JP2005027501A

JP2005027501A - Method for producing automatic contractile muscle cell

Info

Publication number: JP2005027501A
Application number: JP2003192518A
Authority: JP
Inventors: Rui Yuge; 類弓削
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2005-02-03

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for obtaining a muscle cell (a muscle fiber) having an automatic contractile ability by culturing a myoblast. <P>SOLUTION: The method for producing an automatic contractile muscle cell is characterized as follows. Electrical stimulation is applied to a myoblast with pulse waves in a process of culturing the myoblast. Thereby, the myoblast is differentiated and induced into the muscle cell having the automatic contractile ability. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は自動収縮筋細胞の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
筋細胞は収縮機能を有する細胞であり、骨格筋、心筋、平滑筋細胞に大別される。筋細胞はミオシン、アクチンの収縮蛋白質を細胞が自ら合成して収縮する細胞であり、収縮蛋白質を合成すると細胞質内に横紋構造を形成しこの段階から筋線維と呼ぶ。筋細胞とはすなわち筋線維を意味している。本明細書において「筋細胞（筋線維）」とは、このような筋細胞あるいは筋線維を意味する。以下、「筋細胞（筋線維）」を単に「筋細胞」という場合がある。
【０００３】
近年、進行性筋ジストロフィー、心筋症等への筋疾患に対する再生医療の利用のため、骨格筋細胞、心筋細胞などの筋細胞を多能性幹細胞から形成させる試みがなされている。たとえば、これまで筋芽細胞などの多能性幹細胞を哺乳動物から単離し培養して分化誘導させる試みがなされている。
【０００４】
しかしながらこれまで知られている通常の培養方法では、筋芽細胞を筋管細胞にまでしか分化誘導させることができず（非特許文献１、２、３）、最終的に自動収縮能を有する筋細胞（筋線維）へ分化、成熟させる方法はこれまで知られていなかった。
【非特許文献１】ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９１Ｏｃｔｏｂｅｒ１９８１，ｐ１１−１６
【非特許文献２】ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９８Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９８４，ｐ４３６−４４３
【非特許文献３】ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ３６：１６７−１７３，Ｍａｒｃｈ２０００
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、筋芽細胞を培養して自動収縮能を有する筋細胞（筋線維）を得る方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本件発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、筋芽細胞の培養過程において、筋芽細胞にパルス波により電気刺激を与えることにより、自動収縮能を有する筋細胞（筋線維）を得ることができることを見出し本件発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本件発明は以下を含む。
〔１〕筋芽細胞の培養過程で、該筋芽細胞にパルス波により電気刺激を与えて、自動収縮能を有する筋細胞（筋線維）に分化誘導させることを特徴とする自動収縮筋細胞の製造方法。
〔２〕（１）筋芽細胞を培地中で培養したのち、該筋芽細胞に、パルス波により電気刺激を与える段階、および
（２）培地中で前記筋芽細胞の培養を継続して、自動収縮能を有する筋細胞（筋線維）に分化誘導させる段階、
を含むことを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記段階（１）の培地が栄養源を含み、前記段階（２）の培地が栄養源を含まないことを特徴とする〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記電気刺激を、培養過程の細胞がコンフルエントの状態に達した後に与えることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記筋細胞（筋線維）が、骨格筋細胞であることを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記筋芽細胞が、セルライン（ｃｅｌｌｌｉｎｅ：細胞株）化された細胞株であることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記電気刺激が、下記の条件により与えられることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法：
（１）パルス波の電圧の最大値（絶対値）が１〜２００Ｖ、最小値（絶対値）が０Ｖであり、
（２）１回の電気刺激は、パルス波の回数が０．１〜１０回／秒、持続時間が０．１〜２００秒間で与えられる一電気刺激ユニットにより構成される。
〔８〕前記一電気刺激ユニットが、少なくとも１回与えられることを特徴とする〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記一電気刺激ユニットが、少なくとも１日間、１〜１０００回／日の回数で与えられることを特徴とする〔７〕または〔８〕に記載の方法。
〔１０〕セルライン化された筋芽細胞株に由来する、自動収縮能を有する骨格筋細胞。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に係る自動収縮筋細胞の製造方法は、筋芽細胞の培養過程で、該筋芽細胞にパルス波により電気刺激を与えて、自動収縮能を有する筋細胞に分化誘導することを特徴としている。
【０００９】
より具体的には、該方法は、
（１）筋芽細胞を培地中で培養したのち、該筋芽細胞に、パルス波により電気刺激を与える段階、および
（２）培地中で前記筋芽細胞の培養を継続して、自動収縮能を有する筋細胞に分化誘導させる段階、
を含むことが好ましい。
【００１０】
＜筋芽細胞＞
本発明で用いることのできる「筋芽細胞」は、好ましくは鳥類または哺乳類、さらに好ましくは哺乳類に由来する筋芽細胞であることが望ましい。哺乳類としては、ヒトおよび他の霊長類（たとえば、サル、チンパンジー）、ラット、マウス、モルモットなど、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられる。
【００１１】
筋芽細胞は、骨格筋、心筋、平滑筋に由来するものを用いることができる。本発明では、それぞれの由来に応じた筋細胞を形成させることができる。
【００１２】
このような筋芽細胞として、本発明では単離された細胞だけでなく、セルライン（ｃｅｌｌｌｉｎｅ：細胞株）化された細胞株を用いることができる。
セルライン化された細胞株とは、細胞培養においては、初代培養以後の培養による培養細胞を意味し、初代培養に存在した細胞または細胞群からの一連の系統を意味する。
【００１３】
筋芽細胞の培養においては、心筋細胞、骨格筋細胞を生体から取り出し、初期培養を行うと筋収縮が起こる場合がある。しかし、このような細胞は、細胞の抽出後の初期培養における細胞の特異的な反応として筋収縮が起こっただけで、一般に入手容易なセルライン化された筋細胞においては、通常培養しても収縮する機能を付与することができない。すなわち、セルライン化することで高度な分化ができなくなる。しかし、本発明ではこのようなセルライン化された筋芽細胞に対しても自動収縮能を有する筋細胞に分化誘導させることができる。
【００１４】
＜細胞の培養＞
本発明で行うことのできる筋芽細胞の培養は、通常、細胞の培養で用いる方法を適用でき特に制限されない。
【００１５】
培養は、適当な培地で行うが、培地としては、公知の培地を用いることができる。このような培地としては、たとえば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良型Ｅａｇｌｅ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））、最小必須培地（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ））、α改良最小必須培地（αＭＥＭ）、ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅＭｅｄｉａ１６４０（ＲＰＭＩＭｅｄｉａ１６４０）などが挙げられる。これらのうちでは、ＤＭＥＭを好ましく用いることができる。
