collected by dialysis was transferred to Dialyzation tube-1-7 / 8 in Dumeter (GibcoBRL), Dulbecco's PBS (-) (Nissui Pharmaceutical), 0.01% NaN3 (SIGMA) -Dialyzed overnight at 4 ° C against 2 liters of 0.1% Protease inhibitor cocktail (manufactured by SIGMA) solution.

７）ＡＮＧＰＴＬ３の確認
透析後、回収したＡＮＧＰＴＬ３溶液の濃度は、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）で測定した。またＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン解析を行った。なお、ＡＮＧＰＴＬ３溶液中のエンドトキシン濃度はエンドトキシン測定キット（生化学工業）により測定し、ＡＮＧＰＴＬ３ １ｍｇあたり０．２μｇ以下であることを確認した。 7) Confirmation of ANGPTL3 After dialysis, the concentration of the recovered ANGPTL3 solution was measured with DC protein assay kit (Bio Rad). In addition, SDS-PAGE and Western analysis were performed. The endotoxin concentration in the ANGPTL3 solution was measured with an endotoxin measurement kit (Seikagaku Corporation), and it was confirmed that the concentration was 0.2 μg or less per 1 mg of ANGPTL3.

参考例４ ＭＡｂ４５Ｂ１を用いたＡＮＧＰＴＬ３定量系の確立
１）ウサギ抗ＡＮＧＰＴＬ３ポリクローナル抗体の作製
アジュバントとしてフロインド完全アジュバント（ディフコ社）０．５ｍｌを参考例３で精製した０．５ｍｌ(１００μｇ相当)のＡＮＧＰＴＬ３に加え、連結針のついた注射筒内でエマルジョンを形成させた後、雄ウサギの皮下に接種した。２回目以降の免疫ではアジュバントとしてフロインド不完全アジュバント（ディフコ社）を用いた。免疫は、約２週間おきに８回行った。接種後、経時的に部分採血し、抗体価の上昇を調べた。８回目の免疫後７日後に麻酔下で全採血し、５３．５ｍｌの免疫血清を得た。該血清２０ｍｌを、ＭＡｂＴｒａｐ ＧIIキットを用いて精製し、１１５ｍｌの１．６４ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧが得られた。 Reference Example 4 Establishment of ANGPTL3 quantification system using MAb45B1 1) Preparation of rabbit anti-ANGPTL3 polyclonal antibody In addition, after an emulsion was formed in a syringe with a connecting needle, it was inoculated subcutaneously into male rabbits. In the second and subsequent immunizations, Freund's incomplete adjuvant (Difco) was used as an adjuvant. Immunization was performed 8 times about every 2 weeks. After inoculation, partial blood collection was performed over time, and the increase in antibody titer was examined. Seven days after the eighth immunization, whole blood was collected under anesthesia to obtain 53.5 ml of immune serum. 20 ml of the serum was purified using the MAbTrap GII kit to obtain 115 ml of 1.64 mg / ml IgG.

以上の工程を経て、ウサギ抗ＡＮＧＰＴＬ３ポリクローナル抗体（以下「No.1抗体」という）を得た。   Through the above steps, a rabbit anti-ANGPTL3 polyclonal antibody (hereinafter referred to as “No. 1 antibody”) was obtained.

２） ＨＲＰ標識Ｆａｂ´化ポリクローナル抗体の作成
ａ）Ｆ（ａｂ´）2の調製
１．６４ｍｇ／ｍｌの濃度の Ｎｏ．１抗体３０ｍｌを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５ ０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）で透析した。透析後にＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５ ０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）でＮｏ．１抗体の濃度を６ｍｇ／ｍｌに合わせた。 2) Preparation of HRP-labeled Fab′-modified polyclonal antibody a) Preparation of F (ab ′) 2 1. No. 1 at a concentration of 64 mg / ml. 30 ml of 1 antibody was dialyzed against 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.5 containing 0.1 M NaCl). After dialysis, the mixture was concentrated using CENTRICON-30 (Amicon), and No. was added with 0.1 M sodium acetate buffer (containing pH 4.5 and 0.1 M NaCl). The concentration of 1 antibody was adjusted to 6 mg / ml.

このＮｏ．１抗体溶液０．５ｍｌに０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）で１０ｍｇ／ｍｌに溶解したブタ胃・ペプシン（シグマ社）２０μｌ(０．２ｍｇ)を添加し、３７℃で６時間反応させた。反応液を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４（インビトロジェン社）カラム（１．５ｃｍ×４５ｃｍ）−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１抗体Ｆ（ａｂ´）2画分を２８０ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。   This No. Add 20 μl (0.2 mg) of porcine stomach and pepsin (Sigma) dissolved in 10 mg / ml of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.5, containing 0.1 M NaCl) to 0.5 ml of 1 antibody solution. And allowed to react at 37 ° C. for 6 hours. After the reaction solution was dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), Ultragel AcA 44 (Invitrogen) column (1.5 cm × 45 cm) —0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) Gel filtration was performed at a flow rate of 0.35 ml / min and a fraction of 0.5 to 1.0 ml. No. One antibody F (ab ′) 2 fraction was confirmed by absorbance at 280 nm and concentrated using CENTRICON-30 (Amicon).

これらの操作を繰り返し、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の Ｎｏ．１ Ｆ（ａｂ'）2抗体溶液１１．２ｍｌが得られた。   These operations were repeated until No. 2 having a concentration of 2.5 mg / ml. 11.2 ml of 1 F (ab ′) 2 antibody solution was obtained.

ｂ）Ｆａｂ'の調製
２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｏ．１ Ｆ(ａｂ´)2抗体１１．２ｍｌを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で透析した。透析後にＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０(アミコン社)を用いて濃縮し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)で濃度を５ｍｇ／ｍｌに合わせた。 b) Preparation of Fab ′ No. at a concentration of 2.5 mg / ml. 11.2 ml of 1 F (ab ′) 2 antibody was dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0). After dialysis, the mixture was concentrated using CENTRICON-30 (Amicon), and the concentration was adjusted to 5 mg / ml with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0).

このＮｏ．１ Ｆ(ａｂ´)2抗体溶液０．４５ｍｌに０．１Ｍ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)５０μｌを加え、３７℃、９０分間反応させた。反応液をＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４(インビトロジェン社)カラム(１．５×４５ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０，５ｍＭ ＥＤＴＡを含む)、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。Ｎｏ．１ Ｆａｂ´抗体の存在を２８０ｎｍの吸光度により確認した後、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０(アミコン社)を用いて濃縮した。   This No. 50 μl of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.1 M 2-mercaptoethylamine and 10 mM EDTA was added to 0.45 ml of 1 F (ab ′) 2 antibody solution, and reacted at 37 ° C. for 90 minutes. The reaction solution was an Ultragel AcA 44 (Invitrogen) column (1.5 × 45 cm) -0.1 M sodium phosphate buffer (containing pH 6.0, 5 mM EDTA), a flow rate of 0.35 ml / min, a fraction of 0.1. Gel filtration was performed with 5 to 1.0 ml. No. The presence of the 1 Fab ′ antibody was confirmed by absorbance at 280 nm, and then concentrated using CENTRICON-30 (Amicon).

これらの操作を繰り返し、１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｏ．１ Ｆａｂ´抗体１１．４ｍｌが得られた。   These operations were repeated until No. 1 at a concentration of 1.4 mg / ml. 11.4 ml of 1 Fab ′ antibody was obtained.

ｃ）マレイミドペルオキシダーゼの調製
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(シグマ社)３６．８ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７．０)に６．６６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。また、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅに Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−(Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ) ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ(シグマ社)を７０ｍＭの濃度になるように溶解した。 c) Preparation of maleimide peroxidase 36.8 mg of horseradish peroxidase (Sigma) was dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) to a concentration of 6.66 mg / ml. In addition, N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sigma) was dissolved in N, N-dimethylformamide to a concentration of 70 mM.

この西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ溶液３００μｌに７０ｍＭの濃度のＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−(Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ) ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ溶液を３０μｌ加え、３０℃、３０分間反応させた。反応液から沈殿を遠心除去した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラム(１×３０ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．０)，流速０．４乃至０．６ｍｌ／ｍｉｎ，１画分０．５乃至１．０ｍｌでゲル濾過した。ペルオキシダーゼを含む画分を４０３ｎｍの吸光度により確認し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０（アミコン社）を用いて濃縮した。   To 300 μl of this horseradish peroxidase solution was added 30 μl of a 70 mM N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate solution and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. After removing the precipitate from the reaction solution by centrifugation, Sephadex G-25 column (1 × 30 cm) —0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0), flow rate 0.4 to 0.6 ml / min, 1 fraction Gel filtration was performed at 0.5 to 1.0 ml. The fraction containing peroxidase was confirmed by absorbance at 403 nm, and concentrated using CENTRICON-30 (Amicon).

これらの操作を繰り返し、６．５ｍｇ／ｍｌの濃度のマレイミドペルオキシダーゼ溶液が５．２ｍｌ得られた。   These operations were repeated to obtain 5.2 ml of a maleimide peroxidase solution having a concentration of 6.5 mg / ml.

