JP2004531458A - Hedgehog signaling pathway mediators, related compositions and uses - Google Patents

Abstract

The present invention provides that a cell is contacted with a hedgehog antagonist (eg, a small molecule) in an amount sufficient to substitute for an abnormal growth state, for example, to substitute for the normal ptc pathway or antagonize the smoothened or hedgehog pathway. Making available methods and reagents for inhibiting abnormal growth conditions resulting from hedgehog function enhancement, ptc loss of function or smoothened function enhancement, including:

Description

（ここで、Ｒ_９は上で定義した通りであり、Ｒ’_１１は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８（ｍ及びＲ_８は上で定義した通りである）を表わす）
により表わすことができる部分である。
【００６７】
ここで、用語“脂肪族基”とは、直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基をいい、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基のような飽和及び不飽和の脂肪族基を包含する。
【００６８】
用語“アルケニル”及び“アルキニル”とは、上記のアルキルと鎖長及び可能な置換の点で類似するが、少なくとも１個の二重結合又は三重結合をそれぞれ含有する不飽和の脂肪族基をいう。
【００６９】
用語“アルコキシル”又は“アルコキシ”とは、ここで使用するときは、酸素基を結合させた上で定義したようなアルキル基をいう。代表的なアルコキシル基は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔ−ブトキシなどが包含される。“エーテル”は、酸素に共有結合した２個の炭化水素である。従って、そのアルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、アルコキシルであり又はこれに類似し、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８（ｍ及びＲ_８は上で定義した通りである）の一つにより表わすことができる。
【００７０】
用語“アルキル”とは、直鎖状アルキル基、分岐鎖状アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アルキル基も含めて飽和脂肪族基をいう。好ましい具体例では、直鎖状又は分岐鎖状アルキル基は、その主鎖内に３０個以下（直鎖のものについてはＣ_１〜Ｃ_３０、分岐鎖状のものについてはＣ_３〜Ｃ_３０）、好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルはその環構造内に３〜１０個の炭素原子を、好ましくは環構造内に５、６又は７個の炭素原子を有する。
【００７１】
更に、用語“アルキル”（又は、“低級アルキル”）とは、明細書、実施例及び請求の範囲を通じて使用するときは、“置換されていないアルキル”及び“置換されたアルキル”の双方を包含するものとし、後者のものは炭化水素の主鎖の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分をいう。このような置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル又はアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート又はチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドロリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分を包含できる。炭化水素連鎖上に置換した部分が適当ならばそれ自身置換され得ることは当業者ならば理解される。例えば、置換アルキルの置換基は、置換された及び置換されていない形のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートも含めて）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイル又はスルホネートも含めて）及びシリル基並びにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート及びエステルを含めて）、−ＣＦ_３、−ＣＮなどを包含し得る。置換アルキルの例は、以下に説明する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ_３、−ＣＮなどにより更に置換され得る。
【００７２】
炭素数が別に特定されていない限り、“低級アルキル”とは、ここで使用するときは、その主鎖構造内に１〜１０個、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する上で定義したようなアルキル基を意味する。同様に、“低級アルケニル”及び“低級アルキニル”は、類似の鎖長を有する。明細書を通じて、好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい具体例では、アルキルとしてここに示した置換基は低級アルキルである。
【００７３】
用語“アルキルチオ”は、硫黄基を結合してなる上で定義したようなアルキル基をいう。好ましい具体例では、“アルキルチオ”は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル及び−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８（ここで、ｍ及びＲ_８は上で定義した通りである）の一つにより表わされる。
【００７４】
用語“アミン”及び“アミノ”は斯界で認識されており、置換されていないアミン及び置換されたアミンの両方をいい、例えば、一般式：
【化８】

（ここで、Ｒ_９、Ｒ_１０及びＲ’_１０はそれぞれについて独立して水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８を表わし、Ｒ_９とＲ_１０はこれらが結合しているＮ原子と一緒になって４〜８個の原子を環構造内に有する複素環を完成し、Ｒ_８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環又は多環を表わし、ｍは０又は１〜８の整数である）
により表わされる部分である。好ましい具体例では、Ｒ_９又はＲ_１０の１個のみがカルボニルであることができ、例えば、Ｒ_９、Ｒ_１０及び窒素がイミドを形成しない。更に好ましい具体例では、Ｒ_９及びＲ_１０（及び随意にＲ’_１０）がそれぞれ水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８を表わす。しかして、用語“アルキルアミン”は、ここで使用するときは、置換された又は置換されていないアルキル結合してなる上記のようなアミン基、即ち、Ｒ_９及びＲ_１０の少なくとも１個がアルキル基であるものを意味する。
【００７５】
用語“アミド”は、アミノ置換カルボニルとして斯界で認識されており、一般式：
【化９】

（ここで、Ｒ_９及びＲ_１０は上で定義した通りである）
により表わすことができる部分を包含する。アミドの好ましい例は、不安定であり得るイミドを包含しない。
【００７６】
用語“アラルキル”とは、ここで使用するときは、アリール基（例えば、芳香族又はヘテロ芳香族基）により置換されたアルキル基をいう。
【００７７】
用語“アリール”は、ここで使用するときは、０〜４個の複素原子を含有できる５、６及び７員の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどを包含する。環構造に複素原子を有するアリール基も“アリール複素環”又は“ヘテロ芳香族”ということができる。芳香族環は、１個以上の環の位置で、上記したような置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ_３、−ＣＮなどにより置換できる。また、用語“アリール”は、２個以上の環であって２個以上の炭素が２個の接する環に共通であるもの（その環は縮合環である）を有し、しかも環の少なくとも１個が芳香族であり、他の環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロシクリルであってよい多環式環系も包含する。
【００７８】
用語“炭素環”とは、ここで使用するときは、環のそれぞれの原子が炭素である芳香族環又は非芳香族環をいう。
【００７９】
用語“カルボニル”は、斯界で認識されており、一般式：
【化１０】

（ここで、Ｘは結合であるか又は酸素若しくは硫黄を表わし、Ｒ_１１は水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８又は製薬上許容できる塩を表わし、Ｒ’_１１は水素、アルキル、アルケニル又は−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８（ｍ及びＲ_８は上で定義した通りである）を表わす）
により表わすことができるような部分を包含する。Ｘが酸素であり且つＲ_１１又はＲ’_１１が水素でないときは、該式は“エステル”を表わす。Ｘが酸素であり且つＲ_１１が上で定義した通りであるときは、該部分はここではカルボキシル基といい、特に、Ｒ_１１が水素であるときは、該式は“カルボン酸”を表わす。Ｘが酸素であり且つＲ’_１１が水素であるときは、該式は“ホルメート”である。一般に、上記の式の酸素原子が硫黄で置き換えられた場合には、該式は“チオカルボニル”基を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ_１１又はＲ’_１１が水素でないときは、該式は“チオエステル”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ_１１が水素であるときは、該式は“チオカルボン酸”を表わす。Ｘが硫黄であり且つＲ’_１１が水素であるときは、該式は“チオールホルメート”を表わす。 他方、Ｘが結合であり且つＲ’_１１が水素でない場合は、該式は“ケトン基”を表わす。Ｘが結合であり且つＲ_１１が水素である場合には、上記の式は“アルデヒド”基を表わす。
【００８０】
用語“複素原子”は、ここで使用するときは、炭素又は水素以外の任意の元素を意味する。好ましい複素元素は硼素、窒素、酸素、燐、硫黄及びセレンである。
【００８１】
用語“ヘテロシクリル”又は“複素環式基”とは、３〜１０員の環構造、好ましくは３〜７員の環であって、その環構造が１〜４個の複素原子を含有するものをいう。複素環は多環であることができる。ヘテロシクリル基は、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンのようなラクタム、スルタム、スルトンなどを包含する。複素環は、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ_３、−ＣＮなどにより置換できる。
【００８２】
ここで使用するとき、用語”ニトロ”とは−ＮＯ_２を意味し、用語“ハロゲン”とは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを示し、用語“スルフヒドリル”とは−ＳＨを意味し、用語“ヒドロキシル”とは−ＯＨを意味し、用語“スルホニル”とは−ＳＯ_２−を意味する。
【００８３】
“ホスホンアミダイト”は、一般式：
【化１１】

（ここで、Ｒ_９及びＲ_１０は上で定義した通りであり、Ｑ_２はＯ、Ｓ又はＮを表わし、Ｒ_４８は低級アルキル又はアリールを表わす）
で表わすことができる。
【００８４】
“ホスホルアミダイト”は、次式：
【化１２】

（ここで、Ｒ_９及びＲ_１０は上で定義した通りであり、Ｑ_２はＯ、Ｓ又はＮを表わす）
で表わすことができる。
【００８５】
“ホスホリル”は、次式：
【化１３】

（ここで、Ｑ_１はＳ又はＯを表わし、Ｒ_４６は水素、低級アルキル又はアリールを表わす）
で表わすことができる。例えば、アルキルを置換するのに使用するとき、ホスホリルアルキルのホスホリル基は、一般式：
【化１４】

（ここで、Ｑ_１はＳ又はＯを表わし、それぞれＲ_４６は水素、低級アルキル又はアリールを表わし、Ｑ_２はＯ、Ｓ又はＮを表わす）
により表わすことができる。Ｑ_１がＳであるときは、ホスホリル部分は“ホスホロチオエート”である。
【００８６】
用語“ポリシクリル”又は“多環式基”とは、２個以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び（又は）ヘテロシクリル）であって２個以上の炭素が２個の接する環（この環は“縮合環”である）に共通するものをいう。隣接しない炭素により結合される環は“架橋環”と称する。多環式基の環のそれぞれは、上で定義したような置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族部分、−ＣＦ_３、−ＣＮなどにより置換できる。
【００８７】
用語“保護基”とは、ここで使用するときは、望まない化学的変換から潜在的に反応性の官能基を保護する一次的な置換基を意味する。このような保護基の例は、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、アルデヒド及びケトンのそれぞれアセタール及びケタールを包含する。保護基の化学の分野は論評されている（Ｔ．Ｗ．グリーン、Ｐ．Ｇ．Ｍ．ウッツ、「有機化学における保護基」第２版、ウイリー社、ニューヨーク、１９９１）。
【００８８】
“セレノアルキル”とは、置換セレノ基を結合させてなるアルキル基をいう。アルキル上に置換基を有し得る“セレノエーテル”の例は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル及び−Ｓｅ−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_８（ｍ及びＲ_８は上で定義した通りである）の一つから選択される。
【００８９】
用語“置換”とは、ここで使用するときは、有機化合物の全ての許容できる置換基を含有させることを意図する。広い観点では、許容できる置換基は、有機化合物の非環式及び環状の、分岐状の及び分岐状でない、炭素環式及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の置換基を包含する。置換基の例は、例えば、上で定義し通りのものを包含する。許容できる置換基は、適当な化合物について１個又はそれ以上で且つまた同一又は異なったものであることができる。本発明のためには、窒素のような複素原子は、水素置換基及び（又は）複素原子の原子価を安定化させるここに記載する有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができる。本発明は、有機化合物のこの許容できる置換基により何ら限定されるものではない。
【００９０】
“置換”又は“置換された”は、そのような置換が置換された原子及び置換基の許された原子価と一致し並びにその置換が安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離などのような変換を自発的に受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の条件を包含するものと理解される。
【００９１】
用語“スルファモイル”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１５】

（ここで、Ｒ_９及びＲ_１０は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
【００９２】
用語“サルフェート”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１６】

（ここで、Ｒ_４１は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
【００９３】
用語“スルホンアミド”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１７】

（ここで、Ｒ_９及びＲ’_１１は上で定義した通りである）
により表わされる部分を包含する。
【００９４】
用語“スルホネート”とは、斯界で認識されており、一般式：
【化１８】

（ここで、Ｒ_４１は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールである）
により表わされる部分を包含する。
【００９５】
用語“スルホキシド”又は“スルフィニル”とは、ここで使用するときは、一般式：
【化１９】

（ここで、Ｒ_４４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アラルキル又はアリールよりなる群から選択される）
により表わされる部分をいう。
【００９６】
類似の置換を、アルケニル及びアルキニルに対して、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニル又はアルキニルを生成するように行なうことができる。
【００９７】
それぞれの表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、ここで使用するときは、それが任意の構造式において１度よりも多く現われるときは、同じ構造式において他の箇所でのその定義と独立であることが意図される。
【００９８】
用語“トリフリル”、“トシル”、“メシル”及び“ノナフリル”は、斯界で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル及びナノフルオルブタンスルホニル基をいう。用語“トリフレート”、“トシレート”、“メシレート”及び“ナノフレート”は、斯界で認識されており、それぞれトリフルオルメタンスルホン酸エステル、ｐ−トルエンスルホン酸エステル、メタンスルホン酸エステル及びナノフルオルブタンスルホン酸エステル官能基並びにこのような基をそれぞれ含有する分子をいう。
【００９９】
略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ及びＭｓは、それぞれメチル、エチル、フェニル、トリフルオルメタンスルホニル、ナノフルオルブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル及びメタンスルホニルを表わす。斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される略号のより包括的なリストがＪｏｕｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのそれぞれの巻の第１号に見られる。このリストは、「略号の標準リスト」の名称の表に典型的に存在する。該リストに含まれる略号並びに斯界で通常の知識を有する有機化学者により利用される略号の全てをここで引用することにより本明細書に含めるものとする。
【０１００】
本発明のある種の化合物は、特に幾何学的異性体又は立体異性体の形態で存在し得る。本発明は、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、並びにこれらの混合物を含めて、本発明の範囲に入るものとして、上記の化合物の全てを意図するものである。更に、不斉炭素原子がアルキル基のような置換基に存在し得る。このような異性体の全て並びにそれらの混合物は本願発明に包含されるものとする。
【０１０１】
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーを望むならば、それは、不斉合成により又はキラルな助剤による誘導化により製造することができ、この場合には生じたジアステレオマー混合物が分離され、助剤基が純粋な所望エナンチオマーを与えるように開裂される。別法として、分子がアミノのような塩基性の官能基又はカルボキシルのような酸性の官能基を含有するときは、適当な光学活性の酸又は塩基によりジアステレオマー塩を形成し、次いで形成されたジアステレオマーを斯界で知られた分別結晶化又はクロマトグラフィー手段によって分割し、続いて純粋なエナンチオマーを回収することができる。
【０１０２】
上記した化合物の意図される均等物には、これに対応し且つ同じ一般的性質（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達を阻止する能力）を有し、しかも化合物の有効性に悪影響を及ぼさない置換基の簡単な変更が１回以上なされている化合物が包含される。一般に、本発明の化合物は、容易に入手できる出発物質、反応剤及び周知の合成操作を使用して、例えば、以下に説明するような一般的反応式により又はその変更によって製造することができる。これらの反応においては、それ自体知られているが、ここでは述べない別法を使用することも可能である。
【０１０３】
本発明のためには、化学元素は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、６７版、１９８６−８７」の表紙内の「元素の周期律表、ＣＡＳ版」に従って同定される。また、本発明のためには、用語“炭化水素”とは、少なくとも１個の水素と１個の炭素原子を有する全ての許容できる化合物を包含するものとする。広い観点では、許容できる炭化水素は、置換されていてよく又は置換されていない非環式の及び環式の、分岐した及び分岐していない、炭素環式の及び複素環式の、芳香族及び非芳香族の有機化合物を包含する。
【０１０４】
ＩＩＩ ．本発明の化合物の例
以下に詳細に説明するように、主題である方法は、例えば、ここで説明するような薬物スクリーニング検定法によって容易に同定できる種々の異なった小さい分子を使用して実施できることが意図される。例えば、この主題方法に有用な化合物は、一般式（Ｉ）：
【化２０】

［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ_２）_ｎアリール（例えば、置換又は非置換の）又は−（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール（例えば、置換又は非置換の）を表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ_２）_ｎ−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ_２）_ｎアルケニル−、−（ＣＨ_２）_ｎアルキニル−、−（ＣＨ_２）_ｎＯ（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＲ_８（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎアルケニル（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎアルキニル（ＣＨ_２）_ｐ−、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＲ_８（ＣＨ_２）_ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−を表わし、
Ｘ及びＤは、独立して、−Ｎ（Ｒ_８）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（Ｒ_８）Ｎ−Ｎ（Ｒ_８）−、−ＯＮ（Ｒ_８）−及び直接結合から選択され、
Ｙ及びＺは独立してＯ及びＳから選択され、
ＥはＯ、Ｓ又はＮＲ_５（Ｒ_５はＬＲ_８又は−（Ｃ＝Ｏ）ＬＲ_８を表わす）を表わし、
Ｒ_８は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ_２）_ｎアリール（例えば、置換又は非置換の）又は−（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール（例えば、置換又は非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ_８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わし、
ｑ及びｒは、それぞれについて独立して、０〜２の整数を表わす］
により表わすことができる。
【０１０５】
ある種の具体例では、ＤはＮ−低級アルキルを表わさない。ある種の具体例では、Ｄはアラルキル−ヘテロアラルキル−置換アミンを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満であり、例えば２又は３である。
ある種の具体例では、ＸＬＲ_４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
【０１０６】
ある種の具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ_１は低級アルキルである。
ある種の具体例では、Ｒ_１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ_８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、ＥはＮＲ_８である。ある種の具体例では、Ｅは、例えば多環式Ｒ_８も含めて、アラルキル−又はヘテロアラルキル−置換アミンを表わす。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１０７】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＩＩ）：
【化２１】

［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは上で定義した通りであり、
Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ_２Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし、
ｓはそれぞれについて独立して、０〜２の整数である］
により表わすことができる。
【０１０８】
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、Ｒ_１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、ｑとｒとｓの和は５未満であり、例えば２、３又は４である。
ある種の具体例では、ＸＬＲ_４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ_８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１０９】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＩＩＩ） ：
【化２２】

［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｌ、Ｍ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上で定義した通りである］
により表わすことができる。
【０１１０】
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、Ｒ_１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満であり、例えば２又は３である。
ある種の具体例では、ＸＬＲ_４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ_１は低級アルキルである。
ある種の具体例では、Ｒ_１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ_８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１１１】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＩＶ） ：
【化２３】

［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_８、Ｌ、Ｍ、Ｘ、ｎ及びｐは上で定義した通りである］
により表わすことができる。
【０１１２】
ある種の具体例では、ＸＬＲ_４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の具体例では、Ｒ_１は低級アルキルである。
ある種の具体例では、Ｒ_１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ_８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
ある種の具体例では、Ｌは全ての存在について直接結合を表わす。
【０１１３】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（Ｖ） ：
【化２４】

［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｙ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒは上で定義した通りであり、
Ｚ’は−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｓ）−、−（＝ＮＨ）−ＳＯ_２又はＳＯ、好ましくは−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｓ）−であり、
Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ_８を表わし、
Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−ＳＯ_２−を表わし、
Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合した置換若しくは非置換の低級アルキル若しくはアルキレン、例えばメチル、エチル、メチレン、エチレンなどを表わし、
Ｒ_９は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アルキルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ_９の一つの存在と一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、 Ｒ_５は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わし、
Ｒ_６は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、
Ｒ_７は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルを表わす］
により表わすことができる。
【０１１４】
ある種の具体例では、ＹはＯである。ある種の具体例では、Ｚ’はＳＯ_２、−（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｓ）−を表わす。
ある種の具体例では、ｑとｒの和は４未満である。
ある種の具体例では、ＮＪ_２Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ_２又はＮＪＲ_９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方上の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
ある種の具体例では、Ｒ_５は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_６は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_７は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これはハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエーテル（例えば、ＣＨＦ_２ＣＦ_２Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキルチオエーテル（例えば、ＣＦ_３Ｓのように置換されていてよい）により置換されていてよい。
ある種の具体例では、Ｒ_８は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルを表わし、好ましくはＨである。
【０１１５】
ある種の具体例では、本発明で有用な化合物は、一般式（ＶＩ） ：
【化２５】

［ここで、原子価及び安定性が許容するとき、
Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｇ、Ｊ、Ｖ、Ｙ、Ｚ’、ｎ及びｐは上で定義した通りである］
により表わすことができる。
【０１１６】
ある種の具体例では、ＹはＯである。ある種の具体例では、Ｚ’はＳＯ_２、−（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｓ）−を表わす。
ある種の具体例では、ＮＪ_２Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ_２又はＮＪＲ_９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
ある種の具体例では、Ｒ_５は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_６は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_７は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これはハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエーテル（例えば、ＣＨＦ_２ＣＦ_２Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキルチオエーテル（例えば、ＣＦ_３Ｓのように置換されていてよい）により置換されていてよい。
ある種の具体例では、Ｒ_８は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルを表わし、好ましくはＨである。
ある種の具体例では、主題化合物は、図３２に示した化合物から選択される。
【０１１７】
ある具体例においては、主題のアンタゴニストを、それらのヘッジホッグ経路に対する選択性に基づいて選択することができる。この選択性は、他の経路に対してヘッジホッグ経路を選択するものであってよく、特定のヘッジホッグ経路（例えば、ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２等）の間の選択性であってよい。
【０１１８】
ある好適具体例においては、主題のインヒビターは、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進媒介のシグナル変換を、１ｍＭ以下の、一層好ましくは１μＭ以下の、尚一層好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ_５０で阻害する。同様に、ある好適具体例において、主題のインヒビターは、ヘッジホッグ経路の活性を、１０ｎＭより小さい好ましくは１ｎＭより小さい尚一層好ましくは０．１ｎＭより小さいＫ_ｉで阻害する。
【０１１９】
特別の具体例において、この小分子を、それが一つのパッチトイソ型に対して隣のものより一層選択的であるので、例えば、一つのパッチト経路（ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２）に対して、他のものの１０倍、一層好ましくは少なくとも１００倍又は１０００倍も選択的であるので選択する。
【０１２０】
ある具体例においては、ＰＫＡ以外のプロテインキナーゼ例えばＰＫＣより一層選択的にヘッジホッグ活性と拮抗するヘッジホッグ経路のアンタゴニストである化合物を選択し、例えば、その化合物は、ヘッジホッグ経路の活性を、他のプロテインキナーゼの活性を調節する場合より少なくとも一桁強力に、好ましくは少なくとも２桁強力に、尚一層好ましくは少なくとも３桁強力に調節する。従って、例えば、ヘッジホッグ経路の好適なインヒビターは、ヘッジホッグ活性を、ＰＫＣの阻害のＫ_ｉより少なくとも一桁低い、好ましくは少なくとも２桁低い、尚一層好ましくは少なくとも３桁低いＫ_ｉで阻害することができる。ある具体例において、ＰＫＡ阻害のＫ_ｉは、１０ｎＭ未満であり、好ましくは１ｎＭ未満であり、尚一層好ましくは０．１ｎＭ未満である。
【０１２１】
主題化合物の製造方法
本発明は、更に、上記したような主題化合物の製造方法を提供する。例えば、ある種の具体例では、式Ｘの化合物は、以下の反応式：
【化２６】

［ここで、
ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒ＋ｓの和が２〜４の範囲の整数であるように、０〜２の範囲の整数を表わし、
ＬＧはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）又はスルホン酸エステル（例えば、トシレート、メシレート、トリフレートなど）のような脱離基を表わし、
Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＸＬＲ_４を有する基を表わし、
Ｂは窒素を保護する基又は式：ＭＲ_３を有する基を表わし、
Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ_２）_ｎアリール（置換又非置換の）又は−（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール（置換又非置換の）を表わし、
ＹはＯ及びＳから選択でき、
Ｘは−Ｎ（Ｒ_８）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は直接結合から選択され、
Ｍは不存在であるか又はＬ、−ＳＯ_２Ｌ−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）Ｌ−を表わし、
Ｌは、それぞれについて独立して、不存在であるか或いは−（ＣＨ_２）_ｎ−アルキル−、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ_２）_ｎアルケニル−、−（ＣＨ_２）_ｎアルキニル−、−（ＣＨ_２）_ｎＯ（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＲ_８（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎアルケニル（ＣＨ_２）_ｐ−、−（ＣＨ_２）_ｎアルキニル（ＣＨ_２）_ｐ−、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＲ_８（ＣＨ_２）_ｎ−又は−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−を表わし、
Ｒ_８はそれぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ_２）_ｎアリール（例えば、置換又非置換の）又は−（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール（例えば、置換又非置換の）を表わすか、或いは２個のＲ_８は一緒になって４員〜８員の環を形成し、
ｐは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜３の整数を表わし、
ｎは、それぞれについて独立して、０〜１０、好ましくは０〜５の整数を表わす］
に従って変換することができ、
工程Ａはヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、
工程Ｂは該脱離基をアジド基で置換することからなり、
工程Ｃはアジドをアミンに還元することからなる。
【０１２２】
ある種の具体例では、ヒドロキシルの脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化スルホニルと反応させてスルホン酸エステルを生じさせることによって、例えば、塩化トシル若しくはトシル無水物を使用してトシレートを生じさせ、又は塩化メシル若しくはメシル無水物を使用してメシレートを生じさせ、又は塩化トリフリル若しくはトリフリル無水物を使用してトリフレートを生じさせることなどにより達成することができる。ある種の具体例では、ヒドロキシルの脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化チオニル、三ハロゲン化燐、五ハロゲン化燐、オキシハロゲン化燐などのようなハロゲン化反応剤と反応させることにより達成することができる。ヒドロキシル基を脱離基に転化するためのその他の技術は斯界で周知であり、工程Ａに使用することができる。
【０１２３】
ある種の具体例では、工程Ａは、第一脱離基を第二脱離基により置換し、脱離基を有する炭素の立体化学を逆転させることを更に含む。従って、例えば、式Ｘの化合物のヒドロキシルがＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係を有するならば、この化合物と塩化メシルとの反応はＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係でメシレートを生じさせる。このメシレートとＮａＩのような求核性ハロゲン化物反応剤との反応は、メシレートを沃化物で置き換えて、脱離基である沃素とＹとＡを有する基とがｔｒａｎｓ−立体化学的関係を有する式ＸＩの化合物を生じさせる。この技術の使用は、ジアステレオマー的に純粋な出発物質からｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−立体化学のいずれかを有する化合物、例えば、ヒドロキシルとＹとＡを有する基との間にｃｉｓ−立体化学的関係を有する純粋な化合物を選択的に得るのを可能にさせる。
【０１２４】
ある種の具体例では、脱離基をアジドで置換することは、斯界で周知のように、ナトリウムアジドのようなアジド陰イオンのアルカリ若しくはアルカリ土類金属塩を使用して、トリメチルシリルアジドのようなシリルアジド反応剤を使用して、又は任意のその他のアジド反応剤、例えば求核性アジド源を使用して達成することができる。
【０１２５】
ある種の具体例では、アジドからアミンへの還元は、水素化アルミニウムリチウム、トリアルキル硼水素化リチウムなどのような水素化物反応剤を使用して、亜鉛金属若しくは二沃化サマリウムと酢酸のような還元性金属と酸源を使用して、水素と白金若しくはパラジウムのような遷移金属触媒の如き接触水素化を使用して、又は任意のその他の好適な手段により達成することができる。
【０１２６】
ある種の具体例では、ｑ＋ｓ＋ｒは２〜３の整数である。ある種の具体例では、ｓは０である。ある種の具体例では、ｑ及びｒはそれぞれ１を表わす。
【０１２７】
ある種の具体例では、Ａは、酸の保護基に結合した酸素を表わす。例えば、酸保護基は、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であることができる。このような基には、メチル、エチル、トリメチルシリルエチル、メチルチオメチル、アリル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチル又は任意のその他の好適な基が包含される。広範な酸保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。他の具体例では、Ａはアルキルチオ基を表わす。
【０１２８】
ある種の具体例では、Ｂは窒素を保護する基、例えば、置換又は非置換のアシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基、或いはＮと一緒になったときにカルバメート基を形成する基を表わす。普通の窒素保護基二は、ベンジル、アリル、ｐ−メトキシベンジル、アセチル、トリフルオルアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが包含される。広範な窒素保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。
【０１２９】
ある種の具体例では、ＹはＯである。
ある種の具体例では、Ａは、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含み得るＸＬＲ_４を表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_３はアリール又はヘテロアリール基を含む。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＲ_８であり、好ましくはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は、−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミド基を表わす。
【０１３０】
ある種の具体例では、式ＸＩＩＩの化合物は、アミンとＹとＡを含む基とがｃｉｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％＞のｃｉｓ−異性体のために濃縮される。その他の具体例では、式ＸＩＩＩの化合物は、二つの置換基がｔｒａｎｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。好ましくは、このような濃縮は、異性体的に濃縮された出発物質を使用してもたらされ、例えば、式Ｘの化合物は工程Ａを開始する前に＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。
【０１３１】
同様に、他の具体例では、式ＸＩＶの化合物は、以下の反応式：
【化２７】

