JP2004537497A

JP2004537497A - 疼痛を阻害するための方法

Info

Publication number: JP2004537497A
Application number: JP2002540626A
Authority: JP
Inventors: タレクエイ．サマド; クリフォードジェイ．ウルフ; リュ−ロンジ
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2004-12-16
Also published as: US20080026003A1; EP1361897A4; WO2002038035A3; EP1361897A2; AU2002228911A1; WO2002038035A2

Abstract

本発明は、疼痛を治療および予防する方法を提供する。また、本発明は、化合物が哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を阻害するか否かを判定するためのスクリーニング方法を提供する。

Description

【０００１】
連邦政府により助成された研究についての声明
本発明は、米国国立衛生研究所からの助成金、ＮＳ３８２５３−０１およびＮＳ４０６９８、を受けたものである。本発明において、米国政府は一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
一般的に、本発明は、哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を阻害することにより疼痛を治療または予防する方法に関する。
【０００３】
炎症は、心的外傷、血液供給の欠如、出血、異物、化学薬品、刺激剤、アレルゲン、電気、熱、寒さ、微生物、外科的手術または電離放射線による損傷等の組織損傷に対して生じる。炎症は、傷害の部位における過敏症（一次性痛覚過敏症）、隣接する非外傷組織における過敏症（二次性痛覚過敏症）、および、広汎性疼痛を含む疼痛に関連している。一次性痛覚過敏症は、侵害受容器末端の閾値の低下により引き起され、末梢感作と呼ばれる。炎症部位においてシクロオキシゲナーゼ（Ｃｏｘ）により生産されるプロスタノイドは、ＰＫＡが媒介する侵害受容器末端内ナトリウムチャネルのリン酸化により、末梢感作の発生に寄与する。このリン酸化は、侵害受容器末端の興奮性を高め、疼痛閾値を低下させる。二次性痛覚過敏症は、脊髄内のニューロンの興奮性が高まることにより引き起され、中枢感作と呼ばれる。あまり解明されていない広汎性疼痛は、例えば、インフルエンザ様症状に特徴的な疼痛である筋肉痛および関節痛を含み得る。
【０００４】
一次性および二次性の痛覚過敏症に寄与するプロスタノイドの生成における２つの律速段階は、ホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）酵素により制御される膜リン脂質からのアラキドン酸（ＡＡ）の放出、および、Ｃｏｘにより触媒されるＡＡのプロスタノイド前駆体プロスタグランジンＨ_２（ＰＧＨ_２）への変換である。また、Ｃｏｘの２つのイソ型が同定されている：Ｃｏｘ−１は多種の細胞に存在し、一般的には常時発現しており、Ｃｏｘ−２は炎症部位で誘導され、腎臓および中枢神経系の一部で常時発現している。一般的に、非ステロイド性抗炎症薬（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇ；ＮＳＡＩＤ）の抗炎症効果および鎮痛効果はＣｏｘ−２の阻害に由来し、その副作用は、Ｃｏｘ−１の阻害に由来する。
【０００５】
副作用を軽減して、疼痛を治療または予防するためには、治療法の改善が必要とされている。具体的には、胃腸における合併症の発生が少ない、より効果的な治療法が必要とされている。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、疼痛を治療、緩和または予防するための改良された方法を提供することである。本発明者等は、末梢性炎症が中枢神経系のＩＬ−１βを誘導することにより、疼痛感受性に寄与する中枢性のＣｏｘ−２およびプロスタノイドのレベルが上昇することを見出した。また、本発明者等は、中枢性のＩＬ−１β活性の阻害の方が末梢ＩＬ−１β活性の阻害よりも疼痛の緩和に対してより効果的であり、これが、中枢性のＣｏｘ−２活性の阻害と同じ程度の効果を示すことを明らかにした。したがって、中枢性のＩＬ−１β活性の阻害は、疼痛を治療、緩和または予防するための改良された方法である。更に、本発明の方法は、哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を低下させる化合物を選択することを許容し、したがって、疼痛の緩和、安定化または予防に有用な新規治療薬の同定を容易にする。また、本発明者等は、ＭＡＰキナーゼの阻害剤がＣｏｘ−２とプロスタノイドの誘導を減少させることを示した。したがって、ＭＡＰキナーゼのリン酸化または活性を阻害する化合物を哺乳動物の末梢、および／または、中枢神経系に投与することにより、疼痛を治療、緩和または予防できる。
【０００７】
したがって、一つの局面において、本発明は、疼痛を治療、緩和または予防する方法を提供し、該方法は、哺乳動物（例えば、ヒト）の中枢神経系を、疼痛を治療、緩和または予防するのに適当な量のＩＬ−１β活性を低下させる化合物に、接触させる段階を含む。一つの好ましい態様において、化合物は、哺乳動物の中枢神経系に直接投与し、好ましくは、髄腔内、髄内、脳内、側脳室内、頭蓋内、脊髄内、硬膜外腔内、または、頭頂内へ投与する。また別の好ましい態様において、化合物は、哺乳動物の血液−脳関門を通過する。この態様において、血液−脳関門を通過する化合物は、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、眼内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、経口、局所的、または、疼痛を予防、緩和または治療するために適当な量の化合物を投与するのに十分なその他の任意の経路によって投与され得る。好ましくは、化合物は、薬学的に許容される担体と共に哺乳動物へ投与する。好ましい態様においては、ｐ３８のリン酸化もしくは活性を直接的もしくは間接的に阻害する化合物、および／または、ＥＲＫのリン酸化もしくは活性を直接的もしくは間接的に阻害する化合物が投与される。
【０００８】
更に、ｐ３８またはＥＲＫ等のＭＡＰキナーゼのリン酸化または活性を直接的または間接的に阻害する化合物は、疼痛の治療、緩和または予防のために、哺乳動物の末梢、または、末梢および中枢神経系の両方に投与できる。この様な方法の一つは、疼痛の治療、緩和または予防のために適当な量の、第一のＭＡＰキナーゼの活性またはリン酸化を低下させる第一の化合物に、哺乳動物（例えば、ヒト）の末梢を接触させる段階を含む。一つの態様において、該方法は、更に、第一のＭＡＰキナーゼまたは第二のＭＡＰキナーゼの酵素活性またはリン酸化レベルを低下させる第一の化合物または第二の化合物を、哺乳動物の中枢神経系に投与する段階を含む。典型的なＭＡＰキナーゼは、ｐ３８およびＥＲＫである。好ましい態様においては、ｐ３８のリン酸化または活性を阻害する化合物、および、ＥＲＫのリン酸化または活性を阻害する化合物が投与される。一つの好ましい態様において、化合物を、哺乳動物の中枢神経系に直接投与し、好ましくは、髄腔内、髄内、脳内、側脳室内、頭蓋内、脊髄内、硬膜外腔内、または、頭頂内へ投与する。また別の好ましい態様において、化合物は、哺乳動物の血液−脳関門を通過する。この態様において、血液−脳関門を通過する化合物は、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、眼内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、経口、局所的、または、疼痛を予防、緩和または治療するために適当な量の化合物を投与するのに適したその他の任意の経路によって投与され得る。好ましくは、化合物は、薬学的に許容される担体と共に哺乳動物へ投与される。好ましくは、ＭＡＰキナーゼのリン酸化レベルまたは酵素活性は、化合物存在下において少なくとも２、３、５、１０、２０または５０分の一に低下する。
【０００９】
更に、本発明は、化合物が中枢神経系においてＩＬ−１β活性を阻害するか否かを判定する際に使用できる方法に関する。これらの方法により同定された化合物は、疼痛を治療、緩和または予防する際に有用であり得る。
【００１０】
このような一つの局面において、本発明は、化合物が哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を阻害するか否かを判定するためのスクリーニング方法を提供し、該方法は、哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階、ならびに、化合物の存在下および非存在下において、哺乳動物における疼痛を測定する段階、または哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を測定する段階を含む。化合物が疼痛またはＩＬ−１β活性の低下をもたらす場合、化合物は、ＩＬ−１β活性を阻害すると判定される。
【００１１】
別の局面において、本発明は、化合物が哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害するか否かを判定するためのスクリーニング方法を提供する。本方法は、化合物を哺乳動物の末梢に投与する段階、および、化合物の存在下および非存在下において、哺乳動物の中枢神経系および末梢の両方においてＩＬ−１β活性を測定する段階を含む。化合物が哺乳動物の末梢よりも中枢神経系においてＩＬ−１β活性のより大幅な低下をもたらす場合、化合物は、中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害すると判定される。
【００１２】
関連する局面において、本発明は、化合物が哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害するか否かを判定するための、更に別のスクリーニング方法を提供する。この方法は、（ａ）第一の哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階、（ｂ）化合物の存在下および非存在下において、第一の哺乳動物の末梢においてＩＬ−１β活性を測定する段階、（ｃ）第一の哺乳動物または第二の哺乳動物の中枢神経系に化合物を投与する段階、ならびに（ｄ）化合物の存在下および非存在下において、その第一の哺乳動物または第二の哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を測定する段階を含む。化合物が末梢よりも中枢神経系においてＩＬ−１β活性のより大幅な低下をもたらす場合、化合物は、中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害すると判定される。
【００１３】
更に別の関連する局面において、本発明は、化合物が哺乳動物の中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害するか否かを判定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、（ａ）第一の哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階、（ｂ）化合物の存在下および非存在下において、第一の哺乳動物において疼痛を測定する段階、（ｃ）第一の哺乳動物または第二の哺乳動物の中枢神経系に化合物を投与する段階、ならびに（ｄ）化合物の存在下および非存在下において、第一の哺乳動物または第二の哺乳動物において疼痛を測定する段階。化合物が、末梢よりも中枢神経系に投与した際に疼痛を大幅に緩和する場合、化合物は、中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害すると判定される。
【００１４】
本発明の様々なスクリーニング方法の好ましい態様において、これらの方法はまた、ＩＬ−１β活性または疼痛の測定を行う前に、哺乳動物、第一の哺乳動物、または、第二の哺乳動物の末梢において炎症を誘導する段階も含む。炎症は、化合物を末梢または中枢神経系に投与する前、その最中、または、その後に誘導されてもよい。その他の好ましい態様において、これらの方法は、ＩＬ−１β活性または疼痛を測定する前に、哺乳動物、第一の哺乳動物、または、第二の哺乳動物において神経障害からなる神経因性疼痛を引き起こすために神経の損傷、破壊、または、障害を誘導する段階を含む。神経障害は、化合物を末梢または中枢神経系に投与する前、その最中、または、その後に誘導してもよい。化合物は、好ましくは、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、眼内、脳室内、腹腔内、経口、局所的または鼻腔内投与により哺乳動物の末梢に投与されるか、または、髄腔内、髄内、脳内、側脳室内、頭蓋内、脊髄内、硬膜外腔内または頭頂内投与により哺乳動物の中枢神経系に投与される。また、別の好ましい態様において、化合物は、少なくとも５個、１０個、２０個、５０個または１００個の化合物からなるライブラリの一員であり、その全てが同時に哺乳動物に投与される。また、別の好ましい態様において、化合物は、薬学的に許容される担体と共に投与される。哺乳動物は、好ましくは、マウスもしくはラット等の齧歯類であるか、サル、ウサギ、または、モルモットである。中枢性のＩＬ−１β活性を阻害する好ましい化合物には、組換えＩＬ−１ｒａなどのＩＬ−１受容体アンタゴニスト、およびカスパーゼ−１阻害剤が含まれる。好ましいカスパーゼ−１阻害剤としては、アルデヒド、ハロメチルケトン、ジアゾメチルケトン、フェニルアルキルケトンおよびアシルオキシメチルケトン等が含まれる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｊ．ｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６４：１９−２６、１９９７、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ「カスパーゼの阻害剤と基質（ＣａｓｐａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｄＳｕｂｓｔｒａｔｅｓ）」ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。好ましいアルデヒドカスパーゼ−１阻害剤としては、アセチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−アルデヒド、アセチル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−アルデヒド、および、アセチル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−アルデヒドが含まれる。好ましいハロメチルケトンとしては、アセチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）−フルオロメチルケトン、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−ベンジル）−クロロメチルケトン、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ベンジル）−クロロメチルケトン、ベンゾイルオキシカルボニル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）−フルオロメチルケトン、ベンゾイルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン、および、ベンゾイルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−メチル）−フルオロメチルケトンが含まれる。これらのいずれのハロメチルケトンのハロゲンも、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、または、アスタチンで置換し得る。アセチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ジアゾメチルケトンは好ましいジアゾメチルケトンであり、ベンゾイルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フェニルアルキルケトンは好ましいフェニルアルキルケトンである。好ましいアシルオキシメチルケトンの例としては、アセチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−［（２，６−ジメチルベンゾイル）オキシ］メチルケトン、ベンゾイルオキシカルボニル−Ａｓｐ−ＣＨ_２−［（２，６−ジクロロベンゾイル）オキシ］メタン、アセチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−（ジクロロベンゾイル）オキシ−メチルケトン、および、ベンゾイルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏ−エチル）−（ジクロロベンゾイル）オキシ−メチルケトンが含まれる。標準的な方法によりアスパラギン酸残基がエステル化された化合物を含むこれらの化合物の誘導体も本発明の方法に使用してもよい。
