JP2005052034A - Method for analyzing ethanolamine-containing phospholipid and composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素法によるエタノールアミン含有リン脂質の分析方法および分析用試薬に関する。 The present invention relates to a method for analyzing ethanolamine-containing phospholipids by an enzymatic method and an analytical reagent.
リン脂質の1種であるエタノールアミン含有リン脂質は、食品素材や血液等の生体中に幅広く存在している。このリン脂質含量や濃度を分析する方法は古くからシリカゲルやアルミナ等を支持体とする薄層クロマトグラフィー操作でリン脂質を予め分離した後、リン脂質を発色させその程度により濃度を測定する方法、HPLC法による方法や酵素を用いた測定法が知られている(非特許文献1)が、酵素による発色反応時間が15分と長くその短時間化が望まれていた。
本発明の目的は、被験液中のエタノールアミン含有リン脂質を短時間で簡便に精度良く分析する酵素的分析方法、ならびに該方法に使用するエタノールアミン含有リン脂質分析用試薬を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an enzymatic analysis method for analyzing ethanolamine-containing phospholipids in a test solution easily and accurately in a short time, and an ethanolamine-containing phospholipid analysis reagent used in the method. .
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者は多方面から鋭意検討した結果、被験液をリン脂質加水分解酵素であるホスフォリパーゼとエタノールアミンに作用する酵素を用いることにより簡便で精度よく糖化リン脂質を分析できる方法を考案し本発明を完成させた。 The present invention has been made in order to achieve the above object, and as a result of extensive studies by the present inventors, an enzyme that acts on phospholipase, which is a phospholipid hydrolase, and ethanolamine as a test solution. A simple method for analyzing glycated phospholipids was devised and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、
1) 少なくともホスフォリパーゼとチラミンオキシダーゼを用いることを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
2)少なくともチラミンオキシダーゼを含有する第1試薬(R1)にエタノールアミン含有リン脂質を含有する被験液を加えて反応を行った後、少なくともエタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素を含有する第二試薬(R2)を添加して反応を行なうことを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
3)エタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼDである請求項1記載のエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
4)少なくともホスフォリパーゼとチラミンオキシダーゼを含有することを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
5)少なくともチラミンオキシダーゼを含有する第1試薬(R1)と少なくともエタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素を含有する第二試薬(R2)から構成することを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
6)エタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼDである請求項4記載のエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物に関する。
That is, the present invention
1) Analytical method of ethanolamine-containing phospholipid characterized by using at least phospholipase and tyramine oxidase 2) A test solution containing ethanolamine-containing phospholipid in the first reagent (R1) containing at least tyramine oxidase In addition, after the reaction is performed, the reaction is performed by adding the second reagent (R2) containing at least an enzyme that hydrolyzes the ethanolamine-containing phospholipid, and the reaction is performed 3) The method for analyzing an ethanolamine-containing phospholipid according to
以下、本発明の好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に用いるホスフォリパーゼはエタノールアミン含有リン脂質を加水分解できる酵素であればよい。リン脂質を加水分解する酵素としてホスフォリパーゼA、B、C、Dが知られておりこれらの酵素は動植物、微生物等自然界に幅広く存在している。エタノールアミン含有リン脂質を測定するためにこれらのいずれの酵素を使用できるが試薬原料としてはホスフォリパーゼCあるいはホスフォリパーゼDが好ましく特にホスフォリパーゼDが好ましい。本酵素はキャベツ、ピーナッツ、人参等の植物組織や放線菌等の微生物に存在していることが知られ、そのいずれの酵素を使用することができるが、酵素自身の安定性、酵素の安定供給の面から微生物由来の酵素が好ましい。中でも放線菌の1種であるストレプトマイセス・クロモフスクス由来のホスフォリパーゼDが反応性、安定性に優れており特に好ましい。本ホスフォリパーゼDはエタノールアミン含有リン脂質以外のホスファチジルコリン(レシチン)、リゾレシチン、ホスファチジルセリン等のリン脂質に幅広く作用する性質を有するがエタノールアミン含有リン脂質を分析する上では全く問題は生じない。この酵素の試薬中での濃度は0.05から100単位/ml、好ましくは0.5から50単位/mlである。なお酵素の活性は基質ホスファチジルコリンを37℃1分間に1マイクロモル分解する活性を1単位とした。
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail.
