【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、リノール酸を出発物質として、植物性リポキシゲナーゼの作用により得られる脂肪酸関連物質を有効成分とする抗炎症剤及び一酸化窒素産生抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
炎症は、細菌感染、物理化学的な因子の作用等により、生体組織に障害が生じた場合において、この障害の原因物質及び障害された組織を除去するための生体の防御反応である。
【０００３】
生体の炎症反応に関しては、マクロファージによって産生される一酸化窒素が感染・炎症・免疫のメディエーターとして働いていることが知られている。
【０００４】
この感染・炎症・免疫のメディエーターとしての働きは、一酸化窒素自身というより、その反応体によるところが大きい。一酸化窒素は、哺乳類の細胞内において、Ｌ−アルギニンから一酸化窒素合成酵素（ＮＯ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）の触媒作用によって産生される。ここで、一酸化窒素合成酵素には、構成的に発現している非誘導型（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ＮＯＳ，ｃＮＯＳ）と誘導型（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＮＯＳ，ｉＮＯＳ）がある。ｃＮＯＳには、神経ＮＯＳ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ＮＯＳ，ｎＮＯＳ）と内皮ＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＮＯＳ，ｅＮＯＳ）が含まれる。
【０００５】
感染や炎症反応と深く関わっているのは、このうちのｉＮＯＳであり、グラム陰性菌毒素であるリポ多糖（以下、「ＬＰＳ」ということがある。）や炎症性サイトカインのインターフェロン（以下、「ＩＦＮ」ということがある。）−γなどの刺激によって、その発現が誘導されることが確認されている。
【０００６】
ｉＮＯＳの発現誘導によってマクロファージや好中球から過剰に生成された一酸化窒素は、活性酸素の一種であるｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｏ２ −）と反応してｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（ＯＮＯＯ−）やＯＨラジカルなどを生じる。
【０００７】
これらの反応性窒素酸化物は、細菌・寄生虫などの外敵や進入物質の標的分子をニトロ化、ニトロソ化、酸化反応によって攻撃するという生体防御反応に関わっているが、過度のｉＮＯＳ発現による、高濃度の一酸化窒素やＯＮＯＯ−の産生は、逆に生体に対して有害な作用を示す。
【０００８】
一酸化窒素の標的分子は、グルタチオン、タンパク質のＳＨ残基、金属分子などであるため、Ｃｙｓ残基を活性中心にもつＳＨ酵素や、金属又はヘムを有する酵素は、一酸化窒素の過剰な発現によってその活性に大きな影響を受ける。
【０００９】
これら酵素には、アポトーシスの実行に関わるプロテアーゼであるｃａｓｐａｓｅ−３も含まれており、一酸化窒素のアポトーシス抑制作用を解明する１つの指標とされている。
また、一酸化窒素は、ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ（ＮＦκＢ）やａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＡＰ−１）といった炎症関連遺伝子の発現の制御に深く関与するとされている転写因子の活性にも変化を与えることが報告されており、これが炎症や免疫反応のメディエーターといわれる所以ともなっている。
【００１０】
一方、ＯＮＯＯ−は、高い反応性と強い酸化力を持ち、Ｔｙｒ残基のニトロ化反応によるタンパクの不活性化や脂質過酸化反応の促進、ミトコンドリアのクエン酸回路に存在するアコニターゼ（活性中心に鉄（Ｆｅ）を持つ）の失活に伴うエネルギー代謝の低下など、生体に対して様々な病理作用を示すことが明らかにされている。
【００１１】
また、核酸のグアニン残基をニトロ化し、ＤＮＡに対して損傷を与えることから、強い変異原性を持つことが示唆されている。
【００１２】
一酸化窒素の過剰産生による組織や細胞の傷害又は更なる疾患の発現若しくは促進を防ぐため、一酸化窒素が有効な濃度で生体内に存在するように一酸化窒素の産生を抑制する必要があり、一酸化窒素の産生に関与するＮＯＳの作用を阻害するＮＯＳ阻害剤や一酸化窒素産生抑制剤の開発が進められている。
【００１３】
以上述べた、炎症反応との関連性や、一酸化窒素が血管新生を促すｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）の発現を高めるという報告より、一酸化窒素が発がんにおける危険因子であるとの見方も強い。
【００１４】
そこで、一酸化窒素の産生量、ひいてはＮＯＳの発現量を抑えることにより炎症やがんを抑制するとの目的から、Ｎ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）、Ｌ−ニトロ−Ｎ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）に代表される非選択的ＮＯＳ阻害剤の抗炎症・抗腫瘍活性の評価が行われている。
【００１５】
また、ｉＮＯＳ選択的阻害剤であるアミノグアニジン（ＡＧ）には、マウス気道における炎症を抑制する作用があることが報告されている。
【００１６】
【特許文献１】特表２００２−５１３３８６号公報
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本願の発明者は、前述した炎症反応と一酸化窒素との関連性、発がんにおける一酸化窒素を危険因子と考える見方などを踏まえて、生体の炎症反応の抑制、一酸化窒素産生の抑制に効果のある新規物質を提供することを目的として本願発明を行った。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的で研究、検討を進める過程で本願の発明者は、本願出願人が過去に出願した抗腫瘍剤（特開平７−２９１８６２号公報、特開平５−２７９２５２号公報、特開平６−２２００３７号公報）についても研究を加えた。
【００１９】
これらの特許公開公報に記載されている抗腫瘍剤は、リノール酸を出発物質として、植物性リポキシゲナーゼの作用により得られる脂肪酸関連物質からなるものであるが、がん細胞増殖抑制作用などが報告されているにすぎず、その他の生理機能はほとんど知られていなかった。
【００２０】
また、上述の脂肪酸関連物質は、作用する標的が明確でないため、抗炎症作用を示すかどうか、さらに、抗炎症作用の一部としての一酸化窒素産生抑制作用や炎症関連遺伝子発現抑制作用を示すかどうかについても明らかではなかった。
【００２１】
本願発明者等は、生体の炎症反応の抑制、一酸化窒素産生の抑制に効果のある新規物質を提供することを目的として前記の脂肪酸関連物質も含めて研究を進める中で、ハイドロキシリノール酸、ケトール型不飽和脂肪酸又はケトール型不飽和脂肪酸のマクロライドを有効成分とする物質が優れた抗炎症効果、優れた一酸化窒素産生抑制効果、炎症関連遺伝子発現抑制効果を示し、なおかつ、生体に対し安全性が高く、副作用が少ないものであることを見出して本願発明を完成させたものである。
【００２２】
即ち、本願発明の第一の抗炎症剤及び、本願発明の第一の一酸化窒素産生抑制剤は、それぞれ、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼを作用させて得られるハイドロキシリノール酸を有効成分とするものである。
【００２３】
本願発明の第二の抗炎症剤及び、本願発明の第二の一酸化窒素産生抑制剤は、それぞれ、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼ及びハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼを作用させて得られるケトール型不飽和脂肪酸を有効成分とするものである。
【００２４】
本願発明の第三の抗炎症剤及び、本願発明の第三の一酸化窒素産生抑制剤は、それぞれ、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼ及びハイドロパーオキサイドデヒドラーゼを作用させて得られるケトール型不飽和脂肪酸のマクロライドを有効成分とするものである。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本願発明の実施形態について説明する。
【００２６】
本願発明の第一の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼを作用させて得られるハイドロキシリノール酸を有効成分とするものである。
【００２７】
リノール酸は、９位と１２位にシス二重結合をもつ炭素数１８の直鎖不飽和脂肪酸である。本願発明では、植物由来のリノール酸であっても、動物由来のリノール酸であっても、出発原料として用いることができる。
【００２８】
本願発明に用いることができる植物性リポキシゲナーゼとしては、植物、特に種実中に含まれているのものであれば特に限定されず、いずれでもよいが、例えば、稲由来リポキシゲナーゼ、じゃがいも由来のリポキシゲナーゼ、トマト由来のリポキシゲナーゼ、コーン由来のリポキシゲナーゼ、大豆由来のリポキシゲナーゼ、麦由来のリポキシゲナーゼ等を挙げることができる。
【００２９】
なお、前記植物性リポキシゲナーゼは、単離、精製したものであってもよく、種実を粉砕した中に含まれているものであってもよく、市販のものであってもよい。
【００３０】
本願発明の第一の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤の有効成分であるハイドロキシリノール酸は、水酸基を１個、不飽和結合を２個有し、炭素数が１８である直鎖状の脂肪酸である。