【００１６】
これらの基本培地には、筋芽細胞の成長を維持するために、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清などの栄養源を加えることが好ましい。このような栄養源は、通常培地に対して好ましくは１〜２５質量％の量で添加することが望ましい。
【００１７】
また、本発明で用いる培地は、筋芽細胞の培養、分化・誘導を阻害しない範囲で、適宜添加物を含むことができる。添加物としては例えば、アルブミン、トランスフェリン等の担体物質、ホルモン、細胞成長因子、接着因子、ビタミン、糖などが挙げられる。
【００１８】
培養液のｐＨは、筋芽細胞が生存可能であればよく限定されないが、中性（ｐＨ７程度）が好ましい。
細胞培養は、前記培養液に筋芽細胞を播種して行う。培養に供する細胞数は、好ましくは１×１０^３細胞／ｍＬ〜１×１０^６細胞／ｍＬ程度の範囲にあることが望ましい。
【００１９】
細胞培養は、常法により行うことができ、たとえば、５％ＣＯ_２、９５％空気で、好ましくは３６〜３８℃の温度範囲で行うことが望ましい。
【００２０】
なお、哺乳類等に由来する筋芽細胞は、必要に応じ細胞数を調整して使用する。通常、上記培地に筋芽細胞を播き、筋芽細胞が適当な細胞数に増殖した時点でトリプシン等で処理して、所望の細胞数に調整し、細胞培養に供することが好ましい。
細胞培養は公知の培養容器中で行うことができ、この培養容器の材質は特に限定されず、ガラス、プラスチックなどを用いることができる。容器の形状も限定はなく、円形、楕円形、長方形、正方形等のいずれでもよい。
【００２１】
＜電気刺激＞
本発明では、細胞培養の過程で、筋芽細胞に電気刺激を付与するが、好ましくは培地を含む前記培養容器内に筋芽細胞が集密的に存在する領域を形成したのち、電気刺激を与えることができる。さらに好ましくは筋芽細胞が培養容器の表面いっぱいに隙間なく増殖した段階（コンフルエントな段階）で電気刺激を付与することが望ましい。
【００２２】
細胞を増殖させ、コンフルエントな状態にさせた後に電気刺激を付与することで、細胞分化をより有効に行うことができる。
【００２３】
筋芽細胞の分化過程は、単核の筋芽細胞が増殖して、コンフルエントに達し、その後分化すると筋芽細胞同士が、細胞融合を起こして多核の筋管細胞になり、さらに分化・成熟すると筋線維となる。このため、コンフルエントにした状態で電気刺激することで、分化が促進されると推測される。
なお、「集密的に存在する領域」とは、細胞が培養皿の表面等に隙間なく育成した領域を意味している。
【００２４】
本発明で用いる電気刺激は、細胞膜に孔を空けたり、細胞にダメージを与えない程度の電圧、パルス長、印加回数を有していればよく条件は限定されないが、たとえば、下記の条件を有することが好ましい。
（１）パルス波の電圧の最大値（絶対値）が１〜２００Ｖ、最小値（絶対値）が０Ｖであり、
（２）１回の電気刺激は、パルス波の回数が０．１〜１０回／秒、持続時間が０．１〜２００秒間で与えられる一電気刺激ユニットにより構成される。
【００２５】
パルス波は、好ましくは交流電圧または直流パルス電圧により与えられ、直流矩形状の直流パルス電圧によることがより好ましい。
また、「一電気刺激ユニット」とは、パルス波の供給において１回の持続時間の間に与えられる電気刺激条件を意味する。
【００２６】
パルス波の電圧の最大値は、さらに好ましくは１０〜１００Ｖ、パルス波の回数は、さらに好ましくは０．２〜２回／秒、持続時間は、より好ましくは０．５〜１０秒であることが望ましい。
【００２７】
前記一電気刺激ユニットの合計の供給回数は、好ましくは少なくとも１回、さらに好ましくは１〜１００００回、特に好ましくは３〜１０００回与えられることが望ましい。
【００２８】
このような一電気刺激ユニットは、好ましくは少なくとも１日間、さらに好ましくは１日〜１０日間与えることが好ましい。また、電気刺激は、毎日または隔日で付与されることが好ましい。
【００２９】
この場合、１日の一電気刺激ユニットの供給回数は、好ましくは１〜１０００回、さらに好ましくは１〜１００回であることが望ましい。
【００３０】
１日に複数回一電気刺激ユニットが供給される場合、１日の間に付与される一電気刺激ユニット間のインターバルは、好ましくは１〜１０分、さらに好ましくは３〜５分であることが望ましい。一定のインターバルを取ることで、筋芽細胞のダメージを低減させることができる。
【００３１】
このような電気刺激を行った後、前記基本培地でさらに培養を継続することで、筋芽細胞を筋細胞に分化誘導させることができる。ただし、電気刺激後の培地は、前記ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの栄養源が不添加であることが好ましい。筋芽細胞は、他の細胞と比べて特殊な細胞であり、ＦＢＳ、血清などの栄養源を除いて細胞への栄養を枯渇させることにより、分化をより進行させることができる。しかし、電気刺激を行わず、単に栄養源を枯渇させても自動収縮能を有する筋細胞までには分化しない。
【００３２】
このような前記電気刺激による筋芽細胞の筋細胞への分化誘導は、以下の理由により誘起されたものと推測される。
筋芽細胞、筋管細胞、さらに筋線維への分化・成熟は、筋特異的転写調節因子であるＭｙｏＤファミリー（ＭｙｏＤ，ｍｙｆ５，ｍｙｏｇｅｎｉｎ，ＭＲＦ４）の相互間作用による因子と細胞培養環境における正・負の分化制御因子の作用によると考えられている。
【００３３】
本発明では、電気刺激により筋芽細胞の分化のスイッチが入り、まず、上述した分化制御因子の働きを正の方向へ誘導したと考えられる。これに加え、電気刺激を与えていない対照細胞群と比較すると、電気刺激を与えられた筋芽細胞群では、ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ミオゲニン）の発現時期が早まり、その発現量も増加する。またＭＲＦ４の発現が遅延するとともに、ＭＲＦ４の発現期間が持続することを本件発明者らは確認している。
【００３４】
この結果、電気刺激を与えられた筋芽細胞群では、比較的培養後期までＭＲＦ４の強い発現が持続することとなり、筋芽細胞から誘導された筋管細胞を、さらに収縮能を持つ筋線維までに成熟させることができたものと推測される。
【００３５】
より具体的には、筋管細胞が発達するとアセチルコリン（Ａｃｈ）レセプター及び、ｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎ（ギャップ結合）が存在することとなり、このＡｃｈとギャップ結合が、骨格筋細胞等の筋細胞への融合、成熟において筋芽細胞間における小分子の細胞間経路として働き、該Ａｃｈとギャップ結合の形成により筋細胞の自動収縮が可能になると推測される。ギャップ結合は、コネキシンという６量体のタンパク質でできているが、本発明では、このコネキシンが上記電気刺激条件で形成されたものと推測される。
【００３６】
なお、ギャップ結合の形成の確認方法として、次の方法が挙げられる。筋電図学的に孤立する筋線維（筋細胞）からの電位を拾うと、収縮のタイミングのインパルス出現が同期化することにより同期化を確認することができる。この同期化は、細胞表面にある細胞接着装置のギャップ結合を介して行われるから、同期化を確認することでギャップ結合の形成を認識することもできる。
【００３７】
得られる筋細胞への分化、自動収縮は、次の方法により確認することができる。筋芽細胞を分化させると単核の筋芽細胞同士が細胞融合を起こし、多核の筋管細胞を形成する。その時にミオゲニンという筋特異的分化調整因子のｍＲＮＡとタンパク質が発現するが、まずこれを同定することで分化を確認できる。
【００３８】
また、筋管細胞がさらに分化・成熟すると筋管細胞中に収縮タンパク質のミオシンとアクチンを細胞が合成する。その時ＭＲＦ４というｍＲＮＡとタンパク質が発現する。このＭＲＦ４を同定することで、分化を確認できる。
【００３９】
さらに、ミオシンとアクチンの収縮タンパク質（筋フィラメント）が発現すると、その分子構造から筋の横紋が出現するので、この横紋構造を確認することで、分化を確認することができる。
【００４０】
その後、ミオシンフィラメントにアクチンフィラメントが滑り込んで筋収縮を起こすことにより自動収縮がなされる。
【００４１】
本発明に係る自動収縮能を有する筋細胞の形成方法は、再生医療において、幹細胞に骨格筋への分化誘導をかけて経静脈性に細胞移植を行い、目的ターゲット筋へ本発明の電気刺激を行うことにより収縮する筋細胞の形成に用いることができる。具体的には、たとえば、筋ジストロフィー症患者への幹細胞移植後、生体内での分化誘導法として特異的電気刺激を用いて収縮する骨格筋まで分化誘導をかける時に用いることができる。
【００４２】
また、個別の筋へ、収縮能を獲得した筋細胞を直接細胞移植することもできる。具体的には、たとえば、筋細胞を調製し、筋ジストロフィー症患者への収縮骨格筋の細胞移植に用いることができる。
【００４３】
