JP2005058116A - Truncation type variant of apoptosis-inducing ip3 receptor protein - Google Patents

Truncation type variant of apoptosis-inducing ip3 receptor protein Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new apoptosis inducer enabling cell breeding power to be prevented or treated. <P>SOLUTION: The apoptosis is induced in an expression cell by expressing a variant protein composed of only a channel domain of an IP<SB>3</SB>receptor. The variant protein induces the apoptosis by being localized to the endoplasmic reticulum of the cell, and flowing out calcium in the endoplasmic reticulum to cytoplasm. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、IP3受容体のC末端側に位置するチャネル形成ドメインのみを含むタンパク質が、アポトーシス誘導薬として作用することに関する。したがって、本発明は、該タンパク質による抗癌治療等の細胞増殖性疾患の治療にかかる分野に属する。 The present invention relates to the fact that a protein containing only a channel-forming domain located on the C-terminal side of the IP 3 receptor acts as an apoptosis inducer. Therefore, this invention belongs to the field | area concerning the treatment of cell proliferative diseases, such as anticancer treatment by this protein.

細胞膜上のレセプターの活性化に伴いホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate)が加水分解されると、細胞内セカンドメッセンジャーであるイノシトール1,4,5-三リン酸(inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3))が生成する。IP3はIP3受容体(IP3R)に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ（主に小胞体）からのCa2+流出を誘導する。このIP3/Ca2+シグナル経路において、IP3受容体は、IP3のシグナルをCa2+のシグナルへ変換する役割を担っている(1-3)。 When phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is hydrolyzed with receptor activation on the cell membrane, the intracellular second messenger inositol 1,4,5-triphosphate (inositol) 1,4,5-trisphosphate (IP 3 )) is produced. IP 3 induces Ca 2+ efflux from intracellular calcium storage organelles (mainly endoplasmic reticulum) by binding to the IP 3 receptor (IP 3 R). In this IP 3 / Ca 2+ signal pathway, the IP 3 receptor plays a role in converting an IP 3 signal into a Ca 2+ signal (1-3).

IP3受容体は、4量体の細胞内IP3-誘導性Ca2+放出チャネル（IP3-gated Ca2+ release channel）である(3, 4)。哺乳動物では、3種の異なるIP3受容体が存在する(5-7)。IP3により誘発されるIP3受容体チャネル開口の詳細な機序は未だ不明であるが、IP3結合がIP3受容体の何らかの立体構造変化を誘導することによって、チャネルの開口が起こると考えられる(10)。チャネルの開口以外にも、IP3-誘導性の立体構造変化は、IP3受容体の分解にも関与していると考えられる (13, 14)。 IP 3 receptor, intracellular IP tetrameric 3 - inducible Ca 2+ release channels (IP 3 -gated Ca 2+ release channel ) (3, 4). In mammals, there are three different IP 3 receptors (5-7). Although IP 3 induced by the IP 3 receptor channel opening detailed mechanisms are not yet known, considered to IP 3 binding by inducing some conformational changes in the IP 3 receptor, the opening of the channel takes place (10). In addition to channel opening, IP 3 -induced conformational changes are thought to be involved in IP 3 receptor degradation (13, 14).

IP3受容体の活性化による細胞質Ca2+濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている (1-2, 15)。このような多岐に渡る細胞機能を制御するために、Ca2+シグナルは、空間、時間、および濃度の点で厳密に制御される必要がある(2, 15)。このようなCa2+シグナルの複雑な制御は、IP3受容体アイソフォームの発現の多様性、IP3受容体アイソフォームのヘテロ4量体の形成、IP3受容体の細胞内分布、ならびにCa2+自体、ATPおよびリン酸化によるIP3受容体の制御によって部分的に担われている (3-4, 16)。IP3受容体チャネルはまた、カルモジュリン(18, 19)、FKBP12 (20-22、23-24)、カルシニューリン(21、25、23-24)、アンキリン(26-28)、σ-1 受容体(28)、クロモグラニンAおよびB (29-31)、IRAG (32)、Fyn(33)ならびにBANK (34)などの該チャネルと相互作用するタンパク質によっても制御される(4, 17)。さらに、CaBPと呼ばれるファミリーが、Ca2+依存的にIP3受容体と結合し、IP3非存在下でIP3受容体を直接活性化することが示された(35)。IP3受容体はまた、タンパク質-タンパク質間相互作用によってその上流または下流のシグナル分子に物理的に会合していることが示されている。例えば、IP3受容体は、Homerファミリータンパク質を介して代謝型グルタミン酸受容体グループ１(mGluRs)と結合し(36)、また、未知の機序によってB2ブラジキニン受容体(B2Rs)と結合している(37)。mGluRsやB2Rsの活性化によって、IP3受容体に近接した位置でIP3が産生され、効率的かつ特異的にシグナルが伝播される。 Increased cytoplasmic Ca 2+ concentration due to activation of the IP 3 receptor controls the activity of a wide variety of downstream target molecules. These downstream target molecules play an important role in a variety of cellular responses including fertilization, development, proliferation, secretion, and synaptic plasticity (1-2, 15). In order to control such diverse cell functions, Ca 2+ signals need to be tightly controlled in terms of space, time, and concentration (2, 15). Complex control of such Ca 2+ signals, IP 3 diversity expression of the receptor isoforms formation of IP 3 receptor isoforms heterotetrameric of the intracellular distribution of the IP 3 receptors and Ca 2+ itself is partly responsible for the regulation of IP 3 receptors by ATP and phosphorylation (3-4, 16). IP 3 receptor channels are also calmodulin (18, 19), FKBP12 (20-22, 23-24), calcineurin (21, 25, 23-24), ankyrin (26-28), sigma-1 receptor ( 28), also regulated by proteins that interact with the channel such as chromogranins A and B (29-31), IRAG (32), Fyn (33) and BANK (34) (4, 17). Furthermore, a family called CaBP is bound to Ca 2+ dependent manner IP 3 receptor, it has been shown to directly activate IP 3 receptor IP 3 in the absence (35). The IP 3 receptor has also been shown to be physically associated with its upstream or downstream signal molecule through protein-protein interactions. For example, the IP 3 receptor binds to metabotropic glutamate receptor group 1 (mGluRs) through Homer family proteins (36) and to the B 2 bradykinin receptor (B 2 Rs) by an unknown mechanism. (37). Activation of mGluRs and B 2 Rs produces IP 3 at a position close to the IP 3 receptor and efficiently and specifically propagates the signal.

このように、IP3分子は、様々な細胞機能を制御する重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内の濃度は時間空間的に制御された形で変化していると考えられる。 Thus, the IP 3 molecule is an important second messenger that controls various cell functions, and its intracellular concentration is thought to change in a temporally and spatially controlled manner.

上述の制御ドメインのC末端側近傍にはカスパーゼ3特異的切断部位が存在する。カスパーゼ3により該切断部位で切断されると、IP3受容体のチャネルドメインのみを含むタンパク質が生じる。カスパーゼ3によりIP3受容体が切断されると細胞のアポトーシスが起こることが、種々の培養細胞系において示されている（38）。 A caspase 3 specific cleavage site exists in the vicinity of the C-terminal side of the above-mentioned regulatory domain. Cleavage at the cleavage site by caspase 3 yields a protein that contains only the IP 3 receptor channel domain. It has been shown in various cultured cell lines that cell apoptosis occurs when the IP 3 receptor is cleaved by caspase-3 (38).