［ここで、
ｑ及びｒは、それぞれ独立して、ｑ＋ｒの和が２〜４の範囲の整数であるように、０〜２の範囲の整数を表わし、
ＬＧはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）又はスルホン酸エステル（例えば、トシレート、メシレート、トリフレートなど）のような脱離基を表わし、
Ａは酸を保護する基に結合した酸素若しくは硫黄又は式：ＮＪ_２Ｎ（Ｒ_９）_２を有する基を表わし、
Ｂは窒素を保護する基又は式：ＧＲ_６を有する基を表わし、
Ｇは不存在であるか又は−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−又は−ＳＯ_２−を表わし、
Ｊは、それぞれについて独立して、水素又はＪに接するＮの両方の存在がＪの少なくとも一つの存在により結合されるようにＮＣ（＝Ｙ）に結合する置換若しくは非置換の低級アルキル若しくはアルキレンを表わし、
Ｒ_９は、それぞれについて独立して、不存在であるか又はＨ若しくは低級アルキルを表わし、或いはＪの二つの存在又はＪの一つの存在がＲ_９の一つの存在と一緒になって５〜７員の環を形成し、この環はＮの一つ又は両方の存在を含み、 Ｒ_６は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル（多環式基も含めて）を表わし、
ＹはＯ及びＳから選択できる］
に従って変換することができ、
工程Ａはヒドロキシルを脱離基に転化することからなり、
工程Ｂは該脱離基をアジド基で置換することからなり、
工程Ｃはアジドをアミンに還元することからなる。
【０１３２】
ある種の具体例では、ヒドロキシルから脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化スルホニルと反応させてスルホン酸エステルを生じさせることによって、例えば、塩化トシル若しくはトシル無水物を使用してトシレートを生じさせ、又は塩化メシル若しくはメシル無水物を使用してメシレートを生じさせ、又は塩化トリフリル若しくはトリフリル無水物を使用してトリフレートを生じさせることなどにより達成することができる。ある種の具体例では、ヒドロキシルから脱離基への転化は、ヒドロキシルをハロゲン化チオニル、三ハロゲン化燐、五ハロゲン化燐、オキシハロゲン化燐などのようなハロゲン化反応剤と反応させることにより達成することができる。ヒドロキシル基を脱離基に転化するためのその他の技術は斯界で周知であり、工程Ａに使用することができる。
【０１３３】
ある種の具体例では、工程Ａは、第一脱離基を第二脱離基により置換し、脱離基を有する炭素の立体化学を逆転させることを更に含む。従って、例えば、式Ｘの化合物のヒドロキシルがＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係を有するならば、この化合物と塩化メシルとの反応はＹとＡを有する基とｃｉｓ−立体化学的関係でメシレートを生じさせる。このメシレートとＮａＩのような求核性ハロゲン化物反応剤との反応は、メシレートを沃化物で置き換えて、脱離基である沃素とＹとＡを有する基とがｔｒａｎｓ−立体化学的関係を有する式ＸＶの化合物を生じさせる。この技術の使用は、ジアステレオマー的に純粋な出発物質からｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−立体化学のいずれかを有する化合物、例えば、ヒドロキシルとＹとＡを有する基との間にｃｉｓ−立体化学的関係を有する純粋な化合物を選択的に得るのを可能にさせる。
【０１３４】
ある種の具体例では、脱離基をアジドで置換することは、斯界で周知のように、ナトリウムアジドのようなアジド陰イオンのアルカリ若しくはアルカリ土類金属塩を使用して、トリメチルシリルアジドのようなシリルアジド反応剤を使用して、又は任意のその他のアジド反応剤、例えば求核性アジド源を使用して達成することができる。
【０１３５】
ある種の具体例では、アジドからアミンへの還元は、水素化アルミニウムリチウム、トリアルキル硼水素化リチウムなどのような水素化物反応剤を使用して、亜鉛金属若しくは二沃化サマリウムと酢酸のような還元性金属と酸源を使用して、水素と白金若しくはパラジウムのような遷移金属触媒の如き接触水素化を使用して、又は任意のその他の好適な手段により達成することができる。
【０１３６】
ある種の具体例では、ｑ＋ｒは２〜３の整数である。ある種の具体例では、ｑ及びｒはそれぞれ１を表わす。
【０１３７】
ある種の具体例では、Ａは、酸保護基に結合した酸素を表わす。例えば、酸保護基は、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基であることができる。このような基には、メチル、エチル、トリメチルシリルエチル、メチルチオメチル、アリル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、ｔ−ブチル又は任意のその他の好適な基が包含される。広範な酸保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。他の具体例では、Ａはアルキルチオ基を表わす。
【０１３８】
ある種の具体例では、Ｂは窒素を保護する基、例えば、置換又は非置換のアシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアラルキル基、或いはＮと一緒になったときにカルバメート基を形成する基を表わす。普通の窒素保護基二は、ベンジル、アリル、ｐ−メトキシベンジル、アセチル、トリフルオルアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが包含される。広範な窒素保護基が斯界で知られており、本発明の範囲及び精神から離れることなくこの方法に使用することができる。
【０１３９】
ある種の具体例では、ＹはＯである。
ある種の具体例では、ＢはＧＲ_６（ここで、Ｒ_６は少なくとも１個の複素環式環、例えばチオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む）である。
【０１４０】
ある種の具体例では、Ａは、一緒になって、環状ジアミン、例えばピペラジンなどを表わし得るＮＪ_２Ｎを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種のその他の具体例では、ＮＪ_２又はＮＪＲ_９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は両方の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
【０１４１】
ある種の具体例では、式ＸＶＩＩの化合物は、アミンとＹとＡを含む基とがｃｉｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｃｉｓ−異性体のために濃縮される。その他の具体例では、式ＸＶＩＩの化合物は、二つの置換基がｔｒａｎｓ−関係を有する異性体のために、例えば、＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。好ましくは、このような濃縮は、異性体的に濃縮された出発物質を使用してもたらされ、例えば、式ＸＩＶの化合物は工程Ａを開始する前に＞７５％、＞８５％、又は更に＞９５％のｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−異性体のために濃縮される。
【０１４２】
ある種の具体例では、式ＸＩＩＩ又はＸＶＩＩの構造を有するアミンは、例えば、式Ｉ〜ＶＩの化合物を生じさせる方に向けて追加の工程を実施することによって更に変換することができる。しかして、例えば、本発明に従う方法は、下記の工程：
Ｄ）環外アミンに基：−Ｃ（＝Ｚ）ＬＲ_１又は−Ｚ’ＶＲ_５をカップリングさせること、
Ｅ）環外アミンに基：−Ｒ_７又は−ＬＲ_２をカップリングさせること、
Ｆ）Ｙを有する基に基：−ＮＪ_２Ｎ（Ｒ_９）又は−ＸＬＲ_４をカップリングさせること、
Ｇ）環の窒素に基：−ＭＲ_３又は−ＧＲ_６をカップリングさせること
Ｈ）環の窒素から保護基を除去すること、
Ｉ）Ｙを有する基から保持基を除去すること、
Ｊ）環外アミンに窒素保護基を置くこと、
Ｋ）環外アミンから保持基を除去すること
［ここで、
Ｌ、Ｊ、Ｒ_９、Ｍ、Ｒ_３及びＲ_６は上で定義した通りであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれについて独立して、Ｈ、低級アルキル、−（ＣＨ_２）_ｎアリール（置換又は非置換の）又は−（ＣＨ_２）_ｎヘテロアリール（置換又は非置換の）を表わし、
ＺはＯ又はＳであり、
Ｚ’は不存在であるか又は−ＳＯ_２−、−（Ｃ＝Ｓ）−若しくは−（Ｃ＝Ｏ）−を表わし、
Ｖは不存在であるか又はＯ、Ｓ若しくはＮＲ_８を表わし、
Ｒ_５は置換又は非置換のアルキル（分岐状又は非分岐状の）、アルケニル（分岐状又非分岐状の）、アルキニル（分岐状又非分岐状の）、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わし、
Ｒ_７は置換又非置換のアリール、アラルキル、ヘテロアリール又はヘテロアラルキルを表わす］
の一つ以上を含む。
【０１４３】
工程Ｄ〜Ｋのどれも、選択できるときは、斯界で周知であるように、種々の反応及び保護基に応じて、任意の順序で達成することができる。本法で使用するのに好適な種々の保護基を上で概説したが、これらは、このような保護基を結合させ及び除去するための多くの技術と同じように、斯界で周知であり、これらのどれも本法の範囲及び精神から離れることなく本法で使用することができる。
【０１４４】
ある種の具体例では、工程Ｄは、環外アミンをアシル化剤、例えば、酸ハロゲン化物、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホーメート、ハロチオホーメート、無水物、重炭酸エステル、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化スルフィニル、塩化カルバモイル、塩化チオカルバモイル又は現場で製造される活性化アシル化部分と反応させることによって達成することができる。アシル化剤は、現場で、例えば、カルボン酸を、カルボジイミド（例えば、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドなど）、燐系反応剤（例えば、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＰｙＢＲＯＰなど）、塩化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲンのような活性化剤、又はカルボン酸基と反応してアミンとのカップリングに向けて該カルボン酸と比べて感受性が増大した反応性中間体をもたらす任意のその他の反応剤と反応させることによって達成することができる。有機合成、特にペプチドのカップリングの分野では広範囲のこのような反応剤が周知である。同様に、第一アミン又はアルコールを、例えば、カルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン、ジホスゲンなどのようなホスゲンの均等物、又はチオホスゲン、チオカルボニルジイミダゾールなどのようなチオホスゲンの均等物により処理して、アミンと反応して尿素又はチオ尿素を形成できるアシル化剤（例えば、イソシアネート、イソチオシアネート、クロルホルムアミド又はクロルチオホルムアミド）を、その単離又は精製を必要とすることなく、発生させることができる。
【０１４５】
Ｍ又ＧがＳＯ_２、Ｃ＝Ｏ又はＣ＝Ｓを表わす具体例では、工程Ｇは、上記の工程Ｄについて説明したような反応剤及び技術を強い使用して達成することができる。Ｍ又はＧが不存在である具体例では、工程Ｇは、環外アミンを親電子性反応剤、例えばハロゲン化又はスルホン酸アルキル、ハロゲン化又はスルホン酸アラルキル、ハロゲン化又はスルホン酸ヘテロアラルキル、ハロゲン化又はスルホン酸シクロアルキル、ハロゲン化又はスルホン酸シクロアルキルアルキル、ハロゲン化又はスルホン酸ヘテロシクシル、或いはハロゲン化又はスルホン酸ヘテロシクシルアルキルと反応させることによって達成することができる。別法として、工程Ｇは、還元的アルキル化、例えば、環外アミンを適当に置換されたアルデヒドと、硼水素化ナトリウムのような還元剤の存在下に反応させるころによって達成することができる。
【０１４６】
ある種の具体例では、工程Ｅは、還元的アルキル化を使用して又は環外アミンをハロゲン化物若しくはスルホン酸エステルのような求電子性試薬と反応させることによって達成することができる。
【０１４７】
ある種の具体例では、工程Ｆは、エステル、チオエステル又はキサントゲン酸エステルを、例えば、式：ＨＮＪ_２Ｎ（Ｒ_９）_２又はＨＸＬＲ_４を有する化合物と、例えば、ルイス酸の存在下に、高められた温度で反応させるなどして達成することができる。その他の具体例では、工程Ｆは、カルボン酸を活性化剤、例えば、カルボジイミド（例えば、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドなど）、燐系反応剤（例えば、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＰｙＢＲＯＰなど）、塩化オキサリル、ホスゲン、トリホスゲンのような活性化剤、又はカルボン酸基と反応してアミンとのカップリングの法に向けて該カルボン酸と比べて感受性が増大した反応性中間体をもたらす任意のその他の反応剤と反応させることによって達成することができる。求核性反応剤をカルボン酸又はその誘導体（例えば、エステル、チオエステル）とカップリングさせるためのその他の技術も斯界で周知であり、ここに特に列挙したものの代わりに使用することができる。
【０１４８】
ある種の具体例では、Ｙ及びＺはＯである。
ある種の具体例では、Ｒ_１は、分岐状アルキルのような低級アルキル基、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、ネオペンチル、シクロブチル、イソブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチルメチルなどを表わす。
ある種の具体例では、ＸＬＲ_４は、一緒になって、環状アミン、例えばピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジンなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_１に結合したＬはＯ、Ｓ又はＮＲ_８、例えばＮＨを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも１個はアリール又はヘテロアリール基を含む。ある種の関連する具体例では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３の少なくとも２個はアリール又はヘテロアリール基を含む。
ある種の具体例では、Ｍは不存在である。
ある種の具体例では、ＸはＮＨではない。ある種の具体例では、Ｘは環に含まれ、又は−Ｃ（＝Ｙ）−と一緒になって第三アミドを表わす。
【０１４９】
ある種の具体例では、ＮＪ_２Ｎは、一緒になって、ピペラジンなどのような環状ジアミンを表わす。このものは、例えば、オキソ、低級アルキル、低級アルキルエーテルなどのような１個以上の置換基により置換されていてよく又は非置換であってよい。ある種の具体例では、ＮＪ_２又はＮＪＲ_９は、一緒になって、他のＮの存在が結合している置換又は非置換の複素環式環を表わす。ある種の具体例では、Ｊの一つ又は１個以上の存在は、低級アルキル、低級アルキルエーテル、低級アルキルチオエーテル、アミド、オキソなどの１種以上により置換される。ある種の具体例では、Ｊの存在を含む複素環式環は５〜８員を有する。
ある種の具体例では、Ｒ_５は分岐状アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルを表わす。
ある種の具体例では、Ｒ_６は、少なくとも１個の複素環式環、例えば、チオフェン、フラン、オキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ピロール、インドールなどを含む。
ある種の具体例では、Ｒ_７は、ベンジル基のようなフェニル基を表わし、これはハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、ニトロ、シアノ、低級アルキルエーテル（例えば、ＣＨＦ_２ＣＦ_２Ｏのように置換されていてよい）又は低級アルキルチオエーテル（例えば、ＣＦ_３Ｓのように置換されていてよい）により置換されていてよい。
ある種の具体例では、Ｒ_８は、Ｖに存在するときは、Ｈ又は低級アルキルであり、好ましくはＨである。
【０１５０】
ＩＶ．方法及び組成物の典型的適用
本発明の他の特徴は、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進を有する細胞の分化状態、生存及び／又は増殖を、主題の方法に従ってヘッジホッグアンタゴニストに細胞を接触させて調節する方法に関する。
【０１５１】
例えば脊椎動物において、分化した組織が秩序だって空間的に配置されることに、ヘッジホッグ、ｐｔｃ及びスムースンドが明らか広く関与しているという発見に照らし合わせると、主題の方法はイン・ビトロ及びイン・ビボ両方において、異なる脊椎動物組織系列の作成及び／又は維持処置の一部として用いることができる。所与の組織の増殖及び分化に関して、誘導性の有無に関わらず、適当なものであれば、ヘッジホッグアンタゴニストは上記した調製物のいずれでもありうる。
【０１５２】
例えば、本発明の方法は、遺伝上又は生化学上のいずれかの理由から、細胞がｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の表現型を有する場合、細胞培養技術に適用することができる。イン・ビトロのニューロン培養系が、ニューロン発達の研究及び神経向性因子［神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体向性因子（ＣＮＴＦ）及び脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）など］の同定において基本的で不可欠なものだということがわかっている。本発明の方法の使用法の一つとして、神経幹細胞の培養において用いるもの（例えば新しいニューロン及びグリアの作成を目的に、そのような培養において用いる）が挙げられる。主題の方法のそのような態様においては、培養細胞を本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させて、培養中の神経幹細胞の増殖率及び／又は分化の速度を変化させるか、ある種の末期分化神経細胞の培養の完全性を保持する。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、例えば感覚ニューロン又は運動ニューロンを培養することができる。そのようなニューロン培養を、簡易なアッセイ系並びに治療用の移植可能細胞源として用いることができる。
【０１５３】
本発明によると、大量の非腫瘍形成性神経幹細胞をイン・ビトロで永久保存することができ、本発明のヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによってそれらの増殖率及び／又は分化率に影響を及ぼすことができる。一般に、動物から神経幹細胞を単離する段階；これらの細胞を、好ましくは成長因子の存在下に、イン・ビトロ又はイン・ビボで永久保存する段階；及びこれらの細胞をヘッジホッグアンタゴニストに接触させることによって細胞の特定の神経表現型（例えばニューロン及びグリア）への分化を調節する段階を包含する方法が提供される。
【０１５４】
幹細胞は、分化が必要とされるまで抑制した状態に保持される、持続性抑制の影響下にあると考えられる。しかし、最終的な分化にいたる（従って非分裂性の）ニューロンとは違って、これらの細胞を増殖させる方法が近年開発されている。細胞は無限に産生され、神経変性疾患を有する異種及び自己宿主内への移植に非常に好適である。
【０１５５】
「幹細胞」とは、制限無く分裂することができ、特殊な条件下で、最終的にニューロン及びグリアなどに分化する娘細胞を産生することができる、少分化能（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）又は多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有する細胞を意味する。これらの細胞を、異種又は自己宿主への移植に用いることができる。「異種」とは、幹細胞が由来する動物以外の宿主であることを意味する。「自己」とは、細胞が由来するのと同一の宿主であることを意味する。
【０１５６】
細胞は、神経組織を有するあらゆる動物において、胎芽、生後、幼若、又は成人の神経組織から得ることができる。より具体的には、あらゆる魚類、は虫類、鳥類、両生類又はほ乳類などが挙げられる。最も好ましいドナーはほ乳類、特にマウス及びヒトである。
【０１５７】
非ヒト異種ドナー動物を用いる場合、動物を安楽死させ、脳及び対象とする特異な領域を無菌の処理工程によって取り出す。特に対象となる脳の領域としては、宿主の脳の変質した領域の機能を回復するのに用いられる幹細胞が得られる領域であれば、どのような領域でも含まれる。そのような領域の例としては、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、脊髄及び脳室組織などの中枢神経系（ＣＮＳ）の領域、頸動脈小体及び副腎髄質などの末梢神経系（ＰＮＳ）の領域が挙げられる。特に、大脳基底核における領域、好ましくは尾状核及び被殻からなる線条、又は淡蒼球、視床下核などの様々な細胞群、アルツハイマー病患者中で変質がみられる核基底、又はパーキンソン病患者で変質がみられる黒質緻密部が挙げられる。
【０１５８】
ヒト異種神経幹細胞は、人工妊娠中絶から得た胎児組織に由来するものでもよいし、生後、幼若又は成人の臓器ドナーから得たものであってもよい。自己神経組織はバイオプシーによって得ることもできるし、神経外科、具体的には癲癇手術、さらに具体的には側頭葉切除術及び海馬切除術で、神経組織を除去した患者から得ることもできる。
【０１５９】
ドナー組織の連結細胞外基質から個々の細胞を解離することによって、細胞を得ることができる。解離は、公知の方法、例えばトリプシン、コラゲナーゼなどの酵素による処理によって、（先端の尖っていない器具を用いる）物理的な解離方法によって、又はメスを用いる微塵切りによって実施する。これにより組織から得た特異な細胞型の増殖が可能になる。胎児細胞の解離は、組織培養基内で行うことができるが、幼若及び成人細胞の解離に好ましい培養基は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。一般的なａＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３及び１０ｍＭ Ｄ−グルコースを含んでいる。ＭｇＣｌ２を３．２ｍＭの濃度で、ＣａＣｌ２を０．１ｍＭの濃度で含むことを除いては、低Ｃａ２＋ａＣＳＦは同じ成分を含んでいる。
【０１６０】
解離した細胞は、細胞成長を支持する公知のあらゆる培養基で培養することができる。培養基の例としては、細胞の代謝に必要な追加成分（グルタミン及び他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルなど）及び有用な蛋白質（トランスフェリンなど）を含む、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などが挙げられる。培養基は、酵母菌、バクテリア及び菌類などによる汚染を防ぐ抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を更に含んでいてもよい。ある場合には、培養基はウシ、ウマ、ニワトリなどに由来する血清を含んでいてもよい。特に好ましい細胞培養基は、ＤＭＥＭ及びＦ−１２の混合物である。
【０１６１】
培養条件は、生理条件に近いものでなければならない。培養基のｐＨは、生理的ｐＨに近いもの、好ましくはｐＨ６−８、より好ましくはｐＨ７、更により好ましくはｐＨ７．４に近いものでなければならない。細胞は生理的温度に近いもの、好ましくは３０−４０℃、より好ましくは３２−３８℃、更により好ましくは３５−３７℃で培養されなければならない。
【０１６２】
細胞は懸濁液中で又は固定基質上で育成することができるが、幹細胞の増殖は、多数の細胞が「凝集塊」を形成するように好ましくは懸濁液中で行われる（例えばＲｅｙｎｏｌｄｓ他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：１０７０−１７０９；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９１１９、ＷＯ９４／１０２９２、及びＷＯ９４／１６７１８参照）。増殖中（又は分裂中）の懸濁細胞の場合、フラスコを十分に振盪し、凝集塊をフラスコ底角に沈殿させる。凝集塊を５０ｍｌ遠心分離管に移し、低速で遠心分離する。培養基を吸引して、成長因子を含む少量の培養基に細胞を再懸濁する。細胞を機械的に解離して、培養基の別々のアリコートに再懸濁する。
【０１６３】
培養基中の細胞懸濁液に、幹細胞の増殖を可能にする成長因子を補充し、細胞を支持することのできる容器に入れるが、上記したように、好ましくは培養フラスコ又はローラーボトルに入れる。細胞は一般に３−４日間、３７℃の保温器内に入れることで増殖する。細胞を解離し、成長因子を含む培養基中に再懸濁することによっていつでも増殖を再開することができる。
【０１６４】
基質の非存在下では、細胞はフラスコの床を離れて懸濁液中で増殖を続け、未分化細胞の中空凝集塊を形成する。イン・ビトロにて約３−１０日後から、増殖群（凝集塊）を２−７日ごと、好ましくは２−４日ごとに、緩やかな遠心分離によって供給し、成長因子を含む培養基に再懸濁する。
【０１６５】
イン・ビトロで６−７日後に、凝集塊中の個々の細胞を、先端の尖っていない器具で物理的に解離して（より具体的にはピペットで凝集塊を砕いて）分離する。解離した凝集塊からの個々の細胞を、成長因子を含む培養基に再懸濁し、ヘッジホッグアンタゴニストの存在下で細胞を培養する（又は再懸濁する）ことによって、細胞の分化を培養中で制御する。
【０１６６】
主題のヘッジホッグアンタゴニストの他の使用法をさらに例証するものとして、脳内移植が中枢神経系治療の更なる方法として用いられるようになったことを挙げておく。例えば、損傷した脳組織を修復する一つの方法として、胎児又は新生児の細胞を成人の脳に移植する方法が挙げられる（Ｄｕｎｎｅｔｔ他（１９８７）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ１２３：２６５−２８９；及びＦｒｅｕｎｄ他（１９８５）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ５：６０３−６１６）。様々な脳領域から取った胎児ニューロンを、成人の脳にうまく組み込むことができ、その結果、行動上の欠陥を緩和することができる。例えば、脳幹神経節に対するドーパミン作用性突起物における損傷によって起こる運動障害は、胎芽のドーパミン作用性ニューロンを移植することによって避けることができる。新皮質の損傷によって起こる複雑認識機能の障害は、胎芽の皮質細胞を移植することによって部分的に回復させることができる。主題の方法を用いて培養の成長状態を調節することができ、胎児組織が用いられる場合には、特に神経幹細胞を用いて、幹細胞の分化率を調節することができる。
【０１６７】
本発明で用いることのできる幹細胞は、公知のものである。例えば、幾つかの神経冠細胞が同定されているが、そのうちの幾つかは多分化能を有しており拘束されていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）神経冠細胞を代表し、その他は一種類のみの細胞を産生する拘束された（ｃｏｍｉｉｔｔｅｄ）幹細胞を代表する。本発明の方法において、そのような幹細胞の培養に用いられるヘッジホッグアンタゴニストの役割としては、拘束されていない幹細胞の分化の調節；又は拘束された幹細胞の、神経細胞になる最終的分化へ向かう発達の更なる制限の調節が挙げられる。例えば、本発明の方法をイン・ビトロで用いて、神経冠細胞のグリア細胞、シュワン細胞、クロム親和性細胞、コリン作動性交感ニューロン又は副交感ニューロン、並びにペプチド作動性及びセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節することができる。ヘッジホッグアンタゴニストは単独で用いることもできるし、神経幹細胞の特定の分化をさらに促進する他の神経向性因子と組み合わせて用いることもできる。
【０１６８】
本発明の主題のヘッジホッグアンタゴニストの存在下で培養した細胞の移植に加えて、本発明のさらに他の特徴は、ヘッジホッグアンタゴニストを適用して、中枢神経系と末梢神経系両方のニューロン及び他のニューロン細胞の成長状態を調節することに関する。ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、神経系発達中と、おそらくは成人期にニューロンの分化を調節する能力を有する。このことは、主題のヘッジホッグアンタゴニストがある場合において、正常細胞の保持、機能遂行及び老化；化学的又は機械的に損傷を受けた細胞の修復及び再生；及びある種の病理学上の条件下での変質の治療に関して、成人ニューロンを制御するであろうことを示している。これに鑑みて、本発明は特に主題の方法を下記に由来する神経系状態の治療プロトコル（予防及び／又は病状の低減）に適用することを企図する。（ｉ）外傷、化学的損傷、血管損傷及び欠陥（例えば脳卒中による虚血）、感染性／炎症性及び腫瘍性損傷などの神経系の急性、亜急性、又は慢性の損傷；（ｉｉ）アルツハイマー病などの神経系の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性などの慢性神経変性疾患；及び（ｉｖ）多発性硬化症などの、神経系の又は神経系に影響を与える慢性免疫疾患。
【０１６９】
適正に行えば、主題の方法を用いて中枢及び末梢神経損傷を修復する、人工神経を作成することができる。特に、潰れた又は切断された軸索に、人工器具を用いて管を取り付ける場合には、人工器具にヘッジホッグアンタゴニストを添加して、成長速度及び樹状突起の再生を調節することができる。神経導入経路の例は、米国特許第５，０９２，８７１号及び第４，９５５，８９２号に記載がある。
【０１７０】
他の態様においては、主題の方法を（例えば中枢神経系において起こる）悪性又は過形成性形質転換の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、そのような形質転換細胞を分裂終了又は自死状態にすることができる。従って本発明の方法は、例えば悪性神経膠腫、髄膜腫、髄芽細胞腫、神経外胚葉腫及び脳室上皮腫の治療の一部に用いることができる。
【０１７１】
好ましい態様においては、主題の方法を、悪性髄芽細胞腫及び他の一次ＣＮＳ悪性神経外胚葉腫の治療養生法の一部として用いることができる。
【０１７２】
ある態様においては、主題の方法を髄芽細胞腫の治療プログラムの一部として用いることができる。一次脳腫瘍である髄芽細胞腫は、子供にみられる最も一般的な脳腫瘍である。髄芽細胞腫は後窩に発生する初期神経外胚葉腫（ＰＮＥＴ）である。これは小児脳腫瘍の原因の約２５％を占めている（Ｍｉｌｌｅｒ）。髄芽細胞腫は組織構造的には、一般にロゼット状に配置された小型の丸い細胞腫であるが、いくつかは星状細胞、上衣細胞又はニューロンに分化する（Ｒｏｒｋｅ；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ）。ＰＮＥＴは松果体（松果体芽細胞腫）及び大脳を含む脳の他の領域に起こりうる。テント上方領域に起こるこれらは、一般にＰＦ同等物より病状が重い。
【０１７３】
髄芽細胞腫／ＰＮＥＴは切除術の後ＣＮＳのどこにでも再発し、骨にまで移転することが知られる。従って前処理評価において、「脱落（ｄｒｏｐｐｅｄ）移転」の可能性を除外するための脊髄の検査が行われる。このため一般に、脊髄造影法の代わりにガドリニウム促進ＭＲＩが行われており、術後の日常操作としてＣＳＦ細胞診断が得られる。
【０１７４】
他の態様においては、主題の方法が脳室上皮腫の治療プログラムの一部として用いられる。脳室上皮腫は、小児脳腫瘍の原因の約１０％を占めている。概して、脳室上皮腫は脳室の上衣ライニングに起こる腫瘍であり、顕微鏡的な大きさのロゼット、カナル及び血管周囲のロゼットを形成する。脳室上皮腫について報告された５１人の小児のＣＨＯＰにおいて、３／４が組織構造上は良性であった。約２／３が第４の脳室に由来した。１／３がテント上方領域に存在した。ＳＥＥＲのデータ及びＣＨＯＰのデータが示すように、０歳から４歳の間にそれらがピークに達した。中央値の年齢は５歳であった。この疾病を有する小児の多くが乳児なので、多様な治療法が必要とされる。
【０１７５】
本発明のさらに他の特徴は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、上記した神経分化に加えて、他の脊椎動物有機物質経路に関与する形態発生シグナルに関与し、内胚葉のパターン形成、中胚葉及び内胚葉の分化過程に明らかに役割を果たしているという観察に関する。従って本発明は、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成物を、非神経組織の産生及び保持に関わる細胞培養及び治療法の両方に用いることを企図する。
【０１７６】
一つの態様において、本発明はｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが、原腸に由来する消化管、肝臓、肺及び他の臓器の形成に関与する幹細胞の発達の制御に明らかに関与しているという発見を利用するものである。Ｓｈｈは内胚葉から中胚葉への誘導シグナルとして提供されるが、これは腸管形態形成に非常に重要である。従って、例えば本発明の方法のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、正常な肝臓の複数の代謝機能を有する人工肝臓の発達及び維持を調節することができる。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、消化管幹細胞の増殖及び分化を調節し、肝細胞培養を形成して、細胞外基質を稠密にさせるのに用いるかあるいは生体適合性重合体に封入して移植可能及び体外人工肝臓を形成することができる。
【０１７７】
他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの治療組成物を、人工肝臓、胎芽肝臓構造などの移植とともに用いて、腹腔内移植、血管新生及び生体内分化の取り込み並びに移植された肝臓組織の維持を調節することができる。
【０１７８】
さらに他の態様においては、主題の方法を治療に用いて、物理的、化学的又は病理学的損傷を受けた後の上記のような臓器を調節することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する治療用組成物を、肝切除術に次ぐ肝臓修復に用いることができる。
【０１７９】
胎芽の腸管からの膵臓及び小腸の形成は、腸管の内胚葉細胞と中胚葉細胞との間の細胞間シグナリングに依存している。特に、腸の中胚葉の平滑筋への分化は、隣接する内胚葉細胞からのシグナルに依存することが示唆されている。胎芽の後腸における内胚葉に由来するシグナル媒介物の候補の一つとして、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグがある（例えばＡｐｅｌｑｖｉｓｔ他（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ７：８０１−４参照）。Ｓｈｈ遺伝子は胎芽の腸管内胚葉に渡って発現されるが、これには例外があって、膵臓芽内胚葉では、膵臓発達初期の必須レギュレーターであるホメオドメインタンパク質Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１ （インシュリンプロモーター因子１／膵臓及び十二指腸ホメオボックス１）が高レベルで発現される。Ａｐｅｌｑｖｉｓｔ他（上述）では、胎芽の腸管におけるＳｈｈの差異発現が、取り巻く中胚葉から小腸及び膵臓といった特異な中胚葉誘導体への分化を制御するかどうかを研究している。該文献ではこれを調べるために、Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターを用いて、発達中の膵臓上皮におけるＳｈｈを選択的に発現している。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈトランスジェニックマウスにおいて、膵臓中胚葉は膵臓間充織及び脾臓へ分化せず、平滑筋及び腸管カハル細胞（腸管に特徴的な細胞）に発達した。さらに、Ｓｈｈに接触させた膵臓外植は、同様の腸管分化を経た。これらの結果は、内胚葉に由来するＳｈｈの差異発現が、腸管の異なる領域における隣接する中胚葉の分化を制御することを意味している。
【０１８０】
従って本発明の文脈では、主題のヘッジホッグアンタゴニストを用いて、イン・ビボ及びイン・ビトロの両方において膵臓組織の増殖及び／又は分化を制御又は調節することを企図する。
【０１８１】
本発明の阻害剤が治療効果をもたらす、様々な病理学上の細胞増殖及び分化条件がある。例えば異常なインシュリン発現の修正、又は分化の調節などが挙げられる。しかしより一般的には、本発明は、膵臓細胞を主題の阻害剤に接触させることによって、細胞の分化状態を誘導及び／又は維持し、生存を強化し及び／又は増殖へ影響を与える方法に関する。例えば、膵臓組織の秩序だった空間的配置形成にｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが明らかに関与していることから、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方でそのような組織を産生及び／又は維持する方法の一部として主題の方法を用いることが本発明によって企図される。例えば、ヘッジホッグの機能の調節は、細胞及びおそらくは非膵臓組織の産生及び維持に関与する、細胞培養及び治療法の両方に（例えば原腸に由来する消化管、脾臓、肺、泌尿生殖器（例えば、膀胱）及び他の臓器からの組織の発達及び維持の制御に）用いることができる。
【０１８２】
例証的な態様においては、本発明の方法を、特に膵臓細胞の異常な増殖によって特徴づけられる、膵臓組織の過形成性及び腫瘍性疾患の治療に用いることができる。例えば膵臓癌は、膵臓のインシュリン分泌量に調節をきたす、膵臓細胞の異常な増殖によって特徴付けられる。例えば膵癌などのある種の膵臓過形成は、β細胞の機能不全又は島細胞重量の減少によって、低インシュリン血症を引き起こす。病状の進行において異常なｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドシグナリングが示される程度まで、主題のインヒビターを用いて抗腫瘍治療の後の組織再生を促進することができる。
【０１８３】
その上さらに、異なる点でヘッジホッグシグナリング特性を操作することは、イン・ビボ及びイン・ビトロの両方における膵臓組織復元／再生技術の一部として有用である。一つの態様においては本発明は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及びスムースンドが膵臓組織の発達の調節に関与していることを利用する。一般に、主題の方法を治療的に用いて、物理的、化学的又は病理的傷害の後に膵臓を調節することができる。さらに他の態様において、主題の方法を細胞培養技術に適用することができ、特に人工膵臓組織の初期形成の促進に用いることができる。例えばヘッジホッグ活性を変化させることによる膵臓組織の増殖及び分化の操作は、培養組織の特徴をより注意深く制御する手段を提供する。例証的な態様においては、主題の方法を用いて、例えば下記に記載のある封入装置に用いることのできる、β島細胞を必要とする人工器官の産生を増加させることができる（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ他、米国特許第４，８９２，５３８号、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ他、米国特許第５，１０６，６２７号、Ｌｉｍ、米国特許第４，３９１，９０９号、及びＳｅｆｔｏｎ、米国特許第４，３５３，８８８号）。膵島の初期幹細胞は多分化能を有し、最初に出現したときから、全ての島細胞特異的遺伝子を共活性化するのは明らかである。分化が進むにつれて、島細胞特異的ホルモン（例えばインシュリン）の発現は、成熟島細胞に特徴的な発現パターンに制限される。しかし、成熟β細胞における胎芽の特徴の再発が観察できるようになると、成熟島細胞の表現型は培養中では安定しない。主題のヘッジホッグアンタゴニストを利用することによって、細胞の分化経路又は増殖率を調節することができる。
【０１８４】
さらに、膵臓組織の分化状態の操作を、人工膵臓の移植と組み合わせて利用して、移植、血管新生及び生体内分化、並びに移植された組織の維持を促進することができる。例えば、組織分化に影響するヘッジホッグ機能の操作を、移植片の生存能力を維持する手段として利用することができる。
Ｂｅｌｌｕｓｃｉ他（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：５３には、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグが肺間充織細胞増殖をイン・ビボで調節することが報告されている。従って、本発明の方法を用いて、（例えば肺気腫の治療における）肺組織の再生を調節することができる。
【０１８５】
Ｆｕｊｉｔａ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｉｎ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ２３８：６５８には、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグがヒト肺扁平上皮癌及び腺癌において発現することが報告されている。Ｓｏｎｉｃヘッジホッグの発現は、ヒト肺扁平上皮癌組織において検出されたが、同じ患者の正常な肺組織においては検出されなかった。上記文献は、ＳｏｎｉｃヘッジホッグがＢｒｄＵの癌細胞への取り込みを刺激し、細胞成長を刺激する一方で、抗Ｓｈｈ−Ｎが細胞成長を阻害することも報告している。これらの結果は、ｐｔｃ、ヘッジホッグ及び／又はスムースンドが、そのように形質転換した肺組織の細胞成長に関与していることを示唆し、従って主題の方法を、肺癌及び腺癌、並びに肺上皮に関する増殖疾患の治療の一部として用いることができることを示している。
【０１８６】
これらの腫瘍にヘッジホッグ経路が関与していること、又は発達の際にこれらの組織中にヘッジホッグ及びその受容体の発現が検出されることに鑑みて、主題の化合物による処置によって、他の多くの腫瘍に影響を与えうる。そのような腫瘍の例としては、ゴーリン症候群に関する腫瘍（例えば基底細胞癌、髄芽細胞腫、髄膜腫など）、ｐｃｔノックアウトマウスにみられる腫瘍（例えば血管腫、横紋筋肉腫など）、ｇｌｉ−１増幅の結果起こる腫瘍（例えば神経グリア芽細胞腫、肉腫など）、ＴＲＣ８、ｐｔｃ相同体に連結した腫瘍（例えば腎臓癌、甲状腺癌など）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば骨癌など）、Ｓｈｈ誘導腫瘍（例えば肺癌、軟骨肉腫など）及び他の腫瘍（例えば乳癌、尿生殖器（例えば腎臓、膀胱、尿管、前立腺など）癌、副腎癌、胃腸（例えば胃、腸など）癌など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを包含する組成物を用いて、例えば骨格形成性幹細胞から骨格組織をイン・ビトロで産生すること、並びにイン・ビボで骨格組織欠陥を治療することができる。本発明は特に、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて軟骨形成軟骨形成及び／又は骨形成の速度を調節することを企図する。ここでいう「骨格組織欠陥」とは、欠陥がどのような由来（例えば外科手術的介入、腫瘍の除去、潰瘍形成、移植、骨折又は他の外傷あるいは変性状態）であれ、骨又は結合組織の回復が望まれる場所における、骨又は他の骨格結合組織の欠陥のことをいう。
【０１８８】
例えば本発明の方法を、結合組織の軟骨機能の回復を目的とする養生法の一部として用いることができる。そのような方法は、例えば変性摩耗（関節炎など）、並びに組織の外傷（摩耗した半月板組織の置き換え、半月板切除、靱帯の摩耗による関節の緩み、関節の悪性腫瘍、骨折などの組織の外傷により生じる、又は遺伝病により生じうるもの）などの他の機械的傷害の結果起こる、軟骨組織における欠陥又は損傷の回復において有用である。本発明の修復方法は、成形外科、再建術及び歯周手術などの、軟骨基質の再構成に有用である。本発明の方法は、半月板、靱帯又は軟骨の手術による修復に続く、前修復段階の改善に適用することができる。その上更に、本発明の方法は、外傷を受けた後の早い時期に適用された場合には、変性疾患の発症又は病状再燃を防ぎうる。
【０１８９】
本発明の一つの態様において、主題の方法は、治療上十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト（特に、インディアンヘッジホッグシグナル変換に対して選択的なアンタゴニスト）によって疾患のある結合組織を処置し、組織の有する軟骨細胞の分化及び／又は増殖速度を操作することによって、結合組織における軟骨修復応答を調節することを包含する。関節軟骨、関節間軟骨（半月板）、肋軟骨（真肋と胸骨を連結する）、靱帯及び腱などの結合組織は、主題の方法を用いる再建及び／又は再生治療における処置に特に敏感に反応する。ここで言う「再生治療」には、組織の欠陥が明らかに現れる点まで進行した変性状態の治療、変性が初期段階又は切迫した状態である組織の予防治療が含まれる。
【０１９０】
例証的な態様において、主題の方法を、膝、足首、肘、臀部、手首、手又は足の指関節、又は上顎関節などの可動関節の軟骨の治療における治療的介入の一部として用いることができる。治療は関節の半月板、関節軟骨、又はその両方を対象とすることができる。更に例証すると、主題の方法は外傷（例えばスポーツによる傷害又は過度の摩耗）又は変性関節炎の結果起こりうる膝の変性疾患の治療に用いることができる。主題のアンタゴニストは、例えば関節鏡検査針を用いて、関節に注射して投与してもよい。ある場合には投与される薬剤は、薬剤と治療組織との接触を延長させ定常的なものとするために、ヒドロゲル又は上記した他の緩効性賦形剤の形状をとることができる。
【０１９１】
本発明は、軟骨移植及び人工器官治療の分野において主題の方法を使用することを更に企図する。しかし、例えば軟骨と繊維軟骨の特性は組織によって（例えば関節、半月板軟骨、靱帯及び腱の間で；同じ靱帯又は腱の両端の間で；そして同じ組織の表面部と深淵部との間で）異なるので、問題が生じる。これらの組織の空間的配置は、機械的特性上の緩やかな変化を反映しうるので、これらの条件下にある未分化の移植組織が、適当に応答する能力を有していない場合には、機能不全が起こる。例えば、半月板軟骨が前十字靱帯の修復に用いられる場合、組織に化生が起こり純粋な繊維組織になる。軟骨形成の速度を調節することによって、新しい環境に移植細胞を適合させ、組織の初期発達段階の肥大軟骨細胞に類似させるように制御して、主題の方法を特にこの問題を対処するように用いることができる。
【０１９２】
同様に、主題の方法を適用して、人工軟骨の作成及び移植の両方を促進することができる。改善された治療法が必要とされているため、コラーゲン−グリコサミノゲン鋳型［Ｓｔｏｎｅ他（１９９０）Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｄ２５２：１２９］、単離軟骨細胞［Ｇｒａｎｄｅ他（１９８９）Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ７：２０８；及びＴａｋｉｇａｗａ他（１９８７）Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ２：４４９］及び天然又は合成重合体に連結した軟骨細胞［Ｗａｌｉｔａｎｉ他（１９８９）Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｔ Ｓｕｒｇ７１Ｂ：７４；Ｖａｃａｎｔｉ他（１９９１）Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ８８：７５３；ｖｏｎ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ他（１９９１）ＪＢｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ２５：３２９；Ｆｒｅｅｄ他（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ２７：１１；及びＶａｃａｎｔｉ他、米国特許第５，０４１，１３８号］に基づいて、新たな軟骨の作成を目的に研究がされてきた。例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースなどの重合体、あるいは重合体主鎖の加水分解機能で長期にわたって無害のモノマーに分解される他の重合体から形成される、生分解性及び生体適合性を有する多孔質の骨格上の培養基で、軟骨細胞を育成することができる。基質は、移植までに、細胞の適当な栄養供給とガス交換が可能なように設計されている。細胞は、移植する細胞の体積及び密度が適当に大きくなるまでイン・ビトロで培養することができる。基質を用いると、個々が望ましい形状に型どりでき、最終産物を患者自身の例えば耳又は鼻に似せることができるという利点がある。あるいは柔軟な基質を用いて、例えば関節に移植する際に整復することができる。
【０１９３】
主題の方法の一つの態様においては、培養工程のある段階において、移植組織片をヘッジホッグアンタゴニストに接触させて、軟骨細胞の分化の速度及び培養内の肥大軟骨細胞の形成を制御する。
【０１９４】
他の態様においては、移植された人工組織をヘッジホッグアンタゴニストで処置して、移植された基質を能動的に形作って意図する機能に好適なものとする。組織移植に関して上記したように、人工移植には、移植された実際の機械的環境との比較が可能な環境に基質が由来するものではないという、同じ欠点がある。主題の方法の有する、基質において軟骨細胞を調節する能力によって、置換される予定の組織と同様の特徴を移植片が獲得できるようになる。
【０１９５】
更に他の態様において、主題の方法は、人工器官の付着を促進するのに用いられる。例えば主題の方法を、人工歯周器官の移植に用いることができる。ここでは周辺の結合組織を処置することによって、人工器官を取り巻く歯周靱帯の形成が刺激される。
【０１９６】
更に他の態様においては、主題の方法を、動物の骨格組織の欠陥部位における骨形成を目的とした養生法の一部として用いることができる。Ｉｎｄｉａｎヘッジホッグは、最終的に骨芽細胞に置換される肥大軟骨細胞に特に関連している。例えば被験者の骨損失を調節する方法の一部として、本発明のヘッジホッグアンタゴニストを投与することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを包含する調製物を用いて、例えば骨化の「モデル」形成における軟骨内骨化を制御することができる。
【０１９７】
本発明の更に他の態様において、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて精子形成を調節することができる。ヘッジホッグタンパク質、特にＤｈｈは、精巣生殖細胞の分化及び／又は増殖及び維持に関連していることが示されている。Ｄｈｈの発現は、Ｓｒｙ（精巣決定遺伝子）活性化の直後にセルトリ細胞前駆体において誘導され、成人の精巣においても持続する。成熟精子が全く存在しないので、男性は生存可能であるが不妊である。様々な遺伝子背景において発達中の精巣を検査したところ、Ｄｈｈは精子形成の初期段階及び後期段階の両方を調節することが示唆された［Ｂｉｔｇｏｏｄ他（１９９６）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ６：２９８］。好ましい態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストを避妊薬として用いることができる。同様に、主題の方法のヘッジホッグアンタゴニストは、正常な卵巣機能の調節に有用である可能性がある。
【０１９８】
主題の方法は、上皮組織に起こる疾患の予防処置、化粧などに幅広く適用することができる。一般にこの方法は、処置を行った上皮組織の成長状態が変化するのに有効な量のヘッジホッグアンタゴニストを、動物に投与する段階を含むことを特徴とする。投与の方法及び用量計画は、処置される上皮組織に応じて異なる。例えば、処置される組織が表皮組織（皮膚組織又は粘膜組織）である場合には、局所的な投与が好ましい。
【０１９９】
「傷の治癒を促進する」方法で処置を行った場合には、この処置を用いない場合の傷の治癒と比較して、より速く傷が治癒する。「傷の治癒の促進」とは、とりわけケラチン合成細胞の増殖及び／又は成長を調節する方法、又はより少ない傷跡、より少ない傷収縮、より少ないコラーゲン付着及びより表層でおこるの傷の治癒を意味する。ある場合においては、「傷の治癒の促進」とは、本発明の方法を用いたときに、ある種の傷治癒の方法が改善された継代速度（例えば皮膚移植の生着速度）を有することも意味する。
【０２００】
現在まで再建術に有意な進歩があったにもかかわらず、治癒される皮膚の正常機能及び外観の回復において、傷跡は重大な障害になりうる。これは、手や顔のケロイド又は肥大性傷跡などの病理的傷跡が機能障害及び肉体的変形の原因となっている場合に特にあてはまる。最も厳しい状況においては、そのような傷跡は心理的な悩みを引き起こし、経済的な負担にもなる。傷の回復は、止血作用、炎症、増殖及び再形成の段階を含む。増殖段階は、繊維芽細胞並びに内皮及び上皮細胞の増加を含む。傷の閉鎖を促進する及び／又は瘢痕組織の形成を最小化するために、主題の方法の使用を通じて、傷内及び周辺の上皮細胞の増殖速度を制御することができる。
【０２０１】
本発明の処置は、例えば放射線療法及び／又は化学療法の結果起こる口内炎及び口腔傍炎の治療を目的とした、治療養生法の一部として有効である。そのような潰瘍は一般に化学療法又は放射線療法の後、数日以内に発達する。一般に、これらの潰瘍は始めには、灰色の壊死性膜によって覆われ炎症組織によって囲まれる、痛みを伴う、小さな不定形の傷である。多くの場合、処置を施さないでいると、炎症基部上の傷周辺の組織が増殖する。例えば、潰瘍の周縁にある上皮組織が増殖活性を示し、その結果表面上皮組織の連続性が失われる。傷が大きくなり上皮組織の保全性が失われるので、二次感染を起こす可能性がある。食物及び水を摂取する度に痛みを感じ、潰瘍が消化管を通じて増殖した場合には、様々な要因が加わり下痢が起こる。本発明によると、ヘッジホッグアンタゴニストを適用してそのような潰瘍を処置することによって、患部上皮組織の異常な増殖及び分化を低減することができ、それに続く炎症に伴う苦痛を低減することができる。
【０２０２】
主題の方法及び組成物を用いて、自己免疫疾患に由来する傷（例えば乾癬）などの皮膚科学疾患に由来する傷を治療することができる。アトピー性皮膚炎とは、花粉、食物、鱗屑、昆虫毒及び植物毒などのアレルゲンによって引き起こされる免疫応答に関連したアレルギーの結果起こる皮膚の外傷のことをいう。
【０２０３】
他の態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストの抗増殖調製物を用いて、水晶体上皮細胞増殖を阻害して、嚢外白内障摘出の術後合併症を防ぐことができる。白内障は、難治性の眼病であり、白内障の治療について様々な研究がなされてきた。現在、白内障の治療は外科手術によって行われている。白内障の外科術は、長い間用いられており、様々な手術法が研究されてきた。嚢外水晶体摘出が、白内障除去の手段として用いられている。嚢外摘出に用いるこの方法には、無水晶体類嚢胞黄斑浮腫及び網膜剥離が起こりにくいという医療上の利点がある。嚢外摘出は、後眼房型眼内水晶体（ほとんどの場合に用いられるべき水晶体と考えられている）の移植に必要である。
【０２０４】
しかし嚢外白内障摘出には、後水晶体嚢の不透明化（後白内障と称される）が起こりやすいという欠点がある。この不透明化は術後３年以内に５０％までの確立で起こる。後白内障は、嚢外水晶体摘出の後に残る、赤道及び後嚢水晶体上皮細胞の増殖によって起こる。これらの細胞は増殖してゾンマーリング（Ｓｏｍｍｅｒｌｉｎｇ）環を形成し、同じく後嚢に蓄積する繊維芽細胞とともに後嚢の不透明化を起こして、視界を妨げる。後白内障を予防する処置をとることが好ましい。二次白内障形成を阻害するために、主題の方法は、残った水晶体上皮細胞の増殖を阻害する手段を提供する。例えば水晶体除去の後に、後眼房にヘッジホッグアンタゴニストの調製物を含む溶液を点眼することによって、そのような細胞を静止状態に保つことができる。更に、溶液の浸透圧のバランスを保つことによって、後眼房内に適用したときに効果的な投与量を最小限にすることができ、嚢下上皮の成長をある特異性で阻害することができる。
【０２０５】
主題の方法を、角膜上皮細胞の増殖に特徴付けられる角膜疾患（例えば上皮の下方成長、眼表面の扁平上皮細胞癌といった眼の上皮の疾患）治療に用いることもできる。
【０２０６】
Ｌｅｖｉｎｅ他［（１９９７）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１７：６２７７］は、ヘッジホッグタンパク質が脊椎動物網膜における有糸分裂及び光受容体分化を調節し、Ｉｈｈが、網膜幹細胞の増殖及び光受容器の分化を促進しうる色素上皮からの要素であることを示している。同様に、Ｊｅｎｓｅｎ他［（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４：３６３］は、周生期のマウス網膜細胞の培養を、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグのアミノ末端断片で処置すると、ブロモデオキシウリジンを取り込む細胞の割合が、全細胞、桿体光受容体、無軸索細胞、ミュラー神経膠細胞において増加することを示している。このことは、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグが網膜前駆体細胞の増殖を促進することを示唆している。従って、本発明の方法を、網膜細胞の増殖疾患の治療に用いて、光受容体分化を調節することができる。
【０２０７】
本発明の更に他の特徴は、毛の成長の制御に主題の方法を使用することに関する。毛は基本的には強靱で不溶性の蛋白質ケラチンから構成される。強度はシスチンのジスルフィド結合に由来する。各毛は、円筒状の毛幹及び毛根を包含し、皮膚にフラスコ状の陥没部である毛嚢を有する。毛嚢の底部には、毛乳頭と呼ばれる指のような突起物がある。この毛乳頭を構成する結合組織から毛が成長し、結合組織を通じて血管が細胞に栄養を供給する。毛幹は皮膚表面から外部に突き出た部分であり、一方毛根とは埋没した毛の部分である。毛根の基部は毛球内で伸張し、毛乳頭上に収まっている。毛を産生する細胞は、毛嚢の毛球内で成長する。細胞が毛嚢内で増殖するにつれて、細胞は繊維の形で押し出される。毛の「成長」とは、分裂する細胞によって毛繊維が形成され伸張することをいう。
【０２０８】
当分野で知られるように、一般的な毛周期は、発育期、休止期、終止期の３つの段階に分けられる。活性期（発育期）の間、皮膚毛乳頭の表皮幹細胞は急速に分裂する。娘細胞は上方に移動し、分化して円錐状の層を形成する。移行期（休止期）は、毛嚢における幹細胞の有糸分裂の休止を特徴とする。停止段階は終止期として知られる。ここでは毛は頭皮内に数週間保持され、その下に現れる新しい毛が、終止期の毛幹を毛嚢から押し出す。このモデルから明なのは、毛細胞に分化する、分裂幹細胞の集まりが大きいほど、毛の成長が起こりやすいということである。従って、これらの幹細胞の増殖を助長する又は阻害することによって、毛の成長をそれぞれ増加又は低減する方法が得られる。
【０２０９】
ある態様においては、切断、剃毛又は脱毛などの従来の除去方法の代わりに、主題の方法をヒトの毛の成長を押さえる方法として用いることができる。例えば、本発明の方法を、異常に速い又は濃い毛の成長に特徴付けられる毛髪病（例えば多毛症）の治療に用いることができる。例証的な態様においては、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて、異常な発毛に特徴付けられる、女性の多毛症を制御することができる。主題の方法は、脱毛期間を延長する工程を提供することもできる。
【０２１０】
その上更に、ヘッジホッグアンタゴニストは、上皮細胞に細胞毒を与えるのではなく細胞分裂を停止するので、化合物は、効能を得るために細胞周期のＳ期への進行を必要とする細胞毒剤（例えば放射線誘導死）から毛嚢細胞を保護することができる。主題の方法による処置を行うことで、毛嚢細胞を休止させることによって（例えば細胞がＳ期に入るのを阻害し、従って毛嚢細胞の有糸分裂不能とプログラム細胞死を防ぐことによって）細胞を保護することができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを、通常は毛喪失が起こってしまう化学療法又は放射線療法を受けている患者に用いることができる。そのような療法の間に主題の処置を用いて、通常はプログラム細胞死に結びつく細胞周期の進行を阻害することによって、毛嚢細胞死を防ぐことができる。療法の終了後、毛嚢細胞増殖の阻害の停止と同時に、本発明の処置を停止することができる。
【０２１１】
主題の方法は、脱毛性毛嚢炎、網状瘢痕性紅斑毛嚢炎又はケロイド毛嚢炎などの毛嚢炎の治療に用いることができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストを化粧に調製したものを局所的に適用して、擬毛嚢炎を治療することができる。この毛嚢炎は、首の下顎領域における、髭剃りに関連して最もよく起こる慢性的疾患であり、紅斑性の丘疹及び毛が埋没した膿疱に特徴付けられる。
【０２１２】
本発明の他の特徴において、主題の方法を、上皮に由来する組織の分化を促進する及び／又は増殖を阻害するのに用いることができる。これら分子のそのような形態は、上皮組織に関する過形成性及び／又は腫瘍性状態を処置するための分化治療の基礎を提供することができる。例えばそのような調製物を、皮膚細胞の異常な増殖及び成長が起こる皮膚疾患の処置に用いることができる。
【０２１３】
例えば本発明の薬学的調製物は、角化症などの過形成性の表皮状態の処置、並びに様々な皮膚癌（扁平上皮細胞癌など）の高増殖率に特徴付けられる腫瘍性の表皮状態の処置に用いることを企図する。主題の方法は、皮膚に影響を与える自己免疫疾患、特に（乾癬又はアトピー性皮膚炎によって起こる）病的な増殖及び／又は表皮のケラチン化を含む、皮膚科学疾患の処置に用いることができる。
【０２１４】
乾癬、扁平上皮細胞癌、角化棘細胞腫及び光線性角化症などの多くの一般的な皮膚疾患は、局所的な異常増殖及び成長によって特徴付けられる。例えば皮膚上の落屑性の赤い隆起したプラークによって特徴付けられる乾癬においては、正常な細胞に比較してケラチン合成細胞が非常に速く増殖し、ほとんど分化しないことが知られている。
【０２１５】
一つの態様において、本発明の調製物は、炎症又は非炎症要素のいずれかによって特徴付けられる、異常な皮膚細胞の増殖を起こすケラチン化疾患に関連した皮膚科学的疾患の処置に好適である。例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの治療用調製物（例えば休止又は分化を促進する）を、皮膚、粘膜又は爪などの様々な形態の乾癬の治療に用いることができる。上記したように、乾癬は一般に、「再生」経路に沿った増殖活性及び分化を示す表皮ケラチン合成細胞によって特徴付けられる。主題の方法の、抗増殖的な態様を用いた処置は、異常な表皮活性化を反転させるのに用いることができ、疾患の軽減の維持を提供することができる。
【０２１６】
他の様々な角化症損傷も、主題の方法を用いた治療の対象となりうる。例えば光線性角化症は、日光にさらされた及び光線照射を受けた皮膚に起こる表面炎症性前癌性腫瘍である。傷は、紅斑から茶色まで様々なものにわたる。現在行われている治療には、切除術及び冷凍外科手術がある。しかしこれらの処置は苦痛を伴い、しばしば化粧に不適格な傷跡を生じる。従って、光線性角化症といった角化症の処置として、損傷の表皮／類表皮腫細胞の過増殖を阻害するのに十分な量の、ヘッジホッグアンタゴニスト組成物を好ましくは局所的に適用することが挙げられる。
【０２１７】
座瘡は、主題の方法によって処置されうる、別の皮膚科学的疾患である。例えば尋常性座瘡は、十代の若者及び成人初期において最もよく見られる多因性の疾患であり、顔及び胴体上部にみられる、炎症及び非炎症性損傷として特徴付けられる。尋常性座瘡を起こす元になる欠陥は、活動過多な皮脂腺管の過角質化である。過角質化は、皮膚及び毛嚢微生物の正常な移動を妨げ、それによってバクテリアＰｒｏｐｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及び酵母菌Ｐｉｔｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅによるリパーゼの放出が刺激される。抗増殖的なヘッジホッグアンタゴニスト、好ましくは局所用調製物で処置することが、損傷形成に結びつく管の変化（例えば過角質化）を防ぐのに有用であろう。主題の処置は、例えば抗生物質、レチノイド及び抗アンドロゲンをさらに含んでいてもよい。
【０２１８】
本発明は又、様々な形態の皮膚炎を治療する方法を提供する。皮膚炎とは、掻痒性、紅斑性、落屑性、疱疹性、湿潤性、亀裂性又は痂皮性の損傷を漠然と画定する用語である。これらの損傷は、様々な理由で起こる。最も一般的な皮膚炎はアトピー性、接触性及びおむつ皮膚炎である。脂漏性皮膚炎は慢性で通常は掻痒性の、紅斑、乾燥、湿潤又は脂様の鱗片を伴う皮膚炎で、乾燥鱗片の過度な量の剥離を伴う、様々な領域（特に頭皮）における黄色の痂皮性斑点である。主題の方法は、しばしば慢性であり通常は湿疹性皮膚炎である、鬱血性皮膚炎の処置に用いることができる。光線性皮膚炎は、太陽光線、紫外線、Ｘ又はγ放射線などの光線放射にさらされた結果起こる皮膚炎である。本発明によると、主題の方法を、上皮細胞の望まれない増殖によって起こる皮膚炎の、ある種の症状を処置及び／又は予防するのに用いることができる。様々な皮膚炎の形態に対するこうした治療法は、局所的及び全身性投与のコルチコステロイド、止痒剤及び抗生物質をさらに含むことができる。
【０２１９】
例えば、主題の方法を用いて、血管形成を阻止することができるであろうということが予想される。ヘッジホッグは、血管形成を刺激することが知られている。ヘッジホッグタンパク質を浸透させてマウスに挿入されたマトリゲル（登録商標）プラグは、実質的な新血管新生を示すが、ヘッジホッグを有しないマトリゲル（登録商標）プラグは、比較的僅かの血管新生しか示さない。ヘッジホッグタンパク質は又、通常無血管のマウス角膜の血管新生を増大させることもできる。ｐｔｃ−１遺伝子は、大動脈の内皮細胞、血管平滑筋細胞、大動脈の動脈血管外膜繊維芽細胞、心房及び心室の冠状動脈管構造及び心筋細胞を含む正常な血管組織において発現される。これらの組織も又、ヘッジホッグタンパク質に感受性である。外因性ヘッジホッグでの処理は、ｐｔｃ−１発現のアップレギュレーションを引き起こす。加えて、ヘッジホッグタンパク質は、血管平滑筋細胞の増殖をイン・ビボで刺激する。ヘッジホッグタンパク質は又、繊維芽細胞に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２などの血管形成成長因子の発現を増大させる。最後に、ヘッジホッグタンパク質は、虚血性の損傷からの回復を刺激すること及び側副血管の形成を刺激することが知られている。
【０２２０】
ヘッジホッグが血管形成を促進するとすれば、ヘッジホッグアンタゴニストは、特に、あるレベルのヘッジホッグシグナリングが血管形成に必要である状況において、血管形成阻害剤として作用することが予想される。
【０２２１】
血管形成は、多くの疾患にとって基本的に重要である。持続性の、無秩序な血管形成が、ある範囲の病気状態、腫瘍の転移及び内皮細胞の異常増殖において生じる。血管形成過程の結果として造られた脈管構造は、これらの病気においてみられる病的ダメージを支持するものである。無秩序な血管形成により造られた種々の病的状態は、血管形成依存性又は血管形成関連疾患としてグループにまとめられている。血管形成過程の制御に向けられた治療は、これらの疾患の排除又は緩和へと導くことができた。
【０２２２】
血管形成により引き起こされ、支持され又はそれに関係する疾患には、眼の新血管新生疾患、加齢関連黄斑変性、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植の拒絶、新血管新生性緑内障、水晶体後繊維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ疲労症、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、表皮爪膜乾燥症、シェーグレン酒性座瘡、、梅毒、ミコバクテリア感染症、脂質退行変性、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁表皮剥離、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナー類肉腫症、鞏膜炎、スティーヴンズ−ジョンソン病、周辺放射角膜切開、角膜移植片拒絶、慢性関節リウマチ、骨関節症慢性的炎症（例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病）、血管腫、遺伝性出血性毛細管拡張症及び遺伝性出血性毛細管拡張症が含まれる。
【０２２３】
加えて、血管形成は、癌においても重要な役割を演じている。腫瘍は、栄養を供給し且つ細胞老廃物を除去する血液の供給なしでは拡大できない。血管形成が重要である腫瘍には、固形腫瘍例えば横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫及び骨肉腫、並びに良性腫瘍例えば聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫が含まれる。血管形成因子は、幾つかの固形腫瘍と関連することが見出されている。血管形成の防止は、これらの腫瘍の成長及び腫瘍の存在の結果生じる動物のダメージを停止させることができるであろう。血管形成は又、血液から生じる腫瘍例えば白血病（これは、何れかの骨髄の様々な急性又は慢性の新生物疾患で、通常、貧血症、血液凝固機能障害及びリンパ節、肝臓及び脾臓の肥大を伴う）とも関係している。血管形成は、骨髄における白血病様腫瘍を生じさせる異常において役割を演じているということが考えられる。
【０２２４】
腫瘍の成長に加えて、血管形成は、転移においても重要である。初期においては、血管形成は、腫瘍の血管新生において重要であり、それは、癌細胞が血流に入って身体中を循環することを可能にする。腫瘍細胞が原発部位を離れて二次的な転移部位に定着した後は、新たな腫瘍が成長して拡大しうる前に、血管形成が起きなければならない。それ故、血管形成の防止は、腫瘍の転移の防止（おそらく原発部位の新生物成長を含む）に導くことができよう。
【０２２５】
血管形成は又、再生及び傷の治癒などの正常な生理的過程にも関与している。血管形成は、排卵において（及び受精後の胞胚の着床においても）重要なステップである。血管形成の防止は、無月経の誘導、排卵のブロック又は胞胚の着床の防止に利用することができよう。
【０２２６】
この発明は、呼吸障害症候群又は他の不適当な肺表面張力から生じる疾患の治療及び／又は予防において有用であろうということが予想される。呼吸障害症候群は、肺の肺胞における不十分な表面活性物質から生じる。脊椎動物の肺は、肺の膨張中に表面張力を上昇させ且つ肺の収縮中には減少する脂質とタンパク質の複雑な混合物である表面活性物質を含んでいる。肺の収縮中、表面活性物質は、肺胞をつぶす表面力がなくなるように減少する。呼息中つぶれなかった膨らんだ肺胞は、血液と肺胞ガスの間での連続的な酸素と二酸化炭素の輸送を可能にし、その後の吸息中に膨張するのにずっと小さい力しか必要としない。膨張中、肺の表面活性物質は、肺胞表面積が増大するにつれて表面張力を増大させる。膨張中の肺胞におけるすすぎ表面張力は、それらの空気を含んだ空間における過剰膨張に対抗し、吸入された空気を十分空気を含んでいない肺胞へそらし、それにより一様な肺の吸気を促進する傾向がある。
【０２２７】
呼吸障害症候群は、特に、未熟児に多い。肺の表面活性物質は、通常は、胎児期の最後の６週間まで非常に低速で合成される。正常な妊娠期間より６週間以上前に生まれたヒトの幼児は、不適当な量の肺表面活性物質及び不適当な表面活性物質合成速度を有して生まれるリスクが高い。生まれた幼児が未熟であるほど、表面活性物質欠乏は重症でありそうである。重い表面活性物質欠乏症は、誕生後数分から数時間以内に呼吸不全を生じうる。この表面活性物質欠乏症は、最大呼吸努力にもかかわらず、肺の広がる能力の減少の故に、進行性の肺胞崩壊（肺拡張不全）を生じる。その結果、幼児の血液に到達する酸素の量は不十分となる。ＲＤＳは、成人においても、典型的には表面活性物質の生合成不全の結果として生じうる。
【０２２８】
未熟児の肺組織は、ヘッジホッグシグナリング経路の高い活性を示す。この経路のヘッジホッグアンタゴニストを用いた阻害は、ラメラ体の形成を増大させ且つ表面活性物質の生合成に関与する遺伝子の発現を増大させる。ラメラ体は、表面活性物質の生合成に関係する細胞内構造である。これらの理由から、未熟児のヘッジホッグアンタゴニストでの処理は、表面活性物質の生合成を刺激してＲＤＳを改善するはずである。成人のＲＤＳがヘッジホッグ経路の活性化に関係している場合には、ヘッジホッグアンタゴニストでの処理はやはり有効なはずである。
【０２２９】
ヘッジホッグアンタゴニストの利用は、特に、冒された組織及び／又は細胞が高いヘッジホッグ経路の活性化を示す病気を標的としうるということが更に予想される。ｇｌｉ遺伝子の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路により活性化される（ｇｌｉ−１、ｇｌｉ−２及びｇｌｉ−３を含む）。ｇｌｉ−１発現は、最も首尾一貫して、広範囲の組織及び病気にわたって、ヘッジホッグシグナリング活性と相関しているが、ｇｌｉ−３は、それ程でない。このｇｌｉ遺伝子は、ヘッジホッグシグナリングの完全な効果を誘出するのに必要な多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子をコードしている。しかしながら、Ｇｌｉ−３転写因子は又、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のリプレッサーとしても作用し得て、それ故、ｇｌｉ−３の発現は、ヘッジホッグシグナリング経路の減少した効果を引き起こすことができる。Ｇｌｉ−３が転写アクチベーターとして作用するかリプレッサーとして作用するかは、転写後事象に依存しており、それ故、Ｇｌｉ−３タンパク質の活性化型（抑制型に対して）を検出する方法がヘッジホッグ経路活性化の信頼できる測定でもあろうということが予想される。ｇｌｉ−２遺伝子発現は、ヘッジホッグ経路活性化についての信頼できるマーカーを与えることが予想される。ｇｌｉ−１遺伝子は、多くの癌において強く発現されており、ヘッジホッグ経路の相対的な活性化のマーカーとして機能する。加えて、高いｇｌｉ遺伝子発現を有する未熟な肺などの組織は、ヘッジホッグ阻害剤により強く影響される。従って、ｇｌｉ遺伝子発現の検出は、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療から特に利益を得るであろう組織及び病気を同定するための強力な予測ツールとして用いることができるということが予想される。
【０２３０】
好適具体例において、ｇｌｉ−１発現レベルは、転写物の直接的検出により、又はタンパク質のレベル若しくは活性の検出によって検出される。転写物は、主としてプローブのｇｌｉ−１転写物又はそれから合成されたｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに依存する任意の広範囲の技術を用いて検出することができる。周知技術には、ノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ及び転写物レベルのマイクロアレイ分析が含まれる。Ｇｌｉタンパク質レベルを検出する方法には、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（好ましくは、Ｇｌｉタンパク質の位置が決定されている標準と比較する）、及び質量分析法が含まれる。質量分析法は、一連の精製ステップと連結させて、特定の試料中の多くの異なるタンパク質レベルの高スループットの同定を可能にすることができる。質量分析法及び２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥは又、タンパク質分解事象、ユビキチン化、リン酸化、脂質修飾などを含むタンパク質に対する転写後修飾を同定するためにも利用することができる。Ｇｌｉ活性は又、基質ＤＮＡに対する結合又は標的プロモーターのイン・ビトロ転写活性化を分析することによっても評価することができる。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイは、すべて、ＤＮＡ上のＧｌｉ結合部位に結合することのできるタンパク質の存在を評価するために利用することのできる方法である。
【０２３１】
好適具体例において、ｇｌｉ転写物レベルを測定し、異常に高いｇｌｉレベルを示す病気又は障害のある組織をヘッジホッグアンタゴニストで治療する。未熟肺組織、肺癌（例えば、腺癌、気管支肺胞腺癌、小細胞癌）、乳癌（例えば、下方腺管癌、下方小葉癌、管状癌）、前立腺癌（例えば、腺癌）、及び良性前立腺過形成は、すべて、ある場合において、強く上昇したｇｌｉ−１発現レベルを示す。従って、ｇｌｉ−１発現レベルは、これらの組織のどれをヘッジホッグアンタゴニストで処理すべきであるかを測定するための強力な診断デバイスである。加えて、ウロセリアル細胞の癌（例えば、膀胱癌、他の泌尿生殖器癌）がやはりある場合に上昇したｇｌｉ−１レベルを有するであろうという実質的な相関の形跡がある。例えば、染色体９ｑ２２上のヘテロ接合性の喪失が膀胱癌に共通していることが知られている。このｐｔｃ−１遺伝子は、この位置に位置され、ｐｔｃ−１機能欠損は、おそらく、他の多くの種類の癌におけるように、増殖過剰の部分的原因である。従って、かかる癌は又、高いｇｌｉ発現をも示し、特に、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療に従順であろう。
【０２３２】
ｐｔｃ−１及びｐｔｃ−２の発現は又、ヘッジホッグシグナリング経路によっても活性化されるが、これらの遺伝子は、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてはｇｌｉ遺伝子に劣る。ある組織においては、ヘッジホッグ経路が高度に活性であるにもかかわらず、ｐｔｃ−１又はｐｔｃ−２の一方のみが発現される。例えば、精巣の発生において、インディアンヘッジホッグは重要な役割を演じ、そのヘッジホッグ経路が活性化されるが、ｐｔｃ−２しか発現されない。従って、これらの遺伝子は、両遺伝子の同時測定はヘッジホッグアンタゴニストで処理すべき組織の有用な指標として企図されるが、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしては個別的には信頼できない。
【０２３３】
主題の方法によって処置しうる疾患としては、ヒト以外に特異に見られる疾患、例えば疥癬が挙げられる。
【０２３４】
更に他の態様において、主題の方法を、ヒトの癌、特に基底細胞癌及び例えば皮膚などの上皮組織の腫瘍の処置に用いることができる。例えばヘッジホッグアンタゴニストを、主題の方法で、ヒトの癌、特に基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）及び他のヒトの癌、腺癌、肉腫などの処置の一部として用いることができる。
【０２３５】
好ましい態様において、主題の方法を、基底細胞癌の治療（又は予防）のための予防養生法の一部として用いる。ｐｔｃ突然変異により生じる基底細胞癌の一般的な特徴と思われるのが、ヘッジホッグシグナリング経路の調節停止である。家族性及び散在性ＢＣＣ（基底細胞癌）の腫瘍において、インシトゥハイブリダイゼーションで調べたところ、ヒトｐｔｃ ｍＲＮＡが一貫性を有して過剰発現することが報告されている。ｐｔｃは負の自己調節を示すので、ｐｔｃを不活性化する突然変異がｐｔｃ突然変異体の過剰発現を引き起こしていると考えられる。これまでの研究によると、ヘッジホッグ蛋白質の過剰発現が、腫瘍発生を引き起こしうることが示されている。皮膚発達のわずか数日後に皮膚表面全体にわたる複数のＢＣＣ様皮膚増殖を含むＢＣＮＳの特徴を発達させた皮膚内で、Ｓｈｈを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける研究から、マウスの腫瘍発生にＳｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）が役割を担っているということが示唆されている。これまでの研究にはＢＣＣから得たＳｈｈヒト遺伝子における突然変異についての記載もあり、ヒトにおけるＳｈｈ又は他のＨｈ遺伝子が、ヒトにおける優性腫瘍誘発遺伝子として作用しうることを示唆している。散在性ｐｔｃ突然変異が、正常な個人から得たＢＣＣにおいて観察されており、そのうちのいくつかはＵＶ標識突然変異であった。散在性ＢＣＣについて行われた近年の研究の一つにおいて、ＣＴ又はＣＣＴＴのいずれかが変化した５個のＵＶ標識型突然変異が、ｐｔｃ突然変異を含む１５の腫瘍に見つかっている。近年行われた、ＢＣＣ及び神経外胚葉腫における散在性ｐｔｃ突然変異の分析によると、ＢＣＣにおいて発見された３個のｐｔｃ突然変異の一つにおいて、１個のＣＴが変化していることが示されている（例えばＧｏｏｄｒｉｃｈ他（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１１０９−１３；Ｘｉｅ他（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５７：２３６９−７２；Ｏｒｏ他（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：８１７−２１；Ｘｉｅ他（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ１８：３０５−９；Ｓｔｏｎｅ他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８４：１２９−３４；及びＪｏｈｎｓｏｎ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：１６６８−７１参照）。
【０２３６】
主題の方法は、ＢＣＮＳを有する患者の処置、例えばＢＣＣ又はｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の結果起こりうる疾患による他の影響の予防に用いることもできる。基底細胞母斑症候群は、若年期に現れる複数のＢＣＣにより特徴付けられる、希有な常染色体優性疾患である。ＢＣＮＳ患者はこれらの腫瘍を発達させやすく、１０歳から２０歳にかけて、主に日光にさらされた皮膚領域に大量に現れる。この疾患は、肋骨、頭及び顔の変性、時として多指症、合指症及び脊椎披裂を含む、多くの発達異常も引き起こす。又、これらの患者はＢＣＣに加えて卵巣及び心臓の繊維腫、皮膚及び顎の嚢腫、中枢神経系における髄芽細胞腫及び髄膜腫などの多くの腫瘍型を発達させる。主題の方法を、ＢＣＮＳ及び非ＢＣＮＳ患者におけるそのような腫瘍型の予防及び処置に用いることができる。研究によって、ＢＣＮＳ患者がｐｔｃ遺伝子に遺伝子性及び散在性突然変異の両方を有することが示されており、このことは、これらの突然変異体がこれらの疾患の根本的な要因となっていることを示唆している。
【０２３７】
他の特徴において、本発明はヘッジホッグアンタゴニストを包含する薬剤調製物を提供する。主題の方法に用いられるヘッジホッグアンタゴニストは、生物学的に許容可能な媒体［水、緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）又はそれらの好適な混合物］を用いて、投与に都合よく調合することができる。選択された媒体中での活性成分の最適濃度は、医化学者に公知の方法に従って経験的に決定することができる。ここでいう「生物学的に許容可能な媒体」には、薬剤調製物の投与経路に適したあらゆる溶媒、分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体の使用は、当分野において公知のものである。従来の媒体又は薬剤がヘッジホッグアンタゴニストの活性に不適合な場合を除いて、本発明の薬剤調製物に主題の化合物を使用することが企図される。好適な賦形剤及び他の蛋白質を含む調合については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ペンシルバニア州イーストン（１９８５）］に記載がある。これらの賦形剤は、注射可能な「沈殿（ｄｅｐｏｓｉｔ）配合物」を含む。
【０２３８】
本発明の薬剤調製物は、例えば家畜や犬などのペットの処置といった獣医学的な使用に好適なヘッジホッグアンタゴニストの薬剤調製物などの、獣医学的な組成物を含むこともできる。
【０２３９】
導入の方法は、再充填可能な又は生分解性の装置を用いて提供することができる。近年、様々な緩効性重合体装置が開発され、蛋白質様生物薬剤といった薬剤の、制御された投与がイン・ビボで試されている。生分解性及び非分解性重合体の両方を含む様々な生体適合性重合体（ヒドロゲルなど）を用いて、ヘッジホッグアンタゴニストを特定の標的部位において持続的に放出する移植片を形成することができる。
【０２４０】
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、又は直腸内で投与することができる。調製物はもちろん各投与経路に適した形状で投与される。例えば、錠剤、カプセル形状などによる注射、吸入投与；目薬、軟膏、座薬、制御された放出パッチなどによる注射、浸剤又は吸入投与；ローション剤又は軟膏による局所投与；及び座薬による直腸投与が挙げられる。経口及び局所投与が好ましい。
【０２４１】
ここでいう「非経口投与」及び「非経口に投与する」とは、腸内及び局所投与を除く投与方法、通常は注射による投与を意味する。例としては静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び浸剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４２】
ここでいう「全身投与」「全身に投与する」「末梢投与」及び「末梢に投与する」とは、中枢神経系に直接投与するのではなく、化合物、薬剤又は他の物質を患者の系に入るように投与し、従って代謝や他の類似方法（例えば皮下投与）の影響を受ける投与のことを言う。
【０２４３】
これらの化合物は、好適な投与経路によって、治療を目的としてヒト及び他の動物に投与することができる。例えば、噴霧の形での経口、経鼻の投与、粉末、軟膏又は滴下の形での直腸内、膣内、非経口、槽内及び局所投与、並びに口腔及び舌下投与が挙げられる。
【０２４４】
選択された投与経路に関わらず、好適な水和形態で用いることのできる本発明の化合物及び／又は本発明の薬剤組成物を、下に記すような又は当業者に知られる従来法で、薬学的に許容可能な投与形態に調合することができる。
【０２４５】
本発明の薬剤組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物及び投与方法について望ましい治療的応答を達成できるのに有効な量の活性成分が得られるように変えることができる。
【０２４６】
選択される投与レベルは、本発明の特定の化合物、エステル、塩又はそのアミドの活性、投与経路、投与時間、該特定の化合物の排出速度、処置時間、該特定のヘッジホッグアンタゴニストとともに用いられた他の薬剤、化合物及び／又は物質、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、体調、健康状態及び病歴、医療分野で知られるその他の要因といった様々な要因に依存する。
【０２４７】
当分野で通常の技術を有する医者又は獣医は、必要とされる薬剤組成物の有効量を容易に決定し処方することが可能である。例えば、医者又は獣医は、薬剤組成物に用いられる本発明の化合物の用量を、必要とされる量より低いレベルから始めて、望ましい効果が達成できるまで徐々に用量を増加させることができる。
【０２４８】
一般に、好ましい一日の用量は、治療効果を生み出すのに有効な最も低い化合物量である。そのような有効な量は、一般に上記したような要因に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳内及び皮下投与の量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。
【０２４９】
望ましい場合には、活性化合物の有効な一日分の用量は、２、３、４、５、６回以上の副次用量で、一日を通じて適当な間隔をおいて（随意に回分服用の形態をとることができる）、分けて投与することができる。
【０２５０】
ここでいう「処置」とは、予防法、療法及び治療を含むことを意図する。
【０２５１】
この処置を受ける対象は、霊長類（特にヒト）及び他のほ乳類（ウマ、ウシ、ブタ及びヒツジ）、家禽類及びペットを含む、処理を必要とするあらゆる動物を含む。
【０２５２】
本発明の化合物はそのままで又は薬学的に許容でき且つ／若しくは無菌の担体との混合物として投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチドなどの抗菌剤と併せて投与することもできる。従って併合治療は、最初の投与の治療効果が完全に消えないうちに次の投与を行う、活性化合物の連続的、同時及び分離投与を含む。
【０２５３】
Ｖ．製薬組成物
本発明の化合物は単独で投与することが可能であるが、これを製薬処方物（組成物）として投与することが好ましい。本発明に従うヘッジホッグアンタゴニストは、人用又は獣医用の医薬品に使用するために任意の都合のよい方法で投与するために処方することができる。ある種の具体例では、製薬製剤に含有させる化合物は、それ自体活性であってよく、又は例えば生理学的環境で活性化合物に転化できるプロドッラグであることができる。
従って、本発明の他の観点は、治療学的に有効な量の前記の化合物の１種以上を１種以上の製薬上許容できるキャリアー（添加剤）及び（又は）希釈剤と共に処方してなる製薬上許容できる組成物を提供する。以下に詳細に説明するように、本発明の製薬組成物は、以下のもの：（１）経口投与に適合した形態、例えば、飲薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）例えば皮下、筋肉内又は静脈内注射による非経口的投与に適合した形態、例えば、無菌溶液又は懸濁液、（３）局所適用に適合した形態、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏又はスプレー、（４）膣内又は直腸内投与に適合した形態、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームも含めて、固体又は液体形態で投与するために特に処方することができる。しかし、ある種の具体例では、主題化合物は、無菌水に単に溶解又は懸濁させることができる。ある種の具体例では、製薬製剤は発熱性ではない。即ち、患者の体温を上昇させない。
【０２５４】
語句“製薬上有効な量”とは、ここで使用するときは、少なくとも動物細胞の亜集団におけるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進に打ち勝ち、しかして処置された細胞におけるその経路の生物学的結果を、どんな医療的処置にも適用できる合理的な利益／危険の比で持って、ブッロクすることによって何らかの所望の治療的効果を生じさせるのに有効である本発明の化合物を含む化合物、材料又は組成物についてのそのような量を意味する。
【０２５５】
語句“製薬上許容できる”とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又はその他の問題若しくは合併症なしに、人間及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／危険の比で適合する化合物、材料、組成物及び（又は）投薬の形態をいうのに使用する。
【０２５６】
語句“製薬上許容できるキャリアー”とは、ここで使用するときは、主題アンタゴニストを体の一つの器官又は一部から他の器官又は一部に運び又は輸送する際に係わる液体又は固体状の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材のような製薬上許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。それぞれのキャリアーは、処方物の他の成分と適合でき且つ患者に有害でないという意味で“許容できる”ものでなければならない。製薬上許容できるキャリアーとして使用できる材料のいくつかの例には、（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びサッカロース、（２）でんぷん、例えばコーンスターチ及びジャガイモでんぷん、（３）セルロース及びその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース、（４）粉末状トラガンタ、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばココアバター及び座薬用ワックス、（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル及び大豆油、（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビット、マンニット及びポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱原を含まない水、（１７）等張性塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）燐酸塩緩衝溶液及び（２１）製薬処方物に使用されるその他の非毒性の許容できる物質が包含される。
【０２５７】
上記したように、本発明のヘッジホッグアンタゴニストのある種の具体例は、アミノ又はアルキルアミノのような塩基性官能基を含有し、しかして、製薬上許容できる酸により製薬上許容できる塩を形成することができる。この観点で、用語“製薬上許容できる塩”とは、本発明の化合物の比較的毒性でない無機及び有機酸との付加塩をいう。これらの塩類は、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離塩基の形の精製された本発明の化合物を好適な有機又は無機酸と別途反応させ、次いでそのように形成された塩を単離することによって製造することができる。代表的な塩類には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、燐酸塩、トシレート、くえん酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、こはく酸塩、酒石酸塩、ナフタリン酸塩、メシレート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリルスルホン酸塩などが包含される（例えば、ベルジ他による「製薬用塩類」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６：１−１９を参照）。
【０２５８】
主題化合物の製薬上許容できる塩類は、例えば、非毒性の有機又無機酸からの化合物の周知の非毒性の塩類又は第四アンモニウム塩を包含する。例えば、このような周知の非毒性の塩類には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、燐酸、硝酸などのような無機酸から誘導されるもの、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、しゅう酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩類が包含される。
【０２５９】
その他の場合には、本発明の化合物は、１個以上の酸性官能基を含有することができ、しかして、製薬上許容できる塩基により製薬上許容できる塩類を形成することができる。これらの場合に、用語“製薬上許容できる塩類”とは、本発明の化合物の比較的非毒性の有機又無機塩基との付加塩をいう。これらの塩類は、同様に、本発明の化合物の最終の単離及び精製中に現場で、或いは遊離酸の形の精製された本発明の化合物を好適な塩基、例えば製薬上許容できる金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩と、アンモニアと又は製薬上許容できる有機第一、第二若しくは第三アミンと別途反応させることによって製造することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩類には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩などが包含される。塩基付加塩を形成させるのに有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが包含される（例えば、上記のベルジ他を参照）。
【０２６０】
湿潤剤、乳化剤及び滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味剤、香料及び芳香剤、保存剤及び酸化防止剤も組成物中に存在できる。
【０２６１】
製薬上許容できる酸化防止剤の例には、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど、（３）金属キレート剤、例えばくえん酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビット、酒石酸、燐酸などが包含される。
【０２６２】
本発明の処方物は、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含めて）、直腸、膣及び（又は）非経口投与に好適なものを包含する。これらの処方物は、単位投薬形態で具合良く提供でき、医薬品分野で周知の任意の方法により製造することができる。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、処理する宿主、特定の投与方法によって変動する。単位投薬形態を生じさせるためにキャリアー材料と混合できる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物のそういう量である。一般に、１００％からみて、この量は約１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の活性成分の範囲にある。
【０２６３】
これらの処方物又は組成物を製造するための方法は、本発明の化合物をキャリアー及び随意の１種以上の補助成分と会合させる工程を包含する。一般に、処方物は、本発明の化合物を液状キャリアー又は微細状の固体キャリアー又はこれらの両者と均質に且つ緊密に会合させ、次いで必要ならば生成物を賦形させることによって製造される。
【０２６４】
経口投与に好適な本発明の処方物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味付けベース、例えばサッカロース及びアカシア又はトラガンタを使用）、粉末、顆粒の形態で、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、或いは水中油型又は油中水型液状エマルジョンとして、或いはエレキシル又はシロップとして、或いは香錠（不活性ベース、例えばゼラチン及びグリセリン、又はサッカロース及びアカシアを使用）として及び（又は）口腔洗浄液などであって、それぞれ活性成分として本発明の化合物を所定量で含有するものであることができる。また、本発明の化合物はボーラス、舐剤又はペーストとして投与することができる。
【０２６５】
本発明の経口投与用の固形投薬形態（カプセル、錠剤、ピル、糖剤、粉末、顆粒など）では、活性成分は、１種以上の製薬上許容できるキャリアー、例えば、くえん酸ナトリウム若しくは燐酸二カルシウム及び（又は）下記のいずれか：（１）充填剤又は増量剤、例えばでんぷん、ラクトース、サッカロース、グルコース、マンニット及び（又は）珪酸、（２）結合材、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、サッカロース及び（又は）アカシア、（３）保湿剤、例えばグリセリン、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカでんぷん、アルギン酸、ある種の珪酸塩及び炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセリンモノステアレート、（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレー、（９）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれらの混合物、（１０）着色剤と混合される。カプセル、錠剤及びピルの場合には、製薬組成物は、緩衝剤も含むことができる。類似のタイプの固形組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する軟質及び硬質ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用できる。
【０２６６】
錠剤は、１種以上の補助成分と共に圧縮又は成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、結合材（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、でんぷんグリコール酸ナトリウム又は架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性又は分散剤を使用して製造することができる。成形錠剤は、加湿した粉末状化合物と不活性液体希釈剤との混合物を適当な機械で成形することによって製造することができる。
【０２６７】
本発明の製薬組成物の錠剤及びその他の固形投薬形態、例えば糖剤、カプセル、ピル及び顆粒は、要すれば、被覆及び外殻、例えば腸用被覆及び製薬処方分野において周知のその他の被覆で得ることができ又は調製することができる。また、それらは、例えば、所望の放出プロフィルを与えるように割合を変えてヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他の重合体マトリックス、リプソーム及び（又は）マイクロスフェアーを使用して活性成分の遅延された又は制御された放出を与えるように処方することもできる。それらは、例えば、細菌保持性フィルターによるろ過により、又は使用直前に無菌水若しくはその他の無菌注射可能媒体に溶解できる無菌固形組成物の形で滅菌剤を配合することによって滅菌することができる。これらの組成物は随意に不透明剤も含有でき、またこれらが活性成分のみを又は優先的に、胃腸器官のある部分で、場合により遅延された態様で放出させるような組成物であることができる。使用できる包封用組成物の例は重合体物質及びワックスを包含する。また、活性成分は、適当ならば、上記した賦形剤の１種以上によりマイクロカプセル化された形態であることができる。
【０２６８】
本発明の化合物の経口投与用の液状投薬形態は、製薬上許容できるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する。液状投薬形態は、活性成分に加えて、斯界で普通に使用される不活性希釈剤、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、グラウンドナッツ油、コーンオイル、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアリール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、これらの混合物を含有することができる。
【０２６９】
不活性希釈剤以外に、経口投与用組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、風味料、着色剤、香料及び保存剤のような補助剤も含有することができる。
【０２７０】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビット及びソルビタンエステル、微結晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガンタ並びにこれらの混合物を含有することができる。
【０２７１】
直腸又は膣投与用の本発明の製薬組成物の処方物は坐薬として提供でき、これは本発明の１種以上の化合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、座薬用ワックス又はサリチル酸エステルを含む１種以上の好適な非刺激性賦形剤又はキャリアーであって、室温で固体であるが体温で液状であり、従って直腸又は膣内で溶融して活性なヘッジホッグアンタゴニストを放出するものと混合することによって製造することができる。
【０２７２】
膣に投与するのに好適な本発明の処方物は、斯界で適切であることが知られているようなキャリアーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー処方物も包含する。
【０２７３】
本発明の化合物の局所又は経皮投与のための投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を包含する。活性成分は、製薬上許容できるキャリアーと、要求されるかもしれない任意の保存剤、緩衝剤又は吸入剤とを無菌条件下で混合することができる。
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性成分に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、でんぷん、トラガンタ、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク、酸化亜鉛及びこれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。
粉末及びスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、ポリアミド粉末及びこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。スプレーは、さらにクロルフルオル炭化水素や、ブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような慣用の発射剤を含有することができる。
【０２７４】
経皮用パッチは、皮膚に対する本発明の化合物の制御された送出を提供するという付加的な利点を有する。このような投薬形態は、ヘッジホッグアンタゴニストを適切な媒質に溶解又は分散することによって製造することができる。皮膚を介するヘッジホッグアンタゴニストの流れを増大させるために吸収向上剤を使用することができる。このような流れの速度は、速度制御膜を備えるか又は化合物を重合体マトリックス若しくはゲルに分散させることによって制御することができる。
眼科用処方物、眼用軟膏、粉末、溶液なども本発明の範囲内にあるものとして意図される。
【０２７５】
非経口的投与のために好適な本発明の製薬組成物は、１種以上の本発明の化合物を１種以上の製薬上許容できる無菌で等張性の水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、或いは使用直前に無菌注射可能溶液又は分散液に再構成できる無菌粉末と組合わせて含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤や、処方物を意図された受容体の血液により又は懸濁若しくは増粘剤により等張性にさせる溶質を含有することができる。
【０２７６】
本発明の製薬組成物に使用できる好適な水性及び非水性キャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能有機エステルが包含される。適切な流動性は、例えば、レシチンのような被覆材を使用して、分散液の場合には所要の粒度を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって保持することができる。
【０２７７】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤を含有することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗菌剤、例えば、パラベン、クロルブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含有させることによって確実にすることができる。また、糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物中に含有させることが望ましいであろう。更に、注射可能な製薬形態の持続された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含有させることによりもたらすことができる。
【０２７８】
ある場合には、薬物の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水溶解度が劣った結晶質又は非晶質材料の液状懸濁液を使用することにより達成することができる。この場合に、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、後者も結晶寸法及び結晶形態に依存しよう。別法として、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁させることにより達成される。
【０２７９】
注射可能なデポー剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性重合体中の主題化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成させることにより製造される。薬物対重合体の比率及び使用された特定の重合体の種類に応じて、薬物の放出速度は制御することができる。その他の生分解性重合体の例には、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が包含される。また、デポー剤注射可能処方物も薬物を体の組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルジョン中に包封することによって製造される。
【０２８０】
本発明の化合物が人及び動物に薬剤として投与されるときは、それらは、それ自体で又は例えば０．１〜９９．５％（更に好ましくは０．５〜９０％）の活性成分を製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて含有する製薬組成物として与えることができる。
【０２８１】
本発明の化合物の動物飼料への添加は、好ましくは、活性化合物を有効量で含有する適当な供給プレミックスを製造し、このプレミックスを配合して完全な糧食にすることによって達成される。
別法として、活性成分を含有する中間濃厚物又は供給補充物を飼料に配合することができる。このような供給プレミックス及び完全糧食を製造し投与できる方法は、参照文献（例えば、“応用動物栄養”（Ｗ．Ｈ．フリーマン他、サンフランシスコ、１９６９）又は“家畜飼料及び飼育”（Ｏ−Ｂブックス、コーバリス、オレゴン、１９７７））に記載されている。
【０２８２】
ある具体例において、主題の化合物例えば化合物Ｄ又はその塩は、例えば局所適用のために水溶液中に配合することができる。適当な塩には、主題の化合物の塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩又は任意の他の適当な酸（例えば、アミン塩基の存在下で製薬上許容しうるアニオンを形成するもの）の塩が含まれる。
【０２８３】
ある具体例において、この水溶液は、製薬上許容しうる塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムより選択するカチオン、並びにアセテート、シトレート、ホスフェート、クロリドより選択するアニオン、任意の他の適当なイオン又はこれらの組合せ）を含むことができる。
【０２８４】
ある具体例において、この水溶液は、更に又はこれらに代えて、デキストロース、ラクトース、マンニトール、又は他のポリヒドロキシル化化合物例えば製薬上許容しうる炭水化物例えば単糖類若しくは二糖類又はポリオールを含むことができる。
【０２８５】
ある具体例において、水溶液は、２００〜４００ｍＯｓｍの、好ましくは２５０〜３５０Ｏｓｍの、尚一層好ましくは２８０〜３００ｍＯｓｍ（例えば、２９０ｍＯｓｍ）の浸透性を生じる溶質を含むことができる。
【０２８６】
ある具体例において、この溶液のｐＨは、３〜６の、好ましくは、３．５〜５の、尚一層好ましくは、４〜４．５の範囲にある。
【０２８７】
従って、一般に、水溶液は、最大で約７％の炭水化物又は例えば最大で約６％の（又は、約３〜６％の、又は約４〜５％の）ポリオール例えばマンニトール、ラクトース又はデキストロース、最大で約５０ｍＭの（例えば、最大で約２０ｍＭ又は約２〜２０ｍＭ又は約５〜１５ｍＭの）酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムから選択する塩、及び約２００〜４００ｍＯｓｍの、好ましくは２５０〜３５０Ｏｓｍの、尚一層好ましくは２８０〜３００ｍＯｓｍの浸透性を生じるのに十分な製薬上許容しうる溶質例えば塩化ナトリウムを含むことができ、ある具体例において、この水溶液は、実質的に炭水化物又はポリオールを含まず、実質的に酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含まず、又は、両者は、例えば、本質的に、生理食塩水及び主題の化合物の塩よりなるものであってよく、又は実質的に、塩例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含まず且つ、本質的に炭水化物又はポリオール及び主題の化合物の塩の水溶液よりなる。
【０２８８】
こうして、例えば、主題の化合物例えば化合物Ｄの水溶液は、ｐＨ４．２の生理食塩水中に、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムを含むことができる。或は、水溶液は、５％ デキストロース溶液中に、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムを含むことができ、又は単に５％ デキストロース溶液を含むことができる。
【０２８９】
ＶＩ．活性アンタゴニストの合成方法及び同定
主題のアンタゴニスト及びその同族体は、Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓｔｉｌｌｅ等の架橋カップリング技術を用いて容易に調製することができる。これらのカップリング反応は比較的緩やかな条件下で行われ、幅広い「傍観」機能性を許容することができる。
【０２９０】
ａ．組み合わせライブラリー
本発明の化合物、特に様々な置換基の代表的なクラスを有する変異体のライブラリーは、組み合わせ化学及び他の並行合成方法で扱いやすい（例えばＰＣＴＷＯ９４／０８０５１）。従って、ヘッジホッグアンタゴニストになりうる先導化合物を同定するために、並びに先導化合物の特異性、毒性及び／又は細胞毒性−速度プロファイルを細かに区別するために、関連化合物の大型ライブラリー、例えば上記した化合物の多様性ライブラリーを高処理量アッセイにおいて迅速にスクリーンする。例えば、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進のいずれかを有する細胞を用いるアッセイなどの、ｐｔｃ、ヘッジホッグ又はスムースンド対生物活性アッセイを用いて、ｐｔｃに対するアゴニスト活性あるいはヘッジホッグ又はスムースンドに対するアンタゴニスト活性を有するものについて、主題の化合物のライブラリーをスクリーンすることができる。
【０２９１】
本発明に用いるための組み合わせライブラリーの例として、望ましい特性に関して一緒にスクリーンすることのできる、化学的に関連する化合物の混合物が挙げられる。一つの反応において多くの関連化合物の調製することで、実施すべきスクリーニングの回数を減少し単純化する。適当な物理的特性についてのスクリーニングは、従来法によって行うことができる。
【０２９２】
ライブラリーにおける多様性は、様々に異なるレベルで作成することができる。例えば、組み合わせ反応に用いられる基質アリール基は、中心となるアリール基について（例えば環状構造について）多様性を与えることができ、及び／又は他の置換基について変えることもできる。
【０２９３】
例えば主題のヘッジホッグアンタゴニストなどの小さな有機分子の組み合わせライブラリーを作成する技術に、様々な方法を用いることができる［例えばＢｌｏｎｄｅｌｌｅ他（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．１４：８３；Ａｆｆｙｍａｘ、米国特許第５，３５９，１１５号及び第５，３６２，８９９号；Ｅｌｉｍａｎ、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｓｔｉｌｌ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１；ＡｒＱｕｌｅ、米国特許第５，７３６，４１２号及び第５，７１２，１７１号；Ｃｈｅｎ他（１９９４）ＪＡＣＳ１１６：２６６１；Ｋｅｒｒ他（１９９３）ＪＡＣＳ１１５：２５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９３／０９６６８及びＷＯ９１／０７０８７；並びにＬｅｒｎｅｒ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２参照］。従って、約１００〜１，０００，０００以上の主題のヘッジホッグアンタゴニストの多様体（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）の、様々なライブラリーを合成し、特定の活性又は特質についてスクリーンすることができる。
【０２９４】
例証的な態様において、多様体となりうるヘッジホッグアンタゴニストのライブラリーを、Ｓｔｉｌｌ他（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０８０５１）に記載の方法に適応させた計画を用いて合成することができる。例えば、アンタゴニスト候補又は合成中間体の置換基の位置の一つに位置させることのできる、加水分解可能な又は光分解可能な基によって重合体ビーズに連結する。Ｓｔｉｌｌ他の方法によると、ライブラリーは一連のビーズ上で合成される（各ビーズはビーズ上の特定の多様体を同定する標識セットを含む）。次いでビーズライブラリーを、ヘッジホッグアンタゴニストが探されるｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進の細胞とともに「培養」することができる。多様体は、例えば加水分解によってビーズから放出することができる。
【０２９５】
本発明において有用な化合物の構造は、それら自身、容易に、効率的な合成に役立つ。式Ｉ及びＶＩにより一般的に記載されたこれらの構造の性質は、かかる化合物のアセンブリを、上記のＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４部分のある組合せを用いて可能にする。例えば、これらのサブユニットを一般的なアシル化又はアルキル化反応によってコアリングに結合させることができる。かかる反応の大部分は、図１１、１２、１５及び１６に描いたものを含み、極めて温和で且つ極めて確実であり、従って、コンビナトリアルケミストリーに完全に適している。試験化合物のライブラリーの生成へのかかるコンビナトリアルアプローチの容易な性質は、下記の典型的な図式において明らかであり（Ｐ＝保護基）、上記の式による化合物の様々な基は、組合せ的に結合する（例えば、上記の方法の一つを利用して）。一層大きい多様性さえも、例えば、サブユニットを追加する際にある範囲の反応性官能基を用いることにより、例えば、Ｒ_１サブユニットを追加する際にＲ−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｃｌ、ＰＯ−Ａｒ−Ｌ−ＮＣＯ、ＰＯ−Ａｒ−Ｌ−ＳＯ_２Ｃｌなどの範囲を用いることによって達成されうる。
【化２８】