【００１５】
本発明における様々な方法の好ましい態様において、化合物は、ｐ３８またはＥＲＫ等のＭＡＰキナーゼまたはＣＲＥＢ等の転写因子のリン酸化または活性を直接的にまたは間接的に阻害する。別の好ましい態様において、化合物は、ＩＬ−１β、ｐ３８、および／または、ＥＲＫ活性化の下流にあるタンパク質、例えば、膜受容体（例えば、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体）または、イオンチャネル等の翻訳後制御を直接的または間接的に調節する（例えば、リン酸化を阻害する）。好ましくは、このタンパク質リン酸化の阻害は、膜の興奮性を低下させるものであり、標準的な方法により測定される。また別の好ましい態様において、ＥＲＫ活性またはリン酸化を阻害する化合物を投与することは、ＣＲＥＢ等の転写因子のリン酸化レベルの低下または遺伝子転写レベルの低下へとつながる。遺伝子転写が低下する結果となる特定の態様において、化合物は、ｃ−ｆｏｓ等の直前の遺伝子の転写、または、ＣＲＥ部位を含むプロモーター（例えば、プロダイノルフィンまたはＮＫ−１プロモーター）に機能的に接続した遺伝子の転写を低下させる。また、別の好ましい態様において、プロダイノルフィンおよび／またはＮＫ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、化合物の投与により低下する。別の態様において、化合物は、ＶＲ１等のｍＲＮＡの転写、または、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の半減期を減少させる。
【００１６】
本明細書において「ＩＬ−１β活性を低下させる化合物」とは、標準的な方法により測定された、ＩＬ−１βｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベル、ＩＬ−１βの活性、ＩＬ−１βｍＲＮＡもしくはタンパク質の半減期、または、受容体もしくは他の分子へのＩＬ−１βの結合を低下させる化合物を意味する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最新プロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」、第９章、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、２０００参照）。また、別の好ましい態様において、ＩＬ−１β活性を低下させる化合物は、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベル、プロスタノイドのレベル、シグナル伝達タンパク質（例えば、ｐ３８またはＥＲＫ等のＭＡＰキナーゼ）のリン酸化レベル、または、疼痛のレベルまたは継続期間を低下させるか安定させる。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡの発現レベルは、ここに記載されているような標準的なＲＮａｓｅ保護アッセイまたはインサイチューハイブリダイゼーションアッセイを使用して決定され、Ｃｏｘ−２タンパク質レベルは、Ｃｏｘ−２抗体を用いた標準的なウエスタン法または免疫組織化学分析により決定し得る（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌら参照）。また、ＰＧＨ_２またはＰＧＥ_２等の誘導されたＩＬ−１βであるプロスタノイドのレベルは、ここに説明されているような標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定され得る。ＩＬ−１受容体活性化の下流にあるシグナル伝達タンパク質である、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫＭＡＰキナーゼ、ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）、ＮＦκ−Ｂ、または、Ｉκ−Ｂ等のリン酸化レベルも、前記の方法により測定し得る（Ｏ’ＮｅｉｌｌおよびＧｒｅｅｎｅ、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６３：６５０−６５７、１９９８；Ａｕｒｏｎ、ＣｙｔｏｋｉｎｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖ．９：２２１−２３７、１９９８）。様々な態様において、化合物は、ｐ３８またはＥＲＫ等のＭＡＰキナーゼのリン酸化または活性を直接的または間接的に阻害する。その他の態様において、化合物は、ｐ３８またはＥＲＫ等のＭＡＰキナーゼのリン酸化または活性を直接的または間接的に阻害しない。ＩＬ−１β活性のレベルは、下記のとおり、疼痛のレベル、持続期間、または、発生の遅延を測定することにより判定してもよい。ＩＬ−１β活性を低下させる能力について試験されうる化合物としては、合成有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子、ＩＬ−１βアンチセンス核酸、生合成タンパク質もしくはペプチド、天然に存在するペプチドもしくはタンパク質、ＩＬ−１β抗体、または、ドミナントネガティブなＩＬ−１βタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、化合物は、ＩＬ−１β活性を少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または、９０％低下させる。別の好ましい態様において、ＩＬ−１β活性のレベルは、化合物存在下では、少なくとも２、３、５、１０、２０、または、５０分の一である。好ましくは、中枢神経系におけるＩＬ−１β活性の低下は、末梢におけるＩＬ−１β活性の低下の２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、または、５０倍である。
【００１７】
「疼痛」とは、ある形態の神経末端の刺激による苦痛の感覚を意味する。疼痛は、その位置、性質（例えば、局所性の痛み、拡散的な痛み、恒常的な痛み、間欠痛、灼熱痛、きりきりする痛み、噛まれるような痛み、鋭い痛み、鈍痛、または、拍動痛）、放散性（例えば、最もひどい状態の患部からの痛みの分布）、頻度、または、関連する症状（例えば、機械的刺激（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）閾値または払いのけ潜時）により特徴付けられる。哺乳動物における疼痛のレベル、継続時間、または、遅延された発生は、標準的な方法のいずれのものをも使用して測定し得る。好ましい炎症性疼痛のモデルは、ラットまたはマウス等の齧歯類の片側の後ろ足にホルマリン、カラゲナン、または、フロイント完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓａｄｊｕｖａｎｔ；ＣＦＡ）を注射することを含む（Ｈｏｎｏｒｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：７６７０−７６７８、１９９９）。慢性的な炎症性疼痛のモデルとして、ＣＦＡを使用してマウスまたはラットにおいて関節炎を誘導してもよい（Ｈｏｎｏｒｅら、上記参照；Ｖｉｅｉｒａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０７：１０９−１１６２０００）。これらの炎症性疼痛モデルにおける疼痛のレベルを測定する為には、痛感刺激（熱）または機械的刺激過敏症に応答した際の払いのけ潜時を、校正したフォン・フライフィラメントを使用して、既に説明されているとおりにアッセイする（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄら、Ｐａｉｎ８７：１４９−１５８、２０００）。また、マウスまたはラットの足にカプサイシン等の刺激物を皮内または局所的に投与した後の足舐め反応の回数、または、モルモットの結膜に刺激物を局所的に投与した後の拭き動作の回数を測定してもよい（Ｖｉｅｉｒａら、上記参照）。化合物が疼痛を緩和、安定化、予防、または、発生を遅延する能力は、酢酸を腹腔内投与した後の齧歯類の身もだえ反応の回数に対する化合物の効果を測定することにより判定できる（Ｓａｔｕｒｎｉｎｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２３：６５４−６５６、２０００）。また、炎症を起こした足を機械的に刺激するテストチャンバー内の位置を、ＣＦＡ処理されたラットが避ける期間も判定し得る（ＬａＢｕｄａおよびＦｕｃｈ、Ｅｘｐ．Ｎｅｒｕｏｌ．１６３：４９０−４９４，２０００）。一つの好ましい態様において、疼痛を、傷害の部位（一次性痛覚過敏症）または隣接する非外傷組織（二次性痛覚過敏症）で測定する。別の好ましい態様においては、広汎性の痛みが測定される。他の好ましい態様において、痛覚過敏症または異疼痛は、抑制される。また、脊椎損傷後の疼痛等の中枢神経系から生じる疼痛も測定し得ると予想される。末梢神経因性疼痛を研究するために、例えば、残存神経損傷モデル（ＳｐａｒｅｄＮｅｒｖｅＩｎｊｕｒｙｍｏｄｅｌ）（ＤｅｃｏｓｔｅｒｄおよびＷｏｏｌｆ、Ｐａｉｎ８７：１４９−１５８、２０００）または慢性絞扼神経損傷モデル（ＣｈｒｏｎｉｃＣｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎＩｎｊｕｒｙｍｏｄｅｌ）（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ、Ｐａｉｎ３３：８７−１０７、１９８８）において化合物が末梢神経因性疼痛を抑制または予防する能力を測定することが可能である。
【００１８】
「末梢」または「末梢神経系」とは、脳と脊髄以外の神経系領域を意味する。例えば、末梢神経系は、脳または脊髄へ信号を伝達する感覚神経および運動神経繊維を含む。
【００１９】
「中枢神経系」とは、脳脊髄液を含む、脳または脊髄を意味する。
【００２０】
本発明は、疼痛の治療または予防に関連する数々の利益を提供する。例えば、哺乳動物の中枢神経系へＩＬ−１β活性阻害剤を投与することにより、末梢神経系へこれらの阻害剤を投与した場合よりも大幅に疼痛が弱まる。更に、活性型ＩＬ−１βの生成を阻害する化合物の髄腔内投与は、機械的刺激による疼痛および温熱性疼痛に対する感度を低下させることにおいて、選択的なＣｏｘ−２阻害剤と同じ程度の効果を示す。したがって、中枢神経系においてＩＬ−１β活性を阻害する化合物の投与は、疼痛を治療または予防する為の最新の方法よりも効果的であり得る。更に、治療効果のある量を調整する際に、中枢性のＩＬ−１β阻害剤は、より少ない投与量、または、より頻度の低い投与回数を必要とし得る。このような少ない投与量の使用は、これらの化合物からの副作用の頻度および重篤さを最小限にし得る。
【００２１】
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および添付の特許請求の範囲により明らかであると考えられる。
【００２２】
詳細な説明
本発明は、末梢性の炎症に反応した中枢神経系におけるＣｏｘ−２発現とプロスタノイド産生との誘導に関する重要な要因が、中枢神経系におけるＩＬ−１βの上方制御であるという発見に由来する。これに対し、末梢性の炎症部位を神経支配する神経線維からの知覚の流入によって生じた中枢性のＣｏｘ−２レベルの増加は、はるかに小さかった。さらに、疼痛の感受性に関与する中枢神経系のプロスタノイドの産生は、上流の酵素であるホスホリパーゼ２のレベルよりむしろ中枢性のＣｏｘ−２レベルに相関した。
【００２３】
中枢神経系においてＣｏｘ−２が誘導されること、そしてそれによって中枢性のプロスタノイド産生が増加することは、一次性痛覚過敏、二次性痛覚過敏、および散在性疼痛に関与する可能性がある。例えば、中枢性のＣｏｘ−２は、侵害受容器線維からの伝達物質の放出を促進することによるのみならず、中枢神経系におけるプロスタノイド受容体を直接活性化することによって、慢性的な末梢性の炎症性過敏症の確立および維持に関与する可能性がある。炎症組織に隣接した感受性の増大は、おそらく中枢性のプロスタノイドによって、および炎症組織を神経支配する知覚線維の中枢末端から放出される神経調節物質によって媒介される。多くの炎症疾患に典型的な散在性の痛みおよび疼痛、ならびに感染疾患に関連する発熱、嗜眠、および食欲不振も同様に、Ｃｏｘ−２が広い範囲で誘導され、これに続いて末梢炎症後に中枢神経系においてプロスタノイドが産生されることによって引き起こされる可能性がある。
【００２４】
ラット脊髄にＩＬ−１β産生阻害剤を投与すると、末梢炎症によって誘導される中枢性のＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベル、中枢性のプロスタグランジン_２レベル、および熱疼痛感受性の増加が減少した。このように、中枢神経系におけるＩＬ−１β活性の阻害は、ヒトのような哺乳動物における疼痛を予防、減少、または安定化させる有用な手段である。
【００２５】
本発明者らはまた、末梢炎症が一次知覚ニューロンにおいてＭＡＰキナーゼｐ３８を活性化させるが、二次後角ニューロンにおいては活性化させないことも発見した。特に、ｐ３８は、炎症後に後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンのＣ線維侵害受容器において主に活性化された。ｐ３８阻害剤を髄腔内に投与すると、炎症性の熱痛覚過敏を緩和したが、機械的刺激痛覚過敏は緩和しなかった。熱痛覚過敏を媒介するＶＲ１受容体は、ｐ３８活性化の標的である。ＶＲ１タンパク質は炎症によって上方制御されるがＶＲ１ｍＲＮＡは上方制御されず、ｐ３８は、ＶＲ１発現ニューロンにおいて主に活性化された。ｐ３８活性化は、ＶＲ１タンパク質レベルの炎症による増加に必要であった。神経成長因子（ＮＧＦ、既知の疼痛媒介物質）は、これらの事象の誘因となる可能性がある。ＮＧＦは炎症によるｐ３８活性化およびＶＲ１上方制御に必要であり、ＶＲ１のＮＧＦ誘導性上方制御は、ｐ３８によって媒介される（図２６Ａ〜図２６Ｆ）。
【００２６】
もう一つのＭＡＰキナーゼであるＥＲＫの活性化は、後角における侵害受容の可塑性において二つの役割を有する；急性の侵害刺激誘導中枢の感作に対する短い潜時の関与、ならびに炎症性疼痛の誘導および維持における関与。末梢性の炎症性疼痛の知覚過敏におけるｐＥＲＫの関与は、少なくとも部分的に、疼痛メディエータであるプロダイノルフィンおよびＮＫ−１ならびに他の標的遺伝子の発現の調節が原因であるかも知れない。したがって、ＥＲＫ活性化は、多様な入力に対する特定のエフェクター反応の活性化を決定して、これが過敏性の変化に関与する、浅側後角における一群のニューロンの機能的可塑性および化学的表現型において肝要な役割を有する。
【００２７】
ＩＬ−１βを一次知覚ニューロンに投与しても同様に、ＭＡＰキナーゼｐ３８またはＥＲＫのリン酸化が増加した（図２５）。これらのキナーゼの阻害剤は、ＩＬ−１βによって誘導されたＣｏｘ−２ｍＲＮＡおよびＰＧＥ_２の増加を減少させた。これらの結果は、ＭＡＰキナーゼリン酸化および／または活性の阻害剤が、疼痛を減少または予防できることの根拠となる。
【００２８】
上記の実験を、以下のように実施した。
【００２９】
実施例１：Ｃｏｘ２の中枢での誘導
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）によって誘発された片側の後足炎症後の中枢神経系におけるＣｏｘ−２誘導の程度を調べた。ＣＦＡ（１００ μｌ、Ｓｉｇｍａ）を、２％ハロタンによって麻酔したラットの左後足に注射した。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルは、ＲＰＡＩＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて脊髄試料からの全ＲＮＡ抽出物について行うＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて測定した。Ｃｏｘ−２放射標識リボプローブの鋳型を、ラットの後根神経節ｃＤＮＡから、プライマー

および

を用いたＰＣＲによって作製して、その後ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。それぞれの観察について少なくとも二つのアッセイを用いて、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルが何倍変化したかをβアクチンロード対照に関して決定した。
【００３０】
局所的末梢炎症によって、足の求心性末端がある腰髄の領域（Ｌ４／Ｌ５分節）で、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルが迅速に時間依存的に増加した（図１Ａ）。最大誘導は６時間で起こり（１６倍）、少なくとも２４時間持続した（９倍）。初期（２時間〜６時間）では、増加は炎症と同側で最大であった。予想外に、１２時間および２４時間では、レベルは腰髄において両側に対称的であり（図１Ａおよび図１Ｃ）、Ｃｏｘ−２発現が全般的に増加していることを示唆した。