しかし、カスパーゼ3により切断されたIP3受容体が、カルシウムの細胞内プールに対してどのような作用をするのかは不明である。 However, it is unclear how the IP 3 receptor cleaved by caspase 3 acts on the intracellular pool of calcium.

細胞質Ca2+の局在パターンの変動がアポトーシスにどの様な影響を与えるのかということは、現在論争の的であり、細胞種、アポトーシス誘導の刺激、細胞の環境等、種々の条件によって異なることが明らかにされている（2）。しかし、IP3受容体がアポトーシスに関与していることを示唆する報告がある。例えば、Jurkat細胞におけるアンチセンスRNA法によりIP3受容体の存在量を低下させた場合（39）、およびDT40ニワトリB細胞においてIP3受容体の遺伝子を欠失させた場合（40）、有意にアポトーシスが阻害されるとの報告がある。IP3受容体タイプ3（IP3R3）は、リンパ細胞のアポトーシスの際に選択的に増加し、IP3R3アンチセンスRNAを発現させることによりアポトーシスが阻害されることも報告されている（41、42）。Bcl-XLは、IP3R1およびIP3R3をダウンレギュレートするが、該ダウンレギュレートは抗アポトーシス作用の一部であると考えられる（43）。したがって、IP3受容体とそのカスパーゼ3切断産物は、条件によってはアポトーシスに必須のシグナル伝達を任っている可能性が高い。 The effect of changes in the localization pattern of cytoplasmic Ca 2+ on apoptosis is currently controversial and depends on various conditions such as cell type, stimulation of apoptosis induction, and cellular environment. Has been clarified (2). However, there are reports that suggest that the IP 3 receptor is involved in apoptosis. For example, when the abundance of IP 3 receptor is reduced by the antisense RNA method in Jurkat cells (39), and when the gene for IP 3 receptor is deleted in DT40 chicken B cells (40) There are reports that apoptosis is inhibited. IP 3 receptor type 3 (IP 3 R3) is reported to be selectively increased during lymphocyte apoptosis and to inhibit apoptosis by expressing IP 3 R3 antisense RNA (41 42). Bcl-XL down-regulates IP 3 R1 and IP 3 R3, which is thought to be part of the anti-apoptotic effect (43). Therefore, the IP 3 receptor and its caspase 3 cleavage product are likely to be responsible for signaling that is essential for apoptosis under some conditions.

しかしながら、現時点でIP3受容体のカスパーゼ3切断産物のアポトーシスに対する影響を直接的に証明した例は報告されていない。 However, at present, no example has been reported that directly demonstrates the effect of the caspase 3 cleavage product of the IP 3 receptor on apoptosis.

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本発明は、IP3受容体のチャネルドメインのみからなる変異体タンパク質によってアポトーシスを誘導し、細胞増殖性疾患の治療等に有用な薬剤および方法を提供する。 The present invention provides a drug and method useful for the treatment of cell proliferative diseases and the like by inducing apoptosis with a mutant protein consisting only of the IP 3 receptor channel domain.

本発明者らは、種々の長さのIP3受容体タイプ1（IP3R1）変異体タンパク質をグリーン蛍光タンパク質（GFP）で標識したものを作製し、それぞれを細胞内で発現させることにより、IP3受容体のチャネルドメインのみからなるタンパク質を発現させた場合、そのチャネルが開いた状態となるか、または少なくともCa2+イオンの透過が可能な状態であることを見出した。 The present inventors have prepared those labeled with IP 3 receptor type 1 of various lengths (IP 3 R1) variant proteins green fluorescent protein (GFP), by expressing each in a cell, It was found that when a protein consisting only of the channel domain of the IP 3 receptor was expressed, the channel was opened or at least allowed to permeate Ca 2+ ions.

このことから、IP3受容体のチャネルドメインのみからなるタンパク質を強制発現させた細胞では、小胞体（ER）から細胞質へとCa2+イオンが流出し、アポトーシスが誘導されることがわかった。 From this, it was found that in cells in which a protein consisting only of the IP 3 receptor channel domain was forcibly expressed, Ca 2+ ions flow out from the endoplasmic reticulum (ER) into the cytoplasm, and apoptosis was induced.

したがって、上記チャネルドメインのみを含むタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子は、アポトーシス誘導薬として細胞増殖性疾患の治療に用いることができる。   Therefore, a protein containing only the channel domain and a gene encoding the protein can be used as an apoptosis inducer for the treatment of cell proliferative diseases.

以上の知見より、本発明は、以下の態様：
１． IP3受容体タンパク質のチャネルドメインを含み、かつその制御ドメインを機能しうる形で含まないIP3受容体変異体タンパク質；
２． IP3受容体タンパク質がIP3受容体タイプ1タンパク質である、上記１記載のタンパク質；
３． 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、上記２記載のタンパク質；
(a) 配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも2216〜2749位、または2276〜2749位の配列を含み、かつ少なくとも第1〜1891位の配列は含まないタンパク質
(b) 上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質
４． 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、上記２記載のタンパク質；
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも第2222〜2695位の配列を含み、かつ少なくとも第１〜2221位の配列は含まないタンパク質
(b) 上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に、小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質
５． 上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子；
６． 上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも80％の相同性を有する核酸分子、またはこれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
７． 上記１〜４のいずれかに記載のIP3受容体変異体タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法；
８． 上記１〜４のいずれかに記載のIP3受容体変異体タンパク質を発現させた細胞内で、小胞体内のCa2+濃度が減少することを特徴とする、上記７記載の方法；
９． 上記５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、上記７または８記載の方法；
１０． 上記１〜４のいずれかに記載のタンパク質を、対象とする細胞で発現させる、上記７または８記載の方法；
１１． 上記５または６記載の核酸分子を含む、アポトーシス誘導薬；
１２． 上記５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させ、該細胞の小胞体内のCa2+濃度を減少させることを特徴とする、上記１０記載のアポトーシス誘導薬；
に関する。 From the above findings, the present invention provides the following aspects:
1. IP 3 comprises a channel domain of the receptor protein, and IP 3 receptor mutant protein without a form capable of functioning the control domain;
2. IP 3 receptor protein is an IP 3 receptor type 1 protein, the protein of claim 1, wherein the;
3. The protein according to 2 above, which is any one of the following proteins (a) or (b):
(a) a protein comprising at least positions 2216 to 2749 or 2276 to 2749 and not including at least positions 1 to 1891 among the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
(b) In the protein defined in (a) above, a protein having a sequence in which 1 to 60 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and when expressed in a mammalian cell, the endoplasmic reticulum 3. Protein that can induce Ca 2+ efflux from the cell to the cytoplasm The protein according to 2 above, which is any one of the following proteins (a) or (b):
(a) a protein comprising at least the 2222 to 2695th sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and not including at least the 1st to 2221th sequence
(b) In the protein defined in (a) above, a protein having a sequence in which 1 to 60 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and when expressed in a mammalian cell, a vesicle 4. Protein capable of inducing Ca 2+ efflux from the body to the cytoplasm A nucleic acid molecule encoding the protein according to any one of 1 to 4 above;
6). A nucleic acid molecule encoding the protein according to any one of 1 to 4 above, a nucleic acid molecule having at least 80% homology, or a nucleic acid molecule that hybridizes to these under stringent conditions;
7). A method for inducing apoptosis of the cell by expressing the IP 3 receptor mutant protein according to any one of the above 1 to 4 in a target cell;
8). 8. The method according to 7 above, wherein the Ca 2+ concentration in the endoplasmic reticulum decreases in a cell in which the IP 3 receptor mutant protein according to any one of 1 to 4 above is expressed;
9. The method according to 7 or 8 above, wherein the protein is expressed by introducing the nucleic acid molecule according to 5 or 6 above into a target cell;
10. The method according to 7 or 8 above, wherein the protein according to any one of 1 to 4 is expressed in a target cell;
11. An apoptosis inducer comprising the nucleic acid molecule according to 5 or 6 above;
12 10. The apoptosis according to 10 above, wherein the protein is expressed by introducing the nucleic acid molecule according to 5 or 6 above into a target cell and the Ca 2+ concentration in the endoplasmic reticulum of the cell is decreased. Inducer;
About.

