JP2005069827A - Laser scanning type fluorescence microscope - Google Patents
Laser scanning type fluorescence microscope Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005069827A JP2005069827A JP2003299027A JP2003299027A JP2005069827A JP 2005069827 A JP2005069827 A JP 2005069827A JP 2003299027 A JP2003299027 A JP 2003299027A JP 2003299027 A JP2003299027 A JP 2003299027A JP 2005069827 A JP2005069827 A JP 2005069827A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- laser
- fluorescence microscope
- light source
- laser scanning
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
本発明は、３色以上の蛍光検出に用いるレーザ走査型蛍光顕微鏡に関する。 The present invention relates to a laser scanning fluorescence microscope used for detecting fluorescence of three or more colors.
従来、所定の遺伝子やＤＮＡの染色体上での検出方法として、ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）が知られている。この方法は、所定の蛍光体でマーキングした遺伝子やＤＮＡプローブを水銀ランプ等で励起し、発した蛍光を検出器で検出する方法である。
近年、蛍光分光画像解析は、最新の遺伝子工学等に欠かせない技術となっている。そして、ＦＩＳＨを応用した検出方法として、少なくとも３色以上の蛍光体を用いて、例えば多重遺伝子の検出を可能とする所謂Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨが知られている。
Conventionally, FISH (fluorescence in situ hybridization) is known as a method for detecting a predetermined gene or DNA on a chromosome. In this method, a gene or DNA probe marked with a predetermined phosphor is excited with a mercury lamp or the like, and the emitted fluorescence is detected with a detector.
In recent years, fluorescence spectroscopic image analysis has become an indispensable technique for the latest genetic engineering and the like. As a detection method applying FISH, so-called Multi Color FISH is known that enables detection of multiple genes, for example, using phosphors of at least three colors.
Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを用いた顕微鏡としては、例えば、次の非特許文献１に開示のものが提案されている。
従来、ＦＩＳＨは、１光子励起に基づいて行なわれていた。このため、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを行なうためには、励起波長が複数必要であり、また各蛍光のみを検出するためのフィルタ（バリアフィルタ）等も、その分だけ必要であった。
そして、非特許文献１に記載の顕微鏡では、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを行なうために、水銀ランプを光源とする通常の蛍光顕微鏡を用いるとともに、透過波長の異なる励起フィルタとバリアフィルタを多数用意し、これらのうち所望の励起フィルタとバリアフィルタを顕微鏡内においてカセットやターレットを介して順次切り替えることにより、切り替える都度、所望の励起波長で標本を励起するとともに、その励起波長で励起された蛍光を検出していた。
Conventionally, FISH has been performed based on one-photon excitation. For this reason, in order to perform Multi Color FISH, a plurality of excitation wavelengths are necessary, and a filter (barrier filter) for detecting only each fluorescence is also required.
In the microscope described in Non-Patent Document 1, in order to perform Multi Color FISH, an ordinary fluorescent microscope using a mercury lamp as a light source is used, and many excitation filters and barrier filters having different transmission wavelengths are prepared. By switching the desired excitation filter and barrier filter sequentially through the cassette and turret in the microscope, the sample was excited at the desired excitation wavelength and the fluorescence excited at the excitation wavelength was detected each time the switching was performed. .
このため、従来の蛍光顕微鏡では、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを行なうための複数波長の蛍光検出を一度の測定で行なうことができず、しかも複数波長の蛍光励起のための操作がその分、煩雑化していた。 For this reason, in the conventional fluorescence microscope, it is not possible to perform fluorescence detection of a plurality of wavelengths for performing Multi Color FISH in a single measurement, and the operation for excitation of the fluorescence of a plurality of wavelengths is complicated accordingly. .
また、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨをレーザ走査型蛍光顕微鏡の１光子（１光子）で行なうためには、励起波長の種類分のレーザ光源が必要となる。しかし、従来型の共焦点レーザ走査型顕微鏡では、一般に、ごく少数種類の励起波長しか利用できない。このため、非特許文献１に記載の従来型の共焦点レーザ走査型顕微鏡では、２色程度のＦＩＳＨであれば、２本のレーザを用いることにより対応可能であるが、例えば３色〜７色の蛍光検出をする場合には、その蛍光の数に応じた多数のレーザを用いなければならず、到底対応できなかった。 In addition, in order to perform Multi Color FISH with one photon (one photon) of a laser scanning fluorescence microscope, a laser light source corresponding to the type of excitation wavelength is required. However, a conventional confocal laser scanning microscope generally can use only a few types of excitation wavelengths. For this reason, the conventional confocal laser scanning microscope described in Non-Patent Document 1 can cope with FISH of about two colors by using two lasers, for example, three to seven colors. In the case of detecting fluorescence, a large number of lasers corresponding to the number of fluorescences must be used, which cannot be dealt with at all.
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、操作が簡単で、かつ、一度の測定で３色以上の蛍光色素を励起、検出可能なレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and provides a laser scanning fluorescence microscope that is easy to operate and can excite and detect fluorescent dyes of three colors or more by a single measurement. With the goal.
上記目的を達成するため、本第１の発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの光が照射された標本で発する蛍光を検出する検出部を有する蛍光顕微鏡において、前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、前記検出部が、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を検出するように、該各蛍光に対応する複数の検出器を有して構成されていることを特徴としている。 In order to achieve the above object, a laser scanning fluorescence microscope according to the first invention is a fluorescence microscope having a laser light source part and a detection part for detecting fluorescence emitted from a sample irradiated with light from the laser light source part. The laser light source unit is composed of one ultrashort pulse laser that generates fluorescence by two-photon excitation in the sample, and the detection unit has at least three wavelengths of fluorescence emitted by two-photon excitation in the sample. It is characterized by having a plurality of detectors corresponding to each fluorescence so as to detect each different fluorescence.