【０２９６】
上記及び関連の経路についての様々な改変によって、ヘッジホッグ機能を阻止する能力について試験される化合物の様々なライブラリーを合成することができる。
【０２９７】
本発明の例示化合物の製造
ここに開示した一般的構造に従う一連の化合物を製造し、生物学的性質について試験した（以下を参照）。好適なコア構造は、以下の反応式に要約されるような商業的に入手できるｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンから容易に製造することができる。
【化２９】

【０２９８】
ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩
塩化アセチル（２４９ｍｌ、３．４７モル）をメタノール（２０９０ｍＬ）に温度を３０℃以下に保持するように撹拌し冷却しながら滴下した。完全に添加した後に、さらに６０分間撹拌し続けてからｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（３２５ｇ、２．４８モル）を固体状で添加した。反応混合物を２４時間加熱還流し、０℃に冷却し、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５２２０ｍＬ）を３０分間でゆっくりと添加した。沈殿した固体をフィルター上に集め、氷冷ＴＢＭＥで洗浄した（２×１Ｌ）。この生成物を４０℃で終夜真空乾燥して４２４ｇの所望のエステルを得た。
【０２９９】
ｔｒａｎｓ−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチルエステル
上記反応の生成物エステル（４２３ｇ、２．３２モル）をジクロルメタン（６．５Ｌ）に懸濁させた。撹拌しかつ冷却しながら、トリエチルアミン（１０１９ｍＬ、７．３２モル）を３０分間で添加し、次いで重炭酸ジ−ｔ−ブチル（５８８ｇ、２．７０モル）を３０分間で添加して内部温度を１５℃以下に保持した。完全に転化した後に、混合物を室温で３時間撹拌し、次いで１Ｍくえん酸水溶液（６５０ｍＬ）を添加する。混合物を１時間撹拌し、有機相を分離し、１ＭのＫＨＣＯ_３水溶液（９２０ｍＬ）、水（２×１Ｌ）で洗浄し、活性炭（１５ｇ）の存在下にＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２×１８００ｇのシリカゲル、３：１〜２：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃの溶離剤）により精製して所望のカルバメート（４８９ｇ）を得た。
【０３００】
（４Ｒ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−［（メチルスルホニル）オキシ］−Ｌ−プロリンメチルエステル
上記のカルバメート（４７８ｇ、１．９５モル）、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、３７３ｍＬ、２．１５モル）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２３．８ｇ、０．１９５モル）をジクロルメタン（７６５０ｍＬ）に溶解した。塩化メタンスルホニル（１６７ｍＬ、２．１５モル）をジクロルメタン（９５０ｍＬ）に溶解してなる溶液を、冷却して温度を１０℃以下に保持しながら、５０分間で滴下した。混合物を−６℃で２時間撹拌し、水（７５０ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間以上撹拌し、層を分離させた。有機相を１ＭのＫＨＣＯ_３水溶液（９５０ｍＬ）、１Ｍくえん酸水溶液（２×９５０ｍＬ）及び水（７５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をヘキサン（１．９Ｌ）で結晶化させた。結晶質のメシレートをフィルター上に集め、ヘキサンで洗浄し（２×５００ｍＬ）、４０℃で真空乾燥して６２４ｇの所期の化合物を与えた。
【０３０１】
（４Ｓ）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−４−アジド−Ｌ−プロリンメチルエステル
上記のメシレート（６２４ｇ、１．９３モル）とナトリウムアジド（７１６ｇ、１１．０１モル）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３１２０ｍＬ）に溶解してなる溶液を６０℃で２２時間撹拌し、この溶液を０℃に冷却し、水（３Ｌ）を４０分間で添加して温度を２０℃以下に保持し、ＥｔＯＡｃ（３Ｌ）を添加した。混合物を約２０分間攪拌し、層を分離させ、水性相をＥｔＯＡｃ（３Ｌ）で抽出した。一緒にした有機相を水（７５０ｍＬ）、０．１ＭのＨＣｌ水溶液（４００ｍＬ）、次いで水（７５０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２×１８００ｇのシリカゲル、２：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して所望のアジド（５１６ｇ）を得た。
【０３０２】
（４Ｓ）−４−アジド−Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩
ＨＣｌのジオキサン飽和溶液（１９４０ｍＬ）を１０〜１６℃で調製し、アジド（５２３ｇ、１．９４モル）をジオキサン（４８０ｍＬ）に溶解してなる溶液を、３０分間撹拌しかつ冷却して温度を２５℃以下に保持しながら滴下した。完全に溶解した後に、反応混合物を室温で２時間撹拌し、ＴＢＭＥ（２Ｌ）を添加し、生じた混合物を０℃で１時間撹拌した。沈殿した固体をろ紙上に集め、ＴＢＭＥ（４×５００ｍＬ）で洗浄し、４０℃で真空下に乾燥して所望の塩酸塩（３４８ｇ）を得た。
【０３０３】
上記のコア構造から或いは関連する化合物又は誘導体から本発明の主題化合物を以下に示す反応式に示すように製造することができる。
反応式１：溶液相経路１
【化３０】

【０３０４】
反応式２：溶液相経路２
【化３１】

【０３０５】
反応式３：固体相経路３
【化３２】

【０３０６】
これらの経路は、例示の固相経路と共に、異なった置換基及び立体化学的関係を有する広範な化合物をもたらす。当業者ならば、上記の反応式におけるピペラジンの使用が例示に過ぎず、従ってその他のアミンも更に各種の主題化合物群を得るのに使用できることを認識しよう。同様に、ＢＯＣ、ＦＭＯＣ及びその他の保護基の使用は例示に過ぎず、従って当業者は、本発明の範囲及び精神から離れることなく、官能基に好適なその他の保護基を選択し且つその後の反応条件を容易に選択することができる。更に、前記の反応式はｔｒａｎｓ−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン化合物でもって典型的に開始するが、この化合物の全ての異性体は、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ及び（又は）Ｄ／Ｌ化合物も含めて、商業的に入手でき、従って広範な立体化学的に純粋な中間体及び主題化合物を得ることができる。ｔｒａｎｓ−アミノプロリンコア構造は、斯界で周知のように、ｔｒａｎｓ−ヒドロキシプロリン出発物質から、中間体ｃｉｓ−ブロムプロリンを形成させ（例えば、ヒドロキシルのトリフレート又はメシレートを形成させ、そのスルホン酸エステルを臭化物イオンで置換することにより）、次いでアジドで第二の置換を行なってｔｒａｎｓ−立体化学的関係を純粋に保持することにより得ることができる。別法として、ジアステレオマー混合物も前記の反応式３におけるようにして製造し、次いで随意に異性体の分離を行なうことができる。
【０３０７】
ｂ．スクリーニングアッセイ
化合物が、ｐｔｃ機能を代行し又はスムースンド若しくはヘッジホッグ機能に拮抗する能力を有するかどうかを調べるのに、様々なアッセイを用いることができるが、その多くは高処理量フォーマットで処理することができる。化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムにおいて、所定の期間中に生存する化合物の数量を最大化するために、高処理量アッセイを用いるのが望ましい。従って、合成及び天然生産物のライブラリーから、ヘッジホッグアンタゴニストである他の化合物について見本をとることができる。
【０３０８】
細胞を含まないアッセイに加えて、細胞に基づくアッセイで試験化合物を試験することもできる。一つの態様において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進又はスムースンド機能亢進表現型を有する細胞を、例えば試験剤の存在下における細胞増殖阻害剤について評価するアッセイで、目的の試験剤に接触させることができる。
【０３０９】
多くの遺伝子産物が、パッチト媒介シグナル変換（パッチト、ｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ（ｃｉ）の転写因子、セリン／トレオニンキナーゼであるｆｕｓｅｄ（ｆｕ）並びにｃｏｓｔａｌ−２、スムースンド及びｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｆｕｓｅｄの遺伝子産物）において関連づけられている。
【０３１０】
ヘッジホッグ蛋白質による細胞の誘導は、下流エフェクターの活性化及び阻害に関与する一連の事象を推進し、その結果、ある場合においては遺伝子の転写又は翻訳における検出可能な変化に至る。ヘッジホッグ媒介シグナリングの転写標的となりうるものしては、パッチト遺伝子（Ｈｉｄａｌｇｏ及びＩｎｇｈａｍ、１９９０ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１０、２９１−３０１；Ｍａｎｇｏ他、１９９６）及びショウジョウバエ科ｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ遺伝子の脊椎動物相同体、ＧＬＩ遺伝子（Ｈｕｉ他（１９９４）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ１６２：４０２−４１３）が挙げられる。パッチト遺伝子発現は、Ｓｈｈ応答性の肢芽及び神経板の細胞を誘発することが示されている（Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）ＰＮＡＳ９３：９３４６−５１；Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：１２２５−１２３３）。Ｇｌｉ遺伝子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合領域を有する推定転写因子をコードする（Ｏｒｅｎｉｃ他（１９９０）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ４：１０５３−１０６７；Ｋｉｎｚｌｅｒ他（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１０：６３４−６４２）。Ｇｌｉ遺伝子の転写は肢芽のヘッジホッグに応答してアップレギュレーションを受ける一方、Ｇｌｉ３遺伝子の転写はヘッジホッグ誘導に応答してダウンレギュレーションを受けることが報告されている（Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：１２２５−１２３３）。ヘッジホッグシグナリングに応答する遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを引き起こす転写調節配列を、そのような標的遺伝子（例えばパッチト又はＧｌｉ遺伝子）から選択し、そのようなプロモーターをレポーター遺伝子に操作可能に連結することによって、特異な試験化合物の有するヘッジホッグ媒介シグナリング経路を改変する能力に対して感度の高い、転写に基づくアッセイを作成することができる。従って、レポーター遺伝子の発現は、ヘッジホッグのアンタゴニストとして作用する化合物の開発に有用なスクリーニング手段を提供する。
【０３１１】
本発明のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、上記した一連の事象の最終段階、例えば転写調節を測定する。従って、アッセイの一つの態様の実施において、ｐｔｃ機能欠損、ヘッジホッグ機能亢進、スムースンド機能亢進に依存する検出シグナルの発生又はＳＨＨ自体の刺激を得るために、レポーター遺伝子構造体を標的細胞内に挿入する。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者に好適と知られる方法を用いて測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ発現は、リボヌクレアーゼ保護又はＲＮＡに基づくＰＣＲを用いて検出することができ、あるいはレポーター遺伝子の蛋白質産物は、特徴染色又は固有の生物学的活性によって同定することができる。次いでレポーター遺伝子からの発現量を、試験化合物の非存在下において同じ細胞内で発現された量、または実質的に同一だが標的受容体蛋白質を有さない細胞内での転写量のいずれかと比較する。統計的な又は有意な転写量の減少は、試験化合物がある程度正常なｐｔｃシグナルを作動させた（又は機能亢進ヘッジホッグ又はスムースンドシグナルに拮抗した）こと、例えば試験化合物が潜在的なヘッジホッグアンタゴニストであることを意味する。
【０３１２】
例示
ここでは、本発明を一般的に説明するので、本発明は、そのある種の観点及び具体例の例示の目的のためだけで含め且つ限定とならない後記の実施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。
【０３１３】
模範的な抑止薬の合成
Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリル］−Ｎ１−（４−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド、“ｔｒａｎｓ−アミノプロリン”
【化３３】

【０３１４】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロムテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（４）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（３）（２．０ｇ、８．１５ミリモル）をオーブン乾燥フラスコに秤量し、トルエンを使用して共沸的に乾燥した。ジクロルメタン（１６ｍｌ）と四臭化炭素（１０．８１ｇ、８．１５ミリモル）を添加し、溶液を攪拌し、０℃に冷却し、トリフェニルホスフィン（８．５ｇ、３２．４１ミリモル）で処理した。この混合物を０℃で５時間攪拌し、次いでメタノール（１．８ｍＬ）を添加し、室温で終夜攪拌し続けた。この混合物をジエチルエーテル（８０ｍＬ）で希釈し、生じた懸濁液をろ過し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄した。溶媒を一緒にし、減圧下に蒸発させ、粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（１９：１〜４：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記の臭化物（４）（１．０ｇ、４０％）を無色油状物として得た。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．４１及び１．４６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．３８−２．４６（ｍ、１Ｈ）；２．７５−２．８７（ｍ、１Ｈ）；３．６７−３．７４（ｍ、１Ｈ）；３．７６（ｓ、３Ｈ）；３．９６−４．０７（ｍ、１Ｈ）；４．２４−４．４２（ｍ、２Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２１０（１００）
【０３１５】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（５）
ナトリウムアジド（０．９０ｇ、１３．８４ミリモル）と（２Ｓ，４Ｓ）−４−ブロムテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（４）（１．０ｇ、３．２４ミリモル）を無水ジメチルホルムアミド（３２ｍＬ）に加えてなる懸濁液を窒素雰囲気下に６４時間加熱した。この混合物を室温に冷却し、氷冷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一緒にし、水洗し、塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させた。粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：１〜１：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のアジド（５）（０．８８ｇ、９３％）を無色油状物として得た。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．４１及び１．４６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．１３−２．２０（ｍ、１Ｈ）；２．２７−２．３８（ｍ、１Ｈ）；３．４５−３．４９及び３．５７−３．６０（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；３．６８−３．７３（ｍ、１Ｈ）；３．７４−３．７５（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）；４．１５−４．２３（ｍ、１Ｈ）；４．３０−４．３５及び４．３９−４．４３（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ１７１［（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｃ_５Ｈ_９Ｏ_２］（１００）
【０３１６】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（６）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（５）（０．８１ｇ、３．０ミリモル）を２％ｖ／ｖ塩酸エタノール溶液（８ｍＬ）に溶解してなる溶液にパラジウム炭（１０％、０．５ｇ）を添加した。この反応混合物を減圧し、窒素でパージし（３回）、次いで水素雰囲気下に置き、室温で終夜激しく撹拌した。混合物をセライトパッドでろ過し、減圧下に蒸発させて粗生成物とした。これを０℃でジエチルエーテルですり砕き、生じたスラリーをろ過し、氷冷ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。標記の塩（６）を定量的収率で得た。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：１．４６及び１．５１（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．３５−２．４７（ｍ、２Ｈ）；３．５０−３．５５（ｍ、１Ｈ）；３．７４−３．８６［ｍ、４Ｈ、｛３．７９及び３．８０（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）を含む｝］；３．８９−３．９５（ｍ、１Ｈ）及び４．４６−４．５０（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２１０（１００）
【０３１７】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（７）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（６）（０．８３ｇ、２．９６ミリモル）と３−メトキシベンズアルデヒド（０．３８ｇ、２．８ミリモル）をオルトぎ酸トリメチル（８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で４５分間撹拌した。この溶液をシアノ硼水素化ナトリウム（０．２８ｇ、４．４６ミリモル）でゆっくりと処理し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモニターした。完了した（〜１．５時間）ならば、反応を硫酸水素カリウム飽和水溶液により停止させ、ジクロルメタンにより抽出した。水性相のｐＨ値を９に調節し、ジクロルメタンにより逆抽出した。一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて標記のアミン（７）を定量的収率で与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．４０及び１．４５（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；２．０７−２．１９（ｍ、２Ｈ）；３．１８−３．２３及び３．３２−３．３６（２ｘｍ、１Ｈ）；３．４３−３．５３（ｍ、１Ｈ）；３．７０−３．７４［ｍ、４Ｈ、｛３．７２及び３．７３（２ｘｍ、３Ｈ、ロタマー）を含む｝］；３．８１（ｓ、３Ｈ）；４．３２−４．３６及び４．４０−４．４４（２ｘｍ、１Ｈ）；６．７９−６．８１（ｍ、１Ｈ）；６．８７−６．８９（ｍ、２Ｈ）及び７．２４（ｔ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２６５［（Ｍ＋Ｈ）^＋−Ｃ_５Ｈ_９Ｏ_２］（１００）
【０３１８】
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（８）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（７）（０．３ｇ、０．８２ミリモル）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１０６ｇ、０．８２ミリモル）を無水ジクロルメタン（０．８ｍＬ）に溶解してなる溶液を窒素雰囲気下に室温で撹拌した。この溶液を塩化ｔ−ブチルアセチル（０．１３３ｇ、０．９９ミリモル）により滴下しながら処理し、終夜撹拌した。溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）により精製して標記のアミド（８）（１．０ｇ、４０％）を無色油状物として与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．０１及び１．０５（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．３７及び１．４１（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８７−２．５６［ｍ、４Ｈ、（２．１６（ｓ、２Ｈ）で含む）］；３．１７−３．３５（ｍ、１Ｈ）；３．６２−３．８５［ｍ、７Ｈ、｛３．７０及び３．７９（２ｘｓ、６Ｈ）で含む）］；４．２１−４．２４及び４．２８−４．３５（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；４．４０−４．５８（ｍ、２Ｈ）；４．７３−４．９５及び５．０３−５．２１（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；６．５４−６．８８（ｍ、３Ｈ）及び７．１９−７．３１（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３６３（１００）
【０３１９】
２，２，２−トリフルオル酢酸（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシアニリノ）］−２−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリウム（９ａ）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（８）（０．０１ｇ、２１．６μモル）を３０％トリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（０．５ｍＬ）に室温で添加し、３０分間攪拌する。この溶液を減圧下に蒸発乾燥させて標記のピロリウム塩（９ａ）を定量的収率で与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．０５（ｓ、９Ｈ）；２．３８−２．５７（ｍ、４Ｈ）；３．５９−３．６８（ｍ、２Ｈ）；３．７５（ｓ、３Ｈ）；３．７９（ｓ、３Ｈ）；４．０９−４．１５（ｍ、１Ｈ）；４．５２−４．６３（ｍ、２Ｈ）；４．７８−４．９４（ｍ、１Ｈ）；６．６６（ｓ、１Ｈ）；６．７０（ｄ、１Ｈ）；６．８６−６．８８（ｄｄ、１Ｈ）及び７．３１（ｔ、１Ｈ）
【０３２０】
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１０）
（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（８）（０．１５ｇ、０．３２ミリモル）を３０％トリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（３ｍＬ）に室温で添加した。混合物を３０分間攪拌し、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物をジクロルメタンと炭酸カリウム飽和水溶液との間で分配させ、５分間激しく振盪させた。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて１４０ｍｇの粗製の（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（９ｂ）を得た。これは更に精製することなく次の反応に使用した。
上で製造した粗製のアミン（９ｂ）（１４０ｍｇ）、ピペロナール（７４ｍｇ、０．４９ミリモル）及び氷酢酸（２滴）を１，２−ジクロルエタン（０．５ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で３０分間攪拌した。９５％シアノ硼水素化ナトリウム（３２ｍｇ、０．４８ミリモル）を少量づつ添加し、１時間撹拌し続けた。反応を重炭酸ナトリウム飽和水溶液（２ｍＬ）で停止させ、ジクロルメタンで抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させた。残留物を、ジクロルメタン−酢酸エチル（９０：１０〜７５：２５）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピロール（１０）（１１５ｍｇ、７１．４％）を淡黄色油状物として与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：０．９８−１．０８（ｍ、９Ｈ）；２．０９−２．５９［ｍ、４Ｈ、｛２．１３（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．９６−３．０７（ｍ、１Ｈ）；３．４７−３．８５（ｍ、１１Ｈ）；４．４６−４．６３（ｍ、１Ｈ）；４．８３−４．９４（ｍ、１Ｈ）；５．９２−５．９５（ｍ、２Ｈ）；６．６３−６．８９（ｍ、６Ｈ）及び７．１５−７．３４（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４９７［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３２１】
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（１１）
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１０）（１００ｍｇ、０．２０ミリモル）を６６％ｖ／ｖメタノール水溶液（１．０ｍＬ）に溶解してなる溶液に水酸化リチウム一水和物（１７ｍｇ、０．４０５ミリモル）を添加した。この混合物を室温で終夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下に除去し、残留物をジクロルメタン（１．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）との間で分配させた。水性相を１．０Ｍくえん酸水溶液で酸性化し、二つの相を室温で１０分間激しく振盪させた。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで逆抽出した。一緒にしたジクロルメタン抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて標記の酸（１１）（７０ｍｇ、７２％）をオフホワイトの固体として与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．００及び１．０３（２ｘｍ、９Ｈ、ロタマー）；２．１７−２．３９（ｍ、３Ｈ）；２．６２−２．７１（ｍ、１Ｈ）；３．２８−３．３４（ｍ、１Ｈ）；３．４７−３．５６（ｍ、１Ｈ）；３．７６（ｍ、３Ｈ）；３．９６−４．１３（ｍ、１Ｈ）；４．２１−４．２６（ｍ、２Ｈ）；４．３６−４．５８（ｍ、３Ｈ）；５．９３（ｄ、２Ｈ）；６．６２−６．９０（ｍ、６Ｈ）及び７．２１−７．２５（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４８３［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３２２】
４−（｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（１２）
（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（１１）（６０ｍｇ、０．１２ミリモル）とテトラフルオロ硼酸Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（４８ｍｇ、０．１５ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５４μＬ、０．３１ミリモル）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に加えてなる混合物を室温で１．５時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、一緒にした抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物を、１００％ジクロルメタン、ジクロルメタン／酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）及び１００％酢酸エチルを溶離剤として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより部分的に精製してＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで汚染された粗生成物を与えた。ジクロルメタンを添加し、生じた溶液を水洗した。水性相をジクロルメタンで逆抽出し、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて標記のピペラジン（１２）（３３．１ｍｇ、４１％）を与えた。
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ６５１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３２３】
Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（１３ａ）
４−（｛（２Ｓ，４Ｒ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（１２）（２４ｍｇ、３６．９μモル）をジクロルメタン（０．８ｍＬ）に溶解してなる溶液をトリフルオル酢酸（０．１ｍＬ、１．３ミリモル）で処理した。この混合物を室温で撹拌し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモノターした。完了したならば、溶媒を減圧下に蒸発させて標記のトリフルオル酢酸塩（１３ａ）を定量的収率で与えた。この塩は、更に精製することなく次の実験に使用した。
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３２４】
Ｎ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド（１３ｂ）
２６ｍｇの粗製のＮ１−［（３Ｒ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（１３ａ）を含有するジクロルメタン（０．８ｍＬ）と水（０．８ｍＬ）との２相混合物を激しく撹拌し、２．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液により、水性相のｐＨが１２に調節されるまで、滴下しながら処理した。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで抽出した（２×１ｍＬ）。有機抽出物を一緒にし、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて標記のピペラジン（１３ｂ）（１２．７ｍｇ、５９％）を与えた。
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３２５】
Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリル］−Ｎ１−（４−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド、“ｃｉｓ−アミノプロリン”
【化３４】

【０３２６】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（１６）
パラジウム炭（１０％、０．２５ｇ）と（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１５）（１．００ｇ、３．７ミリモル）を、脱ガスした２％ｖ／ｖ塩酸エタノール溶液（１０ｍＬ）に加えてなる懸濁液を水素雰囲気（１気圧）下に室温で激しく撹拌した。終夜撹拌した後、混合物をセライト（登録商標）パッドでろ過し、エタノールで十分に洗浄した。ろ液を減圧下に蒸発させ、残留物を０℃でｔ−ブチルメチルエーテルですり砕いた。生じたスラリーをろ過し、氷冷ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、真空乾燥して標記の塩酸塩（１６）（０．７４ｇ、７１％）を白色固体として与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：１．２１及び１．２６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８５−２．０３（ｍ、１Ｈ）；２．５２−２．６５（ｍ、１Ｈ）；３．２９−３．４８（ｍ、１Ｈ）；３．５８−３．８３（ｍ、５Ｈ）及び４．１４−４．３４（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ１８９（１００）
【０３２７】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１７）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アンモニオテトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル クロリド（１６）（３．００ｇ、１０．７０ミリモル）と３−メトキシベンズアルデヒド（１．３０ｍＬ、１０．７ミリモル）をオルトぎ酸トリメチル（８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で４５分間撹拌した。この溶液にトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（２．２６ｇ、１０．７０ミリモル）を３０分間で少量づつ添加し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモニターした。完了した（約３０分）ならば、反応を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１５ｍＬ）により停止させ、酢酸エチル（１５ｍＬ）により抽出した。有機抽出物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液により抽出し（２×１５ｍＬ）、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させた。残留物を１００％ジクロルメタン、次いで１００％酢酸エチルを溶離剤として使用してフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のアミン（１７）（２．４８ｇ、６４％）を黄色油状物として与えた。
【０３２８】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１８）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−１，２−ピロールジカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１７）（１．３７ｇ、３．７６ミリモル）とトリエチルアミン（０．６３ｍＬ、４．５２ミリモル）を無水ジクロルメタン（１４ｍＬ）に溶解して攪拌した溶液を塩化ｔ−ブチルアセチル（０．５３ｍＬ、３．８２ミリモル）で滴下しながら処理した。室温で終夜攪拌した後、混合物をジクロルメタン（５０ｍＬ）で希釈し、１．０Ｍくえん酸水溶液で洗浄した（２×５０ｍＬ）。相を分離させ、水性相をジクロルメタン（２５ｍＬ）で逆抽出し、一緒にした有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）により精製して標記のアミン（１８）（１．５ｇ、８６％）を淡黄色油状物として与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．００及び１．０６（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．３８及び１．４２（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．８１−１．９３（ｍ、１Ｈ）；２．１５（ｓ、２Ｈ）；２．３０−２．５１（ｍ、１Ｈ）；３．１８−３．２５（ｍ、１Ｈ）；３．６２−３．８５［ｍ、４Ｈ、｛３．６９（ｓ、３Ｈ）で含む）］；３．７８（ｍ、３Ｈ）；４．１５−４．２５（ｍ、１Ｈ）；４．４５−４．６１（ｍ、２Ｈ）；５．１０−５．２３（ｍ、１Ｈ）；６．６４−６．８２（ｍ、３Ｈ）及び７．１３−７．３１（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ３６３（１００）
【０３２９】
２，２，２−トリフルオル酢酸（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシアニリノ）］−２−（メトキシカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリウム（１９ａ）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１８）（５２４ｍｇ、１．１３ミリモル）を２１％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（６．６ｍＬ）に室温で添加した。この混合物を５０分間攪拌し、次いで減圧下に蒸発乾燥させて０．９８ｇの標記のピロリウム塩（１９ａ）とトリフルオル酢酸との混合物を与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１．０８（ｓ、９Ｈ）；２．３４−２．４２（ｍ、１Ｈ）；２．４７（ｓ、３Ｈ）；２．６３−２．７２（ｍ、１Ｈ）；３．６１−３．７１（ｍ、２Ｈ）；３．８２（ｓ、３Ｈ）；３．８３（ｓ、３Ｈ）；４．０７−４．１４（ｍ、１Ｈ）；４．４３−４．５４（ｍ、１Ｈ）；４．５７−４．６７（ｍ、２Ｈ）；６．６８−６．７４（ｍ、２Ｈ）；６．９０−６．９３（ｄｄ、１Ｈ）；及び７．３４（ｔ、１Ｈ）
【０３３０】
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（２０）
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸１−（ｔ−ブチル）２−メチル（１８）（１３８ｍｇ、０．３８ミリモル）を３０％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（３ｍＬ）に室温で添加した。この混合物を３０分間攪拌し、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物をジクロルメタンと炭酸カリウム飽和水溶液との間で分配させ、５分間激しく振盪させた。有機相を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて１４０ｍｇの粗製の（２Ｓ，４Ｒ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１９ｂ）を得た。これは更に精製することなく次の反応に使用した。
（２Ｓ，４Ｓ）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（１９ｂ）（１３８ｍｇ、０．３８ミリモル）、ピペロナール（５８ｍｇ、０．３９ミリモル）及び氷酢酸（２２５μＬ、３．９３ミリモル）をテトラヒドロフラン（２．８ｍＬ）に溶解してなる溶液を室温で３０分間攪拌した。９５％シアノ硼水素化ナトリウム（１２５ｍｇ、１．８８ミリモル）を少量づつ添加し、同じ温度で４５分間撹拌し続けた。酢酸エチル（５ｍＬ）で希釈した後、反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２×５ｍＬ）及び塩水（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させた。残留物を、１００％ジクロルメタン及びジクロルメタン−酢酸エチル（４：１、ｖ／ｖ）を溶離剤としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピロール（２０）を与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：０．８９及び０．９９（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．６５−１．７９（ｍ、１Ｈ）；１．８７−２．１１［ｍ、３Ｈ、｛１．９４（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．２１−２．６６（ｍ、２Ｈ）；３．０４−３．１５（ｍ、２Ｈ）；３．５６（ｓ、３Ｈ）；３．６７−３．７４［ｍ、４Ｈ｛３．６７（ｓ、３Ｈ）で含む）］；４．４３−４．６４（ｍ、２Ｈ）；４．７４−４．９２（ｍ、１Ｈ）；５．１０−５．１４（ｍ、１Ｈ）；５．７４−５．８８（ｍ、２Ｈ）；６．４９−６．７８（ｍ、６Ｈ）及び７．０２−７．１０（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４９７［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３３１】
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（２１）
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸メチル（２０）（１００ｍｇ、０．２０ミリモル）を６％ｖ／ｖメタノール水溶液（１．０ｍＬ）に溶解してなる溶液に水酸化リチウム一水和物（１７ｍｇ、０．４０５ミリモル）を添加した。この混合物を室温で終夜撹拌し、次いで溶媒を減圧下に除去し、残留物をジクロルメタン（１．０ｍＬ）と水（１．０ｍＬ）との間で分配させた。水性相を１．０Ｍくえん酸水溶液で酸性化し、二つの相を室温で１０分間激しく振盪させた。相を分離させ、水性相をジクロルメタンで逆抽出した。一緒にしたジクロルメタン抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させた。残留物を、溶離剤としてジクロルメタン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、次いでジクロルメタン／メタノール（９：１、ｖ／ｖ）を使用してフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記の酸（２１）（８８ｍｇ、９１％）をオフホワイトの固体として与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：０．９５（ｓ、９Ｈ）；２．１８［ｍ、３Ｈ、｛２．１８（ｓ、２Ｈ）で含む）；２．６２−２．８７（ｍ、１Ｈ）；３．１７−３．２８（ｍ、１Ｈ）；３．４２−３．４７（ｍ、１Ｈ）；３．７３（ｍ、３Ｈ）；３．８２−３．９３（ｍ、１Ｈ）；３．９４−４．６０（ｍ、１Ｈ）；４．４１−４．６５（ｍ、４Ｈ）；５．９０−５．９４（ｍ、２Ｈ）；６．６３−６．９３（ｍ、６Ｈ）及び７．２１−７．２５（ｍ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ４８３［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３３２】
４−（｛（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（２２）
（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）（３−メトキシベンジル）アミノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロールカルボン酸（２１）（９６．５ｍｇ、０．２０ミリモル）とテトラフルオロ硼酸Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（７７ｍｇ、０．２４ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８７μＬ、０．５０ミリモル）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に加えてなる混合物を室温で１．５時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。水性相を酢酸エチルで逆抽出し、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発乾燥させた。残留物を、溶離剤としてヘキサン／酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）、次いで１００％酢酸エチルを使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して標記のピペラジン（２２）（８９ｍｇ、６８％）を与えた。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：０．９５及び０．９７（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．４６（ｓ、９Ｈ）；１．７４（ｓ、２Ｈ）；２．０１−２．２４及び２．３８−２．４４（２ｘｍ、２Ｈ、ロタマー）；２．５５−２．５９及び２．７０−２．８１（２ｘｍ、２Ｈ）；３．０９−３．５８（ｍ、９Ｈ）；３．７４−３．８５［ｍ、３Ｈ、（３．７６及び３．７９（２ｘｓ、３Ｈ、ロタマー）で含む）］；３．９４−４．０５及び４．０６−４．１９（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；４．２４−４．４１及び４．６１−４．６９（２ｘｍ、２Ｈ、ロタマー）；４．８６−４．９６及び５．１１−５．２１（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）；５．８９−６．０１（ｍ、２Ｈ、ロタマー）；６．５８−６．９８（ｍ、６Ｈ）；７．１３−７．１８及び７．２５−７．２７（２ｘｍ、１Ｈ、ロタマー）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ６５１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３３３】
Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（２３ａ）
４−（｛（２Ｓ，４Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−４−［（３，３−ジメチルブタノイル）−３−メトキシアニリノ］テトラヒドロ−１Ｈ−２−ピロリル｝カルボニル）−１−ピペラジンカルボン酸ｔ−ブチル（２２）（２１．７ｍｇ、３３．３μモル）をジクロルメタン（０．５ｍＬ）に溶解してなる溶液を９５％ｖ／ｖトリフルオル酢酸ジクロルメタン溶液（０．１ｍＬ、１．２ミリモル）で処理した。この混合物を室温で撹拌し、反応の過程をＴＬＣ分析によりモノターした。完了した（１時間）ならば、溶媒を減圧下に蒸発させて２２．８ｍｇの標記のトリフルオル酢酸塩（２３ａ）と酢酸エチルとトリフルオル酢酸との混合物を与えた。この塩は、更に精製することなく次の実験に使用した。
δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：０．９８（ｓ、９Ｈ）；２．０８−２．１８（ｍ、１Ｈ）；２．３２（ｄ、１Ｈ）；２．４３（ｄ、１Ｈ）；２．７３−２．８２（ｍ、１Ｈ）；３．３０−３．７３（ｍ、８Ｈ）；３．７７（ｓ、３Ｈ）；３．９０−３．９６（ｍ、１Ｈ）；４．０６−４．１９（ｍ、１Ｈ）；４．３６−４．４６（ｍ、２Ｈ）；４．５７（ｄ、１Ｈ）；４．６５−４．７３（ｍ、１Ｈ）；５．５７−６．０１（ｍ、２Ｈ）；６．６１−６．６６（ｍ、２Ｈ）；６．７６−６．９１（ｍ、４Ｈ）及び７．２９（ｔ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３３４】
Ｎ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド（２３ｂ） ２２．８ｍｇの粗製のＮ１−［（３Ｓ，５Ｓ）−１−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）−５−（ピペラジノカルボニル）テトラヒドロ−１Ｈ−３−ピロリウムイル］−Ｎ１−（３−メトキシベンジル）−３，３−ジメチルブタンアミド ２，２，２−トリフルオル酢酸塩（２３ａ）を含有するジクロルメタン（０．５ｍＬ）と水（０．５ｍＬ）との２相混合物を２．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液により、水性相のｐＨが１２に調節されるまで、処理した。この混合物を室温で５分間激しく撹拌し、相を分離させた。水性相をジクロルメタンで抽出し（２×１ｍＬ）、一緒にした有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下に蒸発させて標記のピペラジン（２３ｂ）（１４．５ｍｇ、７９％）を与えた。 δ_Ｈ（３６０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：０．９７及び１．０９（２ｘｓ、９Ｈ、ロタマー）；１．６６−１．７９［ｍ、３Ｈ、｛１．７９（ｓ、２Ｈ）で含む）］；２．０３（ｄ、１Ｈ）；２．１３（ｄ、１Ｈ）；２．３２−２．４７（ｍ、１Ｈ）；２．５４−２．８８（ｍ、５Ｈ）；３．０５−３．１２（ｍ、１Ｈ）；３．２９−３．６７（ｍ、５Ｈ）；３．７６（ｓ、３Ｈ）；３．８６（ｄ、１Ｈ）；４．６６（ｄ、１Ｈ）；４．９７（ｄ、１Ｈ）；５．０８−５．２２（ｍ、１Ｈ）；５．８９−５．９２（ｍ、２Ｈ）；６．５９−６．８１（ｍ、６Ｈ）及び７．０９−７．１８（ｔ、１Ｈ）
ＬＲＭＳ（ＬＣ−ＭＳから）（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５５１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］（１００）
【０３３５】
保護基の枠の変更は、本発明の化合物を製造し得る効率及び速度を増大させることができる。斯界で知られた方法と相まって前記した開示に基づいて、当業者により容易に実施することができる以下に説明する反応式は、ヘッジホッグ活性を示し得る化合物に対する迅速且つ有効な経路を提供する。理解されるように、特定の部分、基及び反応（例えば、アミンの求電子性又は還元的アルキル化）は、例えば、式Ｉ〜ＶＩの何れかに従う構造を有する広範な化合物を製造するように変更することができる。また、Ｊ．Ｗ．ミケルソン、Ｋ．Ｌ．ベロンガ及びＥ．Ｊ．ヤコブセン、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０；４１７７−４１８３も参照されたい。
【０３３６】
反応式１
【化３５】

【０３３７】
反応式２
【化３６】

【０３３８】
反応式３
【化３７】

【０３３９】
反応式４
【化３８】

【０３４０】
固相経路
このテンプレートでの製造を実施するのに使用される合成経路を反応式５に記載する。
反応式５
【化３９】

【０３４１】
洗浄プロトコル
方法１：水（３ｘ）、アセトン（２ｘ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｘ）、水（２ｘ）、アセトン（１ｘ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｘ）、水（２ｘ）、アセトン（３ｘ）、メタノール（３ｘ）、アセトン（３ｘ）及びメタノール（３ｘ）。
方法２：ジクロルメタン、ヘキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、ヘキサン、ジクロルメタン及びヘキサン。
方法３：水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、水、１．０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン及びメタノール。
方法４：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン、メタノール（２×）及びエーテル（２×）。
方法５：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、メタノール、ジクロルメタン及びメタノール（２×）。
溶媒中の樹脂の膨潤は、樹脂１ｇ当たりの溶媒１０ｍＬの標準量に基づいていた。
【０３４２】
工程Ａ：（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングのＰＮＰカーボネートポリスチレン）の製造
・ヒドロキシベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングの樹脂）
クロルメチルポリスチレン（２．４ｋｇ、３．６モルの官能化負荷量）と４−ヒドロキシベンジルアルコール（５８１ｇ、４．６８モル）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１０Ｌ）に加えて撹拌した混合物にナトリウムメトキシド（２３３ｇ、４．３１モル）を窒素雰囲気下にゆっくりと添加した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１３Ｌ）を添加した後、混合物を５０℃に５時間加熱し、次いでカニューレを経てＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過した。粗生成物を方法１にリストした順序を使用して十分に洗浄し、次いで６０℃で真空乾燥して２６３０ｇの標記の樹脂を与えた。
・（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（ワングのＰＮＰカーボネートポリスチレン）
ヒドロキシベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（２０００ｇ、２．５モルの官能化負荷量）と４−ニトロフェノールクロルぎ酸エステル（１２０９ｇ、６．０モル）をジクロルメタン（２２Ｌ）に加えて撹拌した混合物に４−メチルモルホリン（６６０ｍＬ、６．０モル）を０℃で窒素雰囲気下に２時間にわたり滴下した。この混合物を室温まで徐々に加温し、終夜撹拌し、カニューレを経てＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過した。粗製の樹脂を方法２にリストした順序を使用して十分に洗浄し、次いで室温で真空乾燥して２７２８ｇの標記の樹脂と４−メチルモルホリン塩酸塩との混合物を与えた。
【０３４３】
工程Ｂ：ワングの樹脂に結合されたジアミンの製造
・一般的方法（ピペラジン、ホモピペラジン及びｔｒａｎｓ−１，４−ジアミノシクロヘキサンのための）
粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）を無水ジクロルメタンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合物（１：１、ｖ／ｖ、９Ｌ）中で窒素雰囲気下に１５分間膨潤させた。Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミン（６２６ｍＬ、５モル当量）と適当なジアミン（５モル当量）を添加し、混合物を終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾燥して樹脂に結合されたジアミンを得た。
・ワングの樹脂に結合されたエチレンジアミン
粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）をジクロルメタン（７Ｌ）に窒素雰囲気下で１５分間膨潤させ、エチレンジアミン（１８１ｍＬ、２．７モル）により処理した。生じた濃厚な黄色懸濁液をジクロルメタン（２Ｌ）で希釈し、終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾燥して標記の樹脂に結合されたジアミンを得た。
・ワングの樹脂に結合されたｍ−キシレンジアミン
粗製の（ニトロフェン−４’−イルオキシカルボキシ）ベンズ−４−イルオキシメチルポリスチレン（１００２．５ｇ、〜０．９モルの官能化負荷量）をテトラヒドロフラン（７Ｌ）に窒素雰囲気下で１５分間膨潤させ、ｍ−キシレンジアミン（８２８ｍＬ、６．２７モル）をテトラヒドロフラン（１Ｌ）に溶解してなる溶液により処理した。生じた濃厚な黄色懸濁液をジクロルメタン（２Ｌ）で希釈し、終夜室温で激しく撹拌した。この混合物をＰ−ＥＴＦＥメッシュ（７０μｍ）によりろ過し、方法３にリストした順序を使用して十分に洗浄し、６０℃で真空乾燥して標記の樹脂に結合されたジアミンを得た。
【０３４４】
工程Ｃ：ワングのジアミンへの構成ブロックの負荷
適当な樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で１５分間膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、１−［９Ｈ−９−フルオレニルメトキシカルボニル］−４−オキソ−２（Ｓ）−ピロリジンカルボン酸（２当量）により処理した。３０分後に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２当量）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２当量）を添加し、樹脂懸濁液を終夜室温で穏やかに撹拌した。ろ過した後、樹脂を方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４５】
工程Ｄ：Ｃ−４での還元的アミノ化
適当な樹脂を無水テトラヒドロフランとメタノールとの５０％ｖ／ｖ混合物中で１５分間膨潤させ、穏やかに撹拌し、氷酢酸（１０当量）により処理した。適当なアミン（５当量）とシアノ硼水素化ナトリウム（５当量）を添加し、樹脂懸濁液を終夜室温で穏やかに撹拌した。ろ過した後、樹脂を方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４６】
工程Ｅ：還元的アルキル化又はキャッピング
・還元的アルキル化
適当な樹脂を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、氷酢酸（１０当量）で処理した。適当なアルデヒド（５当量）とトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（５当量）を添加し、樹脂懸濁液を室温で１時間注意深く撹拌した。次いで、この期間中に反応容器内に発生した圧力を解放し、懸濁液の穏やかな撹拌を終夜室温で継続した。次いで、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
・酸クロリドによるキャッピング
適当な樹脂を無水テトラヒドロフランとクロロホルムとの５０％ｖ／ｖ混合物に懸濁させて穏やかに撹拌した懸濁液に、適当な酸クロリド（５当量）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を添加した。終夜室温で穏やかに撹拌した後、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して十分に洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４７】
工程Ｆ：Ｎ−Ｆｍｏｃの脱保護
樹脂類似体を２０％ｖ／ｖピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液中に懸濁させ、室温で３０プ間穏やかに撹拌した。次いで、樹脂懸濁液をろ過し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液によるこの処理をもう１回繰り返して完全なＮ−Ｆｍｏｃの脱保護を確実にさせた。３０分間放置した後、樹脂をろ過し、方法４にリストした順序を使用して洗浄し、４０℃で真空乾燥した。
【０３４８】
工程Ｇ：Ｎ１での還元的アルキル化又はキャッピング
・還元的アルキル化
適当な樹脂（２ｍＬのフィルターブロック内でウエル１個あたり〜６０ｍｇ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、氷酢酸（〜５０μＬ、１０当量）で処理した。適当なアルデヒド（５当量）とトリアセトキシ硼水素化ナトリウム（〜８５ｍｇ、５当量）を添加し、次いでフィルターブロックを終夜室温で穏やかに撹拌した。次いで、それぞれの樹脂をろ過し、方法５にリストした順序を使用して洗浄した。
・酸クロリドによるキャッピング
適当な樹脂（２ｍＬのフィルターブロック内でウエル１個あたり〜６０ｍｇ）を無水テトラヒドロフランとクロロホルムとの５０％ｖ／ｖ混合物（１ｍＬ）中で膨潤させ、次いで穏やかに撹拌し、適当な酸クロリド（５当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（〜１５０μＬ、１０当量）で処理した。フィルターブロックを終夜室温で穏やかに撹拌した後、樹脂をろ過し、方法５にリストした順序を使用して洗浄した。
【０３４９】
工程Ｈ：ＴＦＡを使用してワングの樹脂からの最終生成物の解裂
適当な樹脂をＤＣＭ中で膨潤させ、９５％ｖ／ｖＴＦＡジクロルメタン溶液を添加することにより最終生成物を解裂させた。４つの別個のＴＦＡアリコート（２×３００μＬ、７５μＬ及び５００μＬ）を添加し、これらから得られたろ液を９６個のウエルを収容するプレート内に集めた。アリコート１、２及び４の添加により得られたろ液を同じ９６個のウエルのプレートを使用して集めた。また、アリコート３（７５μＬ）の添加後に得られたろ液を分析用の９６個のウエルのプレートを使用して別個に集めた。次いで、全ての画分をジェネバック装置を使用して減圧下に蒸発させて最終生成物を得た。
【０３５０】
生物学的アッセイ
リード化合物の発見／高スループットスクリーニングアッセイ
試験すべき化合物を、ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度まで溶解させて、−２０℃に保存する。アッセイ用細胞中のヘッジホッグ経路を活性化させるために、オクチル化（脂質改変）型のソニックヘッジホッグタンパク質のＮ末端断片（ＯＣＴ−ＳＨＨ）を利用する。このＮ末端ＳＨＨ断片を細菌により生成する。
【０３５１】
化合物を、下記の「Ｇｌｉ−Ｌｕｃ」アッセイにて、細胞株１０Ｔ（ｓ１２）を用いて試験することができ、ここに、これらの細胞は、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として利用するヘッジホッグ応答性レセプター構築物を含んでいる。この方法において、ヘッジホッグ経路のシグナル伝達活性を、Ｇｌｉ−Ｌｕｃ応答により測定することができる。
【０３５２】
１０ｔ１／２（ｓ１２）細胞を、９６ウェルミクロ滴定プレート（ＭＴＰ）中の完全培地［１０％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ］に、２０，０００細胞／ウェルでプレートする。次いで、プレートを、３７℃で５％ＣＯ_２中での一晩（Ｏ／Ｎ）のインキュベーションのためにインキュベーター中に置く。２４時間後に、培地をルシフェラーゼアッセイ用培地（０．５％ ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ）と交換する。化合物を解凍し、アッセイ用培地で３：１０００（約３００倍）に希釈して、約３０μＭの出発濃度を生じる。
【０３５３】
続いて、１５０μｌの各３０μＭの試料を第一のウェルに加える（三連で）。これらのＭＴＰ試料を、次いで、３倍希釈で、全部で７つのウェルに希釈して、最終的に、各化合物について、７つの希釈物の群を三連で生成する。次に、タンパク質リガンドＯＣＴ−ＳＨＨをルシフェラーゼアッセイ用培地中で希釈し、各ウェルに終濃度０．３μｇ／ｍｌで加える。次いで、プレートを、３７℃で、５％ＣＯ^２中での更なるインキュベーション（Ｏ／Ｎ）のためにインキュベーターに戻す。２４時間後に、プレートをインキュベーターから取り出して、培地を吸引／廃棄する。ウェルをアッセイ用緩衝液［ＰＢＳ＋１ｍＭ Ｍｇ^２＋及び１ｍＭ Ｃａ^２＋］で一回洗う。次いで、５０μｌのアッセイ用緩衝液を各ウェルに加える。ルシフェラーゼアッセイ用試薬を、販売者（ＰａｃｋａｒｄのＬｕｃＬｉｔｅキット）により記載されたように調製し、５０μｌを各ウェルに加える。プレートを室温（ＲＴ）で、約３０分間にわたってインキュベートし、その後、シグナルを、やはりＲＴで、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）にて読む。
【０３５４】
このアッセイで同定された化合物を、図３２に描いた。上記のアッセイにおける描かれた化合物の個々のジアステレオマーの試験は、シス異性体が、一層大きい活性を示す傾向があり、ときには、トランス異性体化合物の１００倍を超えるということを示した。その上、主題の化合物のアンモニウム塩誘導体例えばＴＦＡ塩は、上記のアッセイにおいて、同等か一層大きい活性を示すことが示された。
【０３５５】
特定の化合物の活性を下記の表１に与える：
【表１】

