JP2004534524A - 病原性および共生ワクチン抗原 - Google Patents
病原性および共生ワクチン抗原 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004534524A JP2004534524A JP2002575648A JP2002575648A JP2004534524A JP 2004534524 A JP2004534524 A JP 2004534524A JP 2002575648 A JP2002575648 A JP 2002575648A JP 2002575648 A JP2002575648 A JP 2002575648A JP 2004534524 A JP2004534524 A JP 2004534524A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- polypeptide
- nucleic acid
- acid sequence
- symbiotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/22—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Neisseriaceae (F), e.g. Acinetobacter
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本発明は、共生細菌タンパク質に対して惹起された血清に結合するポリペプチド抗原を同定することに基づいて、これまでに同定されていないワクチン抗原について共生細菌および病原性細菌をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法によって同定された抗原を含むワクチン組成物およびワクチン組成物の調製方法も提供される。抗原およびその使用も記載される。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫応答を刺激し、そしてナイセリア感染の予防に有用である組成物およびワクチンを調製するための方法に関する。特に、本発明は、広いスペクトルの防御免疫を与えるワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
髄膜炎菌疾患は、世界中の健康問題として特に重要であり、そして多くの国において感染の発生率は上昇している。Neisseria meningitidis(髄膜炎菌)は、髄膜炎菌敗血症を含む疾患を引き起こす生物であり、これは、急速な発症および高い死亡率に関連し、約22%の症例が死亡している。
【0003】
現在、髄膜炎菌疾患に対する防御免疫を与えるワクチンは、N. meningitidisの多くの異なる株のため、限定された防御を提供するにすぎない。血清群抗原、すなわち莢膜多糖に基づくワクチンは、感染に対して短寿命の防御のみを提供し、そして北アメリカおよびヨーロッパで通常見られる多くの株に対して防御しない。これらのワクチンのさらなる欠点は、これらが、通常感染を受けやすい最も弱い群の1つである2歳以下の子供について、低レベルの防御しか提供しないことである。現在英国で使用されるより新しい複合ワクチンは、これらの問題のいくつかを示すが、髄膜炎菌のC血清群に対してのみ有効である。
【0004】
Goldら(Journal of Infectious Diseases, 137巻2号, 1978年2月, 112-121頁)は、N. lactamicaの感染によって交差反応性抗体が誘導され、N. meningitidisに対する自然免疫の発生を援助し得ることを報告している。この結論は、N. lactamica感染に応答して生じる補体依存性殺菌活性を有する抗体と交差反応するという観察に基づいた。しかし、CannおよびRogers(J. Med. Microbiol., 30巻, 1989年, 23-30頁)は、病原性および共生のNeisseria種の共通抗原に対する抗体を検出したが、同じ抗原に対する抗体が、殺菌および非殺菌の血清の両方ともに存在することも観察した。したがって、交差反応性殺菌性抗体の原因となる抗原を同定することはできなかった。
【0005】
髄膜炎菌疾患に対する弱毒化生ワクチンは、Tangら(Vaccine 17, 1999, 114-117頁)に示唆されており、そこでは、N. meningitidisの生きた弱毒化された株が経粘膜送達され得る。Tangはまた、病原性細菌による感染に対して防御するための共生細菌の使用についてコメントし、髄膜炎菌感染に対する防御を誘導する交差反応性エピトープが定義されておらず、したがってN. meningitidisの遺伝学的に改変された株の使用が好ましいと結論している。
【0006】
Frasch(Meningococcal Disease, Cartwright編(1995);10章, 245-283頁)は、髄膜炎菌ワクチンの歴史および開発を包括的に記述している。Fraschは、多糖に基づくワクチンの開発を述べ、そして代替のワクチン候補の探索における同時期の開発も述べている。Fraschは、血清群Aおよび血清群C多糖などの莢膜成分に基づくワクチンについて広範な部分で論じている−病原性Neisseriaとは異なり、共生N. lactamicaは莢膜を有しないことに注目すること。莢膜は、しばしばあまり免疫原性でないが、キャリアタンパク質を使用すると免疫原性になり得ることが知られている。
【0007】
Pollard(Pediatr. Infect. Dis. J. (2000); 19, 333-45頁)は、グラム陰性のN. meningitidis生物の微生物学的な概要を提供する。Pollardは、髄膜炎菌の外膜を囲む多糖莢膜の化学的組成に基づいて、12もの異なる血清群を同定し、したがって、ワクチンは、これらの多糖血清群にターゲティングされる。
【0008】
Cartwrightら(Vaccine 17(1999), 2612-2619頁)は、ワクチンの代替アプローチの使用を述べ、ここでは、新規なワクチン組成物が、PorAタンパク質を含み、そして、N. meningitidisの株に対して良好な免疫応答を誘起する。まず、特異的な表面に露出したタンパク質が同定され、そして6つのPorAタンパク質を含むOMVが調製される。
【0009】
Fuscoら(JID(1997); 175, 364-72頁)は、精製された組換えPorBポリンタンパク質を含むB群の髄膜炎菌複合ワクチンの生成を記述している。Fuscoらは、Neisseriaの病原性株からの表面タンパク質の同定、およびワクチン組成物中に含有することを教示する。
【0010】
Perrinら(第11回International Pathogenic Neisseria Conference, 要約(1998)), 348頁およびInfect. Immun. (1999)は、ゲノムサブトラクションの技術、すなわち、病原性細菌から共生細菌のゲノムデータを差し引くことを記述している。この技術は、おそらく細菌の病原体の特異的な毒性に関係し、したがっておそらく潜在的なワクチン抗原である、染色体の領域を同定する可能性を有する。
【0011】
Pizzaら(Science (2000) 287; 1816-1820頁)は、潜在的なワクチン候補抗原を同定するために、N. meningitidisの毒性の血清群B株の全ゲノムの配列決定を記述している。Pizzaらは、病原性Neisseriaから適切なワクチン抗原を同定するために、表面に発現されたタンパク質のin silico予測および高スループットスクリーニングを利用する。
【0012】
それにもかかわらず、ナイセイア感染に対するさらなるおよび良好なワクチンが必要なままである。
【0013】
細菌、特にNeisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリーのグラム陰性細菌から選択される病原性細菌、例えば、N. meningitidisおよびN. gonorrhoeaeからの感染に対する防御免疫を与えるワクチンに組み込むための免疫原性タンパク質を同定することが望まれている。さらに、幼児ならびに成人に防御免疫を与え、そしてその防御が長期間であるワクチンを提供することが望まれている。また、無症状感染、すなわち髄膜炎菌または淋菌感染の症状が直ちに現れず、感染した個体が、病原体のキャリアとして行動し得る感染、に対して防御するワクチンを提供することも利点であり得る。さらに、N. meningitidisの株のすべてまたは広い範囲に対して防御することが利点である。他のナイセリア感染、特に淋病に対するワクチンを提供することがさらにいっそう望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明の目的は、抗原、免疫原、免疫刺激成分を含む組成物、それらに基づくワクチン、および当該技術分野における問題点に対処するあるいは少なくとも改善する抗原を同定する方法を提供することである。
【0015】
本発明は、確認された問題点への新しいアプローチに基づき、ワクチンが防御すべき病原体と同じファミリーの共生生物および病原性生物の両方における免疫原性成分を同定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明は、共生Neisseriaのような共生細菌に対して惹起された血清と相互作用する抗原を同定するための組み合わされた方策を用いる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0017】
第1の方策は、N. lactamicaのような共生細菌からのゲノムライブラリーの構築を含む。このアプローチは、潜在的な抗原性ポリペプチドがファージ表面上に発現されるファージディスプレイライブラリーを生成するように、組換えファージにおいてN. lactamicaゲノムのフラグメントを発現させることを含む。防御N. lactamica抽出物に対して惹起された血清と反応するファージが単離される。これによって、免疫反応性タンパク質をコードするN. lactamica配列は潜在的な抗原として同定され、ナイセリア感染を防御するためのワクチンに好適に含有される。
【0018】
本発明の方法によって同定されたN. lactamica免疫原性タンパク質抗原はまた、N. meningitidisのような他の病原性細菌において相同タンパク質を同定するための出発点として役立つ。したがって、本発明は、共生生物および病原性生物の両方において全く新しいクラスのワクチン抗原の同定を可能にする。
【0019】
第2の方策は、共生生物に対して惹起された血清を病原性Neisseriaからの抗原の調製物と組み合わせることを含む。共生血清中の抗体と病原性抗原との結合は、これまでに知られていない免疫原性の可能性を有する抗原を同定するために分析される。
【0020】
したがって、本発明の第1の局面は、抗原を同定する方法にあり、この方法は、
a.共生細菌または共生細菌からの抽出物に対する抗体を得る工程;
b.該抗体を、共生細菌または病原性細菌のいずれかから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが抗体に結合するかどうかを決定する工程;および
d.ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程、を含む。
【0021】
本発明の1つの実施態様では、この方法は、
a.共生細菌または共生細菌からの抽出物に対する抗体を得る工程;
b.該抗体を、共生細菌または病原性細菌のいずれかの発現ライブラリーから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが抗体に結合するかどうかを決定する工程;
d.ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程;および
e.発現ライブラリーから該抗原を発現するクローンを単離する工程、を含む。
【0022】
共生細菌または共生細菌からの抽出物に対する抗体は、該細菌または該抽出物に対して惹起された血清中に含まれ得る。そして以下の特定の実施例において、抗体は、動物に共生体タンパク質を免疫することによって得られる。抗体はまた、共生細菌に感染した患者、患者の血清、粘膜分泌物などから得られ得る。
【0023】
本発明の特定の実施態様では、上記単離工程(工程(e))は、
(i)血清中の抗体に結合するポリペプチドの分子量を同定する工程;
(ii)該分子量を、ポリペプチドが由来する細菌のゲノムによってコードされるポリペプチドの分子量と関連づける工程;および
(iii)該ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする対応の核酸との同一性を決定する工程、を含む。
【0024】
ポリペプチドの分子量を決定するために適切な方法は多い。分子量決定の適切な方法としては、質量分析、電気泳動、またはクロマトグラフィーが挙げられる。以下で詳述する本発明の好適な実施態様においては、ポリペプチドの分子量は、SELDI質量分析によって決定される。
【0025】
抗原は、共生生物または病原性生物のいずれかから得られる。一般に、抗原はポリペプチドであり、そして、ポリペプチドが関連した生物の発現ライブラリーから得られるタンパク質の形態であるかどうか、またはそれらが細胞抽出物の形態であるかどうかは任意である。本発明の質量分析に基づく実施態様について、ポリペプチドは、溶液または懸濁液の形態、代表的には、外膜タンパク質のデタージェント抽出物であることが好ましい。ゲノムライブラリーに基づく実施態様については、ポリペプチドは、好ましくは、ファージディスプレイライブラリーのようなゲノムライブラリーから発現される。後者の場合、ポリペプチド抗原を発現するクローンは、ファージミドベクター内にある。
【0026】
本発明の方法における使用に適切なゲノムライブラリーは、共生ゲノムまたは病原性ゲノムのいずれかに由来し得る。病原性ゲノムが使用される場合、スクリーニング工程の結果は、病原性生物と共生生物との間の交差反応を有するポリペプチドの同定に使用される。
【0027】
共生微生物は、疾患を引き起こすことなく、宿主生物でコロニー形成し得る微生物である。多くの異なる共生細菌が存在する。共生Neisseriaは本発明における使用に適切であり、これらの共生Neisseriaは、代表的には、N. lactamica、N. cinerea、N. elongata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、N. perflava、およびN. subflavaからなる群より選択される。これらの共生生物の異なる種は、口腔または鼻の領域、または他の粘膜表面でコロニー形成することが知られており、したがって各々の種は、正常にコロニー形成する体の領域に応じて異なる抗原を生じ得る。
【0028】
共生生物に対して惹起された血清は、本発明のスクリーニング方法の出発点として特に有利であることが見出されている。病原性生物または抽出物に対して惹起された血清(例えば、回復期血清)とは異なり、共生血清は、より広い範囲の抗原と反応する傾向がある。病原性生物またはこのような生物の抽出物に対して惹起された血清は、特定の優性抗原に対して免疫反応性の偏りを示す傾向がある。例えば、N. meningitidisからの外膜タンパク質調製物に対してウサギで惹起された血清は、PorAのような免疫優性抗原に偏っている。結果として、免疫優性抗原がまた、株間で最も大きく変動する抗原であるという傾向を有することが、このような血清を使用することの明らかな欠点である。したがって、N. meningitidisのような病原体に対して惹起された血清に由来するワクチンは、株間の交差反応性が不十分な傾向にあり、したがって、より低レベルの防御しか与えない。
【0029】
免疫優性抗原の偏りは、N. lactamicaのような共生体に対して本発明に従って惹起された血清では非常に少なく、そして免疫優性抗原をほとんど含まない。結果として、共生生物に対して惹起された血清は、株間でほとんど変動せず、そしてより広いスペクトルおよびより長期間の防御を提供するワクチンの生成を可能にする潜在的なワクチン抗原を同定するための理想的なベースを提供する。
【0030】
本発明の方法が共生細菌からクローン/ポリペプチドを最初に同定するために使用される場合は、以下の工程を含むさらなる方法の工程が、必要に応じて行われ得る:
(i)共生細菌からのポリペプチド抗原をコードする単離されたクローンの核酸配列を用いて、病原性細菌の相同配列を同定する工程;および
(ii)同等の病原性細菌ポリペプチド抗原を生成するために、該病原性細菌から相同配列をクローニングする工程。
【0031】
したがって、共生体タンパク質抗原および対応する病原体タンパク質抗原の両方が同定され得る。これは、相同ポリペプチドの潜在的な抗原性領域のさらなる分析を可能にし、そしてより優れたワクチン抗原の可能性を有する病原体配列および共生体配列を含む融合タンパク質の設計も可能にする。
【0032】
本発明に使用される血清は、代表的には、共生体タンパク質に曝露されるマウスまたはウサギ宿主で惹起される。血清は、適切には、標準的なデタージェント抽出プロトコルによって得られる外膜タンパク質の調製物に対して惹起される。あるいは、共生細菌の細胞が宿主動物に注射され得る。スクリーニング工程の結果により、また、血清が惹起される特定の細胞抽出物を選択することによって、偏りが生じ得る。例えば、特定した分子量範囲の外膜タンパク質抽出物は、特定の免疫反応性プロファイルを有する血清を生じさせるために使用され得る。
【0033】
ポリペプチド抗原スクリーニング工程において使用される血清もまた、精製され得る。代表的には、特に本発明の質量分析の態様が使用される場合に、血清のIgG成分が単離される。
【0034】
本発明の第2の局面は、ワクチン組成物に含有される適切な抗原を同定する方法を提供し、この方法は、
(a)N. lactamicaの外膜タンパク質抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
(b)該血清を、N. lactamicaファージディスプレイライブラリー、好ましくはN. lactamicaゲノム全体を含むファージディスプレイライブラリーと接触させる工程;
(c)該血清との結合相互作用についての試験結果が陽性であるファージを同定し、そして該陽性ファージを単離する工程;
(d)該陽性ファージからファージミドベクターを抽出し、そしてそこに存在するクローニングしたN. lactamicaゲノム配列を特徴づける工程;および
(e)該N. lactamicaゲノム配列によってコードされるポリペプチドを決定し、そして該ポリペプチドを抗原として同定する工程、を含む。
【0035】
好ましい実施態様では、本発明の方法はさらに、