また、本第２の発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの光が照射された標本で発する蛍光を検出する検出部を有する蛍光顕微鏡において、前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、前記検出部が、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を夫々時間差をつけて一つの検出器で検出するように構成されていることを特徴としている。 The laser scanning fluorescence microscope according to the second invention is a fluorescence microscope having a laser light source unit and a detection unit for detecting fluorescence emitted from a sample irradiated with light from the laser light source unit. Is composed of a single ultrashort pulse laser that generates fluorescence by two-photon excitation in the specimen, and the detection unit emits at least three different wavelengths of fluorescence emitted from the specimen by two-photon excitation. It is characterized by being configured to detect with one detector with a time difference.
また、本第３の発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの光が照射された標本から発する蛍光を検出する検出部を有する蛍光顕微鏡において、前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、前記検出部が、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を波長毎に分離させる手段と、１次元センサを有して構成されていることを特徴としている。 The laser scanning fluorescence microscope according to the third aspect of the invention is a fluorescence microscope having a laser light source unit and a detection unit for detecting fluorescence emitted from a sample irradiated with light from the laser light source unit. Is composed of a single ultrashort pulse laser that generates fluorescence by two-photon excitation in the sample, and the detection unit emits at least three different wavelengths of fluorescence emitted from the sample by two-photon excitation. It is characterized by having a means for separating each and a one-dimensional sensor.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記波長毎に分離させる手段が、プリズムで構成されているのがよい。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, it is preferable that the means for separating each wavelength comprises a prism.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記波長毎に分離させる手段が、回折格子で構成されていてもよい。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the means for separating each wavelength may be a diffraction grating.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記１次元センサが、スリットと、光電子増倍管（ＰＭＴ）とで構成され、前記波長毎に分離させる手段が、該波長毎に分離させる手段で分離された各蛍光が順次前記スリットを通過し、前記光電子増倍管で受光されるように、蛍光の位置を調整する手段を有して構成されているのが好ましい。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the one-dimensional sensor is composed of a slit and a photomultiplier tube (PMT), and the means for separating each wavelength is a means for separating each wavelength. It is preferable to have a means for adjusting the position of the fluorescence so that each fluorescence separated in step 1 passes through the slit sequentially and is received by the photomultiplier tube.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記１次元センサが、ラインセンサを用いて、スペクトル情報（蛍光波長情報）のみを検出するように構成されているのが好ましい。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, it is preferable that the one-dimensional sensor is configured to detect only spectrum information (fluorescence wavelength information) using a line sensor.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記１次元センサが、ＣＣＤ又は１次元アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）で構成されているのが好ましい。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the one-dimensional sensor is preferably composed of a CCD or a one-dimensional avalanche photodiode (APD).
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、染色体（ＤＮＡ）の解析に必須の、３色以上の蛍光を検出するＭｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ Hybrization）に適用可能に構成されていることを特徴としている。 In addition, the laser scanning fluorescence microscope of the present invention is configured to be applicable to Multi Color FISH (Fluorescence in situ Hybrization) that detects fluorescence of three colors or more, which is essential for chromosome (DNA) analysis. It is a feature.
本発明によれば、操作が簡単で、かつ、一度の測定で３色以上の蛍光色素を励起、検出可能なレーザ走査型蛍光顕微鏡が得られる。 According to the present invention, it is possible to obtain a laser scanning fluorescence microscope that is easy to operate and that can excite and detect three or more color fluorescent dyes in one measurement.
実施例に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
従来の１光子励起や、３光子励起では、用いる蛍光色素の吸収波長域（３光子では約３倍の波長）に対応した励起光を照射しなければ、蛍光を効率よく発生させることができない。これに対し、２光子励起では、ある波長（例えば８００ｎｍ）を標本に照射すると、様々な蛍光色素を同時に励起させることができる。
本発明は、この点に着目し、レーザ走査型蛍光顕微鏡を、所謂２光子励起により蛍光を発生させるとともに、２光子励起で発生した３種類以上の波長の蛍光をほぼ同時に検出できるように構成したものである。
Prior to the examples, the function and effect of the present invention will be described.
In conventional one-photon excitation or three-photon excitation, fluorescence cannot be generated efficiently unless excitation light corresponding to the absorption wavelength region of the fluorescent dye used (about three times the wavelength for three-photons) is irradiated. On the other hand, in the two-photon excitation, when a sample is irradiated with a certain wavelength (for example, 800 nm), various fluorescent dyes can be excited simultaneously.
The present invention focuses on this point, and the laser scanning fluorescence microscope is configured to generate fluorescence by so-called two-photon excitation and to detect fluorescence of three or more wavelengths generated by two-photon excitation almost simultaneously. Is.
このように構成すれば、一つのレーザ（波長）を用いて、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨによる３種類以上の波長の蛍光検出をほぼ同時に行なうことができる。なお、２光子励起により標本で発せられる３種類以上の波長領域の蛍光を検出する手段は、必要に応じて最適な手段を用いることができる。 If comprised in this way, the fluorescence detection of three or more types of wavelengths by Multi Color FISH can be performed substantially simultaneously using one laser (wavelength). As a means for detecting fluorescence in three or more types of wavelength regions emitted from a specimen by two-photon excitation, an optimum means can be used as necessary.
