JP2005046058A - Method and apparatus for assaying in vivo tissue filling material - Google Patents

Method and apparatus for assaying in vivo tissue filling material Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To ship an in vivo tissue filling material having sufficient activity by simple assay at the shipping of an in vivo tissue filling material. <P>SOLUTION: The method for assaying the in vivo tissue filling material comprises a step S1 and a step S2 for assaying the amount of an alkaline phosphatase and the number of cells contained in the cultured in vivo tissue filling material, a step 3 for determining whether or not the assayed amount of the alkaline phosphatase is more than or equal to a specified value, a step 4 for determining whether the assayed number of cells is more than or equal to a specified value, and, a step 5 in the case of more than or equal to the specified value of the amount the alkaline phosphatase and more than or equal to the specified value of the number of cells, determining the culture completion. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

この発明は、生体組織補填体の検査方法および装置に関するものである。   The present invention relates to an inspection method and apparatus for a biological tissue filling body.

培養されている生体組織、例えば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化しているか否かを示す指標として、従来より、骨芽細胞が分泌するアルカリフォスタファーゼおよびオステオカルシンが用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。
アルカリフォスタファーゼの量は、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化する過程において経時的に上昇していくが、ある時点でピークを迎え、その後減少していくことが知られている。一方、オステオカルシンは、骨芽細胞が産生すると考えられており、その量は、アルカリフォスタファーゼに遅れて増加する。
吉川隆章、生体材料、vol.19、27-33、2001 Conventionally, alkaline fosterase and osteocalcin secreted by osteoblasts have been used as an index to indicate whether cultured biological tissue, for example, mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts ( For example, refer nonpatent literature 1.).
It is known that the amount of alkaline phosphatase increases with time in the process of differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts, but reaches a peak at a certain point and then decreases. On the other hand, osteocalcin is considered to be produced by osteoblasts, and its amount increases after alkaline fosfase.
Takakawa Yoshikawa, Biomaterials, vol.19, 27-33, 2001

その発生の時期の相違から、アルカリフォスタファーゼの量が減少しても、オステオカルシンの量が増加していることがあり、一概にアルカリフォスタファーゼの量のみによって骨芽細胞への十分な分化を判断することは困難である。また、オステオカルシンの量が十分に多い場合においても、細胞のいくつかが大量のオステオカルシンを産生しているに過ぎない場合もあり、生体組織補填体として十分な活性を備えているか否かを判断することが困難であった。   Due to the difference in the timing of its occurrence, even if the amount of alkaline fosterase is decreased, the amount of osteocalcin may be increased. In general, sufficient differentiation into osteoblasts is possible only by the amount of alkaline fosterase. It is difficult to judge. In addition, even when the amount of osteocalcin is sufficiently high, some of the cells may only produce a large amount of osteocalcin, and it is determined whether or not it has sufficient activity as a body tissue complement. It was difficult.

アルカリフォスタファーゼの量およびオステオカルシンの量の変化を経時的に測定していき、その変化の推移から、十分に活性を備えた生体組織補填体として最適な状態となる時点を推定して出荷することも考えられる。しかし、検査に要する時間、サンプル作製などの検査に要する費用を考慮すると現実的な手段ではない。   Measure the amount of alkaline fostafase and the amount of osteocalcin over time, and estimate the optimal point in time for a fully active biological tissue complement from the transition of the changes. It is also possible. However, considering the time required for inspection and the cost required for inspection such as sample preparation, it is not a practical means.

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、十分に活性を備えた生体組織補填体を出荷することを可能にする生体組織補填体の検査方法を提供することを目的としている。   The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and provides a body tissue filling device that makes it possible to ship a body tissue filling body having sufficient activity by simple measurement at the time of shipment of the body tissue filling body. The purpose is to provide a body inspection method.

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量および細胞数を測定するステップと、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップと、測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断するステップと、アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The invention according to claim 1 is a step of measuring the amount of alkaline phosphatase and the number of cells contained in the cultured body tissue complement, and whether the measured amount of alkaline phosphatase is a predetermined value or more. A step of determining, a step of determining whether or not the measured number of cells is equal to or greater than a predetermined value, and a case where the amount of alkaline fosterase is equal to or greater than a predetermined value and the number of cells is equal to or greater than a predetermined value. And a method for examining a body tissue complement comprising the step of determining the end of culture.