(f)N. meningitidis相同ポリペプチド抗原を同定するために、該N. lactamicaポリペプチド抗原の配列と、N. meningitidisゲノム配列とを比較する工程、を含む。
【0036】
本発明の第3の局面は、ワクチン組成物に含有される適切な抗原を同定する方法を提供し、この方法は、
(a)N. lactamicaの外膜タンパク質抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
(b)該血清のIgG成分を単離する工程;
(c)該単離されたIgGを固相に結合させる工程;
(d)該結合したIgGを、N. meningitidis細胞の抽出物から得られるポリペプチドと接触させる工程;
(e)ポリペプチドのIgGへの結合によって形成される固相−IgG−ポリペプチド複合体を単離する工程;
(f)固相−IgG−ポリペプチド複合体をSELDI質量分析によって分析する工程;
(g)該工程(f)からポリペプチドについて得られた分子量と、N. meningitidisゲノムデータベースからの公知および推定のポリペプチドの分子量とを関連づける工程;および
(h)該工程(g)の関連づけられた分子量から決定された遺伝子によってコードされるN. meningitidisポリペプチドを抗原として同定する工程、を含む。
【0037】
本発明のさらなる局面は、上述の方法に従って1以上の抗原を同定する工程、および該1以上の抗原を薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程を含む、ワクチン組成物の調製方法を提供する。この組成物での使用に適切な薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水酸化アルミニウムであるが、経口、静脈内、皮下、腹腔内、またはその他のあらゆる投与経路に適切な任意のキャリアが適切である。
【0038】
共生Neisseriaまたは病原性Neisseriaからの抗原は、全細胞、全細胞からの外膜小胞(OMV)の調製物、または組換え体形態のいずれかの形態でワクチン組成物として適切に投与される。全細胞またはOMVが投与される場合、本発明は、全細胞において交差反応性抗原の発現を導入またはアップレギュレートすることによって、代表的には、さらなる抗原性成分の組換え体生成を可能にする遺伝子構築物の導入することによって、共生Neisseriaの抗原性の可能性を増加させる方法を提供する。
【0039】
デオキシコール酸処理などによるOMV単離の公知の方法は、本発明の組成物の調製に適切である。
【0040】
従来のキャリアまたはアジュバントを含む本発明の組成物の処方物は、グラム陰性細菌のNeisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリー由来の細菌などの病原性細菌による感染の治療のための組成物を提供する。
【0041】
したがって、本発明の組成物の使用により、新たにレシピエントにおいて防御抗体の刺激または生成が生じ得るか、あるいは、個体が既に共生細菌または病原性細菌によってコロニー形成されている場合には、天然に存在する抗体が増強され得る。
【0042】
本発明の方法によって同定される抗原は、病原性細菌感染に対する防御免疫を提供することを意図するワクチン組成物中に適切に含まれ得る。抗原を薬学的に受容可能なキャリアとともに含む組成物は、本明細書で同定され、そして以下に詳細に説明するヌクレオチド配列のいずれかによってコードされる少なくとも10の連続するアミノ酸を含むポリペプチドである抗原を含み得る。
【0043】
本明細書で使用される用語「抗原」とは、タンパク質性抗原および非タンパク質性抗原の両方をいう。そしてタンパク質性抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、少なくとも10の連続するアミノ酸のオリゴペプチド、ならびにタンパク質およびポリペプチドのフラグメントが挙げられる。抗原フラグメントが、全長タンパク質をコードする核酸配列の一部から発現され得る、または全長ポリペプチドの酵素切断に由来し得ることに留意すべきである。後者の場合、タンパク質分解酵素消化によって得られるフラグメントである抗原は、抗原性の保持に必須な3次構造の局面を保持し得る。
【0044】
「ワクチン抗原」とは、ワクチン組成物中に含まれる場合に、細菌感染に対する防御免疫を誘起する抗原である。
【0045】
本発明のワクチン組成物は、動物における感染に対するワクチン接種に特に適切である。本明細書で使用される用語「感染」とは、宿主生物の組織内および/または組織上での病原性生物の増殖を含むことを意図する。このような病原性生物としては、代表的には、細菌、ウイルス、菌類、および原生動物が挙げられるが、生物の組織内および/または組織上でのあらゆる微生物の増殖は、用語「感染」に入るとみなされる。
【0046】
本発明のスクリーニング方法を行うプロセスにおいて、多くの有用なワクチン抗原が同定されている。このスクリーニング方法は、共生N. lactamicaからの外膜抽出物に対して惹起された血清を利用した。潜在的なワクチン抗原をコードする多くのN. lactamicaおよびN. meningitidis核酸配列が同定された。いくつかの同定されたN. meningitidis配列は、公知のワクチン抗原であるが、同定された配列の大多数は、これまで知られていないワクチン潜在性を有するタンパク質をコードする。
【0047】
本発明者らはまた、λファージにおいて新規なN. lactamicaゲノムライブラリーを構築した。したがって、本発明の方法によって同定されるN. lactamica核酸配列は、発現された場合に、これまでに特徴づけされておらずそして以前にN. lactamicaから単離されていない新規なポリペプチドを提供する新規な遺伝子配列を表す。これらのポリペプチドは、ワクチン抗原として顕著な有用性を示す。
【0048】
したがって、本発明のさらなる局面は、配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択されるN. lactamica核酸配列の全部あるいは一部によってコードされるポリペプチドを提供する。これらの核酸配列から発現されるポリペプチドに由来するポリペプチド抗原は、髄膜炎菌疾患に対して防御するワクチン組成物に適切に含まれ得る。
【0049】
本発明はまた、本発明のN. lactamica配列またはN. meningitidis配列から選択される核酸配列と少なくとも80%の相同性、好ましくは少なくとも80%の類似性、または少なくとも90%の相同性、好ましくは少なくとも90%の類似性を有する核酸配列から発現されるポリペプチド抗原を提供する。
【0050】
核酸(またはポリペプチド)配列間の相同性を決定するために適切な多くの配列比較アルゴリズムが、当該技術分野において知られている。これらのアルゴリズムは、核酸配列およびアミノ酸配列の配列比較および分析の両方に適切である。BLAST、FASTA、TepitopeTM、PepToolTM、およびEpiMerTMのようなアルゴリズムを利用するソフトウエアおよびシステムは、本発明の方法での使用に適切である。使用する場合、当業者は、2以上の配列間の相同性の領域を容易に同定し得る。さらに、これらのアルゴリズムは、高い配列同一性を有する特定の領域または局在化したドメインが正確に決定され得る程度まで配列分析を容易にし、したがって、潜在的なサブドメイン抗原が同定され得る。それによって、配列分析は、本発明のワクチン組成物に含まれ得る局在化した抗原性領域の同定を可能にする。本発明の方法は、所望の抗原性領域を含む全タンパク質の含有物が有害であり得る場合に特に有用である。この毒性は、おそらく宿主生物において引き起こされ得る自己免疫応答、あるいは宿主免疫系由来の抗原性領域を隠すマスキングドメインの存在に起因する。
【0051】
本発明のさらなる局面では、配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される単離されたN. lactamica核酸分子が提供される。単離された核酸分子を含むベクターもまた提供される。
【0052】
本発明のN. lactamica配列から翻訳される対応のポリペプチドもまた、本明細書において、配列番号2、6〜8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、および100で提供される。これらのポリペプチドおよびそれらの一部はワクチン抗原として有用である。
【0053】
本明細書において使用される用語「一部」または「フラグメント」とは、完全なタンパク質自体と同等である抗原性を示すポリペプチド抗原の一部をいうことを意図する。本質的には、例えば、全タンパク質の20%のみからなる抗原性モチーフまたはドメインは、ワクチン抗原として全長タンパク質と同等の値を有し得る。全長ポリペプチド抗原の一部またはフラグメントは、代表的には、全長抗原の約10以上の連続するアミノ酸残基を含むが、ある場合には、10よりも少ない残基が、ある程度の防御免疫を生じるのに十分である。
【0054】
上述のように、本発明のスクリーニング方法はまた、候補ワクチン抗原として多くのN. meningitidisタンパク質の同定に成功している。これらのポリペプチド抗原をコードする核酸配列は、配列番号3、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、および198に示される。対応するポリペプチド翻訳物は、配列番号4、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142〜144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、197、および199に提供される。
【0055】
したがって、本発明のさらなる局面は、新規に同定されたN. meningitidisポリペプチド抗原またはそれらの一部を含むワクチン組成物を提供する。
【0056】
本発明のさらなる局面は、ワクチン抗原としての、核酸配列から発現されるポリペプチドの使用または特定のポリペプチド配列自体の使用を提供する。さらなる使用としては、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種のための医薬品の製造における、核酸配列から発現されるポリペプチドの使用または特定のポリペプチド配列自体の使用が挙げられる。
【0057】
本発明の別の局面は、病原性細菌による感染に対するワクチン接種のための組成物を調製する方法を提供し、この方法は、
(1)共生Neisseriaから第1の抗原を得る工程;
(2)(a)該第1の抗原のアミノ酸配列を、病原性細菌からの第2の抗原のアミノ酸配列と比較する工程、または(b)該第1の抗原をコードする核酸の配列を、該第2の抗原をコードする核酸の配列と比較する工程;および該第1の抗原が該第2の抗原と相同である場合、または該第1の抗原の該核酸配列が第2の抗原の核酸配列と相同である場合、
(3)細菌感染に対するワクチン接種のための、該第1の抗原を含む組成物を調製する工程、を含む。
【0058】
共生Neisseriaまたは共生Neisseria由来の核酸配列からの抗原は、病原性細菌由来の対応する相同抗原があるかどうかを決定するために、病原性細菌からの抗原またはヌクレオチド配列のライブラリーと比較され得る。
【0059】
本明細書において使用される用語「相同な」および「相同性」ならびに関連する用語は、共生体抗原に対する免疫応答が病原体と交差反応することを意味する。
【0060】
このような相同性は、共生体抗原に対する免疫応答が病原体によるチャレンジに対して防御的である場合に存在する。このような相同性はまた、配列類似性、例えば、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%のそれぞれの共生体配列および病原体配列との間に配列相同性がある場合に存在する。配列は、アミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードする核酸配列のいずれかである。類似性のレベルは、配列全体間の同一性のレベル、配列の一部分間の同一性のレベル、または抗原性の同等性における類似性のいずれかであり得る。配列間の同一性のレベルが、アミノ酸配列の一次構造の関数であることは明らかであるが、抗原性の同等性/相同性のレベルは、アミノ酸配列の二次構造および三次構造の関数である。
【0061】
共生Neisseriaの抗原性成分についてのアミノ酸または核酸配列と、病原性細菌の抗原性成分についてのアミノ酸または核酸配列との間の相同性のレベルを決定する工程において、相同性のレベルは、重要な抗原性エピトープ、ドメイン、またはサブユニットに関して決定され、そして相同性の全体のレベルに制限はない。
【0062】
例えば、膜結合表面タンパク質の特定のサブユニットの配列に対して高いレベルの相同性があるが、結合した膜に広がるドメインおよび細胞内領域に対して低レベルの相同性である場合、有効な抗原性相同性のレベルは、依然として高いと考えられ、そして、配列相同性の全体のレベルが低くても、本発明に有用である。
【0063】
本発明の組成物の抗原性成分が、好ましくは、宿主生物の免疫系に対して免疫顕性、すなわち「可視」であるアミノ酸配列であることに注目することが重要である。したがって、タンパク質の免疫顕性領域間の50%の相同性は、共生体および病原性型の配列間の高い全体の相同性と対応し得ない。実際に、共生体および病原性種からの抗原性成分間の高い配列相同性の特定のドメインを同定することは、病原性種からの感染に対する防御免疫を提供するワクチン組成物に適切に含まれる共生種からの抗原を同定するのに十分である。
【0064】
90パーセントを超える高いレベルの相同性が理想的であるが、通常は、50%を超える、好ましくは70%を超えるレベルで十分である。
【0065】
本発明の方法は、共生Neisseriaからの抗原であってそのアミノ酸配列が病原性細菌の配列と相同である抗原を同定する工程を含む。好ましくは、病原性細菌はグラム陰性細菌であり、より好ましくは病原性Neisseria、例えば、N. meningitidisまたはN. gonorrhoeaeである。あるいは、細菌は、グラム陰性細菌のNeisseriaceae(Neisseria、Branhamella、Moraxella、Acinetobacter、Kingellaを含む)およびPasteurellaceae(Pasteurella、Haemophilus、Actinobacillus)の病原性メンバーから選択される。これらの微生物は、宿主生物の粘膜表面に存在する能力および中耳炎(中耳感染)のような感染を引き起こす能力によって特徴付けられる。それらが類似の環境ニッチに存在する傾向にあり、そしてしばしば同じ粘膜表面上に共存するという事実のため、このサブグループの細菌の病原性メンバー間を臨床的に識別することは困難であり得る。
【0066】
共生微生物は、疾患を引き起こすことなく、宿主生物でコロニー形成し得る微生物である。多くの異なる共生Neisseriaが、本発明での使用に適切であり、そしてこれらの共生Neisseriaは、N. lactamica、N. cinerea、N. elogata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、N. perflava、およびN. subflavaからなる群より選択され得る。これらの共生生物の異なる種は、口腔または鼻の領域、あるいは他の粘膜表面でコロニー形成することが知られており、したがって各々の種は、体の公知の領域に応じて投与され、正常にコロニー形成する。また、本発明の組成物の使用により、新たに防御抗体の生成を刺激し得るか、または、個体が既にある程度までコロニー形成されている場合には、天然に存在する抗体を増強し得る。
【0067】
Neisseria meningitidis(血清群AおよびB)、Haemophilus influenzae、およびPasteurella multocida(PM70)ゲノムは、配列決定され、公表されている。ゲノムデータは、Sanger研究所(Cambridge、UK)からまたはインターネット上(www.sanger.ac.uk、www.ebi.ac.uk/genomes、およびwww.tigr.org)で入手可能であり、そして、利用可能な完全に配列決定された細菌ゲノムの数は、将来、劇的に増加すると予測される。したがって、ナイセリア共生体核酸配列を多数の病原性細菌のゲノム配列と比較することが可能である。
【0068】
本発明の方法で同定された共生Neisseriaからの抗原は、表面の可視抗原に制限される必要はない。実際、宿主免疫系に対して可視ではないとこれまで考えられていた多くの細胞質およびエンドソームタンパク質が、抗原潜在性を有することは驚くべき観察結果である。このように、本発明は、これまで可能と思われたものよりも、より広い範囲の抗原性成分をワクチン組成物中に含有することを可能にする点で、かなり有利である。上記背景の項で説明した文献から明らかなように、多数の候補抗原は、病原性Neisseriaで同定されており、そして、ワクチンにおいてそれらの価値が試験されたか、あるいは試験されている。さらに任意の本発明のスクリーニング工程は、共生Neisseriaからの抗原を保持することであり、この抗原は病原体についての研究から実際にあるいは潜在的に価値を有すると既に同定されている抗原に対応する。
【0069】
本発明の方法によって共生Neisseriaで同定された候補抗原は、多くの方法で評価される。いくつかの候補抗原は、多数の異なる病原性種における保存配列と相同な配列を有し、したがって、広いスペクトルの防御の可能性を示す。他の候補抗原は、単一の病原性種の配列に対して高レベルの相同性を示し、したがって、この単一種の病原体に関して強い抗原活性の可能性を示す。
【0070】
候補抗原はまた、本発明のワクチン組成物に含有されるための適切性に基づいて評価される。いくつかの候補抗原は、他よりも外膜小胞(例えば、膜結合タンパク質)により容易に組み込まれ、したがって、この送達の特定の態様について選択される。
【0071】
1つの特定の方法においては、タンパク質は、共生Neisseriaで同定される。このタンパク質は、次いで、共生体に結合することが知られている抗体調製物との反応性についてでスクリーニングされる。例えば、抗体調製物は、共生体の膜の抽出物を用いて調製され得る。スクリーニングが陽性である場合、すなわち、タンパク質が抗体調製物によって認識される場合、抗原として同定される。したがって、この最初のスクリーニングは、タンパク質が抗原性であり、そしておそらく共生体の表面上で発現されることを確認する。
【0072】
第2のスクリーニング工程は、病原性Neisseria中に対応する抗原性配列があるかどうか調査することであり、これは、上述のように適切に行われる。この第2のスクリーニングが陽性である場合、最も好ましいワクチン候補を同定するために、第3およびさらなるスクリーニングは、大きさによる選択、すべての病原性種中の対応する抗原の存在の頻度による選択を含む。