また、抗糖尿病薬のレスポンスから創薬開発モデルとして利用することもできる。すなわち、たとえば、通常の分化状態のＬ６細胞（ラット骨格筋由来の筋芽細胞株：ＡＴＣＣＣＲＬ１４５８：ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社、米国）と、ヒト骨格筋細胞（ＳｋｅｌｔａｌＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ：ＳｋＭｃ：ｃｃｓ−２５６１（ＡＭＢＲＥＸＣｏｍｐａｎｙ，米国））との相違を確認することで、その因子が糖尿病でのインスリン受容体にどのように働くかが分かり、治療薬の開発が可能である。
【００４４】
さらに、骨格筋分化に伴い発現状態が変動する遺伝子が同定できれば創薬ターゲットに生かすことも可能である。
【００４５】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により、何ら制限されるものではない。
【００４６】
培養細胞
培養細胞は、ラット骨格筋由来の筋芽細胞株Ｌ６（ＡＴＣＣＣＲＬ１４５８：ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社，米国）を用いた。
【００４７】
培地
培地としてＤｕｌｂｅｃｃｏの改良型Ｅａｇｌｅ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ社，米国））に、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ：ＳＩＧＭＡ社，米国））を添加して培養液とし、さらに抗生剤であるゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（２５μｌ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社））を加えた。
【００４８】
標本作成
前記培地を用い、５％二酸化炭素、９５％空気、３７℃の条件下で前記Ｌ６細胞を培養した。Ｌ６細胞の細胞数が２×１０^６／ｍＬになった時点で、０．２５％トリプシン（ＳＩＧＭＡ社）で処理し、ヘモサイトメーター（Ｅｒｍａ社）を使って２．５×１０^４／ｍＬに細胞数を調整後、直径１００ｍｍの培養皿（ＮａｌｇｅＮｕｎｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に細胞を前記培地に播種し、５％二酸化炭素、９５％空気、３７℃の条件下で培養した。
【００４９】
電気刺激による筋芽細胞分化の経時的変化を観察するため、正常培養（対照群）と、電気刺激（電気刺激群）の二群に分け、培養開始２４時間後から３週後まで経時的に検討した。
【００５０】
電気刺激
シリコン素材を用いて電極台を作り、その中に白金線または金線を通して刺激電極を作製した。この電極を前記標本作成で調製した培養皿の両極に設置し、白金線または金線を培養液に直接浸した。
【００５１】
培養開始５日後、細胞がコンフルエント（培養皿全体に密になった状態）に達した時点から１、３、５、７日後に電気刺激を行った。電気刺激装置は、２チャンネル高感度増幅器ＭＥＧ―２１００（日本光電社）を使用した。刺激条件は、矩形波、刺激頻度０．５ｐｕｌｓｅ／秒、持続時間２ｍｓｅｃ．、電圧５０Ｖ、刺激時間５分／日で行った。
【００５２】
電気刺激群については、コンフルエントに達した時点から７日後に電気刺激を行った後、前記培地において、ゲンタマイシンを加え、ＦＢＳ不添加とした前記培地と置換し、その後は電気刺激を施行せず培養を継続した。培養は、５％二酸化炭素、９５％空気、３７℃の条件下で実施した。
【００５３】
対照群、電気刺激群について、形態学的変化、単位面積あたりの筋管細胞数および筋管細胞の最大横径、分子細胞生物学的解析（ウェブスタンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法）を測定した。結果を以下に示す。
【００５４】
形態学的変化
対照群、電気刺激群について、倒立型位相差顕微鏡（ＴＥ３００Ｅｃｌｉｐｓｅ，ＨＢ−１０１０３ＡＦ，Ｎｉｋｏｎ）を用いて培養開始１日から２１日までの細胞の形態学的変化を観察した。
【００５５】
筋芽細胞は、培養開始２４時間後には紡錘形の形態を示した（図１Ａ）。３日後には細胞のコロニーを形成し始め、５日後には細胞融合を開始し、核を２〜３個有する細く小さな筋管細胞が認められた（図１Ｂ）。
【００５６】
細胞がコンフルエントに達した６日後から電気刺激を行った。７日後は、対照群で数個の核が数珠状に一列に並んだ帯状の筋管細胞がみられた（図１Ｃ）。電気刺激群では、核が二列から三列に配列した対照群よりも太い筋管細胞が出現した（図１Ｄ）。
【００５７】
１０日後には、対照群にも核が二列から三列の筋管細胞がみられた（図１Ｅ）。電気刺激群では、五列程度に配列した核を有する太い筋管細胞が出現した（図１Ｆ）。
【００５８】
１２日後には、対照群でも太い筋管が出現した。電気刺激群では、五列以上の核を有した発達した筋管がみられた。１４日後には、対照群でも発達した太い筋管細胞がみられ（図１Ｇ）、電気刺激群では、七列以上の核の段を有し、細胞質が豊富な太く大きな筋管細胞が認められた（図１Ｈ）。
【００５９】
また、核の周囲に水アメ状の塊も形成され、さらに発達した筋管細胞が認められた。１６日後には電気刺激群で、筋管細胞の細胞質中に横紋構造が認められた（図２）。
【００６０】
１８日後には、電気刺激群で収縮頻度の低い、筋管細胞の自動収縮が観察された。２１日後には対照群では筋管細胞が細くなり、電気刺激群でも全体的に細い筋管細胞がみられたが、一部の成熟した筋管細胞には収縮頻度が一定した律動的な収縮が観察された。また、隣接する筋管細胞同士では同期した収縮が観察された。
【００６１】
単位面積あたりの筋管細胞数および筋管細胞の最大横径
対照群、電気刺激群について、筋芽細胞の分化の程度を観察するため、無作為に写真撮影（×５０）を行い、単位面積当たりの筋管細胞の発生数をカウントした。さらに一個の筋管細胞の最大横径をＮＩＨｉｍａｇｅＶ１．６２ｆｐｕ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、米国）を使用して無作為に計測した。なお融合している筋管細胞では，各筋管細胞の最大横径と融合部分の横径を計測した。
【００６２】
筋管細胞の発生に関し、その発生数の経時的なトレンド（データプロットカーブの傾き）をみると両群ともに近似したカーブを示したが、電気刺激群は培養７日後から１０日後にかけて対照群と比較して増加率が高かった。（図３）。
【００６３】
筋管細胞の最大横径は、対照群は１２日以降急速に増加し、１４日後にピークに達した後、徐々に減少した。電気刺激群は、７日以降細胞横径が急速に増加し、太い筋管を形成し、１４日をピークに徐々に筋管の横径が減少した。全体的には電気刺激開始後から培養２１日後まで、対照群と比較して電気刺激群の方が太い筋管を形成した（図４）。
【００６４】
以上を考察すると、分化の指標である筋管細胞の発生数は、７日後から１０日後にかけて電気刺激群の方が対照群に比べ増加率が高く、その後１８日後にかけて電気刺激群の方が多いものの対照群と大差は無かった。一方、筋管細胞の最大横径は、電気刺激群では電気刺激後急速に増加し、２１日後まで対照群より太い筋管細胞を形成した。この両者のデータからみると、電気刺激により筋管細胞の融合が促進されたことで筋管細胞の横径が増加し、対照群と比べて筋管細胞の増加率に大きな差がみられなかったものと考えられる。
【００６５】
筋芽細胞の増殖および筋管細胞への分化・成熟は、筋特異的転写調節因子であるＭｙｏＤファミリー（ＭｙｏＤ，ｍｙｆ５，ｍｙｏｇｅｎｉｎ，ＭＲＦ４）の相互間作用による因子と、ＩＧＦ−ＩＩ等のサイトカイン系誘導物質を含めた細胞培養環境における正・負の分化制御因子の作用によると考えられる。これらを総括すると、電気刺激により筋芽細胞の分化のスイッチが入り、上述した分化制御因子の働きを正の方向へ誘導したことが示唆される。
【００６６】
Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ミオゲニン）
（１）分子細胞生物学的解析（ＲＴ−ＰＣＲ法）
対照群、電気刺激群について、培養開始１、３、５、７、１０、１２、１４、１６、１８、２１日後にＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてサンプリングを行った。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒｅａｏｒｉｅｓ社，米国）を用いて逆転写反応を行った。Ｍｙｏｇｅｎｉｎのプライマーは、センス５’− ＧＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＴＧ −３’、アンチセンス５’− ＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＴＧＡＣＡＣ −３’（ＳＩＧＭＡＧｅｎｏｓｙｓ社）を設計し、ｃＤＮＡを増幅した。内部標準遺伝子としてＧ３ＰＤＨ（ＴＯＹＯＢＯＩｎｃ．）を用いｃＤＮＡを増幅した。
【００６７】