具体的には、本第１の発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、光源に一つの超短パルスレーザを用い、標本から２光子励起による蛍光が発せられるようにし、その蛍光中の少なくとも３種類の波長の異なる蛍光を検出するように構成する。このようにすれば、一つのレーザ（特定波長）で、少なくとも３種類以上の蛍光色素をほぼ同時に励起、検出することができる。 Specifically, the laser scanning fluorescence microscope of the first invention uses one ultrashort pulse laser as a light source, and emits fluorescence by two-photon excitation from a specimen, and at least three kinds of fluorescence in the fluorescence are emitted. It is configured to detect fluorescence having different wavelengths. In this way, at least three types of fluorescent dyes can be excited and detected almost simultaneously with one laser (specific wavelength).
また、本第１の発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、検出器を検出する波長の種類分設ける。このようにすれば、各波長の蛍光を同時に検出することが可能となる。 The laser scanning fluorescence microscope of the first invention is provided for the types of wavelengths for detecting the detector. By doing so, it becomes possible to simultaneously detect fluorescence of each wavelength.
また、本第２の発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、各蛍光波長に対して時間差をもって順次検出するように構成する。このようにすれば、複数種類の波長の異なる蛍光を一つの検出器で検出することができる。 The laser scanning fluorescence microscope of the second aspect of the invention is configured to sequentially detect each fluorescence wavelength with a time difference. In this way, a plurality of types of fluorescence having different wavelengths can be detected by a single detector.
また、本第３の発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、検出部を、標本から発した蛍光を波長毎に分離させる手段を有すると共に、検出器に１次元センサを用いて構成する。このようにすれば、蛍光のスペクトル分析が可能であり、用いる検出器も一つで足りる。 In the laser scanning fluorescence microscope of the third aspect of the invention, the detection unit includes means for separating the fluorescence emitted from the specimen for each wavelength, and uses a one-dimensional sensor as a detector. In this way, fluorescence spectrum analysis is possible, and only one detector is required.
なお、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記波長毎に分離させる手段をプリズムで構成することができる。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the means for separating each wavelength can be constituted by a prism.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記波長毎に分離させる手段を回折格子で構成することもできる。 Moreover, in the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the means for separating each wavelength can be constituted by a diffraction grating.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記１次元センサを、スリットと、光電子増倍管（ＰＭＴ）とで構成するとともに、前記波長毎に分離させる手段を、該波長毎に分離させる手段で分離された各蛍光が順次前記スリットを通過し、前記光電子増倍管で受光されるように、蛍光の位置を調整する手段を有して構成してもよい。このようにすれば、複数種類の波長の異なる蛍光を一つの検出器で検出することができる。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the one-dimensional sensor is composed of a slit and a photomultiplier tube (PMT), and means for separating each wavelength is separated for each wavelength. A means for adjusting the position of the fluorescence may be provided so that each fluorescence separated by the means sequentially passes through the slit and is received by the photomultiplier tube. In this way, a plurality of types of fluorescence having different wavelengths can be detected by a single detector.
また、前記１次元センサをラインセンサで構成し、スペクトル情報（蛍光波長情報）のみを検出するようにしてもよい。このようにすれば、スペクトル情報（蛍光波長情報）のみを検出し、後で合成することで標本の解析が可能となる。 Further, the one-dimensional sensor may be constituted by a line sensor so as to detect only spectrum information (fluorescence wavelength information). In this way, it is possible to analyze the specimen by detecting only the spectral information (fluorescence wavelength information) and synthesizing it later.
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記１次元センサを、１次元ＣＣＤ又は１次元アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）で構成しても良い。 In the laser scanning fluorescence microscope of the present invention, the one-dimensional sensor may be composed of a one-dimensional CCD or a one-dimensional avalanche photodiode (APD).
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、染色体（ＤＮＤ）の解析に必須なアプリケーションである、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ Hybrization）に適用可能に構成する。このようにすれば、従来の顕微鏡に比べて、より簡単な操作でＭｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨによる３色以上の蛍光検出を行なうことができる。 In addition, the laser scanning fluorescence microscope of the present invention is configured to be applicable to Multi Color FISH (Fluorescence in situ Hybrization), which is an application essential for chromosome (DND) analysis. In this way, it is possible to detect fluorescence of three or more colors by Multi Color FISH with a simpler operation than a conventional microscope.
以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
図１は本発明の第１実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の概略構成図である。
第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、２光子励起用レーザ光源部１と、ミラー２と、走査ユニット３と、ダイクロイックミラー４と、対物レンズ５と、ダイクロイックミラー６1〜６n（ｎ：３≦ｎ）と、光電子増倍管（ＰＭＴ）７1〜７n（ｎ：３≦ｎ）を有して構成されている。
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a laser scanning fluorescent microscope according to the first embodiment of the present invention.
The laser scanning fluorescence microscope of the first embodiment includes a two-photon excitation laser light source unit 1, a mirror 2, a scanning unit 3, a dichroic mirror 4, an objective lens 5, and dichroic mirrors 6 1 to 6 n (n : 3 ≦ n) and photomultiplier tubes (PMT) 7 1 to 7 n (n: 3 ≦ n).
２光子励起用レーザ光源部１は、例えば、チタンサファイアレーザで、レーザ光が１００フェムト秒程度の超短パルスで、近赤外の波長を持ち、１００ＭＨｚ程度の繰り返し周波数を持つレーザ装置として構成されている。 The two-photon excitation laser light source unit 1 is, for example, a titanium sapphire laser, and is configured as a laser device having an ultrashort pulse of about 100 femtoseconds, a near infrared wavelength, and a repetition frequency of about 100 MHz. ing.