【0073】
したがって、本発明の使用についての例では、共生Neisseria(例えば、N. lactamica)のデタージェント抽出物が、マウスにワクチン接種するために使用される。マウスは、Neisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリーの病原性メンバー(例えば、N. meningitidis、Moraxella catarrhalis、Pasteurella multocida、またはHaemophilus influenzae)からチャレンジを受ける。回復期血清がチャレンジで生き残っているマウスから得られ、そして共生Neisseriaから発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されて、候補抗原を同定する。次いで、同定された候補抗原についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が決定され、そして病原性生物からの配列に対する相同性について、配列類似性および他の分析によって比較され得る。候補抗原はそれらの適切性について選択され、そしてワクチン組成物に含まれる。
【0074】
共生Neisseriaからの抗原の使用における本発明の例では、以下の工程によって、ワクチン中に含有するためのそれらの適切性について評価され得る:
共生Neisseriaからの抗原についてのアミノ酸配列を得る工程、または該抗原をコードするヌクレオチド配列を得る工程;
得られた配列を病原性細菌からの対応する配列と比較する工程;および
全体の配列相同性が50%を超える抗原を同定する工程。
【0075】
ナイセリア感染に対するワクチン接種のための組成物は、次いで、この方法に従って抗原を同定し、そして該抗原を組成物中に組み込むことによって調製される。
【0076】
したがって、本発明のこの後者の局面は、ワクチン調製物の領域において、これまで有した知識からの逸脱を示す。本発明によれば、ワクチン抗原は、共生種で発現される抗原で最初に同定される。この抗原は、共生体の表面上に発現するかどうかを決定するために適切にテストされ、そして、そうであれば、対応するタンパク質、すなわち少なくとも50%相同のタンパク質が病原体に存在するかどうかが研究される。対応するタンパク質が病原体中で同定されるのであれば、ワクチンは、共生体タンパク質またはそれらの免疫原性フラグメント、もしくは病原性種からの免疫原性フラグメントのいずれかに基づく。このように、本発明は、サブトラクション方法が、病原体でのみ見られる抗原を同定するために使用された、ワクチンを得るためのこれまでのアプローチとは実質的に異なる。
【0077】
本発明のアプローチの有利な点は、共生生物の取扱いにおいてワクチンの調製中にほとんど危険性がないことである。さらなる有利点は、共生体の抗原が、同一種内変異をほとんど示さない傾向にあることである。したがって、特定の病原性種に由来する抗原よりも、ある病原性株に対して低い防御レベルの状況にもかかわらず、共生体由来抗原は、より広いスペクトルの免疫を提供し得る。共生体由来抗原は、一般的に、より広い範囲の株に対して少なくとも低いレベルの防御を有するという利点がある。
【0078】
したがって、本発明によれば、多くの株に対する交差反応に好都合なように、個々の株に対する効力間のトレードオフが容認される。実際に、ワクチン接種のプログラムは、例えば、1国内のような所定の集団の中の各個体が、その国の特定の地域において、他の地域よりも流行している1つの病原性株であるかどうかに関わりなく、同じワクチンを投与される傾向にある点で、粗雑である。本発明で提供される抗原性成分の交差反応性は、いくつかにおける高い防御およびその他における防御の欠損の危険性よりもむしろ、ワクチン接種された大多数についての少なくともベースラインの防御を確実にする。
【0079】
以下で、より詳細に説明される本発明の実施例において、抗原は、共生Neisseriaタンパク質のフラグメントである。共生Neisseriaデタージェント抽出物に対して惹起された抗体が、抗原を同定するために使用される。この抗原は、上述のように、未処理の共生体タンパク質のフラグメントであり、病原性生物において最小レベルの相同性を有する対応するタンパク質を同定するために使用される。共生Neisseriaからの抗原に対する病原性のパートナーの存在は、共生抗原および病原性抗原の両方をワクチン候補として示す。既に述べたように、共生体タンパク質に対して惹起された血清中に免疫優性抗原がないため、新規な病原性抗原を同定する現実の機会も存在する。
【0080】
以下で、より詳細に説明される実施例において、ゲノムライブラリーを、Neisseria lactamicaから調製した。ゲノムDNAを、MboIによって部分消化した。1〜4kbの消化されたDNAをZAP発現ベクター(Stratagene)にライゲートし、Gigapack III Gold packaging extract(Stratagene)を用いてパッケージングした。ライゲートしパッケージングしたDNAをプレーティングし、プラーク形成を行った。髄膜炎菌感染実験モデルにおいて、髄膜炎菌チャレンジに対して防御性であると既に同定されているN. lactamicaデタージェント抽出物に対して惹起されたウサギ血清を用いて、プラークをスクリーニングした。このN. lactamica血清と反応する陽性のプラークを採集し、精製した。PCRによってインサートが異なるサイズであること確認した後、pBK−CMVファージミドベクターを各クローンのZAP発現ベクターから切り出した。ファージミドを精製し、次いでインサートを、T3およびT7プライマーを用いて配列決定した。生じた配列を、髄膜炎菌ゲノムと比較し、相同な髄膜炎菌タンパク質を以下のリストに示す。NMA番号は、髄膜炎菌血清群Aゲノムに割り当てられる遺伝子番号である。NMB番号は、髄膜炎菌血清群Bゲノムに割り当てられる遺伝子番号である。
【0081】
本発明はまた、以下の工程によるテストの下で、候補抗原が組成物中に存在するかどうかを決定する品質管理方法を提供する:
(i)組成物中の候補抗原を同定する工程、または
(ii)該組成物中の抗原の存在に適切な組成物に対して曝露された宿主動物において、免疫応答を同定する工程。
【0082】
代表的には、評価される調製物は、OMVベースのワクチンの場合と同様の多くの異なる抗原性成分を含む。本発明の方法は、1以上の候補抗原が存在するかどうか、および許容可能な程度に存在するかどうかを評価するために、これらの調製物をスクリーニングすることを可能にする。
【0083】
組換え候補抗原もまた、抗原を含む組成物をワクチン接種した動物からの血清のテストにおいて、品質管理アッセイにルーチンに利用される。これらの動物からの血清が候補抗原と十分に反応する場合、その組成物は、適切な量の候補抗原を含むとみなされる。不十分な反応である場合、組成物は不完全であるとみなされる。血清と組換え抗原との間の反応は、当該技術分野で通常公知の多くの技法によって適切に媒介され、例えば、組換え抗原は、該抗原に対する抗体を含む血清の存在下で凝集反応が生じるように微粒子上に配置され得る。このアッセイはまた、上記の工程において、組換え抗原をワクチン組成物に置換することによって、ワクチン組成物自体をテストするように適合され得る。
【0084】
不完全なワクチンは、所望の候補抗原を含まないことが見出されるか、または所望の免疫応答を誘起しないことが防御テストにおいて見出される場合、廃棄され得る。
【0085】
本発明を、ここで、以下の実施例を参照して、より詳細に説明する。
【実施例】
【0086】
実施例1−ゲノムスクリーニング
1.N. lactamicaゲノムファージディスプレイライブラリーの調製
1.1. N. lactamicaゲノムDNAの調製
100mlのMHB(Oxoid)に、プレート増殖したN. lactamicaのY92-1009株を白金耳で接種し、そして37℃にて18時間振盪しながらインキュベートした。培養物を4000gで遠心分離し、そしてペレットを9.5mlのTE緩衝液(10mM Tris、1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH8.0)に再懸濁した。0.5mlの10%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および50mlの20mg/mlプロテイナーゼK(Sigma)を懸濁液に加え、そしてこれを37℃にて1時間インキュベートした。1.8mlの5M NaClおよび1.5mlの10%セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)を含む0.7M NaCl溶液を加え、そしてこの溶液を65℃にて20分間インキュベートした。DNAを、等容量のクロロホルム:イソアミルアルコール(Sigma)の添加によって溶解した細胞から抽出した。この溶液を6000gにて10分間遠心分離し、そして総容量の0.6のイソプロパノールを添加してDNAを沈殿させた。沈殿したDNAを、1mlの70%(v/v)エタノールで洗浄し、そして10000gにて5分間の遠心分離によって回収し、上清を捨て、そしてペレットを4mlのTE緩衝液に再懸濁した。1.075g/mlのCsCl(Sigma)および50mlの10mg/mlエチジウムブロミド(Sigma)を添加し、そして溶液を15℃にて250000gで18時間クイックシール遠心管で遠心分離した。CsClグラジエントを長波UV下で可視化し、そしてバンドを取り出した。エチジウムブロミドを、水および飽和ブタノールでの連続抽出によって除去した。CsClを、4℃にてエタノールで15分間、次いで10000gにて15分間の遠心分離でのDNAの沈殿によって除去した。ペレットを、長期保存用にTE緩衝液に再懸濁した。
【0087】
1.2. 部分消化ゲノムDNAの調製
10mgのゲノムDNAを、以下のように消化した。10mgのゲノムDNA、1mg BSA、10ml NE緩衝液3(New England Biolabs)、6ml MboI(New England Biolabs)、および63mlの分子生物学グレードの水(Sigma)を、37℃にて2時間インキュベートした。生成物を、0.8%(w/v)低融点アガロースゲル(Sigma)で分析した。1〜4kbのバンドを、長波UVを用いて位置決めし、そしてゲルから切り出した。消化したDNAを、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて、供給されたプロトコルに従ってゲルから取り出した。抽出したDNAを、TE緩衝液中で保存した。
【0088】
1.3. ライゲーション
部分消化したDNAをZAP発現ベクター(Stratagene)にライゲートするために、ライゲーション反応を以下のように設定した。1mgのベクター、0.4mgの消化したDNA、0.5mlの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液(New England Biolabs)、2.7mlの分子生物学グレードの水、および10UのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を、4℃にて18時間インキュベートした。
【0089】
1.4. パッケージング
ファージ粒子を、Gigapack III Gold packaging extract(Stratagene)を用いてパッケージングした。3mlのライゲーション反応物を、packaging extractに添加し、よく混合した。混合物を、6000gにて5秒間遠心分離し、そして室温にて2時間インキュベートした。500mlのSM緩衝液(5.8g NaCl、2g MgSO4・7H2O、50mlの1M Tris(pH7.5)、5mlの2%(w/v)ゼラチンをH2Oで1Lに希釈した)および20mlのクロロホルムを、混合物に添加し、内容物を混合し、短時間遠心分離し、そして上清を4℃にて保存した。
【0090】
1.5. パッケージングしたライゲーション生成物のプレーティング
E. coliのXL1 Blue MRF'株を、LB寒天プレート上で一晩37℃にて18時間増殖させた。10mM MgSO4および0.2%(w/v)マルトースを補充した10mlのLBブロスに、単一コロニーを接種し、そして37℃にて6時間振盪しながらインキュベートした。細胞を、1000gにて10分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを10mM MgSO4に再懸濁した。OD600を0.5に調節した。2mlの最終のパッケージングした反応物を、200mlのXL1 Blue MRF'と混合し、そして穏やかに振盪しながら37℃にて15分間インキュベートした。3mlのNZYトップ寒天、15mlの0.5M イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)、および12.5mgの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトピラノシド(X-gal)(Sigma)を加え、そして混合物を、NZY寒天プレート上にすばやく注ぎ、そして30℃にて18時間インキュベートした。20プレートを調製して、N. lactamicaゲノム全体をカバーした。8〜10mlのSM緩衝液をプレート上に積層し、そして穏やかに振盪しながら4℃にて18時間インキュベートすることによって、バクテリオファージを回収した。5%(v/v)クロロホルムをバクテリオファージ懸濁液に加え、そして細胞破砕物を、500gにて10分間の遠心分離によって除去した。クロロホルム(0.3%v/v)を上清に加え、そしてライブラリーを4℃にて保存した。
【0091】
2.ゲノムライブラリーの分析
2.1. プラーク形成
3mlのバクテリオファージライブラリーを、十分なNZY寒天プレート上に上記のようにプレーティングして、ゲノムをカバーした。30℃にて18時間のインキュベーション後、IPTGに浸漬したニトロセルロースメンブラン(Amersham Pharmacia Biotech)をプレート上に載せ、そして30℃にてさらに18時間インキュベートした。メンブランを注意深く取り出し、そして0.05%(v/v)Tween-20および1%(w/v)ミルク粉末(Marvel)を含むリン酸緩衝化生理食塩液(PBS)で1時間ブロックした。メンブランを、0.05%Tween 20を含むPBS(PBS-T)で洗浄し、次いでN. lactamicaデタージェント抽出したOMPに対して惹起したウサギ血清のPBS-T希釈物とともに1時間インキュベートした。前述のように洗浄した後、メンブランを抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(ICN)と1時間インキュベートし、PBSで洗浄し、そして0.5mg/mlの4-クロロ-1-ナフトール(Sigma)で発色させて交差反応性ファージを同定した。
【0092】
2.2. プラーク精製
同定した各プラークについて、陽性プラークを含む寒天のプラグをプレートから取り出した。プラグを0.5%(v/v)クロロホルムを含む1mlのSM緩衝液中に入れ、そして4℃にて18時間インキュベートした。10mlのファージ懸濁液をプレーティングし、プラーク形成させ、そして陽性のものを既述のように同定した。これを、各陽性のものについて行い、懸濁液が純粋になるまで繰り返した。ファージの長期保存は、SM緩衝液中4℃にて行った。
【0093】
2.3. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
陽性ファージを既述のようにプレーティングした。各陽性のファージについて1つのプラークを取り上げ、500mlの分子生物学グレードの水にピペットで入れ、ボルテックスで撹拌し、4℃にて18時間インキュベートして、寒天からファージ粒子を解離した。これをPCR用のテンプレートとして用いた。以下の反応混合物を用いて、陽性ファージからN. lactamicaインサートを増幅した;1ml T3プライマー(Life Technologies)、1ml T7プライマー(Life Technologies)、1ml テンプレート、2.5U Taq DNAポリメラーゼ(Roche)、5ml 10×PCR緩衝液(Roche)、1mlの10mM dNTP(Roche)。そして、各テンプレートについて、40.5mlを200mlのPCRチューブ(Anachem-Scotlab)中で氷上で混合した。反応物を、94℃まで3分間加熱した。熱サイクルを以下のように35回繰り返した;94℃で30秒間、52℃で30秒間、72℃で2.5分間。最後に、反応物を、72℃にて10分間インキュベートした。
【0094】
2.4. ファージミド切り出し
陽性ファージを既述のようにプレーティングした。個々のファージストックを、20mlクロロホルムを含む500mlのSM緩衝液への1プラークのトランスファーから調製し、次いでボルテックスで攪拌し、4℃にて18時間インキュベートした。E. coliのXL1 Blue MRF'株を、0.2%(w/v)マルトースおよび10mM MgSO4を補充した10mlのLBブロス中で30℃にて18時間増殖させた。細胞を1000gにて15分間遠心分離し、そしてペレットを、OD600が1になるように10mM MgSO4に再懸濁した。200mlの再懸濁したXL1 Blue MRF'を、250mlのファージストックおよび1ml ExAssist helper phage(Stratagene)と合わせ、そして37℃にて15分間インキュベートした。3mlのNZYブロスを各混合物に加え、そしてこれらを穏やかに振盪しながら37℃にて2.5時間さらにインキュベートし、最後に70℃まで20分間加熱し、そして1000gにて15分間遠心分離した。切り出したpBK−CMVファージミドベクターからなる上清をデカントし、そして4℃にて保存した。これを各ファージストックについて繰り返した。
【0095】
2.5. 切り出したファージミドのプレーティング
E. coliのXLOLR株を、10ml NZYブロス中で30℃にて18時間増殖させ、1000gにて15分間遠心分離し、そしてペレットを、OD600が1になるまで10mM MgSO4に再懸濁した。100mlのファージミド上清を、200mlの再懸濁した細胞と混合し、そして37℃にて15分間インキュベートした。300mlのNZYブロスを加え、そして混合物を37℃にて45分間さらにインキュベートした。200mlの細胞混合物を、50mg/mlカナマイシン(Sigma)を補充したLB寒天上にプレーティングし、そして37℃にて18時間インキュベートした。
【0096】
2.6. ファージミド精製
ファージミドを、供給されたプロトコルに従ってWizard Plus Minipreps(Promega)を用いて精製した。
【0097】
2.7. 配列決定