ＰＣＲコンディションは、ＭＲＦ４：９４℃−４５秒、６０℃−４５秒、７２℃−２分を３４サイクルの設定条件で、Ｇ３ＰＤＨ：９４℃−４５秒、６０℃−４５秒、７２℃−２分を２４サイクルの条件設定で行った。さらに、発現したｍＲＮＡのバンドについて、ＮＩＨｉｍａｇｅＶ１．６２ｆｐｕ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，米国）を使用して吸光度分析を行い、サンプル間のｍＲＮＡ発現強度を計測した。
【００６８】
ｍｙｏｇｅｎｉｎの発現は、対照群では５日後にピークに達して強い発現を示し、その後発現が弱まった。電気刺激群では５日後にピークに達し強い発現を示したが、その発現は１６日後まで持続した（図５、７）。前述の通り内部標準遺伝子であるＧ３ＰＤＨの発現には両群ともに差は無かった（図６）。
【００６９】
ｍｙｏｇｅｎｉｎのｍＲＮＡでは、対照群と電気刺激群とは同じタイミングで発現したが、電気刺激群では発現期間が持続した。電気刺激群では比較的培養後期までｍｙｏｇｅｎｉｎの強い発現が持続することにより筋管細胞が収縮能を持つまでに成熟しと考えられる。
【００７０】
（２）分子細胞学的解析（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法）
培養開始５、７、１０、１２、１４、２１日後にそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（サンプルバッファー）（ＳｃｈａｇｇｅｒａｎｄＪａｇｏｗ，１９８７）を用いてサンプリングを行い、ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ミオゲニン）蛋白の発現を、モノクローナルラットミオゲニン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｒａｔｍｙｏｇｅｎｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆ５Ｄ，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａＢａｎｋ，ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｏｗａ，米国））を一次抗体とし、２次抗体は、ＨＲＰ標識アンチ−マウス抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ））を用いてＥＣＬｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ（ＲＰＮ２１０８：ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社，英国）にて検出した。
【００７１】
対照群では７日後にｍｙｏｇｅｎｉｎの発現がピークに達し、その後は徐々に発現が弱まった。電気刺激群では、対照群と同様に７日後に発現のピークに達し、１０日、１２日後も強い発現を保ちその後減少した（図８）。
【００７２】
ｍｙｏｇｅｎｉｎは、筋管細胞への分化を調整するタンパク質であり、外界からの電気刺激によって分化のスイッチが入り、ｍｙｏｇｅｎｉｎの発現が活性化され、筋芽細胞から筋管細胞への分化が対照群より促進したものと考えられる。
【００７３】
今回培養を行ったＬ６は、対照群では収縮が観察されなかった。筋収縮の認められた電気刺激群では、筋管細胞の発達とｍｙｏｇｅｎｉｎの強い発現が続くことが観察された。筋管細胞の成長過程においてｍｙｏｇｅｎｉｎは、筋特異遺伝子の上流に存在する転写制御領域に結合し、分化特異的遺伝子の転写誘導を活性化することによって、筋の機能を果たすために必要なタンパク質を合成蓄積していく役割の一端を担う。また、ｍｙｏｇｅｎｉｎが関与していることが示唆されているものに、筋の分化発育に伴うリアノジン受容体やＣａ^２＋ポンプなどの筋小胞体タンパク質を含む筋小胞体遺伝子の転写の調節、アセチルコリン受容体サブユニットの発現等がある。このような働きをするｍｙｏｇｅｎｉｎの発現が増加したことで、本来ならば収縮の起こらないＬ６が収縮機能を備えた筋管細胞へ分化した可能性が考えられる。
【００７４】
ＭＲＦ４
分子細胞生物学的解析（ＲＴ−ＰＣＲ法）
対照群、電気刺激群について、培養開始３、５、１０、１４、１６、１８、２１日後にＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてサンプリングを行った。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒｅａｏｒｉｅｓ社，米国）を用いて逆転写反応を行った。ＭＲＦ４のプライマーは、センス５’−ＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧ−３’、アンチセンス５’−ＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧ−３’ （ＳＩＧＭＡＧｅｎｏｓｙｓ社）を設計し、ｃＤＮＡを増幅した。内部標準遺伝子としてＧ３ＰＤＨ（ＴＯＹＯＢＯＩｎｃ．）を用いｃＤＮＡを増幅した。
【００７５】
ＰＣＲコンディションは、ＭＲＦ４：９４℃−１分、６８℃−１分、７２℃−１分を３５サイクルの設定条件で、Ｇ３ＰＤＨ：９４℃−４５秒、６０℃−４５秒、７２℃−２分を２４サイクルの条件設定で行った。さらに、発現したｍＲＮＡのバンドについて、ＮＩＨｉｍａｇｅＶ１．６２ｆｐｕ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，米国）を使用して吸光度分析を行い、サンプル間のｍＲＮＡ発現強度を計測した。
【００７６】
ＭＲＦ４の発現は、対照群では５日後から強い発現を示し、１０日後をピークに発現が弱まった。電気刺激群では１４日後から発現が強まり、その発現は１８日後まで持続した（図９、１１）。内部標準遺伝子であるＧ３ＰＤＨの発現には両群ともに差は無かった（図１０）。
【００７７】
ＭＲＦ４のｍＲＮＡでは、対照群と比較すると電気刺激群では遅延して発現し、発現期間は持続した。電気刺激群では比較的培養後期までＭＲＦ４の強い発現が持続することにより筋管細胞が収縮能を持つまでに成熟しと考えられる。
【００７８】
本研究で使用した筋芽細胞株は、ラット骨格筋由来の細胞であるが、通常培養では収縮能を有するまで分化したという報告はこれまでない。しかし本発明では、電気刺激群については、筋細胞にまで分化がおこり、自動収縮が確認された。
【００７９】
【発明の効果】
本発明によれば、筋芽細胞の培養過程において、筋芽細胞にパルス波により複数回の電気刺激を与えることにより、自動収縮能を有する筋細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、対照群および電気刺激群それぞれについて、筋芽細胞の経時的な形態的変化を示す写真である。
【図２】図２は、電気刺激群について、培養から１６日後の筋管細胞の細胞質中の横紋構造の発現を示す写真である。
【図３】図３は、対照群および電気刺激群それぞれについて、筋管細胞発生数の経時的変化を示すグラフである。
【図４】図４は、対照群および電気刺激群それぞれについて、筋管細胞の最大横経の経時的変化を示すグラフである。
【図５】図５は、対照群および電気刺激群それぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲ法による、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ミオゲニン）の発現バンドの吸光度の経時的変化を示す写真である。
【図６】図６は、対照群および電気刺激群それぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲ法による、Ｇ３ＰＤＨの発現の経時的変化を示す写真である。
【図７】図７は、対照群および電気刺激群それぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲ法による、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ミオゲニン）の発現バンドの吸光度の経時的変化を示す図である。
【図８】図８は、対照群および電気刺激群それぞれについて、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ウエスタンブロット）法による、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（ミオゲニン）の発現バンドの吸光度の経時的変化を示す写真である。
【図９】図９は、対照群および電気刺激群それぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲ法による、ＭＲＦ４ｍＲＮＡの発現の経時的変化を示す写真である。
【図１０】図１０は、対照群および電気刺激群それぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲ法による、Ｇ３ＰＤＨの発現の経時的変化を示す写真である。
【図１１】図１１は、対照群および電気刺激群それぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲ法による、ＭＲＦ４ｍＲＮＡの発現バンドの吸光度の経時的変化を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing autocontracting muscle cells.