請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の検査方法において、培養された生体組織補填体に含まれるオステオカルシンの量を測定するステップと、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値より少ないと判断されたときに、測定されたオステオカルシンの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、オステオカルシンの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。   According to a second aspect of the present invention, there is provided the method for testing a biological tissue complement according to the first aspect, wherein the step of measuring the amount of osteocalcin contained in the cultured biological tissue complement, and the measured alkaline fosfase Determining that the amount of osteocalcin measured is greater than or equal to a predetermined value when it is determined that the amount is less than a predetermined value; the amount of osteocalcin is greater than or equal to a predetermined value; and the number of cells is predetermined. When the value is equal to or greater than the value, a method for examining a body tissue complement comprising the step of determining the end of culture is provided.

請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の検査方法において、細胞数の測定を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）の検出により行う生体組織補填体の検査方法を提供する。   The invention according to claim 3 is the biological tissue complement inspection method according to claim 1 or 2, wherein the number of cells is measured by 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5. Provided is a method for examining a body tissue complement by detecting diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT).

請求項４に係る発明は、培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量を測定するアルカリフォスタファーゼ量測定手段と、前記生体組織補填体に含まれる細胞数を測定する細胞数測定手段と、測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断する第１判断手段と、測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断する第２判断手段と、アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断する最終判断手段とを備える生体組織補填体の検査装置を提供する。   The invention according to claim 4 is an alkaline phosphatase amount measuring means for measuring the amount of alkaline phosphatase contained in a cultured biological tissue complement, and a cell for measuring the number of cells contained in the biological tissue complement. A number determination means, a first determination means for determining whether or not the measured amount of alkaline fosterase is greater than or equal to a predetermined value, and a second determination for determining whether or not the measured number of cells is greater than or equal to a predetermined value. There is provided a biological tissue complement inspection apparatus comprising: means and final determination means for determining the end of culture when the amount of alkaline fosterase is not less than a predetermined value and the number of cells is not less than a predetermined value. .

請求項１に係る発明によれば、アルカリフォスタファーゼの量に加えて細胞数が測定され、両者がそれぞれ所定値を超えたことを条件として培養を終了することが判断される。その結果、少ない数の細胞が大量のアルカリフォスタファーゼを分泌しているような場合を除外して、補填後に十分な骨形成作用を生じ得る生体組織補填体を出荷することが可能となる。
また、経時的な測定を行うことなく、出荷時等に短時間に判断することができるので、検査のコストや手間を省くことが可能となる。 According to the first aspect of the present invention, the number of cells is measured in addition to the amount of alkaline phosphatase, and it is determined that the culture is terminated on the condition that both exceed a predetermined value. As a result, excluding cases where a small number of cells secrete a large amount of alkaline phosphatase, it is possible to ship a biological tissue complement that can produce a sufficient bone forming action after supplementation.
In addition, since it is possible to make a determination in a short time at the time of shipment or the like without performing measurement over time, it is possible to save inspection costs and labor.

請求項２に係る発明によれば、アルカリフォスタファーゼの量が少ない場合であっても、オステオカルシンの量が十分に多い場合には、細胞の活性が十分であると判断することができ、しかも、十分な数の細胞が存在しているために、補填後に十分な生体組織形成作用を生じ得る生体組織補填体を出荷することが可能となる。
請求項３に係る発明によれば、細胞数を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）の検出により簡易に測定することができる。 According to the invention of claim 2, even if the amount of alkaline fosfase is small, if the amount of osteocalcin is sufficiently large, it can be determined that the cell activity is sufficient, and Since a sufficient number of cells are present, it is possible to ship a biological tissue filling body that can produce a sufficient biological tissue forming action after supplementation.
According to the invention of claim 3, the number of cells can be easily measured by detecting 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT). Can do.