【００３１】
このようなＣｏｘ−２発現の全般的増加の可能性を確認するために、Ｃｏｘ−２レベルをラットの多数の領域において測定した。後足の炎症によって、皮膚（１８倍）および脊髄の全てのレベルでＣｏｘ−２発現が増加した（図１Ｂ）。Ｃｏｘ−２発現の増加は、橋、腹側中脳、視床下部、および視床においても認められた（図１Ｂおよび図１Ｄ）。大脳皮質におけるＣｏｘ−２発現は構成的であり、炎症によって有意に影響を受けなかった（図１Ｂ）。
【００３２】
末梢炎症後の後角におけるＣｏｘ−２タンパク質の誘導を可視化するために、既に記述されているように（Ａｍａｙら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３３１〜３４２、２０００）、Ｃｏｘ−２抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）および神経マーカーであるＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、脊髄横断切片（２０ μｍ）について免疫組織化学を行った。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡの誘導を可視化するためにジゴキシゲニン標識リボプローブを用いて、インサイチューハイブリダイゼーションを行った（Ｍａｎｎｉｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：９３８５、１９９９）。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡおよびタンパク質の低い基底レベルが後角ニューロンに存在し、炎症後６時間および１２時間で実質的に上方制御された（図２Ａ〜図２Ｄおよび図３）。Ｃｏｘ−２のこの誘導がＰＧＥ_２レベルの増加に相関するか否かを判定するために、脳脊髄液試料１００ μｌ〜２００ μｌを麻酔したラットの大槽から２７Ｇ針を用いて採取して、製造元のプロトコール（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に従ってＰＧＥ_２酵素イムノアッセイを用いてＰＧＥ_２レベルを分析した。実際に、Ｃｏｘ−２の誘導は脳脊髄液においてＰＧＥ_２レベルの８０倍以上の増加に関連し、これは炎症の１２時間後に最大であった（図４）。
【００３３】
Ｃｏｘ−２発現はまた、神経損傷によって中枢神経系においても誘導された。特に、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡは、「予備神経損傷モデル」（「ＳＮＩ」、ＤｅｃｏｓｔｅｒｄおよびＷｏｏｌｆ、Ｐａｉｎ８７：１４９〜１５８、２０００）および慢性結紮損傷（ＣｈｒｏｎｉｃＣｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎＩｎｊｕｒｙ）モデル（「ＣＣＩ」、ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ、Ｐａｉｎ３３：８７〜１０７、１９８８）のようなニューロパシー疼痛ラットモデルの脊髄において誘導された（図１４）。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡはまた、坐骨神経の完全な離断（「軸索切断」）後にも誘導された。このように、炎症性疼痛におけるその役割の他に、中枢性のプロスタノイドはまた、神経損傷によって誘導された病的疼痛の一つの型であるニューロパシー疼痛にも関与している。
【００３４】
実施例２：中枢性のＣｏｘ−２レベルに及ぼす知覚流入の影響
末梢性の炎症に反応した中枢性のＣｏｘ−２誘導には二つの作用機構が関与しうる：１）炎症を有する後足を神経支配する神経線維からの知覚流入、または２）循環中の前炎症性サイトカイン。一次知覚ニューロンの活性が中枢性のＣｏｘ−２を増加させるか否かを判定するために、後根が付随した単離成体ラット脊髄切片調製物を分析した（図５Ａ）。この脊髄切片を調製するために、成体ラットからウレタン麻酔下で腰髄を採取して、冷クレブス溶液に浸した。Ｌ４後根（１５ｍｍ〜２０ｍｍ）が付随した厚さ７００ μｍの横断切片を調製して、９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２によって飽和したクレブス溶液によって３６℃〜３７℃で還流した（Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：８５９、１９９９）。吸引電極を用いて、Ａβ線維に関して２０ μＡ（０．０５ｍｓ、５０Ｈｚ）、Ａβ線維に関して１００ μＡ（０．０５ｍｓ、５０Ｈｚ）、およびＣ線維に関して１０００μＡ（０．５ｍｓ、５０Ｈｚ）で、Ｌ４後根を３０分間電気刺激した。切片をクレブス溶液によって電気刺激の前に２時間還流し、刺激後３時間還流した。
【００３５】
Ａβ線維、Ａδ線維、またはＣ線維の強度で３０分間後根を電気刺激すると、３時間後に同側の後角において、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡが、反対側の後角または非刺激切片と比較して２倍〜３倍増加した（図５Ｂ）。Ｃ線維の強度での坐骨神経のインビボでの３０分間刺激を、既に記述されているとおりに（Ｍａｎｎｉｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：９３８５、１９９９）行った場合も、３時間後に腰髄においてＣｏｘ−２発現が誘導された。しかし、Ｃｏｘ−２発現のこの３倍〜４倍の増加は、末梢炎症後の１０倍以上の増加よりも小さかった（図５Ｃ）。
【００３６】
炎症を有する後足を神経支配する神経線維からの知覚流入が、末梢炎症後の中枢性のＣｏｘ−２の大きい誘導を説明するために十分であるか否かを判定するために、生体分解性のブピバカイン−ポリエステルミクロスフェアの注射用懸濁液を用いて、神経ブロックを行い、その３０分後にＣＦＡをラット後足に注射した（ｎ＝６）（Ｃｕｒｌｅｙら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ８４：１４０１、１９９６）。行動の評価およびこれまでに報告された電気生理研究に基づくと、この神経ブロックによって、坐骨神経の完全な知覚および運動神経遮断が４８時間起こった。坐骨神経伝導のこの遮断によって、脳脊髄液中のＰＧＥ_２レベル（図５Ｅ）および後足炎症後の同側の腰髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡ誘導（５±１．５倍、ｎ＝３、図５Ｄ）は減少したものの、消失しなかった。したがって、知覚流入は中枢性のＣｏｘ−２を誘導するには十分であるが、末梢炎症後の中枢性のＣｏｘ−２誘導にはさらなる要因が関与しているに相違ない。
【００３７】
実施例３：ＩＬ−１ βの上方制御および中枢性のＣｏｘ−２レベルに及ぼすその影響
ＩＬ−１βもまた中枢性のＣｏｘ−２の誘導に関与するか否かを試験するために、既に記述されているように（Ｓａｆｉｅｈ−Ｇａｒａｂｅｄｉａｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１５：１２６５〜１２７５、１９９５）ＥＬＩＳＡを用いて、ＩＬ−１βレベルをラットの末梢および中枢神経系において測定した。ＩＬ−１βの顕著な上方制御（＞１０，０００倍）が、ＣＦＡ投与後まもなく炎症を有する足に起こり、数日間持続した（図６Ａ）。ＩＬ−１βはまた、脳脊髄液において炎症の２時間後および４時間後にそれぞれ、５０倍および２０倍の増加を示し（図６Ｂ）、これはＣｏｘ−２ｍＲＮＡの最大上方制御の前に起こった。既に記述されている（Ａｍａｙａら、上記）通りに行った抗Ｉ型ＩＬ−１受容体抗体（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）による免疫組織化学に基づくと、Ｉ型ＩＬ−１β受容体は、脊髄、特に炎症後にＣｏｘ−２が誘導される領域である後角の第Ｉ層〜第ＩＩＩ層において（図６Ｃ）強く発現された。
【００３８】
ＩＬ−１βが中枢性のＣｏｘ−２を誘導するか否かを判定するために、ラットにこのサイトカインの静脈内または髄腔内投与を行い、腰髄においてＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルを５時間後に評価した。ＩＬ−１β（１μｇ）を静脈内投与すると、脊髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡを４倍上方制御したが（図６Ｄ）、５ｎｇまたは５０ｎｇのＩＬ−１β髄腔内注射によりはるかに大きい作用が得られた（それぞれ、２０倍または３０倍）（図６Ｄ）。ＩＬ−１βはまた、ＩＬ−１βの髄腔内投与後インビボで、そして初代神経培養においてインビトロの双方で、一次知覚ニューロンである後根神経節ニューロン（「ＤＲＧ」）においてＣｏｘ−２発現を誘導する。特に、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルは、１ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの投与後、培養ＤＲＧニューロンにおいて有意に増加した。この分析に関して、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルはＲＮａｓｅ保護アッセイを用いてモニターして、タンパク質発現は、本明細書に記載するように免疫組織化学によって可視化した（図１０）。ＩＬ−１β（１ｎｇおよび１０ｎｇ）の髄腔内投与も同様に、処理の４時間後にラット腰髄ＤＲＧニューロンにおいてＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルを実質的に上方制御させた（図１１）。その上、中枢性ＰＧＥ_２レベルは、ＩＬ−１β（５ｎｇ）の髄腔内投与後に、本来のレベル２４±１０ｐｇ／ｍｌから１２０４±３６０ｐｇ／ｍｌへと有意に上方制御された（５０倍）（ｐ＜０．００５、ｎ＝６）。この結果は、Ｃｏｘ−２の中枢性のＩＬ−１β媒介誘導によって中枢性のプロスタノイド産生が起こることを示唆している。
【００３９】
Ｃｏｘ−２の誘導における中枢性のＩＬ−１βの役割をさらに支持するために、ＩＬ−１β活性を阻害する効果を決定した。中枢性のＩＬ−１β活性は、組み換え型ＩＬ−１β受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）またはカスパーゼ−１（プロインターロイキン−１βを活性型のＩＬ−１βに変換する、インターロイキン−１β変換酵素としても知られる）阻害剤のいずれかの髄腔内投与によって阻害された。６μｇのＩＬ−１ｒａをＣＦＡ注射の３０分前に髄腔内投与すると、Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルは炎症の６時間後に７５％減少した（図７Ｂ）。カスパーゼ−１阻害剤であるＹＶＡＤ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍのアセチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＯ、１ｎｍｏｌ、０．５ μｇ）を用いた３０分間の髄腔内前処理により、末梢炎症の６時間後に脊髄のＣｏｘ−２ｍＲＮＡの誘導が６５％遮断された（図７Ｄ）。ＹＶＡＤ（１ｎｍｏｌ）の髄腔内前処理によってもまた、炎症の１２時間および２４時間後における中枢性のＰＧＥ_２レベルが５０％減少した（図７Ｅ）。これらのデータは、脊髄におけるＩＬ−１βが末梢性の炎症後のＣｏｘ−２の中枢性の転写活性化に関して、おそらく他のサイトカインと共に作用して関与すること、そしてＣｏｘ−２誘導が中枢性のＰＧＥ_２の産生／放出における主な制限因子であることを示す。
【００４０】
中枢性のＣｏｘ−２誘導の挙動的結末を試験するために、カスパーゼ−１阻害剤であるＹＶＡＤ、またはＣｏｘ−２阻害剤であるＮＳ３９８を投与した場合の、ラットにおける機械的刺激感受性および熱刺激感受性に及ぼす影響を決定した。機械的刺激過敏症は、既に記述されているように（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄら、Ｐａｉｎ８７：１４９〜１５８、２０００）較正したフォンフレー（ＶｏｎＦｒｅｙ）繊維（０．０１７〜９５．５）を用いて、無傷および炎症を有するラットにおいて評価された。熱感受性は、輻射熱光線を適用して、足の払いのけ潜時（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌｌａｔｅｎｃｙ）を記録することによって評価された（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄら、上記）。ＮＳ３９８（３０ μｇ）を髄腔内投与すると、機械的刺激痛覚過敏（４．２倍）および熱痛覚過敏が、末梢のＣＦＡ誘導炎症の４８時間後にいずれも有意に減少したが、静脈内投与では減少しなかった（図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｄ）。ＹＶＡＤ（１ｎｍｏｌ）を髄腔内投与すると、機械的刺激感受性の正常化に対してさらにより大きい作用を示した（１２倍）（図４Ｄ）。Ｃｏｘ−２とカスパーゼ−１阻害剤はいずれも、無傷のラットにおける機械的刺激疼痛感受性または熱疼痛感受性に有意な影響を及ぼさなかった。これらの結果は、中枢神経系においてＩＬ−１β活性を阻害する化合物が、哺乳動物における疼痛の治療および予防において有用であることを示唆している。
【００４１】
実施例４：Ｃｏｘ−２の誘導におけるＭＡＰキナーゼおよびＮＦ κ −Ｂの役割
ＩＬ−１βによる処理後にＤＲＧニューロンにおいてＣｏｘ−２ｍＲＮＡを増加させる細胞内シグナル伝達経路を試験するために、一次ＤＲＧニューロンにおけるＮＦκ−Ｂ転写因子およびＭＡＰキナーゼファミリーメンバーの活性化を調べた。ＩＬ−１βをＤＲＧ細胞培養物に投与すると、ｐ３８およびＥＲＫがリン酸化された。リン酸化されたｐ３８およびＥＲＫは、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−１βを培養培地に投与してから３０分後に、標準的なウェスタンブロット分析および免疫組織化学によって可視化した（図１２）。ＤＲＧニューロンにおける特異的Ｉ型ＩＬ−１受容体の発現は、ＭＡＰキナーゼファミリーのこれらのメンバーが、一次知覚ニューロンにおけるＩＬ−１βの直接作用によって活性化されることを示唆している。
【００４２】
Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルのＩＬ−１β媒介誘導に対するｐ３８、ＥＲＫ、およびＮＦκ−Ｂの関与を測定するために、これらの因子のそれぞれに関する特異的阻害剤を用いた。ｐ３８およびＥＲＫ阻害剤はそれぞれ、初代ＤＲＧニューロン培養物においてＩＬ−１βによるＣｏｘ−２ｍＲＮＡの誘導を３０％減少させた（図１０）。対照的に、ＮＦκ−Ｂ特異的阻害剤は、ＩＬ−１β処理によって誘導されたＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルの増加に影響を及ぼさなかった。ｐ３８とＥＲＫＭＡＰキナーゼ阻害剤の双方を組み合わせると、ＩＬ−１βによるＣｏｘ−２ｍＲＮＡの誘導は劇的に減少し、このことは、ｐ３８とＥＲＫとがＩＬ−１β処理に反応して相乗的に作用してＣｏｘ−２ｍＲＮＡを上方制御することを示す（図１０）。
【００４３】
ＣＯＸ−２上方制御と共にＭＡＰキナーゼ阻害剤によるその遮断の機能的関連性を評価するために、培養ＤＲＧニューロンによってインビトロで分泌されたＰＧＥ_２レベルを、ＩＬ−１β処理後にＥＬＩＳＡによって定量した。一次知覚ニューロンにおけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの上方制御によって、ＰＧＥ_２合成が増加した。ＰＧＥ_２レベルのこの増加は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤によって減少した（図１３）。
【００４４】
これらの結果は、ニューロンにおけるＣｏｘ−２発現の誘導およびプロスタノイドの放出に関与するシグナル伝達機構に、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーが含まれることを示す。ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、ＩＬ−１βによるＣｏｘ−２の誘導およびその後のプロスタノイドの放出の双方を遮断できることから、これらの阻害剤は、末梢および中枢のプロスタノイド放出を減少させ、痛覚過敏を緩和するための有用な鎮痛薬候補物質となる。
【００４５】
実施例５：痛覚過敏におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの役割の特徴付け
