JP2004529605A - Dermatophagoides nucleic acid molecules, proteins and uses thereof - Google Patents
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Abstract
本発明は、高分子量のDermatophagoidesタンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸分子、およびこのようなタンパク質から誘導される治療薬および診断薬に関する。本発明は、約60(kdもしくはkD)、70kD、または約98kD〜約109kDの分子量を有する新規のタンパク質に関する。このようなタンパク質は、Dermatophagoides族のダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも1つのエピトープを含み、そして本明細書中で、Der HMW−mapタンパク質と命名される。本発明はまた、全長タンパク質もしくは成熟タンパク質のフラグメントまたはペプチドであるタンパク質、ならびにこのようなタンパク質のいずれかの抗体、ミメトープ、またはムテインを提供する。The present invention relates to high molecular weight Dermatophagoides proteins, nucleic acid molecules encoding such proteins, and therapeutic and diagnostic agents derived from such proteins. The present invention relates to novel proteins having a molecular weight of about 60 (kd or kD), 70 kD, or about 98 kD to about 109 kD. Such proteins comprise at least one epitope of a Dermatophagoides family of mite protein allergens and are herein designated as Der HMW-map proteins. The invention also provides proteins that are fragments or peptides of the full-length or mature proteins, as well as antibodies, mimetopes, or muteins of any of such proteins.
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、高分子量のDermatophagoidesタンパク質、核酸分子、およびこのようなタンパク質に由来する治療薬および診断薬に関する。
【0002】
(発明の背景)
アレルギー症状を媒介するイムノグロブリンE(IgE)は、多くの動物を苦しめる。動物におけるIgE抗体産物は、例えば、アトピー性疾患、喘息および鼻炎を含む、病原性IgE応答を誘導し得る。アレルゲンは、感受性のある個体において病原性IgE応答を誘導する能力により特徴付けされるタンパク質またはペプチドである。
【0003】
イエダニ(例えば、Dermatophagoides farinaeおよびDermatophagoides pteronyssinus;それぞれ、Der fおよびDer p)アレルゲンは、IgE媒介の病因に関連した主要な原因物質である。以前の研究者は、ヒトにおけるイエダニアレルギーの2つの大群(第I群(Der fIおよびDer pI、Mr25,000)ならびに第2群(Der fIIおよびDer pII、Mr14,000);Chapmanら、Allergy,第52巻、37−379頁、1997年)を同定している。以前の研究者は、以下のものについてのヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列を開示している:Der fI、Der fII、Der pI、およびDer pII、米国特許第5,552,142号(Thomasら、1996年9月3日発行)、米国特許第5,460,977号(Andoら、1995年10月24日発行)、PCT特許出願公開番号WO95/28424(Chenら、1995年10月26日公開)、米国特許第5,433,948号(Thomasら、1995年7月18日発行)、PCT特許出願公開番号WO93/08279号(Garmenら、1993年3月4日発行)またはChapman、前出;Der pIII、PCT特許出願公開番号WO95/15976(Thomasら、1995年6月15日公開);Der pVII、PCT特許出願公開番号WO94/20614(Thomasら、1994年9月15日);40キロダルトン(kd)Der fアレルゲン、米国特許第5,405,758号(Okaら、1995年4月11日)、米国特許第5,314,991号(Okaら、1994年5月24日);熱ショックタンパク質(Hsp70)である70−kd Der fアレルゲン、Akiら、J.Biochem.、第115巻、435−440、1994;またはNoliら、Vet.Immunol.Immunopath.,第52巻、147−157頁、1996;ならびに98−kd Der fパラミオシン様アレルゲン、Tsaiら、J.Allergy Clin.Immunol.,第102巻、295−303頁、1998年。これらの公開された配列は、本発明のダニアレルギー核酸分子もタンパク質も、そしてまたイヌ血清、ネコ血清、またはヒト血清中のIgE抗体と免疫反応性であるこのようなタンパク質の関連性も、開示も示唆も予想もしていない。
【0004】
本発明の生成物およびプロセスは、ダニアレルギーの特異的検出および処置を提供する分野において必要とされる。
【0005】
(発明の要旨)
本発明は、約60(kdもしくはkD)70kDまたは約98kD〜約109kDの分子量を有する新規のタンパク質に関する。このようなタンパク質は、Dermatophagoides属のダニのタンパク質アレルゲンの少なくとも1つのエピトープを含み、そして本明細書中でDer HMW−mapタンパク質と命名される。好ましいタンパク質は、Dermatophagoides farinaeまたはDermatophagoides pteronyssiusタンパク質である。本発明はまた、全長タンパク質もしくは成熟タンパク質のフラグメントまたはペプチドであるタンパク質、ならびにこのようなタンパク質の任意の抗体、ミメトープ、またはムテインを提供する。本発明はまた、このようなタンパク質のいずれかをコードする核酸分子、ならびにこれらの相補体を提供する。本発明はまた、このようなタンパク質、核酸分子、抗体、ミメトープ、またはムテインを得るための方法、ならびに診断用途または治療用途にこのような化合物を使用するための方法を提供する。本発明はまた、ダニアレルギー性のイヌまたはネコのIgEに結合する非タンパク質様エピトープを含む試薬、ならびにこのようなエピトープに対して惹起された抗体に関する。本発明はまた、このような非タンパク質様エピトープを含む治療組成物またはアッセイキット、ならびにダニに対するアレルギー性応答に感受性の動物を同定および/または脱感作する方法に関し、この方法は、本発明の非タンパク質様エピトープの使用を含む。
【0006】
本発明の1つの実施形態は、以下の単離された核酸分子の少なくとも1つである:(a)少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子(ここで、このような核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中、約50℃の温度にて、以下の核酸配列の少なくとも1つを含む核酸分子にハイブリダイズする):配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補鎖;ならびに(b)(a)の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子(ここで、このフラグメントは、少なくとも約15ヌクレオチドを含む)。本発明はまた、このような核酸配列を含む組換え分子、組換えウイルスおよび組換え細胞、ならびにこれらを産生する方法を含む。
【0007】
本発明の別の実施形態は、以下の核酸分子の少なくとも1つによってコードされる単離されたタンパク質である:(a)少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子(ここで、このような核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中、約50℃の温度にて、以下の核酸配列の少なくとも1つを含む核酸分子にハイブリダイズする):配列番号16、配列番号19、配列番号22、配列番号36、配列番号39、配列番号42、配列番号45、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列;ならびに(b)(a)の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子(ここで、このフラグメントは、少なくとも約15ヌクレオチドを含む)。本発明の単離されたタンパク質はまた、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つを有するタンパク質をコードする核酸分子の相補体と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされ得る:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および配列番号44。本発明はまた、本発明のタンパク質に選択的に結合する抗体、ならびにこのようなタンパク質または抗体を産生および使用する方法を含む。
【0008】
本発明はまた、ダニに対するアレルギー応答を処置するための治療組成物を含む。このような治療組成物は、少なくとも1つの以下の脱感作化合物を含む:(a)本発明の単離された核酸分子;(b)本発明の単離されたダニアレルギー性タンパク質;(c)このようなダニアレルギー性タンパク質のミメトープ;このようなダニアレルギー性タンパク質のムテイン;(e)このようなダニアレルギー性タンパク質に対する抗体;および(f)IgEに対するダニアレルギー性タンパク質の結合のインヒビター。ダニに対するアレルギー性応答に対して、宿主動物を脱感作する方法もまた含まれる。このような方法は、本発明の治療組成物を動物に投与する行程を包含する。
【0009】
本発明の1つの実施形態は、ある動物が、ダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか否か、またはこの応答を有するか否かを試験するアッセイキットである。このようなキットは、本発明の単離されたタンパク質、ならびにこの動物が、このアレルギー性応答に感受性であるか否か、またはこの応答を有するか否かを決定するための手段を含む。このような手段は、ダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか、またはこの応答を有する動物を同定するための、このようなタンパク質の使用を含む。本発明はまた、ダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか、またはこの応答を有する動物を同定する方法を含む。このような方法は、以下の行程を包含する:(a)本発明の単離されたタンパク質を動物の抗体と接触させる行程;および(b)タンパク質と抗体との間の免疫複合体形成を決定する行程(ここで、この免疫複合体の形成は、この動物がダニに対するアレルギー性応答に感受性であるか、またはこの応答を有することを示す)。
【0010】
本発明は、以下の同定された特性の少なくとも1つを有する非タンパク質様エピトープを含む試薬を含む:(a)エピトープが、ペプチドのβ脱離に耐性である;(b)エピトープがプロテインキナーゼK消化に耐性である;および(c)エピトープがグリコシル化タンパク質を検出するために設計された試験に反応性である。このようなエピトープは、以下の抗体の少なくとも1つに結合する:ダニに対してアレルギー性のイヌ由来のイヌIgE、およびダニに対してアレルギー性のネコ由来のネコIgE。このような非タンパク質様エピトープおよびこのようなエピトープの誘導体を選択的に結合する単離された抗体もまた含まれる。
【0011】
本発明はまた、本発明の非タンパク質様エピトープを含む治療組成物およびアッセイキット、ならびにダニに対するアレルギー応答に感受性の動物を同定および/または脱感作する方法に関し、この方法は、本発明の非タンパク質様エピトープの使用を包含する。
【0012】
(発明の詳細な説明)
本発明は、約60キロダルトン(kD)〜約109キロダルトンの範囲の分子量を有する単離されたタンパク質を提供し、これは、Dermatophagoides属のダニ(特に、Dermatophagoides farinae種および/またはDermatophagoides pteronyssius種のダニ)のタンパク質アレルゲンのエピトープの少なくとも1つを含む。このようなタンパク質は、本明細書中でDer HMW−mapタンパク質と呼ばれる。本発明は、さらに、Der HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子、Der HMW−mapタンパク質に対する抗体、およびDer HMW−mapタンパク質活性のインヒビターを、単離および同定する方法を含む。本明細書中で用いられる場合、用語「単離されたDer HMW−mapタンパク質」とは、Dermatophagoides、さらに好ましくは、Dermatophagoides farinaeおよび/またはDermatophagoides pteronyssius(これら自体は、その天然の供給源に由来するか、または、例えば、組換え核酸技術または化学合成を用いて産生される)由来のDer HMW−mapタンパク質をいう。本発明には、Der HMW−mapタンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンを検出するための方法、ダニアレルゲンに対する病因を処置するための方法、および以下に開示されるような他の適用における、このタンパク質および抗体の使用もまた含まれる。本発明の産物およびプロセスは都合がよい。なぜならば、これらは、動物の体液における抗Der HMW−map抗体の検出、およびIgEまたは疾患に関与するDer HMW−mapタンパク質活性の阻害を可能にするからである。
【0013】
本発明の1つの実施形態は、以下を含む単離されたDermatophagoidesアレルギー性組成物である:(a)以下を包含する方法により産生される組成物:(1)ゲルろ過カラムにDermatophagoides抽出物の可溶性タンパク質を適用する行程;(2)ゲルろ過カラムから排除されたタンパク質を収集し、そしてこの排除されたタンパク質をアニオン交換カラムに適用する行程;および(3)約0.3M Tris−HCl(pH8)を有するアニオン交換カラムに結合したタンパク質を溶出して、Dermatophagoidesアレルギー性組成物を得る行程;および(b)行程(a)に関して産生されたタンパク質のペプチドを含む組成物(ここで、このアレルギー性組成物は、IgEに結合すること、Bリンパ球応答を刺激すること、およびTリンパ球応答を刺激することを含む、生物学的機能を可能にする)。このようなDermatophagoidesアレルギー性組成物はまた、本明細書中でDer HMW−map組成物ともいわれる。適切なゲルろ過カラムとしては、約50kDと約150kDの間の分子量を有するタンパク質を排除し得る任意のゲルろ過カラムが挙げられる。好ましいゲルろ過カラムとしては、Sephacryl S−100カラムが挙げられるが、これに限定されない。適切なアニオン交換カラムとしては、約pI6未満のpIを有するタンパク質に結合し得る任意のアニオン交換カラムが挙げられる。好ましいアニオン交換カラムとしては、Q−Sepharoseカラムが挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で用いられる場合、「Bリンパ球応答を刺激する」とは、動物において本発明のDer HMW−mapにより優先的に誘導され、そしてBリンパ球の活性を伴う、動物における体液性免疫応答の増加をいう。本明細書中で用いられる場合、「Tリンパ球応答を刺激する」とは、動物において本発明のDer HMW−mapにより優先的に誘導され、そしてTリンパ球の活性を伴う、動物における体液性免疫応答の増加をいう。