【００３１】
ハイドロキシリノール酸を生成するためには、植物性リポキシゲナーゼを用いて、リノール酸の炭素鎖に水酸基を１個付加すればよい。
【００３２】
ハイドロキシリノール酸を生成する反応経路の例としては、以下のものを挙げることができる。
【００３３】
例えば、稲のリポキシゲナーゼは、リノール酸の９位の炭素に酸素１分子を付加し、主生成物としてハイドロパーオキシリノール酸を生じる。その後、還元されてハイドロキシリノール酸が生成する。生成したハイドロキシリノール酸は、９−ハイドロキシ−１０（Ｅ）−１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸である。
【００３４】
例えば、大豆のリポキシゲナーゼは、リノール酸の１３位の炭素に酸素１分子を付加し、主生成物としてハイドロパーオキシリノール酸を生じる。その後、還元されてハイドロキシリノール酸を生成する。生成したハイドロキシリノール酸は１３−ハイドロキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸である。
【００３５】
上述の反応系は、酵素反応であり、基質特異性があるため、未反応物を除くだけで反応後の分離精製が容易であり、かつ大量生産し得るものである。また酵素利用にあたっては、廃棄物として出る米糠、トマトの皮などを水抽出することにより利用できるので、ハイドロキシリノール酸を簡単に製造できることになり、安価かつ安定して大量生産できることにより、工業的に有利である。
【００３６】
さらに、上述の反応は、化学合成ではなく、植物の種実の中に広く存在している酵素反応系を応用しているため、人の生体に与える影響も低く、いわゆる副作用を少なくすることができる。
【００３７】
なお、本願発明の第一の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤の有効成分であるハイドロキシリノール酸は、具体的には、例えば、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼを反応させ、この反応液をｐＨ調整し、沈澱物を濾過した後、有機溶媒を加えてその抽出液を減圧濃縮後、順層シリカゲルカラムにかけ、溶出液は適当量づつ分取し、各画分毎に薄層クロマトでハイドロキシリノール酸の画分を集めて沈澱させ、該沈澱物を減圧下で乾燥することによって得ることができる。
【００３８】
本願発明の第二の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼ及びハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼを作用させて得られるケトール型不飽和脂肪酸を有効成分とするものである。
【００３９】
本願発明に用いることができるハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼとしては、植物性リポキシゲナーゼと同様に、植物、特に種実中に含まれているのものであれば特に限定されず、いずれでもよいが、例えば、コーン由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、麦由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、ジャガイモ由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、亜麻仁由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、スイカ由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、ヒマワリ由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、アルファルファ由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ、茶由来ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼ等を例示することができる。
【００４０】
なお、前記ハイドロキシパーオキサイドイソメラーゼは、植物性リポキシゲナーゼと同様に、単離、精製したものであってもよく、種実を粉砕した中に含まれているものであってもよく、市販のものであってもよい。
【００４１】
本願発明の第二の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤の有効成分であるケトール型不飽和脂肪酸は、ケトン基とハイドロキシ基をそれぞれ一個以上有し、かつ不飽和結合を一個以上有し、炭素数が６〜３６である直鎖状の脂肪酸を意味する。通常はケトン基、及びハイドロキシ基を各一個、かつ不飽和結合を一個〜三個有し、炭素数が１２〜２４である直鎖状脂肪酸が適当である。
【００４２】
ケトール型不飽和脂肪酸は、植物性リポキシゲナーゼ及びハイドロパーオキサイドイソメラーゼを用いて、不飽和脂肪酸の炭素鎖にケトン基及びハイドロキシ基を付加させることにより得ることができる。
【００４３】
ケトール型不飽和脂肪酸を生成する反応経路の例としては、以下のものが挙げられる。
【００４４】
リノール酸は、植物性リポキシゲナーゼの存在下で、カルボキシル炭素から数えた９位の炭素又は１３位の炭素の位置に酸素１分子（Ｏ２）が付加され、ハイドロパーオキシリノール酸を生じる。
【００４５】
ここで、コーン由来のリポキシゲナーゼ又は麦由来のリポキシゲナーゼを用いた場合には、９−ハイドロパーオキシリノール酸が主生成物として得られ、大豆由来のリポキシゲナーゼを用いた場合には、１３−ハイドロパーオキシリノール酸が主生成物として得られる。
【００４６】
これらのハイドロパーオキシリノール酸は、植物に含まれるハイドロパーオキサイドイソメラーゼによって酸素原子が転移され、ケトール型不飽和脂肪酸を生じる。
【００４７】
すなわち、９−ハイドロパーオキシリノール酸からは、１３−ハイドロキシ−１０−オキソ−トランス−１１−オクタデセン酸と９−ハイドロキシ−１３−オキソ−トランス−１０−オクタデセン酸が、１３−ハイドロパーオキシリノール酸からは、９−ハイドロキシ−１０−オキソ−シス−１２−オクタデセン酸と１３−ハイドロキシ−１２−オキソ−シス−９−オクタデセン酸が生成する。つまり、この反応系では、一つの不飽和脂肪酸から４種のケトール型不飽和脂肪酸を得ることができる。
【００４８】
本願発明の第三の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、リノール酸に、植物性リポキシゲナーゼ及びハイドロパーオキサイドデヒドラーゼを作用させて得られるケトール型不飽和脂肪酸のマクロライドを有効成分とするものである。
【００４９】
本願発明に用いることができるハイドロパーオキサイドデヒドラーゼは、植物性リポキシゲナーゼと同様に、植物、特に種実中に含まれているのものであれば特に限定されず、いずれでもよいが、例えば、コーン由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、麦由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、ジャガイモ由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、亜麻仁由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、スイカ由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、ヒマワリ由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、アルファルファ由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ、茶由来ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼ等を例示することができる。
【００５０】
なお、前記ハイドロパーオキサイドデヒドラーゼは、植物性リポキシゲナーゼと同様に、単離、精製したものであってもよく、種実を粉砕した中に含まれているものであってもよく、市販のものであってもよい。
【００５１】
本願発明の第三の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤の有効成分であるケトール型不飽和脂肪酸のマクロライドは、例えば、リノール酸を、水中において、植物性リポキシゲナーゼ及びハイドロパーオキサイドデヒドラーゼの存在下で反応させて得られるケトール型不飽和脂肪酸を、有機溶媒中でリパーゼで反応させることにより得ることができる。
【００５２】
ここにいう「有機溶媒」としては、イソオクタン、シクロヘキサン、ヘキサン、テトラクロロメタン、トリクロロエタン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、ジオキサン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン等を例示することができる。
【００５３】
「リパーゼ」は、シュードモナス属、リゾープス属又はカンディダ属の微生物由来のもの、あるいは豚の膵臓由来のものなどを用いることができる。
【００５４】
具体的には、リノール酸を用いた場合に得られるケトール型不飽和脂肪酸としては、１０−オキソ−１３−ハイドロキシ−１１（Ｅ）−オクタデセン酸、１０−オキソ−９−ハイドロキシ−１２（Ｚ）−オクタデセン酸、１２−オキソ−９−ハイドロキシ−１０（Ｅ）−オクタデセン酸、１２−オキソ−１３−ハイドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸などを挙げることができ、それぞれを有機溶媒中でリパーゼで反応せしめて得られるマクロライド化合物は、１０−オキソ−１１（Ｅ）−オクタデセン−１３−オリド、１０−オキソ−１２（Ｚ）−オクタデセン−１０−オリド、１２−オキソ−１０（Ｅ）−オクタデセン−１０−オリド、１２−オキソ−９（Ｚ）−オクタデセン−１３−オリドなどとなる。
