JP2004533804A - Artificial transcription factors and methods of use - Google Patents

Abstract

An artificial transcription factor (ATF) having a non-peptide DNA binding domain, a flexible linker and a short synthetic effector domain is provided. ATFs are very potent transcriptional regulators in vitro and in vivo. Methods are also provided that target the standardized manipulation of gene expression and the development of new classes of pharmaceuticals.

Description

を含む単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸の活性化因子配列の少なくとも１コピーを含む、ポリペプチド配列を有する。少なくとも一態様において、ポリペプチドはＳＷＱＵＩＤ ＮＯ：１２の配列を有する。少なくともいくつかの態様において、ペプチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の活性化因子配列の２コピーおよびペプチド配列のアミノ末端にシステイン残基を含み、ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（表１を参照されたい）
【００１７】
【化２】

の配列を有する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド配列はシステイン残基およびＳＥＱ ＩＦ ＮＯ：１２の活性化因子配列の２コピーを含み、ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列を有する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド転写調節因子のアミノ末端はリンカーに共有結合する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド転写調節因子のカルボキシル末端はリンカーに共有結合する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド転写調節因子のシステイン残基はリンカーに共有結合する。
【００１８】
少なくともいくつかの態様において、真核細胞遺伝子の転写を調節する組成物の転写エフェクタ部分は約３，０００ダルトンより少ない分子量を有する。少なくともいくつかの態様において、転写エフェクタ部分は約１，５００ダルトンより少ない分子量を有する。少なくともいくつかの他の態様において、転写調節因子部分は約１，０００ダルトンより少ない分子量を有する。
【００１９】
真核細胞遺伝子の転写を調節するための組成物の少なくともいくつかの態様において、フレキシブルリンカーはポリグリコールを含む。いくつかの態様において、フレキシブルリンカーポリグリコールは少なくとも２，または少なくとも４，または少なくとも６グリコールユニットを含む。他の態様において、フレキシブルリンカーは核酸、ペプチド、および低級アルキルまたは他の酸素含有アルキル鎖誘導体からなる群から選択される複数のモノマーユニットを含む。
【００２０】
少なくともいくつかの態様において、２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始される転写の量は少なくとも組成物非存在下で開始される２番目の量に比べて１０倍多い。少なくともいくつかの態様において、線状２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始される転写の量は組成物非存在下における２番目の量に比べて少なくとも２０，または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０倍多い。少なくともいくつかの態様において、転写の量は、本発明のＡＴＦの非存在下における転写より３０〜５０倍多い。
【００２１】
少なくとも本発明のいくつかの態様において、真核細胞遺伝子の転写を変化させる（調節する）ための組成物のＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ鋳型上の少なくとも１ＤＮＡ結合部位に対して親和性を有し、ＤＮＡ鋳型は約５００塩基対より短い。
【００２２】
本発明の別の側面において、転写を活性化するための組成物は構造Ａ−Ｂ−Ｃを有し、ここでＡはトリプレックス形成核酸であり、Ｂはフレキシブルリンカーであり、そしてＣは真核細胞ＲＮＡポリメラーゼを含む転写蛋白質複合体上の部位に結合する活性化部分であり、ここでＢはＡおよびＣに共有結合する。少なくともいくつかの態様において、Ｂはポリグリコール鎖であり、そしてＢのＣへの共有結合は二官能橋かけ剤を含む。少なくともいくつかの態様において、Ｂは少なくとも長さ約２８オングストロームのポリグリコールであり、そしてＣは単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明の別の側面は転写調節因子としての活性に関して試験化合物をアッセイするための方法を提供する。方法は以下のことを含む：
試験組成物を提供するために、非ペプチドＤＮＡ結合ドメインに共有結合する、フレキシブルリンカードメインに試験化合物を共有結合させること、ここでＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータにおける転写を調節するために、ＤＮＡ鋳型上の結合部位に十分な親和性を有する；
ＲＮＡが合成されるように、ＲＮＡ合成に適切な条件下で、ＤＮＡ鋳型、試験組成物およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成することができる真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子、バッファーおよび基質を含む転写混合物を試験組成物と接触させること；および
試験組成物の非存在下での基礎レベルに比べた、試験組成物存在下で産生されたＲＮＡの量を測定すること、ここでＲＮＡの量は転写活性化因子としての試験組成物の活性の尺度である。少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合部位は複数の結合部位配列の反復である。転写活性化因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法の少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ鋳型への試験組成物の結合部位は転写開始部位から１００塩基対以内に位置する。
【００２４】
転写活性化因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法の別の態様において、試験組成物に転写混合物を提供するための段階はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。少なくともいくつかの態様において、試験組成物は鋳型に予め結合し、混合物は形質転換により複数の細胞に提供される。少なくともいくつかの態様において、試験組成物は染色体に取り込まれたレポータープラスミド鋳型を持つ細胞（安定なトランスフェクション系統）に提供される。
【００２５】
少なくともいくつかの態様において、試験組成物に転写混合物を提供する段階がマルチウェルディッシュのウェルへの自動化された分配を含む、ハイスループットスクリーニング技術を使用して行われる。少なくともいくつかの態様において、デ−タ解析および表示のためのプログラム可能なコンピュ−タ化されたプログラムを有する自動プレートリーダーを含むハイスループット検出法を使用して、転写の量を測定する段階が実行される。
【００２６】
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は特記しない限り、本説明および請求項を通して使用される。本明細書で参照する特許および科学文献は当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書で引用した、発行された米国特許、認められた出願、および参考文献は本明細書に参照として引用される。
【００２７】
本明細書で使用する用語“人工転写因子”は、合成転写因子を含む。
用語“約”は、引用した値の±２０％の範囲の数値を意味するように使用される。
【００２８】
用語“形質転換”は、少なくともＤＮＡが細胞の一部に入るように、受容細胞とＤＮＡを混合することにより生じる、細胞系統または株の構築に使用される遺伝的事象を表し、トランスフェクション、リポフェクション、または他のリポソ−ム媒介過程、およびエレクトロポレ−ションを含む。
【００２９】
“転写エフェクタ”は、プロモータの近くに存在し、ＤＮＡ結合ドメインに結合するとき、特定のプロモータまたはプロモータのクラスから合成されるＲＮＡの量の増加または減少を引き起こす化学組成物を表す。エフェクタの非存在下における転写は“基礎（ｂａｓａｌ）”レベルであると言う。転写は正のエフェクタまたは“活性化因子”により活性化（誘導、またはアップレギュレ−トとしても知られる）されてもよい。同様に、基礎または活性化レベルは負のエフェクタまたは“抑制因子”により抑制、またはダウンレギュレ−トされてもよい。
【００３０】
転写エフェクタは、遺伝子の転写開始部位の近くまたはかかる部位において作用することができる。遺伝子は鋳型としてＤＮＡ鎖を使用して５’から３’方向に合成されるとき転写される。初めのリボヌクレオシドトリホスフェ−トがＲＮＡポリメラーゼと複合体を形成する転写開始部位は“＋１”として既知のＤＮＡ鋳型上の部位に相補的に見出され、それぞれの連続したヌクレオチド添加は正の数を増しながら“下流”部位に相補的に起こる。＋１部位の“上流”には、一般に、転写因子、転写装置の成分、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連する蛋白質の結合を特定するプロモータのようなＤＮＡ調節シグナルが見出される。プロモータは一般に、転写開始のために適切にＲＮＡポリメラーゼホロ酵素を配置するために、＋１部位の上流の一定の距離内に見出される。転写の量を調節するＤＮＡ配列中の調節シグナル、たとえば最初は酵母で発見されたＧＡＬ−４結合部位配列は一般にプロモータ中、たとえば＋１部位の上流またはかかる部位に隣接して位置する。
【００３１】
本明細書で引用する核酸およびアミノ酸配列を表１に記載する。
【００３２】
【表１】

Ａはアラニンを意味し；Ｃはシステインを意味し；Ｄはアスパラギン酸を意味し；Ｅはグルタミン酸を意味し；Ｆはフェニルアラニンを意味し；Ｇはグリシンを意味し；Ｈはヒスチジンを意味し；Ｉはイソロイシンを意味し；Ｋはリジンを意味し；Ｌはロイシンを意味し；Ｍはメチオニンを意味し；Ｎはアスパラギンを意味し；Ｐはプロリンを意味し；Ｑはグルタミン酸を意味し；Ｒはアルギニンを意味し；Ｓはセリンを意味し；Ｔはスレオニンを意味し；Ｖはバリンを意味し；Ｗはトリプトファンを意味し；そしてＹはチロシンを意味する。
【００３３】
態様の詳細な説明
驚くべきことに、いずれの部分も無傷の、折りたたまれた、蛋白質ドメインを含まない、３部分からなるＡＴＦが転写活性化において、これらの部分の設計の基になった蛋白質転写調節因子と同じか、またはそれより好ましく機能できることが見出されている。３部分からなる分子の設計は、ＡＴＦがＤＮＡ結合ドメイン、フレキシブルリンカー、および転写を活性化するか、または抑制するか、さもなければ変化させる、転写エフェクタを含むものであり、それらは発明の説明および請求項中でそれぞれＡ、Ｂ、およびＣとして表される。しかし、これらの“ドメイン”はいずれも蛋白質ドメインである必要はない。本明細書で使用する“ドメイン”の意味は、ＡＴＦ分子の３部分のそれぞれの機能を表す。
【００３４】
本発明の一側面において、あるＡＴＦ成分が関連する天然の転写活性化因子蛋白質の活性に匹敵するか、またはさらに越える活性を持つ、合成または人工転写因子（ＡＴＦｓ）が提供される。本発明のいくつかの実施例において、転写反応、すなわち活性化または抑制は、対照、すなわち本発明のＡＴＦが存在しない系のそれより、１０倍、または２０倍、または３０倍または４０倍、またはさらに５０倍も大きい。
【００３５】
本発明のＡＴＦの態様は、図１に示される。機能的ＡＴＦはＤＮＡ結合ドメインＡを含み、リンカーＢに５’位で結合するトリプレックス形成オリゴヌクレオチドとして本明細書で示される、。しかし、活性を損失せずに、ＤＮＡ結合ドメインの３’末端でリンカーに結合することは可能である。リンカーは、エフェクタドメインＣ、すなわち転写に影響を及ぼすドメインに遠位端で結合する。作用は、転写を活性化すること、または抑制することであってもよい。ここで、エフェクタは活性化ドメイン、ＡＤとして示される。以下でより詳細に説明するように、ＡＴＦ分子の個々のドメインはもっとも一般には共有結合する；しかし、任意の適切な結合、すなわち共有結合、水素結合、親水性または疎水性結合がＡＴＦを形成するために使用されてもよいことが企図される。
【００３６】
ＤＮＡ結合ドメインＡは、プロモータＤＮＡ内の具体的な認識部位に親和性を有する任意の非ペプチド部分である。非ペプチド部分という用語により、ドメインが天然のアミノ酸の実質的な量を含まないことを意味する。ＤＮＡ結合ドメイン中のペプチド成分を実質的に除外することは、孤立したアミノ酸の包含の可能性を除外しない。本発明の目的のためには、実質的に非ペプチドであるとは、天然のアミノ酸含有量が５０％より少ないか、または２０％より少ないことを意味するべきである。ＤＮＡ結合ドメインの選択は、活性化することを意図した遺伝子に依存する。いくつかの活性化因子は長い距離にわたり作用することができるが、ＤＮＡ結合ドメインは、一般に活性化因子が転写に影響を及ぼすことができる遺伝子の転写開始位置の比較的近くに位置する部位を認識する。多くの活性化因子または抑制因子は長い距離にわたり作用することが可能であり、これらのエフェクタの使用が本発明で企図される。
【００３７】
少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のようなオリゴヌクレオチドである。これらの部分はＤＮＡへリックスの主要な溝（ｇｒｏｏｖｅ）に結合すると考えられている。トリプレックス形成核酸の設計は、Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，の米国特許第５，８７４，５５５号に記載され、これを本明細書に参照として援用する。ＤＮＡ結合ドメインの付加的な型をトリプレックス形成核酸と置換できることが予想される。
【００３８】
ＴＦＯｓは生理的条件で２本鎖ＤＮＡと強力で安定な配列特異的な複合体を形成できる（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７０−８１（１９９２））。この性質は以下の実施例で証明されるように、エフェクタとの結合に不都合な影響を与えない。任意の作用様式または理論には束縛されないが、リンカーは他の可能性のある役割に加えて、結合した化学基による妨害からＴＦＯを“絶縁”する役割を果たすと考えられる。
【００３９】
ＴＦＯとＤＮＡ間のトリプルへリックス形成は、両分子の配列が特別な特徴、とりわけ１ＤＮＡ鎖におけるプリン塩基および相補鎖におけるピリミジンの均一な伸長を有するとき促進される。このことは、医薬的（遺伝子タ−ゲッティング）適用またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏＡＴＦアッセイのような多くの適用の障害ではない、なぜならＴＦＯｓの配列およびレポーター遺伝子の任意のプロモータにおけるその対応する結合部位は随意に選択できるからである。さらに、そのような部位が天然の遺伝子、もっともしばしばプロモータの調節領域に存在することが示されている（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：３７４２−３７４７（１９９４）；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：５２１８−５２２２（１９９８）；およびＢｒａｍａｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９０：１７−２６（１９９７））。さらに、化学的に修飾されたＴＦＯｓは多くの付加的な種類のＤＮＡ配列を認識してもよい。たとえば、“架橋”または固定されたＴＦＯｓを持ついくつかのピリミジン残基により中断されたポリプリン伸長を標的にすることが現在可能である（Ｈｅｌｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：９４−１０２（１９９７））。また、トリプレックス認識スキ−ムは非天然塩基およびヌクレオチド類似体を持つＴＦＯｓを合成することにより拡大することができる。ＴＦＯを基礎にしたＡＴＦは、プロモータの都合のよいＴＦＯ結合部位を同定することを可能にする、ゲノムデ−タベ−スの最近の進歩および有用性を利用してもよい。本発明の一適用において、医学的興味のある遺伝子および適切な結合部位が同定され、したがって適切な親和性を有するＴＦＯ配列が合成される。
【００４０】
ＴＦＯｓに加え、人工（非ペプチド）ＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる他の分子クラスがある。本発明の少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインはペプチド核酸（ＰＮＡ）、すなわちホスフェ−ト骨格がペプチドに見出される骨格に類似したものにより置換されたＤＮＡの分子類似体である。ペプチド核酸はワトソン−クリック塩基対合により１本鎖ＤＮＡに結合することが可能で、ほぼヌクレオシドの様式で、ＤＮＡ／ＰＮＡ２本鎖に対してトリプルへリックスを形成することができる（Ｎｉｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：１６５−７０（１９９４）；Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−８（１９９３）；およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：２８４２−７（１９９９））。フレキシブルリンカーと結合する２本のＰＮＡ鎖からなるＰＮＡ“クランプ”は、ＤＮＡ２本鎖と非常に安定な複合体を形成することが可能で、ＴＦＯｓのように類似した種類のポリプリンおよびポリピリミジンＤＮＡ配列を標的にするように設計することができる。最近、“偽相補的ＰＮＡｓ”（ｐｃＰＮＡｓ）と呼ばれる新規世代のＰＮＡｓが合成された（Ｉｚｖｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１０９０８（２０００））。これらのＰＮＡｓは２重２本鎖侵入様式により、プリンおよびピリジミンの混合配列を含む、ＤＮＡ上に明示された位置を標的にする。ＰＮＡの骨格は荷電していないため、静電反発作用の欠如がＤＮＡとの強力で安定な複合体の形成を導く。また、ＰＮＡはＤＮＡより少ないモノマーユニットあたりの質量を有し、一般にオリゴヌクレオチドのホスフェ−ト骨格を攻撃することができる酵素による分解に耐性である。これらおよび他の性質がＰＮＡを、ＡＴＦ ＤＮＡ結合ドメインの非常に魅力的な選択物にする。
【００４１】
別の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは米国特許第５，８７４，５５５号に記載の、ポリアミド、たとえばポリピロ−ルおよびポリイミダゾ−ルのような、ペプチド類似体であってもよい。これらの部分は、ＤＮＡへリックスの小さい溝に結合すると考えられ、ポリアミドＤＮＡ結合ドメインを使用してＡＴＦで観察される活性化は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインを有するＡＴＦｓで観察される活性化ほど大きくない。ＤＮＡ２本鎖の小さい溝内でのＤＮＡ結合ドメインの結合の特質は、結合した転写エフェクタが転写装置を含む蛋白質と効率的に相互作用する能力を限定することができる。
【００４２】
さらに他の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは有機小分子を使用した、抗生物質または他の部分のような配列特異的な天然のＤＮＡ結合産物を含む、非蛋白質結合ドメインである。
【００４３】
エフェクタドメイン、Ｃは、基礎転写レベル（ｍＲＮＡ）の量の正（活性化因子）または負（抑制因子）の調節因子であってもよい。多くの機能的活性化因子および抑制因子ペプチドが既知であり、本発明のＡＴＦ分子において使用することができる。いくつかの態様において、エフェクタドメインはエフェクタとリンカー間に共有結合を形成する適切な化学結合基（たとえば、アミン、カルボキシルまたはチオール基）を含む（図１）。他の態様において、エフェクタドメイン、リンカーおよびＤＮＡ結合ドメイン（またはその亜成分）は一分子として合成され、そのため付加的な化学結合基は提供されない。
【００４４】
いくつかの態様において、エフェクタドメインはもっとも一般には、転写をアップレギュレ−トまたはダウンレギュレ−トする能力に関して選択されるペプチドである。ペプチドはＬ−またはＤ−アミノ酸のいずれかを含んでいてもよい。エフェクタを活性化する代表的な例としては、ＶＰ−１６、Ｏｃｔ−２、およびＶＰ−１６およびＯｃｔ−２の活性フラグメントが挙げられるが、それらに限定されない。少なくともいくつかの態様において、ＶＰ−１６ペプチドの２９−マ−または１４−マ−がとりわけ強い活性化作用を有することが示されている。
【００４５】
少なくともいくつかの態様において、より長いペプチドの活性化機能の、全部でなくても、大部分を含むより短いペプチドは、ＡＴＦ分子の一部として使用してもよい。より短いペプチドは、たとえば“コア”活性化因子のような、活性化因子ドメインの最も短いペプチド部分を決定することにより同定することが可能で、そのような部分はエフェクタドメインのサイズおよび質量を最小にするために、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて機能的のままである。
【００４６】
本発明の少なくともいくつかの態様において、Ｏｃｔ−２のグルタミンに富むドメインのような、活性化ドメインの他の一般型に由来するペプチドがエフェクタドメインとして使用される。１８アミノ酸ペプチドのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
【００４７】
【化３】