【０３５６】
Ｐｔｃ−ヌルアッセイ
方法
Ｐｔｃ−細胞を、３日間、ビヒクル；ジャービン（公知のパッチト経路のアンタゴニスト（ｉ）ここではポジティブコントロールとして使用）；又は１μＭの化合物Ｄの存在下で培養した。全リボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞から単離して、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用に用いた。マウスｇｌｉ−１ｍＲＮＡの検出のための特異的プライマーをこのＰＣＲにおいて用い、又、同量のｍＲＮＡ試料をこの実験において比較するためにアクチン遺伝子を用いた。これらのｇｌｉ−１及びアクチンｍＲＮＡ試料を、次いで、１．５％アガロースゲルに載せ、エチジウムブロミドを用いる染色により検出した。同じ試料を、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法により分析してｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを定量した。
【０３５７】
結果
図３３Ａは、代表的な実験結果を示している。それは、ビヒクルコントロール（レーン１）；ポジティブコントロール化合物の５μＭ ジャービン（レーン２）；及び１μＭ Ｄ（レーン３）で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を示している。ビヒクルと比較して、Ｄ及びジャービンは、ｐｔｃ−ヌル細胞において、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を有意に低下させた。アクチンｍＲＮＡのレベルは、すべての条件において等しかったが、これは、等量のＲＮＡがこの実験において分析されたことを示している。この定性的結果は、定量的リアルタイムＰＣＲ分析（図３３Ｂ）により確認されたが、これは、Ｄ及びジャービンがｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートしたことを示している。
【０３５８】
まとめると、これらの実験は、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡ転写物の発現の阻害により示されるように、ｐｔｃ−ヌル細胞のＤへの３日間の暴露がパッチト経路をダウンレギュレートすることを確実にするものである。
【０３５９】
マウス胎児皮膚パンチアッセイ：Ｄへの長期間の暴露の効果
方法
新規な細胞培養アッセイを確立して、皮膚におけるパッチト経路の活性化に対するＤの効果を測定した。この系においては、パッチト経路の活性化は、ｐｔｃ遺伝子の増大した発現を生じる。
【０３６０】
胎児の皮膚におけるパッチト経路の活性をモニターするために、我々は、トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の皮膚切片を培養した。これらのマウスは、外来遺伝子（ｌａｃＺ）を有するように遺伝子工学的に処理したものである。このｌａｃＺ遺伝子は、細菌のβ−ガラクトシダーゼをコードしている。この遺伝子を、ｐｔｃ遺伝子座に、正常のｐｔｃ機能が可能なように挿入した。次いで、Ｓｈｈ誘導されたパッチト経路の活性化に応答してのｐｔｃの活性化を、ｌａｃＺ遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼの生成によりモニターすることができる（β−ガラクトシダーゼは、基質のＸ−ｇａｌの青色反応生成物への酵素的変換により検出することができる）。
【０３６１】
１７．５日齢の胎児の皮膚を、これらのトランスジェニックレポーターマウスから２ｍｍの円形パンチとして外植して、Ｓｈｈタンパク質の存在下で５〜７日間培養した（図３４）。Ｓｈｈタンパク質は、これらの培養中のＸ−ｇａｌ染色の量を増大させるので、ｐｔｃ遺伝子の発現をアップレギュレートするはずである。Ｄの効果を試験するために、皮膚パンチを、６日間、Ｓｈｈタンパク質とＤの両者の存在下で培養した（図３５）。
【０３６２】
結果
予想されるように、Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることは、これらの培養物の青色のＸ−ｇａｌ染色により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じた（図３４Ａ−Ｘ−ｇａｌ）。
【０３６３】
切片化皮膚パンチのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、強く染色される好塩基性核及び高い核対細胞質比を有する細胞を示した（図３４Ａ − Ｈ＆Ｅ［１０×］及びＨ＆Ｅ［４０×］）。これらの構造は、皮膚層中でクラスターにて配置され且つ正常の外観の皮膚細胞の柵により分離された点においてＢＣＣに似ている。
【０３６４】
Ｘ−ｇａｌ染色は、パッチト経路が、これらのＢＣＣ様構造内の細胞において活性であることを示した（図３４Ａ − エオシン＋Ｘ−ｇａｌ）。公開された結果と一致し且つヒトＢＣＣと類似して、このマウス皮膚パンチ中のＢＣＣ様クラスターは、ケラチン１４（未分化ケラチノサイトのマーカー）を発現した（図３４Ｂ）。
【０３６５】
皮膚パンチを、６日間、Ｓｈｈタンパク質とＤの両者の存在下で培養して、Ｄの効果を試験した。図３５は、Ｓｈｈ処理した皮膚パンチにおけるパッチト経路の活性レベルに対するＤの投与量依存性の効果を示している。Ｄの増大する濃度（０．０１〜１μＭ）は、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量によりモニターして、経路の活性の量の投与量依存性の減少へと導いた（図３５Ａ）。Ｄ処理した外植片のレポーター酵素染色は、０．２μＭ ＤがＸ−ｇａｌ染色を、Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して減少させたことを示した（図３５Ｂ）。これは、Ｄが、パッチト経路の活性をブロックしてｐｔｃ遺伝子の発現をダウンレギュレートしたことを示している。
【０３６６】
次の実験は、パッチト経路をＤで阻害することは、ＢＣＣ様構造の形成を防止するであろうことを示した。図３５Ｃは、Ｄが、正常皮膚細胞の完全性に影響を与えることなくＢＣＣ様構造の形成を完全にブロックしたことを示している。これは、Ｄが、パッチト経路（ヒトの病気の根底にある同様の経路）の活性化により生成されるＢＣＣ様構造の出現を防止することができることを確実にしている。
【０３６７】
マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：Ｄによる短期の予備処理の効果
方法
トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチを、Ｓｈｈの非存在下で５時間にわたって、ビヒクル又はＤにより処理した。この予備処理後に、ビヒクル又はＤを除去した。これらの皮膚パンチを、２回洗い、次いで、Ｓｈｈの存在下で、６日間培養した。実験の終りに、これらの皮膚パンチを固定して、Ｘ−ｇａｌで染色してパッチト経路活性を測定した。
【０３６８】
結果
外因性Ｓｈｈタンパク質だけで６日間処理した皮膚パンチは、ビヒクルだけで処理したものと比較して、強いＸ−ｇａｌ染色（即ち、活性化）を示した（図３６、上段）。１０、２０及び５０μＭのＤにより５時間にわたって予備処理してから外因性Ｓｈｈタンパク質にさらした皮膚パンチは、Ｘ−ｇａｌ染色の存在しないことにより示されるように、パッチト経路のＳｈｈタンパク質で誘導されるアップレギュレーションの完全な阻止を示した（図３６、下段 − 右側の３スライド）。パッチト経路のアップレギュレーションを示す強いＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルで予備処理してからＳｈｈタンパク質にさらした皮膚パンチにおいて見られた（図３６、下段左側）。この短期間の予備処理は、本質的に、ｐｔｃ阻害のレベルに関して、６日間のＤへの暴露に等しかった（図３６の上段と下段を比較されたい）。
【０３６９】
これらの結果は、Ｄが、その標的にきつく結合すること及び解離の速度論が遅いか又は不可逆であることを示唆している。このデータは又、ＤがＢＣＣの発生を予防する能力を有しうることをも示唆している。
【０３７０】
マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：先在性ＢＣＣ様構造のＤによる長期処理
方法
トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の、１７．５日齢胎児皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で７日間培養して、ＢＣＣ様構造の発生を可能にした。このＳｈｈタンパク質を、７日間の最後に除去した。これらの培養物を、次いで、Ｓｈｈタンパク質にビヒクル又はＤを加えたものに、３日間さらした。これらの培養物を、１０日後に組織学的に分析して、パッチト経路の活性化を示すＢＣＣ様構造の形成を評価した。
【０３７１】
結果
組織学的分析は、Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおけるＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の大きさと数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して有意に減少させるということを示した（図３７Ａ）。従って、存在するＢＣＣ様構造をＤに３日間さらすことがこれらの構造の退行を誘導したらしい。その上、Ｄは、皮膚細胞に対しては、それらの正常な組織学により測定して、一般的な細胞障害性効果を有しているようには見えなかった。
【０３７２】
Ｄ誘導されるＢＣＣ様構造の退行の一つの可能な機構は、活性化された細胞のアポトーシスでありうる。この可能性を調べるために、同時平行的に外植片を、５μＭ Ｄに２日間さらし、次いで、アポトーシスを起こした核の検出に用いられるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介のｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法により染色した。５μＭＤに２日間さらした後に、ＢＣＣ様構造内のアポトーシスを起こした核（右側のスライド中の褐色により示されている）の数は、左側のビヒクルコントロールより有意に高かった（図３７Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｄ誘導されたＢＣＣ様構造の退行が、少なくとも部分的に、パッチト経路が活性化される細胞自殺経路の刺激から生じることを示唆してしている。
【０３７３】
マウス胎児皮膚パンチのアッセイ：先在性ＢＣＣ様構造のＤによる短期処理
方法
トランスジェニックパッチト経路レポーターマウス由来の、１７．５日齢胎児皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で７日間培養した。このＳｈｈタンパク質は、７日間の最後に除去した。次いで、これらの皮膚パンチを、ビヒクル又は１若しくは５μＭ Ｄに、７日目と９日目にさらした。ビヒクル又はＤへの各暴露の後に、このビヒクル又はＤを洗い去り、これらの皮膚パンチを、Ｓｈｈタンパク質の存在下で再び培養した。培養物を、イン・ビトロで１０日の後に、Ｘ−ｇａｌ染色により分析して、パッチト経路の活性を評価した。
【０３７４】
結果
Ｄによる短期処理は、Ｓｈｈタンパク質への暴露と関連したＸ−ｇａｌ染色の量を減少させ（図３８Ａ）、これは、皮膚外植片における経路の活性のダウンレギュレーションを示唆している。組織学的分析は、１μＭの濃度でさえ、Ｄは、Ｘ−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構造の退行を誘導することを示した（図３８Ｂ）。Ｄ処理したパンチにおけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルの定量化は、Ｄによる短期処理が、ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートすることを示した（図３８ｃ、左側）。この効果は、ハウスキーピング酵素のグリセルアルデヒドー３一ホスフェートデヒドロゲナーゼ又はＧＡＰＤＨの比較的一定のｍＲＮＡレベルにより示されるように、パッチト経路に特異的であるようであり、一般的な細胞障害性によるものではない（図３８Ｃ、右側）。
【０３７５】
これらの結果は、短期暴露のある条件下で、Ｄが、培養胎児皮膚外植片においてパッチト経路の活性を阻止する能力を有することを示している。その上、Ｄは、１及び５μＭの濃度で、先在性のＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の退行を引き起こした。
【０３７６】
成体ＢＣＣマウス皮膚パンチアッセイ
方法
ｐｔｃヘテロ接合型トランスジェニックマウスを毎週３回６ヵ月間にわたって照射したが、その間に、多くの小さい（しばしば、顕微鏡的）ＢＣＣ腫瘍が発生した。直径４ｍｍの皮膚パンチ外植片（おそらくＢＣＣ構造を含む）を。ビヒクル、ポジティブコントロール（ジャービン）又は５μＭ Ｄの存在下で６日間培養した。実験の最後に、これらの外植片を、Ｘ−ｇａｌ染色により分析してパッチト経路活性のレベルを検出し、組織学的に分析して紫外線商社誘導されたＢＣＣの形態に対する処理の効果を測定し、そしてｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現レベルを定量することにより分析して経路の阻害の程度を特性決定した。
【０３７７】
結果
処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルのみの存在下で培養した皮膚パンチが、焦点のパッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示す青色に強く染色されたフォーカスを生じたことを示している（図３９Ａの青色スポット）。ビヒクルと比較して、５μＭ Ｄは、ポジティブコントロールと同様に、確立されたＢＣＣ構造の数と大きさを減じた。切片化した外植片の組織学的分析は、Ｄが、ビヒクルコントロールと比較して、紫外線照射により誘導されるＢＣＣ腫瘍の退行を誘導したことを示した（図３９Ｂ）。これらのヘテロ接合型トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルは、ｐｔｃ標的遺伝子の活性化の故に非常に高かった。１〜５μＭの濃度のＤも又、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを、ビヒクルだけの場合と比較して有意に阻害した。ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルの定量化は、標的遺伝子活性化のＤによる殆ど完全な阻害を示している（図３９Ｃ）。この阻害は、処理した状況とビヒクルを用いた状況の間でのハウスキーピングＧＡＰＤＨ酵素のレベルの統計的比較が、一般的な細胞代謝活性のグループ間の有意の差異を示さないので、非特異的な細胞障害性により引き起こされたようには見えなかった。従って、これらの結果は、Ｄが、パッチト経路を阻害して、紫外線照射により誘導される培養皮膚外植片のＢＣＮＳ様ＢＣＣ腫瘍の退行を誘導することを示している。
【０３７８】
これらのデータは、以前の実験の結果を確実にして、ＤがＢＣＣの治療に効果的でありうることを示唆する。
【０３７９】
ヒトＢＣＣ外植片の培養
方法
外科的手順（モーズ切除法等）から得られた試料を、すべての上皮細胞をディスパーゼを用いる消化によって除去した、新鮮な、生きている、１７日目のマウス胎児真皮上で培養した。ディスパーゼ処理は、基底膜成分を消化するので、マトリゲル（市販の基底膜標品）をこの真皮とＢＣＣの間に適用した。培養を、プラスチックグリッドの先端に集めて、ヒトの皮膚の長期培養に適した培地中で３日間インキュベートした（１０μＭの濃度のＤを伴って又は伴わないで）。培養後、これらの試料を、日常的な組織学用に処理し、定量的イン・シトゥーハイブリダイゼーションにかけた。簡単に言うと、パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋した組織（大きい基底細胞島を含む）の７μｍの切片を清浄化し、再水和し、プロテイナーゼＫで消化し、アセチル化し、そして［^３３Ｐ］標識したＲＮＡプローブと一晩ハイブリダイズさせた。高緊縮ハイブリダイゼーション後洗浄の後に、スライドを、暗黒中で、室温で、４〜７日間、フォトイメージャースクリーンに露出した。現像後、［^３３Ｐ］シグナルを、ストームスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてスキャンした。個々の基底細胞島を選択し、イメージクオント１．０ソフトウェアを用いてシグナルを定量して平均カウント／ピクセルで表した。
【０３８０】
結果
ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴例えば未分化基底細胞の島及び幾らかの場合における周囲の細胞の柵及び間質クレフティング（図４０Ａ）は、ＢＣＣをこのシステムで培養した場合に保持されていた。同様に、発現された分化マーカーは、免疫組織化学的染色により測定して、予備培養コントロールのものと同じパターンである（データは示してない）。ＧＬＩ−１遺伝子（パッチトシグナリングの枢要な指標）は、未処理培養物において、^３３Ｐ標識したＲＮＡプローブにさらした切片で測定して、高レベルで活性なままであった（図４０Ｂ）。定量的イン・シトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベルが、Ｄ処理した試料において、ビヒクルで処理したコントロールと比較して、大いに低減されたことを示した（図４１）。
【０３８１】
本発明の化合物の製造
ａ．合成反応式の例
本発明の方法及び組成物に有用なヘッジホッグアンタゴニストを発生させるための合成反応式の例を図１〜３１に示す。
例示した図１〜３１の反応式における反応条件は以下の通りである。
１）Ｒ_１ＣＨ_２ＣＮ，ＮａＮＨ_２，トルエン
（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ １９９０，４０，１１，１２４２）
２）Ｈ_２ＳＯ_４，Ｈ_２Ｏ，還流
（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ １９９０，４０，１１，１２４２）
３）Ｈ_２ＳＯ_４，ＥｔＯＨ，還流
（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ １９９０，４０，１１，１２４２）
４）ＮａＯＨ，ＥｔＯＨ，還流
５）（Ｂｏｃ）_２Ｏ，２Ｍ ＮａＯＨ，ＴＨＦ
６）ＬｉＨＤＭＳ，Ｒ_１Ｘ，ＴＨＦ
（メルク，特許出願ＷＯ９６／０６６０９）
７）Ｐｄ−Ｃ，Ｈ_２，ＭｅＯＨ
８）ｔ−ＢｕＯＮＯ，ＣｕＢｒ，ＨＢｒ，Ｈ_２Ｏ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９７７，４２，２４２６）
９）ＡｒＢ（ＯＨ）_２，Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４，ジオキサン
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，２１７−２２３）
１０）Ｒ_１２（Ｈ）Ｃ＝ＣＲ_１３Ｒ_１４，Ｐｄ（ＯＡｃ）_２，Ｅｔ_３Ｎ，ＤＭＦ
（Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔ．１９８２，２７，３４５）
１１）Ｔｆ_２Ｏ，ＴＨＦ
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，５４７８−５４８６）
１２）ＡｒＳｎＢｕ_３，Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４，ジオキサン
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，５４７８−５４８６）
１３）ＫＭｎＯ_４，Ｐｙ，Ｈ_２Ｏ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． １９９６，３９，２１７−２２３）
１４）ＮａＯＲ_１，ＴＨＦ
１５）ＮａＳＲ_１，ＴＨＦ
１６）ＨＮＲ_１Ｒ_１３，ＴＨＦ
１７）ＨＯＮＯ，ＮａＢＦ_４
（Ａｄｖ．Ｆｌｕｏｒｉｎｅ Ｃｈｅｍ．１９６５，４，１−３０）
１８）Ｐｄ（ＯＡｃ）_２，ＮａＨ，ＤＰＰＦ，ＰｈＣＨ_３，Ｒ_１ＯＨ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，６２，５４１３−５４１８）
１９）ｉ．Ｒ_１Ｘ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，ｉｉ．Ｒ_１３Ｘ
２０）ＳＯＣｌ_３，触媒ＤＭＦ
２１）ＣＨ_２Ｎ_２，Ｅｔ_２Ｏ
２２）Ａｇ_２Ｏ，Ｎａ_２ＣＯ_３，Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３，Ｈ_２Ｏ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９７９，２６６７）
２３）ＡｇＯ_２ＣＰｈ，Ｅｔ_３Ｎ，ＭｅＯＨ
（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９７０，５０，７７；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，５４３２）
２４）ＬｉＯＨ，ＴＨＦ−ＭｅＯＨ
２５）（ＥｔＯ）_２Ｐ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＯ_２Ｒ，ＢｕＬｉ，ＴＨＦ
２６）ＭｅＯ_２ＣＣＨ（Ｂｒ）＝Ｐ（Ｐｈ）_３，ベンゼン
２７）ＫＯＨ又はＫＯｔＢｕ
２８）塩基，Ｘ（ＣＨ_２）_ｎＣＯ_２Ｒ
２９）ＤＰＰＡ，Ｅｔ_３Ｎ，トルエン
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８５，２２０）
３０）ＨＯＮＯ，Ｈ_２Ｏ
３１）ＳＯ_２，ＣｕＣｌ，ＨＣｌ，Ｈ_２Ｏ
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９６９，１−１０，６）
３２）ロウエッソン試薬，トルエン
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ａｓｙｍ．１９９６，７，１２，３５５３）
３３）Ｒ_２Ｍ，溶媒
３４）３０％Ｈ_２Ｏ_２，氷ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ
（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１９６８，３４９，３２３）
３５）トリホスゲン，ＣＨ_２Ｃｌ_２
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
３６）ｉ，（ＥｔＯ）_２Ｐ（Ｏ）ＣＨＬｉＳＯ_２Ｏｉ−Ｐｒ，ＴＨＦ，ｉｉ，ＮａＩ
３７）Ｐｈ_３ＰＣＨ_３Ｉ，ＮａＣＨ_２Ｓ（Ｏ）ＣＨ_３，ＤＭＳＯ
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８７，４９８）
３８）Ｂｒ_２，ＣＨＣｌ_３又は他の溶媒
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８７，４９８）
３９）ＢｕＬｉ，Ｂｕ_３ＳｎＣｌ
４０）ＣｌＳＯ_２ＯＴＭＳ，ＣＣｌ_４
（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９９５，１２８，５７５−５８０）
４１）ＭｅＯＨ−ＨＣｌ，還流
４２）ＬＡＨ，Ｅｔ_２Ｏ又はＬｉＢＨ_４，ＥｔＯＨ又はＢＨ_３−ＴＨＦ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
４３）ＭｓＣｌ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
４４）Ｎａ_２ＳＯ_３，Ｈ_２Ｏ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，８５８９）
４５）Ｒ_２Ｒ_４ＮＨ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
４６）Ｒ_２Ｍ，溶媒
４７）ＣＨ_３ＮＨ（ＯＣＨ_３），ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９８１，２２，３８１５）
４８）ＭｅＬｉ，ＴＨＦ
４９）ｍＣＰＢＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
５０）ＨＯＮＯ，Ｃｕ_２Ｏ，Ｃｕ（ＮＯ_３）_２，Ｈ_２Ｏ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４２，２０５３）
５１）Ｒ_１Ｍ，溶媒
５２）ＨＯＮＯ，ＮａＳ（Ｓ）ＣＯＥｔ，Ｈ_２Ｏ
（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１９４７，２７，８１
５３）ＨＳＲ_２又はＨＳＲ_４，ＣＨ_２Ｃｌ_２
５４）ｉ−ＢｕＯＣ（Ｏ）Ｃｌ，Ｅｔ_３Ｎ，ＮＨ_３，ＴＨＦ
５５）Ｒ_２Ｎ_４ＮＨ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３
５６）Ｒ_２Ｎ_４ＮＨ，ＭｅＯＨ／ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ，ＮａＢＨ_３ＣＮ
５７）Ｒ_２ＯＨ，ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
５８）Ｒ_２ＯＨ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
５９）Ｒ_２Ｎ_４ＮＨ，ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
６０）Ｒ_２Ｎ_４ＮＨ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
６１）ＰＯＣｌ_３，Ｐｙ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
６２）Ｒ_２Ｒ_４ＮＣＯ，溶媒
６３）Ｒ_２ＯＣ（Ｏ），Ｅｔ_３Ｎ，溶媒
６４）Ｒ_２ＣＯ_２Ｈ，ＥＤＣ又はＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
６５）Ｒ_２Ｘ，Ｅｔ_３Ｎ，溶媒
６６）（ＣＨ_３Ｓ）_２Ｃ＝Ｎ（ＣＮ），ＤＭＦ，ＥｔＯＨ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，５７−６６）
６７）Ｒ_２ＳＯ_２Ｃｌ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
６８）Ｒ_２−又はＲ_３−又はＲ_４−ＣＨＯ，ＭｅＯＨ／ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ，ＮａＢＨ_３ＣＮ
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ １９７５，１３５−１４６）
６９）Ｂｏｃ（Ｔｒ）−Ｄ又はＬ−ＣｙｓＯＨ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
７０）Ｂｏｃ（Ｔｒ）−Ｄ又はＬ−ＣｙｓＨ，ＮａＢＨ_３ＣＮ，ＭｅＯＨ／ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ １９７５，１３５−１４６）
７１）Ｓ−Ｔｒ−Ｎ−Ｂｏｃシステイナル，ＣｌＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌ又はＴＨＦ，ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，３８４９−３８６２）
７２）ＴＦＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２，Ｅｔ_３ＳｉＨ又は（３：１：１）チオアニソール／エタンジチオール／ＤＭＳ
７３）ＴＦＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
７４）ＤＰＰＡ，Ｅｔ_３Ｎ，トルエン，ＨＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＣＨ_３
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９８４，２５，３５１５）
７５）ＴＢＡＦ，ＴＨＦ
７６）塩基，ＴｒＳＨ又はＢｎＳＨ
７７）塩基，Ｒ_２Ｘ又はＲ_４Ｘ
７８）Ｒ_３ＮＨ_２，ＭｅＯＨ／ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ，ＮａＢＨ_３ＣＮ
７９）Ｎ_２Ｈ_４，ＫＯＨ
８０）Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３，Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）_３，ＲＮＨ_２，ＮａＯｔＢｕ，ジオキサン，Ｒ_１ＮＨ_２
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，７１８１−７１８４）
８１）シアナミド
８２）Ｆｍｏｃ−Ｃｌ，重炭酸ナトリウム
８３）ＢｎＣＯＣｌ，炭酸ナトリウム
８４）アリルＯＣＯＣｌ，ピリジン
８５）臭化ベンジル、塩基
８６）塩化オキサリル，ＤＭＳＯ
８７）ＲＣＯＮＨ_２
８８）カルボニルジイミダゾール，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
８９）チオカルボニルジイミダゾール，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）９０）臭化シアン，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
９１）ＲＣＯＣｌ，トリエチルアミン
９２）ＲＮＨＮＨ_２，ＥＤＣ
９３）ＲＯ_２ＣＣＯＣｌ，Ｅｔ_３Ｎ，ＤＣＭ
９４）ＭｓＯＨ，ピリジン
（Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ．１９８０，６０７
９５）塩基，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，トルエン，ＴＨＦ）
９６）Ｈ_２ＮＯＲ，ＥＤＣ
９７）ＲＣＳＮＨ_２
９８）ＲＣＯＣＨＢｒＲ，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
（Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｐｒｅｐ．Ｉｎｔｌ．１９９２，２４，１２７）
９９）ＣＨ_２Ｎ_２，ＨＣｌ
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ，１９９３，１９７）
１００）ＮＨ_２ＮＨＲ，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
１０１）ＲＳＯ_２Ｃｌ，ＤＭＡＰ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄ．Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，２７４９）
１０２）Ｅｔ_３Ｎ，ＲＸ
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，６０３７）
１０３）ＮＯＣｌ又はＣｌ_２
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，３９１６）
１０４）Ｈ_２ＮＯＨ，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
１０５）ＲＣＣＲ，中性溶媒（ＤＣＭ，ＴＨＦ，トルエン）
１０６）ＲＣＨＣＨＲ，中性溶媒（ＤＣＭ，ＴＨＦ，トルエン）
１０７）Ｈ_２ＮＯＨ，ＨＣｌ
１０８）チオカルボニルジイミダゾール，ＳｉＯ_２又はＢＦ_３ＯＥｔ_２
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，５２２８）
１０９）チオカルボニルジイミダゾール，ＤＢＵ又はＤＢＮ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，３９，５２２８）
１１０）ＨＮＯ_２，ＨＣｌ
１１１）ＣｌＣＨ_２ＣＯ_２Ｅｔ
（Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９５９，１０，１４３）
１１２）モルホリンエナミン
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８２，１７，２７）
１１３）ＲＣＯＣＨＲ’ＣＮ
１１４）ＲＣＯＣＨＲ’ＣＯ_２Ｅｔ
１１５）Ｎａ_２ＳＯ_３
１１６）Ｈ_２ＮＣＨＲＣＯ_２Ｅｔ
１１７）ＥｔＯ_２ＣＣＨＲＮＣＯ
１１８）ＲＣＮＨＮＨ_２
１１９）ＲＣＯＣＯ_２Ｈ
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３８，３７４１）
１２０）ＲＣＨＯ，ＫＯＡｃ
１２１）２−フルオルニトロベンゼン
１２２）ＳｎＣｌ_２，ＥｔＯＨ，ＤＭＦ
１２３）ＲＣＨＯ，ＮａＢＨ_３ＣＮ，ＨＯＡｃ
１２４）ＮＨ_３，ＭｅＯＨ
１２５）２，４，６−Ｍｅ_３ＰｈＳＯ_２ＮＨ_２
１２６）Ｅｔ_２ＮＨ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１２７）ＭｅＯＣ（Ｏ）Ｃｌ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１２８）Ｒ_２ＮＨ_２，ＥＤＣ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１２９） ＤＢＵ，ＰｈＣＨ_３
１３０）ＢｏｃＮＨＣＨ（ＣＨ_２ＳＴｒ）ＣＨ_２ＮＨ_２，ＥＤＣ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１３１）Ｒ_２ＮＨＣＨ_２ＣＯ_２Ｍｅ，ＨＢＴＵ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１３２）ＢｏｃＮＨＣＨ（ＣＨ_２ＳＴｒ）ＣＨ_２ＯＭｓ，ＬｉＨＭＤＳ，ＴＨＦ
１３３）Ｒ_２ＮＨＣＨ_２ＣＯ_２Ｍｅ，ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３，ＣｌＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌ又はＴＨＦ
１３４）Ｒ_２ＮＨＣＨ_２ＣＨ（ＯＥｔ）_２，ＨＢＴＵ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１３５）ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３，ＣｌＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌ又はＴＨＦ，ＡｃＯＨ
１３６）ピペリジン，ＤＭＦ
１３７）Ｐｄ（Ｐｈ_３Ｐ）_４，Ｂｕ_３ＳｎＨ
１３８）ＲＣＯ_２Ｈ，ＥＤＣ，ＨＯＢＴ，Ｅｔ_３Ｎ，ＤＣＭ
１３９）ＲＮＨ_２，中性溶媒
１４０）ＲＣＨＯ，ＮａＢＨ_３ＣＮ，ＨＯＡｃ
１４１）ＲＮＣＯ，溶媒
１４２）ＲＣＯ_２Ｈ，ＥＤＣ又はＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
１４３）ＲＣＯＣｌ，トリエチルアミン
１４４）ＲＳＯ_２Ｃｌ，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１４５）ＳｎＣｌ_２，ＥｔＯＨ，ＤＭＦ
１４６）ＲＮＨ_２，ＥＤＣ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
１４７）ジブロムメタン，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１４８）塩化オキサリル，中性溶媒
１４９）ＬｉＯＨ，ＴＨＦ−ＭｅＯＨ
１５０）カルボニルジイミダゾール，中性溶媒（例えば，ＤＣＭ，ＤＭＦ，ＴＨＦ，トルエン）
１５１）ＲＮＨ_２，Ｅｔ_３Ｎ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
１５２）塩基，ＲＸ
１５３）ＤＢＵ，ＰｈＣＨ_３
１５４）ＤＰＰＡ，Ｅｔ_３Ｎ，トルエン
（Ｓｙｎｔｈｔｈｅｓｉｓ １９８５，２２０）
１５５）ＳＯＣｌ_２，触媒ＤＭＦ
１５６）ＡｒＨ，ルイス酸（ＡｌＣｌ_３，ＳｎＣｌ_４，ＴｉＣｌ_４），ＣＨ_２Ｃｌ_２
１５７）Ｈ_２ＮＣＨＲＣＯ_２Ｅｔ，中性溶媒
１５８）ＢｏｃＨＮＣＨＲＣＯ_２Ｈ，ＥＤＣ又はＨＢＴＵ，ＨＯＢｔ，ＤＩＥＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２又はＤＭＦ
１５９）ＴＦＡ，ＣＨ_２Ｃｌ_２
【０３８２】
引用した参考文献の全てをここで参照することここに含めるものとする。
【０３８３】
均等物
当業者であれば、ここに説明した本発明の特定の具体例に対して多くの均等なものを認識し、また日常の実験によって確認するであろう。そのような均等物は請求の範囲によって包含されるものとなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図４】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図５】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図６】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図７】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図８】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図９】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１０】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１２】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１３】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１４】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１５】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１６】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１７】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１８】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図１９】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２０】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２２】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２３】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２４】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２５】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２６】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２７】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２８】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図２９】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３０】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３１】
本発明の化合物の合成に有用な反応を描いた図である。
【図３２ａ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｂ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｃ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｄ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｅ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｆ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｇ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｈ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｉ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｊ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｋ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｌ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｍ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｎ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３２ｏ】
本発明の代表的な化合物を図解した図である。
【図３３Ａ】
ビヒクル（レーン１）；５μＭ ジャービン、ポジティブコントロール化合物（レーン２）；及び１μＭ Ｄ（レーン３）で処理した細胞におけるｇｌｉ−１ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図３３Ｂ】
Ｄ及びジャービンが、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡレベルを阻止することを示す図である（定量的リアルタイムＰＣＲにより測定）。
【図３４Ａ】
Ｓｈｈタンパク質を培養皮膚外植片に加えることが、これらの培養物の青色染色（Ｘ−ｇａｌ）により示されるように、ｐｔｃ活性化を生じたことを示す図である。
【図３４Ｂ】
マウス皮膚パンチ内のＢＣＣ様クラスター（その一つを矢印で示してある）が、未分化ケラチノサイトのマーカーのケラチン−１４（褐色の反応生成物）を発現したことを図解する図である。
【図３５Ａ】
Ｄの濃度の増大が、ｌａｃＺレポーター酵素活性の量の投与量依存性の減少と関係していることを示す図である。
【図３５Ｂ】
Ｄ処理した外植片の染色を示し又、０．２μＭ Ｄが、Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチの強いＸ−ｇａｌ染色と比較して、Ｘ−ｇａｌ染色を減じたことを示す図である（これは、ｐｔｃ遺伝子の発現のダウンレギュレーションを示している）。
【図３５Ｃ】
Ｄで処理した皮膚パンチの組織学的試料を描いた図（下段）であり、この処理がＳｈｈ誘導されるＢＣＣ様構造の出現を阻止したことを示唆している。
【図３６】
６日間外因性Ｓｈｈタンパク質だけで処理した皮膚パンチが、ビヒクルだけで処理したもの（上段）と比較して強いＸ−ｇａｌ染色を示したことを描いた図である。
【図３７Ａ】
Ｄが、１又は５μＭで、処理した皮膚パンチにおいてＳｈｈ誘導されたＢＣＣ様構造の大きさ及び数を、ビヒクルで処理した外植片と比較して有意に減少させることを示す図である。
【図３７Ｂ】
５μＭ Ｄ（右側）又はビヒクル（左側）にさらした２日後に、アポトーシスを起こした核（右側のスライド中で褐色により示されている）がＢＣＣ様構造内に出現したことを図解した図である。
【図３８Ａ】
Ｄでの短期処理が、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ染色の量を減じたことを示した図である（経路の活性のダウンレギュレーションを示唆している）。
【図３８Ｂ】
１μＭの濃度でさえ、Ｄが、ビヒクルと比較して、Ｘ−ｇａｌ陽性ＢＣＣ様構造の退行を誘導したことを示した図である。
【図３８Ｃ】
Ｄでの短期処理が、ｇｌｉ−１転写を完全にダウンレギュレートしたことを描いた図である（左側）。
【図３９Ａ】
処理した外植片のＸ−ｇａｌ染色は、ビヒクルだけの存在下で培養した皮膚パンチが、強く染色された青色のフォーカスを生成したことを示したが、これは、パッチト経路及びＢＣＣ構造のアップレギュレーションを示している。
【図３９Ｂ】
組織学的試料は、５μＭ Ｄが、紫外線誘導されたＢＣＣ構造の数を、ビヒクルコントロールと比較して減じたことを示した。
【図３９Ｃ】
トランスジェニックマウス由来の皮膚パンチにおいて、Ｄは、１及び５μＭの濃度で、ｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルを、ビヒクルだけで処理したマウス由来の皮膚パンチと比較して有意に阻止した（左側）。
【図４０Ａ】
ＢＣＣに特徴的な形態学的特徴（例えば、未分化基底細胞の島、及び幾つかの場合には、周囲の細胞の柵及び間質クレフティング）は、培養物をＨ＆Ｅで染色した場合に保持されていた。
【図４０Ｂ】
ＧＬＩ−１遺伝子（パッチトシグナリングの枢要な指標）は、赤色で示されるように、高レベルで活性のままであった。
【図４１】
定量的なイン・シトゥーハイブリダイゼーションは、ＧＬＩ−１発現のレベルが、ビヒクル処理したコントロールと比較して、Ｄ処理した試料において誘導されることを示している。[0001]
Background of the Invention
Pattern formation is the act of forming an ordered spatial arrangement of tissues in which embryonic cells have differentiated. The physical complexity of higher organisms increases during embryogenesis by the interaction of cell-specific lineages with extracellular signaling. Inducible interactions are essential for embryonic patterning in vertebrate development and the development of various cell types during tissue differentiation, from the establishment of the earliest body plan to the patterning of organ systems (Davidson, E. , (1990)Development 108: 365-389; Gurdon, J. et al. B. , (1992)Cell 68: 185-199; Jessell, T .; M. Et al. (1992)Cell 68: 257-270). The effects of developing cell interactions vary. Typically, responding cells are diverted from one pathway of cell differentiation to another by inducing cells that differ from both the uninduced and induced states of the responding cells (induction). . Sometimes cells induce their neighbors to differentiate in the same way (homeogenetic induction); in other cases, cells inhibit their neighbors from differentiating in the same way. Cell interactions in early development are sequential, so early induction between the two cell types leads to a gradual amplification of diversity. Moreover, inducible interactions occur not only in embryos but also in adult cells and can act to establish and maintain morphogenic patterns as well as induce differentiation (JB Gurdon ( 1992)Cell 68: 185-199).
[0002]
Members of the hedgehog family of signaling molecules mediate many important short- and long-range patterning processes during invertebrate and vertebrate development. In flies, a single hedgehog gene regulates patterning of somites and imaginal discs. In contrast, in vertebrates, the hedgehog gene family is involved in the control of left-right asymmetry, CNS, polarity in segments and limbs, organogenesis, chondrogenesis and spermatogenesis.
[0003]
The first hedgehog gene was identified by genetic screening in Drosophila melanogaster (Nusslein-Volhard, C. and Wieshaus, E. (1980) Nature 287, 790-801). This screen identified mutations that affect embryo and larval development. In 1992 and 1993, the molecular nature of the Drosophila hedgehog (hh) gene was reported (CF, Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50), followed by some hedgehog homologues. Has been isolated from various vertebrate species. While only one hedgehog gene was found in Drosophila and other invertebrates, there are numerous hedgehog genes in vertebrates.
[0004]
The vertebrate family of hedgehog genes includes at least four members (eg, a single Drosophila hedgehog gene paralog). Exemplary hedgehog genes and proteins are described in PCT publications WO 95/18856 and WO 96/17924. Three of these members, termed here Desert Hedgehog (Dhh), Sonic Hedgehog (Shh) and Indian Hedgehog (Ihh), are clearly all vertebrae, including fish, birds and mammals. Present in animals. A fourth member, referred to herein as a tiggie-winkle hedgehog (Thh), appears to be characteristic of fish. Desert hedgehog (Dhh) is mainly expressed in the testis, both in mouse embryonic development and in adult rodents and humans; Indian hedgehog (Ihh) is responsible for bone development and adult development during embryogenesis. And Shh, as noted above, are primarily involved in morphogenesis and neuroinductive activity. Given the critical inducible role of hedgehog polypeptides in the development and maintenance of vertebrate organs, the identification of proteins that interact with hedgehog is of paramount importance in both clinical and research contexts.
[0005]
Various hedgehog proteins consist of a signal peptide, a highly conserved N-terminal region, and a more branched C-terminal domain. In addition to cleavage of the signal sequence in the secretory pathway (Lee, JJ et al. (1992)Cell 71: 33-50; Tabata, T .; Et al. (1992)Genes Dev.2635-2645; Chang, D .; E. FIG. Etc. (1994)Development 120: 3339-3353), the hedgehog precursor protein undergoes an internal autoproteolytic cleavage that depends on a conserved sequence in the C-terminal portion (Lee et al. (1994)Science 266: 1528-1537; Porter et al. (1995)Nature 374: 363-366). This cleavage leads to a 19 kD N-terminal peptide and a 26-28 kD C-terminal peptide (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994)). Supra; Bumcrot, DA, et al. (1995)Mol. Cell. Biol.15: 2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S. et al. C. Et al. (1995)Curr. Biol.5: 944-955; Lai, C.I. J. Et al. (1995)Development 121: 2349-2360). The N-terminal peptide remains tightly bound to the surface of the cell from which it was synthesized, whereas the C-terminal peptide is free to diffuse both in vitro and in vivo (Porter et al. (1995)Nature 374: 363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra; Et al. (1995)Development 121: 2537-2547; Roelink, H .; Et al. (1995)Cell 81: 445-455). Interestingly, the cell surface retention of this N-terminal peptide indicates that truncated forms of HH encoded by RNAs that stop exactly at the normal position of internal cleavage are in vitro (Porter et al. (1995) supra) and in vitro. It relies on self-cleavage because it can diffuse in vivo (Porter, JA, et al. (1996) Cell 86, 21-34). Biochemical studies have shown that autoproteolytic cleavage of the HH precursor protein proceeds via an internal thioester intermediate, which is subsequently cleaved with nucleophilic substitution. It is likely that the nucleophilic reagent is a small lipophilic molecule that covalently attaches to the C-terminus of the N-peptide (Porter et al. (1996) supra) and tethers it to the cell surface. Their biological meaning is abyss. This tethering results in a localized high concentration of N-terminal hedgehog on the surface of hedgehog producing cells. It is this N-terminal peptide that is necessary and sufficient for short- and long-range hedgehog signaling activity in Drosophila and vertebrates (Porter et al. (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. Roelink, H. et al. (1995) supra.Cell 81: 445-455; Porter et al. (1996) supra; J. Et al. (1995)Curr. Biol.5: 643-651; Fan, C.I. -M. Et al. (1995)Cell 81: 457-465; Marti, E .; Et al. (1995)Nature 375: 322-325; Lopez-Martinez et al. (1995)Curr. Biol 5: 791-795; Ekker, S .; C. Et al. (1995)Development 121: 2337-2347; Forbes, A .; J. Et al. (1996)Development 122: 1125-1135).
[0006]
HH has been implicated in short- and long-range patterning processes at various sites during the development of Drosophila. In establishing segment polarity in the early embryo, it has a short-range effect that appears to be directly mediated, but in imaginal disc patterning, it induces a long-range effect through induction of secondary signals .
[0007]
In vertebrates, several hedgehog genes have been cloned in the last few years. Among these genes, Shh has received most experimental attention because it is expressed in various organizing centers that are sources of signals that pattern adjacent tissues. Recent evidence indicates that Shh is involved in these interactions.
[0008]
Expression of Shh is determined by the planned midline mesoderm, mouse (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75: 1417-1430), rat (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76: 761-775) and chicken (Riddle, RD, et al. (1993) Cell 75: 1401-1416), and zebrafish shields (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al. 1993) Begins shortly after the onset of gastrulation in Cell 75: 1431-1444). In chick embryos, the expression pattern of Shh at the node plate becomes bilaterally asymmetric, which seems to be responsible for the lateral position of the heart (Levin, M. et al. (1995) Cell 82: 803-814).
[0009]
In the CNS, Shh from notochord and soleplate appear to induce fate of ventral cells. When Shh is ectopically expressed, it can be expressed in mice (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich et al. (1996)).Genes Dev.10: 301-312), Xenopus (Roellink, H. et al. (1994) supra; Ruiz i Altaba, A. et al. (1995)).Mol. Cell. Neurosci.6: 106-121), and zebrafish (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammersschmidt, M. et al. (1996)).Genes Dev.10: 647-658) leading to ventralization of large areas of the midbrain and rhombic brain. In mesenchymal ectoderm explants at the spinal cord level, Shh protein induces bottom plate and motoneuron development at distinct concentration thresholds, but induces the bottom plate at high concentrations and motoneurons at lower concentrations (Roellink et al. (1995) supra; Marti et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995)Curr. Biol.5: 651-658). Moreover, antibody blocking suggests that Shh produced by notochord is required for the induction of notochord-mediated motor neuron fate (Marti et al. (1995) supra). Thus, high concentrations of Shh on the surface of Shh-producing midline cells appear to explain the bottom-plate contact-mediated induction seen in vitro and the midline positioning of the bottom plate just above the notochord in vivo. (Placzek et al. (1993) Development 117: 205-218). Lower concentrations of Shh released from the notochord and soleplate probably induce motor neurons in the more distal ventrolateral region in a process that appeared to be contact-independent in vitro (Yamada). , T., et al. (1993)Cell 73: 673-686). In explants collected at the midbrain and rhombic levels, Shh may also be a suitable ventral lateral neuronal cell type, dopaminergic (Heynes, M. et al. (1995)).Neuron 15: 35-44; Wang, M .; Z. Et al. (1995)Nature Med. 1: 1184-1188) and cholinergic (Ericson, J. et al. (1995)Cell 81: 747-756) also induced progenitor cells, respectively, suggesting that Shh is a general inducer of ventral specification over the entire length of the CNS. These observations raise questions about how the differential response to Shh is controlled at certain anterior-posterior positions.
[0010]
Shh from the midline can also be found in the paraaxial region of vertebrate embryos, the somites in the trunk (Fan et al. (1995) supra) and the upper mesenchyme of these segments (Hammerschmidt et al. (1996) supra). ) Is also patterned. In chicken and mouse paraaxial mesoderm explants, Shh promotes the expression of scleroderma-specific markers such as Pax1 and Twist at the expense of the skin sarcomere marker Pax3. Moreover, filter barrier experiments suggest that Shh mediates induction of scleroderma directly, rather than by activation of secondary signaling mechanisms (Fan, CM-M. And Tessier). -Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175-1186).
[0011]
Shh also induces sarcomere gene expression (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, RL et al. (1994).Cell 79: 1165-1173; Munsterberg, A .; E. FIG. Et al. (1995)Genes Dev.9: 2911-1922; Weinberg, E .; S. Et al. (1996)Development 122: 271-280)} However, recent experiments have shown that members of the WNT family (vertebrate homologue of Drosophila wingless) are required in concert (Munsterberg et al. (1995) supra). ｝. Curiously, induction of sarcomere in chickens requires higher concentrations of Shh than induction of sclerolar markers (Munsterberg et al. (1995) supra), but sclerosis is closer to the notochord. Stems from somatic cells located at Similar results were obtained in zebrafish, where high concentrations of hedgehog induced sarcomere and suppressed the expression of sclerolar marker genes (Hammerschmidt et al. (1996) supra). However, in contrast to amniotes, these observations are consistent with the composition of fish embryos, with sarcomere dominant and more axial components. Thus, the regulation of Shh signaling and the acquisition of novel signaling factors could alter segmental structure in vertebrate evolution.
[0012]
In vertebrate limb buds, a subset of posterior mesenchymal cells, the "polarizing active zone" (ZPA) regulates the identification of front and rear toes (Honig, LS (1981)).Nature 291: 72-73). Ectopic expression of Shh or application of beads soaked in Shh peptide mimics the effect of anterior ZPA grafts and results in mirror image replication of the toe (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) Ridle et al. (1993) supra) (FIG. 2). Thus, toe identification appears to be largely dependent on Shh concentration, but relays this information over a significant distance (100-150 μm) where other signals may be required for AP patterning It is possible. Similar to the interaction of HH and DPP in Drosophila imaginal discs, Shh activates expression of Bmp2 (dpp homolog) in vertebrate limb buds (Francis, PH et al. (1994)).Development 120: 209-218). However, unlike DPP in Drosophila, Bmp2 cannot mimic the polarizing effect of Shh upon ectopic application in chicken limb buds (Francis et al. (1994) supra). In addition to anterior-posterior patterning, Shh also appears to be involved in limb myopia growth by inducing synthesis of fibroblast growth factor FGF4 in the posterior ectoderm ridge (Lauffer, E. et al. (1994)).Cell 79: 993-1003; Niswander, L .; Etc. (1994)Nature 371: 609-612).
[0013]
It is likely that the close relationship between hedgehog proteins and BMPs has been conserved at many, but probably not all, sites of vertebrate hedgehog expression. For example, in the hindgut of chickens, Shh has been shown to induce the expression of Bmp4, another vertebrate dpp homolog (Roberts, DJ et al. (1995)).Development 121: 3163-3174). Furthermore, Shh and Bmp2, 4 or 6 show a striking correlation in their expression in epithelium and mesenchymal cells of the stomach, urogenital system, lungs, dental buds and hair follicles (Bitgood, MJ and McMahon, AP (1995)Dev. Biol.172: 126-138). In addition, Ihh (one of the two other mouse hedgehog genes) is expressed in the gastrointestinal tract and developing cartilage adjacent to cells that express Bmp (Bitgood and McMahon (1995) supra).
[0014]
Recent evidence suggests a model in which Ihh plays a crucial role in regulating cartilage development (Roberts et al. (1995) supra). During chondrogenesis, chondrocytes progress from a proliferative state to an intermediate, pre-hypertrophic state to differentiated hypertrophic chondrocytes. Ihh is expressed in pre-hypertrophic chondrocytes and initiates a signaling cascade that leads to a block in chondrocyte differentiation. Its immediate target is the perichondrium around the Ihh expression domain, which responds by expression of Gli and Patched (Ptc), a conserved transcription target of the hedgehog signal (see below). Most likely, this leads to secondary signaling that results in the synthesis of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) in the perichondrium around the joint. PTHrP itself signals back to pre-hypertrophic chondrocytes, blocking their further differentiation. At the same time, PTHrP suppresses the expression of Ihh, thereby forming a negative feedback loop that regulates the rate of chondrocyte differentiation.
[0015]
Patches were initially identified in Drosophila as segment polarity genes, one of a group of developmental genes that affect cell differentiation within individual segments that occur in cognate rows along the anterior-posterior axis of the embryo. Hooper, J .; E. FIG. Et al. (1989)Cell 59: 751; and Nakano, Y .; Et al. (1989)Nature 341: 508. The expression pattern of the vertebrate homologue of Patched suggests that it is involved in the development of neural tube, skeleton, limbs, craniofacial structure and skin.
[0016]
Genetic and functional studies indicate that patched is part of the hedgehog signaling cascade, an evolutionarily conserved pathway that regulates the expression of many downstream genes. Perrimon, N.M. (1995)Cell 80: 517; and Perrimon, N .; (1996)Cell 86: 513. Patched has been implicated in constitutive transcriptional repression of target genes; its effect is hindered by secreted glycoproteins that activate transcription encoded by hedgehog or vertebrate homologs. Genes under the control of this pathway include Wnt and members of the TGFβ family.
[0017]
Patched proteins have two large extracellular domains, twelve transmembrane segments and several cytoplasmic segments. Hooper, supra; Nakao, supra; Johnson, R .; L. Et al. (1996)Science 272: 1668; and Hahn, H .; Et al. (1996)Cell 85: 841. The biochemical role of patched in the hedgehog signaling pathway is unknown. However, direct interactions with hedgehog proteins have been reported (Chen, Y. et al. (1996)).Cell 87: 553), patched may associate with the hedgehog receptor complex along with other transmembrane proteins encoded by the smoothened gene. See Perrimon, supra; and Chen, supra.
[0018]
The human homologue of Patched has recently been cloned and mapped to chromosome 9q22.3. See Johnson, supra; and Hahn, supra. This area is associated with basal cell nevus syndrome (BCNS), which is characterized by developmental abnormalities including rib and craniofacial degeneration, hand and leg abnormalities, and spina bifida.
[0019]
BCNS is also predisposed to multiple tumor types, most often basal cell carcinoma (BCC), which occurs in many places in the body and appears within the first 20 years of life. However, most cases of BCC occur sporadically, regardless of this syndrome, in sites exposed to sunlight in middle-aged or older people of Nordic descent.
[0020]
Recent studies on BCNS-related and sporadic BCCs suggest that deficits in both alleles of patched lead to the development of BCCs. Johnson, supra; Hahn, supra and Galani, M .; R. (1996) Nature Genetics 14:78. Single allele deletions on chromosome 9q22.3 occur frequently in both sporadic and hereditary BCCs. Linkage analysis indicated that in tumors from BCNS patients, the defective hereditary allele was retained and the normal allele was lost.
[0021]
Sporadic tumors also showed a loss of the patched bifunctional allele. Of the 12 tumors in which the patched mutation was identified by the single-stranded conformation polymorphism screening assay, 9 had a chromosomal deletion in the second allele and three had inactivation in both alleles It had a mutation (Gailani, supra). No changes occurred in the corresponding germline DNA.
[0022]
Most of the identified mutations resulted in premature stop codons or frameshifts. Lench, N .; J. Hum. Genet. 1997 Oct; 100 (5-6): 497-502. However, some were point mutations leading to amino acid substitutions in the extracellular or cytoplasmic domains. These mutation sites may indicate functional importance for interaction with extracellular proteins or members of signaling pathways downstream of the cytoplasm.
The involvement of patched in the inhibition of gene expression and the appearance of frequent allelic deletions of patched in BCC support the tumor suppressor function for this gene. Its role in regulating a family of genes known to be involved in cell signaling and intercellular communication provides a possible mechanism of tumor suppression.
[0023]
Summary of the Invention
The present invention provides a method for inhibiting abnormal growth of cells resulting from phenotypes such as activation of the hedgehog signaling pathway, eg, ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity, or smoothened hyperfunction, and the like. Contacting an agent, such as a small molecule, in an amount sufficient to reverse or control the condition (eg, substitute for normal ptc activity and antagonize normal hedgehog activity or antagonize smoothened activity) Provided are methods and reagents that can be used.
[0024]
Figures 1-31 are diagrams depicting reactions useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
Figures 32a-o are diagrams illustrating representative compounds of the present invention.
FIG. 33A shows gli-1 mRNA expression in cells treated with vehicle (lane 1); 5 μM Jarbin, positive control compound (lane 2); and 1 μM D (lane 3). D and Jarbin significantly reduced the expression of gli-1 mRNA compared to vehicle.
FIG. 33B shows that D and Jarvin block gli-1 mRNA levels (measured by quantitative real-time PCR).
FIG. 34A shows that adding Shh protein to cultured skin explants resulted in ptc activation, as indicated by the blue staining of these cultures (X-gal). Histological samples show strongly stained cells with a basophil nucleus and a high nucleus to cytoplasm ratio (H & E [10x] and H & E [40x]). These structures are similar to BCCs in that they are arranged in clusters in layers of skin and separated by fences of normal looking skin cells. Blue staining indicates that the patched pathway was active in cells within a BCC-like structure (eosin + X-gal).
FIG. 34B is a diagram illustrating that BCC-like clusters (one of which is indicated by an arrow) in the mouse skin punch expressed the undifferentiated keratinocyte marker keratin-14 (brown reaction product). is there. Undifferentiated basal cells in the epithelium were also keratin-14 positive. Human BCC has been reported to express keratin-14.
FIG. 35A shows that increasing concentrations of D are associated with a dose-dependent decrease in the amount of lacZ reporter enzyme activity. Low levels of lacZ activity indicate reduced patched pathway activity in the presence of Shh protein.
FIG. 35B shows staining of D-treated explants and also showed that 0.2 μM D reduced X-gal staining compared to strong X-gal staining of skin punches treated with Shh protein alone. FIG. 1 (which shows down regulation of ptc gene expression).
FIG. 35C depicts a histological sample of a skin punch treated with D (bottom), suggesting that this treatment prevented the appearance of Shh-induced BCC-like structures.
FIG. 36 depicts that skin punches treated with exogenous Shh protein alone for 6 days showed stronger X-gal staining than those treated with vehicle alone (top). Skin punches pre-treated with 10, 20, and 50 μM for 5 hours at D prior to exposure to exogenous Shh protein showed complete inhibition of Shh protein-induced up-regulation of the patched pathway (bottom right 3). slide). Exposure of vehicle-treated skin punches to exogenous Shh protein did not show any inhibition as shown by intense X-gal staining (lower left). The short-term pretreatment was essentially equivalent to a 6-day exposure to D with respect to the level of ptc inhibition (compare top and bottom).
FIG. 37A shows that D, at 1 or 5 μM, significantly reduces the size and number of Shh-induced BCC-like structures in treated skin punches compared to vehicle-treated explants. It is.
FIG. 37B illustrates that apoptotic nuclei (indicated by the brown color in the right slide) appeared within the BCC-like structure two days after exposure to 5 μM D (right) or vehicle (left). FIG.
FIG. 38A shows that short-term treatment with D reduced the amount of X-gal staining compared to vehicle (suggesting a down-regulation of pathway activity).
FIG. 38B shows that, even at a concentration of 1 μM, D induced regression of X-gal positive BCC-like structures as compared to vehicle.
FIG. 38C depicts short-term treatment with D completely down-regulated gli-1 transcription (left). This effect was found to be specific to the patched pathway, as indicated by appropriately constant mRNA levels (right side) of the housekeeping enzyme GAPDH, and was not solely due to general cytotoxicity.
FIG. 39A: X-gal staining of treated explants showed that skin punches cultured in the presence of vehicle alone produced strongly stained blue foci, indicating that the patched pathway and BCC 4 shows the up-regulation of the structure. Compared to vehicle, 5 μM D, like the Jurbin positive control, greatly reduced the number and size of BCC structures (blue spots).
FIG. 39B: Histological samples showed that 5 μM D reduced the number of UV-induced BCC structures as compared to the vehicle control.
FIG. 39C: In skin punches from transgenic mice, D significantly inhibited gli-1 mRNA levels at concentrations of 1 and 5 μM compared to skin punches from mice treated with vehicle alone (left). . This inhibition was nonspecific because statistical comparison (using ANOVA) of mRNA levels of genes encoding the housekeeping GAPDH enzyme between groups did not show a significant difference in general cellular metabolic activity (right). It did not appear to be caused by severe cytotoxicity.
FIG. 40A: Morphological features characteristic of BCC (eg, undifferentiated basal cell islets, and in some cases, surrounding cell fences and stromal clefts) stained cultures with H & E Was held in case.
FIG. 40B: The GLI-1 gene, a key indicator of patched signaling, remained active at high levels, as shown in red.
FIG. 41: Quantitative in situ hybridization shows that the level of GLI-1 expression is induced in D-treated samples as compared to vehicle-treated controls.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
I. Overview
The present invention relates to the discovery that signal transduction pathways regulated by hedgehog, patched (ptc), gli and / or smoothened can be inhibited, at least in part, by small molecules. Without wishing to be bound by any particular theory, receptor activation may be the mechanism by which these factors act. For example, the patched dysfunction (ptc) of these factors^lof) The ability to inhibit the growth of cells is such that the ability of such molecules to interact with hedgehog, patched or smoothened, or at least to activate their proteins, hedgehog, ptc and / or smoothened-mediated signal transduction pathways. Can be due to the ability to disturb.
[0026]
Thus, hedgehog, ptc or these small molecules that interfere with the status of smoothened signal transduction activity may also be normal cell and / or patched deficient phenotype, hedgehog hyperactive phenotype or smoothened hyperactive expression. It is specifically anticipated that proliferation (or other biological consequences) can be inhibited in typed cells. Thus, in certain embodiments, it is anticipated that these compounds may be useful for inhibiting hedgehog activity in normal cells, eg, cells that do not have a genetic mutation that activates the hedgehog pathway. In a preferred embodiment, the subject inhibitors have a molecular weight of less than 2500 amu, more preferably less than 1500 amu, even more preferably less than 750 amu, and at least some of the biological activity of the hedgehog protein, particularly the target cell. Is an organic molecule that can be inhibited in
[0027]
Thus, the methods of the present invention provide repair and / or functional performance of a wide range of cells, tissues and organs, including normal cells, tissues and organs and those having a ptc deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened hyperfunction phenotype. Involves the use of small molecules to survive ptc inhibition of hedgehog signaling in the regulation of, for example, by inhibiting the activation of smooth or downstream components of the signaling pathway. For example, the subject methods range from regulating the formation and repair of nervous tissue, bone and cartilage tissue, regulating spermatogenesis, regulating smooth muscle, regulating lung, liver and other organs arising from the primitive intestinal tract, regulating hematopoietic function. It has therapeutic and cosmetic applications ranging from regulating skin and hair growth. Moreover, the subject methods can be performed on cells given in culture (in vitro) or on cells within an animal individual (in vivo). See, for example, PCT publications WO 95/18856 and WO 96/17924, the disclosures of which are specifically incorporated herein by reference.
[0028]
In a preferred embodiment, the subject method may be to treat epithelial cells having a ptc deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened hyperfunction phenotype. For example, the subject methods can be utilized in treating or preventing basal cell carcinoma or other hedgehog pathway related diseases.
[0029]
In certain embodiments, the subject antagonists can block activation of the hedgehog pathway by binding to smoothened. In certain embodiments, the subject antagonists can block activation of the hedgehog pathway by binding to patched.
[0030]
In other preferred embodiments, the subject methods can be utilized as part of a treatment regimen for malignant medulloblastoma and other primary CNS malignant neuroectodermal tumors.
[0031]
In another aspect, the invention provides a hedgehog antagonist, ptc agonist or smoothened antagonist as described herein, as an active ingredient, which is capable of in vivo growth or other ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothness. The present invention provides a pharmaceutical preparation which is formulated and contained in an amount sufficient to inhibit the biological consequences of hyperactivity.
[0032]
Treatment with the subject hedgehog antagonists, patched agonists or smoothened sub-antagonists may be effective in both human and animal patients. Animal patients to which the invention is applicable include both domestic and domestic animals kept as pets or for commercial purposes. Examples are dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs and goats.
[0033]
II. Definition
For convenience, certain terms employed in the specification, examples, and appended claims are collected here.
[0034]
The phrase "aberrant modification or mutation" of a gene refers to, for example, genetic damage such as deletion, substitution or addition of nucleotides in the gene, as well as large chromosomal rearrangements and / or abnormal methylation of the gene. Similarly, misexpression of a gene refers to abnormal levels of the gene under similar conditions as compared to levels in normal cells, as well as non-wild-type splicing of mRNA transcribed from the gene.
[0035]
"Basal cell carcinoma" exists in various clinical and histological forms such as nodular ulcer, superficial, pigmented, localized scleroderma, fibroepithelioma and nevus. Basal cell carcinoma is the most common skin neoplasm found in humans. The majority of new cases of non-melanoma skin cancer fall into this category.
[0036]
"Burning wound" refers to a case in which a large surface area of an individual's skin has been removed or lost due to heat and / or chemical agents.
[0037]
The term "cancer" refers to a malignant new growth made up of epithelial cells that tends to invade surrounding tissues and to give rise to metastases. Typical cancers include "basal cell carcinoma", an epithelial tumor of the skin that rarely metastasizes but has the potential for local invasion and destruction; "squamous" refers to cancer with cuboid cells arising from squamous epithelium "Epithelial cell carcinoma"; "carcinosarcoma" including malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues; characterized by cylinders or bands of hyaline or mucin stroma separated or surrounded by small epithelial cell populations or bands. "Gland cyst carcinoma," which is a cancer arising in the mammary and salivary glands and mucous glands of the respiratory tract; is used to identify cancer cells that tend to differentiate like the epidermis (ie, form spiny cells and tend to keratinize) "Nasopharyngeal carcinoma" refers to a malignant tumor arising in the epithelial lining of the space behind the nose; and "renal cell carcinoma" belongs to a cancer of the renal parenchyma consisting of tubular cells of variable arrangement. Is included. Other cancerous epithelial growths are "papillomas", which refer to benign tumors that are derived from the epithelium and have papillomavirus as a causative factor; and the brain or meninges formed by the inclusion of ectodermal elements when the neural groove closes. It is "epidermoid tumor" which refers to a tumor.
[0038]
"Dermis" refers to the layer of skin deep within the epithelium, consisting of a dense layer of vascular connective tissue and containing nerves and terminal sensory organs. Hair roots and sebaceous and sweat glands are epidermal structures deeply embedded in the dermis.
[0039]
“Dental tissue” refers to a tissue in the mouth similar to epithelial tissue, for example, gingival tissue. The method of the present invention is useful for treating periodontal disease.
[0040]
"Dermal ulcer" refers to a lesion of the skin (usually with inflammation) caused by the loss of tissue surface. Dermal ulcers that can be treated by the methods of the present invention include decubitus ulcers, diabetic ulcers, venous stasis ulcers and arterial ulcers. Pressure sores refer to chronic ulcers caused by pressure applied to an area of the skin for an extended period of time. This type of wound is often called bedsores. Venous stasis ulcers result from congestion of defective veins or stagnation of other fluids. Arterial ulcer refers to necrotic skin in the area around an artery with poor blood flow.
[0041]
The term "ED₅₀"Means the dose of drug which produces 50% of the maximal response or effect.
[0042]
For the subject methods of treatment, for example, an "effective amount" of a hedgehog antagonist, when applied as part of a desired dosing regimen, is, for example, the rate of cell growth and / or the state of differentiation of cells and / or the level of cellular differentiation. Refers to the amount of antagonist in the formulation that causes a change in viability (according to clinically acceptable standards for the disease to be treated or cosmetic purpose).
[0043]
The terms "epithelial" and "epithelium" refer to the cellular coating of the inner and outer body surfaces (skin, mucous membranes and serosa) and the glands and other structures resulting therefrom, such as the cornea, esophagus, dermis, hair follicles and epithelium Contains cells. Other typical epithelial tissues include pseudo-stratified epithelium, which is the inner surface of the olfactory region of the nasal cavity and contains olfactory sensors; olfactory epithelium; Squamous epithelium, which is an epithelium composed of flat plate-like cells. The term epithelium also refers to the transient epithelium that is characteristically found to line hollow organs that undergo large mechanical changes due to contraction and enlargement, such as between stratified squamous and columnar epithelium.
[0044]
The term "epithelialization" refers to the healing due to the growth of epithelial tissue covering the detached surface.
[0045]
The term "epidermal gland" refers to the aggregation of cells that secrete or excrete substances in relation to the epidermis, independent of the need for normal metabolism. For example, a "sebaceous gland" is a total secretory gland in the dermis that secretes oily substances and sebum. The term "sweat gland" refers to a gland that secretes sweat that is located in the dermis or subcutaneous tissue and is open to the body surface by a duct.
[0046]
The term "epidermis" refers to the outermost non-vascular layer of skin from 0.07 to 1.4 mm thick, derived from the ectoderm of the embryo. On the palmar and plantar surfaces, from the medial to the lateral, it is composed of five layers: a basal layer consisting of uprightly arranged columnar cells; a spinous cell consisting of flat multifaceted cells with short protrusions or thorns or Spinous layer; granular layer consisting of flat granular cells; transparent layer consisting of several layers of transparent cells with unclear or absent nucleus; and stratum corneum consisting of flat keratinized nonnuclear cells . In the epidermis on the body surface of the whole body, the transparent layer is usually absent.
[0047]
"Excision wounds" include tears, abrasions, cuts, punctures or lacerations in the epithelial layer of the skin, and can extend into the dermis layer and even below the subcutaneous fat. Cut-out wounds can be caused by surgical procedures or by accidental skin penetration.
[0048]
The “proliferation state” of a cell refers to the rate of proliferation of the cell and / or the state of differentiation of the cell. An “altered growth state” is a growth state characterized by an abnormal growth rate (eg, cells that exhibit an increased or decreased growth rate compared to normal cells).
[0049]
The term "hair" is a specialized epidermal structure consisting of filamentous structures, especially keratins, arising from papillae buried in the dermis, produced only by mammals and characteristic of a group of animals Epidermis structure. "Hair" may also refer to such a set of hairs. "Hair follicle" refers to one of the tubular invaginations of the epidermis containing hair, from which hair grows. "Hair follicle epithelial cells" refers to epithelial cells surrounding the dermal papillae in the hair follicle, such as stem cells, outer root sheath cells, matrix cells and inner root sheath cells. Such cells can be normal non-malignant cells or transformed / immortalized cells.
[0050]
The term “hedgehog antagonist” refers to an agent that enhances or reproduces the biological activity of a patch, eg, to repress transcription of a target gene. Suitable hedgehog antagonists can be used to overcome ptc function deficiency and / or smooth hyperactivity. The latter is also called a smoothened antagonist. The term "hedgehog antagonist", as used herein, refers not only to any agent that can act by directly inhibiting the normal function of the hedgehog protein, but rather to inhibit the hedgehog signaling pathway, and , Ptc.
[0051]
The term “hedgehog hyperactivity” refers to an abnormality in the ptc gene, hedgehog gene or smoothened gene that results in a phenotype similar to contacting a cell with a hedgehog protein (eg, abnormal activation of the hedgehog pathway). It refers to a type modification or mutation or a decrease (or loss) in the expression level of such a gene. This hyperactivity may include a loss of the ability of the ptc gene product to regulate the expression levels of Ci genes Gli1, Gli2 and Gli3. The term “hedgehog hyperactivity” is also used herein to refer to any similar cell that has arisen due to some change in the hedgehog signal transduction pathway, including but not limited to a modification or mutation of the hedgehog itself. Also used to refer to phenotypes (eg, those that indicate hyperproliferation). For example, a tumor cell that has an abnormally high growth rate for activation of the hedgehog signaling pathway has the “hedgehog hyperactivity” phenotype, even if the hedgehog is not mutated in the cell.
[0052]
As used herein, "immortalized cell" refers to a cell that has been altered by chemical and / or recombinant means to have the ability to divide and grow indefinitely in culture.
[0053]
“Internal epithelial tissue” refers to tissue in the body that has characteristics similar to the epidermal layer in the skin. Examples include the lining of the intestine. The methods of the invention are useful for promoting the healing of certain internal wounds, such as those caused by surgery.
[0054]
The term "keratosis" refers to a proliferative skin disease characterized by hyperplasia of the stratum corneum of the epidermis. Typical keratosis includes follicular keratosis, punctate palmoplantar keratosis, pharyngeal keratosis, hair keratosis and actinic keratosis.
[0055]
The term "LD₅₀"Means the dose of drug that is lethal to 50% of test subjects.
The term "nail" refers to a keratinous skin plate on the dorsal surface of the distal end of a finger or toe.
[0056]
The term "deficient in patched function" refers to an aberrant modification or mutation of the ptc gene or a gene thereof that results in a phenotype similar to contacting a cell with a hedgehog protein (eg, abnormal activation of the hedgehog pathway). Refers to reduced expression levels. The hyperactivity can include a loss of the ability of the ptc gene product to regulate expression levels of Ci genes, such as Gli1, Gli2, and Gli3. The term "ptc function deficiency" is also used herein to refer to any similar (e.g., but not limited to, modifications or mutations of ptc itself) caused by any change in the hedgehog signal transduction pathway. Used to indicate cell phenotype (indicating hyperproliferation). For example, a tumor cell that has an abnormally high growth rate due to activation of the hedgehog signaling pathway will have a “deficient ptc function” phenotype, even if the ptc is not mutated in the cell.
[0057]
A "patient" or "subject" to be treated by the subject method may mean a human or non-human animal.
[0058]
The term "prodrug" is intended to include compounds that, under physiological conditions, are converted into the therapeutically active agents of the present invention. A common method for making prodrugs is to include a selected site at which the desired molecule appears when hydrolyzed under physiological conditions. In another embodiment, the prodrug is converted by the enzymatic activity of the host animal.
[0059]
As used herein, "proliferative" and "proliferation" refer to cells undergoing mitosis.
In this application, the term "proliferative skin disease" refers to any skin disease / disease with significant undesirable or abnormal growth of skin tissue. These diseases are typically characterized by epidermal cell proliferation or incomplete cell differentiation, for example, X-linked ichthyosis, psoriasis, atopic dermatitis, allergic contact dermatitis, epidermolysis Includes keratosis and seborrheic dermatitis. For example, epidermal dysplasia is an incomplete form of epidermal development. Another example is "skin detachment", which refers to a loose state of the epidermis with spontaneous or traumatic blistering.
[0060]
As used herein, the term "psoriasis" refers to a hyperproliferative skin disease that alters the regulatory mechanisms of the skin. In particular, primary and secondary changes in epidermal proliferation, inflammatory responses of the skin and lesions involving the expression of regulatory molecules such as lymphokines and inflammatory factors are formed. Psoriatic skin is morphologically characterized by increased turnover of epidermal cells, thickened epidermis, abnormal keratinization, inflammatory cell infiltration into the dermal layer, and infiltration of polymorphonuclear leukocytes into the epidermal layer (basal cell cycle Which causes an increase). In addition, there are hyperkeratosis and parakeratosis cells.
[0061]
The term “skin” is a protective covering on the outside of the body, consisting of the dermis and epidermis, and is understood to include sweat and sebaceous glands and hair follicle structures. In this application, the adjective "skin" is generally used and understood to refer to the attributes of the skin where appropriate in the context of the use of them.
[0062]
The term “smoothened hyperactivity” refers to an aberrant modification or mutation of the smo gene or a mutation thereof that results in a phenotype similar to contacting a cell with a hedgehog protein (eg, abnormal activation of the hedgehog pathway). Refers to increased expression levels of a gene. Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that ptc cannot send signals directly to cells, but rather, Smoothund, another membrane-bound protein located downstream of ptc in hedgehog signaling. It is noted that they interact (Marigo et al. (1996) Nature 384: 177-179). The gene smo is a segment polarity gene required for correct patterning of each segment of Drosophila (Alcedo et al. (1996) Cell 86: 221-232). A human homolog of smo has been identified. See, for example, Stone et al. (1996) Nature 384: 129-134 and GenBank accession number U84401. The smoothened gene encodes an essential membrane protein with characteristics of a heterotrimeric G protein-coupled receptor; that is, a seven transmembrane region. This protein shows homology to the Drosophila Frizzled (Fz) protein, a member of the wingless pathway. Originally, smo was thought to encode a receptor for the Hh signal. However, this suggestion was later rebutted by evidence that ptc was a Hh receptor. Cells expressing Smo were unable to bind Hh, indicating that smo does not interact directly with Hh (Nusse, (1996) Nature 384: 119-120). Rather, it is believed that the binding of sonic hedgehog (Shh) to its receptor PTCH prevents PTCH from normally inhibiting the seven transmembrane protein, smoothened (SMO).
[0063]
Recently, activation of the Smoothund mutation has been reported in sporadic basal cell carcinomas (Xie et al. (1998) Nature 391: 90-2) and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system (Reifenberger et al. (1998) Cancer Res 58: 1798). -803).
[0064]
The term “therapeutic index” refers to LD₅₀/ ED₅₀Refers to the therapeutic index of a drug defined as
[0065]
As used herein, "transformed cell" refers to a cell that has been spontaneously converted to a state of unrestricted growth (ie, has gained the ability to proliferate in culture by indefinite number of divisions). Transformed cells can be characterized by terms such as neoplastic, undifferentiated, and / or hyperplasia with respect to their loss of growth control.
[0066]
The term “acylamino” is recognized in the art and has the general formula:
Embedded image