【００５５】
本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、試験管内及び動物実験において抗炎症作用、特に一酸化窒素産生抑制作用を示し、医薬品として期待される。
【００５６】
本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、人間及び動物に経口的、または非経口的に投与される。投与方法としては、ドリンク剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤などによる経口投与、座薬、浣腸などによる経腸投与、例えば、皮下、筋肉、静脈注射、点滴などの注射投与、軟膏剤による経皮投与を挙げることができる。なお、経口投与には舌下投与を包含する。本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、塗布してもよい。
【００５７】
本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、製薬上許容し得る吸収促進剤と混合して経口投与すると良い効果をあらわす場合もあり、吸収促進剤としては、例えばコール酸ナトリウム等を使用することができる。
【００５８】
本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤の投与量は、対象となる症状、投与方法などにより異なり、体表面積（ｍ２）あたり、経口投与の場合は、１〜４０００ｍｇ／ｍ２／日、好ましくは１０〜３０００ｍｇ／ｍ２／日の範囲であり、注射投与の場合は、０．１〜４００ｍｇ／ｍ２／日、好ましくは１〜２００ｍｇ／ｍ２／日の範囲であるが、毒性がきわめて低いことから大量に投与することも可能である。１日２〜４回に分けて投与してもよい。また、症状の程度によっては上記の範囲に限られることなくさらに異なった範囲の投与量で投与することもできる。
【００５９】
本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、それ自体又は適宜製剤上で一般的に使用される固体、液体、半固体の賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、溶剤、油剤、分散剤、保存料、表面活性剤、湿潤化剤、増量剤等を混合してもよく、さらに適当なコーティングを施してもよい。
【００６０】
本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、そのまま用いるだけでなく、濃縮したり、乾燥したり、必要成分を精製したりして用いることができ、本願発明の効果を妨げない範囲で各種物質を混合することもできる。
【００６１】
【実施例】
（１）被験物質の作製
（実施例１） ９−ハイドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＯＨ）
米糠２ｋｇを水８リットルに混合し、リノール酸１０ｇを加え、３０℃で３時間撹拌して、濾布濾過後、この反応液を濃塩酸にてｐＨ３に調整した。ｐＨ３に調整後、生成した沈殿物を濾過し、１０００ｍｌの有機溶媒（ヘキサン：酢酸エチルの割合が１：１）で抽出した。
【００６２】
得られた有機溶媒層を減圧濃縮した後、順層シリカゲルカラム（ワコーゲルＣ３００、和光純薬株式会社製）にかけた。順層シリカゲルクロマトはヘキサン：酢酸エチルの割合が７：３の単一溶媒で溶出した。
【００６３】
溶出液は適当量づつ分取し、各画分毎に薄層クロマトグラフィーでハイドロキシリノール酸のスポットのある画分を集め、ヘキサン：酢酸エチルの割合が１０：１の有機溶媒下で、低温（−２０℃）にして、白色の結晶として沈殿してきたものを集め、減圧下で乾燥し、本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤となる、９−ＯＨを１．０ｇ得た。
【００６４】
（実施例２） １３−ハイドロキシ−１０−オキソ−トランス−１１−オクタデセン酸（１３−ＯＨ）
コーン粉砕乾燥物７．４１ｋｇを水２０リットルに混合し、濾布濾過後、濾液に、リノール酸２．５ｇを加え、２０℃〜３０℃で１時間撹拌した。
【００６５】
この反応液をけいそう土で濾過した後、容量１５０ｍｌの合成吸着剤アンバーライトＸＡＤ−８カラム（オルガノ株式会社製）に通液し、吸着物を９５％エタノールで溶出した。
【００６６】
この溶出液は、減圧下でエタノールを除去したのち、適量の水で懸濁し、３００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。
【００６７】
得られた酢酸エチル層を減圧濃縮後、順相シリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬株式会社製）にかけた。順相シリカゲルカラムは、ヘキサン：酢酸エチルの割合が１０：３〜５：３の混合溶媒で溶出した。
【００６８】
得られた溶出液を適当量ずつ分取し、各画分毎に薄層クロマトグラフィーでケトール型物質のスポットのある画分を集め、その後、ヘキサン：酢酸エチルの割合が７：３の有機溶媒下で、低温（−２０℃）にして、白色の結晶として沈澱したものを集め減圧下で乾燥し、本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤となる、１３−ＯＨを１．０ｇ得た。
【００６９】
（実施例３） １０−オキソ−１１（Ｅ）−オクタデセン−１３−オリド（Ｃ１８−ｏｌｉｄｅ）
１０−オキソ−１３−ハイドロキシ−１１（Ｅ）−オクタデセン酸２００ｍｇとリパーゼＰアマノ（天野製薬株式会社製）１０ｇを１リットルのイソオクタンに混合し、４０℃で７２時間攪拌した。
【００７０】
この反応液をろ過後、イソオクタン可溶物を減圧濃縮し、順相シリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−３００、和光純薬株式会社製）にかけた。順相シリカゲルカラムはヘキサン：酢酸エチルの割合が１００：１〜１００：１０の混合溶媒で溶出した。
【００７１】
この順相カラムクロマトグラフィーを２〜３回繰り返して行い、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅのある画分を集め、減圧濃縮し、本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤となる、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅの結晶を２２ｍｇ得た。
【００７２】
（２）抑制効果立証試験
実施例１により得られた９−ＯＨ、実施例２により得られた１３−ＯＨ、実施例３により得られたＣ１８−ｏｌｉｄｅについて、グラム陰性菌毒素とされているリポ多糖（ＬＰＳ）と、炎症性サイトカインであるインターフェロン（ＩＦＮ）−γで刺激したＲＡＷマウスマクロファージを炎症モデルとして用い、いくつかの炎症メディエーターに対して抑制効果を示すかについて試験を行った。
【００７３】
（試験例１）一酸化窒素産生抑制試験
実施例１により得られた９−ＯＨ、実施例２により得られた１３−ＯＨ、実施例３により得られたＣ１８−ｏｌｉｄｅが、一酸化窒素産生抑制効果を示すかどうかを調べた。
【００７４】
ａ）被験物質のサンプル
被験物質（９−ＯＨ、１３−ＯＨ、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅ）のそれぞれをジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という。）で希釈し、１６０μＭ、８００μＭ、４ｍＭ、２０ｍＭの溶液を作製し、被験物質のサンプルとした。
【００７５】
試験に際しては、ＤＭＳＯが０．５％（ｖ／ｖ）となるように添加し、最終濃度を０．８μＭ、４μＭ、２０μＭ、１００μＭとした。
【００７６】
なお、９−ＯＨ、１３−ＯＨについては、４μＭ、２０μＭ、１００μＭの３つの濃度を選択し、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅについては、１００μＭでやや強い細胞毒性が見られたため、２０μＭを最大添加濃度とした、０．８μＭ、４μＭ、２０μＭの３つの濃度を選択した。
【００７７】
対照として、各被験物質の出発物質であるリノール酸（ＬＡ）を１００μＭの濃度についても試験を行った。
【００７８】
ｂ）培養
２４ウェルプレートにマウス・マクロファージ系細胞株ＲＡＷ２６４．７（以下、「ＲＡＷ２６４．７細胞」という。）を、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製して、１ｍＬ播き、３７℃、５％の二酸化炭素ガス雰囲気で、前培養を１３時間行った。
【００７９】
前培養後、ウェルから培地を抜き取り、１ｍＬのＰＢＳ（ＫＣｌ ０．２ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４／７Ｈ２Ｏ ２．１６ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ）で２回洗い、５００μＬのダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ培地」という。）（無血清、ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ ｆｒｅｅ）を加え、被験物質のサンプル５μＬ（コントロールにはＤＭＳＯ５μＬ）を加え、次に、１００ｎｇ／ｍＬのＬ−アルギニン、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γを１０μＬずつ加え、最後にＤＭＥＭ培地を５００μＬ加えた。
【００８０】