走査ユニット３は、所定方向に傾きを変えることにより標本８上を走査可能なミラー３ａを有している。
ダイクロイックミラー６1は、標本８で発生し、ダイクロイックミラー４で反射された蛍光のうち所定波長の蛍光を反射し、その他の波長の蛍光を透過するように構成されている。
ダイクロイックミラー６2は、ダイクロイックミラー６1を透過した蛍光のうち所定波長領の蛍光を反射し、その他の波長の蛍光を透過するように構成されている。
ダイクロイックミラー６nは、ダイクロイックミラー６n-1を透過した蛍光を反射するように構成されている。
The scanning unit 3 has a mirror 3a that can scan the sample 8 by changing the inclination in a predetermined direction.
The dichroic mirror 61 is generated at the specimen 8, it reflects the fluorescence of a predetermined wavelength among the fluorescence reflected by the dichroic mirror 4, and is configured to transmit the fluorescence of other wavelengths.
The dichroic mirror 6 2 is configured so as to reflect the fluorescence of a predetermined wavelength territory of fluorescence transmitted through the dichroic mirror 61, transmitted through the fluorescence of other wavelengths.
The dichroic mirror 6 n is configured to reflect the fluorescence transmitted through the dichroic mirror 6 n-1 .
このように構成された第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、２光子励起用レーザ光源部１から近赤外の波長を持ち１００フェムト秒程度の超短パルスのレーザ光が出射される。出射されたレーザ光は、ミラー２、走査ユニット３、ダイクロイックミラー４、対物レンズ５を経て、標本８上に照射される。標本８はレーザ光を２光子励起されることで、３種類以上の複数の波長の蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ５を経て、ダイクロイックミラー４で反射される。反射された蛍光は、ダイクロイックミラー６1〜６n、光電子増倍管７1〜７nを介して、夫々所定の波長の蛍光ごとに検出される。 In the laser scanning fluorescence microscope of the first embodiment configured as described above, an ultrashort pulse laser beam having a near-infrared wavelength and about 100 femtoseconds is emitted from the two-photon excitation laser light source unit 1. The emitted laser light is irradiated on the specimen 8 through the mirror 2, the scanning unit 3, the dichroic mirror 4, and the objective lens 5. The specimen 8 emits fluorescence of a plurality of wavelengths of three or more by exciting the laser beam with two photons. The fluorescence is reflected by the dichroic mirror 4 through the objective lens 5. The reflected fluorescence is detected for each fluorescence having a predetermined wavelength via the dichroic mirrors 6 1 to 6 n and the photomultiplier tubes 7 1 to 7 n .
従って、第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、従来の１光子顕微鏡を用いた場合と異なり、２光子励起により、一つのレーザでもって、様々な色の３種類以上の蛍光色素を同時に励起させることができる。また、従来の１光子顕微鏡を用いた場合のような複数波長の光励起操作のために励起フィルタとバリアフィルタを多数用意してこれらのうち所望の励起フィルタとバリアフィルタを切り替えるという必要がなくて済む。 Therefore, according to the laser scanning fluorescent microscope of the first embodiment, unlike the case of using the conventional one-photon microscope, three or more kinds of fluorescent dyes of various colors can be obtained with one laser by two-photon excitation. It can be excited simultaneously. Further, it is not necessary to prepare a large number of excitation filters and barrier filters for the optical excitation operation of a plurality of wavelengths as in the case of using a conventional one-photon microscope, and to switch between the desired excitation filter and barrier filter. .
次に、図２に変形例を示す。図２の変形例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、図１の構成のダイクロイックミラー６1〜６3、光電子増倍管７1〜７3に加えて、所定波長の蛍光のみを透過させるバリアフィルタ９ａ1〜９ａ5と光電子増倍管９ｂ1〜９ｂ5とを備えた５つのユニット９1〜９5が設けられている。ユニット９1〜９5のそれぞれのバリアフィルタ９ａ1〜９ａ5は、それぞれ所望波長の蛍光のみ透過する特性を有している。なお、図２中、レンズ５1’〜５5’は、標本８で発生し対物レンズ５以外の方向に向かって発散する蛍光を平行光にしてバリアフィルタ９ａ1〜９ａ5に導くレンズである。
図２の変形例によれば、標本８で発生した蛍光のうち、対物レンズ５以外の方向に向かう５種類の蛍光は、ユニット９1〜９5の光電子増倍管９ｂ1〜９ｂ5で検出され、一方、対物レンズ５を通過した３種類の蛍光は、光電子増倍管７1〜７3で検出される。つまり、この変形例のレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、合計８種類の蛍光を検出することができる。
そして、対物レンズ５以外の方向の蛍光を含めて合計８種類の蛍光を検出するので、対物レンズ５を通過した蛍光のみで８種類の蛍光を検出するように構成した場合に比べて、ダイクロイックミラー４の後方に配置すべき光電子増倍管の数を少なくすることができ、ダイクロイックミラー４以降の装置の長さ（大きさ）を短く（小さく）することができる。
Next, a modification is shown in FIG. The laser scanning fluorescence microscope of the modified example of FIG. 2 includes a barrier filter 9a that transmits only fluorescence of a predetermined wavelength in addition to the dichroic mirrors 6 1 to 6 3 and the photomultiplier tubes 7 1 to 7 3 configured as shown in FIG. 1 ～9A 5 and five units 91 to 93 5 and a photomultiplier tube 9b 1 ~9b 5 is provided. Each barrier filter 9a 1 ~9a unit 91 to 93 5 5 has a characteristic of transmitting only the fluorescence of each desired wavelength. In FIG. 2, lenses 5 1 ′ to 5 5 ′ are lenses that guide fluorescence to the barrier filters 9 a 1 to 9 a 5 by making the fluorescent light generated in the specimen 8 and diverging in a direction other than the objective lens 5 into parallel light. .
