JP2005000024A

JP2005000024A - Method for testing mutagenicity using mammalian cell

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Publication number: JP2005000024A
Application number: JP2003164781A
Authority: JP
Inventors: Katsutoshi Ono; 克利大野; Yukimasa Azuma; 幸雅東; Yukio Yoneda; 幸生米田; Toshihiro Yamada; 敏広山田
Original assignee: Nissin Food Products Co Ltd
Current assignee: Nissin Food Products Co Ltd
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2003-06-10
Publication date: 2005-01-06
Anticipated expiration: 2023-06-10
Also published as: JP4243716B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for testing designed to accurately and simply confirm mutagenicity for mammals including humans and to provide a material used therefor. <P>SOLUTION: The method for testing the mutagenicity is carried out as follows. A transformant holding a recombinant vector containing a p53 binding sequence, a minimum promoter functioning with a mammalian cell and a reporter gene expressibly linked to the promoter is brought into contact with a test substance to compare the expression level of the reporter gene between the transformant brought into contact with the test substance and the transformant without contact with the test substance. Thereby, a judgment whether or not the test substance affects the expression level of the reporter gene is made. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験物質の哺乳動物細胞に対する変異原性ひいては発癌性を確認するための変異原性試験方法、並びに、この方法に用いられる組み換えベクター及び形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品や環境中に廃棄される製品に含まれる物質は、発癌性がないことが求められる。変異原性物質は発癌性を有するものが多いため、使用する物質が変異原性を有するか否かを評価することは、これらの物質の安全性評価の必須事項である。
【０００３】
変異原性試験の一次スクリーニングとしては、通常、サルモネラ菌を用いたエイムス（Ａｍｅｓ）試験やウム試験（ｕｍｕ−ｔｅｓｔ）などが行われている。これらの試験は微生物を対象とした試験であるため、これらの試験で変異原性陽性と判定された化学物質は、必ずしもヒトに対して同様の結果をもたらさない。一方、哺乳類の培養細胞を対象とした試験や動物個体を対象とした試験、例えば、染色体異常試験や小核試験等も変異原性試験法として確立されているが、操作が煩雑で、結果が得られるまでに比較的長時間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確かつ簡便に確認できる試験方法、及び、それに用いる材料を提供することを主目的とする
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
▲１▼ ｐ５３結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、このプロモーターによって発現可能であるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクターを保持する哺乳動物細胞を用い、この細胞に被験物質を接触させて、接触によりレポーター遺伝子の発現量が変化するか否かを判定することにより、被験物質が哺乳動物のＤＮＡに損傷を与える変異原性物質であるか否かを正確かつ簡便に検出できる。
▲２▼ ｐ５３結合配列が、そのコンセンサス配列とされている配列番号２に示す塩基配列を３個含む場合には、特に感度良く変異原性物質を検出できる。
【０００６】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の組み換えベクター、形質転換体及び変異原性試験方法を提供する。
【０００７】
項１．ｐ５３結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、このプロモーターにより発現できるように連結されたレポーター遺伝子とを含む組み換えベクター。
【０００８】
項２．上流側から、ｐ５３結合配列、最小プロモーター、及びレポーター遺伝子の順に配置されている項１に記載の組み換えベクター。
【０００９】
項３．上流側から、最小プロモーター、ｐ５３結合配列、及びレポーター遺伝子の順に配置されている項１に記載の組み換えベクター。
【００１０】
項４．ｐ５３結合配列が、配列番号１に示す塩基配列（配列番号１中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Ｗはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Ｙはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を有するものである項１、２又は３に記載の組み換えベクター。
【００１１】
項５．ｐ５３結合配列が、配列番号２（配列番号２中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Ｗはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Ｙはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）に示す塩基配列を有するものである項１、２又は３に記載の組み換えベクター。
【００１２】
項６．ｐ５３結合配列が、配列番号２に示す塩基配列を３個有するものである項５に記載の組み換えベクター。
【００１３】
項７．変異原性試験用の項１から６のいずれかに記載の組み換えベクター。
【００１４】
項８．項１から６のいずれかに記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
【００１５】
項９．変異原性試験用の項８に記載の形質転換体。
【００１６】
項１０．（１）項８に記載の形質転換体と被験物質とを接触させる工程と、
（２）被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程とを含む変異原性試験方法。
【００１７】
項１１．ｐ５３結合配列が、配列番号２（配列番号１中、Ｒはプリン塩基を含むヌクレオチドを示し、Ｗはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Ｙはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）に示す塩基配列からなるものである項１、２又は３に記載の組み換えベクター。
【００１８】
項１２．ｐ５３結合配列が、配列番号２に示す塩基配列を３回繰り返したものである項１１に記載の組み換えベクター。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列と、哺乳動物細胞で機能可能な最小プロモーターと、このプロモーターにより発現可能であるように連結されたレポーター遺伝子とを含むベクターである。
ｐ５３結合配列
ｐ５３は、化学物質、紫外線又はガンマ線などによるＤＮＡ損傷時に、特定部位がリン酸化されることにより活性化し、特定遺伝子群の転写調節領域に結合して、その転写を調節する機能を有する転写因子である。
【００２０】
ｐ５３結合配列としては、哺乳動物細胞において、ＤＮＡ損傷を契機としてｐ５３により転写活性が調節される標的遺伝子群の上流又はイントロン中の転写調節領域中に存在するＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２１】
ＤＮＡ損傷によりリン酸化された活性型ｐ５３が、その転写調節領域を認識し結合することにより、転写が活性化され、転写量が増大する遺伝子群のｐ５３結合配列を用いることが好ましい。ｐ５３により転写が活性化される遺伝子としては、具体的には、ＤＮＡ修復に関わるｐ５３Ｒ２、細胞周期調節に関わるｐ２１／Ｗａｆ−１、アポトーシスの調節に関わるｐ５３ＡＩＰ１、Ｂａｘ、ｐ５３ＤＩＮＰ１等が挙げられる。
【００２２】
天然の哺乳動物細胞においてｐ５３により転写が促進される遺伝子群のｐ５３結合ＤＮＡ配列は、通常、コンセンサス配列である５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ −３’（配列番号１：Ｒはプリン塩基を有するヌクレオチドを示し、Ｗはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Ｙはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を２回繰り返した配列５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ −３’（配列番号２：Ｒはプリン塩基を有するヌクレオチドを示し、Ｗはアデニン又はチミンを含むヌクレオチドを示し、Ｙはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを示す）を含む。
【００２３】
従って、本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列として配列番号１のコンセンサス配列を１個以上含むことが好ましい。また本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列として配列番号２のコンセンサス配列を１個以上含むことが好ましい。本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列として配列番号２の塩基配列において数個程度まで、特に１〜２個のヌクレオチドが置換された塩基配列を１個以上含んでいてもよい。
【００２４】
本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列として、配列番号２の塩基配列又は配列番号２の塩基配列において数個までのヌクレオチドが置換された塩基配列を３個程度含むことがより好ましい。配列番号２のコンセンサス配列を２個以上含む場合は、それらは直接連結されていてもよく、間に１〜２０個程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。
【００２５】
天然の哺乳動物細胞においては、ｐ５３Ｒ２のイントロン１には、５’− ＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴ − ３’（配列番号３：Ｎａｔｕｒｅ，４０４，４２−４９（２０００））が存在し、Ｂａｘのイントロン１には５’− ＧＧＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧ − ３’（配列番号４：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，９９０−９９９（２００２））が存在し、ｐ５３ＡＩＰ１のイントロン１には５’− ＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧ − ３’ （配列番号５：Ｃｅｌｌ，１０２，８４９−８６２（２０００））が存在し、ｐ５３ＤＩＮＰ１のイントロン２には５’− ＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧＴＴＴ − ３’ （配列番号６：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，８，８５−９４（２００１））が存在し、ｐ２１／Ｗａｆ−１の上流には５’− ＧＡＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＴＴＧ − ３’ （配列番号７：Ｃｅｌｌ，７５，８１７−８２５（１９９３））が存在する。
【００２６】
本発明の組み換えＤＮＡにおけるｐ５３結合配列としては、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列（特に配列番号３又は５の塩基配列）を１個以上含む配列を好ましく用いることができる。また、塩基番号２の塩基配列に該当すれば、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列において１〜３個程度のヌクレオチドが置換されている塩基配列を１個以上含む配列であってもよい。特に、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列（特に配列番号３又は５の塩基配列）を３個含む配列が好ましい。また、配列番号３、４、５、６又は７の塩基配列が複数含まれる場合は、これらが組み合わされて含まれていてもよい。このような例として、例えば、配列番号３の配列と配列番号４の配列と配列番号５の配列とが連結された塩基配列が挙げられる。
【００２７】
コンセンサス配列を含むＤＮＡ配列は、化学合成することができ、また哺乳動物の染色体ＤＮＡを鋳型にして、上記コンセンサス配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより増幅しクローニングすることによっても調製できる。
【００２８】
本発明の組み換えベクターにおいては、ｐ５３の結合により転写量が低下するような遺伝子群のｐ５３結合配列を用いることもできる。
【００２９】
また本発明の組み換えベクターにおいては、ｐ５３結合配列に代えて、ＤＮＡ損傷を契機として活性化する他の転写因子の結合配列を用いることもできる。すなわち、哺乳動物細胞においてＤＮＡ損傷を契機として転写活性が調節される他の標的遺伝子群の転写因子結合配列を用いることもできる。このような標的遺伝子として、キナーゼタンパク質であるＡＴＭ又はＡＴＲなどが挙げられる。ＡＴＭはＤＮＡ損傷に応答してｐ５３をリン酸化するキナーゼである。従ってｐ５３結合配列に代えて、ＡＴＭ遺伝子の上流域に存在する転写因子結合配列を用いることもできる。また、ＡＴＲは主に紫外線などによるＤＮＡ損傷に応答してｐ５３をリン酸化するキナーゼである。従って、ｐ５３結合配列に代えて、ＡＴＭ遺伝子の上流域に存在する転写因子結合配列を用いることもできる。
最小プロモーター
哺乳動物細胞で発現可能な最小プロモーターは、コアプロモーターともいわれ、通常、遺伝子の転写開始部位付近の比較的狭い部分にみられる領域である。また、最小プロモーターは、転写調節に関わる主たる機能性エレメントであり、例えば他の転写調節因子の認識配列のような転写調節に関わる他の機能性エレメントを含まないか、または、このような機能性エレメントを含んでいてもそれがｐ５３結合配列と最小プロモーターとによる転写調節機能を本質的に変化させることのない配列である。
【００３０】
本発明の組み換えベクターは、哺乳動物の最小プロモーターとして公知のものを制限なく使用できる。このような最小プロモーターの塩基配列としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始部位を決定し最低限の転写水準維持に関与するＤＮＡ領域であるＴＡＴＡボックスおよび転写開始点近傍の塩基配列が挙げられ、具体的には例えば、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子の５’上流領域の塩基配列（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｊ００６０５）、チキンオボアルブミン遺伝子の５’上流領域の塩基配列（ＧｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｊ００８９５）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の５’上流領域の塩基配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７８，１４４１−１４４５（１９８１））、シミアンウィルス（ＳＶ４０）の最小プロモーター等が挙げられる。本発明の組み換えベクターにおける最小プロモーターとしては、これらの最小プロモーター配列を用いることが好ましい。また、これらのＤＮＡ配列において１〜数個程度のヌクレオチドが付加、欠失又は置換したＤＮＡ配列も、哺乳動物細胞において最小プロモーターとして機能する限り使用できる。