【0014】
本発明の1つの実施形態は、Der HMW−mapタンパク質を含む単離されたタンパク質である。用語(ある)(「a」または「an」)実体とは、1つ以上の実体をいうことについて特に言及する。例えば、(ある)タンパク質、(ある)核酸分子、(ある)抗体、(ある)インヒビター、(ある)化合物、または(ある)治療組成物とは、それぞれ、「1つ以上」または「少なくとも1つ」のタンパク質、「1つ以上」または「少なくとも1つ」の核酸分子、「1つ以上」または「少なくとも1つ」の抗体、「1つ以上」または「少なくとも1つ」のインヒビター、「1つ以上」または「少なくとも1つ」の化合物、あるいは「1つ以上」または「少なくとも1つ」の治療組成物をいう。それ自体では、用語「ある(「a」(または「an」))」、「1つ以上」、および「少なくとも1つ」とは、本明細書中で交換可能に用いられ得る。用語「含む」、「含有する」、および「有する」とは、交換可能に用いられ得ることについて特に言及する。本発明に従って、単離されたタンパク質、または生物学的に純粋なタンパク質は、その天然の環境から取り出されているタンパク質である。これ自体では、「単離された」および「生物学的に純粋な」とは、タンパク質が精製されている程度を反映する必要はない。本発明の単離されたタンパク質は、その天然の供給源から得られ得るか、組換えDNA技術を用いて生成され得るか、または化学合成により生成され得る。
【0015】
本明細書中で用いられる場合、Der HMW−mapタンパク質は、全長タンパク質、またはこのようなタンパク質の任意のホモログであり得る。本明細書中で用いられる場合、タンパク質とは、ポリペプチドまたはペプチドであり得る(これらの用語が、当業者に用いられる)。好ましくは、Der HMW−mapタンパク質は、Der HMW−mapタンパク質に対するIgE媒介性の病因を示す動物由来の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の存在下で、IgE抗体により認識される(すなわち、本発明のタンパク質がIgE抗体に結合する)、Bリンパ球の表面上の抗体により認識される、そして/あるいはT細胞レセプターにより認識されるエピトープの少なくとも1つを含む、Der HMW−mapタンパク質の少なくとも一部を含む。
【0016】
本発明のペプチドは、IgEに結合し得る、ダニアレルゲンに対して動物を脱感作し得る、Bリンパ球応答を刺激し得る、そして/あるいはTリンパ球応答を刺激し得る、本発明のDer HMW−mapタンパク質を含む。好ましくは、本発明のペプチドは、Bリンパ球エピトープ、またはTリンパ球エピトープを含む。Bリンパ球エピトープを有するペプチドは、抗体に結合し得る。Tリンパ球エピトープを有するペプチドは、ペプチドがT細胞レセプターを介してTリンパ球を刺激し得るような様式でMHC分子に結合し得る。本発明に従って、Bリンパ球エピトープを含むペプチドは、約4残基〜約50残基の長さ、好ましくは、約5残基〜約20残基の長さであり得る。本発明に従って、Tリンパ球エピトープを含むペプチドは、約4残基〜約20残基の長さ、好ましくは、約8残基〜約16残基の長さであり得る。
【0017】
本発明のDer HMW−mapタンパク質(ホモログを含む)は、Der HMW−mapタンパク質に対するアレルギー性応答を誘導し得るタンパク質の能力により、単純な方法で同定され得る。Der HMW−mapタンパク質ホモログの例としては、Der HMW−mapタンパク質が挙げられ、ここで、アミノ酸は、欠失(例えば、ペプチドのようなタンパク質の短縮型バージョン)、挿入、転換、置換、および/または誘導体化(例えば、グリコシル化、ホスホリル化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および/またはグリセロホスファチジルイノシトールの付加による)されており、その結果、ホモログは、天然のDer HMW−mapタンパク質に対するアレルギー応答を誘導し得る。
【0018】
Der HMW−mapタンパク質ホモログは、天然の対立遺伝子改変または天然の変異の結果であり得る。本発明のDer HMW−mapタンパク質ホモログはまた、タンパク質に対する直接的改変、あるいは例えば、無作為変異もしくは標的化された変異をもたらす、古典的核酸技術もしくは組換え核酸技術を用いる、タンパク質をコードする遺伝子に対する改変を含むが、これらに限定されない、当該分野で公知の技術を用いて産生され得る。
【0019】
本発明の1つの実施形態は、Der HMW−map遺伝子であり、これは、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、および配列番号45の核酸配列、ならびにこれらの核酸配列のいずれかの相補体を含む。これらの核酸配列は、本明細書中でさらに記載される。例えば、核酸配列(配列番号14)は、Der HMW−map遺伝子の核酸分子nDerf981752(この生成は実施例に開示される)として、本明細書中で示されるcDNA(相補的DNA)のコード鎖の縮重配列を示す。核酸分子nDerf981752は、明らかに全長コード領域を含む。配列番号14の相補体(配列番号16により本明細書中で示される)は、配列番号14を有する鎖に相補的な鎖の核酸配列をいい、これは当業者により簡単に決定され得る。同様に、本発明の任意の核酸配列の核酸配列相補体とは、配列が引用される鎖に相補的である(すなわち、この鎖と二重鎖を形成し得る)核酸鎖の核酸配列をいう。核酸配列決定技術は全体として誤りをなくせないので、配列番号14(ならびに本明細書中で示される他の核酸配列およびタンパク質配列)は、本発明のDer HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子の明確な核酸配列を示すことに注目すべきである。
【0020】
別の実施形態では、Der HMW−map遺伝子、または核酸分子は、配列番号14または配列番号16に類似するが同一ではない対立遺伝子改変体、あるいは本明細書中で引用される任意の他のDer HMW−map核酸配列であり得る。例えば、配列番号14または配列番号16を含むDer HMW−map遺伝子の対立遺伝子改変体は、配列番号14および配列番号16を含む遺伝子と、本質的に同じゲノムの遺伝子座(単数および複数)で生じる遺伝子であるが、これらは、例えば、変異または組換えにより生じる天然のバリエーションに起因して、類似するが同一ではない配列を有する。天然の選択は、代表的に、機能に影響する変異に対する選択であるので、対立遺伝子改変体(すなわち、引用される核酸配列に対応するか、または引用される核酸配列の対立遺伝子)は、通常、比較される遺伝子によりコードされるタンパク質の活性に類似する活性を有するタンパク質をコードする。遺伝子または核酸分子の対立遺伝子改変体はまた、(例えば、コントロール領域を調節する際に)遺伝子の5’または3’の非翻訳領域の変化を含み得るか、初期翻訳物の選択的スプライシングを伴って、それにより交互にエキソンを並列にし得る。対立遺伝子改変体は、当業者に周知であり、そして所定のチリダニ(例えば、Dermatophagoides)内で天然に存在することが予測される。なぜならば、代表的ゲノムは、二倍体であり、そして有性生殖は、対立遺伝子の再分類を生じるからである。
【0021】
本発明の1つの実施形態では、単離されたDer HMW−mapタンパク質は、Der HMW−mapタンパク質をコードする遺伝子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる。本発明のDer HMW−mapタンパク質の最小のサイズは、対応する天然のタンパク質をコードする核酸分子の相補的配列と、安定なハイブリッドを形成し得る(すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする)核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。このようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸の組成、およびDer HMW−map核酸分子と相補的核酸配列との間の%相同性に依存する。ストリンジェントな条件下で安定なハイブリッドを形成するために必要とされる相同性の範囲は、相同配列が所定の核酸分子の全体を通じて散在するか、または所定の核酸分子の別個の領域にクラスター化する(すなわち、局在化する)かに依存して変化し得ることが容易に理解される。
【0022】
Der HMW−mapタンパク質をコードする遺伝子と安定なハイブリッドを形成し得る核酸分子の最小のサイズは、この核酸分子がGCリッチである場合、代表的には、少なくとも約12ヌクレオチド〜約15ヌクレオチドの長さであり、そしてこれがATリッチである場合、少なくとも約15ヌクレオチド〜約17塩基の長さである。本発明のDer HMW−mapタンパク質ホモログをコードするために用いられる核酸分子の最小のサイズは、約12ヌクレオチド〜約18ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約12ヌクレオチドの長さ、約15ヌクレオチドの長さ、または約18ヌクレオチドの長さである。従って、本発明のDer HMW−mapタンパク質ホモログの最小の長さは、約4〜約6アミノ酸の長さである。本発明のDer HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子の最小サイズに対して、特定の制限以外の制限はない。なぜならば、本発明の核酸分子は、ある遺伝子、遺伝子全体、または複数の遺伝子の一部を含み得るからである。本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質の好ましいサイズは、このようなタンパク質の全長タンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質、または機能的タンパク質のいずれが所望されるかに依存する。好ましくは、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質の好ましいサイズは、免疫応答を誘導するタンパク質の一部であり、これは、約30アミノ酸、より好ましくは、約35アミノ酸、そしてさらにより好ましくは、約44アミノ酸の長さである。
【0023】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、核酸分子がハイブリダイズし、そして数学的に規定され得る、遺伝子の規定された物理学的特性に基づいて決定される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者が非相同的な核酸分子間の優位な類似性を同定することを可能にする、実験パラメーターである。これらの条件は、当業者に周知である。例えば、Sambrookら、1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LabsPress、およびMeinkothら、1984,Anal.Biochem.138,267−284を参照のこと。参考文献に詳細に説明されるように、ハイブリダイゼーション条件の決定は、イオン強度(M(モル/リットル))、ハイブリダイゼーション温度(℃)、核酸らせん不安定化剤(例えば、ホルムアミド)の濃度、最も短いハイブリッド二重鎖の平均の長さ(n)、および未知の核酸分子がハイブリダイズするフラグメントのG+C組成のパーセントを含む一組の変数の操作を伴う。少なくとも約150ヌクレオチドの核酸分子について、これらの変数は、標準的な数式に代入されて、所定の核酸分子の融解温度(すなわちTm)を計算する。以下の式に規定されるように、Tmは、2つの鎖の間が100%相補性であるとみなされている、2つの相補的核酸分子鎖が解離する温度である:
Tm=81.5℃+16.6logM+0.41(G+Cの%)−500/n−0.61(ホルムアミドの%)。約50ヌクレオチドよりも小さい核酸分子について、ハイブリッド安定性は、解離温度(Td)(50%の二重鎖が解離する温度として規定される)により規定される。これらのより小さな分子について、標準的なイオン強度での安定性は、以下の式により定義される:
Td=4(G+C)+2(A+T)。
【0024】
Tdより5℃低い温度が、完全に一致した分子間のハイブリダイゼーションを決定するために用いられる。
【0025】
また、どれくらいの塩基対のミスマッチ(すなわち、比較される2つの核酸分子間の差異)が所定の位置の塩基の非相補性を含み、そしてギャップが、比較される核酸分子のいずれかの所定の位置での1つ以上の塩基の挿入または欠失に起因して、異なるサイズの核酸分子に関するTmまたはTdに影響するかも当業者に周知である。例えば、Tmは、約150bpよりも大きいハイブリッドに関して、1%のミスマッチの塩基対の各々について約1℃低下し、そしてTdは、約50bpよりも小さいハイブリッドに関して、ミスマッチの塩基対の各々について約5℃低下する。約50〜約150塩基対の間のハイブリッドの条件は、経験的にかつ過度な実験なしに、当業者に周知の標準的な実験手順を用いて決定され得る。これらの単純な手順は、当業者に、特定の塩基対ミスマッチ%未満を有する核酸ハイブリッドのみがハイブリダイズするような、(例えば、塩濃度、ホルムアミド濃度、または温度を変化させることによる)ハイブリダイゼーション条件の設定を可能にさせる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約30%未満の塩基対ミスマッチ(すなわち、約70%以上の同一性)を有する分子間のハイブリダイゼーションを可能にさせる実験条件であることが、当業者により一般に理解される。当業者は、試験される所定の核酸分子が、約50ヌクレオチド未満であるか、または約50ヌクレオチドを越えるかを容易に決定し得、従って、ハイブリダイゼーション条件を決定するための適切な式を選択し得るので、当業者は、核酸分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で所定の遺伝子とハイブリダイズするか否か、そして、同様に、核酸分子が、所望の量の塩基対ミスマッチを可能にするように設計された条件下でハイブリダイズするか否かを決定し得る。
【0026】
ハイブリダイゼーション反応はしばしば、ハイブリダイズされるべき核酸分子を、膜のような固体支持体に付着させる工程、次いで、ハイブリダイゼーション溶液中に懸濁された標識核酸分子(代表的に、プローブと称される)とハイブリダイズさせる工程によって実施される。一般的なハイブリダイゼーション反応技術の例としては、周知のサザンブロッティング手順およびノーザンブロッティング手順が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、実際のハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェントではない条件(すなわち、より低い温度および/またはより高い塩濃度)でなされ、次いで、高ストリンジェンシーを、所望のストリンジェンシーを達成するためにより高い温度および/またはより低い塩濃度の溶液中でこの膜を洗浄することによって達成する。
【0027】
例えば、当業者が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Dermatophagoides farinaeおよび/またはDermatophagoides pteronyssiusの約150bp長の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を同定することを望む場合、以下の条件が好ましくは使用され得る。Dermatophagoides farinaeおよびDermatophagoides pteronyssiusのDNAの平均G+C含量は、約39%である。未知の核酸分子が支持体膜に付着され、そしてこの150bpのプローブが標識される(例えば、放射性タグを用いて)。ハイブリダイゼーション反応は、2×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中において約37℃の温度(低ストリンジェンシー条件)で実施され得る。異なる濃度のSSCの溶液は、所望される濃度のSSCを得るように20×SSC(1リットルの水中において、175.3gのNaClおよび約88.2gのクエン酸ナトリウム(pH7))のストック溶液を希釈することによって、当業者により作製され得る。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを達成するために、当業者は、30%までの塩基対ミスマッチを許容するために必要とされる洗浄条件を算出する。例えば、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む洗浄溶液中において、完全なハイブリッドのTmは約80℃である:
81.5℃+16.6log(0.15M)+(0.41×39)−(500/150)−(0.61×0)=80.4℃。
従って、約30%の塩基対ミスマッチを有する核酸分子とのハイブリダイゼーションを達成するために、ハイブリダイゼーションの洗浄を、約50℃の温度で実施する。従って、本明細書中に開示される所望される%塩基対ミスマッチ、式およびG/C含量に基づいて、さらなるハイブリダイゼーション温度を算出することは当業者の技術の範囲内である。例えば、本明細書中において特定される配列を有する本発明の核酸分子に対するハイブリダイゼーションについて試験されるべき核酸分子は150ヌクレオチドよりも長いので、30%までの塩基対ミスマッチを許容するハイブリダイゼーション反応のためのTmは、50℃から有意に変動しないことが当業者に理解される。
【0028】
さらに、2つの核酸配列間の類似性程度を決定するための市販のコンピュータープログラムが存在することが当該分野で公知である。これらのコンピュータープログラムは、ハイブリッド核酸分子間の%同一性ならびにギャップの数および長さを決定するための種々の公知の方法を含む。アミノ酸配列間およびまた核酸配列間の%同一性を決定するための好ましい方法は、核酸配列またはアミノ酸配列を比較および分析するために設計された市販の1つ以上のコンピュータープログラムを使用する分析を含む。これらのコンピュータープログラムは、以下を含むが、これらに限定されない:GCGTM(Genetics Computer Group,Madison,WIから入手可能)、DNAsisTM(Hitachi Software,San Bruno,CAから入手可能)およびMacVectorTM(Eastman Kodak Company,New Haven,CTから入手可能)。アミノ酸配列間およびまた核酸配列間の%同一性を決定するための好ましい方法は、プログラムDNAsisバージョン2.1における最大マッチによる比較機能(Compare function by maximum matching)をデフォルトパラメーターで用いる使用を含む。
【0029】
本発明の1つの実施形態は、Der HMW−mapタンパク質を含む。1つの実施形態では、本発明のDer HMW−mapタンパク質は、還元型12%TrisグリシンSDS−PAGEに提示された場合に、図1に示されるように、約98kD〜約109kDの分子量のバンドとして移動するタンパク質を含む。図1におけるこのバンドは、タンパク質を、実施例1に詳細に記載された方法を使用してDermataphagoides farinaeダニから収集する場合に得られる。好ましくは、本発明のDer HMW−mapタンパク質は、約90kD〜約120kD、そしてより好ましくは、約98kD〜約109kDの範囲の分子量を有するタンパク質を含む。本発明の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、mapAおよびmapBを含む。この同定を、実施例の節に記載する。
【0030】
別の実施形態では、本発明のDer HMW−mapタンパク質は、還元型14%TrisグリシンSDS−PAGEに提示された場合に、図2に示されるように、約60kDの分子量のバンドとして移動するタンパク質を含む。図2におけるこのバンドは、タンパク質を、実施例9に詳細に記載された方法を使用してDermataphagoides farinaeダニから収集する場合に得られる。好ましくは、本発明のDer HMW−mapタンパク質は、約60kDの分子量を有するタンパク質を含む。本発明の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、mapDを含む。この同定を、実施例の節に記載する。
【0031】
別の実施形態では、好ましいDer HMW−mapタンパク質は、少なくとも約50ヌクレオチドであるかまたは約150ヌクレオチドであり、かつ、好ましくは約40%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約35%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約30%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約25%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約20%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約15%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、より好ましくは約10%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下、そしてさらにより好ましくは約5%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下において、配列番号16、配列番号19、配列番号22、配列番号36、配列番号39、配列番号42、配列番号45、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、それらの相補体からなる群より選択される核酸分子とハイブリダイズする核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。
【0032】
本発明の別の実施形態は、以下からなる群より選択される核酸分子によってコードされるDer HMW−mapタンパク質を含む:少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで、少なくとも約150ヌクレオチドを含むこの核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中において約50℃の温度で、配列番号16、配列番号19、配列番号22、配列番号36、配列番号39、配列番号42、配列番号45、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体、ならびに少なくとも約15ヌクレオチドを含む上記の任意の核酸分子のフラグメントを含む核酸分子からなる群より選択される核酸配列に対してハイブリダイズする。
【0033】
本発明のさらに別の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号34、配列番号37、配列番号40、配列番号43および/または配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体の核酸配列を有する核酸分子に対して、好ましくは少なくとも約60%同一、より好ましくは少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、そしてさらにより好ましくは少なくとも約95%同一である核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。このようなタンパク質のフラグメントもまた好ましい。本明細書中で使用される場合の%同一性は、プログラムDNAsisバージョン2.1における最大マッチによる比較機能(Compare function by maximum matching)をデフォルトパラメーターで用いて使用することにより決定される。
【0034】
本発明のさらなる好ましいDer HMW−mapタンパク質としては、以下が挙げられる:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44のアミノ酸配列を有するタンパク質、および配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログを含むタンパク質であって、ここでこのようなホモログは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、配列番号44のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する免疫応答を誘発する少なくとも1つのエピトープを含む、タンパク質。同様に、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号34、配列番号37、配列番号40、配列番号43の核酸配列および/または配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、あるいはそれらのホモログによってコードされる核酸分子によってコードされるタンパク質もまた好ましい。
【0035】
本発明の好ましい単離されたタンパク質は、以下の核酸分子のなかの少なくとも1つによりコードされるタンパク質である:nDerf981752、nDerf981665、nDerf981608、nDerp981621、nDerp981527、nDerp981470、nDerf60510、またはこれらの任意の核酸分子の対立遺伝子改変体。別の好ましい単離されたタンパク質は、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号34、配列番号37、配列番号40、配列番号43の核酸配列を有する核酸分子によってコードされるか、またはこれらの列挙された任意の核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質である。
【0036】
配列番号14(nDerf981752のコード鎖)の翻訳により、本明細書中でPDerf98555と称される約555アミノ酸のタンパク質が生じ、このアミノ酸配列は配列番号15に提示され、最初のインフレームコドンは、配列番号14のヌクレオチド1〜ヌクレオチド3にわたると考えられる。配列番号14の相補鎖を、本明細書中では配列番号16として提示する。PDerf98555のアミノ酸配列は、nDerf981665の核酸分子によってコードされ、この核酸分子は、配列番号17に示されるコード鎖および配列番号19に示される相補鎖を有する。配列番号15の分析は、ほぼアミノ酸1〜ほぼアミノ酸19に及ぶシグナルペプチドの存在を示唆している。本明細書中でPDerf98536と称される提案された成熟タンパク質は、約536アミノ酸を含む。この配列は、本明細書中で配列番号21として表され、そして配列番号20(コード鎖)および配列番号22(相補鎖)により表される、本明細書中でnDerf981608と称される核酸分子によってコードされる。
【0037】
配列番号34(nDerp981621のコード鎖)の翻訳により、本明細書中でPDerp98509と称される約509アミノ酸のタンパク質が生じ、このアミノ酸配列は配列番号35に提示され、最初のインフレームコドンは、配列番号34のヌクレオチド14〜ヌクレオチド16にわたると考えられる。配列番号34の相補鎖を、本明細書中では配列番号36として提示する。PDerpf98509のアミノ酸配列は、nDerp981527の核酸分子によってコードされ、この核酸分子は、配列番号37に示されるコード鎖および配列番号39に示される相補鎖を有する。配列番号35の分析は、ほぼアミノ酸1〜ほぼアミノ酸19に及ぶシグナルペプチドの存在を示唆している。本明細書中でPDerp98490と称される提案された成熟タンパク質は、約490アミノ酸を含む。この配列は、本明細書中で配列番号41として表され、そして配列番号40(コード鎖)および配列番号42(相補鎖)により表される、本明細書中でnDerp981470と称される核酸分子によってコードされる。
【0038】
D.farinae 60−kD抗原タンパク質の部分をコードする核酸分子である、配列番号43(nDerf60510のコード鎖)の翻訳により、本明細書中でPDerf60170と称される約170アミノ酸のタンパク質が生じ、このアミノ酸配列は、配列番号44として提示され、最初のインフレームコドンは、配列番号43のヌクレオチド1〜ヌクレオチド3にわたると考えられる。配列番号43に対する相補配列は、本明細書中で配列番号45として表される。
【0039】
本発明の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、PDerf98555と、少なくとも約45%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約55%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、さらにより好ましくは少なくとも約65%、さらにより好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約75%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、そしてさらにより好ましくは約95%同一であるタンパク質を含む。より好ましいのは、PDerf98555、PDerf98536、PDerp98509、PDerp98490、および/またはPDerf60170を含むDer HMW−mapタンパク質;ならびにPDerf98555、PDerf98536、PDerp98509、PDerp98490、および/またはPDerf60170のタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質である。
【0040】
本発明の他の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44のアミノ酸配列と、少なくとも約45%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約55%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、さらにより好ましくは少なくとも約65%、さらにより好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約75%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、さらにより好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、そしてさらにより好ましくは約95%同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。より好ましいのは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44のアミノ酸配列を含むDer HMW−mapタンパク質;ならびに配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44のアミノ酸配列を有するDer HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるDer HMW−mapタンパク質である。
【0041】
本発明の1つの実施形態では、Der HMW−mapタンパク質は、配列番号15、配列番号35、および/または配列番号44のアミノ酸を含み(配列番号15、配列番号35、および/または配列番号44のアミノ酸配列からなるタンパク質、それらのフラグメント、融合タンパク質、および多価タンパク質を含むが、これらに限定されない)、そして配列番号15、配列番号35、および/または配列番号44のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質を含む。
【0042】