(Where R₉Is as defined above, and R '₁₁Is hydrogen, alkyl, alkenyl or-(CH₂)_m-R₈(M and R₈Is as defined above)
Is a part that can be represented by
[0067]
Here, the term "aliphatic group" refers to a linear, branched or cyclic aliphatic hydrocarbon group, and refers to a saturated or unsaturated aliphatic group such as an alkyl group, an alkenyl group and an alkynyl group. Include.
[0068]
The terms "alkenyl" and "alkynyl" refer to unsaturated aliphatic groups analogous in alkyl length to the above and in possible substitution, but containing at least one double or triple bond, respectively. .
[0069]
The terms "alkoxyl" or "alkoxy" as used herein refer to an alkyl group as defined above with an oxygen group attached. Representative alkoxyl groups include methoxy, ethoxy, propyloxy, t-butoxy and the like. An "ether" is two hydrocarbons covalently linked to an oxygen. Thus, the substituent of the alkyl that makes the alkyl an ether is alkoxyl or similar, for example, -O-alkyl, -O-alkenyl, -O-alkynyl, -O- (CH₂)_m-R₈(M and R₈Is as defined above).
[0070]
The term "alkyl" refers to saturated aliphatic groups, including straight-chain alkyl groups, branched-chain alkyl groups, cycloalkyl (alicyclic) groups, alkyl-substituted cycloalkyl groups, and cycloalkyl-substituted alkyl groups. In a preferred embodiment, no more than 30 straight or branched chain alkyl groups are present in the main chain (C₁~ C₃₀, For branched chains, C₃~ C₃₀), Preferably having up to 20 carbon atoms. Likewise, preferred cycloalkyls have from 3-10 carbon atoms in their ring structure, and preferably have 5, 6 or 7 carbons in the ring structure.
[0071]
Further, the term "alkyl" (or "lower alkyl") as used throughout the specification, examples and claims encompasses both "unsubstituted alkyl" and "substituted alkyl." The latter refers to an alkyl moiety having a substituent that replaces a hydrogen on one or more carbons of the hydrocarbon backbone. Such substituents include, for example, halogen, hydroxyl, carbonyl (eg, carboxyl, alkoxycarbonyl, formyl or acyl), thiocarbonyl (eg, thioester, thioacetate or thioformate), alkoxyl, phosphoryl, phosphate, phosphonate, phosphinate, An amino, amide, amidine, imine, cyano, nitro, azide, sulfhydryl, alkylthio, sulfate, sulfonate, sulfamoyl, sulfonamide, sulfonyl, heterocyclyl, aralkyl, or aromatic or heteroaromatic moiety can be included. It is understood by those skilled in the art that the moiety substituted on the hydrocarbon chain may itself be substituted if appropriate. For example, substituted alkyl substituents include substituted and unsubstituted forms of amino, azido, imino, amide, phosphoryl (including phosphonates and phosphinates), sulfonyl (including sulfate, sulfonamide, sulfamoyl or sulfonate). ) And silyl groups and ethers, alkylthio, carbonyl (including ketones, aldehydes, carboxylates and esters), -CF₃, -CN and the like. Examples of substituted alkyl are described below. Cycloalkyl is alkyl, alkenyl, alkoxy, alkylthio, aminoalkyl, carbonyl-substituted alkyl, -CF₃, -CN and the like.
[0072]
Unless the number of carbons is specified otherwise, "lower alkyl" as used herein, is defined above as having 1-10, preferably 1-6, carbon atoms in its backbone structure. Such an alkyl group is meant. Similarly, "lower alkenyl" and "lower alkynyl" have similar chain lengths. Throughout the specification, preferred alkyl groups are lower alkyl. In a preferred embodiment, the substituents indicated herein as alkyl are lower alkyl.
[0073]
The term "alkylthio" refers to an alkyl group, as defined above, attached to a sulfur group. In a preferred embodiment, "alkylthio" refers to -S-alkyl, -S-alkenyl, -S-alkynyl, and -S- (CH₂)_m-R₈(Where m and R₈Is as defined above).
[0074]
The terms “amine” and “amino” are art-recognized and refer to both unsubstituted and substituted amines, for example, of the general formula:
Embedded image

(Where R₉, R₁₀And R '₁₀Is independently hydrogen, alkyl, alkenyl or-(CH₂)_m-R₈And R₉And R₁₀Completes a heterocycle having from 4 to 8 atoms in the ring structure together with the N atom to which they are attached,₈Represents an aryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, heterocyclic or polycyclic, and m is 0 or an integer of 1 to 8)
Is the portion represented by In a preferred embodiment, R₉Or R₁₀Can be only carbonyl, for example, R₉, R₁₀And nitrogen do not form imides. In a more preferred embodiment, R₉And R₁₀(And optionally R '₁₀) Is hydrogen, alkyl, alkenyl or-(CH₂)_m-R₈Represents Thus, the term "alkylamine," as used herein, refers to a substituted or unsubstituted alkyl linked amine group as described above, ie, R₉And R₁₀At least one is an alkyl group.
[0075]
The term "amide" is recognized in the art as an amino-substituted carbonyl and has the general formula:
Embedded image

(Where R₉And R₁₀Is as defined above)
And a moiety that can be represented by Preferred examples of amides do not include imides which may be unstable.
[0076]
The term “aralkyl,” as used herein, refers to an alkyl group substituted with an aryl group (eg, an aromatic or heteroaromatic group).
[0077]
The term "aryl", as used herein, is a 5, 6 and 7 membered monocyclic aromatic group which can contain 0-4 heteroatoms, such as benzene, pyrrole, furan, thiophene, imidazole, oxazole , Thiazole, triazole, pyrazole, pyridine, pyrazine, pyridazine, pyrimidine and the like. An aryl group having a heteroatom in the ring structure can also be referred to as "aryl heterocycle" or "heteroaromatic". The aromatic ring may be substituted at one or more ring positions with a substituent as described above, e.g., halogen, azide, alkyl, aralkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, hydroxyl, alkoxyl, amino, nitro, sulfhydryl, imino, Amide, phosphate, phosphonate, phosphinate, carbonyl, carboxyl, silyl, ether, alkylthio, sulfonyl, sulfonamide, ketone, aldehyde, ester, heterocyclyl, aromatic or heteroaromatic moiety, -CF₃, -CN and the like. The term "aryl" also includes two or more rings in which two or more carbons are common to two tangent rings (the ring is a fused ring) and at least one ring Also included are polycyclic ring systems wherein the individual is aromatic and the other ring can be cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkynyl, aryl and / or heterocyclyl.
[0078]
The term "carbocycle," as used herein, refers to an aromatic or non-aromatic ring in which each atom of the ring is carbon.
[0079]
The term "carbonyl" is art-recognized and has the general formula:
Embedded image

(Where X is a bond or represents oxygen or sulfur;₁₁Is hydrogen, alkyl, alkenyl,-(CH₂)_m-R₈Or a pharmaceutically acceptable salt;₁₁Is hydrogen, alkyl, alkenyl or-(CH₂)_m-R₈(M and R₈Is as defined above)
And a moiety that can be represented by X is oxygen and R₁₁Or R '₁₁When is not hydrogen, the formula represents an "ester". X is oxygen and R₁₁Is as defined above, the moiety is referred to herein as a carboxyl group;₁₁When is hydrogen, the formula represents a "carboxylic acid." X is oxygen and R '₁₁When is hydrogen, the formula is "formate". Generally, where the oxygen atom of the above formula is replaced by sulfur, the formula represents a "thiocarbonyl" group. X is sulfur and R₁₁Or R '₁₁When is not hydrogen, the formula represents a "thioester". X is sulfur and R₁₁When is hydrogen, the formula represents a "thiocarboxylic acid". X is sulfur and R '₁₁When is hydrogen, the formula represents "thiol formate". On the other hand, X is a bond and R '₁₁If is not hydrogen, the formula represents a "ketone group". X is a bond and R₁₁If is hydrogen, the above formula represents an "aldehyde" group.
[0080]
The term "heteroatom" as used herein means any element other than carbon or hydrogen. Preferred complex elements are boron, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur and selenium.
[0081]
The term "heterocyclyl" or "heterocyclic group" refers to a 3-10 membered ring structure, preferably a 3-7 membered ring, wherein the ring structure contains 1-4 heteroatoms. Say. Heterocycles can be polycycles. Heterocyclyl groups include, for example, thiophene, thianthrene, furan, pyran, isobenzofuran, chromene, xanthene, phenoxathiin, pyrrole, imidazole, pyrazole, isothiazole, isoxazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indolizine, isoindole , Indole, indazole, purine, quinolidine, isoquinoline, quinoline, phthalazine, naphthyridine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, pteridine, carbazole, carbolin, phenanthridine, acridine, pyrimidine, phenanthroline, phenazine, phenaldazine, phenothiazine, flazan, phenoxazine, Pyrrolidine, oxolane, thiolane, oxazole, piperidine, piperazine, morpholine, lactone Encompasses lactams such as azetidinones and pyrrolidinones, sultams, sultones, and the like. Heterocycle is a substituent as defined above, for example, halogen, alkyl, aralkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, hydroxyl, amino, nitro, sulfhydryl, imino, amide, phosphate, phosphonate, phosphinate, carbonyl, carboxyl, Silyl, ether, alkylthio, sulfonyl, ketone, aldehyde, ester, heterocyclyl, aromatic or heteroaromatic moiety, -CF₃, -CN and the like.
[0082]
As used herein, the term "nitro" refers to -NO₂The term "halogen" denotes -F, -Cl, -Br or -I; the term "sulfhydryl" means -SH; the term "hydroxyl" means -OH; “Sulfonyl” refers to —SO₂Means-.
[0083]
“Phosphonamidite” has the general formula:
Embedded image

(Where R₉And R₁₀Is as defined above, and Q₂Represents O, S or N;₄₈Represents lower alkyl or aryl)
Can be represented by
[0084]
“Phosphoramidite” has the formula:
Embedded image

(Where R₉And R₁₀Is as defined above, and Q₂Represents O, S or N)
Can be represented by
[0085]
“Phosphoryl” has the formula:
Embedded image

(Where Q₁Represents S or O, and R₄₆Represents hydrogen, lower alkyl or aryl)
Can be represented by For example, when used to replace alkyl, the phosphoryl group of the phosphorylalkyl has the general formula:
Embedded image

(Where Q₁Represents S or O, and R₄₆Represents hydrogen, lower alkyl or aryl;₂Represents O, S or N)
Can be represented by Q₁When is S, the phosphoryl moiety is "phosphorothioate".
[0086]
The term “polycyclyl” or “polycyclic group” refers to two or more rings (eg, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkynyl, aryl and / or heterocyclyl) wherein two or more carbons are two It refers to a ring that is common to adjacent rings (this ring is a "fused ring"). Rings that are joined through non-adjacent carbons are termed "bridged rings." Each of the rings of the polycyclic group may be a substituent as defined above, e.g., halogen, alkyl, aralkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, hydroxyl, amino, nitro, sulfhydryl, imino, amide, phosphate, phosphonate, Phosphinate, carbonyl, carboxyl, silyl, ether, alkylthio, sulfonyl, sulfonamide, ketone, aldehyde, ester, heterocyclyl, aromatic or heteroaromatic moiety, -CF₃, -CN and the like.
[0087]
The term "protecting group," as used herein, refers to a primary substituent that protects a potentially reactive functional group from unwanted chemical transformations. Examples of such protecting groups include esters of carboxylic acids, silyl ethers of alcohols, acetals and ketals of aldehydes and ketones, respectively. The field of protecting group chemistry has been reviewed (TW Green, PGM Utz, Protecting Groups in Organic Chemistry, 2nd Edition, Wheelie, New York, 1991).
[0088]
“Selenoalkyl” refers to an alkyl group having a substituted seleno group attached thereto. Examples of "selenoethers" which may have a substituent on alkyl are -Se-alkyl, -Se-alkenyl, -Se-alkynyl and -Se- (CH₂)_m-R₈(M and R₈Is as defined above).
[0089]
The term "substituted" as used herein is intended to include all acceptable substituents on organic compounds. In a broad aspect, acceptable substituents include acyclic and cyclic, branched and unbranched, carbocyclic and heterocyclic, aromatic and non-aromatic substituents of organic compounds. Examples of substituents include, for example, those as defined above. The permissible substituents can be one or more and the same or different for the appropriate compound. For purposes of the present invention, a heteroatom such as nitrogen can have a hydrogen substituent and / or any acceptable substituent of the organic compounds described herein that stabilizes the valence of the heteroatom. The invention is not limited in any way by this acceptable substituent of the organic compound.
[0090]
“Substituted” or “substituted” is a compound in which such substitution is consistent with the substituted valence of the substituted atom and the substituent and the substitution is stable, eg, rearrangement, cyclization, elimination, and the like. Is understood to encompass the implicit condition of providing a stable compound that does not undergo spontaneous transformations such as
[0091]
The term “sulfamoyl” is recognized in the art and has the general formula:
Embedded image

(Where R₉And R₁₀Is as defined above)
And a portion represented by
[0092]
The term “sulfate” is recognized in the art and has the general formula:
Embedded image

(Where R₄₁Is as defined above)
And a portion represented by
[0093]
The term "sulfonamide" is art-recognized and has the general formula:
Embedded image

(Where R₉And R '₁₁Is as defined above)
And a portion represented by
[0094]
The term “sulfonate” is recognized in the art and has the general formula:
Embedded image

(Where R₄₁Is an electron pair, hydrogen, alkyl, cycloalkyl or aryl)
And a portion represented by
[0095]
The terms "sulfoxide" or "sulfinyl", as used herein, have the general formula:
Embedded image

(Where R₄₄Is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, heterocyclyl, aralkyl or aryl)
Means a portion represented by
[0096]
Similar substitutions are made on alkenyl and alkynyl, for example, to produce aminoalkenyl, aminoalkynyl, amidoalkenyl, amidoalkynyl, iminoalkenyl, iminoalkynyl, thioalkenyl, thioalkynyl, carbonyl-substituted alkenyl or alkynyl. Can be.
[0097]
The definition of each expression, eg, alkyl, m, n, etc., as used herein, when it appears more than once in any structural formula, its definition elsewhere in the same structural formula. And intended to be independent.
[0098]
The terms "trifuryl", "tosyl", "mesyl" and "nonafryl" are art-recognized and refer to trifluoromethanesulfonyl, p-toluenesulfonyl, methanesulfonyl and nanofluorobutanesulfonyl groups, respectively. The terms "triflate", "tosylate", "mesylate" and "nanoflate" are recognized in the art and include trifluoromethanesulfonate, p-toluenesulfonate, methanesulfonate and nanofluorobutanesulfone, respectively. Acid ester functional groups as well as molecules containing such groups respectively.
[0099]
The abbreviations Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts and Ms represent methyl, ethyl, phenyl, trifluoromethanesulfonyl, nanofluorobutanesulfonyl, p-toluenesulfonyl and methanesulfonyl, respectively. A more comprehensive list of abbreviations utilized by organic chemists of ordinary skill in the art can be found in the first of each volume of the Journal of Organic Chemistry. This list is typically found in a table named "Standard List of Abbreviations". All abbreviations included in the list, as well as those utilized by organic chemists of ordinary skill in the art, are hereby incorporated by reference.
[0100]
Certain compounds of the present invention may exist in particular geometric or stereoisomeric forms. The present invention includes cis- and trans-isomers, R- and S-enantiomers, diastereomers, (D) -isomers, (L) -isomers, racemic mixtures thereof, and mixtures thereof. All of the above compounds are intended to be within the scope of the present invention. In addition, asymmetric carbon atoms may be present in a substituent such as an alkyl group. All such isomers, as well as mixtures thereof, are intended to be included in the present invention.
[0101]
For example, if one desires a particular enantiomer of a compound of the present invention, it can be prepared by asymmetric synthesis or by derivatization with a chiral auxiliary, in which case the resulting diastereomeric mixture is separated, The auxiliary group is cleaved to give the pure desired enantiomer. Alternatively, when the molecule contains a basic functional group such as amino or an acidic functional group such as carboxyl, a diastereomer salt may be formed with a suitable optically active acid or base and then formed. The diastereomer can be resolved by fractional crystallization or chromatographic means known in the art, followed by recovery of the pure enantiomer.
[0102]
The intended equivalents of the compounds described above include those with corresponding and corresponding general properties (eg, the ability to block hedgehog signaling), but which do not adversely affect the effectiveness of the compound. Compounds that include one or more simple changes are included. In general, the compounds of the present invention can be prepared using readily available starting materials, reactants and well-known synthetic procedures, for example, by the general reaction schemes described below or by modifications thereof. In these reactions, it is also possible to use alternatives, which are known per se but are not mentioned here.
[0103]
For the purposes of the present invention, chemical elements are identified in accordance with the "Periodic Table of Elements, CAS Version" in the cover page of "Handbook of Chemistry and Physics, 67th Edition, 1986-87". Also, for the purposes of the present invention, the term "hydrocarbon" is intended to include all acceptable compounds having at least one hydrogen and one carbon atom. In a broad aspect, acceptable hydrocarbons include substituted or unsubstituted acyclic and cyclic, branched and unbranched, carbocyclic and heterocyclic, aromatic and Includes non-aromatic organic compounds.
[0104]
III . Examples of compounds of the present invention
As described in detail below, it is contemplated that the subject methods can be practiced using a variety of different small molecules that can be readily identified, for example, by drug screening assays as described herein. For example, compounds useful in this subject method have general formula (I):
Embedded image

[Where valence and stability allow,
R₁, R₂, R₃And R₄Is independently for each occurrence H, lower alkyl,-(CH₂)_nAryl (e.g., substituted or unsubstituted) or-(CH₂)_nRepresents a heteroaryl (eg, substituted or unsubstituted),
L is independently for each occurrence either absent or-(CH₂)_n-, -Alkenyl-, -alkynyl-,-(CH₂)_nAlkenyl-,-(CH₂)_nAlkynyl-,-(CH₂)_nO (CH₂)_p-,-(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-,-(CH₂)_nS (CH₂)_p-,-(CH₂)_nAlkenyl (CH₂)_p-,-(CH₂)_nAlkynyl (CH₂)_p-, -O (CH₂)_n-, -NR₈(CH₂)_n-Or -S (CH₂)_n-
X and D are independently -N (R₈)-, -O-, -S-,-(R₈) NN (R₈)-, -ON (R₈)-And a direct bond;
Y and Z are independently selected from O and S;
E is O, S or NR₅(R₅Is LR₈Or-(C = O) LR₈Represents)
R₈Is independently for each occurrence H, lower alkyl,-(CH₂)_nAryl (e.g., substituted or unsubstituted) or-(CH₂)_nRepresents a heteroaryl (eg, substituted or unsubstituted) or two R₈Together form a 4- to 8-membered ring,
p independently represents an integer of 0 to 10, preferably 0 to 3,
n independently represents an integer of 0 to 10, preferably 0 to 5;
q and r independently represent an integer of 0 to 2]
Can be represented by
[0105]
In certain embodiments, D does not represent N-lower alkyl. In certain embodiments, D represents aralkyl-heteroaralkyl-substituted amine.
In certain embodiments, R₁Represents a lower alkyl group such as a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, for example, cyclopropyl, cyclopropylmethyl, neopentyl, cyclobutyl, isobutyl, isopropyl, sec-butyl, cyclobutylmethyl and the like.
In certain embodiments, Y and Z are O.
In certain embodiments, the sum of q and r is less than 4, for example, 2 or 3.
In certain embodiments, the XLR₄Together comprise a cyclic amine such as piperazine, morpholine, piperidine, pyrrolidine and the like.
[0106]
In certain embodiments, R₁, R₂And R₃At least one comprises an aryl or heteroaryl group. In certain related embodiments, R₁, R₂And R₃At least two comprise an aryl or heteroaryl group. In certain embodiments, R₁Is lower alkyl.
In certain embodiments, R₁L is O, S or NR₈, For example, NH.
In certain embodiments, E is NR₈It is. In certain embodiments, E is, for example, a polycyclic R₈And aralkyl- or heteroaralkyl-substituted amines.
In certain embodiments, X is not NH. In certain embodiments, X is included in a ring or, together with -C (= Y)-, represents a tertiary amide.
[0107]
In certain embodiments, compounds useful in the invention have the general formula (II):
Embedded image

[Where valence and stability allow,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₈, L, X, Y, Z, n, p, q, r and s are as defined above,
M is absent or L, -SO₂L- or-(C = O) L-,
s is independently an integer from 0 to 2]
Can be represented by
[0108]
In certain embodiments, Y and Z are O.
In certain embodiments, R₁Represents a lower alkyl group such as a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, for example, cyclopropyl, cyclopropylmethyl, neopentyl, cyclobutyl, isobutyl, isopropyl, sec-butyl, cyclobutylmethyl and the like.
In certain embodiments, the sum of q, r, and s is less than 5, for example, 2, 3, or 4.
In certain embodiments, the XLR₄Together comprise a cyclic amine such as piperazine, morpholine, piperidine, pyrrolidine and the like.
In certain embodiments, R₁L is O, S or NR₈, For example, NH.
In certain embodiments, R₁, R₂And R₃At least one comprises an aryl or heteroaryl group. In certain related embodiments, R₁, R₂And R₃At least two comprise an aryl or heteroaryl group.
In certain embodiments, M is absent.
In certain embodiments, X is not NH. In certain embodiments, X is included in a ring or, together with -C (= Y)-, represents a tertiary amide.
[0109]
In certain embodiments, compounds useful in the invention have the general formula (III):
Embedded image

[Where valence and stability allow,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₈, L, M, X, Y, Z, n, p, q and r are as defined above]
Can be represented by
[0110]
In certain embodiments, Y and Z are O.
In certain embodiments, R₁Represents a lower alkyl group such as a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, for example, cyclopropyl, cyclopropylmethyl, neopentyl, cyclobutyl, isobutyl, isopropyl, sec-butyl, cyclobutylmethyl and the like.
In certain embodiments, the sum of q and r is less than 4, for example, 2 or 3.
In certain embodiments, the XLR₄Together comprise a cyclic amine such as piperazine, morpholine, piperidine, pyrrolidine and the like.
In certain embodiments, R₁, R₂And R₃At least one comprises an aryl or heteroaryl group. In certain related embodiments, R₁, R₂And R₃At least two comprise an aryl or heteroaryl group. In certain embodiments, R₁Is lower alkyl.
In certain embodiments, R₁L is O, S or NR₈, For example, NH.
In certain embodiments, M is absent.
In certain embodiments, X is not NH. In certain embodiments, X is included in a ring or, together with -C (= Y)-, represents a tertiary amide.
[0111]
In certain embodiments, compounds useful in the present invention have the general formula (IV):
Embedded image

[Where valence and stability allow,
R₁, R₂, R₃, R₄, R₈, L, M, X, n and p are as defined above]
Can be represented by
[0112]
In certain embodiments, the XLR₄Together comprise a cyclic amine such as piperazine, morpholine, piperidine, pyrrolidine and the like.
In certain embodiments, R₁Represents a lower alkyl group such as a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, for example, cyclopropyl, cyclopropylmethyl, neopentyl, cyclobutyl, isobutyl, isopropyl, sec-butyl, cyclobutylmethyl and the like.
In certain embodiments, R₁, R₂And R₃At least one comprises an aryl or heteroaryl group. In certain related embodiments, R₁, R₂And R₃At least two comprise an aryl or heteroaryl group. In certain embodiments, R₁Is lower alkyl.
In certain embodiments, R₁L is O, S or NR₈, For example, NH.
In certain embodiments, M is absent.
In certain embodiments, X is not NH. In certain embodiments, X is included in a ring or, together with -C (= Y)-, represents a tertiary amide.
In certain embodiments, L represents a direct bond for all occurrences.
[0113]
In certain embodiments, compounds useful in the present invention have the general formula (V):
Embedded image

[Where valence and stability allow,
Y, n, p, q and r are as defined above,
Z 'is-(C = O)-,-(C = S)-,-(= NH) -SO₂Or SO, preferably-(C = O)-,-(C = S)-,
V is absent or O, S or NR₈Represents
G is absent or -C (= O)-or -SO₂-
J is independently for each occurrence a substituted or unsubstituted lower alkyl or alkylene attached to NC (= Y) such that both the presence of hydrogen or N in contact with J are joined by at least one occurrence of J; For example, represents methyl, ethyl, methylene, ethylene,
R₉Is independently for each occurrence absent or represents H or lower alkyl, or two occurrences of J or one occurrence of J is R₉Form a 5- to 7-membered ring with one or both occurrences of N;₅Represents a substituted or unsubstituted alkyl (branched or unbranched), alkenyl (branched or unbranched), alkynyl (branched or unbranched), cycloalkyl or cycloalkylalkyl;
R₆Represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl, heteroaralkyl, heterocyclyl, heterocyclylalkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl (including a polycyclic group);
R₇Represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl or heteroaralkyl.
Can be represented by
[0114]
In certain embodiments, Y is O. In certain embodiments, Z 'is SO₂,-(C = O)-or-(C = S)-.
In certain embodiments, the sum of q and r is less than 4.
In certain embodiments, NJ₂N together represents a cyclic diamine such as piperazine and the like. It may be substituted or unsubstituted by one or more substituents such as, for example, oxo, lower alkyl, lower alkyl ether and the like. In certain embodiments, NJ₂Or NJR₉Together represent a substituted or unsubstituted heterocyclic ring to which another occurrence of N is attached. In certain embodiments, the occurrence on one or both of J is replaced by one or more of lower alkyl, lower alkyl ether, lower alkyl thioether, amide, oxo, and the like. In certain embodiments, the heterocyclic ring containing the presence of J has from 5 to 8 members.
In certain embodiments, R₅Represents a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl.
In certain embodiments, R₆Includes at least one heterocyclic ring, for example, thiophene, furan, oxazole, benzodioxane, benzodioxole, pyrrole, indole, and the like.
In certain embodiments, R₇Represents a phenyl group such as a benzyl group, which is a halogen, hydroxyl, lower alkyl, nitro, cyano, lower alkyl ether (for example, CHF₂CF₂O) or a lower alkyl thioether (eg, CF₃(It may be substituted like S).
In certain embodiments, R₈Represents H or lower alkyl when present in V, preferably H.
[0115]
In certain embodiments, compounds useful in the present invention have the general formula (VI):
Embedded image

[Where valence and stability allow,
R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, G, J, V, Y, Z ', n and p are as defined above]
Can be represented by
[0116]
In certain embodiments, Y is O. In certain embodiments, Z 'is SO₂,-(C = O)-or-(C = S)-.
In certain embodiments, NJ₂N together represents a cyclic diamine such as piperazine and the like. It may be substituted or unsubstituted by one or more substituents such as, for example, oxo, lower alkyl, lower alkyl ether and the like. In certain embodiments, NJ₂Or NJR₉Together represent a substituted or unsubstituted heterocyclic ring to which another occurrence of N is attached. In certain embodiments, one or both occurrences of J is replaced by one or more of lower alkyl, lower alkyl ether, lower alkyl thioether, amide, oxo, and the like. In certain embodiments, the heterocyclic ring containing the presence of J has from 5 to 8 members.
In certain embodiments, R₅Represents a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl.
In certain embodiments, R₆Includes at least one heterocyclic ring, for example, thiophene, furan, oxazole, benzodioxane, benzodioxole, pyrrole, indole, and the like.
In certain embodiments, R₇Represents a phenyl group such as a benzyl group, which is a halogen, hydroxyl, lower alkyl, nitro, cyano, lower alkyl ether (for example, CHF₂CF₂O) or a lower alkyl thioether (eg, CF₃(It may be substituted like S).
In certain embodiments, R₈Represents H or lower alkyl when present in V, preferably H.
In certain embodiments, the subject compound is selected from the compounds shown in FIG.
[0117]
In certain embodiments, the subject antagonists can be selected based on their selectivity for the hedgehog pathway. The selectivity may be to select a hedgehog pathway over other pathways, and may be a selectivity between particular hedgehog pathways (eg, ptc-1, ptc-2, etc.).
[0118]
In certain preferred embodiments, the subject inhibitors are capable of inhibiting ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened function mediated signal transduction of less than 1 mM, more preferably less than 1 μM, and even more preferably less than 1 nM ED.₅₀Inhibits. Similarly, in certain preferred embodiments, the subject inhibitors have an activity of the hedgehog pathway of less than 10 nM, preferably less than 1 nM, even more preferably less than 0.1 nM._iInhibits.
[0119]
In a specific embodiment, this small molecule is, for example, for one patched pathway (ptc-1, ptc-2) because it is more selective for one patched isoform than its neighbors. It is selected because it is 10 times, more preferably at least 100 times or 1000 times as selective as the others.
[0120]
In certain embodiments, compounds that are antagonists of the hedgehog pathway that more selectively antagonize hedgehog activity than protein kinases other than PKA, such as PKC, are selected, for example, where the compound inhibits the activity of the hedgehog pathway by another. It is at least one order of magnitude more potent, preferably at least two orders of magnitude more even more preferably at least three orders of magnitude more potent when regulating the activity of a protein kinase. Thus, for example, a suitable inhibitor of the hedgehog pathway would have hedgehog activity,_iK at least one order of magnitude lower, preferably at least two orders of magnitude lower, even more preferably at least three orders of magnitude lower_iCan be inhibited. In certain embodiments, the PKA inhibition K_iIs less than 10 nM, preferably less than 1 nM, even more preferably less than 0.1 nM.
[0121]
Method for producing the subject compound
The present invention further provides a method for producing the subject compound as described above. For example, in certain embodiments, the compound of Formula X is represented by the following reaction scheme:
Embedded image

[here,
q, r and s each independently represent an integer in the range of 0 to 2 so that the sum of q + r + s is an integer in the range of 2 to 4;
LG represents a leaving group such as a halogen (eg, Cl, Br or I) or a sulfonic acid ester (eg, tosylate, mesylate, triflate, etc.);
A is oxygen or sulfur bonded to an acid protecting group or a compound of the formula: XLR₄Represents a group having
B is a nitrogen-protecting group or formula: MR₃Represents a group having
R₃And R₄Is independently for each occurrence H, lower alkyl,-(CH₂)_nAryl (substituted or unsubstituted) or-(CH₂)_nRepresents heteroaryl (substituted or unsubstituted),
Y can be selected from O and S,
X is -N (R₈)-, -O-, -S- or a direct bond;
M is absent or L, -SO₂L- or-(C = O) L-,
L is independently for each occurrence either absent or-(CH₂)_n-Alkyl-, -alkenyl-, -alkynyl-,-(CH₂)_nAlkenyl-,-(CH₂)_nAlkynyl-,-(CH₂)_nO (CH₂)_p-,-(CH₂)_nNR₈(CH₂)_p-,-(CH₂)_nS (CH₂)_p-,-(CH₂)_nAlkenyl (CH₂)_p-,-(CH₂)_nAlkynyl (CH₂)_p-, -O (CH₂)_n-, -NR₈(CH₂)_n-Or -S (CH₂)_n-
R₈Is independently for each occurrence H, lower alkyl,-(CH₂)_nAryl (e.g., substituted or unsubstituted) or-(CH₂)_nRepresents a heteroaryl (eg, substituted or unsubstituted), or₈Together form a 4- to 8-membered ring,
p independently represents an integer of 0 to 10, preferably 0 to 3,
n independently represents an integer of 0 to 10, preferably 0 to 5]
Can be converted according to
Step A consists of converting the hydroxyl to a leaving group,
Step B comprises replacing the leaving group with an azide group;
Step C consists of reducing the azide to the amine.
[0122]
In certain embodiments, the conversion of a hydroxyl to a leaving group is accomplished by reacting the hydroxyl with a sulfonyl halide to give a sulfonic ester, for example, using tosyl chloride or tosyl anhydride to give a tosylate. Or using mesyl chloride or mesyl anhydride to produce a mesylate, or using trifuryl chloride or trifuryl anhydride to produce triflate, and the like. In certain embodiments, conversion of the hydroxyl to the leaving group is accomplished by reacting the hydroxyl with a halogenating reagent such as thionyl halide, phosphorus trihalide, phosphorus pentahalide, phosphorus oxyhalide, and the like. Can be achieved. Other techniques for converting a hydroxyl group to a leaving group are well known in the art and can be used in Step A.
[0123]
In certain embodiments, step A further comprises replacing the first leaving group with a second leaving group to reverse the stereochemistry of the carbon bearing the leaving group. Thus, for example, if the hydroxyl of a compound of formula X has a cis-stereochemical relationship with a group having Y and A, the reaction of the compound with mesyl chloride will result in a group having Y and A and a cis-stereochemical relationship. Causes mesylate in the relationship. The reaction of this mesylate with a nucleophilic halide reactant such as NaI replaces the mesylate with an iodide, and the leaving group iodine and the group having Y and A have a trans-stereochemical relationship. This gives a compound of formula XI. The use of this technique involves compounds having either cis- or trans-stereochemistry from diastereomerically pure starting materials, such as the cis-stereochemical relationship between the hydroxyl and the group having Y and A. To selectively obtain pure compounds having the formula:
[0124]
In certain embodiments, replacing the leaving group with an azide can be accomplished by using an alkali or alkaline earth metal salt of an azide anion such as sodium azide, such as trimethylsilyl azide, as is well known in the art. This can be accomplished using a suitable silyl azide reactant or using any other azide reactant, such as a nucleophilic azide source.
[0125]
In certain embodiments, the reduction of the azide to the amine is accomplished using a hydride reactant such as lithium aluminum hydride, lithium trialkyl borohydride and the like, such as zinc metal or samarium diiodide and acetic acid. It can be achieved using catalytic hydrogenation, such as using a reducing metal and an acid source, hydrogen and a transition metal catalyst such as platinum or palladium, or by any other suitable means.
[0126]
In certain embodiments, q + s + r is an integer from 2-3. In certain embodiments, s is 0. In certain embodiments, q and r each represent 1.
[0127]
In certain embodiments, A represents oxygen attached to an acid protecting group. For example, the acid protecting group can be a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or aralkyl group. Such groups include methyl, ethyl, trimethylsilylethyl, methylthiomethyl, allyl, benzyl, p-nitrobenzyl, tetrahydropyranyl (THP), t-butyl or any other suitable group. A wide variety of acid protecting groups are known in the art and can be used in this method without departing from the scope and spirit of the invention. In another embodiment, A represents an alkylthio group.
[0128]
In certain embodiments, B is a nitrogen protecting group, such as a substituted or unsubstituted acyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or aralkyl group, or a group that when taken together with N forms a carbamate group. Represents Common nitrogen protecting groups include benzyl, allyl, p-methoxybenzyl, acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and the like. A wide variety of nitrogen protecting groups are known in the art and can be used in this method without departing from the scope and spirit of the invention.
[0129]
In certain embodiments, Y is O.
In certain embodiments, A is an XLR that, together, can comprise a cyclic amine, such as piperazine, morpholine, piperidine, pyrrolidine, and the like.₄Represents
In certain embodiments, R₃Contains an aryl or heteroaryl group.
In certain embodiments, M is absent.
In certain embodiments, X is NR₈And preferably not NH. In certain embodiments, X is contained in a ring or together with -C (= Y)-represents a tertiary amide group.
[0130]
In certain embodiments, the compounds of formula XIII are, for example,> 75%,> 85%, or even> 95%> because of the isomer in which the amine and the group containing Y and A have a cis- relationship. Concentrated for the cis-isomer of In other embodiments, compounds of formula XIII are for isomers in which the two substituents have a trans- isomer, for example, for> 75%,> 85%, or even> 95% of the trans-isomer. Is concentrated. Preferably, such enrichment is effected using isomerically enriched starting materials, for example, the compound of Formula X is> 75%,> 85%, or even before starting Step A Concentrated for> 95% cis- or trans-isomer.
[0131]
Similarly, in another embodiment, the compound of formula XIV has the following reaction formula:
Embedded image