According to a variant of Figure 2, of the fluorescence generated in the specimen 8, five types of fluorescence toward the direction other than the objective lens 5, the units 91 to 93 5 of the photomultiplier tube 9b 1 ~9b 5 detection On the other hand, the three types of fluorescence that have passed through the objective lens 5 are detected by the photomultiplier tubes 7 1 to 7 3 . That is, according to the laser scanning fluorescence microscope of this modification, a total of eight types of fluorescence can be detected.
Since a total of 8 types of fluorescence including fluorescence in directions other than the objective lens 5 are detected, the dichroic mirror is compared with a configuration in which only 8 types of fluorescence are detected by passing through the objective lens 5. 4 can be reduced, and the length (size) of the device after the dichroic mirror 4 can be shortened (decreased).
また、図２の変形例をさらに変形して、対物レンズ５を通過した蛍光を検出する光電子増倍管の数と、対物レンズ５以外の方向に向かう蛍光を検出する光電子増倍管の数とを同数配置、例えば、光電子増倍管７1〜７5と光電子増倍管９ｂ1〜９ｂ5というように夫々５個ずつ配置し、光電子増倍管７1と光電子増倍管９ｂ1、光電子増倍管７2と光電子増倍管９ｂ2、…、光電子増倍管７5と光電子増倍管９ｂ5を夫々ペアーとし、ペアー毎に同じ種類の蛍光を検出することができるようにして合計で５種類の蛍光を検出することができるようにし、図示省略した蛍光信号合成手段等を介して同じ種類の蛍光を合成するようにしてもよい。
このように構成した場合は、標本８で発生する蛍光が非常に強度が弱い場合であっても、標本８で発生する対物レンズ５以外の方向に向かう蛍光と対物レンズ５を通過する蛍光とを同じ種類の蛍光として同時に検出することができ、その分、より多くの光量で高精度に検出することができ、明るい蛍光観察が可能になる。
2 is further modified so that the number of photomultiplier tubes that detect fluorescence that has passed through the objective lens 5 and the number of photomultiplier tubes that detect fluorescence in a direction other than the objective lens 5 are as follows. the same number arranged, for example, by respective five and so photomultiplier 7 1-7 5 and the photomultiplier tube 9b 1 ～9B 5 arranged, photomultiplier 71 and photomultiplier tube 9b 1, photoelectrons intensifier 7 2 and photomultiplier tube 9b 2, ..., sum the photomultiplier tube 7 5 photomultiplier tube 9b 5 and each pair, so as to be able to detect the same type of fluorescent each pair Thus, the five types of fluorescence can be detected, and the same type of fluorescence may be synthesized via a fluorescence signal synthesizing unit (not shown).
When configured in this way, even when the fluorescence generated in the specimen 8 is very weak, the fluorescence generated in the specimen 8 in a direction other than the objective lens 5 and the fluorescence passing through the objective lens 5 are obtained. The same type of fluorescence can be detected at the same time, and accordingly, it can be detected with a higher amount of light with high accuracy, enabling bright fluorescence observation.
図３は本発明の第２実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の概略構成図である。
第２実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、２光子励起用レーザ光源部１と、ダイクロイックミラー２’と、走査ユニット３と、瞳リレーレンズ１０と、結像レンズ１１と、対物レンズ５と、単レンズ１２と、分散素子１３と、集光レンズ１４と、ラインセンサ１５を有して構成されている。
FIG. 3 is a schematic configuration diagram of a laser scanning fluorescence microscope according to the second embodiment of the present invention.
The laser scanning fluorescence microscope of the second embodiment includes a two-photon excitation laser light source unit 1, a dichroic mirror 2 ', a scanning unit 3, a pupil relay lens 10, an imaging lens 11, an objective lens 5, A single lens 12, a dispersion element 13, a condenser lens 14, and a line sensor 15 are included.
ダイクロイックミラー２’は、２光子励起用レーザ光源部１からのレーザ光を反射し、標本８で発生した蛍光を透過するように構成されている。
単レンズ１２は、ダイクロイックミラー２’を透過した光束を平行光にするように構成されている。
分散素子１３は、プリズムで構成され、入射した蛍光を夫々の波長ごとに分光して出射するようになっている。
集光レンズ１４は、分散素子１３で分光された各波長域の蛍光を集光して、ラインセンサ１５の各波長域の蛍光に対応して設けられた所定の受光素子１５ａに導くようになっている。
ラインセンサ１５は、分散素子１３で分散される各波長域の蛍光が検出されるように、複数の受光素子１５ａを線状に配列して構成されている。
The dichroic mirror 2 ′ is configured to reflect the laser light from the two-photon excitation laser light source unit 1 and transmit the fluorescence generated in the specimen 8.
The single lens 12 is configured so that the light beam that has passed through the dichroic mirror 2 ′ becomes parallel light.
The dispersive element 13 is composed of a prism, and splits the emitted fluorescence for each wavelength and emits it.