1つの実施形態では、好ましいDer HMW−mapタンパク質は、少なくとも約35アミノ酸長、好ましくは少なくとも約50アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約100アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約200アミノ酸長、さらにより好ましくは少なくとも約250アミノ酸長のアミノ酸配列を含む。この実施形態において、本発明の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、配列番号15の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、好ましいDer HMW−mapタンパク質は、全長タンパク質(すなわち、全長コード領域によってコードされるタンパク質)を含む。
【0043】
本発明のさらなる好ましいDer HMW−mapタンパク質は、nDerf981752、nDerf981665、nDerf981608、nDerp981621、nDerp981527、nDerp981470、およびnDerf60510の少なくとも一部を含む核酸分子によってコードされるタンパク質、ならびにこのような核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるDer HMW−mapタンパク質を含む。
【0044】
また好ましいのは、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号34、配列番号37、配列番号40、配列番号43および/または配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにこれらの核酸分子の対立遺伝子改変体の少なくとも一部を含む核酸配列を有する核酸分子によってコードされるDer HMW−mapタンパク質である。
【0045】
別の実施形態では、本発明の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、少なくとも約12ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約16ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約18ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約20ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約25ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約50ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約100ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約350ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約450ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約500ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約800ヌクレオチドを含む核酸分子によってコードされる。この実施形態に含まれるのは、nDerf981752、nDerp981621、および/またはnDerf60510の少なくとも部分によってコードされるDer HMW−mapタンパク質であるか、あるいはこれらの核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるDer HMW−mapタンパク質である。さらに別の実施形態では、本発明の好ましいDer HMW−mapタンパク質は、見かけ上全長のDer HMW−mapコード領域を含む核酸分子(すなわち、見かけ上全長のDer HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子)によってコードされる。
【0046】
本発明のDer HMW−mapタンパク質の1つの実施形態は、1つ以上の融合セグメントに結合されたDer HMW−mapタンパク質含有ドメインを含む融合タンパク質である。本発明での使用に適切な融合セグメントとしては、タンパク質の安定性を増強し得るセグメント;Der HMW−mapタンパク質に対する免疫応答を増強するための免疫増強物質として作用し得るセグメント、Der HMW−mapタンパク質に対するIgE応答を減少し得るセグメント;および/またはDer HMW−mapタンパク質の精製(例えば、アフィニティクロマトグラフィーによる)を補助し得るセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。適切な融合セグメントは、所望される機能(例えば、増加した安定性の付与、タンパク質に対する増加した免疫原性の付与、IgE応答の減少、および/またはタンパク質精製の単純化)を有する任意のサイズのドメインであり得る。融合セグメントは、このタンパク質のDer HMW−mapタンパク質含有ドメインのアミノ末端および/またはカルボキシル末端に結合され得、そしてDer HMW−mapタンパク質の簡単な回収を可能にするために、切断に対して感受性であり得る。融合タンパク質は、好ましくは、Der HMW−mapタンパク質含有ドメインのカルボキシル末端および/またはアミノ末端のいずれかに結合された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸分子で形質転換された組換え細胞を培養することによって生成される。好ましい融合セグメントとしては、以下が挙げられる:金属結合ドメイン(例えば、ポリ−ヒスチジンセグメント);免疫グロブリン結合ドメイン(例えば、プロテインA;プロテインG;T細胞;B細胞;Fcレセプターまたは補体タンパク質の抗体結合ドメイン);糖結合ドメイン(例えば、マルトース結合ドメイン);「タグ」ドメイン(例えば、ガラクトシダーゼ、strepタグペプチド、このドメインに結合する化合物を使用して精製され得る他のドメイン(例えば、モノクローナル抗体)の少なくとも一部分);および/またはリンカーおよび酵素ドメイン(例えば、リンカーによって、Der HMW−mapタンパク質に連結されたアルカリホスファターゼドメイン)。より好ましい融合セグメントとしては、以下が挙げられる:金属結合ドメイン(例えば、ポリ−ヒスチジンセグメント);マルトース結合ドメイン;strepタグペプチド(例えば、Biometra、Tampa,FLから入手され得るペプチド);ファージT7 S10ペプチド。
【0047】
別の実施形態では、本発明のDer HMW−mapタンパク質はまた、1つ以上のアレルゲンから動物を脱感作し得る少なくとも1つのさらなるタンパク質セグメントを含む。このような多価の脱感作タンパク質は、2つ以上の核酸ドメインを含む核酸分子で形質転換された細胞を培養することによって生成され得、この2つ以上の核酸ドメインは、生じる核酸分子が、アレルゲンから動物を脱感作し得る少なくとも2つの脱感作化合物を含む多価の脱感作化合物として発現されるような様式で、共に連結されている。
【0048】
多価の脱感作化合物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:1つ以上のアレルゲン(例えば、植物アレルゲン、動物アレルゲン、寄生生物アレルゲン、または外寄生生物アレルゲン)によって引き起こされるアレルギーに対して脱感作する1つ以上の化合物に対して結合された、本発明のDer HMW−mapタンパク質。アレルゲンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:イネ科草本、メドーフェスキュー(Meadow Fescue)、ギシギシ(Curly Dock)、オオバコ(plantain)、メキシカンファイアーブッシュ(Mexican Firebush)、シロザ(Lamb’s Quarter)、アカザ(pigweed)、ブタクサ(ragweed)、セージ(sage)、ニレ(elm)、オナモミ(cocklebur)、トリネコバカエデ(Box Elder)、クルミ(walnut)、ハコヤナギ(cottonwood)、トネリコ(ash)、シラカンバ(birch)、ヒマラヤスギ(cedar)、オーク(oak)、クワ(mulberry)由来の植物(pant)アレルゲン、ゴキブリ、Dermatophagoides、Alternaria、Aspergillus、Cladosporium、Fusarium、Helminthosporium、Mucor、Penicillium、Pullularia、Rhizopusおよび/またはTricophyton;蠕虫由来の寄生生物アレルゲン;あるいは、クモ形綱、昆虫(ノミ、マダニ、ハエ、カ、スナバエ、ブユ(black fly)、ウマバエ、ノサシバエ(horn fly)、アブ、ツェツェバエ、サシバエ(stable fly)、ハエウジ病原因バエ(myiasis−causing fly)および噛み付きブユ(biting gnats)、アリ、クモ、シラミ;ダニならびに半翅類昆虫を含む)およびヒル型類(leech)由来の外寄生生物アレルゲン。
【0049】
本発明はまた、本発明のDer HMW−mapタンパク質のマイムトープ(mimetope)を含む。本明細書中で使用される場合、本発明のDer HMW−mapタンパク質のマイムトープとは、このようなDer HMW−mapタンパク質の活性(例えば、Der HMW−mapタンパク質に対する免疫応答を誘導するために結合する能力)を模擬し得る任意の化合物をいい、これはしばしば、このマイムトープが、Der HMW−mapタンパク質を模擬する構造を有することに起因する。しかし、マイムトープは、そのマイムトープがDer HMW−mapタンパク質を機能的に模擬する限り、Der HMW−mapタンパク質に類似した構造を有する必要はないことに留意されるべきである。マイムトープは、以下であり得るが、これらに限定されない:分解に対するその感受性を減少するように改変されたペプチド;抗イディオタイプ抗体および/または触媒性抗体、あるいはそれらのフラグメント;単離されたタンパク質の非タンパク質様免疫原性部分(例えば、糖質構造);合成または天然の有機分子または無機分子(核酸を含む);および/または任意の他のペプチド模擬化合物。本発明のマイムトープは、本発明のDer HMW−mapタンパク質に関してコンピューターにより生成される構造を使用して設計され得る。マイムトープはまた、分子(例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたは他の有機分子)の無作為サンプルを生成し、そしてこのようなサンプルを、対応する結合パートナー(例えば、抗Der HMW−mapタンパク質抗体)を使用してアフィニティクロマトグラフィー技術によりスクリーニングすることによって獲得され得る。マイムトープはまた、例えば、合理的薬物設計によって獲得され得る。合理的薬物設計手順では、本発明の化合物の三次元構造を、例えば、核磁気共鳴(NMR)またはX線結晶学によって分析し得る。次いで、この三次元構造を使用して、例えば、コンピューターモデリングによって潜在的なマイムトープの構造を予測し得る。次いで、この予測されたマイムトープ構造を、例えば、化学合成、組換えDNA技術によってか、または天然の供給源からマイムトープを単離することによって、生成し得る。Der HMW−mapタンパク質のマイムトープの特定の例としては、抗イディオタイプ抗体、SelexTM技術を使用して生成されるオリゴヌクレオチド、ペプチドライブラリーの無作為スクリーニングによって同定されるペプチド、およびファージディスプレイ技術によって同定されるタンパク質が挙げられる。好ましいマイムトープは、本発明のDer HMW−mapタンパク質に対して、特に、免疫応答を誘導するDer HMW−mapタンパク質のエピトープに対して、構造的および/または機能的に類似したペプチド模擬化合物である。
【0050】
本発明はまた、本発明のDer HMW−mapタンパク質のムテインも包含する。本明細書中で使用される場合、ムテインとは、所望のアミノ酸残基が置換または除去された、Der HMW−mapタンパク質の特定のホモログをいう。本発明の好ましいムテインとしては、そのムテインを治療用量で動物に投与した場合に、その動物によるアナフィラキシー反応を減少するようにアミノ酸残基が変化された、Der HMW−mapタンパク質ホモログが挙げられる。本発明のより好ましいムテインとしては、Der HMW−mapタンパク質の1つ以上のシステイン残基が置換または除去された、Der HMW−mapタンパク質ホモログが挙げられる。ムテインを生成するための方法は、当業者に公知であり、そしてそのような方法は、本明細書中に開示されている。好ましくは、ムテインは、組換え技術を使用して生成される。
【0051】
本発明の別の実施形態は、Der HMW−map核酸分子を含む、単離された核酸分子である。このような核酸分子の識別的な特徴は、今までに記載されている。本発明の核酸分子は、単離された天然のDer HMW−map遺伝子またはそのホモログを包含し得、この後者は、以下により詳細に記載される。本発明の核酸分子は、1つ以上の調節領域、全長コード領域もしくは部分的コード領域、またはこれらの組み合わせを含み得る。本発明の核酸分子の最小サイズは、別の核酸分子の相補配列との安定なハイブリッドの形成(すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション)を可能にするに十分な、サイズである。
【0052】
本発明に従うと、単離された核酸分子は、その天然環境から取り出された(すなわち、ヒトによる操作を受けた)核酸分子であり、そしてこの単離された核酸分子は、DNA、RNA、またはDNAもしくはRNAのいずれかの誘導体を含み得る。このように、「単離された」とは、その核酸分子が精製された程度を反映しない。本発明の単離されたDer HMW−map核酸分子またはそのホモログは、その天然供給源から単離され得るし、あるいは組換えDNA技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅またはクローニング)または化学合成を使用して生成され得る。単離されたDer HMW−map核酸分子およびそのホモログとしては、例えば、天然の対立遺伝子改変体、ならびに本発明のDer HMW−mapタンパク質をコードする能力を実質的に妨げないような様式でヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および/または逆位によって改変された核酸分子が挙げられ得る。
【0053】
Der HMW−map核酸分子ホモログは、当業者に公知の多数の方法(例えば、Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labs Press;Sambrookら(同書)を、参照のこと)を使用して、生成され得る。例えば、種々の技術を使用して核酸分子が改変され得、このような種々の技術としては、古典的変異誘発技術および組換えDNA技術(例えば、部位特異的変異誘発、化学的処理、制限酵素切断、核酸フラグメントの連結、PCR増幅、オリゴヌクレオチド混合物の合成、および核酸分子混合物を「構築」するための混合物群の連結、ならびにこれらの組み合わせ)が挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子ホモログは、Der HMW−map核酸分子とのハイブリダイゼーションによってか、またはこの核酸分子によりコードされるタンパク質の機能(例えば、Der HMW−mapタンパク質の少なくとも1つのエピトープに対する免疫応答を惹起する能力、またはDer HMW−map活性をもたらす能力)をスクリーニングすることによって、選択され得る。
【0054】
対立遺伝子改変体は、代表的には、その改変体が比較されている遺伝子によりコードされるタンパク質の活性と類似する活性を有する、タンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、その遺伝子の5’非翻訳領域または3’非翻訳領域(例えば、調節制御領域)中に変化を含み得る。対立遺伝子改変体は、当業者に周知であり、そして所定のチリダニにおいて見出されると予測される。なぜなら、そのゲノムは、二倍体であり、そして/または2つ以上のチリダニの群の間にあるからである。本発明はまた、実験室での操作に起因する改変体(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅の間に生成される改変体であるが、これに限定されない)も含む。
【0055】