以上より、本発明により、細胞内Ca2+ストアから細胞質へのCa2+の流出を誘導することにより細胞のアポトーシスを誘導するタンパク質、およびそれによるアポトーシス誘導方法が提供される。また、IP3受容体のチャネルドメインからなるアポトーシス誘導薬が提供される。 As described above, the present invention provides a protein that induces cell apoptosis by inducing Ca 2+ efflux from an intracellular Ca 2+ store into the cytoplasm, and an apoptosis induction method using the protein. Further, the apoptosis inducing agent is provided comprising a channel domain of the IP 3 receptor.

以下、本発明を具体的に説明する。   The present invention will be specifically described below.

IP3受容体は、4量体の細胞内IP3-誘導性Ca2+放出チャネル（IP3-gated Ca2+ release channel）である(3, 4)。哺乳動物では、3種の異なるサブタイプのIP3受容体が存在する(5-7)。いずれのサブタイプも、N末端近傍にIP3結合ドメイン、C末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら2つのドメインの間に制御ドメインが存在する(10, 11)。 IP 3 receptor, intracellular IP tetrameric 3 - inducible Ca 2+ release channels (IP 3 -gated Ca 2+ release channel ) (3, 4). In mammals, there are three different subtypes of IP 3 receptors (5-7). Both subtypes have an IP 3 binding domain near the N-terminus, a channel-forming domain with a 6-transmembrane region near the C-terminus, and a regulatory domain between these two domains (10, 11).

マウスIP3受容体タイプ1（IP3R1）では、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。N末端側（1〜610残基）がリガンド結合ドメインで、C末端側（2276〜2749残基）がチャネル形成ドメインであり、これらの間に制御ドメイン（611〜2275残基）が存在する。該タンパク質の1891残基と1892残基の間のペプチド結合は、カスパーゼ3特異的切断部位である。上述のとおり、カスパーゼ3切断断片がアポトーシスを促進することが報告されていることから、カスパーゼ3切断部位よりC末端側がアポトーシスの誘導に重要であると考えられる。 Mouse IP 3 receptor type 1 (IP 3 R1) has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The N-terminal side (residues 1 to 610) is a ligand binding domain, the C-terminal side (residues 2276 to 2749) is a channel-forming domain, and a regulatory domain (residues 611 to 2275) exists between them. The peptide bond between residues 1891 and 1892 of the protein is a caspase 3 specific cleavage site. As described above, since the caspase 3 cleavage fragment has been reported to promote apoptosis, the C-terminal side from the caspase 3 cleavage site is considered to be important for the induction of apoptosis.

この知見に基づいて、本発明者らは、アポトーシス誘導に関与するIP3受容体部位をさらに限定するために、マウスIP3R1のカスパーゼ3切断C末端側断片よりさらに短い、配列番号1に示すマウスIP3R1のアミノ酸配列のうち2216〜2749位の配列のみを含むタンパク質にGFPタグを付したもの(GFP-IP3R1-ES)を作製した。すなわち、該タンパク質は、IP3R1のC末端に存在するチャネルドメインとそのN末端側の制御ドメインのC末端配列60残基を含むものであり、これにはリガンド結合ドメインおよび制御ドメインは機能し得る形で含んまれていない。 Based on this finding, we show in SEQ ID NO: 1, which is even shorter than the caspase 3 cleaved C-terminal fragment of mouse IP 3 R1 to further limit the IP 3 receptor sites involved in apoptosis induction. A protein (GFP-IP 3 R1-ES) having a GFP tag attached to a protein containing only the positions 2216 to 2749 of the amino acid sequence of mouse IP 3 R1 was prepared. That is, the protein includes a C-terminal sequence of 60 residues of the channel domain present at the C-terminus of IP 3 R1 and its N-terminal regulatory domain, to which the ligand binding domain and the regulatory domain function. Not included in the form to get.

このGFP-IP3R1-ESを、細胞に強制発現させたところ、細胞の小胞体内におけるCa2+ストアからのCa2+の流出が起こり、小胞体内のCa2+濃度が低くなる。この小胞体内のCa2+濃度の低下により、細胞外から細胞質へのストア作動性Ca2+流入が起こる。これにより、IP3R1-ESを強制発現した細胞ではアポトーシスが誘導される。 The GFP-IP 3 R1-ES, was forced to express in the cell, occurs outflow of Ca 2+ from Ca 2+ store in the endoplasmic reticulum of cells, Ca 2+ concentration in the endoplasmic reticulum becomes lower. This decrease in Ca 2+ concentration in the endoplasmic reticulum causes store-operated Ca 2+ influx from the outside of the cell into the cytoplasm. Thereby, apoptosis is induced in cells in which IP 3 R1-ES is forcibly expressed.

IP3R1-ESはほぼチャネルドメインのみからなるものであり、N末端側の制御ドメイン由来の60残基は機能を有してはいない。IP3Rの制御ドメインは、リガンド結合ドメインへのIP3の結合を受けてチャネルドメインの何らかの立体構造変化を誘導してチャネルの開口をもたらすと考えられている。本明細書中、「制御ドメインを機能しうる形で含まない」とは、制御ドメインを構成するアミノ酸配列の全部を含まないか、または一部または全部を含むものの上記のようなリガンド結合部位によるチャネルドメインの開口を誘導するという制御ドメイン本来の機能を有していないことをいう。したがって、IP3R1-ESも、「制御ドメインを機能しうる形で含まない」IP3R1変異体タンパク質に含まれる。 IP 3 R1-ES is almost composed only of the channel domain, and 60 residues derived from the N-terminal control domain have no function. The IP 3 R regulatory domain is believed to undergo IP 3 binding to the ligand binding domain and induce some conformational change in the channel domain resulting in channel opening. In the present specification, “does not contain the regulatory domain in a functional manner” means that it does not contain all or part or all of the amino acid sequence constituting the regulatory domain, but depends on the ligand binding site as described above. It means that it does not have the original function of the control domain for inducing the opening of the channel domain. Thus, IP 3 R1-ES is also included in the IP 3 R1 variant protein “without functionally containing the regulatory domain”.