The condensing lens 14 condenses the fluorescent light of each wavelength region dispersed by the dispersive element 13 and guides it to a predetermined light receiving element 15 a provided corresponding to the fluorescent light of each wavelength region of the line sensor 15. ing.
The line sensor 15 is configured by linearly arranging a plurality of light receiving elements 15a so that fluorescence in each wavelength region dispersed by the dispersion element 13 is detected.
このように構成された第２実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、２光子励起用レーザ光源部１から近赤外の波長を持ち１００フェムト秒程度の超短パルスのレーザ光が照射される。出射されたレーザ光は、ダイクロイックミラー２’と、走査ユニット３と、瞳リレーレンズ１０と、結像レンズ１１と、対物レンズ５を経て、標本８上に照射される。標本８はレーザ光を２光子励起されることで、３種類以上の複数の波長の蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ７、結像レンズ１１、瞳リレーレンズ１０、操作ユニット３を経て、ダイクロイックミラー２’を透過する。ダイクロイックミラー２’を透過した蛍光は、単レンズ１２で平行光となり、分散素子１３で夫々の波長に平行光のまま分光され、集光レンズ１４を介して夫々集光され、ラインセンサ１５上の所定の受光素子１５ａで夫々受光される。 In the laser scanning fluorescence microscope of the second embodiment configured as described above, a laser beam of an ultrashort pulse having a near-infrared wavelength and about 100 femtoseconds is irradiated from the two-photon excitation laser light source unit 1. The emitted laser light is irradiated onto the specimen 8 through the dichroic mirror 2 ′, the scanning unit 3, the pupil relay lens 10, the imaging lens 11, and the objective lens 5. The specimen 8 emits fluorescence of a plurality of wavelengths of three or more by exciting the laser beam with two photons. The fluorescent light passes through the dichroic mirror 2 ′ through the objective lens 7, the imaging lens 11, the pupil relay lens 10, and the operation unit 3. The fluorescence transmitted through the dichroic mirror 2 ′ is converted into parallel light by the single lens 12, and is dispersed by the dispersive element 13 as parallel light at each wavelength, and is condensed through the condenser lens 14. Each light is received by a predetermined light receiving element 15a.
従って、第２実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、図１の実施例と同様に、２光子励起により、一つのレーザでもって、様々な色の３種類以上の蛍光色素を同時に励起させることができる。また、従来の１光子顕微鏡を用いた場合と異なり、複数波長の光励起操作のために励起フィルタとバリアフィルタを多数用意してこれらのうち所望の励起フィルタとバリアフィルタを切り替える必要がなくて済み、操作がその分、簡単になる。さらに、第１実施例のように複数の検出器を必要とせず、一つの検出器で蛍光のスペクトル分析が可能となる。 Therefore, according to the laser scanning fluorescence microscope of the second embodiment, as in the embodiment of FIG. 1, two or more photochromic dyes of various colors are simultaneously excited with one laser by two-photon excitation. be able to. Also, unlike the case of using a conventional one-photon microscope, it is not necessary to prepare a large number of excitation filters and barrier filters for a multi-wavelength optical excitation operation, and it is not necessary to switch between the desired excitation filter and barrier filter. Operation is much easier. Further, unlike the first embodiment, a plurality of detectors are not required, and the fluorescence spectrum can be analyzed with one detector.
図４は本発明の第３実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の概略構成図である。
第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、２光子励起用レーザ光源部１と、ダイクロイックミラー２’と、走査ユニット３と、瞳リレーレンズ１０と、結像レンズ１１と、対物レンズ５と、単レンズ１２と、回折格子１６と、集光レンズ１４と、スリット１７と、光量検出器１８を有して構成されている。
FIG. 4 is a schematic configuration diagram of a laser scanning fluorescence microscope according to the third embodiment of the present invention.
The laser scanning fluorescence microscope of the third embodiment includes a two-photon excitation laser light source unit 1, a dichroic mirror 2 ′, a scanning unit 3, a pupil relay lens 10, an imaging lens 11, an objective lens 5, A single lens 12, a diffraction grating 16, a condenser lens 14, a slit 17, and a light amount detector 18 are included.
回折格子１６は、異なる波長の蛍光に分光反射するように構成されている。また、回折格子１６には図示省略した回動手段が設けられており、矢印方向へ回動可能になっている。
スリット１７は、回折格子１６で分光され、集光レンズ１４で集光される蛍光のうち所定波長域の蛍光のみを通過させるように形成されている。なお、スリット１７は幅を変えることによって波長域の範囲を選択できるようになっている。
光量検出器１８は、例えば電子増倍管（ＰＭＴ）で構成されており、スリット１７を通過した光を受光するように配置されている。
The diffraction grating 16 is configured to spectrally reflect fluorescence having different wavelengths. The diffraction grating 16 is provided with a rotating means (not shown) so that it can be rotated in the direction of the arrow.
The slit 17 is formed so as to pass only the fluorescence in a predetermined wavelength region out of the fluorescence that is split by the diffraction grating 16 and collected by the condenser lens 14. In addition, the slit 17 can select the range of a wavelength range by changing the width | variety.
The light quantity detector 18 is composed of, for example, an electron multiplier tube (PMT), and is disposed so as to receive light that has passed through the slit 17.