ｄ）マレイミド化ペルオキシダーゼとＦａｂ´の反応
１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｏ．１ Ｆａｂ´抗体溶液０．７１ｍｌに６．５ｍｇ／ｍｌの濃度のマレイミド化ペルオキシダーゼ溶液０．２８ｍｌを添加し、４℃、２０時間反応させた。反応後、５０ｍＭ Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅを１０μｌ添加した。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ４４(インビトロジェン社)カラム(１．５×４５乃至１００ｃｍ)−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６．５)、流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、１画分１．０ｍｌでゲル濾過した。各画分の２８０ｎｍ及び４０３ｎｍにおける吸光度を測定し、さらに各画分のペルオキシダーゼ活性を測定した。各画分に０．２％(ｗ／ｖ) ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ(シグマ社)を終濃度０．００２％になるように、１０％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンを終濃度０．１％になるようにそれぞれ添加した後、４℃で保存した。ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ´の濃度はペルオキシダーゼ活性あるいは４０３ｎｍの吸光度から計算した。 d) Reaction of maleimidated peroxidase and Fab ′ No. 1 at a concentration of 1.4 mg / ml. 0.28 ml of a maleimidated peroxidase solution having a concentration of 6.5 mg / ml was added to 0.71 ml of the 1 Fab ′ antibody solution and reacted at 4 ° C. for 20 hours. After the reaction, 10 μl of 50 mM N-ethylmaleimide was added. Gel filtration was performed with an Ultragel AcA44 (Invitrogen) column (1.5 × 45 to 100 cm) —0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5), a flow rate of 0.35 ml / min, and a fraction of 1.0 ml. The absorbance at 280 nm and 403 nm of each fraction was measured, and the peroxidase activity of each fraction was further measured. 0.2% (w / v) thymosal (Sigma) in each fraction to a final concentration of 0.002% and 10% (w / v) bovine serum albumin to a final concentration of 0.1%. Each was added to and stored at 4 ° C. The concentration of peroxidase-labeled Fab ′ was calculated from peroxidase activity or absorbance at 403 nm.

これらの操作を繰り返し、０．７８ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＲＰ標識化Ｎｏ．１ Ｆａｂ´抗体８．６ｍｌを得た。   These operations were repeated until HRP labeling No. 7 having a concentration of 0.78 mg / ml was obtained. 8.6 ml of 1 Fab ′ antibody was obtained.

３）ＡＮＧＰＴＬ３定量系の作製
参考例１で培養上清より得られた精製ＭＡｂ４５Ｂ１を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈し、これを１００μｌずつ９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート(マキシソープ；ヌンク社製)の各ウェルに分注し、４℃で一晩保温して抗体をプレートのウェル底面に吸着させた。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩保温した。次に０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを２回洗浄し、これに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで段階希釈した精製ＡＮＧＰＴＬ３を１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩保温した。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを７回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ標識化Ｎｏ．１ Ｆａｂ´抗体を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを９回洗浄し、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質液（バイオラッド社 ＴＭＢパーオキシダーゼキット）を１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で３０分間保温した後、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウェルずつ分注し、ペルオキシダーゼ反応を停止させてから、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸収を測定した。 3) Preparation of ANGPTL3 quantification system Purified MAb45B1 obtained from the culture supernatant in Reference Example 1 was diluted with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) to a concentration of 2 μg / ml, and 100 μl each of 96 was diluted. The wells were dispensed into each well of an ELISA plate (Maxisorp; manufactured by NUNK) and incubated overnight at 4 ° C. to allow the antibody to be adsorbed to the bottom of the well of the plate. Each well was washed 3 times with PBS, and PBS containing 0.1% (w / v) BSA was added at 200 μl / well and incubated at 4 ° C. overnight. Each well is then washed twice with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, which contains 1% (w / v) BSA and 0.05% (v / v) Tween 20. Purified ANGPTL3 serially diluted with PBS was dispensed at 100 μl / well and incubated at 4 ° C. overnight. Each well was washed 7 times with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, and 0.5 μg with PBS containing 1% (w / v) BSA and 0.05% (v / v) Tween 20 HRP labeled no. 1 Fab ′ antibody was dispensed at 100 μl / well and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Each well was washed 9 times with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, TMB peroxidase substrate solution (BioRad TMB peroxidase kit) was added at 100 μl / well, and incubated at room temperature for 30 minutes. After that, 1N sulfuric acid was dispensed at 100 μl / well to stop the peroxidase reaction, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (Bio-Rad).

その結果、精製ＡＮＧＰＴＬ３濃度と測定結果が正比例したことから、このＥＬＩＳＡ系によりＡＮＧＰＴＬ３を直線性良く定量可能であることが判明した（図１）。   As a result, since the concentration of purified ANGPTL3 and the measurement result were directly proportional, it was found that ANGPTL3 can be quantified with high linearity by this ELISA system (FIG. 1).

参考例５ ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓの精製
１）ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ発現プラスミドの構築
ANGPTL3のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のＮ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグが挿入され、かつＮ末端から２０８番目以降のアミノ酸配列を欠失したポリペプチド（「ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ」という。）（配列表の配列番号８）は、以下の方法に従って調製した。 Reference Example 5 Purification of KhAP5 CC / His 1) Construction of KhAP5 CC / His expression plasmid
A histidine tag was inserted immediately after the codon encoding the 20th amino acid residue (aspartic acid) from the N-terminal in the amino acid sequence containing the ANGPTL3 signal peptide, and the 208th and subsequent amino acid sequences from the N-terminal were deleted. A polypeptide (referred to as “KhAP5 CC / His”) (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) was prepared according to the following method.

ｉ）コザック配列の挿入
ＡＮＧＰＴＬ３のｃＤＮＡに、コザックのコンセンサス配列が付加されたｃＤＮＡクローンを得るため、下記のヌクレオチド配列：
5'- gccaccatggtcacaattaagctccttctttttattg -3'（配列表の配列番号９）
および、制限酵素ＸｈｏＩの特異的認識配列が付加された下記のヌクレオチド配列：
5'- tctagagcctcgttcattcaaagctttctgaatctg -3'（配列表の配列番号１０）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。 i) Insertion of Kozak sequence In order to obtain a cDNA clone in which the Kozak consensus sequence was added to the ANGPTL3 cDNA, the following nucleotide sequence:
5'- gccaccatggtcacaattaagctccttctttttattg-3 '(SEQ ID NO: 9 in the sequence listing)
And the following nucleotide sequence to which a specific recognition sequence for the restriction enzyme XhoI has been added:
5'-tctagagcctcgttcattcaaagctttctgaatctg-3 '(SEQ ID NO: 10 in the sequence listing)
An oligonucleotide primer consisting of

次に、参考例１に記載の方法で得られた組換えファージミドｐＴｒｉｐ／ｈ５５−１ 約０．４μｇ／ｍｌを鋳型とし、上記プライマー（それぞれ０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記サンプルを９４℃で３分間加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の温度サイクル３０回、最後に６８℃で２分間保温の条件で行なった。   Next, about 0.4 μg / ml of recombinant phagemid pTrip / h55-1 obtained by the method described in Reference Example 1 was used as a template, the above primers (each 0.4 mM), Tbr EXT DNA polymerase (manufactured by Finzyme) PCR was carried out in the presence of 1 × PCR reaction buffer (1/10 volume of 10 × buffer attached to DNA polymerase), 2 mM magnesium chloride, and 0.4 mM each of dNTPs. PCR was performed by heating the above sample at 94 ° C. for 3 minutes, followed by 30 temperature cycles at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute, and finally at 68 ° C. for 2 minutes. .

ＰＣＲの結果得られた増幅断片（約１．４ｋｂｐ）を、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）に添付されたプラスミドベクターｐＣＲ２．１へ挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローン（ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５）を単離した。ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００、アプライドバイオシステムズ社製）で挿入断片の配列を解析して、ＰＣＲの際に該挿入断片内に変異が生じていないことを確認した。   The amplified fragment (about 1.4 kbp) obtained as a result of PCR was inserted into the plasmid vector pCR2.1 attached to the TA cloning kit (Invitrogen), and a plasmid clone (pCR / KhAP5) containing the inserted fragment was simply Released. The sequence of the inserted fragment was analyzed with a DNA sequencer (ABI PRISM 3700, manufactured by Applied Biosystems), and it was confirmed that no mutation occurred in the inserted fragment during PCR.

次に、ｐＣＲ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、生成した断片のうち、ヒト・ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｃＤＮＡを含む断片を、予め制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した哺乳動物細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに挿入することにより、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を得た。   Next, pCR / KhAP5 was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and among the generated fragments, a fragment containing cDNA encoding human ANGPTL3 was previously digested with restriction enzyme EcoRI and XbaI, a mammalian cell expression vector pME18S. To obtain a recombinant plasmid pME18S / KhAP5.

ｉｉ）ヒスチジンタグの挿入
ＡＮＧＰＴＬ３の前駆体のアミノ酸配列のアミノ末端から２０番目（成熟体のアミノ酸配列の4番目）に相当するアミノ酸（アスパラギン酸）のカルボキシル末端側に、ヒスチジンタグ（配列表の配列番号８のアミノ酸番号２２乃至２７に示されるアミノ酸配列）が挿入されるように、組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を改変した。 ii) Insertion of histidine tag A histidine tag (sequence in the sequence listing) is placed on the carboxyl terminal side of the amino acid (aspartic acid) corresponding to the 20th amino acid from the amino terminus of the amino acid sequence of the precursor of ANGPTL3 (the 4th in the mature amino acid sequence). The recombinant plasmid pME18S / KhAP5 was modified so that the amino acid sequence shown in amino acid numbers 22 to 27 of number 8) was inserted.