本発明者らは、末梢神経系の後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに作用する炎症性熱疼痛過敏の発生におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの新規役割を発見した。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）をラットの後足に注射すると、持続的な炎症およびＤＲＧニューロンにおけるＣ線維侵害受容器一次知覚ニューロンにおけるｐ３８の持続的な活性化が起こった。ＥＲＫ活性化とは対照的に、炎症後の後角にｐ３８活性化の増加を認めなかった。炎症はまた、ＤＲＧニューロンにおいて、バニロイド受容体サブタイプ１（ＶＲ１）タンパク質の持続的な上方制御を引き起こしたが、ｍＲＮＡの持続的な上方制御は引き起こさなかった。ＶＲ１は、侵害熱刺激の検出に関与する受容体であり、同様に炎症性の熱痛覚過敏も媒介する。ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０を髄腔内に注入すると、炎症によって誘導されたＶＲ１タンパク質レベルの増加が遮断され、炎症によって誘導された熱痛覚過敏の持続が緩和された。対照的に、阻害剤は、機械的刺激異痛、炎症の重症度（すなわち、腫脹）、または基底疼痛感受性（すなわち、炎症が存在しない場合の疼痛）に有意な影響を及ぼさなかった。炎症によるｐ３８の活性化には神経成長因子（ＮＧＦ）を必要とし、ＮＧＦは炎症組織において産生され、末梢の感作を促進して、知覚ニューロンにおける遺伝子発現を増加させることによって炎症性疼痛を促進する。逆に、ｐ３８活性化は、ＮＧＦ誘導ＶＲ１上方制御（図２６Ａ〜図２６Ｆ）に必要であった。このように、末梢神経系におけるＣ線維侵害受容器におけるｐ３８の活性化は、ＮＧＦ依存的にＶＲ１翻訳を増加させることによって、炎症性の熱痛覚過敏に関与する可能性がある。
【００４６】
本実験を、下記においてより詳しく説明する。
【００４７】
ＤＲＧにおけるｐ３８の活性化
局所的末梢炎症によってＤＲＧニューロンにおけるｐ３８活性化が起こるか否かを評価するために、マサチューセッツ総合病院動物飼育施設ガイドライン（ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従って飼育して、ペントバルビタール麻酔下（５０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）の成体雄性スプレージ−ドーリー系ラット（２４０ｇ〜３２０ｇ）の左後足の足底表面に、ＣＦＡを１００ μｌ注射した。このＣＦＡ注射によって、数分間で発症して１週間以上持続する局所炎症が誘導され、腫脹、紅斑、および炎症性疼痛を伴った（Ｓｔｅｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．３１：４５５〜５１、１９８８；Ｓａｆｉｅｈ−Ｇａｒａｂｅｄｉａｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１５：１２６５、１９９５）。
【００４８】
ｐ３８のリン酸化がこのＣＦＡ処理によって誘導されるか否かを判定するために、免疫組織化学を行った。固定液はリン酸化を直ちに停止させることから、還流固定組織の免疫染色を用いてｐ−ｐ３８レベルを定量した。新鮮な組織の場合、ＤＲＧ採取の際の軸索の切断および組織の冷却のような機械的解剖技法は、強い知覚刺激であり、このように知覚ニューロンのリン酸化レベルの変化を引き起こすであろう。したがって、ＤＲＧニューロンにおけるｐ３８リン酸化を試験するために、ウェスタン分析を用いなかった。
【００４９】
この免疫組織化学分析に関して、ラットの上行大動脈内部を生理食塩水によって還流した後、１．５％ピクリン酸を含む４％パラホルムアルデヒドによって還流した。Ｌ４およびＬ５のＤＲＧならびにＬ４−Ｌ５脊髄セグメントを解剖した。ＤＲＧおよび脊髄横断切片（２０ μｍ）を切断して、既に記述されたＡＢＣ法を用いて（Ｊｉら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１１１４〜１１１９、１９９９）、抗ｐ３８ポリクローナル抗体およびホスホｐ３８ポリクローナル抗体（３００倍希釈、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）ならびに抗ＶＲ１ポリクローナル抗体（５０００倍希釈、ＧｌａｘｓｏＷｅｌｃｏｍｅ社およびＤａｖｉｄＪｕｌｉｕｓ博士から提供された）によって、免疫組織化学のために処理した。同時局在試験に関して、ホスホｐ３８抗体（抗ウサギ抗体、３００倍希釈）およびＶＲ１抗体（抗モルモット抗体、３０００倍希釈、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ）またはＰ２Ｘ３抗体（抗モルモット抗体、３０００倍希釈、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ）、またはＮｅｕＮ抗体（抗マウス抗体、３０００倍希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に反応する抗体のあいだの二重染色を分析するために免疫蛍光を行った。この二重免疫蛍光は、これまでに記述されている通りに実施した（Ｊｉら、上記）。簡単に説明すると、ＤＲＧおよび脊髄切片を二つの一次抗体の混合物と共に４℃で一晩インキュベートした後、ＦＩＴＣ結合二次抗体およびＣＹ３結合二次抗体（３００倍希釈、Ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏｌａｂ）の混合物と共に室温で２時間インキュベートした。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ、ＮＥＮ社）キットを用いて、既に報告されているように（Ａｍａｙａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３３１〜３４２、２０００）二つのウサギポリクローナル抗体による二重染色を行った。免疫染色したＤＲＧ切片の像は、ＣＣＤカメラによって捕獲した。免疫染色の強度は、コンピューター補助ソフトウェア（ＩＰｌａｂ）によって測定して、免疫反応性ニューロンのプロフィールを盲検的に計数した。この計数は、細胞総数を決定しなかった（ＣｏｇｇｅｓｈａｌｌおよびＬｅｋａｎ、１９９６）。その代わりに、結果は、対照および処理動物のあいだに染色レベルの差を評価する方法を提供する。実験条件による変動を防止するために、対照および処理ＤＲＧ切片を同じスライドガラス上に載せて同じ条件で処理した。陽性細胞を採取する閾値は、弱く染色した細胞を検出しないレベルに設定した。これまでに報告されているように（Ｊｉら、１９９９、上記）、一連のＤＲＧ連続切片（２０ μｍ）から５個目ごとの切片を採取して、切片４個をそれぞれのＤＲＧに含めた。免疫反応性ニューロンのプロフィールの割合（％）＝（陽性染色ニューロンプロフィールの数／総ニューロンプロフィールの数）×１００。
【００５０】
リン特異的ｐ３８抗体によるこの染色に基づいて、活性化ｐ３８（ホスホｐ３８（ｐ−ｐ３８））は、無傷のラットのＤＲＧニューロンの約１５％（小さなニューロン全て）に存在する。ホスホｐ３８はニューロンおよびグリア細胞の核および細胞質において発現される。炎症は、ホスホｐ３８（ｐ−ｐ３８）レベルの実質的な増加を誘導した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。この増加は、ＣＦＡ注射後１日目で有意であり、２日後にピークに達し、数日間高レベルで維持された（図１５Ｃ）。ｐ−ｐ３８レベルの増加は、ｐ−ｐ３８免疫反応性ニューロンの数の増加のみならず、その強度の増加を伴った（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。ＤＲＧニューロンの約３０％が炎症後にｐ−ｐ３８を発現した。これらのニューロンはほとんどが大きさが小さく、それらが侵害受容器であることを示唆している（図１５Ｅ）。炎症によって、ＤＲＧニューロンにおけるｐ３８の非リン酸化型レベルは増加せず、このことは、ｐ−ｐ３８の上昇が、キナーゼの発現の増加よりむしろこのＭＡＰキナーゼのリン酸化の増加によって引き起こされたことを示す。対照および炎症条件のいずれにおいても、ｐ−ｐ３８は、Ｃ線維において主に発現された。特に、ｐ−ｐ３８はほとんどが、Ｃ線維侵害受容器において主に発現されるカプサイシン受容体ＶＲ１と共に局在した（図１６Ｃ〜図１６Ｅ）。ｐ−ｐ３８は、Ａ線維のマーカーであるニューロフィラメント−２００（図１６Ａおよび図１６Ｂ）と共に局在しなかった。Ｃ線維侵害受容器は２つの群に分けることができる：ＮＧＦ反応性／ＴｒｋＡ発現ニューロンおよびＧＤＮＦ反応性／ｃ−ｒｅｔ発現ニューロン。ｐ−ｐ３８は、炎症の２日後にＤＲＧニューロンにおいてＰ２Ｘ３およびＴｒｋＡの双方と強く同時局在する。このように、ｐ３８は、炎症後に両タイプのＣ線維侵害受容器において活性化された。
【００５１】
後角におけるｐ３８活性化
炎症によって、浅側後角のニューロンにおいてＥＲＫＭＡＰキナーゼの持続的な活性化が起こる。対照的に、ｐ３８リン酸化は、後角の炎症（６時間から７日）によっても増加しなかった。先に記述したように実施した免疫組織化学分析に基づいて、ｐ−ｐ３８は、ニューロンマーカーであるＮｅｕＮと同時局在しなかった（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。このように、ｐ−ｐ３８は、対照および炎症動物の双方において後角の非神経細胞に限って発現された。
【００５２】
ｐ３８活性化と炎症性疼痛
ＣＦＡ誘導炎症性疼痛は、痛覚過敏（すなわち、侵害刺激に対する感受性の増加）、および異痛（すなわち、通常は無害な刺激による疼痛の発生）を特徴とする。炎症性疼痛におけるＤＲＧ中のｐ３８活性化の関与を試験するために、特異的ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（１μｇ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１０ μｌ、髄腔内ＰＰ１０カテーテルを通して髄腔内空間（Ｌ４ＤＲＧレベルに近い）に投与した。ｐ３８阻害剤は、全身投与すると抗炎症作用を有するが、局所的な髄腔内に薬物を投与すると、足の炎症に影響を及ぼさないはずである。持続的かつ安定な薬物注入を得るために、アルゼ（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプ（７日間ポンプ、０．５ μｌ／時間）に、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（１μｇ／μｌ）の生理食塩水溶液を満たして、ポンプの接続カテーテルをＣＦＡ注射の１６時間前に髄腔内に埋め込んだ。生理食塩水を浸透圧ポンプの溶媒対照として用いた。足の厚さに基づくと、ＳＢ２０３５８０（０．５ μｇ／μｌ／時間）をこのアプローチによって注入しても、ＣＦＡ誘導腫脹は減少しなかった（図１６Ａ）。
【００５３】
ｐ３８阻害剤が基底疼痛感受性に影響を及ぼすか否かを試験するために、熱感受性および機械的刺激感受性を、既に記述されているように測定した（Ｊｉら、２００１、上記）。簡単に説明すると、動物を環境に慣らして、薬物投与または手術の前に基底疼痛感受性を調べた。後足の足底表面での機械的刺激払いのけ閾値をフォンフレー繊維の組を用いて測定した。閾値は鋭い払いのけ反応を誘発した最小の力として得た。熱に対する足払いのけ潜時は、ハーグリーブス輻射熱装置を用いて測定し、３回の試行の平均値とした。非炎症ラットにおける熱感受性または機械的刺激感受性はいずれも、ＳＢ２０３５８０によって影響を受けなかった（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。ＳＢ２０３５８０投与は、炎症性疼痛の初期相を変化させなかった（すなわち、６時間の時点で）（図１６Ａ）。この阻害剤は、炎症によって誘発された熱痛覚過敏の遅延相を減少させたが、機械的刺激異痛には影響を及ぼさなかった（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。ｐ３８阻害剤が確立された炎症性疼痛に影響を及ぼすか否かを試験するために、ＳＢ２０３５８０（１μｇ）をＣＦＡ注射の４８時間後に髄腔内注射した。疼痛挙動を、阻害剤の注射の０．５時間後、３時間後および２４時間後に測定した。ＳＢ２０３５８０は、０．５時間後の炎症性疼痛には影響を及ぼさなかったが、３時間後に熱痛覚過敏を減少させ始め、注射の２４時間後には熱痛覚過敏を完全に逆転させた（図１６Ｄおよび図１６Ｅ）。調べた全ての時点で、機械的刺激異痛は、阻害剤によって変化しなかった（図１６Ｄおよび図１６Ｅ）。
【００５４】
ｐ３８活性化およびＶＲ１発現
ＲＮａｓｅ保護アッセイを用いて、ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１ｍＲＮＡの発現がＣＦＡ媒介炎症によって誘導されるか否かを判定した。このアッセイに関して、Ｌ４およびＬ５のＤＲＧを速やかに採取した。ＶＲ１ｃＤＮＡを、ラットＤＲＧの全ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって作製して、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。プラスミドをＥｃｏＲＶによって線状にし、Ｓｐ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを合成し、^３２Ｐ−ＵＴＰ（ＮＥＮ社、８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）によって標識した。ＲＮａｓｅ保護アッセイを、既に記述されているように（Ｓａｍａｄら、Ｎａｔｕｒｅ４１０：４７１〜４７５、２００１）ＲＰＡＩＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ）のプロトコールを用いて実施した。簡単に説明すると、ＲＮＡ試料５μｇを標識プローブに４２℃で一晩ハイブリダイズさせた後、ＲＮａｓｅ消化緩衝液においてＲＮａｓｅＡ／ＲＮａｓｅＴ１混合物を用いて３７℃で３０分間消化した。最後に、試料を変性アクリルアミドゲル上で分離して、Ｘ線フィルムに露光した。β−アクチンプローブを、ローティング対照としてそれぞれの試料に関して用いた。特異的バンドの密度を測定して、ロード対照からの内部対照バンドによって標準化した。データを平均値＋ＳＥＭとして表した。群のあいだの差は、スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いた後、フィッシャーのＰＬＳＤを用いて比較した。ノンパラメトリックデータに関しては、マン−ホイットニーＵ検定を適用した。統計学的有意性の基準はＰ＜０．０５であった。この分析により、炎症によって、調べた全時間経過にわたって、ＤＲＧにおけるＶＲ１ｍＲＮＡの発現が誘導されないことを示した（図１７Ａ）。
【００５５】
ＤＲＧニューロンにおけるＶＲ１タンパク質の発現が末梢性の炎症によって誘導されるか否かを判定するため、以下のウェスタンブロット分析を用いた。Ｌ４およびＬ５のＤＲＧおよび後角（腰膨大）を、プロテイナーゼとホスファターゼ阻害剤のカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含む緩衝液において溶解した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４％〜１５％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質試料を分離して、ＰＶＤＦフィルターに転写した。ブロットを５％牛乳によって１時間ブロッキングし、ホスホｐ３８抗体（１０００倍希釈）またはＶＲ１抗体（３０００倍希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、ブロットをＨＲＰ結合二次抗体（３０００倍希釈）と共に室温で１時間インキュベートして、ＥＣＬ溶液（ＮＥＮ社）中で１分間発色させて、Ｘ線フィルム（スーパーフィルム）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に２分間〜３０分間露光した。次に、ブロットを剥離緩衝液（１００ μＭ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、および６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．７）において５０℃で３０分間インキュベートして、ロード対照として抗ｐ３８抗体および抗ＥＲＫ２抗体（３０００倍希釈、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）によって再度プロービングした。特異的バンドの密度を測定して、ロード対照からの内部対照バンドによって標準化した。データは平均値＋ＳＥＭとして表した。群の差は、スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いた後、フィッシャーのＰＬＳＤを用いて比較した。ノンパラメトリックデータには、マン−ホイットニーＵ検定を適用した。統計学的有意性の基準はＰ＜０．０５であった。このウェスタンブロット分析に基づいて、ＣＦＡ誘導炎症は、ＶＲ１タンパク質レベルの持続的な増加を誘導した（図１７Ｂ）。