請求項４に係る発明によれば、アルカリフォスタファーゼ量測定手段の作動により、生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量が測定され、細胞数測定手段の作動により、生体組織補填体に含まれる細胞数が測定される。その後、第１判断手段により、アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かが判断されるとともに、第２判断手段の作動により、細胞数が所定値以上であるか否かが判断される。そして、最終判断手段により、アルカリフォスタファーゼの量のみならず、細胞数によって培養の終了が判断されるので、十分に活性を有し、補填された後にも生体組織形成作用を十分に発揮し得る生体組織補填体を提供することが可能となる。   According to the invention of claim 4, the amount of alkaline phosphatase contained in the biological tissue complement is measured by the operation of the alkaline phosphatase amount measuring means, and the biological tissue complement is operated by the operation of the cell number measuring means. The number of cells contained in is measured. Thereafter, the first determination means determines whether or not the amount of alkaline fosterase is equal to or greater than a predetermined value, and the operation of the second determination means determines whether or not the number of cells is equal to or greater than a predetermined value. . And since the end of the culture is judged not only by the amount of alkaline phosphatase but also by the number of cells by the final judging means, it is sufficiently active and sufficiently exhibits the biological tissue forming action even after supplementation. It becomes possible to provide the obtained biological tissue complement.

この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法および装置について図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法は、例えば、骨髄間葉系幹細胞をリン酸カルシウム多孔体のような生体組織補填材に付着させて所定期間培養した培養骨の検査方法である。この検査方法は、図１に示されるように、第１ステップＳ１から第６ステップＳ６までの６個のステップを備えている。第１ステップＳ１は、提供された培養骨に含まれるアルカリフォスタファーゼの量を測定する。第２ステップＳ２は、培養骨に含まれる細胞数を測定する。第３ステップＳ３は、アルカリフォスタファーゼの量が所定のしきい値Ａ１より大きいか否かを判断する。第４ステップＳ４は、アルカリフォスタファーゼの量が所定のしきい値Ａ１より大きいと判断された場合に、細胞数が所定のしきい値Ａ２より多いか否かを判断する。第５ステップＳ５は、細胞数が所定のしきい値Ａ２より多い場合に、出荷を許可するステップである。第６ステップＳ６は、アルカリフォスタファーゼの量がしきい値Ａ１より少ない場合および細胞数がしきい値Ａ２より少ない場合に出荷を禁止するステップである。 A method and apparatus for examining a tissue substitute according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIG.
The method for examining a tissue substitute according to this embodiment is, for example, a method for examining cultured bone obtained by attaching bone marrow mesenchymal stem cells to a tissue filling material such as a calcium phosphate porous body and culturing for a predetermined period. As shown in FIG. 1, this inspection method includes six steps from a first step S1 to a sixth step S6. In the first step S1, the amount of alkaline phosphatase contained in the provided cultured bone is measured. In the second step S2, the number of cells contained in the cultured bone is measured. In the third step S3, it is determined whether or not the amount of alkaline fosterase is greater than a predetermined threshold value A1. The fourth step S4 determines whether or not the number of cells is greater than a predetermined threshold A2 when it is determined that the amount of alkaline fosterase is greater than the predetermined threshold A1. The fifth step S5 is a step of permitting shipment when the number of cells is larger than a predetermined threshold value A2. The sixth step S6 is a step of prohibiting shipment when the amount of alkaline fosterase is less than the threshold value A1 and when the number of cells is less than the threshold value A2.

アルカリフォスタファーゼの量は、Ｐ−ニトロフェニルリン酸法（和光純薬）でＰ−ニトロフェノールの生成速度を測定することにより測定される。
細胞数は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）を検出することにより測定される。
しきい値Ａ１，Ａ２は、細胞の種類、適用条件等に応じて適宜設定されている。例えば、しきい値Ａ１は、２０ＩＵ／Ｌ／３７℃であり、しきい値Ａ２は、１０５個である。 The amount of alkaline fosterase is measured by measuring the production rate of P-nitrophenol by the P-nitrophenyl phosphate method (Wako Pure Chemical Industries).
The cell number is determined by detecting 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT).
The threshold values A1 and A2 are appropriately set according to the cell type, application conditions, and the like. For example, the threshold value A1 is 20IU / L / 37 ℃, threshold A2 is a 10 5.

