JP2005049164A - Labelling reagent and method for sensitively measuring and quantifying peptide - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a reagent and a method for sensitively implementing a qualitative and quantitative analysis of a peptide using a mass spectroscope, and a reagent and a method for sensitively implementing a qualitative and quantitative analysis of a phosphorylated peptide having a low ionization efficiency in normal mass spectrometry. <P>SOLUTION: In the mass spectroscope, the labelling agent is expressed by formula (A). X expresses a 3-pyridyl group with a substituent, a nitrogen containing aromatic series heterocyclic group other than the 3-pyridyl group possibly having the substituent, or an aromatic series hydrocarbon group having an amino group with the substituent. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【００１０】
（式中、Ｘは、置換基を有する３−ピリジル基、又は置換基を有してもよい前記３−ピリジル基以外の含窒素芳香族複素環基、又は置換基を有するアミノ基を有する芳香族炭化水素基を表す。）で表されるラベル化試薬。
【００１１】
２．前記含窒素芳香族複素環基が、２−ピリジル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
３．前記ラベル化試薬が下記式（１）で表される、上記１．又は２．に記載のラベル化試薬。
【化９】

【００１２】
４．一般式におけるＸが３−ピリジル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
５．前記ラベル化試薬が下記式（３）〜（１０）のうちのいずれかで表される、上記１．又は４．に記載のラベル化試薬。
【化１０】

【００１３】
６．前記含窒素芳香族複素環基が４−ピリジル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
７．前記ラベル化試薬が下記式（１１）で表される、上記１．又は６．に記載のラベル化試薬。
【化１１】

【００１４】
８．前記含窒素芳香族複素環基がベンズイミダゾリル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
９．前記ラベル化試薬が下記式（１２）で表される、上記１．又は８．に記載のラベル化試薬。
【化１２】

【００１５】
１０．前記芳香族炭化水素基がフェニル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
１１．前記ラベル化試薬が下記式（１３）で表される、上記１．又は１０．に記載のラベル化試薬。
【化１３】

【００１６】
１２．前記含窒素芳香族複素環基がイミダゾリル基である、上記１．に記載のラベル化試薬。
１３．前記ラベル化試薬が下記式（１４）で表される、上記１．又は１２．に記載のラベル化試薬。
【化１４】

【００１７】
１４．上記１．〜１３．のいずれかに記載のラベル化試薬を用いてペプチドのＮ末端アミノ基、リジン残基の側鎖アミノ基、又は、Ｎ末端アミノ基及びリジン残基の側鎖アミノ基を修飾し、質量分析装置によってペプチドを高感度測定又は定量する方法。
１５．前記ペプチドがリン酸化されている、上記１４．に記載のペプチドを高感度測定又は定量する方法。
【００１８】
１６．ペプチドを修飾するためのラベル化試薬と、前記ラベル化試薬に特定の置換基が導入された他のラベル化試薬とを対で用い、質量分析装置によってペプチドの定量を行う方法。
【００１９】
１７．ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか一方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化されたペプチドを得て、
別途、対照ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか他方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化された対照ペプチドを得て、
前記誘導体化されたペプチドと前記誘導体化された対照ペプチドとを混合し、混合した誘導体化ペプチドを質量分析装置によって測定する、上記１６．に記載のペプチドの定量を行う方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。なお、本発明においてペプチドとは、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む意味で用いる。
本発明は、質量分析装置を用いたペプチドの高感度測定及び定量のためのラベル化試薬であり、下記一般式（Ａ）で表される窒素を含有する芳香族化合物のカルボン酸誘導体である。
【００２１】
【化１５】

【００２２】
式中、Ｘは、置換基を有する３−ピリジル基、又は置換基を有してもよい前記３−ピリジル基以外の含窒素芳香族複素環基、又は置換基を有するアミノ基を有する芳香族炭化水素基を表す。また、前記含窒素芳香族複素環基としては、２−ピリジル基、４−ピリジル基、ベンズイミダゾリル基、イミダゾリル基などが挙げられる。前記芳香族炭化水素基としては、フェニル基などが挙げられる。
【００２３】
前記Ｘが２−ピリジル基であるラベル化試薬としては、下記式（１）が挙げられる。
【００２４】
【化１６】

【００２５】
前記Ｘが３−ピリジル基であるラベル化試薬としては、下記式（３）〜（１０）が挙げられる。
【００２６】
【化１７】

【００２７】
前記Ｘが４−ピリジル基であるラベル化試薬としては、下記式（１１）が挙げられる。
【００２８】
【化１８】

【００２９】
前記Ｘがベンズイミダゾリル基であるラベル化試薬としては、下記式（１２）が挙げられる。
【００３０】
【化１９】

【００３１】
前記Ｘがフェニル基であるラベル化試薬としては、下記式（１３）が挙げられる。
【００３２】
【化２０】

【００３３】
前記Ｘがイミダゾリル基であるラベル化試薬としては、下記式（１４）が挙げられる。
【００３４】
【化２１】

【００３５】
本発明のラベル化試薬は、塩基性の異なるピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール等のカルボン酸類から当業者が適宜選択し、選択されたカルボン酸類を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、例えば乾燥テトラヒドロフラン（ｄｒｙ ＴＨＦ）中で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で縮合させることによりスクシンイミド化して合成することができる。上記ラベル化試薬（３）を一例に挙げ、本発明のラベル化試薬の合成例を下記化学反応式Ｂに示す。
【００３６】
【化２２】

【００３７】
このとき、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは前記カルボン酸類に対して例えば１〜２０当量用いることができる。縮合剤としては、上記ＥＤＣの他にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いることもできる。縮合剤の量としては、前記カルボン酸に対して例えば１〜１０当量用いることができる。また溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒の量としては、全試薬の濃度が１〜３０重量％になるように用いることができる。スクシンイミド化の反応条件としては、例えば０〜５０℃で、０．５時間〜１０日間の条件下で行うことができる。
【００３８】
また、上記ラベル化試薬４及び７として表される化合物、すなわち、１−［６−（Ｄ_３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（４）及び１−｛２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（７）は、新規な化合物である。
【００３９】
１−［６−（Ｄ_３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（４）は、下記化学反応式Ｃに示すように、新規化合物６−（Ｄ_３）メチルニコチン酸を中間体として６−メチルニコチン酸から合成することができる。
【００４０】
【化２３】

【００４１】
１−｛２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（７）は、下記化学反応式Ｄに示すように、新規化合物２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチン酸（１６）を中間体として２，６−ジメチルニコチン酸から合成することができる。
【００４２】
【化２４】

【００４３】
上記式Ｃ及びＤの合成経路によって合成することは、出発物質に安定同位体を含まない、一般に入手が容易なものを用いる点で好ましい。
【００４４】
以下、これら新規化合物の合成法について述べる。
出発物質であるニコチン酸は、メチル基の水素が重水素化される。重水素化には、金属水酸化物の重水素置換体の重水溶液を用いることができる。金属水酸化物の重水素置換体の重水溶液としては、ＮａＯＤ−Ｄ_２Ｏ、ＫＯＤ−Ｄ_２Ｏ、ＬｉＯＤ−Ｄ_２Ｏ等が挙げられる。上記重水溶液は、金属水酸化物の重水素置換体が０．５〜３０重量％のものを用いることができる。また上記重水溶液の量は、例えば反応溶液全体に対して上記ニコチン酸が１〜３０重量部程度含まれるように用いることができる。
【００４５】
重水素化反応は、例えば封管中で、１００〜２００℃、１〜１０時間の条件下で行うことができる。反応後は希塩酸などを用いて中和を行うとよい。このようにして、６−メチルニコチン酸からは６−（Ｄ_３）メチルニコチン酸（１５）を得る。また、２，６−ジメチルニコチン酸からは２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチン酸（１６）を得る。本発明においては、これら重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）を特に精製しなくとも次の反応に用いることができる。
【００４６】
次に重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）がスクシンイミド化される。スクシンイミド化は、重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合させることによって行うことができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは、重水素化ニコチン酸（１５）又は（１６）に対して例えば１〜２０当量用いることができる。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等を用いることが好ましい。縮合剤は、重水素化ニコチン酸に対して例えば１〜１０当量用いることができる。また溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒の量としては、全試薬の濃度が１〜３０重量％となるように用いることができる。
【００４７】
スクシンイミド化は、例えば０〜５０℃で０．５時間〜１０日間の条件下で行うことができる。このようにして、６−（Ｄ_３）メチルニコチン酸（１５）からは１−［６−（Ｄ_３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（４）を得る。また、２，６−ジ（Ｄ_３）メチルニコチン酸（１６）からは１−｛２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（７）を得る。得られたニコチン酸誘導体（４）又は（７）は、必要に応じカラムクロマトグラフィー、再結晶等によって精製を行うとよい。以上のようにして、ペプチドのラベル化試薬として有用な新規ニコチン酸誘導体（４）及び（７）を得ることができる。
【００４８】
また、上記ラベル化試薬６として表される化合物、すなわち、１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（６）も、新規な化合物である。この化合物は、下記化学反応式Ｅに示すように、２，６−ジメチルニコチン酸をスクシンイミド化することにより合成することができる。スクシンイミド化は、上記ニコチン酸誘導体（４）又は（７）の合成におけるスクシンイミド化と同様にして行うことができる。
【００４９】
【化２５】