マウスIP3R1のアミノ酸配列のうち2276〜2749位のチャネルドメインを構成するアミノ酸配列のみを含むタンパク質も、IP3R1-ESと同様のアポトーシス誘導作用を示し得ることが当業者であれば容易に認識し得るであろう。さらに、これらのIP3R1の2216〜2749位、または2276〜2749位のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、アポトーシス誘導作用を有する。ここで、「機能的に同等なタンパク質」とは、上記アミノ酸配列において、1〜60、好ましくは1〜20、さらに好ましくは1〜10、特に好ましくは1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、IP3R1-ESと同様に哺乳動物細胞で発現させた場合、小胞体膜上に存在して小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質をいう。 A person skilled in the art can easily understand that a protein containing only the amino acid sequence constituting the channel domain from positions 2276 to 2749 in the amino acid sequence of mouse IP 3 R1 can also exhibit the apoptosis-inducing action similar to IP 3 R1-ES. Would be recognizable. Furthermore, proteins functionally equivalent to proteins containing the amino acid sequences of positions 2216 to 2749 or 2276 to 2749 of IP 3 R1 also have an apoptosis-inducing action. Here, the “functionally equivalent protein” means that 1 to 60, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5 amino acids are substituted or deleted in the above amino acid sequence. , a protein having an inserted or added in the sequence, when expressed in IP 3 R1-ES as well as mammalian cells, present on the endoplasmic reticulum membrane of Ca 2+ into the cytoplasm from the endoplasmic reticulum A protein that can induce efflux.

また、IP3受容体タイプ１に限らず、IP3受容体タイプ２およびタイプ３についても同様に、チャネルドメインを含み、かつ制御ドメインを機能し得る形で含まない変異体タンパク質は、アポトーシス誘導作用を有すると考えられるため、これらのタンパク質およびこれらと機能的に同等なタンパク質もまた本発明の範囲内である。 Further, not only for IP 3 receptor type 1, but also for IP 3 receptor types 2 and 3, a mutant protein that contains a channel domain and does not contain a regulatory domain in a functioning manner has an apoptosis-inducing action. These proteins and proteins functionally equivalent to these are also within the scope of the present invention.

また、あらゆる哺乳動物に由来するIP3受容体についても同様である。したがって、例えば配列番号２にアミノ酸配列を示すヒトIP3受容体タイプ１では、少なくとも第2222〜2695位の配列を含み、少なくとも第596〜2221位の配列は含まないタンパク質、およびこれに機能的に同等なタンパク質もまた、アポトーシス誘導作用を有する。 The same applies to IP 3 receptors derived from any mammal. Thus, for example, in the human IP 3 receptor type 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein containing at least a sequence of positions 2222-2695 and not including a sequence of at least positions 596-2221, and functionally therefor Equivalent proteins also have an apoptosis inducing action.

したがって、これらのタンパク質は全て本発明の範囲内にある。
また、これらのタンパク質をコードする核酸分子もまた本発明の範囲内である。本明細書中、「核酸分子」という用語は、DNAおよびRNAを含む。また、これらの核酸分子と少なくとも80％の相同性を有する核酸分子、好ましくはBLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、90％の相同性を有する核酸分子、さらに好ましくは95％の相同性を有する核酸分子、およびこれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明に含まれる。本明細書中「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、ナトリウム濃度が10mM〜300mMであり、好ましくは37〜65℃、より好ましくは42℃である条件でハイブリダイズすることをいう。 Therefore, all these proteins are within the scope of the present invention.
Nucleic acid molecules encoding these proteins are also within the scope of the present invention. As used herein, the term “nucleic acid molecule” includes DNA and RNA. Also, when calculated using nucleic acid molecules having at least 80% homology with these nucleic acid molecules, preferably BLAST, etc. (for example, using BLAST default or initial condition parameters), 90% Also included in the present invention are nucleic acid molecules having homology, more preferably nucleic acid molecules having 95% homology, and nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions thereto. In the present specification, “hybridizes under stringent conditions” means, for example, to hybridize under conditions where the sodium concentration is 10 mM to 300 mM, preferably 37 to 65 ° C., more preferably 42 ° C. Say.

さらに、上記の核酸分子を含むベクター、上記核酸分子が発現可能なように該核酸分子にプロモーターが機能し得る形で連結されているベクター、および上記核酸分子の発現産物を標識化するための何らかの標識物をコードする核酸分子と上記核酸分子がインフレームで連結されているベクター、さらにはこれらのベクターを含有する宿主細胞(哺乳動物細胞が好ましいが、これらに限定はされない)も、本発明に包含される。   Further, a vector containing the nucleic acid molecule, a vector in which a promoter is operably linked to the nucleic acid molecule so that the nucleic acid molecule can be expressed, and any label for labeling the expression product of the nucleic acid molecule A vector in which a nucleic acid molecule encoding a label and the above nucleic acid molecule are linked in frame, and a host cell containing these vectors (preferably, but not limited to, mammalian cells) are also included in the present invention. Is included.

本発明のタンパク質を発現させるためには、IP3受容体のアミノ酸配列に基づいて上記タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子を作製し、これを周知の遺伝子工学的手法を用いて、適切な発現ベクターに組込むとよい。アミノ酸配列に基づいて遺伝子を作製または単離する技法、および哺乳動物細胞での発現に適切な発現ベクターは、様々なものが公知であり、当業者であれば容易に適切なものを選択することができる。 In order to express the protein of the present invention, a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the protein is prepared based on the amino acid sequence of the IP 3 receptor, and this is expressed appropriately using a well-known genetic engineering technique. It is good to incorporate in a vector. Various techniques for producing or isolating genes based on amino acid sequences and expression vectors suitable for expression in mammalian cells are known, and those skilled in the art can easily select appropriate ones. Can do.

対象とする細胞に該発現ベクターを導入して、該細胞で上記遺伝子を発現させるための種々の方法も知られている。   Various methods for introducing the expression vector into a target cell and expressing the gene in the cell are also known.

IP3R1が細胞の小胞体膜上に存在するためには、チャネルドメインのみが必要十分であることを本発明者らは見い出しており、少なくともチャネルドメインを含む上記IP3受容体変異体タンパク質を細胞で強制発現させた場合、該変異体タンパク質は小胞体膜上に局在する。該変異体タンパク質は、制御ドメインを欠くため、正常なIP3受容体の立体構造をとることができず、チャネルが完全に閉口せず、小胞体内のCa2+を細胞質へと流出させ、細胞をアポトーシスへと導くと考えられる。 The present inventors have found that in order for IP 3 R1 to be present on the endoplasmic reticulum membrane of a cell, only the channel domain is necessary and sufficient, and the above IP 3 receptor mutant protein containing at least the channel domain is identified. When forcedly expressed in cells, the mutant protein is localized on the endoplasmic reticulum membrane. Since the mutant protein lacks the regulatory domain, it cannot adopt the normal IP 3 receptor conformation, the channel is not completely closed, and Ca 2+ in the endoplasmic reticulum is released into the cytoplasm, It is thought to lead cells to apoptosis.

すなわち、上述のタンパク質は細胞のアポトーシス誘導薬として有用である。アポトーシス誘導薬は、細胞増殖性疾患の治療に有用である。   That is, the above-mentioned protein is useful as a cell apoptosis inducer. Apoptosis-inducing drugs are useful for the treatment of cell proliferative diseases.

