JP2004534075A

JP2004534075A - Mucosal repair with TFF dimer peptide

Info

Publication number: JP2004534075A
Application number: JP2003504989A
Authority: JP
Inventors: ティム，ラルス; セイエルポウルセン，ステーン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-06-13
Publication date: 2004-11-11
Also published as: EP1401481A1; WO2002102403A1

Abstract

粘液層の粘度を高めるための三葉因子ダイマーを含んで成る医薬組成物に関する。The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a trilobular factor dimer for increasing the viscosity of a mucus layer.

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、三葉第1因子（TFF1）及び三葉第3因子（TFF3）ダイマーの使用、及び粘液層におけるムチンの粘度を高めるための、及び胃腸管（口、食道、胃、小及び大腸、結腸）、気道、眼、尿システム（膀胱を包含する）及び子宮頸における損傷された粘液層の修復するための、TFFダイマーを含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類三葉因子（TFF）は、胃腸管に広く分布される３種のペプチド（TFF1, TFF2, 及びTFF3）の郡を構成する。それらのペプチドは、１つの（TFF1及びTFF3）又は２つの（TFF2）三葉ドメインを含むことによって特徴づけられる。三葉ドメインは、６個のシステインが１−５、２−４及び３−６配置においてジスルフィド結合されている、38又は39個のアミノ酸残基の配列として定義される。三葉ペプチドは、胃腸管において、組織特異的態様で発現される。ヒトにおいては、TFF1及びTFF2は、胃及び十二指腸における粘液生成細胞において発現され、そしてTFF3は、小及び大腸における杯状細胞において主に発現される。胃潰瘍又は炎症性腸疾患においては、三葉ペプチドの発現が高くアップレギュレートされる。これは、三葉ペプチドが胃腸管における損傷のための修復機能を有し、従って、天然において存在する治癒因子として作用することを示唆する。
【０００３】
正常な粘膜機能のためのTFFの重要性はまた、それぞれTFF1及びTFF3をコードする遺伝子が遺伝子標的化技法により欠失される２種の遺伝子ノックアウト研究により調査された。TFF3ノックアウトマウスは、粘膜治癒を損なっており、そして硫酸デキストランの経口投与の後、広範囲な大腸炎により死亡し、この状況は、組み換えTFF3の管腔投与により回避される。いくつかの研究が胃潰瘍及び大腸炎モデルにおける三葉ペプチドの保護又は治癒効果を示しているが、その詳細な作用機構は多くは知られていない。理論の１つは、ムチンと共に三葉ペプチドが機会的応力及び胃腸プロテアーゼに対して耐性の安定したゲル複合体を形成することである。そのようなゲル形成についての直接的な証拠はこれまで与えられたことはないが、いくつかの研究が、三葉ペプチドとムチンとの相互作用/結合を示している。
【０００４】
ラット及びヒト一本鎖ドメインTFF3（ITF）のクローニング、及び胃腸損傷の処理へのこのペプチドの使用は、WO92/14837号に記載される。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、ムチン溶液のレオロジー性質を改良するためへのヒトTFF1ダイマー及びTFF3ダイマーペプチドの使用に関する。TFFダイマーペプチドは、生理学的及び病理生理学状態に相互関係する、異なったムチン溶液の粘度及び弾性を高めることが、本発明者により見出された。
本発明は、TFFダイマーペプチドが、ムチン溶液の粘度及び弾性に対するTFFダイマーペプチドの直接的な効果により示されるそれらの生物学的活性を発揮する機構を開示する。TFFダイマーペプチドは、ムチン溶液の粘度を有意に高める。正味効果は、数倍の粘度の上昇であり、そして液体ムチン溶液がより粘性のゲル様物質に転換される事実により可視化され得る。
【０００６】
TFFダイマーペプチドは、存在する粘液層の異常性が存在する場合、多くの異なった徴候の処理に使用され得る粘液層の粘度及び弾性を高めるために有用であることを、本発明者が見出した。既知の治療以上の利点は、TFFダイマーペプチドによる処理が主要副作用を伴わないで外傷の側での特定の処理を提供することである。
【０００７】
局部及び管腔適用に関しては、TFFダイマーペプチドは、次の多くの異なった徴候において有用である。粘液層におけるムチンの粘度及び弾性性質を高めることができる：
１）口内粘膜の処理に関しては、TFFダイマーペプチドは、刺激療法、抗コリン作用剤による処理により引き起こされる唾液の低められた分泌を有する患者、又はシューグレン症候群を有する患者に、単独で又は粘液様調製物と一緒に与えられ得る。
２）通常の風邪又はアレルギー性鼻炎における鼻漏における鼻分泌液の粘度を高めることに関しては、刺激物、ガス、ダスト又はフェームの偶然の吸入に続く呼吸気管の粘膜を保護できる。
３）食道逆流、出血性裂孔又はBarrets食道における胃からの酸分泌に対する食道の遠位部分の保護に関して。
【０００８】
４）外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患に続く急性ストレス誘発性胃潰瘍、又はアスピリン、他のNSAIDS、ステロイド又はアルコールによる処理により引き起こされる胃炎に対する胃の保護に関して。
５）腸分泌の粘度を高くすることによる急性又は延長された下痢の処理に関して。
６）クローン病、刺激性腸症候群、又は潰瘍性大腸炎における小腸又は結腸粘液の保護に関して。
７）他の理由に関しては、角結膜炎、乾燥/シューグレン症候群又はドライアイを有する患者における涙液の粘度を高めるために眼薬に関して。
８）変形性関節炎における及び関節置換に続いての滑液の粘度を高めるために特に膝関節への局部適用に関して。
【０００９】
TFFダイマーペプチドはまた、非経口適用のためにも使用され得る：
非経口TFFダイマーは、胃腸管における幹細胞に関する細胞により取られる。それは、ストレス−誘発された損傷に対する胃の保護、及び照射又は化学療法に続く又は潰瘍性大腸炎、刺激性腸症候群又はクローン病の処理における損傷に対する胃及び腸の保護のために使用され得る。注入されたTFFダイマーペプチドは、尿において完全に排泄され、そして尿細胞層を被覆するムコ多糖類の層に結合することによって尿膀胱の防御機構を高めることができ、そしてそれにより、慢性膀胱感染、カテーテルを有する患者、間質性膀胱炎における細菌の付着を防げるか、又は乳頭腫又は膀胱癌における尿増殖因子の結合を妨げることができる。
【００１０】
第１の観点においては、TFFダイマーペプチド又は医薬的に許容できるその塩を含んで成る、哺乳類における粘液層の粘度を高めるための医薬組織組成物に関する。
【００１１】
“TFFダイマーペプチド類”又は“TFFダイマーペプチド”とは、ダイマー形でのヒトTFF1又はヒトTFF3に実質的に相同であるタンパク質を意味する。TFF1ダイマーは、個々のTFF1モノマーの位置58でのシステインアミノ酸残基間でジスルフィド結合により一緒に結合される２種のTFF1モノマーから成る。TFF3ダイマーは、個々のTFF3モノマーの位置57でのシステインアミノ酸残基間でのジスルフィド結合により一緒に結合される２種のTFF3モノマーから成る。用語TFFダイマーペプチドはまた、天然に存在するTFFダイマーペプチドの類似体を包含する。類似体は、アミノ酸配列の差異により、又は配列に影響を及ぼさない修飾により、又は両者により、天然に存在するTFFダイマーとは異なることができる。本発明の類似体は一般的に、天然に存在するTFFダイマー配列と少なくとも70％、より好ましくは80％、より好ましくは90％及び最も好ましくは95％又はさらに99％の配列同一性を示すであろう。
【００１２】
修飾は、ポリペプチドのインビボ、又はインビトロ化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化を包含する。グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドの合成又はプロセッシングの間、又はされなるプロセッシング段階において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えばそのようなプロセッシング、例えば哺乳類グリコシル化酵素を通常供給する細胞に起因するグリコシル化に影響を及ぼす酵素に前記ポリペプチドを暴露することによって行われるそれらの修飾がまた包含される。リン酸化されたアミノ配列のバージョンがまた、包含される。
【００１３】
実質的に十分な長さのポリペプチドの他に、用語TFFダイマーペプチドは、本明細書において使用される場合、ポリペプチドの生物学的活性フラグメントを包含する。本明細書において使用される場合、ポリペプチドに適用されるような用語“フラグメント”とは、通常少なくとも10個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも20個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも30個の連続したアミノ酸、通常少なくとも40個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも50個の連続したアミノ酸、及び最も好ましくは少なくとも60〜80個、又はそれ以上連続したアミノ酸の長さであろう。
【００１４】
TFFダイマーペプチドの生物学的活性を示す候補体フラグメントの能力は、当業者に知られている方法により評価され得る。ポリペプチドの生物学的活性のために必要とされない追加のアミノ酸、又は他のmRNAフラグメント又は他のタンパク質プロセッシング現象に起因する追加のアミノ酸を包含する、タンパク質プロセッシングの間、通常除去されるアミノ酸を含む生成物学的活性TFFダイマーペプチドがまた、用語“フラグメント”に包含される。
【００１５】
フラグメント又は類似体を包含するTFFダイマーペプチドは、それが天然に存在するTFFダイマーの生物学的活性、例えば哺乳類における粘液層におけるムチンの粘度又は弾性を変更する能力を示す場合、生物学的に活性である。
用語“グリコシル化”とは、本明細書において使用される場合、炭水化物分子がペプチドに共有結合されている、ペプチドの後−翻訳修飾を意味する。グリコシル化は、真核宿主細胞、例えば酵母細胞において生じることができ、又はそれは、細胞におけるペプチドの生成の後、化学的連鎖により行われ得、例えばペプチドは、細菌において生成され、そしてその後、インビトロでグリコシル化され得る。
【００１６】
第２の観点においては、本発明は、哺乳類における粘液層の粘度を高めるための薬剤の調製のためへのTFFダイマーペプチドの使用に関する。
第３の観点においては、本発明は、
ａ）医薬的許容できるキャリヤー又は希釈剤、
ｂ）治療的有効量のTFFダイマーペプチド、及び任意には、
ｃ）ムチン糖タンパク質調製物を含んで成る組成物を前記対象に投与することを含んで成る、対象における粘液層の粘度のインビボ上昇のための方法関する。
もう１つの観点においては、本発明は、哺乳類における粘液層の高められた粘度を有する状態の処理のためへのTFFダイマーペプチドの使用に関する。
【００１７】
用語“処理”とは、本明細書において使用される場合、いずれかの徴候又は疾病状態の進行を妨げるために、又はすでに進行したそのような徴候又は疾病状態を治癒するか又は容易にするために、有効量の本発明の治療的活性化合物の投与を意味する。従って、用語“処理”とは、予防及び保護処理を包含することを意味する。徴候又は疾病状態は、胃潰瘍又は喘息、遺伝性生物学的障害、又は外部刺激、例えば毒性又は酸性化学物質の吸入により誘発される状態を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
本発明の１つの態様においては、哺乳類は、ヒトである。
本発明のもう１つの態様は、局部適用のための医薬組成物に関する。
【００１８】
さらなる態様においては、本発明は、管腔適用のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、非経口投与のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、経口投与のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、ムチン糖タンパク質調製物をさらに含んで成る医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、口内粘液の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、唾液の低められた分泌を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。１つの態様においては、唾液の低められた分泌は、刺激的治療、抗コリン作用剤による処理又はシェーグレン症候群により引き起こされる。
【００１９】
さらなる態様においては、本発明は、照射療法を受ける患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、抗コリン作用剤による処理される患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、シューグレン症候群を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、呼吸路の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、通常の風邪又はアレルギー性鼻炎における鼻の分泌物の粘度を高めるため医薬組成物に関する。
【００２０】
さらなる態様においては、本発明は、通常の風邪を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、アレルギー性鼻炎を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、気道の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、刺激物の偶然の吸入に続いての気道の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、ガス、ダスト又はフェームの偶然の吸入に続いての気道の処理のための医薬組成物に関する。
【００２１】
さらなる態様においては、本発明は、食道の処理のための医薬組成物に関する。１つの態様においては、本発明は、食道の遠位部分の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、胃からの酸分泌に対する保護のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、食道逆流における胃からの酸分泌に対する保護のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、Burrets食道における胃からの酸分泌に対する保護のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、胃の処理のための医薬組成物に関する。
【００２２】
さらなる態様においては、本発明は、ストレス誘発性胃潰瘍の処理のための医薬組成物に関する。１つの態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、外傷に続くものである。もう１つの態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、ショックに続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、大手術に続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、腎疾患に続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、肝疾患に続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、アスピリン、他の非ステロイド性炎症薬物（NSAIDS）、ステロイド又はアルコールによる処理のものである。