がＯｃｔ−２のコア活性化配列を形成することが示されている（Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｃｌｏｕｓｔｏｎ，Ｗ．Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：６０４６−５５（１９９４）；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４，６０５６−６７（１９９４））。この配列の２または３の直列反復は機能的な活性化ドメインを形成する。最近の報告は、８アミノ酸ペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
【００４８】
【化４】

が蛋白質ＤＮＡ結合ドメインに融合するとき、比較的強力な活性化ドメインを形成することを証明する（Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ．，ＬａＲｉｃｃｉａ，Ｌ．Ｍ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．＆Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８，１０８０−５（２０００））。
【００４９】
本発明の少なくともいくつかの態様において、ＡＴＦｓの有効性は１つのエフェクタ中に異なる活性化因子由来の最小活性化ドメインを結合させることにより促進される。これは転写活性化における協同作用を利用する。たとえば、同じプロモータに結合する２つの異なる活性化因子は、おそらく異なるクラスの活性化ドメインを、転写開始に関与する異なる共活性化因子と接触させることにより、それらのおのおのが単独で作用するより、比例した、より強力な作用を生じる（Ｂｌａｕ Ｊ．Ｘｉａｏ、Ｈ．，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｓ．，Ｏ’Ｈａｒａ，Ｐ．，Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，Ｊ．＆Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６，２０４４−５５（１９９６）；Ｈａｍｐｓｅｙ，Ｍ．＆Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ９，１３２−９（１９９９））。少なくともいくつかの態様において、Ｏｃｔ−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびＶＰ１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）活性化ドメイン由来のコア配列は、それらの有効性を最大にするための新しい配列で結合する。
【００５０】
また、エフェクタの形状は天然のポリペプチド鎖に限定されないことが企図される。少なくともいくつかの態様において、ポリグリコールスペーサが個々のコアペプチド配列間に導入される。このことは、分子量を著しく増加させずに、立体構造の柔軟性および他の蛋白質と相互作用する能力を増加させる。
【００５１】
いくつかの他の態様において、活性化ドメインのより低い質量および／またはより高い潜在能力は、２次構造を安定化させる非天然アミノ酸の取込により得られる。たとえば、短いアルファへリックス構造は側鎖ラクタムブリッジに側鎖を導入することにより安定化させることができる。これらの構造の制約条件が、より長い、非修飾ポリペプチド鎖の構造および活性の大部分を保持する、さらに短いペプチドを導いてもよい。本発明の少なくともいくつかの態様において、エフェクタは転写を抑制するために選択される。抑制因子ドメインの結合、すなわち抑制因子ＡＴＦｓの合成が企図される。天然の転写因子は一般に活性化ドメインまたは抑制ドメインを含み、いくつかの場合それらは活性化および抑制ドメインを共に含んでいてもよい（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚ．，Ｌｅｅ，Ｉ．Ｋ．Ｌｏｃｋｅ，Ｉ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．＆Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６，２４６４−７２（１９９８）；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｃｌｏｕｓｔｏｎ，Ｗ．Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：６０４６−５５（１９９４）；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４，６０５６−６７（１９９４））。抑制因子ドメインを含む転写因子は、活性化因子ドメインを含む転写因子と類似した様式で機能する、すなわち、それらは共に、ＲＮＡ転写にそれらの作用を及ぼすためにプロモータＤＮＡの近くにそれぞれのドメインを運ぶ必要がある（Ｐｔａｓｈｎｅ，“Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｗｉｔｃｈ：Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ ａｎｄ Ｈｉｇｈｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（１９９２）；およびＰｔａｓｈｎｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｏｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ“．Ｎａｔｕｒｅ ３８６：５６９−５７７（１９９７））。転写活性化因子とは対照的に、転写抑制因子のプロモータへの結合は、ＲＮＡ転写レベルの低下を生じる。この作用は、各種の異なる機序を通じての、ポリメラ−ゼＩＩホロ酵素複合体の構築による転写抑制因子ドメインの妨害により引き起こされる。これらの機序はヒストン脱アセチル化によるクロマチン構造の再配列から、活性化ドメインの作用の妨害までに及ぶ（Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ６，１９２−７（１９９０）。Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｐｕｔｎｅｙ，Ａ．，Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ，Ｆ．Ｅ．＆Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ａ．ＮＭｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４，９００−１４（２０００）；Ｂｕｓｃｈ，Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．，Ｂａｎｉａｈｍａｄ，Ａ．，Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．＆Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １１，３７９−８９（１９９７））。抑制因子ドメインは非常に多様で、構造の特徴をほとんど共有しないが、標的遺伝子転写に対するそれらの最終的な作用は大部分類似する。
【００５２】
ＡＴＦの概念に匹敵する多くの抑制ドメイン、たとえばショウジョウバエ転写抑制因子ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄおよびＫｒｕｐｐｅｌ由来の抑制ドメイン、およびヒト抑制因子蛋白質ＭａｄＩがある（Ｌｉｃｈｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｈａｎｎａ−Ｒｏｓｅ，Ｗ．，Ｒｅａｄｄｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｍ．Ａ．，Ｒｏ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｓｅｌ，Ｍ．，Ｓｈａｋｎｏｖｉｃｈ，Ｒ．＆Ｈａｎｓｅｎ，Ｕ．（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４，４０５７−６６；Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．Ｋ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ，Ｆ．Ｊ．，３ｒｄ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１，４５０９−１３；Ｈａｎ，Ｋ．＆Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７，４９１−５０３；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．＆Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，１４６２８−３３；Ｅｉｌｅｒｓ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｎ．，Ｌｉｕ，Ｊ．＆Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，３２７５０−６））。これらの抑制因子は異なる作用機序を有するが、それらはすべて以下の一様な特性を有する：（ｉ）多様な活性化因子を抑制し、結合部位から離れた位置で作用する能力；（ｉｉ）移動可能（異なるＤＮＡ結合部分に移動しても機能を維持すること）；および（ｉｉｉ）比較的小サイズ。たとえば、ヒト蛋白質ＭａｄＩ抑制ドメイン由来の１３アミノ酸ペプチドは、異種ＤＮＡ結合ドメインと融合すると抑制機能を与えることができる（Ｅｉｌｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｎ．，Ｌｉｕ，Ｊ．＆Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，３２７５０−６）。合成されたペプチド配列はこれらの抑制因子に由来し、活性化因子ＡＴＦｓに関して本明細書に記載され、示された抑制因子ＡＴＦｓを実質的に作製するために使用してもよい。
【００５３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ ｖｉｖｏにおける抑制に関する転写アッセイは、たとえばＡＴＦおよびＧＡＬ４結合部位を共に含む鋳型により行ってもよい。抑制因子ＡＴＦｓは、ＧＡＬ４−ＶＰ１６およびＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合した他の強力な活性化ドメインにより媒介される転写活性化を阻害する能力に関して試験される。あるいは、抑制に関するアッセイは、ＣＭＶ極初期エンハンサ−プロモータのような、基礎転写の構成的高レベルを有するプロモータ中に取り込まれたＡＴＦ結合部位を含む転写鋳型により行われてもよい（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ １０，４４０４−１１（１９９０））。この場合、ＡＴＦ抑制因子のプロモータへの結合はＲＮＡ転写を減少させ、そして転写活性化のための付加的な結合部位の存在は必要でない。
【００５４】
“人工抑制因子”という用語は、プロモータへの転写因子の結合の阻害に関与する研究方法を示すために使用されている（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７０−８１（１９９２）；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７２５−７３０（１９８９）；およびＬａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４５８−６３（１９９６））。これは、トリプルへリックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯｓ）、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）または同じ部位に結合する特定の転写因子に対抗するように設計された、いくつかの他の配列特異的非ペプチドＤＮＡ結合分子によりもっともしばしば得られる。“受動的”抑制因子という用語は、これらの既知の人工抑制因子分子およびそれらの作用様式を説明するために本明細書で使用される。受動的抑制因子に関するきわめて重要な必要条件は、その結合部位が指定の遺伝子の発現に必要な転写因子（またはいくつかの他の蛋白質）の結合部位に非常に近いか、または重複して位置することである。したがって、受動抑制は、これらのまれな重複結合部位の配列を含む天然のプロモータ上でのみ可能である。対照的に、本明細書に記載のように非ペプチドＤＮＡ結合部分への“活性な”抑制因子部分の結合は、人工抑制因子（抑制因子ＡＴＦｓ）による、より高い柔軟性および転写抑制の効率を与えるであろう。たとえば、プロモータのいずれかの部位への抑制因子ＡＴＦｓの結合は転写を抑制する、なぜならば、ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄまたはＫｒｕｐｐｅｌのような典型的な抑制ドメインは結合部位から長い距離にわたって作用することができるからである。したがって、上記の “受動的”抑制因子についてのように、プロモータ内の抑制因子ＡＴＦｓの結合部位の正確な位置はそれらの作用に関して重要ではない。そのため、抑制因子ＡＴＦｓは受動的人工抑制因子より多様な遺伝子のタ−ゲッティングを可能にする。言い換えれば、ＡＴＦ概念は予言可能な様式で標的遺伝子の転写を調節するための、プロモータへの“活性な”転写エフェクタ（活性化因子または抑制因子）の送達のための新しい方法として説明することができる。ＡＴＦｓは完全に人工（合成）分子であるため、本発明はプロモータへの送達、および完全に人工的な多様な化学部分が、選択された（標的）遺伝子の転写を調節するための能力の試験を可能にする。
【００５５】
ＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメインは、フレキシブルリンカー、Ｂを介して、結合（たとえば共有結合）する。本明細書のＡＴＦのリンカーＢ部分は、最小の長さおよび最大の柔軟性を有するため、ＤＮＡ鋳型上のプロモータの近くの認識部位にＤＮＡ結合ドメインが結合するとき、ＡＴＦの調節部分またはドメインはＤＮＡ鋳型から最小の距離内で比較的自由に拡散することが可能であり、細胞の転写装置の各種成分の表面、より具体的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の蛋白質成分の表面と分子的に相互作用をすることができる。あるいは、エフェクタは酵素または他の転写因子を調節する、ヒストン、ヒストン修飾酵素、または他の転写因子のような、転写調節に関与する他の蛋白質と相互作用してもよい。本発明の少なくともいくつかの態様において、リンカーはエフェクタ部分がＤＮＡの表面より上を自由に動けるような、柔軟性および長さを有する。
【００５６】
少なくともいくつかの態様において、本発明のフレキシブルリンカーは少なくとも長さ５オングストローム、１０オングストロームもしくは１５オングストローム、または少なくとも１５オングストローム、または少なくとも２０オングストローム、または少なくとも２８オングストロームである。リンカーの長さは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素または他の関連する蛋白質と相互作用（結合）するためにエフェクタドメインが近づきやすいように選択されてもよい。リンカーの長さは、とりわけ、ＤＮＡ鋳型におけるＤＮＡ結合ドメインの位置および配向性、またはエフェクタドメインの化学組成に依存して変化してもよい。リンカーは２つのドメイン間の鎖（骨格）に少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０原子を含んでいてもよく、そして５０まで、または１００原子までを含んでいてもよい。
【００５７】
結合基は、主に炭素、水素、窒素、酸素、硫黄およびリンからなる。適切なリンカーはポリグリコール、もしくは他のポリアルコキシ部分、またはヌクレオチドモノマー由来のオリゴマーのようなフレキシブル部分、天然または非天然アミノ酸および低級アルキル、ならびに好ましくは酸素含有有機部分を含む。リンカーは好ましくは低分子量、化学的に不活性および水溶性である。少なくともいくつかの態様において、リンカーは酸素含有部分であり、それは親水性を改善し、そして一般に薬物開発に好ましい。
【００５８】
リンカーはＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメイン間のフレキシブルな結合状態であり、他のドメインがそれらの意図した機能を果たしながら、２つのドメイン間の結合状態が存在するように選択される。リンカーは最適な幾何学的配置を可能にし、したがってＡＴＦｓの潜在的な生化学的活性を最大化するため、ＡＴＦ組成物の重要な成分である。リンカーはＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメインに共有結合した部分である。共有結合には、アミド、炭酸誘導体、エ−テル、有機および無機エステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素などのような各種官能基を使用してもよい。結合を提供するために、具体的なドメイン、たとえばＤＮＡ結合ドメインまたはエフェクタドメインが、たとえば酸化、ヒドロキシル化、置換、還元などにより修飾され、リンカーとの結合部位を提供してもよい。ドメインは、慣用のペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチド反応に感受性のある、反応性アミン、カルボン酸、ヒドロキシ、またはチオール基などで停止してもよい。ドメイン機能を著しく変化させないドメインに対する修飾が好ましいということは理解されるであろう。ドメインに依存して、リンカーを介してのカップリングに利用可能な多数の部位があってもよい。２つのドメインの細胞機能を妨害しない限り、いずれの適切なリンカーおよびリンカーカップリングを使用してもよい。
【００５９】
少なくともいくつかの態様において、自動化学合成でのＤＮＡまたはＰＮＡの合成中に、リンカーがＤＮＡまたはＰＮＡ鎖に容易に含まれてもよい。そのように取り込まれてもよい１部分は、ポリグリコールスペーサである。たとえば、ポリグリコールスペーサはＤＮＡ結合ドメインの末端に結合し、反応基は末端の第１アミンを生じる修飾されたチミジンの添加により、ポリグリコールリンカーの末端に提供される（図２を参照されたい）。
【００６０】
少なくともいくつかの態様において、リンカーをＤＮＡ結合またはエフェクタドメインのいずれかに結合させるために２官能橋かけ剤が使用される。適切な橋かけ剤は、２つの標的基を結合させることができる小さい２官能分子を含む。標的基は一般に上記の官能基である。代表的なチオール−チオール橋かけ基はジブロモビマンを含む。代表的なアミン−アミン橋かけ基はビス（スクシニミジルエステル）、たとえば５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）のビス（スクシニミジルエステル）、またはエチレングリコールビス（コハク酸）を含む。代表的なアミン−チオール橋かけ剤はアミン反応性マレイミドおよびヨ−ドアセチミド誘導体、たとえばスクシニミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ−ト、スクシニミジル３−マレイミジルベンゾエ−ト、スクシニミジル６−マレイミジルシクロヘキサノエ−ト、または４−ニトロへニルヨ−ドアセテ−トを含む。
【００６１】
アミンおよびカルボン酸基のカップリングも、最終産物に取り込まれない橋かけ剤、“ゼロ長”橋かけ剤により促進されてもよい。代表的な物質は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび２−エトキシ−１−エチキソカルボニル−１，２−ジヒドロキノリンを含む。
【００６２】
図２Ｂに図式で示した成分を使用して設計し、合成された代表的なＡＴＦを図２Ａに示す。ＤＮＡ結合ドメインは、修飾されたトリプルへリックス形成オリゴヌクレオチドに基づいて設計された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
【００６３】
【化５】

の２２塩基配列は、生理的ｐＨでトリプルへリックス複合体を形成することにより、対応する標的２本鎖配列に結合する（Ｓｋｏｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ Ｂｙ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２１３１−２１３８（１９９３））。長く（たとえば１５オングストロームより長い）フレキシブルなポリグリコールリンカーは自動化学合成により５’または３’末端のいずれかに導入された。これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
【００６４】
【化６】

およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
【００６５】
【化７】

の塩基配列を有する２つの分子を合成することにより得られ、そしてここでＸはＳｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８（ヘキサエチレングリコールスペーサ、Ｇｒｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２８２５ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ ２０１６４）を表し、そしてＹは短いテザ−上に第１アミン基を生じるチミジン残基を表す（Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６−ｄＴ，Ｇｒｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。この第１アミンは分子の残部に影響を与えない各種化合物と反応することができる。このことは、修飾された残基が各種機能的ドメイン（“エフェクタ”）のカップリングのための“アンカ−”として役立つことを可能にし、その活性はその後転写アッセイにおいて試験することができる。エフェクタは合成ペプチド、非天然ペプチド（天然に存在しないアミノ酸を有する）、または非ペプチド有機分子であってもよい。
【００６６】
本発明のＡＴＦｓは標的遺伝子の発現を調節することにおいて有用である。標的遺伝子は細胞により分泌されるいずれの遺伝子であってもよく、その結果コ−ドされた産物が随意に利用可能になってもよい（または抑制されてもよい）。多くの遺伝子の転写はｉｎ ｖｉｖｏで、正または負に調節されていることが見出されるが、しばしば“ハウスキ−ピング”として呼ばれる他の遺伝子の基礎レベルは細胞の寿命中、比較的一定であってもよい。さらに、任意の遺伝子の調節は、発達のある段階において正常細胞に発現されるときだけ、一時的に特異的であってもよいか、またはある組織または細胞または器官型において発現されるときだけ、組織特異的であってもよい。
【００６７】
ネスチン、またはＩＩ型コラゲナーゼのようなメタロプロテイナーゼの遺伝子のような、一時的に調節される遺伝子は、正常細胞では胎児発達中に発現されてもよいが、ネスチンの場合は脳腫瘍またはメラノーマにおいて、またはＩＩ型コラゲナーゼの場合には腫瘍の転移中にアップレギュレートされてもよい。あるいは、胚ヘモグロビンの遺伝子のような胎児遺伝子が、鎌状赤血球貧血のような各種貧血型疾患において、不十分な成人ヘモグロビンと置換するために現れてもよい。
【００６８】
これらおよび多くの他の適用のために、プロモータ特異的人工転写因子（活性化因子または抑制因子）、とりわけ薬物として、たとえば腫瘍特異的遺伝子を取り除くための負の人工調節因子として作用することができる低分子量のものが提供される。治療薬として有用なＡＴＦは、経口的に投与するため、および対象の標的細胞に透過するために十分低い分子量のものである。
【００６９】
医薬組成物
別の側面において、本発明は１以上の薬剤的に受容できるキャリアと一緒に製剤される、本発明の１以上のＡＴＦ組成物の治療的有効量を含む、薬剤的に受容できる組成物を提供する。本明細書に記載の医薬組成物および方法は本発明の１以上のＡＴＦ組成物を含んでいてもよい。
【００７０】
本明細書で使用する“治療的有効量”という句は、たとえば遺伝子発現の調節のような、意図した機能を生じる、ＡＴＦ組成物に対して有効な、ＡＴＦ組成物、またはそのようなＡＴＦ組成物を含む組成物の量を意味する。有効量は、治療または阻害される細胞増殖の型、ＡＴＦ組成物の具体的な型、対象のサイズ、または望ましくない細胞増殖または活性の程度のような因子に依存して変化してもよい。当業者は、前述の因子を研究し、不適切な実験をしないでＡＴＦ組成物の有効量に関する決定をすることができるであろう。
【００７１】
“薬剤的に受容できる”という句は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギ−反応、または他の問題もしくは合併症を起こさずに、ヒトおよび動物組織と接触しての使用に適した、適切な利益／リスク比に対応する、化合物、および／または剤形を含むＡＴＦ組成物を表すために本明細書で使用される。
【００７２】
本発明のＡＴＦ組成物は、遊離型、または適宜、塩型で存在してもよい。薬剤的に受容できる塩およびそれらの製剤は、当業者には公知である。そのような化合物の薬剤的に受容できる塩は、たとえば無機または有機酸もしくは塩基から形成される化合物の慣用の非毒性塩、または４級アンモニウム塩を含む。本発明の化合物は、水和物または溶媒和物を形成してもよい。荷電した化合物を水と共に凍結乾燥すると水和種を形成すること、または適切な有機溶媒と共に溶液中で濃縮すると溶媒和種を形成することは、当業者には既知である。
【００７３】
特定の疾患または状態の治療または予防に効果的である化合物の量は、疾患または状態の性質に部分的に依存し、標準臨床技術により決定することができる。さらに、至適投与量範囲を同定するのを容易にするためにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してもよい。効果的な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物試験系に由来する用量−反応曲線から推定してもよい。的確な投与量レベルは、主治医または他の健康管理者により決定されるべきであり、投与経路、ならびに年齢、体重、性および一般的な個人の健康状態；疾患の性質、重症度および臨床段階；付随する治療の使用（または不使用）；および患者の細胞の遺伝子工学的操作の性質および程度を含む、既知の因子に依存するであろう。
【００７４】
本発明はまた、医薬品パッケ−ジ、およびＤＮＡ結合ドメインに共有結合したフレキシブルリンカーを有する前駆体組成物を含む、１以上の成分を持つ１以上の容器を含むキットを提供し、ＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータ前駆体組成物において転写を調節するために十分な、ＤＮＡ鋳型上の部位への親和性を有するＤＮＡ結合ドメインは、転写における組成物の活性を評価するために、前駆体化合物を興味のある試験化合物と結合させるために使用することができる、反応性末端基を含む。キットはまた、ＤＮＡ鋳型を含む転写混合物、およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成する真核細胞ＲＮＡポリメラーゼを含む。場合により、本発明の方法に記載の前駆体組成物を使用するための取り扱い説明書がキットに付いていてもよい。
【００７５】
アッセイ
本明細書に記載の実験系を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的付加物の活性化または抑制の可能性を試験するために使用してもよい；しかし、本明細書に記載の本発明の付加的な態様はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを含む。本明細書に記載の実験系は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで共に使用することができる線状（一般にｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ）または環状プラスミド鋳型からの転写を活性化する。たとえば、プロモータＤＮＡへのＡＴＦの結合は環状（プラスミド）ＤＮＡ転写鋳型を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ、得られた予め形成されたＡＴＦ−鋳型複合体は、トランスフェクション、エレクトロポレ−ション、リポソ−ム補助技術などを含む各種形質転換法により組織培養に導入される。開始部位から下流に転写されるレポーター遺伝子からｉｎ ｖｉｖｏで生じたＲＮＡ転写物（すなわち、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど）の定量が、試験されるＡＴＦの活性を明らかにする。あるいは、転写鋳型を有する安定なプラスミドを含む細胞の試料がＡＴＦにより処理される。この場合、鋳型プロモータの対応する部位へのＡＴＦの結合はｉｎ ｖｉｖｏで起こる。比較的小さく、一般に非ペプチド分子であるため、ＡＴＦはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる透過に類似した様式で細胞膜を透過する。ＡＴＦの存在下および非存在下における細胞のレポーター遺伝子活性は、転写活性化または抑制の程度を表す。
【００７６】
本発明のＡＴＦは、転写調節因子としての活性に関して試験化合物をアッセイするための方法に使用される。方法は以下のことを含む：試験組成物を提供するためにＤＮＡ結合ドメインに共有結合するフレキシブルリンカードメインに試験化合物を共有結合させること（ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータにおける転写を調節するために、ＤＮＡ鋳型上の部位に十分な親和性を有する）；ＲＮＡが合成されるように、ＲＮＡ合成に適切な条件下で、ＤＮＡ鋳型、他の蛋白質を介して直接的、または間接的に試験組成物およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成することができる真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子、バッファーおよび基質を含む転写混合物を試験組成物と接触させること；および試験組成物の非存在下での基礎レベルに比較して、試験組成物存在下で産生されたＲＮＡの量を測定すること、ここでＲＮＡの量は転写活性化因子としての試験組成物の活性の尺度である。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合部位は複数の結合部位配列の反復である
合成されたＲＮＡは任意の慣用の検出系を使用して定量してもよい。ＲＮＡ産物の定量のためのそのような系は、先行技術で公知である。
【００７７】
本発明のＡＴＦ組成物は先に記載の治療的適用だけでなく、新規ＡＴＦｓのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング系を開発するために使用してもよい（ｉｎ ｖｉｖｏでのトランスジェニック細胞の的確な調節）。たとえば、安定なトランスフェクトされた細胞系統を、一過性のトランスフェクション（以下のｉｎ ｖｉｖｏ実験において本明細書に記載される）のかわりに、染色体に導入されたレポーター構築物により作製してもよい。したがって、任意の新規ＡＴＦをこのレポーター遺伝子を活性化するか、または抑制する能力に関して試験してもよい。また、内因性遺伝子を標的として使用してもよいが、この場合シグナルはＤＮＡアレイ（チップ）上で検出される。
【００７８】
高密度ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（“ＤＮＡチップ”）は多くの異なる遺伝子の発現を同時にモニターし、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイの拡大を可能にする、なぜならそれは個々のＡＴＦ設計の有効性についての手がかりを提供できるからである。たとえば、組織培養細胞のＡＴＦによる処理後の遺伝子発現パタ−ンの初期の変化のモニターは、ＡＴＦによりどの遺伝子が直接影響されるかを明らかにする。ゲノムにおけるＡＴＦ標的はプロモータの配列についての事前の知識なしに同定することができる。遺伝子発現の相対的レベルはまた、個々のエフェクターの活性に関する有用な情報を提供する。この様式において、将来における可能な医学的適用のための潜在的な遺伝子標的の同定とともに、ＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメインの両方が同時に非常に詳細に特徴付けられる。マイクロアレイ解析は１つの細胞型に限定されない；酵母からヒトまでの多くの多様な真核細胞のための検出キットが市販されている（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）．
本発明のＡＴＦ組成物は上記のような各種適用に使用してもよく、とりわけ遺伝子治療において使用してもよい。多くの例において、随意に治療遺伝子のスイッチをオンまたはオフする能力、または正確に発現を滴定する能力が治療効果にとって重要である。本発明は、ヒト遺伝子治療において治療標的遺伝子が調節された発現を行うためにとりわけよく適する。
【００７９】
本発明はさらに以下の実施例において説明され、それらは説明のためだけに提供され、本発明を限定することを意図せず、明細書に続く請求項において完全な範囲が示される。
【００８０】
実施例
実施例１．ＡＴＦの設計および合成
これらの実験において、エフェクタドメインは、天然に見出される最も強い転写因子の一つである単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６の十分に研究された活性化ドメインに由来する一連の合成ペプチドであった。これらのペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
【００８１】
【化８】

の２９アミノ酸配列を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のＶＰ１６アミノ酸配列の２つのコピーに結合したシステイン残基を有する。ＶＰ１６アミノ酸の２重コピーを含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合したとき、全長ＶＰ１６の活性の約７０％を保持する（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｏｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｒｅｍｏｔｅ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ） Ａｎｄ Ｐｒｏｘｉｍａｌ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４９６１−４９６８（１９９２）；およびＮｙａｎｇｕｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３４０２−１３４０６（１９９７））。チオールを持つシステイン残基はアミノ末端に添加され、ＡＴＦ分子の残部に結合するための結合点となる。
【００８２】
すべてのペプチドは標準ＦＭＯＣ化学を使用して、自動ペプチド合成機上により合成された（Ｂａｒｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ Ｗｉｔｈ Ａ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ Ｓｕｆｆｉｃｅｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ８１：３５９−３６８（１９９５））。ペプチドとオリゴヌクレオチドの化学的結合はＦｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから得た２官能橋かけ剤、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル６−マレイミジルヘキサノエ−トの使用により行った（図２Ａを参照されたい）。この市販の橋かけ剤は６炭素鎖で隔てられた２つの官能基を有し：コハク酸のエステルは特異的に第１アミンと反応し、そしてマレイミド官能基はある条件下でチオールと特異的に反応する。カップリング反応は連続した段階で行われた。２つの基のうちエステル基はより不安定なため、橋かけ剤は初めにオリゴヌクレオチドの第１アミンと結合する。過剰な橋かけ剤はクロロホルム抽出およびエタノ−ル沈殿により除去された。第２の段階はペプチドのチオール基と橋かけ剤のマレイミド官能基間の反応に関連した。過剰なペプチドおよび未反応ＤＮＡの結合物の精製は逆相ＨＰＬＣにより行った。精製されたアリコ−トは凍結乾燥機で乾燥し、続いて超純粋（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に溶解し、−７０℃で保存した。
【００８３】
実施例２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写アッセイ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の配列を有する２つの２６塩基オリゴヌクレオチド５’をアニーリングし、結合させて、トリプルへリックス形成のための複数の結合部位を含む一連の２本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の２本鎖に示された部位の５コピーを含むフラグメントはアガロースゲル電気泳動により精製し、ＧＳＥ４Ｔシリーズの転写鋳型の態様のポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入された。
【００８４】
図３は転写鋳型のプロモータ領域を示す。図３Ａでは、対照鋳型は調節された転写のためのプロモーターを含み、＋１転写開始部位に関してそれぞれ−５３および−１５５ｂｐにおいて５ＧＡＬ４および５ＡＴＦ結合部位は当該プロモータに取り込まれており；そして図３Ｂでは、ＡＴＦアッセイ鋳型は−６５ｂｐにおいて取り込まれた５ＡＴＦ結合部位を含む。
【００８５】
得られたプラスミドは、ＥｃｏＲＩによる消化により線状にし、精製し、そして線状鋳型は超純粋中に−２０℃で保存した。転写アッセイは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１００ｍＭ ＫＣｌを含む結合バッファー中、ＡＴＦｓと２００ｎｇの線状転写鋳型を室温で２４時間インキュベートすることにより開始した。結合反応の総容積は５マイクロリットルであった。結合反応後、塩およびバッファー状態を水５マイクロリットル、１Ｘ ＨｅＬａバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２０％ グリセロール）６マイクロリットル、およびにＨｅＬａ核抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）５マイクロリットルの添加により調整した。ＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質のアリコート（全部で１マイクロリットル）を対照鋳型に添加し、すべての反応物を３０℃で１０分間インキュベートした。転写はリボヌクレアーゼトリホスフェ−ト（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）および^３２Ｐ−α−ＵＴＰ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）０．５マイクロリットルの混合物１マイクロリットルの添加により開始した。さらに３０℃で３０分間インキュベーション後、すべての転写反応は停止バッファー（０．５Ｍ 酢酸ナトリウム、０．２％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１マイクログラム／ｍｌ グリコーゲン、１マイクログラム／ｍｌ プロテイナーゼＫ）１００マイクロリットルの添加により停止した。反応物を撹拌し、３７℃で１０分間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽出し、氷冷エタノール２５０マイクロリットルで沈殿させた。ペレットを標準変性用ホルムアルデヒド／色素混合物２０マイクロリットルに溶解し、変性用６％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、流した。
【００８６】
結果は図４に示す。レーン１およびレーン２は対照鋳型由来の対照融合蛋白質ＧＡＬ４−ＶＰ１６による活性化を示し（図４Ａ）、他のすべてのレーンはＡＴＦアッセイ転写鋳型由来のＡＴＦによる活性化を表す。各試料の正しい開始部位で開始された２５０塩基転写物を以下に示す。レーン１は対照転写鋳型由来の任意の転写因子非存在下での基礎転写のレベルを示す。レーン２は対照融合蛋白質ＧＡＬ４−ＶＰ１６の添加が、対照鋳型からの著しい転写量の増加を生じることを示す。レーン３はＡＴＦアッセイ転写鋳型由来の基礎転写を示す。レーン４〜７は予想されるように、ＡＴＦ値の増加量の関数としての転写活性化を示す。レーン５、６、および７はレーン４よりそれぞれ５倍、１００倍および５００倍多いＡＴＦを含む。曲線は“ベル曲線”反応における結果を示す。ＡＴＦの至適濃度（レーン５）において、転写活性化のレベルは対照活性化因子蛋白質ＧＡＬ４−ＶＰ１６存在下において対照鋳型から観察された活性化の最大レベルより高くはないとしても、それに相当する。
【００８７】
図４の結果は、天然の活性化因子ＶＰ１６はＧＡＬ４結合部位に結合して融合ＧＡＬ４−ＶＰ１６を生み出し、５ＧＡＬ４結合部位を含む対照鋳型からの転写を強力に活性化したことを示す。＋１転写開始部位で開始された流出転写物は２５０ｂｐ長である（図４の矢印で示される）。同時に、ＡＴＦ（２９）はプロモータ中に５ＡＴＦ結合部位を含む鋳型からの転写を活性化することができる。ＡＴＦ（２９）は対照鋳型または他のＡＴＦ結合部位を欠如する鋳型からの転写を活性化しないため、その活性は、プロモータの対応する結合部位の存在に完全に依存する（データは示さない）。ＲＮＡ転写物の比較は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６およびＡＴＦが共にＴＡＴＡボックスに隣接するプロモータの同じ、“正しい”（＋１）部位から転写を開始することを確証する。もっとも意外なことには、ＡＴＦ（２９）による転写活性化の最大レベルはＧＡＬ４−ＶＰ１６により得ることのできるレベルに匹敵した。たとえば、ＲＮＡ転写物の定量は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６およびＡＴＦ（２９）が基礎レベルの３０〜４０倍転写を活性化することを示す（図４）。この結果は以前報告された５ＧＡＬ４結合部位を含む線状鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＡＬ４−ＶＰ１６による転写活性化の最大レベルに対応する（Ｈａｉｌｅ，Ｄ．Ｔ．＆Ｐａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４，２１１３−７）。これらの活性化のレベルはＡＴＦ濃度２０〜４０ｎＭ間で得られ、濃度のそれ以上の上昇は活性化の減少を導く（図４）。このデ−タはまた、強力な天然の活性化因子とＡＴＦとの別の類似性：転写活性化を“抑制する”能力を示し、これはおそらく過剰な強力な量の活性化因子による転写装置の標的成分の隔離によるものであろう（Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３５，６８３−９）。活性化および抑制能は共に結合するＡＤペプチドの存在に完全に依存する。なぜならＡＤを欠如する“切断”ＡＴＦｓは完全に不活性であることが証明されたからである。
【００８８】
Ａ．十分に機能的で、非常に強力なＡＴＦｓ．
遺伝子産物を標的にする多くの成功した薬物があるが、遺伝子自体の薬剤的タ−ゲッティングのための効果的で実用的な方法は今まで存在しない。転写レベルでの遺伝子発現の操作は、基礎的な調節機序が大部分の真核細胞遺伝子に共通であるため、薬物開発に高い可能性を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｇ．（２０００）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５７，１１４９−６０）。原則として、特定の遺伝子の転写を調節するために設計された小分子薬物は、そのＤＮＡ結合部分をわずかに修正することにより、異なる遺伝子に類似した作用を引き起こすことができる。したがって、特定の遺伝子を活性化または抑制することができる細胞透過性薬物は、医学的に興味のある多くの異なる遺伝子に適用可能な、一般的な治療方法の基礎を形成することができる。
【００８９】
この分野の進歩は、効果的なＡＴＦを設計することが主な難問であるという事実により妨げられてきた。たとえば、合成ペプチドとポリアミドＤＮＡバインダ−を結合させる以前の試みは、最小の溝によりＤＮＡに結合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは非常に低い活性を示す転写活性化因子を生じた（Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ．，上記）。これらの研究はＧ−ｌｅｓｓカセットを含むレポーター遺伝子だけを使用するため、ＲＮＡの全体的な増加が特異的または非特異的（すなわち、任意）転写開始によるためであるか否かは明らかでない。
【００９０】
しかし、ＡＴＦの新規手段としての有用性を示し、初めての実用的適用を開発するためには、一般に使用される天然の転写因子の生物学的活性および特異性に近いものを得ることが必要である。本研究の結果は、（ｉ）正しい部位からのＲＮＡ転写を開始し、そして（ｉｉ）ＧＡＬ４−ＶＰ１６のような強力な転写活性化因子蛋白質に匹敵する生物学的活性を有する、十分に機能的なＡＴＦを設計することが可能であることを初めて示した。
【００９１】
Ｂ．活性化の効果はＡＴＦの化学構造に依存する。
非常に強力なＡＴＦの設計は、いくつかの分子設計および合成の繰り返しにより行われた。いずれか特定の機序に束縛されることなく、リンカーの化学構造（とりわけ、長さおよびフレキシビリティ−）は転写装置へのエフェクタの最適な提示において重要な役割を果たすと考えられる。すなわち、長くフレキシブルなポリグリコール鎖とより剛性で疎水性のヌクレオチド−橋かけ剤構造との組合せは転写因子の分子形状をとりわけよく模倣することができると考えられる。実際、図３および４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写アッセイは、ＡＴＦｓがＧＡＬ４−ＶＰ１６よりいっそう強力な転写活性化因子であってもよいことを暗示する。たとえば、ＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質はダイマーとしてプロモータの５部位のそれぞれに結合するが、ＡＴＦ分子はモノマーとして対応するトリプル−へリックス標的部位に結合する（Ｃａｒｅｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０９，４２３−３２）。しかし、プロモータに結合した５ＡＴＦ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０ＧＡＬ４−ＶＰ１６分子に匹敵する類似した転写への作用を引き起こす（図４）。ＡＴＦ分子のこの高い効力は、かさ高い蛋白質ドメインを持たないため、エフェクタがより多く暴露されたまま、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素および／または他の蛋白質と相互作用する、単純に伸長した化学構造のためであってもよい。暴露されたエフェクタは、事実上プロモータへのホロ酵素の補充およびＲＮＡ転写の開始を促進するであろう。この結論は、ＶＰ１６由来の１４−マーペプチド（図２Ａ）が組換えＤＮＡ技術によりＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合したとき不活性であることを示す以前の仕事に一致する（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記）。対照的に、本研究は同じ１４マーペプチド配列がＡＴＦの環境内で著しい生化学的活性を示すということを示した。
【００９２】
実施例３．ＤＮＡ結合ドメインの３’末端に共有結合したリンカーを有するＡＴＦ
強力な正の転写エフェクタである（図４、レーン３〜７）図２ＡのＡＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインの５’末端を介してリンカーＢに共有結合したＤＮＡ結合ドメインＡを有する。ポリリンカーは３’末端に結合し、そしてこのＡＴＦも強力な正の転写エフェクタ活性を示した（図４，レーン８〜９）。レーン８は３’Ａ−Ｂ−Ｃ構造ＡＴＦにより媒介される転写を示し、レーン９は量が５倍増加した転写を示す。鋳型に対する任意のエフェクタの非存在下における基礎レベルを示すレーン３に見られる２５０ｂｐ流出転写物の量と比較したレーン８の量は、活性化ドメインへのフレキシブルポリリンカーの共有結合が強力なＡＴＦである形状を提供することを示す。〔リンカーの存在は、他の形状と対比したとき、正の機能における役割を果たす（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．，上記）。〕 実施例４．Ｌ−およびＤ−アミノ酸活性化ドメインならびに３’および５’結合ＤＮＡ結合ドメインを有するＡＴＦ。
【００９３】
本実施例は本発明のＡＴＦ組成物の多能性を示し、ドメインに対する活性化因子の両Ｌ−およびＤ−版ならびに３’および５’結合ＤＮＡ結合ドメインの機能を証明する。
【００９４】
Ａ．ＡＴＦｓの合成
ＴＦＯへのリンカーの導入はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（５’ＡＴＦｓに対して）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（３’ＡＴＦｓに対して）の配列を有する２つの分子を合成することにより行われ、ここでＸはＳｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を表し、Ｙは短いテザ−上の第１アミン基を持つ修飾されたＴ残基を表す（ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ２−ｄＴ，Ｇｌｅｎｎ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【００９５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸の配列を有する２９マーペプチドの２つの異なる形状（Ｌ−およびＤ−）の合成は標準法により行った（Ｎｙａｎｇｕｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１３４０２−６（１９９７）；およびＳｔａｎｏｊｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：４５０−４５７（１９９５））。ＡＴＦ分子の残部へのペプチドの化学結合は、実施例１に記載のように、２官能橋かけ剤、スクシニミジル６−マレイミジルヘキサノエートの使用により行った（ＥＭＣＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。
【００９６】
Ｂ．転写アッセイ．
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のための鋳型は、ＧｎＥ４Ｔ系列の転写鋳型のポリリンカーにおけるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位へのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
【００９７】
【化９】