まず、一部が相補的な、下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
5'- gatccgcatcatcaccatcaccat -3'（配列表の配列番号１１）及び
5'- gatcatggtgatggtgatgatgcg -3'（配列表の配列番号１２）
を合成し、さらに合成ＤＮＡ末端リン酸化試薬フォスファリンク（アプライドバイオシステム社製）を用いて５’末端をリン酸化した。これらをアニーリングさせたものを、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５を制限酵素ＢｃｌＩで完全に消化して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。その結果として、上記のアニーリングさせたオリゴヌクレオチドが３単位連結したＤＮＡが、ＢｃｌＩ切断部位に挿入されたプラスミドクローンが得られた。次に、このクローンをＢｃｌＩで消化したものに、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に消化して得られる約１８０ｂｐの断片を挿入することにより、プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６を得た。 First, a partially complementary oligonucleotide consisting of the following nucleotide sequence:
5'-gatccgcatcatcaccatcaccat-3 '(SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) and
5'-gatcatggtgatggtgatgatgcg-3 '(SEQ ID NO: 12 in the sequence listing)
Was further phosphorylated using the synthetic DNA terminal phosphorylation reagent Phosphorlink (manufactured by Applied Biosystems). These annealed products were inserted into a fragment of about 4.2 kb obtained by completely digesting pME18S / KhAP5 with the restriction enzyme BclI. As a result, a plasmid clone was obtained in which a DNA comprising 3 units of the above-mentioned annealed oligonucleotide was linked to the BclI cleavage site. Next, a plasmid pME18S / KhAP5 / His + 16 was obtained by inserting an approximately 180 bp fragment obtained by completely digesting pME18S / KhAP5 with BclI into the digested clone with BclI.

プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６には、ヒスチジンタグをコードする配列が３単位含まれており、その中の３’末端側の２単位は、目的とは逆の方向に連結された余分な配列である。この配列を省いた断片をＰＣＲにより増幅するために、センス／アンチセンス兼用プライマーとして、以下のヌクレオチド配列：
5'-gaattgatcagcatcatcaccatcaccacgatc-3'（配列表の配列番号１３）
からなるオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。次いで、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓ＋１６（０．４μｇ／ｍｌ）を鋳型とし、上記プライマー（０．４ｍＭ）、Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社製）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０分の１量）、２ｍＭの塩化マグネシウム、各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、まず９４℃で２分加熱した後に、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温するという条件で行なった。 The plasmid pME18S / KhAP5 / His + 16 contains 3 units of a sequence encoding a histidine tag, of which 2 units on the 3 ′ end side are extra sequences linked in the opposite direction to the intended purpose. . In order to amplify the fragment from which this sequence was omitted by PCR, the following nucleotide sequence was used as a sense / antisense primer:
5'-gaattgatcagcatcatcaccatcaccacgatc-3 '(SEQ ID NO: 13 in the sequence listing)
An oligonucleotide primer consisting of Next, using pME18S / KhAP5 / His + 16 (0.4 μg / ml) as a template, the above primer (0.4 mM), Tbr EXT DNA polymerase (manufactured by Finzyme), 1 × PCR reaction buffer (10 × attached to DNA polymerase) PCR was performed in the presence of 2 mM magnesium chloride and 0.4 mM each of dNTPs. In PCR, after heating at 94 ° C. for 2 minutes, the temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds is repeated 30 times, and finally the temperature is maintained at 72 ° C. for 7 minutes. I did it.

ＰＣＲの結果得られた増幅断片（２６８ｂｐ）をＢｃｌＩで消化した後、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５をＢｃｌＩで完全に切断して得られた約４．２ｋｂの断片に挿入した。以上の操作により、ｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５に挿入されているｃＤＮＡ配列中に存在する２ヶ所のＢｃｌＩ切断部位のうち、上流側の切断部位に、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列が挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを得た。   The amplified fragment (268 bp) obtained as a result of PCR was digested with BclI, and then pME18S / KhAP5 was completely digested with BclI and inserted into a fragment of about 4.2 kb. As a result of the above operations, a combination comprising a DNA in which a nucleotide sequence encoding a histidine tag is inserted into the upstream cleavage site among the two BclI cleavage sites present in the cDNA sequence inserted into pME18S / KhAP5. The replacement plasmid pME18S / KhAP5 / His was obtained.

プラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５／Ｈｉｓを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化した後に、ＤＮＡリガーゼ反応を行って再び両端を連結することにより、ＡＮＧＰＴＬ３のシグナルペプチドを含むアミノ酸配列中のアミノ末端から２０７番目のアミノ酸残基（セリン）をコードするコドン（atc）の後に終止コドン（tag）が挿入され、またアミノ末端から２０番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸）をコードするコドンの直後にヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列が挿入されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓを構築した。   After digesting the plasmid pME18S / KhAP5 / His with the restriction enzyme SpeI, smoothing the cut ends with T4 DNA polymerase, the DNA ligase reaction was performed and the both ends were ligated again, whereby the amino acid sequence containing the signal peptide of ANGPTL3 A stop codon (tag) is inserted after the codon (atc) encoding the 207th amino acid residue (serine) from the amino terminus, and immediately after the codon encoding the 20th amino acid residue (aspartic acid) from the amino terminus. A recombinant plasmid pME18S / KhAP5 CC / His containing a DNA in which a nucleotide sequence encoding a histidine tag was inserted was constructed.

２）ＣＯＳ−１細胞での発現
直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０6細胞）を懸濁した１０％ ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を除去してから、トランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００ １８０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液（いずれもギブコ社製） ３ｍｌとを混濁したもの）に３６μｇのｐＭＥ１８Ｓ／ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓを加えて混ぜたものをＣＯＳ−１細胞に加えることにより、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以上の操作をシャーレ１３０枚分のＣＯＳ−１細胞に対して実施し、総計約４．４Ｌの培養上清を集めた。この培養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトルトップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過して、ろ液を回収した。 2) Expression in COS-1 cells 10% fetal calf serum (hereinafter referred to as “FCS”) in which COS-1 cells (0.5 × 10 6 cells) are suspended in a petri dish for tissue culture (manufactured by Corning) having a diameter of 150 mm. 30 ml of Dulbecco's modified Eagle's medium (hereinafter referred to as “DMEM”, manufactured by Gibco) containing Gibco) was added and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas for 3 days. Then, after removing the medium, 36 μg of pME18S / KhAP5 CC / His was added to transfection reagent (Lipofectamine 2000 180 μl and OPTIMEM-I solution (both manufactured by Gibco) 3 ml) and mixed. Was added to the COS-1 cells. After transfection, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. under 5% carbon dioxide for 3 days. The above operation was performed on 130 petri dishes of COS-1 cells, and a total of about 4.4 L of culture supernatant was collected. The culture supernatant was subjected to suction filtration using a 0.22 μm cellulose acetate bottle top filter (Corning), and the filtrate was collected.

３）発現量、濃度の確認
上記２）で回収されたろ液の一部と、精製済のＡＮＧＰＴＬ３（国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報）についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウェット法で転写した（０．２Ａ、９０分、４℃）。このニトロセルロース膜を、５％ スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％ ツイーン２０溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッキングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次抗体には国際特許出願国際公開番号ＷＯ０１／４２４９９号公報に記載の５５−Ｎ１抗体を、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。５５−Ｎ１抗体が特異的に結合したバンドの検出には、ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上記３）で得られたろ液中には約１．０〜１．５ｍｇ／リットル（全ろ液中に４．４〜６．６ｍｇ）のＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓが含まれていることが明らかになった。 3) Confirmation of expression level and concentration SDS-PAGE is performed on a part of the filtrate collected in the above 2) and purified ANGPTL3 (International Patent Application International Publication No. WO01 / 42499), and the protein in the gel Was transferred to a nitrocellulose membrane (manufactured by Bio-Rad) by a wet method (0.2 A, 90 minutes, 4 ° C.). This nitrocellulose membrane was immersed in a PBS-0.05% Tween 20 solution (hereinafter referred to as “PBS-T”) containing 5% skim milk (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) for blocking overnight. Next, the nitrocellulose membrane was washed with PBS-T, and then Western blotting was performed. As the primary antibody, 55-N1 antibody described in International Patent Application Publication No. WO01 / 42499 was used, and as the secondary antibody, horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit polyclonal IgG antibody (Amersham) was used. An ECL reagent (manufactured by Amersham) was used for detection of a band specifically bound by 55-N1 antibody. As a result, the filtrate obtained in 3) above contained about 1.0 to 1.5 mg / liter (4.4 to 6.6 mg in the total filtrate) of KhAP5 CC / His. It was revealed.

４）ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓの精製
上記３）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌとなるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限外ろ過装置中で２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１％ アジ化ナトリウムおよび０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。 4) Purification of KhAP5 CC / His The total amount of the filtrate obtained in 3) above was 440 ml using an ultrafiltration device (TIFF lab scale and 30 KDa pore size ultrafiltration membrane (both manufactured by Millipore)). Concentrated to the end. Further, the obtained sample was subjected to a buffer containing 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.1% sodium azide and 0.05% protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma) in an ultrafiltration apparatus ( pH 7.4) By continuing ultrafiltration while gradually adding 4 liters, a sample in which the solvent was replaced with the buffer solution was obtained (liquid amount 600 ml).

一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング ５ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル ５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させた。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。   On the other hand, nickel ions were bound to the support by flowing 5 ml of 0.1 M nickel sulfate at a flow rate of about 5 ml / min through a chelating column (HiTrap chelating 5 ml column, manufactured by Amersham). After washing this column with flowing ultrapure water, it was attached to an HPLC liquid feeding system (manufactured by Amersham), and the sample was subjected to affinity purification under the conditions described below.

溶媒：
Ａ液： ２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％ アジ化ナトリウム、０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
Ｂ液： ２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ イミダゾール（ｐＨ７．４）、０．１％ アジ化ナトリウム、０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
流速： ５ｍｌ／分
精製手順： 試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液 ８０％、Ｂ液 ２０％の緩衝液（０．１Ｍ イミダゾール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去した。その後、Ｂ液 ５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフィニティー精製用試料とした。 solvent:
Solution A: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride (pH 7.4), 0.1% sodium azide, 0.05% protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma)
B liquid: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.5 M imidazole (pH 7.4), 0.1% sodium azide, 0.05% protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma)
Flow rate: 5 ml / min Purification procedure: After flowing 600 ml of the sample through the column, 50 ml of buffer solution A (80%) and solution B (20%) (corresponding to a 0.1M imidazole concentration) was passed to wash away non-adsorbed substances. Thereafter, 50 ml of solution B was passed through the column to elute the polypeptide having a histidine tag, and the eluate was collected. 200 ml of solution A was added to this eluate to prepare a solution with an imidazole concentration of 0.1 M, which was used as the second sample for affinity purification.

小スケールのキレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング １ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル ５ｍｌを約１ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラムをＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１Ｍ イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去した。その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍ イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。   By flowing 5 ml of 0.1 M nickel sulfate at a flow rate of about 1 ml / min through a small-scale chelating column (HiTrap chelating 1 ml column, manufactured by Amersham), nickel ions were bound to the support, and then ultrapure water was added. After flushing and washing, the column was attached to the HPLC delivery system, the sample was run, and the column was removed from the HPLC. Subsequently, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.1 M imidazole, and a pH 7.4 buffer solution were manually passed through a 1 ml column at a flow rate of 1 ml / min to wash away non-adsorbed substances. Thereafter, a buffer solution of 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.3 M imidazole, pH 7.4 was similarly flowed at a flow rate of 1 ml / min, and the eluate was collected in 5 ml fractions (5 ml in total). .

回収した溶出液をそれぞれ透析チューブ（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳは、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、ＬＰＬ活性評価の際の陰性対照試料とした。   Each recovered eluate was put in a dialysis tube (manufactured by Gibco) and dialyzed against 500 mL of PBS (manufactured by Gibco). PBS, which is the dialysis membrane solution, was changed three times. A part of the final dialysis membrane was collected and used as a negative control sample for the LPL activity evaluation.

回収した試料中のタンパク質濃度を、プロテインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を使用）やＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で見積もった結果、計１．８ｍｇのＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓが得られたことが判明した。そして、下記のＬＰＬ活性評価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第２および第３の分画をまとめたものを用いた。   As a result of estimating the protein concentration in the collected sample by protein assay (using DC protein assay kit (manufactured by Bio-Rad)) or SDS-PAGE, a total of 1.8 mg of KhAP5 CC / His was obtained. found. For the following LPL activity evaluation, a summary of the second and third fractions obtained by the second affinity purification was used.

参考例６ ＡＮＧＰＴＬ４の精製
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるヒトANGPTL4タンパク質のアミノ酸番号26乃至143のアミノ酸配列のN末およびC末にプラスミドベクターpAPtag-5（N末側に免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドを、C末側にヒスチジンタグをコードする配列を含む。ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ社製）由来のアミノ配列を含むタンパク質（以下、「ANGPTL4-CC」という。）を以下に記載する方法に従って調製した。なおヒスチジンタグのアミノ酸配列は配列表の配列番号１５のアミノ酸番号180乃至185のアミノ酸配列に相当する。 Reference Example 6 Purification of ANGPTL4 Plasmid vector pAPtag-5 (an immunoglobulin on the N-terminal side) at the N-terminus and C-terminus of the amino acid sequence of amino acid numbers 26 to 143 of the human ANGPTL4 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing A protein (hereinafter referred to as “ANGPTL4-CC”) containing an amino sequence derived from a κ chain signal peptide containing a sequence encoding a histidine tag on the C-terminal side (manufactured by GeneHunter) was prepared according to the method described below. . The amino acid sequence of the histidine tag corresponds to the amino acid sequence of amino acid numbers 180 to 185 of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.

また、ANGPTL4-CCはシグナル配列を有しており、シグナル配列予想プログラム
SignalP ver2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）を用いた場合では、配列番号１５のアミノ酸番号20番と21番の間で切断されることが予測されている。 In addition, ANGPTL4-CC has a signal sequence.
When SignalP ver2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/) is used, it is predicted to be cleaved between amino acid numbers 20 and 21 of SEQ ID NO: 15. Has been.

ｉ）ＤＮＡの調製
まず、ＰＣＲ用プライマーとして、下記のヌクレオチド配列：
5'- cccaagcttttggacccgtgcagtccaag-3'（ANGPTL4-CC用センスプライマー：配列表の配列番号１６）；および
5'- ccgctcgagctggctttgcagatgctg-3'（ANGPTL4-CC用アンチセンスプライマー：配列表の配列番号１７）を合成した。
次に、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入したｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ（ｃｌｏｎｅ ４１４９０３９）を鋳型とし、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ０．２μＭ）、Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｔｂｒ ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×緩衝液を１０倍希釈）、２ｍＭの塩化マグネシウムおよび各０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、上記サンプルを９４℃で３分加熱した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で７分間の条件で行なった。 i) Preparation of DNA First, as a primer for PCR, the following nucleotide sequence:
5'-cccaagcttttggacccgtgcagtccaag-3 '(sense primer for ANGPTL4-CC: SEQ ID NO: 16 of the Sequence Listing); and
5′-ccgctcgagctggctttgcagatgctg-3 ′ (Ansense primer for ANGPTL4-CC: SEQ ID NO: 17 in the sequence listing) was synthesized.
Next, I.I. M.M. A. G. Using cDNA clone (clone 4149039) purchased from E Consortium as a template, sense primer and antisense primer (each 0.2 μM), Tbr EXT DNA polymerase, 1 × PCR buffer (10 × buffer attached to Tbr EXT DNA polymerase) PCR was carried out in the presence of 2 mM magnesium chloride and 0.4 mM each of dNTPs. PCR was performed by heating the sample at 94 ° C. for 3 minutes, repeating 30 temperature cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds, and finally at 72 ° C. for 7 minutes. Performed under conditions.

ＰＣＲで増幅した約３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化した。プラスミドベクターpAPtag-5をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）社製）を用いて切断末端の脱リン酸化処理した後、5.1kbのDNA断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入し、挿入断片を含むプラスミドクローンを単離した。このプラスミドクローンをpAPtag-5-ANGPTL4-CCと命名した。   An approximately 370 bp DNA fragment amplified by PCR was recovered and digested with HindIII and XhoI. The plasmid vector pAPtag-5 was digested with HindIII and XhoI and subjected to dephosphorylation of the cleaved end using bovine small intestine alkaline phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.), and then a 5.1 kb DNA fragment was recovered. A PCR amplified DNA fragment digested with XhoI was inserted, and a plasmid clone containing the inserted fragment was isolated. This plasmid clone was named pAPtag-5-ANGPTL4-CC.

ｉｉ）ＣＯＳ−１細胞での発現
直径１５０ｍｍ組織培養用シャーレ（コーニング社製）に、ＣＯＳ−１細胞（０．５×１０6細胞）を懸濁した１０％ ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。ギブコ社製）および100 units/mlペニシリン-100 μg/mlストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という。ギブコ社製）３０ｍｌを入れて、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間培養した。その後、培地を無血清の100 units/mlペニシリン-100 ug/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ30mlに交換した。ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションするため、Ａ液（リポフェクトアミン２０００ ６０μｌとＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ溶液（いずれもギブコ社製） ２ｍｌとを混濁したもの）とＢ液（24μｇのpAPtag-5-ANGPTL4-CCと2mlの無血清の100 units/mlペニシリンー100 μg/mlストレプトマイシンを含むＤＭＥＭとを混合したもの）を作製した。A液とＢ液を混濁し、20分間室温で静置した後、シャーレに加えることにより、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、３７℃、５％炭酸ガス下で３日間静置した。以上の操作をシャーレ６０枚分のＣＯＳ−１細胞に対して実施し、総計約２Ｌの培養上清を集めた。この培養上清を、０．２２μｍセルロースアセテート製ボトルトップフィルター（コーニング社製）を用いて吸引ろ過して、ろ液を回収した。 ii) Expression in COS-1 cells 10% fetal calf serum (hereinafter referred to as “FCS”) in which COS-1 cells (0.5 × 10 6 cells) are suspended in a petri dish for tissue culture (manufactured by Corning) having a diameter of 150 mm. Gibco) and 100 units / ml penicillin-100 μg / ml Dulbecco's modified Eagle's medium (hereinafter referred to as “DMEM”, Gibco) containing 30 ml of streptomycin was added, and the mixture was added at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas. Cultured for days. Thereafter, the medium was replaced with 30 ml of DMEM containing 100 units / ml penicillin-100 ug / ml streptomycin without serum. In order to transfect COS-1 cells, solution A (60 μl of Lipofectamine 2000 and OPTIMEM-I solution (both from Gibco) 2 ml) and solution B (24 μg of pAPtag-5-ANGPTL4-CC And 2 ml of serum-free 100 units / ml penicillin—100 μg / ml DMEM containing streptomycin). Solution A and solution B were turbid, allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then added to a petri dish for transfection. After transfection, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. under 5% carbon dioxide for 3 days. The above operation was performed on COS-1 cells for 60 petri dishes, and a total of about 2 L of culture supernatant was collected. The culture supernatant was subjected to suction filtration using a 0.22 μm cellulose acetate bottle top filter (Corning), and the filtrate was collected.