細胞増殖性疾患とは、特定の細胞種が異常増殖することにより発症する疾患であり、皮膚T細胞増殖性疾患、血管平滑筋細胞増殖性疾患、骨芽細胞増殖性疾患、眼内細胞増殖性疾患、甲状腺の細胞増殖性疾患等を含む各種腫瘍および慢性関節リウマチ（RA）などが挙げられるが、これらに限定はされない。   A cell proliferative disorder is a disease that develops when a specific cell type proliferates abnormally, and is a skin T cell proliferative disorder, vascular smooth muscle cell proliferative disorder, osteoblast proliferative disorder, or intraocular cell proliferative disorder. Examples include, but are not limited to, various tumors including diseases, thyroid cell proliferative diseases, and rheumatoid arthritis (RA).

かかる細胞増殖性疾患において、増殖する細胞をアポトーシスにより死滅させる治療が該疾患において有効であり得る。   In such cell proliferative diseases, a treatment that kills proliferating cells by apoptosis may be effective in the disease.

上記アポトーシス誘導薬としてのIP3受容体変異体タンパク質をコードする遺伝子を、所望の細胞内で該タンパク質を発現し得る形で導入することにより、所望の細胞のアポトーシスを誘導し得る。IP3R受容体変異体タンパク質をコードする遺伝子が所望の細胞でのみ発現し得るように、該細胞種に特異的な発現プロモーター等の調節因子を上記遺伝子に機能し得る形で連結した発現カセットを含むベクターを用いて、対象とする生物個体に導入することができる。これらの方法は、種々のものが既に公知であり、いずれの方法を使用することも可能であるが、例えばアデノウイルス等を用いることができる。細胞種特異的な発現プロモーターも個々の細胞種について様々なものが公知であり、当業者であれば適切なものを選択することは容易である。 By introducing a gene encoding the IP 3 receptor mutant protein as the apoptosis inducer in a form capable of expressing the protein in the desired cell, apoptosis of the desired cell can be induced. An expression cassette in which a regulatory factor such as an expression promoter specific to the cell type is operably linked to the gene so that the gene encoding the IP 3 R receptor mutant protein can be expressed only in a desired cell. Can be introduced into a target organism. Various methods are already known, and any method can be used. For example, adenovirus can be used. Various cell type-specific expression promoters are known for individual cell types, and those skilled in the art can easily select an appropriate promoter.

例えば、IP3受容体変異体タンパク質をコードするDNAを上記治療薬として使用する場合は、本発明のDNAを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴性ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常法に従って、患者に投与することができる。該DNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。また、DNAを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は当業者であれば適当な用量がわかるであろう。 For example, when DNA encoding an IP 3 receptor mutant protein is used as the therapeutic agent, the DNA of the present invention alone or a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus-associated virus vector, etc. Can be administered to patients according to conventional methods. The DNA can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting intake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, as needed, or aseptic solutions or suspensions with water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections. In addition, by mixing DNA with known carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., which are generally recognized physiologically, in unit dosage forms required for the practice of approved formulations. Can be manufactured. Appropriate doses will be known to those skilled in the art for the amount of active ingredient in these formulations.

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなビヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート80TM、HCO-50）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, you may use together with alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™ , HCO-50), and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

また、上記治療薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。   The therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin). , Polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.

投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより相違し、対象とする患者の健康状態、体重、併用する治療方法等の条件によって、個別に担当医によって決定される。   The dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, and is individually determined by the attending physician depending on conditions such as the health condition, body weight, and treatment method used in combination.

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を例示として記載する。   Hereinafter, in order to help understanding of the present invention, examples will be described as examples.

GFPタグを付したIP 3 受容体タイプ1変異体DNAの構築とその発現
IP3受容体タイプ1の1892残基よりC末端側のアミノ酸配列のみからなるペプチドのN末端側にグリーン蛍光タンパク質EGFPを付したIP3受容体タイプ1変異体（GFP-IP3R1-casp）、および、IP3受容体タイプ1の2216残基よりC末端側のアミノ酸配列のみからなるペプチドのN末端側にグリーン蛍光タンパク質EGFPを付加したIP3受容体タイプ1変異体（GFP-IP3R1-ES）を作製した。 Construction and expression of IP 3 receptor type 1 mutant DNA tagged with GFP tag
IP 3 receptor type 1 mutant (GFP-IP 3 R1-casp) with green fluorescent protein EGFP attached to the N-terminal side of a peptide consisting only of the amino acid sequence C-terminal to 1892 residues of IP 3 receptor type 1 and, IP 3 IP 3 that the N-terminal side of the receptor type 1 of 2216 residues from consisting only the amino acid sequence of the C-terminal side peptide obtained by adding a green fluorescent protein EGFP receptor type 1 mutant (GFP-IP 3 R1 -ES).

まず、マウスIP3R1をコードするcDNAを、Pfu turbo（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて常法に従ってPCRにより増幅した。該cDNA断片とEGFPのコード配列（Clontech, Palo Alto, CA）とを、pcDNA3.1/Zeo+（Invitrogen,Carlsbad,CA）内にEGFPcDNAがIP3R1cDNAの上流に位置するようにサブクローニングし、GFP-IP3R1-N発現ベクターを得た。該ベクター内ではEGFPcDNAとIP3R1cDNAとの間にリンカーとしてLeu-Lys（AflII制限酵素認識配列に含まれる）が挿入されている。GFP-IP3R1-Cは、EGFP分子がIP3R1のC末端側に付加されており、同様の方法で、GFP-IP3R1-C発現ベクターも作製することができる。IP3R1cDNAとEGFPcDNAとの間にリンカーとしてGly-Pro-Alaが挿入されている。 First, a cDNA encoding mouse IP 3 R1 was amplified by PCR using Pfu turbo (Stratagene, La Jolla, Calif.) According to a conventional method. Subclone the cDNA fragment and the EGFP coding sequence (Clontech, Palo Alto, CA) into pcDNA3.1 / Zeo + (Invitrogen, Carlsbad, CA) so that the EGFP cDNA is located upstream of the IP 3 R1 cDNA. An IP 3 R1-N expression vector was obtained. In the vector, Leu-Lys (included in the AflII restriction enzyme recognition sequence) is inserted as a linker between EGFP cDNA and IP 3 R1 cDNA. GFP-IP 3 R1-C is, EGFP molecules are added to the C-terminal side of the IP 3 R1, in a similar manner, GFP-IP 3 R1-C expression vector can also be produced. Gly-Pro-Ala is inserted as a linker between IP 3 R1 cDNA and EGFP cDNA.

さらに、上記GFP-IP3R1-N発現ベクターからIP3R1の1〜610残基をコードする配列部位をAflII/SacII消化により切り出し、そこにGly-Ser-Ser-Glyをコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、GFP-IP3R1-610発現ベクターを得た。さらに、上記GFP-IP3R1-N発現ベクターからIP3R1の1〜2216残基をコードする配列部位をAflII/EcoRI消化により切り出し、そこにGlu-Pheをコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、GFP-IP3R1-ES発現ベクターを得た。さらに、IP3R1のArg1892〜Glu2216アミノ酸配列をコードするcDNA断片をPCRにより増幅させて、上記GFP-IP3R1-ES発現ベクターのEcoRI部位に挿入することにより、GFP-IP3R1-casp発現ベクターを得た。図１Ａ参照のこと。 Furthermore, an oligonucleotide linker encoding Gly-Ser-Ser-Gly was excised from the GFP-IP 3 R1-N expression vector by sequencing AflII / SacII digestion of the sequence site encoding residues 1 to 610 of IP 3 R1. Was inserted to obtain a GFP-IP 3 R1-610 expression vector. In addition, the sequence site encoding residues 1 to 2216 of IP 3 R1 was excised from the GFP-IP 3 R1-N expression vector by AflII / EcoRI digestion, and an oligonucleotide linker encoding Glu-Phe was inserted therein. A GFP-IP 3 R1-ES expression vector was obtained. Furthermore, a cDNA fragment encoding the Arg1892 to Glu2216 amino acid sequence of IP 3 R1 was amplified by PCR and inserted into the EcoRI site of the GFP-IP 3 R1-ES expression vector to express GFP-IP 3 R1-casp. Got vector. See FIG. 1A.