本発明の単離された核酸分子は、少なくとも1つの本発明のDer HMW−mapタンパク質をコードする、核酸配列を含み得、このようなタンパク質の例は、本明細書中に開示される。句「核酸分子」は、物理的な核酸分子を主に指し、そして句「核酸配列」は、その核酸分子に関するヌクレオチドの配列を主に指すが、この2つの句は、互換可能に使用され得、特に、Der HMW−mapタンパク質をコードすることができる核酸分子または核酸配列に関して、互換可能に使用され得る。
【0056】
本発明の好ましい核酸分子は、動物に投与された場合、Der HMW−mapアレルゲンにより引き起こされるアレルギー反応からその動物を脱感作することができる。以下により詳細に開示されるように、このような核酸分子は、アンチセンスRNA、三重らせんを形成できる分子、リボザイム、または他の核酸ベース薬物化合物であり得るし、またはそれらをコードし得る。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、脱感作タンパク質(例えば、本発明のDer HMW−mapタンパク質)をコードし得、この核酸分子は、例えば、直接注入によって(すなわち、DNA試薬として)か、またはビヒクル(例えば、組換えウイルス試薬または組換え細胞試薬)中で、その動物に送達される。
【0057】
本発明の1つの実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でDer HMW−map遺伝子にハイブリダイズする、単離された核酸分子である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、本明細書中に記載される標準的ハイブリダイゼーション条件を指す。本発明の好ましい核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子とハイブリダイズする、単離された核酸分子を含む。本発明のより好ましい核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体とハイブリダイズする、単離された核酸分子を含む。
【0058】
本発明のより好ましい核酸分子は、少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子からなる群より選択される単離された核酸分子を含み、ここで少なくとも約150ヌクレオチドを含むこの核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液において、温度約50℃にて、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45の核酸配列、および/または配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。
【0059】
本発明はまた、本明細書中に開示される任意の核酸分子のフラグメントをも包含する。本発明に従うと、フラグメントは、そのサイズが、本発明の配列番号により同定される配列より小さい長さと、本明細書中で規定されるようなオリゴヌクレオチドの最小サイズとの間の範囲であり得る、任意の核酸分子または核酸配列を含み得る。例えば、本発明のフラグメントのサイズは、長さが約1752ヌクレオチド未満でありかつ11ヌクレオチドよりは大きい、任意のサイズであり得る。
【0060】
本発明の1つの実施形態において、好ましいDer HMW−map核酸分子は、単離された核酸分子を含み、この単離された核酸分子は、少なくとも約50ヌクレオチドまたは少なくとも約150ヌクレオチドであり、かつこの単離された核酸分子は、約40%以下の塩基対ミスマッチを好ましくは許容する条件下で、より好ましくは、約35%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約30%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約25%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約20%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約15%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは、約10%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、そしてなおより好ましくは、約5%以下の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45の核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。
【0061】
本発明の別の実施形態は、少なくとも約150塩基対を含む核酸分子を含み、ここでこの核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液において、温度約50℃にて、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45の核酸配列、および/または配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。本発明のさらなる好ましい核酸分子は、少なくとも約150塩基対を含む単離された核酸分子のフラグメントを含み、ここでこの核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液において、温度約50℃にて、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45の核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列に、ハイブリダイズする。
【0062】
本発明のさらなる好ましいDer HMW−map核酸分子は、少なくとも約50ヌクレオチドまたは少なくとも約150ヌクレオチドである単離された核酸分子を含み、この単離された核酸分子は、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45の核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体からなる群より選択される核酸配列と、好ましくは少なくとも約60%同一であり、より好ましくは少なくとも約65%同一であり、より好ましくは少なくとも約70%同一であり、より好ましくは少なくとも約75%同一であり、より好ましくは少なくとも約80%同一であり、より好ましくは少なくとも約85%同一であり、より好ましくは少なくとも約90%同一であり、そしてなおより好ましくは少なくとも約95%同一である、核酸配列を含む。このような核酸分子のいずれかのフラグメントもまた、好ましい。同一性パーセントは、プログラムDNAsis Version 2.1内において、デフォルトパラメータを使用して最大一致によるCompare機能を使用して、決定され得る。
【0063】
本発明の1つの実施形態は、核酸分子nDerf981752、nDerf981665、およびnDerf981608、nDerp981621、nDerp981527、nDerp981470、および/もしくはnDerf60510、またはこれらの核酸分子の対立遺伝子改変体の、すべてまたは一部を含む、核酸分子である。本発明の別の好ましい核酸分子は、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45の核酸配列、および/または配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにこれらの核酸配列を有する核酸分子の対立遺伝子改変体、およびこれらの核酸配列を有する核酸分子のホモログの、少なくとも一部を含み;好ましくは、このようなホモログは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44のアミノ酸配列を有するタンパク質に対して、免疫応答を惹起する少なくとも1つのエピトープをコードする核酸分子をコードするか、またはその核酸分子と相補的である。このような核酸分子は、上記配列番号に含まれるヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドを含み得、そのヌクレオチドは、例えば、全長遺伝子、全長コード領域、融合タンパク質をコードする核酸分子、または多価防御化合物をコードする核酸分子であるが、これらに限定されない。
【0064】
1つの実施形態において、本発明のDer HMW−map核酸分子は、PDerf98555、PDerp98509、および/またはPDerf60170と、少なくとも約45%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約55%、なおより好ましくは少なくとも約60%、なおより好ましくは少なくとも約65%、なおより好ましくは少なくとも約70%、なおより好ましくは少なくとも約75%、なおより好ましくは少なくとも約80%、なおより好ましくは少なくとも約85%、なおより好ましくは少なくとも約90%、そしてなおより好ましくは少なくとも約95%同一である、タンパク質をコードする。なおより好ましいのは、PDerf98555、PDerf98536、PDerp98509、PDerp98490、および/もしくはPDerf60170をコードする核酸分子、ならびに/またはこのような核酸分子の対立遺伝子改変体である。
【0065】
別の実施形態において、本発明のDer HMW−map核酸分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44と、少なくとも約45%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約55%、なおより好ましくは少なくとも約60%、なおより好ましくは少なくとも約65%、なおより好ましくは少なくとも約70%、なおより好ましくは少なくとも約75%、なおより好ましくは少なくとも約80%、なおより好ましくは少なくとも約85%、なおより好ましくは少なくとも約90%、そしてなおより好ましくは少なくとも約95%同一である、アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本発明はまた、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/または配列番号44の少なくとも一部を有するタンパク質をコードするDer HMW−map核酸分子、ならびにこれらの配列を有するタンパク質をコードするDer HMW−map核酸分子の対立遺伝子改変体(発現される細胞のコドン使用頻度特性に適合するように改変された、核酸分子を含む)も、包含する。
【0066】
別の実施形態において、好ましいDer HMW−map核酸分子は、少なくとも約35アミノ酸長、好ましくは少なくとも約50アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約100アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約200アミノ酸長、なおより好ましくは少なくとも約250アミノ酸長を含む、Der HMW−mapタンパク質をコードする。
【0067】
本発明の特定のDer HMW−map核酸分子の核酸配列を知ることにより、当業者は、例えば、(a)それらの核酸分子のコピーを作製し得、(b)そのような核酸分子の少なくとも一部を含む核酸分子(例えば、全長遺伝子、全長コード領域、調節制御配列、短縮コード領域を含む、核酸分子)を得ることができ、そして(c)他のDer HMW−map核酸分子を得ることができる。このような核酸分子は、種々の方法で得ることができ、そのような方法としては、適切な発現ライブラリーを、本発明の抗体を用いてスクリーニングすること;適切なライブラリーをスクリーニングするために本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用する、従来のクローニング技術;および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、適切なライブラリーもしくはDNAのPCR増幅が、挙げられる。核酸分子をスクリーニングまたは増幅するための好ましいライブラリーとしては、Dermatophagoides farinaeライブラリー、および/またはDermatophagoides pteronyssiusライブラリー(例えば、本明細書中に実施例にて開示される、ライブラリー)が挙げられる。遺伝子をクローニングおよび増幅するための技術は、例えば、Sambrookら(同書)に開示されている。
【0068】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の他の核酸分子(好ましくは、より長い他の核酸分子)(例えば、Der HMW−map核酸分子を含む核酸分子、または他のDer HMW−map核酸分子を含む核酸分子)の相補的領域とハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドである核酸分子を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、RNAでも、DNAでも、またはいずれかの誘導体でも、あり得る。このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、オリゴヌクレオチドと、本発明の核酸分子上の相補的配列と間での、安定なハイブリッドの形成に必要なサイズである。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは約200ヌクレオチド、より好ましくは約150ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは約100ヌクレオチドの最大サイズを有する。本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブとして、使用され得るオリゴヌクレオチドを包含する。
【0069】
本発明の1つの実施形態は、組換えベクターを包含し、その組換えベクターは、本発明の少なくとも1つの単離された核酸分子を、宿主細胞中にその核酸分子を送達することができる任意のベクター中に挿入された状態で、含む。そのようなベクターは、異種核酸配列を含み、その異種核酸配列は、天然では本発明の核酸分子に近接して見出されず、かつ好ましくは、その本発明の核酸分子が由来する種以外の種に由来する、核酸配列である。そのベクターは、RNAまたはDNAのいずれかであり得、原核生物性または真核生物性のいずれかであり得、そして代表的には、ウイルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、本発明のDer HMW−map核酸分子のクローニング、配列決定、および/または他の操作において、使用され得る。
【0070】
1つの型の組換えベクター(本明細書中において、組換え分子と呼ばれる)は、発現ベクターに作動可能に連結された、本発明の核酸分子を含む。句「作動可能に連結された」とは、宿主細胞中に形質転換された場合に核酸分子が発現されることができる様式で、発現ベクター中にその核酸分子が挿入されていることを指す。本明細書中で使用される場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、かつ特定の核酸分子の発現をもたらすことができる、DNAベクターまたはRNAベクターである。好ましくは、その発現ベクターはまた、その宿主細胞中で複製することもできる。発現ベクターは、原核生物性または真核生物性のいずれかであり得、そして発現ベクターは、代表的には、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、本発明の組換え細胞(細菌細胞、真菌細胞、内寄生生物細胞、昆虫細胞、他の動物細胞、ならびに植物細胞を含む)において機能する(すなわち、遺伝子発現を指向する)、任意のベクターが挙げられる。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において、そしてより好ましくは、本明細書中に開示される細胞型において、遺伝子発現を指向し得る。
【0071】