The phospholipase used in the present invention may be any enzyme that can hydrolyze ethanolamine-containing phospholipids. Phospholipases A, B, C, and D are known as enzymes that hydrolyze phospholipids, and these enzymes are widely present in nature such as animals and plants and microorganisms. Any of these enzymes can be used to measure ethanolamine-containing phospholipids, but the reagent raw material is preferably phospholipase C or phospholipase D, and particularly preferably phospholipase D. This enzyme is known to exist in plant tissues such as cabbage, peanuts, carrots, and microorganisms such as actinomycetes, and any of these enzymes can be used, but the stability of the enzyme itself, the stable supply of the enzyme From this aspect, an enzyme derived from a microorganism is preferred. Among them, phospholipase D derived from Streptomyces chromofuscus, which is one of actinomycetes, is particularly preferable because of its excellent reactivity and stability. This phospholipase D has a property of acting widely on phospholipids such as phosphatidylcholine (lecithin), lysolecithin, phosphatidylserine and the like other than ethanolamine-containing phospholipids, but there is no problem in analyzing ethanolamine-containing phospholipids. The concentration of the enzyme in the reagent is 0.05 to 100 units / ml, preferably 0.5 to 50 units / ml. The activity of the enzyme was defined as 1 unit of activity of decomposing the substrate phosphatidylcholine by 1 micromole per minute at 37 ° C.
本発明に使用しうるエタノールアミンに作用する酵素としては、エタノールアミンに作用する酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、例えばオキシダーゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。中でもオキシダーゼは良く知られており、産業用に製造されていることから安価に入手することが可能であり好ましい。エタノールアミンに作用するオキシダーゼとしてはエタノールアミンに良好に作用し、過酸化水素を生成する酵素であればいかなる酵素を用いても良い。エタノールアミンを酸化する酵素の例としては、バチルス属由来酵素があげられるが、本酵素を使用した場合には少なくとも15分の反応時間が必要である(医学のあゆみ、第127巻、第2号、昭和58年、114−120頁)。 As an enzyme that acts on ethanolamine that can be used in the present invention, any enzyme that acts on ethanolamine may be used, and examples thereof include oxidase, kinase, dehydrogenase and the like. Among them, oxidase is well known and is preferable because it can be obtained at low cost because it is manufactured for industrial use. As an oxidase that acts on ethanolamine, any enzyme may be used as long as it works well on ethanolamine and generates hydrogen peroxide. An example of an enzyme that oxidizes ethanolamine is an enzyme derived from the genus Bacillus, but when this enzyme is used, a reaction time of at least 15 minutes is required (Medical History, Vol. 127, No. 2). 1984, pp. 114-120).
これに比較してアースロバクター属由来のチラミンオキシダーゼは5分間で発色反応を効率良く行なうことができる。更に酵素の安定性、酵素の安定供給の面からアースロバクター属由来のチラミンオキシダーゼが特に好ましい。その試薬中での濃度は0.1から50U/ml、好ましくは1から20単位/mlである。チラミンに作用する酵素の活性はチラミンを基質にして37℃1分間に1マイクロモルを酸化する活性を1単位とした。また、被検液中に含有するモノアミン、ジアミンを消去する目的でチラミンオキシダーゼとモノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼとを併用することもできる。モノアミン、ジアミンを酸化する酵素としてブタ腎、ブタ血漿、ウシ血漿、マメ科幼植物、アスペルギルス・ニガー由来の酵素が知られているが、上記の消去の目的には基質特異性が広い性質をもつアスペルギルス・ニガー由来酵素が好ましい。 Compared with this, tyramine oxidase derived from the genus Arthrobacter can efficiently perform the color reaction in 5 minutes. Furthermore, tyramine oxidase derived from Arthrobacter is particularly preferable from the viewpoints of enzyme stability and stable enzyme supply. The concentration in the reagent is 0.1 to 50 U / ml, preferably 1 to 20 units / ml. The activity of the enzyme acting on tyramine was defined as 1 unit of activity that oxidizes 1 micromole per minute at 37 ° C. using tyramine as a substrate. Moreover, tyramine oxidase, monoamine oxidase, and diamine oxidase can be used in combination for the purpose of eliminating monoamine and diamine contained in the test solution. Enzymes derived from porcine kidney, porcine plasma, bovine plasma, leguminous seedlings, and Aspergillus niger are known as enzymes that oxidize monoamines and diamines. Aspergillus niger derived enzymes are preferred.