次いで、精製したファージミドストックを、T3およびT7プライマーを用いて配列決定した。配列番号1〜102に、それらの翻訳産物および対応するN. meningitidisホモログ(核酸およびタンパク質)の配列を示す。
【0098】
ゲノムスクリーニングから推定されそして候補ワクチン抗原として同定されたN. lactamicaタンパク質を、以下の表1に示す。
【0099】
【表1】
【0100】
実施例2−質量分析スクリーニング
表面増強レーザー脱着イオン化法
1 ウサギ血清の生成
ウサギに、60μgのN. lactamicaタンパク質プール(上述)を含む2mlの25%(v/v)アルヒドロゲルを、4部位に皮下投与して免疫した。初回ワクチン注射を、実験の1日目にウサギに投与した。ワクチン注射を21日目および28日目にブーストし、そしてチャレンジを実験の35日目に行った。
【0101】
1.1 血清からのIgGの精製
プロテインG Sepharose Fast Flowゲルカラムを、製造業者による記載のようにパッケージした。血清試料を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0(緩衝液A)で1:4に希釈し、そして同じ緩衝液でカラムを平衡化した。希釈した試料をカラムに載せ、そして緩衝液Aで1ml/分の流速にてカラムを洗浄した。溶出液を5ml画分として収集した。48mlでカラムを洗浄した後、緩衝液を、0.1Mグリシン、pH2.8(緩衝液B)に変更した。これを、結合したIgGをカラムから予め除去するのと同じ速度でカラムから溶出した。22mlの緩衝液Bでカラムを洗浄し、そして試料を2ml画分に収集し、0.5ml Tris pH9.0でpHを中性にした。
【0102】
2 デタージェント抽出したOMPの調製
N. meningitidisのMC58 cap-株の500mlのブロス培養物を、200gにて60分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを、100mlのPBSで200gにて30分間の遠心分離によって洗浄した。上清を再度捨て、そして各1グラムのペレットに対して0.3%(v/v)エルジェント(elugent)を含む2mlのPBSを添加した。ペレットをホモジナイズし、そして37℃にて振盪しながら20分間インキュベートした。この溶液を、14,000rpmにて10分間遠心分離し、そしてペレットを捨てた。上清に、10mM(w/v)EDTA、0.5%(w/v)N-ラウリル-サルコシン(Sigma)、および0.1%(v/v)の10%(w/v)PMSF溶液を加えた。抽出されたOMPを含む上清を、−20℃にて保存した。
【0103】
2.1 プレパラティブ電気泳動によるデタージェント抽出物の分離
プレパラティブ電気泳動を、供給されたプロトコルに記載のように、モデル419 Prep-Cell(BioRad)を用いて行った。使用したゲルは非変性であり、そして7%(v/v)プロトゲルからなるゲルを、100kDa未満のOMPの分離に用いた。
【0104】
3 N. lactamica IgGおよびN. meningitidisタンパク質プールでのダイナビーズのコーティング
250μlのトシル活性化したダイナビーズを、1.5mlチューブに入れ、そして磁石によってビーズを保持した。溶液を除去し、そしてビーズを、250μlの0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.5)に2分間混合することによって再懸濁した。これを2回繰り返した。次いで、緩衝液を除去し、そしてビーズを、30μgのIgGを含む500μlに再懸濁した。ビーズを、ゆっくりと傾斜回転しながら37℃にて18時間インキュベートした。ビーズを、0.1%(w/v)BSAを含む500μlのPBSに再懸濁することによってブロックした。これを2回繰り返した。溶液を除去し、そして0.1%(w/v)BSAを含む0.2MのTris(pH8.5)に置換し、そしてゆっくりと傾斜回転しながら37℃にて4時間インキュベートした。溶液を除去し、そしてビーズを、0.1% BSAを含む500μlのPBSに再懸濁した。ビーズを0.5%(v/v)Triton X100を含む500μlのPBSで洗浄し、0.1% BSAを含む500μlのPBSに再懸濁し、そして最後に0.1% BSAを含む100μlのPBSに再懸濁した。10μlのIgGコーティングしたビーズ溶液を、50μgのN. meningitidis OMPプールとともにゆっくりと傾斜回転しながら4時間インキュベートした。上清を除去し、そしてビーズを滅菌水で5分間3回洗浄した。洗浄したビーズを、分析用に10μlの滅菌水に再懸濁した。正常ウサギIgGでコーティングしそしてN. meningitidis OMPとともにインキュベートしたビーズを、コントロールとして用いた。
【0105】
4 ビーズの分析
2μlのビーズを、H4チップのスポット上の1μlの50%(v/v)アセトニトリル中に入れた。これらを乾燥するまで放置し、そして0.25%(v/v)トリフッ素酸および50%(v/v)アセトニトリル中の10mg/mlのシナピン酸溶液0.7μlで覆った。Protein Chip(CiphergenTM)を、Ciphergen SELDI装置を用いて読み取り、そしてウサギIgGに結合したタンパク質の正確な分子量を決定した。SELDI装置の較正を、CiphergenTMハンドブックに記載のように行った。
【0106】
スクリーニングで同定されたN. lactamica抗血清からのIgGと交差反応する推定の髄膜炎菌タンパク質を、ExPasy Tagldentソフトウエアを用いてN. meningitidisのB群のゲノムデータベースと関連づけた。N. meningitidisゲノムから同定されたすべてのタンパク質は、SELDIスクリーニングにおいて特定のポリペプチドについて決定された分子量の5%以内の分子量を有する。好ましいタンパク質は、SELDI同定されたポリペプチドについての分子量の2%以内の分子量を有する。
【0107】
質量分析スクリーニングにおいて候補ワクチン抗原およびその翻訳産物をコードすると同定されたN. meningitidis核酸配列を、配列番号103〜199に示し、そして以下の表2に記載する。
【0108】
【表2−1】
【0109】
【表2−2】
【0110】
興味深いことに、この方法が、TbpB、クラス3タンパク質、H8外膜タンパク質、およびCu,Znスーパーオキシドジスムターゼのような強力なワクチン抗原であることが知られている多くのタンパク質も同定することに着目する。これは、本発明の方法の有効性を明らかに認証する。
【0111】
同定された配列をさらに分析して、いずれかの推定タンパク質がシグナル配列または膜貫通ドメインを含むかどうかを決定した。これらの特有のモチーフの存在は、しばしば表面曝露を示し、そして適切なワクチン抗原をさらに同定することを補助し得る。
【0112】
シグナルペプチドの存在を、SignalPアルゴリズムを用いて決定し、そして膜貫通ドメインについては、TMpredアルゴリズムを用いた。両方のアルゴリズムとも、当該技術分野で通常公知であり、そしてwww.expasy.org(The ExPASyTM、Expert Protein Analysis Systemはthe Swiss Institute of Bioinformaticsのプロテオミクスサーバーによってホストされる)から入手可能である。
【0113】
SignalPおよびTMpred分析の結果を表3に示す。
【0114】
【表3−1】
【0115】
【表3−2】
【0116】
多くの同定された配列は、推定シグナル配列または膜貫通ドメインを含むようであるが、かなりの数もまた含まないことは驚くべきことである。
【産業上の利用可能性】
【0117】
したがって、本発明の方法が、抗原性の可能性を有することがこれまでに知られていないポリペプチドを同定するための方法を提供することが理解され得る。
【0001】
本発明は、免疫応答を刺激し、そしてナイセリア感染の予防に有用である組成物およびワクチンを調製するための方法に関する。特に、本発明は、広いスペクトルの防御免疫を与えるワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
髄膜炎菌疾患は、世界中の健康問題として特に重要であり、そして多くの国において感染の発生率は上昇している。Neisseria meningitidis(髄膜炎菌)は、髄膜炎菌敗血症を含む疾患を引き起こす生物であり、これは、急速な発症および高い死亡率に関連し、約22%の症例が死亡している。
【0003】
現在、髄膜炎菌疾患に対する防御免疫を与えるワクチンは、N. meningitidisの多くの異なる株のため、限定された防御を提供するにすぎない。血清群抗原、すなわち莢膜多糖に基づくワクチンは、感染に対して短寿命の防御のみを提供し、そして北アメリカおよびヨーロッパで通常見られる多くの株に対して防御しない。これらのワクチンのさらなる欠点は、これらが、通常感染を受けやすい最も弱い群の1つである2歳以下の子供について、低レベルの防御しか提供しないことである。現在英国で使用されるより新しい複合ワクチンは、これらの問題のいくつかを示すが、髄膜炎菌のC血清群に対してのみ有効である。
【0004】
Goldら(Journal of Infectious Diseases, 137巻2号, 1978年2月, 112-121頁)は、N. lactamicaの感染によって交差反応性抗体が誘導され、N. meningitidisに対する自然免疫の発生を援助し得ることを報告している。この結論は、N. lactamica感染に応答して生じる補体依存性殺菌活性を有する抗体と交差反応するという観察に基づいた。しかし、CannおよびRogers(J. Med. Microbiol., 30巻, 1989年, 23-30頁)は、病原性および共生のNeisseria種の共通抗原に対する抗体を検出したが、同じ抗原に対する抗体が、殺菌および非殺菌の血清の両方ともに存在することも観察した。したがって、交差反応性殺菌性抗体の原因となる抗原を同定することはできなかった。
【0005】
髄膜炎菌疾患に対する弱毒化生ワクチンは、Tangら(Vaccine 17, 1999, 114-117頁)に示唆されており、そこでは、N. meningitidisの生きた弱毒化された株が経粘膜送達され得る。Tangはまた、病原性細菌による感染に対して防御するための共生細菌の使用についてコメントし、髄膜炎菌感染に対する防御を誘導する交差反応性エピトープが定義されておらず、したがってN. meningitidisの遺伝学的に改変された株の使用が好ましいと結論している。
【0006】
Frasch(Meningococcal Disease, Cartwright編(1995);10章, 245-283頁)は、髄膜炎菌ワクチンの歴史および開発を包括的に記述している。Fraschは、多糖に基づくワクチンの開発を述べ、そして代替のワクチン候補の探索における同時期の開発も述べている。Fraschは、血清群Aおよび血清群C多糖などの莢膜成分に基づくワクチンについて広範な部分で論じている−病原性Neisseriaとは異なり、共生N. lactamicaは莢膜を有しないことに注目すること。莢膜は、しばしばあまり免疫原性でないが、キャリアタンパク質を使用すると免疫原性になり得ることが知られている。
【0007】
Pollard(Pediatr. Infect. Dis. J. (2000); 19, 333-45頁)は、グラム陰性のN. meningitidis生物の微生物学的な概要を提供する。Pollardは、髄膜炎菌の外膜を囲む多糖莢膜の化学的組成に基づいて、12もの異なる血清群を同定し、したがって、ワクチンは、これらの多糖血清群にターゲティングされる。
【0008】
Cartwrightら(Vaccine 17(1999), 2612-2619頁)は、ワクチンの代替アプローチの使用を述べ、ここでは、新規なワクチン組成物が、PorAタンパク質を含み、そして、N. meningitidisの株に対して良好な免疫応答を誘起する。まず、特異的な表面に露出したタンパク質が同定され、そして6つのPorAタンパク質を含むOMVが調製される。
【0009】
Fuscoら(JID(1997); 175, 364-72頁)は、精製された組換えPorBポリンタンパク質を含むB群の髄膜炎菌複合ワクチンの生成を記述している。Fuscoらは、Neisseriaの病原性株からの表面タンパク質の同定、およびワクチン組成物中に含有することを教示する。
【0010】
Perrinら(第11回International Pathogenic Neisseria Conference, 要約(1998)), 348頁およびInfect. Immun. (1999)は、ゲノムサブトラクションの技術、すなわち、病原性細菌から共生細菌のゲノムデータを差し引くことを記述している。この技術は、おそらく細菌の病原体の特異的な毒性に関係し、したがっておそらく潜在的なワクチン抗原である、染色体の領域を同定する可能性を有する。
【0011】
Pizzaら(Science (2000) 287; 1816-1820頁)は、潜在的なワクチン候補抗原を同定するために、N. meningitidisの毒性の血清群B株の全ゲノムの配列決定を記述している。Pizzaらは、病原性Neisseriaから適切なワクチン抗原を同定するために、表面に発現されたタンパク質のin silico予測および高スループットスクリーニングを利用する。
【0012】
それにもかかわらず、ナイセイア感染に対するさらなるおよび良好なワクチンが必要なままである。
【0013】
細菌、特にNeisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリーのグラム陰性細菌から選択される病原性細菌、例えば、N. meningitidisおよびN. gonorrhoeaeからの感染に対する防御免疫を与えるワクチンに組み込むための免疫原性タンパク質を同定することが望まれている。さらに、幼児ならびに成人に防御免疫を与え、そしてその防御が長期間であるワクチンを提供することが望まれている。また、無症状感染、すなわち髄膜炎菌または淋菌感染の症状が直ちに現れず、感染した個体が、病原体のキャリアとして行動し得る感染、に対して防御するワクチンを提供することも利点であり得る。さらに、N. meningitidisの株のすべてまたは広い範囲に対して防御することが利点である。他のナイセリア感染、特に淋病に対するワクチンを提供することがさらにいっそう望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明の目的は、抗原、免疫原、免疫刺激成分を含む組成物、それらに基づくワクチン、および当該技術分野における問題点に対処するあるいは少なくとも改善する抗原を同定する方法を提供することである。
【0015】
本発明は、確認された問題点への新しいアプローチに基づき、ワクチンが防御すべき病原体と同じファミリーの共生生物および病原性生物の両方における免疫原性成分を同定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明は、共生Neisseriaのような共生細菌に対して惹起された血清と相互作用する抗原を同定するための組み合わされた方策を用いる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0017】
第1の方策は、N. lactamicaのような共生細菌からのゲノムライブラリーの構築を含む。このアプローチは、潜在的な抗原性ポリペプチドがファージ表面上に発現されるファージディスプレイライブラリーを生成するように、組換えファージにおいてN. lactamicaゲノムのフラグメントを発現させることを含む。防御N. lactamica抽出物に対して惹起された血清と反応するファージが単離される。これによって、免疫反応性タンパク質をコードするN. lactamica配列は潜在的な抗原として同定され、ナイセリア感染を防御するためのワクチンに好適に含有される。
【0018】
本発明の方法によって同定されたN. lactamica免疫原性タンパク質抗原はまた、N. meningitidisのような他の病原性細菌において相同タンパク質を同定するための出発点として役立つ。したがって、本発明は、共生生物および病原性生物の両方において全く新しいクラスのワクチン抗原の同定を可能にする。
【0019】
第2の方策は、共生生物に対して惹起された血清を病原性Neisseriaからの抗原の調製物と組み合わせることを含む。共生血清中の抗体と病原性抗原との結合は、これまでに知られていない免疫原性の可能性を有する抗原を同定するために分析される。
【0020】
したがって、本発明の第1の局面は、抗原を同定する方法にあり、この方法は、
a.共生細菌または共生細菌からの抽出物に対する抗体を得る工程;
b.該抗体を、共生細菌または病原性細菌のいずれかから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが抗体に結合するかどうかを決定する工程;および
d.ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程、を含む。
【0021】
本発明の1つの実施態様では、この方法は、
a.共生細菌または共生細菌からの抽出物に対する抗体を得る工程;
b.該抗体を、共生細菌または病原性細菌のいずれかの発現ライブラリーから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが抗体に結合するかどうかを決定する工程;
d.ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程;および
e.発現ライブラリーから該抗原を発現するクローンを単離する工程、を含む。
【0022】
共生細菌または共生細菌からの抽出物に対する抗体は、該細菌または該抽出物に対して惹起された血清中に含まれ得る。そして以下の特定の実施例において、抗体は、動物に共生体タンパク質を免疫することによって得られる。抗体はまた、共生細菌に感染した患者、患者の血清、粘膜分泌物などから得られ得る。
【0023】
本発明の特定の実施態様では、上記単離工程(工程(e))は、
(i)血清中の抗体に結合するポリペプチドの分子量を同定する工程;
(ii)該分子量を、ポリペプチドが由来する細菌のゲノムによってコードされるポリペプチドの分子量と関連づける工程;および
(iii)該ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする対応の核酸との同一性を決定する工程、を含む。
【0024】
ポリペプチドの分子量を決定するために適切な方法は多い。分子量決定の適切な方法としては、質量分析、電気泳動、またはクロマトグラフィーが挙げられる。以下で詳述する本発明の好適な実施態様においては、ポリペプチドの分子量は、SELDI質量分析によって決定される。