【００２３】
さらなる態様においては、本発明は、下痢の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、小腸粘膜の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、結腸粘膜の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、クローン病の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、刺激性腸症候群の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、胃潰瘍大腸炎の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、眼の処理のための医薬組成物に関する。
【００２４】
さらなる態様においては、本発明は、涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、角結膜炎を有する患者における涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、シューグレンを有する患者における涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、ドライアイを有する患者における涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
用語“ドライアイ”とは、本明細書において使用される場合、眼が乾燥していることを感じるいずれかの状態を意味する。
【００２５】
さらなる態様においては、本発明は眼薬における医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は膝関節の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は滑液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は変形性関節炎における滑液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は関節置換に続く滑液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は膀胱の処理のための医薬組成物に関する。
【００２６】
さらなる態様においては、本発明はカテーテルを有する患者のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は感染の処理ための医薬組成物に関する。１つの態様に関しては、前記感染は、膀胱の慢性感染である。
さらなる態様においては、本発明は間質性膀胱炎の処理ための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は乳頭腫の処理ための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は癌の処理ための医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様においては、TFFダイマーペプチドは組換えヒトTFF1である。
本発明のさらなる態様においては、TFFダイマーペプチドは組換えヒトTFF3である。
本発明のさらなる態様においては、TFFダイマーペプチドはグリコシル化される。
【００２７】
TFFダイマーペプチドは典型的には、組み換えDNA技法により生成される。このためには、TFFダイマーペプチドをコードするDNA配列は、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標準技法（Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989）に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションにより、ペプチドのすべて又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって、単離され得る。この目的のためには、ペプチドをコードするDNA配列は好ましくは、ヒト起源のもの、すなわちヒトゲノムDNA又はcDNAライブラリーから誘導される。
【００２８】
TFFダイマーペプチドをコードするDNA配列はまた、確立された標準方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869により記載されるホスホアミジット方法、又はMatthesなど., EMBO Jourral 3 (1984), 801-806により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット方法に従って、オリゴヌクレオチドは、自動DNA合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターにクローン化される。
【００２９】
DNA配列はまた、例えばアメリカ特許第4,683,202号、Saikiなど., Science 239 (1988), 487-491, 又はSambrookなど., 前記に記載される特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応により調製され得る。
【００３０】
TFFダイマーペプチドをコードするDNA配列は、便利には組換えDNA方法にゆだねられ得る。いずれかのベクターであり得る組換えベクター中に通常には挿入され、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自立的に複製するベクター、すなわち染色体外実在物（この複製は、染色体複製とは無関係である）として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色と共に複製されるベクターであり得る。
【００３１】
ベクターは好ましくは、TFFダイマーをコードするDNA配列がDNAの転写のために必要とされる追加のセグメントに操作可能的に結合されている発現ベクターである。一般的に発現ベクターは、プラスミド又はウィルスDNAから誘導されるか、又は両者の要素を含むことができる。用語“操作可能に結合される”とは、セグメントが、それらがそれらの意図された目的に関して機能し、例えば転写がプロモーターにより開始し、そしてペプチドをコードするDNA配列を通して進行するよう配置されることを示す。
プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性の示すいずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同の又は異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。
【００３２】
哺乳類細胞におけるTFF2ペプチドをコードするDNAの転写を指図するための適切なプロモーターの例は、SV40プロモーター（Subramani., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864）, MT-1 (メタロチオネイン遺伝子)プロモーター（Palmiterなど., Science 222 (1983), 809-814）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。
【００３３】
昆虫細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター（アメリカ特許第4,745,051号；Vasuvedanなど., FEBS Lett. 311 (1992) 7-11）、P10プロモーター（J. M. Vlakなど., J. Gen. Virology 69, 1988, pp.765-776）、オートグラファ・カリホミカ（Autographa califomica）多角体病ウィルス塩基性タンパク質プロモーター（EP397485号）、バキュロウィルス即時型初期遺伝子１プロモーター（アメリカ特許第5,155,037号、第5,162,222号）、又はバキュロウィルス39K遅延された初期遺伝子プロモーター（アメリカ特許第5,155,037号、第5,162,222号）である。
【００３４】
酵母宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、酵母解糖遺伝子（Hitzemanなど., J.Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Young など., in Genetic Engineering ofMicroorqanisms for Chemicals(Hollaender など, eds.), Plenum Press, New York, 1982）、TPI1（アメリカ特許第4,599,311号）又はADH2−4c（Russell etal., Nature 304 (1983), 652-654）プロモーターを包含する。
【００３５】
糸状菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターは、例えばADH3プロモーター（Mcknightなど., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099）又はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A. オリザエ（A. oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. ニガー（A. niger）中性α−アミラーゼ、A. ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A. ニガー又はA. アワモリ（A. awamori）グルコアミラーゼ（gluA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A. オリザエアルカリプロテアーゼ、A. オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はA. ニジュランス（A. nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子から誘導されたそれらである。TAKA−アミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。適切なプロモーターは、例えばEP238023号及びEP383779号に言及される。
【００３６】
TFFダイマーペプチドをコードするDNA配列はまた、必要なら、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiterなど., Science 222, 1983, pp. 809-814）, TP11 (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1. 1982, pp. 419-434), 又はADH3（Mcknight）など., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) ターミネーターに操作可能的に結合され得る。ベクターはさらに、要素、例えばポリアデニル化シグナル（例えば、SV40又はアデノウィルス5EIb領域からの）、転写エンハンサー配列（例えば、SV40エンハンサー）及び翻訳されたエンハンサー配列（例えば、アデノウィルスVA RNAをコードする配列）を含んで成ることができる。
【００３７】
組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成る。そのような配列の例（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）は、複数のSV40起点である。
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1-3及び複製の起点である。
【００３８】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば１つの遺伝子（この生成物は、宿主細胞における欠失を補足する）、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子、又はシゾサッカロミセスポンベ（Schisosaccharomyces pombe）TPI遺伝子（P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130により記載される）、又は薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んで成ることができる。糸状菌に関しては、選択マーカーは、amdS, pyrG, argB, niaD, 又はsCを包含する。
【００３９】
宿主細胞の分泌路中に本発明のTFFダイマーペプチドを指図するためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列として知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠で、TFFダイマーペプチドをコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするDNA配列の5’側に通常位置する。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質に関連する配列であるか、又はもう１つの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からであり得る。
【００４０】
酵母細胞からの分泌に関しては、分泌シグナル配列は、細胞の分泌路中への発現されたTFFダイマーペプチドの効果的な指図を確保するいずれかのシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド、又はその機能的部位であり得るか、又は合成ペプチドであり得る。適切なシグナルペプチドは、α−因子シグナルペプチド（アメリカ特許第4,870,008号を参照のこと）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O. Hagenbuchleなど., Nature 289, 1981, pp. 643-646）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A. Valisなど., Cell48, 1987, pp. 887-897）、酵母BAR1シグナルペプチド（WO87/02670号）、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチド（M. Egel-Mitaniなど., Yeast 6, 1990, pp. 127-137）であることが見出されている。
【００４１】
酵母における効果的な分泌に関しては、リーダーペプチドをコードする配列はまた、シグナル配列の下流に及びTFFダイマーペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入され得る。リーダーペプチドの機能は、ゴルジ体への、及びさらに、培養培地中への分泌のための分泌小胞への小胞体からの発現されたペプチドの方向付け（すなわち、酵母細胞の細胞周辺腔中への細胞を通しての又は少なくとも細胞膜を通してのTFFダイマーペプチドの輸送）を可能にすることである。リーダーペプチドは、酵母α−因子リーダーであり得る（その使用は、例えばアメリカ特許第4,546,082号、アメリカ特許第4,870,008号、EP16201号、EP123294号、EP123544号及びEP163529号に記載される）。他方では、リーダーペプチドは、天然において見出されないリーダーペプチドである合成リーダーペプチドであり得る。例えば、合成リーダーペプチドは、WO89/02463号又はWO92/11378号に記載されている。