【００５６】
ウェスタンブロットの結果を確認するために、ＶＲ１免疫組織化学を行った。炎症によって、２日目にＶＲ１免疫反応性が増加した（図１７Ｄ）。ｐ３８活性化が炎症後のＶＲ１上方制御に貢献するか否かを試験するために、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（１μｇ）を髄腔内投与した（１日２回を２日間、１回目の注射はＣＦＡ注射の３０分前に行った）。このボーラス注射により、炎症性の熱痛覚過敏が減少され、２日目におけるＶＲ１のＣＦＡ誘導上方制御が遮断された（図１７Ｂおよび図１７Ｃ）。浸透圧ポンプによるＳＢ２０３５８０の持続的な注入も同様に、炎症後のＶＲ１の誘導を減少させた（図１７Ｄおよび図１７Ｅ）。
【００５７】
ＮＧＦ、ｐ３８活性化およびＶＲ１発現
ＣＦＡ誘導炎症後、ＮＧＦは炎症を有する足組織において産生され、ＤＲＧニューロンの細胞体に逆輸送される。ＮＧＦは、ＤＲＧニューロンにおける遺伝子発現にとって極めて重要であり、炎症性疼痛において主要な役割を有する（Ｌｉｎｄｓａｙら、Ｎａｔｕｒｅ３３７：３６２〜３６４、１９８９；およびＷｏｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ６２：３２７〜３３１、１９９４）。ＮＧＦは、ＰＣ１２細胞においてｐ３８活性化を誘導することが示されている（ＭｏｒｏｏｋａおよびＮｉｓｈｉｄａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４３８５〜２４２８８、１９９８）。上記のデータは、ｐ３８がＴｒｋＡ発現（ＮＧＦ反応性）ニューロンにおいて活性化されること、そしてｐ３８によって炎症後のＶＲ１上方制御が起こることを示す。ＮＧＦがｐ３８の炎症誘導活性化およびＶＲ１の上方制御に必要であるか否かを判定するために、ＮＧＦ抗血清（腹腔内注射、５μｌ／ｇ体重、８４ｍｇ／ｍｌ）を注射して、内因性のＮＧＦを中和した。この抗ＮＧＦ処理（１日１回を２日間、１回目の注射はＣＦＡ注射の１時間前に行う）によって、炎症性の熱痛覚過敏は実質的に減少し、程度は弱いものの機械的刺激異痛が減少した。処理はまた、ＣＦＡの投与によるｐ３８の活性化を減少させ、ＶＲ１上方制御を減少させた。ＮＧＦ（１０ μｌ中に２μｇ、１日２回を３日間、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）を髄腔内注射すると、ＤＲＧニューロンにおけるｐ−ｐ３８レベルおよびＶＲ１レベルの双方が増加した。ＮＧＦはまた、培養において増殖した成体の初代ＤＲＧニューロンにおいてｐ３８活性化を誘導した。ＮＧＦがｐ３８を通してＶＲ１を上方制御するように作用するか否かを試験するために、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（１μｇ）を、ＮＧＦと同時投与した（１日２回を３日間）。ＳＢ２０３５８０は、ＮＧＦ誘導性のＶＲ１増加を有意に抑制した。
【００５８】
実施例６：痛覚過敏におけるＥＲＫＭＡＰキナーゼの役割の特徴付け
痛覚過敏におけるＥＲＫ活性化の役割をさらに試験するために、末梢性の炎症によるＥＲＫの活性化を調べた。ＣＦＡを後足に注射すると、持続的な炎症と後角の表層（第Ｉ層〜第ＩＩｏ層）のニューロンにおける持続的なＥＲＫ活性化とが起こった。ＣＦＡはまた、後角ニューロンにおいて既知の疼痛メディエータである、プロダイノルフィンとニューロキニン−１（ＮＫ−１）の上方制御を誘導したが、これは、ＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）阻害剤であるＵ０１２６の髄腔内投与によって抑制された。ＣＦＡ誘導性ｐＥＲＫのほとんどが、浅側後角ニューロンにおいてプロダイノルフィンおよびＮＫ−１と同時局在した。Ｕ０１２６の髄腔内注射は、基底疼痛感受性に影響を及ぼさなかったが、持続的な炎症性の熱および機械的刺激過敏の確立と維持とをいずれも減弱した。したがって、侵害受容体脊髄ニューロンのサブセットにおけるＥＲＫ経路の活性化は、おそらくプロダイノルフィンおよびＮＫ−１のような遺伝子の転写調節によって、持続的な痛覚過敏に関与する。これらの結果は、痛覚過敏におけるＥＲＫの役割および急性または慢性疼痛の治療におけるＥＲＫ阻害剤の有用性のさらなる根拠となる。
【００５９】
本実験を、下記においてより詳細に説明する。
【００６０】
末梢炎症によるＥＲＫの活性化
ＥＲＫが末梢炎症によって活性化されるか否かを試験するために、ＣＦＡを注射してラットの後足に炎症を誘導し、ＥＲＫのリン酸化を測定した。特に、マサチューセッツ総合病院動物飼育施設ガイドラインに従って、成体雄性スプレージ−ドーリー系ラット（２３０ｇ〜３００ｇ）を用いた。動物をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）によって麻酔した。ＣＦＡ（１００ μｌ）を後足の足底鏡面に注射した。ＣＦＡ注射の１時間以内に、局所的な腫脹、紅斑、ならびに機械的刺激および熱刺激に対する過敏領域が起こり、これは実験期間のあいだ（４８時間）持続した。
【００６１】
ＣＦＡ注射によるＥＲＫリン酸化の誘導に関する免疫組織化学分析に関して、ラットをペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）によって深く麻酔して上行大動脈の中を生理食塩水によって還流した後、１．５％ピクリン酸を含む４％パラホルムアルデヒドによって還流した。Ｌ４−Ｌ５脊髄セグメントを切除して２時間〜４時間かけて後固定した。脊髄横断切片（浮動性、３０ μｍ）を切断して、既に記述されているように（Ｊｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ６８：５６３〜５７６、１９９５およびＪｉら、１９９９、上記）ＡＢＣ法を用いる免疫組織化学のために処理した。簡単に説明すると、切片を０．３％トライトン中で２％ヤギ血清によって室温で１時間ブロッキングして、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、切片をビオチン結合二次抗体（２００倍希釈）と共に２時間インキュベートして、ＡＢＣ複合体（５０倍希釈、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、反応産物を、２％ニッケル硫酸アンモニウムを含む０．０５％ＤＡＢ／０．００２％過酸化水素を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）において２分間〜５分間可視化した。いくつかの切片を一次抗体と共に一晩インキュベートして、ＦＩＴＣ結合二次抗体（３００倍希釈、Ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏｌａｂ）と共に室温で１時間インキュベートすることによって、免疫蛍光処理した。この分析において、以下の抗体を用いた：抗ｐＥＲＫ抗体（抗ｐＭＡＰＫ抗体とも呼ばれる；抗ウサギ抗体、５００倍希釈、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）および抗ｐＥＲＫ抗体（モノクローナル抗体、３００倍希釈、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）。この実験による結果を定量するために、Ｌ４−Ｌ５腰髄からの隣接しない切片８個を無作為に選択して、それぞれの切片における後角の表層および／または深部層における免疫反応性ニューロンプロフィールの数を、処理を知らない第三者が計数した（２０倍の対物視野で）。切片８個からの値をそれぞれの動物に関して平均した。データは平均値＋ＳＥＭとして表す。
【００６２】
この免疫組織化学分析に基づいて、ＣＦＡ注射によって誘導された炎症によって、腰膨大の同側での内側浅側後角（ｍｅｄｉａｌｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｄｏｒｓａｌｈｏｒｎ）におけるニューロンのホスホＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の誘導が得られた（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。反対側の脊髄には誘導を認めなかった（図１８Ａ）。生理食塩水（１００ μｌ）を足底内注射した場合のみ、非常に弱いｐＥＲＫ誘導が示された。ＣＦＡによるｐＥＲＫ誘導は、ニューロンに限って認められた。全てのｐＥＲＫ細胞が、ニューロン細胞のマーカーであるＮｅｕＮを発現した。ｐＥＲＫ標識ニューロンは、第Ｉ層〜第ＩＩｏ層に主に局在し、ｐＥＲＫは既に報告されているように（Ｊｉら、１９９９、上記）、核、細胞質、および樹状突起に存在した。ｐＥＲＫニューロンの数は、１０分後でピークであったが、４８時間のあいだに徐々に減少したものの上昇したままであった（図１８Ｃ）。この時間パターンは、カプサイシンの足底内注射によって誘発された一過性の（＜１時間）ＥＲＫ活性化とは実質的に異なる（Ｊｉら、１９９９、上記）。
【００６３】
ＣＦＡによるＥＲＫ活性化を、ウェスタンブロット分析によって確認した。この分析に関して、動物を屠殺して、Ｌ４−Ｌ５脊髄セグメントの後角を速やかに採取して、ホスファターゼ阻害剤（１００倍）およびプロテイナーゼ阻害剤（２５倍、Ｓｉｇｍａ）のカクテルを含む溶解緩衝液において、携帯型の乳棒によってホモジナイズした。タンパク質試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４％〜１５％勾配ゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離して、ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。フィルターを３％牛乳でブロックして、抗ｐＥＲＫポリクローナル抗体（１０００倍希釈、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＨＲＰ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、３０００倍希釈）と共に室温で１時間インキュベートして、ＥＣＬ溶液（ＮＥＮ）中で１分間可視化して、ハイパーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１分間〜３０分間露光した。次に、ブロットを剥離緩衝液（６７．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．７％β−メルカプトエタノール）において５０℃で３０分間インキュベートして、ロード対照としての抗ＥＲＫポリクローナル抗体に再プロービングした。このウェスタンブロット分析を少なくとも２回繰り返し、全ての場合について同じ結果を得た。特異的バンドの密度を、コンピューター補助造影分析システム（ＩＰｌａｂｓｏｆｔｗａｒｅ）によって測定して、ロード対照に対して標準化した。群のあいだの差は、スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いた後、フィッシャーのＰＬＳＤを用いて比較した。ノンパラメトリックデータに関しては、マン−ホイットニーＵ検定を適用した。統計学的有意性の基準はｐ＜０．０５であった。
【００６４】
このウェスタン分析に基づいて、ＥＲＫ１（４４ｋＤ）およびＥＲＫ２（４２ｋＤ）の双方のリン酸化レベルが、反対側と比較して同側の後角では増加した（図１８Ｄ）。ＥＲＫは、後角細胞の小さいサブセットにおいて活性化されるに過ぎないため、ウェスタン分析は、浅側後角におけるＥＲＫ活性化の検出において、免疫組織化学より感度が低い。
【００６５】
ｐＥＲＫがＣＦＡ注射後非常に迅速に（１０分間）ピークレベルに達したため、本発明者らは、ＣＦＡによっても痛覚過敏または疼痛関連挙動が起こるか否かを判定した。これらの研究に関して、基準値の試験を行う前に、動物を２日間毎日試験環境に慣らした。熱の試験を除き、全ての動物を上昇した針金のグリッド上に置いた。機械的刺激異痛に関しては、後足の足底表面を一連のフォンフレー繊維によって刺激した。閾値は、素早い払いのけ反応を誘発する最も小さい力として得た。熱痛覚過敏に関して、後足の足底表面は、透明なパースペックス表面（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｐａｉｎ３２：７７〜８８、１９８８）を通して輻射熱の光線に曝露した。払いのけ潜時を記録して、最大１５秒間をカットオフ値とした。払いのけ潜時は、３回の試行の平均値とした。
【００６６】
この挙動試験において、ＣＦＡ（１００ μｌ）を覚醒状態のラットの後足の足底表面に注射すると、紅斑と急速な熱痛覚過敏を生じた。足の払いのけ潜時は、１０分間および３０分間においてそれぞれ、６０％（１０．８±０．４から４．３±０．７、Ｐ＜０．０１、ｔ検定、ｎ＝３）および５０％（９．７±１．２から４．９±１．３、Ｐ＜０．０５）減少した。生理食塩水注射ラットは、如何なる熱痛覚過敏も示さなかった。
【００６７】
炎症によるプロダイノルフィンの誘導
炎症に反応したプロダイノルフィンの発現の変化を試験するために、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、インサイチューハイブリダイゼーション、および免疫組織化学を用いた。ＲＮａｓｅ保護アッセイに関して、ダイノルフィンｃＤＮＡを、プライマー

および

を用いて、ラットＤＲＧの全ＲＮＡから室温ＰＣＲによって作製し、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。プラスミドをＥｃｏＲＶによって線状にし、アンチセンスプローブをＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成して、^３２Ｐ−ＵＴＰ（ＮＥＮ社、８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）によって標識した。ＲＮａｓｅ保護アッセイを、既に報告されているように（Ｓａｍａｄら、Ｎａｔｕｒｅ２２：４７１〜４７５、２００１）、ＲＮａｓｅ保護アッセイＩＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ）プロトコールを用いて行った。簡単に説明すると、ＲＮＡ試料１０ μｇを標識プローブを４２℃で一晩ハイブリダイズさせた後、ＲＮａｓｅ消化緩衝液中でＲＮａｓｅＡ／ＲＮａｓｅＴ１混合物を用いて３７℃で３０分間消化した。最後に、試料を変性アクリルアミドゲル上で分離して、Ｘ線フィルムに露光した。β−アクチンプローブをそれぞれの試料に関してロード対照として用いた。ＲＮａｓｅ保護アッセイに関して、それぞれの実験を少なくとも２回繰り返して、全ての場合について同じ結果を得た。特異的バンドの密度を、コンピューター補助造影分析系によって測定して（ＩＰｌａｂｓｏｆｔｗａｒｅ）、ロード対照に対して標準化した。群間の差は、スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いた後、フィッシャーのＰＬＳＤを用いて比較した。ノンパラメトリックデータに関しては、マン−ホイットニーＵ検定を適用した。統計学的有意性の基準はＰ＜０．０５であった。ＲＮａｓｅ保護アッセイに基づいて、末梢性の炎症によって、ＣＦＡ注射の２４時間後および４８時間後に同側の脊髄後角において、プロダイノルフィンｍＲＮＡの実質的な上方制御が起こった（図１９Ａ）。
【００６８】
インサイチューハイブリダイゼーション分析に関して、動物をＣＯ_２チャンバーにおいて急速に屠殺して、Ｌ４−Ｌ５脊髄セグメントを採取して、低温槽上で２０ μｍの厚さに切断した。１．７ｋｂプロダイノルフィン挿入物を有するベクター（ｐＳＰ６５）は、リンダ・コビエルスキ（ＬｉｎｄａＫｏｂｉｅｒｓｋｉ）博士（ＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ）から供与された。アンチセンスＲＮＡプローブ、および対応するセンス対照プローブを、プロダイノルフィンの直線状のＤＮＡ鋳型とｄｉｇ標識混合物とを用いるインビトロ転写によって３７℃で２時間標識した。ハイブリダイゼーションを、既に記述されているように処理した（Ｊｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１５６３５〜１５６４０、１９９８）。組織切片を２時間空気乾燥させて、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、無水酢酸中（０．２５％）で１０分間アセチル化した。切片を室温で２時間プレハイブリダイズした後、ハイブリダイゼーション緩衝液中で６０℃で一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、切片を漸減濃度の（２×、１×、および０．２×）ＳＳＣにおいて全体で２時間洗浄した。次に、切片を２％ヤギ血清と共に１時間ブロッキングして、アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体（ＢｏｅｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、５０００倍希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。最後に、切片を７５ｇ／ｍｌＮＢＴ、５０ｇ／ｍｌＢＣＩＰおよび０．２４ｍｇ／ｍｌレバミゾールにおいて２時間〜２４時間可視化した。Ｌ４−Ｌ５腰髄からの隣接しない切片８個を無作為に選択して、それぞれの切片における後角の表層部および／または深層におけるｍＲＮＡ陽性ニューロンプロフィールの数を、治療割付を知らない第三者が調べた（２０倍の対物視野で）。切片８個からの値をそれぞれの動物に関して平均した。データは平均値＋ＳＥＭとして表す。このインサイチューハイブリダイゼーション分析に基づいて、主な強く標識されたプロダイノルフィンｍＲＮＡ標識ニューロンは、ＣＦＡ注射の２４時間後に同側の後角の表層部および深部の双方において認められたが、反対側では、ごく少数の弱く標識されたニューロンが検出されたに過ぎなかった（図１９Ｂ）。