[here,
q and r each independently represent an integer in the range of 0 to 2 so that the sum of q + r is an integer in the range of 2 to 4;
LG represents a leaving group such as a halogen (eg, Cl, Br or I) or a sulfonic acid ester (eg, tosylate, mesylate, triflate, etc.);
A is oxygen or sulfur bonded to a group protecting the acid or a compound of the formula: NJ₂N (R₉)₂Represents a group having
B is a nitrogen protecting group or a formula: GR₆Represents a group having
G is absent or -C (= O)-, -C (= S)-or -SO₂-
J is independently for each occurrence a substituted or unsubstituted lower alkyl or alkylene linked to NC (= Y) such that both the presence of hydrogen or N in contact with J are linked by at least one occurrence of J. Represent,
R₉Is independently for each occurrence absent or represents H or lower alkyl, or two occurrences of J or one occurrence of J is R₉Form a 5- to 7-membered ring with one or both occurrences of N;₆Represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl, heteroaralkyl, heterocyclyl, heterocyclylalkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl (including a polycyclic group);
Y can be selected from O and S]
Can be converted according to
Step A consists of converting the hydroxyl to a leaving group,
Step B comprises replacing the leaving group with an azide group;
Step C consists of reducing the azide to the amine.
[0132]
In certain embodiments, the conversion of a hydroxyl to a leaving group is accomplished by reacting the hydroxyl with a sulfonyl halide to give a sulfonic ester, for example, using tosyl chloride or tosyl anhydride to give a tosylate. Or using mesyl chloride or mesyl anhydride to produce a mesylate, or using trifuryl chloride or trifuryl anhydride to produce triflate, and the like. In certain embodiments, the conversion of a hydroxyl to a leaving group is accomplished by reacting the hydroxyl with a halogenating reactant such as a thionyl halide, phosphorus trihalide, phosphorus pentahalide, phosphorus oxyhalide, and the like. Can be achieved. Other techniques for converting a hydroxyl group to a leaving group are well known in the art and can be used in Step A.
[0133]
In certain embodiments, step A further comprises replacing the first leaving group with a second leaving group to reverse the stereochemistry of the carbon bearing the leaving group. Thus, for example, if the hydroxyl of a compound of formula X has a cis-stereochemical relationship with a group having Y and A, the reaction of the compound with mesyl chloride will result in a group having Y and A and a cis-stereochemical relationship. Causes mesylate in the relationship. The reaction of this mesylate with a nucleophilic halide reactant such as NaI replaces the mesylate with an iodide, and the leaving group iodine and the group having Y and A have a trans-stereochemical relationship. This gives a compound of formula XV. The use of this technique involves compounds having either cis- or trans-stereochemistry from diastereomerically pure starting materials, such as the cis-stereochemical relationship between the hydroxyl and the group having Y and A. To selectively obtain pure compounds having the formula:
[0134]
In certain embodiments, replacing the leaving group with an azide can be accomplished by using an alkali or alkaline earth metal salt of an azide anion such as sodium azide, such as trimethylsilyl azide, as is well known in the art. This can be accomplished using a suitable silyl azide reactant or using any other azide reactant, such as a nucleophilic azide source.
[0135]
In certain embodiments, the reduction of the azide to the amine is accomplished using a hydride reactant such as lithium aluminum hydride, lithium trialkyl borohydride and the like, such as zinc metal or samarium diiodide and acetic acid. It can be achieved using catalytic hydrogenation, such as using a reducing metal and an acid source, hydrogen and a transition metal catalyst such as platinum or palladium, or by any other suitable means.
[0136]
In certain embodiments, q + r is an integer from 2-3. In certain embodiments, q and r each represent 1.
[0137]
In certain embodiments, A represents oxygen attached to an acid protecting group. For example, the acid protecting group can be a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or aralkyl group. Such groups include methyl, ethyl, trimethylsilylethyl, methylthiomethyl, allyl, benzyl, p-nitrobenzyl, tetrahydropyranyl (THP), t-butyl or any other suitable group. A wide variety of acid protecting groups are known in the art and can be used in this method without departing from the scope and spirit of the invention. In another embodiment, A represents an alkylthio group.
[0138]
In certain embodiments, B is a nitrogen protecting group, such as a substituted or unsubstituted acyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or aralkyl group, or a group that when taken together with N forms a carbamate group. Represents Common nitrogen protecting groups include benzyl, allyl, p-methoxybenzyl, acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and the like. A wide variety of nitrogen protecting groups are known in the art and can be used in this method without departing from the scope and spirit of the invention.
[0139]
In certain embodiments, Y is O.
In certain embodiments, B is GR₆(Where R₆Is at least one heterocyclic ring, including, for example, thiophene, furan, oxazole, benzodioxane, benzodioxole, pyrrole, indole, and the like.
[0140]
In certain embodiments, A may be taken together to represent a cyclic diamine, such as piperazine, etc.₂Represents N. It may be substituted or unsubstituted by one or more substituents such as, for example, oxo, lower alkyl, lower alkyl ether and the like. In certain other embodiments, NJ₂Or NJR₉Together represent a substituted or unsubstituted heterocyclic ring to which another occurrence of N is attached. In certain embodiments, one or both occurrences of J is replaced by one or more of lower alkyl, lower alkyl ether, lower alkyl thioether, amide, oxo, and the like. In certain embodiments, the heterocyclic ring containing the presence of J has from 5 to 8 members.
[0141]
In certain embodiments, the compound of formula XVII has, for example,> 75%,> 85%, or even> 95%, because of the isomer in which the amine and the group containing Y and A have a cis- relationship. Concentrated for the cis-isomer. In other embodiments, the compounds of formula XVII are for isomers where the two substituents have a trans-isomer, for example, for> 75%,> 85%, or even> 95% of the trans-isomer. Is concentrated. Preferably, such enrichment is effected using isomerically enriched starting materials, for example, the compound of formula XIV is> 75%,> 85%, or even before starting step A Concentrated for> 95% cis- or trans-isomer.
[0142]
In certain embodiments, amines having a structure of Formula XIII or XVII can be further transformed, for example, by performing additional steps towards giving compounds of Formulas I-VI. Thus, for example, the method according to the invention comprises the following steps:
D) Group on exocyclic amine: -C (= Z) LR₁Or -Z'VR₅Coupling the
E) Group on exocyclic amine: -R₇Or -LR₂Coupling the
F) Group based on a group having Y: -NJ₂N (R₉) Or -XLR₄Coupling the
G) Group based on ring nitrogen: -MR₃Or -GR₆Coupling
H) removing the protecting group from the ring nitrogen;
I) removing the retaining group from the group having Y;
J) placing a nitrogen protecting group on the exocyclic amine;
K) Removing the retaining group from the exocyclic amine
[here,
L, J, R₉, M, R₃And R₆Is as defined above,
R₁, R₂, R₃And R₄Is independently for each occurrence H, lower alkyl,-(CH₂)_nAryl (substituted or unsubstituted) or-(CH₂)_nRepresents heteroaryl (substituted or unsubstituted),
Z is O or S;
Z 'is absent or -SO₂-,-(C = S)-or-(C = O)-,
V is absent or O, S or NR₈Represents
R₅Represents a substituted or unsubstituted alkyl (branched or unbranched), alkenyl (branched or unbranched), alkynyl (branched or unbranched), cycloalkyl or cycloalkylalkyl;
R₇Represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl or heteroaralkyl.
Including one or more.
[0143]
When any of steps DK can be selected, they can be accomplished in any order, depending on various reactions and protecting groups, as is well known in the art. While various protecting groups suitable for use in this method have been outlined above, they are well known in the art, as are many techniques for attaching and removing such protecting groups, Any of these can be used in the present Act without departing from the scope and spirit of the Act.
[0144]
In certain embodiments, step D comprises converting the exocyclic amine to an acylating agent, such as an acid halide, isocyanate, isothiocyanate, haloformate, halothioformate, anhydride, bicarbonate, sulfonyl halide, halogenated halide. It can be achieved by reacting with sulfinyl, carbamoyl chloride, thiocarbamoyl chloride or an activated acylation moiety prepared in situ. The acylating agent can be used in situ, for example, to convert a carboxylic acid into a carbodiimide (eg, diisopropylcarbodiimide, dicyclohexylcarbodiimide, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide, etc.), a phosphorus-based reactant (eg, BOP- Cl, PyBROP, etc.), an activating agent such as oxalyl chloride, phosgene, triphosgene, or a reactive intermediate that has increased sensitivity as compared to the carboxylic acid for coupling with an amine upon reaction with a carboxylic acid group. It can be achieved by reacting with any other reactant that results. A wide variety of such reagents are well known in the field of organic synthesis, particularly peptide coupling. Similarly, treatment of a primary amine or alcohol with an equivalent of phosgene, such as, for example, carbonyldiimidazole, phosgene, triphosgene, diphosgene, or the like, or an equivalent of thiophosgene, such as thiophosgene, thiocarbonyldiimidazole, An acylating agent that can react with an amine to form urea or thiourea (eg, isocyanate, isothiocyanate, chloroformamide or chlorothioformamide) can be generated without requiring its isolation or purification.
[0145]
M or G is SO₂, C = O or C = S, step G can be accomplished using the intensive reagents and techniques as described for step D above. In embodiments wherein M or G is absent, step G comprises converting the exocyclic amine to an electrophilic reactant such as an alkyl halide or alkyl sulfonate, a halogenated or aralkyl sulfonate, a halogenated or heteroaralkyl sulfonate, a halogen By reacting with a cycloalkyl halide or sulfonate, a cycloalkylalkyl halide or sulfonate, a heterocyclyl halide or sulfonate, or a heterocyclyl alkyl halide or sulfonate. Alternatively, step G can be accomplished by reductive alkylation, for example, by reacting the exocyclic amine with an appropriately substituted aldehyde in the presence of a reducing agent such as sodium borohydride.
[0146]
In certain embodiments, step E can be accomplished using reductive alkylation or by reacting the exocyclic amine with an electrophile such as a halide or sulfonate.
[0147]
In certain embodiments, step F comprises converting the ester, thioester, or xanthate to a compound of the formula: HNJ₂N (R₉)₂Or HXLR₄With a compound having, for example, an elevated temperature in the presence of a Lewis acid. In other embodiments, step F comprises activating the carboxylic acid, for example, a carbodiimide (eg, diisopropylcarbodiimide, dicyclohexylcarbodiimide, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide, etc.), a phosphorus-based reactant (E.g., BOP-Cl, PyBROP, etc.), an activating agent such as oxalyl chloride, phosgene, triphosgene, or a sensitizing agent that reacts with a carboxylic acid group to provide a method of coupling with an amine in comparison with the carboxylic acid. It can be achieved by reacting with any other reactant that results in an increased reactive intermediate. Other techniques for coupling nucleophilic reagents with carboxylic acids or derivatives thereof (eg, esters, thioesters) are well known in the art and can be used in place of those specifically listed herein.
[0148]
In certain embodiments, Y and Z are O.
In certain embodiments, R₁Represents a lower alkyl group such as a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, for example, cyclopropyl, cyclopropylmethyl, neopentyl, cyclobutyl, isobutyl, isopropyl, sec-butyl, cyclobutylmethyl and the like.
In certain embodiments, the XLR₄Together comprise a cyclic amine such as piperazine, morpholine, piperidine, pyrrolidine and the like.
In certain embodiments, R₁L is O, S or NR₈, For example, NH.
In certain embodiments, R₁, R₂And R₃At least one comprises an aryl or heteroaryl group. In certain related embodiments, R₁, R₂And R₃At least two comprise an aryl or heteroaryl group.
In certain embodiments, M is absent.
In certain embodiments, X is not NH. In certain embodiments, X is included in a ring or, together with -C (= Y)-, represents a tertiary amide.
[0149]
In certain embodiments, NJ₂N together represents a cyclic diamine such as piperazine and the like. It may be substituted or unsubstituted by one or more substituents such as, for example, oxo, lower alkyl, lower alkyl ether and the like. In certain embodiments, NJ₂Or NJR₉Together represent a substituted or unsubstituted heterocyclic ring to which another occurrence of N is attached. In certain embodiments, one or more occurrences of J is replaced by one or more of lower alkyl, lower alkyl ether, lower alkyl thioether, amide, oxo, and the like. In certain embodiments, the heterocyclic ring containing the presence of J has from 5 to 8 members.
In certain embodiments, R₅Represents a branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl.
In certain embodiments, R₆Includes at least one heterocyclic ring, for example, thiophene, furan, oxazole, benzodioxane, benzodioxole, pyrrole, indole, and the like.
In certain embodiments, R₇Represents a phenyl group such as a benzyl group, which is a halogen, hydroxyl, lower alkyl, nitro, cyano, lower alkyl ether (for example, CHF₂CF₂O) or a lower alkyl thioether (eg, CF₃(It may be substituted like S).
In certain embodiments, R₈Is H or lower alkyl when present in V, preferably H.
[0150]
IV. Typical application of methods and compositions
Another aspect of the invention is to regulate the differentiation status, survival and / or proliferation of cells having ptc deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened hyperactivity by contacting the cells with a hedgehog antagonist according to the subject method. About the method.
[0151]
In light of the discovery that hedgehog, ptc and smoothund are clearly involved in the ordered and spatial arrangement of differentiated tissues in vertebrates, for example, the subject methods are in vitro and in vivo. Can be used as part of the creation and / or maintenance of different vertebrate tissue lines, both in vivo. The hedgehog antagonist can be any of the preparations described above, as appropriate, with or without inducibility, for the growth and differentiation of a given tissue.
[0152]
For example, the method of the present invention may be applied to cell culture techniques when the cells have a phenotype of ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened function hyperactivity, either for genetic or biochemical reasons. Can be. In vitro neuronal culture systems have been used to study neuronal development and to identify neurotrophic factors such as nerve growth factor (NGF), ciliary tropism factor (CNTF) and brain-induced neurotrophic factor (BDNF). I know it's basic and essential. One use of the methods of the invention is for use in culturing neural stem cells (eg, for use in such cultures for the purpose of creating new neurons and glia). In such embodiments of the subject method, the cultured cells are contacted with a hedgehog antagonist of the invention to alter the rate of proliferation and / or the rate of differentiation of the neural stem cells in culture, or to produce certain types of terminally differentiated neural cells. Maintain cell culture integrity. In an exemplary embodiment, the subject methods can be used to culture, for example, sensory or motor neurons. Such neuronal cultures can be used as a simple assay system as well as a source of implantable cells for therapy.
[0153]
According to the present invention, large numbers of non-tumorigenic neural stem cells can be permanently stored in vitro and affect their proliferation and / or differentiation rates by contacting with the hedgehog antagonists of the invention. Can be. Generally, isolating neural stem cells from the animal; permanently storing these cells in vitro or in vivo, preferably in the presence of growth factors; and contacting these cells with a hedgehog antagonist Thus, a method is provided that includes the step of regulating the differentiation of cells to a particular neural phenotype (eg, neurons and glia).
[0154]
Stem cells are thought to be under the effect of sustained suppression, which remains suppressed until differentiation is required. However, unlike neurons that have ultimately differentiated (and thus are non-dividing), methods of expanding these cells have recently been developed. The cells are produced indefinitely and are very suitable for transplantation into xenogeneic and autologous hosts with neurodegenerative diseases.
[0155]
A “stem cell” is an oligopotent or multipotent cell that is capable of dividing without limitation and producing, under special conditions, a daughter cell that ultimately differentiates into neurons and glia and the like. (multipotent). These cells can be used for transplantation into xenogeneic or autologous hosts. "Heterologous" means a host other than an animal from which the stem cells are derived. "Self" means the same host from which the cell is derived.
[0156]
Cells can be obtained from embryonic, postnatal, juvenile, or adult neural tissue in any animal that has neural tissue. More specifically, examples include all fish, reptiles, birds, amphibians or mammals. Most preferred donors are mammals, especially mice and humans.
[0157]
If a non-human xenogeneic donor animal is used, the animal is euthanized and the brain and the specific region of interest are removed by a sterile process. In particular, the target brain region includes any region where a stem cell used for restoring the function of a degenerated region of the host brain can be obtained. Examples of such areas include areas of the central nervous system (CNS) such as cerebral cortex, cerebellum, midbrain, brainstem, spinal cord and ventricular tissue, and peripheral nervous systems (PNS) such as carotid body and adrenal medulla. Area. In particular, a region in the basal ganglia, preferably a striatum composed of the caudate nucleus and putamen, or various cell groups such as the pallidus, the hypothalamus nucleus, or the basal nucleus in which alteration is seen in Alzheimer's disease patients There is a dense substantia nigra that is altered in patients with the disease.
[0158]
The human xenogeneic neural stem cells may be derived from fetal tissue obtained from abortion, or may be obtained from a postnatal, young or adult organ donor. Autologous nervous tissue can be obtained by biopsy or from a patient whose nerve tissue has been removed by neurosurgery, specifically epilepsy surgery, more specifically temporal lobectomy and hippocampal resection.
[0159]
Cells can be obtained by dissociating individual cells from the connected extracellular matrix of the donor tissue. The dissociation is performed by a known method, for example, treatment with an enzyme such as trypsin, collagenase, or the like, by a physical dissociation method (using a blunt instrument), or by dusting with a scalpel. This allows for the growth of specific cell types obtained from the tissue. Although dissociation of fetal cells can be performed in tissue culture media, a preferred culture media for dissociation of young and adult cells is artificial cerebrospinal fluid (aCSF). A typical aCSF contains 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, and 10 mM D-glucose. Low Ca2 + aCSF contains the same components, except that it contains MgCl2 at a concentration of 3.2 mM and CaCl2 at a concentration of 0.1 mM.
[0160]
The dissociated cells can be cultured in any known culture medium that supports cell growth. Examples of culture media include MEM, DMEM, RPMI, F-12, etc., containing additional components required for cell metabolism (glutamine and other amino acids, vitamins, minerals, etc.) and useful proteins (transferrin, etc.). . The culture medium may further contain an antibiotic (penicillin, streptomycin, gentamicin, etc.) that prevents contamination by yeasts, bacteria, fungi, and the like. In some cases, the culture medium may include serum from cows, horses, chickens, and the like. A particularly preferred cell culture medium is a mixture of DMEM and F-12.
[0161]
Culture conditions must be close to physiological conditions. The pH of the culture medium should be close to physiological pH, preferably pH 6-8, more preferably pH 7, and even more preferably pH 7.4. The cells must be cultured at near physiological temperatures, preferably at 30-40 ° C, more preferably at 32-38 ° C, and even more preferably at 35-37 ° C.
[0162]
Although the cells can be grown in suspension or on a fixed substrate, the expansion of the stem cells is preferably performed in suspension so that the large number of cells form "aggregates" (eg, Reynolds et al. (1992) Science 255: 1070-1709; and PCT Publication Nos. WO93 / 01275, WO94 / 09119, WO94 / 10292, and WO94 / 16718). In the case of growing (or dividing) suspension cells, shake the flask thoroughly and allow the clumps to settle in the bottom corner of the flask. Transfer the agglomerates to a 50 ml centrifuge tube and centrifuge at low speed. The medium is aspirated and the cells are resuspended in a small amount of medium containing growth factors. The cells are mechanically dissociated and resuspended in separate aliquots of the culture medium.
[0163]
The cell suspension in the culture medium is supplemented with a growth factor that allows the growth of stem cells and is placed in a container that can support the cells, but is preferably placed in a culture flask or roller bottle, as described above. Cells are generally grown by placing them in a 37 ° C incubator for 3-4 days. Growth can be resumed at any time by dissociating the cells and resuspending them in growth media containing growth factors.
[0164]
In the absence of the substrate, the cells leave the flask bed and continue to grow in suspension, forming hollow clumps of undifferentiated cells. After about 3-10 days in vitro, the growth groups (agglomerates) are fed by gentle centrifugation every 2-7 days, preferably every 2-4 days, and resuspended in growth medium containing growth factors. It becomes cloudy.
[0165]
After 6-7 days in vitro, the individual cells in the clumps are physically dissociated with a blunt instrument (more specifically, crushing the clumps with a pipette) and separated. Controlling cell differentiation in culture by resuspending individual cells from dissociated clumps in growth media containing growth factors and culturing (or resuspending) cells in the presence of hedgehog antagonist I do.
[0166]
To further illustrate other uses of the subject hedgehog antagonists, it is mentioned that intracerebral transplantation has been used as an additional method of central nervous system treatment. For example, one method of repairing damaged brain tissue includes transplanting fetal or neonatal cells into the adult brain (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123: 265-289; and Freund et al. (1985). J Neurosci 5: 603-616). Fetal neurons taken from various brain regions can be successfully integrated into the adult brain, thus mitigating behavioral deficits. For example, motor impairment caused by damage in dopaminergic projections to the basal ganglia can be avoided by transplanting embryonic dopaminergic neurons. Impaired complex cognitive function caused by neocortical damage can be partially restored by transplanting embryonic cortical cells. The subject methods can be used to regulate the growth state of the culture, and when fetal tissue is used, particularly using neural stem cells, to regulate the rate of stem cell differentiation.
[0167]
Stem cells that can be used in the present invention are known. For example, several neural crest cells have been identified, some of which are pluripotent and represent uncommitted neural crest cells, while others represent only one type of cell. Representative of committed committed stem cells. In the methods of the present invention, the role of the hedgehog antagonist used in culturing such stem cells may be to regulate the differentiation of uncommitted stem cells; or to develop committed stem cells towards terminal differentiation into neural cells. Adjustment of further restrictions. For example, using the method of the invention in vitro, the differentiation of neural crest cells into glial cells, Schwann cells, chromaffin cells, cholinergic or parasympathetic neurons, and peptidergic and serotonergic neurons Can be adjusted. Hedgehog antagonists can be used alone or in combination with other neurotrophic factors that further promote specific differentiation of neural stem cells.
[0168]
In addition to the transplantation of cells cultured in the presence of the hedgehog antagonists of the present subject matter, yet another feature of the present invention is the application of hedgehog antagonists to neurons and other neurons in both the central and peripheral nervous systems. Modulating the growth state of neurons in the brain. ptc, hedgehog, and smoothened have the ability to regulate neuronal differentiation during nervous system development and possibly during adulthood. This indicates that, in the presence of the subject hedgehog antagonists, the retention, performance and aging of normal cells; the repair and regeneration of chemically or mechanically damaged cells; and certain pathological conditions Indicate that it would control adult neurons for the treatment of alterations in In view of this, the present invention specifically contemplates applying the subject methods to treatment protocols (prevention and / or reduction of medical conditions) for nervous system conditions derived from: (I) acute, subacute, or chronic damage to the nervous system such as trauma, chemical damage, vascular damage and defects (eg, ischemia due to stroke), infectious / inflammatory and neoplastic damage; (ii) Alzheimer's disease (Iii) chronic neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration; and (iv) nervous system such as multiple sclerosis Chronic immune disease that affects the nervous system.
[0169]
If done properly, the subject method can be used to create an artificial nerve that repairs central and peripheral nerve damage. In particular, when attaching a tube to a collapsed or severed axon using a prosthetic device, a hedgehog antagonist can be added to the prosthetic device to control growth rate and dendritic regeneration. Examples of neural transduction routes are described in U.S. Patent Nos. 5,092,871 and 4,955,892.
[0170]
In other embodiments, the subject methods can be used to treat malignant or hyperplastic transformation (eg, occurring in the central nervous system). For example, a hedgehog antagonist can be used to render such transformed cells terminally divided or suicidal. Thus, the methods of the present invention can be used, for example, in part of the treatment of malignant gliomas, meningioma, medulloblastoma, neuroectodermal and ventricular epithelioma.
[0171]
In a preferred embodiment, the subject methods can be used as part of a treatment regimen for malignant medulloblastoma and other primary CNS malignant neuroectodermal tumors.
[0172]
In some embodiments, the subject methods can be used as part of a medulloblastoma treatment program. Medulloblastoma, the primary brain tumor, is the most common brain tumor in children. Medulloblastoma is an early neuroectodermal tumor (PNET) that develops in the retro-foveal cavity. It accounts for about 25% of childhood brain tumors (Miller). Medulloblastomas are histologically small round cell tumors that are generally arranged in rosettes, but some differentiate into astrocytes, ependymal cells or neurons (Rorke; Kleihues). PNETs can occur in the pineal gland (pineoblastoma) and other areas of the brain, including the cerebrum. Those that occur in the upper tent area are generally more pathological than PF equivalents.
[0173]
Medulloblastoma / PNET is known to recur anywhere in the CNS after resection and spread to bone. Thus, in the pre-processing evaluation, a spinal cord examination is performed to rule out the possibility of "dropped transfer". For this reason, gadolinium-enhanced MRI is generally performed instead of myelography, and CSF cell diagnosis can be obtained as a routine operation after surgery.
[0174]
In other embodiments, the subject methods are used as part of a ventricular epithelioma treatment program. Ventricular epithelioma accounts for about 10% of childhood brain tumors. In general, ventricular epithelioma is a tumor that occurs in the ependymal lining of the ventricle and forms microscopic sized rosettes, canals, and perivascular rosettes. In 51 children with CHOP reported for ventricular epithelioma, 3/4 were histologically benign. About two thirds came from the fourth ventricle. One third was in the area above the tent. They peaked between the ages of 0 and 4 as shown by the SEER and CHOP data. The median age was 5 years. Since many children with this disease are infants, a variety of treatments are needed.
[0175]
Yet another feature of the invention is that ptc, hedgehog and / or smoothened are involved in morphogenetic signals involved in other vertebrate organic matter pathways in addition to the neural differentiation described above, resulting in endoderm patterning. , And the observation that they clearly play a role in the differentiation process of mesoderm and endoderm. Thus, the present invention contemplates the use of compositions comprising hedgehog antagonists in both cell cultures and therapeutics involving the production and retention of non-neural tissue.
[0176]
In one embodiment, the invention provides that ptc, hedgehog, and smoothened are clearly involved in controlling the development of stem cells involved in the formation of gastrointestinal tract, liver, lung and other organs from the gastrointestinal tract. It uses discovery. Shh is provided as an inducing signal from endoderm to mesoderm, which is critical for intestinal morphogenesis. Thus, for example, the hedgehog antagonists of the method of the invention can be used to regulate the development and maintenance of an artificial liver having multiple metabolic functions in normal liver. In an exemplary embodiment, the subject methods are used to regulate the growth and differentiation of gastrointestinal stem cells, to form hepatocyte cultures, to be used to densify extracellular matrix, or to be used in biocompatible polymers. To form an implantable and extracorporeal artificial liver.
[0177]
In other embodiments, therapeutic compositions of hedgehog antagonists are used in conjunction with transplantation of artificial liver, embryonic liver structures, etc. to modulate intraperitoneal transplantation, uptake of angiogenesis and in vivo differentiation and maintenance of transplanted liver tissue can do.
[0178]
In yet other embodiments, the subject methods can be used for treatment to modulate such organs after physical, chemical or pathological damage. For example, therapeutic compositions including hedgehog antagonists can be used for liver repair following hepatectomy.
[0179]
The formation of the pancreas and small intestine from the intestinal tract of the embryo depends on intercellular signaling between endodermal and mesodermal cells of the intestinal tract. In particular, it has been suggested that the differentiation of intestinal mesoderm into smooth muscle depends on signals from adjacent endoderm cells. One candidate for endoderm-derived signal mediators in the hindgut of embryos is Sonic hedgehog (see, for example, Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7: 801-4). The Shh gene is expressed throughout the intestinal endoderm of the embryo, with the exception of the pancreatic endoderm, which is a homeodomain protein Ipf1 / Pdx1 (insulin promoter factor 1/1, which is an essential regulator of early pancreatic development). Pancreatic and duodenal homeobox 1) are expressed at high levels. Apelqvist et al. (Supra) have investigated whether differential expression of Shh in the intestinal tract of embryos controls the differentiation of the surrounding mesoderm into specific mesoderm derivatives such as the small intestine and pancreas. In the literature, to examine this, Shh is selectively expressed in the developing pancreatic epithelium using the promoter of the Ipf1 / Pdx1 gene. In Ipf1 / Pdx1-Shh transgenic mice, the pancreatic mesoderm did not differentiate into pancreatic mesenchyme and spleen, but developed into smooth muscle and intestinal Kahal cells (cells characteristic of the intestinal tract). Furthermore, pancreatic explants contacted with Shh underwent similar intestinal differentiation. These results imply that differential expression of Shh from endoderm controls differentiation of adjacent mesoderm in different regions of the intestinal tract.
[0180]
Thus, in the context of the present invention, it is contemplated that the subject hedgehog antagonists are used to control or regulate the growth and / or differentiation of pancreatic tissue both in vivo and in vitro.
[0181]
There are various pathological cell growth and differentiation conditions for which the inhibitors of the present invention provide a therapeutic effect. For example, correction of abnormal insulin expression or regulation of differentiation is mentioned. More generally, however, the invention relates to a method of inducing and / or maintaining the differentiation state of a cell, enhancing survival and / or affecting proliferation by contacting pancreatic cells with a subject inhibitor. . For example, the production and / or maintenance of such tissues both in vitro and in vivo, as ptc, hedgehog and smoothened are clearly involved in the ordered spatial formation of pancreatic tissue It is contemplated by the present invention to use the subject method as part of a method for performing the method. For example, modulation of hedgehog function involves both cell culture and therapy (eg, gastrointestinal tract, spleen, lung, urogenital (eg, gastrointestinal) from cells involved in the production and maintenance of cells and possibly non-pancreatic tissue. , Bladder) and the control of the development and maintenance of tissue from other organs).
[0182]
In an exemplary embodiment, the methods of the invention can be used for the treatment of hyperplastic and neoplastic diseases of pancreatic tissue, particularly characterized by abnormal proliferation of pancreatic cells. For example, pancreatic cancer is characterized by abnormal pancreatic cell proliferation that regulates pancreatic insulin secretion. Certain pancreatic hyperplasias, such as, for example, pancreatic cancer, cause hypoinsulinemia due to β-cell dysfunction or decreased islet cell weight. To the extent that abnormal ptc, hedgehog and smoothened signaling are shown in the progression of the disease state, the subject inhibitors can be used to promote tissue regeneration following anti-tumor treatment.
[0183]
Still further, manipulating the hedgehog signaling properties at different points is useful as part of pancreatic tissue reconstruction / regeneration techniques both in vivo and in vitro. In one embodiment, the invention takes advantage of the fact that ptc, hedgehog and smoothened are involved in regulating the development of pancreatic tissue. Generally, the subject methods can be used therapeutically to modulate the pancreas following physical, chemical or pathological injury. In yet other embodiments, the subject methods can be applied to cell culture techniques, and in particular, can be used to promote the initial formation of artificial pancreatic tissue. Manipulating the growth and differentiation of pancreatic tissue, for example, by altering hedgehog activity, provides a means to more carefully control the characteristics of the cultured tissue. In an exemplary embodiment, the subject method can be used to increase the production of prostheses that require β-islet cells, which can be used, for example, in some of the encapsulation devices described below (Aebischer et al., US U.S. Patent No. 4,892,538, Aebischer et al., U.S. Patent No. 5,106,627, Lim, U.S. Patent No. 4,391,909, and Sefton, U.S. Patent No. 4,353,888). It is clear that early islet stem cells of the pancreatic islets are pluripotent and co-activate all islet cell-specific genes from the first appearance. As differentiation progresses, expression of islet cell-specific hormones (eg, insulin) is restricted to the expression pattern characteristic of mature islet cells. However, the phenotype of mature islet cells is not stable in culture when the recurrence of embryonic features in mature β cells becomes observable. By utilizing the subject hedgehog antagonists, the differentiation pathway or proliferation rate of a cell can be modulated.
[0184]
In addition, manipulation of the differentiation state of pancreatic tissue can be utilized in combination with transplantation of an artificial pancreas to promote transplantation, angiogenesis and in vivo differentiation, and maintenance of the transplanted tissue. For example, manipulation of hedgehog function, which affects tissue differentiation, can be used as a means to maintain graft viability.
(1997) Development 124: 53 report that Sonic hedgehog regulates lung mesenchymal cell proliferation in vivo. Thus, the methods of the invention can be used to regulate the regeneration of lung tissue (eg, in the treatment of emphysema).
[0185]
Fujita et al. (1997) Biochain Biophys Res Commun 238: 658 reports that Sonic hedgehog is expressed in human lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. Sonic hedgehog expression was detected in human lung squamous cell carcinoma tissue, but not in normal lung tissue of the same patient. The literature also reports that Sonic hedgehog stimulates BrdU uptake into cancer cells and stimulates cell growth, while anti-Shh-N inhibits cell growth. These results suggest that ptc, hedgehog and / or smoothened are involved in the cell growth of such transformed lung tissue, and thus the subject method is described in lung and adenocarcinoma, and lung cancer. It shows that it can be used as part of the treatment of proliferative disorders involving the epithelium.
[0186]
In view of the involvement of the hedgehog pathway in these tumors, or the detection of hedgehog and its receptor expression in these tissues during development, treatment with the subject compounds has It can affect many tumors. Examples of such tumors include tumors related to Gaulin's syndrome (eg, basal cell carcinoma, medulloblastoma, meningiomas, etc.), tumors found in pct knockout mice (eg, hemangiomas, rhabdomyosarcomas, etc.), gli Tumors resulting from -1 amplification (eg, glioblastoma, sarcoma, etc.), tumors linked to TRC8, ptc homolog (eg, kidney cancer, thyroid cancer, etc.), Ext-1 related tumors (eg, bone cancer, etc.), Shh-induced tumors (eg, lung cancer, chondrosarcoma, etc.) and other tumors (eg, breast cancer, genitourinary (eg, kidney, bladder, ureter, prostate, etc.), adrenal cancer, gastrointestinal (eg, stomach, intestine, etc.) cancer). But not limited thereto.
[0187]
In yet another embodiment of the present invention, the use of a composition comprising a hedgehog antagonist to produce skeletal tissue in vitro, for example from skeletogenic stem cells, and to treat skeletal tissue defects in vivo Can be. The present invention specifically contemplates using a hedgehog antagonist to modulate the rate of chondrogenesis and / or bone formation. As used herein, a "skeletal tissue defect" is of any origin (eg, surgical intervention, removal of a tumor, ulceration, transplantation, fracture or other traumatic or degenerative condition) of the bone or connective tissue. Refers to a defect in bone or other skeletal connective tissue where recovery is desired.
[0188]
For example, the method of the present invention can be used as part of a regimen for restoring cartilage function of connective tissue. Such methods include, for example, degenerative wear (eg, arthritis) and tissue trauma (replacement of worn meniscal tissue, meniscectomy, loosening of joints due to ligament wear, malignant tumors of joints, fractures of tissues such as fractures) Or as a result of other mechanical injuries, such as those caused by or caused by genetic disease). The repair method of the present invention is useful for cartilage matrix reconstruction such as plastic surgery, reconstruction surgery, and periodontal surgery. The method of the invention can be applied to improve the pre-repair stage following surgical repair of meniscus, ligament or cartilage. Still further, the methods of the present invention may prevent the onset of degenerative disease or relapse if applied early after trauma.
[0189]
In one embodiment of the present invention, the subject method comprises treating diseased connective tissue with a therapeutically sufficient amount of a hedgehog antagonist, particularly an antagonist selective for Indian hedgehog signal transduction, Modulating the cartilage repair response in connective tissue by manipulating the rate of differentiation and / or proliferation of chondrocytes. Connective tissues such as articular cartilage, interarticular cartilage (meniscus), costal cartilage (connecting the true costum and sternum), ligaments and tendons are particularly sensitive to treatment in reconstruction and / or regenerative therapy using the subject methods I do. "Regenerative treatment" as used herein includes treatment of a degenerative condition that has progressed to the point where a tissue defect is apparent, and prophylactic treatment of tissue in which degeneration is at an early stage or in an imminent state.
[0190]
In an illustrative embodiment, the subject method may be used as part of a therapeutic intervention in the treatment of cartilage of a mobile joint, such as a knee, ankle, elbow, buttocks, wrist, hand or toe finger joint, or maxillary joint. it can. The treatment may target the meniscus of the joint, articular cartilage, or both. To further illustrate, the subject methods can be used to treat degenerative diseases of the knee that can result from trauma (eg, sports injury or excessive wear) or degenerative arthritis. The subject antagonists may be administered by injection into a joint, for example using an arthroscopy needle. In some cases, the administered drug may be in the form of a hydrogel or other slow-release excipient described above to prolong the contact of the drug with the treated tissue and make it constant.
[0191]
The present invention further contemplates using the subject methods in the field of cartilage transplantation and prosthetic treatment. However, for example, the properties of cartilage and fibrocartilage depend on the tissue (eg, between joints, meniscal cartilage, ligaments and tendons; between the ends of the same ligament or tendon; and between the surface and abyss of the same tissue). A) Difficulties arise. Since the spatial arrangement of these tissues can reflect gradual changes in mechanical properties, if undifferentiated transplants under these conditions do not have the ability to respond properly, Dysfunction occurs. For example, when meniscal cartilage is used to repair the anterior cruciate ligament, the tissue undergoes metaplasia and becomes pure fibrous tissue. Use the subject method to specifically address this problem, by adjusting the rate of cartilage formation to adapt the transplanted cells to a new environment and control them to resemble hypertrophic chondrocytes in the early developmental stage of the tissue be able to.
[0192]
Similarly, the subject methods can be applied to facilitate both the creation and implantation of artificial cartilage. There is a need for improved therapies, such as collagen-glycosaminogen templates [Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252: 129], isolated chondrocytes [Grande et al. (1989) J Orthop Res7: 208; and Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2: 449] and chondrocytes linked to natural or synthetic polymers [Walitini et al. (1989) J Bone Jt Surg71B: 74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88: 753; von Schroeder et al. Mater Res 25: 329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27:11; and Vacanti et al., US Pat. Based on the No. 041,138], it has been studied for the purpose of creation of new cartilage. For example, biodegradable and biocompatible, formed from polymers such as polyglycolic acid, polylactic acid, agarose, or other polymers that are degraded to harmless monomers over a long period of time by the hydrolysis function of the polymer backbone A chondrocyte can be grown using a culture medium on a porous skeleton having The substrate is designed to allow adequate nutrient supply and gas exchange of the cells prior to implantation. The cells can be cultured in vitro until the volume and density of the cells to be transplanted are appropriately large. The use of a substrate has the advantage that the individual can be shaped into the desired shape and the end product can resemble the patient's own eg ears or nose. Alternatively, reduction can be achieved using a flexible matrix, for example, when implanted in a joint.
[0193]
In one embodiment of the subject method, at some stage in the culture process, the explant is contacted with a hedgehog antagonist to control the rate of chondrocyte differentiation and the formation of hypertrophic chondrocytes in culture.
[0194]
In other embodiments, the implanted artificial tissue is treated with a hedgehog antagonist to actively shape the implanted matrix to make it suitable for its intended function. As noted above with respect to tissue transplantation, artificial transplants have the same disadvantage that the substrate is not derived from an environment that can be compared to the actual mechanical environment in which it is transplanted. The ability of the subject method to modulate chondrocytes in the matrix allows the graft to acquire similar characteristics to the tissue to be replaced.
[0195]
In yet another aspect, the subject method is used to promote attachment of a prosthesis. For example, the subject method can be used for implantation of a periodontal prosthesis. Here, the treatment of the surrounding connective tissue stimulates the formation of the periodontal ligament surrounding the prosthesis.
[0196]
In still other embodiments, the subject method can be used as part of a regimen for bone formation at a defect site in an animal's skeletal tissue. Indian hedgehog is particularly related to hypertrophic chondrocytes, which are ultimately replaced by osteoblasts. For example, a hedgehog antagonist of the present invention can be administered as part of a method of regulating bone loss in a subject. Preparations including, for example, hedgehog antagonists can be used to control endochondral ossification, eg, in forming a “model” of ossification.
[0197]
In yet another aspect of the invention, hedgehog antagonists can be used to modulate spermatogenesis. Hedgehog proteins, especially Dhh, have been shown to be involved in testicular germ cell differentiation and / or proliferation and maintenance. Dhh expression is induced in Sertoli cell precursors shortly after Sry (testis-determining gene) activation and persists in adult testis. Because no mature sperm is present, men are viable but infertile. Examination of the developing testis in various genetic backgrounds suggested that Dhh regulates both the early and late stages of spermatogenesis [Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6: 298]. In a preferred embodiment, hedgehog antagonists can be used as contraceptives. Similarly, hedgehog antagonists of the subject methods may be useful in regulating normal ovarian function.
[0198]
The subject method can be widely applied to preventive treatment of diseases occurring in epithelial tissues, makeup, and the like. Generally, the method comprises administering to the animal an amount of a hedgehog antagonist effective to alter the growth state of the treated epithelial tissue. The mode of administration and dosage regimen will depend on the epithelial tissue being treated. For example, if the tissue to be treated is epidermal tissue (skin or mucosal tissue), topical administration is preferred.
[0199]
When the treatment is performed in a "promotes wound healing" manner, the wound heals faster than when the treatment is not used. By "promoting wound healing" is meant, inter alia, a method of regulating the proliferation and / or growth of keratinocytes, or less scarring, less wound shrinkage, less collagen attachment and more superficial wound healing. I do. In some cases, "promoting wound healing" refers to having a method of wound healing that has improved passage rates (eg, skin graft engraftment rates) when using the methods of the present invention. It also means that.
[0200]
Despite significant progress in reconstruction to date, scars can be a significant obstacle in restoring the normal function and appearance of the healed skin. This is particularly true where pathological scars such as keloid or hypertrophic scars on the hands and face are causing dysfunction and physical deformation. In the most severe situations, such scars can cause psychological distress and financial burden. Wound healing involves the stages of hemostasis, inflammation, proliferation and remodeling. The proliferative phase involves the expansion of fibroblasts and endothelial and epithelial cells. To promote wound closure and / or minimize scar tissue formation, the rate of proliferation of epithelial cells within and around the wound can be controlled through use of the subject methods.
[0201]
The treatment of the present invention is effective as part of a therapeutic regimen, for example, for the treatment of stomatitis and parastomatitis resulting from radiotherapy and / or chemotherapy. Such ulcers generally develop within days after chemotherapy or radiation therapy. Generally, these ulcers are initially painful, small amorphous wounds that are initially covered by a gray necrotic membrane and surrounded by inflammatory tissue. In many cases, without treatment, the tissue around the wound on the inflammatory base grows. For example, epithelial tissue at the periphery of the ulcer exhibits proliferative activity, resulting in a loss of continuity of surface epithelial tissue. Secondary infections can occur as the wound becomes larger and the integrity of the epithelial tissue is lost. Whenever ulcers grow through the gastrointestinal tract, pain is felt every time food and water are consumed, and various factors are added to cause diarrhea. According to the present invention, treating such ulcers by applying a hedgehog antagonist can reduce abnormal growth and differentiation of affected epithelial tissue and reduce the pain associated with subsequent inflammation. .
[0202]
The subject methods and compositions can be used to treat wounds from dermatological disorders, such as wounds from autoimmune disorders (eg, psoriasis). Atopic dermatitis refers to skin trauma resulting from an allergy associated with an immune response caused by allergens such as pollen, food, scale, insect venom and phytotoxin.
[0203]
In other embodiments, anti-proliferative preparations of hedgehog antagonists can be used to inhibit lens epithelial cell proliferation and prevent post-operative complications of extracapsular cataract extraction. Cataract is an intractable eye disease, and various studies have been made on the treatment of cataract. Currently, cataracts are treated by surgery. Cataract surgery has been used for a long time, and various surgical methods have been studied. Extracapsular lens extraction has been used as a means of cataract removal. This method used for extracapsular extraction has the medical benefit of less aphakic cystic macular edema and retinal detachment. Extracapsular extraction is necessary for transplantation of the posterior chamber intraocular lens, which is considered to be the lens to be used in most cases.
[0204]
However, extracapsular cataract extraction has the disadvantage that opacification of the posterior lens capsule (called posterior cataract) is likely to occur. This opacity occurs with up to 50% probability within 3 years after surgery. Posterior cataracts are caused by proliferation of equatorial and posterior capsule lens epithelial cells that remain after extracapsular lensectomy. These cells proliferate to form a Sommerling annulus, which also obscures the posterior capsule with fibroblasts that also accumulate in the posterior capsule, obstructing vision. It is preferable to take measures to prevent post-cataract. To inhibit secondary cataract formation, the subject methods provide a means of inhibiting proliferation of the remaining lens epithelial cells. For example, after lens removal, such cells can be kept stationary by instilling a solution containing a preparation of a hedgehog antagonist in the posterior chamber. Furthermore, by balancing the osmotic pressure of the solution, it is possible to minimize the effective dose when applied in the posterior chamber and to inhibit the growth of the subcapsular epithelium with a certain specificity. it can.
[0205]
The subject methods can also be used to treat corneal diseases characterized by proliferation of corneal epithelial cells (e.g., diseases of the epithelium of the eye, such as epithelial downgrowth, squamous cell carcinoma of the ocular surface).
[0206]
[(1997) J Neurosci 17: 6277] suggest that hedgehog proteins regulate mitosis and photoreceptor differentiation in the vertebrate retina, and that Ihh can promote retinal stem cell proliferation and photoreceptor differentiation. This indicates that the element is from the pigment epithelium. Similarly, Jensen et al. ((1997) Development 124: 363) show that when a culture of perinatal mouse retinal cells is treated with the amino-terminal fragment of Sonic hedgehog, the percentage of cells that take up bromodeoxyuridine increases the percentage of cells that take up bromodeoxyuridine. It has been shown to be increased in photoreceptors, axonal cells, and Muller glial cells. This suggests that Sonic hedgehog promotes retinal progenitor cell proliferation. Thus, the methods of the present invention can be used to treat proliferative disorders of retinal cells to regulate photoreceptor differentiation.
[0207]
Yet another aspect of the present invention relates to using the subject method for controlling hair growth. Hair is basically composed of the tough and insoluble protein keratin. The strength comes from the disulfide bonds of cystine. Each hair contains a cylindrical shaft and a hair root, and has a follicle, which is a flask-like depression in the skin. At the bottom of the hair follicle is a finger-like projection called the dermal papilla. Hair grows from the connective tissue that makes up the dermal papilla, and blood vessels supply cells to the cells through the connective tissue. The hair shaft is the part protruding outside from the skin surface, while the hair root is the part of the buried hair. The base of the hair root extends within the hair bulb and rests on the dermal papilla. Hair-producing cells grow in the hair bulb of the hair follicle. As the cells grow in the hair follicle, they are extruded in the form of fibers. Hair "growth" refers to the formation and extension of hair fibers by dividing cells.
[0208]
As is known in the art, the common hair cycle is divided into three stages: anagen, telogen, and telogen. During the active phase (developing phase), the epidermal stem cells of the dermal papilla divide rapidly. The daughter cells move upward and differentiate to form a conical layer. The transitional phase (resting phase) is characterized by mitotic cessation of stem cells in the hair follicle. The stop phase is known as the end phase. Here the hair is retained in the scalp for several weeks, and the new hair that appears beneath pushes the anaphase hair shaft out of the hair follicle. What is clear from this model is that the larger the population of dividing stem cells that differentiate into hair cells, the more likely hair growth occurs. Thus, by promoting or inhibiting the proliferation of these stem cells, a method is provided for increasing or decreasing hair growth, respectively.
[0209]
In some embodiments, the subject method can be used as a method of reducing human hair growth instead of conventional removal methods such as cutting, shaving or depilation. For example, the methods of the present invention can be used to treat a hair condition (eg, hirsutism) characterized by abnormally fast or dense hair growth. In an exemplary embodiment, a hedgehog antagonist can be used to control hirsutism in a woman, which is characterized by abnormal hair growth. The subject method can also provide a step of extending the period of hair loss.
[0210]
Still further, hedgehog antagonists arrest cell division rather than cytotoxic to epithelial cells, so that compounds may require cytotoxic agents that require progression to the S phase of the cell cycle for efficacy ( For example, hair follicle cells can be protected from radiation-induced death). Treating hair follicle cells by arresting hair follicle cells (eg, by preventing cells from entering S phase, thus preventing hair follicle cell mitosis and programmed cell death) by performing treatment according to the subject method Can be protected. For example, hedgehog antagonists can be used in patients receiving chemotherapy or radiation therapy, which usually results in hair loss. The subject treatment can be used during such therapy to prevent hair follicle cell death by inhibiting cell cycle progression, which is usually associated with programmed cell death. After termination of the therapy, the treatment of the present invention can be stopped at the same time as the inhibition of hair follicle cell proliferation is stopped.
[0211]
The subject method can be used to treat folliculitis, such as alopecia folliculitis, reticular scar folliculitis or keloid folliculitis. For example, a cosmetic preparation of a hedgehog antagonist can be applied topically to treat pseudofolliculitis. This folliculitis is the most common chronic disease associated with shaving in the lower jaw region of the neck and is characterized by erythematous papules and buried pustules.
[0212]
In another aspect of the invention, the subject methods can be used to promote differentiation and / or inhibit proliferation of epithelial-derived tissue. Such forms of these molecules can provide a basis for differentiation therapy to treat hyperplastic and / or neoplastic conditions involving epithelial tissue. For example, such preparations can be used in the treatment of skin diseases in which abnormal proliferation and growth of skin cells occurs.
[0213]
For example, the pharmaceutical preparations of the invention may be used to treat hyperplastic epidermal conditions such as keratosis, as well as neoplastic epidermal conditions characterized by a high proliferation rate of various skin cancers (such as squamous cell carcinoma). It is contemplated for use in treatment. The subject method can be used to treat autoimmune diseases affecting the skin, especially dermatological diseases, including pathological growth (caused by psoriasis or atopic dermatitis) and / or epidermal keratinization.
[0214]
Many common skin diseases, such as psoriasis, squamous cell carcinoma, keratocystoma and actinic keratosis, are characterized by local overgrowth and growth. For example, in psoriasis, which is characterized by desquamating, red, raised plaques on the skin, it is known that keratinocytes proliferate much faster and hardly differentiate as compared to normal cells.
[0215]
In one embodiment, the preparations of the present invention are suitable for the treatment of dermatological disorders associated with keratinizing disorders that result in abnormal skin cell proliferation characterized by either inflammatory or non-inflammatory factors. For example, therapeutic preparations of hedgehog antagonists (eg, promoting resting or differentiating) can be used to treat various forms of psoriasis, such as skin, mucous membranes or nails. As mentioned above, psoriasis is generally characterized by epidermal keratinocytes that exhibit proliferative activity and differentiation along the "regenerative" pathway. Treatment of the subject method with an anti-proliferative aspect can be used to reverse aberrant epidermal activation and provide maintenance of disease relief.
[0216]
Various other keratosis injuries can also be treated using the subject methods. Actinic keratosis, for example, is a surface inflammatory precancerous tumor that occurs in sun-exposed and light-irradiated skin. Wounds can range from erythema to brown. Current treatments include resection and cryosurgery. However, these treatments are painful and often result in scars that are unfit for makeup. Thus, as a treatment for keratosis, such as actinic keratosis, applying a hedgehog antagonist composition, preferably topically, in an amount sufficient to inhibit hyperproliferation of damaged epidermoid / epidermoid cells. Is mentioned.
[0217]
Acne is another dermatological disease that can be treated by the subject method. For example, acne vulgaris is the most common multifactorial disease in teens and early adulthood, characterized by inflamed and non-inflammatory lesions on the face and upper torso. A defect that causes acne vulgaris is hyperkeratinization of the hyperactive sebaceous duct. Hyperkeratosis interferes with the normal movement of skin and hair follicle microbes, thereby stimulating the release of lipase by the bacteria Propinobacterium acnes, Staphylococcus epidermidis and the yeast Pitrosporum ovale. Treatment with an anti-proliferative hedgehog antagonist, preferably a topical preparation, may be useful in preventing vascular changes (eg, hyperkeratinization) that can lead to lesion formation. The subject treatment may further include, for example, antibiotics, retinoids, and antiandrogens.
[0218]
The present invention also provides methods for treating various forms of dermatitis. Dermatitis is a term that vaguely defines pruritic, erythematous, exfoliative, herpetic, moist, fissured or crusted lesions. These damages can occur for various reasons. The most common dermatitis is atopic, contact and diaper dermatitis. Seborrheic dermatitis is a chronic, usually pruritic, dermatitis with erythema, dry, moist or greasy scales, with yellowing in various areas (especially the scalp), with excessive exfoliation of the dry scales. Crusted spots. The subject method can be used to treat congestive dermatitis, which is often chronic and usually eczema. Actinic dermatitis is dermatitis that results from exposure to light radiation such as sunlight, ultraviolet light, X or gamma radiation. According to the present invention, the subject method can be used to treat and / or prevent certain symptoms of dermatitis caused by unwanted proliferation of epithelial cells. Such treatments for various forms of dermatitis may further include topical and systemic administration of corticosteroids, antipruritics and antibiotics.
[0219]
For example, it is anticipated that the subject method could be used to prevent angiogenesis. Hedgehog is known to stimulate angiogenesis. Matrigel® plugs inserted into mice infiltrated with hedgehog protein show substantial neovascularization, whereas Matrigel® plugs without hedgehog show relatively little neovascularization. Not shown. Hedgehog proteins can also increase angiogenesis in the normally avascular mouse cornea. The ptc-1 gene is expressed in normal vascular tissue including aortic endothelial cells, vascular smooth muscle cells, aortic arterial adventitial fibroblasts, atrial and ventricular coronary vasculature and cardiomyocytes. These tissues are also sensitive to hedgehog proteins. Treatment with exogenous hedgehog causes up-regulation of ptc-1 expression. In addition, hedgehog proteins stimulate vascular smooth muscle cell proliferation in vivo. Hedgehog proteins also increase fibroblast expression of angiogenic growth factors such as VEGF, bFGF, Ang-1 and Ang-2. Finally, hedgehog proteins are known to stimulate recovery from ischemic damage and to stimulate collateral vessel formation.
[0220]
Given that hedgehog promotes angiogenesis, hedgehog antagonists are expected to act as angiogenesis inhibitors, especially in situations where some level of hedgehog signaling is required for angiogenesis.
[0221]
Angiogenesis is of fundamental importance for many diseases. Persistent, unregulated angiogenesis occurs in a range of disease states, tumor metastasis and endothelial cell overgrowth. The vasculature created as a result of the angiogenesis process supports the pathological damage seen in these diseases. Various pathological conditions created by unregulated angiogenesis have been grouped as angiogenesis-dependent or angiogenesis-related diseases. Treatments directed at controlling the angiogenic process could lead to elimination or alleviation of these diseases.
[0222]
Diseases caused, supported or related to angiogenesis include ocular neovascular diseases, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma, Post-lens fibroplasia, epidemic keratoconjunctivitis, vitamin A deficiency, contact lens fatigue, atopic keratitis, upper limbal keratoconjunctivitis, epidermal nail dryness, Sjogren's acne, syphilis, mycobacterial infection , Lipid degeneration, chemical burn, bacterial ulcer, fungal ulcer, herpes simplex infection, shingles, protozoan infection, Kaposi's sarcoma, Mohren's ulcer, terien marginal degeneration, marginal epidermis detachment, rheumatoid arthritis, whole body Lupus, polyarteritis, trauma, Wegener's sarcoma, scleritis, Stevens-Johnson disease, peripheral radiation keratotomy, corneal graft rejection, rheumatoid arthritis, osteoarthritis Sexual inflammation (e.g., ulcerative colitis or Crohn's disease), include hemangiomas, hereditary hemorrhagic telangiectasia and hereditary hemorrhagic telangiectasia.
[0223]
In addition, angiogenesis plays an important role in cancer. Tumors cannot spread without a blood supply that provides nutrients and removes cellular waste. Tumors where angiogenesis is important include solid tumors such as rhabdomyosarcomas, retinoblastomas, Ewing's sarcomas, neuroblastomas and osteosarcomas, and benign tumors such as acoustic neuromas, neurofibromas, trachoma and purulent granulation Tumors are included. Angiogenic factors have been found to be associated with some solid tumors. Preventing angiogenesis could stop the growth of these tumors and damage the animals resulting from the presence of the tumors. Angiogenesis is also a tumor arising from the blood, such as leukemia, which is a variety of acute or chronic neoplastic diseases of any bone marrow that usually cause anemia, impaired blood coagulation and hypertrophy of lymph nodes, liver and spleen. Accompanying). It is believed that angiogenesis plays a role in abnormalities that give rise to leukemic tumors in the bone marrow.
[0224]
In addition to tumor growth, angiogenesis is also important in metastasis. Initially, angiogenesis is important in tumor angiogenesis, which allows cancer cells to enter the bloodstream and circulate throughout the body. After tumor cells have left the primary site and settled in secondary metastatic sites, angiogenesis must occur before new tumors can grow and spread. Therefore, prevention of angiogenesis could lead to prevention of tumor metastasis, possibly including neoplastic growth at the primary site.
[0225]
Angiogenesis is also involved in normal physiological processes such as regeneration and wound healing. Angiogenesis is an important step in ovulation (and also in implantation of the blastula after fertilization). Preventing angiogenesis could be used to induce amenorrhea, block ovulation, or prevent implantation of blastulas.
[0226]
It is envisioned that the present invention will be useful in the treatment and / or prevention of respiratory distress syndrome or other disorders resulting from inappropriate lung surface tension. Respiratory distress syndrome results from insufficient surfactant in the alveoli of the lungs. Vertebrate lungs contain surfactants, which are complex mixtures of lipids and proteins that increase surface tension during lung inflation and decrease during lung contraction. During lung contraction, the surfactant decreases so that there is no surface force to crush the alveoli. The inflated alveoli, which did not collapse during exhalation, allows for continuous oxygen and carbon dioxide transport between blood and alveolar gas, requiring much less force to expand during subsequent inspiration. do not do. During inflation, lung surfactant increases surface tension as the alveoli surface area increases. Rinse surface tension in the inflating alveoli counters overinflation in those aerated spaces, diverting inhaled air to the under-inflated alveoli, thereby providing uniform lung inspiration. Tends to promote.
[0227]
Respiratory distress syndrome is particularly common in premature babies. Pulmonary surfactant is usually synthesized very slowly until the last six weeks of fetal life. Human infants born more than six weeks before a normal gestational age are at increased risk of being born with an inappropriate amount of pulmonary surfactant and an inappropriate rate of surfactant synthesis. The more premature the infant born, the more likely the surfactant deficiency is severe. Severe surfactant deficiency can result in respiratory failure within minutes to hours after birth. This surfactant deficiency results in a progressive alveolar collapse (pulmonary insufficiency), despite the maximum respiratory effort, due to the reduced ability of the lung to spread. As a result, the amount of oxygen reaching the infant's blood is insufficient. RDS can also occur in adults, typically as a result of defective biosynthesis of surfactants.
[0228]
Lung tissue from premature babies shows high activity of the hedgehog signaling pathway. Inhibition of this pathway with hedgehog antagonists increases lamellar body formation and increases the expression of genes involved in surfactant biosynthesis. The lamellae are intracellular structures involved in the biosynthesis of surfactants. For these reasons, treatment of a premature infant with a hedgehog antagonist should stimulate surfactant biosynthesis and improve RDS. If adult RDS is involved in activation of the hedgehog pathway, treatment with hedgehog antagonists should still be effective.
[0229]
It is further envisaged that the use of hedgehog antagonists may be particularly targeted to diseases in which the affected tissues and / or cells show high hedgehog pathway activation. The expression of the gli gene is activated by the hedgehog signaling pathway (including gli-1, gli-2 and gli-3). gli-1 expression is most consistently correlated with hedgehog signaling activity over a wide range of tissues and diseases, while gli-3 is less so. The gli gene encodes a transcription factor that activates the expression of a number of genes required to elicit the full effect of hedgehog signaling. However, the Gli-3 transcription factor can also act as a repressor of the hedgehog effector gene, and thus expression of gli-3 can cause a diminished effect of the hedgehog signaling pathway. Whether Gli-3 acts as a transcriptional activator or a repressor depends on the post-transcriptional event and, therefore, a method for detecting the activated (as opposed to repressed) form of the Gli-3 protein Is also expected to be a reliable measure of hedgehog pathway activation. gli-2 gene expression is expected to provide a reliable marker for hedgehog pathway activation. The gli-1 gene is strongly expressed in many cancers and functions as a marker for the relative activation of the hedgehog pathway. In addition, tissues such as immature lungs with high gli gene expression are strongly affected by hedgehog inhibitors. It is therefore anticipated that detection of gli gene expression could be used as a powerful predictive tool to identify tissues and diseases that would benefit particularly from treatment with hedgehog antagonists.
[0230]
In a preferred embodiment, the level of gli-1 expression is detected by direct detection of the transcript or by detecting the level or activity of the protein. The transcript can be detected using any of a wide variety of techniques that rely primarily on hybridization of the probe to the gli-1 transcript or cDNA synthesized therefrom. Well-known techniques include Northern blotting, reverse transcription PCR and transcript level microarray analysis. Methods for detecting Gli protein levels include Western blotting, immunoprecipitation, two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D SDS-PAGE) (preferably compared to a standard where the Gli protein is located), and mass. Analytical methods are included. Mass spectrometry can be coupled with a series of purification steps to enable high-throughput identification of many different protein levels in a particular sample. Mass spectrometry and 2D SDS-PAGE can also be used to identify post-transcriptional modifications to proteins, including proteolytic events, ubiquitination, phosphorylation, lipid modification, and the like. Gli activity can also be assessed by analyzing binding to substrate DNA or in vitro transcriptional activation of the target promoter. Gel shift assays, DNA footprinting assays, and DNA-protein cross-linking assays are all methods that can be used to assess the presence of proteins that can bind to the Gli binding site on DNA.
[0231]
In a preferred embodiment, gli transcript levels are measured, and diseased or disordered tissues that exhibit abnormally high gli levels are treated with a hedgehog antagonist. Immature lung tissue, lung cancer (eg, adenocarcinoma, bronchoalveolar adenocarcinoma, small cell carcinoma), breast cancer (eg, lower ductal carcinoma, lower lobular carcinoma, tubular carcinoma), prostate cancer (eg, adenocarcinoma), and benign Prostate hyperplasia all show, in some cases, strongly elevated gli-1 expression levels. Thus, gli-1 expression levels are a powerful diagnostic device for determining which of these tissues should be treated with hedgehog antagonists. In addition, there is evidence of substantial correlation that urothelial cell cancers (eg, bladder cancer, other urogenital cancers) will also have elevated gli-1 levels in some cases. For example, it is known that loss of heterozygosity on chromosome 9q22 is common to bladder cancer. The ptc-1 gene is located at this location, and ptc-1 deficiency is probably a partial cause of hyperproliferation, as in many other types of cancer. Thus, such cancers will also show high gli expression, and will be particularly amenable to treatment with hedgehog antagonists.
[0232]
Although expression of ptc-1 and ptc-2 is also activated by the hedgehog signaling pathway, these genes are inferior to the gli gene as a marker for hedgehog pathway activation. In some tissues, only one of ptc-1 or ptc-2 is expressed, even though the hedgehog pathway is highly active. For example, in testis development, Indian hedgehog plays an important role, activating its hedgehog pathway, but expressing only ptc-2. Thus, these genes are not individually reliable markers of hedgehog pathway activation, although simultaneous measurement of both genes is contemplated as a useful indicator of tissue to be treated with hedgehog antagonists.
[0233]
Diseases that can be treated by the subject methods include diseases specifically found in humans, such as scabies.
[0234]
In yet other embodiments, the subject methods can be used to treat human cancers, particularly basal cell carcinomas and tumors of epithelial tissue such as, for example, skin. For example, hedgehog antagonists can be used in the subject methods as part of the treatment of human cancers, particularly basal cell nevus syndrome (BCNS) and other human cancers, adenocarcinoma, sarcomas, and the like.
[0235]
In a preferred embodiment, the subject method is used as part of a prophylactic regime for the treatment (or prevention) of basal cell carcinoma. A likely characteristic of basal cell carcinomas caused by ptc mutations is a dysregulation of the hedgehog signaling pathway. It has been reported that human ptc mRNA is consistently overexpressed in familial and sporadic BCC (basal cell carcinoma) tumors as determined by in situ hybridization. Since ptc exhibits negative autoregulation, mutations that inactivate ptc may be causing overexpression of the ptc mutant. Previous studies have shown that overexpression of hedgehog protein can cause tumorigenesis. Studies in transgenic mice overexpressing Shh in skin that developed BCNS features including multiple BCC-like skin growths across the skin surface only a few days after skin development have shown that Sonic hedgehog has been shown to develop tumors in mice. It has been suggested that (Shh) plays a role. Previous studies have also described mutations in the Shh human gene obtained from BCC, suggesting that Shh or other Hhh genes in humans may act as dominant tumor-inducing genes in humans. Sporadic ptc mutations have been observed in BCCs obtained from normal individuals, some of which were UV-tagged mutations. In one recent study performed on sporadic BCCs, five UV-tagged mutations with altered CT or CCTT were found in 15 tumors, including ptc mutations. A recent analysis of sporadic ptc mutations in BCC and neuroectodermal tumors shows that one of the three ptc mutations found in BCC has an altered CT. (Eg, Goodrich et al. (1997)Science227: 1109-13; Xie et al. (1997)Cancer Res57: 2369-72; Oro et al. (1997).Science276: 817-21; Xie et al. (1997).Genes Chromosomes Cancer18: 305-9; Stone et al. (1996)Nature384: 129-34; and Johnson et al. (1996).Science272: 1668-71).
[0236]
The subject methods can also be used to treat patients with BCNS, eg, to prevent BCC or ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity, or other effects of a disease that may result from hypersmoothened function. Basal cell nevus syndrome is a rare autosomal dominant disease characterized by multiple BCCs that appear early in life. BCNS patients are susceptible to developing these tumors and appear in large quantities, mainly in sun-exposed skin areas, between the ages of 10 and 20 years. The disease also causes a number of developmental abnormalities, including degeneration of the ribs, head and face, sometimes polydactyly, syndactyly, and spina bifida. Also, these patients develop many tumor types in addition to BCC, including ovarian and cardiac fibromas, cutaneous and jaw cysts, medulloblastomas and meningiomas in the central nervous system. The subject methods can be used for the prevention and treatment of such tumor types in BCNS and non-BCNS patients. Studies have shown that BCNS patients have both genetic and sporadic mutations in the ptc gene, indicating that these mutants are the underlying cause of these diseases. It suggests.
[0237]
In another aspect, the invention provides a pharmaceutical preparation that includes a hedgehog antagonist. The hedgehog antagonist used in the subject method can be prepared using a biologically acceptable medium [water, buffered saline, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.) or a suitable mixture thereof] It can be conveniently formulated for administration. The optimum concentration of the active ingredient in the chosen medium can be determined empirically according to methods known to medicinal chemists. As used herein, "biologically acceptable medium" includes any and all solvents, dispersion media, and the like which are suitable for the route of administration of the pharmaceutical preparation. The use of such media for pharmaceutically active substances is well known in the art. It is contemplated that the subject compounds will be used in the pharmaceutical preparations of the present invention unless the conventional vehicle or agent is incompatible with the activity of the hedgehog antagonist. Formulations containing suitable excipients and other proteins are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985)]. These excipients include injectable "deposit formulations".
[0238]
The pharmaceutical preparations of the present invention may also include veterinary compositions, such as pharmaceutical preparations of hedgehog antagonists suitable for veterinary use, for example, in the treatment of pets such as livestock and dogs.
[0239]
The method of introduction can be provided using a refillable or biodegradable device. In recent years, various slow-release polymer devices have been developed, and controlled administration of drugs, such as proteinaceous biopharmaceuticals, has been tried in vivo. A variety of biocompatible polymers (such as hydrogels), including both biodegradable and non-degradable polymers, can be used to form implants that sustainably release hedgehog antagonists at specific target sites. .
[0240]
The preparations of the present invention can be administered orally, parenterally, topically, or rectally. The preparation is of course administered in a form suitable for each administration route. Examples include injection, inhalation administration in the form of tablets, capsules, etc .; injection, infusion or inhalation administration by eye drops, ointments, suppositories, controlled release patches, etc .; topical administration by lotion or ointment; and rectal administration by suppositories. Oral and topical administration are preferred.
[0241]
The terms “parenteral administration” and “parenteral administration” as used herein mean a method of administration other than enteral and topical administration, usually administration by injection. Examples include intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subepidermal, intraarticular, intracapsular, subarachnoid, intrathecal And intra- and intrasternal injections and infusions.
[0242]
As used herein, "systemic administration", "systemic administration", "peripheral administration", and "peripheral administration" do not mean direct administration to the central nervous system, but rather a compound, drug or other substance administered to the patient's system. Administration that is administered as such and thus is affected by metabolism or other similar methods (eg, subcutaneous administration).
[0243]
These compounds can be administered to humans and other animals for therapeutic purposes by any suitable route of administration. Examples include oral, nasal administration in the form of a spray, rectal, vaginal, parenteral, intracisternal and topical administration in the form of powders, ointments or drops, and buccal and sublingual administration.
[0244]
Regardless of the route of administration chosen, the compounds of the invention and / or pharmaceutical compositions of the invention, which can be used in suitable hydrated forms, can be prepared by conventional methods as described below or known to those skilled in the art. It can be formulated into an acceptable dosage form.
[0245]
The actual dosage level of the active ingredient in the pharmaceutical compositions of the present invention will be that amount of the active ingredient that is effective to achieve the desired therapeutic response for the particular patient, composition and method of administration without causing toxicity to the patient. Can be changed to obtain
[0246]
The selected dosage level was used with the activity of the particular compound, ester, salt or amide thereof, route of administration, time of administration, excretion rate of the particular compound, treatment time, the particular hedgehog antagonist of the invention. It depends on various factors, such as other drugs, compounds and / or substances, the age, sex, weight, physical condition, health and medical history of the patient to be treated, and other factors known in the medical arts.
[0247]
A physician or veterinarian having ordinary skill in the art can readily determine and prescribe the effective amount of the pharmaceutical composition required. For example, a physician or veterinarian could start using doses of a compound of the present invention in a pharmaceutical composition that is below the required level and gradually increase the dosage until the desired effect can be achieved.
[0248]
In general, a preferred daily dose is the lowest amount of the compound that is effective to produce a therapeutic effect. Such an effective amount will generally depend upon the factors described above. Generally, the amount of intravenous, intracerebral and subcutaneous administration of a compound of the present invention to a patient will be about 0.0001-100 mg / kg (body weight) / day.
[0249]
If desired, an effective daily dose of the active compound may be given in two, three, four, five, six or more sub-doses at appropriate intervals throughout the day, optionally in a dosage form. Can be administered separately).
[0250]
The term “treatment” as used herein is intended to include prophylaxis, therapy and therapy.
[0251]
Subjects undergoing this treatment include any animal in need of treatment, including primates (especially humans) and other mammals (horses, cows, pigs and sheep), poultry and pets.
[0252]
The compounds of the present invention can be administered neat or as a mixture with a pharmaceutically acceptable and / or sterile carrier, and can be administered in combination with antibacterial agents such as penicillin, cephalosporins, aminoglycosides and glycopeptides. it can. Combination therapy thus includes the sequential, simultaneous and separate administration of the active compounds, with the subsequent administration taking place before the therapeutic effects of the first administration have completely ceased.
[0253]
V. Pharmaceutical composition
While it is possible for a compound of the present invention to be administered alone, it is preferable to administer it as a pharmaceutical formulation (composition). The hedgehog antagonists according to the invention can be formulated for administration in any convenient way for use in human or veterinary medicine. In certain embodiments, the compound included in the pharmaceutical formulation may be active per se or may be, for example, a prodrug that can be converted to the active compound in a physiological environment.
Accordingly, another aspect of the invention is the formulation of a therapeutically effective amount of one or more of the foregoing compounds with one or more pharmaceutically acceptable carriers (additives) and / or diluents. A pharmaceutically acceptable composition is provided. As described in detail below, the pharmaceutical composition of the present invention comprises: (1) a form adapted for oral administration, such as a drug (aqueous or non-aqueous solution or suspension), a tablet, Boluses, powders, granules, pastes for application to the tongue, (2) forms suitable for parenteral administration, for example by subcutaneous, intramuscular or intravenous injection, for example sterile solutions or suspensions; (3) topical application , For example, creams, ointments or sprays applied to the skin, (4) administered in solid or liquid form, including also for vaginal or rectal administration, for example pessaries, creams or foams Can be specifically prescribed for: However, in certain embodiments, the subject compounds can simply be dissolved or suspended in sterile water. In certain embodiments, the pharmaceutical formulation is not pyrogenic. That is, the body temperature of the patient is not increased.
[0254]
The phrase "pharmaceutically effective amount", as used herein, refers to a pathway that overcomes ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened hyperactivity at least in a subpopulation of animal cells, and thus in a treated cell. Compounds of the present invention that are effective to produce any desired therapeutic effect by blocking, with the biological consequences of the above at a reasonable benefit / risk ratio applicable to any medical treatment. Such an amount is intended to include the compound, material, or composition that includes it.
[0255]
The phrase "pharmaceutically acceptable" is intended to be used in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation, allergic reactions or other problems or complications within sound medical judgment. Used to refer to compounds, materials, compositions and / or dosage forms that are suitable and suitable at a reasonable benefit / risk ratio.
[0256]
The phrase "pharmaceutically acceptable carrier" as used herein refers to a liquid or solid filling involved in carrying or transporting a subject antagonist from one organ or part of the body to another. A pharmaceutically acceptable material, composition or vehicle such as an agent, diluent, excipient, solvent or encapsulating material. Each carrier must be "acceptable" in the sense that it is compatible with the other ingredients of the formulation and is not harmful to the patient. Some examples of materials that can be used as pharmaceutically acceptable carriers include (1) sugars such as lactose, glucose and saccharose, (2) starches such as corn starch and potato starch, (3) cellulose and derivatives thereof such as sodium Carboxymethylcellulose, ethylcellulose and cellulose acetate, (4) powdered tragacanth, (5) malt, (6) gelatin, (7) talc, (8) excipients such as cocoa butter and suppository waxes, (9) oils, For example, peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil, (10) glycols such as propylene glycol, (11) polyols such as glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol, (12) esters, An example Ethyl oleate and ethyl laurate, (13) agar, (14) buffers such as magnesium and aluminum hydroxide, (15) alginic acid, (16) water without pyrogens, (17) isotonicity Salt water, (18) Ringer's solution, (19) ethyl alcohol, (20) phosphate buffer solution and (21) other non-toxic acceptable substances used in pharmaceutical formulations are included.
[0257]
As mentioned above, certain embodiments of the hedgehog antagonists of the present invention contain a basic functional group such as an amino or alkylamino, thus forming a pharmaceutically acceptable salt with a pharmaceutically acceptable acid. can do. In this regard, the term "pharmaceutically acceptable salts" refers to the relatively non-toxic, addition salts of compounds of the present invention with inorganic and organic acids. These salts may be used to react the purified compound of the invention in situ during the final isolation and purification of the compound of the invention, or separately with the appropriate organic or inorganic acid, in free base form, and then It can be prepared by isolating the salt formed. Representative salts include hydrobromide, hydrochloride, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acetate, valerate, oleate, palmitate, stearate, laurate Benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, naphthalate, mesylate, glucoheptonate, lactobionate, lauryl sulfonate (See, eg, “Pharmaceutical Salts” by Bergi et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66: 1-19).
[0258]
Pharmaceutically acceptable salts of the subject compounds include, for example, the well-known non-toxic salts or quaternary ammonium salts of the compound from a non-toxic organic or inorganic acid. For example, such known non-toxic salts include those derived from inorganic acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, sulfamic acid, phosphoric acid, nitric acid, and the like, acetic acid, propionic acid, succinic acid, glycol Acid, stearic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, palmitic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, phenylacetic acid, glutamic acid, benzoic acid, salicylic acid, sulfanilic acid, 2-acetoxybenzoic acid, fumaric acid, Salts prepared from organic acids such as toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, ethanedisulfonic acid, oxalic acid, isethionic acid and the like are included.
[0259]
In other cases, the compounds of the present invention may contain one or more acidic functional groups, and may thus form pharmaceutically acceptable salts with pharmaceutically acceptable bases. In these cases, the term "pharmaceutically acceptable salts" refers to addition salts of the compounds of this invention with relatively non-toxic organic or inorganic bases. These salts may likewise be used in situ during the final isolation and purification of the compounds of the invention or in the form of the free acids in purified acid form with suitable bases, such as pharmaceutically acceptable metal cations. Can be prepared by separately reacting a hydroxide, carbonate or bicarbonate of the above with ammonia or a pharmaceutically acceptable organic primary, secondary or tertiary amine. Representative alkali or alkaline earth metal salts include the lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum salts, and the like. Representative organic amines useful for forming base addition salts include ethylamine, diethylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, piperazine, and the like (see, for example, Berge et al., Supra).
[0260]
Wetting agents, emulsifiers and lubricants, such as sodium lauryl sulfate and magnesium stearate, as well as colorants, exfoliants, coatings, sweeteners, flavors and fragrances, preservatives and antioxidants can also be present in the composition.
[0261]
Examples of pharmaceutically acceptable antioxidants include (1) water-soluble antioxidants, such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite, and (2) oil-soluble antioxidants. Such as ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), lecithin, propyl gallate, and α-tocopherol; (3) metal chelating agents such as citric acid and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like.
[0262]
The formulations of the present invention include those suitable for oral, nasal, topical (including buccal and sublingual), rectal, vaginal and / or parenteral administration. These formulations may conveniently be presented in unit dosage form and may be prepared by any of the methods well-known in the art of pharmacy. The amount of active ingredient that can be combined with the carrier materials to produce a single dosage form will vary depending upon the host treated, the particular mode of administration. The amount of active ingredient which can be combined with a carrier material to produce a single dosage form will generally be that amount of the compound which produces a therapeutic effect. Generally, from a 100% perspective, this amount will range from about 1% to about 99%, preferably from about 5% to about 70%, most preferably from about 10% to about 30%, of the active ingredient.
[0263]
The methods for preparing these formulations or compositions include the step of bringing into association the compound of the present invention with the carrier and one or more optional accessory ingredients. In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing into association a compound of the present invention with liquid carriers or finely divided solid carriers or both, and then, if necessary, shaping the product.
[0264]
Formulations of the present invention suitable for oral administration include capsules, cachets, pills, tablets, lozenges (using a flavoring base such as saccharose and acacia or tragacanth), powders, granules, or in aqueous or non-aqueous liquids. Or as an oil-in-water or water-in-oil liquid emulsion, or as an elixir or syrup, or as a pastille (using an inert base such as gelatin and glycerin, or saccharose and acacia) and ( Or) mouthwashes and the like, each containing a predetermined amount of a compound of the present invention as an active ingredient. Also, the compounds of the present invention can be administered as a bolus, electuary or paste.
[0265]
In the solid dosage forms for oral administration of the present invention (capsules, tablets, pills, dragees, powders, granules, etc.), the active ingredient is one or more pharmaceutically acceptable carriers, such as sodium citrate or dicalcium phosphate And / or any of the following: (1) fillers or bulking agents such as starch, lactose, saccharose, glucose, mannitol and / or silicic acid, (2) binders such as carboxymethylcellulose, alginate, gelatin, Polyvinylpyrrolidone, saccharose and / or acacia, (3) humectants such as glycerin, (4) disintegrants such as agar, calcium carbonate, potato or tapioca starch, alginic acid, certain silicates and sodium carbonate, (5) Dissolution retardants such as paraffin, (6) absorption enhancers such as quaternary Compounds, (7) wetting agents such as cetyl alcohol and glycerin monostearate, (8) absorbents such as kaolin and bentonite clay, (9) lubricants such as talc, calcium stearate, magnesium stearate, solid polyethylene glycol, lauryl. It is mixed with sodium sulfate and mixtures thereof, (10) coloring agent. In the case of capsules, tablets and pills, the pharmaceutical compositions may also include a buffer. Solid compositions of a similar type can be used as fillers in soft and hard gelatin capsules using such excipients as lactose or milk sugar as well as high molecular weight polyethylene glycols and the like.
[0266]
A tablet may be made by compression or moulding, with one or more accessory ingredients. Compressed tablets use binders (eg, gelatin or hydroxypropylmethylcellulose), lubricants, inert diluents, preservatives, disintegrants (eg, sodium starch glycolate or cross-linked sodium carboxymethylcellulose), surfactants or dispersants. Can be manufactured. Molded tablets may be made by molding in a suitable machine a mixture of the moistened powdered compound and an inert liquid diluent.
[0267]
Tablets and other solid dosage forms of the pharmaceutical compositions of this invention, such as dragees, capsules, pills, and granules, may be coated, if necessary, with a coating and shell, such as enteric coatings and other coatings well known in the pharmaceutical formulating art. Can be obtained or prepared. Also, they can provide a delayed or controlled release of the active ingredient using, for example, hydroxypropylmethylcellulose, other polymeric matrices, liposomes and / or microspheres in varying proportions to provide the desired release profile. It can also be formulated to give release. They can be sterilized, for example, by filtration through bacteria-retentive filters or by incorporating sterilizing agents in the form of sterile solid compositions that can be dissolved in sterile water or other sterile injectable medium immediately before use. These compositions may also optionally contain opacifying agents and may be such that they release the active ingredient only or preferentially, in some part of the gastrointestinal tract, optionally in a delayed manner. . Examples of encapsulating compositions that can be used include polymeric substances and waxes. The active ingredient can also be in micro-encapsulated form, if appropriate, with one or more of the above-mentioned excipients.
[0268]
Liquid dosage forms for oral administration of the compounds of the present invention include pharmaceutically acceptable emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups and elixirs. Liquid dosage forms may contain, in addition to the active ingredient, inert diluents commonly used in the art, such as water or other solvents, solubilizers and emulsifiers, such as ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, Benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, oils (especially cottonseed oil, groundnut oil, corn oil, germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil), glycerin, tetrahydrofurylaryl, polyethylene glycol and sorbitan And mixtures thereof.
[0269]
In addition to inert diluents, compositions for oral administration can also contain adjuvants such as wetting, emulsifying and suspending agents, sweetening, flavoring, coloring, flavoring, and preservatives.
[0270]
Suspensions can contain, in addition to the active compounds, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbite and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar and tragacanth, and mixtures thereof. Can be contained.
[0271]
Formulations of the pharmaceutical compositions of this invention for rectal or vaginal administration may be presented as a suppository, which will contain one or more compounds of the invention containing one or more compounds including, for example, cocoa butter, polyethylene glycol, suppository waxes or salicylates. Mixing with a suitable non-irritating excipient or carrier as described above, which is solid at room temperature but liquid at body temperature and thus melts in the rectum or vagina to release the active hedgehog antagonist. Can be manufactured by
[0272]
Formulations of the present invention suitable for vaginal administration also include pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or spray formulations containing a carrier as known in the art to be suitable. .
[0273]
Dosage forms for topical or transdermal administration of a compound of this invention include powders, sprays, ointments, pastes, creams, lotions, gels, solutions, patches and inhalants. The active ingredient can be mixed under sterile conditions with a pharmaceutically acceptable carrier and any preservatives, buffers or inhalants that may be required.
Ointments, pastes, creams and gels may contain, in addition to the active ingredients of the present invention, animal and vegetable fats, oils, waxes, paraffins, starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silicic acid, talc, oxidized Excipients such as zinc and mixtures thereof can be included.
Powders and sprays can contain, in addition to the compounds of the present invention, excipients such as lactose, talc, silicic acid, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder and mixtures of these substances. Sprays may also contain conventional propellants such as chlorofluorohydrocarbons and volatile unsubstituted hydrocarbons such as butane and propane.
[0274]
Transdermal patches have the added advantage of providing controlled delivery of a compound of the present invention to the skin. Such dosage forms can be made by dissolving or dispersing the hedgehog antagonist in a suitable medium. Absorption enhancers can be used to increase the flow of the hedgehog antagonist through the skin. The rate of such flow can be controlled by providing a rate controlling membrane or by dispersing the compound in a polymer matrix or gel.
Ophthalmic formulations, eye ointments, powders, solutions, and the like, are also contemplated as being within the scope of this invention.
[0275]
Pharmaceutical compositions of the present invention suitable for parenteral administration include administering one or more compounds of the present invention to one or more pharmaceutically acceptable sterile, isotonic aqueous or non-aqueous solutions, dispersions, suspensions. Solutions or emulsions, or sterile powders that can be reconstituted immediately before use into a sterile injectable solution or dispersion, which can contain an antioxidant, a buffer, a bacteriostat, or a formulation of the intended receptor. Solutes which can be made isotonic with blood or with suspending or thickening agents can be included.
[0276]
Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers that can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention include water, ethanol, polyols (glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, and the like) and suitable mixtures thereof, vegetable oils such as olive oil, olein Injectable organic esters such as ethyl acid are included. Proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersion, and by using surfactants.
[0277]
These compositions may contain adjuvants such as preserving, wetting, emulsifying, and dispersing agents. Prevention of the action of microorganisms can be ensured by the inclusion of various antibacterial and antibacterial agents, for example, parabens, chlorbutanol, phenol, sorbic acid, and the like. It may also be desirable to include isotonic agents, such as sugars, sodium chloride, and the like into the compositions. In addition, prolonged absorption of the injectable pharmaceutical form can be brought about by the inclusion of agents which delay the absorption, such as aluminum monostearate and gelatin.
[0278]
In some cases, in order to prolong the effect of the drug, it is desirable to slow the absorption of the drug from subcutaneous or intramuscular injection. This can be achieved by using a liquid suspension of crystalline or amorphous material with poor water solubility. In this case, the absorption rate of the drug will depend on its dissolution rate, which will also depend on the crystal size and morphology. Alternatively, delayed absorption of a parenterally administered drug form is accomplished by dissolving or suspending the drug in an oil vehicle.
[0279]
Injectable depot forms are made by forming microencapsule matrices of the subject compounds in biodegradable polymers such as polylactide-polyglycolide. Depending on the ratio of drug to polymer and the type of particular polymer used, the rate of drug release can be controlled. Examples of other biodegradable polymers include poly (orthoester) and poly (anhydride). Depot injectable formulations are also prepared by entrapping the drug in liposomes or microemulsions that are compatible with body tissue.
[0280]
When the compounds of the present invention are administered to humans and animals as medicaments, they may contain as pharmaceutically acceptable active ingredients, for example, 0.1-99.5% (more preferably 0.5-90%). It can be provided as a pharmaceutical composition containing it in combination with an acceptable carrier.
[0281]
Addition of the compounds of the present invention to animal feed is preferably accomplished by preparing a suitable feed premix containing the active compound in an effective amount and formulating the premix into a complete ration.
Alternatively, an intermediate concentrate or feed supplement containing the active ingredient can be incorporated into the feed. Methods for producing and administering such feed premixes and complete rations are described in the literature (eg, “Applied Animal Nutrition” (WH Freeman et al., San Francisco, 1969) or “Livestock Feed and Breeding” (OB). Books, Corvallis, Oregon, 1977)).
[0282]
In certain embodiments, a subject compound, such as compound D or a salt thereof, can be formulated in an aqueous solution, for example, for topical application. Suitable salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, tartrate, lactate, methanesulfonate, maleate or any other suitable acid of the subject compound (eg, Salts that form a pharmaceutically acceptable anion in the presence of an amine base).
[0283]
In certain embodiments, the aqueous solution comprises a pharmaceutically acceptable salt, such as a cation selected from sodium, potassium, magnesium and calcium, and an anion selected from acetate, citrate, phosphate, chloride, any other suitable ion. Or combinations thereof).
[0284]
In certain embodiments, the aqueous solution may further or alternatively include dextrose, lactose, mannitol, or other polyhydroxylated compounds such as pharmaceutically acceptable carbohydrates such as mono- or disaccharides or polyols.
[0285]
In certain embodiments, the aqueous solution can include a solute that produces a permeability of 200-400 mOsm, preferably 250-350 Osm, even more preferably 280-300 mOsm (eg, 290 mOsm).
[0286]
In certain embodiments, the pH of the solution is in the range of from 3 to 6, preferably from 3.5 to 5, and even more preferably from 4 to 4.5.
[0287]
Thus, in general, the aqueous solution will contain up to about 7% carbohydrate or up to about 6% (or about 3-6% or about 4-5%) polyol such as mannitol, lactose or dextrose, up to about 6%. About 50 mM (e.g., up to about 20 mM or about 2-20 mM or about 5-15 mM) of a salt selected from sodium acetate and sodium citrate, and about 200-400 mOsm, preferably 250-350 Osm, even more preferably Can include sufficient pharmaceutically acceptable solute to produce a permeability of 280-300 mOsm, such as sodium chloride, and in certain embodiments, the aqueous solution is substantially free of carbohydrates or polyols and substantially free of carbohydrates or polyols. It does not contain sodium acetate and sodium citrate, or both are, for example, essentially saline Or substantially free of salts such as sodium chloride, sodium acetate and sodium citrate, and consisting essentially of an aqueous solution of a carbohydrate or polyol and a salt of the subject compound. Become.
[0288]
Thus, for example, an aqueous solution of a subject compound, eg, Compound D, can include 10 mM sodium acetate in saline at pH 4.2. Alternatively, the aqueous solution can include 10 mM sodium acetate in a 5% dextrose solution, or can simply include a 5% dextrose solution.
[0289]
VI. Method and identification of active antagonists
The subject antagonists and homologs thereof can be readily prepared using cross-linking coupling techniques such as Suzuki, Stille. These coupling reactions are performed under relatively mild conditions and can tolerate a wide range of "bystand" functionality.
[0290]
a. Combination library
Libraries of compounds of the present invention, particularly variants having representative classes of various substituents, are amenable to combinatorial chemistry and other parallel synthesis methods (eg, PCT WO 94/08051). Thus, in order to identify lead compounds that can be hedgehog antagonists and to fine-tune the specificity, toxicity and / or cytotoxicity-rate profiles of the lead compounds, a large library of related compounds, such as those described above Compound diversity libraries are rapidly screened in high-throughput assays. For example, agonist activity on ptc or hedgehog or ptc using a ptc, hedgehog or smoothened versus biological activity assay, such as assays using cells with ptc deficiency, either hedgehog hyperactivity or smoothened hyperactivity. Libraries of the subject compounds can be screened for those having antagonist activity against smoothened.
[0291]
Examples of combinatorial libraries for use in the present invention include a mixture of chemically related compounds that can be screened together for desirable properties. The preparation of many related compounds in one reaction reduces and simplifies the number of screenings to be performed. Screening for appropriate physical properties can be performed by conventional methods.
[0292]
Diversity in the library can be created at different levels. For example, the substrate aryl group used in the combination reaction can provide diversity for the central aryl group (eg, for a cyclic structure), and / or can vary for other substituents.
[0293]
A variety of methods can be used to create a combinatorial library of small organic molecules, such as, for example, the subject hedgehog antagonists [eg, Blondelle et al. (1995)Trends Anal. Chem. Affymax, U.S. Patent Nos. 5,359,115 and 5,362,899; Eliman, U.S. Patent No. 5,288,514; Still et al., PCT Publication No. WO 94/08051; ArQuule, U.S. Patent. 5,736,412 and 5,712,171; Chen et al. (1994).JACS116: 2661; Kerr et al. (1993).JACS115: 252; PCT Publication Nos. WO92 / 10092, WO93 / 09668 and WO91 / 07087; and Lerner et al., PCT Publication No. WO93 / 20242]. Thus, various libraries of about 100-1,000,000 or more of the subject hedgehog antagonist diversomers can be synthesized and screened for specific activities or attributes.
[0294]
In an exemplary embodiment, a library of potential hedgehog antagonists can be synthesized using a scheme adapted to the methods described in Still et al. (PCT Publication No. WO 94/08051). For example, it is linked to the polymer bead by a hydrolysable or photodegradable group that can be located at one of the substituent positions of the candidate antagonist or synthetic intermediate. According to Still et al., The library is synthesized on a series of beads (each bead contains a set of labels that identify a particular variant on the bead). The bead library can then be "cultured" with ptc deficient, hedgehog hyperactive or smoothened hyperactive cells for which hedgehog antagonists are sought. The manifold can be released from the beads, for example, by hydrolysis.
[0295]
The structures of the compounds useful in the present invention lend themselves to easy, efficient synthesis. formulaIas well asVIThe nature of these structures, described more generally by₁, R₂, R₃And R₄Some combinations of parts make it possible. For example, these subunits can be attached to the coring by a general acylation or alkylation reaction. The majority of such reactions, including those depicted in FIGS. 11, 12, 15 and 16, are very mild and very reliable and are therefore perfectly suited for combinatorial chemistry. The easy nature of such a combinatorial approach to the generation of a library of test compounds is evident in the following exemplary scheme (P = protecting group), where the various groups of the compound according to the above formula are combined in a combinatorial manner. (Eg, using one of the methods described above). Even greater diversity, for example, by using a range of reactive functional groups in adding subunits, e.g.₁When adding a subunit, R-LC (O) Cl, PO-Ar-L-NCO, PO-Ar-L-SO₂This can be achieved by using a range such as Cl.
Embedded image