このように構成された本実施形態に係る検査方法によれば、最終的な出荷の許可が、アルカリフォスタファーゼの量のみによって判断されるのではなく、細胞数が所定値以上含まれていることをも条件として判断されるので、より正確に培養骨の機能を評価することができる。すなわち、アルカリフォスタファーゼの量がしきい値Ａ１より多いことにより、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化していることが推測できるとともに、細胞数がしきい値Ａ２より多いことにより、補填後に十分な骨形成作用が発生することが推測できる。そして、アルカリフォスタファーゼの量の変化を経時的に測定するのではなく、比較的短時間の内にこのような判断を行うことができるので、検査に要するコストや手間を省くことができるという効果を奏する。   According to the inspection method according to the present embodiment configured as described above, the final shipment permission is not determined only by the amount of alkaline fosterase, but the number of cells is not less than a predetermined value. Therefore, the function of the cultured bone can be more accurately evaluated. That is, it can be inferred that mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts when the amount of alkaline phosphatase is greater than threshold value A1, and compensation is provided when the number of cells is greater than threshold value A2. It can be inferred that sufficient osteogenic action will occur later. And since it is possible to make such a determination within a relatively short period of time rather than measuring the change in the amount of alkaline phosphatase over time, the cost and labor required for the inspection can be saved. There is an effect.

また、細胞数の測定にＭＴＴを使用しているので、ＣＣＫ（Cell Counting Kit）による場合のように、培養骨の分化過程において培養液中に使用されるアスコルビン酸等の影響を受けることが比較的少なく、精度よく測定することができる。   In addition, since MTT is used to measure the number of cells, it is compared with the influence of ascorbic acid used in the culture solution in the differentiation process of cultured bone as in the case of CCK (Cell Counting Kit). Therefore, it is possible to measure with high accuracy.

次に、本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法は、図２に示されるように、提供された培養骨に含まれるオステオカルシンの量を測定する第７ステップＳ７と、オステオカルシンの量が所定のしきい値Ａ３より多いか否かを判断する第８ステップＳ８とをさらに備えている点で、第１の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法と相違している。   Next, the biological tissue complement inspection method according to the second embodiment of the present invention includes a seventh step S7 for measuring the amount of osteocalcin contained in the provided cultured bone, as shown in FIG. The method further includes an eighth step S8 for determining whether or not the amount of osteocalcin is greater than a predetermined threshold value A3, and is different from the method for testing a biological tissue complement according to the first embodiment. .

本実施形態に係る検査方法によれば、第３ステップＳ３において、アルカリフォスタファーゼの量がしきい値Ａ１より少ない場合には、第８ステップＳ８において、オステオカルシンの量がしきい値Ａ３より多いか否かが判断される。オステオカルシンの量がしきい値Ａ３より多いと判断された場合には、たとえ、アルカリフォスタファーゼの量が少ない場合であっても、骨芽細胞の活性が十分に高いと考えられるので、第４ステップＳ４に進んで細胞数がしきい値Ａ２より多いか否かが判断される。その結果、細胞数がしきい値Ａ２より多い場合には、ステップＳ５において出荷が許可され、オステオカルシンの量がしきい値Ａ３以下の場合、および細胞数がしきい値Ａ２以下の場合には、ステップＳ６において出荷が禁止されることになる。   According to the inspection method according to the present embodiment, when the amount of alkaline phosphatase is smaller than the threshold value A1 in the third step S3, the amount of osteocalcin is larger than the threshold value A3 in the eighth step S8. It is determined whether or not. If it is determined that the amount of osteocalcin is greater than the threshold A3, the activity of osteoblasts is considered to be sufficiently high even if the amount of alkaline fosfase is small. Proceeding to step S4, it is determined whether or not the number of cells is greater than a threshold value A2. As a result, if the number of cells is greater than the threshold value A2, shipping is permitted in step S5. If the amount of osteocalcin is not more than the threshold value A3 and if the number of cells is not more than the threshold value A2, In step S6, shipment is prohibited.