【００３１】
また本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列と最小プロモーターとによる転写調節機能を本質的に変化させない限り、最小プロモーターを含むより広範囲なプロモーター領域を含むものであってもよい。
【００３２】
これらの配列からなるＤＮＡは、その塩基配列に基づいた化学合成などにより調製できる。
レポーター遺伝子
本発明において、レポーター遺伝子とは、その遺伝子の発現を定性的又は定量的に確認できる遺伝子をいう。レポーター遺伝子としては、例えば公知のレポーター遺伝子を広く使用できる。特に、発現量の測定が容易である点で、その転写産物（レポーター蛋白質）の有する酵素活性等に基づいて発現量を測定できる遺伝子が好ましく、このようなレポーター遺伝子として、例えばホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼのような酵素蛋白質をコードする遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）のような発光タンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００３３】
これらのレポーター遺伝子はレポータープラスミドとして市販されているものを使用してもよい。
細胞選択マーカー遺伝子
本発明の組み換えベクターは、細胞における組み換えベクターの保持を確認できるように、哺乳動物細胞で機能可能な細胞選択マーカー遺伝子が含まれていてよい。「細胞選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子を含むＤＮＡで形質転換された細胞と非形質転換細胞とを見分ける際に目印となり得る表現形質をコードする遺伝子である。「動物細胞で機能可能な」とは、動物細胞で前記形質を発現することができることを意味し、「動物細胞で機能可能な遺伝子」とは、動物細胞で転写開始能を有するプロモーターの制御下にあることにより動物細胞で発現可能な状態にある遺伝子をいう。
【００３４】
動物細胞で有効な細胞選択マーカー遺伝子としては、例えば、動物細胞の増殖を抑制または阻害する薬剤に対する耐性を細胞に付与することの可能な遺伝子を挙げることができる。具体的には、ネオマイシン耐性付与遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子（ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子）等が挙げられ、形質転換細胞の選抜がより短期間で行える点で、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子が好ましい。
構成
本発明の組み換えベクターは、ｐ５３結合配列と最小プロモーターとを含む転写調節領域の下流に、レポーター遺伝子が発現可能に連結されている。転写因子結合配列と最小プロモーターとはいずれがより上流に存在していてもよい。
【００３５】
ｐ５３結合配列と最小プロモーターとの間には１〜数個程度のヌクレオチドが存在していてもよい。また、ｐ５３結合配列及び最小プロモーターを含む転写調節領域とレポーター遺伝子との間には、レポーター遺伝子が発現可能な範囲で、１〜数個程度のヌクレオチドが存在していてもよい。
【００３６】
このようなベクターとするために、本発明の組み換えベクターは、最小プロモーター及びその下流に遺伝子挿入部位を有する市販の哺乳動物細胞用発現ベクターを利用し、このベクターにｐ５３結合配列及びレポーター遺伝子を挿入したものとしてよい。このような市販の哺乳動物用発現ベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。また前述したように、本発明の組み換えベクターは、市販のレポータープラスミドとして市販されているベクターにｐ５３結合配列を挿入したものとすることもできる。市販のレポータープラスミドとしては、ルシフェラーゼプラスミドであるｐＴ８１ｌｕ、ｐＳｌｕｃ２、ｐＧＬ３等が挙げられる。
【００３７】
本発明の組み換えベクターは、取扱い易く、ベクター分子内または分子間の遺伝子組換えや安定形質転換細胞における染色体からの脱落等が起こる頻度が低くなる点で、コンパクトな大きさであることが望ましく、例えば２〜１０ｋｂ程度の大きさであることが好ましい。
【００３８】
本発明の組み換えベクターは、後述する変異原性試験に供する細胞として好適に使用できる。
（ＩＩ）形質転換体
本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の組み換えベクターを保持する細胞である。本発明の形質転換体は、上記組み換えベクターを一時的に保持してていもよく、安定的に保持していてもよい。
細胞
形質転換体を調製するに際し、組み換えベクターを導入する宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞としては、野生型ｐ５３が発現し、正常に機能している哺乳動物細胞を用いることができるが、ｐ５３機能が低下、欠損又は変異している異常細胞であっても、野生型ｐ５３遺伝子を別途導入することによりｐ５３を発現させてやれば使用することができる。また、野生型ｐ５３が発現している細胞であっても、その発現量が少ない場合や組み換えベクター中のプロモーター活性が弱すぎる場合等は、さらに野生型ｐ５３遺伝子を別途導入してｐ５３遺伝子の発現量を増大させて使用すればよい。
【００３９】
操作の容易性や再現性等を考慮すると安定に継代可能な樹立細胞株が好ましい。このような細胞株は特に限定されず公知のものを使用できる。Ｐ５３が正常に発現しかつ安定に継代可能な樹立細胞株としては、例えばヒト乳ガン由来のＭＣＦ−７細胞、ヒトリンパ球由来のＴＫ６細胞、ヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２のようなヒト由来の細胞；マウス繊維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞；アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞、ＣＯＳ−７細胞；チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ細胞等が挙げられる。特に、ヒトにおけるＤＮＡ損傷とｐ５３の活性化との関係を再現でき被験物質のヒト細胞に対する変異原性を正確に評価できる点で、ヒト由来の細胞を用いることが好ましい。上記の培養細胞は、いずれもＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる。但し、これらの細胞を使用するにあたっては、その細胞が野生型のｐ５３を発現していることをＤＮＡシーケンスなどで予め確認することが好ましい。
形質転換方法
形質転換体の調製に当たっては、本発明の組み換えベクターを宿主細胞に一過的又は安定的に導入すればよい。形質転換率を考慮する必要がない点で、安定的に導入することが好ましい。
【００４０】
ベクター導入方法はすでに周知である。具体的には、例えば、まず１０^５〜１０^７細胞程度の宿主細胞を直径６〜１０ｃｍ程度のシャーレに播き、５〜１０％程度の血清を含有するＭＥＭ培地等を用いて、５％ＣＯ_２および飽和湿度条件下に３７℃で数時間〜一晩程度培養することができる。このようにして培養した細胞へ、上記ＤＮＡを導入すればよい。宿主細胞に導入されるＤＮＡの純度は、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法で精製したプラスミドＤＮＡとほぼ同等であることが望ましい。
【００４１】
ＤＮＡ導入法は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等の一般的な方法を制限なく採用できる。これらの方法によりベクターを導入した場合は、通常、発現ベクターは一過的に発現できる状態である。従って、ＤＮＡ導入後直ぐに形質転換体を変異原性試験に供すればよい。また、発現ベクターが安定的に発現している細胞を選択するには、ベクター導入後、薬物耐性又は陽性対照物質によるレポーター遺伝子の活性化を指標に、組み換えベクターが適切に導入された宿主細胞を選択すればよい。ここで、陽性対照物質を添加したときにルシフェラーゼ活性が基底レベルの２倍以上認められる細胞をレポーター遺伝子が活性化している細胞とみなす。
【００４２】
本発明の形質転換体は、後述する変異原性試験に供する細胞として好適に使用できる。
（ＩＩＩ）変異原性試験方法
本発明の変異原性試験方法は、
（１）上記説明した本発明の形質転換体と被験物質とを接触させる工程と、
（２）被験物質を接触させた形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量と被験物質を接触させない形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより、被験物質が形質転換体におけるレポーター遺伝子の発現量に影響を及ぼすか否かを判定する工程とを含む方法である。
被験物質
被験物質の種類は特に限定されない。低分子化合物、高分子化合物等の他に、例えば、食品、食品加工物、廃棄物、ゴミ焼却物等の複数種類の物質の混合物であってもよい。
工程（１）
本発明の形質転換体と被験物質とを接触させるに当たっては、先ず、形質転換体を細胞培養容器に播種し、８時間〜一晩程度培養すればよい。培養温度は、その細胞に適した温度とすればよく、通常は３７℃程度とすればよい。培養液は特に限定されず、細胞に適した培養液を使用すればよい。細胞数は特に限定されないが、例えば９６穴プレートを使用する場合は、通常１穴あたり１×１０^４個程度の細胞を播種すればよい。
【００４３】
次いで、細胞培養液に被験物質を添加する。被験物質はそのまま又は溶媒に溶解させて添加する。溶媒としては、例えば蒸留水、細胞に影響を与えないＰＢＳ（−）のような緩衝液、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール等を用いることができる。被験物質は、細胞培養液中の最終濃度が通常０．１〜１重量％程度になるように添加すればよい。食品加工物の場合は、細胞に影響を与えないＰＢＳ（−）のような緩衝液で混和したものを培養液に対して１０容量％以内添加するか、被験物質をメタノール等の有機溶媒で抽出、濃縮したものを最終濃度が通常０．１〜１重量％程度になるように添加すればよい。被験物質を溶媒に溶解させて添加する場合は、対照形質転換体の培養液には、その溶媒を被験物質溶液の添加量と同量添加する。
【００４４】
細胞培養液に被験物質を添加した後、前記と同様の温度範囲で通常は１２〜７２時間程度、好ましくは２４〜４８時間程度培養を継続する。
工程（２）
その後、被験物質を接触させた形質転換体と接触させていない形質転換体との間で、レポーター遺伝子の発現量を比較する。比較するに当たっては、両細胞のレポーター遺伝子の発現量をそれぞれ測定し、両測定値を比較することができ、又は、両細胞のレポーター遺伝子発現量を目視などにより直接定性的に比較することもできる。
【００４５】
それぞれ測定したレポーター遺伝子発現量を比較する場合は、各レポーター遺伝子の発現量をレポーター遺伝子の種類に応じた方法で測定すればよい。例えばレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である場合には、各細胞をＰＢＳ（−）等で洗浄した後、界面活性剤入りの細胞溶解剤を添加して細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを細胞溶解物に添加し、ルシフェリンの分解による発光量をルミノメーターを用いて定量することによりルシフェラーゼ活性を測定することができる。
【００４６】
レポーターアッセイは、マニュアル作業でも行えるが、機械を用いて自動で行ういわゆるハイスループットスクリーニング（組織培養工学、ｖｏｌ１２３，Ｎｏ．１３，５２１−５２４、米国特許第５，６７０，１１３号）を用いることにより迅速かつ簡便に行うことができる。
【００４７】
ｐ５３により転写が活性化される遺伝子群のｐ５３結合配列を用いる場合は、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子
発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、例えば１５０％以上、好ましくは２００％以上になる場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。
【００４８】
また、ｐ５３により転写が抑制される遺伝子群のｐ５３結合配列を用いる場合は、被験物質を接触させた形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量の方が接触させない形質転換体の細胞当たりのレポーター遺伝子発現量に較べて、例えば７０％以下、好ましくは５０％以下になる場合に、その被験物質が変異原性物質又は発癌性物質であると判定できる。
【００４９】
また、本発明方法において、形質転換体に既知の変異原性物質とともに被験物質を接触させることにより、抗変異原性物質又は抗発癌性物質を選択することもできる。すなわち、対照形質転換体のレポーター遺伝子発現量と、変異原性物質のみ接触させた形質転換体のレポーター遺伝子の発現量と、変異原性物質及び被験物質を接触させた形質転換体のレポーター遺伝子の発現量とを比較して、変異原性物質を接触させることによるレポーター遺伝子発現の変化量が、さらに被験物質を接触させることにより例えば１０％、好ましくは５０％低下する場合に、その被験物質が抗変異原性物質又は抗発癌性物質であると判定できる。このような物質として、抗酸化物質等が挙げられる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒトを含む哺乳動物に対する変異原性を正確かつ簡便に確認できる試験方法、及び、それに用いる材料が提供された。
【００５１】
さらにいえば、本発明の変異原性試験方法は、ＤＮＡ損傷による表現型の変化を直接評価するのではなく、ＤＮＡ損傷による生物反応を評価するため、ＤＮＡ損傷を高感度で検出することができる。
【００５２】
また本発明方法は、従来の変異原性試験のように微生物を利用するのではなく、ヒトをはじめとする哺乳類細胞のＤＮＡ損傷に対する反応系を利用するため、その試験結果はヒトでの変異原性を正確に反映したものとなる。
【００５３】
また本発明方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで簡便に行えるとともに、被験物質を細胞に接触させた後にレポーター遺伝子産物量を測定するだけの迅速な方法である。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例および試験例を示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（組み換えベクターの作製）
ＤＮＡ損傷で発現するｐ５３Ｒ２遺伝子イントロンのｐ５３結合配列を３回繰り返し含む塩基配列（５’−ＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡ−３’：配列番号８）からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列（５’−ＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＧＧＴＡＣ−３’ ：配列番号９）からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡとした。
【００５５】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子、及び、ＳＶ４０最小プロモーターを含むプラスミドＰＧＶ−Ｐ２（東洋インキ製）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後、低融点アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ；ＢＭＡ製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の４９７４ｂｐのＤＮＡを回収した。このＤＮＡ約３０ｎｇと、前記のｐ５３結合配列を３回繰り返し含むＤＮＡ１ｎｇとを混合し、Ｔ４リガーゼ（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ；ＴａＫａＲａ製）で結合させた後、この反応液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ＴａＫａＲａ製）へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で精製し、ＲＶ３プライマー及びＧＬ２プライマー（いずれもプロメガ製）を用いて、ＤＮＡシーケンス（ＡＢＩＰｒｉｓｍＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｅｒｖ３．０；アプライドバイオシステムズ製）を確認した。正しくｐ５３結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃと名づけた。
実施例２（組み換えベクターの作製；ｐ５３結合配列のレパートリー；ｐ５３ＡＩＰ１由来ｐ５３結合配列を含むレポータープラスミドの作成）
ＤＮＡ損傷で発現するｐ５３ＡＩＰ１遺伝子イントロンのｐ５３結合配列を３回繰り返し含む塩基配列（５’−ＣＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＧＴＣＧＡ −３’：配列番号１０）からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列（５’− ＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＡＣ −３’ ：配列番号１１）からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡとした。
【００５６】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子、及び、ＳＶ４０最小プロモーターを含むプラスミドＰＧＶ−Ｐ２（東洋インキ製）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後、低融点アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ；ＢＭＡ製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の４９７４ｂｐのＤＮＡを回収した。このＤＮＡ約３０ｎｇと、前記のｐ５３結合配列を３回繰り返し含むＤＮＡ１ｎｇとを混合し、Ｔ４リガーゼ（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ；ＴａＫａＲａ製）で結合させた後、この反応液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ＴａＫａＲａ製）へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で精製し、ＲＶ３プライマー及びＧＬ２プライマーを用いて、ＤＮＡシーケンスを確認した。正しくｐ５３結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをＰＧＶ−ｐ５３ＡＩＰ１ｘ３−Ｌｕｃと名づけた。
実施例３（組み換えベクターの作製；プロモーターのレパートリー；ｔｋ最小プロモーターを含むレポータープラスミドの作成）
ヘルペスウイルス由来のｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅプロモーターを含むプラスミドｐＲＬ−ｔｋ（東洋インキ製）を鋳型として、ヘルペスウイルス由来のｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅプロモーターの最小領域（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１５２３４）をフォワードプライマー（５’−ＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡ−３’：配列番号１２）、リバースプライマー（５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＣＧＧ−３’：配列番号１３）を用いたＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑを用い、この酵素に添付したＤＮＡポリメラーゼ、反応用緩衝液、ｄＮＴＰ、及び、鋳型としてｐＲＬ−ｔｋ１００ｎｇ、上記プライマー各１０ｐｍｏｌずつを混合し、反応液量５０μｌとして、９５℃２０秒間、次いで５９℃にて２０秒間、６８℃３０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５サイクル行った。このＰＣＲ産物をＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、クローニングプラスミドＴＯＰＯに挿入し、次いでキット付属のコンピーテントセルＯｎｅＳｈｏｔに挿入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔで精製し、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の１８１ｂｐのＤＮＡを回収し、ｔｋ最小プロモーターと名づけた。実施例１で作成したレポータープラスミドＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の４８３２ｂｐのＤＮＡを回収した。
このＤＮＡ約３ｎｇと、前記のｔｋ最小プロモーターのＤＮＡ１０ｎｇとを混合し、Ｔ４リガーゼで結合させた後、この反応液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で精製し、ＲＶ３プライマー及びＧＬ２プライマーを用いて、ＤＮＡシーケンスを確認した。正しくｔｋ最小プロモーター配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃと名づけた。
実施例４（組み換えベクターの作製；ｐ５３結合配列とプロモーター配列の順序を置換したレポータープラスミドの作成）
ＤＮＡ損傷で発現するｐ５３Ｒ２遺伝子イントロンのｐ５３結合配列を３回繰り返し含む塩基配列（５’−ＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡ−３’：配列番号１４）からなるオリゴヌクレオチド、及びこの塩基配列と相補的な塩基配列（５’−ＡＧＣＴＴＡＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＡ−３’ ：配列番号１５）からなるオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機にてそれぞれ合成し、これらをアニーリングさせて２本鎖ＤＮＡとし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ社製）で５’末端をリン酸化した。
【００５７】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子、及び、ＳＶ４０最小プロモーターを含むプラスミドＰＧＶ−Ｐ２（東洋インキ製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリフォスファターゼ（ＴａＫａＲａ社製）で脱リン酸化した後、低融点アガロースを用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルから目的の５０１０ｂｐのＤＮＡを回収した。このＤＮＡ約３ｎｇと、前記のｐ５３結合配列を３回繰り返し含むリン酸化ＤＮＡ１０ｎｇとを混合し、Ｔ４リガーゼ（ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ；ＴａＫａＲａ製）で結合させた後、この反応液を大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルへ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）で精製し、ＲＶ３プライマー及びＧＬ２プライマー（いずれもプロメガ製）を用いて、ＤＮＡシーケンスを確認した。正しくｐ５３結合配列が挿入したことが確認されたレポータープラスミドをＰＧＶ−ＳＶ４０−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃと名づけた。
実施例５（一過的形質転換体の作製・変異原性試験）
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７の野生型ｐ５３が正常であることを、シーケンス用プライマーである５’−ＡＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＡＴＴＧ−３’（配列番号１６）及び５’−ＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号１７）を用いたＤＮＡシーケンス（ＡＢＩＰｒｉｓｍＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｅｒｖ３．０；アプライドバイオシステムズ製）により確認した。
【００５８】
この細胞を、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用９６穴プレート（コーニング製＃３９１０）に約１×１０^４細胞／穴ずつ播種し、ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ；インビトロジェン製）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％含む培地を用いて、３７℃で一晩培養した。次いで、培養細胞に、実施例１〜４で作製されたプラスミドＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ、ＰＧＶ−ｐ５３ＡＩＰ１ｘ３−Ｌｕｃ、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃ、及び、ＰＧＶ−ＳＶ４０−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃを５ｎｇ／穴添加し、遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＦａｓｔ（プロメガ製）を３０ｎｌ／穴添加することにより、一過的に導入した。
【００５９】
ＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡを切断することが知られているアドリアマイシンをこの形質転換体に接触させ、ルシフェラーゼ生産量が増加するか否かを確認した。詳述すれば、得られた形質転換体細胞を４群に分け、そのうちの３群にはそれぞれ、ＤＭＳＯに溶解させたアドリアマイシンを最終０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ
、１μｇ／ｍＬになるように添加した。（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））残りの１群
にはアドリアマイシン溶液の添加量と同容量のＤＭＳＯを添加し、陰性対照とした。アドリアマイシン又はＤＭＳＯ添加後、これらの細胞を３７℃で２４時間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５倍に希釈した細胞溶解液（東洋インキ製）を２０μｌ／穴添加し、室温で１５分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド製）にセットし、１００μＬ／穴の基質液（東洋インキ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６０】
結果を図１に示す。レポータープラスミドＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ、ＰＧＶ−ｐ５３ＡＩＰ１ｘ３−Ｌｕｃ、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃ、及び、ＰＧＶ−ＳＶ４０−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃを導入した細胞において、細胞に添加されたアドリアマイシン濃度の増加に伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。このことから、上記方法と同様にして、アドリアマイシンに替えて被験物質を各試験群に添加して試験することにより、被験物質の変異原性活性を確認できることが分かる。
実施例６（安定型形質転換体の作製・変異原性試験）
野生型ｐ５３が正常であるヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞を、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用６０ｍｍシャーレ（ファルコン製＃３９１０）に約１×１０^６細胞播種し、ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ；インビトロジェン製）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％含む培地を用いて、３７℃で一晩培養した。次いで、得られた細胞に制限酵素Ａｓｐ７００とＢａｍＨＩで切断した実施例１で作製されたプラスミドＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃを３００ｎｇ添加し、遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＦａｓｔ（プロメガ製）を１．８μｌ添加することにより、培養細胞に導入した。４８時間後、細胞を１００細胞／１０ｍＬになるように調製し、細胞をルシフェラーゼ発光測定用兼培養用９６穴プレート（コーニング製＃３９１０）に約１細胞／穴ずつ播種し、ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ；インビトロジェン製）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％含む培地を用いて、３７℃で３週間培養した。これにアドリアマイシンを添加し、ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた細胞をクローニングし、安定型形質転換体ＭＣＦ−７−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ細胞を得た。
【００６１】
非形質転換体のＭＣＦ−７細胞と安定形質転換体ＭＣＦ−７−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ細胞のアドリアマイシン１μｇ／ｍＬに対するルシフェラーゼ活性を測定した。細胞は約１×１０^４細胞／穴ずつ播種し、ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ；インビトロジェン製）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％、アドリアマイシンを１μｇ／ｍＬ含む培地を用いて、３７℃で２４時間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５倍に希釈した細胞溶解液（東洋インキ製）を２０μｌ／穴添加し、室温で１５分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド製）にセットし、１００μＬ／穴の基質液（東洋インキ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６２】
結果を図２に示す。安定形質転換体であるＭＣＦ−７−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ細胞にのみ、添加したアドリアマイシンに伴うルシフェラーゼ活性の強い上昇が認められた。このことから、本安定形質転換体を用いて、アドリアマイシンに替えて被験物質を各試験群に添加して試験することにより、被験物質の変異原性活性を確認できることが分かる。
実施例７（変異原性の有無が既知である物質を用いた本発明試験法とエイムス試験との比較）
変異原性物質の有無が既に知られている被験物質を用いて、既存の変異原性試験法であるエイムス試験と本発明の変異原性試験法とを比較した。
【００６３】
エイムス試験は安衛法における変異原性試験（労働省化学物質調査課編）に記載された方法により実施した。すなわち、サルモネラティフィムリウムのヒスチジン要求性変異株ＴＡ１００株又はＴＡ９８株（財団法人発酵研究所から入手）を、ニュートリエントブロス培地に接種し、３７℃で１４〜１６時間培養した。この培養液に被験物質溶液を最終濃度が、菌の生育を阻害しない場合５０００μｇ／０．１ｍＬ、菌の生育を阻害する場合は阻害しない濃度を最高濃度から公比２の濃度間隔で４濃度になるように添加し、さらに３７℃で２０分間培養した。この菌液を希釈し、ヒスチジンを含まない合成平板培地及びヒスチジンを含む合成平板培地にそれぞれ塗布した。各平板培地を３７℃で４８時間培養し、被験物質を添加した菌株の復帰変異株の出現率を評価した。また、上記方法において、培養液に肝臓抽出液であるＳ９を添加し、肝臓代謝物の変異原性の有無も確認した。各被験物質につき２回試験を繰り返し、復帰変異株の出現率が陰性対照の２倍以上となった場合に変異原性が陽性（＋）と判定した。
【００６４】
また、アドリアマイシンに代えて被験物質を用いた他は実施例２と同様にして、本発明の変異原性試験を実施した。各被験物質は、最終の最高濃度を１００μｇ／ｍＬとし、１０倍希釈系列で最終最低濃度０．０００１μｇ／ｍＬになるように添加した。（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））残りの１群には同容量のＤＭＳＯを添加し、陰性対照とした。各被験物質につき２回試験を繰り返し、ルシフェラーゼ活性が溶媒のみを添加した陰性対照に対して１５０％以上、かつ、濃度依存的に上昇した被験物質を変異原性が陽性（＋）と判断した。
【００６５】
被験物質としては、アドリアマイシン、フリルフラミド、マイトマイシンＣ、シクロフォスファミド、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、ダウノルビシン、ベンゾ（ａ）ピレン、クエルセチン、オーラミン、ビタミンＤ３を用いた。これらの化合物は（ＤＭＳＯ）に溶解して用いた。
【００６６】
本発明の変異原性試験法及びエイムステストの結果を以下の表１に示す。また、各被験物質の国際ガン研究機関（ＩＡＲＣ：ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｅｎｃｙｆｏｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＣａｎｃｅｒ）による発ガン性の有無のデータを併記する。ＩＡＲＣのデータは、動物個体を用いた実験や疫学的調査などから得られたものである
【００６７】
【表１】

【００６８】
表１から明らかなように、本発明方法による結果はＩＡＲＣの結果と一致している。本発明方法によると、特にベンゾ（ａ）ピレンのように、エイムステストではＳ９処理による代謝活性化により始めて変異原性が確認できる物質も変異原性物質として検出できる。また、エイムステストでは陽性となるが、ＩＡＲＣデータでは発癌性が確認されていないクエルセチンは、本発明試験法では陰性を示した。また、ＩＡＲＣデータでは発ガン性物質とされているオーラミンは、エイムステストでは陰性と判定されたが、本発明方法では陽性と判定された。本発明方法は、動物個体を用いた結果とよく一致していることが分かる。
実施例８（ｐ５３結合配列繰り返し数がアドリアマイシンによるルシフェラーゼ活性上昇に与える影響）
実施例１と同様の手法でｐ５３Ｒ２遺伝子イントロンのｐ５３結合配列を１、又は２回繰り返し含むレポータープラスミドをＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ１−Ｌｕｃ，ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ２−Ｌｕｃを作成した。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７を、ルシフェラーゼ発光測定用兼培養用９６穴プレート（コーニング製＃３９１０）に約１×１０^４細胞／穴ずつ播種し、ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ；インビトロジェン製）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％含む培地を用いて、３７℃で一晩培養した。次いで、培養細胞に、制限酵素Ａｓｐ７００とＢａｍＨＩで切断したプラスミドＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ１−Ｌｕｃ（ｐ５３結合配列を１個含む）、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ２−Ｌｕｃ（ｐ５３結合配列を２個含む）、及び、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ（ｐ５３結合配列を３個含む）をそれぞれ５ｎｇ／穴づつ添加し、遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＦａｓｔ（プロメガ製）を３０ｎｌ／穴添加することにより、一過的に導入した。
【００６９】
アドリアマイシン１μｇ／ｍＬをこの形質転換体に接触させ、ルシフェラーゼ生産量が増加するか否かを確認した。詳述すれば、培養細胞を６群に分け、２群ずつを３つのプラスミドでそれぞれ形質転換し、さらに、その１群にＤＭＳＯに溶解させたアドリアマイシンを最終１μｇ／ｍＬになるように添加した。（最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））残りの１群にはアドリアマイシン溶液の添加量と同容量のＤＭＳＯを添加し、陰性対照とした。
【００７０】
アドリアマイシン又はＤＭＳＯ添加後、これらの細胞を３７℃で２４時間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５倍に希釈した細胞溶解液（東洋インキ製）を２０μｌ／穴添加し、室温で１５分間放置した。このプレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド製）にセットし、１００μＬ／穴の基質液（東洋インキ製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７１】
結果を図３に示す。レポータープラスミドＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ１−Ｌｕｃ、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ２−Ｌｕｃ、及び、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃを導入した細胞において、細胞に添加されたアドリアマイシンに伴うルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。また、ｐ５３Ｒ２由来のｐ５３結合配列の繰り返し数の増加に伴う、ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。
【００７２】
このことから、ｐ５３結合配列の繰り返し数が３回のレポータープラスミドが、アドリアマイシンに対する反応性が最も高くなることが分かる。
【００７３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の変異原性試験法において、アドリアマイシンが濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増大させることを示すグラフである。ＤＭＳＯは溶媒のみを添加した群、ＡＤＭ０．０１、ＡＤＭ０．１、ＡＤＭ１は、アドリアマイシンをそれぞれ０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ添加した群である。
【図２】本発明の変異原性試験法において発明した安定形質転換体であるＭＣＦ−７−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃ細胞について、アドリアマイシンがルシフェラーゼ活性を増大させることを示すグラフである。
【図３】本発明の変異原性試験法において、ｐ５３結合配列の繰り返し数と、アドリアマイシンによって誘導されたルシフェラーゼ活性との関係を示すグラフである。ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ１−Ｌｕｃ、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ２−Ｌｕｃ、及び、ＰＧＶ−ｐ５３Ｒ２ｘ３−Ｌｕｃは、ｐ５３Ｒ２由来のｐ５３結合配列をそれぞれ１回、２回及び３回含むプラスミドを導入した細胞を用いた群である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a mutagenicity test method for confirming the mutagenicity and thus carcinogenicity of a test substance to mammalian cells, and a recombinant vector and a transformant used in this method.
[0002]
[Prior art]
Substances contained in food and products discarded in the environmentcancerThere must be no sex. Since many mutagenic substances have carcinogenicity, it is essential to evaluate whether or not the substance to be used has mutagenicity.
[0003]
As primary screening for mutagenicity tests, Ames tests and um-tests using Salmonella are usually performed. Since these tests are directed to microorganisms, chemical substances determined to be positive for mutagenicity in these tests do not necessarily give similar results to humans. On the other hand, tests on cultured mammalian cells and tests on individual animals, such as chromosomal aberration tests and micronucleus tests, have been established as mutagenicity test methods. It takes a relatively long time to obtain.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The main object of the present invention is to provide a test method capable of accurately and simply confirming mutagenicity to mammals including humans and materials used therefor.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventor repeated research and obtained the following knowledge.
(1) A mammalian cell carrying a recombinant vector comprising a p53-binding sequence, a minimal promoter that can function in mammalian cells, and a reporter gene linked so as to be expressed by this promoter is used. By contacting a test substance and determining whether the expression level of the reporter gene changes due to contact, it is possible to accurately and easily determine whether the test substance is a mutagenic substance that damages mammalian DNA. Can be detected.
{Circle around (2)} When the p53 binding sequence contains three base sequences shown in SEQ ID NO: 2 as its consensus sequence, the mutagenic substance can be detected particularly sensitively.
[0006]
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following recombinant vector, transformant, and mutagenicity test method.
[0007]
Item 1. A recombinant vector comprising a p53 binding sequence, a minimal promoter capable of functioning in mammalian cells, and a reporter gene linked so as to be expressed by this promoter.
[0008]
Item 2. Item 2. The recombinant vector according to Item 1, wherein a p53 binding sequence, a minimal promoter, and a reporter gene are arranged in this order from the upstream side.
[0009]
Item 3. Item 2. The recombinant vector according to Item 1, wherein a minimal promoter, a p53 binding sequence, and a reporter gene are arranged in this order from the upstream side.
[0010]
Item 4. The p53 binding sequence is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (in SEQ ID NO: 1, R represents a nucleotide containing a purine base, W represents a nucleotide containing adenine or thymine, and Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base) Item 4. The recombinant vector according to Item 1, 2, or 3
[0011]
Item 5. The p53 binding sequence has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (wherein R represents a nucleotide containing a purine base, W represents a nucleotide containing adenine or thymine, and Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base). Item 4. The recombinant vector according to Item 1, 2, or 3
[0012]
Item 6. Item 6. The recombinant vector according to Item 5, wherein the p53-binding sequence has three base sequences represented by SEQ ID NO: 2.
[0013]
Item 7. Item 7. The recombinant vector according to any one of Items 1 to 6 for testing for mutagenicity.
[0014]
Item 8. Item 7. A transformant that retains the recombinant vector according to any one of Items 1 to 6.
[0015]
Item 9. Item 9. The transformant according to item 8 for mutagenicity test.
[0016]
Item 10. (1) The step of bringing the transformant according to item 8 into contact with a test substance;
(2) By comparing the expression level of the reporter gene in the transformant contacted with the test substance and the expression level of the reporter gene in the transformant not contacted with the test substance, the test substance And a step of determining whether or not the amount of expression is affected.
[0017]
Item 11. p53 binding sequence from the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (in SEQ ID NO: 1, R represents a nucleotide containing a purine base, W represents a nucleotide containing adenine or thymine, and Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base) Item 4. The recombinant vector according to Item 1, 2, or 3
[0018]
Item 12. Item 12. The recombinant vector according to Item 11, wherein the p53-binding sequence is obtained by repeating the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 three times.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(I) Recombination vector
The recombinant vector of the present invention is a vector comprising a p53 binding sequence, a minimal promoter that can function in mammalian cells, and a reporter gene linked so as to be expressed by this promoter.
p53 Associative array
p53 is a transcription factor that activates by phosphorylating a specific site when DNA is damaged by chemical substances, ultraviolet rays, gamma rays, etc., and binds to a transcriptional regulatory region of a specific gene group to regulate its transcription. is there.
[0020]
Examples of the p53-binding sequence include a DNA sequence that exists in a transcriptional regulatory region in an upstream or upstream of a target gene group whose transcriptional activity is regulated by p53 in mammalian cells when DNA damage is triggered.
[0021]
It is preferable to use a p53-binding sequence of a gene group in which activated p53 phosphorylated by DNA damage recognizes and binds to its transcriptional regulatory region to activate transcription and increase the transcription amount. Specific examples of genes whose transcription is activated by p53 include p53R2 involved in DNA repair, p21 / Waf-1 involved in cell cycle regulation, p53AIP1, Bax, p53DINP1 involved in regulation of apoptosis, and the like.
[0022]
The p53 binding DNA sequence of the gene group whose transcription is promoted by p53 in natural mammalian cells is usually a consensus sequence 5′-RRRCWWGYY-3 ′ (SEQ ID NO: 1: R represents a nucleotide having a purine base, W represents a nucleotide containing adenine or thymine, Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base, and the sequence 5′-RRRCWWGYY RRRCWWGYY-3 ′ (SEQ ID NO: 2: R represents a nucleotide having a purine base) W represents a nucleotide containing adenine or thymine, and Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base).
[0023]
Therefore, the recombinant vector of the present invention preferably contains one or more consensus sequences of SEQ ID NO: 1 as p53 binding sequences. In addition, the recombinant vector of the present invention preferably contains one or more consensus sequences of SEQ ID NO: 2 as p53 binding sequences. The recombinant vector of the present invention may contain at least one base sequence in which about 1 to 2 nucleotides are substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 2 as a p53 binding sequence.
[0024]
More preferably, the recombinant vector of the present invention contains about 3 base sequences in which up to several nucleotides are substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 2 or the base sequence of SEQ ID NO: 2 as the p53 binding sequence. When two or more consensus sequences of SEQ ID NO: 2 are included, they may be directly linked, and about 1 to 20 nucleotides may be sandwiched between them.
[0025]
In natural mammalian cells, intron 1 of p53R2 contains 5′-TGACATGCCCAGGGCATGTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 3 Nature, 404, 42-49 (2000)), and 5 ′ in Bax intron 1. -GGGCAGGCCCGGGCTTGTCG-3 '(SEQ ID NO: 4: Oncogene, 21, 990-999 (2002)) is present, and p53AIP1 intron 1 is 5'-TCTCTTGCCCGGGGTTGTCG-3' (SEQ ID NO: 5: Cell, 2108, 4928) (2000)) and 5'-GAACTTGGGGGAACATGTTT-3 '(SEQ ID NO: 6: Mol. Cell, 8, 85-94 (2001)) is present in intron 2 of p53DINP1. 5'-GAACATGTCCCAACATGTTG-3 '(SEQ ID NO: 7: Cell, 75, 817-825 (1993)) exists upstream of p21 / Waf-1.
[0026]
As the p53 binding sequence in the recombinant DNA of the present invention, a sequence containing at least one base sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7 (particularly the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 5) can be preferably used. Further, if it corresponds to the base sequence of base number 2, it is a sequence containing one or more base sequences in which about 1 to 3 nucleotides are substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7. May be. In particular, a sequence containing three base sequences of SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7 (particularly the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 5) is preferable. Further, when a plurality of base sequences of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6 or 7 are included, these may be included in combination. As such an example, for example, a base sequence in which the sequence of SEQ ID NO: 3, the sequence of SEQ ID NO: 4 and the sequence of SEQ ID NO: 5 are linked can be mentioned.
[0027]
A DNA sequence containing a consensus sequence can be chemically synthesized, or can be prepared by amplifying and cloning by PCR using primers designed based on the above consensus sequence using a mammalian chromosomal DNA as a template.
[0028]
In the recombinant vector of the present invention, a p53 binding sequence of a gene group whose transcription amount is reduced by p53 binding can also be used.
[0029]
In the recombinant vector of the present invention, a binding sequence of another transcription factor activated by DNA damage can be used instead of the p53 binding sequence. That is, transcription factor binding sequences of other target genes whose transcriptional activity is regulated by DNA damage in mammalian cells can also be used. Examples of such target genes include ATM or ATR which are kinase proteins. ATM is a kinase that phosphorylates p53 in response to DNA damage. Therefore, a transcription factor binding sequence existing in the upstream region of the ATM gene can be used instead of the p53 binding sequence. ATR is a kinase that phosphorylates p53 mainly in response to DNA damage caused by ultraviolet rays. Therefore, a transcription factor binding sequence existing in the upstream region of the ATM gene can be used in place of the p53 binding sequence.
Minimal promoter
The minimum promoter that can be expressed in mammalian cells is also called a core promoter, and is usually a region found in a relatively narrow portion near the transcription start site of a gene. In addition, the minimal promoter is a main functional element involved in transcriptional regulation, and does not contain other functional elements involved in transcriptional regulation such as recognition sequences of other transcriptional regulatory factors, or such functionality. Even if it contains an element, it is a sequence that does not substantially change the transcriptional regulatory function of the p53 binding sequence and minimal promoter.
[0030]
The recombinant vector of the present invention can be used without limitation any known mammalian minimal promoter. Examples of the base sequence of such a minimal promoter include a TATA box, which is a DNA region involved in determining the transcription start site by RNA polymerase II and maintaining the minimum transcription level, and a base sequence near the transcription start point, Specifically, for example, the base sequence of the 5 ′ upstream region of the mouse metallothionein I gene (Genbank Accession No. J00605), the base sequence of the 5 ′ upstream region of the chicken ovalbumin gene (Genbank accession No. J00895), herpes simplex virus (HSV) -derived thymidine kinase (tk) gene 5 ′ upstream region base sequence (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1441-1445 (1981)), Simian virus (SV40) minimal pro Ta, and the like. These minimal promoter sequences are preferably used as the minimal promoter in the recombinant vector of the present invention. In addition, DNA sequences in which about 1 to several nucleotides are added, deleted or substituted in these DNA sequences can be used as long as they function as a minimal promoter in mammalian cells.
[0031]
In addition, the recombinant vector of the present invention may contain a broader promoter region including the minimal promoter as long as the transcriptional control function by the p53 binding sequence and the minimal promoter is not essentially changed.
[0032]
DNA comprising these sequences can be prepared by chemical synthesis based on the base sequence.
Reporter gene
In the present invention, the reporter gene refers to a gene that can qualitatively or quantitatively confirm the expression of the gene. As the reporter gene, for example, known reporter genes can be widely used. In particular, a gene capable of measuring the expression level based on the enzyme activity or the like of the transcription product (reporter protein) is preferable because the expression level can be easily measured. Examples of such a reporter gene include firefly luciferase and Renilla. Genes encoding enzyme proteins such as luciferase, β-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, alkaline phosphatase, β-glucuronidase, genes encoding luminescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) Can be mentioned.
[0033]
As these reporter genes, commercially available reporter plasmids may be used.
Cell selectable marker gene
The recombinant vector of the present invention may contain a cell selection marker gene that can function in mammalian cells so that the retention of the recombinant vector in the cells can be confirmed. A “cell selection marker gene” is a gene that encodes a phenotype that can serve as a mark when distinguishing between cells transformed with DNA containing the gene and non-transformed cells. “Functional in animal cells” means that the trait can be expressed in animal cells, and “genes capable of functioning in animal cells” mean that under the control of a promoter capable of initiating transcription in animal cells. It means a gene that is in a state that can be expressed in animal cells.
[0034]
Examples of cell selectable marker genes that are effective in animal cells include genes that can confer resistance to drugs that suppress or inhibit the growth of animal cells. Specific examples include a neomycin resistance-conferring gene (aminoglycoside phosphotransferase gene), a hygromycin resistance-conferring gene (hygromycin phosphotransferase gene), and a blasticidin S resistance-conferring gene (blastcidin S deaminase gene). A blasticidin S resistance-conferring gene is preferable in that selection of transformed cells can be performed in a shorter period of time.
Constitution
In the recombinant vector of the present invention, a reporter gene is linked to the downstream of a transcriptional regulatory region containing a p53 binding sequence and a minimal promoter so that it can be expressed. Either the transcription factor binding sequence or the minimal promoter may be present upstream.
[0035]
About 1 to several nucleotides may be present between the p53 binding sequence and the minimal promoter. Further, between the transcriptional regulatory region including the p53 binding sequence and the minimal promoter and the reporter gene, about 1 to several nucleotides may be present within a range in which the reporter gene can be expressed.
[0036]
In order to obtain such a vector, the recombinant vector of the present invention uses a commercially available expression vector for mammalian cells having a minimal promoter and a gene insertion site downstream thereof, and a p53 binding sequence and a reporter gene are inserted into this vector. It is good to have done. Examples of such commercially available mammalian expression vectors include pUC18 and pUC19. In addition, as described above, the recombinant vector of the present invention can be one in which a p53 binding sequence is inserted into a vector marketed as a commercially available reporter plasmid. Examples of commercially available reporter plasmids include luciferase plasmids pT81lu, pSluc2, pGL3, and the like.
[0037]
The recombinant vector of the present invention is preferably a compact size in that it is easy to handle, and the frequency of gene recombination within a vector molecule or between molecules or dropout from a chromosome in a stably transformed cell is reduced. For example, the size is preferably about 2 to 10 kb.
[0038]
The recombinant vector of the present invention can be suitably used as a cell for a mutagenicity test described later.
(II) Transformant
The transformant of the present invention is a cell that holds the above-described recombinant vector of the present invention. The transformant of the present invention may temporarily hold the recombinant vector or may stably hold it.
cell
In preparing the transformant, the host cell into which the recombinant vector is introduced is not particularly limited. As a host cell, a mammalian cell in which wild-type p53 is expressed and functions normally can be used. However, even if an abnormal cell has reduced, defective or mutated p53 function, the wild-type p53 gene If p53 is expressed by separately introducing p53, it can be used. In addition, even in the case of cells expressing wild type p53, if the expression level is low or the promoter activity in the recombinant vector is too weak, the wild type p53 gene is additionally introduced to express the p53 gene. What is necessary is just to use it, increasing the quantity.
[0039]
In view of ease of operation, reproducibility, and the like, an established cell line that can be stably passaged is preferable. Such cell lines are not particularly limited and known ones can be used. Examples of established cell lines that normally express P53 and can be stably passaged include human-derived cells such as human breast cancer-derived MCF-7 cells, human lymphocyte-derived TK6 cells, and human liver cancer cells HepG2; mice NIH3T3 cells that are fibroblasts; Vero cells derived from African green monkey kidney, COS-7 cells; CHO cells derived from Chinese hamsters, and the like. In particular, it is preferable to use human-derived cells in that the relationship between DNA damage in humans and p53 activation can be reproduced and the mutagenicity of the test substance to human cells can be accurately evaluated. All of the above cultured cells can be obtained from American Type Culture Collection (ATCC). However, when using these cells, it is preferable to confirm beforehand by DNA sequencing that the cells express wild-type p53.
Transformation method
In preparation of the transformant, the recombinant vector of the present invention may be transiently or stably introduced into the host cell. It is preferable to introduce stably because it is not necessary to consider the transformation rate.
[0040]
Vector introduction methods are already well known. Specifically, for example, first, 10⁵-10⁷Cell host cells are seeded on a petri dish having a diameter of about 6 to 10 cm, and 5% CO is used by using a MEM medium containing about 5 to 10% serum.₂In addition, it can be cultured for several hours to overnight at 37 ° C. under saturated humidity conditions. What is necessary is just to introduce | transduce the said DNA into the cell cultured in this way. It is desirable that the purity of the DNA introduced into the host cell is almost equivalent to that of the plasmid DNA purified by CsCl density gradient centrifugation.
[0041]
As the DNA introduction method, general methods such as electroporation, calcium phosphate, and lipofection can be used without limitation. When a vector is introduced by these methods, the expression vector is usually in a state where it can be expressed transiently. Therefore, the transformant may be subjected to a mutagenicity test immediately after DNA introduction. In addition, in order to select cells in which the expression vector is stably expressed, host cells into which the recombinant vector has been appropriately introduced can be selected after the introduction of the vector using the drug resistance or activation of the reporter gene by a positive control substance as an indicator. Just choose. Here, a cell in which the luciferase activity is recognized at least twice the basal level when a positive control substance is added is regarded as a cell in which the reporter gene is activated.
[0042]
The transformant of the present invention can be suitably used as a cell to be subjected to a mutagenicity test described later.
(III) Mutagenicity test method
The mutagenicity test method of the present invention comprises:
(1) a step of bringing the transformant of the present invention described above into contact with a test substance;
(2) By comparing the expression level of the reporter gene in the transformant contacted with the test substance and the expression level of the reporter gene in the transformant not contacted with the test substance, the test substance And determining whether or not it affects the expression level.
Test substance
The type of test substance is not particularly limited. In addition to a low molecular compound, a high molecular compound, etc., for example, it may be a mixture of a plurality of types of substances such as foods, processed foods, wastes, and waste incinerators.
Process (1)
In bringing the transformant of the present invention into contact with the test substance, first, the transformant is seeded in a cell culture vessel and cultured for about 8 hours to overnight. The culture temperature may be a temperature suitable for the cell, and usually about 37 ° C. The culture solution is not particularly limited, and a culture solution suitable for cells may be used. The number of cells is not particularly limited. For example, when a 96-well plate is used, 1 × 10 per well is usually used.⁴About one cell may be seeded.
[0043]
Next, a test substance is added to the cell culture medium. The test substance is added as it is or dissolved in a solvent. As the solvent, for example, distilled water, a buffer solution such as PBS (−) that does not affect the cells, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol, or the like can be used. The test substance may be added so that the final concentration in the cell culture solution is usually about 0.1 to 1% by weight. In the case of processed foods, add 10% by volume or less mixed with a buffer solution such as PBS (-) that does not affect cells, or extract the test substance with an organic solvent such as methanol. The concentrated product may be added so that the final concentration is usually about 0.1 to 1% by weight. When the test substance is dissolved in a solvent and added, the solvent is added to the culture medium of the control transformant in the same amount as that of the test substance solution.
[0044]
After adding the test substance to the cell culture medium, the culture is continued usually in the same temperature range as above for about 12 to 72 hours, preferably about 24 to 48 hours.
Process (2)
Thereafter, the expression level of the reporter gene is compared between the transformant contacted with the test substance and the transformant not contacted. In comparison, the expression level of the reporter gene in both cells can be measured, and both measured values can be compared, or the reporter gene expression level in both cells can be directly qualitatively compared visually. .
[0045]
When comparing each measured reporter gene expression level, the expression level of each reporter gene may be measured by a method according to the type of reporter gene. For example, when the reporter gene is a firefly luciferase gene, each cell is washed with PBS (−) or the like, then a cell lysing agent containing a surfactant is added to lyse the cell, and luciferin, which is a luciferase substrate, is added to the cell. The luciferase activity can be measured by adding to the lysate and quantifying the amount of luminescence due to the decomposition of luciferin using a luminometer.
[0046]
The reporter assay can be performed manually, but by using so-called high-throughput screening (tissue culture engineering, vol. 123, No. 13, 521-524, US Pat. No. 5,670, 113) that is automatically performed using a machine. It can be performed quickly and easily.
[0047]
When using a p53 binding sequence of a gene group whose transcription is activated by p53, a reporter gene per cell of the transformant contacted with the test substance
When the expression level is 150% or more, preferably 200% or more, compared to the expression level of the reporter gene per cell of the transformant that is not contacted, the test substance is a mutagenic substance or a carcinogenic substance. It can be determined that there is.
[0048]
In addition, when a p53 binding sequence of a gene group whose transcription is suppressed by p53 is used, the reporter gene expression level per cell of the transformant contacted with the test substance is not the contact reporter per cell of the transformant. For example, when it is 70% or less, preferably 50% or less, compared to the gene expression level, it can be determined that the test substance is a mutagenic substance or a carcinogenic substance.
[0049]
In the method of the present invention, an antimutagenic substance or an anticarcinogenic substance can also be selected by bringing a transformant into contact with a test substance together with a known mutagenic substance. That is, the reporter gene expression level of the control transformant, the expression level of the reporter gene of the transformant contacted only with the mutagenic substance, and the reporter gene of the transformant contacted with the mutagenic substance and the test substance When the amount of change in reporter gene expression due to contact with the mutagenic substance is reduced by, for example, 10%, preferably 50% by further contacting with the test substance, the test substance is compared with the expression level. It can be determined that the substance is an antimutagenic substance or anticarcinogenic substance. Examples of such substances include antioxidant substances.
[0050]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the test method which can confirm the mutagenicity with respect to mammals including a human correctly and simply, and the material used therefor were provided.
[0051]
Furthermore, since the mutagenicity test method of the present invention does not directly evaluate phenotypic changes due to DNA damage but evaluates biological reactions due to DNA damage, it can detect DNA damage with high sensitivity. .
[0052]
In addition, the method of the present invention uses a reaction system against DNA damage in mammalian cells such as humans, rather than using microorganisms as in the conventional mutagenicity test. It accurately reflects gender.
[0053]
In addition, the method of the present invention is a rapid method that can be easily performed in vitro and only measures the amount of reporter gene product after contacting a test substance with cells.
[0054]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a test example are shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these Examples.
Example 1 (Production of recombinant vector)
A nucleotide sequence (5′-CTGACATGCCCAGGCATGTTCTTGACATGCCCAGGCATGTCCTGGACATGCCCAGGCCATGTTCTA-3 ′: SEQ ID NO: 8) containing a p53-binding sequence of a p53R2 gene intron expressed by DNA damage, and a complementary base sequence (5 ′) -Oligonucleotides consisting of GATCTAGACATGCCCTGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGGCATGTCAGGTAC-3 ': SEQ ID NO: 9) were each synthesized by a DNA synthesizer and annealed to form double-stranded DNA.
[0055]
After digesting the firefly luciferase gene and plasmid PGV-P2 (manufactured by Toyo Ink) containing the SV40 minimal promoter with restriction enzymes KpnI and BglII, electrophoresis was performed using low melting point agarose (NuSieve 3: 1 Agarose; manufactured by BMA). The target 4974 bp DNA was recovered from the gel in the band part. About 30 ng of this DNA was mixed with 1 ng of DNA containing the above-mentioned p53-binding sequence three times, and combined with T4 ligase (DNA Ligation kit; manufactured by TaKaRa), and then this reaction solution was E. coli JM109 competent cell (TaKaRaRa). ). From several colonies of Escherichia coli that showed ampicillin resistance, the DNA of the respective plasmids was purified with Plasmid Mini kit (manufactured by QIAGEN), and the DNA sequence (ABI Prism was used) using RV3 primer and GL2 primer (both manufactured by Promega). BigDye Terminator v3.0; manufactured by Applied Biosystems). The reporter plasmid in which the p53 binding sequence was correctly inserted was named PGV-p53R2x3-Luc.
Example 2 (Preparation of recombinant vector; p53 Repertoire of binding sequences; p53AIP1 Origin p53 Preparation of reporter plasmid containing binding sequence)
Oligonucleotide consisting of a base sequence (5′-CTCTCTTGCCCCGGGCTTGTCGTCCTCTTGCCCGGGCTTTGCCCCGGCTTTGTCGA-3 ′: SEQ ID NO: 10) and a base sequence complementary to this base sequence 5 (the sequence number is 10 ′) and the p53 binding sequence of the p53AIP1 gene intron expressed by DNA damage -Oligonucleotides consisting of GATCTCGACAAGCCCCGGGGCAAGAGACGACAAGCCCGGGCAAGAGACGACAAGCCCCGGGCAAGAGAGGTAC-3 ': SEQ ID NO: 11) were respectively synthesized by a DNA synthesizer, and annealed to form double-stranded DNA.
[0056]
After digesting the firefly luciferase gene and plasmid PGV-P2 (manufactured by Toyo Ink) containing the SV40 minimal promoter with restriction enzymes KpnI and BglII, electrophoresis was performed using low melting point agarose (NuSieve 3: 1 Agarose; manufactured by BMA). The target 4974 bp DNA was recovered from the gel in the band part. About 30 ng of this DNA and 1 ng of DNA containing the above-mentioned p53 binding sequence 3 times were mixed and ligated with T4 ligase (DNA Ligation kit; manufactured by TaKaRa), and then this reaction solution was E. coli JM109 competent cell (TaKaRaRa). ). From several colonies of Escherichia coli that showed ampicillin resistance, the plasmid DNA retained was purified with Plasmid Mini kit (manufactured by QIAGEN), and the DNA sequence was confirmed using RV3 primer and GL2 primer. The reporter plasmid in which the p53 binding sequence was correctly inserted was named PGV-p53AIP1x3-Luc.
Example 3 (Production of recombinant vectors; promoter repertoire; tk Preparation of a reporter plasmid containing a minimal promoter)
Using the plasmid pRL-tk (manufactured by Toyo Ink) containing the herpesvirus-derived thymidine kinase promoter as a template, the minimal region of the herpesvirus-derived thymidine kinase promoter (Genbank Accession No. M15234) is used as a forward primer (5'-GATCTAGAAAATTATTTGTTGTTGATTGTTATTG) : SEQ ID NO: 12) and a reverse primer (5′-GCCAAGCTTTTAAGCGG-3 ′: SEQ ID NO: 13). The PCR reaction uses TaKaRa Ex Taq, DNA polymerase attached to this enzyme, reaction buffer solution, dNTP, pRL-tk 100 ng as a template, and 10 pmol each of the above primers are mixed to give a reaction solution volume of 50 μl, 95 The temperature was kept at 20 ° C. for 20 seconds, then at 59 ° C. for 20 seconds, and at 68 ° C. for 30 seconds. This PCR product was inserted into the cloning plasmid TOPO using TOPO TA Cloning Kits (manufactured by Invitrogen), and then inserted into the competent cell One Shot attached to the kit. The plasmid DNA retained from several colonies of Escherichia coli that showed ampicillin resistance was purified with Plasmid Mini kit, digested with restriction enzymes BglII and HindIII, and subjected to electrophoresis using low melting point agarose. The desired 181 bp DNA was recovered from the gel and named the tk minimal promoter. The reporter plasmid PGV-p53R2x3-Luc prepared in Example 1 was digested with restriction enzymes BglII and HindIII, and then subjected to electrophoresis using a low melting point agarose to recover the desired 4832 bp DNA from the gel in the band part.
About 3 ng of this DNA and 10 ng of the tk minimal promoter DNA were mixed and ligated with T4 ligase, and then this reaction solution was introduced into E. coli JM109 competent cells. Plasmid DNA possessed from several colonies of Escherichia coli showing ampicillin resistance was purified with Plasmid Mini kit (manufactured by QIAGEN), and the DNA sequence was confirmed using RV3 primer and GL2 primer. The reporter plasmid in which the tk minimal promoter sequence was correctly inserted was named PGV-p53R2x3-tk-Luc.
Example 4 (Preparation of recombinant vector; p53 Create a reporter plasmid with the binding sequence and promoter sequence replaced
A nucleotide sequence (5′-AGCTTTGACATGCCCAGGGCATGTCTTGACATGCCCAGGCATGTCCTGGACATGCCCAGGCATGTTCTA-3 ′: SEQ ID NO: 14) containing a p53 binding sequence of a p53R2 gene intron expressed by DNA damage, and a complementary nucleotide sequence to this base sequence 5 -AGCTAGGACATGCCTGGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGGCATGTCAAGACATGCCTGGGGCATGTCAA-3 ': SEQ ID NO: 15) was synthesized with a DNA synthesizer, annealed to form double-stranded DNA, and T4 polynucleotide kinase (TaKaRa Phosphorus 5') Oxidized.
[0057]
Plasmid PGV-P2 (manufactured by Toyo Ink) containing firefly luciferase gene and SV40 minimal promoter was digested with restriction enzyme HindIII, dephosphorylated with alkaline phosphatase (TaKaRa), and then subjected to electrophoresis using low melting point agarose The target 5010 bp DNA was recovered from the gel of the band part. About 3 ng of this DNA was mixed with 10 ng of phosphorylated DNA containing the above-mentioned p53-binding sequence three times, and combined with T4 ligase (DNA Ligation kit; manufactured by TaKaRa), and then this reaction solution was E. coli JM109 competent cell. Introduced. Plasmid DNA from each of several colonies of Escherichia coli that showed ampicillin resistance was purified with Plasmid Mini kit (manufactured by QIAGEN), and the DNA sequence was confirmed using RV3 primer and GL2 primer (both manufactured by Promega). . The reporter plasmid in which the p53 binding sequence was correctly inserted was named PGV-SV40-p53R2x3-Luc.
Example 5 (Production of transient transformants / mutagenicity test)
The use of 5′-ACACCGCTCCCTGGATTG-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and 5′-CTGTCAGTGGGGAACAAGAAGTGGAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 17) as sequencing primers to confirm that the wild type p53 of human breast cancer cell line MCF-7 is normal. DNA sequence (ABI Prism BigDye Terminator v3.0; manufactured by Applied Biosystems) was confirmed.
[0058]
The cells were placed in a 96-well plate for luciferase luminescence measurement and culture (Corning # 3910) at about 1 × 10 × 10.⁴Cells / well were seeded and cultured overnight at 37 ° C. using a medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in MEM medium (GIBCO; manufactured by Invitrogen). Next, the plasmids PGV-p53R2x3-Luc, PGV-p53AIP1x3-Luc, PGV-p53R2x3-tk-Luc and PGV-SV40-p53R2x3-Luc prepared in Examples 1 to 4 were added to the cultured cells at 5 ng / hole. Then, the gene introduction reagent TransFast (manufactured by Promega) was added at a rate of 30 nl / hole, and then introduced transiently.
[0059]
Adriamycin, which is known to intercalate with DNA and cleave DNA, was brought into contact with this transformant, and it was confirmed whether or not the amount of luciferase production increased. More specifically, the obtained transformant cells were divided into 4 groups, of which 3 groups each had adriamycin dissolved in DMSO at a final concentration of 0.01 μg / mL and 0.1 μg / mL.
1 μg / mL was added. (Final DMSO concentration 0.1% (v / v)) remaining 1 group
The same amount of DMSO as that of the adriamycin solution was added to serve as a negative control. After addition of adriamycin or DMSO, these cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours. Next, the medium was removed, and the cells were washed twice with PBS (−), and then 20 μl / well of a cell lysate diluted 5 times (Toyo Ink) was added and left at room temperature for 15 minutes. This plate was set in a luminometer LB96P (manufactured by Berthold) equipped with an enzyme substrate automatic injector, and 100 μL / well of substrate solution (manufactured by Toyo Ink) was automatically dispensed to measure luciferase activity.
[0060]
The results are shown in FIG. Luciferase activity accompanying increase in the concentration of adriamycin added to cells in cells transfected with reporter plasmids PGV-p53R2x3-Luc, PGV-p53AIP1x3-Luc, PGV-p53R2x3-tk-Luc, and PGV-SV40-p53R2x3-Luc An increase was observed. From this, it can be seen that the mutagenic activity of the test substance can be confirmed by adding the test substance to each test group in place of adriamycin and testing in the same manner as in the above method.
Example 6 (Production of stable transformant / mutagenicity test)
The human breast cancer cell line MCF-7 cells in which wild-type p53 is normal are about 1 × 10 6 in a 60 mm petri dish (Falcon # 3910) for luciferase luminescence measurement and culture.⁶The cells were seeded and cultured overnight at 37 ° C. using a medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in MEM medium (GIBCO; manufactured by Invitrogen). Next, 300 ng of the plasmid PGV-p53R2x3-Luc prepared in Example 1 cleaved with restriction enzymes Asp700 and BamHI was added to the obtained cells, and 1.8 μl of gene introduction reagent TransFast (manufactured by Promega) was added. It was introduced into cultured cells. After 48 hours, the cells were prepared to 100 cells / 10 mL, and the cells were seeded at about 1 cell / well in a 96-well plate for luciferase luminescence measurement and culture (Corning # 3910), and MEM medium (GIBCO; Invitrogen) was cultured at 37 ° C. for 3 weeks using a medium containing fetal bovine serum (FBS) at a final concentration of 10%. Adriamycin was added thereto, and a cell in which an increase in luciferase activity was observed was cloned to obtain a stable transformant MCF-7-p53R2x3-Luc cell.
[0061]
The luciferase activity of 1 μg / mL of adriamycin in non-transformed MCF-7 cells and stable transformant MCF-7-p53R2x3-Luc cells was measured. About 1 × 10 cells⁴Cells / well were seeded, and cultured in a MEM medium (GIBCO; manufactured by Invitrogen) using a medium containing fetal bovine serum (FBS) at a final concentration of 10% and adriamycin 1 μg / mL at 37 ° C. for 24 hours. Next, the medium was removed, and the cells were washed twice with PBS (−), and then 20 μl / well of a cell lysate diluted 5 times (Toyo Ink) was added and left at room temperature for 15 minutes. This plate was set in a luminometer LB96P (manufactured by Berthold) equipped with an enzyme substrate automatic injector, and 100 μL / well of substrate solution (manufactured by Toyo Ink) was automatically dispensed to measure luciferase activity.
[0062]
The results are shown in FIG. Only in the stable transformant MCF-7-p53R2x3-Luc cells, a strong increase in luciferase activity associated with the added adriamycin was observed. From this, it can be seen that the mutagenic activity of the test substance can be confirmed by using this stable transformant and adding the test substance to each test group instead of adriamycin for testing.
Example 7 (Comparison between the test method of the present invention using a substance whose mutagenicity is known and the Ames test)
Using a test substance whose presence or absence of a mutagenic substance is already known, the Ames test, which is an existing mutagenicity test method, was compared with the mutagenicity test method of the present invention.
[0063]
The Ames test was carried out by the method described in the mutagenicity test (edited by the Ministry of Labor, Chemical Substances Research Division) in the Japanese Industrial Safety and Health Act. That is, Salmonella typhimurium histidine-requiring mutant strain TA100 or TA98 (obtained from the Fermentation Research Institute) was inoculated into a nutrient broth medium and cultured at 37 ° C. for 14 to 16 hours. The final concentration of the test substance solution in this culture solution is 5000 μg / 0.1 mL when the growth of the fungus is not inhibited, and the concentration that is not inhibited when the growth of the fungus is inhibited is increased from the highest concentration to 4 with a concentration interval of a common ratio of 2. And further incubated at 37 ° C. for 20 minutes. This bacterial solution was diluted and applied to a synthetic plate medium containing no histidine and a synthetic plate medium containing histidine, respectively. Each plate medium was cultured at 37 ° C. for 48 hours, and the appearance rate of revertants of the strain to which the test substance was added was evaluated. In the above method, S9, which is a liver extract, was added to the culture solution, and the presence or absence of mutagenicity of the liver metabolite was also confirmed. The test was repeated twice for each test substance, and the mutagenicity was determined to be positive (+) when the appearance rate of the revertant strain was more than twice that of the negative control.
[0064]
Further, the mutagenicity test of the present invention was performed in the same manner as in Example 2 except that the test substance was used instead of adriamycin. Each test substance was added so that the final maximum concentration was 100 μg / mL and the final minimum concentration was 0.0001 μg / mL in a 10-fold dilution series. (Final DMSO concentration 0.1% (v / v)) The remaining group was added with the same volume of DMSO as a negative control. The test was repeated twice for each test substance, and a test substance whose luciferase activity was increased by 150% or more with respect to the negative control to which only the solvent was added and increased in a concentration-dependent manner was judged to be positive (+).
[0065]
As test substances, adriamycin, furylfuramide, mitomycin C, cyclophosphamide, 4-nitroquinoline-N-oxide, daunorubicin, benzo (a) pyrene, quercetin, auramine, vitamin D3 were used. These compounds were used by dissolving in (DMSO).
[0066]
The results of the mutagenicity test method and Ames test of the present invention are shown in Table 1 below. In addition, data on the presence or absence of carcinogenicity of each test substance by the International Agency for Research on Cancer (IARC) is also shown. IARC data was obtained from experiments using animals and epidemiological studies.
[0067]
[Table 1]

[0068]
As is clear from Table 1, the results of the method of the present invention are consistent with the results of IARC. According to the method of the present invention, a substance that can be confirmed mutagenic only by metabolic activation by S9 treatment, such as benzo (a) pyrene, can be detected as a mutagenic substance. Further, quercetin, which was positive in the Ames test but not confirmed to be carcinogenic in the IARC data, was negative in the test method of the present invention. Auramine, which is a carcinogenic substance in IARC data, was determined to be negative in the Ames test, but was determined to be positive in the method of the present invention. It can be seen that the method of the present invention is in good agreement with the results using animal individuals.
Example 8 ( p53 Effect of binding sequence repeat number on luciferase activity increase by adriamycin)
PGV-p53R2x1-Luc and PGV-p53R2x2-Luc were prepared as reporter plasmids containing the p53R2 gene intron p53 binding sequence one or two times in the same manner as in Example 1. The human breast cancer cell line MCF-7 was placed in a 96-well plate for luciferase luminescence measurement and culture (Corning # 3910) at about 1 × 10⁴Cells / well were seeded and cultured overnight at 37 ° C. using a medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in MEM medium (GIBCO; manufactured by Invitrogen). Then, the cultured cells were subjected to plasmids PGV-p53R2x1-Luc (containing one p53 binding sequence), PGV-p53R2x2-Luc (containing two p53 binding sequences) and PGV-p53R2x3 cut with restriction enzymes Asp700 and BamHI. -Luc (including 3 p53 binding sequences) was added in an amount of 5 ng / well each, and a gene transfer reagent TransFast (manufactured by Promega) was added at 30 nl / hole to introduce it transiently.
[0069]
Adriamycin 1 μg / mL was brought into contact with this transformant, and it was confirmed whether or not the luciferase production amount increased. Specifically, the cultured cells were divided into 6 groups, and 2 groups were each transformed with 3 plasmids. Adriamycin dissolved in DMSO was added to 1 group so that the final concentration was 1 μg / mL. (Final DMSO concentration 0.1% (v / v)) To the remaining one group, DMSO having the same volume as the adriamycin solution was added to serve as a negative control.
[0070]
After addition of adriamycin or DMSO, these cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours. Next, the medium was removed, and the cells were washed twice with PBS (−), and then 20 μl / well of a cell lysate diluted 5 times (Toyo Ink) was added and left at room temperature for 15 minutes. This plate was set in a luminometer LB96P (manufactured by Berthold) equipped with an enzyme substrate automatic injector, and 100 μL / well of substrate solution (manufactured by Toyo Ink) was automatically dispensed to measure luciferase activity.
[0071]
The results are shown in FIG. In the cells into which the reporter plasmids PGV-p53R2x1-Luc, PGV-p53R2x2-Luc, and PGV-p53R2x3-Luc were introduced, an increase in luciferase activity accompanying adriamycin added to the cells was observed. In addition, an increase in luciferase activity was observed with an increase in the number of repeats of the p53R2-derived p53 binding sequence.
[0072]
This shows that the reporter plasmid having 3 repeats of the p53 binding sequence has the highest reactivity with adriamycin.
[0073]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing that adriamycin increases luciferase activity in a concentration-dependent manner in the mutagenicity test method of the present invention. DMSO is a group to which only a solvent is added, ADM 0.01, ADM 0.1, and ADM 1 are groups to which adriamycin is added at 0.01 μg / mL, 0.1 μg / mL, and 1 μg / mL, respectively.
FIG. 2 is a graph showing that adriamycin increases luciferase activity in MCF-7-p53R2x3-Luc cells, which are stable transformants invented in the mutagenicity test method of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the number of repeated p53 binding sequences and the luciferase activity induced by adriamycin in the mutagenicity test method of the present invention. PGV-p53R2x1-Luc, PGV-p53R2x2-Luc, and PGV-p53R2x3-Luc are groups using cells introduced with plasmids containing p53R2-derived p53 binding sequences once, twice and three times, respectively.