【００４２】
糸状菌への使用に関しては、シグナルペプチドは便利には、アスペルギラスsp. アミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ又はプロテアーゼをコードする遺伝子、又はヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼをコードする遺伝子から誘導され得る。シグナルペプチドは好ましくは、A．オリザエTAKAアミラーゼ、A．ニガー中性α−アミラーゼ、A．ニガー酸安定性アミラーゼ、又はA．ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導される。適切なシグナルペプチドは、例えばEP238023号及びEP215594号に開示される。
昆虫細胞への使用に関しては、シグナルペプチドは便利には、昆虫遺伝子（WO90/05783号）、例えば鱗翅目のマンジュカ・セキスタ（Manduca sexta）脂肪動員物質）ホルモン前駆体ペプチド（アメリカ特許第5,023,328号）から誘導され得る。
【００４３】
それぞれ、TFFダイマーペプチド、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をコードするDNA配列を連結し、そして複製のために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, 1989）。
TFFダイマーペプチドをコードするDNA配列が導入される宿主細胞は、後翻訳の修飾されたTFFダイマーペプチドを生成することができるいずれかの細胞であり得、そして酵母、菌類及び高等真核細胞を包含する。
【００４４】
適切な哺乳類細胞系の例は、COS（ATCC CRL1650）, BHK (ATCC CRL1632, ATCC CCL10), CHL (ATCC C39) 又はCHO (ATCC CCL61) 細胞系である。哺乳類細胞をトランスフェクトし、そして細胞に導入されるDNA配列を発現する方法は、例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1(1982), 327-341; Loyterなど., Proc.Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426;Wiglerなど., Cell 14(1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7(1981), 603, Graham and van der Eb, Virology52 (1973), 456; 及びNeumannet al., EMBO J. 1 (1982), 841-845に記載される。
【００４５】
適切な酵母細胞の例は、サッカロミセスsp.又はシゾサッカロミセスspp., 特にサッカロミセス・セレビシアエ又はサッカロミセス・クルイベリの株の細胞を包含する。異種DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれらから異種ポリペプチドを生成するための方法は、例えばアメリカ特許第4,599,311、第4,931,373号、第4,670,008号、第5,037,743号及び第4,845,075号（それらのすべては、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４６】
形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、薬物耐性、又は特定の栄養物、例えばロイシン不在下で増殖する能力により決定される表情型により選択される。酵母への使用のための好ましいベクターは、アメリカ特許第4,931,373号に開示されるPOT1ベクターである。TFF2ペプチドをコードするDNA配列に続いて、シグナル配列及び任意には、リーダー配列が存在する。適切な酵母細胞のさらなる例は、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、例えばK. ラクチス（K. lactis）、ハンセヌラ（Hunsenula）、例えばH. ポリモルファ（H．polymorpha）、又はピチア（Pichia）、例えばP. パストリス（P．pastoris）の株である（Gleesonなど., J. Gen. Microbiol. B2, 1986, pp. 3459-3465; アメリカ特許第4,882,279号）。
【００４７】
他の菌類細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギラスspp., ニューロスポラspp., フサリウムspp. 又はトリコダーマspp. の株、特にA．オリザエ、A．ニジュランス又はA．ニガーの株である。タンパク質の発現のためへのアスペルギラスspp.の使用は、例えばEP272277号、EP238023号、EP184438号に記載される。F．オキシスポラムの形質転換は、Malardierなど., 1989, Gene 78: 147-156により記載される。トリコダーマsppの形質転換は、例えばEP244234号に記載のようにして行われ得る。
【００４８】
糸状菌が宿主細胞として使用される場合、それは、便利には、組換え宿主細胞を得るために、宿主染色体にDNA構成体を組み込むことによって、本発明のDNA構成体により形質転換され得る。この組み込みは一般的に、DNA配列が細胞に安定して維持される場合、有益であると思われる。宿主染色体中へのDNA構造体の組み込みは、従来の方法、例えば相同又は異種組換えにより行われ得る。
【００４９】
昆虫細胞の形質転換及びそこにおける異種ポリペプチドの生成は、アメリカ特許第4,745,051号；第4,879,236号；第5,155,037号；第5,162,222号；EP397,485号（それらはすべて引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして行われ得る。宿主として使用される昆虫細胞系は適切には、レピドプテラ（Lepidoptera）細胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞又はトリコプルシエ・ニ（Trichoplusia ni）細胞である（アメリカ特許第5,077,214号）。培養条件は、適切には、WO89/01029号又はWO89/01028号、又は前述の引例のいずれかに記載される。
【００５０】
次に、上記形質転換されるか又はトランスフェクトされた宿主細胞は、TFFダイマーペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地において培養され、この後、得られるペプチドのすべて又は一部が培養物から回収され得る。細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地、例えば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る。適切な培地は市販されており、又は公開されたレセピー（例えば、ATCCのカタログ）に従って調製され得る。次に、細胞により生成されるTFFダイマーペプチドが、従来の方法、例えば遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清液又は濾液のタンパク質成分の沈殿、問題のポリペプチドの型に依存して、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル化クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものによる精製により、培養培地から回収され得る。
【００５１】
本発明の医薬組成物においては、TFFダイマーペプチドは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 1985に記載される医薬組成物のいずれかの確立された配合方法により配合され得る。前記組成物は、全身性注射又は注入のために適切である形で存在することができ、そして無菌水、又は等張塩溶液又はグルコース溶液と共に配合され得る。組成物は、当業界においてよく知られている従来の殺菌技法により殺菌され得る。得られる水溶液は、使用のためにパッケージングされるか、又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され、その凍結乾燥された調製物は、投与の前、無菌水溶液と共に組合される。組成物は、生理学的条件に近づく必要がある場合、医薬的に許容できる補助物質、例えば緩衝剤、張度調節剤及び同様のもの、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、等を含むことができる。
【００５２】
本発明の医薬組成物はまた、鼻、経皮又は直腸投与のためにも適合され得る。組成物に使用される医薬的に許容できるキャリヤー又は希釈剤は、いずれかの従来の固体キャリヤーであり得る。固体キャリヤーの例は、ラクトース、白土、スクロオース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。同様に、キャリヤー又は希釈剤は、当業界において知られている持効性物質、例えば単独での又はワックスと共に混合された、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートを包含する。固体キャリヤーの量は、広く変化するが、しかし通常、約25mg〜約1gであろう。
【００５３】
組成物中のTFFダイマーペプチドの濃度は、広く変化し、すなわち約５重量％〜約100重量％である。典型的な濃度は、50〜100重量％の範囲で存在する。組成物の単位用量は、約1mg〜約200mg、典型的には25mg〜約75mg、例えば約50mgのペプチドを含む。
【００５４】
用語“治療的有効量”とは、所望する応答を達成するための用量を滴定することができる有資格者により決定され得る。用量の考慮のための因子は、効能、生物利用性、所望する薬物動力学/薬力学プロフィール、処理の状態（例えば、外傷、潰瘍性大腸炎、胃潰瘍）、患者関連因子（例えば、体重、健康、年齢、等）、同時投与薬剤の存在、投与の時間、又は医学的実施者に知られている他の因子を包含するであろう。患者に投与されるTFF2ペプチドの用量は、処理される状態の型及び重症度と共に変化するが、しかし一般的には、0.1〜1.0mg/kg体重の範囲で存在する。
【００５５】
用語“対象”とは、本明細書において使用される場合、動物、特に哺乳類、例えばヒトを意味し、そして適切な場合、用語“患者”と交換可能的に使用され得る。
本発明は次の例によりさらに示されるが、しかしながら、それらは本発明の範囲を制限するものではない。前述の記載及び次の例に開示される特徴は、別々に及びそのいずれかの組み合わせで、その種々の形で本発明を現実化するための材料であり得る。
【実施例】
【００５６】
例１． TFF ペプチドのレオロジー特性：
ムチン：ブタ胃からのタイプII粗ムチン（Sigma, St. Louis, Mo, USA）。組換えヒトTFF3のダイマー形を、これまで記載の通りとして調製した（Thim, L. など. (1995) Biochemistry 34, 4757-4764）。組換えヒトTFF1のダイマー形を、これまで記載の通りにして調製した（Kannan, R. など. (2001) Protein Expression and Purification 21, 92-98）。
【００５７】
ムチン溶液：ムチンIの10％（w/v）溶液を調製し、そして異なったTFFダイマーペプチドを水に溶解し、そしてムチン溶液に添加した。サンプルを混合した後（Vortexミキサー）、サンプルを５分間、放置し、そして粘膜を、TFFダイマーペプチドを有さない水を添加されたムチンの対照溶液に比較して、可視的に評価した。血流計測定のための詳細な実験条件が図に与えられる。
【００５８】
レオロジー測定：レオロジーを、回転Reologica血流計（Reologica Instruments AB, Lund, Sweden）の使用により測定した。その装置は、少なくとも1.2mlのサンプル体積を必要とするステンレス鋼C40 ４円錐プレート（４°角度を有する40mmの直径）を備えている。装置を、いくつかの異なった型の測定を可能にする標準ソフトウェア（Version3.6）を用いて作動せしめた。この研究においては、本発明者は、次の測定プログラムを使用した：定速度（剪断速度の関数としての粘度及び応力）、振動（異なった周波数での複素粘度、弾性率及び粘稠度）及び振動応答運動曲線（測定結果が線状であり、すなわち適用される応力に無関係である応力範囲を同定するための）。
【００５９】
TFFダイマーペプチドがムチン溶液に添加される場合に観察され得る性質の変化の目に見える評価を行った（表１）。いくつかの実験においては、効果は驚きのものであった。ムチン溶液へのTFFダイマーペプチドの添加は、粘度の有意な目に見える上昇をもたらした（表１）。
ムチン溶液及びムチン/ TFFダイマーペプチドゲル様物質：TFFダイマーペプチドが添加されているムチン溶液を比較した。図２から見出され得るように、ムチン溶液は単独で非ニュートン溶液として挙動する。それらの液体は、Ostwald de waeleモデル（指数法則）（Barnes, H. A. (1989) An introduction to rheology. Elsevier and Ferguson,J. and Kemblowski, Z. (1991) Applied fluid rheology. Elsevier）により記載され得る：
【００６０】
δ＝k(γ)ⁿ
ここでδ＝剪断応力、γ＝剪断速度n及びkは、溶液に対して一定である（n＝１である場合、溶液はニュートン流体である）。この場合、次の値を図２から計算することができる：n＝0.75及びｋ＝0.35
n＜１の場合、溶液は、不斉粒子を有する分散液又はエマルジョンの特徴である、剪断−タイニング（tinning）と呼ばれる。しかしながら、n値が１に近い場合、その溶液はニュートン溶液とはほど遠くない。図２からまた見出され得るように、粘度は、低い剪断速度での0.34Pa〜高い剪断速度での0.12Paである。
【００６１】
ムチン/ TFFダイマーペプチドゲル様構造体を特徴づけるために、ゲル様材料が洞様毛細血管的に変化する応力にゆだねられる振動測定の技法を通用し、そして株応答を測定した。この測定が行われる前、本発明者は、いわゆる線状粘弾性領域を定義するための振動応力運動曲線を使用した。この領域内では、ムチン/ TFFダイマーペプチド構造の変化は生じず、そして適用された応力と測定された量との間の関係は線状である。
【００６２】
図３は、ムチン溶液のみ（図４a）及びムチン/ TFF3ダイマーペプチドゲル様材料（図３b）の振動測定に起因する。このタイプの実験は、周波数の関数としての次のいくつかのパラメーターの評価を可能にする：複素粘度η^*、弾性率G’及び粘稠度G’’（詳細な流動学理論については、Bames, H.A. (1989) An introduction to rheology. Elsevier and Ferguson, J. and Kemblowski, Z. (1991) Applied Fluid rhoology. Elsevierを参照のこと）。
【００６３】
ムチン溶液及びムチン/ TFF3ダイマーペプチドゲル様材料の弾性率及び粘稠度の絶対値の比較が表２に与えられる。それらの結果から見出されるように、弾性率及び粘稠度の両者は、ムチン溶液に比較して、ムチン/ TFF3ダイマーペプチドゲル様構造体において劇的に高められる。
図４は、TFF3ダイマーペプチドの添加により得られるムチンI溶液の粘度の変化を示す。TFF3ダイマーペプチドは、前記ムチン溶液の粘度に対して有意な効果を有した。TFF3ダイマーペプチドの添加は、液体溶液により取り囲まれる１−４mmの繊維様構造を有する粘液溶液をもたらした。
【００６４】
【表１】