【００５０】
本発明のラベル化試薬は、ペプチドのＮ末端を効率よく化学修飾することにより誘導体化することができる。特にペプチドのＮ末端残基が塩基性のもの（アルギニン、ヒスチジン）、酸性のもの（アスパラギン酸）、水酸基を有するもの（トレオニン、チロシン）の場合はほぼ定量的に誘導体化することが可能である。なお、ペプチドのＮ末端以外に塩基性アミノ酸のアルギニン、リジンがある場合、リジンは修飾され、アルギニンは修飾されない。
【００５１】
ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）のＮ末端の誘導体化（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）は、下記化学反応式Ｆであらわされる。式Ｆにおいては、ラベル化試薬（Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）の一例として１−ニコチノイルスクシンイミド類を挙げている。
【００５２】
【化２６】

【００５３】
本発明のラベル化試薬は、スクシンイミド基で活性化されているために、弱塩基性下でペプチドのアミノ基と縮合反応し、ペプチドのＮ末端が誘導体化される。誘導体化は、例えば次のようにして行うことができる。ペプチド溶液と、適切なｐＨに調整されたラベル化試薬溶液とを混合し、室温で２０分程度置く。さらに上述で用いたものと同量のラベル化試薬溶液を加え、さらに２時間程度置く。さらに、適切なｐＨに調製されたヒドロキシルアミン溶液を加え、一晩程度放置する。反応停止後、脱塩を行う。
【００５４】
本発明の試薬を用いてペプチドのＮ末端を修飾すると、ペプチドが正電荷に荷電しやすくなるためにイオン化効率が良くなり、質量分析におけるペプチドのピークが高感度に検出される。すなわち、本発明の試薬を用いることによって高感度分析が可能となる。特にリン酸化ペプチドのように負電荷を有するためにイオン化効率が悪いペプチドにおいても、本発明の試薬を用いるとイオン化効率を良くすることができるため、高感度分析が可能となる。また、硫酸化ペプチドもイオン化効率が悪いが、本発明の試薬を用いると、誘導体化によって脱硫酸化されたペプチドのピークが高感度に検出される。
【００５５】
また本発明は、ペプチドを修飾するためのラベル化試薬と、前記ラベル化試薬に特定の置換基が導入された他のラベル化試薬とを対で用い、質量分析装置によってペプチドの定量を行う方法である。前記特定の置換基としては、低分子量のものが好ましく、メチル基が特に好ましい。例えば、前記ラベル化試薬として１−（ニコチノイルオキシ）スクシンイミド、及び前記他のラベル化試薬として１−（６−メチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（前記試薬３）を対にして用いることができる。また例えば、前記ラベル化試薬として前記試薬３、及び前記他のラベル化試薬として１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（前記試薬６）を対にして用いることができる。
【００５６】
具体的には、次のようにしてペプチドの定量を行うことができる。（ｉ）ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか一方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化されたペプチドを得る。（ｉｉ）別途、対照ペプチドを、前記ラベル化試薬及び前記他のラベル化試薬のいずれか他方を用いて化学修飾することにより誘導体化し、誘導体化された対照ペプチドを得る。（ｉｉｉ）前記誘導体化されたペプチドと前記誘導体化された対照ペプチドとを混合する。（ｉｖ）誘導体化ペプチドの混合物を質量分析装置によって測定する。得られたスペクトルにおいて、ラベル化試薬の分子量の差だけずれた対ピークを確認し、そのイオン強度比から対ピークに由来するペプチドの比率を知ることができる。
【００５７】
なお、誘導体化されるペプチド、すなわち前記ペプチドと前記対照ペプチドとの組み合わせとしては、病細胞に由来するタンパク質と正常細胞に由来するタンパク質との組み合わせ等が挙げられる。
【００５８】
本発明のペプチドの定量方法は、ペプチドに対して同程度のイオン化効率を有するラベル化試薬同士を対にして用いることができるため、安定同位体を含むラベル化試薬を用いなくともペプチドの定量が可能であり、簡便かつ安価である。
【００５９】
【実施例】
本実施例では、下記式で表されるラベル化試薬２を含む、ラベル化試薬１〜１４をそれぞれ合成した。
【００６０】
【化２７】