ｉｉｉ）発現量、濃度の確認
上記ｉｉ）で回収されたろ液の一部と、濃度推定のスタンダードとしてヒスチジンタグ付きアンジオポエチン２タンパク質（Genzyme/Techne社製）を、マルチゲル4/20（第一化学薬品社）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にウェット法で転写した（０．２Ａ、2時間、４℃）。このニトロセルロース膜を、５％ スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含むＰＢＳ−０．０５％ ツイーン２０溶液（以下「ＰＢＳ−Ｔ」という）に一晩浸してブロッキングを行った。次いで、ニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ウエスタンブロットを行った。一次抗体には、抗ヒスチジンタグ抗体（アマシャム社製）を、二次抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を使用した。抗ヒスチジンタグ抗体が特異的に結合したバンドの検出には、ＥＣＬ試薬（アマシャム社製）を用いた。その結果、上記ii）で得られたろ液中には約１ｍｇ／Ｌ（全ろ液中に約２ｍｇ）のANGPTL4-CCが含まれていることが明らかになった。 iii) Confirmation of expression level and concentration A part of the filtrate collected in the above ii) and angiopoietin 2 protein with histidine tag (Genzyme / Techne) as a standard for concentration estimation, Multigel 4/20 (Daiichi Kagaku) SDS-PAGE was performed, and the protein in the gel was transferred onto a nitrocellulose membrane (Bio-Rad) by a wet method (0.2 A, 2 hours, 4 ° C.). This nitrocellulose membrane was immersed in a PBS-0.05% Tween 20 solution (hereinafter referred to as “PBS-T”) containing 5% skim milk (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) for blocking overnight. Next, the nitrocellulose membrane was washed with PBS-T, and then Western blotting was performed. An anti-histidine tag antibody (Amersham) was used as the primary antibody, and a horseradish peroxidase-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody (Amersham) was used as the secondary antibody. An ECL reagent (manufactured by Amersham) was used for detection of a band specifically bound to the anti-histidine tag antibody. As a result, it was revealed that the filtrate obtained in ii) contained about 1 mg / L of ANGPTL4-CC (about 2 mg in the total filtrate).

iv）ANGPTL4-CCの精製
上記ｉｉ）で得られたろ液の全量について、限外ろ過装置（ＴＩＦＦラボスケールおよび３０ＫＤａ孔径の限外ろ過膜（いずれもミリポア社製））を用いて、４４０ｍｌとなるまで限外濃縮した。さらに、得られた試料に、限外ろ過装置中で２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１％ アジ化ナトリウムおよび０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む緩衝液（ｐＨ７．４）４リットルを徐々に加えながら限外ろ過を続行することにより、溶媒が該緩衝液に置換された試料を得た（液量６００ｍｌ）。 iv) Purification of ANGPTL4-CC The total amount of the filtrate obtained in ii) above is 440 ml using an ultrafiltration device (TIFF lab scale and 30 KDa pore size ultrafiltration membrane (both manufactured by Millipore)). Concentrated to ultra Further, the obtained sample was subjected to a buffer containing 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.1% sodium azide and 0.05% protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma) in an ultrafiltration apparatus ( pH 7.4) By continuing ultrafiltration while gradually adding 4 liters, a sample in which the solvent was replaced with the buffer solution was obtained (liquid amount 600 ml).

一方、キレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング ５ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル ５ｍｌを約５ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させた。このカラムに超純水を流して洗浄した後、ＨＰＬＣ送液システム（アマシャム社製）に装着して、以下に記載する条件で試料のアフィニティー精製を行った。   On the other hand, nickel ions were bound to the support by flowing 5 ml of 0.1 M nickel sulfate at a flow rate of about 5 ml / min through a chelating column (HiTrap chelating 5 ml column, manufactured by Amersham). After washing this column with flowing ultrapure water, it was attached to an HPLC liquid feeding system (manufactured by Amersham), and the sample was subjected to affinity purification under the conditions described below.

溶媒：
Ａ液： ２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％ アジ化ナトリウム、０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
Ｂ液： ２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．５Ｍ イミダゾール（ｐＨ７．４）、０．１％ アジ化ナトリウム、０．０５％ プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）
流速： ５ｍｌ／分
精製手順： 試料６００ｍｌをカラムに流した後、Ａ液 ８０％、Ｂ液 ２０％の緩衝液（０．１Ｍ イミダゾール濃度に相当）５０ｍｌを流して非吸着物を洗浄除去した。その後、Ｂ液 ５０ｍｌをカラムに流し、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液にＡ液２００ｍｌを加えて、イミダゾール濃度０．１Ｍの溶液としたものを、第２回のアフィニティー精製用試料とした。 solvent:
Solution A: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride (pH 7.4), 0.1% sodium azide, 0.05% protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma)
B liquid: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.5 M imidazole (pH 7.4), 0.1% sodium azide, 0.05% protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma)
Flow rate: 5 ml / min Purification procedure: After flowing 600 ml of the sample through the column, 50 ml of buffer solution A (80%) and solution B (20%) (corresponding to a 0.1M imidazole concentration) was passed to wash away non-adsorbed substances. Thereafter, 50 ml of solution B was passed through the column to elute the polypeptide having a histidine tag, and the eluate was collected. 200 ml of solution A was added to this eluate to prepare a solution with an imidazole concentration of 0.1 M, which was used as the second sample for affinity purification.

小スケールのキレーティングカラム（ＨｉＴｒａｐキレーティング １ｍｌカラム。アマシャム社製）に０．１Ｍの硫酸ニッケル ５ｍｌを約１ｍｌ／分の流速で流すことにより、担体にニッケルイオンを結合させ、次いで超純水を流して洗浄した後、カラムをＨＰＬＣ送液システムに装着し、試料を流してから、カラムをＨＰＬＣから取り外した。次いで、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１Ｍ イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌカラムに手動で流して、非吸着物を洗浄除去した。その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍ イミダゾール、ｐＨ７．４の緩衝液を同様に１ｍｌ／分の流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ、５分画（計５ｍｌ）回収した。   By flowing 5 ml of 0.1 M nickel sulfate at a flow rate of about 1 ml / min through a small-scale chelating column (HiTrap chelating 1 ml column, manufactured by Amersham), nickel ions were bound to the support, and then ultrapure water was added. After flushing and washing, the column was attached to the HPLC delivery system, the sample was run, and the column was removed from the HPLC. Subsequently, 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.1 M imidazole, and a pH 7.4 buffer solution were manually passed through a 1 ml column at a flow rate of 1 ml / min to wash away non-adsorbed substances. Thereafter, a buffer solution of 20 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, 0.3 M imidazole, pH 7.4 was similarly flowed at a flow rate of 1 ml / min, and the eluate was collected in 5 ml fractions (5 ml in total). .

回収した各分画の溶出液のうち、10 μlを用いて、SDS-PAGEを実施した。その結果、ANGPTL4-CCが２、３番目の分画に溶出されている事を確認した。各分画の溶出液をそれぞれ透析チューブ（ギブコ社製）に入れて、５００ｍＬのＰＢＳ（ギブコ社製）に対して透析を行った。透析膜外液であるＰＢＳは、３回交換した。最後の透析膜外液を一部採取して、ＥＬの活性評価の際の陰性対照試料とした。   SDS-PAGE was performed using 10 μl of the collected eluate of each fraction. As a result, it was confirmed that ANGPTL4-CC was eluted in the second and third fractions. The eluate of each fraction was placed in a dialysis tube (Gibco) and dialyzed against 500 mL of PBS (Gibco). PBS, which is the dialysis membrane solution, was changed three times. A part of the final dialysis membrane was collected and used as a negative control sample for the evaluation of EL activity.

回収した試料中のタンパク質濃度を、プロテインアッセイ（ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を使用）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロッティング等で見積もった結果、計0.7ｍｇのANGPTL4-CCが得られたことが判明した。そして、下記のＥＬの活性評価には、第２回のアフィニティー精製により得られた第２および第３の分画をまとめたものを用いた。   The protein concentration in the collected sample was estimated by protein assay (using DC protein assay kit (Bio-Rad)), SDS-PAGE, Western blotting, etc. As a result, 0.7 mg of ANGPTL4-CC was obtained in total. It has been found. Then, the following EL activity evaluation was performed using a summary of the second and third fractions obtained by the second affinity purification.

参考例７ 組換え体Endothelial Lipaseの調製
文献（The Journal of Biological Chemistry 274, 1999, 14170-14175）を参照し、エンドセリアルリパーゼ（Eendothelial Lipase（以下、「EL」という。））のC末端にミック・ヒスチジン（以下、Myc-His）タグが融合した組換え体ELを調製した。なお、本発明はMyc-Hisタグが融合しない該タンパク質によっても同様にもたらされる。 Reference Example 7 Preparation of Recombinant Endothelial Lipase Referring to the literature (The Journal of Biological Chemistry 274 , 1999, 14170-14175), Mic was added to the C-terminus of endothelial lipase (hereinafter referred to as “EL”). A recombinant EL fused with a histidine (hereinafter referred to as Myc-His) tag was prepared. The present invention is similarly brought about by the protein to which the Myc-His tag is not fused.

１）EL遺伝子のクローニング
以下の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：
5'-aagctagcatgagcaactccgttcctctgctctgt-3'（hEL-ms1：配列表の配列番号５）;および
5'- ttaagcttgggaagctccacagtgggact -3'（hEL-mas2：配列表の配列番号６）
を合成した。 1) Cloning of EL gene The following two oligonucleotide primers:
5'-aagctagcatgagcaactccgttcctctgctctgt-3 '(hEL-ms1: SEQ ID NO: 5 in the sequence listing); and
5'-ttaagcttgggaagctccacagtgggact-3 '(hEL-mas2: SEQ ID NO: 6 in the sequence listing)
Was synthesized.