このように構成された第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、２光子励起用光源部から近赤外の波長を持ち１００フェムト秒程度の超短パルスのレーザ光が照射される。レーザ光は、ダイクロイックミラー２’と、走査ユニット３と、瞳リレーレンズ１０と、結像レンズ１１と、対物レンズ５を経て、標本８上に照射される。標本８はレーザ光を２光子励起されることで、３種類以上の複数の波長の蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ７、結像レンズ１１、瞳リレーレンズ１０、操作ユニット３を経て、ダイクロイックミラー２’を透過する。ダイクロイックミラー２’を透過した蛍光は、単レンズ１２で平行光となり、回折格子１６で夫々の波長に平行光のまま分光されて反射され、集光レンズ１４を介して夫々集光される。集光された蛍光は線状に分布している。ここで、不要の波長はスリット１７で遮断される。スリット１７を通過した所定波長の蛍光が光量検出器１８で受光される。
また、回折格子１６を回転させることでスリット１６を通過する波長を選択できる。従って、回折格子１６を所定方向に回転させながら光量検出器１８で受光する。
In the laser scanning fluorescence microscope of the third embodiment configured as described above, a laser beam having an ultrashort pulse of about 100 femtoseconds having a near-infrared wavelength is emitted from a two-photon excitation light source unit. The laser light is irradiated on the specimen 8 through the dichroic mirror 2 ′, the scanning unit 3, the pupil relay lens 10, the imaging lens 11, and the objective lens 5. The specimen 8 emits fluorescence of a plurality of wavelengths of three or more by exciting the laser beam with two photons. The fluorescence passes through the dichroic mirror 2 ′ through the objective lens 7, the imaging lens 11, the pupil relay lens 10, and the operation unit 3. The fluorescence that has passed through the dichroic mirror 2 ′ becomes parallel light by the single lens 12, is split and reflected by the diffraction grating 16 as parallel light at each wavelength, and is condensed through the condenser lens 14. The condensed fluorescence is distributed linearly. Here, unnecessary wavelengths are blocked by the slit 17. The fluorescence having a predetermined wavelength that has passed through the slit 17 is received by the light amount detector 18.
Further, the wavelength passing through the slit 16 can be selected by rotating the diffraction grating 16. Therefore, the light quantity detector 18 receives light while rotating the diffraction grating 16 in a predetermined direction.
従って、第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、図１の実施例と同様に、２光子励起により、一つのレーザでもって、様々な色の３種類以上の蛍光色素を同時に励起させることができる。また、第２実施例と同様に、従来の１光子顕微鏡を用いた場合と異なり、複数波長の光励起操作のために励起フィルタとバリアフィルタを多数用意してこれらのうち所望の励起フィルタとバリアフィルタを切り替える必要がなくて済み、操作がその分、簡単になる。さらに、第１実施例のように複数の検出器を必要とせず、一つの検出器で蛍光のスペクトル分析が可能となる。 Therefore, according to the laser scanning fluorescent microscope of the third embodiment, as in the embodiment of FIG. 1, two or more photochromic dyes of various colors are excited simultaneously with one laser by two-photon excitation. be able to. As in the second embodiment, unlike the conventional one-photon microscope, many excitation filters and barrier filters are prepared for the optical excitation operation of a plurality of wavelengths, and a desired excitation filter and barrier filter among them are prepared. There is no need to switch between and the operation becomes much easier. Further, unlike the first embodiment, a plurality of detectors are not required, and the fluorescence spectrum can be analyzed with one detector.
１ ２光子励起用レーザ光源
２，３ａ ミラー
２’，４，６1，６2，６n ダイクロイックミラー
３ 走査手段
５ 対物レレンズ
５1’，５2’，５3’，５4’，５5’ レンズ
７1，７2，７3，７n，９ｂ1，９ｂ2，９ｂ3，９ｂ4，９ｂ5，１８
光電子増倍管
８ 標本
９1，９2，９3，９4，９5 ユニット
９ａ1，９ａ2，９ａ3，９ａ4，９ａ5 バリアフィルタ
１０ 瞳リレーレンズ
１１ 結像レンズ
１２ 単レンズ
１３ 分散素子
１４ 集光レンズ
１５ ラインセンサ
１５ａ 受光素子
１６ 回折格子
１７ スリット
1 Two-photon excitation laser light source 2, 3a Mirror 2 ', 4, 6 1 , 6 2 , 6 n Dichroic mirror 3 Scanning means 5 Objective lens 5 1 ', 5 2 ', 5 3 ', 5 4 ', 5 5 'Lens 7 1 , 7 2 , 7 3 , 7 n , 9b 1 , 9b 2 , 9b 3 , 9b 4 , 9b 5 , 18
Photomultiplier tube 8 sample 9 1 , 9 2 , 9 3 , 9 4 , 9 5 unit 9a 1 , 9a 2 , 9a 3 , 9a 4 , 9a 5 barrier filter 10 pupil relay lens 11 imaging lens 12 single lens 13 dispersion Element 14 Condensing lens 15 Line sensor 15a Light receiving element 16 Diffraction grating 17 Slit
Claims (9)
前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、
前記検出部が、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を検出するように、該各蛍光に対応する複数の検出器を有して構成されていることを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。 In a fluorescence microscope having a laser light source unit and a detection unit for detecting fluorescence emitted from a sample irradiated with light from the laser light source unit,
The laser light source unit is composed of one ultrashort pulse laser that generates fluorescence by two-photon excitation in the specimen,
The detection unit is configured to have a plurality of detectors corresponding to each fluorescence so as to detect each fluorescence having different wavelengths among at least three fluorescences emitted by two-photon excitation in the specimen. A laser scanning fluorescence microscope characterized by the above.