【００６１】
［１−（ニコチノイルオキシ）スクシンイミド（試薬２）の合成］
市販のニコチン酸４ｍｍｏｌを乾燥テトラヒドロフラン８０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド４．８ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）５．２ｍｍｏｌを加えて室温で２日撹拌した。反応後、溶液部分を分離し、減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルム８０ｍｌに溶解し、８０ｍｌの飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。再結晶を酢酸エチルを用いて行い、無色板状晶を得た。
【００６２】
［実施例１：１−（６−メチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（試薬３）の合成］
市販の６−メチルニコチン酸を用いた以外は上述の試薬２の合成と同様にして行った。
【００６３】
［実施例２：１−［６−（Ｄ_３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミド（試薬４）の合成］
市販の６−メチルニコチン酸０．５ｍｍｏｌを１重量％ＮａＯＤ−Ｄ_２Ｏ １．０ｍｌに溶解し封管中、１８０℃で３時間反応させた。反応後、希塩酸を加えて中和し、減圧下濃縮乾固し、６−（Ｄ_３）メチルニコチン酸を生成物として得た。この生成物は精製せずに次の反応に用いた。
【００６４】
得られた６−（Ｄ_３）メチルニコチン酸を乾燥テトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．６ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）０．６５ｍｍｏｌを加え、室温で２日撹拌して反応させた。反応後、溶液部分を分離し、減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルム１０ｍｌに溶解し、飽和食塩水１０ｍｌで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。酢酸エチルを用いて再結晶を行い、無色板状晶の１−［６−（Ｄ_３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミドを収率７５％で得た。
【００６５】
（１−［６−（Ｄ_３）メチルニコチノイルオキシ］スクシンイミドの同定データ）
ｍｐ：１６５〜１６７℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ４００ＭＨｚ）：δ ２．９２（ｂｒ． ｓ， ４Ｈ， ＣＨ_２＊２）， ７．３２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， ５−Ｈ）， ８．２７（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２， ８．１Ｈｚ， ４−Ｈ）， ９．２２（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝２．２Ｈｚ， ２−Ｈ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ２３７（Ｍ^＋）
【００６６】
［実施例３：１−｛２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミド（試薬７）の合成］
２，６−ジメチルニコチン酸は、文献：Ｋａｔｏ Ｔ．， Ｎｏｄａ Ｍ．， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．，２４， ３０３−３０９ （１９７６）に従って合成した。得られた２，６−ジメチルニコチン酸０．５ｍｍｏｌを１重量％ＮａＯＤ−Ｄ_２Ｏ １．０ｍｌに溶解し封管中、１８０℃で８時間反応させた。反応後、希塩酸を加えて中和し、減圧下濃縮乾固し、２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチン酸を生成物として得た。この生成物は精製せずに次の反応に用いた。
【００６７】
得られた２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチン酸を乾燥テトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．６ｍｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）０．６５ｍｍｏｌを加え、室温で２日撹拌して反応させた。反応後、溶液部分を分離し、減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルム１０ｍｌに溶解し、飽和食塩水１０ｍｌで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し、１−｛２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミドを収率７０％で得た。酢酸エチルを用いて再結晶を行い、無色板状晶を得た。
【００６８】
（１−｛２，６−ジ［（Ｄ_３）メチル］ニコチノイルオキシ｝スクシンイミドの同定データ）
ｍｐ：１３５〜１３７℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ４００ＭＨｚ）：δ ２．９２（ｂｒ． ｓ， ４Ｈ， ＣＨ_２＊２）， ７．１４（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， ５−Ｈ）， ８．２７（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， ４−Ｈ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ２５４（Ｍ^＋）
【００６９】
［実施例４：１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミド（試薬６）の合成］
２，６−ジメチルニコチン酸は、文献：Ｋａｔｏ Ｔ．， Ｎｏｄａ Ｍ．， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．，２４， ３０３−３０９ （１９７６）に従って合成した。得られた２，６−ジメチルニコチン酸４ｍｍｏｌを乾燥テトラヒドロフラン８０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド４．８ｍｍｏｌ及びＥＤＣ５．２ｍｍｏｌを加え室温で２時間撹拌した。粘凋な残渣と溶液部分とを分離した後、溶液部分を減圧濃縮した。ここにクロロホルム８０ｍＬを加え、飽和食塩水８０ｍＬで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し濃縮乾固した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し、６６％の収率で１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミドを得た。再結晶を酢酸エチルから行い、無色板状晶を得た。
【００７０】
（１−（２，６−ジメチルニコチノイルオキシ）スクシンイミドの同定データ）
ｍｐ：１３４−１３６℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３， ４００ＭＨｚ）：δ ２．６１（ｓ， ３Ｈ， ６−ＣＨ_３）， ２．８２（ｓ， ３Ｈ， ２−ＣＨ_３）， ２．９２（ｂｒ． ｓ， ４Ｈ， ＣＨ_２＊２）， ７．１９（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， ５−Ｈ）， ８．２８（ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， ４−Ｈ）
ＥＩＭＳ：ｍ／ｚ ２４８（Ｍ^＋）
【００７１】
その他のラベル化試薬に関しては、原料に相当するカルボン酸をそれぞれ選択して用いた以外は、実施例４と同様にしてそれぞれ合成した。
【００７２】
本実施例においては、表１に表すペプチドを用いた。表１においては、用いたペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）、アミノ酸の１文字略号で表されたペプチドの構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、及びそれぞれのモノアイソトピック（Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量を表す。
【００７３】
【表１】

【００７４】
これらペプチドは、以下に述べる方法を用いてＮ末端を化学修飾することにより誘導体化した。
５０ｐｍｏｌ／μｌのペプチド水溶液３０μｌに合成したラベル化試薬溶液３０μｌ（１ｍｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５に溶解した溶液）を加え、２０分間放置した。次に上記のラベル化試薬溶液３０μｌを加え２時間放置した。さらにヒドロキシルアミン３０μｌ（３４．８ｍｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５に溶解した溶液）を加え一晩反応させた。反応終了後ギ酸３０μｌを加え反応を停止し、ＺｉｐＴｉｐＣ１８（ミリポア社）で脱塩を行った。
【００７５】
［実施例５：ラベル化試薬のペプチド修飾率］
モデルペプチドとしてＰ１のブラジキニン（Ｂｙａｄｙｋｉｎｉｎ；ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ；配列番号１）を用い、合成したそれぞれのラベル化試薬を用いてＮ末端を化学修飾し、ペプチドの誘導体化を行った。用いた試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）、誘導体化されたペプチドのモノアイソトピック（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量、及び修飾率（％）を表２に示す。
【００７６】
【表２】