次いで、市販ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＬＡ ＰＣＲキット・バージョン２．１（宝酒造（株）社製）を用いたＰＣＲを行なった。すなわち、５μｌのｃＤＮＡライブラリー（Marathon-Ready human testis（クロンテック社製））と、オリゴヌクレオチドプライマー（hEL-ms1およびhEL-mas2）各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ 塩化マグネシウムを含む１×ＬＡ ＰＣＲ緩衝液、０．０５単位のＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で30秒、６5℃で30秒、７２℃で２分の温度サイクルを３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分間保温したタカラＰＣＲサーマルサイクラー ＭＰ（宝酒造（株）社製）を使用）。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動で解析した結果、目的とする1500ｂｐに近い大きさのＤＮＡ断片のバンドが観察された。このバンド内のＤＮＡ断片をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット(キアゲン社製)を用いて回収した。本DNA断片およびpcDNA3.1(-)/Myc-His(A)ベクター（動物細胞発現用ベクター、インビトロゲン社製）を制限酵素（Nhe IおよびHind III（ともに宝酒造（株）社製））で37℃、12時間処理した後、各々の反応液を１％アガロースゲル電気泳動で解析し、目的とする1500ｂｐおよび5500bpに近い大きさのＤＮＡ断片のバンドが観察された。この各々のバンド内のＤＮＡ断片をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット(キアゲン社製)を用いて回収した。これらをSolution I（宝酒造（株）社製）を使用し連結し、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’株（真核生物用ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ ｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELを抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法によりヌクレオチド配列を決定した。その結果、得られたヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１９に示されるアミノ酸配列をコードするものであった。   Subsequently, PCR using LA PCR kit version 2.1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was performed using a commercially available cDNA library as a template. That is, 5 μl of a cDNA library (Marathon-Ready human testis (Clontech)), oligonucleotide primers (hEL-ms1 and hEL-mas2) 0.4 μM each, and dATP, dGTP, dCTP, dTTP each 400 μM, 2 A 50 μl reaction solution consisting of 1 × LA PCR buffer containing 5 mM magnesium chloride and 0.05 unit of LA Taq DNA polymerase (supplied in the kit) was prepared. This reaction solution was heated at 94 ° C. for 2 minutes, and then a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 65 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes was repeated 30 times, and then Takara PCR thermal was kept at 72 ° C. for 10 minutes Cycler MP (Takara Shuzo Co., Ltd.) is used). As a result of analyzing this reaction solution by 1% agarose gel electrophoresis, a target DNA fragment band having a size close to 1500 bp was observed. The DNA fragment in this band was recovered from the gel using a QIA quick gel extraction kit (Qiagen). This DNA fragment and pcDNA3.1 (-) / Myc-His (A) vector (animal cell expression vector, manufactured by Invitrogen) with restriction enzymes (Nhe I and Hind III (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)) After treatment at 37 ° C. for 12 hours, each reaction solution was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, and target DNA fragment bands having a size close to 1500 bp and 5500 bp were observed. The DNA fragment in each band was recovered from the gel using a QIA quick gel extraction kit (Qiagen). These were ligated using Solution I (Takara Shuzo Co., Ltd.) and introduced into E. coli TOP10F 'strain (attached to eukaryotic TA cloning kit (Invitrogen)). Plasmid DNA pcDNA3.1 (−) / Myc-His-hEL was extracted from the obtained transformant, and the nucleotide sequence of the entire nucleotide sequence of the inserted cDNA was determined by the dideoxynucleotide chain termination method. As a result, the obtained nucleotide sequence encoded the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.

２）動物細胞での発現
上記で作成した発現ベクターｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELをヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３に、トランスアイティー試薬(ミラス社製)を用いて、添付のプロトコールにしたがって、トランスフェクションした。すなわち、１ウェルあたり10×１０5個のＨＥＫ２９３細胞を組織培養用ポリリジンコート６ウェルプレートに蒔いた２４時間後に、3μｇのｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELをトランスフェクションした。なお、ELが血清により阻害される（Journal of Lipid Research 43, 2002, 921-929）ことから、トランスフェクション時には血清なしで培養可能な培地であるオプティメム（インビトロジェン社製）を使用した。３７℃で3日間培養した後、培養上清にヘパリンナトリウム（ノボヘパリン注、ノバルティス社製） 20単位/mlを添加し、さらに３７℃で2時間培養した後に培養上清を回収した。本培養上清はＥＬの活性測定の酵素源としてそのまま用いることが可能であった。本培養上清は小分けにした後-80℃で保存し、必要に応じて凍結融解後に使用した。
また、ｐcDNA3.1(-)/Myc-His発現ベクター上には、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子があり、ｐcDNA3.1(-)/Myc-His−hELをトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞より、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、EL蛋白質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができた。 2) Expression in animal cells The expression vector pcDNA3.1 (-) / Myc-His-hEL prepared above was applied to human embryonic kidney cells HEK293 using Transity reagent (Mirasu) and attached protocol. Therefore, it was transfected. That is, 10 × 10 5 HEK293 cells per well were seeded on a polylysine-coated 6-well plate for tissue culture, 24 hours later, 3 μg of pcDNA3.1 (−) / Myc-His-hEL was transfected. Since EL is inhibited by serum (Journal of Lipid Research 43 , 2002, 921-929), Optimem (manufactured by Invitrogen), a medium that can be cultured without serum, was used at the time of transfection. After culturing at 37 ° C. for 3 days, 20 units / ml of heparin sodium (Novoheparin injection, Novartis) was added to the culture supernatant, and further cultured at 37 ° C. for 2 hours, and then the culture supernatant was collected. The main culture supernatant could be used as it was as an enzyme source for EL activity measurement. The main culture supernatant was aliquoted and stored at −80 ° C. and used after freezing and thawing as necessary.
In addition, there is a neo gene that functions as an antibiotic G418 resistance marker on the pcDNA3.1 (−) / Myc-His expression vector, and HEK293 cells after transfection with pcDNA3.1 (−) / Myc-His-hEL. Thus, by selecting G418-resistant colonies, transformed cells that stably produce EL protein could be obtained.

実施例１ 血漿の分析
１）ＡＮＧＰＴＬ３の定量
約１１時間絶食した日本人１００名（男性５１名、女性４９名）から得られた血漿について、ＡＮＧＰＴＬ３の濃度を参考例４で確立したＥＬＩＳＡ系により定量した。測定したヒト血漿におけるＡＮＧＰＴＬ３の濃度の平均値は４７２±１２２ｎｇ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．）であった（表１）。 Example 1 Analysis of Plasma 1) Quantification of ANGPTL3 The concentration of ANGPTL3 was determined by ELISA established in Reference Example 4 for plasma obtained from 100 Japanese (51 males and 49 females) fasted for about 11 hours. did. The average value of ANGPTL3 concentration in human plasma measured was 472 ± 122 ng / ml (SD) (Table 1).

２）ＨＤＬコレステロール、総コレステロール及びリン脂質の測定
１）で用いたのと同じヒト血漿について、ＬタイプワコーＨＤＬ−Ｃ（和光純薬工業）を用いてＨＤＬコレステロールを、ＬタイプワコーＣＨＯ・Ｈ（和光純薬工業）を用いて総コレステロールを、Ｌタイプワコーリン脂質（和光純薬工業）を用いてリン脂質を、それぞれ測定した（表１）。測定装置としては７２５０形自動分析装置（日立製作所）を用いた。 2) Measurement of HDL cholesterol, total cholesterol and phospholipid For the same human plasma used in 1), L-type Wako HDL-C (Wako Pure Chemical Industries) was used to convert HDL cholesterol into L-type Wako CHO · H ( Total cholesterol was measured using Wako Pure Chemical Industries), and phospholipids were measured using L-type Wako phospholipid (Wako Pure Chemical Industries) (Table 1). A 7250 type automatic analyzer (Hitachi, Ltd.) was used as a measuring device.

３）測定結果の解析
血漿中におけるＨＤＬコレステロール濃度、総コレステロール濃度、およびリン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との相関をThe SAS(R) System Release 6.12 (TS045) for Windowsを用いて解析した。ピアソンの相関係数(r)および相関係数１に対する検定p値で調べたところ、ＨＤＬコレステロール濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との間に有意な正相関が得られた(r=0.52,p=0.0001、表２参照)。同様にリン脂質濃度とＡＮＧＰＴＬ３濃度との間にも有意な正相関が得られた（r=0.28,p=0.0052、表２） 3) Analysis of measurement results Plasma HDL cholesterol concentration, total cholesterol concentration, and the correlation between phospholipid concentration and ANGPTL3 concentration were analyzed using The SAS® System Release 6.12 (TS045) for Windows. When examined with the Pearson correlation coefficient (r) and the test p-value for correlation coefficient 1, significant positive correlation was obtained between HDL cholesterol concentration and ANGPTL3 concentration (r = 0.52, p = 0.0001, Table 2). Similarly, a significant positive correlation was also obtained between the phospholipid concentration and the ANGPTL3 concentration (r = 0.28, p = 0.0052, Table 2).

実施例２ 放射標識基質を使用したＥＬの活性測定
放射標識基質を使用したＥＬの活性の測定法は、文献記載の方法（Nilsson-Ehle, P. and Schotz, M. C.(1976) J. Lipid Res. 17, 536-541）に従った。 Example 2 Measurement of EL Activity Using Radiolabeled Substrate The method for measuring the activity of EL using a radiolabeled substrate is the method described in the literature (Nilsson-Ehle, P. and Schotz, MC (1976) J. Lipid Res. 17, 536-541).

まず、上記参考例７記載の方法で調製した培養上清１００μｌを等量の基質溶液［0.4ｍＭ グリセロール・トリオレイン酸（シグマ社製）、4μM 1,2−ジ[1-14C]オレオイル・ホスファチジルコリン（60mCi/mmol、アマシャムファルマシア社製）、2.8 ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、28 ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、3 ％（ｖ／ｖ）グリセロール］と混合し、参考例３で精製したＡＮＧＰＴＬ３、参考例５で精製したＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ及び参考例６で精製したＡＮＧＰＴＬ４−CCの各ポリペプチドのいずれか１種類のポリペプチドを加え、３７℃で90分間保温した。その後、１．０５ｍｌの０．１Ｍ 炭酸カリウム・ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）と３．２５ｍｌのメタノール：クロロホルム：ヘキサン＝１４１：１２５：１００（ｖ／ｖ）を加えて反応を停止させ、強く撹拌した後、３０００×ｇで１0分間遠心分離した。水−メタノール層の14Cカウントを液体シンチレーションカウンターにて測定した。 First, (Sigma) Reference Example 7 an equal volume of substrate solution culture supernatant 100μl prepared by the method described [0.4 mM glycerol trioleate, 4 [mu] M 1,2-di [1- 14 C] oleoyl Phosphatidylcholine (60 mCi / mmol, Amersham Pharmacia), 2.8 mg / ml bovine serum albumin (Sigma), 28 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 3% (v / v) glycerol] Any one of the polypeptides of ANGPTL3 purified in Reference Example 3, KhAP5 CC / His purified in Reference Example 5 and ANGPTL4-CC purified in Reference Example 6 was added and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. . Thereafter, 1.05 ml of 0.1 M potassium carbonate / borate buffer (pH 10.5) and 3.25 ml of methanol: chloroform: hexane = 141: 125: 100 (v / v) were added to stop the reaction, After vigorous stirring, it was centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. The 14 C count of the water-methanol layer was measured with a liquid scintillation counter.