の配列を有するトリプルへリックス結合ＤＮＡ配列の５直接反復の挿入により作製された（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５Ａ：６５９−６６４（１９８８））。プラスミドは、ＥｃｏＲＩおよび／またはＨｉｎｄＩＩＩによる消化により線状にし、鋳型へのＡＴＦｓの結合は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、４０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１００ｍＭ ＫＣｌを含む結合バッファー中で、ＡＴＦｓと２０〜１００ｎｇの線状ＡＴＦ転写鋳型を室温で２４時間インキュベートすることにより開始した。ＡＴＦｓとプロモータ間の至適複合体形成のために十分なインキュベーション時間が与えられた。次に希釈したＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質のアリコ−ト（全部で１マイクロリットル）を対照鋳型に添加し、すべての反応物を３０℃で１０分間インキュベートした。転写反応は標準法（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）を使用してＨｅＬａ粗核抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに行った。最終ＲＮＡ転写物を６％変性用ポリアクリルアミドゲル上で分析した。乾燥したゲルをＫｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＳフィルムおよびＦｕｊｉ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ｐｌａｔｅｓの両方に暴露した。シグナルの定量はＦｕｊｉ ＭａｃＢＡＳソフトウェアにより行った。
【００９８】
図５は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６ならびに次のＡＴＦｓ：３’ＡＴＦ、５’ＡＴＦ（Ｄ）および３’ＡＴＦ（Ｄ）による転写活性化の並列比較を示す。レーン２、４、５、６および７の比較は、ｉｎ ｖｉｔｒｏですべてのＡＴＦｓが少なくともＧＡＬ４−ＶＰ１６と同様に強力に転写を活性化できることを示す。３’ＡＴＦおよびＧＡＬ４−ＶＰ１６による活性化の比較は、３’ＡＴＦも転写に非常に強力な効果を有することを示す。わずかに異なる化学的形状を有するにもかかわらず、５’ＡＴＦと３’ＡＴＦはそれらの生物学的作用、すなわち活性化強度および抑制能力において非常に類似する。さらに、図５の結果は、Ｄアミノ酸からなる活性化ドメインにより合成されたＡＴＦｓも強力な転写活性化因子であることを示す。５’ＡＴＦ（Ｄ）および３’ＡＴＦ（Ｄ）は共に正しい開始部位から転写を活性化し、他のＡＴＦｓまたはＧＡＬ４−ＶＰ１６により生成された２５０ｂｐ ＲＮＡ転写物と実際に区別ができない転写物を生じることは明白である。活性化強度の点から、両５’ＡＴＦ（Ｄ）は他のＡＴＦｓおよびＧＡＬ４−ＶＰ１６に匹敵する。
【００９９】
実施例５．ｉｎ ｖｉｖｏ転写
Ａ．ＡＴＦの合成．
ＡＴＦ分子は実質的に実施例１に記載のように作製した。ＡＴＦ構造は、生理的ｐＨで標的ＤＮＡと安定なトリプルへリックス複合体を形成することが示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の２２−マートリプルへリックス形成オリゴヌクレオチド〔ＴＦＯ〕を包含した。長くフレキシブルなポリグリコールリンカーはおのおののＴＦＯの５’末端近くに挿入される。リンカーの遠位末端は、短い２炭素鎖テザ−上に第１アミン基を含む修飾されたチミジン残基を持つ。この第１アミンは転写活性化ドメイン（ＡＤ）のカップリングのためのアンカー部位として役立つ。ＡＤは単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来の２９−マー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）または１４−マーペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）配列からなる。チオールを持つシステイン残基はアミノ末端に取り込まれ、ＡＴＦ分子の残部と共有結合する。ＡＴＦ分子の残部へのペプチドの化学的結合は２官能橋かけ剤により行われた。カップリング反応は、２９アミノ酸ＶＰ１６ペプチドを持つＡＴＦ（２９）および１４アミノ酸ＶＰ１６ペプチドを持つＡＴＦ（１４）の２つのＡＴＦ分子の形状を生じた。
【０１００】
Ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏＡＴＦ活性化
ｉｎ ｖｉｖｏで転写を活性化するＡＴＦｓの能力は、ＢＨＫ−２１培養細胞における一過性共トランスフェクションアッセイにより試験した。対照鋳型として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の発現をおこす、最小ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータを含むレポーター構築物を使用した。転写鋳型は、対照鋳型プロモータ上流のポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位間におけるＡＴＦ結合部位の５コピーを持つオリゴヌクレオチドを組み込むことにより構築した（図６Ａ）。トランスフェクション混合物は、１マイクログラムのプラスミドＤＮＡおよび５０ｎＭ ＡＴＦｓを包含した。トランスフェクションはポリカチオン性脂質ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．）を使用することにより行った。細胞はトランスフェクション４８時間後に採取し、ＣＡＴアッセイは基質としてＦＡＳＴ ＣＡＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行い、Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上で視覚化し、定量した。図６Ａに示した各レポーター構築物はＡＴＦ分子と共におよびＡＴＦ分子を伴わないで細胞にトランスフェクトし、活性化シグナルを標準法により測定した。
【０１０１】
図６Ｂおよび６Ｃに示した結果は、ＡＴＦ（２９）が転写を基礎レベルの５倍活性化することを示す。同時に、ＡＴＦ（１４）は同じ鋳型から約３０倍の転写活性化を引き起こした。いずれのＡＴＦもＡＴＦ結合部位を欠如する対照鋳型の転写を活性化することができないため、この作用は配列特異的である。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイと同様に、無傷のＡＴＦ構造が同様にｉｎ ｖｉｖｏで機能するために必要である；すなわち、結合ペプチドを持たないＡＴＦｓはいずれの鋳型からの転写も活性化することができなかった。
【０１０２】
組織培養細胞における共トランスフェクションアッセイの結果は、細胞内環境における実質的なＡＴＦｓの生化学的活性を初めて示し、さらに本発明者らの設計の有効性を確証する。ＡＴＦｓはプロモータに結合し、組織培養細胞に導入したとき、レポーター遺伝子からの転写の強力（３０倍まで）で配列特異的な活性化を引き起こす（図６Ｂおよび６Ｃ）。ｉｎ ｖｉｖｏでＡＴＦ（２９）よりずっと強力な作用を引き起こすＡＴＦ（１４）の見かけの能力は、細胞透過性の差のためであると考えられる。ＡＴＦ（１４）はより低い静電荷を持つより短いペプチドエフェクタを含むため、より長いＡＴＦ（２９）に比べ高い細胞透過性を有すると予想される。ＡＴＦにより得られる転写活性化の程度は、具体的な実験手順の状況において考慮すべきである。すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは合成および天然の転写因子間の直接比較ができるが、組織培養アッセイにおいてそのような実験を解釈することは非常に困難であろう。すなわち、トランスフェクションアッセイは生細胞へのＧＡＬ４−ＶＰ１６発現構築物の導入を必要とし、結果として細胞内におけるＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質の継続的な合成を起こす。これは、一般に実験の開始における細胞膜からの導入とは明らかに異なる。したがって、実験の経過にわたり天然対合成活性化因子の細胞内濃度を較正することは非常に難しいであろう。
【０１０３】
実施例６．低分子量の潜在的薬物を試験するための方法
ＶＰ１６アミノ酸配列を有する、本明細書に記載のＡＴＦｓの態様の有効性および可能性は、ＡＴＦのＶＰ１６由来エフェクタドメインのかわりにフレキシブルポリリンカーへの付加物として共有結合した、活性化因子化学部分を変化させることにより、各種化合物を転写アッセイにおいて試験することができる。これらの化合物は３，０００より少ないか、または１，５００より少ない分子量を有する、低分子量潜在的薬物を含んでいてもよい。予備的な結果は、多様な分子が活性化または抑制ドメインの機能を模倣することが可能であってもよいことを暗示する。たとえば、１以上の天然に存在しないＤ−アミノ酸を使用して合成された２９アミノ酸ＶＰ１６配列は、天然のＬ−アミノ酸残基から作られた配列と比べ多少の活性化能力を示す（図５）。本明細書に記載の方法を使用すれば、転写を活性化または抑制する能力は、ペプチドおよび非ペプチド分子からなる構造を有する部分に、および効果的な活性化または抑制ドメインであることに限定されないことが示されうる。
【０１０４】
本明細書で考察した他の潜在的なＡＴＦｓのＤＮＡ結合ドメイン、ならびにリンカーおよび小分子エフェクタドメイン候補の非ペプチド性は、治療薬剤的可能性を持つ、より小さい細胞透過性分子の開発を可能にする。本明細書のＡＴＦの態様の化学構造および組成は転写レベルでの遺伝子発現の操作のための新規薬物クラスの開発、またはスクリーニングにおける出発点として役立ってもよい。
【０１０５】
当業者は慣用の実験法を使用して、本明細書に記載の具体的な物質および方法に対する多くの等価物を認識するか、または確かめるであろう。そのような等価物は本発明の範囲内であるとみなし、以下の請求項により包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は本発明の３部分からなるＡＴＦの図による説明である。ＡＴＦはＤＮＡ結合ドメイン（Ａで示す）、フレキシブルリンカー（Ｂ），およびエフェクタドメイン、たとえば活性化因子ドメイン（Ｃ）の３成分を有する。
【図２】
図２は（Ａ）本発明のＡＴＦおよび（Ｂ）本発明の少なくともいくつかの態様におけるＡＴＦ合成のための１つの可能なスキ−ムを示す。
【図３】
図３は転写鋳型のプロモータ領域を示し、ここで：（Ａ）対照鋳型はプロモータ中に、＋１転写開始部位に関して−５３および−１５５ｂｐにおいてプロモータに取り込まれた５ＧＡＬ４および５ＡＴＦ結合部位を含み；そして（Ｂ）ＡＴＦアッセイ鋳型は−６５ｂｐにおいて取り込まれた５ＡＴＦ結合部位を含む。
【図４】
図４は以下のように同定された各レーンの内容を含む、ＡＴＦの存在下および非存在下における流出転写生成物のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す：レーン１は図２Ａの対照転写鋳型由来の低レベルの基礎転写を示す；レーン２は対照鋳型上のＧＡＬ４−ＶＰ１６融合蛋白質により活性化された２５０塩基転写物を示す；レーン３は図２ＢのＡＴＦアッセイ転写鋳型由来の基礎転写を示す；レーン４〜７はＡＴＦアッセイ転写鋳型由来の転写に対する図１のＡＴＦの作用を示し、レーン４は最小量のＡＴＦを有し、そしてレーン５はレーン４より５倍多いＡＴＦを有し、レーン６はレーン４より１００倍多いＡＴＦを有し、そしてレーン７はレーン４より５００倍多いＡＴＦを有する。レーン８および９は活性化ドメインに共有結合したポリリンカーを有するＡＴＦの作用を示し、ポリリンカーはＡＴＦ試験鋳型の転写に対してＤＮＡ結合ドメインの３’末端に結合する。レーン９はレーン８より２０倍多いＡＴＦを有する。
【図５】
図５は転写活性化因子ＧＡＬ４−ＶＰ１６、３’ＡＴＦ、５’ＡＴＦ（Ｄ）および３’ＡＴＦ（Ｄ）に関する流出転写生成物のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。
【図６】
図６は以下のものを示す：（Ａ）転写鋳型がプロモータ中に５ＡＴＦ結合部位を含む、共転写アッセイで使用されたレポーター構築物、（Ｂ）ＢＨＫ−２１が転写鋳型のみと（レーン１および２）、またはＡＴＦ’ｓと組み合わせて（レーン３〜６）共トランスフェクトされる、代表的なＣＡＴアッセイ、および（Ｃ）それぞれデュプリケ−トで行われた３回の実験のＡＴＦによる転写活性化の平均倍数の棒グラフ；誤差の線はＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。[0001]
Government funding
This invention was made in part with a government grant IR41 GM57712-01 awarded to the inventors by the National Institute of General and Medical Sciences. The government has certain rights in the invention.
[0002]
Cross reference to related application
The present application claims 35 U.S.C. S. Provisional application U.C., entitled "Artificial Transcription Factors and Methods of Use," filed October 13, 2000, claiming priority under section 119 (e). S. S. N. 60 / 240,479 is a continuation-in-part application.
[0003]
Background of the Invention
The present invention relates to the regulation of gene expression, particularly to the design and synthesis of compositions useful as artificial transcription factors (ATFs). The invention also relates to the use of such molecules as novel therapeutics that regulate gene expression at the level of RNA transcription, as a means for target validation in gene regulation and functional genomics, and in drug development.
[0004]
Key steps in eukaryotic cell genome regulation include the activation and repression of RNA synthesis by transcription factors. Transcription factors are regulatory proteins that contain at least two functional moieties: a DNA binding domain and an activation or repression (ie, “effector”) domain (Ptashne, “A Genetic Switch: Phase Lambda and Higher Organisms. Cell and Blackwellwell.” And Ptashne et al., Nature 386: 569-577 (1997)) In general, DNA binding domains anchor transcription factors to promoters by interaction with specific DNA sequences. Domains include TATA-BOX binding protein (TBP) and TBP-related proteins, proteins including RNA polymerase II holoenzyme, co-activation Involved in interactions with other proteins involved in RNA transcription, such as codons, co-suppressors, histones and histone modifying enzymes (Blau, J et al., Mol Cell Biol 16, 2044-55 (1996); Brown, SA, et al. EMBO J 17, 3146-54 (1998); Collingwood, T. N., Umov, FD & Wolfe, APJ Mol Endcrinol 23, 255-75 (1999). These protein-DNA and protein-protein interactions promote or inhibit the assembly of the transcriptional machinery in the promoter, thus activating or repressing the synthesis of RNA encoded by the regulated gene (Koleske et al.). , "The RNA Polymeras II Holoenzyme And Its Implications For Gene Regulation ".Trends Biochem.Sci.20:. 113-116 (1995); Hampsey, M & Reinberg, D.Curr Opin Genet Dev 9,132-9 (1999)).
[0005]
Therefore, the experimental data reported strongly suggest that the effector domain is functionally independent of the DNA binding domain. For example, the activation domain of one transcription factor can bind to the DNA binding domain of a different factor. Such hybrid molecules retain their characteristic functions across organisms ranging from yeast to human cells, suggesting that basic regulatory mechanisms are common to a variety of eukaryotic cells (Brent et al. al., Cell 43: 729-736 (1985)). Thus, the DNA binding and effector domains may be considered as a completely separate, functional structural entity taken together as a bifunctional molecule.
[0006]
Conceptually, the molecular structure of the transcription factor implies that each transcription factor molecule may simply be considered a bidentate ligand, where one of the ligands (the DNA binding domain) is sequence-specifically DNA-specific. And other ligands ("effector" domains) bind (activate or repress) proteins involved in transcriptional regulation. This simple model replaces DNA binding and / or effector domains with synthetic chemical moieties, increasing the likelihood of generating a new class of molecule-synthetic or artificial transcription factors (ATFs). The primary goal of ATF molecular design is to lower the molecular weight, resistance to enzymatic degradation and cell membrane permeability while maintaining the ability to regulate RNA transcription of critical biological functions-specific genes. To introduce new, drug-like chemistry.
[0007]
There have been some recent attempts to link the minimal activation domain of a strong transcriptional activator, such as VP16 or GCN4, to an artificial DNA binding domain based on triple helix-forming oligonucleotides or pyrrole oligomers. . These efforts have led to minimal activation with little detectable activity (Kuznetsova et al., Nucleic Acids Res. 27: 3995-4000 (1999)) or limited to in vitro (cell-free) assays. (Mapp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3930-3935 (2000)). In general, the activity of such hybrid molecules is very weak (and possibly non-specific) compared to that of the natural (or protein) activator from which the parts of these molecules are derived (Sadowski et al., Nature 335: 563-564 (1988)).
[0008]
There remains a need for the identification of new transcriptional activators and for improved activation systems. In particular, there remains a need for artificial transcriptional activators that are comparable to or even greater than those activated by strong natural transcriptional activators. There is still a need for new transcription repressors and repression systems. In general, there remains a need for new transcription systems that can regulate the transcription process. The molecule will open possibilities for the first practical application of technology in biology and medicine.
[0009]
Summary of the Invention
The present invention relates to molecular designs that yield very potent ATFs, demonstrated in both cell-free assays (in vitro) and in vivo (in tissue culture cells). These ATFs can be used as a means of gene regulation at the transcriptional level, and as a class of gene targeting drugs for the treatment of cancer and many other diseases.
[0010]
In one aspect of the present invention, there is provided a composition that regulates transcription of a eukaryotic cell gene. The composition includes a non-peptide DNA binding domain, a flexible linker, and a transcription effector, wherein one end of the linker is covalently linked to the DNA binding domain and the other end of the linker is covalently linked to the transcription effector.
[0011]
In at least some embodiments, the effector activates transcription. In at least some other embodiments, the effector suppresses transcription. In at least some embodiments, the flexible linker of the ATF of the invention is at least 10 angstroms, or at least 15 angstroms, or in at least some other embodiments, at least 28 angstroms in length. In at least some embodiments, the flexible linker has a length in the range of 10-100 angstroms. In at least some embodiments, the flexible linker has a length in the range of 15-25 Angstroms, or in the range of 25-40 Angstroms, or in the range of 40-60 Angstroms, or in the range of 60-100 Angstroms.
[0012]
In at least some embodiments, the composition for regulating transcription of a eukaryotic gene binds to a co-regulatory protein. In at least some embodiments, the compositions repress transcription and bind to histones or histone regulatory proteins.
[0013]
In at least some embodiments, the DNA binding domain is a nucleic acid. In at least some embodiments, the nucleic acids are modified nucleic acids. In other embodiments, the nucleic acid comprises a modified backbone or the nucleic acid comprises a modified base. In yet other embodiments, the modified backbone comprises a substituent for a phosphodiester bond selected from the group consisting of phosphorothioates and peptide nucleic acids. In other embodiments, the linker is attached to the 3 'or 5' end of the nucleic acid.
[0014]
In at least some embodiments, the DNA binding domain is a peptide nucleic acid. In some embodiments, the DNA binding domain does not contain more than one pyrrol or imidazole group. In at least some embodiments, the DNA binding domain is a sequence-specific DNA binding natural product.
[0015]
In at least some embodiments, the transcription factor is a polypeptide sequence. In some embodiments, the transcription factor is a polypeptide activator and the polypeptide is SEQ ID NO: 1 (see Table 1).
[0016]
Embedded image