50μg/mlポリリジンでコートしたガラスカバースリップ（直径18mm）またはガラス底マイクロウェルディッシュ（直径35mm、コーティングなし）上で細胞を増殖させ、リポフェクトアミン2000溶液（Invitorgen）を説明書の指示どおりの方法で、上記発現ベクターをHeLa細胞に一過性にトランスフェクトして、その細胞溶解液を抗IP3R1モノクローナル抗体18A10（IP3R1のC末端部を認識する）(14)を用いたウェスタンブロットにより各発現タンパク質の分子量を検定したところ、いずれも予想どおりの分子量を有することが確認された(図１Ｂ)。さらに、抗GFP抗体(Santa Cruz CA)によるウェスタンブロットの結果でも同様であった(図１Ｃ)。 Grow cells on glass cover slips (18 mm diameter) or glass bottom microwell dishes (35 mm diameter, uncoated) coated with 50 μg / ml polylysine and use Lipofectamine 2000 solution (Invitorgen) as directed The above expression vector was transiently transfected into HeLa cells, and the cell lysate was Western blotted using anti-IP 3 R1 monoclonal antibody 18A10 (recognizes the C-terminal part of IP 3 R1) (14). When the molecular weight of each expressed protein was assayed by the above, it was confirmed that all of the expressed proteins had the expected molecular weight (FIG. 1B). Furthermore, the result of Western blotting with an anti-GFP antibody (Santa Cruz CA) was the same (FIG. 1C).

なお、本明細書中に開示する実施例中の細胞培養では、COS細胞およびHeLa細胞は、10％ウシ胎児血清（FCS）、1.0g/lグルコース、2mM L-グルタミン、ペニシリンストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて行い、培養は37℃、5％CO2湿潤環境下で行った。 In the cell culture in the examples disclosed in the present specification, COS cells and HeLa cells are 10% fetal calf serum (FCS), 1.0 g / l glucose, 2 mM L-glutamine, penicillin streptomycin-containing Dulbecco's modified Eagle. The culture was performed using a medium (DMEM), and the culture was performed in a 37 ° C., 5% CO 2 humid environment.

Ca 2+ イメージング
次に、これらのIP3R1変異体を強制発現させたHela細胞を用いて、シングルセルCa2+イメージングを実施した。 Ca 2+ Imaging Next, single cell Ca 2+ imaging was performed using Hela cells in which these IP 3 R1 mutants were forcibly expressed.

トランスフェクションの１〜２日後、HeLa細胞を5μM fura-2アセトキシメチルエステル(Molecular Probe)で45分間処理し、fura-2をロードした細胞を倒立蛍光顕微鏡(IX-70、オリンパス社製)にセットし、平衡塩類溶液(BSS；115mM NaCl、5.4mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM グルコースおよび20mM HEPES(pH7.4)を2.0ml/分の流速で灌流させた。画像処理は、Argus50/CA(浜松フォトニクス社製)を用いて、室温にて340nmと380nmとで交互に励起して、それぞれの励起に対する蛍光イメージを取得した。細胞は、100μM ATPおよびタプシガルジン(TG)それぞれで刺激して、その際の蛍光比率(F340/F380)の変化を観察した。結果を図２に示す。 One to two days after transfection, HeLa cells were treated with 5 μM fura-2 acetoxymethyl ester (Molecular Probe) for 45 minutes, and cells loaded with fura-2 were set in an inverted fluorescence microscope (IX-70, Olympus) Then, a balanced salt solution (BSS; 115 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM glucose and 20 mM HEPES (pH 7.4) was perfused at a flow rate of 2.0 ml / min. Using CA / CA (Hamamatsu Photonics), excitation was performed alternately at 340 nm and 380 nm at room temperature, and fluorescence images for each excitation were obtained.The cells were stimulated with 100 μM ATP and thapsigargin (TG), respectively. The change in the fluorescence ratio (F340 / F380) at that time was observed, and the results are shown in FIG.

GFP-IP3R1-NおよびGFP-IP3R1-D610は、ATP誘導性およびTG誘導性のCa2+流入にはほとんど影響を与えなかった(図２Ａ、Ｂ)。一方、GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESはATP-誘導性およびTG誘導性Ca2+流入の両方とも応答が減少した(図２Ｃ、Ｄ)。GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESの発現量の増加に従って、減少が顕著であった。 GFP-IP 3 R1-N and GFP-IP 3 R1-D610 had little effect on ATP-induced and TG-induced Ca 2+ influx (FIG. 2A, B). On the other hand, GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1-ES had reduced responses for both ATP-induced and TG-induced Ca 2+ influx (FIGS. 2C, D). The decrease was remarkable as the expression levels of GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1-ES increased.

COS細胞を用いて同様の実験を行った場合も、同様の結果を示した(データは示していない)。
この機序を探るために、さらに実験を行った。 Similar results were obtained when COS cells were used (data not shown).
Further experiments were conducted to explore this mechanism.

各種IP3R1変異体を発現させたCOS細胞のTG誘導性のCa2+ストアからのCa2+の漏出およびこれに伴うストア作動性Ca2+流入を調べた。GFP-IP3R1-NおよびGFP-IP3R1-D610を発現させた細胞は、TGの誘導によるCa2+ストアからのCa2+の漏出およびストア作動性Ca2+の流入ともにほとんど影響を示さなかったが、GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESを発現させた細胞では、TG処理による細胞内Ca2+濃度の上昇がほとんど認められなかった。しかし、細胞外Ca2+濃度を上げた際のストア作動性Ca2+の流入は明らかに認められた(図３Ｃ、Ｄ)。この現象は、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESを発現させた細胞の小胞体内のCa2+濃度が低すぎ、すなわち小胞体のCa2+ストアが枯渇した状態にあり、TG刺激による細胞内Ca2+濃度の上昇が認められないことを示唆するものである。 It was investigated leakage and store-operated Ca 2+ entry associated therewith of Ca 2+ from various IP 3 R1 TG-induced Ca 2+ store COS cells expressing mutant. GFP-IP 3 R1-N and GFP-IP 3 R1-D610 cells expressing the little effect on the inflow both the leakage and store-operated Ca 2+ of Ca 2+ from Ca 2+ store by induction of TG Although not shown, in the cells expressing GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1-ES, an increase in intracellular Ca 2+ concentration due to TG treatment was hardly observed. However, store-operated Ca 2+ influx was clearly observed when the extracellular Ca 2+ concentration was increased (FIGS. 3C and D). This phenomenon is due to the fact that the Ca 2+ concentration in the ER of cells expressing GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES is too low, that is, the Ca 2+ store in the ER is depleted. There is no suggestion of an increase in intracellular Ca 2+ concentration by TG stimulation.