[0002]
[Prior art]
Muscle cells are cells having a contractile function, and are roughly classified into skeletal muscle, cardiac muscle, and smooth muscle cells. A muscle cell is a cell that synthesizes contractile proteins of myosin and actin by itself, and when a contractile protein is synthesized, a striated structure is formed in the cytoplasm and is called a muscle fiber from this stage. A muscle cell means a muscle fiber. In the present specification, “muscle cell (muscle fiber)” means such muscle cell or muscle fiber. Hereinafter, “muscle cells (muscle fibers)” may be simply referred to as “muscle cells”.
[0003]
In recent years, attempts have been made to form muscle cells such as skeletal muscle cells and cardiomyocytes from pluripotent stem cells in order to use regenerative medicine for progressive muscular dystrophy and myopathy such as cardiomyopathy. For example, so far, attempts have been made to induce differentiation by isolating and culturing pluripotent stem cells such as myoblasts from mammals.
[0004]
However, conventional culture methods known so far can only induce myoblasts to differentiate into myotubes (Non-Patent Documents 1, 2, and 3), and finally have muscles with automatic contraction ability. A method for differentiating and maturating cells (muscle fibers) has not been known so far.
[Non-Patent Document 1] The Journal of Cell Biology, vol. 91 October 1981, p11-16
[Non-Patent Document 2] The Journal of Cell Biology, vol. 98 February 1984, p436-443
[Non-Patent Document 3] In Vitro Cell. Dev. Biol. -Animal 36: 167-173, March 2000
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a method for culturing myoblasts to obtain myocytes (muscle fibers) having automatic contraction ability.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and in the process of culturing myoblasts, by applying electrical stimulation to the myoblasts with a pulse wave, muscle cells (muscle fibers) having an automatic contraction ability are obtained. As a result, the present invention has been completed.
[0007]
That is, this invention includes the following.
[1] In the process of culturing myoblasts, an electrical stimulation is applied to the myoblasts by a pulse wave to induce differentiation into muscle cells (muscle fibers) having an autocontractive function. Production method.
[2] (1) After culturing myoblasts in a medium, applying electrical stimulation to the myoblasts by a pulse wave;
(2) continuing the culture of the myoblast in a medium to induce differentiation into a myocyte (muscle fiber) having an automatic contraction ability;
[1] The method according to [1].
[3] The method according to [2], wherein the medium in the step (1) contains a nutrient source, and the medium in the step (2) does not contain a nutrient source.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the electrical stimulation is applied after the cells in the culture process reach a confluent state.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the muscle cells (muscle fibers) are skeletal muscle cells.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the myoblast is a cell line (cell line) cell line.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the electrical stimulation is given under the following conditions:
(1) The maximum value (absolute value) of the voltage of the pulse wave is 1 to 200 V, the minimum value (absolute value) is 0 V,
(2) One electrical stimulation is composed of one electrical stimulation unit in which the number of pulse waves is 0.1 to 10 times / second and the duration is 0.1 to 200 seconds.
[8] The method according to [7], wherein the one electrical stimulation unit is given at least once.
[9] The method according to [7] or [8], wherein the one electrical stimulation unit is given at a frequency of 1-1000 times / day for at least one day.
[10] A skeletal muscle cell having an automatic contraction ability, derived from a cell lined myoblast cell line.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method for producing autocontractive muscle cells according to the present invention is characterized in that, during the myoblast culture process, the myoblast is electrically stimulated by a pulse wave to induce differentiation into a myocyte having an autocontractive function. Yes.
[0009]
More specifically, the method comprises:
(1) culturing myoblasts in a medium and then applying electrical stimulation to the myoblasts by a pulse wave; and
(2) continuing the culture of the myoblast in a medium to induce differentiation into a myocyte having an autocontracting ability;
It is preferable to contain.
[0010]
<Myoblast>
The “myoblasts” that can be used in the present invention are preferably myoblasts derived from birds or mammals, more preferably from mammals. Mammals include humans and other primates (eg, monkeys, chimpanzees), rats, mice, guinea pigs, cows, horses, pigs, and the like.
[0011]
As myoblasts, those derived from skeletal muscle, cardiac muscle and smooth muscle can be used. In the present invention, myocytes can be formed according to their origin.
[0012]
As such myoblast, not only an isolated cell but also a cell line (cell line) cell line can be used in the present invention.
In the cell culture, the cell line formed into a cell line means a cultured cell obtained by the culture after the primary culture, and means a series of lines from the cells or cell groups present in the primary culture.
[0013]
In myoblast culture, muscle contraction may occur when cardiomyocytes and skeletal muscle cells are removed from the living body and subjected to initial culture. However, these cells only undergo muscle contraction as a specific reaction of the cells in the initial culture after cell extraction. In general, cell lined muscle cells that are readily available can be cultured. The function to contract cannot be given. That is, a high degree of differentiation cannot be achieved by making a cell line. However, in the present invention, such cell lined myoblasts can be induced to differentiate into myocytes having automatic contraction ability.
[0014]
<Cell culture>
The myoblast culture that can be carried out in the present invention is not particularly limited, and a method used for cell culture can be generally applied.
[0015]
The culture is performed in an appropriate medium, and a known medium can be used as the medium. Examples of such a medium include Dulbecco's modified Eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)), minimum essential medium (Minimal Essential Medium (MEM)), α improved minimum essential medium (αMEM), Examples include Roswell Park Memory Institute Media 1640 (RPMI Media 1640). Among these, DMEM can be preferably used.
[0016]
In order to maintain myoblast growth, nutrient sources such as fetal bovine serum (FBS) and human serum are preferably added to these basic media. Such a nutrient source is preferably added in an amount of preferably 1 to 25% by mass with respect to the normal medium.
[0017]
In addition, the medium used in the present invention can appropriately contain additives as long as the culture, differentiation and induction of myoblasts are not inhibited. Examples of the additive include carrier substances such as albumin and transferrin, hormones, cell growth factors, adhesion factors, vitamins, sugars and the like.
[0018]
The pH of the culture solution is not limited as long as the myoblasts can survive, but is preferably neutral (about pH 7).
Cell culture is performed by seeding myoblasts in the culture medium. The number of cells to be cultured is preferably 1 × 10³Cells / mL to 1 × 10⁶It is desirable to be in the range of about cells / mL.
[0019]
Cell culture can be performed by a conventional method, for example, 5% CO2.₂95% air, preferably in the temperature range of 36-38 ° C.
[0020]
In addition, myoblasts derived from mammals are used after adjusting the number of cells as necessary. Usually, it is preferable to seed myoblasts in the above-mentioned medium, and treat the cells with trypsin or the like when the myoblasts have grown to an appropriate number of cells to adjust to the desired number of cells and use it for cell culture.
Cell culture can be performed in a known culture vessel, and the material of the culture vessel is not particularly limited, and glass, plastic, or the like can be used. The shape of the container is not limited, and may be any of a circle, an ellipse, a rectangle, a square, and the like.
[0021]
<Electric stimulation>
In the present invention, electrical stimulation is applied to myoblasts in the process of cell culture. Preferably, after forming a region where myoblasts are congested in the culture vessel containing a medium, electrical stimulation is performed. Can be given. More preferably, it is desirable to apply electrical stimulation at the stage where the myoblasts are grown on the entire surface of the culture container without any gaps (confluent stage).
[0022]
Cell differentiation can be performed more effectively by applying electrical stimulation after the cells are grown and brought to a confluent state.
[0023]
The differentiation process of myoblasts is that when mononuclear myoblasts proliferate and reach confluence, and then differentiate, myoblasts cause cell fusion to become multinucleated myotubes, and further differentiation and maturation. It becomes a muscle fiber. For this reason, it is estimated that differentiation is accelerated | stimulated by electrically stimulating in the state made confluent.
In addition, “the area | region which exists densely” means the area | region which the cell grew on the surface etc. of the culture dish without the clearance gap.
[0024]
The electrical stimulation used in the present invention is not limited as long as it has a voltage, a pulse length, and the number of times of application that do not puncture the cell membrane or damage the cells. For example, the electrical stimulation has the following conditions: It is preferable.
(1) The maximum value (absolute value) of the voltage of the pulse wave is 1 to 200 V, the minimum value (absolute value) is 0 V,
(2) One electrical stimulation is composed of one electrical stimulation unit in which the number of pulse waves is 0.1 to 10 times / second and the duration is 0.1 to 200 seconds.
[0025]
The pulse wave is preferably applied by an AC voltage or a DC pulse voltage, and more preferably by a DC rectangular DC pulse voltage.
In addition, “one electrical stimulation unit” means an electrical stimulation condition given for one duration in supplying a pulse wave.
[0026]
The maximum value of the voltage of the pulse wave is more preferably 10 to 100 V, the number of pulse waves is more preferably 0.2 to 2 times / second, and the duration is more preferably 0.5 to 10 seconds. Is desirable.
[0027]
The total number of times the one electrical stimulation unit is supplied is preferably at least once, more preferably 1 to 10,000 times, and particularly preferably 3 to 1000 times.
[0028]
Such an electrical stimulation unit is preferably given for at least 1 day, more preferably for 1 to 10 days. Moreover, it is preferable that electrical stimulation is given every day or every other day.
[0029]
In this case, the number of times of supplying the electrical stimulation unit per day is preferably 1 to 1000 times, more preferably 1 to 100 times.
[0030]
When one electrical stimulation unit is supplied several times a day, the interval between one electrical stimulation unit given during the day is preferably 1 to 10 minutes, more preferably 3 to 5 minutes. desirable. By taking a certain interval, it is possible to reduce myoblast damage.
[0031]
After such electrical stimulation, myoblasts can be induced to differentiate into myocytes by further culturing in the basic medium. However, it is preferable that the nutrient medium such as fetal bovine serum (FBS) is not added to the medium after electrical stimulation. Myoblasts are special cells compared to other cells, and differentiation can be further advanced by depleting nutrients to cells except for nutrient sources such as FBS and serum. However, no electrical stimulation is performed, and even if the nutrient source is simply depleted, it does not differentiate into a muscle cell having an automatic contraction ability.
[0032]
Such induction of differentiation of myoblasts into myocytes by electrical stimulation is presumed to have been induced for the following reasons.
Differentiation and maturation into myoblasts, myotubes, and myofibers depends on the interaction between factors of the myoD family (MyoD, myf 5, myogenin, MRF4), which are muscle-specific transcriptional regulators, and the positive in the cell culture environment.・ It is thought to be due to the action of negative differentiation regulators.
[0033]
In the present invention, it is considered that the differentiation of myoblasts is switched on by electrical stimulation, and first, the action of the differentiation control factor described above is induced in the positive direction. In addition to this, in the myoblast group given electrical stimulation, myogenin (myogenin) is expressed earlier and the amount of expression is also increased in comparison with the control cell group not given electrical stimulation. In addition, the present inventors have confirmed that the expression period of MRF4 is delayed and the expression period of MRF4 is sustained.
[0034]
As a result, in the myoblast group to which electrical stimulation was given, strong expression of MRF4 was sustained until relatively late in the culture, and myotube cells derived from myoblasts were further converted to myofibers having contractile ability. It is presumed that they were able to mature.
[0035]
More specifically, when myotubes develop, acetylcholine (Ach) receptors and gap junctions (gap junctions) exist, and this Ach and gap junctions are fused and matured into muscle cells such as skeletal muscle cells. It acts as an intercellular pathway for small molecules between myoblasts, and it is speculated that the formation of gap junctions with the Ach enables automatic contraction of myocytes. The gap junction is made of a hexameric protein called connexin. In the present invention, it is presumed that this connexin was formed under the electrical stimulation conditions.
[0036]
In addition, the following method is mentioned as a confirmation method of formation of gap junction. When the potential from the myofibers (myocytes) isolated electromyographically is picked up, synchronization can be confirmed by synchronizing the appearance of impulses at the timing of contraction. Since this synchronization is performed through a gap junction of a cell adhesion device on the cell surface, the formation of a gap junction can be recognized by confirming the synchronization.
[0037]
Differentiation into muscle cells and automatic contraction obtained can be confirmed by the following method. When myoblasts are differentiated, mononuclear myoblasts undergo cell fusion to form multinucleated myotubes. At that time, myogenin, a muscle-specific differentiation regulator mRNA and protein, is expressed, and differentiation can be confirmed by first identifying this.
[0038]
In addition, when myotube cells further differentiate and mature, the cells synthesize the contractile proteins myosin and actin into myotube cells. At that time, mRNA and protein called MRF4 are expressed. By identifying this MRF4, differentiation can be confirmed.
[0039]
Furthermore, when a myosin and actin contractile protein (muscle filament) is expressed, a muscle striation appears from its molecular structure, and differentiation can be confirmed by confirming this striated structure.
[0040]
Thereafter, the actin filaments slide into the myosin filaments to cause muscle contraction, thereby causing automatic contraction.
[0041]
According to the present invention, the method for forming a myocyte having an autocontractive function is a regenerative medicine in which stem cells are induced to differentiate into skeletal muscles, and then transplanted intravenously, and the electrical stimulation of the present invention is applied to a target target muscle. It can be used to form muscle cells that contract by doing so. Specifically, for example, it can be used to induce differentiation to skeletal muscle that contracts using specific electrical stimulation as an in vivo differentiation induction method after transplantation of stem cells into a muscular dystrophy patient.
[0042]
It is also possible to directly transplant myocytes that have acquired contractility into individual muscles. Specifically, for example, muscle cells can be prepared and used for transplantation of contractile skeletal muscle cells to muscular dystrophy patients.
[0043]
It can also be used as a drug development model from the response of antidiabetic drugs. That is, for example, normal differentiated L6 cells (rat skeletal muscle-derived myoblast cell line: ATCC CRL 1458: American Type Culture Collection, USA) and human skeletal muscle cells: SkMc: ccs-2561 (AMBREX Company, USA)), it is possible to know how the factor acts on the insulin receptor in diabetes and to develop a therapeutic drug.
[0044]
Furthermore, if a gene whose expression state varies with skeletal muscle differentiation can be identified, it can be used as a drug discovery target.