Has a polypeptide sequence comprising at least one copy of an activator sequence of an amino acid derived from herpes simplex virus protein VP16. In at least one embodiment, the polypeptide has the sequence of SWQUID NO: 12. In at least some embodiments, the peptide sequence comprises two copies of the activator sequence of SEQ ID NO: 1 and a cysteine residue at the amino terminus of the peptide sequence, wherein the peptide is SEQ ID NO: 2 (see Table 1). )
[0017]
Embedded image

Having the following sequence: In at least some embodiments, the polypeptide sequence comprises a cysteine residue and two copies of the activator sequence of SEQ ID NO: 12, and the peptide has the sequence of SEQ ID NO: 8. In at least some embodiments, the amino terminus of the polypeptide transcription factor is covalently linked to a linker. In at least some embodiments, the carboxyl terminus of the polypeptide transcription factor is covalently linked to a linker. In at least some embodiments, the cysteine residue of the polypeptide transcriptional regulator is covalently linked to the linker.
[0018]
In at least some embodiments, the transcription effector portion of the composition that modulates transcription of a eukaryotic cell gene has a molecular weight of less than about 3,000 daltons. In at least some embodiments, the transcription effector moiety has a molecular weight of less than about 1,500 daltons. In at least some other embodiments, the transcription factor moiety has a molecular weight of less than about 1,000 daltons.
[0019]
In at least some embodiments of the composition for regulating transcription of a eukaryotic cell gene, the flexible linker comprises a polyglycol. In some embodiments, the flexible linker polyglycol comprises at least 2, or at least 4, or at least 6 glycol units. In another embodiment, the flexible linker comprises a plurality of monomer units selected from the group consisting of nucleic acids, peptides, and lower alkyl or other oxygen-containing alkyl chain derivatives.
[0020]
In at least some embodiments, the amount of transcription initiated on the double-stranded DNA template is at least 10 times greater than the second amount initiated in the absence of the composition. In at least some embodiments, the amount of transcription initiated on the linear double-stranded DNA template is at least 20, or at least 30, or at least 40, or at least 50, relative to the second amount in the absence of the composition. Twice as many. In at least some embodiments, the amount of transcription is 30-50 fold greater than transcription in the absence of the ATF of the invention.
[0021]
In at least some embodiments of the present invention, the DNA binding domain of the composition for altering (modulating) transcription of a eukaryotic gene has an affinity for at least one DNA binding site on a DNA template; DNA templates are shorter than about 500 base pairs.
[0022]
In another aspect of the invention, a composition for activating transcription has the structure ABC, wherein A is a triplex forming nucleic acid, B is a flexible linker, and C is a true linker. An activating moiety that binds to a site on the transcriptional protein complex that contains a nuclear RNA polymerase, where B is covalently linked to A and C. In at least some embodiments, B is a polyglycol chain, and the covalent attachment of B to C comprises a bifunctional crosslinking agent. In at least some embodiments, B is at least about 28 angstroms in length polyglycol and C comprises an amino acid sequence from herpes simplex virus protein VP16.
[0023]
Another aspect of the invention provides a method for assaying a test compound for activity as a transcriptional regulator. The method includes:
Covalently attaching a test compound to a flexible linker domain, which covalently binds to a non-peptide DNA binding domain, to provide a test composition, wherein the DNA binding domain binds to a DNA binding site and regulates transcription at a promoter. Have sufficient affinity for the binding site on the DNA template to
A transcription mixture comprising a eukaryotic RNA polymerase molecule, a buffer and a substrate capable of forming a complex with the DNA template, test composition and DNA template under conditions suitable for RNA synthesis so that the RNA is synthesized. Contacting with a test composition; and
Measuring the amount of RNA produced in the presence of the test composition, relative to a basal level in the absence of the test composition, wherein the amount of RNA is a measure of the activity of the test composition as a transcriptional activator. It is a measure. In at least some embodiments, the DNA binding site is a repeat of multiple binding site sequences. In at least some embodiments of the methods for assaying a test composition for activity as a transcription activator, the binding site of the test composition to the DNA template is located within 100 base pairs from the transcription start site.
[0024]
In another embodiment of the method for assaying a test composition for activity as a transcription activator, the step of providing the test composition with the transcription mixture is performed in vivo. In at least some embodiments, the test composition is pre-bound to the template and the mixture is provided to a plurality of cells by transformation. In at least some embodiments, the test composition is provided to cells having a chromosomally integrated reporter plasmid template (stable transfection line).
[0025]
In at least some embodiments, providing the transcription mixture to the test composition is performed using high-throughput screening techniques, including automated dispensing of multi-well dishes into wells. In at least some embodiments, the step of measuring the amount of transcript using a high-throughput detection method that includes an automated plate reader with a programmable computerized program for data analysis and display comprises Be executed.
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Definition
The following definitions are used throughout the description and the claims unless otherwise indicated. The patent and scientific literature referred to herein establishes knowledge that is available to those skilled in the art. The issued U.S. patents, allowed applications, and references cited herein are hereby incorporated by reference.
[0027]
The term "artificial transcription factor" as used herein includes synthetic transcription factors.
The term “about” is used to mean a numerical value in the range of ± 20% of the recited value.
[0028]
The term "transformation" refers to the genetic event used to construct a cell line or line that results from mixing DNA with a recipient cell so that at least the DNA enters a portion of the cell; Or other liposome-mediated processes, and electroporation.
[0029]
"Transcription effector" refers to a chemical composition that is proximate to a promoter and that, when bound to a DNA binding domain, causes an increase or decrease in the amount of RNA synthesized from a particular promoter or class of promoters. Transcription in the absence of the effector is said to be at the "basal" level. Transcription may be activated (also known as induction or up-regulation) by positive effectors or "activators". Similarly, basal or activation levels may be suppressed or down-regulated by negative effectors or "inhibitors".
[0030]
Transcription effectors can act near or at the transcription start site of a gene. Genes are transcribed when synthesized in the 5 'to 3' direction using the DNA strand as a template. The transcription start site where the first ribonucleoside triphosphate forms a complex with RNA polymerase is found complementary to a site on the DNA template known as "+1", with each successive nucleotide addition being a positive number. And occur complementarily to the "downstream" site. "Upstream" of the +1 site is generally found a DNA regulatory signal such as a transcription factor, a component of the transcription apparatus, a promoter that specifies the binding of RNA polymerase and related proteins. The promoter is generally found within a certain distance upstream of the +1 site to properly position the RNA polymerase holoenzyme for transcription initiation. Regulatory signals in the DNA sequence that regulate the amount of transcription, such as the GAL-4 binding site sequence originally found in yeast, are generally located in the promoter, eg, upstream of or adjacent to the +1 site.
[0031]
The nucleic acid and amino acid sequences cited herein are set forth in Table 1.
[0032]
[Table 1]