オステオカルシンの量は、ＥＩＡ法によるオステオカルシン測定キット（タカラ・バイオ）により測定される。
しきい値Ａ３は、細胞の種類、適用条件等に応じて適宜設定されている。例えば、しきい値Ａ３は、１０ng/mlである。 The amount of osteocalcin is measured by an osteocalcin measurement kit (Takara Bio) based on the EIA method.
The threshold value A3 is appropriately set according to the cell type, application conditions, and the like. For example, the threshold value A3 is 10 ng / ml.

したがって、最終的な出荷の許可が、アルカリフォスタファーゼの量による判断に加えて、オステオカルシンの量により判断されるとともに、細胞数が所定値以上含まれていることをも条件として判断されるので、より正確に培養骨の機能を評価することができる。
その結果、骨欠損部に補填された後に、十分な骨形成作用を生じ得る培養骨のみに対して出荷の許可が出されるので、高い性能の培養骨を提供することが可能となる。 Therefore, the final shipment permission is determined based on the amount of osteocalcin, in addition to the determination based on the amount of alkaline fosfase, and on the condition that the number of cells is more than a predetermined value. Thus, the function of cultured bone can be evaluated more accurately.
As a result, after the bone defect is compensated for, only the cultured bone that can generate a sufficient bone forming action is allowed to be shipped, so that it is possible to provide a high-performance cultured bone.

図３に本実施形態に係る生体組織補填体の検査装置１を例示する。
この検査装置１は、培養された所定量の培養骨を投入されることにより、当該培養骨に対して、アルカリフォスタファーゼの量を測定するアルカリフォスタファーゼ量測定部２と、オステオカルシンの量を測定するオステオカルシン量測定部３と、細胞数を測定する細胞数測定部４と、これらの測定部２〜４から出力された測定結果に基づいて、上述した図１または図２の処理を施す判断部５とを備えている。判断部からの出力が検査装置から出力され、符号６に示すディスプレイのような表示部に表示されることになる。
その結果、迅速に出荷の可否が判断でき、出荷を禁止された培養骨に対しては、再度の培養等の処理が施されることになる。 FIG. 3 illustrates a biological tissue complement inspection apparatus 1 according to this embodiment.
The inspection apparatus 1 includes an alkaline fosfase amount measuring unit 2 that measures the amount of alkaline fosfase with respect to the cultured bone by introducing a predetermined amount of cultured bone, and the amount of osteocalcin. Based on the measurement results output from these measurement units 2 to 4, the above-described processing of FIG. 1 or FIG. 2 is performed. And a determination unit 5. The output from the determination unit is output from the inspection apparatus and displayed on a display unit such as a display indicated by reference numeral 6.
As a result, it is possible to quickly determine whether or not shipment is possible, and the cultured bones for which shipment is prohibited are subjected to processing such as re-cultivation.

なお、上記実施形態においては、生体組織補填体として、リン酸カルシウム多孔体に骨髄間葉系幹細胞を付着させた培養骨を採用したが、細胞を付着させる生体組織補填材としては、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウムの他、ハイドロキシアパタイトなどの他のリン酸カルシウム、コラーゲンやキチンなどの天然高分子材料、ポリ乳酸やε−カプロラクタンのような合成高分子材料、チタン合金やステンレス鋼３１６およびタンタル合金のような金属材料や金属繊維およびこれらの材料の少なくとも２種類以上の複合材などを採用してもよい。また、生体組織補填材に生着させる細胞としては骨髄細胞に含まれる間葉系幹細胞の他、末梢血、臍帯血から分離した間葉系幹細胞を用いて生体組織補填体を製造することにしてもよい。また、間葉系幹細胞に代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞あるいは神経細胞等を採用してもよい。
また、自家細胞に限らず他家細胞でもよい。 In the above embodiment, a cultured bone obtained by attaching bone marrow mesenchymal stem cells to a calcium phosphate porous body is used as a biological tissue filling material. However, as a biological tissue filling material for attaching cells, β-TCP is used. In addition to calcium phosphate, other calcium phosphates such as hydroxyapatite, natural polymer materials such as collagen and chitin, synthetic polymer materials such as polylactic acid and ε-caprolactan, metals such as titanium alloy, stainless steel 316 and tantalum alloy Materials, metal fibers, and composite materials of at least two kinds of these materials may be employed. In addition to the mesenchymal stem cells contained in the bone marrow cells as cells to be engrafted in the biological tissue filling material, a biological tissue complement is produced using mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord blood. Also good. Further, instead of mesenchymal stem cells, ES cells, somatic stem cells, bone cells, chondrocytes or nerve cells may be employed.
Moreover, not only autologous cells but also non-autologous cells may be used.