次にエタノールアミン含有リン脂質の分析試薬について述べる。分析用試薬の保存安定性を保つために分析試薬は2種類の試薬に分割され使用される。また血清等の生体成分中には遊離のアミンが存在することがあるため正誤差を生じる危険性が考えられる。エタノールアミンオキシダーゼ(チラミンオキシダーゼ)、カタラーゼあるいはパーオキシダーゼとフェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等のトリンダー試薬の色原体とを含有する試薬1(R1)に被験液を添加し予め加温することでこの成分を消去することができる。試薬2(R2)はホスフォリパーゼD、4アミノアンチピリン若しくは3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーからなる成分で構成される。R1とR2が混合されると同時にエタノールアミンオキシダーゼ反応で生成される過酸化水素はトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成する。この色素の吸光度を分光学的に測定することができる。 Next, an analysis reagent for ethanolamine-containing phospholipid will be described. In order to maintain the storage stability of the analytical reagent, the analytical reagent is divided into two types of reagents. In addition, since free amines may be present in biological components such as serum, there is a risk of causing a positive error. By adding the test solution to Reagent 1 (R1) containing ethanolamine oxidase (tyramine oxidase), catalase or peroxidase and a chromogen of a tender reagent such as a phenol derivative, aniline derivative, or toluidine derivative, and pre-heating. This component can be eliminated. Reagent 2 (R2) is composed of a component composed of a coupler such as phospholipase D, 4 aminoantipyrine, or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH). Hydrogen peroxide produced by the ethanolamine oxidase reaction simultaneously with the mixing of R1 and R2 produces a dye by oxidative condensation between the chromogen of the Trinder reagent and the coupler. The absorbance of this dye can be measured spectroscopically.
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例としてN,Nジメチルアニリン、N,Nジエチルアニリン、2,4ジクロロフェノール、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5ジメチルアニリン(MAPS)、N-エチル-N- (2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-3,5- ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N- (2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m- トルイジン(TOOS)、N-エチル-N- スルホプロピル-m- アニシジン(ADPS)、N-エチル-N- スルホプロピルアニリン(ALPS)、N-エチル-N- スルホプロピル-3,5- ジメトキシアニリン(DAPS)、N-スルホプロピル-3,5- ジメトキシアニリン(HDAPS )、N-エチル-N- スルホプロピル-m- トルイジン(TOPS)、N-エチル-N- (2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-m- アニシジン(ADOS)、N-エチル-N- (2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)アニリン(ALOS)、N-(2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル)-3,5- ジメトキシアニリン(HDAOS )、N-スルホプロピル−アニリン(HALPS )(以上同人化学研究所社製)等が挙げられる。また過酸化水素はパーオキシダーゼ存在下ロイコ型試薬を用いて発色することができる。この試薬の具体例としては、o-ジアニシジン、o-トリジン、3,3 ジアミノベンジジン、3,3,5,5-テトラメチルベンジジン;以上同人化学研究所社製、N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4,4- ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン(DA64)、10- (カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7- ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン(DA67);以上和光純薬社製等が挙げられる。 As the chromogen of the Trinder type reagent, phenol derivatives, aniline derivatives, toluidine derivatives, etc. can be used, and specific examples include N, N dimethylaniline, N, N diethylaniline, 2,4 dichlorophenol, N-ethyl- N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5 dimethylaniline (MAPS), N-ethyl-N- (2- Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS), N-ethyl-N-sulfopropyl -m- Anisidine (ADPS), N-ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline (DAPS), N-sulfopropyl-3,5-dimethoxy Aniline (HDAPS), N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine (TOPS), N-ethyl- N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine (ADOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N- (2-hydroxy-3- Sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-sulfopropyl-aniline (HALPS) (manufactured by Dojindo Laboratories) and the like. Hydrogen peroxide can be colored using a leuco reagent in the presence of peroxidase. Specific examples of this reagent include o-dianisidine, o-tolidine, 3,3 diaminobenzidine, 3,3,5,5-tetramethylbenzidine; N- (carboxymethylaminocarbonyl) manufactured by Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd. -4,4-bis (dimethylamino) biphenylamine (DA64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine (DA67);
また過酸化水素の定量方法としては蛍光法や電極法でも分析することができる。蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、4-ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフルオレスシン誘導体等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロール等を用いることが出来る。カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドを定量する方法としては、ハンチ反応を用いる方法や、MBTHとの縮合反応により発色させる方法、若しくはアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる方法等が挙げられる。 Further, as a method for quantifying hydrogen peroxide, it can also be analyzed by a fluorescence method or an electrode method. In the fluorescence method, compounds that fluoresce upon oxidation, such as homovanillic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, tyramine, paracresol, diacetylfluorescin derivatives and the like, and in the chemiluminescence method, luminol, lucigenin, isoluminol, Pyrogallol or the like can be used. Examples of a method for producing aldehyde from alcohol using catalase or the like and quantifying the generated aldehyde include a method using a hunch reaction, a method of developing a color by a condensation reaction with MBTH, or a method using an aldehyde dehydrogenase. .