A means alanine; C means cysteine; D means aspartic acid; E means glutamic acid; F means phenylalanine; G means glycine; H means histidine; I means isoleucine; K means lysine; L means leucine; M means methionine; N means asparagine; P means proline; Q means glutamic acid; Means arginine; S means serine; T means threonine; V means valine; W means tryptophan; and Y means tyrosine.
[0033]
Detailed description of the embodiment
Surprisingly, whether the three-part ATF, intact, folded, without any protein domain, is the same in transcriptional activation as the protein transcriptional regulator upon which these parts were designed. , Or better. The design of the three-part molecule is such that the ATF includes a DNA binding domain, a flexible linker, and a transcription effector that activates, represses, or otherwise alters transcription; And in the claims as A, B, and C, respectively. However, none of these "domains" need be protein domains. The meaning of "domain" as used herein refers to the function of each of the three parts of the ATF molecule.
[0034]
In one aspect of the invention, there are provided synthetic or artificial transcription factors (ATFs), wherein an ATF component has an activity comparable to or even greater than the activity of a related natural transcriptional activator protein. In some embodiments of the present invention, the transcription reaction, ie, activation or repression, is 10-fold, or 20-fold, or 30- or 40-fold, or In addition, it is 50 times larger.
[0035]
An embodiment of the ATF of the present invention is shown in FIG. A functional ATF comprises a DNA binding domain A and is designated herein as a triplex forming oligonucleotide that binds to linker B at the 5 'position. However, it is possible to attach the linker at the 3 'end of the DNA binding domain without loss of activity. The linker binds at the distal end to effector domain C, a domain that affects transcription. The effect may be to activate or repress transcription. Here, the effector is designated as the activation domain, AD. As described in more detail below, the individual domains of the ATF molecule are most commonly covalently bound; however, any suitable linkage, ie, a covalent, hydrogen, hydrophilic or hydrophobic bond, forms ATF. It is contemplated that it may be used for
[0036]
DNA binding domain A is any non-peptide moiety that has affinity for a specific recognition site in the promoter DNA. By the term non-peptide moiety is meant that the domain does not contain a substantial amount of naturally occurring amino acids. Substantially eliminating the peptide component in the DNA binding domain does not exclude the possibility of including isolated amino acids. For the purposes of the present invention, substantially non-peptide should mean that the natural amino acid content is less than 50% or less than 20%. The choice of the DNA binding domain depends on the gene intended to be activated. Although some activators can act over long distances, the DNA binding domain generally recognizes a site located relatively close to the transcription start site of the gene where the activator can affect transcription. I do. Many activators or repressors can act over long distances, and the use of these effectors is contemplated by the present invention.
[0037]
In at least some embodiments, the DNA binding domain is an oligonucleotide, such as a triplex forming oligonucleotide (TFO). These moieties are believed to bind to the major groove of the DNA helix. The design of triplex forming nucleic acids is described in Dervan et al. No. 5,874,555, which is incorporated herein by reference. It is anticipated that additional types of DNA binding domains can be substituted for triplex forming nucleic acids.
[0038]
TFOs can form strong and stable sequence-specific complexes with double-stranded DNA under physiological conditions (Maher et al., Biochemistry 31: 70-81 (1992)). This property does not adversely affect the coupling with the effector, as demonstrated in the examples below. Without being bound by any mode or theory of action, it is believed that the linker, in addition to other possible roles, plays a role of "insulating" the TFO from interference by attached chemical groups.
[0039]
Triple helix formation between TFO and DNA is promoted when the sequences of both molecules have special features, especially the uniform extension of purine bases in one DNA strand and pyrimidines in the complementary strand. This is not an obstacle to pharmaceutical (gene targeting) applications or many applications such as in vitro and in vivo ATF assays, since the sequence of TFOs and its corresponding binding site in any promoter of the reporter gene This is because it can be selected arbitrarily. Furthermore, it has been shown that such sites are present in the natural gene, most often in the regulatory region of the promoter (Svinarchuk et al., Nucleic Acid Res. 22: 3742-3747 (1994); Nakanishi et al., Nucleic Acid Res. 26: 5218-5222 (1998); and Bramachari et al., Gene 190: 17-26 (1997)). In addition, chemically modified TFOs may recognize many additional types of DNA sequences. For example, it is now possible to target polypurine elongations interrupted by "pyridin" residues with "bridged" or immobilized TFOs (Helene et al., Ciba Found. Symp. 209: 94-102). (1997)). Also, the triplex recognition scheme can be extended by synthesizing TFOs with unnatural bases and nucleotide analogs. TFO-based ATFs may take advantage of recent advances and utilities in genomic databases, which allow the identification of favorable TFO binding sites for promoters. In one application of the present invention, genes of medical interest and appropriate binding sites are identified, and thus TFO sequences with appropriate affinity are synthesized.
[0040]
In addition to TFOs, there are other classes of molecules that can be used as artificial (non-peptide) DNA binding domains. In at least some embodiments of the present invention, the DNA binding domain is a peptide nucleic acid (PNA), a molecular analog of DNA in which the phosphate backbone has been replaced by a backbone similar to that found in peptides. Peptide nucleic acids can bind to single-stranded DNA by Watson-Crick base pairing and can form triple helices to the DNA / PNA duplex in a nearly nucleoside fashion (Nielson et al. , J. Molec. Recognit. 7: 165-70 (1994); Egholm et al., Nature 365: 566-8 (1993); and Kim et al., Nucleic Acid Res. 27: 2842-7 (1999)). . PNA "clamps", consisting of two PNA chains linked to a flexible linker, are capable of forming very stable complexes with DNA duplexes, and include polypurine and polypyrimidine DNA sequences of similar types, such as TFOs. Can be designed to target Recently, a new generation of PNAs called "pseudo-complementary PNAs" (pcPNAs) has been synthesized (Izvolsky et al., Biochemistry 39: 10908 (2000)). These PNAs target well-defined positions on DNA, including mixed purine and pyridimine sequences, in a double-duplex invasion manner. Since the backbone of PNA is uncharged, the lack of electrostatic repulsion leads to the formation of a strong and stable complex with DNA. PNA also has a lower mass per monomer unit than DNA and is generally resistant to degradation by enzymes that can attack the phosphate backbone of oligonucleotides. These and other properties make PNA a very attractive selection of ATF DNA binding domains.
[0041]
In another embodiment, the DNA binding domain may be a peptide analog, such as a polyamide, eg, polypyrrol and polyimidazole, described in US Pat. No. 5,874,555. These moieties are believed to bind to the small groove of the DNA helix, and the activation observed with ATF using the polyamide DNA binding domain is greater than the activation observed with ATFs having an oligonucleotide DNA binding domain. Absent. The nature of the binding of the DNA binding domain within the small groove of the DNA duplex can limit the ability of the bound transcription effector to efficiently interact with proteins, including transcription devices.
[0042]
In still other embodiments, the DNA binding domain is a non-protein binding domain that includes a sequence specific natural DNA binding product such as an antibiotic or other moiety using a small organic molecule.
[0043]
The effector domain, C, may be a positive (activator) or negative (repressor) regulator of the amount of basal transcription levels (mRNA). Many functional activator and repressor peptides are known and can be used in the ATF molecules of the present invention. In some embodiments, the effector domain comprises a suitable chemical linking group (eg, an amine, carboxyl, or thiol group) that forms a covalent bond between the effector and the linker (FIG. 1). In other embodiments, the effector domain, linker and DNA binding domain (or a subcomponent thereof) are synthesized as a single molecule, so that no additional chemical binding groups are provided.
[0044]
In some embodiments, the effector domain is most generally a peptide that is selected for its ability to up-regulate or down-regulate transcription. Peptides may contain either L- or D-amino acids. Representative examples of activating effectors include, but are not limited to, VP-16, Oct-2, and active fragments of VP-16 and Oct-2. In at least some embodiments, the 29-mer or 14-mer of the VP-16 peptide has been shown to have a particularly strong activating effect.
[0045]
In at least some embodiments, shorter peptides that include most, if not all, of the activation functions of the longer peptide may be used as part of the ATF molecule. Shorter peptides can be identified by determining the shortest peptide portion of the activator domain, eg, a "core" activator, which minimizes the size and mass of the effector domain. To remain functional in in vitro and in vivo assays.
[0046]
In at least some embodiments of the present invention, peptides derived from other general types of activation domains, such as the glutamine-rich domain of Oct-2, are used as effector domains. SEQ ID NO: 3 for 18 amino acid peptide
[0047]
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Form the core activating sequence of Oct-2 (Tanaka, M. Clauston, WM & Herr, W, Mol. Cell Biol 14: 6046-55 (1994); Tanaka, M .; & Herr, W. Mol Cell Biol 14, 6056-67 (1994)). Two or three tandem repeats of this sequence form a functional activation domain. A recent report shows the eight amino acid peptide sequence SEQ ID NO: 4
[0048]
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Form a relatively strong activation domain when fused to a protein DNA binding domain (Frangioni, JV, LaRiccia, LM, Cantley, LC & Montminy, MR). Nat Biotechnol 18, 1080-5 (2000)).
[0049]
In at least some embodiments of the invention, the effectiveness of ATFs is promoted by binding minimal activation domains from different activators in one effector. It exploits the synergy in transcriptional activation. For example, two different activators that bind to the same promoter, possibly by contacting different classes of activation domains with different coactivators involved in transcription initiation, rather than each of them acting alone Produces a proportional, more potent effect (Blau J. Xiao, H., McCracken, S., O'Hara, P., Greenblatt, J. & Bentley, D. Mol Cell Biol 16, 2044-55 (1996); Hampsey, M. & Reinberg, D. Curr Opin Genet Dev 9, 132-9 (1999)). In at least some embodiments, the core sequences from the Oct-2 (SEQ ID NO: 3) and VP16 (SEQ ID NO: 1) activation domains bind with new sequences to maximize their effectiveness. .
[0050]
It is also contemplated that the shape of the effector is not limited to natural polypeptide chains. In at least some embodiments, a polyglycol spacer is introduced between the individual core peptide sequences. This increases conformational flexibility and the ability to interact with other proteins without significantly increasing molecular weight.
[0051]
In some other embodiments, lower mass and / or higher potency of the activation domain is obtained by incorporation of unnatural amino acids that stabilize secondary structure. For example, short alpha helix structures can be stabilized by introducing side chains into the side chain lactam bridge. These structural constraints may lead to shorter peptides that retain most of the structure and activity of longer, unmodified polypeptide chains. In at least some aspects of the invention, the effector is selected to suppress transcription. Binding of the repressor domain, ie synthesis of repressor ATFs, is contemplated. Natural transcription factors generally contain an activation or repression domain, and in some cases they may contain both an activation and a repression domain (Liu, YZ, Lee, IK Locke, I , Dawson, SJ & Latchman, DS Nucleic Acids Res 26, 2464-72 (1998); Tanaka, M. Clooston, WM & Herr, W, Mol Cell Biol 14: 6046-55 (1994). Tanaka, M. & Herr, W. Mol Cell Biol 14, 6056-67 (1994)). Transcription factors containing the repressor domain function in a manner similar to transcription factors containing the activator domain, i.e., they both put their respective domains near the promoter DNA to exert their effects on RNA transcription. It is necessary to carry (Pashene, "A Genetic Switch: Phase Lambda and Higher Organisms. Cell and Blackwell Scientific, Cambridge, Mass., Nation, Canada, Canada, USA, and Canada." (1997)) In contrast to transcriptional activators, the binding of transcriptional repressors to promoters is This results in a decrease in the level of A transcription, an effect caused by the blockage of the transcription repressor domain by assembly of the polymerase II holoenzyme complex through a variety of different mechanisms, which are histone deacetylations. From chromatin structure rearrangement to interference with the action of the activation domain (Renkawitz, R. Trends Genet 6, 192-7 (1990). Cohen, RN, Putney, A., Wondisford, F. et al. E. & Hollenberg, A. NMol Endocrinol 14, 900-14 (2000); Busch, K., Martin, B., Baniahmad, A., Renkawaitz, R. & Muller, M. Mol Endocrinol 11, 379-89. 7)). Inhibitor domain is very diverse, but share little structural features, the final their effects on target gene transcription is most similar.
[0052]
There are many repression domains that are comparable to the ATF concept, such as those from the Drosophila transcription repressors even-skipped and Kruppel, and the human repressor protein MadI (Licht, JD, Hanna-Rose, W., Readdy). J., JC, English, MA, Ro, M., Grossel, M., Shaknovich, R. & Hansen, U. (1994) Mol Cell Biol 14, 4057-66; Friedman, JR, Meyer, WK, Vissing, H., Thiesen, HJ & Rauscher, FJ, 3rd (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 4509-13; K. & Manley, JL (1993) Genes Dev 7, 491-503; Beerli, RR, Segel, DJ, Dreier, B. & Barbas, CF, 3rd (1998) Proc Natl. Acad Sci USA 95, 14628-33; Eilers, AL, Billin, AN, Liu, J. & Ayer, DE (1999) J Biol Chem 274, 32750-6)). Although these inhibitors have different mechanisms of action, they all have the following uniform properties: (i) the ability to inhibit a variety of activators and act away from the binding site; (ii) ) Movable (to maintain function when moved to a different DNA binding moiety); and (iii) Relatively small size. For example, a 13 amino acid peptide derived from the human protein MadI repression domain can provide a repression function when fused to a heterologous DNA binding domain (Eiler, AL, Billin, AN, Liu, J. & Ayer, D E. (1999) J Biol Chem 274, 32750-6). Synthesized peptide sequences are derived from these repressors and may be used to substantially generate the repressor ATFs described and described herein for activator ATFs.
[0053]
Transcription assays for repression in vitro and in vivo may be performed, for example, with templates containing both ATF and GAL4 binding sites. Repressor ATFs are tested for their ability to inhibit transcriptional activation mediated by GAL4-VP16 and other potent activation domains fused to the GAL4 DNA binding domain. Alternatively, assays for repression may be performed with a transcription template that includes an ATF binding site incorporated into a promoter with constitutively high levels of basal transcription, such as the CMV immediate early enhancer-promoter (Schmidt et al. , Mol.Cell.Biol 10, 4404-11 (1990)). In this case, binding of the ATF repressor to the promoter reduces RNA transcription, and the presence of additional binding sites for transcriptional activation is not required.
[0054]
The term "artificial repressor" has been used to indicate research methods that involve the inhibition of transcription factor binding to a promoter (Maher et al., Biochemistry 31: 70-81 (1992); Maher et al). , Science 245: 725-730 (1989); and Larsen, HJ and Nielsen, PE, Nucleic Acids Res. 24: 458-63 (1996)). It is a triple helix-forming oligonucleotide (TFOs), peptide nucleic acids (PNAs) or several other sequence-specific non-peptide DNA binding molecules designed to counter specific transcription factors that bind to the same site Most often obtained by The term “passive” inhibitor is used herein to describe these known artificial inhibitor molecules and their mode of action. A critical requirement for passive repressors is that their binding sites are very close to or overlap those of transcription factors (or some other proteins) that are required for expression of the specified gene. That is. Thus, passive repression is only possible on native promoters containing the sequences of these rare overlapping binding sites. In contrast, binding of an "active" repressor moiety to a non-peptide DNA binding moiety, as described herein, results in greater flexibility and efficiency of transcriptional repression by artificial repressors (suppressor ATFs). Will give. For example, binding of the repressor ATFs to any site of the promoter represses transcription because typical repression domains such as even-skipped or Kruppel can act over long distances from the binding site. It is. Thus, as with the "passive" repressors described above, the exact location of the binding sites for the repressor ATFs within the promoter is not critical with respect to their action. Thus, repressor ATFs allow for the targeting of more diverse genes than passive artificial repressors. In other words, the ATF concept can be described as a new method for the delivery of an "active" transcription effector (activator or repressor) to a promoter to regulate the transcription of a target gene in a predictable manner. it can. Because ATFs are completely artificial (synthetic) molecules, the present invention is directed to the delivery to promoters and the ability of fully artificial diverse chemical moieties to regulate transcription of selected (target) genes. Enable.
[0055]
The DNA binding domain and the effector domain are linked (eg, covalently linked) via a flexible linker, B. The linker B portion of the ATF herein has a minimal length and maximum flexibility so that when the DNA binding domain binds to a recognition site near the promoter on the DNA template, the regulatory portion or domain of the ATF will It is relatively free to spread within a minimal distance from the DNA template and can be molecularly interacted with the surface of various components of the cell transcription apparatus, more specifically the surface of the protein component of RNA polymerase II holoenzyme. Can work. Alternatively, the effector may interact with other proteins involved in transcription regulation, such as histones, histone modifying enzymes, or other transcription factors that regulate enzymes or other transcription factors. In at least some embodiments of the present invention, the linker has flexibility and length such that the effector moiety is free to move above the surface of the DNA.
[0056]
In at least some embodiments, the flexible linker of the present invention is at least 5 Angstroms, 10 Angstroms or 15 Angstroms, or at least 15 Angstroms, or at least 20 Angstroms, or at least 28 Angstroms. The length of the linker may be chosen so that the effector domain is accessible for interacting (binding) with the RNA polymerase II holoenzyme or other related proteins. The length of the linker may vary depending on, inter alia, the location and orientation of the DNA binding domain in the DNA template, or the chemical composition of the effector domain. The linker may contain at least 10, or at least 20, or at least 30 atoms in the chain (backbone) between the two domains, and may contain up to 50, or up to 100 atoms.
[0057]
The linking group consists mainly of carbon, hydrogen, nitrogen, oxygen, sulfur and phosphorus. Suitable linkers include polyglycols, or other polyalkoxy moieties, or flexible moieties such as oligomers from nucleotide monomers, natural or unnatural amino acids and lower alkyls, and preferably oxygen-containing organic moieties. The linker is preferably low molecular weight, chemically inert and water soluble. In at least some embodiments, the linker is an oxygen-containing moiety, which improves hydrophilicity and is generally preferred for drug development.
[0058]
The linker is a flexible bond between the DNA binding domain and the effector domain, and is selected such that there is a bond between the two domains while the other domains perform their intended function. The linker is an important component of the ATF composition because it allows for optimal geometry and thus maximizes the potential biochemical activity of ATFs. A linker is a moiety covalently linked to a DNA binding domain and an effector domain. Various functional groups such as amides, carbonic acid derivatives, ethers, esters including organic and inorganic esters, amino, urethane, urea and the like may be used for the covalent bond. To provide binding, a specific domain, eg, a DNA binding domain or effector domain, may be modified, eg, by oxidation, hydroxylation, substitution, reduction, etc., to provide a binding site for the linker. The domains may be terminated at reactive amine, carboxylic acid, hydroxy, or thiol groups, etc., which are sensitive to conventional peptide and / or oligonucleotide reactions. It will be appreciated that modifications to domains that do not significantly alter domain function are preferred. Depending on the domain, there may be multiple sites available for coupling via the linker. Any suitable linker and linker coupling may be used, as long as they do not interfere with the cellular function of the two domains.
[0059]
In at least some embodiments, a linker may be readily included in the DNA or PNA chain during the synthesis of DNA or PNA in an automated chemical synthesis. One part that may be so incorporated is a polyglycol spacer. For example, a polyglycol spacer attaches to the end of the DNA binding domain, and a reactive group is provided at the end of the polyglycol linker by the addition of a modified thymidine to yield a terminal primary amine (see FIG. 2). .
[0060]
In at least some embodiments, a bifunctional crosslinking agent is used to attach the linker to either the DNA binding or the effector domain. Suitable crosslinking agents include small bifunctional molecules that can bind two targeting groups. The targeting group is generally a functional group as described above. Representative thiol-thiol bridging groups include dibromobiman. Representative amine-amine bridging groups are bis (succinimidyl esters), such as bis (succinimidyl ester) of 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzoic acid), or ethylene glycol bis (succinic acid) including. Representative amine-thiol crosslinkers are amine-reactive maleimide and iodoacetimide derivatives such as succinimidyl trans-4- (maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate, succinimidyl 3-maleimidyl Includes benzoate, succinimidyl 6-maleimidyl cyclohexanoate, or 4-nitrohenyliodoacetate.
[0061]
Coupling of amine and carboxylic acid groups may also be facilitated by a crosslinking agent that is not incorporated into the final product, a "zero length" crosslinking agent. Representative materials include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline.
[0062]
A representative ATF designed and synthesized using the components shown schematically in FIG. 2B is shown in FIG. 2A. The DNA binding domain was designed based on a modified triple helix forming oligonucleotide. SEQ ID NO: 5
[0063]
Embedded image

22 binds to the corresponding target double-stranded sequence by forming a triple helix complex at physiological pH (Skoog et al., Repression of Bacteriophage Promoters By DNA and RNA Oligonucleotides. .21: 2131-2138 (1993)). Long (eg, greater than 15 angstroms) flexible polyglycol linkers have been introduced at either the 5 'or 3' end by automated chemical synthesis. This is SEQ ID NO: 6
[0064]
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And SEQ ID NO: 7
[0065]
Embedded image