【００６９】
免疫組織化学を、抗プロダイノルフィン抗体（抗モルモット抗体、３０００倍希釈、ミネソタ大学、Ｒ．Ｅｌｄｅ博士からの供与）を用いて、上記のように実施した。プロダイノルフィンペプチド免疫反応性ニューロン数の増加はまた、表層部および深部後角においてＣＦＡ誘導炎症後４８時間に認められた（図１９Ｃ）。
【００７０】
ＥＲＫ活性化およびプロダイノルフィン発現
後角におけるプロダイノルフィンｍＲＮＡ発現のＥＲＫ活性化による調節の可能性を調べた。特異的かつ強力なＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６（Ｆａｖａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８６２３〜１８６３２、１９９８）を、２回（１μｇ）、すなわちＣＦＡの足底内注射の３０分前および６時間後に、髄腔内注射した。投与に関して、ＰＥ１０カテーテルを脊髄の腰膨大の髄腔内間隙に埋め込んで、ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６を１０ μｌ（１μｇ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、１０％ＤＭＳＯに溶解）投与した。１０％ＤＭＳＯを溶媒対照として注射した。この阻害剤は、同側の後角におけるＣＦＡ誘導プロダイノルフィンｍＲＮＡを減少させた（図２０Ａ）。浅側後角におけるプロダイノルフィンｍＲＮＡ陽性ニューロン数のＣＦＡ誘導性の増加もまた、深部層における標識ニューロン数に影響を及ぼすことなく、Ｕ０１２６（２×１μｇ）によって減少した（図２０Ｂおよび図２０Ｃ）。
【００７１】
ＥＲＫ活性化およびＮＫ−１発現
初期の研究と一致して、ＣＦＡ誘導炎症後の浅側後角におけるＮＫ−１免疫反応性の増加は、上記の免疫組織化学アッセイ（Ａｂｂａｄｉｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ７０：２０１〜２０９、１９９６、およびＡｂｂａｄｉｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：８０４９〜８０６０、１９９７）において抗ＮＫ１抗体（抗ウサギ抗体、３０００倍希釈、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を用いて認められた。しかし、これまでの研究（Ａｂｂａｄｉｅら、１９９７、上記；およびＨｏｎｏｒｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：７６７０〜７６７８、１９９９）とは対照的に、本発明者らは炎症後に、より多くのＮＫ−１発現細胞を認めた（図２１Ａ）。この相違は、ほぼ間違いなくＮＫ−１陽性ニューロンに関する異なる検出閾値のためであり、本発明者らの定量は、標準的な免疫蛍光顕微鏡に基づいているが、対照動物における弱く染色された細胞、すなわち共焦点顕微鏡によって検出されるであろう細胞を含めなかった（Ａｂｂａｄｉｅら、１９９７、上記；およびＨｏｎｏｒｅら、１９９９、上記）。第Ｉ層において検出されたＮＫ−１免疫反応性ニューロンの増加（図２１Ａ）は、ホノール（Ｈｏｎｏｒｅ）ら（１９９９、上記）によって認められた染色強度がこの層において増加していることを反映した。ＥＲＫ活性化がＮＫ−１上方制御に関与するか否かを試験するために、炎症を誘導する前にＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６を浸透圧ポンプによって髄腔内に送達した（０．５ μｇ／μｌ／時間で、２日間）。特に、アルゼ（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプ（３日間ポンプ、１μｌ／時間）にＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６（０．５ μｇ／μｌ）の５０％ＤＭＳＯ溶液を満たして、ポンプのカテーテルをＣＦＡ注射の少なくとも３時間前に髄腔内に埋め込んだ。ＤＭＳＯ（５０％）を溶媒対照として用いた。ＭＥＫ阻害剤は、浅側後角におけるＮＫ−１免疫反応性ニューロンのＣＦＡ誘導性の増加を抑制した（図２１Ａおよび図２１Ｂ）。抗ＮＫ１一次抗体（５０００倍希釈、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）と共にロード対照として抗ＣＲＥＢ抗体（３０００倍希釈、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を用いるウェスタンブロット分析によっても同様に、この結果が確認された（図２１Ｃ）。
【００７２】
ｐＥＲＫ陽性ニューロンおよびプロダイノルフィン／ＮＫ−１発現ニューロンが後角細胞の同じサブセットに属するか否かを試験するために、ｐＥＲＫ／プロダイノルフィンおよびｐＥＲＫ／ＮＫ−１に関する二重免疫蛍光を行った。この免疫蛍光分析は、一次抗体（抗ｐＥＲＫモノクローナル抗体／抗ＮＫ１ポリクローナル抗体、またはウサギ抗ｐＥＲＫ抗体／モルモット抗プロダイノルフィン抗体）の混合物と共にインキュベートした後、Ｃｙ３またはＦＩＴＣのいずれかを結合した対応する二次抗体の混合物と共にインキュベートすることによって行われた。浅側後角におけるほとんど全てのプロダイノルフィンおよびＮＫ−１陽性ニューロンもまた、ＣＦＡ注射の２４時間後にｐＥＲＫを発現した（図２２Ａ〜図２２Ｈ）。
【００７３】
ＥＲＫ活性化および持続的炎症性疼痛
プロダイノルフィンおよびＮＫ−１上方制御に及ぼすＥＲＫ活性化およびその下流の作用の機能的結末を試験するために、本発明者らは、ＥＲＫ活性化の阻害が炎症性疼痛の過敏症を改変するか否かを調べた。他のＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９と同様に（Ｊｉら、１９９９、上記）、Ｕ０１２６（１μｇ）を非炎症動物の髄腔内に投与して投与の３０分後に試験したところ、機械的刺激払いのけ閾値（溶媒対照の１０８％）および熱払いのけ潜時（溶媒対照の１１３％）に関して、測定した基底疼痛感受性に有意差を示さなかった。しかし、浸透圧ポンプ（０．５ μｇ／μｌ／時間）によるＵ０１２６の髄腔内投与をＣＦＡ注射の前に開始して４８時間維持すると、２４時間および４８時間に測定した炎症誘導性の熱過敏症および機械的刺激過敏症は有意に減少した（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。
【００７４】
急性の痛覚過敏（ホルマリン足底内注射の１０分後〜６０分後）は、おそらく翻訳後変化の妨害による、ＥＲＫ活性化の阻害によって減少する（Ｊｉら、１９９９、上記）。ＣＦＡによるＥＲＫ活性化は、進行中の翻訳後変化を維持することまたはＮＫ１およびプロダイノルフィンのような遺伝子の転写を誘導することのいずれかによって、炎症性疼痛の過敏症に関与する可能性がある。前者の場合、確立された炎症におけるＥＲＫ活性化の阻害は、ＥＲＫ基質の脱リン酸化により痛覚過敏を１０分間以内に減少させると予想されるであろう。ＥＲＫ活性化の関与が転写を介する場合、ＥＲＫ活性化の阻害は、即時的作用を有しないが遅延型作用を有すると予想されるであろう。これらの２つの可能な機構を区別するために、Ｕ０１２６を、確立された炎症を有するラットに髄腔内注射して（１μｇ）（ＣＦＡ注射の２４時間後）、痛覚過敏をＵ０１２６の注射の３０分後、６時間後、および２４時間後に試験した。熱痛覚過敏も機械的刺激異痛のどちらも、３０分後に試験した場合にはそのような後処理によって有意な影響を受けなかった（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。しかし後処理は、２４時間後に熱痛覚過敏を減少させ、かつ６時間後に機械的刺激異痛を減少させ（図２４Ａおよび図２４Ｂ）、これは持続的な炎症性疼痛の維持に対してＥＲＫ活性化が遅れて関与することを示す。
【００７５】
侵害受容後角ニューロンにおけるＥＲＫ活性化
末梢性の炎症は、短い潜時の後、同側の浅側後角の第Ｉ層〜第ＩＩｏ層ニューロンにおいてＥＲＫの持続的な活性化を誘導した。ＭＥＫ阻害剤を用いてこの活性を阻害すると、後角ニューロンのこの特定のサブセットにおけるプロダイノルフィンおよびＮＫ−１発現の上昇が遮断され、炎症性の痛覚過敏が減少した。ｐＥＲＫは、プロダイノルフィンおよびＮＫ−１を発現する後角ニューロンの同じサブセットにおいてＣＦＡによって誘導された。第Ｉ層においてＮＫ−１およびダイノルフィンを発現する多くのニューロンは、突起ニューロンである（Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ７２：２５５〜２６３、１９９６；およびＮａｈｉｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．９６：２４７〜２５２、１９８９）。第Ｉ層における突起ニューロンは、ＣＦＡによる炎症後その受容領域の拡大を示し（Ｄｕｂｎｅｒら、ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｓｃｉ．１５：９６〜１０３、１９９２；およびＲｕｄａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６２２〜６２６、１９９２）、第Ｉ層におけるＮＫ−１発現ニューロンの標的化喪失によって、炎症性疼痛が消失することが示されており（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６：１５５８〜１５６１、１９９９）、これは、炎症に対するＣＮＳの反応におけるこれらの表層部ニューロンの重要な役割を示す。特定のサブセットのＣ侵害受容線維、すなわちＮＧＦ反応性かつＴｒｋＡおよびニューロペプチドを発現する線維は、ＥＲＫ活性化を示すニューロンが重なり合う領域内の第Ｉ層および第ＩＩｏ層において末端を有する。もう一つのサブセットのＣ線維、すなわち増殖因子のＧＤＮＦファミリーに反応して、ＩＢ４レクチンの選択的結合を特徴とするＣ線維は、第ＩＩｉ層に末端を有する（Ａｖｅｒｉｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１４８４〜１４９４、１９９５；Ｍｏｌｉｖｅｒら、１９９７）。これらの線維が接触するニューロンは、その多くがＰＫＣを含み（Ｍａｌｍｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８：２７９〜２８３、１９９７）、カプサイシンまたはＣＦＡ注射後にＥＲＫ活性化を示さない。したがって、痛覚過敏の調節におけるＥＲＫの役割は、特定のサブセットの侵害受容後角ニューロン、すなわち第Ｉ層〜第ＩＩｏ層に存在するサブセットのみに限定され、この活性化は、ＴｒｋＡ発現Ｃ線維のみの活性化を反映する可能性がある。
【００７６】
ＥＲＫ活性化に応答した転写調節
ｐＥＲＫは、ＣＦＡ刺激後ニューロンの核において認められ（図１８Ａ）、活性化キナーゼの転写的役割を有する可能性を示す。カプサイシンの注射後に誘導される一過性の活性化（持続は２時間未満）とは異なり（Ｊｉら、１９９９、上記）、ＣＦＡは持続的なＥＲＫ活性化を生じた（図１８Ｃ）。ＣＦＡ注射後の持続的なＥＲＫ活性化は、プロダイノルフィンｍＲＮＡの持続的な上方制御に関連するが（４８時間以上持続、図１９Ａ）、カプサイシンによって誘導される一過性のｐＥＲＫは、プロダイノルフィンｍＲＮＡのより短い持続の上方制御（＜６時間）に関連する。ＥＲＫ活性化によって、どちらもＣＲＥ含有遺伝子であるプロダイノルフィンとＮＫ１の発現が、ＣＲＥＢリン酸化によって調節される可能性がある。ＣＲＥＢは、線条体ニューロンにおけるプロダイノルフィンのドーパミン誘発発現に必要であり（Ｃｏｌｅら、１９９５、上記）、侵害刺激後にＮＫ−１発現ニューロンにおいてリン酸化される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８３：２９〜３２、２０００；およびＳｅｙｂｏｌｄ、２０００）。さらに、ＣＲＥ部位は、アメフラシにおける侵害受容ニューロンの長期感作を媒介することが示されている（Ｌｅｗｉｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１８〜２３、１９９９）。
【００７７】
ＥＲＫ活性化および炎症性痛覚過敏
Ｕ０１２６は、ホルボルエステルのような強い活性化剤の存在下においてもＥＲＫ活性化を阻害することができるが、他のシグナル伝達経路には影響を及ぼさない強力かつ選択的なＭＥＫ阻害剤である（Ｆａｖａｔａら、１９９８、上記）。本研究において用いられる用量において、この阻害剤による毒性の明白な兆候は認められず、動物は通常の挙動を示し、移動は影響を受けなかった。基底疼痛感受性は阻害剤によって改変されなかったが、持続的な炎症性疼痛は減少した。持続的な疼痛に及ぼすこの影響は、ＥＲＫシグナル伝達経路によってまたはプロダイノルフィンおよびＮＫ１のような標的遺伝子の転写の減少によって媒介される翻訳後変化が原因で起こる可能性がある。疼痛機構への関与が既に暗示されているプロダイノルフィンとＮＫ１とがＥＲＫ活性化によって調節されることは、炎症後のＥＲＫ活性化が遺伝子転写を調節することによって痛覚過敏に関与するという仮説と一致する。ＥＲＫ活性化を遮断する作用の時間的プロフィールは、この仮説をさらに支持する。対照的に、ホルマリンの足底内注射の数分以内に確立される急性の痛覚過敏は、ＥＲＫ活性化を防止することによって（Ｊｉら、１９９９、上記）減少させることができる。この作用は、転写の阻害によって媒介されるには速すぎて（＜１時間）、したがって、おそらく活性化ＥＲＫの下流の翻訳後変化を表す可能性がある。そのような翻訳後変化の基質は、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体のようなイオンチャンネルまたは受容体であってもよい（Ｗｏｏｌｆら、２０００、上記）。そのような翻訳後変化は、中枢感作、その開始刺激を何十分も持続させる用途に応じた可塑性の誘導および維持の基礎となる（Ｗｏｏｌｆら、Ｎａｔｕｒｅ３０６：６８６〜６８８、１９８３；およびＷｏｏｌｆら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１４３３〜１４４２、１９８６）。炎症性の過敏症が、炎症組織からの現行の求心性入力によって維持されるのみの中枢感作の症状発現である場合、ＥＲＫ媒介リン酸化の阻害によって中枢感作の開始を阻害すれば、重要なタンパク質が脱リン酸化されるために何十分ものあいだ過敏が減少するはずである。確立された炎症ではＭＥＫを阻害しても即時型作用を示さないが、むしろ６時間後〜２４時間後に機械的刺激過敏症および熱過敏症のみが減少するという事実は、ＥＲＫ活性化の役割が転写の調節によるのもうなずけることを示す。
【００７８】
ダイノルフィンおよびＮＫ−１は炎症性痛覚過敏に貢献する
プロダイノルフィンおよびＮＫ−１の発現と、炎症性痛覚過敏の発生との間の時間的な相関が既に証明されている。他のオピオイドペプチドとは異なり、ダイノルフィンを髄腔内注射しても鎮痛を生じない。ダイノルフィンは、何らかの病的疼痛状態において前侵害受容性であることが他の研究者によって判明している。例えば、ダイノルフィンＡ抗血清は、神経損傷後の痛覚過敏を減少させ、ニューロパシー疼痛は、プロダイノルフィンノックアウトマウスでは持続しない。ダイノルフィンの前侵害受容作用は、興奮毒性を誘発するために十分なＮＭＤＡ受容体の活性化を含む、その非オピオイド作用の結果であるように思われる。
【００７９】
炎症は、後角ニューロンにおけるＮＫ−１受容体の上方制御および一次求心性ニューロンにおいてそのリガンドの神経ペプチドである物質Ｐの上方制御を誘導する。ＮＫ−１アンタゴニストは、ＮＫ−１ノックアウトマウスを含むいくつかの異なる動物モデルにおいて炎症性疼痛（痛覚過敏と機械的刺激異痛の双方）を減少させることが既に示されている。炎症後の侵害刺激および無害な刺激に反応した後角ニューロンの樹状細胞において、ＮＫ−１受容体の量が増加して、インターナリゼーションされることは、この受容体が末梢刺激に反応した物質Ｐによって活性化されることを示す。
【００８０】
実施例７：中枢神経系におけるＰＬＡ _２の誘導なし