前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、
前記検出部が、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を夫々時間差をつけて一つの検出器で検出するように構成されていることを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。 In a fluorescence microscope having a laser light source unit and a detection unit for detecting fluorescence emitted from a sample irradiated with light from the laser light source unit,
The laser light source unit is composed of one ultrashort pulse laser that generates fluorescence by two-photon excitation in the specimen,
The detection unit is configured to detect at least three fluorescences having different wavelengths among the fluorescences emitted by the two-photon excitation in the specimen with a single time detector. Scanning fluorescence microscope.
前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、
前記検出部が、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を波長毎に分離させる手段と、１次元センサを有して構成されていることを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。 In a fluorescence microscope having a laser light source unit and a detection unit for detecting fluorescence emitted from a sample irradiated with light from the laser light source unit,
The laser light source unit is composed of one ultrashort pulse laser that generates fluorescence by two-photon excitation in the specimen,
The detection unit is configured to include means for separating each fluorescence having different wavelengths among the fluorescence emitted by the two-photon excitation in the sample for each wavelength, and a one-dimensional sensor. Laser scanning fluorescence microscope.
前記波長毎に分離させる手段が、該波長毎に分離させる手段で分離された各蛍光が順次前記スリットを通過し、前記光電子増倍管で受光されるように、蛍光の位置を調整する手段を有して構成されていることを特徴とする請求項３に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。 The one-dimensional sensor includes a slit and a photomultiplier tube (PMT),
Means for adjusting the position of the fluorescence so that each fluorescence separated by the means for separating each wavelength sequentially passes through the slit and is received by the photomultiplier tube. The laser scanning fluorescence microscope according to claim 3, wherein the laser scanning fluorescence microscope is provided.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003299027A JP4231754B2 (en) | 2003-08-22 | 2003-08-22 | Laser scanning fluorescence microscope |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003299027A JP4231754B2 (en) | 2003-08-22 | 2003-08-22 | Laser scanning fluorescence microscope |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005069827A true JP2005069827A (en) | 2005-03-17 |
| JP4231754B2 JP4231754B2 (en) | 2009-03-04 |
Family
ID=34404357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003299027A Expired - Fee Related JP4231754B2 (en) | 2003-08-22 | 2003-08-22 | Laser scanning fluorescence microscope |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4231754B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009510498A (en) * | 2005-09-29 | 2009-03-12 | カール ツァイス マイクロイメージング ゲーエムベーハー | Microscopic inspection method and microscope |
| JP2010525404A (en) * | 2007-04-24 | 2010-07-22 | デグデント・ゲーエムベーハー | Arrangement and method for three-dimensional measurement of an object |
-
2003
- 2003-08-22 JP JP2003299027A patent/JP4231754B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009510498A (en) * | 2005-09-29 | 2009-03-12 | カール ツァイス マイクロイメージング ゲーエムベーハー | Microscopic inspection method and microscope |
| JP2010525404A (en) * | 2007-04-24 | 2010-07-22 | デグデント・ゲーエムベーハー | Arrangement and method for three-dimensional measurement of an object |
| US8515528B2 (en) | 2007-04-24 | 2013-08-20 | Degudent Gmbh | Measuring arrangement and method for the three-dimensional measurement of an object |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4231754B2 (en) | 2009-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4441695B2 (en) | Sample inspection method | |
| JP5485289B2 (en) | Resolution-enhanced microscopy | |
| JP4509940B2 (en) | Method and apparatus for determining wavelength dependent characteristics of illuminated samples | |
| JP4452850B2 (en) | Method and apparatus configuration for optically grasping characteristic characteristic values depending on wavelength of illuminated sample | |
| US10401607B2 (en) | High-resolution scanning microscopy resolving at least two spectral ranges | |
| US6703621B2 (en) | Method for the optical acquisition of characteristic sizes of an illuminated sample | |
| JP4899648B2 (en) | Spectrum observation method and spectrum observation system | |
| JP4964568B2 (en) | Fluorescence detection apparatus, fluorescence detection method, and fluorescence detection program | |
| JP2006010944A (en) | Optical scanning type confocal microscope | |
| US7268330B2 (en) | Apparatus and method for defining illumination parameters of a sample | |
| US7319520B2 (en) | Method for separating fluorescence spectra of dyes present in a sample | |
| JP5541978B2 (en) | Laser scanning microscope | |
| JP2005283264A (en) | Fluorescent spectroscopic analyzer | |
| US11668918B2 (en) | System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes | |
| JP4855009B2 (en) | Scanning fluorescence microscope | |
| US8294897B2 (en) | Method for imaging a sample using a microscope, and microscope and data storage center | |
| JP4646506B2 (en) | Laser scanning microscope | |
| US7119898B2 (en) | Method for the detection of fluorescent light | |
| CN116249891A (en) | Method for detecting emitted light, detection device and laser scanning microscope | |
| JP2003185927A (en) | Scanning laser microscope | |
| JP2005069827A (en) | Laser scanning type fluorescence microscope | |
| JP4896301B2 (en) | Scanning optical microscope | |
| JP2003295064A (en) | Laser scanning microscope system, system control method, and control program for making computer execute system control | |
| JP4633386B2 (en) | Scanning laser microscope and data acquisition method using the same | |
| JP2006276840A (en) | Microscope apparatus, control unit thereof, and program |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060818 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080402 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080422 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080613 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080826 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081023 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081118 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081208 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 4231754 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111212 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111212 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121212 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131212 Year of fee payment: 5 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |