【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基質に対する保持容量が高く、保持容量の再生が可能な、トロンビン及び／またはトロンビン誘導体をリガンドとする固定化物及びその再生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、アンヒドロトロンビンをリガンドとする親和性吸着体としては、ＮＨＳ活性化担体、臭化シアン活性化担体にアンヒドロトロンビンのアミノ基を用いて、アンヒドロトロンビンを固定した固定化物が知られている（例えば、特許文献１および非特許文献１参照。）。
【０００３】
トロンビンのフィブリノーゲン、血液凝固ＶＩＩＩ因子、血液凝固Ｖ因子、血液凝固ＸＩＩＩ因子等の多くの基質との相互作用にはエクソサイトＩと呼ばれる塩基性アミノ酸領域が重要であることが報告されている。トロンビンのアミノ基を化学修飾した場合には化学修飾のごく初期においてエクソサイトＩ上のＬｙｓ２１，６５が修飾を受け、その修飾によりトロンビンはフィブリノーゲンに対する凝固活性が消失することが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。このことから、Ｌｙｓ２１，６５が、活性に密接に関連する必須アミノ基であると考えられている。ＮＨＳ活性化担体、臭化シアン活性化担体に、アンヒドロトロンビンのアミノ基を用いて、アンヒドロトロンビンを固定した場合には、エクソサイトＩ上の必須アミノ基が固定の初期段階で固定に使用されることが予想されている。実際、このアンヒドロトロンビン固定化物は、フィブリノーゲンをはじめとするトロンビン基質に対して非常に低い保持容量の担体になっていた。
【０００４】
また、トロンビン及びアンヒドロトロンビンは、グアニジン塩酸塩、尿素等のカオトロピック試薬によって生じた変性に対し、透析、希釈等の再生処理によって立体構造が回復するが、上記ＮＨＳ活性化担体、臭化シアン活性化担体にアンヒドロトロンビンのアミノ基を用いて固定した場合には、それらの担体に対する多点結合等の影響により、担体上では高次構造の効率的な回復が阻害され、親和性吸着体の繰り返し使用ができない問題があった。その他、一般的に用いられている、エポキシ活性化担体、カルボジイミドを用いたアミノ担体、カルボキシル担体等へ固定を行った場合においても、効率的な固定化、多点結合等の問題でトロンビン基質に対して、高い保持容量を持ち、高次構造の再生により繰り返し使用ができる親和性吸着体は得られてはいなかった。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第９９／２０６５５号のパンフレット
【非特許文献１】
ＡＣＴＡ ＨＡＥＭＡＴＯＬＯＧＩＣＡ ＪＡＰＯＮＩＣＡ Ｖｏｌ．４９， Ｎｏ．４， ９６９， １９８６
【非特許文献２】
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９ ５； ２６４（ ３１ ） １８４１９−２５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このようなことから、本発明の課題は、親和力のある基質に対する保持容量が高く、さらにトロンビン及びトロンビン誘導体の変性により低下した保持容量を回復させることができる固定化物及びその再生方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、以下の構成を採用することにより、課題を解決することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
【０００９】
［１］ 保護剤の化学修飾により、一部のアミノ基が保護されたトロンビンを水不溶性担体に固定し、次いで、保護されたアミノ基を脱保護し、トロンビンを化学処理し、トロンビン誘導体とすることによって得られる固定化物。
【００１０】
［２］ 保護剤の化学修飾により、一部のアミノ基が保護されたトロンビン誘導体を水不溶性担体に固定し、保護されたアミノ基を脱保護することによって得られる固定化物。
【００１１】
［３］ トロンビン誘導体が、トロンビンの立体構造を維持し、求核性を持たないことを特徴とする前記［１］項または前記［２］項記載の固定化物。
【００１２】
［４］ トロンビン誘導体が、トロンビンを化学処理することにより得られることを特徴とする前記［２］項または前記［３］項記載の固定化物。
【００１３】
［５］ トロンビン誘導体が、トロンビンの遺伝子組換体であることを特徴とする前記［２］項または前記［３］項記載の固定化物。
【００１４】
［６］ トロンビン誘導体が、アンヒドロトロンビンである前記［２］〜［５］のいずれか１項記載の固定化物。
【００１５】
［７］ 保護剤が、マレイル、アセトアセチル、トルエンスルホニル、カルボベンゾキシ及びｔ−ブトキシカルボニルから選ばれる少なくとも１種の官能基を有する化合物であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか１項記載の固定化物。
【００１６】
［８］ 保護剤が、無水マレイン酸、メチルマレイン酸無水物及びジケテンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか１項記載の固定化物。
【００１７】
［９］ 水不溶性担体が、セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、キトサン及びポリアクリルアミドから選ばれる少なくとも１種である前記［１］〜［８］のいずれか１項記載の固定化物。
【００１８】
［１０］ 水不溶性担体が、球状粒子の形態である前記［９］項記載の固定化物。
【００１９】
［１１］ 固定化物が、フィブリノーゲンに対して、０．５〜３ｍｇ／ｍｌの初期保持容量を有することを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれか１項記載の固定化物。
【００２０】
［１２］ 活性低下後の固定化物の保持容量が、再生処理によって初期保持容量の７０％以上に回復することを特徴とする前記［１］〜［１１］のいずれか１項記載の固定化物。
【００２１】
［１３］ 前記［１］〜［１２］のいずれか１項記載の固定化物を、活性が低下した後、カオトロピックイオンを含有する溶液で処理した後に、カオトロピックイオンを除去し、固定化物の基質に対する保持容量を回復する、固定化物の再生方法。
【００２２】
［１４］ カオトロピックイオンを含有する溶液が、グアニジン塩酸塩溶液及び尿素溶液から選ばれる少なくとも１種である前記［１３］項記載の固定化物の再生方法。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の固定化物は、トロンビン及びトロンビン誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種が水不溶性担体に固定された固定化物であって、固定化物は、高い保持容量と保持容量の回復機能を有している。なお、本発明では、トロンビン及びトロンビン誘導体を総称してトロンビン体という場合がある。これらの機能は、トロンビン体と水不溶性担体とが、トロンビン体のエクソサイトＩ内の高い反応性を有するアミノ基以外のアミノ基を介して固定化されていることから発揮すると推定している。なお、本発明において、反応性の高いアミノ基を、高活性のアミノ基または活性化アミノ基という場合がある。
【００２５】
本発明の固定化物は、保護剤の化学修飾により、一部のアミノ基が保護されたトロンビンを水不溶性担体に固定し、次いで、保護されたアミノ基を脱保護し、トロンビンを化学処理し、トロンビン誘導体とすることによって得られる。また、保護剤の化学修飾により、一部のアミノ基が保護されたトロンビン誘導体を水不溶性担体に固定し、保護されたアミノ基を脱保護することによっても得られる。なお、保護剤の化学修飾により、高活性のアミノ基の一部が、化学修飾されていることが必要であり、高活性のアミノ基のすべてが化学修飾されていることが最も好ましい
本発明に用いる保護剤は、アミノ基と選択的に反応し、その後、可逆的に脱離させることができる官能基を有することが好ましい。このような官能基としては、マレイル、アセトアセチル、トルエンスルホニル、カルボベンゾキシ及びｔ−ブトキシカルボニル等の基が挙げられる。これらのうち、保護及び脱保護工程の容易さを考慮すると、官能基は、好ましくはマレイル及びアセトアセチルである。本発明では、これらの官能基を少なくとも１種有する保護剤が利用できる。
【００２６】
マレイル基を有する保護剤は、この基を有していれば、特に限定されないが、例えば、式（１）で表される化合物が利用できる。
【００２７】
【化１】
【００２８】
式（１）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素及び炭素数１〜１０のアルキルからなる群から選択される基である。具体的には、保護剤として、無水マレイン酸、メチルマレイン酸無水物が例示できる。
【００２９】
また、アセトアセチル基を有する保護剤は、この基を有していれば、特に限定されないが、例えば、下記式（２）で表される化合物が利用できる。
【００３０】
【化２】
【００３１】
式（２）において、Ｒ１は、炭素数１〜１０のアルキルである。具体的には、保護剤として、ジケテンが例示できる。
【００３２】
なお、これらの保護剤は、単独で用いるだけでなく２種以上を混合して用いてもよい。これらの保護剤を用い、トロンビン体の保護及び脱離させる手法としては、各保護剤において従来既知の化学的手法を用いることができる。保護剤によるトロンビン体中のアミノ基の保護は、保護前のトロンビン体のフィブリノーゲン活性に対して１０％以下になるまで行うことが好ましく、５％以下がより好ましい。なお、本発明においてフィブリノーゲン活性は、溶液（５０ｍＭ リン酸緩衝液、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）にフィブリノーゲンを１ｍｇ／ｍｌで添加した溶液の凝固時間を測定することによって評価した。
【００３３】
本発明では、このように保護剤で保護され、水不溶性担体に固定されたトロンビン体（以下、水不溶性担体に固定されたトロンビン体をリガンド修飾体という。）は、保護基の脱保護（脱修飾）処理が施される。本発明によるリガンド修飾体の脱保護処理方法や条件は、リガンド修飾体の保護基が効率よく、脱保護できる方法や条件であれば特に制限されず、保護基の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、マレイル基による修飾体の脱保護の場合には、リガンド修飾体を、適当な水や緩衝液で洗浄し、塩酸、硫酸、酢酸等の酸性の水溶液で、ｐＨを２〜５に調節した後、リガンド修飾体を含む酸性溶液を、０〜３０℃で、好ましくは４〜２０℃で、１〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、攪拌した後、ガラスフィルターに移して、適当な水や緩衝液で洗浄する。さらに、１〜６Ｍグアニジン、１〜１２Ｍ 尿素を加えて０〜３０℃で、好ましくは４〜２５℃で、数秒間〜１時間、好ましくは数秒〜１０分攪拌して、リガンド修飾体に十分浸透させた後、適当な水や緩衝液で洗浄する方法がある。
【００３４】
このようにして得られた固定化物は、フィブリノーゲン等のトロンビン基質及び／または阻害剤を分離、精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用の充填剤として使用できる。
【００３５】
本発明に用いるトロンビンは、特に制限されないが、市販されている各種の精製トロンビンを用いることができる。例えば、ヒト由来のコーンペーストＩＩＩ（Ｃｏｈｎ Ｐａｓｔｅ ＩＩＩ）のトロンビン、持田製薬株式会社製のウシ由来の精製トロンビン、三菱ウェルファーマ株式会社製のヒト由来の精製トロンビン等である。なお、これらのトロンビンは、単独で用いるだけでなく２種以上を混合して用いてもよい。また、以下に詳述するトロンビン誘導体と組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
本発明に用いるトロンビン誘導体は、特に制限されないが、トロンビンの立体構造を維持し、求核性を持たない、即ち、トロンビン基質及び／または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさずに求核性を失わせたトロンビン誘導体が好ましい。例えば、親和的な結合に関与する立体構造がトロンビンと同じであり、トロンビンの活性部位のセリン残基をアラニン等の他のアミノ酸残基に置換して求核性を失わせたトロンビン誘導体が利用できる。具体的には、トロンビンを公知の化学処理の手法（特開平１１−４９８００号公報）で、セリン残基をデヒドロアラニン残基に変更したアンヒドロトロンビンや、遺伝子組換操作により得られるトロンビン誘導体が挙げられる。これらのトロンビン誘導体は、単独で用いるだけでなく２種以上を混合して用いてもよい。また、トロンビンの１種だけでなく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
トロンビン誘導体の好ましい一例であるアンヒドロトロンビンの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、特開平１１−４９８００号公報や国際公開第９９／２０６５５号のパンフレット等に示された化学処理方法が挙げられる。より具体的には、トロンビン等のセリンプロテアーゼのセリン活性残基部位を、フェニルメタンスルホニルフルオリド（略号：ＰＭＳＦ）やアミジノフェニルメタンスルホニルフルオリド（略号：ＡＰＭＳＦ）等の阻害剤で反応させた後、ｐＨ１１以上でアルカリ処理を施し、アンヒドロ化することによって、アンヒドロトロンビンが製造できる。また、遺伝子組換等の手法を用いて、トロンビンの活性セリン残基をアラニン等に置き換えて、酵素活性を消失させる方法によっても、アンヒドロトロンビンと同じく酵素活性を失った不活化トロンビンが製造できる（以下、これらを含めて、アンヒドロトロンビンと総称する）。
【００３８】
アンヒドロトロンビンが、トロンビンの遺伝子組換体である例としては、トロンビンのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が遺伝子組換操作により欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつトロンビン基質及び／または阻害剤との結合に立体障害を引き起こさないトロンビンの変異体が挙げられる。このような変異体は、上記条件を満たすものであれば特に制限されないが、例えば、トロンビン活性部位中のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換及びトロンビン活性部位中の活性セリンからアラニンへの置換がある。なお、トロンビンまたはアンヒドロトロンビンとトロンビン基質及び／または阻害剤との結合部位は、完全には明らかにされていないが、これらの（アニオン）エクソサイトＩと呼ばれる領域が重要であると考えられている。このため、このエクソサイトＩ中の活性化アミノ基を修飾することによって、このエクソサイトＩの活性化アミノ基をリガンドに固定化させることがほとんどなく、立体障害を引き起こさずに、トロンビン基質及び／または阻害剤の精製が可能になる。
【００３９】
また、本発明において、上記方法によって得られたアンヒドロトロンビンは、不純物を除去することを目的として、さらに精製工程を施されてもよい。この際、精製方法は特に制限されず、特開平１１−４９８００号公報や国際公開第９９／２０６５５号のパンフレットに記載される方法等、従来公知の分離、精製方法を利用することができる。より具体的には、アンヒドロトロンビン溶液を濃縮し、この溶液をｐＨ４〜１０の範囲で調整された緩衝液（セリンプロテアーゼのアンヒドロ化反応の際に用いられた緩衝液をそのまま使用してもよい）を使用して平衡化されたヒルジン等のトロンビンと相互作用するリガンドを結合させたアフィニティークロマトグラフィーカラムに通液して、アンヒドロトロンビンを選択的に吸着させた後、洗浄し、他の不純物を除去する方法である。
【００４０】
上記工程後、アフィニティークロマトカラムに結合したアンヒドロトロンビンを脱離する目的で、セリンプロテアーゼ阻害剤溶液、またはアミジノ、グアニジル、フェニル、長鎖アルキル、アルギニン残基のうち少なくとも１つ以上の基を有する化合物の溶液をｐＨ４〜１０に調整し、アフィニティーカラムに通液し、目的の物質（アンヒドロトロンビン）を溶出させる。その後、透析、限外濾過、ゲル濾過等の手法により前述の脱離液成分を除去し、より高純度のアンヒドロトロンビンを得ることができる。上記アンヒドロトロンビンの溶出工程に使用することが可能なセリンプロテアーゼ阻害剤は、特に制限されず、公知のセリンプロテアーゼ阻害剤が使用できるが、例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド（略号：ＰＭＳＦ）、アミジノフェニルメチルスルホニルフルオリド（略号：ＡＰＭＳＦ）、２−フェニルエタン−１−スルホニルフルオリド、メタンスルホニルフルオリド及びｐ−トルエンスルホニル（トシル）フルオリド等の各種スルホニルフルオリド、さらに、トシルクロリド、 ジイソプロピルフルオロリン酸（略号：ＤＦＰ）、３，４−ジクロロイソクマリン（略号：３，４−ＤＣＩ）、Ｌ−１−クロロ−３−［４−トシルアシド］−７−アミノ−２−ヘプタノン−塩酸（略号：ＴＬＣＫ）及びＬ−１−クロロ−３−［４−トシルアシド］−４−フェニル−２−ブタノン（略号：ＴＰＣＫ）等が挙げられる。
【００４１】
本発明において、担体としては水不溶性担体が使用される。なお、本発明では、「水不溶性担体」は、担体を構成する成分が非水溶性の物質からなる担体、または水溶性の物質を架橋反応等の処理を行うことにより水不溶性とした物質からなる担体をいう。水不溶性担体は、例えば、セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、キトサン、ポリアクリルアミド等である。なかでも、セルロース及び架橋アガロースが水不溶性担体として好ましい。また、水不溶性担体の形状は、特に制限されず、種々の形状が利用できるが、例えば、球状、中空糸状及び膜状等の形状が挙げられ、なかでも、球状粒子が好ましい。また、これらの水不溶性担体は、単独で用いるだけでなく２種以上を混合して用いてもよい。
【００４２】
本発明において、水不溶性担体が球状である場合には、その形状は正確に真球である必要はないものの、高い真球度であることが好ましい。具体的には、球状粒子の真球度が０．９以上、より好ましくは０．９５以上である。なお、本明細書において、「真球度」とは、粒子の最小径（短径）に対する最大径（長径）の比（＝短径／長径）であり、ゆえにこの値が１．０に近づくほど真球度が高い、即ち、真球に近くなることを意味する。好ましく利用できる球状粒子は、球状セルロースである。水不溶性担体として球状セルロースを使用することによって、リガンドであるトロンビン体の固定が容易になり、トロンビン体をリガンドして含む固定化物が、生体適合性及び強度ともに高くなる。このため、本発明の固定化物は、所望のトロンビン基質及び／または阻害剤の吸着体として有効である。なお、ここで示される「生体適合性」とは、固定化物を用いて精製操作を行う際に、固定化物から生体に有害な物質の溶出が生じないことをいう。
【００４３】
本発明において、中空糸状の水不溶性担体とは、内部に連続または不連続の空洞を有する繊維状の担体をいう。このような担体は、熱溶融紡糸法によって製造できる。例えば、熱可塑性樹脂に発泡剤を添加し、これを原料として熱溶融紡糸を行うことで、不連続の空洞を有する繊維が製造できる。また、熱可塑性樹脂に無機微粒子を添加し、これを原料として熱溶融紡糸を行ない、さらに延伸倍率を適宜設定して延伸処理を行うことで、不連続の空洞を有する繊維が製造できる。また、中空構造の繊維断面用の口金を用いて、汎用の熱可塑性樹脂を原料として熱溶融紡糸を行うことにより、連続した空洞を有する繊維が製造できる。これらの繊維は、担体として必要に応じた繊維長に切断して利用できる。
【００４４】
本発明において、水不溶性担体の形状が膜状である場合には、例えば、市販のメンブランフィルターのように平板状で多孔を有し、一定の範囲の排除限界分子量を持つ膜が利用できる。
【００４５】
本発明において、化学修飾したトロンビン体のアミノ基を水不溶性担体に固定する方法は、特に限定はないが、例えば、エポキシ、ホルミル、活性化エステル等の基を、スペーサーを介して水不溶性担体に導入し、化学修飾したトロンビン体に存在する残存アミノ基（水不溶性担体の固定に用いられなかったアミノ基をいう。）を固定させる方法が挙げられる。このときの固定化条件は、使用されるトロンビン体、水不溶性担体の種類、その量、残存アミノ基の量等によっても異なり、残存アミノ基が効率よく水不溶性担体に固定できる条件であれば特に制限はない。具体的には、水不溶性担体を必要に応じて水や緩衝液等で洗浄した後、化学修飾したトロンビン体を添加して、縮合剤を加えて、４〜３０℃、好ましくは４〜２５℃で、１〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、攪拌する。これにより、化学修飾されたトロンビンの残存アミノ基が水不溶性担体の官能基と結合して固定される。本発明に用いる縮合剤は、公知の縮合剤が使用できるが、例えば、シアノトリヒドロほう酸ナトリウム、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロライド（略号：ＥＤＣ）等である。
【００４６】
本発明の固定化物は、フィブリノーゲンに対して、０．５〜３ｍｇ／ｍｌの初期保持容量を有していることが好ましい。また、活性低下後の固定化物の保持容量が、再生処理によって初期保持容量の７０％以上に回復できることが好ましい。
【００４７】
本発明では、このようにトロンビン体の活性アミノ基の少なくとも一部が化学修飾によって保護され、さらにトロンビン体が水不溶性担体に固定される。
【００４８】
本発明において、固定化物は、変性によりリガンドの活性が低下することで保持容量が低下する。このような場合には、変性した固定化物を、カオトロピックイオンを含有する溶液で処理し、トロンビン体を変性させた後、固定化物からカオトロピックイオンを除去することによって、固定化物の基質に対する高次構造（保持容量）を回復させることができる。カオトロピックイオンとは、水溶液中の水分子のカゴ構造を壊す作用のあるイオンの総称であり、ＳＣＮ−，Ｉ−，ＣｌＯ４ −，ＮＯ３ −，Ｂｒ−，Ｃｌ−，ＣＨ３ＣＯ２ −，Ｆ−，ＳＯ４ ２−等である。カオトロピックイオンを含有する溶液は、具体的には、グアニジン塩酸塩溶液，尿素溶液等である。トロンビン体の変性した固定化物の再生には、カオトロピックイオンを含有する溶液を単独で処理する方法や、これと緩衝液の混合液で処理する方法が利用できる。処理方法はカラムを用いた連続法または回分法を用いることができる。その際、カオトロピックイオンを含有する溶液の濃度は、３〜６Ｍ グアニジン塩酸塩、６Ｍ以上の尿素であることが好ましい。その後、固定化物からカオトロピックイオンを洗浄操作により除去するが、洗浄液は、水、緩衝液等であり、好ましくは、再生されたトロンビン体の安定性を図れる緩衝液である。洗浄操作は、カラムを用いた連続法または回分法で行える。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００５０】
なお、実施例、比較例で用いた材料の組成は以下の通りである。
【００５１】
リン酸緩衝液１：５０ｍＭ リン酸緩衝液＋１．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）
リン酸緩衝液２：５０ｍＭ リン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋０．３Ｍ アルギニン（ｐＨ６．５）
リン酸緩衝液３：５０ｍＭ リン酸緩衝液＋６．０Ｍ グアニジン塩酸＋１．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
クエン酸緩衝液：５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ４）
中和液：２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）
透析液：０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３＋１．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液１：５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液２：５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋１．０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液３：５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液４：０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液５：０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液６：５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋１０Ｍ尿素＋０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
洗浄液７：５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８）
ＡＰＭＳＦ：アミジノフェニルメタンスルホニルフルオリドの略号。
【００５２】
実施例１
１）アミノ基の保護
人血液由来のトロンビン（約２８ｍｇ）を、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍｌ）に溶解し、これを透析チューブに入れて、透析液（５００ｍｌ）中で、２時間ずつ２回透析した。透析チューブから透析サンプル溶液を取り出し、これに１０容量％のシトラコン酸無水物のジオキサン溶液（１０μｌ）を加えた。室温で５分攪拌し、同試薬（１０μｌ）を添加する操作を２回繰り返した。次に、３０分攪拌した後、これを透析チューブに入れてリン酸緩衝液（５００ｍｌ）中で、２時間ずつ３回透析し、アミノ基を保護したトロンビンを得た。このトロンビンは、もとのトロンビンと比較して、フィブリノーゲン凝固活性が１０％以下に低下していた。
【００５３】
２）トロンビンのセルロースゲルへの固定
ホルミル基を約５μＭ／ｍｌ有する湿潤状態のホルミルセルロファイン（チッソ（株）製球状セルロース、１０ｇ）を、グラスフィルター上で、リン酸緩衝液１で十分に洗浄し、これを容器に移し、上記１）の処理を施し、アミノ基を保護したトロンビンを加えた。さらに、これにシアノトリヒドロほう酸ナトリウム（５０ｍｇ）を添加し、２時間室温にて攪拌後、ガラスフィルター上で、セルロースゲルをリン酸緩衝液で洗浄し、さらに中和液で洗浄した。得られたセルロースゲルを容器に移し、さらに中和液を加え、体積を３０ｍｌにした。セルロースゲルの残存ホルミル基のブロッキングを行なうために、シアノトリヒドロほう酸ナトリウム（１００ｍｇ）を添加し、室温で２時間攪拌後、ガラスフィルター上に移し、洗浄液１（５００ｍｌ）でゲルを洗浄した。
【００５４】
この操作において、非固定化タンパク量から計算したところ、約１５ｍｇのトロンビンがセルロースゲルに固定されていることがわかった。
【００５５】
３）脱保護操作
上記２）の操作で得られた、トロンビン固定化セルロースゲルを超純水で洗浄後、ｐＨ２．０の塩酸水（５００ｍｌ）に加えた。室温で２時間攪拌後、ガラスフィルターに移し、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（５００ｍｌ）で洗浄後、５Ｍ グアニジン溶液（３０ｍｌ）を加え、トロンビン固定化セルロースゲル全体に充分に浸透させた。その後、洗浄液２（５００ｍｌ）で該セルロースゲルを洗浄した。
【００５６】
４）固定化トロンビンのアンヒドロ化
上記３）の操作で得られたトロンビン固定化セルロースゲルを洗浄液３で洗浄後、ＡＰＭＳＦ（５ｍｇ）を添加し、室温で３分間、攪拌して、トロンビン修飾体を誘導化（ＡＰＭＳ化）した。得られたアンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルを超純水（４℃）で洗浄後、これを容器に移し、超純水（４℃）で全体積を２００ｍｌにした。１Ｎ ＮａＯＨ（１０ｍｌ）を加え、４℃で１５分攪拌後、ガラスフィルター上において、洗浄液３で洗浄し、余分な水分を程よくきった後、５Ｍ グアニジン溶液（３０ｍｌ）を加え、アンヒドロトロンビン固定化セルロースゲル全体に充分に浸透させた。洗浄液２、洗浄液３で順次、アンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルを洗浄した。その後、これをビーカーに移し、上澄み液を除去後、洗浄液３で、全体積を２０ｍｌにした。ここに０．１ｍｇ／ｍｌのＰＰＡＣＫ（３０μｌ）を加え、攪拌し、残存トロンビン凝固活性を不活性化した。残存活性は、合成基質Ｓ−２２３８分解活性を用いて測定した。
【００５７】
５）アンヒドロトロンビンカラムによるフィブリノーゲンの精製
上記４）の操作で得られた、アンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルを充填したカラムを、リン酸緩衝液（４℃）で平衡化した後、同様のリン酸緩衝液（５ｍｌ）に溶解した、和光純薬製６５％ｃｌｏｔｔａｂｌｅ ＦｒａｃｔｉｏｎＩ分画（２０ｍｇ）を添加し、リン酸緩衝液（５０ｍｌ）でカラム中の非吸着タンパク質を洗浄した。次に、リン酸緩衝液２（４℃）で溶出を行なったところ、純度９５％以上のフィブリノーゲンが、約１０ｍｇ溶出した。
【００５８】
比較例１
１）トロンビンのセルロースゲルへの固定化
アミノ基を保護したトロンビンに代えて、洗浄液２（５０ｍｌ）で溶解した人血液由来のトロンビンを加え、最初の撹拌時間を２時間から２０分に変更した以外は、実施例１に準拠して、セルロースゲルにトロンビンの固定を行った。
【００５９】
本操作において、非固定化タンパク量から計算したところ、約１８ｍｇのトロンビンがセルロースゲルに固定されていることがわかった。
【００６０】
２）固定化トロンビンのアンヒドロ化
実施例１に準拠して、上記１）の操作で得られたセルロースを用いて、残存トロンビン活性を不活性化した。
【００６１】
３）アンヒドロトロンビンカラムによるフィブリノーゲンの精製
実施例１に準拠して、上記３）の操作で得られた、セルロースゲルを用いて、フィブリノーゲンの精製を行った。その結果、大部分のタンパク質は、リン酸緩衝液２と共に洗い流され、純度９５％以上のフィブリノーゲンは、約１ｍｇ溶出したのみであった。
【００６２】
比較例２
１）アンヒドロトロンビンの固定化
特許文献１に記載の方法と同様にして、人トロンビン（４０ｍｇ）からアンヒドロトロンビンを合成した。アンヒドロトロンビン（２０ｍｇ）を、洗浄液４に溶解し、球状セルロース（１０ｇ）を洗浄液４で洗浄し、これに添加し、１５分攪拌して固定化処理を行った。この固定化処理で８０％以上のアンヒドロトロンビンがセルロースに固定された。
【００６３】
２）アンヒドロトロンビンカラムによるフィブリノーゲンの精製
上記１）の操作で得られたアンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルを充填カラムとして用いた以外は、実施例１に準拠して、フィブリノーゲンの精製を行った。その結果、大部分のタンパク質は、リン酸緩衝液２と共に洗い流され、純度９５％以上のフィブリノーゲンが、約２．５ｍｇ溶出した。
【００６４】
実施例２
実施例１と同様にして得られたアンヒドロトロンビン固定化セルロースゲル（固定化物）をクエン酸緩衝液（４℃）で洗浄し、固定されたアンヒドロトロンビンのリガンド活性を低下させ、変性アンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルにした。次に、この変性アンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルをカラムに充填し、充填した該ゲルの１０倍量の洗浄液５（４℃）で得られたカラムを洗浄後、充填したゲルの１０倍量のリン酸緩衝液３（４℃）で再生処理を行なった。
【００６５】
実施例１に準拠して、再生処理を行ったカラムを用いて、フィブリノーゲンの精製を行った。その結果、実施例１と同等の純度９５％以上のフィブリノーゲンが、約９．５ｍｇ溶出し、フィブリノーゲンに対する保持容量が９５％保持されていることがわかった。
【００６６】
比較例３
比較例２と同様にして得られたアンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルを用いて、実施例２に準拠して、アンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルの変性と再生を行ない、そのカラムを用いて、フィブリノーゲンの精製を行った。その結果、純度９５％以上のフィブリノーゲンが、約０．２ｍｇ溶出し、フィブリノーゲンに対する保持容量が１０％保持されていることがわかった
実施例３
人血液由来のトロンビン（１０ｍｇ）を、洗浄液５（５ｍｌ）に溶解し、スターラーで攪拌しながら、ジケテン（原液、３μｌ）を５分間隔で添加した。このジケテンの添加を、もとのトロンビンに対しフィブリノーゲン凝固活性が５％になるまで行なった。ジケテン処理を行なったトロンビン溶液を洗浄液４に対し透析を行ない、洗浄液４で洗浄したＮＨＳ活性化セルロファイン（チッソ（株）製球状セルロース、１０ｇ）を加え、２５℃で３０分攪拌した。次いで、１Ｍ エタノールアミン（ｐＨ９）で、残存ＮＨＳのブロッキングを行なったところ、約６ｍｇのトロンビンが固定できた。これを、ｐＨ７．５の０．５Ｍ ヒドロキシアミン（１００ｍｌ）に加え、８時間、２５℃で攪拌し、脱修飾処理を行なった後、精製水でヒドロキシアミンを除去して、トロンビン固定化セルロースゲル（ゲルＡ）が得られた。
【００６７】
比較例４
人血液由来のトロンビン（１０ｍｇ）を、洗浄液４（５ｍｌ）に溶解し、洗浄液４で洗浄したＮＨＳ活性化セルロファイン（チッソ（株）製球状セルロース、１０ｇ）を加え、２５℃で５分攪拌した。次いで、１Ｍ エタノールアミン（ｐＨ９）で、残存ＮＨＳのブロッキングを行ったところ、９ｍｇ以上のトロンビンが固定され、トロンビン固定化セルロースゲル（ゲルＢ）が得られた。
【００６８】
このようにして得られたゲルＡ、ゲルＢを、それぞれ１Ｎ塩酸で、４℃、ｐＨ２に調製し、それぞれのトロンビンを完全に変性させ、リガンド活性を低下させた。この時点で両ゲルは合成基質Ｓ−２２３８活性を完全に失っていた。次に変性状態のゲルＡ、ゲルＢに対し、グラスフィルター上で、洗浄液６（１００ｍｌ）で洗浄し、次いで、洗浄液１を添加し、再生処理を行った後、再度ゲルＡ、ゲルＢのＳ−２２３８活性を測定した。これによりゲルＡ、ゲルＢにおける変性したトロンビン立体構造の再生効果が確認できた。
【００６９】
合成基質Ｓ−２２３８分解活性は、ゲルＡ（１０ｍｇ）、ゲルＢ（１０ｍｇ）に、それぞれ洗浄液７（１ｍｌ）を加え、２５℃で攪拌し、これらから、ゲルＡ、ゲルＢを５０μｌずつ取り、これに合成基質Ｓ−２２３８（１ｍｇ／ｍｌ、５０μｌ）及び洗浄液７（２００μｌ）を添加し、３７℃で測定した。
【００７０】
再生処理後のゲルＡはゲルＢに比較し約１５倍高い合成基質Ｓ−２２３８分解活性を示した。
【００７１】
この結果より、ジケテンでトロンビンの活性アミノ基の保護を行った後に、球状セルロースに固定された、トロンビン固定化ゲルは、活性アミノ基の保護を行わず直接固定された、トロンビン固定化ゲルと比較して、カオトロピック試薬による再生処理によって、ゲルに固定された状態で、トロンビンの立体構造の再生が１０倍以上であることがわかった。
【００７２】
実施例４
１）アミノ基の保護
アンヒドロトロンビン（約２５ｍｇ）を１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍｌ）に溶解し、これを透析チューブに入れて、透析液（５００ｍｌ）中で、２時間ずつ２回透析した。透析チューブから透析サンプル溶液を取り出し、これに１０容量％シトラコン酸無水物／ジオキサン溶液（１００μｌ）を加えた。室温で５分攪拌し、同試薬（１００μｌ）を添加する操作を２回繰り返した。次に３０分これを攪拌した後、透析チューブに入れて洗浄液２（５００ｍｌ）中で、２時間ずつ３回透析することで、アミノ基を保護したアンヒドロトロンビンを得た。
【００７３】
２）トロンビンの固定化
ホルミル基を約５μＭ／ｍｌ有する湿潤状態のホルミルセルロファイン（チッソ（株）製球状セルロース、１０ｇ）を、グラスフィルター上で、リン酸緩衝液１で十分に洗浄し、これを容器に移し、上記１）のアンヒドロトロンビン（２５ｍｇ）を溶かしたリン酸緩衝液１（５ｍｌ）を加えた。さらに、これにシアノトリヒドロほう酸ナトリウム（１ｍｇ）を添加し、１８０分、室温にて攪拌後、ガラスフィルター上で、セルロースゲルをリン酸緩衝液１で洗浄し、さらに中和液で洗浄した。得られたセルロースゲルを容器に移し、さらに、中和液を加え、体積を３０ｍｌにした。セルロースゲルの残存ホルミル基のブロッキングを行なうために、シアノトリヒドロほう酸ナトリウム（２ｍｇ）を添加し、室温で１時間攪拌後、ガラスフィルター上に移し、洗浄液１（５００ｍｌ）でゲルを洗浄した。
【００７４】
この操作において、非固定化タンパク量から計算したところ、約１３ｍｇのアンヒドロトロンビンが固定されていることがわかった。
【００７５】
この方法で作製したアンヒドロトロンビン固定化セルロースゲルのカラムに対し、実施例１と同様のフィブリノーゲン精製実験を行なったところ、純度９５％以上のフィブリノーゲンが約１２ｍｇ溶出した。
【００７６】
【発明の効果】
本発明の固定化物は、トロンビン体のアミノ基を保護剤で保護した状態で、保護されていない残存アミノ基を用いて水不溶性担体に固定し、その後、脱保護を行うことで、保持容量が高い。さらに、本発明の固定化物は、リガンドの変性によって低下した保持容量が、カオトロピックイオンを含有した溶液で、固定化物を処理し、固定化物からカオトロピックイオンを除去することにで、保持容量を回復させことが可能である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immobilized product using thrombin and / or thrombin derivatives as a ligand, which has a high retention capacity for a substrate and can be regenerated, and a regeneration method thereof.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as an affinity adsorbent using anhydrothrombin as a ligand, an immobilized product in which anhydrothrombin is immobilized on an NHS-activated carrier or cyanogen bromide-activated carrier using an anhydrothrombin amino group is known. (For example, see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
[0003]
It has been reported that a basic amino acid region called exosite I is important for the interaction of thrombin with many substrates such as fibrinogen, blood coagulation factor VIII, blood coagulation factor V, and blood coagulation factor XIII. It is reported that when the amino group of thrombin is chemically modified, Lys21,65 on exosite I is modified at the very early stage of the chemical modification, and thrombin loses the coagulation activity against fibrinogen due to the modification (for example, Non-patent document 2). From this, it is considered that Lys21, 65 is an essential amino group closely related to activity. When anhydrothrombin is immobilized on an NHS activated carrier or cyanogen bromide activated carrier using the amino group of anhydrothrombin, the essential amino group on exosite I is used for immobilization at the initial stage of immobilization. It is expected to be. In fact, this anhydrothrombin immobilization product has become a carrier having a very low retention capacity for thrombin substrates including fibrinogen.
[0004]
In addition, thrombin and anhydrothrombin recover their steric structure by regeneration treatment such as dialysis and dilution against denaturation caused by chaotropic reagents such as guanidine hydrochloride and urea, but the NHS activated carrier, cyanogen bromide activity When immobilized onto an immobilized carrier using the amino group of anhydrothrombin, the efficient recovery of the higher-order structure is inhibited on the carrier due to the effects of multipoint binding to the carrier, and the affinity adsorbent There was a problem that could not be used repeatedly. In addition, even when fixing to commonly used epoxy-activated carriers, amino carriers using carbodiimide, carboxyl carriers, etc., thrombin substrates are used due to problems such as efficient immobilization and multipoint bonding. On the other hand, an affinity adsorbent that has a high retention capacity and can be used repeatedly by regeneration of higher-order structures has not been obtained.
[0005]
[Patent Document 1]
Pamphlet of International Publication No. 99/20655
[Non-Patent Document 1]
ACTA HAEMATOLOGICA JAPONICA Vol. 49, no. 4, 969, 1986
[Non-Patent Document 2]
J Biol Chem 1989 5; 264 (31) 18419-25
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above, an object of the present invention is to provide an immobilization product that has a high retention capacity for an affinity substrate and that can recover the retention capacity that has been reduced by denaturation of thrombin and thrombin derivatives, and a method for regenerating the same. It is.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have made extensive studies to solve the above problems. As a result, the inventors have found that the problems can be solved by adopting the following configuration, and have completed the present invention based on this finding.
[0008]
That is, the present invention has the following configuration.
[0009]
[1] Thrombin in which some amino groups are protected is immobilized on a water-insoluble carrier by chemical modification of a protective agent, then the protected amino group is deprotected, and thrombin is chemically treated to obtain a thrombin derivative. Immobilized material obtained by
[0010]
[2] An immobilized product obtained by immobilizing a thrombin derivative in which a part of the amino group is protected by a chemical modification of a protective agent on a water-insoluble carrier and deprotecting the protected amino group.
[0011]
[3] The immobilized product according to [1] or [2], wherein the thrombin derivative maintains the three-dimensional structure of thrombin and does not have nucleophilicity.
[0012]
[4] The immobilized product according to [2] or [3], wherein the thrombin derivative is obtained by chemically treating thrombin.
[0013]
[5] The immobilized product according to [2] or [3] above, wherein the thrombin derivative is a recombinant gene of thrombin.
[0014]
[6] The immobilized product according to any one of [2] to [5], wherein the thrombin derivative is anhydrothrombin.
[0015]
[7] The above [1] to [6], wherein the protective agent is a compound having at least one functional group selected from maleyl, acetoacetyl, toluenesulfonyl, carbobenzoxy and t-butoxycarbonyl. The immobilization thing of any one of these.
[0016]
[8] The immobilized product according to any one of [1] to [6], wherein the protective agent is at least one selected from maleic anhydride, methylmaleic anhydride, and diketene.
[0017]
[9] The immobilized product according to any one of [1] to [8], wherein the water-insoluble carrier is at least one selected from cellulose, crosslinked agarose, crosslinked dextran, chitosan, and polyacrylamide.
[0018]
[10] The immobilized product according to [9], wherein the water-insoluble carrier is in the form of spherical particles.
[0019]
[11] The immobilized product according to any one of [1] to [10], wherein the immobilized product has an initial retention capacity of 0.5 to 3 mg / ml with respect to fibrinogen.
[0020]
[12] The immobilized product according to any one of the above [1] to [11], wherein the retention capacity of the immobilized product after the decrease in activity is restored to 70% or more of the initial retention capacity by regeneration treatment.
[0021]
[13] After the activity of the immobilized product according to any one of [1] to [12] is reduced and then treated with a solution containing chaotropic ions, the chaotropic ions are removed, and the immobilized product is immobilized on a substrate. A method for regenerating immobilized materials that restores the storage capacity.
[0022]
[14] The method for regenerating an immobilized product according to [13], wherein the solution containing chaotropic ions is at least one selected from a guanidine hydrochloride solution and a urea solution.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0024]
The immobilized product of the present invention is an immobilized product in which at least one selected from the group consisting of thrombin and thrombin derivatives is immobilized on a water-insoluble carrier, and the immobilized product has a high retention capacity and a retention capacity recovery function. ing. In the present invention, thrombin and thrombin derivatives are sometimes collectively referred to as thrombin bodies. It is presumed that these functions are exerted because the thrombin body and the water-insoluble carrier are immobilized via an amino group other than the highly reactive amino group in the exosite I of the thrombin body. In the present invention, a highly reactive amino group may be referred to as a highly active amino group or an activated amino group.
[0025]
In the immobilized product of the present invention, thrombin in which some amino groups are protected is fixed to a water-insoluble carrier by chemical modification of a protective agent, then the protected amino group is deprotected, and thrombin is chemically treated, It is obtained by making a thrombin derivative. It can also be obtained by fixing a thrombin derivative in which a part of the amino group is protected to a water-insoluble carrier by chemical modification of the protective agent and deprotecting the protected amino group. In addition, it is necessary that a part of the highly active amino group is chemically modified by chemical modification of the protective agent, and it is most preferable that all of the highly active amino group is chemically modified.
The protective agent used in the present invention preferably has a functional group that can selectively react with an amino group and then be reversibly removed. Examples of such a functional group include groups such as maleyl, acetoacetyl, toluenesulfonyl, carbobenzoxy, and t-butoxycarbonyl. Among these, considering the ease of the protection and deprotection steps, the functional group is preferably maleyl and acetoacetyl. In the present invention, a protective agent having at least one of these functional groups can be used.
[0026]
The protective agent having a maleyl group is not particularly limited as long as it has this group. For example, a compound represented by the formula (1) can be used.
[0027]
[Chemical 1]
In formula (1), R2And R3Are each independently a group selected from the group consisting of hydrogen and alkyl having 1 to 10 carbon atoms. Specific examples of the protective agent include maleic anhydride and methylmaleic anhydride.
[0029]
Moreover, the protective agent having an acetoacetyl group is not particularly limited as long as it has this group. For example, a compound represented by the following formula (2) can be used.
[0030]
[Chemical formula 2]
[0031]
In formula (2), R1Is alkyl having 1 to 10 carbon atoms. Specifically, diketene can be illustrated as a protective agent.
[0032]
In addition, you may use these protective agents not only independently but in mixture of 2 or more types. As a method for protecting and desorbing the thrombin body using these protective agents, conventionally known chemical methods can be used for each protective agent. The protection of the amino group in the thrombin body by the protective agent is preferably carried out until it becomes 10% or less with respect to the fibrinogen activity of the thrombin body before protection, and more preferably 5% or less. In the present invention, fibrinogen activity was evaluated by measuring the coagulation time of a solution obtained by adding 1 mg / ml of fibrinogen to a solution (50 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7).
[0033]
In the present invention, the thrombin body thus protected with a protective agent and immobilized on a water-insoluble carrier (hereinafter, the thrombin body immobilized on the water-insoluble carrier is referred to as a ligand-modified body) is deprotected (deprotected). (Modification) processing is performed. The method and conditions for deprotection of the ligand-modified product according to the present invention are not particularly limited as long as the protecting group of the ligand-modified product is efficient and can be deprotected, and can be appropriately selected depending on the type of the protecting group and the like. . For example, in the case of deprotecting a modified product with a maleyl group, the ligand-modified product is washed with an appropriate water or buffer solution, and the pH is adjusted to 2 to 5 with an acidic aqueous solution such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or acetic acid. After that, the acidic solution containing the ligand-modified product is stirred at 0 to 30 ° C., preferably at 4 to 20 ° C. for 1 to 24 hours, preferably 1 to 12 hours, and then transferred to a glass filter to obtain an appropriate water. Wash with or buffer. Further, 1-6M guanidine and 1-12M urea are added and stirred at 0-30 ° C., preferably 4-25 ° C., for several seconds to one hour, preferably several seconds to 10 minutes, and sufficiently penetrates into the ligand-modified product. There is a method of washing with an appropriate water or buffer after the treatment.
[0034]
The immobilized product thus obtained can be used as a packing material for affinity chromatography for separating and purifying a thrombin substrate such as fibrinogen and / or an inhibitor.
[0035]
The thrombin used in the present invention is not particularly limited, but various purified thrombin commercially available can be used. For example, human-derived corn paste III (Cohn Paste III) thrombin, bovine-derived purified thrombin manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., human-derived purified thrombin manufactured by Mitsubishi Pharma Corporation, and the like. These thrombins may be used alone or in combination of two or more. Moreover, you may use in combination with the thrombin derivative explained in full detail below.
[0036]
The thrombin derivative used in the present invention is not particularly limited, but maintains the thrombin steric structure and does not have nucleophilicity, that is, nucleophilicity without causing steric hindrance to the binding to the thrombin substrate and / or inhibitor. A thrombin derivative in which is lost is preferred. For example, thrombin derivatives that have the same steric structure involved in affinity binding as thrombin and have lost the nucleophilicity by substituting serine residues in the active site of thrombin with other amino acid residues such as alanine are used. it can. Specifically, thrombin is obtained by a known chemical treatment technique (Japanese Patent Laid-Open No. 11-49800), an anhydrothrombin in which a serine residue is changed to a dehydroalanine residue, or a thrombin derivative obtained by gene recombination. Can be mentioned. These thrombin derivatives may be used alone or in combination of two or more. Moreover, you may use not only 1 type of thrombin but 2 or more types in combination.
[0037]
The method for producing anhydrothrombin, which is a preferred example of a thrombin derivative, is not particularly limited. For example, the chemical treatment described in JP-A-11-49800, WO99 / 20655, etc. A method is mentioned. More specifically, after reacting the serine active residue site of a serine protease such as thrombin with an inhibitor such as phenylmethanesulfonyl fluoride (abbreviation: PMSF) or amidinophenylmethanesulfonyl fluoride (abbreviation: APMSF). Anhydrothrombin can be produced by applying an alkali treatment at a pH of 11 or higher and anhydrotreating. Moreover, inactivated thrombin that has lost enzyme activity in the same manner as anhydrothrombin can also be produced by replacing the active serine residue of thrombin with alanine or the like by using a method such as gene recombination, thereby eliminating the enzyme activity. (Hereafter, these are collectively referred to as anhydrothrombin).
[0038]
Examples of the anhydrothrombin being a genetic recombinant of thrombin include an amino acid sequence in which at least one amino acid of the thrombin amino acid sequence has been deleted, substituted, or added by genetic recombination, and a thrombin substrate and / or Examples include thrombin mutants that do not cause steric hindrance in binding to the inhibitor. Such a mutant is not particularly limited as long as it satisfies the above conditions. For example, there are substitution of aspartic acid into asparagine in the thrombin active site and substitution of active serine into alanine in the thrombin active site. Although the binding site between thrombin or anhydrothrombin and the thrombin substrate and / or inhibitor has not been completely clarified, it is thought that these regions called (anion) exosite I are important. Yes. For this reason, by modifying the activated amino group in the exosite I, the activated amino group of the exosite I is hardly immobilized on the ligand, and without causing steric hindrance, the thrombin substrate and / or Alternatively, the inhibitor can be purified.
[0039]
In the present invention, the anhydrothrombin obtained by the above method may be further subjected to a purification step for the purpose of removing impurities. In this case, the purification method is not particularly limited, and conventionally known separation and purification methods such as the method described in JP-A-11-49800 and WO99 / 20655 can be used. More specifically, the anhydrothrombin solution is concentrated, and this solution is adjusted to a pH in the range of 4 to 10 (the buffer used in the serine protease anhydrolysis reaction may be used as it is. ) Was passed through an affinity chromatography column to which a ligand that interacts with thrombin such as hirudin was equilibrated using a) to adsorb anhydrothrombin selectively, and then washed and other impurities. It is a method of removing.
[0040]
After the above steps, for the purpose of eliminating anhydrothrombin bound to the affinity chromatography column, it has a serine protease inhibitor solution, or at least one group of amidino, guanidyl, phenyl, long chain alkyl, arginine residues. The solution of the compound is adjusted to pH 4 to 10, passed through an affinity column, and the target substance (anhydrothrombin) is eluted. Thereafter, the aforementioned desorbed liquid component is removed by a technique such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, etc., and higher-purity anhydrothrombin can be obtained. The serine protease inhibitor that can be used in the elution step of the anhydrothrombin is not particularly limited, and a known serine protease inhibitor can be used. For example, phenylmethylsulfonyl fluoride (abbreviation: PMSF), amidino Various sulfonyl fluorides such as phenylmethylsulfonyl fluoride (abbreviation: APMSF), 2-phenylethane-1-sulfonyl fluoride, methanesulfonyl fluoride, and p-toluenesulfonyl (tosyl) fluoride, tosyl chloride, diisopropylfluorolin Acid (abbreviation: DFP), 3,4-dichloroisocoumarin (abbreviation: 3,4-DCI), L-1-chloro-3- [4-tosylacid] -7-amino-2-heptanone-hydrochloric acid (abbreviation: TLCK) and L-1-chloro-3- [4 Toshiruashido] -4-phenyl-2-butanone (abbreviation: TPCK), and the like.
[0041]
In the present invention, a water-insoluble carrier is used as the carrier. In the present invention, the “water-insoluble carrier” is a carrier in which the component constituting the carrier is a water-insoluble substance, or a substance that has been made water-insoluble by subjecting the water-soluble substance to a treatment such as a crosslinking reaction. Refers to the carrier. Examples of the water-insoluble carrier include cellulose, crosslinked agarose, crosslinked dextran, chitosan, polyacrylamide and the like. Of these, cellulose and crosslinked agarose are preferred as the water-insoluble carrier. In addition, the shape of the water-insoluble carrier is not particularly limited, and various shapes can be used. Examples thereof include a spherical shape, a hollow fiber shape, and a membrane shape. Among them, spherical particles are preferable. These water-insoluble carriers may be used alone or in combination of two or more.
[0042]
In the present invention, when the water-insoluble carrier is spherical, the shape does not need to be exactly spherical, but preferably has high sphericity. Specifically, the sphericity of the spherical particles is 0.9 or more, more preferably 0.95 or more. In the present specification, “sphericity” is the ratio of the maximum diameter (major axis) to the minimum particle diameter (minor axis) (= minor axis / major axis), and therefore this value approaches 1.0. This means that the sphericity is higher, that is, closer to a sphere. Spherical particles that can be preferably used are spherical celluloses. By using spherical cellulose as a water-insoluble carrier, the thrombin body, which is a ligand, can be easily fixed, and the immobilization product containing the thrombin body as a ligand has high biocompatibility and strength. Therefore, the immobilized product of the present invention is effective as an adsorbent for a desired thrombin substrate and / or inhibitor. In addition, “biocompatibility” shown here means that when a purification operation is performed using an immobilized product, no elution of a substance harmful to the living body occurs from the immobilized product.
[0043]
In the present invention, the hollow fiber-like water-insoluble carrier refers to a fibrous carrier having continuous or discontinuous cavities inside. Such a carrier can be produced by a hot melt spinning method. For example, a fiber having discontinuous cavities can be produced by adding a foaming agent to a thermoplastic resin and performing hot melt spinning using this as a raw material. In addition, fibers having discontinuous cavities can be produced by adding inorganic fine particles to a thermoplastic resin, performing hot melt spinning using this as a raw material, and further performing a stretching treatment by appropriately setting the stretching ratio. Further, a fiber having continuous cavities can be produced by performing hot melt spinning using a general-purpose thermoplastic resin as a raw material using a hollow structure fiber cross-section die. These fibers can be used by cutting into a fiber length as required as a carrier.
[0044]
In the present invention, when the shape of the water-insoluble carrier is a membrane, for example, a membrane having a flat plate shape and a certain range of exclusion limit molecular weight, such as a commercially available membrane filter, can be used.
[0045]
In the present invention, the method for immobilizing the amino group of the chemically modified thrombin body to the water-insoluble carrier is not particularly limited. For example, groups such as epoxy, formyl, activated ester, etc. are attached to the water-insoluble carrier via a spacer. A method of immobilizing a residual amino group (referred to as an amino group that has not been used for immobilizing a water-insoluble carrier) present in the thrombin body that has been introduced and chemically modified may be mentioned. The immobilization conditions at this time vary depending on the thrombin body used, the type of water-insoluble carrier, the amount thereof, the amount of residual amino groups, and the like, and particularly if the residual amino groups can be efficiently immobilized on the water-insoluble carrier. There is no limit. Specifically, after washing the water-insoluble carrier with water or a buffer solution as necessary, a chemically modified thrombin body is added, and a condensing agent is added to the mixture at 4 to 30 ° C., preferably 4 to 25 ° C. And stirring for 1 to 24 hours, preferably 1 to 12 hours. Thereby, the residual amino group of the chemically modified thrombin is bonded and fixed to the functional group of the water-insoluble carrier. As the condensing agent used in the present invention, known condensing agents can be used. For example, sodium cyanotrihydroborate, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (abbreviation: EDC), etc. is there.
[0046]
The immobilized product of the present invention preferably has an initial holding capacity of 0.5 to 3 mg / ml with respect to fibrinogen. Moreover, it is preferable that the retention capacity of the immobilized product after the activity decrease can be recovered to 70% or more of the initial retention capacity by the regeneration treatment.
[0047]
In the present invention, at least a part of the active amino group of the thrombin body is thus protected by chemical modification, and the thrombin body is fixed to the water-insoluble carrier.
[0048]
In the present invention, the immobilized product has a reduced retention capacity due to a decrease in ligand activity due to denaturation. In such a case, the denatured immobilized product is treated with a solution containing chaotropic ions, the thrombin body is denatured, and then the chaotropic ions are removed from the immobilized product, whereby a higher-order structure of the immobilized product with respect to the substrate is obtained. (Holding capacity) can be recovered. The chaotropic ion is a general term for ions having an action of breaking the cage structure of water molecules in an aqueous solution.−, I−, ClO4 −, NO3 −, Br−, Cl−, CH3CO2 −, F−, SO4 2-Etc. Specific examples of the solution containing chaotropic ions include guanidine hydrochloride solution and urea solution. In order to regenerate the immobilized product in which the thrombin body is denatured, a method of treating a solution containing chaotropic ions alone or a method of treating with a mixed solution of this and a buffer solution can be used. As a treatment method, a continuous method using a column or a batch method can be used. At that time, the concentration of the solution containing chaotropic ions is preferably 3 to 6 M guanidine hydrochloride and 6 M or more urea. Thereafter, chaotropic ions are removed from the immobilized product by a washing operation. The washing solution is water, a buffer solution, or the like, and is preferably a buffer solution that can stabilize the regenerated thrombin body. The washing operation can be performed by a continuous method or a batch method using a column.
[0049]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
[0050]
In addition, the composition of the material used by the Example and the comparative example is as follows.
[0051]
Phosphate buffer 1: 50 mM phosphate buffer + 1.0 M NaCl (pH 6.5)
Phosphate buffer 2: 50 mM phosphate buffer + 0.1 M NaCl + 0.3 M arginine (pH 6.5)
Phosphate buffer 3: 50 mM phosphate buffer + 6.0 M guanidine hydrochloride + 1.0 M NaCl (pH 7.5)
Citrate buffer: 50 mM citrate buffer (pH 4)
Neutralization solution: 2M Tris-HCl + 1M NaCl (pH 6.5)
Dialysate: 0.5M NaHCO3+1.0 M NaCl (pH 8)
Washing solution 1: 50 mM NaHCO 33+ 0.5M NaCl (pH 8)
Washing solution 2: 50 mM NaHCO 33+1.0 M NaCl (pH 8)
Washing solution 3: 50 mM NaHCO 33+ 0.1M NaCl (pH 8)
Washing solution 4: 0.2M NaHCO 33+ 0.5M NaCl (pH 8)
Washing solution 5: 0.5M NaHCO 33+ 0.5M NaCl (pH 8)
Washing solution 6: 50 mM NaHCO 33+10 M urea +0.5 M NaCl (pH 8)
Washing solution 7: 50 mM NaHCO 33+ 0.15M NaCl (pH 8)
APMSF: Abbreviation for amidinophenylmethanesulfonyl fluoride.
[0052]
Example 1
1) Protection of amino group
Human blood-derived thrombin (about 28 mg) was added to 10 mM NaHCO 33This was dissolved in a solution (5 ml), placed in a dialysis tube, and dialyzed twice in dialysate (500 ml) for 2 hours. The dialysis sample solution was taken out from the dialysis tube, and 10% by volume of citraconic anhydride dioxane solution (10 μl) was added thereto. The operation of stirring for 5 minutes at room temperature and adding the same reagent (10 μl) was repeated twice. Next, after stirring for 30 minutes, this was put into a dialysis tube and dialyzed 3 times for 2 hours in a phosphate buffer (500 ml) to obtain thrombin having a protected amino group. This thrombin had a fibrinogen coagulation activity reduced to 10% or less compared to the original thrombin.
[0053]
2) Immobilization of thrombin on cellulose gel
Wet formyl cellulofine having a formyl group of about 5 μM / ml (spherical cellulose manufactured by Chisso Co., Ltd., 10 g) was thoroughly washed with phosphate buffer 1 on a glass filter, transferred to a container, and The treatment of 1) was applied, and thrombin in which the amino group was protected was added. Furthermore, sodium cyanotrihydroborate (50 mg) was added thereto, and after stirring for 2 hours at room temperature, the cellulose gel was washed with a phosphate buffer on a glass filter, and further washed with a neutralizing solution. The obtained cellulose gel was transferred to a container, and a neutralizing solution was further added to make the volume 30 ml. In order to block the residual formyl group of the cellulose gel, sodium cyanotrihydroborate (100 mg) was added, stirred for 2 hours at room temperature, transferred onto a glass filter, and the gel was washed with washing solution 1 (500 ml).
[0054]
In this operation, calculation from the amount of non-immobilized protein revealed that about 15 mg of thrombin was immobilized on the cellulose gel.
[0055]
3) Deprotection operation
The thrombin-immobilized cellulose gel obtained by the above operation 2) was washed with ultrapure water, and then added to pH 2.0 hydrochloric acid water (500 ml). After stirring at room temperature for 2 hours, transfer to a glass filter and 10 mM NaHCO 33After washing with (500 ml), a 5M guanidine solution (30 ml) was added to sufficiently infiltrate the entire thrombin-immobilized cellulose gel. Thereafter, the cellulose gel was washed with a washing solution 2 (500 ml).
[0056]
4) Anhydrolation of immobilized thrombin
The thrombin-immobilized cellulose gel obtained in the above operation 3) was washed with the washing solution 3, APMSF (5 mg) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 minutes to induce thrombin modification (APMS). The obtained anhydrothrombin-immobilized cellulose gel was washed with ultrapure water (4 ° C.), then transferred to a container, and the total volume was made up to 200 ml with ultrapure water (4 ° C.). Add 1N NaOH (10 ml), stir at 4 ° C. for 15 minutes, wash on glass filter with washing solution 3, drain excess water, add 5M guanidine solution (30 ml) and immobilize anhydrothrombin. The cellulose gel was fully infiltrated. The anhydrothrombin-immobilized cellulose gel was washed sequentially with the washing liquid 2 and the washing liquid 3. Thereafter, this was transferred to a beaker, and after removing the supernatant, the total volume was made 20 ml with the washing liquid 3. 0.1 mg / ml PPACK (30 μl) was added thereto and stirred to inactivate the remaining thrombin clotting activity. The residual activity was measured using the synthetic substrate S-2238 degradation activity.