ＰＧＥ_２の合成に必要である遊離アラキドン酸の利用率を、ホスホリパーゼ_２（ＰＬＡ_２）が調節するため、本発明者らはまた、低分子量の分泌型ＰＬＡ_２（ｓＰＬＡ_２）または高分子量の細胞内サイトソルＰＬＡ_２（ｃＰＬＡ_２）は末梢炎症後の中枢神経系において誘導されるか否かを判定した。無傷および炎症を有するラット（１２時間）の足、脊髄、および脳からの総タンパク質抽出物におけるＰＬＡ_２活性は、ｓＰＬＡ_２の活性（すなわち、２−アラキドニル−ホスファチジルコリンからのアラキドン酸の放出；図９Ａ）またはｃＰＬＡ_２（すなわち、２−アラキドニル−ホスファチジルエタノールアミンからのアラキドン酸の放出；図９Ｂ）の活性のいずれかに都合がよいアッセイ系を用いて測定した（Ｂｉｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１４７６〜３１４８４、１９９９）。予想されるように、炎症を有する足においてｓＰＬＡ_２およびｃＰＬＡ_２の双方の活性が有意に増加した（図９Ａおよび９Ｂ）。対照的に、脊髄または脳のいずれにおいても、後足の炎症によるこれらのＰＬＡ_２活性の増加は検出されなかった。ｃＰＬＡ_２の最初の１２９個のアミノ酸残基に対するポリクローナル抗体を用いるｃＰＬＡ_２のウェスタンブロットおよび免疫組織化学分析（Ｓａｐｉｒｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１５０５〜２１５１２、１９９６）は、脊髄内のタンパク質誘導を示さなかった（図９Ｃ）。したがって、中枢性のＰＬＡ_２活性の基底レベルは、末梢炎症後に中枢神経系におけるプロスタノイドの産生の増加にとって十分である。このように、プロスタノイド産生速度がＣｏｘ−２およびＰＬＡ_２の双方によって調節される炎症の末梢部位とは対照的に、Ｃｏｘ−２のみが中枢性のＰＧＥ_２誘導の中心的な役割を有するように思われる。
【００８１】
実施例８：中枢性ＩＬ−１ β活性の阻害剤に関するアッセイ
中枢性のＩＬ−１β活性の阻害は、疼痛を測定する任意の標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）またはＩＬ−１β活性の変化を測定する任意の方法によって同定することができる（例えば、上記のように）。さらに、中枢性のＩＬ−１β活性が阻害されうるような機構の一つとは、プロインターロイキン−１βをＩＬ−１βの活性化型に変換するカスパーゼ−１の阻害を介する。多くのカスパーゼ−１阻害剤は、アルデヒド、クロロメチルケトン、フルオロメチルケトン、フルオロアシルオキシメチルケトン、ジアゾメチルケトン、またはフェニルアルキルケトンのような官能基に結合したＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ、Ａｌａ−Ａｓｐ、またはＡｓｐペプチド認識配列を含む。アルデヒド基を有するカスパーゼ−１阻害剤は可逆的であるが、クロロメチルケトン、フルオロメチルケトン、またはフルオロアシルオキシメチルケトン基を有する阻害剤は非可逆的である（「カスパーゼ阻害剤と基質（ＣａｓｐａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｄＳｕｂｓｔｒａｔｅｓ）」と題するカルビオケム技術会報、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。阻害剤

のような長い疎水性領域を有する阻害剤は、細胞透過性が増加している。カルボン酸のヒドロキシル基をメトキシ基、エトキシ基、ベンズオキシ基、またはイソプロポキシ基のようなアルコキシ基に置換するために、標準的な技術を用いてアスパラギン酸残基のカルボキシ側鎖をエステル化してもまた、カスパーゼ−１阻害剤の細胞透過性が増加する。好ましいアルコキシ基は、式−ＯＲ’を有し、ここでＲ’は、アルキルまたはアリール基である。一つの好ましい態様において、Ｒ’基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、もしくはテトラデシル基；またはシクロペンチルもしくはシクロヘキシル基のようなシクロアルキル基のような炭素原子１個〜１０個、１個〜２０個、１個〜５０個、または１個〜１００個の直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素アルキル基である。好ましいアリール基には、少なくとも１つの環が本質的に芳香族である一つまたはそれ以上の融合環からなる一価の芳香族炭化水素ラジカルが含まれ、それらは選択的に以下の置換基の一つによって置換してもよい：ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルコキシ、チオアルキル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノ。
【００８２】
候補となるカスパーゼ−１阻害剤を試験するために、カスパーゼ−１活性は、既に記述されているように、蛍光体（例えば、ＡＦＣ、ＡＭＣ、ＥＤＡＮＳ、またはＭＣＡ）または発色団（例えば、ｐＮＡ）のいずれかを含むカスパーゼ−１基質の切断速度を決定するために候補化合物の存在下および非存在下でアッセイしてもよい（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８０７７４、１９９２；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：３９３４〜３９４０、１９９４）。さらに、候補カスパーゼ−１阻害剤は、それらが疼痛の発現を減少、安定化、予防、または遅らせるか否かを判定するために、本明細書に記載する任意の炎症性疼痛モデルにおいて試験することができる。
【００８３】
候補ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載するように、ホスホ特異的抗体を用いて一つまたはそれ以上のＭＡＰキナーゼのリン酸化の阻害を測定することによって試験することができる。または、ＭＡＰキナーゼが基質をリン酸化できるか否かは、標準的なキナーゼアッセイを用いて候補化合物の存在下および非存在下において測定することができる。
【００８４】
その他の態様
前述の記述から、本発明を様々な用途および条件に適合させるために、本明細書に記載された本発明に変更および改変を行ってもよいことは明らかであると考えられる。そのような態様もまた、添付の特許請求の範囲内である。
【００８５】
本明細書において言及した全ての出版物は、本明細書において、それぞれ別々の出版物または特許出願が明確かつ個々に参照として組み入れられると示されるのと同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、片側後足の炎症から０時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、および２４時間後のＣｏｘ−２ｍＲＮＡの誘導を示すゲルの写真である。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡの増加は、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）の足底内注射後に、同側および反対側のラット腰髄Ｌ４／Ｌ５、炎症を起こした皮膚、頚髄、および視床において検出された。図１Ｃは、図１Ａのデータに基づく同側および反対側の腰髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡ誘導のグラフである。図１Ｄは、図１Ｂのデータに基づく後足、腰髄、頚髄、および視床におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡの相対的発現のグラフである。
【図２】炎症を有するラット（図２Ｂ、図２Ｃ、および図２Ｄ）および無傷のラット（図２Ａ）における１２時間後の後角ニューロンにおけるＣｏｘ−２発現の免疫組織化学分析を示す写真である（目盛り：５０ μｍ）。図２Ｄは、図１Ｂにおける炎症を有するラットの深部後角領域の高倍率写真である。ニューロンマーカーＮｅｕＮによる二重標識に基づき、ほぼ全てのＣｏｘ−２免疫標識細胞がニューロンである（図２Ｃ）。
【図３】炎症の１２時間後の脊髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡ分布を示す写真である（目盛り：１００ μｍ）。
【図４】ＣＦＡ誘導炎症後の脳脊髄液におけるプロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）レベルの増加を示す棒グラフである（「^＊」は、ｐ＜０．０１を指す）。
【図５】図５Ａは、Ｌ４後根が付随した脊髄横断切片調製物の略図である。図５Ｂは、インビトロでＡβ線維、Ａδ線維、またはＣ線維の後根を電気刺激した２時間後のＣｏｘ−２ｍＲＮＡ誘導を示すゲルの一連の写真である。「Ｎ」は刺激を示し、「Ｉ」は同側刺激を示し、かつ「Ｃ」は反対側刺激を示す。図５Ｃは、Ｃ線維の強度で坐骨神経を３０分間電気刺激してから３時間後のＣｏｘ−２ｍＲＮＡのインビボ増加が、足底内ＣＦＡ炎症後の増加より小さかったことを示すゲルの写真である。図５Ｄは、求心性活性を阻害するために十分なブピバカインを神経周囲に処理することによる坐骨神経ブロックを行っても、炎症６時間後のＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルのＣＦＡ誘導性の増加を打ち消すことができなかったことを示すゲルの写真である。列挙された誘導倍数は、β−アクチンｍＲＮＡレベルに関して標準化した後に無傷のラットに関して測定したものである。図５Ｅは、ＣＦＡ処理ラット（ＣＦＡ、ｎ＝１３）および坐骨神経ブロックを行ったＣＦＡ処理ラット（ブロック／ＣＦＡ、ｎ＝６）の脳脊髄液における６時間後のＰＧＥ_２レベルの増加を示す棒グラフである（「^＊」は、無傷のラットと比較した場合にｐ＜０．０１を示し、「＃」は、ＣＦＡ処理ラットと比較した場合にｐ＜０．０５を示す）。
【図６】図６Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定した、反対側の後足におけるＩＬ−１βレベルと比較して炎症を有する同側の後足皮膚におけるＩＬ−１βレベルの増加を示すグラフである（Ｓａｆｉｅｈ−Ｇａｒａｂｅｄｉａｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１５：１２６５、１９９５）。図６Ｂは、足底内ＣＦＡ後足炎症の２時間後および４時間後の脳脊髄液におけるＩＬ−１βレベルを示す棒グラフである（「Ｎ．Ｄ．」は検出されないことを示す）。図６Ｃは後角におけるＩ型ＩＬ１受容体の免疫学的局在を示す写真である（目盛り：１００ μｍ）。図６Ｄは、ＩＬ−１βが３時間後にインビトロで脊髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡ発現を増加させたが、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）は増加させなかったことを示すゲルの一連の写真である。ＩＬ−１βの髄腔内（ｉ．ｔ．）注射はインビボで脊髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルを増加させたが、静脈内（ｉ．ｖ．）注射はより小規模に増加させた。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、足底内ＣＦＡ注射の前にＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を静脈内または髄腔内にそれぞれ投与してから６時間後のＣｏｘ−２ｍＲＮＡレベルを示すゲルの写真である。図７Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌＩＬ−１ｒａがインビトロ脊髄切片における活性誘発Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡ誘導に影響を及ぼさなかったことを示すゲルの写真である。図７Ｄは、ＣＦＡ足底内注射の１５分前に髄腔内投与されたＩＬ−１受容体アンタゴニスト（「ＣＦＡ／ＩＬ−１ｒａ」）６μｇ、または、カスパーゼ−１阻害剤であるＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（「ＣＦＡ／ＹＶＡＤ」）１ナノモルが、６時間後のＣｏｘ−２ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示す棒グラフである（「^＊」はＣＦＡと比較した場合にｐ＜０．００５を示す、ｎ＝３）。図７Ｅは、ＹＶＡＤが炎症の１２時間後に脳脊髄液中のＰＧＥ_２レベルを５０％減少させ、炎症の２４時間後には７０％減少させたことを示す棒グラフである（「^＊」はＣＦＡと比較してｐ＜０．０１を示す、１群ｎ＝７〜１０）。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＣＦＡ炎症誘導の４８時間後に選択的Ｃｏｘ−２阻害剤ＮＳ３９８（３０ μｇ、ＲＢＩ社から入手）の髄腔内投与は、処理ラットの機械的刺激応答（図８Ａおよび８Ｂ）および熱応答（図８Ｄ）を炎症前に認められた反応レベル方向に減少させるが、静脈内投与は減少させなかったことを示すグラフである。対照的に、ＮＳ３９８は、無傷のラットにおける感受性を変化させなかった。図８Ｅおよび図８Ｃは、ＹＶＡＤ（１ｎｍｏｌ）の髄腔内投与が、熱払いのけ潜時に有意に影響を及ぼさなかったが、溶媒対照と比較してＣＦＡ炎症を有する後足の機械的刺激閾値を増加させたことを示すグラフである（ｐ＜０．０５）。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、無傷動物および炎症後１２時間の炎症動物からの新鮮なラット皮膚、脊髄、および全脳ホモジネートにおけるｓＰＬＡ_２活性レベルおよびｃＰＬＡ_２活性レベルをそれぞれ示す棒グラフである。表示の組織ホモジネート（３０ μｇ）のＰＬＡ_２活性は、［^１４Ｃ］２−アラキドニル−ホスファチジルコリンから３０分間で放出された（図９Ａ）、または［^１４Ｃ］２−アラキドニル−ホスファチジルエタノールアミンから１２０分間で放出された（図９Ｂ）［^１４Ｃ］アラキドン酸の１分間あたりの数（ｃｐｍ）として表記する（スチューデントｔ検定に基づいて無傷のラットと比較した場合に「^＊」はｐ＝０．００６を示し、「^＊＊」はｐ＜０．０５を示す、ラット数ｎ＝４）。図９Ｃは、無傷のラットおよび炎症後１２時間の炎症ラットにおけるｃＰＬＡ_２発現のウェスタンブロット分析を示すゲルの写真である。β−アクチンは、ロードの対照として用いた。
【図１０】ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＰＤ９８０５９（ＥＲＫ阻害剤）およびＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）の非存在下または存在下で、ＤＲＧ細胞をインビトロにおいて４時間ＩＬ−１β処理した後のＣＯＸ−２ｍＲＮＡ誘導を示すゲルの写真である。
【図１１】生理食塩水（Ｓａｌ）またはＩＬ−１β（１０ｎｇ）の髄腔内投与から４時間後のＬ４ＤＲＧにおけるＣＯＸ−２ｍＲＮＡレベルを示すゲルの写真である。
【図１２】ＥＲＫ（「ｐＥＲＫ」）およびｐ３８（「ｐ−ｐ３８」）に対するリン特異的抗体を用いた、ＤＲＧ初代培養におけるＩＬ−１βによるＥＲＫおよびｐ３８の誘導のウェスタンブロット分析の写真である。
【図１３】ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０およびＰＤ９８０５９の存在下または非存在下におけるＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）による４時間の刺激後のＤＲＧ初代培養物の培養培地におけるＰＧＥ_２レベルの棒グラフである。
【図１４】予備神経損傷モデル（「ＳＮＩ」）および慢性結紮損傷モデル（「ＣＣＩ」）を含む、ニューロパシー疼痛ラットモデルの脊髄におけるＣｏｘ−２ｍＲＮＡ発現の誘導を示すゲルの写真である。Ｃｏｘ−２ｍＲＮＡはまた、坐骨神経の完全な離断（「軸索切断」）後にも誘導された。
【図１５】炎症がＤＲＧニューロンにおける持続的なｐ３８活性化を誘導することを示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ｐ３８リン酸化が後足へのＣＦＡ注射の２日後にＤＲＧニューロンにおいて増加することを示す免疫組織化学分析の写真である（目盛り、５０ μｍ）。図１５Ｃは、ＤＲＧ中のｐ−ｐ３８陽性ニューロンの割合（％）として測定した、ＣＦＡ投与後のｐ３８リン酸化の時間経過を示す棒グラフである［（ｎ＝５）、無傷の対照と比較して、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１］。図１５Ｄは、一定レベルの染色を示したニューロンの数を示す棒グラフである。このグラフは、炎症の２日後にｐ−ｐ３８免疫染色ニューロンの強度が増加していることを示す。各条件について、動物３匹からニューロン３００個を測定した。