【0025】
抗原は、共生生物または病原性生物のいずれかから得られる。一般に、抗原はポリペプチドであり、そして、ポリペプチドが関連した生物の発現ライブラリーから得られるタンパク質の形態であるかどうか、またはそれらが細胞抽出物の形態であるかどうかは任意である。本発明の質量分析に基づく実施態様について、ポリペプチドは、溶液または懸濁液の形態、代表的には、外膜タンパク質のデタージェント抽出物であることが好ましい。ゲノムライブラリーに基づく実施態様については、ポリペプチドは、好ましくは、ファージディスプレイライブラリーのようなゲノムライブラリーから発現される。後者の場合、ポリペプチド抗原を発現するクローンは、ファージミドベクター内にある。
【0026】
本発明の方法における使用に適切なゲノムライブラリーは、共生ゲノムまたは病原性ゲノムのいずれかに由来し得る。病原性ゲノムが使用される場合、スクリーニング工程の結果は、病原性生物と共生生物との間の交差反応を有するポリペプチドの同定に使用される。
【0027】
共生微生物は、疾患を引き起こすことなく、宿主生物でコロニー形成し得る微生物である。多くの異なる共生細菌が存在する。共生Neisseriaは本発明における使用に適切であり、これらの共生Neisseriaは、代表的には、N. lactamica、N. cinerea、N. elongata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、N. perflava、およびN. subflavaからなる群より選択される。これらの共生生物の異なる種は、口腔または鼻の領域、または他の粘膜表面でコロニー形成することが知られており、したがって各々の種は、正常にコロニー形成する体の領域に応じて異なる抗原を生じ得る。
【0028】
共生生物に対して惹起された血清は、本発明のスクリーニング方法の出発点として特に有利であることが見出されている。病原性生物または抽出物に対して惹起された血清(例えば、回復期血清)とは異なり、共生血清は、より広い範囲の抗原と反応する傾向がある。病原性生物またはこのような生物の抽出物に対して惹起された血清は、特定の優性抗原に対して免疫反応性の偏りを示す傾向がある。例えば、N. meningitidisからの外膜タンパク質調製物に対してウサギで惹起された血清は、PorAのような免疫優性抗原に偏っている。結果として、免疫優性抗原がまた、株間で最も大きく変動する抗原であるという傾向を有することが、このような血清を使用することの明らかな欠点である。したがって、N. meningitidisのような病原体に対して惹起された血清に由来するワクチンは、株間の交差反応性が不十分な傾向にあり、したがって、より低レベルの防御しか与えない。
【0029】
免疫優性抗原の偏りは、N. lactamicaのような共生体に対して本発明に従って惹起された血清では非常に少なく、そして免疫優性抗原をほとんど含まない。結果として、共生生物に対して惹起された血清は、株間でほとんど変動せず、そしてより広いスペクトルおよびより長期間の防御を提供するワクチンの生成を可能にする潜在的なワクチン抗原を同定するための理想的なベースを提供する。
【0030】
本発明の方法が共生細菌からクローン/ポリペプチドを最初に同定するために使用される場合は、以下の工程を含むさらなる方法の工程が、必要に応じて行われ得る:
(i)共生細菌からのポリペプチド抗原をコードする単離されたクローンの核酸配列を用いて、病原性細菌の相同配列を同定する工程;および
(ii)同等の病原性細菌ポリペプチド抗原を生成するために、該病原性細菌から相同配列をクローニングする工程。
【0031】
したがって、共生体タンパク質抗原および対応する病原体タンパク質抗原の両方が同定され得る。これは、相同ポリペプチドの潜在的な抗原性領域のさらなる分析を可能にし、そしてより優れたワクチン抗原の可能性を有する病原体配列および共生体配列を含む融合タンパク質の設計も可能にする。
【0032】
本発明に使用される血清は、代表的には、共生体タンパク質に曝露されるマウスまたはウサギ宿主で惹起される。血清は、適切には、標準的なデタージェント抽出プロトコルによって得られる外膜タンパク質の調製物に対して惹起される。あるいは、共生細菌の細胞が宿主動物に注射され得る。スクリーニング工程の結果により、また、血清が惹起される特定の細胞抽出物を選択することによって、偏りが生じ得る。例えば、特定した分子量範囲の外膜タンパク質抽出物は、特定の免疫反応性プロファイルを有する血清を生じさせるために使用され得る。
【0033】
ポリペプチド抗原スクリーニング工程において使用される血清もまた、精製され得る。代表的には、特に本発明の質量分析の態様が使用される場合に、血清のIgG成分が単離される。
【0034】
本発明の第2の局面は、ワクチン組成物に含有される適切な抗原を同定する方法を提供し、この方法は、
(a)N. lactamicaの外膜タンパク質抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
(b)該血清を、N. lactamicaファージディスプレイライブラリー、好ましくはN. lactamicaゲノム全体を含むファージディスプレイライブラリーと接触させる工程;
(c)該血清との結合相互作用についての試験結果が陽性であるファージを同定し、そして該陽性ファージを単離する工程;
(d)該陽性ファージからファージミドベクターを抽出し、そしてそこに存在するクローニングしたN. lactamicaゲノム配列を特徴づける工程;および
(e)該N. lactamicaゲノム配列によってコードされるポリペプチドを決定し、そして該ポリペプチドを抗原として同定する工程、を含む。
【0035】
好ましい実施態様では、本発明の方法はさらに、
(f)N. meningitidis相同ポリペプチド抗原を同定するために、該N. lactamicaポリペプチド抗原の配列と、N. meningitidisゲノム配列とを比較する工程、を含む。
【0036】
本発明の第3の局面は、ワクチン組成物に含有される適切な抗原を同定する方法を提供し、この方法は、
(a)N. lactamicaの外膜タンパク質抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
(b)該血清のIgG成分を単離する工程;
(c)該単離されたIgGを固相に結合させる工程;
(d)該結合したIgGを、N. meningitidis細胞の抽出物から得られるポリペプチドと接触させる工程;
(e)ポリペプチドのIgGへの結合によって形成される固相−IgG−ポリペプチド複合体を単離する工程;
(f)固相−IgG−ポリペプチド複合体をSELDI質量分析によって分析する工程;
(g)該工程(f)からポリペプチドについて得られた分子量と、N. meningitidisゲノムデータベースからの公知および推定のポリペプチドの分子量とを関連づける工程;および
(h)該工程(g)の関連づけられた分子量から決定された遺伝子によってコードされるN. meningitidisポリペプチドを抗原として同定する工程、を含む。
【0037】
本発明のさらなる局面は、上述の方法に従って1以上の抗原を同定する工程、および該1以上の抗原を薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程を含む、ワクチン組成物の調製方法を提供する。この組成物での使用に適切な薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水酸化アルミニウムであるが、経口、静脈内、皮下、腹腔内、またはその他のあらゆる投与経路に適切な任意のキャリアが適切である。
【0038】
共生Neisseriaまたは病原性Neisseriaからの抗原は、全細胞、全細胞からの外膜小胞(OMV)の調製物、または組換え体形態のいずれかの形態でワクチン組成物として適切に投与される。全細胞またはOMVが投与される場合、本発明は、全細胞において交差反応性抗原の発現を導入またはアップレギュレートすることによって、代表的には、さらなる抗原性成分の組換え体生成を可能にする遺伝子構築物の導入することによって、共生Neisseriaの抗原性の可能性を増加させる方法を提供する。
【0039】
デオキシコール酸処理などによるOMV単離の公知の方法は、本発明の組成物の調製に適切である。
【0040】
従来のキャリアまたはアジュバントを含む本発明の組成物の処方物は、グラム陰性細菌のNeisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリー由来の細菌などの病原性細菌による感染の治療のための組成物を提供する。
【0041】
したがって、本発明の組成物の使用により、新たにレシピエントにおいて防御抗体の刺激または生成が生じ得るか、あるいは、個体が既に共生細菌または病原性細菌によってコロニー形成されている場合には、天然に存在する抗体が増強され得る。
【0042】
本発明の方法によって同定される抗原は、病原性細菌感染に対する防御免疫を提供することを意図するワクチン組成物中に適切に含まれ得る。抗原を薬学的に受容可能なキャリアとともに含む組成物は、本明細書で同定され、そして以下に詳細に説明するヌクレオチド配列のいずれかによってコードされる少なくとも10の連続するアミノ酸を含むポリペプチドである抗原を含み得る。
【0043】
本明細書で使用される用語「抗原」とは、タンパク質性抗原および非タンパク質性抗原の両方をいう。そしてタンパク質性抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、少なくとも10の連続するアミノ酸のオリゴペプチド、ならびにタンパク質およびポリペプチドのフラグメントが挙げられる。抗原フラグメントが、全長タンパク質をコードする核酸配列の一部から発現され得る、または全長ポリペプチドの酵素切断に由来し得ることに留意すべきである。後者の場合、タンパク質分解酵素消化によって得られるフラグメントである抗原は、抗原性の保持に必須な3次構造の局面を保持し得る。
【0044】
「ワクチン抗原」とは、ワクチン組成物中に含まれる場合に、細菌感染に対する防御免疫を誘起する抗原である。
【0045】
本発明のワクチン組成物は、動物における感染に対するワクチン接種に特に適切である。本明細書で使用される用語「感染」とは、宿主生物の組織内および/または組織上での病原性生物の増殖を含むことを意図する。このような病原性生物としては、代表的には、細菌、ウイルス、菌類、および原生動物が挙げられるが、生物の組織内および/または組織上でのあらゆる微生物の増殖は、用語「感染」に入るとみなされる。
【0046】
本発明のスクリーニング方法を行うプロセスにおいて、多くの有用なワクチン抗原が同定されている。このスクリーニング方法は、共生N. lactamicaからの外膜抽出物に対して惹起された血清を利用した。潜在的なワクチン抗原をコードする多くのN. lactamicaおよびN. meningitidis核酸配列が同定された。いくつかの同定されたN. meningitidis配列は、公知のワクチン抗原であるが、同定された配列の大多数は、これまで知られていないワクチン潜在性を有するタンパク質をコードする。
【0047】
本発明者らはまた、λファージにおいて新規なN. lactamicaゲノムライブラリーを構築した。したがって、本発明の方法によって同定されるN. lactamica核酸配列は、発現された場合に、これまでに特徴づけされておらずそして以前にN. lactamicaから単離されていない新規なポリペプチドを提供する新規な遺伝子配列を表す。これらのポリペプチドは、ワクチン抗原として顕著な有用性を示す。
【0048】
したがって、本発明のさらなる局面は、配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択されるN. lactamica核酸配列の全部あるいは一部によってコードされるポリペプチドを提供する。これらの核酸配列から発現されるポリペプチドに由来するポリペプチド抗原は、髄膜炎菌疾患に対して防御するワクチン組成物に適切に含まれ得る。
【0049】
本発明はまた、本発明のN. lactamica配列またはN. meningitidis配列から選択される核酸配列と少なくとも80%の相同性、好ましくは少なくとも80%の類似性、または少なくとも90%の相同性、好ましくは少なくとも90%の類似性を有する核酸配列から発現されるポリペプチド抗原を提供する。
【0050】
核酸(またはポリペプチド)配列間の相同性を決定するために適切な多くの配列比較アルゴリズムが、当該技術分野において知られている。これらのアルゴリズムは、核酸配列およびアミノ酸配列の配列比較および分析の両方に適切である。BLAST、FASTA、TepitopeTM、PepToolTM、およびEpiMerTMのようなアルゴリズムを利用するソフトウエアおよびシステムは、本発明の方法での使用に適切である。使用する場合、当業者は、2以上の配列間の相同性の領域を容易に同定し得る。さらに、これらのアルゴリズムは、高い配列同一性を有する特定の領域または局在化したドメインが正確に決定され得る程度まで配列分析を容易にし、したがって、潜在的なサブドメイン抗原が同定され得る。それによって、配列分析は、本発明のワクチン組成物に含まれ得る局在化した抗原性領域の同定を可能にする。本発明の方法は、所望の抗原性領域を含む全タンパク質の含有物が有害であり得る場合に特に有用である。この毒性は、おそらく宿主生物において引き起こされ得る自己免疫応答、あるいは宿主免疫系由来の抗原性領域を隠すマスキングドメインの存在に起因する。
【0051】
本発明のさらなる局面では、配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される単離されたN. lactamica核酸分子が提供される。単離された核酸分子を含むベクターもまた提供される。
【0052】
本発明のN. lactamica配列から翻訳される対応のポリペプチドもまた、本明細書において、配列番号2、6〜8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、および100で提供される。これらのポリペプチドおよびそれらの一部はワクチン抗原として有用である。
【0053】
本明細書において使用される用語「一部」または「フラグメント」とは、完全なタンパク質自体と同等である抗原性を示すポリペプチド抗原の一部をいうことを意図する。本質的には、例えば、全タンパク質の20%のみからなる抗原性モチーフまたはドメインは、ワクチン抗原として全長タンパク質と同等の値を有し得る。全長ポリペプチド抗原の一部またはフラグメントは、代表的には、全長抗原の約10以上の連続するアミノ酸残基を含むが、ある場合には、10よりも少ない残基が、ある程度の防御免疫を生じるのに十分である。
【0054】
上述のように、本発明のスクリーニング方法はまた、候補ワクチン抗原として多くのN. meningitidisタンパク質の同定に成功している。これらのポリペプチド抗原をコードする核酸配列は、配列番号3、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、および198に示される。対応するポリペプチド翻訳物は、配列番号4、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142〜144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、197、および199に提供される。
【0055】
したがって、本発明のさらなる局面は、新規に同定されたN. meningitidisポリペプチド抗原またはそれらの一部を含むワクチン組成物を提供する。
【0056】
本発明のさらなる局面は、ワクチン抗原としての、核酸配列から発現されるポリペプチドの使用または特定のポリペプチド配列自体の使用を提供する。さらなる使用としては、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種のための医薬品の製造における、核酸配列から発現されるポリペプチドの使用または特定のポリペプチド配列自体の使用が挙げられる。
【0057】
本発明の別の局面は、病原性細菌による感染に対するワクチン接種のための組成物を調製する方法を提供し、この方法は、
(1)共生Neisseriaから第1の抗原を得る工程;
(2)(a)該第1の抗原のアミノ酸配列を、病原性細菌からの第2の抗原のアミノ酸配列と比較する工程、または(b)該第1の抗原をコードする核酸の配列を、該第2の抗原をコードする核酸の配列と比較する工程;および該第1の抗原が該第2の抗原と相同である場合、または該第1の抗原の該核酸配列が第2の抗原の核酸配列と相同である場合、
(3)細菌感染に対するワクチン接種のための、該第1の抗原を含む組成物を調製する工程、を含む。
【0058】
共生Neisseriaまたは共生Neisseria由来の核酸配列からの抗原は、病原性細菌由来の対応する相同抗原があるかどうかを決定するために、病原性細菌からの抗原またはヌクレオチド配列のライブラリーと比較され得る。
【0059】
本明細書において使用される用語「相同な」および「相同性」ならびに関連する用語は、共生体抗原に対する免疫応答が病原体と交差反応することを意味する。
【0060】
このような相同性は、共生体抗原に対する免疫応答が病原体によるチャレンジに対して防御的である場合に存在する。このような相同性はまた、配列類似性、例えば、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%のそれぞれの共生体配列および病原体配列との間に配列相同性がある場合に存在する。配列は、アミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードする核酸配列のいずれかである。類似性のレベルは、配列全体間の同一性のレベル、配列の一部分間の同一性のレベル、または抗原性の同等性における類似性のいずれかであり得る。配列間の同一性のレベルが、アミノ酸配列の一次構造の関数であることは明らかであるが、抗原性の同等性/相同性のレベルは、アミノ酸配列の二次構造および三次構造の関数である。
【0061】
共生Neisseriaの抗原性成分についてのアミノ酸または核酸配列と、病原性細菌の抗原性成分についてのアミノ酸または核酸配列との間の相同性のレベルを決定する工程において、相同性のレベルは、重要な抗原性エピトープ、ドメイン、またはサブユニットに関して決定され、そして相同性の全体のレベルに制限はない。
【0062】
例えば、膜結合表面タンパク質の特定のサブユニットの配列に対して高いレベルの相同性があるが、結合した膜に広がるドメインおよび細胞内領域に対して低レベルの相同性である場合、有効な抗原性相同性のレベルは、依然として高いと考えられ、そして、配列相同性の全体のレベルが低くても、本発明に有用である。
【0063】