【００６５】
【表２】

【００６６】
例２．ラットにおける実験大腸炎における管腔 TFF3 の効果：
方法：体重200gの326匹の雌Wistarラットを、この研究に使用した。管腔TFF3の効果を、大腸炎の２匹のラットモデル（マイトマイシンC誘発された大腸炎モデル：Keshavarzian A.など. J. Lab. Clin. Med. 1992; 120: 778-91及びデキストラン誘発された大腸炎モデル：Mottet NK. Gastroenterology 1972; 62: 1269-71）において研究した。TFF3を、麻酔されたラットにおいて、側腹切開により、軟質のポリエチレン管を、結腸管腔中に挿入し、6−0絹縫合糸により固定し、そしてラットの首領域まで皮下的に導くことにより、結腸の近位部分中に直接的に投与した。この手術の後、ラットは６日の回復期間を有した。
【００６７】
マイトマイシンC大腸炎:16匹のラットにおいて、大腸炎を、3.75mg/kgのマイトマイシンCにより誘発した。８匹のラットは、１日当たり２度、0.5mlの水中、5mg/kgのTFF3を結腸管中に与えられた。８匹の対照は、NaCl を受けた。ラットを、マイトマイシン投与の８日後、過剰量のバルビツレートにより殺害した。結腸を、10％ホルマリンの管腔内注入により固定し、そして10分後、切開し、そしてポリエチレンプレート上に懸濁した。さらなる24時間の固定の後、検体を、水によりフラッシュし、そして表面を0.3％ Alcian Green 3BXにより染色した。結腸検体を、Wild Photomacroscopeにより調べ、疾病の程度及び潰瘍の数を、定量化した。組織的分析のために、検体を、近位、中間及び遠位結腸から採取し（盲検的に）、そしてパラフィンに包埋した。５μmの組織切片を、PAS−ヘマトキシリン−アウレンチアにより染色した。大腸炎の重症度を、組織学的大腸炎評点により評点を付けた（図５、Williams KL.など. Gastroenterology 2001; 120: 925-37）。
【００６８】
結果：TFF3による管腔内処理は、全体の大腸炎評点を有意の低めた（3.4対10.8；p＜0.01、図６）。中間セグメント及び遠位結腸が比較される場合、両部位に類似する処理効果が存在した（データは示されていない）。
【００６９】
デキストラン大腸炎：16匹のラットにおいて、大腸炎を、飲料水に投与された５％硫酸デキストランナトリウムにより誘発した。８匹のラットは、ラットが殺害される９日目まで、デキストラン供給の開始の前日から、１日当たり２度、0.5mlの水中、5mg/kgのTFF3を結腸管中に与えられた。８匹の対照は、NaCl を受けた。ラットを、過剰量のバルビツレートにより殺害した。結腸を、10％ホルマリンの管腔内注入により固定し、そして10分後、切開し、そしてポリエチレンプレート上に懸濁した。
【００７０】
さらなる24時間の固定の後、検体を、水によりフラッシュし、そして表面を0.3％ Alcian Green 3BXにより染色した。結腸検体を、Wild Photomacroscopeにより調べ、疾病の程度及び潰瘍の数を、定量化した。組織的分析のために、検体を、近位、中間及び遠位結腸から採取し（盲検的に）、そしてパラフィンに包埋した。５μmの組織切片を、PAS−ヘマトキシリン−アウレンチアにより染色した。大腸炎の重症度を、組織学的大腸炎評点により評点を付けた（Williams KL.など. Gastroenterology 2001; 120: 925-37）。
【００７１】
結果： TFF3による管腔内処理は、全体の大腸炎評点に対して有意な効果を有した（1.1対3.18；p＜0.05、図６）。効果は、TFF3が結腸内腔中に導入された部位に隣接する結腸の中間部分において有力であった（0.4対1.8；p＜0.05、図７）。
結論： TFF3による管腔内処理は、ラットにおけるマイトマイシン誘発性大腸炎及びデキストラン誘発性大腸炎の重症度を低める。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、モノマー形での哺乳類三葉因子（TFF）、すなわちTFF1及びTFF3を示す。この図は、ヒト配列を示す。TFF1及びTFF3のダイマーは、それぞれ、TFF1又はTFF3の２種の異なった分子上の示される遊離スルフヒドリル基によるシステインアミノ酸残基のジスルフィド結合により形成される。
【図２】図２は、ムチン溶液にみの応力対剪断速度を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、0.4mlの水に添加した。20℃での30分後、剪断応力を、ソフトウェアプログラムを用いて、剪断速度の関数として測定した：“一定速度”−指数法則への近似。
【図３】図３は、ムチン溶液（ａ）及びムチン/TFF3ダイマーペプチドゲル様材料（ｂ）の振動測定を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、0.4mlの水（ａ）又は10mgのTFF3ダイマーペプチドを含む0.4mlの水（ｂ）に添加した。20℃での30分後、変化する応力を適用し、そして応力応答を異なった周波数で検出した。複素粘度（η^*）◇―◇、弾性率（G’）□―□及び粘稠度（G’’）○―○を計算し、そして異なった周波数の関数としてプロットした。
【図４】図４は、TFF3ダイマーペプチドの粘度対剪断速度を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、水に溶解された7.05mlのTFF3ダイマーペプチドに添加した。20℃での30分後、剪断応力を、ソフトウェアプログラムを用いて、剪断速度の関数として測定した：“一定速度”、□―□：ムチンIのみ；△―△：ムチンI＋TFF3ダイマー。
【図５】図５では、ラットにおける実験大腸炎に対する管腔TFF3の効果を、組織学的大腸炎評点（Williams KL. など. Gastroenterology 2001; 120: 925-37）により評点を付けた。
【図６】図６は、ラットにおける実験大腸炎に対する管腔TFF3の効果を示す。全体的な大腸炎評点に対する有意な効果が、この図に示されている。
【図７】図７は、ラットにおける実験デキストラン大腸炎に対する管腔TFF3の効果を示す。効果は、TFF3が結腸内腔中に導入されている部位に隣接した結腸の中間部位において有効であった。【Technical field】
[0001]
Field of the Invention:
The present invention relates to the use of the Trilobular Factor 1 (TFF1) and Trilobular Factor 3 (TFF3) dimers, and to increase the viscosity of mucin in the mucus layer, and to the gastrointestinal tract (mouth, esophagus, Pharmaceutical compositions comprising a TFF dimer for repairing damaged mucus layers in the respiratory tract, eyes, urinary system (including the bladder) and cervix.
[Background Art]
[0002]
Mammalian trilobe factor (TFF) constitutes a group of three peptides (TFF1, TFF2, and TFF3) that are widely distributed in the gastrointestinal tract. These peptides are characterized by containing one (TFF1 and TFF3) or two (TFF2) trefoil domains. The trilobe domain is defined as a sequence of 38 or 39 amino acid residues in which six cysteines are disulfide bonded in a 1-5, 2-4 and 3-6 configuration. Trefoil peptides are expressed in the gastrointestinal tract in a tissue-specific manner. In humans, TFF1 and TFF2 are expressed in mucous-producing cells in the stomach and duodenum, and TFF3 is mainly expressed in goblet cells in the small and large intestine. In gastric ulcer or inflammatory bowel disease, the expression of the trilobal peptide is highly up-regulated. This suggests that the trilobal peptide has a repair function for damage in the gastrointestinal tract and thus acts as a naturally occurring healing factor.
[0003]
The importance of TFF for normal mucosal function was also investigated by two gene knockout studies in which the genes encoding TFF1 and TFF3, respectively, were deleted by gene targeting techniques. TFF3 knockout mice have impaired mucosal healing and have died from extensive colitis following oral administration of dextran sulfate, a situation that is avoided by luminal administration of recombinant TFF3. Although some studies have shown the protective or healing effect of trilobal peptides in gastric ulcer and colitis models, their detailed mechanism of action is largely unknown. One theory is that trilobal peptides together with mucins form stable gel complexes that are resistant to opportunistic stress and gastrointestinal proteases. Although no direct evidence for such gel formation has been given before, several studies indicate the interaction / binding of the trilobal peptide with mucin.
[0004]
The cloning of rat and human single-chain domain TFF3 (ITF) and the use of this peptide in treating gastrointestinal damage is described in WO 92/14837.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0005]
The present invention relates to the use of human TFF1 dimer and TFF3 dimer peptides to improve the rheological properties of mucin solutions. It has been found by the present inventors that TFF dimer peptides increase the viscosity and elasticity of different mucin solutions, which correlate with physiological and pathophysiological conditions.
The present invention discloses a mechanism by which TFF dimer peptides exert their biological activity as indicated by the direct effects of TFF dimer peptides on the viscosity and elasticity of mucin solutions. The TFF dimer peptide significantly increases the viscosity of the mucin solution. The net effect is a several fold increase in viscosity and can be visualized by the fact that the liquid mucin solution is converted to a more viscous gel-like material.
[0006]
The present inventors have found that the TFF dimer peptide is useful for increasing the viscosity and elasticity of the mucus layer, which can be used to treat many different indications when there is an abnormality of the mucus layer present. . An advantage over known treatments is that treatment with the TFF dimer peptide provides a specific treatment on the side of the trauma without major side effects.
[0007]
For local and luminal applications, TFF dimer peptides are useful in a number of different indications: Can increase the viscosity and elastic properties of mucin in the mucus layer:
1) For the treatment of oral mucosa, the TFF dimer peptide may be used alone or in mucus-like forms in patients with reduced secretion of saliva caused by stimulation therapy, treatment with anticholinergic agents, or patients with Sjogren's syndrome. It can be given together with the preparation.
2) With regard to increasing the viscosity of nasal secretions in rhinorrhea in common colds or allergic rhinitis, it can protect the mucous membranes of the respiratory tract following accidental inhalation of irritants, gases, dusts or femes.
3) For protection of the distal part of the esophagus against gastric acid secretion in esophageal reflux, hemorrhagic hiatus or Barrets esophagus.
[0008]
4) For protection of the stomach against acute stress-induced gastric ulcer following trauma, shock, major surgery, renal or liver disease, or gastritis caused by treatment with aspirin, other NSAIDS, steroids or alcohol.
5) For treatment of acute or prolonged diarrhea by increasing the viscosity of intestinal secretions.
6) For protection of small intestine or colon mucus in Crohn's disease, irritable bowel syndrome, or ulcerative colitis.
7) For other reasons, for eye drops to increase the viscosity of tear fluid in patients with keratoconjunctivitis, dry / Shugren's syndrome or dry eye.
8) For local application, especially to the knee joint, to increase the viscosity of synovial fluid in osteoarthritis and following joint replacement.
[0009]
TFF dimer peptides can also be used for parenteral applications:
Parenteral TFF dimers are taken up by cells for stem cells in the gastrointestinal tract. It can be used for protection of the stomach against stress-induced damage and protection of the stomach and intestine against damage following irradiation or chemotherapy or in the treatment of ulcerative colitis, irritable bowel syndrome or Crohn's disease. The infused TFF dimer peptide is completely excreted in the urine and can enhance the defense mechanism of the urinary bladder by binding to the layer of mucopolysaccharide that coats the urine cell layer, and thereby enhance chronic bladder infection Can prevent bacterial adhesion in patients with catheters, interstitial cystitis, or prevent urinary growth factor binding in papillomas or bladder cancer.
[0010]
In a first aspect, it relates to a pharmaceutical tissue composition for increasing the viscosity of a mucus layer in a mammal, comprising a TFF dimer peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[0011]
By “TFF dimer peptides” or “TFF dimer peptide” is meant a protein that is substantially homologous to human TFF1 or human TFF3 in dimeric form. The TFF1 dimer consists of two TFF1 monomers linked together by disulfide bonds between cysteine amino acid residues at position 58 of each TFF1 monomer. The TFF3 dimer consists of two TFF3 monomers joined together by disulfide bonds between cysteine amino acid residues at position 57 of each TFF3 monomer. The term TFF dimer peptide also includes analogs of the naturally occurring TFF dimer peptide. Analogs can differ from naturally occurring TFF dimers by amino acid sequence differences or by modifications that do not affect sequence, or by both. Analogs of the invention generally exhibit at least 70%, more preferably 80%, more preferably 90% and most preferably 95% or even 99% sequence identity with a naturally occurring TFF dimer sequence. There will be.
[0012]