ＡＮＧＰＴＬ３のＥＬの活性に与える結果を表３に示した。   The results of the ANGPTL3 on the EL activity are shown in Table 3.

ＡＮＧＰＴＬ３はELの活性を用量依存的に抑制した。KhAP5 CC/HisおよびＡＮＧＰＴＬ４-ＣＣのＥＬの活性に与える結果を表４に示した。
 ANGPTL3 suppressed EL activity in a dose-dependent manner. Table 4 shows the results given to the EL activity of KhAP5 CC / His and ANGPTL4-CC.

KhAP5 CC/HisおよびＡＮＧＰＴＬ４-ＣＣはELの活性を抑制した。 KhAP5 CC / His and ANGPTL4-CC suppressed EL activity.

製剤例
本発明の医薬組成物の例として 以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを水またはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルを挙げることができる。具体的には、上記ポリペプチド０．５ｍｇを１リットルの注射用水に溶解し、無菌的にアンプルに分注、封入するか、ポリペプチドを凍結乾燥してアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈する：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。 Formulation Example As an example of the pharmaceutical composition of the present invention, a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the following (1) to (8) was dissolved in water or other pharmacologically acceptable solution. Mention may be made of ampoules of sterile solutions or suspensions. Specifically, 0.5 mg of the above polypeptide is dissolved in 1 liter of water for injection and dispensed and sealed aseptically in an ampoule, or the polypeptide is freeze-dried and filled into an ampoule. Dilute with a physically acceptable solution:
(1) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(2) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(3) One continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(4) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(5) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(6) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(7) One continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(8) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (1) to (7), and lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endocelial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity.

精製ＡＮＧＰＴＬ３と４５０ｎｍの吸光度との相関を示す図。The figure which shows the correlation with refinement | purification ANGPTL3 and the light absorbency of 450 nm.

配列番号７：ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ
配列番号８：ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ
配列番号９：コザックのコンセンサス配列を含むＰＣＲセンスプライマー
配列番号１０：コザックのコンセンサス配列を含むＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１１：ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１２：ＫｈＡＰ５ ＣＣ／Ｈｉｓ用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１３：ＫｈＡＰ ＣＣ／Ｈｉｓ＋１６
配列番号１４：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ
配列番号１５：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ
配列番号１６：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１７：ＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣ用ＰＣＲアンチセンスプライマー SEQ ID NO: 7: KhAP5 CC / His
SEQ ID NO: 8: KhAP5 CC / His
SEQ ID NO: 9: PCR sense primer containing a Kozak consensus sequence SEQ ID NO: 10: PCR antisense primer containing a Kozak consensus sequence SEQ ID NO: 11: PCR sense primer for KhAP5 CC / His SEQ ID NO: 12: PCR anti-PCR for KhAP5 CC / His Sense primer SEQ ID NO: 13: KhAP CC / His + 16
Sequence number 14: ANGPTL4-CC
SEQ ID NO: 15: ANGPTL4-CC
SEQ ID NO: 16: PCR sense primer for ANGPTL4-CC SEQ ID NO: 17: PCR antisense primer for ANGPTL4-CC

Claims (28)