【００７７】
ラベル化試薬３を用いた場合の、Ｐ１ブラジキニン（Ｂｙａｄｙｋｉｎｉｎ）の誘導体化前後のＭＡＬＤＩの分析結果を図１に示す。図１においては、横軸に質量数（Ｍａｓｓ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（％、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を表す（以下、全てのスペクトルチャートにおいて同じ）。なお、図１のスペクトルの測定においては、内部標準試料（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃａｒｉｂｒａｔｉｏｎ）にＡＣＴＨ（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎ Ｈｕｍａｎ， １−２４、モノアイソトピック質量２４６５．２０）を用いた。図１上のスペクトルは、Ｂｙａｄｙｋｉｎｉｎが試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ３）を受ける前のものであり、質量数１１６０．１８（ｍ／ｚ）のピークとして検出された。図１下のスペクトルは、ブラジキニンが誘導体化を受けた後のものであり、質量数１１７９．２４（ｍ／ｚ）のピークとして検出されていることから、誘導体化が行われたことが確認された。
【００７８】
［実施例６：リン酸化ペプチドの誘導体化］
分子中に２個のアミノ基（Ｎ末端アミノ基とリジン残基の側鎖アミノ基）を有する合成ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）Ｐ９（ＴＮＡＳＹＳＰＲＡＫ；配列番号３）を用い、試薬３を用いて誘導体化を行った。Ｐ９の誘導体化前後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図２に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定においては、内部標準試料にＡＣＴＨを用いた。
【００７９】
図２においては、誘導体化前（上図）と後（下図）とにおけるＰ９のピークのイオン強度、及び内部標準試料ＡＣＴＨのピークのイオン強度を比較することができる。試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ３）を受ける前の上図のスペクトルにおいては、質量数１０９４．１６（ｍ／ｚ）のＰ９の分子イオンピークが検出された。誘導体化を受けた後の下図のスペクトルにおいては、誘導体化によって、Ｐ９の２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されたもの（ｍｏｎｏ）が質量数１２１３．２４（ｍ／ｚ）のピーク、及び２個のアミノ基が両方とも誘導体化されたもの（ｄｉ）が質量数１３３２．３１（ｍ／ｚ）のピークとして検出された。これらのイオン強度は、ＡＣＴＨのイオン強度と比較すると、誘導体化する前に比べて強くなっている。すなわち、本発明の試薬で誘導体化することによって高感度で検出できたことが示された。
【００８０】
別途、リン酸化合成ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）Ｐ１０（ＴＮＡＳ（ＨＰＯ_３）ＹＳＰＲＡＫ；配列番号４）を用い、Ｐ９と同様にして試薬３によって誘導体化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定を行った。ここで、Ｐ１０は、Ｎ末端から４番目のセリン残基がリン酸化されており、リン酸化されたセリン残基をＳ（ＨＰＯ_３）と表している。誘導体化前後におけるＰ１０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図３に示す。
【００８１】
試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ３）を受ける前のスペクトル（上図）においては、Ｐ１０の分子イオンピークはＡＣＴＨのピークと比べるととても低い。誘導体化を受けた後のスペクトル（下図）のＰ１０においては、上記Ｐ９の場合と同様に２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されたもの（ｍｏｎｏ）のピークと、２個のアミノ基が両方とも誘導体化されたもの（ｄｉ）のピークとが検出されたが、これらのイオン強度も、誘導体化される前に比べて強くなっている。すなわち、リン酸化ペプチドも、本発明の試薬で誘導体化することによって高感度で検出できたことが示された。
【００８２】
［実施例７：サブスタンスＰの誘導体化］
ペプチドとしてＰ２のサブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ；ＲＰＫＰＥＥＦＦＧＬＭ−ＮＨ_２；配列番号２）を用い、試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ３）を行い、内部標準試料にＡＣＴＨを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの測定を行った。ここで、Ｐ２は、Ｃ末端残基であるメチオニン残基がアミド化されており、アミド化されたメチオニン残基をＭ−ＮＨ_２と表している。誘導体化前後におけるＰ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図４に示す。誘導体化された後（下図）のＰ２においては、２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されたもの（ｍｏｎｏ）のピークと、２個のアミノ基が両方とも誘導体化されたもの（ｄｉ）のピークとが検出された。
【００８３】
［実施例８：ＰＳＤスペクトル］
ペプチドＰ９（ＴＮＡＳＹＳＰＲＡＫ；配列番号３）と、試薬３による誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ３）を受けたペプチドＰ９（６−Ｍｅ−Ｎｉｃ−ＴＮＡＳＹＳＰＲＡＫ；配列番号５）とを、ＰＳＤモードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを測定した。ここで、６−Ｍｅ−Ｎｉｃ−Ｔは、誘導体化によって６−メチルニコチノイル基が導入されたトレオニンを表す。誘導体化されていないペプチドＰ９のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図５上に、誘導体化されたペプチドＰ９のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果を図５下に示す。それぞれのスペクトルには、フラグメントイオンピークの位置が示されている。これらのスペクトルから、誘導体化により、ＰＳＤモードで得られたスペクトルにおいてはイオン強度が上昇すると共に、ピーク数も増加することが示された。
【００８４】
［実施例９：誘導体化によるリン酸化ペプチドの高感度測定］
ペプチドＰ１０に対し、試薬２及び試薬３を用いて誘導体化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで質量分析を行った。この際、１０ｐｍｏｌ／μｌのペプチドを、内部標準試料として１ｐｍｏｌ／μｌのＡＣＴＨ（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎ Ｈｕｍａｎ， １−２４、分子量２４６４．２、ペプチド研究所社製）及びマトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて測定した。
【００８５】
図６に、誘導体化前（ａ）と後（（ｂ）及び（ｃ））とのＰ１０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの分析結果を示す。誘導化前のＰ１０のスペクトル（ａ）においては、Ｐ１０（質量数１１７４．７５（ｍ／ｚ））がＡＣＴＨ（質量数２４６６．７２（ｍ／ｚ））とともに検出されている。試薬２を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｂ）においては、Ｐ１０の２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されて質量数が１０６増えたもの（質量数１２８０．０１（ｍ／ｚ））と、２個のアミノ基の両方が誘導体化されて質量数が（１０６×２）増えたもの（質量数１３８６．０９（ｍ／ｚ））とが検出された。試薬３を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｃ）においては、Ｐ１０の２個のアミノ基のうち１個が誘導体化されて質量数が１２０増えたもの（質量数１２９４．０７（ｍ／ｚ））と、２個のアミノ基の両方が誘導体化されて質量数が（１２０×２）増えたもの（質量数１４１４．０７（ｍ／ｚ））とが検出された。
【００８６】
図６の（ａ）によると、誘導体化前のＰ１０の分子イオンピークは、ＡＣＴＨのピークと比べるととても低い。しかし、試薬２を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｂ）、及び試薬３を用いて誘導体化した後のＰ１０のスペクトル（ｃ）によると、１０〜２０倍イオン強度が上昇している。すなわち、誘導体化によってイオン化効率が上がり、高感度で検出できたことが示された。
【００８７】
また、濃度の異なる同一ペプチドを、分子量の異なる試薬で別々に修飾し、混合後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを測定すると、試薬の分子量の差だけずれた２つのピークを確認することができた。本発明においては、そのピーク強度比とペプチドの相対量との誤差は１５〜３０％であった。本発明の試薬を用いることにより、１５〜３０％以上の発現量の差があるペプチドの変動解析へ利用できる可能性が示された。
【００８８】
［実施例１０：誘導体化による定量分析］
１、２、３、４及び５ｐｍｏｌ／μｌの５種類のＰ１に対してそれぞれ試薬２を用いて誘導体化した。一方、５ｐｍｏｌ／μｌ のＰ１に対して試薬３を用いて誘導体化した。試薬２による誘導体化を行ったＰ１溶液の各々に対し、試薬３による誘導体化を行ったＰ１の溶液を等量混合し、５種類の混合溶液を調製した。それぞれの混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで分析した結果を図７に示す。図７中、（ａ）はＰ１（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、（ｂ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の１ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｃ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の２ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｄ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の３ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｅ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の４ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物、（ｆ）は、試薬２による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌと試薬３による誘導体化を行ったＰ１の５ｐｍｏｌ／μｌとの混合物のＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルである。
【００８９】
図７の（ｂ）〜（ｆ）のいずれのスペクトルにおいても、誘導体化ペプチドの濃度比に比例したイオン強度が得られた。このことによって、濃度の異なる試料をそれぞれラベル化試薬２及び３で誘導体化し、その後誘導体化されたそれぞれの試料を一定量混合し、ＭＡＬＤＩで分析することによって定量が行えることが示された。
【００９０】
【発明の効果】
本発明によると、質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び質量分析装置を用いるペプチドの定性及び定量解析を高感度に行う方法を提供することができる。特に本発明によると、通常質量分析においてイオン化効率が悪いリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行うことができる試薬、及び質量分析装置を用いるリン酸化ペプチドの定性及び定量解析を高感度に行う方法を提供することができる。
【００９１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ブラジキニンと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化されたブラジキニンとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図２】合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化された合成ペプチドとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図３】リン酸化合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化されたリン酸化合成ペプチドとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図４】サブスタンスＰと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化されたサブスタンスＰとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図５】合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬によって誘導体化された合成ペプチドとの、ＰＳＤモードで測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図６】リン酸化合成ペプチドと、本発明のラベル化試薬２種によって誘導体化されたリン酸化合成ペプチドとのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルチャートである。
【図７】本発明のラベル化試薬を用いた誘導体化によるブラジキニンの量的変動解析の結果である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a labeling reagent useful in the field of peptide analysis using a mass spectrometer and qualitative or quantitative determination of peptides using the same.
[0002]
[Prior art]
In vivo functions are regulated not only by quantitative changes in proteins but also by qualitative changes due to post-translational modifications such as phosphorylation. A mass spectrometer using a soft ionization method such as MALDI plays an important role in protein identification and quantification. Many methods for chemically modifying proteins and peptides and performing high-sensitivity analysis using a mass spectrometer have been studied. For example, “Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17, 255-274” 1999 by John Wiley & Sons, Inc. It is summarized. As a method for chemically modifying proteins and peptides with a labeling reagent having an isotope and quantifying them, the Isotoped Coded Affinity Tag (ICATs) method (NATURE BIOTECHNOLOGY VOL 17, OCTOBER 1999, 944-999) is known.
[0003]
However, conventional labeling reagents are insufficient in terms of detection sensitivity in peptide analysis, and have not yet been analyzed with high sensitivity for peptides with poor ionization efficiency such as phosphorylated peptides. In addition, in the ICAT method, in order to modify the cysteine residue of the peptide, the protein fragment cannot be quantified after the protein is fragmented with an enzyme or the like, and the phosphorylated peptide is subjected to chemical modification. There are problems such as not necessarily being.
[0004]
Since various chemical structures exist in proteins and peptides, compounds having various chemical structures corresponding to the types of labeling reagents have been sought and reported. As a labeling reagent for the N-terminal amino group of proteins / peptides, nicotinoyl succinimide derivatives, that is, 1- (nicotinoyloxy) succinimide and 1-([D ₄ ] Nicotinoyloxy) succinimide has been synthesized by Munchbach et al. (Anal. Chem., 2000, 72 (17), 4047-4057) and has been used for peptide mass spectrometry expression and amino acid sequence analysis.
[0005]
In general, a compound containing a stable isotope is a raw material compound containing a stable isotope [D ₄ It has been synthesized by using nicotinic acid (Cambridge Island Laboratories (Andover, MA)) to derive a compound having a target structure. The starting material containing deuterium is also used in the synthesis by Munchbach et al. However, there are problems in that raw materials containing stable isotopes such as deuterium are expensive and require complicated processes.
[0006]
[Non-Patent Document 1]
“Mass Spectrometry Reviews 1998, Vol. 17, p. 255-274”, John Wiley & Sons, Inc., 1999.
[Non-Patent Document 2]
“NATURE BIOTECHNOLOGY”, Vol. 17, October 1999, p944-999
[Non-Patent Document 3]
Munchback M, Quadroni M, Miotto G, James P, peptide N-terminal isotope labeling with components that promote fragmentation Quantification of proteins and simple de novo sequencing (Quantitative de novo sequencing of proteins by isotopic peptidism Month 1, Vol. 72, No. 17, p. 4047-4057
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a reagent capable of performing qualitative and quantitative analysis of peptides using a mass spectrometer with high sensitivity, and a method of performing qualitative and quantitative analysis of peptides using a mass spectrometer with high sensitivity. is there. In particular, the object of the present invention is to provide a highly sensitive qualitative and quantitative analysis of a phosphopeptide using a mass spectrometer and a reagent capable of performing a qualitative and quantitative analysis of a phosphopeptide with poor ionization efficiency in normal mass spectrometry. It is to provide a way to do.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention includes the following inventions.
1. General formula (A) for highly sensitive measurement or quantification of peptides in a mass spectrometer:
[0009]
[Chemical 8]