Where X represents Spacer Phosphoramidite 18 (hexaethylene glycol spacer, Glenn Research, 22825 Davis Drive, Sterling, VA 20164), and Y is a short tether. -Represents a thymidine residue giving rise to a primary amine group above (Amino-Modifier C6-dT, Glenn Research). This primary amine can react with various compounds that do not affect the rest of the molecule. This allows the modified residue to serve as an "anchor" for the coupling of various functional domains ("effectors"), the activity of which can then be tested in transcription assays. The effector may be a synthetic peptide, a non-natural peptide (having non-naturally occurring amino acids), or a non-peptidic organic molecule.
[0066]
The ATFs of the present invention are useful in regulating the expression of a target gene. The target gene may be any gene secreted by the cell, such that the encoded product may optionally be made available (or may be suppressed). Although the transcription of many genes is found to be regulated in vivo, either positively or negatively, the basal level of other genes, often referred to as "housekeeping", remains relatively constant throughout the life of the cell. Is also good. Further, the regulation of any gene may be temporally specific only when expressed in normal cells at some stage of development, or only when expressed in certain tissues or cells or organ types. It may be tissue specific.
[0067]
Temporally regulated genes, such as nestin, or genes for metalloproteinases such as type II collagenase, may be expressed during fetal development in normal cells, but in the case of nestin in brain tumors or melanomas, or In the case of type II collagenase, it may be up-regulated during tumor metastasis. Alternatively, fetal genes, such as those of embryonic hemoglobin, may appear in various anemia-type diseases, such as sickle cell anemia, to replace insufficient adult hemoglobin.
[0068]
For these and many other applications, it can act as a promoter-specific artificial transcription factor (activator or repressor), especially as a drug, eg, as a negative artificial regulator for removing tumor-specific genes. Low molecular weight ones are provided. ATFs useful as therapeutics are of sufficiently low molecular weight to be administered orally and to penetrate the target cells of the subject.
[0069]
Pharmaceutical composition
In another aspect, the invention provides a pharmaceutically acceptable composition comprising a therapeutically effective amount of one or more ATF compositions of the invention, formulated with one or more pharmaceutically acceptable carriers. I do. The pharmaceutical compositions and methods described herein may include one or more ATF compositions of the present invention.
[0070]
As used herein, the phrase "therapeutically effective amount" refers to an ATF composition, or an ATF composition effective against an ATF composition that produces an intended function, such as, for example, modulation of gene expression. Means the amount of the composition containing the substance. The effective amount may vary depending on factors such as the type of cell growth to be treated or inhibited, the specific type of ATF composition, the size of the subject, or the degree of unwanted cell growth or activity. One of skill in the art would be able to study the foregoing factors and make a determination as to the effective amount of the ATF composition without undue experimentation.
[0071]
The phrase “pharmaceutically acceptable” refers to contacting human and animal tissues without undue toxicity, irritation, allergic reactions, or other problems or complications, within the scope of sound medical judgment. Used herein to describe an ATF composition comprising a compound and / or dosage form that corresponds to an appropriate benefit / risk ratio, suitable for use in any given context.
[0072]
The ATF compositions of the present invention may exist in free form or, where appropriate, in salt form. Pharmaceutically acceptable salts and their formulations are known to those skilled in the art. Pharmaceutically acceptable salts of such compounds include, for example, conventional non-toxic salts of compounds formed from inorganic or organic acids or bases, or quaternary ammonium salts. The compounds of the present invention may form hydrates or solvates. It is known to those skilled in the art that lyophilization of a charged compound with water to form a hydrated species or concentration in solution with a suitable organic solvent to form a solvated species.
[0073]
The amount of a compound that is effective in the treatment or prevention of a particular disease or condition will depend, in part, on the nature of the disease or condition, and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro or in vivo assays may be employed to help identify optimal dosage ranges. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal test systems. The exact dosage level should be determined by the attending physician or other healthcare professional and will determine the route of administration and age, weight, sex and general personal health; the nature, severity and clinical stage of the disease; The use of (or no) concomitant therapy; and the nature and extent of genetic engineering of the patient's cells will depend on known factors.
[0074]
The present invention also provides a kit comprising one or more containers having one or more components, comprising a pharmaceutical package and a precursor composition having a flexible linker covalently linked to a DNA binding domain, wherein the kit comprises a DNA binding site. A DNA binding domain that binds and has an affinity for a site on a DNA template that is sufficient to modulate transcription in the promoter precursor composition will allow the precursor compound to evaluate the activity of the composition in transcription. Includes a reactive end group that can be used to attach a test compound of interest. The kit also includes a transcription mixture that includes the DNA template, and a eukaryotic RNA polymerase that forms a complex with the DNA template. Optionally, instructions for using the precursor compositions described in the methods of the invention may be provided with the kit.
[0075]
Assay
The experimental systems described herein may be used to test the possibility of activating or inhibiting a chemical adduct in vitro; however, the additional systems of the invention described herein may be used. Embodiments include in vivo assays. The experimental systems described herein activate transcription from linear (generally in vitro assays) or circular plasmid templates that can be used in both in vivo and in vitro assays. For example, binding of ATF to promoter DNA is performed in vitro using a circular (plasmid) DNA transcription template, and the resulting preformed ATF-template complex can be used for transfection, electroporation, liposome -Introduced into tissue culture by various transformation methods, including auxiliary techniques. Quantitation of in vivo generated RNA transcripts (ie, β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, etc.) from a reporter gene transcribed downstream from the start site reveals the activity of the ATF being tested. Alternatively, a sample of cells containing a stable plasmid with a transcription template is treated with ATF. In this case, the binding of ATF to the corresponding site of the template promoter occurs in vivo. Because of their relatively small size and generally non-peptidic molecules, ATF permeates cell membranes in a manner similar to permeation by antisense oligonucleotides. Reporter gene activity of cells in the presence and absence of ATF indicates the degree of transcriptional activation or repression.
[0076]
The ATF of the invention is used in a method for assaying a test compound for activity as a transcriptional regulator. The method includes: covalently linking a test compound to a flexible linker domain that is covalently linked to a DNA binding domain to provide a test composition (the DNA binding domain binds to the DNA binding site and is transcribed at the promoter). Has a sufficient affinity for the site on the DNA template to regulate DNA); under conditions appropriate for RNA synthesis, directly through the DNA template, other proteins, or so that RNA is synthesized. Contacting a transcription mixture comprising a eukaryotic RNA polymerase molecule, a buffer and a substrate capable of indirectly complexing with the test composition and a DNA template, with the test composition; and in the absence of the test composition Measuring the amount of RNA produced in the presence of the test composition, as compared to the basal level of It is a measure of the activity of the test composition as a factor. In some embodiments, the DNA binding site is a repeat of multiple binding site sequences
The synthesized RNA may be quantified using any conventional detection system. Such systems for the quantification of RNA products are known in the prior art.
[0077]
The ATF compositions of the present invention may be used to develop in vivo screening systems for new ATFs, as well as the therapeutic applications described above (exact regulation of transgenic cells in vivo). For example, a stable transfected cell line may be generated with a reporter construct introduced into the chromosome, instead of transient transfection (described herein in the in vivo experiments below). . Thus, any new ATF may be tested for its ability to activate or repress this reporter gene. Alternatively, an endogenous gene may be used as a target, in which case the signal is detected on a DNA array (chip).
[0078]
High-density DNA and oligonucleotide microarrays ("DNA chips") simultaneously monitor the expression of many different genes and allow expansion of in vivo assays because it can provide clues to the effectiveness of individual ATF designs Because. For example, monitoring early changes in gene expression patterns after treatment of tissue culture cells with ATF reveals which genes are directly affected by ATF. ATF targets in the genome can be identified without prior knowledge of the promoter sequence. The relative levels of gene expression also provide useful information regarding the activity of individual effectors. In this manner, both the DNA binding domain and the effector domain are characterized very simultaneously, with the identification of potential gene targets for possible medical applications in the future. Microarray analysis is not limited to one cell type; detection kits are commercially available for many diverse eukaryotic cells, from yeast to human (Affymetrix).
The ATF composition of the present invention may be used in various applications as described above, and in particular in gene therapy. In many instances, the ability to optionally switch the therapeutic gene on or off, or to accurately titrate expression, is important for therapeutic efficacy. The present invention is particularly well suited for performing regulated expression of a therapeutic target gene in human gene therapy.
[0079]
The present invention is further described in the following examples, which are provided by way of illustration only, and are not intended to limit the invention, and the full scope is set forth in the claims that follow the specification.
[0080]
Example
Embodiment 1 FIG. ATF design and synthesis
In these experiments, the effector domain was a series of synthetic peptides derived from the well-studied activation domain of the herpes simplex virus protein VP16, one of the strongest transcription factors found in nature. These peptides have SEQ ID NO: 8
[0081]
Embedded image

And has a cysteine residue attached to two copies of the VP16 amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 8, which contains a double copy of VP16 amino acid, retains about 70% of the activity of full-length VP16 when fused to the GAL4 DNA binding domain (Seipel et al., Different Activation Domains, a stomach-from-a-half-length homologation). Proximal (Promoter) Positions. EMBO J. 11: 4961-4968 (1992); A cysteine residue with a thiol is added to the amino terminus to provide a point of attachment for binding to the rest of the ATF molecule.
[0082]
All peptides were synthesized on an automated peptide synthesizer using standard FMOC chemistry (Barberis et al., Contact With a Component of The Polymerase II Hologenzyme Suffices For Gene Activation. 95-69: 35-95). ). The chemical bond between the peptide and the oligonucleotide is determined by Fire Chemical Co. This was done by using N-hydroxysuccinimidyl 6-maleimidyl hexanoate, a bifunctional crosslinking agent from Rockford, IL (see FIG. 2A). This commercially available crosslinker has two functional groups separated by a six carbon chain: the ester of succinic acid reacts specifically with primary amines, and the maleimide function, under certain conditions, specifically reacts with thiols. Reacts to. The coupling reaction was performed in successive stages. Since the ester group of the two groups is more labile, the crosslinker first binds to the primary amine of the oligonucleotide. Excess crosslinker was removed by chloroform extraction and ethanol precipitation. The second step involved the reaction between the thiol group of the peptide and the maleimide function of the crosslinking agent. Purification of the conjugate of excess peptide and unreacted DNA was performed by reverse phase HPLC. Purified aliquots were dried in a lyophilizer, then dissolved in ultrapure (Ambion, Austin, TX) and stored at -70 ° C.
[0083]
Embodiment 2. FIG. In vitro transcription assay
A series of double stranded DNAs containing multiple binding sites for triple helix formation by annealing and joining two 26 base oligonucleotides 5 'having the sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 The fragment was obtained. A fragment containing 5 copies of the sites shown in the duplex of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 was purified by agarose gel electrophoresis and placed in the HindIII restriction site of the polylinker in the form of a GSE4T series transcription template. Inserted.
[0084]
FIG. 3 shows the promoter region of the transcription template. In FIG. 3A, the control template contains a promoter for regulated transcription, the 5GAL4 and 5ATF binding sites are incorporated into the promoter at -53 and -155 bp, respectively, for the +1 transcription start site; and in FIG. 3B, the ATF The assay template contains a 5ATF binding site incorporated at -65 bp.
[0085]
The resulting plasmid was linearized by digestion with EcoRI, purified, and the linear template was stored at −20 ° C. in ultrapure. The transcription assay was performed at 10 mM Tris pH 8, 40 mM MgCl.₂Initiated by incubating ATFs and 200 ng of linear transfer template in binding buffer containing 100 mM KCl at room temperature for 24 hours. The total volume of the coupling reaction was 5 microliters. After the binding reaction, the salt and buffer conditions were changed to 5 microliters of water, 6 microliters of 1X HeLa buffer (20 mM HEPES pH 7.9, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 20% glycerol), and HeLa nuclear extraction (Promega, Madison, WI). Aliquots (1 microliter total) of GAL4-VP16 protein were added to control templates and all reactions were incubated at 30 ° C. for 10 minutes. Transcription was performed with ribonuclease triphosphate (ATP, CTP, GTP, 10 mM each) and³²Started by the addition of 1 microliter of a 0.5 microliter mixture of P-α-UTP (NEN, Boston, Mass.). After an additional 30 minutes incubation at 30 ° C., all transcription reactions were stopped with 100 microliters of stop buffer (0.5 M sodium acetate, 0.2% SDS, 10 mM EDTA, 1 microgram / ml glycogen, 1 microgram / ml proteinase K). Was stopped by the addition of The reaction was vortexed, incubated at 37 ° C. for 10 minutes, extracted with phenol / chloroform, and precipitated with 250 microliters of ice-cold ethanol. The pellet was dissolved in 20 microliters of a standard denaturing formaldehyde / dye mixture, loaded onto a 6% denaturing polyacrylamide gel, and run.
[0086]
The results are shown in FIG. Lanes 1 and 2 show activation by the control fusion protein GAL4-VP16 from the control template (FIG. 4A), all other lanes represent activation by ATF from the ATF assay transcription template. The 250 base transcript starting at the correct start site for each sample is shown below. Lane 1 shows the level of basal transcription in the absence of any transcription factors from the control transcription template. Lane 2 shows that the addition of the control fusion protein GAL4-VP16 resulted in a significant increase in the amount of transcript from the control template. Lane 3 shows the basal transcript from the ATF assay transcription template. Lanes 4-7 show transcriptional activation as expected as a function of increasing ATF value. Lanes 5, 6, and 7 contain 5 times, 100 times, and 500 times more ATF than lane 4, respectively. The curves show the results in a "bell curve" reaction. At the optimal concentration of ATF (lane 5), the level of transcriptional activation corresponds to, if not higher than, the maximum level of activation observed from the control template in the presence of the control activator protein GAL4-VP16.
[0087]
The results in FIG. 4 show that the native activator VP16 bound to the GAL4 binding site to create a fused GAL4-VP16 and potently activated transcription from a control template containing a 5GAL4 binding site. The effluent transcript initiated at the +1 transcription start site is 250 bp long (indicated by the arrow in FIG. 4). At the same time, ATF (29) can activate transcription from a template that contains a 5ATF binding site in the promoter. Since ATF (29) does not activate transcription from control templates or templates lacking other ATF binding sites, its activity is completely dependent on the presence of the corresponding binding site of the promoter (data not shown). Comparison of RNA transcripts confirms that GAL4-VP16 and ATF both initiate transcription from the same, "correct" (+1) site of the promoter adjacent to the TATA box. Most surprisingly, the maximum level of transcriptional activation by ATF (29) was comparable to that obtainable by GAL4-VP16. For example, quantification of RNA transcripts indicates that GAL4-VP16 and ATF (29) activate basal levels 30-40 fold transcription (FIG. 4). This result corresponds to the previously reported maximum level of transcriptional activation by GAL4-VP16 from a linear template containing a 5GAL4 binding site in vitro (Haile, DT & Parvin, JD (1999)). J Biol Chem 274, 2113-7). These levels of activation are obtained between ATF concentrations of 20-40 nM, with further increases in concentration leading to reduced activation (FIG. 4). This data also shows another similarity between the strong natural activator and ATF: the ability to “repress” transcriptional activation, possibly due to excessive strong amounts of activator in the transcription machinery. (Ptashne, M. (1988) Nature 335, 683-9). The ability to activate and suppress depends entirely on the presence of the binding AD peptide. This is because "cleaved" ATFs lacking AD have proven to be completely inactive.
[0088]
A. Fully functional and very powerful ATFs.
Although there are many successful drugs that target gene products, there is to date no effective and practical method for pharmaceutical targeting of the gene itself. Manipulation of gene expression at the transcriptional level has high potential for drug development because the underlying regulatory mechanisms are common to most eukaryotic genes (Roberts, SG (2000) Cell Mol). Life Sci 57, 1149-60). In principle, small molecule drugs designed to regulate the transcription of a particular gene can cause similar effects on different genes by slightly modifying its DNA binding portion. Thus, cell permeable drugs that can activate or repress specific genes can form the basis for general therapeutic methods applicable to many different genes of medical interest.
[0089]
Advances in this area have been hampered by the fact that designing an effective ATF is a major challenge. For example, previous attempts to bind a synthetic peptide to a polyamide DNA binder resulted in a transcriptional activator that bound to DNA with a minimal groove and showed very low activity in an in vitro assay (Mapp et al., Supra). ). Because these studies only use reporter genes containing the G-less cassette, it is not clear whether the overall increase in RNA is due to specific or non-specific (ie, arbitrary) transcription initiation.
[0090]
However, in order to demonstrate the usefulness of ATF as a novel tool and to develop the first practical application, it is necessary to obtain biological activity and specificity close to that of commonly used natural transcription factors. is there. The results of this study indicate that fully functional, (i) RNA transcription initiation from the correct site and (ii) biological activity comparable to potent transcriptional activator proteins such as GAL4-VP16 It has been shown for the first time that it is possible to design a suitable ATF.
[0091]
B. The effect of the activation depends on the chemical structure of ATF.
The design of very powerful ATFs has been done through several molecular design and synthesis iterations. Without being bound by any particular mechanism, it is believed that the chemical structure of the linker (among others, length and flexibility) plays an important role in optimal presentation of the effector to the transcription apparatus. Thus, it is believed that the combination of a long, flexible polyglycol chain and a stiffer, more hydrophobic nucleotide-crosslinker structure can mimic the molecular shape of a transcription factor particularly well. In fact, the in vitro transcription assays described in FIGS. 3 and 4 imply that ATFs may be even more potent transcription activators than GAL4-VP16. For example, the GAL4-VP16 protein binds as a dimer to each of the five sites of the promoter, while the ATF molecule binds as a monomer to the corresponding triple-helix target site (Carey, M. et al., (1989) J Mol. Biol 209, 423-32). However, the 5ATF molecule attached to the promoter causes a similar effect on transcription comparable to the 10GAL4-VP16 molecule in vitro (FIG. 4). This high potency of the ATF molecule is due to the lack of a bulky protein domain and a simple elongated chemical structure that interacts with the RNA polymerase II holoenzyme and / or other proteins while leaving the effector more exposed. It may be. The exposed effectors will effectively promote recruitment of the holoenzyme to the promoter and initiation of RNA transcription. This conclusion is consistent with previous work indicating that the 14-mer peptide from VP16 (FIG. 2A) was inactive when fused to the GAL4 DNA binding domain by recombinant DNA technology (Seipel et al., Supra). In contrast, this study showed that the same 14-mer peptide sequence exhibited significant biochemical activity in the environment of ATF.
[0092]
Embodiment 3 FIG. ATF with a linker covalently linked to the 3 'end of the DNA binding domain
A strong positive transcription effector (FIG. 4, lanes 3-7) The ATF of FIG. 2A has DNA binding domain A covalently linked to linker B via the 5 ′ end of the DNA binding domain. The polylinker was attached to the 3 'end, and this ATF also showed strong positive transcription effector activity (Figure 4, lanes 8-9). Lane 8 shows transcription mediated by the 3 'ABC-structured ATF, and lane 9 shows 5-fold increased transcription. The amount of lane 8 compared to the amount of 250 bp efflux transcript seen in lane 3, which shows basal levels in the absence of any effectors to the template, is due to the ATF where covalent attachment of the flexible polylinker to the activation domain is strong. Indicates providing a shape. [The presence of a linker plays a role in positive function when compared to other shapes (Kuznetsova et al., Supra). ]Embodiment 4. FIG. ATF having L- and D-amino acid activation domains and 3 'and 5' binding DNA binding domains.
[0093]
This example demonstrates the pluripotency of the ATF compositions of the invention and demonstrates the function of both L- and D-versions of the activator for the domain and the 3 'and 5' binding DNA binding domains.
[0094]
A. Synthesis of ATFs
Introduction of the linker into the TFO is performed by synthesizing two molecules having the sequence of SEQ ID NO: 6 (for 5 'ATFs) and SEQ ID NO: 7 (for 3' ATFs). X represents Spacer Phosphoramidite 18 (Glenn Research) and Y represents a modified T residue with a primary amine group on a short tether (AminoModifier C2-dT, Glenn-Research).
[0095]
The synthesis of two different forms (L- and D-) of a 29-mer peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 was performed by standard methods (Nyanguile et al.,; Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 94: 13402-6 (1997); and Stanojevic et al., Natl. Struct. Biol. 2: 450-457 (1995)). Chemical coupling of the peptide to the rest of the ATF molecule was performed as described in Example 1 using a bifunctional crosslinking agent, succinimidyl 6-maleimidyl hexanoate (EMCS, Molecular Probes).
[0096]
B. Transcription assay.
The template for in vitro transcription was SEQ ID NO: 11 to the HindIII restriction site in the polylinker of the GnE4T series transcription template.
[0097]
Embedded image