Modifications include in vivo or in vitro chemical derivatization of the polypeptide, for example, acetylation or carboxylation. Modification of glycosylation, e.g., during the synthesis or processing of a polypeptide, or during a subsequent processing step, by modifying the glycosylation pattern of the polypeptide, e.g., a cell that normally supplies such processing, e.g., a mammalian glycosylation enzyme. Also included are those modifications made by exposing the polypeptide to enzymes that affect glycosylation due to S. cerevisiae. A version of the phosphorylated amino sequence is also included.
[0013]
In addition to polypeptides of substantially full length, the term TFF dimer peptide as used herein encompasses biologically active fragments of the polypeptide. As used herein, the term "fragment" as applied to a polypeptide usually means at least 10 contiguous amino acids, typically at least 20 contiguous amino acids, more typically It will be at least 30 contiguous amino acids, usually at least 40 contiguous amino acids, preferably at least 50 contiguous amino acids, and most preferably at least 60 to 80 or more contiguous amino acids in length.
[0014]
The ability of a candidate fragment to exhibit the biological activity of a TFF dimer peptide can be assessed by methods known to those skilled in the art. Includes amino acids that are not normally required during protein processing, including additional amino acids that are not required for the biological activity of the polypeptide, or that are due to other mRNA fragments or other protein processing phenomena Productologically active TFF dimer peptides are also encompassed by the term “fragment”.
[0015]
A TFF dimer peptide, including fragments or analogs, is biologically active if it exhibits the biological activity of a naturally occurring TFF dimer, e.g., the ability to alter the viscosity or elasticity of mucin in the mucus layer in mammals. It is.
The term "glycosylation" as used herein refers to a post-translational modification of a peptide in which a carbohydrate molecule is covalently attached to the peptide. Glycosylation can occur in a eukaryotic host cell, such as a yeast cell, or it can be performed by chemical linkage after production of the peptide in the cell, for example, where the peptide is produced in a bacterium and then in vitro Can be glycosylated.
[0016]
In a second aspect, the invention relates to the use of a TFF dimer peptide for the preparation of a medicament for increasing the viscosity of a mucus layer in a mammal.
In a third aspect, the present invention provides:
a) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent,
b) a therapeutically effective amount of a TFF dimer peptide, and optionally,
c) A method for in vivo increasing the viscosity of a mucus layer in a subject, comprising administering to the subject a composition comprising a mucin glycoprotein preparation.
In another aspect, the invention relates to the use of a TFF dimer peptide for the treatment of a mucus layer with increased viscosity in a mammal.
[0017]
The term "treatment", as used herein, is intended to prevent the progress of any sign or disease state, or to cure or facilitate such a sign or disease state that has already progressed. Means the administration of an effective amount of a therapeutically active compound of the invention. Thus, the term "treatment" is meant to encompass preventive and protective treatments. Signs or disease states include, but are not limited to, gastric ulcers or asthma, genetic biological disorders, or conditions induced by external stimuli, such as inhalation of toxic or acidic chemicals.
In one aspect of the invention, the mammal is a human.
Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for topical application.
[0018]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for luminal application.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for parenteral administration.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for oral administration.
In a further aspect, the invention is directed to a pharmaceutical composition further comprising a mucin glycoprotein preparation.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of oral mucus.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a patient having a reduced secretion of saliva. In one embodiment, the reduced secretion of saliva is caused by stimulating treatment, treatment with anticholinergics or Sjögren's syndrome.
[0019]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a patient undergoing radiation therapy.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a patient to be treated with an anticholinergic.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a patient having Sjogren's syndrome.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating the respiratory tract.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of nasal secretions in common colds or allergic rhinitis.
[0020]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a patient having a common cold.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a patient having allergic rhinitis.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating the respiratory tract.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treatment of the respiratory tract following accidental inhalation of an irritant.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treatment of the respiratory tract following accidental inhalation of gas, dust or fame.
[0021]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating the esophagus. In one aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition for treating the distal portion of the esophagus.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for protection against acid secretion from the stomach.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for protection against acid secretion from the stomach in esophageal reflux.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for protection against acid secretion from the stomach in Burrets esophagus.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating the stomach.
[0022]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of stress-induced gastric ulcer. In one embodiment, the stress-induced gastric ulcer is secondary to trauma. In another embodiment, the stress-induced gastric ulcer is subsequent to shock. In a further aspect, the stress-induced gastric ulcer follows major surgery. In a further aspect, the stress-induced gastric ulcer is secondary to renal disease. In a further aspect, the stress-induced gastric ulcer is secondary to liver disease. In a further embodiment, the stress-induced gastric ulcer is treatment with aspirin, another non-steroidal inflammatory drug (NSAIDS), steroid or alcohol.
[0023]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of diarrhea.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating small intestinal mucosa.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of colonic mucosa.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of Crohn's disease.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of irritable bowel syndrome.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of gastric ulcerative colitis.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for ophthalmic treatment.
[0024]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of tear fluid.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of tear fluid in patients with keratoconjunctivitis.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of tears in a patient with Shougren.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of tear fluid in patients with dry eye.
The term "dry eye" as used herein refers to any condition where the eye feels dry.
[0025]
In a further aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition in an ophthalmic drug.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a knee joint.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of synovial fluid.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of synovial fluid in osteoarthritis.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for increasing the viscosity of synovial fluid following joint replacement.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating the bladder.
[0026]
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for a patient having a catheter.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating an infection. In one embodiment, the infection is a chronic bladder infection.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of interstitial cystitis.
In a further aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating papilloma.
In a further aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer.
In a further aspect of the invention, the TFF dimer peptide is recombinant human TFF1.
In a further aspect of the invention, the TFF dimer peptide is recombinant human TFF3.
In a further aspect of the invention, the TFF dimer peptide is glycosylated.
[0027]
TFF dimer peptides are typically produced by recombinant DNA techniques. For this, the DNA sequence encoding the TFF dimer peptide is prepared from a genomic or cDNA library and prepared using standard techniques (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. , 1989) by screening with DNA sequences encoding all or part of the peptide by hybridization with synthetic oligonucleotide probes. For this purpose, the DNA sequence encoding the peptide is preferably of human origin, ie derived from a human genomic DNA or cDNA library.
[0028]
The DNA sequence encoding the TFF dimer peptide can also be obtained using established standard methods, such as the phosphoamidite method described by Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, or Matthes, etc., EMBO Jourral 3 ( 1984), 801-806. According to the phosphoamidite method, oligonucleotides are synthesized by an automatic DNA synthesizer, purified, annealed, ligated, and cloned into an appropriate vector.
[0029]
DNA sequences can also be prepared by the polymerase chain reaction using the specific primers described, for example, in U.S. Pat.No. 4,683,202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, or Sambrook et al., Supra. .
[0030]