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知、の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。本発明の分析用試薬には必要に応じて緩衝液、酵素の安定化剤、防腐剤等を適宜使用する。 In addition, when measuring hydrogen peroxide using an electrode, the electrode is not particularly limited as long as it is a material that can exchange electrons with hydrogen peroxide, and examples thereof include platinum, gold, and silver. As an electrode measurement method, known methods such as amperometry, potentiometry, coulometry, etc. can be used, and further, an oxidation or reduction current obtained by interposing an electron carrier in the reaction between oxidase or substrate and electrode. Alternatively, the amount of electricity may be measured. Any substance having an electron transfer function can be used as the electron carrier, and examples thereof include substances such as ferrocene derivatives and quinone derivatives. Alternatively, the oxidation or reduction current obtained by interposing an electron carrier between hydrogen peroxide generated by the oxidase reaction and the electrode, or the amount of electricity thereof may be measured. For the analytical reagent of the present invention, a buffer, an enzyme stabilizer, a preservative, and the like are appropriately used as necessary.
適宜な添加物において、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレンひまし油、ポリオキシエチレンステロール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンラノリン類、ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸・リン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、Nアシルアミノ酸塩類、アルキルエーテルカルボン酸塩類、アルキルリン酸塩、Nアシルタウリン酸塩、スルホン酸塩、アルキル硫酸、酢酸ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤、レシチン誘導体、ポリエチレングリコール類、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ポリエチレングリコールイソオクチルフェニルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、等の0.01〜10%、好適には0.05〜5%、各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の1mM〜5M、好適には10mM〜1M、各種緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等の10mM〜2M、好適には20mM〜1M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの0.01〜10%、好適には0.05〜1%を適宜添加すれば良い。
エタノールアミンオキシダーゼの安定化剤としてはソルビトールに代表される各種糖類を適宜使用する。これらは0.1〜10%、好適には0.5〜5%の範囲で添加すればいい。
In appropriate additives, surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene glycerin fatty acid esters, polyoxyethylene sorbite fatty acid esters, polyoxyethylene alkylphenyl formaldehyde condensates , Polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene sterols, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ethers, polyoxyethylene lanolins, polyoxyethylene alkylamine / fatty acid amides, polyoxyethylene alkyl ether phosphates / phosphates, Polyoxyethylene alkyl ether sulfates, polyglycerin fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters Sorbitan fatty acid esters, N acylamino acid salts, alkyl ether carboxylates, alkyl phosphates, N acyl taurates, sulfonates, alkyl sulfates, betaine acetate amphoteric surfactants, imidazoline amphoteric surfactants, lecithin Derivatives, polyethylene glycols, polyethylene glycol lauryl ether, polyethylene glycol isooctyl phenyl ether, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, etc. 0.01-10%, preferably 0.05-5%, various metal salts such as lithium chloride, sodium chloride, Potassium chloride, manganese chloride, cobalt chloride, zinc chloride, calcium chloride, etc. 1 mM to 5 M, preferably 10 mM to 1 M, various buffers such as Tris-HCl buffer, glycine-NaOH buffer, phosphate buffer, Good 10mM to 2M, such as buffer solution, suitable The 20MM~1M, various preservatives such 0.01% to 10% of sodium azide, preferably may be appropriately added 0.05 to 1%.
As a stabilizer for ethanolamine oxidase, various saccharides represented by sorbitol are appropriately used. These may be added in the range of 0.1 to 10%, preferably 0.5 to 5%.
本発明に使用しうるエタノールアミン含有リン脂質の定量方法としては、前記本発明のエタノールアミン含有リン脂質分析用組成物1mlに被験液0.01〜0.05mlを加え、37℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後一定時間後の2点間の数分ないし数十分間、例えば3分後と4分後の1分間、または3分後と8分後の5分間における変化した、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度のエタノールアミンリン脂質を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化蛋白質の量を求めることができる。 As a method for quantifying ethanolamine-containing phospholipid that can be used in the present invention, 0.01 to 0.05 ml of a test solution is added to 1 ml of the ethanolamine-containing phospholipid analysis composition of the present invention, and reacted at a temperature of 37 ° C. When performing a rate assay, several minutes to several tens of minutes between two points after the start of the reaction, for example, 1 minute after 3 minutes and 4 minutes, or 5 minutes after 3 minutes and 8 minutes The amount of dissolved oxygen, hydrogen peroxide or other product changed in the above can be measured directly or indirectly by the above-described method. In the case of an endpoint assay, the amount of dissolved oxygen changed after a certain time from the start of the reaction, The amount of hydrogen peroxide or other products may be measured in the same way. In this case, the amount of glycated protein in the test solution can be determined by comparing with changes in absorbance and the like when measured using a known concentration of ethanolamine phospholipid.