特に、本発明の発現ベクターは、調節配列(例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞と適合性でありかつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列)を含む。特に、本発明の組換え分子は、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終結を制御する、配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御する配列(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列)である。適切な転写制御配列としては、本発明の組換え細胞の少なくとも1つにおいて機能し得る、任意の転写制御配列が挙げられる。種々のこのような転写制御配列が、当業者に公知である。好ましい転写制御配列としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞において機能する配列が挙げられ、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、oxy−proプロモーター、omp/lppプロモーター、rrnBプロモーター、バクテリオファージλプロモーター(例えば、λPLプロモーターおよびλPRプロモーター、およびこのようなプロモーターを含む融合物)、バクテリオファージT7プロモーター、T7lacプロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、バクテリオファージSP6プロモーター、バクテリオファージSP01プロモーター、メタロチオネインプロモーター、α接合因子プロモーター、Pichiaアルコールオキシダーゼプロモーター、アルファウイルスサブゲノムプロモーター(例えば、シンドビスウイルスサブゲノムプロモーター)、抗生物質耐性遺伝子プロモーター、バキュロウイルスプロモーター、Heliothis zae昆虫ウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、ヘルペスウイルスプロモーター、アライグマポックスウイルスプロモーター、他のポックスウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター(例えば、中初期プロモーター)、シミアンウイルス40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、レトロウイルス長末端反復プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、熱ショックプロモーター、リン酸および硝酸転写制御配列、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる適切な転写制御配列としては、組織特異的プロモーターおよび組織特異的エンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター(例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導される、プロモーター)が、挙げられる。本発明の転写制御配列としてはまた、イヌまたはネコと天然で関連がある、天然に存在する転写制御配列が挙げられ得る。
【0072】
本発明の組換えベクター中に含むために適切かつ好ましい核酸分子は、本明細書中に開示されるような核酸分子である。組換えベクター中、特に組換え分子中に含むために好ましい核酸分子としては、nDerf981752、nDerf981665、nDerf981608、nDerp981621、nDerp981527、nDerp981470、およびnDerf60510が、挙げられる。
【0073】
本発明の組換え分子はまた、(a)発現される本発明のDer HMW−mapタンパク質が、そのタンパク質を産生する細胞から分泌されることができるように、分泌シグナル(すなわち、シグナルセグメント核酸配列)を含み得、そして/または(b)融合タンパク質として本発明の核酸分子の発現をもたらす、融合配列を含み得る。適切なシグナルセグメントの例としては、本発明のタンパク質の分泌を指向することができる、任意のシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、組織プラスミノーゲンアクチベーター(t−PA)シグナルセグメント、インターフェロンシグナルセグメント、インターロイキンシグナルセグメント、成長ホルモンシグナルセグメント、組織適合性シグナルセグメントおよびウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメント、ならびに天然のシグナルセグメントが、挙げられるが、これらに限定されない。融合セグメント核酸によりコードされる適切な融合セグメントは、本明細書中に開示される。さらに、本発明の核酸分子は、コードされるタンパク質をプロテオソームへと指向する、融合セグメント(例えば、ユビキチン融合セグメント)に、連結され得る。組換え分子はまた、本発明の核酸分子の核酸配列の周囲および/または内部に、介在配列および/または非翻訳配列を含み得る。
【0074】
本発明の別の実施形態は、本発明の1つ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞を含む、組換え細胞を包含する。細胞中への核酸分子の形質転換は、核酸分子をその細胞中に挿入し得る任意の方法によって、達成され得る。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままであり得るし、または組織、器官、もしくは多細胞生物へと成長し得る。本発明の形質転換された核酸分子は、その核酸分子が発現される能力が維持されるような様式で、形質転換された(すなわち、組換え)細胞の染色体外にあるままであり得るし、またはその細胞の染色体中の1つ以上の部位に組み込み得る。細胞を形質転換するための好ましい核酸分子としては、本明細書中に開示されるDer HMW−map核酸分子が挙げられる。細胞を形質転換するための特に好ましい核酸分子としては、nDerf981752、nDerf981665、nDerf981608、nDerp981621、nDerp981527、nDerp981470、およびnDerf60510が、挙げられる。
【0075】
形質転換するために適切な宿主細胞としては、本発明の核酸分子で形質転換され得る任意の細胞が挙げられる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞であり得るか、または少なくとも1つの核酸分子(例えば、本発明の1以上のタンパク質および/または多価ワクチンの産生に有用な他のタンパク質をコードする核酸分子)で既に形質転換されている細胞であり得るかのいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明のDer HMW−mapタンパク質を内因的(すなわち、天然で)産生し得るか、または本発明の少なくとも1つの核酸分子で形質転換された後にこのようなタンパク質を産生し得るかのいずれかである。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも1つのタンパク質を産生し得る任意の細胞であり得、そしてこれらには、細菌細胞、真菌細胞(酵母を含む)、他の昆虫細胞、他の動物細胞および植物細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、細菌細胞、ミコバクテリア細胞、酵母細胞、寄生生物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、Salmonella、Escherichia、Bacillus、Listeria、Saccharomyces、Spodoptera、Mycobacteria、Trichoplusia、BHK(乳児ハムスター腎臓)細胞、MDCK細胞(イヌヘルペスウイルス培養のための正常なイヌ腎臓細胞株)、CRFK細胞(ネコヘルペスウイルス培養のための正常なネコ腎臓細胞株)、CV−1細胞(例えば、アライグマポックスウイルスを培養するために使用される、アフリカザル腎臓細胞株)、COS(例えば、COS−7)細胞、およびVero細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞としては、Escherichia coli(E.coli K−12誘導株を含む);Salmonella typhi;Salmonella typhimurium(UK−1X3987およびSR−11X4072のような弱毒化株を含む);Spodoptera frugiperda;Trichoplusia ni;BHK細胞;MDCK細胞;CRFK細胞;CV−1細胞;COS細胞;Vero細胞および非腫瘍形成性マウス筋芽細胞G8細胞(例えば、ATCC CRL1246)である。さらなる適切な哺乳動物細胞宿主としては、他の腎臓細胞株、他の線維芽細胞株(例えば、ヒト、マウス、またはニワトリの胚線維芽細胞株)、骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスNIH/3T3細胞、LMTK31細胞および/またはHeLa細胞が挙げられる。
【0076】
組換え細胞は、好ましくは、宿主細胞を1以上の組換え分子で形質転換することによって生成され、各組換え分子は、1以上の転写制御配列を含む発現ベクターに作動可能に連結された、本発明の1以上の核酸分子を含む。句「作動可能に連結される」とは、核酸分子を、その核酸分子が宿主細胞内に形質転換された場合に発現され得るような様式で、発現ベクター内に挿入することをいう。
【0077】
本発明の組換え分子は、任意の転写制御配列のうちの少なくとも1つに作動可能に連結された、上記の任意の核酸分子うちの少なくとも1つを含み得る分子であり、その転写制御配列は、形質転換される細胞においてその核酸分子の発現を効果的に調節し得る。これらの例を、本明細書中に開示する。
【0078】
本発明の組換え細胞としては、本発明の任意のDer HMW−map核酸分子のうちの少なくとも1つで形質転換された任意の細胞が挙げられる。細胞を形質転換するために適切かつ好ましいDer HMW−map核酸分子ならびに適切かつ好ましい組換え分子を、本明細書中に開示する。
【0079】
組換えDNA技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換された核酸分子の発現を改善するために、使用され得る。本発明の核酸分子の発現を増加するために有用な組換え技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:高コピー数プラスミドへの核酸分子の作動可能な連結、1以上の宿主細胞染色体内への核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル(例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー)の置換または改変、翻訳制御シグナル(例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガノ配列)の置換または改変、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させるような本発明の核酸分子の改変、転写物を不安定化させる配列の欠失、および発酵中の組換え酵素産生から組換え細胞増殖を時間的に切り離す制御シグナルの使用。本発明の発現させる組換えタンパク質の活性は、このようなタンパク質をコードする核酸分子のフラグメント化、改変または誘導体化によって改善され得る。
【0080】
本発明の単離されたDer HMW−mapタンパク質は、種々の様式で産生され得、これらには、天然のタンパク質の産生および回収、組換えタンパク質の産生および回収、およびこれらのタンパク質の化学合成が挙げられる。1つの実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、タンパク質を産生するのに効果的な条件下でそのタンパク質を発現し得る細胞を培養し、そしてそのタンパク質を回収することによって、産生される。培養するために好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。効果的な培養条件としては、タンパク質産生を可能にする、効果的な培地条件、バイオリアクター条件、温度条件、pH条件および酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。効果的な培地とは、細胞が本発明のDer HMW−mapタンパク質を産生するように培養される、任意の培地をいう。このような培地は、代表的に、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養素(例えば、ビタミン)を有する水性培地を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリプレートにおいて培養され得る。培養は、組換え細胞に適切な温度、pHおよび酸素含量で行われ得る。このような培養条件は、当業者の技術の範囲内である。
【0081】
産生のために使用されるベクターおよび宿主系に依存して、本発明の得られるタンパク質は、組換え細胞内に残ったままであり得るか;発酵培地中に分泌され得るか;2つの細胞膜間の空間(例えば、E.coliのペリプラズム空間)に分泌され得るか;あるいは細胞またはウイルスの膜の外側表面上に保持され得るかの、いずれかである。句「タンパク質を回収する」、ならびに同様の句は、タンパク質を含む発酵培地全体を回収することをいい、そして分離または精製のさらなる工程を含む必要はない。本発明のタンパク質は、種々の標準的なタンパク質精製技術(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンAクロマトグラフィー、等電点電気泳動および差次的可溶化が挙げられるが、これらに限定されない)を使用して精製され得る。本発明のタンパク質は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収され得る。本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋(な)」とは、治療組成物または診断剤としてのタンパク質の効果的な使用を可能にする純度をいう。例えば、動物のための治療組成物は、実質的な毒性を示すべきでなく、そして好ましくは、処置される動物を脱感作し得るべきである。
【0082】
本発明はまた、本発明のDer HMW−mapタンパク質またはそのミメトープ(mimetope)に選択的に結合する単離された(すなわち、それらの天然環境から取り出された)抗体(すなわち、抗Der HMW−mapタンパク質抗体)を包含する。本明細書中で使用される場合、用語、Der HMW−mapに「選択的に結合する」とは、本発明の抗体が、本発明の特定化されたタンパク質またはそのミメトープに優先的に結合する能力をいう。結合は、当該分野で標準的な種々の方法(酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、イムノブロットアッセイなどを含む;例えば、Sambrookら、同書、を参照のこと)を使用して測定され得る。抗Der HMW−mapタンパク質抗体は、好ましくは、動物において免疫応答を誘導するDer HMW−mapタンパク質の部分に選択的に結合する。
【0083】
本発明の単離された抗体としては、体液(例えば、血清が挙げられるが、これに限定されない)中の抗体、または種々の程度に精製された抗体が挙げられ得る。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。このような抗体の機能的等価物(例えば、抗体フラグメントおよび遺伝子操作された抗体(1より多いエピトープに結合し得る、単鎖抗体またはキメラ抗体を含む)もまた、本発明に含まれる。
【0084】
本発明の抗体を産生するための好ましい方法は、(a)本発明のタンパク質、ペプチドまたはそのミメトープの有効量を動物に投与して、抗体を産生する工程;および(b)それらの抗体を回収する工程、を包含する。別の方法において、本発明の抗体は、本発明のDer HMW−mapタンパク質を産生するために先に開示したような技術を使用して、組換え的に産生される。定義されるタンパク質またはミメトープに対して惹起された抗体が有利であり得る。なぜなら、そのような抗体は、治療組成物中で使用する場合に、さもなければ診断アッセイにおける干渉または副作用を生じ得る他の物質に対する抗体が、実質的に混入されていないからである。