The DNA sequence encoding the TFF dimer peptide can be conveniently subjected to recombinant DNA methods. It is usually inserted into a recombinant vector, which can be any vector, and the choice of vector will often depend on the host cell into which it is to be introduced. Thus, the vector can be an autonomously replicating vector, ie, a vector that exists as an extrachromosomal entity, whose replication is independent of chromosomal replication, such as a plasmid. On the other hand, the vector may be one that, when introduced into a host cell, is integrated into the host cell genome and replicated along with the integrated staining.
[0031]
The vector is preferably an expression vector in which the DNA sequence encoding the TFF dimer is operably linked to additional segments required for transcription of the DNA. Generally, expression vectors can be derived from plasmid or viral DNA, or can include elements of both. The term "operably linked" means that the segments are arranged such that they function for their intended purpose, for example, transcription is initiated by a promoter, and proceeds through the DNA sequence encoding the peptide. Is shown.
A promoter can be any DNA sequence that exhibits transcriptional activity in the host cell of choice and can be derived from a gene encoding a protein homologous or heterologous to the host cell.
[0032]
Examples of suitable promoters for directing the transcription of DNA encoding the TFF2 peptide in mammalian cells include the SV40 promoter (Subramani., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), MT-1 (metallothionein gene). ) Promoter (Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814) or adenovirus 2 major late promoter.
[0033]
Examples of suitable promoters for use in insect cells include the polyhedrin promoter (U.S. Pat. No. 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311 (1992) 7-11), the P10 promoter (JM Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), Autographa califomica polyhedrosis virus basic protein promoter (EP397485), baculovirus immediate early gene 1 promoter (US Pat. No. 5,155,037) No. 5,162,222) or a 39K delayed baculovirus early gene promoter (US Pat. Nos. 5,155,037, 5,162,222).
[0034]
Examples of suitable promoters for use in yeast host cells include yeast glycolytic genes (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434), alcohol dehydrogenase gene (Young et al., In Genetic Engineering of Microorqanisms for Chemicals (Hollaender et al., Eds.), Plenum Press, New York, 1982), TPI1 (US Pat. No. 4,599,311) ) Or the ADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) promoter.
[0035]
Suitable promoters for use in filamentous fungal host cells are, for example, the ADH3 promoter (Mcknight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) or the tpiA promoter. Examples of other useful promoters are A. oryzae TAKA amylase, Rhizomucor miehei aspartate proteinase, A. niger neutral α-amylase, A. niger acid stable A-amylase, A. niger or A. awamori glucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei lipase, A. oryzae alkaline protease, A. oryzae triose phosphate isomerase or A. nidulans (A. nidulans) derived from the gene encoding acetamidase. TAKA-amylase and gluA promoters are preferred. Suitable promoters are mentioned, for example, in EP238023 and EP383779.
[0036]
The DNA sequence encoding the TFF dimer peptide may also be provided, if necessary, with a suitable terminator, such as the human growth hormone terminator (Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814), TP11 (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1. 1982, pp. 419-434), or ADH3 (Mcknight), etc., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099). The vector may further include elements such as a polyadenylation signal (eg, from the SV40 or adenovirus 5EIb region), a transcriptional enhancer sequence (eg, the SV40 enhancer), and a translated enhancer sequence (eg, a sequence encoding adenovirus VA RNA). Can consist of
[0037]
The recombinant vector further comprises a DNA sequence enabling the vector to replicate in the host cell in question. An example of such a sequence (where the host cell is a mammalian cell) is the multiple SV40 origin.
When the host cell is a yeast cell, suitable sequences allowing the vector to replicate are the yeast plasmid 2μ replication genes REP1-3 and the origin of replication.
[0038]
The vector may also include a selectable marker, for example, a gene (the product of which complements the deletion in the host cell), for example, a gene encoding dihydrofolate reductase (DHFR), or a Schisosaccharomyces pombe TPI gene. (Described by PR Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130), or comprising a gene that confers resistance to a drug such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, neomycin, hygromycin or methotrexate. be able to. For filamentous fungi, selectable markers include amdS, pyrG, argB, niaD, or sC.
[0039]
To direct the TFF dimer peptide of the invention in the secretory tract of a host cell, a secretory signal sequence (known as a leader sequence, prepro sequence or pre sequence) can be provided in the recombinant vector. The secretory signal sequence is ligated in the correct reading frame to the DNA sequence encoding the TFF dimer peptide. Secretory signal sequences are usually located 5 'to the DNA sequence encoding the peptide. The secretory signal sequence will usually be a sequence associated with the protein, or may be from a gene encoding another secreted protein.
[0040]
For secretion from yeast cells, the secretory signal sequence can encode any signal peptide that ensures efficient direction of the expressed TFF dimer peptide into the secretory tract of the cell. The signal peptide can be a naturally occurring signal peptide, or a functional site thereof, or can be a synthetic peptide. Suitable signal peptides are the α-factor signal peptide (see US Pat. No. 4,870,008), the mouse salivary amylase signal peptide (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646), modified. Carboxypeptidase signal peptide (LA Valis et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), yeast BAR1 signal peptide (WO87 / 02670), or yeast aspartic protease 3 (YAP3) signal peptide (M. Egel-Mitani) , Yeast 6, 1990, pp. 127-137).
[0041]
For efficient secretion in yeast, the sequence encoding the leader peptide can also be inserted downstream of the signal sequence and upstream of the DNA sequence encoding the TFF dimer peptide. The function of the leader peptide is to direct the expressed peptide from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus and further to secretory vesicles for secretion into the culture medium (ie, into the periplasmic space of yeast cells). Transport of the TFF dimer peptide across the cell or at least across the cell membrane). The leader peptide can be a yeast α-factor leader (the use of which is described, for example, in US Pat. No. 4,546,082, US Pat. No. 4,870,008, EP16201, EP123294, EP123544 and EP163529). On the other hand, the leader peptide can be a synthetic leader peptide that is a leader peptide not found in nature. For example, synthetic leader peptides are described in WO89 / 02463 or WO92 / 11378.
[0042]
For use in filamentous fungi, the signal peptide conveniently encodes a gene encoding Aspergillus sp. Amylase or glucoamylase, a gene encoding Rhizomucor miehei lipase or a protease, or Humicola lanuginosa lipase. Derived from the gene. The signal peptide is preferably Oryzae TAKA amylase, A. Niger neutral α-amylase; Niger acid stable amylase; Derived from the gene encoding niger glucoamylase. Suitable signal peptides are disclosed, for example, in EP238023 and EP215594.
For use in insect cells, signal peptides are conveniently insect genes (WO90 / 05783), such as Lepidopteran Manduca sexta fat mobilizer) hormone precursor peptide (US Pat. No. 5,023,328). Can be derived from
[0043]
Each is used to ligate a DNA sequence encoding a TFF dimer peptide, promoter and, optionally, a terminator and / or secretion signal sequence, and insert them into a suitable vector containing the necessary information for replication. Methods performed are well known to those skilled in the art (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, 1989).
The host cell into which the DNA sequence encoding the TFF dimer peptide is introduced can be any cell capable of producing a post-translationally modified TFF dimer peptide, and includes yeast, fungi and higher eukaryotic cells. I do.
[0044]
Examples of suitable mammalian cell lines are COS (ATCC CRL1650), BHK (ATCC CRL1632, ATCC CCL10), CHL (ATCC C39) or CHO (ATCC CCL61) cell lines. Methods for transfecting mammalian cells and expressing DNA sequences to be introduced into cells are described, for example, in Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; and Neumannet al., EMBO J. 1 (1982), 841-845.
[0045]
Examples of suitable yeast cells include cells of the strains of Saccharomyces sp. Or Schizosaccharomyces spp., Especially Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces kluyberg. Methods for transforming yeast cells with heterologous DNA and producing heterologous polypeptides therefrom are described, for example, in U.S. Patent Nos. 4,599,311; 4,931,373; 4,670,008; 5,037,743 and 4,845,075, all of which are incorporated herein by reference. , Incorporated herein by reference).
[0046]
Transformed cells are selected by expression type determined by a selectable marker, usually drug resistance, or the ability to grow in the absence of a particular nutrient, such as leucine. A preferred vector for use in yeast is the POT1 vector disclosed in US Pat. No. 4,931,373. Following the DNA sequence encoding the TFF2 peptide is a signal sequence and, optionally, a leader sequence. Further examples of suitable yeast cells are Kluyveromyces, such as K. lactis, Hunsenula, such as H. polymorpha, or Pichia, such as Pichia. A strain of P. pastoris (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. B2, 1986, pp. 3459-3465; U.S. Pat. No. 4,882,279).
[0047]