[0045]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0046]
Cultured cells
As a cultured cell, a rat skeletal muscle myoblast cell line L6 (ATCC CRL 1458: American Type Culture Collection, USA) was used.
[0047]
Culture medium
10% fetal bovine serum (FBS: SIGMA, USA) added to Dulbecco's modified Eagle medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (SIGMA, USA)) as the medium In addition, gentamicin (Gentamin (25 μl: BioWhittaker)), which is an antibiotic, was added.
[0048]
Sample preparation
Using the medium, the L6 cells were cultured under conditions of 5% carbon dioxide, 95% air, and 37 ° C. The number of L6 cells is 2 × 10⁶/ ML, treated with 0.25% trypsin (SIGMA) and 2.5 × 10 6 using a hemocytometer (Erma)⁴After adjusting the number of cells to / mL, the cells were seeded in the culture medium in a culture dish (Nalge Nunc International) having a diameter of 100 mm, and cultured under conditions of 5% carbon dioxide, 95% air, and 37 ° C.
[0049]
In order to observe changes over time in myoblast differentiation by electrical stimulation, it was divided into two groups, normal culture (control group) and electrical stimulation (electric stimulation group), and the time course from 24 hours to 3 weeks later was started. investigated.
[0050]
Electrical stimulation
An electrode base was made using a silicon material, and a stimulation electrode was made through a platinum wire or a gold wire therein. This electrode was placed on both electrodes of the culture dish prepared in the preparation of the specimen, and a platinum wire or a gold wire was directly immersed in the culture solution.
[0051]
Five days after the start of culture, electrical stimulation was performed 1, 3, 5, and 7 days after the cells reached confluence (in a state where the cells became dense throughout the culture dish). As the electrical stimulator, a 2-channel high-sensitivity amplifier MEG-2100 (Nihon Kohden) was used. Stimulation conditions were a rectangular wave, a stimulation frequency of 0.5 pulse / second, and a duration of 2 msec. The voltage was 50 V and the stimulation time was 5 minutes / day.
[0052]
For the electrical stimulation group, after electrical stimulation was performed 7 days after reaching confluence, gentamicin was added to the medium, and the medium was replaced with FBS-free, and then cultured without electrical stimulation. Continued. The culture was performed under conditions of 5% carbon dioxide, 95% air, and 37 ° C.
[0053]
For the control group and the electrical stimulation group, morphological changes, the number of myotube cells per unit area and the maximum transverse diameter of myotube cells, and molecular cell biological analysis (webstan blotting method, RT-PCR method) were measured . The results are shown below.
[0054]
Morphological changes
About the control group and the electrical stimulation group, the morphological change of the cell from the culture | cultivation start 1st to 21st was observed using the inverted phase-contrast microscope (TE300 Eclipse, HB-10103 AF, Nikon).
[0055]
Myoblasts showed a spindle-shaped morphology 24 hours after the start of culture (FIG. 1A). After 3 days, cell colonies started to form, and after 5 days, cell fusion was started, and thin and small myotube cells having 2 to 3 nuclei were observed (FIG. 1B).
[0056]
Electrical stimulation was performed 6 days after the cells reached confluence. Seven days later, a strip-shaped myotube cell in which several nuclei were arranged in a row in a bead shape was seen in the control group (FIG. 1C). In the electrical stimulation group, thicker myotubes appeared than in the control group in which the nuclei were arranged in two to three rows (FIG. 1D).
[0057]
Ten days later, the control group also had two to three rows of myotubes in the control group (FIG. 1E). In the electrical stimulation group, thick myotube cells having nuclei arranged in about five rows appeared (FIG. 1F).
[0058]
After 12 days, thick myotubes also appeared in the control group. In the electrical stimulation group, developed myotubes with more than five rows of nuclei were seen. After 14 days, developed thick myotubes were also seen in the control group (FIG. 1G), and in the electrical stimulation group, thick and large myotube cells with more than seven rows of nuclei and rich in cytoplasm were observed. (FIG. 1H).
[0059]
In addition, a water-like mass was also formed around the nucleus, and further developed myotube cells were observed. After 16 days, a striated structure was observed in the cytoplasm of myotube cells in the electrical stimulation group (FIG. 2).
[0060]
After 18 days, automatic contraction of myotube cells with low frequency of contraction was observed in the electrical stimulation group. After 21 days, myotubes became thinner in the control group and thin myotubes were seen overall in the electrical stimulation group, but some mature myotubes had rhythmic contractions with a constant rate of contraction. Was observed. In addition, synchronized contraction was observed between adjacent myotube cells.
[0061]
Myotube number per unit area and maximum myotube diameter
In order to observe the degree of differentiation of myoblasts in the control group and electrical stimulation group, photographs were taken at random (× 50), and the number of myotube cells generated per unit area was counted. In addition, the maximum transverse diameter of a single myotube was measured randomly using NIH image V1.62 fpu (National Institutes of Health, USA). For fused myotube cells, the maximum lateral diameter of each myotube cell and the lateral diameter of the fused part were measured.
[0062]
Regarding the development of myotube cells, the trend over time (the slope of the data plot curve) of the number of occurrences showed an approximate curve in both groups. The rate of increase was high. (Figure 3).
[0063]
The maximum lateral diameter of myotube cells increased rapidly after 12 days in the control group and gradually decreased after reaching a peak after 14 days. In the electrical stimulation group, the lateral diameter of the cells rapidly increased after 7 days, a thick myotube was formed, and the lateral diameter of the myotube gradually decreased after 14 days. Overall, a thicker myotube was formed in the electrical stimulation group compared to the control group from the start of electrical stimulation to 21 days after culture (FIG. 4).
[0064]
Considering the above, the number of myotubes, which is an index of differentiation, is higher in the electrical stimulation group than in the control group from 7 days to 10 days later, and more in the electrical stimulation group after 18 days. There was no significant difference from the control group. On the other hand, the maximum lateral diameter of myotube cells increased rapidly after electrical stimulation in the electrical stimulation group, and thicker myotubes were formed than in the control group until 21 days later. From the data of both, myotubes' lateral diameter increased due to the promotion of myotube fusion by electrical stimulation, and there was no significant difference in myotube increase rate compared to the control group. It is thought that.
[0065]
Proliferation of myoblasts and differentiation / maturation into myotube cells are caused by the interaction of myoD family (MyoD, myf5, myogenin, MRF4), which are muscle-specific transcriptional regulators, and cytokines such as IGF-II. This is thought to be due to the action of positive and negative differentiation factors in the cell culture environment including system inducers. In summary, it is suggested that the differentiation of myoblasts was switched on by electrical stimulation, and that the above-described differentiation control factor was induced in the positive direction.
[0066]
Myogenin ( Myogenin )
(1) Molecular cell biological analysis ( RT-PCR method )
For the control group and electrical stimulation group, sampling was performed using ISOGEN (Nippon Gene) 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 21 days after the start of culture. Then, reverse transcription reaction was performed using SuperScript II (GIBCO Laboratories, USA). As Myogenin primers, sense 5′-GTG AAT GAG GCC TTC GAG GCT CTG-3 ′ and antisense 5′-GCA GAA GTG GTG GCG TCT GAC AC-3 ′ (SIGMA Genosys) were designed and amplified. . CDNA was amplified using G3PDH (TOYOBO Inc.) as an internal standard gene.
[0067]
PCR conditions are MRF4: 94 ° C.-45 seconds, 60 ° C.-45 seconds, 72 ° C.-2 minutes, and G3PDH: 94 ° C.-45 seconds, 60 ° C.-45 seconds, 72 ° C.-2 minutes. Was performed under the condition setting of 24 cycles. Furthermore, the absorbance of the expressed mRNA band was analyzed using NIH image V1.62 fpu (National Institutes of Health, USA), and the mRNA expression intensity between samples was measured.