Was generated by insertion of five direct repeats of a triple helix-binding DNA sequence having the following sequence (Lin et al., Cell 5A: 659-664 (1988)). Plasmids are linearized by digestion with EcoRI and / or HindIII and binding of ATFs to the template is 10 mM Tris pH8, 40 mM MgCl2.₂Initiated by incubating ATFs with 20-100 ng of linear ATF transfer template in binding buffer containing and 100 mM KCl for 24 hours at room temperature. Sufficient incubation time was given for optimal complex formation between ATFs and promoter. Aliquots (1 microliter total) of diluted GAL4-VP16 protein were then added to the control template and all reactions were incubated at 30 ° C for 10 minutes. Transcription reactions were performed with HeLa crude nuclear extract (Promega) using standard methods (Promega protocols). The final RNA transcript was analyzed on a 6% denaturing polyacrylamide gel. The dried gel was exposed to both Kodak Biomax MS film and Fuji Phosphoimager plates. The quantification of the signal was performed by Fuji MacBAS software.
[0098]
FIG. 5 shows a side-by-side comparison of transcriptional activation by GAL4-VP16 and the following ATFs: 3'ATF, 5'ATF (D) and 3'ATF (D). Comparison of lanes 2, 4, 5, 6, and 7 shows that all ATFs can activate transcription at least as strongly as GAL4-VP16 in vitro. Comparison of activation by 3'ATF and GAL4-VP16 shows that 3'ATF also has a very strong effect on transcription. Despite having slightly different chemical forms, 5'ATF and 3'ATF are very similar in their biological actions, i.e., activation strength and inhibitory ability. Furthermore, the results in FIG. 5 indicate that ATFs synthesized by an activation domain consisting of D amino acids are also potent transcriptional activators. Both 5'ATF (D) and 3'ATF (D) activate transcription from the correct start site, resulting in transcripts that are actually indistinguishable from other ATFs or the 250 bp RNA transcript produced by GAL4-VP16 Is obvious. In terms of activation intensity, both 5 'ATFs (D) are comparable to the other ATFs and GAL4-VP16.
[0099]
Embodiment 5 FIG. In vivo transcription
A. Synthesis of ATF.
ATF molecules were made substantially as described in Example 1. The ATF structure included a 22-mer triple helix-forming oligonucleotide [TFO] of SEQ ID NO: 5 that has been shown to form a stable triple helix complex with target DNA at physiological pH. A long flexible polyglycol linker is inserted near the 5 'end of each TFO. The distal end of the linker has a modified thymidine residue containing a primary amine group on a short two carbon chain tether. This primary amine serves as an anchor site for coupling of the transcription activation domain (AD). AD consists of a 29-mer (SEQ ID NO: 8) or 14-mer peptide (SEQ ID NO: 12) sequence from herpes simplex virus protein VP16. A thiol bearing cysteine residue is incorporated at the amino terminus and covalently bonds to the rest of the ATF molecule. Chemical coupling of the peptide to the rest of the ATF molecule was achieved with a bifunctional crosslinking agent. The coupling reaction resulted in two ATF molecule shapes, ATF with the 29 amino acid VP16 peptide (29) and ATF with the 14 amino acid VP16 peptide (14).
[0100]
B. In vivo ATF activation
The ability of ATFs to activate transcription in vivo was tested by a transient co-transfection assay in BHK-21 cultured cells. As a control template, a reporter construct containing the minimal HSV thymidine kinase promoter, which causes expression of the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter gene, was used. Transcription templates were constructed by incorporating oligonucleotides with 5 copies of the ATF binding site between the HindIII and BamHI restriction sites of the polylinker upstream of the control template promoter (FIG. 6A). The transfection mixture contained 1 microgram of plasmid DNA and 50 nM ATFs. Transfection was performed by using the polycationic lipid LipofectAMINE (Life Tech.). Cells were harvested 48 hours after transfection and CAT assays were performed using FAST CAT (Molecular Probes, Inc.) as a substrate, visualized on a Fluorimager (Molecular Dynamics) and quantified. Each reporter construct shown in FIG. 6A was transfected into cells with and without ATF molecules and the activation signal was measured by standard methods.
[0101]
The results, shown in FIGS. 6B and 6C, indicate that ATF (29) activates transcription five-fold over basal levels. At the same time, ATF (14) caused approximately 30-fold transcriptional activation from the same template. This effect is sequence-specific because none of the ATFs can activate the transcription of a control template lacking the ATF binding site. As in the in vitro assay, intact ATF structure is also required to function in vivo; that is, ATFs without a binding peptide were unable to activate transcription from either template.
[0102]
The results of the co-transfection assay in tissue culture cells show for the first time the substantial biochemical activity of ATFs in the intracellular environment, further confirming the validity of our design. ATFs bind to the promoter and cause strong (up to 30-fold) and sequence-specific activation of transcription from the reporter gene when introduced into tissue culture cells (FIGS. 6B and 6C). The apparent ability of ATF (14) to cause a much stronger effect than ATF (29) in vivo is believed to be due to differences in cell permeability. ATF (14) is expected to have higher cell permeability than longer ATF (29) because it contains shorter peptide effectors with lower electrostatic charge. The degree of transcriptional activation obtained by ATF should be considered in the context of specific experimental procedures. That is, while in vitro assays allow direct comparison between synthetic and natural transcription factors, interpreting such experiments in tissue culture assays would be very difficult. That is, transfection assays require the introduction of a GAL4-VP16 expression construct into living cells, resulting in continued synthesis of the GAL4-VP16 protein in the cell. This is distinctly different from introduction from the cell membrane in general at the beginning of the experiment. Therefore, it will be very difficult to calibrate intracellular concentrations of natural versus synthetic activators over the course of the experiment.
[0103]
Embodiment 6 FIG. Methods for testing low molecular weight potential drugs
The efficacy and potential of embodiments of the ATFs described herein having a VP16 amino acid sequence are based on the activator chemistry moieties covalently attached as an adduct to a flexible polylinker instead of the VP16 derived effector domain of ATF. By varying, various compounds can be tested in transcription assays. These compounds may include low molecular weight potential drugs having a molecular weight of less than 3,000 or less than 1,500. Preliminary results imply that a variety of molecules may be able to mimic the function of the activation or repression domain. For example, a 29 amino acid VP16 sequence synthesized using one or more non-naturally occurring D-amino acids shows some activating ability compared to a sequence made from natural L-amino acid residues (FIG. 5). . Using the methods described herein, the ability to activate or repress transcription is not limited to moieties having a structure consisting of peptide and non-peptide molecules and to effective activation or repression domains. Can be shown.
[0104]
The DNA binding domains of other potential ATFs discussed herein, as well as the non-peptidic nature of the linker and candidate small molecule effector domains, allow the development of smaller cell-permeable molecules with therapeutic potential. I do. The chemical structure and composition of the ATF embodiments herein may serve as a starting point in the development or screening of new drug classes for manipulating gene expression at the transcriptional level.
[0105]
Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific materials and methods described herein. Such equivalents are considered to be within the scope of this invention and are covered by the following claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 is a diagrammatic description of a three-part ATF of the present invention. ATF has three components: a DNA binding domain (denoted by A), a flexible linker (B), and an effector domain, such as an activator domain (C).
FIG. 2
FIG. 2 illustrates one possible scheme for ATF synthesis (A) of the present invention and (B) at least some embodiments of the present invention.
FIG. 3
FIG. 3 shows the promoter region of the transcription template, where: (A) the control template contains 5GAL4 and 5ATF binding sites incorporated into the promoter at -53 and -155 bp with respect to the +1 transcription start site; and ( B) ATF assay template contains a 5ATF binding site incorporated at -65 bp.
FIG. 4
FIG. 4 shows an acrylamide gel electropherogram of the effluxed transcripts in the presence and absence of ATF, including the contents of each lane identified as follows: Lane 1 is from the control transcription template of FIG. 2A. Shows low level basal transcript; lane 2 shows 250 base transcript activated by GAL4-VP16 fusion protein on control template; lane 3 shows basal transcript from ATF assay transcription template of FIG. 2B; lane 4-7 show the effect of the ATF of FIG. 1 on transcription from the ATF assay transcription template, lane 4 has minimal ATF, and lane 5 has 5 times more ATF than lane 4, and lane 6 Lane 100 has 100 times more ATF than lane 4 and lane 7 has 500 times more ATF than lane 4. Lanes 8 and 9 show the effect of ATF with a polylinker covalently linked to the activation domain, which binds to the 3 'end of the DNA binding domain for transcription of the ATF test template. Lane 9 has 20 times more ATF than lane 8.
FIG. 5
FIG. 5 shows acrylamide gel electropherograms of effluxed transcription products for the transcriptional activators GAL4-VP16, 3'ATF, 5'ATF (D) and 3'ATF (D).
FIG. 6
Figure 6 shows the following: (A) the reporter construct used in the co-transcription assay, where the transcription template contains a 5ATF binding site in the promoter, (B) BHK-21 with the transcription template alone (lanes 1 and 2). ) Or in combination with ATF's (lanes 3-6), a representative CAT assay, and (C) transcriptional activation by ATF in three experiments each performed in duplicate. Average multiple bar graph; error lines represent SEM (n = 3).

Claims (48)

A composition for regulating transcription of a eukaryotic cell gene, comprising:
A non-peptide DNA binding domain,
Such a composition, comprising a transcription effector, and a flexible linker, wherein one end of the linker is covalently linked to a DNA binding domain and the other end of the linker is covalently linked to a transcriptional activator. 2. The composition of claim 1, wherein the effector activates transcription. 2. The composition of claim 1, wherein the effector suppresses transcription. 2. The composition of claim 1, wherein the transcription effector binds a synergistic protein, such as a repressor or activator co-protein. 4. The composition of claim 3, wherein the transcription repressor binds to a histone protein. 2. The composition according to claim 1, wherein the DNA binding domain is a nucleic acid. 7. The composition according to claim 6, wherein the nucleic acid is a modified nucleic acid. 9. The composition of claim 7, wherein the modified nucleic acid is selected from the group of a nucleic acid having a modified backbone, a nucleic acid having a modified base, and combinations thereof. 9. The composition according to claim 8, wherein the modified backbone is selected from the group consisting of phosphorothioates and peptide nucleic acids. The composition of claim 1, wherein the DNA binding domain is a peptide nucleic acid. 7. The composition of claim 6, wherein the linker is attached to the 3 'or 5' end of the nucleic acid. 2. The composition according to claim 1, wherein the DNA binding domain does not contain a plurality of pyrrol or imidazole groups. The composition of claim 1, wherein the transcription effector is a polypeptide sequence. The transcription activator is a polypeptide sequence, and the polypeptide sequence is a herpes virus protein VP16 selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 12 3. The composition of claim 2, comprising at least one copy of the amino acid activator sequence from the source. 2. The composition of claim 1, wherein the effector is an organic moiety. 14. The composition of claim 13, wherein the amino terminus of the sequence is covalently linked to a linker. 14. The composition of claim 13, wherein the transfer effector moiety has a molecular weight of less than about 3,000 daltons. 14. The composition of claim 13, wherein the transfer effector moiety has a molecular weight of less than about 1,500 daltons. The composition of claim 1, wherein the flexible linker comprises a polyglycol. 20. The composition of claim 19, wherein the flexible linker comprises at least 6 glycol units. 20. The composition of claim 19, wherein the flexible linker comprises a monomer unit selected from the group consisting of a nucleotide, a peptide, a lower alkyl and an oxygen containing alkyl group. 2. The composition of claim 1, wherein the flexible linker is at least 15 angstroms in length. 2. The composition of claim 1, wherein the flexible linker is at least 28 angstroms in length. 2. The composition of claim 1, wherein the amount of transcription initiated on the linear double-stranded DNA template is at least ten times greater than the second amount initiated in the absence of the composition. 2. The composition of claim 1, wherein the amount of transcription initiated on the linear double-stranded DNA template is 30 to 50 times greater than the second amount in the absence of the composition. The composition of claim 1, wherein the DNA binding domain has an affinity for a DNA binding site on the DNA template, and the DNA template is shorter than about 500 base pairs. A is a triplex forming nucleic acid, B is a flexible linker, and C is an effector moiety that binds to a site on a transcription protein complex containing eukaryotic RNA polymerase, and B is covalently linked to A and C A composition for activating transcription, having the structure ABC. 28. The composition of claim 27, wherein B is a polyglycol chain, and wherein the covalent bond between B and C comprises a bifunctional crosslinking agent. 28. The composition of claim 27, wherein B is at least about 28 angstroms in length, and C comprises an amino acid sequence from herpes virus protein VP16. A method for assaying a test composition for activity as a transcriptional regulator, including:
Providing a cell comprising a target gene under the control of at least one transcription regulatory element and having a DNA binding site;
Contacting the cell with a test composition comprising a DNA binding domain, a test moiety of interest, and a flexible linker under conditions in which transcription occurs, wherein one end of the linker is covalently linked to the DNA binding domain and The other end is covalently linked to the test compound and the DNA binding domain has sufficient affinity for the binding site;
Detect any change in the level of transcriptional activity of the target gene in the presence of the test composition, relative to the level in the absence of the test composition, which is a measure of the activity of the test composition as a transcriptional regulator thing. A method for assaying a test composition for activity as a transcriptional regulator, including:
Providing a test composition comprising a DNA binding domain, a test moiety of interest, and a flexible linker, wherein one end of the linker is covalently linked to the DNA binding domain and the other end of the linker is covalently linked to the test compound. The DNA binding domain has a sufficient affinity for the DNA binding site on the DNA template to bind to the site and activate transcription at the promoter;
A transcription mixture comprising a DNA template, a test composition and a eukaryotic RNA polymerase molecule capable of forming a complex with the DNA template under conditions suitable for RNA synthesis such that the RNA is synthesized, a buffer and a substrate, And contacting a detection system for the quantification of the RNA product with the test composition; and compared to the level in the absence of the test composition, which is a measure of the activity of the test composition as a transcriptional regulator; Detecting any change in the level of transcriptional activity of the target gene in the presence of the test composition. 32. The method of claim 30 or 31, wherein the test moiety is a chemical moiety and the test composition has a molecular weight of less than about 3 kD. 32. The method of claim 30 or 31, wherein the test moiety is a chemical moiety and the test composition has a molecular weight of less than about 1.5 kD. 32. The method of claim 30 or 31, wherein the test portion is membrane permeable. 32. The method of claim 30 or 31, wherein the test moiety is believed to have transcriptional activation or repressor activity. 32. The method of claim 30 or 31, wherein the change in transcriptional activity is detected as a change in the observed level of mRNA or a protein product encoded by the target gene. The target gene is selected from the group consisting of a gene encoding a protein that confers resistance to a drug, a gene encoding an enzyme, a gene rescuing an auxotrophic phenotype, and a gene encoding a cell surface antigen. 31. The method of claim 30, wherein 38. The method of claim 37, wherein the target gene encodes a protein that provides for calorimetric, luminescent, or fluorescent detection. 32. The method of claim 30 or 31, wherein the binding site of the test composition to the DNA template is located within 100 base pairs of the transcription initiation site. 32. The method of claim 31, wherein the DNA binding site comprises a plurality of binding site sequence repeats. 31. The method of claim 30, wherein providing the transcription mixture to the test composition is performed in vivo. 32. The method of claim 31, wherein providing the transcription mixture to the test composition is performed using a high-throughput screening technique, including automated sample distribution into a multiwell dish. Wherein the step of measuring the amount of transcript using an automatic pre-reader using a high-throughput detection method having a programmable computerized program for data analysis and display is performed. Clause 42. The method of clause 42. 32. The method of claim 31, wherein the DNA binding domain has an affinity for a DNA binding site on the DNA template, and the DNA template is shorter than about 500 base pairs. Methods for altering transcriptional activity, including:
Introducing a DNA binding domain, a flexible linker, one end of the linker covalently linked to the DNA binding domain, the other end of the linker covalently linked to a transcriptional regulator, and introducing a transcription composition comprising the transcriptional regulator into the cell. 46. The method of claim 45, wherein the modulator is an activator or a repressor. Kits for assaying test compositions for activity as transcriptional regulators, including:
A flexible linker covalently linked to a DNA binding domain, wherein the DNA binding domain binds to the DNA binding site and has sufficient affinity for the DNA binding site on the DNA template to activate transcription at the promoter; and A transcription mixture comprising a template and a eukaryotic RNA polymerase molecule that forms a complex with the DNA template. 50. The kit of claim 47, wherein the modulator is an activator or a repressor.

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