[0057]
5) Purification of fibrinogen using an anhydrothrombin column
The column packed with the anhydrothrombin-immobilized cellulose gel obtained in the above operation 4) was equilibrated with a phosphate buffer (4 ° C.), and then dissolved in the same phosphate buffer (5 ml). Wako Pure Chemicals 65% clotable Fraction I fraction (20 mg) was added, and non-adsorbed protein in the column was washed with a phosphate buffer (50 ml). Next, elution was performed with phosphate buffer 2 (4 ° C.), and about 10 mg of fibrinogen having a purity of 95% or more was eluted.
[0058]
Comparative Example 1
1) Immobilization of thrombin on cellulose gel
Instead of thrombin protecting the amino group, thrombin derived from human blood dissolved in washing solution 2 (50 ml) was added, and the initial stirring time was changed from 2 hours to 20 minutes, according to Example 1, Thrombin was fixed on the cellulose gel.
[0059]
In this operation, when calculated from the amount of non-immobilized protein, it was found that about 18 mg of thrombin was immobilized on the cellulose gel.
[0060]
2) Unhydrolysis of immobilized thrombin
Based on Example 1, the residual thrombin activity was inactivated using the cellulose obtained by the operation of 1) above.
[0061]
3) Purification of fibrinogen by an anhydrothrombin column
In accordance with Example 1, fibrinogen was purified using the cellulose gel obtained by the above operation 3). As a result, most of the protein was washed away with the phosphate buffer 2, and only about 1 mg of fibrinogen having a purity of 95% or more was eluted.
[0062]
Comparative Example 2
1) Immobilization of anhydrothrombin
Anhydrothrombin was synthesized from human thrombin (40 mg) in the same manner as described in Patent Document 1. Anhydrothrombin (20 mg) was dissolved in the washing solution 4, spherical cellulose (10 g) was washed with the washing solution 4, added thereto, and stirred for 15 minutes for immobilization. By this immobilization treatment, 80% or more of anhydrothrombin was fixed to cellulose.
[0063]
2) Purification of fibrinogen by an anhydrothrombin column
Fibrinogen was purified according to Example 1 except that the anhydrothrombin-immobilized cellulose gel obtained in the operation 1) was used as a packed column. As a result, most of the protein was washed away with the phosphate buffer 2, and about 2.5 mg of fibrinogen having a purity of 95% or more was eluted.
[0064]
Example 2
The anhydrothrombin-immobilized cellulose gel (immobilized product) obtained in the same manner as in Example 1 was washed with a citrate buffer (4 ° C.) to reduce the ligand activity of the immobilized anhydrothrombin. A thrombin-immobilized cellulose gel was used. Next, this modified anhydrothrombin-immobilized cellulose gel is packed into a column, and the column obtained with 10 times the amount of the washing solution 5 (4 ° C.) is washed, and then 10 times the amount of the filled gel is washed. Regeneration treatment was performed with phosphate buffer 3 (4 ° C.).
[0065]
In accordance with Example 1, fibrinogen was purified using a column subjected to regeneration treatment. As a result, it was found that about 9.5 mg of fibrinogen having a purity of 95% or more equivalent to that of Example 1 was eluted, and the retention capacity for fibrinogen was maintained at 95%.
[0066]
Comparative Example 3
The anhydrothrombin-immobilized cellulose gel obtained in the same manner as in Comparative Example 2 was used to modify and regenerate the anhydrothrombin-immobilized cellulose gel according to Example 2, and the column was used to produce fibrinogen. Was purified. As a result, it was found that about 0.2 mg of fibrinogen having a purity of 95% or more was eluted, and the retention capacity for fibrinogen was maintained at 10%.
Example 3
Human blood-derived thrombin (10 mg) was dissolved in washing solution 5 (5 ml), and diketene (stock solution, 3 μl) was added at 5-minute intervals while stirring with a stirrer. This diketene was added until the fibrinogen coagulation activity was 5% with respect to the original thrombin. The thrombin solution that had been subjected to the diketene treatment was dialyzed against the washing solution 4, NHS activated cellulose fine washed with the washing solution 4 (spherical cellulose manufactured by Chisso Corporation, 10 g) was added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 30 minutes. Subsequently, when residual NHS was blocked with 1M ethanolamine (pH 9), about 6 mg of thrombin could be fixed. This was added to 0.5M hydroxyamine (100 ml) having a pH of 7.5, stirred at 25 ° C. for 8 hours, and subjected to demodification treatment, and then the hydroxyamine was removed with purified water to obtain a thrombin-immobilized cellulose gel. (Gel A) was obtained.
[0067]
Comparative Example 4
Human blood-derived thrombin (10 mg) was dissolved in washing solution 4 (5 ml), NHS activated cellulose fine washed with washing solution 4 (spherical cellulose manufactured by Chisso Corporation, 10 g) was added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 5 minutes. . Subsequently, when residual NHS was blocked with 1M ethanolamine (pH 9), 9 mg or more of thrombin was fixed, and a thrombin-immobilized cellulose gel (gel B) was obtained.
[0068]
Gels A and B thus obtained were each adjusted to 4 ° C. and pH 2 with 1N hydrochloric acid, and each thrombin was completely denatured to reduce the ligand activity. At this point both gels had completely lost the synthetic substrate S-2238 activity. Next, the gel A and the gel B in the denatured state are washed with a washing solution 6 (100 ml) on a glass filter, and then the washing solution 1 is added and subjected to a regeneration treatment. -2238 activity was measured. This confirmed the regeneration effect of the modified thrombin steric structure in gel A and gel B.
[0069]
Synthetic substrate S-2238 degradation activity was obtained by adding washing solution 7 (1 ml) to gel A (10 mg) and gel B (10 mg), respectively, stirring at 25 ° C., and taking 50 μl each of gel A and gel B, To this, synthetic substrate S-2238 (1 mg / ml, 50 μl) and washing solution 7 (200 μl) were added and measured at 37 ° C.
[0070]
Gel A after the regeneration treatment showed about 15 times higher synthetic substrate S-2238 degradation activity than gel B.
[0071]
From this result, the thrombin-immobilized gel fixed to the spherical cellulose after protecting the active amino group of thrombin with diketene is compared with the thrombin-immobilized gel directly fixed without protecting the active amino group. Then, it was found that the regeneration of the three-dimensional structure of thrombin was 10 times or more in the state of being fixed to the gel by the regeneration treatment with the chaotropic reagent.
[0072]
Example 4
1) Protection of amino group
Anhydrothrombin (about 25 mg) was added to 10 mM NaHCO 33This was dissolved in a solution (5 ml), placed in a dialysis tube, and dialyzed twice in dialysate (500 ml) for 2 hours. The dialysis sample solution was taken out from the dialysis tube, and 10% by volume citraconic anhydride / dioxane solution (100 μl) was added thereto. The operation of stirring at room temperature for 5 minutes and adding the same reagent (100 μl) was repeated twice. Next, after stirring this for 30 minutes, it was placed in a dialysis tube and dialyzed 3 times in washing solution 2 (500 ml) for 2 hours, thereby obtaining an anhydrothrombin having a protected amino group.
[0073]
2) Immobilization of thrombin
Wet formyl cellulofine having a formyl group of about 5 μM / ml (spherical cellulose manufactured by Chisso Corporation, 10 g) is thoroughly washed with phosphate buffer 1 on a glass filter, transferred to a container, and Phosphate buffer solution 1 (5 ml) in which 1) anhydrothrombin (25 mg) was dissolved was added. Further, sodium cyanotrihydroborate (1 mg) was added thereto, and after stirring at room temperature for 180 minutes, the cellulose gel was washed with phosphate buffer 1 on a glass filter, and further washed with a neutralizing solution. The obtained cellulose gel was transferred to a container, and a neutralizing solution was further added to make the volume 30 ml. In order to block the residual formyl group of the cellulose gel, sodium cyanotrihydroborate (2 mg) was added, stirred for 1 hour at room temperature, transferred onto a glass filter, and the gel was washed with washing solution 1 (500 ml).
[0074]
In this operation, when calculated from the amount of non-immobilized protein, it was found that about 13 mg of anhydrothrombin was immobilized.
[0075]
When a fibrinogen purification experiment similar to that of Example 1 was performed on the anhydrothrombin-immobilized cellulose gel column produced by this method, about 12 mg of fibrinogen having a purity of 95% or more was eluted.
[0076]
【The invention's effect】
The immobilized product of the present invention has a retention capacity by fixing it to a water-insoluble carrier using the unprotected residual amino group in a state where the amino group of the thrombin body is protected with a protective agent, and then performing deprotection. high. Furthermore, the immobilized product of the present invention has a retention capacity that has been reduced by denaturation of the ligand. The immobilized product is recovered by treating the immobilized product with a solution containing chaotropic ions and removing chaotropic ions from the immobilized product. It is possible.