本発明の組成物の抗原性成分が、好ましくは、宿主生物の免疫系に対して免疫顕性、すなわち「可視」であるアミノ酸配列であることに注目することが重要である。したがって、タンパク質の免疫顕性領域間の50%の相同性は、共生体および病原性型の配列間の高い全体の相同性と対応し得ない。実際に、共生体および病原性種からの抗原性成分間の高い配列相同性の特定のドメインを同定することは、病原性種からの感染に対する防御免疫を提供するワクチン組成物に適切に含まれる共生種からの抗原を同定するのに十分である。
【0064】
90パーセントを超える高いレベルの相同性が理想的であるが、通常は、50%を超える、好ましくは70%を超えるレベルで十分である。
【0065】
本発明の方法は、共生Neisseriaからの抗原であってそのアミノ酸配列が病原性細菌の配列と相同である抗原を同定する工程を含む。好ましくは、病原性細菌はグラム陰性細菌であり、より好ましくは病原性Neisseria、例えば、N. meningitidisまたはN. gonorrhoeaeである。あるいは、細菌は、グラム陰性細菌のNeisseriaceae(Neisseria、Branhamella、Moraxella、Acinetobacter、Kingellaを含む)およびPasteurellaceae(Pasteurella、Haemophilus、Actinobacillus)の病原性メンバーから選択される。これらの微生物は、宿主生物の粘膜表面に存在する能力および中耳炎(中耳感染)のような感染を引き起こす能力によって特徴付けられる。それらが類似の環境ニッチに存在する傾向にあり、そしてしばしば同じ粘膜表面上に共存するという事実のため、このサブグループの細菌の病原性メンバー間を臨床的に識別することは困難であり得る。
【0066】
共生微生物は、疾患を引き起こすことなく、宿主生物でコロニー形成し得る微生物である。多くの異なる共生Neisseriaが、本発明での使用に適切であり、そしてこれらの共生Neisseriaは、N. lactamica、N. cinerea、N. elogata、N. flavescens、N. polysaccharea、N. sicca、N. perflava、およびN. subflavaからなる群より選択され得る。これらの共生生物の異なる種は、口腔または鼻の領域、あるいは他の粘膜表面でコロニー形成することが知られており、したがって各々の種は、体の公知の領域に応じて投与され、正常にコロニー形成する。また、本発明の組成物の使用により、新たに防御抗体の生成を刺激し得るか、または、個体が既にある程度までコロニー形成されている場合には、天然に存在する抗体を増強し得る。
【0067】
Neisseria meningitidis(血清群AおよびB)、Haemophilus influenzae、およびPasteurella multocida(PM70)ゲノムは、配列決定され、公表されている。ゲノムデータは、Sanger研究所(Cambridge、UK)からまたはインターネット上(www.sanger.ac.uk、www.ebi.ac.uk/genomes、およびwww.tigr.org)で入手可能であり、そして、利用可能な完全に配列決定された細菌ゲノムの数は、将来、劇的に増加すると予測される。したがって、ナイセリア共生体核酸配列を多数の病原性細菌のゲノム配列と比較することが可能である。
【0068】
本発明の方法で同定された共生Neisseriaからの抗原は、表面の可視抗原に制限される必要はない。実際、宿主免疫系に対して可視ではないとこれまで考えられていた多くの細胞質およびエンドソームタンパク質が、抗原潜在性を有することは驚くべき観察結果である。このように、本発明は、これまで可能と思われたものよりも、より広い範囲の抗原性成分をワクチン組成物中に含有することを可能にする点で、かなり有利である。上記背景の項で説明した文献から明らかなように、多数の候補抗原は、病原性Neisseriaで同定されており、そして、ワクチンにおいてそれらの価値が試験されたか、あるいは試験されている。さらに任意の本発明のスクリーニング工程は、共生Neisseriaからの抗原を保持することであり、この抗原は病原体についての研究から実際にあるいは潜在的に価値を有すると既に同定されている抗原に対応する。
【0069】
本発明の方法によって共生Neisseriaで同定された候補抗原は、多くの方法で評価される。いくつかの候補抗原は、多数の異なる病原性種における保存配列と相同な配列を有し、したがって、広いスペクトルの防御の可能性を示す。他の候補抗原は、単一の病原性種の配列に対して高レベルの相同性を示し、したがって、この単一種の病原体に関して強い抗原活性の可能性を示す。
【0070】
候補抗原はまた、本発明のワクチン組成物に含有されるための適切性に基づいて評価される。いくつかの候補抗原は、他よりも外膜小胞(例えば、膜結合タンパク質)により容易に組み込まれ、したがって、この送達の特定の態様について選択される。
【0071】
1つの特定の方法においては、タンパク質は、共生Neisseriaで同定される。このタンパク質は、次いで、共生体に結合することが知られている抗体調製物との反応性についてでスクリーニングされる。例えば、抗体調製物は、共生体の膜の抽出物を用いて調製され得る。スクリーニングが陽性である場合、すなわち、タンパク質が抗体調製物によって認識される場合、抗原として同定される。したがって、この最初のスクリーニングは、タンパク質が抗原性であり、そしておそらく共生体の表面上で発現されることを確認する。
【0072】
第2のスクリーニング工程は、病原性Neisseria中に対応する抗原性配列があるかどうか調査することであり、これは、上述のように適切に行われる。この第2のスクリーニングが陽性である場合、最も好ましいワクチン候補を同定するために、第3およびさらなるスクリーニングは、大きさによる選択、すべての病原性種中の対応する抗原の存在の頻度による選択を含む。
【0073】
したがって、本発明の使用についての例では、共生Neisseria(例えば、N. lactamica)のデタージェント抽出物が、マウスにワクチン接種するために使用される。マウスは、Neisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリーの病原性メンバー(例えば、N. meningitidis、Moraxella catarrhalis、Pasteurella multocida、またはHaemophilus influenzae)からチャレンジを受ける。回復期血清がチャレンジで生き残っているマウスから得られ、そして共生Neisseriaから発現ライブラリーをスクリーニングするために使用されて、候補抗原を同定する。次いで、同定された候補抗原についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が決定され、そして病原性生物からの配列に対する相同性について、配列類似性および他の分析によって比較され得る。候補抗原はそれらの適切性について選択され、そしてワクチン組成物に含まれる。
【0074】
共生Neisseriaからの抗原の使用における本発明の例では、以下の工程によって、ワクチン中に含有するためのそれらの適切性について評価され得る:
共生Neisseriaからの抗原についてのアミノ酸配列を得る工程、または該抗原をコードするヌクレオチド配列を得る工程;
得られた配列を病原性細菌からの対応する配列と比較する工程;および
全体の配列相同性が50%を超える抗原を同定する工程。
【0075】
ナイセリア感染に対するワクチン接種のための組成物は、次いで、この方法に従って抗原を同定し、そして該抗原を組成物中に組み込むことによって調製される。
【0076】
したがって、本発明のこの後者の局面は、ワクチン調製物の領域において、これまで有した知識からの逸脱を示す。本発明によれば、ワクチン抗原は、共生種で発現される抗原で最初に同定される。この抗原は、共生体の表面上に発現するかどうかを決定するために適切にテストされ、そして、そうであれば、対応するタンパク質、すなわち少なくとも50%相同のタンパク質が病原体に存在するかどうかが研究される。対応するタンパク質が病原体中で同定されるのであれば、ワクチンは、共生体タンパク質またはそれらの免疫原性フラグメント、もしくは病原性種からの免疫原性フラグメントのいずれかに基づく。このように、本発明は、サブトラクション方法が、病原体でのみ見られる抗原を同定するために使用された、ワクチンを得るためのこれまでのアプローチとは実質的に異なる。
【0077】
本発明のアプローチの有利な点は、共生生物の取扱いにおいてワクチンの調製中にほとんど危険性がないことである。さらなる有利点は、共生体の抗原が、同一種内変異をほとんど示さない傾向にあることである。したがって、特定の病原性種に由来する抗原よりも、ある病原性株に対して低い防御レベルの状況にもかかわらず、共生体由来抗原は、より広いスペクトルの免疫を提供し得る。共生体由来抗原は、一般的に、より広い範囲の株に対して少なくとも低いレベルの防御を有するという利点がある。
【0078】
したがって、本発明によれば、多くの株に対する交差反応に好都合なように、個々の株に対する効力間のトレードオフが容認される。実際に、ワクチン接種のプログラムは、例えば、1国内のような所定の集団の中の各個体が、その国の特定の地域において、他の地域よりも流行している1つの病原性株であるかどうかに関わりなく、同じワクチンを投与される傾向にある点で、粗雑である。本発明で提供される抗原性成分の交差反応性は、いくつかにおける高い防御およびその他における防御の欠損の危険性よりもむしろ、ワクチン接種された大多数についての少なくともベースラインの防御を確実にする。
【0079】
以下で、より詳細に説明される本発明の実施例において、抗原は、共生Neisseriaタンパク質のフラグメントである。共生Neisseriaデタージェント抽出物に対して惹起された抗体が、抗原を同定するために使用される。この抗原は、上述のように、未処理の共生体タンパク質のフラグメントであり、病原性生物において最小レベルの相同性を有する対応するタンパク質を同定するために使用される。共生Neisseriaからの抗原に対する病原性のパートナーの存在は、共生抗原および病原性抗原の両方をワクチン候補として示す。既に述べたように、共生体タンパク質に対して惹起された血清中に免疫優性抗原がないため、新規な病原性抗原を同定する現実の機会も存在する。
【0080】
以下で、より詳細に説明される実施例において、ゲノムライブラリーを、Neisseria lactamicaから調製した。ゲノムDNAを、MboIによって部分消化した。1〜4kbの消化されたDNAをZAP発現ベクター(Stratagene)にライゲートし、Gigapack III Gold packaging extract(Stratagene)を用いてパッケージングした。ライゲートしパッケージングしたDNAをプレーティングし、プラーク形成を行った。髄膜炎菌感染実験モデルにおいて、髄膜炎菌チャレンジに対して防御性であると既に同定されているN. lactamicaデタージェント抽出物に対して惹起されたウサギ血清を用いて、プラークをスクリーニングした。このN. lactamica血清と反応する陽性のプラークを採集し、精製した。PCRによってインサートが異なるサイズであること確認した後、pBK−CMVファージミドベクターを各クローンのZAP発現ベクターから切り出した。ファージミドを精製し、次いでインサートを、T3およびT7プライマーを用いて配列決定した。生じた配列を、髄膜炎菌ゲノムと比較し、相同な髄膜炎菌タンパク質を以下のリストに示す。NMA番号は、髄膜炎菌血清群Aゲノムに割り当てられる遺伝子番号である。NMB番号は、髄膜炎菌血清群Bゲノムに割り当てられる遺伝子番号である。
【0081】
本発明はまた、以下の工程によるテストの下で、候補抗原が組成物中に存在するかどうかを決定する品質管理方法を提供する:
(i)組成物中の候補抗原を同定する工程、または
(ii)該組成物中の抗原の存在に適切な組成物に対して曝露された宿主動物において、免疫応答を同定する工程。
【0082】
代表的には、評価される調製物は、OMVベースのワクチンの場合と同様の多くの異なる抗原性成分を含む。本発明の方法は、1以上の候補抗原が存在するかどうか、および許容可能な程度に存在するかどうかを評価するために、これらの調製物をスクリーニングすることを可能にする。
【0083】
組換え候補抗原もまた、抗原を含む組成物をワクチン接種した動物からの血清のテストにおいて、品質管理アッセイにルーチンに利用される。これらの動物からの血清が候補抗原と十分に反応する場合、その組成物は、適切な量の候補抗原を含むとみなされる。不十分な反応である場合、組成物は不完全であるとみなされる。血清と組換え抗原との間の反応は、当該技術分野で通常公知の多くの技法によって適切に媒介され、例えば、組換え抗原は、該抗原に対する抗体を含む血清の存在下で凝集反応が生じるように微粒子上に配置され得る。このアッセイはまた、上記の工程において、組換え抗原をワクチン組成物に置換することによって、ワクチン組成物自体をテストするように適合され得る。
【0084】
不完全なワクチンは、所望の候補抗原を含まないことが見出されるか、または所望の免疫応答を誘起しないことが防御テストにおいて見出される場合、廃棄され得る。
【0085】
本発明を、ここで、以下の実施例を参照して、より詳細に説明する。
【実施例】
【0086】
実施例1−ゲノムスクリーニング
1.N. lactamicaゲノムファージディスプレイライブラリーの調製
1.1. N. lactamicaゲノムDNAの調製
100mlのMHB(Oxoid)に、プレート増殖したN. lactamicaのY92-1009株を白金耳で接種し、そして37℃にて18時間振盪しながらインキュベートした。培養物を4000gで遠心分離し、そしてペレットを9.5mlのTE緩衝液(10mM Tris、1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH8.0)に再懸濁した。0.5mlの10%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および50mlの20mg/mlプロテイナーゼK(Sigma)を懸濁液に加え、そしてこれを37℃にて1時間インキュベートした。1.8mlの5M NaClおよび1.5mlの10%セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)を含む0.7M NaCl溶液を加え、そしてこの溶液を65℃にて20分間インキュベートした。DNAを、等容量のクロロホルム:イソアミルアルコール(Sigma)の添加によって溶解した細胞から抽出した。この溶液を6000gにて10分間遠心分離し、そして総容量の0.6のイソプロパノールを添加してDNAを沈殿させた。沈殿したDNAを、1mlの70%(v/v)エタノールで洗浄し、そして10000gにて5分間の遠心分離によって回収し、上清を捨て、そしてペレットを4mlのTE緩衝液に再懸濁した。1.075g/mlのCsCl(Sigma)および50mlの10mg/mlエチジウムブロミド(Sigma)を添加し、そして溶液を15℃にて250000gで18時間クイックシール遠心管で遠心分離した。CsClグラジエントを長波UV下で可視化し、そしてバンドを取り出した。エチジウムブロミドを、水および飽和ブタノールでの連続抽出によって除去した。CsClを、4℃にてエタノールで15分間、次いで10000gにて15分間の遠心分離でのDNAの沈殿によって除去した。ペレットを、長期保存用にTE緩衝液に再懸濁した。
【0087】
1.2. 部分消化ゲノムDNAの調製
10mgのゲノムDNAを、以下のように消化した。10mgのゲノムDNA、1mg BSA、10ml NE緩衝液3(New England Biolabs)、6ml MboI(New England Biolabs)、および63mlの分子生物学グレードの水(Sigma)を、37℃にて2時間インキュベートした。生成物を、0.8%(w/v)低融点アガロースゲル(Sigma)で分析した。1〜4kbのバンドを、長波UVを用いて位置決めし、そしてゲルから切り出した。消化したDNAを、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて、供給されたプロトコルに従ってゲルから取り出した。抽出したDNAを、TE緩衝液中で保存した。
【0088】
1.3. ライゲーション
部分消化したDNAをZAP発現ベクター(Stratagene)にライゲートするために、ライゲーション反応を以下のように設定した。1mgのベクター、0.4mgの消化したDNA、0.5mlの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液(New England Biolabs)、2.7mlの分子生物学グレードの水、および10UのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を、4℃にて18時間インキュベートした。
【0089】
1.4. パッケージング
ファージ粒子を、Gigapack III Gold packaging extract(Stratagene)を用いてパッケージングした。3mlのライゲーション反応物を、packaging extractに添加し、よく混合した。混合物を、6000gにて5秒間遠心分離し、そして室温にて2時間インキュベートした。500mlのSM緩衝液(5.8g NaCl、2g MgSO4・7H2O、50mlの1M Tris(pH7.5)、5mlの2%(w/v)ゼラチンをH2Oで1Lに希釈した)および20mlのクロロホルムを、混合物に添加し、内容物を混合し、短時間遠心分離し、そして上清を4℃にて保存した。
【0090】
1.5. パッケージングしたライゲーション生成物のプレーティング
E. coliのXL1 Blue MRF'株を、LB寒天プレート上で一晩37℃にて18時間増殖させた。10mM MgSO4および0.2%(w/v)マルトースを補充した10mlのLBブロスに、単一コロニーを接種し、そして37℃にて6時間振盪しながらインキュベートした。細胞を、1000gにて10分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを10mM MgSO4に再懸濁した。OD600を0.5に調節した。2mlの最終のパッケージングした反応物を、200mlのXL1 Blue MRF'と混合し、そして穏やかに振盪しながら37℃にて15分間インキュベートした。3mlのNZYトップ寒天、15mlの0.5M イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)、および12.5mgの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b-D-ガラクトピラノシド(X-gal)(Sigma)を加え、そして混合物を、NZY寒天プレート上にすばやく注ぎ、そして30℃にて18時間インキュベートした。20プレートを調製して、N. lactamicaゲノム全体をカバーした。8〜10mlのSM緩衝液をプレート上に積層し、そして穏やかに振盪しながら4℃にて18時間インキュベートすることによって、バクテリオファージを回収した。5%(v/v)クロロホルムをバクテリオファージ懸濁液に加え、そして細胞破砕物を、500gにて10分間の遠心分離によって除去した。クロロホルム(0.3%v/v)を上清に加え、そしてライブラリーを4℃にて保存した。