【0085】
本発明の抗体は、本発明の範囲内の種々の潜在的用途を有する。例えば、このような抗体は、(a)ダニアレルゲン(特に、Der HMW−mapタンパク質)を検出するためのツールとして;(b)発現ライブラリーをスクリーニングするためのツールとして;および/または(c)タンパク質と他の混入物との混合物から本発明の所望のタンパク質を回収するために、使用され得る。本発明の抗体はまた、例えば、Der HMW−mapに特異的に結合するIgEへのDer HMW−mapタンパク質の結合を阻害し、免疫複合体形成を妨げ、それによって、ダニアレルゲンに対する過敏性応答を減少するために、使用され得る。
【0086】
本発明のDer HMW−mapタンパク質は、キメラ分子中に含まれ得、このキメラ分子は、動物において免疫応答を誘導するDer HMW−mapタンパク質の少なくとも一部、および第2の分子を含み、この第2の分子は、基質に結合されていないDer HMW−mapタンパク質と本質的に同じ様式でそのDer HMW−mapタンパク質の部分がIgEに結合し得るような様式で、そのキメラ分子が基質に結合されるのを可能にする。適切な第2の分子の例としては、免疫グロブリン分子の一部、または基質に固定化され得る適切な結合パートナーを有する別のリガンドが挙げられる(例えば、ビオチンおよびアビジン、または金属結合タンパク質および金属(例えば、His)、または糖結合タンパク質および糖(例えば、マルトース))。
【0087】
本発明のDer HMW−mapタンパク質は、処方物中に含まれ得、本明細書中で、Der HMW−mapタンパク質処方物と称する。例えば、Der HMW−mapタンパク質は、そのDer HMW−mapタンパク質が可溶化される緩衝液、および/またはキャリアと合わせられ得る。適切な緩衝液およびキャリアは、当業者に公知である。適切な緩衝液の例としては、Der HMW−mapタンパク質が、Der HMW−mapタンパク質に特異的に結合する抗体に選択的に結合するように機能し得る、任意の緩衝液(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、HEPES緩衝液(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸緩衝化生理食塩水)、TES緩衝液(Tris−EDTA緩衝化生理食塩水)、Tris緩衝液およびTAE緩衝液(Tris−酢酸−EDTA)が挙げられるが、これらに限定されない)が挙げられる。キャリアの例としては、ポリマーマトリクス、トキソイド、および血清アルブミン(例えば、ウシ血清アルブミン)が挙げられるが、これらに限定されない。キャリアは、Der HMW−mapタンパク質に特異的に結合する抗体に選択的に結合するDer HMW−mapタンパク質の能力を実質的に干渉しないような様式で、Der HMW−mapタンパク質と混合され得るかまたはDer HMW−mapタンパク質に結合体化(すなわち、付着)され得る。
【0088】
本発明のDer HMW−mapタンパク質は、Der HMW−mapタンパク質を含む細胞によって産生され得る。好ましいDer HMW−mapタンパク質保有細胞としては、本発明のDer HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子を含む組換え細胞が挙げられる。
【0089】
さらに、本発明のDer HMW−mapタンパク質処方物は、Der HMW−mapタンパク質のみならず、アレルギーに対する動物の脱感作、あるいはダニアレルゲン病原の予防または処置において有用な、1以上のさらなる抗原または抗体を含み得る。本明細書中で使用される場合、抗原とは、抗体によって選択的に結合され得る、任意の分子をいう。本明細書中で使用される場合、アレルゲンとは、動物におけるアレルギー応答に関与する抗体の産生を刺激し得る、任意の抗原をいう。本明細書中で使用される場合、第2の分子への第1の分子の選択的結合とは、第1の分子が第3の分子へ結合する能力と比較して、その第1の分子が第2の分子に優先的に結合(例えば、より高い親和性、より高いアビディティを有する)する能力をいう。この第1の分子は、必ずしも第2の分子の天然のリガンドである必要はない。本発明のアレルゲンは、好ましくは、ダニ由来であり、そしてダニ関連アレルゲン(他の昆虫アレルゲンおよび植物アレルゲンを含むが、これらに限定されない)である。
【0090】
本発明に従って、実質的に任意の物質が、抗原として作用し得、そして抗体応答を誘発し得る(すなわち、エピトープとして機能し得る)。例えば、抗体は、糖質エピトープ(タンパク質に付加されている、サッカリドおよび/またはポリサッカリド(いわゆる、グリコシル化タンパク質))に応答して惹起され得る。しかし、サッカリドおよび/またはポリサッカリドは、タンパク質が存在することなく、単独で抗原として作用し得る。糖質部分の末端の糖、および内部の糖が、エピトープとして作用し得る。ポリサッカリドは、分枝鎖として存在し得、この場合、エピトープは、順番が連続しないが空間的に隣接する糖を有し得る。哺乳動物タンパク質において通常見られない、非通常の、昆虫特異的な糖は、昆虫の核酸分子由来の糖タンパク質に存在し得、そしてこれらの非通常の糖は、哺乳動物免疫系によって認識されるエピトープを含み得る。
【0091】
本発明の1つの実施形態は、ダニに対してアレルギー性である動物のIgEに結合し得るか、ダニアレルゲンに対して動物を脱感作し得るか、Bリンパ球応答を刺激し得るか、そして/またはTリンパ球応答を刺激し得る非タンパク質エピトープを含む、試薬である。このようなエピトープ(本明細書中でDer NPエピトープと呼ばれる)は、本発明のDer HMW−mapタンパク質の部分として存在し得るか、または本発明のDer HMW−mapタンパク質から単離され得る。このようなエピトープは、例えば、実施例1に従って産生されたD.farinae HMW−map組成物中に含まれるタンパク質上に存在する。本発明のDer NPエピトープは、その天然の供給源から単離され得るか、または合成的に産生され得る。このようなエピトープは、キャリアまたは他の分子に連結され得るが、その必ずしもその必要はない。Der NPエピトープは、以下の識別される特徴のうちの少なくとも1つを有する:(a)そのエピトープは、ペプチドのβ−脱離に対して耐性である;(b)そのエピトープは、プロテイナーゼK消化に対して耐性である;および(c)そのエピトープは、グリコシル化されたタンパク質を検出するように設計された試験に対して反応性である。好ましいDer NPエピトープは、このような識別される特徴の全てを有する。Der NPエピトープは、ダニに対してアレルギー性のイヌまたはネコのIgEに選択的に結合し得る。理論に束縛されないが、Der NPエピトープは、N結合型グリカンを明らかに含まない糖質部分を含むと考えられている。このようなエピトープの構造的特徴の同定は、当業者によって決定され得る。1つの実施形態において、Der NPエピトープに選択的に結合する単離された抗体が提供される。本発明はまた、Der NPエピトープの誘導体(すなわち、このようなエピトープの活性を模倣する(例えば、Der NPエピトープのミメトープである)、ネイティブ(すなわち、天然で見られる)Der Npエピトープに対して惹起された抗体に結合し得る、化合物)を包含する。
【0092】
本発明のDer NPエピトープを含む試薬は、本発明に従って種々の様式で使用され得る。このような試薬は、脱感作化合物であり得るか、またはダニアレルギーの感受性または感度について試験するための検出試薬であり得る。1つの実施形態において、本発明の治療組成物は、Der NPエピトープを含む試薬を含む。別の実施形態において、本発明のアッセイキットは、Der NPエピトープを含む試薬を備える。本発明の1つの実施形態は、ダニに対するアレルギー応答に対して感受性であるかまたはダニに対するアレルギー応答を有する動物を同定する方法である。このような方法は、Der NPエピトープを含む試薬を動物の抗体と接触させる工程、およびその試薬と抗体との間の免疫複合体の形成を決定する工程を包含し、この免疫複合体の形成は、その動物が、そのアレルギー応答に感受性であるかまたはそのアレルギー応答を有することを示す。本発明の別の実施形態は、ダニに対するアレルギー応答に対して宿主動物を脱感作するための方法である。このような方法は、その動物に、脱感作化合物としてDer NPエピトープを含む試薬を含む治療組成物を投与する工程を包含する。
【0093】
本発明の別の実施形態は、Der NPエピトープを欠くDer HMW−mapタンパク質である。理論に束縛されないが、このようなタンパク質は、より良好な脱感作化合物である。なぜなら、このようなタンパク質は、IgEに結合する能力が減少されていることが予測されるからである。このようなタンパク質は、例えば、ネイティブDer HMW−mapタンパク質からDer NPエピトープを除去することによってか、またはこのタンパク質を組換え的に(例えば、E.coliにおいて)産生することによって、産生され得る。
【0094】
本発明の1つの実施形態は、動物がDer HMW−mapタンパク質に対して過敏性であるか否かを検出し得る、インビボ試験である。本発明のインビボ過敏性試験は、ダニアレルゲンに対して感受性であるかまたはダニアレルゲンに対するアレルギーを有する動物を同定するために、特に有用である。本発明の適切なインビボ過敏性試験は、皮膚試験であり得るが、これに限定されず、この皮膚試験は、Der HMW−mapタンパク質またはそのミメトープを含む有効量の処方物を投与(例えば、皮内注射または表面スクラッチ)する工程を包含する。本発明の皮膚試験を行うための方法は、当業者に公知であり、そして本明細書中に簡単に開示される。
【0095】
インビボ皮膚試験において使用するための適切な処方物は、Der HMW−mapタンパク質、Der HMW−mapタンパク質のホモログおよび/またはDer HMW−mapタンパク質のミメトープを含む。
【0096】
本発明の皮膚試験における使用のためのDer HMW−mapタンパク質タンパク質処方物の適切な量は、その試験に使用される処方物のアレルゲン性および生成物が送達される部位に依存して、広範に変化し得る。本発明の皮膚試験における使用のためのDer HMW−mapタンパク質処方物の適切な量としては、反応(例えば、その処方物に対するアレルギー反応から生じる検出可能な膨疹または硬化(硬度))を形成し得る量が挙げられる。本発明の皮膚試験における使用のためのDer HMW−mapタンパク質の好ましい量は、約1×10−8マイクログラム(μg)〜約100μg、より好ましくは、約1×10−7μg〜約10μg、そしてさらにより好ましくは、約1×10−6μg〜約1μgのDer HMW−mapタンパク質の範囲にある。このような量は、投与されるタンパク質のアレルゲン性に依存して変化することが、当業者に理解される。
【0097】
本発明に従って、本発明のDer HMW−mapタンパク質は、免疫増強物質(例えば、以下に詳細に定義されるような、本発明のキャリアまたはアジュバント)と合わされ得る。しかし、本発明の新しい局面は、本発明のDer HMW−mapタンパク質が、特に、イヌにおいて、免疫増強物質の非存在下で過敏性応答を誘導し得ることである。
【0098】
本発明の皮膚試験はさらに、コントロール溶液を動物に投与する工程を包含する。コントロール溶液としては、ネガティブコントロール溶液および/またはポジティブコントロール溶液が挙げられ得る。本発明のポジティブコントロール溶液は、動物に投与された場合に過敏性応答を誘導することが公知の少なくとも1つの化合物の有効量を含む。ポジティブコントロール溶液としての使用のための好ましい化合物としては、ヒスタミンが挙げられるが、これに限定されない。本発明のネガティブコントロール溶液は、動物に投与された場合に過敏性応答を誘導しないことが公知の溶液を含み得る。それ自体で、ネガティブコントロール溶液は、過敏性応答を本質的に誘導し得ない化合物を有する溶液を含み得るか、または処方物を調製するために使用される緩衝液(例えば、生理食塩水)を単に有する溶液を含み得る。好ましいネガティブコントロール溶液の例は、フェノレート化リン酸緩衝化生理食塩水(Greer Laboratories,Inc.、Lenoir、NCから入手可能)である。
【0099】
本発明の1以上の処方物に対する動物の過敏性は、動物への1以上の実験サンプルおよびコントロールサンプルの投与から生じる反応を測定し(例えば、膨疹、硬化または硬度;当業者に公知の技術を使用して)、そして実験サンプルに対する反応を1以上のコントロール溶液の投与から生じる反応と比較することによって、評価され得る。皮内注射のための好ましいデバイスとしては、個々のシリンジが挙げられる。スクラッチのための好ましいデバイスとしては、一時に多くのサンプルの投与を可能にするデバイスが挙げられる。動物の過敏性は、本発明の処方物の投与から生じる反応が、ネガティブコントロールの投与から生じる反応よりも大きいか否かを決定することによってか、および/またはその処方物の投与から生じる反応が、ポジティブコントロール溶液の投与から生じる反応と少なくともおよそ同じサイズであるか否かを決定することによって、評価され得る。それ自体で、実験サンプルが、動物へのポジティブコントロールサンプルの投与によって生じた膨疹のサイズより大きいかまたはそれに等しい反応を生じる場合、その動物は、その実験サンプルに対して過敏性である。反対に、実験サンプルが、動物へのネガティブコントロールサンプルの投与によって生じた反応に類似する反応を生じる場合、その動物は、その実験サンプルに対して過敏症ではない。
【0100】
動物の過敏症の評価のための好ましい膨疹サイズは、約16mm〜約8mm、より好ましくは、約15mm〜約9mm、そしてさらにより好ましくは、約14mm〜約10mmの範囲の直径である。
【0101】
好ましくは、動物が本発明の処方物に対する即時型過敏性応答を生じる能力またはその過敏性応答を生じる能力がないことは、サンプルの投与後約2分〜約30分で、より好ましくは、サンプルの投与後約10分〜約25分で、そしてさらにより好ましくは、サンプルの投与後約15分で、膨疹サイズを測定することによって決定される。
【0102】
好ましくは、動物が本発明の処方物に対する遅延型過敏性応答を生じる能力およびその過敏性応答を生じる能力がないことは、サンプルの投与後約18時間〜約30時間で、より好ましくは、サンプルの投与後約20時間〜約28時間で、そしてさらにより好ましくは、サンプルの投与後約24時間で、硬化および/または紅斑を測定することによって決定される。遅延型過敏性応答はまた、他の技術を使用して(例えば、当業者に公知の技術を使用して、上記に直接規定した期間の間の投与部位での細胞浸潤の程度を決定することによって)測定され得る。
【0103】
好ましい実施形態において、本発明の皮膚試験は、Der HMW−mapタンパク質を含む有効量の処方物を動物に所定の部位で皮内注射する工程、および有効量のコントロール溶液を同じ動物に異なる部位で皮内注射する工程を包含する。多くの部位で複数のサンプルを同時に送達し得る(好ましくは、多くの処方物の同時の評価を可能にする)デバイスを使用することは、当業者の範囲内である。皮膚試験に使用するための好ましいDer HMW−mapタンパク質は、全長タンパク質を含む。好ましいポジティブコントロールサンプルは、ヒスタミンを含むサンプルであり得る。好ましいネガティブコントロールサンプルは、希釈剤を含むサンプルであり得る。
【0104】
本発明の皮膚試験を使用してDer HMW−mapタンパク質に対する過敏性について試験するために適切かつ好ましい動物は、本明細書中に開示される。本発明の皮膚試験で試験するために特に好ましい動物としては、ヒト、イヌ、ネコおよびウマが挙げられ、ヒト、イヌおよびネコが、さらにより好ましい。本明細書中で使用される場合、イヌとは、イヌ科の任意のメンバーをいい、これらには、家庭内のイヌ、野生のイヌおよび動物園のイヌが含まれる。イヌの例としては、家庭内のイヌ、野生のイヌ、キツネ、オオカミ、ジャッカルおよびコヨーテが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、ネコとは、ネコ科の任意のメンバーをいい、これらには、家庭内のネコ、野生のネコおよび動物園のネコが含まれる。ネコの例としては、家庭内のネコ、ライオン、トラ、ヒョウ(leopard)、ヒョウ(panther)、ピューマ、ボブキャット、オオヤマネコ、ジャガー、チーターおよびサーバルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、ウマとは、ウマ科の任意のメンバーをいい、これらには、ウマ、ロバ、ラバおよびシマウマが挙げられる。