[0010]
(In the formula, X is a 3-pyridyl group having a substituent, or a nitrogen-containing aromatic heterocyclic group other than the 3-pyridyl group which may have a substituent, or an aromatic having an amino group having a substituent. Represents a group hydrocarbon group.)
[0011]
2. 1. The nitrogen-containing aromatic heterocyclic group is a 2-pyridyl group. A labeling reagent according to 1.
3. The labeling reagent is represented by the following formula (1): Or 2. A labeling reagent according to 1.
[Chemical 9]

[0012]
4). 1. In the general formula, X is a 3-pyridyl group. A labeling reagent according to 1.
5. 1. The labeling reagent represented by any one of the following formulas (3) to (10): Or 4. A labeling reagent according to 1.
Embedded image

[0013]
6). 1. The nitrogen-containing aromatic heterocyclic group is a 4-pyridyl group. A labeling reagent according to 1.
7. The labeling reagent is represented by the following formula (11): Or 6. A labeling reagent according to 1.
Embedded image

[0014]
8). 1. The nitrogen-containing aromatic heterocyclic group is a benzimidazolyl group. A labeling reagent according to 1.
9. The labeling reagent is represented by the following formula (12): Or 8. A labeling reagent according to 1.
Embedded image

[0015]
10. 1. The aromatic hydrocarbon group is a phenyl group. A labeling reagent according to 1.
11. The labeling reagent is represented by the following formula (13): Or 10. A labeling reagent according to 1.
Embedded image

[0016]
12 1. The nitrogen-containing aromatic heterocyclic group is an imidazolyl group. A labeling reagent according to 1.
13. The labeling reagent is represented by the following formula (14): Or 12. A labeling reagent according to 1.
Embedded image

[0017]
14 Above 1. ~ 13. The N-terminal amino group of a peptide, the side chain amino group of a lysine residue, or the N-terminal amino group and the side chain amino group of a lysine residue are modified using the labeling reagent according to any one of A method for measuring or quantifying peptides with high sensitivity.
15. 14. The peptide according to the above 14, wherein the peptide is phosphorylated. A method for highly sensitive measurement or quantification of the peptide described in 1.
[0018]
16. A method of quantifying a peptide by a mass spectrometer using a labeling reagent for modifying a peptide and another labeling reagent having a specific substituent introduced into the labeling reagent as a pair.
[0019]
17. The peptide is derivatized by chemical modification using one of the labeling reagent and the other labeling reagent to obtain a derivatized peptide,
Separately, a control peptide is derivatized by chemical modification using either one of the labeling reagent and the other labeling reagent to obtain a derivatized control peptide,
16. The derivatized peptide and the derivatized control peptide are mixed, and the mixed derivatized peptide is measured by a mass spectrometer. A method for quantifying the peptide described in 1.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present invention, the term “peptide” is used to include oligopeptides, polypeptides, and proteins.
The present invention is a labeling reagent for sensitive measurement and quantification of peptides using a mass spectrometer, and is a carboxylic acid derivative of an aromatic compound containing nitrogen represented by the following general formula (A).
[0021]
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[0022]
In the formula, X is a 3-pyridyl group having a substituent, a nitrogen-containing aromatic heterocyclic group other than the 3-pyridyl group which may have a substituent, or an aromatic having an amino group having a substituent. Represents a hydrocarbon group. Moreover, as said nitrogen-containing aromatic heterocyclic group, 2-pyridyl group, 4-pyridyl group, benzimidazolyl group, imidazolyl group, etc. are mentioned. Examples of the aromatic hydrocarbon group include a phenyl group.
[0023]
The labeling reagent in which X is a 2-pyridyl group includes the following formula (1).
[0024]
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[0025]
Examples of the labeling reagent in which X is a 3-pyridyl group include the following formulas (3) to (10).
[0026]
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[0027]
The labeling reagent in which X is a 4-pyridyl group includes the following formula (11).
[0028]
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[0029]
The labeling reagent in which X is a benzimidazolyl group includes the following formula (12).
[0030]
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[0031]
The labeling reagent in which X is a phenyl group includes the following formula (13).
[0032]
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[0033]
Examples of the labeling reagent in which X is an imidazolyl group include the following formula (14).
[0034]
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[0035]
The labeling reagent of the present invention is appropriately selected by those skilled in the art from carboxylic acids such as pyridine, imidazole and benzimidazole having different basicity, and the selected carboxylic acid is converted into, for example, dry tetrahydrofuran (dry) using N-hydroxysuccinimide. It can be synthesized by succinimidation by condensation with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) in (THF). The labeling reagent (3) is taken as an example, and a synthesis example of the labeling reagent of the present invention is shown in the following chemical reaction formula B.
[0036]
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[0037]
At this time, 1-20 equivalent can be used for N-hydroxysuccinimide with respect to the said carboxylic acids. As the condensing agent, dicyclohexylcarbodiimide (DCC) can be used in addition to the EDC. As a quantity of a condensing agent, 1-10 equivalent can be used with respect to the said carboxylic acid. As the solvent, for example, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, dimethylformamide and the like can be used alone or in admixture of two or more. The amount of the solvent can be used so that the concentration of all reagents is 1 to 30% by weight. As reaction conditions for succinimidation, for example, the reaction can be performed at 0 to 50 ° C. for 0.5 hours to 10 days.
[0038]
Further, the compounds represented as the labeling reagents 4 and 7, that is, 1- [6- (D ₃ ) Methylnicotinoyloxy] succinimide (4) and 1- {2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinoyloxy} succinimide (7) is a novel compound.
[0039]
1- [6- (D ₃ ) Methylnicotinoyloxy] succinimide (4) is a novel compound 6- (D ₃ ) It can be synthesized from 6-methylnicotinic acid using methylnicotinic acid as an intermediate.
[0040]
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[0041]
1- {2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinoyloxy} succinimide (7) is a novel compound 2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinic acid (16) as an intermediate can be synthesized from 2,6-dimethylnicotinic acid.
[0042]
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[0043]
The synthesis by the synthesis routes of the above formulas C and D is preferable in that a starting material does not contain a stable isotope and is generally available.
[0044]
Hereinafter, the synthesis method of these novel compounds will be described.
In the starting material nicotinic acid, the hydrogen of the methyl group is deuterated. For deuteration, a heavy aqueous solution of a metal hydroxide deuterium substitute can be used. As a heavy aqueous solution of a metal hydroxide deuterium substitute, NaOD-D ₂ O, KOD-D ₂ O, LiOD-D ₂ O etc. are mentioned. As the heavy aqueous solution, a metal hydroxide deuterium substitute of 0.5 to 30% by weight can be used. Moreover, the quantity of the said heavy aqueous solution can be used so that the said nicotinic acid may be contained about 1-30 weight part with respect to the whole reaction solution, for example.
[0045]
The deuteration reaction can be performed, for example, in a sealed tube under conditions of 100 to 200 ° C. and 1 to 10 hours. After the reaction, neutralization may be performed using diluted hydrochloric acid or the like. Thus, from 6-methylnicotinic acid, 6- (D ₃ ) Obtain methyl nicotinic acid (15). In addition, 2,6-dimethylnicotinic acid is 2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinic acid (16). In the present invention, these deuterated nicotinic acids (15) or (16) can be used in the next reaction without any particular purification.
[0046]
The deuterated nicotinic acid (15) or (16) is then succinimidated. Succinimidation can be performed by condensing deuterated nicotinic acid (15) or (16) with N-hydroxysuccinimide. N-hydroxysuccinimide can be used, for example, in an amount of 1 to 20 equivalents based on deuterated nicotinic acid (15) or (16). As the condensing agent, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or the like is preferably used. For example, 1 to 10 equivalents of the condensing agent can be used with respect to deuterated nicotinic acid. As the solvent, for example, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, dimethylformamide and the like can be used alone or in admixture of two or more. The amount of the solvent can be used so that the concentration of all reagents is 1 to 30% by weight.
[0047]
The succinimidation can be performed, for example, at 0 to 50 ° C. for 0.5 hours to 10 days. In this way, 6- (D ₃ ) From methylnicotinic acid (15), 1- [6- (D ₃ ) Methylnicotinoyloxy] succinimide (4). In addition, 2,6-di (D ₃ ) From methylnicotinic acid (16), 1- {2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinoyloxy} succinimide (7). The obtained nicotinic acid derivative (4) or (7) may be purified by column chromatography, recrystallization or the like, if necessary. As described above, novel nicotinic acid derivatives (4) and (7) useful as peptide labeling reagents can be obtained.
[0048]
The compound represented as the labeling reagent 6, that is, 1- (2,6-dimethylnicotinoyloxy) succinimide (6) is also a novel compound. This compound can be synthesized by succinimidation of 2,6-dimethylnicotinic acid as shown in chemical reaction formula E below. Succinimidation can be performed in the same manner as succinimidation in the synthesis of the nicotinic acid derivative (4) or (7).
[0049]
Embedded image