Examples of other fungal cells are filamentous fungi, such as strains of Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. Or Trichoderma spp. Orizae, A. Nidurans or A. Niger strain. The use of Aspergillus spp. For protein expression is described, for example, in EP 272277, EP 238023, EP 184438. F. Transformation of oxysporum is described by Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156. Transformation of Trichoderma spp can be performed, for example, as described in EP244234.
[0048]
When a filamentous fungus is used as a host cell, it can be conveniently transformed with a DNA construct of the present invention by integrating the DNA construct into the host chromosome to obtain a recombinant host cell. This integration will generally be beneficial if the DNA sequence is stably maintained in the cell. Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed by conventional methods, for example, by homologous or heterologous recombination.
[0049]
Transformation of insect cells and production of heterologous polypeptides therein is described in U.S. Patent Nos. 4,745,051; 4,879,236; 5,155,037; 5,162,222; EP397,485, all of which are incorporated herein by reference. Can be performed as described in The insect cell line used as host is suitably a Lepidoptera cell line, such as Spodoptera frugiperda cells or Trichoplusia ni cells (US Pat. No. 5,077,214). Culture conditions are suitably described in WO 89/01029 or WO 89/01028 or any of the aforementioned references.
[0050]
The transformed or transfected host cells are then cultured in a suitable nutrient medium under conditions that allow expression of the TFF dimer peptide, followed by all or a portion of the resulting peptide. Can be recovered from the culture. The medium used to culture the cells can be any conventional medium suitable for growing host cells, such as minimal or complex media with appropriate supplements. Suitable media are commercially available or can be prepared according to published recipes (eg, ATCC catalogs). The TFF dimer peptide produced by the cells can then be isolated by conventional methods, such as separation of the host cells from the medium by centrifugation or filtration, precipitation of the protein components of the supernatant or filtrate by salts, such as ammonium sulfate, poly-polysaccharide of interest. Depending on the type of peptide, it can be recovered from the culture medium by various chromatographic methods, for example by purification by ion exchange chromatography, gel chromatography, affinity chromatography or the like.
[0051]
In the pharmaceutical compositions of the present invention, the TFF dimer peptide can be formulated by any of the established methods of formulating pharmaceutical compositions described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. The compositions can be in a form suitable for systemic injection or infusion and can be formulated with sterile water, or an isotonic saline or glucose solution. The composition can be sterilized by conventional sterilization techniques well known in the art. The resulting aqueous solution may be packaged for use or filtered under aseptic conditions and lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous solution prior to administration. If the composition needs to approach physiological conditions, it may be pharmaceutically acceptable auxiliary substances, such as buffers, tonicity adjusting agents and the like, such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride. , Etc. can be included.
[0052]
The pharmaceutical composition of the invention may also be adapted for nasal, transdermal or rectal administration. The pharmaceutically acceptable carrier or diluent used in the composition can be any conventional solid carrier. Examples of solid carriers are lactose, terra alba, sucrose, talc, gelatin, agar, pectin, acacia, magnesium stearate and stearic acid. Similarly, carriers or diluents include sustained release materials known in the art, such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate, alone or mixed with a wax. The amount of solid carrier will vary widely but will usually be from about 25 mg to about 1 g.
[0053]
The concentration of the TFF dimer peptide in the composition varies widely, i.e., from about 5% to about 100% by weight. Typical concentrations are in the range 50-100% by weight. A unit dose of the composition contains about 1 mg to about 200 mg, typically 25 mg to about 75 mg, for example about 50 mg of the peptide.
[0054]
The term "therapeutically effective amount" can be determined by a qualified individual capable of titrating a dose to achieve a desired response. Factors for dose considerations include efficacy, bioavailability, desired pharmacokinetic / pharmacodynamic profile, status of treatment (eg, trauma, ulcerative colitis, gastric ulcer), patient-related factors (eg, weight, health , Age, etc.), the presence of the co-administered drug, the time of administration, or other factors known to the medical practitioner. The dose of TFF2 peptide administered to a patient will vary with the type and severity of the condition being treated, but will generally be in the range of 0.1 to 1.0 mg / kg body weight.
[0055]
The term "subject" as used herein means an animal, particularly a mammal, such as a human, and may be used interchangeably with the term "patient" where appropriate.
The present invention is further illustrated by the following examples, which do not limit the scope of the invention. The features disclosed in the foregoing description and in the following examples, separately and in any combination thereof, may be materials for implementing the invention in its various forms.
【Example】
[0056]
Example 1 TFF Rheological properties of peptides:
Mucin: Type II crude mucin from pig stomach (Sigma, St. Louis, Mo, USA). Dimeric forms of recombinant human TFF3 were prepared as described previously (Thim, L. et al. (1995) Biochemistry 34, 4757-4764). Dimeric forms of recombinant human TFF1 were prepared as described previously (Kannan, R. et al. (2001) Protein Expression and Purification 21, 92-98).
[0057]
Mucin solution: A 10% (w / v) solution of mucin I was prepared and the different TFF dimer peptides were dissolved in water and added to the mucin solution. After mixing the samples (Vortex mixer), the samples were left for 5 minutes and the mucous membrane was visually evaluated compared to a water-free mucin control solution without the TFF dimer peptide. Detailed experimental conditions for blood flow meter measurements are given in the figure.
[0058]
Rheology measurement: Rheology was measured by using a rotating Reologica blood flow meter (Reologica Instruments AB, Lund, Sweden). The apparatus is equipped with a stainless steel C40 4-cone plate (40 mm diameter with a 4 ° angle) requiring a sample volume of at least 1.2 ml. The instrument was operated using standard software (Version 3.6) which allows several different types of measurements. In this study, we used the following measurement programs: constant speed (viscosity and stress as a function of shear rate), vibration (complex viscosity at different frequencies, modulus and consistency) and Vibration response motion curve (to identify stress ranges where the measurement is linear, ie independent of the applied stress).
[0059]
A visual assessment of the change in properties that could be observed when the TFF dimer peptide was added to the mucin solution was performed (Table 1). In some experiments, the effect was surprising. Addition of the TFF dimer peptide to the mucin solution resulted in a significant visible increase in viscosity (Table 1).
Mucin solution and mucin / TFF dimer peptide gel-like substance: A mucin solution to which a TFF dimer peptide was added was compared. As can be seen from FIG. 2, the mucin solution behaves alone as a non-Newtonian solution. These liquids can be described by the Ostwald de waele model (power law) (Barnes, H.A. (1989) An introduction to rheology. Elsevier and Ferguson, J. and Kemblowski, Z. (1991) Applied fluid rheology. Elsevier):
[0060]
δ = k (γ)ⁿ
Where δ = shear stress, γ = shear rate n and k are constant for the solution (if n = 1, the solution is a Newtonian fluid). In this case, the following values can be calculated from FIG. 2: n = 0.75 and k = 0.35
If n <1, the solution is called shear-tinning, characteristic of a dispersion or emulsion with asymmetric particles. However, if the n value is close to 1, the solution is not far from Newton's solution. As can also be seen from FIG. 2, the viscosity is 0.34 Pa at low shear rates to 0.12 Pa at high shear rates.
[0061]
To characterize the mucin / TFF dimer peptide gel-like structure, a technique of vibration measurement in which the gel-like material was subjected to sinusoidally changing stresses was applied and the strain response was measured. Prior to this measurement, the inventor used an oscillating stress motion curve to define a so-called linear viscoelastic region. Within this region, no change in the mucin / TFF dimer peptide structure occurs, and the relationship between the applied stress and the measured amount is linear.
[0062]
FIG. 3 results from vibrational measurements of mucin solution alone (FIG. 4a) and mucin / TFF3 dimer peptide gel-like material (FIG. 3b). This type of experiment allows the evaluation of several parameters as a function of frequency: complex viscosity η^*, Elastic modulus G ′ and consistency G ″ (for a detailed rheological theory, see Bames, HA (1989) An introduction to rheology. Elsevier and Ferguson, J. and Kemblowski, Z. (1991) Applied Fluid rhoology. See Elsevier).
[0063]
A comparison of the absolute values of modulus and consistency of the mucin solution and the mucin / TFF3 dimer peptide gel-like material is given in Table 2. As can be seen from these results, both modulus and consistency are dramatically increased in the mucin / TFF3 dimer peptide gel-like structure compared to the mucin solution.
FIG. 4 shows the change in viscosity of the mucin I solution obtained by adding the TFF3 dimer peptide. The TFF3 dimer peptide had a significant effect on the viscosity of the mucin solution. Addition of the TFF3 dimer peptide resulted in a mucus solution having a 1-4 mm fibrous structure surrounded by a liquid solution.
[0064]
[Table 1]