このことをさらに証明するために、TGによる前処理を行わずに、細胞外Ca2+濃度を変化させてCa2+の流入を観察した(図４)。GFP-IP3R1-NまたはGFP-IP3R1-D610を発現させた細胞では、細胞内Ca2+濃度は細胞外Ca2+濃度に影響されることなくほぼ安定していたのに対し(図４Ａ、Ｂ)、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESを発現させた細胞では、細胞外Ca2+の除去に伴い細胞内Ca2+濃度が低下し、細胞外Ca2+の増加とともに細胞内Ca2+濃度が上昇した(図４Ｃ、Ｄ)。 To further prove this, Ca 2+ influx was observed by changing the extracellular Ca 2+ concentration without pretreatment with TG (FIG. 4). In cells expressing GFP-IP 3 R1-N or GFP-IP 3 R1-D610, the intracellular Ca 2+ concentration was almost stable without being affected by the extracellular Ca 2+ concentration ( 4A and B), in cells expressing GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES, the intracellular Ca 2+ concentration decreases with the removal of extracellular Ca 2+ , and extracellular Ca 2+ decreases. The intracellular Ca 2+ concentration increased with the increase of 2+ (FIGS. 4C and D).

これらの結果より、GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESはいずれも、小胞体内のCa2+ストアからCa2+を漏洩させていると考えられる。GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESは、Ca2+ストア内のCa2+量が低下し、細胞外から細胞質内へのストア作動性カルシウム流入が起こり、その状態が維持されると考えられる。 From these results, it is considered that both GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1-ES leak Ca 2+ from the Ca 2+ store in the endoplasmic reticulum. GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1-ES is to decrease Ca 2+ content in the Ca 2+ store, occur store-operated calcium influx from the extracellular into the cytoplasm, the state is maintained It is thought that it is done.

GFP-IP 3 R1-caspおよびGFP-IP 3 R1-ESによる細胞死
次いで、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESによる細胞死の誘導を調べた。GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESをトランスフェクションした後、96時間後におけるGFPの蛍光を発する細胞を計測し、GFPのみを発現させたコントロールHeLa細胞の生存率を100％として細胞生存率を算出した（図５）。 Cell death by GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1-ES Subsequently, induction of cell death by GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES was examined. After transfection with GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES, 96 hours later, cells that emit GFP fluorescence were counted, and the survival rate of control HeLa cells expressing only GFP was 100% The cell viability was calculated as (FIG. 5).

GFP-IP3R1-caspおよびGFP-IP3R1-ESのいずれを発現させた細胞でも、細胞死の誘導が顕著に認められた。この結果は、IP3R1のチャネルドメインのみの変異体がアポトーシスを誘導することを示唆するものである。 Induction of cell death was remarkably observed in cells expressing either GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES. This result suggests that a mutant of only the IP 3 R1 channel domain induces apoptosis.

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図１は、GFPタグを付したマウスIP3R1構築物の構造（Ａ）およびその発現産物のサイズ（ＢおよびＣ）を示す。A中、LBDはリガンド結合ドメインを示す。抗IP3R1モノクローナル抗体18A10によって認識されるエピトープ部位は、C末端部分である。BおよびCは、HeLa細胞で各GFP-IP3R1変異体を発現させ、その細胞溶解液を、それぞれ抗体18A10および抗GFP抗体によるウェスタンブロット（5％ゲルSDS-PAGE）に供した結果である。レーン１はコントロールベクター、レーン２はGFP-IP3R1-Nの発現プラスミド、レーン３はGFP-IP3R1-C、レーン４はGFP-IP3R1-D610、レーン５はGFP-GFP-R1-caspおよびレーン6はGFP-IP3R1-ESである。ネイティブなIP3R1の位置を星印で示している（Ｂ）。FIG. 1 shows the structure (A) of the mouse IP 3 R1 construct tagged with the GFP tag and the size of the expression product (B and C). In A, LBD represents a ligand binding domain. The epitope site recognized by the anti-IP 3 R1 monoclonal antibody 18A10 is the C-terminal part. B and C are the results of expressing each GFP-IP 3 R1 mutant in HeLa cells and subjecting the cell lysate to Western blot (5% gel SDS-PAGE) with antibody 18A10 and anti-GFP antibody, respectively. . Lane 1 is a control vector, Lane 2 is a GFP-IP 3 R1-N expression plasmid, Lane 3 is GFP-IP 3 R1-C, Lane 4 is GFP-IP 3 R1-D610, Lane 5 is GFP-GFP-R1 -casp and lane 6 are GFP-IP 3 R1-ES. The position of native IP 3 R1 is indicated by an asterisk (B).

図２は、各GFP-IP3R1変異体を発現させたHela細胞のATPおよびTGに対する細胞内Ca2+濃度の変化を調べた結果である。ＡおよびＢ中、細い実線は、各GFP-IP3R1変異体を発現させていないHela細胞（コントロール）であり、太い実線は、それぞれGFP-IP3R1-N、GFP-IP3R1-D610、をそれぞれに発現させたHela細胞である。また、ＣおよびＤ中、細い実線は、各GFP-IP3R1変異体を発現させていないHela細胞（コントロール）であり、太い実線は、それぞれGFP-IP3R1-casp、GFP-IP3R1-ESを低発現した細胞、破線はそれぞれを高発現した細胞である。発現レベルは、470〜490nmで励起しGFPによる510〜550nmの蛍光強度を指標に判断した。GFPの蛍光画像（左上のパネル）中、高発現細胞を棒付き矢印、低発現細胞を矢羽印で示している。星印はGFP-IP3R1変異体の局在が正常でないか、または凝集しているものを示す。Ｅは、Ａ〜Ｄの結果をグラフ化したものである。同じ実験を4回繰り返して実施したが同様の結果が得られた。FIG. 2 shows the results of examining changes in intracellular Ca 2+ concentration with respect to ATP and TG in Hela cells expressing each GFP-IP 3 R1 mutant. In A and B, thin solid lines are Hela cells (control) not expressing each GFP-IP 3 R1 mutant, and thick solid lines are GFP-IP 3 R1-N and GFP-IP 3 R1-D610, respectively. , Hela cells expressing each of. In C and D, thin solid lines are Hela cells (control) that do not express each GFP-IP 3 R1 mutant, and thick solid lines are GFP-IP 3 R1-casp and GFP-IP 3 R1 respectively. -ES cells with low expression and broken lines are cells with high expression. The expression level was determined by using excitation at 470 to 490 nm and fluorescence intensity of 510 to 550 nm by GFP as an index. In the fluorescence image of GFP (upper left panel), high-expressing cells are indicated by arrows with sticks, and low-expressing cells are indicated by arrows. An asterisk indicates that the GFP-IP3R1 mutant is not normally localized or aggregated. E is a graph of the results of A to D. The same experiment was repeated four times with similar results.