なお、ＬＰＳとＩＦＮ−γの刺激剤を加えず、ＤＭＳＯ（最終濃度０．５％（ｖ／ｖ））のみを添加したものをブランクとした。
【００８１】
その後、３７℃で、１２時間又は２４時間の本培養を行った。
【００８２】
ｃ）細胞の一酸化窒素産生抑制率の測定
一酸化窒素は、イ）２ＮＯ＋Ｏ２→２ＮＯ２ ロ）ＮＯ２＋ＮＯ→Ｎ２Ｏ３ ハ）Ｎ２Ｏ３＋Ｈ２Ｏ→２Ｈ＋＋２ＮＯ２ −と順次反応するため、培地中に変生されたＮＯ２ −をＧｒｉｅｓｓ法で測定し、細胞の一酸化窒素産生抑制率を求めた。
【００８３】
本培養後における上清液５００μＬにＧｒｉｅｓｓ試薬（１％ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ ｉｎ ５％リン酸：０．１％Ｎ−１−Ｎａｐｈｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ＝１：１）５００μＬを加え、よく撹枠して、ジアゾカップリング反応によって生じる波長５４３ｎｍにおける吸光度を測定した。
ＮＯ２ −の量は、ＮａＮＯ２を用いて作製した検量線（０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ）に乗せて定量した。
【００８４】
ＮＯ２ −産生抑制活性は次式により求めた。
【００８５】
ＮＯ２ −産生抑制活性（％）＝１００−（ＥＳ−ＥＤ）／（ＥＬ−ＥＤ）×１００
ＥＤ：ＤＭＳＯ添加群吸光度、ＥＬ：ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ添加群吸光度、ＥＳ：＋サンプル添加群吸光度）
その結果、ブランクでは、ＮＯ２ −の産生がほとんど見られなかったのに対し、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激を加えると、その産生量が時間と共に増大し、２４時間培養では実に１０倍以上の差が見られた。
【００８６】
９−ＯＨ、１３−ＯＨ、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅ、リノール酸についての一酸化窒素産生抑制率の結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
表１より、誘導されたＮＯ２ −に対し、９−ＯＨ、１３−ＯＨ、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅは、すべて濃度依存的なＮＯ２ −産生抑制効果を示していることがわかった。中でもＣ１８−ｏｌｉｄｅは、１００μＭですべての時間において１００％もの抑制率を、４μＭでも７０％以上の抑制率を示しており、その活性の高さがうかがえた。９−ＯＨと１３−ＯＨも、２０μＭ、２４時間培養時において、それぞれ８０％、６３％の抑制率を示しており、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅほどでないまでも、ＮＯ２ −産生抑制効果を有することが示された。
【００８９】
また、９−ＯＨ、１３−ＯＨ、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅは、すべてその出発物質であるリノール酸に比べて高い抑制率を示した。
【００９０】
この実験結果より、本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤における優れた一酸化窒素産生抑制効果が明らかとなった。
【００９１】
（試験例２）炎症関連遺伝子の発現に対する抑制作用
炎症反応は、ｉＮＯＳやＣＯＸ−２の過剰発現によって産生されるＮＯやＰＧＥ２が、生体内に様々な損傷を与えた結果引き起こされると考えられている。また、これらの炎症関連遺伝子の発現を、オートクラインループを形成することにより誘導する作用のあるＴＮＦ−αやインターロイキン（ＩＬ）−１βに代表される炎症性サイトカインの発現も、炎症に大きく関わっていることが知られている。
【００９２】
そこで、一酸化窒素産生抑制効果を示した、本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤である、９−ＯＨ、１３−ＯＨ、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅのそれぞれについて、炎症関連遺伝子の発現に対し抑制効果を示すかどうかを調べた。
【００９３】
本試験例においては、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅは、０．８μＭと４μＭを、１３−ＯＨは、４μＭと２０μＭを、９−ＯＨは、２０μＭと１００μＭをそれぞれサンプルとして使用した。なお、これらの被験物質のサンプルは、試験例１と同様の方法により作製した。
【００９４】
６ウェルプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製して、５ｍＬ播き、３７℃、５％の二酸化炭素ガス雰囲気で、前培養を１３時間行い、前培養後、ウェルから培地を抜き取り、２〜３ｍＬのＰＢＳ（ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４／７Ｈ２Ｏ ２．１６ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ）で２回洗い、２．５ｍＬのＤＭＥＭ培地（無血清、ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ ｆｒｅｅ）を加え、被験物質のサンプル２５μＬ（コントロールにはＤＭＳＯ２５μＬ）を加え、次に、１００ｎｇ／ｍＬのＬ−アルギニン、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γを５０μＬずつ加え、最後にＤＭＥＭ培地を２．５ｍＬ加え、３７℃で６時間培養した。遺伝子の発現は、細胞が刺激に応答してからかなり早い段階で起こるため、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γ及び各サンプルでＲＡＷ２６４．７細胞を処理した後、６時間でｍＲＮＡを抽出し、その後、逆転写反応によって相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））を合成し、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）で、ＲＴ−ＰＣＲ法により、内部標準であるＧＡＰＤＨと、ＣＯＸ−１、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−６という６つの炎症関連遺伝子についてその発現レベルを解析した。
【００９５】
その結果、ＧＡＰＤＨ、ＣＯＸ−１、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βの４つの遺伝子に関しては、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激を加えてもその発現はブランクとほとんど変わらず、さらにサンプル処理を行った群でもやはり発現レベルに変化は見られなかった。
【００９６】
一方、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−６の３つの遺伝子は、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γの刺激を受けると発現量がブランクに対してそれぞれ９倍、４倍、８倍と大きく誘導され、さらにその発現誘導レベルは、各サンプル添加に伴い、濃度依存的に抑制されていることがわかった。ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−６の３つの炎症関連遺伝子の発現抑制結果を表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
表２より、Ｃ１８−ｏｌｉｄｅは、４μＭでｉＮＯＳを約５０％、ＩＬ−６を約８０％抑制しており、ＣＯＸ−２に関しては、０．８μＭで６０％の発現抑制作用が見られ、１３−ＯＨは、２０μＭで３つの遺伝子すべてに対し９０％近い抑制率を示し、９−ＯＨは、２０μＭではそれほど発現抑制効果は見られなかったが、１００μＭで７０〜１００％という高い抑制活性を示した。
【００９９】
これより、本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤における、非常に良好な炎症関連遺伝子の発現抑制作用も明らかとなった。
【０１００】
【発明の効果】
本願発明の本願発明の抗炎症剤、一酸化窒素産生抑制剤は、優れた抗炎症効果、特に、優れた一酸化窒素産生抑制効果を有し、炎症関連遺伝子の発現抑制作用も非常に良好であって、副作用が少なく、安全性が高いという利点がある。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an anti-inflammatory agent and a nitric oxide production inhibitor containing linoleic acid as a starting material and a fatty acid-related substance obtained by the action of plant lipoxygenase as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Inflammation is a defense reaction of a living body for removing the causative substance of the disorder and the damaged tissue when a disorder occurs in the living tissue due to bacterial infection, the action of physicochemical factors, or the like.