【図１６】ｐ３８阻害がＣＦＡ誘導炎症性熱痛覚過敏の遅延相を緩和することを示す棒グラフである。図１６Ａは、足の厚みに基づき、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０の髄腔内注入が、ＣＦＡを注射した足における炎症の発生を変化させないことを示す。ＳＢ２０３５８０（１μｇ／μｌ）および対照溶媒（生理食塩水）を、ＣＦＡ注射の前に髄腔内に埋め込んだカテーテルに接続した浸透圧ポンプによって注入した（０．５ μｇ／０．５ μｌ／時間）。図１６Ｂおよび図１６Ｃは、ＣＦＡ投与の前に図１６Ａに関して記述したようにＳＢ２０３５８０による処理の結果を示す棒グラフである。この前処理は、ＣＦＡ注射の２４時間後および４８時間後における炎症性の熱痛覚過敏の遅延相を減少させた（図１６Ｂ）。機械的刺激異痛は減少しなかった（図１６Ｃ）。熱感受性および機械的刺激感受性を、後足の払いのけ潜時および後足の払いのけ閾値によってそれぞれ測定して、溶媒対照のＣＦＡ前の基準値測定値の割合（％）として表記した［^＊＊、溶媒対照と比較してＰ＜０．０１（ｎ＝８）］。図１６Ｄおよび図１６Ｅは、ＣＦＡによる処理後のＳＢ２０３５８０投与の影響を示すグラフである。ＣＦＡ処理から２４時間後にＳＢ２０３５８０（１μｇ）を髄腔内注射すると、炎症性熱痛覚過敏が遅れて阻害された。熱感受性および機械的刺激感受性を、阻害剤投与から０．５時間後、３時間後および２４時間後に試験した［^＊、溶媒（生理食塩水）対照と比較してＰ＜０．０５（ｎ＝８）］。
【図１７】ｐ３８活性化がＤＲＧニューロンにおける炎症誘導ＶＲ１上方制御を媒介することを示す。図１７Ａは、ＲＮａｓｅ保護アッセイからのゲルの写真である。このアッセイでは、ＣＦＡ誘導炎症後のＶＲ１ｍＲＮＡレベルの増加を検出できなかった。「倍数（ｆｏｌｄ）」とは、アクチン対照に関して標準化した後の、対照に対する比較可能なレベルを表す。図１７Ｂは、炎症後にＶＲ１タンパク質の発現の増加を示すウェスタンブロットの写真である。２日目のこのような上方制御は、ＳＢ２０３５８０の髄腔内注射（１μｇ、１日２回を２日間）によって阻止された。「倍数」とは、ロード対照に関して標準化した後の対照に対する比較可能なレベルを表す。図１７Ｃは、図１７ＢからのＶＲ１タンパク質のレベルを定量する棒グラフである（^＊＊、対照と比較してｐ＜０．０１；＋、ＣＦＡと比較してＰ＜０．０５、ｎ＝５）。図１７Ｄは、炎症から２日後のＶＲ１レベルの増加を確認する、免疫組織化学分析の写真である。ＶＲ１タンパク質発現のこの誘導は、図１６Ａに関して記述したように浸透圧ポンプを用いて送達されたＳＢ２０３５８０によって阻害された（目盛り、５０ μｍ）。図１７Ｅは、図１７Ｄに基づくＶＲ１陽性ニューロンの割合（％）を示す棒グラフである（^＊＊、対照と比較してＰ＜０．０１；^＋＋、ＣＦＡと比較してｐ＜０．０１、ｎ＝５）。
【図１８】ＣＦＡがＥＲＫの持続的な活性化を誘導することを示す。図１８Ａは、後足へのＣＦＡ注射の１０分後に同側脊髄（矢印で示す）の第Ｉ層〜第ＩＩｏ層のニューロンにおいてＥＲＫリン酸化が誘導されることを示す低倍率画像の写真である（目盛り、２００ μｍ）。図１８Ｂは、ＣＦＡ注射から１０分後の同側脊髄の内側浅側後角におけるＥＲＫ活性化を示す図１８Ａの高倍率画像である（目盛り、５０ μｍ）。図１８Ｃは、同側後角の表層（Ｉ〜ＩＩｏ）におけるｐＥＲＫ陽性ニューロンの数によって測定したＣＦＡ投与後のｐＥＲＫ誘導の時間経過を示す棒グラフである。データを、平均値＋ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。図１８Ｄは、ＣＦＡ注射の３０分後および６時間後に、反対側（Ｃ）と比較して同側の（Ｉ）後角ではＥＲＫ１（４４ｋＤ）およびＥＲＫ２（４２ｋＤ）双方のＥＲＬリン酸化が増加したことを示すウェスタンブロットの写真である。下のパネルは、ロード対照としての全ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のレベルを示す。「倍数」とは、ロード用に標準化した後の対応する反対側に対する比較可能なレベルを表す。
【図１９】ＣＦＡが後角におけるプロダイノルフィンの上方制御を誘導することを示す。図１９Ａは、ＣＦＡ注射から２４時間後および４８時間後に同側の後角におけるプロダイノルフィンｍＲＮＡの増加を示すＲＮａｓｅ保護アッセイからのゲルの写真である。「倍数」とは、ロード用に標準化した後の対照に対する比較可能なレベルを表す。図１９Ｂは、ＣＦＡ処理から２４時間後の同側の表層部または深部の後角ニューロンにおけるプロダイノルフィンｍＲＮＡの発現の増加を示すインサイチューハイブリダイゼーションの写真である（目盛り、５０ μｍ）。図１９Ｃは、４８時間後におけるＣＦＡ注射による同側の表層部および深部の後角において誘導されたプロダイノルフィン免疫反応ニューロンの数の増加を示す写真である（目盛り、５０ μｍ）。
【図２０】ＥＲＫ活性化がプロダイノルフィン発現を調節することを示す。図２０Ａは、２４時間後の後角におけるプロダイノルフィンｍＲＮＡのＣＦＡ誘導性の増加が、Ｕ０１２６（１μｇ、ＣＦＡの３０分前および６時間後に髄腔内注射した）によって部分的に抑制されることを示すゲルの写真である。「倍数」とは、ロード用に標準化した後の対照に対する比較可能なレベルを表す。図２０Ｂは、ＣＦＡ注射から２４時間後の同側後角の第Ｉ層〜第ＩＩ層および第ＩＩＩ層〜第ＶＩ層におけるプロダイノルフィンｍＲＮＡ陽性ニューロンの定量を示す棒グラフである［^＊、対照と比較してＰ＜０．００１；＋、ＣＦＡと比較してＰ＜０．００１（ｎ＝４）］。図２０Ｃは、ＣＦＡ注射から２４時間後に、浅側後角におけるプロダイノルフィンｍＲＮＡ標識ニューロンのＣＦＡ誘導性の増加がＵ０１２６によって阻害されることを示すインサイチューハイブリダイゼーションの写真である（目盛り、５０μｍ）。
【図２１】ＥＲＫ活性化がＮＫ−１発現を調節することを示す。図２１Ａは、４８時間後の内側浅側後角におけるＮＫ−１免疫反応性のＣＦＡ誘導性の増加が、浸透圧ポンプによって送達されたＵ０１２６によって抑制されることを示す写真である（目盛り、５０μｍ）。図２１Ｂは、ＣＦＡ注射から４８時間後の同側後角の第Ｉ層〜第ＩＩｏ層におけるＮＫ−１ニューロンの数の定量を示す棒グラフである［^＊、対照と比較してＰ＜０．００１；^＋、ＣＦＡと比較してＰ＜０．００１（ｎ＝５）］。図２１Ｃは、２４時間後の後角におけるＣＦＡ誘導性ＮＫ−１の増加がＵ０１２６（１μｇ、ＣＦＡ注射の３０分前および６時間後に髄腔内注射）によって阻害されることを示すウェスタンブロットの写真である。構成的に発現されるタンパク質であるＣＲＥＢをロード対照として用いた。「倍数」とは、ロード用に標準化した後の対照に対する比較可能なレベルを表す。
【図２２】ＥＲＫがプロダイノルフィン発現ニューロンおよびＮＫ−１発現ニューロンのサブセットにおいて活性化されることを示す。ｐＥＲＫの多くは、ＣＦＡ注射から２４時間後の内側浅側後角において、プロダイノルフィン（図２２Ａ、図２２Ｃ、および図２２Ｅ）およびＮＫ−１（図２２Ｂ、図２２Ｄ、および図２２Ｆ）と共に局在する。矢印は二重標識ニューロンを示す（目盛り、２０ μｍ）。
【図２３】ＭＥＫ阻害剤の持続的注入がＣＦＡ誘導炎症性疼痛を減少させることを示す棒グラフである。ＣＦＡ注射の前にＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６を浸透圧ポンプ（０．５ μｇ／μｌ／時間）によって送達すると、ＣＦＡ注射から２４時間後および４８時間後に熱痛覚過敏（図２３Ｂ）および機械的刺激異痛（図２３Ｂ）が減少する。これらをそれぞれ、足の払いのけ潜時および足の払いのけ閾値として測定し、溶媒対照（５０％ＤＭＳＯ）のＣＦＡ前の基底測定値の割合（％）として表記する［^＊、溶媒対照と比較してＰ＜０．０１（ｎ＝８）］。
【図２４】ＭＥＫ阻害剤による後処理が炎症性疼痛に対して遅延型作用を有することを示す棒グラフである。Ｕ０１２６（１μｇ）または溶媒（１０％ＤＭＳＯ）をＣＦＡ注射の２４時間後に髄腔内投与した。熱痛覚過敏（図２４Ａ）および機械的刺激異痛（図２４Ｂ）を、Ｕ０１２６投与の３０分後、６時間後、および２４時間後に試験した［^＊、対応する溶媒対照と比較してＰ＜０．０５（ｎ＝１０）］。データは、溶媒対照のＣＦＡ前基底測定値の割合（％）として表記する。
【図２５】痛覚過敏に関係する経路の略図である。
【図２６】ＮＧＦが炎症後のｐ３８活性化に必要であり、かつこれはＤＲＧにおいてｐ３８を介したＶＲ１上方制御をもたらすことを示す。図２６Ａおよび図２６Ｂは、ＮＧＦ抗血清による処理（８４ｍｇ／ｇ体重で１日１回の腹腔内注射を２日間）が、炎症性疼痛、特に熱痛覚過敏を緩和するのみならず、ＤＲＧにおけるｐ−ｐ３８レベルおよびＶＲ１レベルのＣＦＡ誘導性の増加を抑制することを示す棒グラフである（ＣＦＡと比較して、^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；ｎ＝３）。図２６Ｃおよび図２６Ｄは、ＮＧＦ（２μｇ、１日２回を３日間）の髄腔内注射がｐ−ｐ３８およびＶＲ１の発現を増加させることを示す写真および棒グラフである（対照（生理食塩水）と比較して、^＊＊、ｐ＜０．０１；ｎ＝３、目盛り、５０ μｍ）。図２６Ｅは、ＮＧＦ誘導性のＶＲ１増加が、ｐ３８阻害剤２０３５８０（１μｇ）をＮＧＦとの３日間同時投与によって遮断されることを示す棒グラフである［^＊＊、溶媒（生理食塩水）と比較してＰ＜０．０１；^＋＋、ＮＧＦと比較してＰ＜０．０１、ｎ＝３］。図２７Ｆは、ＮＧＦ髄腔内投与後のＶＲ１免疫染色ニューロンの強度増加もまた、ｐ３８阻害によって減少することを示す、強度頻度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の棒グラフである。それぞれの場合について、動物３匹からニューロン３００個を測定した。

Claims

疼痛を治療、減少、または予防する方法であって、以下の段階を含む方法：
ＩＬ−１β活性を減少させる化合物を、疼痛を治療、減少、または予防するために十分な量で哺乳動物の中枢神経系に接触させる段階であって、化合物が、ＩＬ−１βｍＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベル、ＩＬ−１β活性、ＩＬ−１βｍＲＮＡもしくはタンパク質の半減期、または受容体もしくは別の分子へのＩＬ−１βの結合を減少させる段階。
ｐ３８の酵素活性またはリン酸化レベルを減少させる化合物を、疼痛を治療、減少、または予防するために十分な量で、哺乳動物の中枢神経系に接触させる段階を含む、疼痛を治療、減少、または予防する方法。
接触段階が、哺乳動物の中枢神経系に化合物を投与する段階を含む、請求項１または２記載の方法。
化合物が、髄腔内、髄質内、脳内、脳室内、頭蓋内、硬膜外、脊髄内、または頭頂内に投与される、請求項３記載の方法。
化合物が哺乳動物の血液脳関門を通過する、請求項１記載の方法。
接触段階が、哺乳動物に、化合物を静脈内、非経口、皮下、筋肉内、眼内、脳室内、腹腔内、経口、局所、または鼻腔内投与する段階を含む、請求項５記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
化合物がＩＬ−１受容体アンタゴニストまたはカスパーゼ−１阻害剤である、請求項１記載の方法。
リン酸化またはＥＲＫ活性を阻害する化合物を哺乳動物の末梢または中枢神経系に投与する段階をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
ＭＡＰキナーゼの酵素活性またはリン酸化レベルを減少させる化合物を、疼痛を治療、減少、または予防するために十分な量で哺乳動物の末梢に接触させる段階を含む、疼痛を治療、減少、または予防する方法。
ＭＡＰキナーゼの酵素活性またはリン酸化レベルを減少させる化合物を、哺乳動物の中枢神経系に投与する段階をさらに含む、請求項１０記載の方法。
化合物が、髄腔内、髄質内、脳内、脳室内、頭蓋内、硬膜外、脊髄内、または頭頂内に投与される、請求項１１記載の方法。
化合物が哺乳動物の血液脳関門を通過する、請求項１１記載の方法。
接触段階が、哺乳動物に、化合物を静脈内、非経口、皮下、筋肉内、眼内、脳室内、腹腔内、経口、局所、または鼻腔内投与する段階を含む、請求項１０または１３記載の方法。
ＭＡＰキナーゼがｐ３８またはＥＲＫである、請求項１０または１１記載の方法。
ｐ３８のリン酸化または活性を阻害する化合物および、ＥＲＫのリン酸化または活性を阻害する化合物を投与する、請求項１０または１１記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項１０記載の方法。
以下の段階を含む、化合物が、哺乳動物の中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を阻害するか否かを判定するスクリーニング方法：
（ａ）哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階；ならびに
（ｂ）化合物が疼痛またはＩＬ−１β活性の減少を引き起こす場合はそれによって化合物がＩＬ−１β活性を阻害することが決定される、化合物の存在下および非存在下で哺乳動物における疼痛を測定する段階または哺乳動物の中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を測定する段階。
以下の段階を含む、化合物が哺乳動物の中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を選択的に阻害するか否かを判定するスクリーニング方法：
（ａ）哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階；ならびに
（ｂ）化合物が末梢よりも中枢神経系においてＩＬ−１β活性のより大きな減少を引き起こす場合はそれによって化合物が中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害することが決定される、化合物の存在下および非存在下で哺乳動物の中枢神経系と末梢の双方におけるＩＬ−１β活性を測定する段階。
以下の段階を含む、化合物が哺乳動物の中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を選択的に阻害するか否かを判定するスクリーニング方法：
（ａ）第一の哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階；
（ｂ）化合物の存在下および非存在下で第一の哺乳動物の末梢におけるＩＬ−１β活性を測定する段階；
（ｃ）第一の哺乳動物または第二の哺乳動物の中枢神経系に化合物を投与する段階；ならびに
（ｄ）化合物が末梢よりも中枢神経系においてＩＬ−１β活性のより大きな減少を引き起こす場合はそれによって化合物が中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を選択的に阻害することが決定される、化合物の存在下および非存在下で段階（ｃ）の第一の哺乳動物または第二の哺乳動物の中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を測定する段階。
以下の段階を含む、化合物が哺乳動物の中枢神経系におけるＩＬ−１β活性を選択的に阻害するか否かを判定するスクリーニング方法：
（ａ）第一の哺乳動物の末梢に化合物を投与する段階；
（ｂ）化合物の存在下および非存在下で第一の哺乳動物における疼痛を測定する段階；
（ｃ）第一の哺乳動物または第二の哺乳動物の中枢神経系に化合物を投与する段階；ならびに
（ｄ）化合物が末梢よりも中枢神経系に投与された場合に疼痛のより大きな減少を引き起こす場合はそれによって化合物が中枢神経系においてＩＬ−１β活性を選択的に阻害することが決定される、化合物の存在下および非存在下で段階（ｃ）の第一の哺乳動物または第二の哺乳動物における疼痛を測定する段階。
ＩＬ−１β活性または疼痛を測定する前に、哺乳動物、第一の哺乳動物、または第二の哺乳動物の末梢において炎症を誘導する段階をさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
ＩＬ−１β活性または疼痛を測定する前に、哺乳動物、第一の哺乳動物、または第二の哺乳動物の末梢においてニューロパシーを誘導する段階をさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
化合物が、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、眼内、脳室内、腹腔内、経口、局所、または鼻腔内に投与される、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
化合物が、その全てが哺乳動物に同時に投与される、少なくとも５個の化合物を含むライブラリのメンバーである、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
化合物が、ｐ３８またはＥＲＫのリン酸化または活性を阻害する、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
化合物が、ＣＲＥＢのリン酸化または活性を阻害する、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
哺乳動物が、齧歯類、サル、モルモット、またはウサギである、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
齧歯類がマウスまたはラットである、請求項２８記載の方法。