図３は、各GFP- P3R1変異体を発現させたHeLa細胞のTGに対する応答および続いて細胞外Ca2+濃度を上昇させた場合のCa2+の流入を調べた結果を示す。GFP-IP3R1-N、GFP-P3R1-D610、GFP-IP3R1-casp、GFP-IP3R1-ESをそれぞれ発現するHeLa細胞（Ａ〜Ｄ：Ca2+不含BSS中）を10分間0.3μMのTGで処理し、その後TGを含まない2mMCa2+含有BSSで処理した。細い実線はGFP-IP3R1変異体を発現させてない細胞（コントロール）、太い実線は各GFP-IP3R1変異体を発現させたものを示す。それぞれ12〜14個の細胞について観察された平均を示す。同じ実験を3回繰り返し実施したが、同様の結果が得られた。FIG. 3 shows the results of examining the response of HeLa cells expressing each GFP-P 3 R1 mutant to TG and subsequently the influx of Ca 2+ when the extracellular Ca 2+ concentration was increased. HeLa cells expressing GFP-IP 3 R1-N, GFP-P 3 R1-D610, GFP-IP 3 R1-casp, and GFP-IP 3 R1-ES (AD, in Ca 2 + -free BSS) Was treated with 0.3 μM TG for 10 min, followed by treatment with 2 mM Ca2 + -containing BSS without TG. The thin solid line shows cells not expressing the GFP-IP 3 R1 mutant (control), and the thick solid line shows each GFP-IP 3 R1 mutant expressed. Shown are the averages observed for 12-14 cells each. The same experiment was repeated three times with similar results.

図４は、各GFP-IP3R1変異体を発現させたHeLa細胞の細胞外Ca2+濃度の変化に対する細胞質内へのCa2+の流入について調べた結果を示す。細胞を2mMCa2+含有BSSからCa2+不含BSSに培地交換し、さらにその10分後に再度2mMCa2+含有BSSに培地交換した。その際のFura-2によるF340/380の蛍光変化を図に示している。細い実線はGFP-IP3R1変異体を発現させてない細胞（コントロール）、太い実線はGFP-IP3R1-N、GFP-IP3R1-D610、GFP-IP3R1-casp、GFP-IP3R1-ESをそれぞれ発現させたHeLa細胞（Ａ〜Ｄ）を示す。それぞれ10〜14個の細胞について観察された平均を示す。同じ実験を3回繰り返し実施したが、同様の結果が得られた。FIG. 4 shows the results of examining Ca 2+ influx into the cytoplasm with respect to changes in extracellular Ca 2+ concentration in HeLa cells expressing each GFP-IP3R1 mutant. The cells were changed from 2 mMCa2 + -containing BSS to Ca2 + -free BSS, and further 10 minutes later, the medium was changed again to 2 mMCa2 + -containing BSS. The change in fluorescence of F340 / 380 by Fura-2 at that time is shown in the figure. Thin solid lines are cells that do not express GFP-IP 3 R1 mutant (control), thick solid lines are GFP-IP 3 R1-N, GFP-IP 3 R1-D610, GFP-IP 3 R1-casp, GFP-IP 3 shows HeLa cells (AD) expressing R1-ES, respectively. Shown are the averages observed for 10-14 cells each. The same experiment was repeated three times with similar results.

図５は、GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESによる細胞死の誘導を確認した結果を示す。GFP-IP3R1-caspまたはGFP-IP3R1-ESを一過性発現させたHeLa細胞について、トランスフェクション後96時間におけるGFPの蛍光を発する細胞を計測し、GFPのみを発現させたコントロールHeLa細胞の生存率を100％として細胞生存率を算出した。FIG. 5 shows the results of confirming the induction of cell death by GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES. For HeLa cells transiently expressing GFP-IP 3 R1-casp or GFP-IP 3 R1-ES, cells that emit GFP fluorescence 96 hours after transfection were counted, and control HeLa that expressed only GFP The cell viability was calculated with the cell viability as 100%.

Claims (12)

IP3受容体タンパク質のチャネルドメインを含み、かつその制御ドメインを機能しうる形で含まないIP3受容体変異体タンパク質。 IP 3 comprises a channel domain of the receptor protein, and IP 3 receptor mutant protein without a form capable of functioning the control domain. IP3受容体タンパク質がIP3受容体タイプ1タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。 IP 3 receptor protein is an IP 3 receptor type 1 protein of claim 1, wherein the protein. 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。
(a) 配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも2216〜2749位、または2276〜2749位の配列を含み、かつ少なくとも第1〜1891位の配列は含まないタンパク質
(b) 上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質 The protein according to claim 2, wherein the protein is any one of the following (a) and (b).
(a) a protein comprising at least positions 2216 to 2749 or 2276 to 2749 and not including at least positions 1 to 1891 among the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
(b) In the protein defined in (a) above, a protein having a sequence in which 1 to 60 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and when expressed in a mammalian cell, the endoplasmic reticulum That can induce Ca 2+ efflux from the cell to the cytoplasm 以下の(a)または(b)のいずれかのタンパク質である、請求項２記載のタンパク質。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも第2222〜2695位の配列を含み、かつ少なくとも第１〜2221位の配列は含まないタンパク質
(b) 上記(a)に規定するタンパク質において、1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に、小胞体内から細胞質へのCa2+の流出を誘導することができるタンパク質 The protein according to claim 2, wherein the protein is any one of the following (a) and (b).
(a) a protein comprising at least the 2222 to 2695th sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and not including at least the 1st to 2221th sequence
(b) In the protein defined in (a) above, a protein having a sequence in which 1 to 60 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and when expressed in a mammalian cell, a vesicle Protein that can induce Ca 2+ efflux from the body to the cytoplasm 請求項１〜４のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。   A nucleic acid molecule encoding the protein according to any one of claims 1 to 4. 請求項１〜４のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも80％の相同性を有する核酸分子、およびこれらにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。   A nucleic acid molecule encoding the protein according to any one of claims 1 to 4, a nucleic acid molecule having at least 80% homology, and a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions thereto. 請求項１〜４のいずれか1項に記載のIP3受容体変異体タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法。 A method for inducing apoptosis of a cell by expressing the IP 3 receptor mutant protein according to any one of claims 1 to 4 in a target cell. 請求項１〜４のいずれか1項に記載のIP3受容体変異体タンパク質を発現させた細胞内で、小胞体内のCa2+濃度が減少することを特徴とする、請求項７記載の方法。 The Ca 2+ concentration in the endoplasmic reticulum decreases in a cell in which the IP 3 receptor mutant protein according to any one of claims 1 to 4 is expressed. Method. 請求項５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、請求項７または８記載の方法。   The method according to claim 7 or 8, wherein the protein is expressed by introducing the nucleic acid molecule according to claim 5 or 6 into a target cell. 請求項１〜４のいずれか1項に記載のタンパク質を、対象とする細胞で発現させる、請求項７または８記載の方法。   The method according to claim 7 or 8, wherein the protein according to any one of claims 1 to 4 is expressed in a target cell. 請求項５または６記載の核酸分子を含む、アポトーシス誘導薬。   An apoptosis inducer comprising the nucleic acid molecule according to claim 5 or 6. 請求項５または６記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させ、該細胞の小胞体内のCa2+濃度を減少させることを特徴とする、請求項１１記載のアポトーシス誘導薬。 The nucleic acid molecule according to claim 5 or 6 is introduced into a target cell to express the protein, thereby reducing the Ca 2+ concentration in the endoplasmic reticulum of the cell. Apoptosis inducer.
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