【0091】
2.ゲノムライブラリーの分析
2.1. プラーク形成
3mlのバクテリオファージライブラリーを、十分なNZY寒天プレート上に上記のようにプレーティングして、ゲノムをカバーした。30℃にて18時間のインキュベーション後、IPTGに浸漬したニトロセルロースメンブラン(Amersham Pharmacia Biotech)をプレート上に載せ、そして30℃にてさらに18時間インキュベートした。メンブランを注意深く取り出し、そして0.05%(v/v)Tween-20および1%(w/v)ミルク粉末(Marvel)を含むリン酸緩衝化生理食塩液(PBS)で1時間ブロックした。メンブランを、0.05%Tween 20を含むPBS(PBS-T)で洗浄し、次いでN. lactamicaデタージェント抽出したOMPに対して惹起したウサギ血清のPBS-T希釈物とともに1時間インキュベートした。前述のように洗浄した後、メンブランを抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(ICN)と1時間インキュベートし、PBSで洗浄し、そして0.5mg/mlの4-クロロ-1-ナフトール(Sigma)で発色させて交差反応性ファージを同定した。
【0092】
2.2. プラーク精製
同定した各プラークについて、陽性プラークを含む寒天のプラグをプレートから取り出した。プラグを0.5%(v/v)クロロホルムを含む1mlのSM緩衝液中に入れ、そして4℃にて18時間インキュベートした。10mlのファージ懸濁液をプレーティングし、プラーク形成させ、そして陽性のものを既述のように同定した。これを、各陽性のものについて行い、懸濁液が純粋になるまで繰り返した。ファージの長期保存は、SM緩衝液中4℃にて行った。
【0093】
2.3. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
陽性ファージを既述のようにプレーティングした。各陽性のファージについて1つのプラークを取り上げ、500mlの分子生物学グレードの水にピペットで入れ、ボルテックスで撹拌し、4℃にて18時間インキュベートして、寒天からファージ粒子を解離した。これをPCR用のテンプレートとして用いた。以下の反応混合物を用いて、陽性ファージからN. lactamicaインサートを増幅した;1ml T3プライマー(Life Technologies)、1ml T7プライマー(Life Technologies)、1ml テンプレート、2.5U Taq DNAポリメラーゼ(Roche)、5ml 10×PCR緩衝液(Roche)、1mlの10mM dNTP(Roche)。そして、各テンプレートについて、40.5mlを200mlのPCRチューブ(Anachem-Scotlab)中で氷上で混合した。反応物を、94℃まで3分間加熱した。熱サイクルを以下のように35回繰り返した;94℃で30秒間、52℃で30秒間、72℃で2.5分間。最後に、反応物を、72℃にて10分間インキュベートした。
【0094】
2.4. ファージミド切り出し
陽性ファージを既述のようにプレーティングした。個々のファージストックを、20mlクロロホルムを含む500mlのSM緩衝液への1プラークのトランスファーから調製し、次いでボルテックスで攪拌し、4℃にて18時間インキュベートした。E. coliのXL1 Blue MRF'株を、0.2%(w/v)マルトースおよび10mM MgSO4を補充した10mlのLBブロス中で30℃にて18時間増殖させた。細胞を1000gにて15分間遠心分離し、そしてペレットを、OD600が1になるように10mM MgSO4に再懸濁した。200mlの再懸濁したXL1 Blue MRF'を、250mlのファージストックおよび1ml ExAssist helper phage(Stratagene)と合わせ、そして37℃にて15分間インキュベートした。3mlのNZYブロスを各混合物に加え、そしてこれらを穏やかに振盪しながら37℃にて2.5時間さらにインキュベートし、最後に70℃まで20分間加熱し、そして1000gにて15分間遠心分離した。切り出したpBK−CMVファージミドベクターからなる上清をデカントし、そして4℃にて保存した。これを各ファージストックについて繰り返した。
【0095】
2.5. 切り出したファージミドのプレーティング
E. coliのXLOLR株を、10ml NZYブロス中で30℃にて18時間増殖させ、1000gにて15分間遠心分離し、そしてペレットを、OD600が1になるまで10mM MgSO4に再懸濁した。100mlのファージミド上清を、200mlの再懸濁した細胞と混合し、そして37℃にて15分間インキュベートした。300mlのNZYブロスを加え、そして混合物を37℃にて45分間さらにインキュベートした。200mlの細胞混合物を、50mg/mlカナマイシン(Sigma)を補充したLB寒天上にプレーティングし、そして37℃にて18時間インキュベートした。
【0096】
2.6. ファージミド精製
ファージミドを、供給されたプロトコルに従ってWizard Plus Minipreps(Promega)を用いて精製した。
【0097】
2.7. 配列決定
次いで、精製したファージミドストックを、T3およびT7プライマーを用いて配列決定した。配列番号1〜102に、それらの翻訳産物および対応するN. meningitidisホモログ(核酸およびタンパク質)の配列を示す。
【0098】
ゲノムスクリーニングから推定されそして候補ワクチン抗原として同定されたN. lactamicaタンパク質を、以下の表1に示す。
【0099】
【表1】
【0100】
実施例2−質量分析スクリーニング
表面増強レーザー脱着イオン化法
1 ウサギ血清の生成
ウサギに、60μgのN. lactamicaタンパク質プール(上述)を含む2mlの25%(v/v)アルヒドロゲルを、4部位に皮下投与して免疫した。初回ワクチン注射を、実験の1日目にウサギに投与した。ワクチン注射を21日目および28日目にブーストし、そしてチャレンジを実験の35日目に行った。
【0101】
1.1 血清からのIgGの精製
プロテインG Sepharose Fast Flowゲルカラムを、製造業者による記載のようにパッケージした。血清試料を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0(緩衝液A)で1:4に希釈し、そして同じ緩衝液でカラムを平衡化した。希釈した試料をカラムに載せ、そして緩衝液Aで1ml/分の流速にてカラムを洗浄した。溶出液を5ml画分として収集した。48mlでカラムを洗浄した後、緩衝液を、0.1Mグリシン、pH2.8(緩衝液B)に変更した。これを、結合したIgGをカラムから予め除去するのと同じ速度でカラムから溶出した。22mlの緩衝液Bでカラムを洗浄し、そして試料を2ml画分に収集し、0.5ml Tris pH9.0でpHを中性にした。
【0102】
2 デタージェント抽出したOMPの調製
N. meningitidisのMC58 cap-株の500mlのブロス培養物を、200gにて60分間遠心分離した。上清を捨て、そしてペレットを、100mlのPBSで200gにて30分間の遠心分離によって洗浄した。上清を再度捨て、そして各1グラムのペレットに対して0.3%(v/v)エルジェント(elugent)を含む2mlのPBSを添加した。ペレットをホモジナイズし、そして37℃にて振盪しながら20分間インキュベートした。この溶液を、14,000rpmにて10分間遠心分離し、そしてペレットを捨てた。上清に、10mM(w/v)EDTA、0.5%(w/v)N-ラウリル-サルコシン(Sigma)、および0.1%(v/v)の10%(w/v)PMSF溶液を加えた。抽出されたOMPを含む上清を、−20℃にて保存した。
【0103】
2.1 プレパラティブ電気泳動によるデタージェント抽出物の分離
プレパラティブ電気泳動を、供給されたプロトコルに記載のように、モデル419 Prep-Cell(BioRad)を用いて行った。使用したゲルは非変性であり、そして7%(v/v)プロトゲルからなるゲルを、100kDa未満のOMPの分離に用いた。
【0104】
3 N. lactamica IgGおよびN. meningitidisタンパク質プールでのダイナビーズのコーティング
250μlのトシル活性化したダイナビーズを、1.5mlチューブに入れ、そして磁石によってビーズを保持した。溶液を除去し、そしてビーズを、250μlの0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.5)に2分間混合することによって再懸濁した。これを2回繰り返した。次いで、緩衝液を除去し、そしてビーズを、30μgのIgGを含む500μlに再懸濁した。ビーズを、ゆっくりと傾斜回転しながら37℃にて18時間インキュベートした。ビーズを、0.1%(w/v)BSAを含む500μlのPBSに再懸濁することによってブロックした。これを2回繰り返した。溶液を除去し、そして0.1%(w/v)BSAを含む0.2MのTris(pH8.5)に置換し、そしてゆっくりと傾斜回転しながら37℃にて4時間インキュベートした。溶液を除去し、そしてビーズを、0.1% BSAを含む500μlのPBSに再懸濁した。ビーズを0.5%(v/v)Triton X100を含む500μlのPBSで洗浄し、0.1% BSAを含む500μlのPBSに再懸濁し、そして最後に0.1% BSAを含む100μlのPBSに再懸濁した。10μlのIgGコーティングしたビーズ溶液を、50μgのN. meningitidis OMPプールとともにゆっくりと傾斜回転しながら4時間インキュベートした。上清を除去し、そしてビーズを滅菌水で5分間3回洗浄した。洗浄したビーズを、分析用に10μlの滅菌水に再懸濁した。正常ウサギIgGでコーティングしそしてN. meningitidis OMPとともにインキュベートしたビーズを、コントロールとして用いた。
【0105】
4 ビーズの分析
2μlのビーズを、H4チップのスポット上の1μlの50%(v/v)アセトニトリル中に入れた。これらを乾燥するまで放置し、そして0.25%(v/v)トリフッ素酸および50%(v/v)アセトニトリル中の10mg/mlのシナピン酸溶液0.7μlで覆った。Protein Chip(CiphergenTM)を、Ciphergen SELDI装置を用いて読み取り、そしてウサギIgGに結合したタンパク質の正確な分子量を決定した。SELDI装置の較正を、CiphergenTMハンドブックに記載のように行った。
【0106】
スクリーニングで同定されたN. lactamica抗血清からのIgGと交差反応する推定の髄膜炎菌タンパク質を、ExPasy Tagldentソフトウエアを用いてN. meningitidisのB群のゲノムデータベースと関連づけた。N. meningitidisゲノムから同定されたすべてのタンパク質は、SELDIスクリーニングにおいて特定のポリペプチドについて決定された分子量の5%以内の分子量を有する。好ましいタンパク質は、SELDI同定されたポリペプチドについての分子量の2%以内の分子量を有する。
【0107】
質量分析スクリーニングにおいて候補ワクチン抗原およびその翻訳産物をコードすると同定されたN. meningitidis核酸配列を、配列番号103〜199に示し、そして以下の表2に記載する。
【0108】
【表2−1】
【0109】
【表2−2】
【0110】
興味深いことに、この方法が、TbpB、クラス3タンパク質、H8外膜タンパク質、およびCu,Znスーパーオキシドジスムターゼのような強力なワクチン抗原であることが知られている多くのタンパク質も同定することに着目する。これは、本発明の方法の有効性を明らかに認証する。
【0111】
同定された配列をさらに分析して、いずれかの推定タンパク質がシグナル配列または膜貫通ドメインを含むかどうかを決定した。これらの特有のモチーフの存在は、しばしば表面曝露を示し、そして適切なワクチン抗原をさらに同定することを補助し得る。
【0112】
シグナルペプチドの存在を、SignalPアルゴリズムを用いて決定し、そして膜貫通ドメインについては、TMpredアルゴリズムを用いた。両方のアルゴリズムとも、当該技術分野で通常公知であり、そしてwww.expasy.org(The ExPASyTM、Expert Protein Analysis Systemはthe Swiss Institute of Bioinformaticsのプロテオミクスサーバーによってホストされる)から入手可能である。
【0113】
SignalPおよびTMpred分析の結果を表3に示す。
【0114】
【表3−1】
【0115】
【表3−2】
【0116】
多くの同定された配列は、推定シグナル配列または膜貫通ドメインを含むようであるが、かなりの数もまた含まないことは驚くべきことである。
【産業上の利用可能性】
【0117】
したがって、本発明の方法が、抗原性の可能性を有することがこれまでに知られていないポリペプチドを同定するための方法を提供することが理解され得る。
Claims (44)
- 抗原を同定する方法であって、
a.共生Neisseriaまたは共生Neisseriaからの抽出物に対して惹起された抗体を得る工程;
b.該抗体を、共生細菌または病原性細菌のいずれかの発現ライブラリーから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが該抗体に結合するかどうかを決定する工程;
d.ポリペプチドが抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程;および
e.該発現ライブラリーから該抗原を発現するクローンを単離する工程;
を含む、方法。 - 前記工程(e)が、
i.前記抗体に結合する前記ポリペプチドの分子量を同定する工程;
ii.該分子量を、該ポリペプチドが由来する細菌のゲノムによってコードされるポリペプチドの分子量と関連づける工程;および
iii.該ポリペプチドと該ポリペプチドをコードする対応の核酸との同一性を決定する工程;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ポリペプチドの分子量が、質量分析、電気泳動、またはクロマトグラフィーによって決定される、請求項2に記載の方法。
- 前記工程(b)のポリペプチドが、ファージディスプレイライブラリーの形態で存在し、そして前記工程(e)において、前記ポリペプチド抗原を発現するクローンがファージミドベクター内に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記ファージディスプレイライブラリーが、λファージ中にある、請求項4に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーが、病原性細菌ゲノム由来である、請求項1から5のいずれかの項に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーが、共生細菌ゲノム由来である、請求項1から5のいずれかの項に記載の方法。
- i.前記共生細菌由来のポリペプチド抗原をコードする単離されたクローンの核酸配列を用いて、病原性細菌における相同配列を同定する工程;および
ii.同等の病原性細菌ポリペプチド抗原を生成するために、該病原性細菌由来の相同配列をクローニングする工程;
をさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記共生Neisseriaが、N. lactamica; N. cinerea; N. sicca; N. subflava; N. elogata; N. flavescens; N. perflava;およびN. polysacchareaからなる群より選択される、請求項1から8のいずれかの項に記載の方法。
- 前記病原性細菌が、グラム陰性細菌のNeisseriaceae/Pasteurellaceaeファミリーから選択される、請求項1から9のいずれかの項に記載の方法。
- 前記病原性細菌が、N. meningitidisである、請求項10に記載の方法。
- 前記抗体が、共生Neisseriaの細胞に対して惹起される、請求項1から11のいずれかの項に記載の方法。
- 前記抗体が、共生Neisseria細胞からのタンパク質抽出物に対して惹起される、請求項1から11のいずれかの項に記載の方法。
- 前記タンパク質抽出物が、外膜タンパク質抽出物である、請求項13に記載の方法。
- 前記抗体が、IgGを富化するように精製される、請求項1から14のいずれかの項に記載の方法。
- ワクチン組成物に含有される適切な抗原を同定する方法であって、
a.N. lactamicaの外膜タンパク質抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
b.該血清を、N. lactamicaゲノム全体を含むファージディスプレイライブラリーと接触させる工程;
c.該血清との結合相互作用についての試験結果が陽性であるファージを同定し、そして該陽性ファージを単離する工程;
d.該陽性ファージからファージミドベクターを抽出し、そしてそこに存在するクローニングしたN. lactamicaゲノム配列を特徴づける工程;および
e.該N. lactamicaゲノム配列によってコードされるポリペプチドを決定し、そして該ポリペプチドを抗原として同定する工程;
を含む、方法。 - f.N. meningitidis相同ポリペプチド抗原を同定するために、前記N. lactamicaポリペプチド抗原の配列と、N. meningitidisゲノムライブラリーとを比較する工程、
をさらに含む、請求項16に記載の方法。 - ワクチン組成物に含有される適切な抗原を同定する方法であって、
a.N. lactamicaの外膜タンパク質抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
b.該血清のIgG成分を単離する工程;
c.該単離されたIgGを固相に結合させる工程;
d.該結合したIgGを、N. meningitidis細胞の抽出物から得られるポリペプチドと接触させる工程;
e.ポリペプチドとIgGとの結合によって形成される固相−IgG−ポリペプチド複合体を単離する工程;
f.固相−IgG−ポリペプチド複合体をSELDI質量分析によって分析する工程;