[0050]
The labeling reagent of the present invention can be derivatized by efficiently chemically modifying the N-terminus of the peptide. In particular, when the N-terminal residue of a peptide is basic (arginine, histidine), acidic (aspartic acid), or has a hydroxyl group (threonine, tyrosine), it can be derivatized almost quantitatively. . When there are arginine and lysine, which are basic amino acids other than the N-terminal of the peptide, lysine is modified and arginine is not modified.
[0051]
N-terminal derivatization of peptide (Peptide) is represented by the following chemical reaction formula F. In Formula F, 1-nicotinoyl succinimides are mentioned as an example of a labeling reagent (Labeling Reagent).
[0052]
Embedded image

[0053]
Since the labeling reagent of the present invention is activated with a succinimide group, it undergoes a condensation reaction with the amino group of the peptide under weak basicity to derivatize the N-terminus of the peptide. Derivatization can be performed as follows, for example. The peptide solution and the labeling reagent solution adjusted to an appropriate pH are mixed and placed at room temperature for about 20 minutes. Further, add the same amount of the labeling reagent solution as used above and leave for about 2 hours. Furthermore, a hydroxylamine solution adjusted to an appropriate pH is added, and the mixture is allowed to stand overnight. After stopping the reaction, desalting is performed.
[0054]
When the N-terminus of the peptide is modified using the reagent of the present invention, the peptide is easily charged with a positive charge, so that the ionization efficiency is improved, and the peptide peak in mass spectrometry is detected with high sensitivity. That is, highly sensitive analysis can be performed by using the reagent of the present invention. Even in the case of a peptide having a negative charge such as a phosphorylated peptide, the ionization efficiency can be improved by using the reagent of the present invention, so that a highly sensitive analysis can be performed. Although sulfated peptides also have poor ionization efficiency, when the reagent of the present invention is used, the peak of the peptide desulfated by derivatization is detected with high sensitivity.
[0055]
The present invention also relates to a method for quantifying a peptide by a mass spectrometer using a labeling reagent for modifying a peptide and another labeling reagent in which a specific substituent is introduced into the labeling reagent. It is. As the specific substituent, those having a low molecular weight are preferable, and a methyl group is particularly preferable. For example, 1- (nicotinoyloxy) succinimide can be used as the labeling reagent, and 1- (6-methylnicotinoyloxy) succinimide (reagent 3) can be used as the other labeling reagent. Further, for example, the reagent 3 can be used as the labeling reagent, and 1- (2,6-dimethylnicotinoyloxy) succinimide (the reagent 6) can be used as a pair as the other labeling reagent.
[0056]
Specifically, the peptide can be quantified as follows. (I) The peptide is derivatized by chemical modification using either one of the labeling reagent and the other labeling reagent to obtain a derivatized peptide. (Ii) Separately, the control peptide is derivatized by chemical modification using either one of the labeling reagent and the other labeling reagent to obtain a derivatized control peptide. (Iii) Mixing the derivatized peptide and the derivatized control peptide. (Iv) The mixture of derivatized peptides is measured with a mass spectrometer. In the obtained spectrum, a peak-to-peak shifted by the difference in molecular weight of the labeling reagent can be confirmed, and the ratio of peptides derived from the peak-to-peak can be known from the ionic strength ratio.
[0057]
Examples of the peptide to be derivatized, that is, the combination of the peptide and the control peptide include a combination of a protein derived from a diseased cell and a protein derived from a normal cell.
[0058]
Since the peptide quantification method of the present invention can be used by pairing labeled reagents having the same degree of ionization efficiency with respect to the peptide, the peptide can be quantified without using a labeling reagent containing a stable isotope. It is possible, simple and inexpensive.
[0059]
【Example】
In this example, labeling reagents 1 to 14 including the labeling reagent 2 represented by the following formula were synthesized.
[0060]
Embedded image