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
〔実施例1〕
試薬1(R1)は下記最終濃度になるように各成分を混合して調製した。
50mM トリスー塩酸緩衝液(pH8.0)
6U/ml チラミンオキシダーゼ(旭化成社製)
10U/ml パーオキシダーゼ(シグマ社製)
0.1% トリトンX100
0.1% TOOS
[Example 1]
Reagent 1 (R1) was prepared by mixing each component so as to have the following final concentration.
50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)
6U / ml tyramine oxidase (Asahi Kasei Corporation)
10U / ml peroxidase (Sigma)
0.1% Triton X100
0.1% TOOS
〔実施例2〕
試薬2(R2)は下記最終濃度になるように各成分を混合して調整した。
50mM トリスー塩酸緩衝液(pH8.0)
ホスフォリパーゼD (旭化成社製;7U/ml)
2mM 塩化カルシウム
0.1% 4アミノアンチピリン
0.1% トリトンX100
[Example 2]
Reagent 2 (R2) was prepared by mixing each component so as to have the following final concentration.
50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0)
Phospholipase D (Asahi Kasei Corporation; 7U / ml)
2 mM calcium chloride 0.1% 4-aminoantipyrine 0.1% Triton X100
〔実施例3〕
実施例1および2記載の反応液各500マイクロリットルを混合し、0.1から1mMのホスファチジルエタノールアミン溶液20マイクロリットルを添加し、37℃で5分間反応後、550nmの吸光度を測定した。そのときの結果を図1に示した。
図1から分かるようにホスフォリパーゼ及びエタノールアミンに作用する酵素を用いてホスファチジルエタノールアミンを測定することが可能であった。またホスファチジルエタノールアミンの替わりにリゾホスファチジルエタノールアミンを用いても同様の結果が得られた。
Example 3
500 microliters of each of the reaction solutions described in Examples 1 and 2 were mixed, 20 microliters of a 0.1 to 1 mM phosphatidylethanolamine solution was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then the absorbance at 550 nm was measured. The results at that time are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 1, phosphatidylethanolamine could be measured using an enzyme that acts on phospholipase and ethanolamine. Similar results were obtained when lysophosphatidylethanolamine was used instead of phosphatidylethanolamine.
〔実施例4〕
実施例1記載の反応液500μlに、0〜100μMのフェニルエチルアミンを含む0.5mMホスファチジルエタノールアミン溶液20マイクロリットルを添加し、37℃で5分間アミンの消去反応を行い、続いて実施例2記載の反応液500μlを添加し37℃で5分間反応後、550nmの吸光度を測定した。そのときの結果を図2に示した。
図2から分かるようにフェニルエチルアミンの濃度によらず、一定の糖化ホスファチジルエタノールアミンの測定値が得られることから、遊離のアミンを消去して、正確にホスファチジルエタノールアミンのみを測定することが可能であった。またホスファチジルエタノールアミンの替わりにリゾホスファチジルエタノールアミンを用いても同様の結果が得られた。
Example 4
To 500 μl of the reaction solution described in Example 1, 20 microliters of 0.5 mM phosphatidylethanolamine solution containing 0-100 μM phenylethylamine was added to carry out an amine elimination reaction at 37 ° C. for 5 minutes, followed by Example 2. After adding 500 μl of the reaction solution and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the absorbance at 550 nm was measured. The results at that time are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 2, since a constant measurement value of glycated phosphatidylethanolamine can be obtained regardless of the concentration of phenylethylamine, it is possible to eliminate only the free amine and accurately measure only phosphatidylethanolamine. there were. Similar results were obtained when lysophosphatidylethanolamine was used instead of phosphatidylethanolamine.
本発明の分析方法及び分析用組成物は、食品中のリン脂質分析や臨床診断に好適に利用できる。 The analysis method and analysis composition of the present invention can be suitably used for phospholipid analysis and clinical diagnosis in foods.
Claims (6)
The composition for analyzing ethanolamine-containing phospholipid according to claim 4, wherein the enzyme that hydrolyzes ethanolamine-containing phospholipid is phospholipase D.
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