以下の工程（１）乃至（２）を含む、エンドセリアルリパーゼ（Endothelial Lipase）の活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３（angiopoietin-like 3）又はアンジオポエチン関連タンパク質４（angiopoietin-like 4）、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（２）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of Endothelial Lipase, comprising the following steps (1) to (2):
(1) A step of contacting the test substance, angiopoietin-like protein 3 (angiopoietin-like 3) or angiopoietin-like protein 4 (angiopoietin-like 4), endothelial lipase, and its substrate, and measuring the activity of endothelial lipase;
(2) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase. 以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（２）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。
（３）（２）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、並びにその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（４）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance causing a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (4):
(1) A step of contacting a test substance, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4, an endothelial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of the endothelial lipase;
(2) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase.
(3) The test substance selected in (2), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Measuring the activity of the active triacylglycerol lipase;
(4) A test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase. 以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（２）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（３）（２）で選択された被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（４）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance causing a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (4):
(1) Contact with a test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase and a substrate thereof, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measuring
(2) A test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase;
(3) A step of contacting the test substance selected in (2), an endothelial lipase, and its substrate, and measuring the activity of the endothelial lipase;
(4) A step of selecting a test substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase. 以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（２）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程；
（３）（２）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（４）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance causing a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (4):
(1) Contact with a test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase and a substrate thereof, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measuring
(2) A test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase;
(3) A step of contacting the test substance selected in (2), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, endocelial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of endocelial lipase;
(4) A step of selecting a test substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase. 以下の工程（１）乃至（３）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程；
（２）（１）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程；
（３）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (3):
(1) a step of selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase;
(2) The test substance selected in (1), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Measuring the activity of the active triacylglycerol lipase;
(3) A test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase. 以下の工程（１）乃至（３）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質を選択する工程；
（２）（１）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（３）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (3):
(1) A substance that increases the activity of lipoprotein lipase or a substance that does not change the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or hepatic triacylglycerol lipase that increases the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that does not change the activity of
(2) contacting the test substance selected in (1), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, endothelial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of endothelial lipase;
(3) A step of selecting a test substance that has caused a decrease in the activity of endothelial lipase. 以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程；
（２）エンドセリアルリパーゼの活性が低下した被験物質を選択する工程；
（３）（２）で選択された被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロール、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールの活性を測定する工程；
（４）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance causing a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (4):
(1) A step of contacting a test substance, endocerial lipase, and a substrate thereof, and measuring the activity of endocerial lipase;
(2) a step of selecting a test substance having a decreased activity of endothelial lipase;
(3) The test substance selected in (2), angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or hepatic Measuring the activity of triacylglycerol;
(4) A test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase. 以下の工程（１）乃至（４）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質と、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する工程：
（２）リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こした被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質を選択する工程。
（３）（２）で選択された被験物質とエンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（４）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance causing a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (4):
(1) A step of contacting a test substance with lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase and its substrate, and measuring the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase:
(2) A test substance that has increased the activity of lipoprotein lipase or a test substance that has not changed the activity of lipoprotein lipase, and / or a test substance or liver that has increased the activity of hepatic triacylglycerol lipase Selecting a test substance that has not changed the activity of the sex triacylglycerol lipase.
(3) A step of bringing the test substance selected in (2) into contact with the endocerial lipase and its substrate, and measuring the activity of the endocelial lipase:
(4) A step of selecting a test substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase. 以下の工程（１）乃至（２）を含む、エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こす物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定する工程：
（２）エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質であって、かつ以下の性質を有する被験物質を選択する工程；
リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させなかった被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させなかった被験物質。 A screening method for a substance that causes a decrease in the activity of endothelial lipase, comprising the following steps (1) to (2):
(1) A test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, its substrate, endothelial lipase, and its substrate are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Measuring the activity of the active triacylglycerol lipase and the activity of the endothelial lipase:
(2) a step of selecting a test substance that has reduced the activity of endothelial lipase and that has the following properties;
Test substance that caused increased activity of lipoprotein lipase or did not change the activity of lipoprotein lipase, and / or test substance that caused increased activity of hepatic triacylglycerol lipase or hepatic triacylglycerol lipase A test substance whose activity was not changed. 以下の工程（１）及び（２）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）非ヒト哺乳動物に以下の(a)乃至(h)から選択されるアミノ酸配列を含むことからなる、１種又は２種以上のポリペプチド、及び被験物質を投与する工程；
(a)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列、
(b)配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列、
(c)配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(d)配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列、
(e)配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列、
(f)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(g)配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列、
(h)上記(a)乃至(g)から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列；
（２）上記工程（１）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。 A therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of a test substance, comprising the following steps (1) and (2): How to test:
(1) A step of administering one or more polypeptides comprising a amino acid sequence selected from the following (a) to (h) and a test substance to a non-human mammal;
(a) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(b) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(c) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus,
(d) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(e) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(f) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus,
(g) one continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence,
(h) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (a) to (g), and inhibits lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endosial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity;
(2) A step of measuring the neutral fat concentration, HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration in the blood of the animal in the step (1). 以下の工程（１）乃至（３）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）非ヒト哺乳動物に以下の(a)乃至(f)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、アデノウイルスベクターを保持するアデノウイルスを感染させる工程；
(a)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(b)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(c)配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
(d)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
(e)配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(f)上記(a)乃至(f)から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２）上記工程（１）の動物に被験物質を投与する工程；
（３）上記工程（２）の動物の血中の中性脂肪濃度、並びに、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度、を測定する工程。 A therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of a test substance, comprising the following steps (1) to (3): How to test:
(1) A step of infecting a non-human mammal with an adenovirus carrying an adenovirus vector comprising the polynucleotide according to any one of (a) to (f) below:
(a) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 25 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1407 is the 3 ′ end;
(b) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 645 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(c) one continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 609 is the 3 ′ end A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(d) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide number 173 is the 5 ′ end and the nucleotide number 1393 is the 3 ′ end;
(e) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, wherein the nucleotide at nucleotide number 173 is the 5 ′ end and nucleotide number 601 is the 3 ′ end.
(f) hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide selected from (a) to (f) above under stringent conditions, and has lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endothelial A polynucleotide encoding a polypeptide having lipase inhibitory activity;
(2) A step of administering a test substance to the animal of the above step (1);
(3) A step of measuring the neutral fat concentration, HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration in the blood of the animal in the step (2). 被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。 Hyperlipidemia, low HDL blood of a test substance, characterized by contacting a test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, endothelial lipase, and its substrate, and measuring the activity of endothelial lipase A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from symptom, arteriosclerosis and hyperglycemia. 以下の（１）及び（２）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する；
（２）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する。 Test the therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, including the following (1) and (2) how to:
(1) A test substance, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4, an endothelial lipase, and a substrate thereof are contacted, and the activity of the endothelial lipase is measured;
(2) The test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measure. 以下の（１）及び（２）を含む、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法：
（１）被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定する；
（２）被験物質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定する。 Test the therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance, including the following (1) and (2) how to:
(1) Contact with a test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase and a substrate thereof, and the activity of lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase Measure
(2) Contact the test substance, endosial lipase, and its substrate, and measure the activity of endosial lipase. エンドセリアルリパーゼの活性の低下を起こした被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を測定することを、特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。 A test substance having reduced activity of endothelial lipase, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, and a substrate thereof are contacted, and lipoprotein lipase and / or liver Treatment of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia, characterized by measuring the activity of sex triacylglycerol lipase Or a method of testing the preventive effect. リポタンパク質リパーゼの活性の増加を起こす被験物質又はリポタンパク質リパーゼの活性を変化させない被験物質、及び／又は、肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性の増加を起こした被験物質又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性を変化させない被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、エンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。 Test substance that causes increased activity of lipoprotein lipase or test substance that does not change the activity of lipoprotein lipase and / or test substance that causes increased activity of hepatic triacylglycerol lipase or hepatic triacylglycerol lipase A test substance that does not change its activity, an angiopoietin-related protein 3 or an angiopoietin-related protein 4, an endothelial lipase, and a substrate thereof, and the activity of the endothelial lipase is measured. A method for testing the therapeutic or prophylactic effect of one or more diseases selected from hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia. 被験物質、アンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼ、その基質、エンドセリアルリパーゼ、及びその基質を接触させ、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性トリアシルグリセロールリパーゼの活性、及びエンドセリアルリパーゼの活性を測定することを特徴とする、被験物質の、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を試験する方法。 A test substance, angiopoietin-related protein 3 or angiopoietin-related protein 4, lipoprotein lipase and / or hepatic triacylglycerol lipase, its substrate, endothelial lipase, and its substrate are contacted, and lipoprotein lipase and / or hepatic triacyl One or two or more selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia of the test substance characterized by measuring the activity of glycerol lipase and the activity of endothelial lipase A method for testing a therapeutic or prophylactic effect of a disease. 下記の（１）及び（２）を含む、ＨＤＬコレステロール濃度及び／又はリン脂質濃度の定量方法：
（１）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３又はアンジオポエチン関連タンパク質４を定量する；
（２）（１）で定量されたアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の濃度から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の濃度を計算する。 Quantification method of HDL cholesterol concentration and / or phospholipid concentration, including the following (1) and (2):
(1) quantifying Angiopoietin-related protein 3 or Angiopoietin-related protein 4 in a sample;
(2) The concentration of HDL cholesterol and / or phospholipid in the sample is calculated from the concentration of angiopoietin-related protein 3 and / or angiopoietin-related protein 4 determined in (1). 下記の（１）及び（２）を含む、ＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量方法：
（１）試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３を定量する；
（２）（１）で得られたアンジオポエチン関連タンパク質３の定量値から試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の量を計算する。 A method for quantifying HDL cholesterol and / or phospholipid, comprising the following (1) and (2):
(1) quantifying angiopoietin-related protein 3 in a sample;
(2) The amount of HDL cholesterol and / or phospholipid in the sample is calculated from the quantitative value of the angiopoietin-related protein 3 obtained in (1). 下記の（１）及び（２）を含む、アンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の定量方法：
（１）試料中のＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質を定量する；
（２）（１）で得られたＨＤＬコレステロール及び／又はリン脂質の定量値から、試料中のアンジオポエチン関連タンパク質３及び／又はアンジオポエチン関連タンパク質４の量を計算する。 A method for quantifying Angiopoietin-related protein 3 and / or Angiopoietin-related protein 4 comprising the following (1) and (2):
(1) quantifying HDL cholesterol and / or phospholipid in a sample;
(2) From the quantitative value of HDL cholesterol and / or phospholipid obtained in (1), the amount of angiopoietin-related protein 3 and / or angiopoietin-related protein 4 in the sample is calculated. 請求項１乃至９のいずれか１項に記載されたスクリーニング方法によって高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された選択されたエンドセリアルリパーゼの活性の低下を阻害する物質。 A therapeutic or preventive effect for one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia by the screening method according to any one of claims 1 to 9. A substance that inhibits a decrease in the activity of a selected endocerial lipase that has been confirmed to have. 請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載された方法によって、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果を有することが確認された物質。 The therapeutic or preventive effect of one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia by the method according to any one of claims 10 to 17. Substances confirmed to have. 請求項２１又は２２に記載された物質を有効成分として含有する、エンドセリアルリパーゼ阻害剤。 An endothelial lipase inhibitor comprising the substance according to claim 21 or 22 as an active ingredient. 請求項２１又は２２に記載された物質を有効成分として含有する、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防効果用、医薬組成物。 A therapeutic or prophylactic effect for one or more diseases selected from hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia, comprising the substance according to claim 21 or 22 as an active ingredient. , Pharmaceutical composition. 以下の（１）乃至（５）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列においてヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号１４０７を３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した1つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６４５のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（３）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列に含まれる連続した１つの配列であって、ヌクレオチド番号２５を５’末端とし、ヌクレオチド番号４６５〜６０９のいずれか１つを３’末端とするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３を５’末端とし、ヌクレオチド番号１３９３を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（５）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１７３のヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号６０１を３’末端とするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。 It hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide selected from the following (1) to (5), and has lipoprotein lipase inhibitory activity and endocelial lipase inhibitory activity: A polynucleotide encoding a polypeptide having:
(1) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having the nucleotide number 25 as the 5 ′ end and the nucleotide number 1407 as the 3 ′ end in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing;
(2) One continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 645 is the 3 ′ end. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(3) One continuous sequence included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein nucleotide number 25 is the 5 ′ end, and any one of nucleotide numbers 465 to 609 is the 3 ′ end. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence that:
(4) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, having nucleotide number 173 as the 5 ′ end and nucleotide number 1393 as the 3 ′ end;
(5) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing, wherein the nucleotide at nucleotide number 173 is the 5 ′ end and nucleotide number 601 is the 3 ′ end. 以下の（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及びエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド。
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列。 It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the following (1) to (7), and has lipoprotein lipase inhibitory activity and endothelial lipase inhibitory activity. A polypeptide comprising an amino acid sequence encoding a polypeptide having the same.
(1) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(2) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(3) One continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(4) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(5) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(6) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(7) One continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence. 以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、エンドセリアルリパーゼ阻害剤：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。 An endothelial lipase inhibitor comprising one or more polypeptides comprising an amino acid sequence selected from the following (1) to (8):
(1) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(2) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(3) One continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(4) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(5) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(6) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(7) One continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(8) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (1) to (7), and lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endocelial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity. 以下の（１）乃至（８）から選択されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを１種又は２種以上含むことからなる、高脂血症、低HDL血症、動脈硬化及び高血糖から選択される一つ又は二つ以上の疾患の治療又は予防用医薬組成物：
（１）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から４６０に示されるアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１７から４６０に示されるアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号１７をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４７〜２０７またはアミノ酸番号１４７〜１９５のいずれか１つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４０６に示されるアミノ酸配列；
（５）配列表の配列番号４のアミノ酸番号２６から４０６に示されるアミノ酸配列；
（６）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列中の連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４３をカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれる連続した１つのアミノ酸配列であって、アミノ酸番号２６をアミノ末端とし、アミノ酸番号１４４〜１８３のいずれか一つをカルボキシル末端とするアミノ酸配列；
（８）上記（１）乃至（７）から選択されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、リポタンパク質リパーゼ阻害活性及び／又はエンドセリアルリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。 From hyperlipidemia, hypoHDLemia, arteriosclerosis and hyperglycemia comprising one or more polypeptides comprising an amino acid sequence selected from the following (1) to (8) Pharmaceutical composition for treatment or prevention of one or more selected diseases:
(1) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(2) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 17 to 460 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing;
(3) One continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein amino acid number 17 is the amino terminus, and any one of amino acid numbers 147 to 207 or amino acid numbers 147 to 195 An amino acid sequence having a carboxyl terminus;
(4) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(5) an amino acid sequence represented by amino acid numbers 26 to 406 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing;
(6) one continuous amino acid sequence in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein the amino acid number 26 is the amino terminus and the amino acid number 143 is the carboxyl terminus;
(7) One continuous amino acid sequence included in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, wherein amino acid number 26 is the amino terminus and any one of amino acid numbers 144 to 183 is the carboxy terminus Amino acid sequence;
(8) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence selected from the above (1) to (7), and lipoprotein lipase inhibitory activity and / or endocelial lipase inhibition An amino acid sequence encoding a polypeptide having activity.
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