[0061]
[Synthesis of 1- (nicotinoyloxy) succinimide (Reagent 2)]
4 mmol of commercially available nicotinic acid was dissolved in 80 ml of dry tetrahydrofuran, and 4.8 mmol of N-hydroxysuccinimide and 5.2 mmol of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) were added for 2 days at room temperature. Stir. After the reaction, the solution portion was separated and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in 80 ml of chloroform and washed with 80 ml of saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. Recrystallization was performed using ethyl acetate to obtain colorless plate crystals.
[0062]
[Example 1: Synthesis of 1- (6-methylnicotinoyloxy) succinimide (reagent 3)]
It was carried out in the same manner as the synthesis of Reagent 2 described above except that commercially available 6-methylnicotinic acid was used.
[0063]
[Example 2: 1- [6- (D ₃ ) Methylnicotinoyloxy] succinimide (reagent 4) synthesis]
Commercially available 0.5 mmol of 6-methylnicotinic acid was added to 1 wt% NaOD-D. ₂ O was dissolved in 1.0 ml and reacted in a sealed tube at 180 ° C. for 3 hours. After the reaction, the reaction mixture was neutralized with dilute hydrochloric acid, concentrated to dryness under reduced pressure, and 6- (D ₃ ) Methylnicotinic acid was obtained as product. This product was used in the next reaction without purification.
[0064]
The obtained 6- (D ₃ ) Dissolve methylnicotinic acid in 10 ml of dry tetrahydrofuran, add 0.6 mmol of N-hydroxysuccinimide and 0.65 mmol of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), and stir at room temperature for 2 days And reacted. After the reaction, the solution portion was separated and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in 10 ml of chloroform and washed with 10 ml of saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. Recrystallization with ethyl acetate gave colorless plate-like 1- [6- (D ₃ ) Methylnicotinoyloxy] succinimide in 75% yield.
[0065]
(1- [6- (D ₃ ) Methylnicotinoyloxy] succinimide identification data)
mp: 165-167 ° C
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): δ 2.92 (br. S, 4H, CH ₂ * 2), 7.32 (d, 1H, J = 8.1 Hz, 5-H), 8.27 (dd, 1H, J = 2.2, 8.1 Hz, 4-H), 9.22 ( d, 1H, J = 2.2Hz, 2-H)
MS: m / z 237 (M ⁺ )
[0066]
[Example 3: 1- {2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinoyloxy} succinimide (Reagent 7) Synthesis]
2,6-dimethylnicotinic acid is described in Kato T. et al. Noda M. et al. Chem. Pharm. Bull. , 24, 303-309 (1976). 0.5 mmol of 2,6-dimethylnicotinic acid obtained was added to 1 wt% NaOD-D. ₂ O was dissolved in 1.0 ml, and reacted at 180 ° C. for 8 hours in a sealed tube. After the reaction, the reaction mixture was neutralized with dilute hydrochloric acid, concentrated to dryness under reduced pressure, and 2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinic acid was obtained as product. This product was used in the next reaction without purification.
[0067]
The obtained 2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinic acid was dissolved in 10 ml of dry tetrahydrofuran, 0.6 mmol of N-hydroxysuccinimide and 0.65 mmol of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) were added, and 2 days at room temperature. Stir to react. After the reaction, the solution portion was separated and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was dissolved in 10 ml of chloroform and washed with 10 ml of saturated saline. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by column chromatography (silica gel, ethyl acetate: hexane = 1: 1), and 1- {2,6-di [(D ₃ ) Methyl] nicotinoyloxy} succinimide was obtained in 70% yield. Recrystallization was performed using ethyl acetate to obtain colorless plate crystals.
[0068]
(1- {2,6-di [(D ₃ ) Identification data for methyl] nicotinoyloxy} succinimide)
mp: 135-137 ° C
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): δ 2.92 (br. S, 4H, CH ₂ * 2), 7.14 (d, 1H, J = 8.1 Hz, 5-H), 8.27 (d, 1H, J = 8.1 Hz, 4-H)
MS: m / z 254 (M ⁺ )
[0069]
[Example 4: Synthesis of 1- (2,6-dimethylnicotinoyloxy) succinimide (reagent 6)]
2,6-dimethylnicotinic acid is described in Kato T. et al. Noda M. et al. Chem. Pharm. Bull. , 24, 303-309 (1976). 4 mmol of 2,6-dimethylnicotinic acid obtained was dissolved in 80 mL of dry tetrahydrofuran, 4.8 mmol of N-hydroxysuccinimide and 5.2 mmol of EDC were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After separating the viscous residue and the solution portion, the solution portion was concentrated under reduced pressure. Chloroform 80mL was added here, and it wash | cleaned by the saturated salt solution 80mL. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated to dryness. The crude product was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate: hexane = 1: 1) to obtain 1- (2,6-dimethylnicotinoyloxy) succinimide in a yield of 66%. Recrystallization was performed from ethyl acetate to obtain colorless plate crystals.
[0070]
(Identification data of 1- (2,6-dimethylnicotinoyloxy) succinimide)
mp: 134-136 ° C
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): δ 2.61 (s, 3H, 6-CH ₃ ), 2.82 (s, 3H, 2-CH ₃ ), 2.92 (br. S, 4H, CH ₂ * 2), 7.19 (d, 1H, J = 8.1 Hz, 5-H), 8.28 (d, 1H, J = 8.1 Hz, 4-H)
EIMS: m / z 248 (M ⁺ )
[0071]
Other labeling reagents were respectively synthesized in the same manner as in Example 4 except that carboxylic acids corresponding to the raw materials were selected and used.
[0072]
In this example, the peptides shown in Table 1 were used. In Table 1, the peptide used (Peptide), the structure of the peptide represented by the one-letter abbreviation of the amino acid (Structure), and the monoisotopic mass of each are shown.
[0073]
[Table 1]

[0074]
These peptides were derivatized by chemically modifying the N-terminus using the method described below.
30 μl of a labeled reagent solution (solution dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer pH 8.5 at a concentration of 1 mg / ml) was added to 30 μl of a 50 pmol / μl aqueous peptide solution and left for 20 minutes. Next, 30 μl of the above labeled reagent solution was added and left for 2 hours. Further, 30 μl of hydroxylamine (solution dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer pH 8.5 at a concentration of 34.8 mg / ml) was added and allowed to react overnight. After completion of the reaction, 30 μl of formic acid was added to stop the reaction, and desalting was performed with ZipTipC18 (Millipore).
[0075]
[Example 5: Peptide modification rate of labeling reagent]
P1 bradykinin (RPPPGFSPFR; SEQ ID NO: 1) was used as a model peptide, and the N-terminus was chemically modified using each of the synthesized labeling reagents to derivatize the peptide. Table 2 shows the reagents used, the monoisotopic mass of the derivatized peptide, and the modification rate (%).
[0076]
[Table 2]