[0003]
It is known that nitric oxide produced by macrophages acts as a mediator of infection, inflammation, and immunity with respect to the inflammatory response of living bodies.
[0004]
This mediation of infection, inflammation and immunity is largely due to the reactants rather than nitric oxide itself. Nitric oxide is produced in mammalian cells from L-arginine by the catalytic action of nitric oxide synthase (NO synthase, NOS). Here, nitric oxide synthase includes a constitutively expressed non-inducible type (constant NOS, cNOS) and an inducible type (inductive NOS, iNOS). cNOS includes neural NOS (neural NOS, nNOS) and endothelial NOS (endothelial NOS, eNOS).
[0005]
Of these, iNOS is closely related to infection and inflammatory reaction, and is a Gram-negative bacterial toxin lipopolysaccharide (hereinafter sometimes referred to as “LPS”) and inflammatory cytokine interferon (hereinafter referred to as “IFN”). It is confirmed that the expression is induced by stimuli such as -γ.
[0006]
Nitric oxide produced excessively from macrophages and neutrophils by inducing iNOS expression is superoxide (O2 −) And peroxynitrite (ONOO)−) And OH radicals.
[0007]
These reactive nitrogen oxides are involved in biological defense reactions that attack target enemies such as bacteria and parasites and invading substances by nitration, nitrosation, and oxidation reactions, but due to excessive iNOS expression, High concentrations of nitric oxide and ONOO−On the other hand, the production of has a harmful effect on the living body.
[0008]
Since nitric oxide target molecules are glutathione, protein SH residues, metal molecules, etc., an SH enzyme having a Cys residue as an active center, or an enzyme having a metal or heme, causes excessive expression of nitric oxide. Is greatly influenced by its activity.
[0009]
These enzymes include caspase-3, which is a protease involved in the execution of apoptosis, and is considered as one index for elucidating the apoptosis-inhibiting action of nitric oxide.
Nitric oxide may also change the activity of transcription factors that are thought to be deeply involved in the regulation of inflammation-related genes such as nuclear factor kappa B (NFκB) and activator protein-1 (AP-1). It has been reported, and this is why it is called a mediator of inflammation and immune response.
[0010]
On the other hand, ONOO−Has high reactivity and strong oxidizing power, inactivation of proteins and promotion of lipid peroxidation by nitration reaction of Tyr residue, aconitase present in mitochondrial citrate cycle (iron (Fe) as active center) It has been clarified that it exhibits various pathological effects on the living body, such as a decrease in energy metabolism accompanying the inactivation of
[0011]
In addition, it is suggested that it has strong mutagenicity because it nitrates guanine residues of nucleic acids and damages DNA.
[0012]
In order to prevent tissue or cell damage or further disease development or promotion due to excessive nitric oxide production, it is necessary to suppress nitric oxide production so that nitric oxide is present in the body at an effective concentration. The development of NOS inhibitors and nitric oxide production inhibitors that inhibit the action of NOS involved in the production of nitric oxide has been promoted.
[0013]
From the above-mentioned reports that the relationship with the inflammatory reaction and the expression of basic endothelial growth factor (VEGF) that promotes angiogenesis is enhanced by nitric oxide, there is a strong view that nitric oxide is a risk factor for carcinogenesis. .
[0014]
Therefore, N-monomethyl-L-arginine (L-NMMA), L-nitro-N-arginine methyl is used for the purpose of suppressing inflammation and cancer by suppressing the production amount of nitric oxide and thus the expression level of NOS. Evaluation of anti-inflammatory and anti-tumor activities of non-selective NOS inhibitors represented by esters (L-NAME) has been carried out.
[0015]
In addition, aminoguanidine (AG), which is an iNOS selective inhibitor, has been reported to have an action of suppressing inflammation in the mouse respiratory tract.
[0016]
[Patent Document 1] Japanese Patent Publication No. 2002-513386
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
The inventor of the present application is effective in suppressing the inflammatory reaction in the living body and the production of nitric oxide based on the relationship between the inflammatory reaction and nitric oxide described above, and the viewpoint of considering nitric oxide in carcinogenesis as a risk factor. The present invention has been made for the purpose of providing a novel substance.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
In the course of advancing research and examination for the above purpose, the inventor of the present application has applied an antitumor agent (JP-A-7-291862, JP-A-5-279252, JP-A-6-220037) previously filed by the applicant of the present application. No. Gazette) was also studied.
[0019]
The antitumor agents described in these patent publications are composed of fatty acid-related substances obtained by the action of plant lipoxygenase starting from linoleic acid, but have been reported to inhibit cancer cell growth. Only other physiological functions were known.
[0020]
In addition, since the above-mentioned fatty acid-related substances have no clear target to act on, they exhibit anti-inflammatory action, and further show nitric oxide production inhibitory action and inflammation-related gene expression inhibitory action as part of the anti-inflammatory action. Whether it was not clear.
[0021]
The inventors of the present application proceeded with the research including the fatty acid-related substances described above for the purpose of providing a novel substance effective in suppressing the inflammatory reaction in the living body and inhibiting nitric oxide production. Substances containing ketol-type unsaturated fatty acids or ketol-type unsaturated fatty acid macrolides as active ingredients have excellent anti-inflammatory effects, excellent nitric oxide production-suppressing effects, and inflammation-related gene expression-suppressing effects. The present invention has been completed by finding that it has high safety and few side effects.
[0022]
That is, the first anti-inflammatory agent of the present invention and the first nitric oxide production inhibitor of the present invention each have hydroxylinoleic acid obtained by allowing plant lipoxygenase to act on linoleic acid as an active ingredient. Is.
[0023]
The second anti-inflammatory agent of the present invention and the second nitric oxide production inhibitor of the present invention are ketol-type unsaturated fatty acids obtained by reacting linoleic acid with plant lipoxygenase and hydroxyperoxide isomerase, respectively. Is an active ingredient.
[0024]
The third anti-inflammatory agent of the present invention and the third nitric oxide production inhibitor of the present invention are ketol-type unsaturated compounds obtained by allowing plant lipoxygenase and hydroperoxide dehydrase to act on linoleic acid, respectively. Fatty acid macrolides are used as active ingredients.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
[0026]
The first anti-inflammatory agent and nitric oxide production inhibitor of the present invention comprises hydroxylinoleic acid obtained by allowing plant lipoxygenase to act on linoleic acid as an active ingredient.
[0027]
Linoleic acid is a straight-chain unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having cis double bonds at the 9th and 12th positions. In the present invention, either plant-derived linoleic acid or animal-derived linoleic acid can be used as a starting material.
[0028]
The plant lipoxygenase that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is contained in plants, particularly seeds and seeds. For example, rice-derived lipoxygenase, potato-derived lipoxygenase, tomato Examples include lipoxygenase derived from corn, lipoxygenase derived from corn, lipoxygenase derived from soybean, lipoxygenase derived from wheat, and the like.
[0029]
The plant lipoxygenase may be isolated and purified, may be contained in crushed seeds, or may be commercially available.
[0030]
Hydroxylinoleic acid, which is an active ingredient of the first anti-inflammatory agent and nitric oxide production inhibitor of the present invention, is a linear chain having one hydroxyl group, two unsaturated bonds, and 18 carbon atoms. It is a fatty acid.
[0031]
In order to produce hydroxylinoleic acid, one hydroxyl group may be added to the carbon chain of linoleic acid using plant lipoxygenase.
[0032]
Examples of the reaction pathway for producing hydroxylinoleic acid include the following.
[0033]
For example, rice lipoxygenase adds one molecule of oxygen to the 9-position carbon of linoleic acid to produce hydroperoxylinoleic acid as the main product. Thereafter, it is reduced to produce hydroxylinoleic acid. The produced hydroxylinoleic acid is 9-hydroxy-10 (E) -12 (Z) -octadecadienoic acid.
[0034]
For example, soybean lipoxygenase adds one molecule of oxygen to the 13th carbon of linoleic acid, producing hydroperoxylinoleic acid as the main product. Thereafter, it is reduced to produce hydroxylinoleic acid. The produced hydroxylinoleic acid is 13-hydroxy-9 (Z) -11 (E) -octadecadienoic acid.
[0035]
The above reaction system is an enzyme reaction and has substrate specificity. Therefore, separation and purification after the reaction is easy only by removing unreacted substances, and mass production is possible. Also, when using enzymes, it can be used by extracting rice straw, tomato skin, etc., which is produced as waste, so that hydroxylinoleic acid can be easily produced, and it can be produced inexpensively and stably in large quantities. It is advantageous.
[0036]
Furthermore, the above-mentioned reaction is not chemical synthesis, but an enzyme reaction system widely present in plant seeds is applied, so that the influence on the human body is low and so-called side effects can be reduced. .
[0037]
In addition, hydroxylinoleic acid which is an active ingredient of the first anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention is specifically, for example, by reacting plant lipoxygenase with linoleic acid, The pH is adjusted, the precipitate is filtered, the organic solvent is added, the extract is concentrated under reduced pressure, applied to a normal silica gel column, the appropriate amount of the eluate is collected, and each fraction is hydrolyzed by thin layer chromatography. The linoleic acid fraction can be collected and precipitated, and the precipitate can be obtained by drying under reduced pressure.
[0038]
The second anti-inflammatory agent, the nitric oxide production inhibitor of the present invention comprises, as an active ingredient, a ketol-type unsaturated fatty acid obtained by allowing plant lipoxygenase and hydroxyperoxide isomerase to act on linoleic acid.
[0039]
Hydroxyperoxide isomerase that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is contained in plants, particularly seeds, as in plant lipoxygenase. Hydroxyperoxide isomerase, wheat-derived hydroxyperoxide isomerase, potato-derived hydroxyperoxide isomerase, flaxseed-derived hydroxyperoxide isomerase, watermelon-derived hydroxyperoxide isomerase, sunflower-derived hydroxyperoxide isomerase, alfalfa-derived hydroxyperoxide isomerase, tea-derived hydroxy A peroxide isomerase etc. can be illustrated.
[0040]
The hydroxyperoxide isomerase may be isolated and purified as in the case of plant lipoxygenase, or may be contained in the crushed seeds or commercially available. May be.
[0041]
The second anti-inflammatory agent of the present invention, an ketol-type unsaturated fatty acid that is an active ingredient of a nitric oxide production inhibitor, each has one or more ketone groups and hydroxy groups, and one or more unsaturated bonds, It means a straight-chain fatty acid having 6 to 36 carbon atoms. Usually, a linear fatty acid having one ketone group and one hydroxy group and one to three unsaturated bonds and having 12 to 24 carbon atoms is suitable.
[0042]
The ketol type unsaturated fatty acid can be obtained by adding a ketone group and a hydroxy group to the carbon chain of the unsaturated fatty acid using plant lipoxygenase and hydroperoxide isomerase.
[0043]
Examples of reaction pathways that produce ketol-type unsaturated fatty acids include the following.
[0044]
In the presence of plant lipoxygenase, linoleic acid is a molecule of oxygen (O) at the 9th carbon position or 13th carbon position counted from the carboxyl carbon.2) To form hydroperoxylinoleic acid.
[0045]
Here, when corn-derived lipoxygenase or wheat-derived lipoxygenase is used, 9-hydroperoxylinoleic acid is obtained as the main product, and when soybean-derived lipoxygenase is used, 13-hydroperoxygen is obtained. Linoleic acid is obtained as the main product.
[0046]
In these hydroperoxylinoleic acids, oxygen atoms are transferred by hydroperoxide isomerase contained in plants to produce ketol-type unsaturated fatty acids.
[0047]
That is, from 9-hydroperoxylinoleic acid, 13-hydroxy-10-oxo-trans-11-octadecenoic acid and 9-hydroxy-13-oxo-trans-10-octadecenoic acid are converted into 13-hydroperoxylinoleic acid. Produces 9-hydroxy-10-oxo-cis-12-octadecenoic acid and 13-hydroxy-12-oxo-cis-9-octadecenoic acid. That is, in this reaction system, four types of ketol-type unsaturated fatty acids can be obtained from one unsaturated fatty acid.
[0048]
The third anti-inflammatory agent, nitric oxide production inhibitor of the present invention comprises, as an active ingredient, a macrolide of a ketol-type unsaturated fatty acid obtained by allowing plant lipoxygenase and hydroperoxide dehydrase to act on linoleic acid. Is.
[0049]
The hydroperoxide dehydrase that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is contained in plants, particularly seeds, as in the case of plant lipoxygenase. Hydroperoxide dehydrase, wheat-derived hydroperoxide dehydrase, potato-derived hydroperoxide dehydrase, flaxseed-derived hydroperoxide dehydrase, watermelon-derived hydroperoxide dehydrase, sunflower-derived hydroperoxide dehydrase, alfalfa-derived hydroper Examples thereof include oxide dehydrase and tea-derived hydroperoxide dehydrase.
[0050]
The hydroperoxide dehydrase may be isolated and purified, as in the case of plant lipoxygenase, or may be contained in crushed seeds or commercially available. There may be.
[0051]
A macrolide of a ketol-type unsaturated fatty acid that is an active ingredient of the third anti-inflammatory agent and nitric oxide production inhibitor of the present invention includes, for example, linoleic acid, water, plant lipoxygenase and hydroperoxide dehydrase. The ketol type unsaturated fatty acid obtained by reacting in the presence can be obtained by reacting with a lipase in an organic solvent.
[0052]
Examples of the “organic solvent” herein include isooctane, cyclohexane, hexane, tetrachloromethane, trichloroethane, heptane, benzene, toluene, dioxane, trichloroethylene, tetrachloroethylene and the like.
[0053]
“Lipase” may be derived from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas, Rhizopus or Candida, or derived from porcine pancreas.
[0054]
Specifically, as ketol type unsaturated fatty acid obtained when linoleic acid is used, 10-oxo-13-hydroxy-11 (E) -octadecenoic acid, 10-oxo-9-hydroxy-12 (Z) -Octadecenoic acid, 12-oxo-9-hydroxy-10 (E) -octadecenoic acid, 12-oxo-13-hydroxy-9 (Z) -octadecenoic acid and the like can be mentioned. The macrolide compounds obtained by the reaction are 10-oxo-11 (E) -octadecene-13-olide, 10-oxo-12 (Z) -octadecene-10-olide, 12-oxo-10 (E) -octadecene. -10-olide, 12-oxo-9 (Z) -octadecene-13-olide and the like.
[0055]
The anti-inflammatory agent and nitric oxide production inhibitor of the present invention exhibit anti-inflammatory action, particularly nitric oxide production inhibitory action in vitro and in animal experiments, and are expected as pharmaceuticals.
[0056]
The anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention are administered to humans and animals orally or parenterally. The administration method includes oral administration by drinks, tablets, capsules, granules, powders, emulsions, syrups, suspensions, liquids, etc., enteral administration by suppositories, enemas, etc., for example, subcutaneous, intramuscular, intravenous injection And injection administration such as infusion, and transdermal administration using an ointment. Oral administration includes sublingual administration. The anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention may be applied.
[0057]
The anti-inflammatory agent and nitric oxide production inhibitor of the present invention may have a good effect when orally mixed with a pharmaceutically acceptable absorption enhancer, and examples of the absorption enhancer include sodium cholate. Can be used.
[0058]
The dosage of the anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention varies depending on the target symptom, administration method, etc.2) Per oral administration, 1 to 4000 mg / m2/ Day, preferably 10 to 3000 mg / m2/ Day, in the case of injection administration, 0.1 to 400 mg / m2/ Day, preferably 1 to 200 mg / m2/ Day, but it is possible to administer a large dose because of its extremely low toxicity. The administration may be divided into 2 to 4 times a day. Further, depending on the degree of symptoms, the dose is not limited to the above range and can be administered in a different range.
[0059]
The anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention are solid, liquid, semi-solid excipients, binders, disintegrants, solubilizers, solvents, which are generally used on their own or as appropriate. , Oil agents, dispersants, preservatives, surfactants, wetting agents, extenders, etc. may be mixed, and further appropriate coatings may be applied.
[0060]
The anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention can be used not only as they are, but also after concentration, drying, purification of necessary components, etc. It is also possible to mix various substances.
[0061]
【Example】
(1) Preparation of test substance
Example 1 9-Hydroxy-10,12-octadecadienoic acid (9-OH)
2 kg of rice bran was mixed with 8 liters of water, 10 g of linoleic acid was added, the mixture was stirred at 30 ° C. for 3 hours, filtered through a filter cloth, and the reaction solution was adjusted to pH 3 with concentrated hydrochloric acid. After adjusting to pH 3, the produced precipitate was filtered and extracted with 1000 ml of an organic solvent (hexane: ethyl acetate ratio of 1: 1).
[0062]
The obtained organic solvent layer was concentrated under reduced pressure and then applied to a normal layer silica gel column (Wakogel C300, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Normal layer silica gel chromatography was eluted with a single solvent having a hexane: ethyl acetate ratio of 7: 3.
[0063]
The eluate is collected in an appropriate amount, and fractions with spots of hydroxylinoleic acid are collected by thin layer chromatography for each fraction, and are cooled at low temperature (in an organic solvent with a ratio of hexane: ethyl acetate of 10: 1). −20 ° C.), and the precipitated white crystals were collected and dried under reduced pressure to obtain 1.0 g of 9-OH, which becomes the anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention.
[0064]
Example 2 13-Hydroxy-10-oxo-trans-11-octadecenoic acid (13-OH)
7.41 kg of dried corn grind was mixed with 20 liters of water, filtered through a filter cloth, 2.5 g of linoleic acid was added to the filtrate, and the mixture was stirred at 20 ° C. to 30 ° C. for 1 hour.
[0065]
The reaction solution was filtered through diatomaceous earth and then passed through a synthetic adsorbent Amberlite XAD-8 column (manufactured by Organo Corporation) having a capacity of 150 ml, and the adsorbate was eluted with 95% ethanol.
[0066]
The eluate was freed from ethanol under reduced pressure, suspended in an appropriate amount of water, and extracted with 300 ml of ethyl acetate.
[0067]
The obtained ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure and then applied to a normal phase silica gel column (Wakogel C-300, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The normal phase silica gel column was eluted with a mixed solvent having a ratio of hexane: ethyl acetate of 10: 3 to 5: 3.
[0068]
Appropriate amounts of the obtained eluate were collected, and fractions with spots of ketol-type substances were collected by thin layer chromatography for each fraction, and then an organic solvent having a hexane: ethyl acetate ratio of 7: 3. Under low temperature (−20 ° C.), the white crystals precipitated are collected and dried under reduced pressure, and 1.0 g of 13-OH, which becomes the anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention. Obtained.
[0069]
Example 3 10-Oxo-11 (E) -octadecene-13-olide (C18-Olide)
200 mg of 10-oxo-13-hydroxy-11 (E) -octadecenoic acid and 10 g of lipase P Amano (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) were mixed in 1 liter of isooctane and stirred at 40 ° C. for 72 hours.
[0070]
After filtering this reaction solution, the isooctane-soluble material was concentrated under reduced pressure and applied to a normal phase silica gel column (Wakogel C-300, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The normal phase silica gel column was eluted with a mixed solvent having a ratio of hexane: ethyl acetate of 100: 1 to 100: 10.
[0071]
This normal phase column chromatography is repeated 2-3 times, and C18-Olide fractions are collected, concentrated under reduced pressure, and used as the anti-inflammatory agent and nitric oxide production inhibitor of the present invention, C1822 mg of crystals of -olide were obtained.
[0072]
(2) Inhibition effect verification test
9-OH obtained by Example 1, 13-OH obtained by Example 2, C obtained by Example 318-Olide, a lipopolysaccharide (LPS), which is regarded as a Gram-negative bacterial toxin, and RAW mouse macrophages stimulated with interferon (IFN) -γ, which is an inflammatory cytokine, are used as an inflammation model. A test was conducted as to whether or not the inhibitory effect was exhibited.
[0073]
(Test Example 1) Nitric oxide production suppression test
9-OH obtained by Example 1, 13-OH obtained by Example 2, C obtained by Example 318It was investigated whether or not -olide has a nitric oxide production inhibitory effect.
[0074]
a) Test substance sample
Test substance (9-OH, 13-OH, C18-Olide) was diluted with dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “DMSO”) to prepare 160 μM, 800 μM, 4 mM, and 20 mM solutions, which were used as samples of the test substance.
[0075]
In the test, DMSO was added so as to be 0.5% (v / v), and final concentrations were adjusted to 0.8 μM, 4 μM, 20 μM, and 100 μM.