g.該工程(f)からポリペプチドについて得られた分子量と、N. meningitidisゲノムデータベースからの公知および推定のポリペプチドの分子量とを関連づける工程;および
h.該工程(g)の関連づけられた分子量から決定された遺伝子によってコードされるN. meningitidisポリペプチドを抗原として同定する工程;
を含む、方法。 - 請求項1から18のいずれかの方法に従って抗原を同定する工程、および
該抗原を薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程、
からなる、ワクチンの調製方法。 - ワクチン組成物の調製方法であって、
a.共生細菌に対してまたは共生Neisseriaからの抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
b.該血清を、共生または病原性細菌のいずれかから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが該血清中に存在する抗体に結合するかどうかを決定する工程;
d.ポリペプチドが該血清中の抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程;および
e.該抗原を薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程;
からなる、方法。 - ワクチン組成物の調製方法であって、
a.共生Neisseriaまたは共生Neisseriaからの抽出物に対して惹起された血清を得る工程;
b.該血清を、共生または病原性細菌のいずれかから得られる1以上のポリペプチドと接触させる工程;
c.該1以上のポリペプチドが該血清中に存在する抗体に結合するかどうかを決定する工程;
d.ポリペプチドが該血清中の抗体に結合する場合、該ポリペプチドを抗原として同定する工程;
e.該抗原をコードする核酸配列を得る工程;および
f.該核酸配列および薬学的に受容可能なキャリアを含むワクチン組成物を調製する工程;
からなる、方法。 - 請求項19から21のいずれかの方法によって得られ得る、ワクチン組成物。
- 請求項1から18のいずれかの方法によって同定される、抗原。
- 配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される核酸配列の全部または一部によってコードされる、ポリペプチド。
- 配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される核酸配列の全部または一部から発現される、ポリペプチド抗原。
- 配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される核酸配列と少なくとも90%の相同性を有する核酸配列から発現される、ポリペプチド抗原。
- 配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される、単離された核酸分子。
- 配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される1以上の核酸配列を含む、ベクター。
- 配列番号2、6〜8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、および100からなる群より選択される、ポリペプチド。
- 配列番号1、5、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、および99からなる群より選択される核酸配列の全部または一部から発現されるポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
- 配列番号3、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、および198からなる群より選択される核酸配列の全部または一部から発現されるポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
- 前記ポリペプチドが、請求項30および/または31に列挙された1以上の配列と少なくとも90%の相同性を有する核酸配列の全部または一部から発現される、請求項30または31に記載の組成物。
- 配列番号2、6〜8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、および100からなる群より選択されるポリペプチドの全部または一部、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
- 配列番号4、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142〜144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、197、および199からなる群より選択されるポリペプチドの全部または一部、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、ワクチン組成物。
- 配列番号3、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、および198からなる群より選択される核酸配列の全部または一部から発現されるポリペプチドの、ワクチン抗原としての使用。
- 髄膜炎菌感染に対するワクチン接種のための医薬品の製造における、配列番号3、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、および198からなる群より選択される核酸配列の全部または一部から発現されるポリペプチドの使用。
- 髄膜炎菌感染に対するワクチン接種のための医薬品の製造における、配列番号4、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142〜144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196〜197、および199からなる群より選択されるポリペプチド配列の全部または一部を含む抗原の使用。
- 病原性細菌による感染に対するワクチン接種のための組成物の調製方法であって、
a.共生Neisseriaから第1の抗原を得る工程;
b.(i)該第1の抗原のアミノ酸配列を、病原性細菌からの第2の抗原のアミノ酸配列と比較する工程、または(ii)該第1の抗原をコードする核酸の配列を、該第2の抗原をコードする核酸の配列と比較する工程;および、該第1の抗原が該第2の抗原と相同である場合、または該第1の抗原の核酸配列が該第2の抗原の核酸配列と相同である場合、
c.細菌感染に対するワクチン接種のための、該第1の抗原を含む組成物を調製する工程;
を含む、方法。 - 前記第2の抗原が、病原性細菌からの抗原のライブラリーに由来する、または該第2の抗原をコードする核酸配列が、病原性細菌からの抗原をコードする核酸配列のライブラリーに由来する、請求項38に記載の方法。
- 前記共生核酸配列が、病原性Neisseriaのゲノム配列と比較される、請求項38または39に記載の方法。
- ナイセリアの外膜小胞(OMV)をさらに含む、請求項30から34のいずれかの項に記載のワクチン組成物。
- 請求項23に記載の抗原に結合する、抗体。
- 請求項24から26のいずれかの項に記載のポリペプチド抗原に結合する、抗体。
- 請求項42または43に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0107219.8A GB0107219D0 (en) | 2001-03-22 | 2001-03-22 | Immunogenic commensal neisseria sequences |
PCT/GB2002/001399 WO2002077648A2 (en) | 2001-03-22 | 2002-03-22 | Pathogenic and commensal vaccine antigens |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004534524A true JP2004534524A (ja) | 2004-11-18 |
Family
ID=9911344
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002575648A Pending JP2004534524A (ja) | 2001-03-22 | 2002-03-22 | 病原性および共生ワクチン抗原 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040265328A1 (ja) |
EP (1) | EP1401865A2 (ja) |
JP (1) | JP2004534524A (ja) |
AU (1) | AU2002241156B2 (ja) |
CA (1) | CA2441551A1 (ja) |
GB (1) | GB0107219D0 (ja) |
WO (1) | WO2002077648A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3112379A1 (en) * | 2008-03-21 | 2017-01-04 | Universiteit Hasselt | Biomarkers for rheumatoid arthritis |
WO2012059592A1 (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Compounds for delivering a therapeutic or imaging agent to the brain |
JP2015524418A (ja) | 2012-07-27 | 2015-08-24 | アンスティテュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 血管内皮細胞への髄膜炎菌の線毛媒介接着の受容体としてのcd147 |
US11668021B2 (en) | 2017-05-09 | 2023-06-06 | Yale University | Basehit, a high-throughput assay to identify proteins involved in host-microbe interaction |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5834591A (en) * | 1991-01-31 | 1998-11-10 | Washington University | Polypeptides and antibodies useful for the diagnosis and treatment of pathogenic neisseria and other microorganisms having type 4 pilin |
FR2767060B1 (fr) * | 1997-08-07 | 2000-02-11 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Vaccin meningocoque comportant la valence de souche bz83 |
EP1003874B1 (en) * | 1997-08-15 | 2006-11-02 | Rijksuniversiteit Utrecht | Neisseria lactoferrin binding protein |
US6248329B1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-06-19 | Ramaswamy Chandrashekar | Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof |
WO2000022430A2 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Chiron Corporation | Neisseria genomic sequences and methods of their use |
PT1154791E (pt) * | 1999-02-22 | 2008-05-30 | Health Prot Agency | Composições e métodos de vacinação contra neisseria |
ATE430207T1 (de) * | 1999-04-30 | 2009-05-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Genomische sequenzen von neisseria und verfahren zu ihrer verwendung |
-
2001
- 2001-03-22 GB GBGB0107219.8A patent/GB0107219D0/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-03-22 CA CA002441551A patent/CA2441551A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-22 US US10/472,260 patent/US20040265328A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-22 JP JP2002575648A patent/JP2004534524A/ja active Pending
- 2002-03-22 AU AU2002241156A patent/AU2002241156B2/en not_active Ceased
- 2002-03-22 EP EP02706996A patent/EP1401865A2/en not_active Withdrawn
- 2002-03-22 WO PCT/GB2002/001399 patent/WO2002077648A2/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20040265328A1 (en) | 2004-12-30 |
WO2002077648A2 (en) | 2002-10-03 |
WO2002077648A3 (en) | 2003-12-31 |
EP1401865A2 (en) | 2004-03-31 |
AU2002241156B2 (en) | 2006-09-14 |
GB0107219D0 (en) | 2001-05-16 |
CA2441551A1 (en) | 2002-10-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100361562B1 (ko) | 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질 | |
West et al. | Recombinant Neisseria meningitidis transferrin binding protein A protects against experimental meningococcal infection | |
US7786286B2 (en) | Proteinase K resistant surface protein of Neisseria meningitidis | |
Hsu et al. | Immunoproteomic identification of the hypothetical protein NMB1468 as a novel lipoprotein ubiquitous in Neisseria meningitidis with vaccine potential | |
JP2001517091A (ja) | Helicobacter pyloriについての抗原性組成物および検出方法 | |
JP2004534524A (ja) | 病原性および共生ワクチン抗原 | |
AU2002241156A1 (en) | Pathogenic and commensal vaccine antigens | |
CN111948387B (zh) | 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1485在制备结核疫苗中的应用 | |
RU2335505C2 (ru) | Белок nmb0928 и его применение в фармацевтических композициях | |
EP1572729A2 (en) | Mutant protein and refolding method | |
KR20080106985A (ko) | Nmb0938 단백질을 포함하는 약학적 조성물 | |
RU2336900C2 (ru) | Белок nmb1125 и его применение в фармацевтических композициях | |
JP2008525008A (ja) | 髄膜炎菌に対するワクチン | |
EP0815234B1 (en) | Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis | |
WO2007042326A2 (en) | Neisseria meningitidis antigens | |
KR20080108576A (ko) | Nmb0606 단백질을 포함하는 약학적 조성물 | |
Setchfield | Identification of Neisseria lactamica Outer Membrane Proteins Protective against Meningococcal Disease | |
JP2009520491A (ja) | 髄膜炎菌に対するワクチン | |
MXPA06006266A (en) | Protein nmb1125 and use thereof in pharmaceutical formulations | |
MXPA06006267A (en) | Protein nmb0928 and use thereof in pharmaceutical formulations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050304 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071030 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080325 |