[0068]
The expression of myogenin peaked after 5 days in the control group and showed strong expression, and then the expression weakened. In the electrical stimulation group, the peak reached after 5 days and showed strong expression, but the expression persisted until 16 days (FIGS. 5 and 7). As described above, there was no difference in the expression of G3PDH, which is an internal standard gene, in both groups (FIG. 6).
[0069]
In myogenin mRNA, the control group and the electrical stimulation group were expressed at the same timing, but the expression period was sustained in the electrical stimulation group. In the electrical stimulation group, it is considered that myotube cells mature until the myotube cells have contractile ability due to relatively strong expression of myogenin that is maintained relatively late in culture.
[0070]
(2) Molecular cytological analysis (Western blot Law )
Sampling was performed using SDS-PAGE sample buffer (sample buffer and Jagow, 1987) after 5, 7, 10, 12, 14, and 21 days from the start of culture, and expression of myogenin (myogenin) protein was determined by monoclonal rat. A myogenin antibody (monoclonal rat myogenin antibody (F5D, Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of I-us, US) is used as a primary antibody, and a secondary antibody is used as a primary antibody. ECL Western blotting analysis system (R N 2108: Amersham International, Inc., was detected in the UK).
[0071]
In the control group, myogenin expression reached its peak after 7 days, and thereafter the expression gradually weakened. In the electrical stimulation group, as in the control group, the peak of expression was reached after 7 days, and strong expression was maintained after 10 and 12 days and then decreased (FIG. 8).
[0072]
Myogenin is a protein that regulates differentiation into myotube cells, and is switched on by electrical stimulation from the outside, and myogenin expression is activated. It is thought that it promoted.
[0073]
In L6 cultured this time, no contraction was observed in the control group. In the electrical stimulation group in which muscle contraction was observed, it was observed that myotube cell development and strong expression of myogenin continued. In the process of myotube growth, myogenin binds to the transcriptional regulatory region located upstream of the muscle-specific gene and activates the induction of transcription of the differentiation-specific gene, thereby producing the protein necessary to fulfill muscle functions. Part of the role of synthesis and accumulation. In addition, it is suggested that myogenin is involved, ryanodine receptor and Ca that accompany muscle differentiation and development²⁺ Examples include regulation of sarcoplasmic reticulum gene transcription including sarcoplasmic reticulum proteins such as pumps, expression of acetylcholine receptor subunits, and the like. The increase in the expression of myogenin that functions in this way may suggest that L6, which normally does not contract, may have differentiated into myotube cells with a contractile function.
[0074]
MRF4
Molecular cell biological analysis ( RT-PCR method )
For the control group and the electrical stimulation group, sampling was performed using ISOGEN (Nippon Gene) 3, 5, 10, 14, 16, 18, and 21 days after the start of culture. Then, reverse transcription reaction was performed using SuperScript II (GIBCO Laboratories, USA). Primers of MRF4 were designed as sense 5′-TCA ACT ACA TTG AGC GTC TGC AGG-3 ′, antisense 5′-CTG AGG AAA TAC TGT CCA CGA TGG-3 ′ (SIGMA Genosys) and amplified cDNA . CDNA was amplified using G3PDH (TOYOBO Inc.) as an internal standard gene.
[0075]
PCR conditions are MRF4: 94 ° C-1 min, 68 ° C-1 min, 72 ° C-1 min under the setting conditions of 35 cycles, G3PDH: 94 ° C-45 sec, 60 ° C-45 sec, 72 ° C-2 min Was performed under the condition setting of 24 cycles. Furthermore, the absorbance of the expressed mRNA band was analyzed using NIH image V1.62 fpu (National Institutes of Health, USA), and the mRNA expression intensity between samples was measured.
[0076]
The expression of MRF4 showed strong expression after 5 days in the control group, and the expression was weakened after 10 days. In the electrical stimulation group, the expression increased after 14 days, and the expression persisted until 18 days (FIGS. 9 and 11). There was no difference in the expression of the internal standard gene G3PDH in both groups (FIG. 10).
[0077]
MRF4 mRNA was delayed in the electrical stimulation group compared to the control group, and the expression period persisted. In the electrical stimulation group, it is considered that the myotube cells mature until the myotube cells have contractility due to relatively strong expression of MRF4 until relatively late in the culture.
[0078]
The myoblast cell line used in this study is derived from rat skeletal muscle, but there has been no report that it has differentiated until it has contractility in normal culture. However, in the present invention, the electrical stimulation group was differentiated to muscle cells, and automatic contraction was confirmed.
[0079]
【The invention's effect】
According to the present invention, in the process of culturing myoblasts, a myocyte having an autocontracting ability can be obtained by applying electrical stimulation to the myoblast several times by a pulse wave.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing morphological changes of myoblasts over time for each of a control group and an electrical stimulation group.
FIG. 2 is a photograph showing the expression of striated structure in the cytoplasm of myotube cells after 16 days of culture in the electrical stimulation group.
FIG. 3 is a graph showing changes over time in the number of myotubes generated for each of a control group and an electrical stimulation group.
FIG. 4 is a graph showing changes over time in the maximum transverse length of myotube cells for each of the control group and the electrical stimulation group.
FIG. 5 is a photograph showing changes over time in the absorbance of the expression band of Myogenin (myogenin) by RT-PCR for each of the control group and the electrical stimulation group.
FIG. 6 is a photograph showing changes over time in the expression of G3PDH by RT-PCR for each of a control group and an electrical stimulation group.
FIG. 7 is a graph showing changes over time in absorbance of an expression band of Myogenin (myogenin) by RT-PCR for each of a control group and an electrical stimulation group.
FIG. 8 is a photograph showing time-dependent changes in absorbance of Myogenin (myogenin) expression band by Western blot method for each of the control group and the electrical stimulation group.
FIG. 9 is a photograph showing time-dependent changes in the expression of MRF4 mRNA by RT-PCR for each of the control group and the electrical stimulation group.
FIG. 10 is a photograph showing changes over time in the expression of G3PDH by RT-PCR for each of a control group and an electrical stimulation group.
FIG. 11 is a graph showing changes over time in the absorbance of the MRF4 mRNA expression band by RT-PCR for each of the control group and the electrical stimulation group.

Claims

A method for producing autocontractive muscle cells, characterized in that, during the myoblast culture process, electrical stimulation is applied to the myoblasts by a pulse wave to induce differentiation into muscle cells (muscle fibers) having autocontractivity.

(1) a step of culturing myoblasts in a medium, and then subjecting the myoblasts to electrical stimulation by a pulse wave; and (2) continuing the culture of the myoblasts in the medium to automatically contract. Inducing differentiation into muscle cells (muscle fibers) having
The method of claim 1, comprising:

3. The method of claim 2, wherein the medium of step (1) includes a nutrient source and the medium of step (2) does not include a nutrient source.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the electrical stimulation is given after cells in the culture process reach a confluent state.

The method according to claim 1, wherein the muscle cell (muscle fiber) is a skeletal muscle cell.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the myoblast is a cell line formed into a cell line.

The method according to claim 1, wherein the electrical stimulation is given under the following conditions:
(1) The maximum value (absolute value) of the voltage of the pulse wave is 1 to 200V, the minimum value (absolute value) is 0V,
(2) One electrical stimulation is composed of one electrical stimulation unit in which the number of pulse waves is 0.1 to 10 times / second and the duration is 0.1 to 200 seconds.

The method according to claim 7, wherein the one electrical stimulation unit is given at least once.

9. The method according to claim 7 or 8, wherein the one electrical stimulation unit is given at a frequency of 1-1000 times / day for at least one day.

A skeletal muscle cell having an autocontraction ability derived from a cell lined myoblast cell line.