[0296]
With various modifications to the above and related pathways, various libraries of compounds to be tested for their ability to block hedgehog function can be synthesized.
[0297]
Production of exemplified compounds of the present invention
A series of compounds according to the general structure disclosed herein have been prepared and tested for biological properties (see below). Suitable core structures can be readily prepared from commercially available trans-4-hydroxy-L-proline as summarized in the following scheme.
Embedded image

[0298]
trans-4-hydroxy-L-proline methyl ester hydrochloride
Acetyl chloride (249 ml, 3.47 mol) was added dropwise to methanol (2090 mL) with stirring and cooling while keeping the temperature at 30 ° C. or lower. After complete addition, stirring was continued for a further 60 minutes before trans-4-hydroxy-L-proline (325 g, 2.48 mol) was added as a solid. The reaction mixture was heated at reflux for 24 hours, cooled to 0 ° C., and t-butyl methyl ether (TBME, 5220 mL) was added slowly over 30 minutes. The precipitated solid was collected on a filter and washed with ice-cold TBME (2 × 1 L). The product was vacuum dried overnight at 40 ° C. to give 424 g of the desired ester.
[0299]
trans-1- (t-butoxycarbonyl) -4-hydroxy-L-proline methyl ester
The product ester of the above reaction (423 g, 2.32 mol) was suspended in dichloromethane (6.5 L). With stirring and cooling, triethylamine (1019 mL, 7.32 mol) was added over 30 minutes, then di-tert-butyl bicarbonate (588 g, 2.70 mol) was added over 30 minutes to bring the internal temperature to 15%. C. or less. After complete conversion, the mixture is stirred at room temperature for 3 hours, then 1 M aqueous citric acid solution (650 mL) is added. The mixture was stirred for 1 hour, the organic phase was separated and 1M KHCO₃Wash with aqueous solution (920 mL), water (2 × 1 L) and MgSO 4 in the presence of activated carbon (15 g)₄And dried. The solvent was removed in vacuo and the residue was purified by flash chromatography (2 x 1800 g silica gel, 3: 1 to 2: 1 hexane: EtOAc eluent) to give the desired carbamate (489 g).
[0300]
(4R) -1- (t-butoxycarbonyl) -4-[(methylsulfonyl) oxy] -L-proline methyl ester
The above carbamate (478 g, 1.95 mol), N-diisopropylethylamine (DIPEA, 373 mL, 2.15 mol) and 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 23.8 g, 0.195 mol) were added to dichloromethane (7650 mL). Dissolved. A solution of methanesulfonyl chloride (167 mL, 2.15 mol) dissolved in dichloromethane (950 mL) was added dropwise over 50 minutes while cooling and keeping the temperature below 10 ° C. The mixture was stirred at −6 ° C. for 2 hours, water (750 mL) was added, the mixture was stirred for more than 15 minutes, and the layers were separated. The organic phase is 1M KHCO₃Aqueous solution (950 mL), washed with 1M citric acid aqueous solution (2 × 950 mL) and water (750 mL),₄And dried. The solvent was removed under vacuum and the residue was crystallized from hexane (1.9 L). The crystalline mesylate was collected on a filter, washed with hexane (2 × 500 mL) and dried in vacuo at 40 ° C. to give 624 g of the expected compound.
[0301]
(4S) -1- (t-butoxycarbonyl) -4-azido-L-proline methyl ester
A solution prepared by dissolving the above mesylate (624 g, 1.93 mol) and sodium azide (716 g, 11.01 mol) in dimethylformamide (DMF, 3120 mL) was stirred at 60 ° C. for 22 hours, and the solution was cooled to 0 ° C. And water (3 L) was added over 40 minutes to keep the temperature below 20 ° C., and EtOAc (3 L) was added. The mixture was stirred for about 20 minutes, the layers were separated and the aqueous phase was extracted with EtOAc (3L). Wash the combined organic phases with water (750 mL), 0.1 M aqueous HCl (400 mL), then water (750 mL), then MgSO 4₄And dried. The solvent was removed under vacuum and the residue was purified by flash chromatography (2 × 1800 g silica gel, 2: 1 hexane: EtOAc) to give the desired azide (516 g).
[0302]
(4S) -4-azido-L-proline methyl ester hydrochloride
A saturated solution of HCl in dioxane (1940 mL) was prepared at 10-16 ° C., and a solution of azide (523 g, 1.94 mol) in dioxane (480 mL) was stirred for 30 minutes and cooled to 25 ° C. The solution was added dropwise while maintaining the temperature at not more than ° C. After complete dissolution, the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours, TBME (2 L) was added and the resulting mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour. The precipitated solid was collected on a filter paper, washed with TBME (4 × 500 mL) and dried under vacuum at 40 ° C. to give the desired hydrochloride (348 g).
[0303]
From the above core structures or from related compounds or derivatives, the subject compounds of the present invention can be prepared as shown in the scheme below.
Reaction formula 1: Solution phase route 1
Embedded image

[0304]
Reaction formula 2: Solution phase route 2
Embedded image

[0305]
Reaction formula 3: Solid phase route 3
Embedded image

[0306]
These routes, along with the exemplary solid phase route, result in a wide range of compounds with different substituents and stereochemical relationships. One skilled in the art will recognize that the use of piperazine in the above scheme is merely exemplary, and that other amines can also be used to obtain a further variety of subject compounds. Similarly, the use of BOC, FMOC and other protecting groups is merely exemplary, and one of ordinary skill in the art would be able to select other suitable protecting groups for the functional group without departing from the scope and spirit of the invention, and then Reaction conditions can be easily selected. Further, the above scheme typically starts with a trans-hydroxy-L-proline compound, but all isomers of this compound are commercially available, including cis / trans and / or D / L compounds. Thus, a wide range of stereochemically pure intermediates and subject compounds can be obtained. The trans-aminoproline core structure allows the formation of the intermediate cis-bromoproline from the trans-hydroxyproline starting material (e.g., the formation of the triflate or mesylate of the hydroxyl and the formation of the sulfonic acid ester, as is well known in the art). (Substitution with bromide ion), followed by a second substitution with azide to preserve the trans-stereochemical relationship purely. Alternatively, diastereomeric mixtures can also be prepared as in Scheme 3 above, followed by optional isomer separation.
[0307]
b. Screening assay
A variety of assays can be used to determine if a compound has the ability to surrogate ptc function or antagonize smooth or hedgehog function, but many can be processed in a high-throughput format. it can. In many drug screening programs that test libraries of compounds and natural extracts, it is desirable to use high-throughput assays to maximize the number of compounds that survive during a given time period. Thus, libraries of synthetic and natural products can be sampled for other compounds that are hedgehog antagonists.
[0308]
In addition to cell-free assays, test compounds can be tested in cell-based assays. In one embodiment, contacting a cell with a ptc deficiency, hedgehog hyperactivity or smoothened hyperfunction phenotype with a test agent of interest, e.g., in an assay that evaluates for a cell growth inhibitor in the presence of the test agent. Can be.
[0309]
Many gene products are implicated in patched-mediated signal transduction (patched, transcription factors of cubius interruptus (ci), fused (fu), a serine / threonine kinase, and gene products of costal-2, smoothened and suppressor of fused). ing.
[0310]
Induction of cells by hedgehog proteins drives a series of events involved in activation and inhibition of downstream effectors, which in some cases leads to detectable changes in gene transcription or translation. Potential transcription targets for hedgehog-mediated signaling include patched genes (Hidalgo and Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Mango et al., 1996) and vertebrate homologues of the Drosophila cubitus interruptus gene, GLI gene (Hui et al.). (1994) Dev Biol 162: 402-413). Patched gene expression has been shown to induce Shh-responsive limb buds and neural plate cells (Marigo et al. (1996) PNAS 93: 9346-51; Marigo et al. (1996) Development 122: 1225-1233). The Gli gene encodes a putative transcription factor with a zinc finger DNA binding region (Orenic et al. (1990) Genes & Dev4: 1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10: 634-642). It has been reported that transcription of the Gli gene is up-regulated in response to hedgehog in limb buds, while transcription of the Gli3 gene is down-regulated in response to hedgehog induction (Marigo et al. (1996) Development 122: 1225-1233). Selecting transcriptional regulatory sequences that cause up-regulation and down-regulation of genes responsive to hedgehog signaling from such target genes (eg, patched or Gli genes) and operably linking such promoters to a reporter gene This allows the creation of transcription-based assays that are sensitive to the ability of specific test compounds to alter the hedgehog-mediated signaling pathway. Thus, expression of the reporter gene provides a useful screening tool for the development of compounds that act as hedgehog antagonists.
[0311]
The reporter gene-based assays of the present invention measure the last step in the above series of events, such as transcriptional regulation. Therefore, in the practice of one embodiment of the assay, the reporter gene construct is placed in the target cell to obtain ptc function deficiency, hedgehog hyperactivity, generation of a detection signal dependent on smooth hyperfunction, or stimulation of SHH itself. insert. The amount of transcription from the reporter gene can be measured using a method known to those skilled in the art. For example, mRNA expression from a reporter gene can be detected using ribonuclease protection or RNA-based PCR, or the protein product of the reporter gene can be identified by characteristic staining or an intrinsic biological activity. The amount of expression from the reporter gene is then compared to either the amount expressed in the same cell in the absence of the test compound, or the amount transcribed in cells that are substantially identical but lack the target receptor protein. . A statistical or significant decrease in the amount of transcript indicates that the test compound elicited a somewhat normal ptc signal (or antagonized a hyperactive hedgehog or smoothened signal), eg, if the test compound was a potential hedgehog antagonist It means that
[0312]
Example
Because the invention will now be described in general terms, the invention will be more readily understood by reference to the following examples, which are included for purposes of illustration of certain aspects and embodiments only, and are not limiting. Will be appreciated.
[0313]
Synthesis of exemplary deterrents
N1-[(3R, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolyl] -N1- (4-methoxybenzyl) ) -3,3-Dimethylbutanamide, “trans-aminoproline”
Embedded image

[0314]
1- (t-butyl) 2-methyl (2S, 4S) -4-bromotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (4)
(2S, 4R) -4-Hydroxytetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylic acid 1- (t-butyl) 2-methyl (3) (2.0 g, 8.15 mmol) was weighed into an oven-dried flask. And dried azeotropically using toluene. Dichloromethane (16 ml) and carbon tetrabromide (10.81 g, 8.15 mmol) were added, the solution was stirred, cooled to 0 ° C. and treated with triphenylphosphine (8.5 g, 32.41 mmol). . The mixture was stirred at 0 ° C. for 5 hours, then methanol (1.8 mL) was added and stirring continued at room temperature overnight. The mixture was diluted with diethyl ether (80 mL) and the resulting suspension was filtered and washed with diethyl ether (30 mL). The solvents are combined, evaporated under reduced pressure and the crude product is purified by column chromatography on silica gel with hexane / ethyl acetate (19: 1 to 4: 1, v / v) as eluent to give the title bromide (4). (1.0 g, 40%) was obtained as a colorless oil.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.41 and 1.46 (2xs, 9H, rotamer); 2.38-2.46 (m, 1H); 2.75-2.87 (m, 1H); 3.67-3.74. (M, 1H); 3.76 (s, 3H); 3.96-4.07 (m, 1H); 4.24-4.42 (m, 2H)
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 210 (100)
[0315]
1- (t-butyl) 2-methyl (2S, 4R) -4-azidotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (5)
Sodium azide (0.90 g, 13.84 mmol) and 1- (t-butyl) 2-methyl (4) (2S, 4S) -4-bromotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (1.0 g) , 3.24 mmol) in anhydrous dimethylformamide (32 mL) was heated under a nitrogen atmosphere for 64 hours. The mixture was cooled to room temperature, poured into ice-cold water and extracted with ethyl acetate. The organic extracts are combined, washed with water, washed with brine, dried (MgSO₄) And evaporated under reduced pressure. The crude product was purified by silica gel column chromatography using hexane / ethyl acetate (3: 1 to 1: 1, v / v) as eluent to give the title azide (5) (0.88 g, 93%) as a colorless oil Obtained as a product.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.41 and 1.46 (2xs, 9H, rotamer); 2.13-2.20 (m, 1H); 2.27-1.38 (m, 1H); 3.45-3.49. And 3.57-3.60 (2xm, 1H, rotamer); 3.68-3.73 (m, 1H); 3.74-3.75 (2xm, 3H, rotamer); 4.15-4. 23 (m, 1H); 4.30-4.35 and 4.39-4.43 (2xm, 1H, rotamer).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 171 [(M + H)⁺-C₅H₉O₂] (100)
[0316]
(2S, 4R) -4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylic acid 1- (t-butyl) 2-methyl chloride (6)
1- (t-butyl) 2-methyl (5) (2S, 4R) -4-azidotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (0.81 g, 3.0 mmol) was added to 2% v / v hydrochloric acid. Palladium charcoal (10%, 0.5 g) was added to a solution obtained by dissolving in an ethanol solution (8 mL). The reaction mixture was vacuumed and purged with nitrogen (3 times), then placed under a hydrogen atmosphere and stirred vigorously at room temperature overnight. The mixture was filtered through a pad of celite and evaporated under reduced pressure to a crude product. This was triturated with diethyl ether at 0 ° C., the resulting slurry was filtered, washed with ice-cold diethyl ether and dried in vacuo. The title salt (6) was obtained in quantitative yield.
δ_H(360MHz, CD₃OD): 1.46 and 1.51 (2xs, 9H, rotamer); 2.35-2.47 (m, 2H); 3.50-3.55 (m, 1H); 3.74-3. 86 [m, 4H, {including 3.79 and 3.80 (2xm, 3H, rotamer)}]; 3.89-3.95 (m, 1H) and 4.46-4.50 (m, 1H) )
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 210 (100)
[0317]
1- (t-butyl) 2-methyl (2S, 4R) -4-[(3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (7)
(2S, 4R) -4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylic acid 1- (t-butyl) 2-methyl chloride (6) (0.83 g, 2.96 mmol) and 3-methoxybenzaldehyde (0.38 g, 2.8 mmol) in trimethyl orthoformate (8 mL) was stirred at room temperature for 45 minutes. The solution was treated slowly with sodium cyanoborohydride (0.28 g, 4.46 mmol) and the course of the reaction was monitored by TLC analysis. When complete (〜1.5 hours), the reaction was quenched with saturated aqueous potassium hydrogen sulfate and extracted with dichloromethane. The pH of the aqueous phase was adjusted to 9 and back-extracted with dichloromethane. The combined organic extracts were dried (MgSO 4₄), Evaporated under reduced pressure to give the title amine (7) in quantitative yield.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.40 and 1.45 (2xs, 9H, rotamer); 2.07-2.19 (m, 2H); 3.18-3.23 and 3.32-3.36 (2xm, 1H). 3.43-3.53 (m, 1H); 3.70-3.74 [m, 4H, {including 3.72 and 3.73 (2xm, 3H, rotamer)]]; 3.81 ( s, 3H); 4.32-4.36 and 4.40-4.44 (2xm, 1H); 6.79-6.81 (m, 1H); 6.87-6.89 (m, 2H). ) And 7.24 (t, 1H)
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 265 [(M + H)⁺-C₅H₉O₂] (100)
[0318]
(2S, 4R) -4-[(3,3-Dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate 1- (t-butyl) 2-methyl (8)
(2S, 4R) -4-[(3-Methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylic acid 1- (t-butyl) 2-methyl (7) (0.3 g, 0.82 mmol) ) And N, N-diisopropylethylamine (0.106 g, 0.82 mmol) in anhydrous dichloromethane (0.8 mL) were stirred at room temperature under a nitrogen atmosphere. The solution was treated dropwise with t-butylacetyl chloride (0.133 g, 0.99 mmol) and stirred overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure and the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane-ethyl acetate, 2: 1, v / v) to give the title amide (8) (1.0 g, 40%) as a colorless oil Given as a thing.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.01 and 1.05 (2xs, 9H, rotamer); 1.37 and 1.41 (2xs, 9H, rotamer); 1.87-2.56 [m, 4H, (2.16 (s 3.17-3.35 (m, 1H); 3.62-3.85 [m, 7H, $ 3.70 and 3.79 (2xs, 6H)]] 4.21-4.24 and 4.28-4.35 (2xm, 1H, rotamer); 4.40-4.58 (m, 2H); 4.73-4.95 and 5.03-5. .21 (2 × m, 1H, rotamer); 6.54-6.88 (m, 3H) and 7.19-7.31 (m, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 363 (100)
[0319]
2,2,2-trifluoroacetic acid (2S, 4R) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxyanilino)]-2- (methoxycarbonyl) tetrahydro-1H-2-pyrrolium (9a )
(2S, 4R) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate 1- (t-butyl) 2-methyl (8) (0 (0.01 g, 21.6 μmol) is added to a 30% dichloromethane (0.5 mL) trifluoroacetate solution at room temperature and stirred for 30 minutes. The solution was evaporated to dryness under reduced pressure to give the title pyrrolium salt (9a) in quantitative yield.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.05 (s, 9H); 2.38-2.57 (m, 4H); 3.59-3.68 (m, 2H); 3.75 (s, 3H); 3.79 ( 4.09-4.15 (m, 1H); 4.52-4.63 (m, 2H); 4.78-4.94 (m, 1H); 6.66 (s, 1H); 6.70 (d, 1H); 6.86-6.88 (dd, 1H) and 7.31 (t, 1H).
[0320]
(2S, 4R) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Methyl carboxylate (10)
(2S, 4R) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate 1- (t-butyl) 2-methyl (8) (0 .15 g, 0.32 mmol) was added to a 30% dichloromethane solution of trifluoroacetic acid (3 mL) at room temperature. The mixture was stirred for 30 minutes and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was partitioned between dichloromethane and saturated aqueous potassium carbonate and shaken vigorously for 5 minutes. The organic phase is separated, dried (MgSO₄) And evaporate under reduced pressure to give 140 mg of crude methyl (2S, 4R) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) 3-methoxyanilino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate (9b). Obtained. This was used for the next reaction without further purification.
A solution of the above prepared crude amine (9b) (140 mg), piperonal (74 mg, 0.49 mmol) and glacial acetic acid (2 drops) in 1,2-dichloroethane (0.5 mL) was added at room temperature. Stir for 30 minutes. 95% sodium cyanoborohydride (32 mg, 0.48 mmol) was added in small portions and stirring was continued for 1 hour. The reaction was quenched with saturated aqueous sodium bicarbonate (2 mL), extracted with dichloromethane, dried (MgSO 4).₄) And evaporated under reduced pressure. The residue was purified by column chromatography on silica gel eluting with dichloromethane-ethyl acetate (90:10 to 75:25) to give the title pyrrole (10) (115 mg, 71.4%) as a pale yellow oil. Was.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 0.98-1.08 (m, 9H); 2.09-2.59 [m, 4H, including in 2.13 (s, 2H)]]; 2.96-3.07 (m 3.47-3.85 (m, 11H); 4.46-4.63 (m, 1H); 4.83-4.94 (m, 1H); 5.92-5.95. (M, 2H); 6.63-6.89 (m, 6H) and 7.15-7.34 (m, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 497 [(M + H)⁺] (100)
[0321]
(2S, 4R) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Carboxylic acid (11)
(2S, 4R) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Lithium hydroxide monohydrate (17 mg, 0.405 mmol) was added to a solution of methyl carboxylate (10) (100 mg, 0.20 mmol) dissolved in a 66% v / v methanol aqueous solution (1.0 mL). Was added. The mixture was stirred at room temperature overnight, then the solvent was removed under reduced pressure and the residue was partitioned between dichloromethane (1.0 mL) and water (1.0 mL). The aqueous phase was acidified with 1.0 M aqueous citric acid and the two phases were shaken vigorously at room temperature for 10 minutes. The phases were separated and the aqueous phase was back-extracted with dichloromethane. The combined dichloromethane extracts are dried (MgSO 4).₄), Evaporated under reduced pressure to give the title acid (11) (70 mg, 72%) as an off-white solid.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.00 and 1.03 (2xm, 9H, rotamer); 2.17-2.39 (m, 3H); 2.62-2.71 (m, 1H); 3.28-3.34. (M, 1H); 3.47-3.56 (m, 1H); 3.76 (m, 3H); 3.96-4.13 (m, 1H); 4.21-4.26 (m 4.36-4.58 (m, 3H); 5.93 (d, 2H); 6.62-6.90 (m, 6H) and 7.21-7.25 (m, 1H). )
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 483 [(M + H)⁺] (100)
[0322]
4-({(2S, 4R) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) -3-methoxyanilino] tetrahydro-1H- T-butyl 2-pyrrolyl @ carbonyl) -1-piperazinecarboxylate (12)
(2S, 4R) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Carboxylic acid (11) (60 mg, 0.12 mmol) and O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (48 mg, 0.15 mmol) and N , N-Diisopropylethylamine (54 μL, 0.31 mmol) in dimethylformamide (1 mL) was stirred at room temperature for 1.5 hours. The mixture was diluted with water and extracted with ethyl acetate. The aqueous phase was back-extracted with ethyl acetate and the combined extracts were dried (MgSO 4).₄) And evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was partially purified by silica gel column chromatography using 100% dichloromethane, dichloromethane / ethyl acetate (4: 1, v / v) and 100% ethyl acetate as eluents and contaminated with N, N-dimethylformamide. The crude product obtained was obtained. Dichloromethane was added and the resulting solution was washed with water. The aqueous phase was back-extracted with dichloromethane and the combined organic extracts were dried (MgSO 4).₄), Evaporated under reduced pressure to give the title piperazine (12) (33.1 mg, 41%).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 651 [(M + H)⁺] (100)
[0323]
N1-[(3R, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolylyl] -N1- (3-methoxybenzyl ) -3,3-Dimethylbutanamide 2,2,2-trifluoroacetate (13a)
4-({(2S, 4R) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) -3-methoxyanilino] tetrahydro-1H- A solution obtained by dissolving t-butyl (2-pyrrolylcarbonyl) -1-piperazinecarboxylate (12) (24 mg, 36.9 μmol) in dichloromethane (0.8 mL) was treated with trifluoroacetic acid (0.1 mL, 1.3). Mmol). The mixture was stirred at room temperature and the course of the reaction was monitored by TLC analysis. Upon completion, the solvent was evaporated under reduced pressure to give the title trifluoroacetate salt (13a) in quantitative yield. This salt was used for the next experiment without further purification.
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 551 [(M + H)⁺] (100)
[0324]
N1-[(3R, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-2-pyrrolyl] -N1- (3-methoxybenzyl ) -3,3-Dimethylbutanamide (13b)
26 mg of crude N1-[(3R, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolyl] -N1- ( (3-methoxybenzyl) -3,3-dimethylbutanamide A two-phase mixture of dichloromethane (0.8 mL) containing 2,2,2-trifluoroacetate (13a) and water (0.8 mL) is stirred vigorously. The mixture was treated dropwise with a 2.0 M aqueous sodium hydroxide solution until the pH of the aqueous phase was adjusted to 12. The phases were separated and the aqueous phase was extracted with dichloromethane (2 × 1 mL). The organic extracts are combined, dried (MgSO₄), Evaporated under reduced pressure to give the title piperazine (13b) (12.7 mg, 59%).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 551 [(M + H)⁺] (100)
[0325]
N1-[(3S, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolyl] -N1- (4-methoxybenzyl) ) -3,3-Dimethylbutanamide, “cis-aminoproline”
Embedded image

[0326]
(2S, 4S) -4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylic acid 1- (t-butyl) 2-methyl chloride (16)
Palladium charcoal (10%, 0.25 g) and (2S, 4S) -4-azidotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate 1- (t-butyl) 2-methyl (15) (1.00 g, 3 (0.7 mmol) in 2% v / v ethanolic hydrochloric acid solution (10 mL) was stirred vigorously at room temperature under a hydrogen atmosphere (1 atm). After stirring overnight, the mixture was filtered through a pad of Celite® and washed well with ethanol. The filtrate was evaporated under reduced pressure and the residue was triturated at 0 ° C. with t-butyl methyl ether. The resulting slurry was filtered, washed with ice-cold t-butyl methyl ether and dried in vacuo to give the title hydrochloride salt (16) (0.74 g, 71%) as a white solid.
δ_H(360 MHz, D₂O): 1.21 and 1.26 (2xs, 9H, rotamer); 1.85-2.03 (m, 1H); 2.52-2.65 (m, 1H); 3.29-3. 48 (m, 1H); 3.58-3.83 (m, 5H) and 4.14-4.34 (m, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 189 (100)
[0327]
1- (t-butyl) 2-methyl (2S, 4S) -4-[(3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (17)
(2S, 4S) -4-ammoniotetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylic acid 1- (t-butyl) 2-methyl chloride (16) (3.00 g, 10.70 mmol) and 3-methoxybenzaldehyde (1.30 mL, 10.7 mmol) in trimethyl orthoformate (8 mL) was stirred at room temperature for 45 minutes. To this solution was added sodium triacetoxyborohydride (2.26 g, 10.70 mmol) in small portions over 30 minutes and the course of the reaction was monitored by TLC analysis. Upon completion (about 30 minutes), the reaction was quenched with saturated aqueous sodium bicarbonate (15 mL) and extracted with ethyl acetate (15 mL). The organic extract was extracted with saturated aqueous sodium bicarbonate (2 × 15 mL), dried (MgSO 4)₄) And evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica gel column chromatography using 100% dichloromethane and then 100% ethyl acetate as eluent to give the title amine (17) (2.48 g, 64%) as a yellow oil.
[0328]
(2S, 4S) -4-[(3,3-Dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] 1- (t-butyl) 2-methyl tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate (18)
1- (t-butyl) 2-methyl (2S, 4S) -4-[(3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-1,2-pyrroledicarboxylate (17) (1.37 g, 3.76 mmol) ) And triethylamine (0.63 mL, 4.52 mmol) were dissolved in anhydrous dichloromethane (14 mL) and the stirred solution was treated dropwise with t-butylacetyl chloride (0.53 mL, 3.82 mmol). After stirring at room temperature overnight, the mixture was diluted with dichloromethane (50 mL) and washed with 1.0 M aqueous citric acid (2 × 50 mL). The phases were separated, the aqueous phase was back-extracted with dichloromethane (25 mL), the combined organic phases were washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and dried (MgSO 4).₄) And evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane / ethyl acetate, 2: 1, v / v) to give the title amine (18) (1.5 g, 86%) as a pale yellow oil.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.00 and 1.06 (2xs, 9H, rotamer); 1.38 and 1.42 (2xs, 9H, rotamer); 1.81-1.93 (m, 1H); 2.15 (s) 2.30-2.51 (m, 1H); 3.18-3.25 (m, 1H); 3.62-3.85 [m, 4H, ｛3.69 (s, 3H) )]); 3.78 (m, 3H); 4.15-4.25 (m, 1H); 4.45-4.61 (m, 2H); 5.10-5.23 (m 6.6-6.82 (m, 3H) and 7.13-7.31 (m, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 363 (100)
[0329]
2,2,2-trifluoroacetic acid (2S, 4S) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxyanilino)]-2- (methoxycarbonyl) tetrahydro-1H-2-pyrrolium (19a )
(2S, 4S) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate 1- (t-butyl) 2-methyl (18) (524 mg , 1.13 mmol) was added to a 21% v / v solution of trifluoroacetic acid in dichloromethane (6.6 mL) at room temperature. The mixture was stirred for 50 minutes and then evaporated to dryness under reduced pressure to give 0.98 g of a mixture of the title pyrrolium salt (19a) and trifluoroacetic acid.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 1.08 (s, 9H); 2.34-2.42 (m, 1H); 2.47 (s, 3H); 2.63-2.72 (m, 1H); 3.61- 3.71 (m, 2H); 3.82 (s, 3H); 3.83 (s, 3H); 4.07-4.14 (m, 1H); 4.43-4.54 (m, 4.57-4.67 (m, 2H); 6.68-6.74 (m, 2H); 6.90-6.93 (dd, 1H); and 7.34 (t, 1H). )
[0330]
(2S, 4S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Methyl carboxylate (20)
(2S, 4S) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] 1- (t-butyl) 2-methyltetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate (18) (138 mg , 0.38 mmol) was added to a 30% v / v solution of trifluoroacetic acid in dichloromethane (3 mL) at room temperature. The mixture was stirred for 30 minutes and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was partitioned between dichloromethane and saturated aqueous potassium carbonate and shaken vigorously for 5 minutes. The organic phase is separated, dried (MgSO₄) And evaporated under reduced pressure to give 140 mg of crude methyl (2S, 4R) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) 3-methoxyanilino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate (19b). Obtained. This was used for the next reaction without further purification.
Methyl (2S, 4S) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrolecarboxylate (19b) (138 mg, 0.38 mmol), piperonal ( A solution of 58 mg, 0.39 mmol) and glacial acetic acid (225 μL, 3.93 mmol) in tetrahydrofuran (2.8 mL) was stirred at room temperature for 30 minutes. 95% sodium cyanoborohydride (125 mg, 1.88 mmol) was added in small portions and stirring was continued at the same temperature for 45 minutes. After dilution with ethyl acetate (5 mL), the reaction mixture was washed with saturated aqueous sodium bicarbonate (2 × 5 mL) and brine (5 mL), dried (MgSO 4)₄) And evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography using 100% dichloromethane and dichloromethane-ethyl acetate (4: 1, v / v) as eluent to give the title pyrrole (20).
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 0.89 and 0.99 (2xs, 9H, rotamer); 1.65-1.79 (m, 1H); 1.87-2.11 [m, 3H, ｛1.94 (s, 2H). ))]; 2.21-2.66 (m, 2H); 3.04-3.15 (m, 2H); 3.56 (s, 3H); 3.67-3.74 [m 4.43-4.64 (m, 2H); 4.74-4.92 (m, 1H); 5.10-5.14 (4H ｛3.67 (s, 3H)); 5.74-5.88 (m, 2H); 6.49-6.78 (m, 6H) and 7.02-7.10 (m, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 497 [(M + H)⁺] (100)
[0331]
(2S, 4S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Carboxylic acid (21)
(2S, 4S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Lithium hydroxide monohydrate (17 mg, 0.405 mmol) was added to a solution of methyl carboxylate (20) (100 mg, 0.20 mmol) dissolved in a 6% v / v methanol aqueous solution (1.0 mL). Was added. The mixture was stirred at room temperature overnight, then the solvent was removed under reduced pressure and the residue was partitioned between dichloromethane (1.0 mL) and water (1.0 mL). The aqueous phase was acidified with 1.0 M aqueous citric acid and the two phases were shaken vigorously at room temperature for 10 minutes. The phases were separated and the aqueous phase was back-extracted with dichloromethane. The combined dichloromethane extracts are dried (MgSO 4).₄) And evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica gel column chromatography using dichloromethane / ethyl acetate (1: 1, v / v) as eluent and then dichloromethane / methanol (9: 1, v / v) to give the title acid. (21) (88 mg, 91%) was provided as an off-white solid.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 0.95 (s, 9H); 2.18 [m, 3H, including in 2.18 (s, 2H)]; 2.62-2.87 (m, 1H); 3.17-3 .28 (m, 1H); 3.42-3.47 (m, 1H); 3.73 (m, 3H); 3.82-3.93 (m, 1H); 3.94-4.60 (M, 1H); 4.41-4.65 (m, 4H); 5.90-5.94 (m, 2H); 6.63-6.93 (m, 6H) and 7.21-7. .25 (m, 1H)
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 483 [(M + H)⁺] (100)
[0332]
4-({(2S, 4S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) -3-methoxyanilino] tetrahydro-1H- T-butyl 2-pyrrolyl @ carbonyl) -1-piperazinecarboxylate (22)
(2S, 4S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) (3-methoxybenzyl) amino] tetrahydro-1H-2-pyrrole Carboxylic acid (21) (96.5 mg, 0.20 mmol) and O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (77 mg, 0.24 mmol) And a mixture of N, N-diisopropylethylamine (87 μL, 0.50 mmol) in dimethylformamide (1 mL) was stirred at room temperature for 1.5 hours. The mixture was diluted with water and extracted with ethyl acetate. The aqueous phase was back-extracted with ethyl acetate and the combined organic extracts were dried (MgSO₄) And evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography using hexane / ethyl acetate (1: 1, v / v) then 100% ethyl acetate as eluent to give the title piperazine (22) (89 mg, 68% ).
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 0.95 and 0.97 (2xs, 9H, rotamer); 1.46 (s, 9H); 1.74 (s, 2H); 2.01-2.24 and 2.38-2.44. (2xm, 2H, rotamer); 2.55-2.59 and 2.70-2.81 (2xm, 2H); 3.09-3.58 (m, 9H); 3.74-3.85 [ m, 3H, (includes 3.76 and 3.79 (2xs, 3H, rotamer))]; 3.94-4.05 and 4.06-4.19 (2xm, 1H, rotamer); 4.24 -4.41 and 4.61-4.69 (2xm, 2H, rotamer); 4.86-4.96 and 5.11-5.21 (2xm, 1H, rotamer); 5.89-6.01 (M, 2H, rotamer); 6.58-6.98 (m, 6H); 7.13-7.18 and 7.25-7.27 (2 m, 1H, rotamers)
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 651 [(M + H)⁺] (100)
[0333]
N1-[(3S, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolylyl] -N1- (3-methoxybenzyl ) -3,3-Dimethylbutanamide 2,2,2-trifluoroacetate (23a)
4-({(2S, 4S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -4-[(3,3-dimethylbutanoyl) -3-methoxyanilino] tetrahydro-1H- A solution of t-butyl (2-pyrrolyl @ carbonyl) -1-piperazinecarboxylate (22) (21.7 mg, 33.3 μmol) in dichloromethane (0.5 mL) was treated with 95% v / v dichloromethane in 95% v / v dichloromethane. Treated with solution (0.1 mL, 1.2 mmol). The mixture was stirred at room temperature and the course of the reaction was monitored by TLC analysis. Upon completion (1 hour), the solvent was evaporated under reduced pressure to give 22.8 mg of the title trifluoroacetate salt (23a) and a mixture of ethyl acetate and trifluoroacetic acid. This salt was used for the next experiment without further purification.
δ_H(360 MHz, CDCl₃): 0.98 (s, 9H); 2.08-2.18 (m, 1H); 2.32 (d, 1H); 2.43 (d, 1H); 2.73-2.82 ( 3.30-3.73 (m, 8H); 3.77 (s, 3H); 3.90-3.96 (m, 1H); 4.06-4.19 (m, 1H); 1H); 4.36-4.46 (m, 2H); 4.57 (d, 1H); 4.65-4.73 (m, 1H); 5.57-6.01 (m, 2H). 6.61-6.66 (m, 2H); 6.76-6.91 (m, 4H) and 7.29 (t, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 551 [(M + H)⁺] (100)
[0334]
N1-[(3S, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazinocarbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolylyl] -N1- (3-methoxybenzyl ) -3,3-Dimethylbutanamide (23b) 22.8 mg of crude N1-[(3S, 5S) -1- (1,3-benzodioxol-5-ylmethyl) -5- (piperazino) Carbonyl) tetrahydro-1H-3-pyrrolylyl] -N1- (3-methoxybenzyl) -3,3-dimethylbutanamide Dichloromethane (0.5 mL) containing 2,2,2-trifluoroacetic acid salt (23a) and water (0.5 mL) was treated with 2.0 M aqueous sodium hydroxide until the pH of the aqueous phase was adjusted to 12. The mixture was stirred vigorously at room temperature for 5 minutes and the phases were separated. The aqueous phase was extracted with dichloromethane (2 × 1 mL) and the combined organic extracts were dried (MgSO 4).₄), Evaporated under reduced pressure to give the title piperazine (23b) (14.5 mg, 79%). δ_H(360 MHz, CDCl₃): 0.97 and 1.09 (2xs, 9H, rotamer); 1.66-1.79 [m, 3H, including in 1.79 (s, 2H)]]; 2.03 (d, 1H). 2.13 (d, 1H); 2.32-2.47 (m, 1H); 2.54-2.88 (m, 5H); 3.05-3.12 (m, 1H); 3.29-3.67 (m, 5H); 3.76 (s, 3H); 3.86 (d, 1H); 4.66 (d, 1H); 4.97 (d, 1H); .08-5.22 (m, 1H); 5.89-5.92 (m, 2H); 6.59-6.81 (m, 6H) and 7.09-7.18 (t, 1H).
LRMS (from LC-MS) (ES +) m / z 551 [(M + H)⁺] (100)
[0335]
Changing the protecting group frame can increase the efficiency and speed with which the compounds of the present invention can be made. Based on the foregoing disclosure, in conjunction with methods known in the art, the reaction scheme described below, which can be readily implemented by those skilled in the art, provides a rapid and effective route to compounds that may exhibit hedgehog activity. As will be appreciated, certain moieties, groups and reactions (e.g., electrophilic or reductive alkylation of an amine) can be performed, for example, to produce a wide variety of compounds having a structure according to any of Formulas I-VI. Can be changed. Also, J.I. W. Mickelson, K. L. Veronga and E.L. J. Jacobsen, J.C. Org. Chem. 1995, 60; 4177-4183.
[0336]
Reaction formula 1
Embedded image