[0076]
For 9-OH and 13-OH, three concentrations of 4 μM, 20 μM, and 100 μM are selected, and C18As for -olide, since slightly strong cytotoxicity was observed at 100 μM, three concentrations of 0.8 μM, 4 μM, and 20 μM were selected with 20 μM as the maximum addition concentration.
[0077]
As a control, linoleic acid (LA), which is the starting material for each test substance, was also tested for a concentration of 100 μM.
[0078]
b) Culture
A mouse macrophage cell line RAW264.7 (hereinafter referred to as “RAW264.7 cells”) was placed in a 24 well plate at 2 × 10.5cells / ml, seeded with 1 mL, and precultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas atmosphere for 13 hours.
[0079]
After pre-culture, the medium was removed from the well, and 1 mL of PBS (KCl 0.2 g / L, KH2PO4 0.2g / L, Na2HPO4/ 7H2O. 2.16 g / L, NaCl 8 g / L) was washed twice, 500 μL of Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM medium”) (serum-free, phenol red free) was added, and 5 μL of the test substance sample ( DMSO (5 μL) was added to the control, and then 100 ng / mL L-arginine, 100 ng / mL LPS and 100 U / mL IFN-γ were added in an amount of 10 μL, and finally DMEM medium was added in an amount of 500 μL.
[0080]
A blank was prepared by adding only DMSO (final concentration 0.5% (v / v)) without adding LPS and IFN-γ stimulants.
[0081]
Thereafter, main culture was performed at 37 ° C. for 12 hours or 24 hours.
[0082]
c) Measurement of inhibition rate of nitric oxide production in cells
Nitric oxide is b) 2NO + O2→ 2NO2 B) NO2+ NO → N2O3 C) N2O3+ H2O → 2H++ 2NO2 −In order to react with NO in the medium.2 −Was measured by the Griess method, and the inhibition rate of nitric oxide production in the cells was determined.
[0083]
Add 500 μL of Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid: 0.1% N-1-naphthylethylene dihydrochloride = 1: 1) to 500 μL of supernatant after the main culture, mix well, and diazo coupling reaction Was measured for absorbance at a wavelength of 543 nm.
NO2 −The amount of NaNO2The sample was placed on a calibration curve (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM) prepared using
[0084]
NO2 −Production inhibitory activity was determined by the following formula.
[0085]
NO2 −Production inhibitory activity (%) = 100− (ES-ED) / (EL-ED) × 100
ED: DMSO-added group absorbance, EL: LPS / IFN-γ added group absorbance, ES: + Sample added group absorbance)
As a result, if blank, NO2 −However, when stimulation was performed with LPS / IFN-γ, the production increased with time, and a difference of 10 times or more was observed in the 24-hour culture.
[0086]
9-OH, 13-OH, C18Table 1 shows the results of the inhibition rate of nitric oxide production for -olide and linoleic acid.
[0087]
[Table 1]
[0088]
From Table 1, derived NO2 −In contrast, 9-OH, 13-OH, C18-Olide is all concentration-dependent NO2 −It was found that production was suppressed. Above all, C18-Olide showed an inhibition rate of 100% at 100 μM at all times, and an inhibition rate of 70% or more even at 4 μM, indicating a high activity. 9-OH and 13-OH also showed inhibition rates of 80% and 63%, respectively, when cultured at 20 μM for 24 hours.18-If not as much as NO, NO2 −It was shown to have a production inhibitory effect.
[0089]
Also, 9-OH, 13-OH, C18-Olide showed a high inhibition rate compared with linoleic acid which is the starting material.
[0090]
From this experimental result, the excellent inhibitory effect of nitric oxide production in the anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention was clarified.
[0091]
(Test Example 2) Inhibitory action on the expression of inflammation-related genes
Inflammatory reaction is caused by NO and PGE produced by overexpression of iNOS and COX-2.2However, it is thought to be caused as a result of various damages in vivo. In addition, the expression of inflammatory cytokines represented by TNF-α and interleukin (IL) -1β, which has an action of inducing the expression of these inflammation-related genes by forming an autocrine loop, is also greatly involved in inflammation. It is known that
[0092]
Therefore, 9-OH, 13-OH, C, which are anti-inflammatory agents and nitric oxide production inhibitors of the present invention, which showed a nitric oxide production inhibitory effect.18Whether or not each of the -olides showed an inhibitory effect on the expression of inflammation-related genes was examined.
[0093]
In this test example, C18-Olide used 0.8 μM and 4 μM, 13-OH used 4 μM and 20 μM, and 9-OH used 20 μM and 100 μM, respectively. These test substance samples were prepared in the same manner as in Test Example 1.
[0094]
RAW264.7 cells in a 6-well plate5cell / ml, seeded with 5 mL, pre-cultured at 37 ° C. in 5% carbon dioxide gas atmosphere for 13 hours. After pre-culture, the medium was removed from the well, and 2-3 mL of PBS (KCl 0.2 g / kg) was obtained. L, KH2PO4 0.2g / L, Na2HPO4/ 7H2O. 2.16 g / L, NaCl 8 g / L), add 2.5 mL of DMEM medium (serum free, phenol red free), add 25 μL of test substance sample (25 μL of DMSO for control), then 100 ng / mL L-arginine, 100 ng / mL LPS and 100 U / mL IFN-γ were added in an amount of 50 μL, and finally 2.5 mL of DMEM medium was added, followed by incubation at 37 ° C. for 6 hours. Since gene expression occurs fairly early after the cells respond to the stimulus, mRNA was extracted 6 hours after treatment of RAW264.7 cells with LPS / IFN-γ and each sample, followed by reverse transcription Complementary DNA (cDNA) is synthesized by reaction, and internal standard GAPDH, COX-1, TNF-α, TGF-β are synthesized by polymerase-chain-reaction (PCR) and RT-PCR method by RT-PCR method. , INOS, COX-2, and IL-6 were analyzed for their expression levels.
[0095]
As a result, with regard to the four genes GAPDH, COX-1, TNF-α, and TGF-β, even when stimulation was performed with LPS / IFN-γ, the expression thereof was almost the same as that of the blank, and the group was further subjected to sample processing. However, there was no change in the expression level.
[0096]
On the other hand, the three genes iNOS, COX-2, and IL-6 are significantly induced to 9 times, 4 times, and 8 times the expression level of the blank when stimulated by LPS / IFN-γ. It was found that the expression induction level was suppressed in a concentration-dependent manner with the addition of each sample. Table 2 shows the results of suppressing the expression of three inflammation-related genes, iNOS, COX-2, and IL-6.
[0097]
[Table 2]
[0098]
From Table 2, C18-Olide suppresses iNOS by about 50% and IL-6 by about 80% at 4 μM, and COX-2 shows an expression suppression effect of 60% at 0.8 μM, and 13-OH has 20 μM The 9-OH showed a repression rate close to 90% for all three genes, and 9-OH showed a high repressive activity of 70 to 100% at 100 μM, although the expression suppressing effect was not so much seen at 20 μM.
[0099]
Thus, the anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention also revealed a very good inflammation-related gene expression inhibitory action.
[0100]
【The invention's effect】
The anti-inflammatory agent and the nitric oxide production inhibitor of the present invention of the present invention have an excellent anti-inflammatory effect, particularly an excellent nitric oxide production inhibitory effect, and an extremely good suppression effect on the expression of inflammation-related genes. Therefore, there are advantages such as few side effects and high safety.