[0065]
[Table 2]

[0066]
Example 2. Lumen in experimental colitis in rats TFF3 Effect:
Methods: 326 female Wistar rats weighing 200 g were used in this study. The effects of luminal TFF3 were induced in two rat models of colitis (mitomycin C induced colitis model: Keshavarzian A. et al. J. Lab. Clin. Med. 1992; 120: 778-91 and dextran induced. Colitis model: studied in Mottet NK. Gastroenterology 1972; 62: 1269-71). TFF3 is injected in anesthetized rats by flank incision, inserting a soft polyethylene tubing into the colon lumen, securing with 6-0 silk suture, and leading subcutaneously to the neck area of the rat. , Administered directly into the proximal part of the colon. After this operation, the rats had a 6-day recovery period.
[0067]
Mitomycin C colitis: In 16 rats, colitis was induced by 3.75 mg / kg mitomycin C. Eight rats received 5 mg / kg TFF3 in 0.5 ml water twice daily in the colonic tract. Eight controls received NaCl 2. Rats were killed 8 days after mitomycin administration with an excess of barbiturate. The colon was fixed by intraluminal injection of 10% formalin and 10 minutes later, dissected and suspended on a polyethylene plate. After an additional 24 hours of fixation, the specimen was flushed with water and the surface was stained with 0.3% Alcian Green 3BX. Colon specimens were examined with a Wild Photomacroscope to quantify the extent of disease and the number of ulcers. For histological analysis, specimens were taken from the proximal, middle and distal colon (blindly) and embedded in paraffin. 5 μm tissue sections were stained with PAS-Hematoxylin-Aurentia. Colitis severity was scored by histological colitis score (FIG. 5, Williams KL. Et al. Gastroenterology 2001; 120: 925-37).
[0068]
Results: Intraluminal treatment with TFF3 significantly reduced the overall colitis score (3.4 vs. 10.8; p <0.01, FIG. 6). When the middle segment and distal colon were compared, there were similar treatment effects at both sites (data not shown).
[0069]
Dextran colitis: In 16 rats, colitis was induced by 5% dextran sodium sulfate administered in drinking water. Eight rats received 5 mg / kg TFF3 in 0.5 ml water twice a day in the colonic tract twice a day from the day before the start of dextran feeding until day 9 when the rats were killed. Eight controls received NaCl 2. Rats were killed by an excess of barbiturate. The colon was fixed by intraluminal injection of 10% formalin and 10 minutes later, dissected and suspended on a polyethylene plate.
[0070]
After an additional 24 hours of fixation, the specimen was flushed with water and the surface was stained with 0.3% Alcian Green 3BX. Colon specimens were examined by Wild Photomacroscope and the extent of disease and the number of ulcers were quantified. For histological analysis, specimens were taken from the proximal, middle and distal colon (blindly) and embedded in paraffin. 5 μm tissue sections were stained with PAS-Hematoxylin-Aurentia. Colitis severity was scored by histological colitis score (Williams KL. Et al. Gastroenterology 2001; 120: 925-37).
[0071]
Results: Intraluminal treatment with TFF3 had a significant effect on the overall colitis score (1.1 vs. 3.18; p <0.05, Figure 6). The effect was potent in the middle part of the colon adjacent to the site where TFF3 was introduced into the colon lumen (0.4 vs 1.8; p <0.05, FIG. 7).
Conclusion: Intraluminal treatment with TFF3 reduces the severity of mitomycin-induced colitis and dextran-induced colitis in rats.
[Brief description of the drawings]
[0072]
FIG. 1 shows mammalian trilobular factor (TFF) in monomeric form, TFF1 and TFF3. This figure shows the human sequence. The dimers of TFF1 and TFF3 are formed by disulfide bonds of cysteine amino acid residues by the indicated free sulfhydryl groups on two different molecules of TFF1 or TFF3, respectively.
FIG. 2 shows the stress versus shear rate for mucin solutions only. 2 ml of 10% (w / v) mucin I dissolved in 0.05% (w / v) sodium azide was added to 0.4 ml of water. After 30 minutes at 20 ° C., the shear stress was measured as a function of the shear rate using a software program: “constant rate” —approximation to the power law.
FIG. 3 shows vibration measurements of a mucin solution (a) and a mucin / TFF3 dimer peptide gel-like material (b). 2 ml of 10% (w / v) mucin I dissolved in 0.05% (w / v) sodium azide was added to 0.4 ml of water (a) or 0.4 ml of water (b) containing 10 mg of TFF3 dimer peptide. Was added. After 30 minutes at 20 ° C., varying stresses were applied and the stress response was detected at different frequencies. Complex viscosity (η^*) ◇-◇, modulus (G ′) □-□ and consistency (G ″)）-○ were calculated and plotted as a function of different frequencies.
FIG. 4 shows the viscosity versus shear rate of the TFF3 dimer peptide. 2 ml of 10% (w / v) mucin I dissolved in 0.05% (w / v) sodium azide was added to 7.05 ml of TFF3 dimer peptide dissolved in water. After 30 minutes at 20 ° C., the shear stress was measured as a function of shear rate using a software program: “constant rate”, □-□: mucin I only; △-△: mucin I + TFF3 dimer.
In FIG. 5, the effect of luminal TFF3 on experimental colitis in rats was scored by histological colitis score (Williams KL. Et al. Gastroenterology 2001; 120: 925-37).
FIG. 6 shows the effect of luminal TFF3 on experimental colitis in rats. A significant effect on the overall colitis score is shown in this figure.
FIG. 7 shows the effect of luminal TFF3 on experimental dextran colitis in rats. The effect was effective in the middle part of the colon adjacent to the site where TFF3 was introduced into the colon lumen.

Claims

A pharmaceutical tissue composition for increasing the viscosity of a mucus layer in a mammal, comprising a trilobular factor (TFF) dimer peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the mammal is a human.

3. A pharmaceutical composition according to claim 1 or 2 for topical and luminal application.

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2 for parenteral administration.

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2 for oral administration.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the TFF dimer peptide is human recombinant TFF1.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the TFF dimer peptide is human recombinant TFF3.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, further comprising a mucin glycoprotein preparation.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating oral mucus.

10. A pharmaceutical composition according to claim 9 for treatment of a patient with reduced secretion of saliva.

11. The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the reduced secretion of saliva is caused by stimulating treatment, treatment with an anticholinergic agent or Sjogren's syndrome.

9. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating the respiratory tract.

13. The pharmaceutical composition according to claim 12, for increasing the viscosity of nasal secretions in a common cold or allergic rhinitis.

14. The pharmaceutical composition according to claim 13, for treatment of the respiratory tract following accidental inhalation of irritants, gases, dusts or fumes.

9. A pharmaceutical composition according to any one of the preceding claims for the treatment of the distal part of the esophagus.

16. The pharmaceutical composition according to claim 15, for protection against acid secretion from the stomach in esophageal reflux, hemorrhagic hiatus or Barrets esophagus.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating a stomach.

18. The pharmaceutical composition according to claim 17, for treating stress-induced gastric ulcer following trauma, shock, major surgery, renal or liver disease, or treating with aspirin, other NSAIDS, steroids or alcohol.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating diarrhea.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating small intestine or colon mucus in Crohn's disease, irritable bowel syndrome, or ulcerative colitis.

9. A pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8 for treatment of the eye.

22. The pharmaceutical composition according to claim 21, for increasing the viscosity of tear fluid in a patient having keratoconjunctivitis, dry / Sjogren's syndrome or dry eye.

23. The pharmaceutical composition according to claim 21 or 22, wherein said pharmaceutical composition is present in an eye drop.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating a knee joint.

25. A pharmaceutical composition according to claim 24 for increasing the viscosity of synovial fluid in osteoarthritis and following joint replacement.

9. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 8, for treating chronic bladder infections, patients with catheters, interstitial cystitis, papillomas or bladder cancers.

Use of a TFF dimer peptide for the preparation of a medicament for increasing the viscosity of a mucus layer in a mammal.

Use of a TFF dimer peptide for the preparation of a medicament according to any one of claims 1 to 26 for increasing the viscosity of a mucus layer in a mammal.

The use according to claim 27 or 28, wherein the mammal is a human.

A method for in vivo increasing the viscosity of a mucus layer in a subject, comprising:
a) a pharmaceutically acceptable carrier or diluent,
b) a therapeutically effective amount of a TFF dimer peptide and optionally
c) administering to the subject a composition comprising a mucin glycoprotein preparation.

31. The method of claim 30, wherein said administration is local and luminal.

31. The method of claim 30, wherein said administering is parenteral.

The method according to any one of claims 30 to 32, wherein the TFF dimer peptide is human recombinant TFF1.

The method according to any one of claims 30 to 32, wherein the TFF dimer peptide is human recombinant TFF3.

35. The method of any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in oral mucus.

36. The method of claim 35, wherein said disease state is reduced secretion of saliva.

37. The method of claim 36, wherein the reduced secretion of saliva is caused by a stimulating treatment, treatment with an anticholinergic, or Sjögren's syndrome.

35. The method of any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in the respiratory tract.

39. The method of claim 38, wherein said disease state is to increase the viscosity of nasal secretions in a common cold or allergic rhinitis.

39. The method of claim 38, wherein the disease state is accidental inhalation of an irritant, gas, dust or fume.

35. The method of any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in a distal portion of the esophagus.

42. The method of claim 41, wherein the disease state is esophageal reflux, hemorrhagic hiatus, or acid secretion from the stomach in the Barrets esophagus.

35. The method of any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in the stomach.

44. The method of claim 43, wherein said disease state is trauma, shock, major surgery, renal or hepatic disease, or stress-induced gastric ulcer following treatment with aspirin, other NSAIDS, steroids or alcohol.

The method according to any one of claims 30 to 34, wherein the disease state is diarrhea.

35. The method according to any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in the small intestine or colon.

47. The method of claim 46, wherein said disease state is Crohn's disease, irritable bowel syndrome, or ulcerative colitis.

35. The method of any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in the eye.

50. The method of claim 48, wherein said disease state is keratoconjunctivitis, dry / Sjogren's syndrome, or dry eye.

35. The method of any one of claims 30 to 34, wherein the mucin viscosity level is associated with a disease state in a knee joint.

51. The method of claim 50, wherein the disease state is increased viscosity of synovial fluid in osteoarthritis and following joint replacement.

35. The method according to any one of claims 30 to 34, wherein the disease state is a chronic bladder infection, a patient with a catheter, interstitial cystitis, papilloma or bladder cancer.