[0337]
Reaction formula 2
Embedded image

[0338]
Reaction formula 3
Embedded image

[0339]
Reaction formula 4
Embedded image

[0340]
Solid phase route
The synthetic route used to carry out the production with this template is described in Scheme 5.
Reaction formula 5
Embedded image

[0341]
Wash protocol
Method 1: water (3x), acetone (2x), N, N-dimethylformamide (3x), water (2x), acetone (1x), N, N-dimethylformamide (3x), water (2x), acetone ( 3x), methanol (3x), acetone (3x) and methanol (3x).
Method 2: dichloromethane, hexane, N, N-dimethylformamide, dichloromethane, hexane, dichloromethane and hexane.
Method 3: water, N, N-dimethylformamide, water, 1.0 M aqueous sodium hydroxide solution, water, N, N-dimethylformamide, water, 1.0 M aqueous sodium hydroxide solution, water, N, N-dimethylformamide, Dichloromethane, methanol, dichloromethane and methanol.
Method 4: N, N-dimethylformamide, dichloromethane, N, N-dimethylformamide, dichloromethane, methanol, dichloromethane, methanol (2x) and ether (2x).
Method 5: N, N-dimethylformamide, dichloromethane, N, N-dimethylformamide, dichloromethane, methanol, dichloromethane and methanol (2x).
Swelling of the resin in the solvent was based on a standard amount of 10 mL of solvent per gram of resin.
[0342]
Step A: Preparation of (nitrophen-4'-yloxycarboxy) benz-4-yloxymethylpolystyrene (PNP carbonate polystyrene from Wang)
・ Hydroxybenz-4-yloxymethyl polystyrene (Wang resin)
Chloromethyl polystyrene (2.4 kg, 3.6 mol functionalization loading) and 4-hydroxybenzyl alcohol (581 g, 4.68 mol) were added to N, N-dimethylacetamide (10 L) and the mixture was stirred with sodium. Methoxide (233 g, 4.31 mol) was added slowly under a nitrogen atmosphere. After addition of N, N-dimethylacetamide (13 L), the mixture was heated to 50 ° C. for 5 hours and then filtered through a cannula through a P-ETFE mesh (70 μm). The crude product was thoroughly washed using the sequence listed in Method 1 and then vacuum dried at 60 ° C. to give 2630 g of the title resin.
-(Nitrophen-4'-yloxycarboxy) benz-4-yloxymethylpolystyrene (WNP's PNP carbonate polystyrene)
Mixture of hydroxybenz-4-yloxymethylpolystyrene (2000 g, 2.5 mol functionalization loading) and 4-nitrophenol chloroformate (1209 g, 6.0 mol) added to dichloromethane (22 L) and stirred. 4-Methylmorpholine (660 mL, 6.0 mol) was added dropwise at 0 ° C. under a nitrogen atmosphere for 2 hours. The mixture was gradually warmed to room temperature, stirred overnight, and filtered through a cannula through a P-ETFE mesh (70 μm). The crude resin was thoroughly washed using the sequence listed in Method 2 and then dried in vacuo at room temperature to give 2728 g of a mixture of the title resin and 4-methylmorpholine hydrochloride.
[0343]
Step B: Production of Diamine Bound to Wang's Resin
General methods (for piperazine, homopiperazine and trans-1,4-diaminocyclohexane)
Crude (nitrophen-4′-yloxycarboxy) benz-4-yloxymethylpolystyrene (1002.5 g, functionalized loading of 負荷 0.9 mol) was treated with a mixture of anhydrous dichloromethane and N, N-dimethylformamide (1 : 1, v / v, 9 L) under a nitrogen atmosphere for 15 minutes. N, N-diisopropylamine (626 mL, 5 molar equivalents) and the appropriate diamine (5 molar equivalents) were added and the mixture was vigorously stirred at room temperature overnight. The mixture was filtered through a P-ETFE mesh (70 μm), washed thoroughly using the sequence listed in Method 3 and dried in vacuo at 60 ° C. to yield the resin-bound diamine.
.Ethylenediamine bonded to Wang's resin
Crude (nitrophen-4′-yloxycarboxy) benz-4-yloxymethylpolystyrene (1002.5 g, ０．９0.9 mol functionalization loading) is swollen in dichloromethane (7 L) under a nitrogen atmosphere for 15 minutes. , Ethylenediamine (181 mL, 2.7 mol). The resulting thick yellow suspension was diluted with dichloromethane (2 L) and stirred vigorously overnight at room temperature. The mixture was filtered through a P-ETFE mesh (70 μm), washed thoroughly using the sequence listed in Method 3 and dried in vacuo at 60 ° C. to give the diamine bound to the title resin.
M-xylene diamine bound to Wang's resin
Crude (nitrophen-4′-yloxycarboxy) benz-4-yloxymethylpolystyrene (1002.5 g, ０．９0.9 mol functionalization loading) was swollen in tetrahydrofuran (7 L) under a nitrogen atmosphere for 15 minutes. , M-xylenediamine (828 mL, 6.27 mol) in tetrahydrofuran (1 L). The resulting thick yellow suspension was diluted with dichloromethane (2 L) and stirred vigorously overnight at room temperature. The mixture was filtered through a P-ETFE mesh (70 μm), washed thoroughly using the sequence listed in Method 3 and dried in vacuo at 60 ° C. to give the diamine bound to the title resin.
[0344]
Step C: Loading of building blocks on diamines of Wang
The appropriate resin is swollen in N, N-dimethylformamide for 15 minutes and then gently stirred to give 1- [9H-9-fluorenylmethoxycarbonyl] -4-oxo-2 (S) -pyrrolidinecarboxylic acid ( 2 eq.). After 30 minutes, 1-hydroxybenzotriazole hydrate (2 eq) and N, N'-diisopropylcarbodiimide (2 eq) were added and the resin suspension was gently stirred overnight at room temperature. After filtration, the resin was thoroughly washed using the sequence listed in Method 4 and vacuum dried at 40 ° C.
[0345]
Step D: Reductive amination at C-4
The appropriate resin was swollen in a 50% v / v mixture of anhydrous tetrahydrofuran and methanol for 15 minutes, gently stirred and treated with glacial acetic acid (10 equivalents). The appropriate amine (5 eq) and sodium cyanoborohydride (5 eq) were added and the resin suspension was gently stirred overnight at room temperature. After filtration, the resin was thoroughly washed using the sequence listed in Method 4 and vacuum dried at 40 ° C.
[0346]
Step E: Reductive alkylation or capping
・ Reductive alkylation
The appropriate resin was swollen in anhydrous N, N-dimethylformamide, then gently stirred and treated with glacial acetic acid (10 equivalents). The appropriate aldehyde (5 eq) and sodium triacetoxyborohydride (5 eq) were added and the resin suspension was carefully stirred at room temperature for 1 hour. The pressure generated in the reaction vessel during this period was then released, and gentle stirring of the suspension continued overnight at room temperature. The resin was then filtered, thoroughly washed using the sequence listed in Method 4, and dried in vacuo at 40 ° C.
・ Capping with acid chloride
The appropriate resin (5 equivalents) and N, N-diisopropylethylamine (10 equivalents) were added to a gently stirred suspension of the appropriate resin in a 50% v / v mixture of anhydrous tetrahydrofuran and chloroform. Was added. After gentle stirring overnight at room temperature, the resin was filtered, washed thoroughly using the sequence listed in Method 4, and dried in vacuo at 40 ° C.
[0347]
Step F: Deprotection of N-Fmoc
The resin analog was suspended in a solution of 20% v / v piperidine in N, N-dimethylformamide and gently stirred at room temperature for 30 minutes. Next, the resin suspension was filtered and washed with N, N-dimethylformamide. This treatment with piperidine in N, N-dimethylformamide was repeated one more time to ensure complete deprotection of N-Fmoc. After standing for 30 minutes, the resin was filtered, washed using the sequence listed in Method 4, and vacuum dried at 40 ° C.
[0348]
Step G: Reductive alkylation or capping at N1
・ Reductive alkylation
The appropriate resin (〜60 mg per well in a 2 mL filter block) is swollen in anhydrous N, N-dimethylformamide (1 mL), then gently stirred and treated with glacial acetic acid (〜50 μL, 10 eq) did. The appropriate aldehyde (5 eq) and sodium triacetoxyborohydride (-85 mg, 5 eq) were added, then the filter block was gently stirred overnight at room temperature. Each resin was then filtered and washed using the sequence listed in Method 5.
・ Capping with acid chloride
The appropriate resin (〜60 mg per well in a 2 mL filter block) is swollen in a 50% v / v mixture of anhydrous tetrahydrofuran and chloroform (1 mL), then gently stirred and mixed with the appropriate acid chloride (5 mL). Eq.) And N, N-diisopropylethylamine (〜150 μL, 10 eq.). After gently stirring the filter block overnight at room temperature, the resin was filtered and washed using the sequence listed in Method 5.
[0349]
Step H: Cleavage of End Product from Wang's Resin Using TFA
The appropriate resin was swollen in DCM and the final product was cleaved by adding a 95% v / v TFA dichloromethane solution. Four separate TFA aliquots (2 × 300 μL, 75 μL and 500 μL) were added and the filtrates obtained from these were collected in a plate containing 96 wells. The filtrate obtained by adding aliquots 1, 2 and 4 was collected using the same 96-well plate. Also, the filtrates obtained after the addition of aliquot 3 (75 μL) were collected separately using 96-well plates for analysis. All fractions were then evaporated under reduced pressure using a Genevac device to give the final product.
[0350]
Biological assays
Lead Compound Discovery / High Throughput Screening Assay
The compound to be tested is dissolved in DMSO to a concentration of 10 mM and stored at -20C. To activate the hedgehog pathway in the assay cells, an octylated (lipid-modified) form of the N-terminal fragment of sonic hedgehog protein (OCT-SHH) is utilized. This N-terminal SHH fragment is produced by bacteria.
[0351]
Compounds can be tested in the "Gli-Luc" assay described below using cell line 10T (s12), where these cells utilize a hedgehog-responsive receptor construct that utilizes luciferase as a reporter gene. Includes In this way, the signaling activity of the hedgehog pathway can be measured by the Gli-Luc response.
[0352]
10t1 / 2 (s12) cells are plated at 20,000 cells / well in complete medium [DMEM with 10% FBS] in a 96-well microtiter plate (MTP). The plate was then placed at 37 ° C. with 5% CO 2₂Place in an incubator for overnight (O / N) incubation in. After 24 hours, the medium is replaced with luciferase assay medium (DMEM with 0.5% FBS). Compounds are thawed and diluted 3: 1000 (about 300-fold) in assay medium to give a starting concentration of about 30 μM.
[0353]
Subsequently, 150 μl of each 30 μM sample is added to the first well (in triplicate). These MTP samples are then diluted three-fold into a total of seven wells, ultimately generating a group of seven dilutions for each compound in triplicate. Next, the protein ligand OCT-SHH is diluted in luciferase assay medium and added to each well at a final concentration of 0.3 μg / ml. The plate was then incubated at 37 ° C. with 5% CO 2²Return to incubator for further incubation in (O / N). After 24 hours, the plate is removed from the incubator and the medium is aspirated / discarded. Wells were assay buffer [PBS + 1 mM Mg]²⁺And 1 mM Ca²⁺] Once. Then 50 μl of assay buffer is added to each well. The luciferase assay reagent is prepared as described by the vendor (LucLite kit from Packard) and 50 μl is added to each well. The plate is incubated at room temperature (RT) for about 30 minutes, after which the signal is read on a Topcount (Packard), also at RT.
[0354]
The compounds identified in this assay are depicted in FIG. Examination of the individual diastereomers of the depicted compounds in the above assay indicated that the cis isomer tended to show greater activity, sometimes more than 100-fold than the trans isomer compound. Moreover, ammonium salt derivatives of the subject compounds, such as TFA salts, have been shown to exhibit comparable or greater activity in the above assays.
[0355]
The activity of particular compounds is given in Table 1 below:
[Table 1]

[0356]
Ptc-null assay
Method
Ptc-cells were cultured for 3 days in the presence of vehicle; Jarbin (a known patched pathway antagonist (i) used here as a positive control); or 1 μM Compound D. Total ribonucleic acid (RNA) was isolated from cells and used for reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Specific primers for the detection of mouse gli-1 mRNA were used in this PCR, and the actin gene was used to compare equal amounts of mRNA samples in this experiment. These gli-1 and actin mRNA samples were then loaded on a 1.5% agarose gel and detected by staining with ethidium bromide. The same samples were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction to quantify gli-1 mRNA levels.
[0357]
result
FIG. 33A shows a representative experimental result. It shows expression of gli-1 mRNA in cells treated with the vehicle control (lane 1); the positive control compound 5 μM Jarbin (lane 2); and 1 μM D (lane 3). D and Jarbin significantly reduced the expression of gli-1 mRNA in ptc-null cells compared to vehicle. Actin mRNA levels were equal in all conditions, indicating that equal amounts of RNA were analyzed in this experiment. This qualitative result was confirmed by quantitative real-time PCR analysis (FIG. 33B), indicating that D and Jarvin downregulated gli-1 mRNA levels.
[0358]
Taken together, these experiments ensure that exposure of ptc-null cells to D for 3 days down-regulates the patched pathway, as indicated by inhibition of gli-1 mRNA transcript expression. is there.
[0359]
Mouse fetal skin punch assay: effects of long-term exposure to D
Method
A new cell culture assay was established to determine the effect of D on activation of the patched pathway in skin. In this system, activation of the patched pathway results in increased expression of the ptc gene.
[0360]
To monitor the activity of the patched pathway in fetal skin, we cultured skin sections from transgenic patched pathway reporter mice. These mice were genetically engineered to have a foreign gene (lacZ). This lacZ gene encodes bacterial β-galactosidase. This gene was inserted into the ptc locus to allow for normal ptc function. Activation of ptc in response to Shh-induced activation of the patched pathway can then be monitored by production of the lacZ gene product, β-galactosidase (β-galactosidase is the blue color of the substrate, X-gal). Can be detected by enzymatic conversion to the reaction product).
[0361]
Fetal skin at 17.5 days of age was explanted from these transgenic reporter mice as 2 mm circular punches and cultured in the presence of Shh protein for 5-7 days (FIG. 34). The Shh protein should upregulate ptc gene expression as it increases the amount of X-gal staining in these cultures. To test the effect of D, skin punches were cultured for 6 days in the presence of both Shh protein and D (FIG. 35).
[0362]
result
As expected, adding Shh protein to cultured skin explants resulted in ptc activation as shown by the blue X-gal staining of these cultures (FIG. 34A-X-gal). .
[0363]
Hematoxylin and eosin (H & E) staining of sectioned skin punches showed strongly stained basophils and cells with a high nucleus to cytoplasm ratio (FIG. 34A-H & E [10 ×] and H & E [40 ×]). . These structures resemble BCCs in that they are arranged in clusters in the skin layer and separated by palisades of normal-looking skin cells.
[0364]
X-gal staining showed that the patched pathway was active in cells within these BCC-like structures (FIG. 34A-eosin + X-gal). Consistent with published results and similar to human BCC, the BCC-like cluster in this mouse skin punch expressed keratin 14 (a marker of undifferentiated keratinocytes) (FIG. 34B).
[0365]
Skin punches were cultured for 6 days in the presence of both Shh protein and D to test the effect of D. FIG. 35 shows the dose-dependent effect of D on patched pathway activity levels in Shh-treated skin punches. Increasing concentrations of D (0.01-1 μM) were monitored by the amount of lacZ reporter enzyme activity and led to a dose-dependent decrease in the amount of pathway activity (FIG. 35A). Reporter enzyme staining of D-treated explants showed that 0.2 μM D reduced X-gal staining compared to strong X-gal staining of skin punches treated with Shh protein alone (FIG. 35B). This indicates that D blocked the activity of the patched pathway and down-regulated ptc gene expression.
[0366]
The next experiment showed that inhibiting the patched pathway with D would prevent the formation of BCC-like structures. FIG. 35C shows that D completely blocked the formation of BCC-like structures without affecting the integrity of normal skin cells. This ensures that D can prevent the emergence of BCC-like structures generated by activation of the patched pathway (a similar pathway underlying human disease).
[0367]
Mouse fetal skin punch assay: effect of short-term pretreatment with D
Method
Skin punches from transgenic mice were treated with vehicle or D for 5 hours in the absence of Shh. After this pretreatment, the vehicle or D was removed. These skin punches were washed twice and then cultured for 6 days in the presence of Shh. At the end of the experiment, these skin punches were fixed and stained with X-gal to determine patched pathway activity.
[0368]
result
Skin punches treated with exogenous Shh protein alone for 6 days showed stronger X-gal staining (ie, activation) compared to those treated with vehicle alone (FIG. 36, top). Skin punches pretreated with 10, 20, and 50 μM D for 5 hours and then exposed to exogenous Shh protein are induced by the Shh protein in the patched pathway, as indicated by the absence of X-gal staining Complete inhibition of up-regulation was shown (FIG. 36, bottom-right 3 slides). Strong X-gal staining indicating upregulation of the patched pathway was seen in skin punches that had been pretreated with vehicle and then exposed to Shh protein (FIG. 36, bottom left). This short-term pretreatment was essentially equivalent to a 6-day exposure to D with respect to the level of ptc inhibition (compare the upper and lower panels of FIG. 36).
[0369]
These results suggest that D binds tightly to its target and that the kinetics of dissociation is slow or irreversible. This data also suggests that D may have the ability to prevent the development of BCC.
[0370]
Mouse fetal skin punch assay: long-term treatment of pre-existing BCC-like structures with D
Method
A 17.5 day old fetal skin punch from a transgenic patched pathway reporter mouse was cultured for 7 days in the presence of the Shh protein to allow the development of BCC-like structures. The Shh protein was removed at the end of 7 days. These cultures were then exposed to Shh protein plus vehicle or D for 3 days. These cultures were analyzed histologically after 10 days to assess the formation of BCC-like structures indicating activation of the patched pathway.
[0371]
result
Histological analysis showed that D, at 1 or 5 μM, significantly reduced the size and number of Shh-induced BCC-like structures in treated skin punches as compared to explants treated with vehicle. (FIG. 37A). Thus, exposure of existing BCC-like structures to D for 3 days likely induced regression of these structures. Moreover, D did not appear to have general cytotoxic effects on skin cells as measured by their normal histology.
[0372]
One possible mechanism of D-induced regression of BCC-like structures may be activated cell apoptosis. To examine this possibility, explants were exposed to 5 μM D for 2 days in parallel, then terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) used to detect apoptotic nuclei. Stained by the method. After two days of exposure to 5 μMD, the number of apoptotic nuclei in BCC-like structures (indicated by the brown color in the right slide) was significantly higher than the vehicle control on the left (FIG. 37B). Taken together, these results suggest that D-induced regression of BCC-like structures results, at least in part, from stimulation of the cell suicide pathway where the patched pathway is activated.
[0373]
Mouse fetal skin punch assay: short-term treatment of pre-existing BCC-like structures with D
Method
A 17.5 day old fetal skin punch from a transgenic patched pathway reporter mouse was cultured for 7 days in the presence of the Shh protein. The Shh protein was removed at the end of 7 days. These skin punches were then exposed to vehicle or 1 or 5 μM D on days 7 and 9. After each exposure to vehicle or D, the vehicle or D was washed off and the skin punches were cultivated again in the presence of Shh protein. Cultures were analyzed by X-gal staining after 10 days in vitro to assess the activity of the patched pathway.
[0374]
result
Short-term treatment with D reduced the amount of X-gal staining associated with exposure to Shh protein (FIG. 38A), suggesting a down-regulation of pathway activity in skin explants. Histological analysis showed that D, even at a concentration of 1 μM, induced regression of X-gal positive BCC-like structures (FIG. 38B). Quantification of gli-1 mRNA levels in D-treated punches indicated that short-term treatment with D completely down-regulated gli-1 transcription (FIG. 38c, left). This effect appears to be specific to the patched pathway, as indicated by the relatively constant mRNA levels of the housekeeping enzymes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase or GAPDH, and is due to general cytotoxicity. Not (FIG. 38C, right).
[0375]
These results indicate that under certain conditions of short-term exposure, D has the ability to block the activity of the patched pathway in cultured fetal skin explants. Moreover, D caused regression of pre-existing Shh-induced BCC-like structures at concentrations of 1 and 5 μM.
[0376]
Adult BCC mouse skin punch assay
Method
The ptc heterozygous transgenic mice were irradiated three times weekly for 6 months, during which many small (often microscopic) BCC tumors developed. 4 mm diameter skin punch explants (possibly containing BCC structures). Cultured for 6 days in the presence of vehicle, positive control (Jurbin) or 5 μM D. At the end of the experiment, these explants were analyzed by X-gal staining to detect levels of patched pathway activity, and histologically analyzed to determine the effect of treatment on UV trading company induced BCC morphology. And analyzed by quantifying the expression levels of gli-1 mRNA to characterize the degree of inhibition of the pathway.
[0377]
result
X-gal staining of the treated explants shows that skin punches cultured in the presence of vehicle alone resulted in blue strongly stained foci indicating patched pathways of focus and up-regulation of BCC structures. (Blue spot in FIG. 39A). Compared with vehicle, 5 μM D, like the positive control, reduced the number and size of established BCC structures. Histological analysis of sectioned explants showed that D induced regression of BCC tumors induced by UV irradiation compared to vehicle control (FIG. 39B). In skin punches from these heterozygous transgenic mice, gli-1 mRNA levels were very high due to activation of the ptc target gene. D at a concentration of 1-5 μM also significantly inhibited gli-1 mRNA levels compared to vehicle alone. Quantification of gli-1 mRNA levels shows almost complete inhibition of target gene activation by D (FIG. 39C). This inhibition is nonspecific because statistical comparison of the levels of housekeeping GAPDH enzyme between the treated and vehicle situations does not show a significant difference between groups of general cellular metabolic activity. Did not appear to be caused by severe cytotoxicity. Thus, these results indicate that D inhibits the patched pathway and induces UV irradiation-induced regression of BCNS-like BCC tumors in cultured skin explants.
[0378]
These data confirm the results of previous experiments and suggest that D may be effective in treating BCC.
[0379]
Culture of human BCC explants
Method
Samples obtained from surgical procedures (such as the Mohs excision procedure) were cultured on fresh, live, day 17 mouse fetal dermis in which all epithelial cells had been removed by digestion with dispase. Since dispase treatment digests basement membrane components, Matrigel (a commercially available basement membrane preparation) was applied between the dermis and the BCC. Cultures were collected on the tip of a plastic grid and incubated for 3 days (with or without a concentration of 10 μM D) in a medium suitable for long-term culture of human skin. After culture, the samples were processed for routine histology and subjected to quantitative in situ hybridization. Briefly, 7 μm sections of paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissues (including large basal cell islets) were cleaned, rehydrated, digested with proteinase K, acetylated, and [³³[P] was hybridized with the labeled RNA probe overnight. After high stringency post-hybridization washes, slides were exposed to a photoimager screen in the dark for 4-7 days at room temperature. After development,³³[P] signal was scanned using a storm scanner (Molecular Dynamics). Individual basal islets were selected and the signal was quantified using Image Quant 1.0 software and expressed as mean counts / pixel.
[0380]
result
The morphological features characteristic of BCC, such as the islets of undifferentiated basal cells and the fences and stromal clefts of the surrounding cells in some cases (FIG. 40A) are retained when BCC is cultured in this system. Was. Similarly, the expressed differentiation markers have the same pattern as that of the preculture control as measured by immunohistochemical staining (data not shown). The GLI-I gene (a key indicator of patched signaling), in untreated cultures,³³It remained active at high levels as measured on sections exposed to P-labeled RNA probes (FIG. 40B). Quantitative in situ hybridization showed that the level of GLI-1 expression was greatly reduced in D-treated samples compared to vehicle-treated controls (FIG. 41).
[0381]
Preparation of the compounds of the invention
a. Example of synthetic reaction formula
Examples of synthetic schemes for generating hedgehog antagonists useful in the methods and compositions of the present invention are shown in FIGS.
The reaction conditions in the illustrated reaction formulas of FIGS. 1 to 31 are as follows.
1) R₁CH₂CN, NaNH₂,toluene
(Arzneim-Forsch 1990, 40, 11, 1242)
2) H₂SO₄, H₂O, reflux
(Arzneim-Forsch 1990, 40, 11, 1242)
3) H₂SO₄, EtOH, reflux
(Arzneim-Forsch 1990, 40, 11, 1242)
4) NaOH, EtOH, reflux
5) (Boc)₂O, 2M NaOH, THF
6) LiHDMS, R₁X, THF
(Merck, patent application WO 96/06609)
7) Pd-C, H₂, MeOH
8) t-BuONO, CuBr, HBr, H₂O
(J. Org. Chem. 4977, 42, 2426).
9) ArB (OH)₂, Pd (PPh₃)₄, Dioxane
(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223).
10) R₁₂(H) C = CR_ThirteenR₁₄, Pd (OAc)₂, Et₃N, DMF
(Org. React. 1982, 27, 345).
11) Tf₂O, THF
(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486).
12) ArSnBu₃, Pd (PPh₃)₄, Dioxane
(J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486).
13) KMnO₄, Py, H₂O
(J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223).
14) NaOR₁, THF
15) NaSR₁, THF
16) HNR₁R_Thirteen, THF
17) HONO, NaBF₄
(Adv. Fluorine Chem. 1965, 4, 1-30).
18) Pd (OAc)₂, NaH, DPPF, PhCH₃, R₁OH
(J. Org. Chem. 1977, 62, 5413-5418).
19) i. R₁X, Et₃N, CH₂Cl₂Ii. R_ThirteenX
20) SOCl₃, Catalyst DMF
21) CH₂N₂, Et₂O
22) Ag₂O, Na₂CO₃, Na₂S₂O₃, H₂O
(Tetrahed. Lett. 1979, 2667).
23) AgO₂CPh, Et₃N, MeOH
(Org. Synth. 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432).
24) LiOH, THF-MeOH
25) (EtO)₂P (O) CH₂CO₂R, BuLi, THF
26) MeO₂CCH (Br) = P (Ph)₃,benzene
27) KOH or KOtBu
28) base, X (CH₂)_nCO₂R
29) DPPA, Et₃N, toluene
(Synthesis 1985, 220)
30) HONO, H₂O
31) SO₂, CuCl, HCl, H₂O
(Synthesis 1969, 1-10, 6)
32) Lowesson's reagent, toluene
(Tetrahed. Asym. 1996, 7, 12, 3553).
33) R₂M, solvent
34) 30% H₂O₂, Ice CH₃CO₂H
(Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323).
35) Triphosgene, CH₂Cl₂
(Tetrahed. Lett. 1996, 37, 8589).
36) i, (EtO)₂P (O) CHLiSO₂Oi-Pr, THF, ii, NaI
37) Ph₃PCH₃I, NaCH₂S (O) CH₃, DMSO
(Synthesis 1987, 498)
38) Br₂, CHCl₃Or other solvent
(Synthesis 1987, 498)
39) BuLi, Bu₃SnCl
40) ClSO₂OTMS, CCl₄
(Chem. Ber. 1995, 128, 575-580).
41) MeOH-HCl, reflux
42) LAH, Et₂O or LiBH₄, EtOH or BH₃-THF
(Tetrahed. Lett. 1996, 37, 8589).
43) MsCl, Et₃N, CH₂Cl₂
(Tetrahed. Lett. 1996, 37, 8589).
44) Na₂SO₃, H₂O
(Tetrahed. Lett. 1996, 37, 8589).
45) R₂R₄NH, Et₃N, CH₂Cl₂
46) R₂M, solvent
47) CH₃NH (OCH₃), EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
(Tetrahed. Lett. 198, 22, 3815).
48) MeLi, THF
49) mCPBA, CH₂Cl₂
50) HONO, Cu₂O, Cu (NO₃)₂, H₂O
(J. Org. Chem. 1977, 42, 2053).
51) R₁M, solvent
52) HONO, NaS (S) COEt, H₂O
(Org. Synth. 1947, 27, 81)
53) HSR₂Or HSR₄, CH₂Cl₂
54) i-BuOC (O) Cl, Et₃N, NH₃, THF
55) R₂N₄NH, CH₂Cl₂, NaBH (OAc)₃
56) R₂N₄NH, MeOH / CH₃CO₂H, NaBH₃CN
57) R₂OH, EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
58) R₂OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
59) R₂N₄NH, EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
60) R₂N₄NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
61) POCl₃, Py, CH₂Cl₂
62) R₂R₄NCO, solvent
63) R₂OC (O), Et₃N, solvent
64) R₂CO₂H, EDC or HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
65) R₂X, Et₃N, solvent
66) (CH₃S)₂C = N (CN), DMF, EtOH
(J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66).
67) R₂SO₂Cl, Et₃N, CH₂Cl₂
68) R₂-Or R₃-Or R₄-CHO, MeOH / CH₃CO₂H, NaBH₃CN
(Synthesis 1975, 135-146)
69) Boc (Tr) -D or L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
70) Boc (Tr) -D or L-CysH, NaBH₃CN, MeOH / CH₃CO₂H
(Synthesis 1975, 135-146)
71) S-Tr-N-Boc stationary, ClCH₂CH₂Cl or THF, NaBH (OAc)₃
(J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-3862).
72) TFA, CH₂Cl₂, Et₃SiH or (3: 1: 1) thioanisole / ethanedithiol / DMS
73) TFA, CH₂Cl₂
74) DPPA, Et₃N, toluene, HOCH₂CH₂SiCH₃
(Tetrahed. Lett. 1984, 25, 3515).
75) TBAF, THF
76) Base, TrSH or BnSH
77) Base, R₂X or R₄X
78) R₃NH₂, MeOH / CH₃CO₂H, NaBH₃CN
79) N₂H₄, KOH
80) Pd₂(Dba)₃, P (o-tol)₃, RNH₂, NaOtBu, dioxane, R₁NH₂
(Tetrahed. Lett. 1996, 37, 7181-7184).
81) Cyanamide
82) Fmoc-Cl, sodium bicarbonate
83) BnCOCl, sodium carbonate
84) Allyl OCOCl, pyridine
85) Benzyl bromide, base
86) Oxalyl chloride, DMSO
87) RCONH₂
88) Carbonyl diimidazole, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene)
89) Thiocarbonyldiimidazole, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene) 90) Cyanogen bromide, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene)
91) RCOCl, triethylamine
92) RNHNH₂, EDC
93) RO₂CCOCl, Et₃N, DCM
94) MsOH, pyridine
(J. Het. Chem. 1980, 607)
95) Base, neutral solvent (eg, DCM, toluene, THF)
96) H₂NOR, EDC
97) RCSNH₂
98) RCOCHBrR, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene)
(Org. Proc. Prep. Intl. 1992, 24, 127).
99) CH₂N₂, HCl
(Synthesis, 1993, 197)
100) NH₂NHR, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene)
101) RSO₂Cl, DMAP
(Tetrahed. Lett. 1993, 34, 2749).
102) Et₃N, RX
(J. Org. Chem. 1990, 55, 6037).
103) NOCl or Cl₂
(J. Org. Chem. 1990, 55, 3916).
104) H₂NOH, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene)
105) RCCR, neutral solvent (DCM, THF, toluene)
106) RCHCHR, neutral solvent (DCM, THF, toluene)
107) H₂NOH, HCl
108) Thiocarbonyldiimidazole, SiO₂Or BF₃OEt₂
(J. Med. Chem. 1996, 39, 5228).
109) Thiocarbonyldiimidazole, DBU or DBN
(J. Med. Chem. 1996, 39, 5228).
110) HNO₂, HCl
111) ClCH₂CO₂Et
(Org. Reactions, 1959, 10, 143)
112) Morpholine enamine
(Eur. J. Med. Chem. 1982, 17, 27).
113) RCOCHR'CN
114) RCOCHR'CO₂Et
115) Na₂SO₃
116) H₂NCHRCO₂Et
117) EtO₂CCHRNCO
118) RCNHNH₂
119) RCOCO₂H
(J. Med. Chem. 1995, 38, 3741).
120) RCHO, KOAc
121) 2-Fluoronitrobenzene
122) SnCl₂, EtOH, DMF
123) RCHO, NaBH₃CN, HOAc
124) NH₃, MeOH
125) 2,4,6-Me₃PhSO₂NH₂
126) Et₂NH, CH₂Cl₂
127) MeOC (O) Cl, Et₃N, CH₂Cl₂
128) R₂NH₂, EDC, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
129) DBU, PhCH₃
130) BocNHCH (CH₂STr) CH₂NH₂, EDC, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
131) R₂NHCH₂CO₂Me, HBTU, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
132) BocNHCH (CH₂STr) CH₂OMs, LiHMDS, THF
133) R₂NHCH₂CO₂Me, NaBH (OAc)₃, ClCH₂CH₂Cl or THF
134) R₂NHCH₂CH (OEt)₂, HBTU, HOBT, Et₃N, CH₂Cl₂
135) NaBH (OAc)₃, ClCH₂CH₂Cl or THF, AcOH
136) Piperidine, DMF
137) Pd (Ph₃P)₄, Bu₃SnH
138) RCO₂H, EDC, HOBT, Et₃N, DCM
139) RNH₂, Neutral solvent
140) RCHO, NaBH₃CN, HOAc
141) RNCO, solvent
142) RCO₂H, EDC or HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
143) RCOCl, triethylamine
144) RSO₂Cl, Et₃N, CH₂Cl₂
145) SnCl₂, EtOH, DMF
146) RNH₂, EDC, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
147) Dibromomethane, Et₃N, CH₂Cl₂
148) Oxalyl chloride, neutral solvent
149) LiOH, THF-MeOH
150) Carbonyl diimidazole, neutral solvent (eg, DCM, DMF, THF, toluene)
151) RNH₂, Et₃N, CH₂Cl₂
152) Base, RX
153) DBU, PhCH₃
154) DPPA, Et₃N, toluene
(Synthesis 1985, 220)
155) SOCl₂, Catalyst DMF
156) ArH, Lewis acid (AlCl₃, SnCl₄, TiCl₄), CH₂Cl₂
157) H₂NCHRCO₂Et, neutral solvent
158) BocHNCHRCO₂H, EDC or HBTU, HOBt, DIEA, CH₂Cl₂Or DMF
159) TFA, CH₂Cl₂
[0382]
All of the cited references are hereby incorporated by reference.
[0383]
Equivalent
Those skilled in the art will recognize many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein and will recognize them through routine experimentation. Such equivalents are intended to be encompassed by the appended claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 2
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 3
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 4
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 5
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 6
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 7
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 8
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 9
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 10
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 11
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 13
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 14
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG.
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 21
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 22
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 23
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 24
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 25
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 26
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 27
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 28
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 29
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 30
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 31
FIG. 2 depicts a reaction useful for the synthesis of the compounds of the present invention.
FIG. 32a
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32b
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32c
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG.
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32e
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32f
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32g
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32h
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32i
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32j
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32k
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG.
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32m
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32n
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 32o
FIG. 2 illustrates a representative compound of the present invention.
FIG. 33A
FIG. 3 shows expression of gli-1 mRNA in cells treated with vehicle (lane 1); 5 μM Jarbin, positive control compound (lane 2); and 1 μM D (lane 3).
FIG. 33B
FIG. 3D shows that D and Jarbin block gli-1 mRNA levels (measured by quantitative real-time PCR).
FIG. 34A
FIG. 4 shows that adding Shh protein to cultured skin explants resulted in ptc activation as indicated by blue staining (X-gal) of these cultures.
FIG. 34B
FIG. 2 illustrates that BCC-like clusters (one of which is indicated by an arrow) in the mouse skin punch expressed the undifferentiated keratinocyte marker keratin-14 (brown reaction product).
FIG. 35A
FIG. 3 shows that increasing concentrations of D are associated with a dose-dependent decrease in the amount of lacZ reporter enzyme activity.
FIG. 35B
FIG. 9 shows staining of D-treated explants and also shows that 0.2 μM D reduced X-gal staining compared to strong X-gal staining of skin punches treated with Shh protein only. (This indicates down regulation of expression of the ptc gene).
FIG. 35C
D is a histological drawing of a skin punch treated with D (bottom), suggesting that this treatment prevented Shh-induced appearance of BCC-like structures.
FIG. 36
FIG. 4 depicts that skin punches treated with exogenous Shh protein alone for 6 days showed stronger X-gal staining compared to those treated with vehicle only (top).
FIG. 37A
D shows that at 1 or 5 μM, the size and number of Shh-induced BCC-like structures in treated skin punches are significantly reduced compared to explants treated with vehicle.
FIG. 37B
Figure 2 illustrates that apoptotic nuclei (indicated by the brown color in the right slide) appeared within the BCC-like structure two days after exposure to 5 μM D (right) or vehicle (left). .
FIG. 38A
FIG. 9 shows that short-term treatment with D reduced the amount of X-gal staining compared to vehicle (suggesting a down-regulation of pathway activity).
FIG. 38B
FIG. 4 shows that D induced regression of X-gal positive BCC-like structures as compared to vehicle, even at a concentration of 1 μM.
FIG. 38C
D depicts short-term treatment with D completely down-regulated gli-1 transcription (left).
FIG. 39A
X-gal staining of the treated explants showed that skin punches cultured in the presence of vehicle alone produced intensely stained blue foci, indicating an increase in patched pathway and BCC structure. The regulation is shown.
FIG. 39B
Histological samples showed that 5 μM D reduced the number of UV-induced BCC structures compared to the vehicle control.
FIG. 39C
In skin punches from transgenic mice, D significantly inhibited gli-1 mRNA levels at concentrations of 1 and 5 μM as compared to skin punches from mice treated with vehicle alone (left).
FIG. 40A
Morphological features characteristic of BCC (eg, undifferentiated basal cell islets, and in some cases, surrounding cell fences and stromal clefts) are retained when cultures are stained with H & E It had been.
FIG. 40B
The GLI-1 gene, a key indicator of patched signaling, remained active at high levels, as shown in red.
FIG. 41
Quantitative in situ hybridization shows that the level of GLI-1 expression is induced in D-treated samples as compared to vehicle-treated controls.

Claims (92)

A pharmaceutical formulation comprising an aqueous solution of a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I):

[Where valence and stability allow,
R ₁ and R ₄ independently represent H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl;
L, independently for each, or either absent - _{(CH 2) n} -, - alkenyl -, - alkynyl -, - _{(CH 2) n} alkenyl -, - _{(CH 2) n} alkynyl -, - _{(CH 2) n O (CH} 2) p -, - (CH 2) n NR 8 (CH 2) p -, - (CH 2) n S (CH 2) p -, - (CH 2) n alkenyl ( _{CH 2) p -, - (} CH 2) n alkynyl _{(CH 2) p -, -} O (CH 2) n -, - NR 8 (CH 2) n - or -S _{(CH 2) n} - represents,
X and D, _{independently, -N (R 8) -,} - O -, - S -, - (R 8) N-N (R 8) -, - ON (R 8) - and from a direct bond Selected,
Y and Z are independently selected from O and S;
E represents NR ₅ (R ₅ represents LR ₈ or an ammonium salt thereof),
R ₈ , for each occurrence, independently represents H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl, or two R _{8 taken} together from 4 members to 8 members. Form a ring of members,
p independently represents an integer of 0 to 3;
n independently represents an integer of 0 to 5;
q and r each independently represent an integer of 0 to 2]. The formulation of claim 1, wherein Y and Z each represent O. The formulation of claim 1, wherein the sum of q and r is less than 4. The formulation according to claim 1, wherein D represents an aralkyl- or heteroaralkyl-substituted amine. The formulation according to claim 1, wherein R ₁ represents branched alkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl. The formulation of claim 1 wherein L attached to R ₁ represents O, S or NR ₈ . The formulation of claim 1, wherein X is included in a ring. The formulation of claim 1, wherein XLR ₄ comprises a cyclic amine. The formulation according to claim 1, wherein the salt is chloride, bromide, iodide, succinate, tartrate, lactate, mesylate or maleate. The formulation of claim 1, wherein the solution comprises a dissolved physiologically acceptable salt. 12. The formulation of claim 11, wherein the physiological salt is sodium acetate. The formulation of claim 1, wherein the aqueous solution further comprises a solute selected from dextrose, lactose, mannitol, or other polyhydroxylated compound. The formulation according to claim 1, wherein the aqueous solution has a permeability of 200 to 400 mOsm. The formulation of claim 1, wherein the solution has a pH in the range of 3-6. The formulation according to claim 1, wherein the formulation is suitable for topical administration. Pharmaceutical formulations comprising an aqueous solution of a pharmaceutically acceptable salt of a compound represented by the following general formula (II):

[Where valence and stability allow,
R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ each independently represent H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl;
L, independently for each, or either absent - _{(CH 2) n} -, - alkenyl -, - alkynyl -, - _{(CH 2) n} alkenyl -, - _{(CH 2) n} alkynyl -, - _{(CH 2) n O (CH} 2) p -, - (CH 2) n NR 8 (CH 2) p -, - (CH 2) n S (CH 2) p -, - (CH 2) n alkenyl ( _{CH 2) p -, - (} CH 2) n alkynyl _{(CH 2) p -, -} O (CH 2) n -, - NR 8 (CH 2) n - or -S _{(CH 2) n} - represents,
X is _{independently, -N (R 8) -,} - O -, - S -, - (R 8) N-N (R 8) -, - ON (R 8) - and it is selected from a direct bond ,
Y and Z are independently selected from O and S;
R ₈ , for each occurrence, independently represents H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl, or two R _{8 taken} together from 4 members to 8 members. Form a ring of members,
M is absent or L, _-SO 2 L-or - (C = O) L- and represents;
p independently represents an integer of 0 to 3;
n independently represents an integer of 0 to 5;
q, r and s each independently represent an integer of 0 to 2]. 18. The formulation according to claim 17, wherein Y and Z each represent O. 18. The formulation of claim 17, wherein the sum of q, r, and s is less than 4. At least one of R _{1, R 2} and _{R 3,} but comprises an aryl group, formulation of claim 17. 18. The formulation of claim 17, wherein XLR ₄ comprises a cyclic diamine. 18. The formulation of claim 17, wherein X is included in a diaza carbocycle. R ₁ is an alkyl branched, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, formulation of claim 17. L bound to R ₁ is, O, represents S or NR _8, A formulation according to claim 17. 18. The formulation according to claim 17, wherein the salt is chloride, bromide, iodide, succinate, tartrate, lactate, mesylate or maleate. 18. The formulation of claim 17, wherein the solution comprises a dissolved physiologically acceptable salt. 27. The formulation of claim 26, wherein the physiological salt is sodium acetate. 18. The formulation of claim 17, wherein the aqueous solution further comprises a solute selected from dextrose, lactose, mannitol or other polyhydroxylated compound. 18. The formulation of claim 17, wherein the aqueous solution has a permeability of 200-400 mOsm. 18. The formulation of claim 17, wherein the solution has a pH in the range of 3-6. 18. The formulation according to claim 17, wherein the formulation is suitable for topical administration. A method of inhibiting activation of the hedgehog pathway in a cell, comprising contacting the cell with the formulation of claim 1. 21. A method of inhibiting activation of the hedgehog pathway in a cell, comprising contacting the cell with the formulation of claim 17. A method of treating or preventing basal cell carcinoma, comprising administering to a patient the formulation of claim 1 in an amount sufficient to inhibit the progression of basal cell carcinoma. 18. A method of treating or preventing basal cell carcinoma, comprising administering to a patient the formulation of claim 17 in an amount sufficient to prevent the progression of basal cell carcinoma. Pharmaceutical formulations comprising an aqueous solution of a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (III):

[Where valence and stability allow,
R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ each independently represent H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl;
L, independently for each, or either absent - _{(CH 2) n} -, - alkenyl -, - alkynyl -, - _{(CH 2) n} alkenyl -, - _{(CH 2) n} alkynyl -, - _{(CH 2) n O (CH} 2) p -, - (CH 2) n NR 8 (CH 2) p -, - (CH 2) n S (CH 2) p -, - (CH 2) n alkenyl ( _{CH 2) p -, - (} CH 2) n alkynyl _{(CH 2) p -, -} O (CH 2) n -, - NR 8 (CH 2) n - or -S _{(CH 2) n} - represents,
X _{is, -N (R 8) -,} - O -, - S -, - (R 8) N-N (R 8) -, - ON (R 8) - and is selected from a direct bond,
Y and Z are independently selected from O and S;
R ₈ , for each occurrence, independently represents H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl, or two R _{8 taken} together from 4 members to 8 members. Form a ring of members,
M is absent or L, _-SO 2 L-or - (C = O) L- and represents;
p independently represents an integer of 0 to 3;
n independently represents an integer of 0 to 5;
q and r each independently represent an integer of 0 to 2]. 37. The formulation of claim 36, wherein the sum of q and r is less than 4. R ₁ is an alkyl branched, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, formulation of claim 36. 37. The formulation of claim 36, wherein XLR ₄ comprises a cyclic amine. 37. The formulation of claim 36, wherein the salt is chloride, bromide, iodide, succinate, tartrate, lactate, mesylate or maleate. 37. The formulation of claim 36, wherein the solution comprises a dissolved physiologically acceptable salt. 37. The formulation of claim 36, wherein the physiological salt is sodium acetate. 37. The formulation of claim 36, wherein the aqueous solution further comprises a solute selected from dextrose, lactose, mannitol or other polyhydroxylated compound. 37. The formulation of claim 36, wherein the aqueous solution has a permeability of 200-400 mOsm. 37. The formulation of claim 36, wherein the solution has a pH in the range of 3-6. 37. The formulation of claim 36, wherein the formulation is suitable for topical administration. A pharmaceutical formulation comprising an aqueous solution of a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (IV):

[Where valence and stability allow,
R ₁ , R ₂ , R ₃ and R ₄ each independently represent H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl;
L, independently for each, or either absent - _{(CH 2) n} -, - alkenyl -, - alkynyl -, - _{(CH 2) n} alkenyl -, - _{(CH 2) n} alkynyl -, - _{(CH 2) n O (CH} 2) p -, - (CH 2) n NR 8 (CH 2) p -, - (CH 2) n S (CH 2) p -, - (CH 2) n alkenyl ( _{CH 2) p -, - (} CH 2) n alkynyl _{(CH 2) p -, -} O (CH 2) n -, - NR 8 (CH 2) n - or -S _{(CH 2) n} - represents,
X is _{independently, -N (R 8) -,} - O -, - S -, - (R 8) N-N (R 8) -, - ON (R 8) - and is selected from a direct bond,
R ₈ , for each occurrence, independently represents H, lower alkyl, — (CH ₂ ) _n aryl or — (CH ₂ ) _n heteroaryl, or two R _{8 taken} together from 4 members to 8 members. Form a ring of members,
M is absent or L, _-SO 2 L-or - (C = O) L- and represents;
p independently represents an integer from 0 to 3; and n independently represents an integer from 0 to 5]. R ₁ is an alkyl branched, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, formulation of claim 47. R _{1, R 2} and _{R 3} includes an aryl group, formulation of claim 47. 50. The formulation of claim 47, wherein XLR ₄ comprises a cyclic amine. 48. The formulation of claim 47, wherein X is part of a diaza carbocycle. 48. The formulation of claim 47, wherein the salt is chloride, bromide, iodide, succinate, tartrate, lactate, mesylate or maleate. 50. The formulation of claim 47, wherein the solution comprises a dissolved physiologically acceptable salt. 54. The formulation of claim 53, wherein the physiological salt is sodium acetate. 48. The formulation of claim 47, wherein the aqueous solution further comprises a solute selected from dextrose, lactose, mannitol or other polyhydroxylated compound. 48. The formulation of claim 47, wherein the aqueous solution has a permeability of 200-400 mOsm. 48. The formulation of claim 47, wherein the solution has a pH in the range of 3-6. 50. The formulation of claim 47, wherein the formulation is suitable for topical administration. 37. A method of inhibiting activation of the hedgehog pathway in a cell, comprising contacting the cell with the formulation of claim 36. 48. A method of inhibiting activation of the hedgehog pathway in a cell, comprising contacting the cell with the formulation of claim 47. 37. A method of treating or preventing basal cell carcinoma, comprising administering to a patient the formulation of claim 36 in an amount sufficient to prevent the progression of basal cell carcinoma. 49. A method of treating or preventing basal cell carcinoma, comprising administering to a patient the formulation of claim 47 in an amount sufficient to prevent the progression of basal cell carcinoma. A pharmaceutical formulation comprising an aqueous solution of a pharmaceutically acceptable salt of a compound represented by the following general formula (V):

[Where valence and stability allow,
Y is O or S;
Z ′ is SO ₂ , — (C ＝ S) — or — (C ＝ O) —,
p represents, independently for each occurrence, an integer from 0 to 3,
n represents, independently for each occurrence, an integer from 0 to 5,
q and r independently represent an integer of 0 to 2 for each occurrence;
V is absent or represents O, S or NR ₈ ;
G is or -C is absent (= O) - or -SO ₂ - represents,
J is independently for each occurrence a substituted or unsubstituted lower alkyl or alkylene linked to NC (= Y) such that both the presence of hydrogen or N in contact with J are linked by at least one occurrence of J. Represent,
R ₉ , independently for each occurrence, is absent or represents H or lower alkyl, or two occurrences of J or one occurrence of J together with one occurrence of R ₉ is 5-7. A ring comprising one or both of N, wherein R ₅ is a substituted or unsubstituted alkyl (branched or unbranched), alkenyl (branched or unbranched) , Alkynyl (branched or unbranched), cycloalkyl or cycloalkylalkyl,
R ₆ represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl, heteroaralkyl, heterocyclyl, heterocyclylalkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl (including a polycyclic group);
R ₇ represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl or heteroaralkyl. 64. The formulation of claim 63, wherein Y and Z are O. 64. The formulation of claim 63, wherein the sum of q and r is less than 4. 64. The formulation of claim 63, wherein at least one occurrence of J is a 5-8 membered heterocyclic moiety. R ₅ is an alkyl branched, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, formulation of claim 63. R ₆ comprises at least one hetero ring, formulation of claim 63. R ₇ is phenyl alkyl, formulation of claim 63. 64. The formulation of claim 63, wherein the salt is chloride, bromide, iodide, succinate, tartrate, lactate, mesylate, or maleate. 64. The formulation of claim 63, wherein the solution comprises a dissolved physiologically acceptable salt. 72. The formulation of claim 71, wherein the physiologically salt is sodium acetate. 64. The formulation of claim 63, wherein the aqueous solution further comprises a solute selected from dextrose, lactose, mannitol or other polyhydroxylated compound. 64. The formulation of claim 63, wherein the aqueous solution has a permeability of 200-400 mOsm. 64. The formulation of claim 63, wherein the solution has a pH in the range of 3-6. 64. The formulation of claim 63, wherein the formulation is suitable for topical administration. 64. A method of inhibiting activation of the hedgehog pathway in a cell, comprising contacting the cell with the formulation of claim 63. 64. A method of treating or preventing basal cell carcinoma, comprising administering to a patient the formulation of claim 63 in an amount sufficient to inhibit the progression of basal cell carcinoma. A pharmaceutical formulation comprising an aqueous solution of a pharmaceutically acceptable salt of a compound represented by the following general formula (VI):

[Where valence and stability allow,
Y is O or S;
Z ′ is SO ₂ , — (C ＝ S) — or — (C ＝ O) —,
p represents, independently for each occurrence, an integer from 0 to 3,
n represents, independently for each occurrence, an integer from 0 to 5,
V is absent or represents O, S or NR ₈ ;
G is or -C is absent (= O) - or -SO ₂ - represents,
J is independently for each occurrence a substituted or unsubstituted lower alkyl or alkylene linked to NC (= Y) such that both the presence of hydrogen or N in contact with J are linked by at least one occurrence of J; For example, represents methyl, ethyl, methylene, ethylene,
R ₉ , independently for each occurrence, is absent or represents H or lower alkyl, or two occurrences of J or one occurrence of J together with one occurrence of R ₉ is 5-7. A ring comprising one or both of N, wherein R ₅ is a substituted or unsubstituted alkyl (branched or unbranched), alkenyl (branched or unbranched) , Alkynyl (branched or unbranched), cycloalkyl or cycloalkylalkyl,
R ₆ represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl, heteroaralkyl, heterocyclyl, heterocyclylalkyl, cycloalkyl or cycloalkylalkyl (including a polycyclic group);
R ₇ represents a substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, heteroaryl or heteroaralkyl. 80. The formulation of claim 79, wherein Y and Z are O. 80. The formulation of claim 79, wherein at least one occurrence of J is a 5-8 membered heterocyclic moiety. R ₅ is an alkyl branched, cycloalkyl or cycloalkylalkyl, formulation of claim 79. R ₆ comprises at least one hetero ring A formulation according to claim 79. R ₇ is phenyl alkyl, formulation of claim 79. 80. The formulation of claim 79, wherein the salt is chloride, bromide, iodide, succinate, tartrate, lactate, mesylate or maleate. 80. The formulation of claim 79, wherein the solution comprises a dissolved physiologically acceptable salt. 91. The formulation of claim 86, wherein the physiological salt is sodium acetate. 80. The formulation of claim 79, wherein the aqueous solution further comprises a solute selected from dextrose, lactose, mannitol, or other polyhydroxylated compound. 80. The formulation of claim 79, wherein the aqueous solution has a permeability of 200-400 mOsm. 80. The formulation of claim 79, wherein the solution has a pH in the range of 3-6. 80. The formulation of claim 79, wherein the formulation is suitable for topical administration. 80. A method of inhibiting activation of the hedgehog pathway in a cell, comprising contacting the cell with the formulation of claim 79. 80. A method for treating or preventing basal cell carcinoma, comprising administering to a patient the formulation of claim 79 in an amount sufficient to prevent the progression of basal cell carcinoma.

Images