Claims

A recombinant vector comprising a p53 binding sequence, a minimal promoter capable of functioning in mammalian cells, and a reporter gene linked so as to be expressed by the minimal promoter.

The recombinant vector according to claim 1, wherein a p53 binding sequence, a minimal promoter, and a reporter gene are arranged in this order from the upstream side.

The recombinant vector according to claim 1, wherein a minimal promoter, a p53 binding sequence, and a reporter gene are arranged in this order from the upstream side.

The p53 binding sequence is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (in SEQ ID NO: 1, R represents a nucleotide containing a purine base, W represents a nucleotide containing adenine or thymine, and Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base) The recombinant vector according to claim 1, 2 or 3.

The p53 binding sequence has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (wherein R represents a nucleotide containing a purine base, W represents a nucleotide containing adenine or thymine, and Y represents a nucleotide containing a pyrimidine base). The recombinant vector according to claim 1, 2 or 3.

The recombinant vector according to claim 5, wherein the p53-binding sequence has three base sequences shown in SEQ ID NO: 2.

The recombinant vector according to any one of claims 1 to 6 for mutagenicity test.

A transformant carrying the recombinant vector according to any one of claims 1 to 6.

The transformant according to claim 8 for mutagenicity test.

(1) a step of bringing the transformant according to claim 8 into contact with a test substance;
(2) By comparing the expression level of the reporter gene in the transformant contacted with the test substance and the expression level of the reporter gene in the transformant not contacted with the test substance, the test substance And a step of determining whether or not the amount of expression is affected.