この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the test | inspection method of the biological tissue complement body which concerns on one Embodiment of this invention. この発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the test | inspection method of the biological tissue complement body which concerns on 2nd Embodiment of this invention. この発明の検査方法を実施するための検査装置を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the test | inspection apparatus for enforcing the test | inspection method of this invention.

符号の説明Explanation of symbols

Ｓ１ 第１ステップ（アルカリフォスタファーゼの量を測定するステップ）
Ｓ２ 第２ステップ（細胞数を測定するステップ）
Ｓ３ 第３ステップ（アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップ）
Ｓ４ 第４ステップ（細胞数が所定値以上か否かを判断するステップ）
Ｓ５ 第５ステップ（培養終了を判断するステップ） S1 first step (step of measuring the amount of alkaline fosterase)
S2 Second step (step of measuring the number of cells)
S3 3rd step (step which judges whether the quantity of alkaline fosterase is more than predetermined value)
S4 4th step (step which judges whether the number of cells is more than predetermined value)
S5 5th step (step to judge the end of culture)

Claims (4)

培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量および細胞数を測定するステップと、
測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断するステップと、
測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断するステップと、
アルカリフォスタファーゼが所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法。 Measuring the amount of alkaline phosphatase and the number of cells contained in the cultured biological tissue complement;
Determining whether the amount of alkaline fosterase measured is greater than or equal to a predetermined value;
Determining whether the measured number of cells is greater than or equal to a predetermined value;
A method for examining a body tissue complement comprising the step of determining the end of culture when the alkaline fosterase is not less than a predetermined value and the number of cells is not less than a predetermined value. 培養された生体組織補填体に含まれるオステオカルシンの量を測定するステップと、
測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値より少ないと判断されたときに、測定されたオステオカルシンの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、
オステオカルシンの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える請求項１に記載の生体組織補填体の検査方法。 Measuring the amount of osteocalcin contained in the cultured biological tissue complement;
Determining whether the measured amount of osteocalcin is greater than or equal to a predetermined value when it is determined that the measured amount of alkaline fosterase is less than a predetermined value;
The method for examining a biological tissue complement according to claim 1, further comprising a step of determining the end of culture when the amount of osteocalcin is not less than a predetermined value and the number of cells is not less than a predetermined value. 細胞数の測定を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロマイド（ＭＴＴ）の検出により行う請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の検査方法。   The tissue count according to claim 1 or 2, wherein the number of cells is measured by detecting 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT). Body inspection method. 培養された生体組織補填体に含まれるアルカリフォスタファーゼの量を測定するアルカリフォスタファーゼ量測定手段と、
前記生体組織補填体に含まれる細胞数を測定する細胞数測定手段と、
測定されたアルカリフォスタファーゼの量が所定値以上か否かを判断する第１判断手段と、
測定された細胞数が所定値以上であるか否かを判断する第２判断手段と、
アルカリフォスタファーゼの量が所定値以上であり、かつ、細胞数が所定値以上である場合に、培養終了を判断する最終判断手段とを備える生体組織補填体の検査装置。 Alkaline fosterase amount measuring means for measuring the amount of alkaline fosfase contained in the cultured body tissue complement,
A cell number measuring means for measuring the number of cells contained in the biological tissue complement;
First determination means for determining whether or not the measured amount of alkaline fosterase is greater than or equal to a predetermined value;
Second determination means for determining whether or not the measured number of cells is equal to or greater than a predetermined value;
A biological tissue complement inspection device comprising: final determination means for determining the end of culture when the amount of alkaline fosterase is not less than a predetermined value and the number of cells is not less than a predetermined value.
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