[0077]
FIG. 1 shows the MALDI analysis results before and after derivatization of P1 bradykinin when using the labeling reagent 3. In FIG. 1, the horizontal axis represents the mass number (Mass (m / z)), and the vertical axis represents the relative intensity (%, Intensity) of the ions (hereinafter the same for all spectrum charts). In the measurement of the spectrum shown in FIG. 1, ACTH (Adrenocorticotropic Mormon Human, 1-24, monoisotopic mass 2465.20) was used as an internal standard sample (Internal Calibration). The spectrum in FIG. 1 was before Byadykinin was subjected to derivatization with Reagent 3 (Derivation by Reagent 3), and was detected as a peak having a mass number of 1160.18 (m / z). The spectrum in the lower part of FIG. 1 is obtained after derivatization of bradykinin and is detected as a peak having a mass number of 1179.24 (m / z), confirming that derivatization has been performed. It was.
[0078]
[Example 6: Derivatization of phosphorylated peptide]
A synthetic peptide (Peptide) P9 (TNASYSPRAK; SEQ ID NO: 3) having two amino groups (N-terminal amino group and lysine side chain amino group) in the molecule is used for derivatization with reagent 3. It was. The results of MALDI-TOF / MS before and after derivatization of P9 are shown in FIG. In the MALDI-TOF / MS measurement, ACTH was used as an internal standard sample.
[0079]
In FIG. 2, the ionic strength of the peak of P9 before derivatization (upper figure) and after (lower figure) and the ionic strength of the peak of the internal standard sample ACTH can be compared. In the above spectrum before receiving derivatization by Reagent 3 (Derivation by Reagent 3), a molecular ion peak of P9 having a mass number of 1094.16 (m / z) was detected. In the spectrum of the lower figure after derivatization, a peak in which one of the two amino groups of P9 is derivatized (mono) by derivatization has a mass number of 121.24 (m / z). , And a derivative of both amino groups (di) was detected as a peak having a mass number of 1332.31 (m / z). These ionic strengths are stronger than before derivatization compared to the ionic strength of ACTH. That is, it was shown that detection was possible with high sensitivity by derivatization with the reagent of the present invention.
[0080]
Separately, phosphorylated synthetic peptide (Peptide) P10 (TNAS (HPO ₃ ) YSPRAK; SEQ ID NO: 4) was used for derivatization with reagent 3 in the same manner as P9, and MALDI-TOF / MS measurement was performed. Here, in P10, the fourth serine residue from the N-terminal is phosphorylated, and the phosphorylated serine residue is converted to S (HPO ₃ ). The results of MALDI-TOF / MS of P10 before and after derivatization are shown in FIG.
[0081]
In the spectrum before the derivatization with Reagent 3 (Derivatization by Reagent 3) (upper figure), the molecular ion peak of P10 is very low compared to the peak of ACTH. In P10 of the spectrum after derivatization (below), as in the case of P9 above, a peak of one of two amino groups derivatized (mono) and two amino groups Both were derivatized (di) peaks were detected, but their ionic strengths were also stronger than before derivatization. That is, it was shown that the phosphorylated peptide could be detected with high sensitivity by derivatization with the reagent of the present invention.
[0082]
[Example 7: Derivatization of substance P]
Substance P of P2 as a peptide (Substance P; RPKPEEFFGLM-NH ₂ Derivatization by reagent 3 (Derivation by Reagent 3) was performed using SEQ ID NO: 2), and MALDI-TOF / MS was measured using ACTH as an internal standard sample. Here, P2 is a C-terminal residue methionine residue is amidated, and the amidated methionine residue is M-NH. ₂ It expresses. The results of MALDI-TOF / MS of P2 before and after derivatization are shown in FIG. In P2 after derivatization (below), the peak of one of the two amino groups derivatized (mono) and the derivative of both of the two amino groups (di ) Peak was detected.
[0083]
[Example 8: PSD spectrum]
Peptide P9 (TNASYSPRAK; SEQ ID NO: 3) and peptide P9 (6-Me-Nic-TNASYSPRAK; SEQ ID NO: 5) which has undergone derivatization with Reagent 3 (MALDI-TOF / SEQ ID NO: 5) in PSD mode MS was measured. Here, 6-Me-Nic-T represents threonine into which a 6-methylnicotinoyl group has been introduced by derivatization. The result of MALDI-TOF / MS of the peptide P9 not derivatized is shown in FIG. 5, and the result of MALDI-TOF / MS of the derivatized peptide P9 is shown in FIG. In each spectrum, the position of the fragment ion peak is shown. From these spectra, it was shown that, due to derivatization, in the spectrum obtained in the PSD mode, the ionic strength increases and the number of peaks also increases.
[0084]
[Example 9: Sensitive measurement of phosphorylated peptide by derivatization]
Peptide P10 was derivatized with Reagent 2 and Reagent 3 and mass spectrometry was performed with MALDI-TOF / MS. At this time, 10 pmol / μl of peptide was used as an internal standard sample of 1 pmol / μl of ACTH (Adrenocorticotropic Hormon Human, 1-24, molecular weight 2464.2, manufactured by Peptide Laboratories) and α-cyano-4-hydroxysilicate as a matrix. Measured using skin acid (CHCA).
[0085]
FIG. 6 shows the MALDI-TOF / MS analysis results of P10 before (a) and after ((b) and (c)) derivatization. In the spectrum (a) of P10 before derivatization, P10 (mass number 1174.75 (m / z)) is detected together with ACTH (mass number 24466.72 (m / z)). In the spectrum (b) of P10 after derivatization with the reagent 2, one of the two amino groups of P10 was derivatized and the mass number increased by 106 (mass number 1280.01 (m / Z)) and the two amino groups derivatized to increase the mass number by (106 × 2) (mass number 1386.09 (m / z)). In the spectrum (c) of P10 after derivatization with the reagent 3, one of the two amino groups of P10 was derivatized to increase the mass number by 120 (mass number 1294.007 (m / Z)) and two amino groups derivatized to increase mass number (120 × 2) (mass number 1414.07 (m / z)) were detected.
[0086]
According to FIG. 6A, the molecular ion peak of P10 before derivatization is very low compared to the peak of ACTH. However, according to spectrum (b) of P10 after derivatization with reagent 2 and spectrum (c) of P10 after derivatization with reagent 3, the ionic strength is increased 10 to 20 times. . That is, it was shown that ionization efficiency was increased by derivatization and detection was possible with high sensitivity.
[0087]
Further, when the same peptides having different concentrations were separately modified with reagents having different molecular weights, and after mixing, MALDI-TOF / MS was measured, two peaks shifted by the difference in the molecular weight of the reagents could be confirmed. In the present invention, the error between the peak intensity ratio and the relative amount of peptide was 15-30%. By using the reagent of the present invention, the possibility that it can be used for the analysis of fluctuation of peptides having a difference in expression level of 15 to 30% or more was shown.
[0088]
[Example 10: Quantitative analysis by derivatization]
The derivatization was performed using Reagent 2 for five types of P1, 1, 2, 3, 4 and 5 pmol / μl. On the other hand, it was derivatized with Reagent 3 to 5 pmol / μl of P1. Each P1 solution derivatized with Reagent 2 was mixed with an equal amount of P1 solution derivatized with Reagent 3 to prepare 5 types of mixed solutions. The result of having analyzed each mixture by MALDI-TOF / MS is shown in FIG. 7, (a) is P1 (Bradykinin), (b) is a mixture of 1 pmol / μl of P1 derivatized with Reagent 2 and 5 pmol / μl of P1 derivatized with Reagent 3, c) is a mixture of 2 pmol / μl of P1 derivatized with reagent 2 and 5 pmol / μl of P1 derivatized with reagent 3, and (d) is a mixture of P1 derivatized with reagent 2 A mixture of 3 pmol / μl and 5 pmol / μl of P1 derivatized with reagent 3, (e) shows 4 pmol / μl of P1 derivatized with reagent 2 and P1 derivatized with reagent 3 (F) is the MAD of the mixture of 5 pmol / μl of P1 derivatized with Reagent 2 and 5 pmol / μl of P1 derivatized with Reagent 3 A I-TOF / MS spectra.
[0089]
In any of the spectra (b) to (f) in FIG. 7, an ionic strength proportional to the concentration ratio of the derivatized peptide was obtained. This showed that samples with different concentrations were derivatized with labeling reagents 2 and 3, respectively, and then quantified by mixing a certain amount of each derivatized sample and analyzing with MALDI.
[0090]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a reagent capable of performing qualitative and quantitative analysis of a peptide using a mass spectrometer with high sensitivity, and a method of performing qualitative and quantitative analysis of a peptide using a mass spectrometer with high sensitivity. . In particular, according to the present invention, a reagent capable of performing qualitative and quantitative analysis of a phosphopeptide with poor ionization efficiency in mass spectrometry with high sensitivity, and a qualitative and quantitative analysis of phosphopeptide using a mass spectrometer with high sensitivity. A method of performing can be provided.
[0091]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a MALDI-TOF / MS spectrum chart of bradykinin and bradykinin derivatized with a labeling reagent of the present invention.
FIG. 2 is a MALDI-TOF / MS spectrum chart of a synthetic peptide and a synthetic peptide derivatized with the labeling reagent of the present invention.
FIG. 3 is a MALDI-TOF / MS spectrum chart of a phosphorylated synthetic peptide and a phosphorylated synthetic peptide derivatized with the labeling reagent of the present invention.
FIG. 4 is a MALDI-TOF / MS spectrum chart of substance P and substance P derivatized with the labeling reagent of the present invention.
FIG. 5 is a MALDI-TOF / MS spectrum chart of a synthetic peptide and a synthetic peptide derivatized with the labeling reagent of the present invention, measured in PSD mode.
FIG. 6 is a MALDI-TOF / MS spectrum chart of a phosphorylated synthetic peptide and a phosphorylated synthetic peptide derivatized with two kinds of labeling reagents of the present invention.
FIG. 7 shows the results of quantitative analysis of bradykinin by derivatization using the labeling reagent of the present invention.

Claims (11)

General formula (A) for highly sensitive measurement or quantification of peptides in a mass spectrometer:

(In the formula, X is a 3-pyridyl group having a substituent, or a nitrogen-containing aromatic heterocyclic group other than the 3-pyridyl group which may have a substituent, or an aromatic having an amino group having a substituent. Represents a group hydrocarbon group.) The labeling reagent is represented by the following formula (1):

The labeling reagent of Claim 1 represented by these. The labeling reagent is represented by the following formulas (3) to (10):

The labeling reagent according to claim 1, which is represented by any one of the above. The labeling reagent is represented by the following formula (11):

The labeling reagent of Claim 1 represented by these. The labeling reagent is represented by the following formula (12):

The labeling reagent of Claim 1 represented by these. The labeling reagent is represented by the following formula (13):

The labeling reagent of Claim 1 represented by these. The labeling reagent is represented by the following formula (14):

The labeling reagent of Claim 1 represented by these. An N-terminal amino group of a peptide, a side-chain amino group of a lysine residue, or a side-chain amino group of an N-terminal amino group and a lysine residue using the labeling reagent according to any one of claims 1 to 7 A method for highly sensitive measurement or quantification of peptides using a mass spectrometer. The method for highly sensitive measurement or quantification of the peptide according to claim 8, wherein the peptide is phosphorylated. A method of quantifying a peptide by a mass spectrometer using a labeling reagent for modifying a peptide and another labeling reagent having a specific substituent introduced into the labeling reagent as a pair. The peptide is derivatized by modifying it using either one of the labeling reagent and the other labeling reagent to obtain a derivatized peptide,
Separately, a control peptide is derivatized by chemical modification using either one of the labeling reagent and the other labeling reagent to obtain a derivatized control peptide,
Mixing the derivatized peptide and the derivatized control peptide;
The method for quantifying a peptide according to claim 10, wherein the mixed derivatized peptide is measured by a mass spectrometer.

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