【0105】
本発明の1つの実施形態は、Der HMW−mapタンパク質に結合する抗体(本明細書中で抗Der HMW−map抗体といわれる)をインビトロで検出する方法である。この方法は、以下の工程を包含する:(a)単離されたHMW−mapタンパク質と推定抗Der HMW−map抗体含有組成物とを、Der HMW−mapタンパク質:抗体複合体を形成するに適切な条件下で接触させる工程;および(b)このDer HMW−mapタンパク質:抗体複合体を検出することにより、上記抗体の存在を検出する工程。このようなDer HMW−mapタンパク質:抗体複合体の存在は、動物が、ダニアレルゲンに対する抗体を生成していることを示す。検出するための好ましい抗Der HMW−map抗体としては、IgEアイソタイプまたはIgGアイソタイプを有する抗体が挙げられる。検出するための好ましい抗Der HMW−map抗体としては、ネコ抗体、イヌ抗体、ウマ抗体、およびヒト抗体が挙げられ、ネコ、イヌおよびヒト抗体が特に好ましい。
【0106】
本明細書中で用いられる場合、用語「接触する(接触させる)」は、この場合、推定抗体含有組成物とDer HMW−mapタンパク質とを合わせるまたは混合することをいう。Der HMW−mapタンパク質と抗体との間の複合体の形成は、測定され得る(すなわち、検出され得る)安定な複合体を形成するために、Der HMW−mapタンパク質がこの抗体に選択的に結合する能力をいう。本明細書中で用いられる場合、用語、抗体に選択的に結合するとは、Der HMW−mapタンパク質に特異的に結合しない他の抗体に実質的に結合することなく、本発明のDer HMW−mapタンパク質が抗体に優先的に結合する能力をいう。Der HMW−mapタンパク質と抗体との間の結合は、複合体を形成するに適切な条件下でもたらされる;このような条件(例えば、適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間)ならびにこのような条件を最適化する方法は、当業者に公知であり、例が本明細書中に開示される。複合体形成条件の例はまた、例えば、Sambrook et al.,(同書)に開示される。
【0107】
本明細書中で用いられる場合、用語「複合体形成を検出する」とは、任意の複合体が形成されたか否かを決定すること(すなわち、複合体の存在(すなわち、実在)をアッセイすること)をいう。複合体が形成されると、形成された複合体の量が決定されるが、必ずしも必要ではない。Der HMW−mapタンパク質と組成物中の抗体との間の複合体形成、または選択的結合が、当該分野で標準的な種々の方法(例えば、Sambrook et al(同書)を参照のこと)を用いて測定され得る(すなわち、検出、決定され得る)。これらの例は、本明細書中で開示される。
【0108】
1つの実施形態において、本発明の方法の推定抗体含有組成物は、動物由来の生物学的サンプルを含む。適切な生物学的サンプルとしては、体液組成物または細胞組成物が挙げられるが、これらに限定されない。体液とは、動物から集められ得る(すなわち、得られ得る)任意の流体をいい、これらの例としては、血液、血清、血漿、尿、涙、水溶性体液(aqueous humor)、脳脊髄液(CSF)、唾液、リンパ、鼻分泌物、乳汁、および糞便が挙げられるが、これらに限定されない。このような本発明の組成物は、体液中に存在する免疫グロブリンの非IgEまたは非IgGアイソタイプおよび/または他のタンパク質(例えば、アルブミン)の少なくともいくつかを除去するために予め処理され得るが、必ずしも必要ではない。このような除去としては、体液と、レクチンであるjacalinまたはIgA免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合する抗体(すなわち、抗IgAアイソタイプ抗体)のような物質を接触させて、IgA抗体を除去すること、および/あるいはこの体液を、例えば、コンカナバリンAまたはプロテインGに、それぞれ曝すことにより、IgE抗体またはIgG抗体を体液の他の成分からアフィニティー精製することが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、組成物は、体液中に含まれる免疫グロブリンを濃縮するために予め処理された、集められた体液を含む。例えば、体液中に含まれる免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムを用いて他のタンパク質から沈殿され得る。本発明の好ましい組成物は、血清である。
【0109】
別の実施形態において、本発明の方法の抗体含有組成物としては、IgEもしくはIgGを生成する細胞が挙げられる。このような細胞は、細胞の表面に結合したIgEもしくはIgGを有し得るか、そして/あるいはIgEもしくはIgGを分泌し得る。このような細胞の例としては、骨髄腫細胞が挙げられる。IgEもしくはIgGは、細胞の膜に直接結合するか、または細胞の表面に結合した分子(例えば、抗原)に結合するかのいずれかで、細胞の表面に結合され得る。
【0110】
複合体は、種々の方法において検出され得、これらの方法としては以下の1以上のアッセイの使用が挙げられるが、これらに限定されない:酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、側流(lateral flow)アッセイ、凝集アッセイ、粒子ベースのアッセイ(例えば、磁性粒子またはプラスチックポリマー(例えば、ラテックスまたはポリスチレンビーズ)のような粒子が挙げられるが、これらに限定されない粒子を用いる)、免疫沈降アッセイ、BioCoreTMアッセイ(例えば、金コロイドを用いる)、および免疫ブロッティングアッセイ(例えば、ウェスタンブロット)。このようなアッセイは、当業者に周知である。アッセイは、結果がどのように用いられ得るかに依存して、定性的結果または定量的結果を与えるために用いられ得る。例えば、凝集、粒子分離、および免疫沈降のようないくつかのアッセイは、検出可能なマーカーを必要とすることなく、視覚的に観察され得る(例えば、肉眼または濃度計または分光光度計のような機械のいずれかにより)。
【0111】
他のアッセイにおいて、検出可能なマーカーのDer HMW−mapタンパク質、Der HMW−mapタンパク質に結合した抗体、またはDer HMW−mapタンパク質もしくはDer HMW−mapタンパク質に結合した抗体に選択的に結合する試薬(以下により詳細に記載される)への結合体化(すなわち、結合)は、複合体形成の検出を補助する。検出可能なマーカーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:放射活性標識、酵素、蛍光標識、化学発光標識、色素生成標識またはリガンド。リガンドとは、別の分子に選択的に結合する分子をいう。好ましい検出可能なマーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:フルオレセイン、放射性同位体、ホスファターゼ(例えば、アルカリホスファターゼ)、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)、およびビオチン関連化合物またはアビジン関連化合物(例えば、ストレプトアビジンまたはPierce,Rockford,ILから市販されるImmunoPure(登録商標)NeutrAvidin)。
【0112】
1つの実施形態において、複合体は、推定抗体含有組成物と、検出可能なマーカーに結合体化されるDer HMW−mapタンパク質とを接触させることにより検出される。Der HMW−mapタンパク質に結合体化するための適切な検出マーカーとしては、放射活性標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、色素生成標識またはリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なマーカーは、Der HMW−mapタンパク質が検出される抗体に結合する能力をブロックしないように、Der HMW−mapタンパク質に結合体化される。
【0113】
別の実施形態において、Der HMW−mapタンパク質:抗体複合体は、推定抗体含有組成物とDer HMW−mapタンパク質とを接触させ、次いで、この複合体と、指標分子とを接触させることにより検出される。本発明の適切な指標分子としては、Der HMW−mapタンパク質またはDer HMW−mapタンパク質に結合した抗体のいずれかに結合し得る分子が挙げられる。このように、指標分子は、Der HMW−mapタンパク質:抗体複合体のどの部分が検出されるかに依存して、例えば、抗原および抗体を含み得る。抗体である好ましい指標分子としては、例えば、抗IgE抗体、抗IgG抗体、およびDer HMW−mapタンパク質に結合するが、Der HMW−mapタンパク質上の異なるエピトープに結合することが既知の推定抗体含有組成物中で同定された抗体以外の抗体が挙げられる。好ましいレクチンとしては、高マンノース基に結合するレクチンが挙げられる。指標分子自体は、本発明の検出可能なマーカーに結合され得る。例えば、抗体は、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはフルオレセインに結合体化され得る。
【0114】
1つの好ましい実施形態において、Der HMW−mapタンパク質:抗体複合体は、この複合体と、IgE抗体に選択的に結合する指標分子(本明細書中で抗IgE試薬といわれる)またはIgG抗体に選択的に結合する指標分子(本明細書中で抗IgG試薬といわれる)とを接触させることにより検出される。このような抗IgEまたは抗IgG抗体の例としては、抗アイソタイプ抗体である2次抗体(例えば、IgEもしくはIgGの定常領域に選択的に結合する抗体)、抗体結合細菌表面タンパク質(例えば、プロテインAまたはプロテインG)、抗体結合細胞(例えば、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、多形核白血球細胞、単球またはマクロファージ細胞)、抗体結合真核生物細胞表面タンパク質(例えば、Fcレセプター)、および抗体結合補体タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい指標分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:抗ネコIgE抗体、抗ネコIgG抗体、抗イヌIgE抗体、抗イヌIgG抗体、抗ヒトIgE抗体、および抗ヒトIgG抗体。本明細書中で用いられる場合、抗IgE抗体または抗IgG抗体は、完全な抗体のみならず、IgEもしくはIgG重鎖定常領域に選択的に結合し得るその任意のサブユニットもしくは一部もまた含み得る。例えば、抗IgE試薬または抗IgG試薬としては、FabフラグメントまたはF(ab’)2フラグメントが挙げられ、これらはともに、Janeway et al.,Immunobiology,the Immune System in Health and Disease,Garland Publishing,Inc.,NY,1996に詳細に記載される。
【0115】
別の好ましい実施形態において、Der HMW−mapタンパク質:抗体複合体は、この複合体と、推定抗体含有組成物中の抗体がDer HMW−mapタンパク質に結合するエピトープ以外の異なるエピトープで、Der HMW−mapタンパク質に選択的に結合する指標分子とを接触させることにより検出される。
【0116】
1つの実施形態において、複合体は、溶液中で形成され、検出され得る。別の実施形態において、複合体が形成され、ここで、この複合体の1以上のメンバーが基材に固定化(例えば、基材上にコーティング)される。固定化技術は、当業者に公知である。適切な基材材料としては、プラスチック、硝子、ゲル、セルロイド、紙、PVDF(ポリ−ビニリデン−フルオリド)、ナイロン、ニトロセルロース、および粒子物質(例えば、ラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロースおよび磁性樹脂)が挙げられるが、これらに限定されない。基材材料の適切な形状としては、ウェル(例えば、マイクロタイターディッシュウェル)、プレート、ディップスティック、ビーズ、側流装置、膜、フィルター、管、ディッシュ、セルロイド型マトリックス、磁性粒子、および他の粒子物質が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい基材は、ELISAプレート、ディップスティック、ラジオイムノアッセイプレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、イムノブロット膜およびイムノブロットペーパーを含む。1つの実施形態において、基材(例えば、粒子物質)としては、検出可能なマーカーを含み得る。
【0117】
Der HMW−mapタンパク質に結合する抗体を検出するための好ましい方法は、免疫吸着アッセイである。本発明の免疫吸着アッセイは、捕捉分子および指標分子を含む。本発明の捕捉分子は、IgEもしくはIgGが基材に固定化される様式で、IgEもしくはIgGに結合する。このように、捕捉分子は、好ましくは、本発明の基材に固定化され、その後、推定IgE含有組成物または推定IgG含有組成物に捕捉分子が曝される。本発明の指標分子は、捕捉分子に結合したIgEもしくはIgGの存在を検出する。このように、指標分子は、好ましくは、推定IgE含有組成物または推定IgG含有組成物に捕捉分子を曝す前に、捕捉分子と同じ基材に固定化されない。
【0118】
好ましい免疫吸着アッセイ法は、以下のいずれかの工程を包含する:(a)Der HMW−mapタンパク質を基材上に固定化した後に、Der HMW−mapタンパク質と、推定IgE含有組成物もしくは推定IgG含有組成物とを接触させて、Der HMW−mapタンパク質−固定化基材を形成する工程;および(b)Der HMW−mapタンパク質と、推定IgE含有組成物または推定IgG含有組成物を接触させて、推定IgE含有組成物結合基材または推定IgG含有組成物結合基材を形成する前に、推定IgE含有組成物または推定IgG含有組成物を基材に結合させる工程。好ましくは、基材としては、コーティングしていない基材、Der HMW−mapタンパク質固定化基材、抗IgE抗体固定化基材、抗IgG抗体固定化基材が挙げられる。
【0119】
本発明の捕捉分子および指標分子はともに、IgE、IgGまたたはDer HMW−mapタンパク質に結合し得る。好ましくは、捕捉分子は、指標分子と異なるIgE、IgGまたはDer HMW−mapタンパク質の領域に結合し、それにより、捕捉分子が、指標分子と同時にIgE、IgGまたはDer HMW−mapタンパク質に同時に結合することを可能にする。捕捉分子または指標分子としての試薬の使用は、この分子がIgE、IgGまたはDer HMW−mapタンパク質に曝された場合に、基材に固定化されているか否かに依存する。例えば、本発明のDer HMW−mapタンパク質は、Der HMW−mapタンパク質が基材に結合している場合に捕捉分子として用いられる。あるいは、Der HMW−mapタンパク質は、Der HMW−mapタンパク質が基材に結合していない場合に指標分子として用いられる。捕捉分子または指標分子としての使用に適切な分子としては、本発明のDer HMW−mapタンパク質、本発明の抗IgE抗体試薬または抗IgG抗体試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【0120】
本発明の免疫吸着アッセイは、1以上の層および/または型の指標分子の存在を検出し得る第2の分子または他の結合分子を含み得る。例えば、指標分子に選択的に結合する、タグ化されていない(すなわち、検出可能なマーカーに結合体化されていない)二次抗体は、この二次抗体に選択的に結合する、タグ化された(すなわち、検出可能なマーカーに結合体化されている)三次抗体に結合され得る。適切な二次抗体、三次抗体および他の二次分子または三次分子は、当業者により選択され得る。本発明の好ましい二次分子としては、抗原、抗IgEイディオタイプ抗体(すなわち、抗IgE抗体に独特のエピトープに結合する抗体)、抗IgEアイソタイプ抗体、抗IgGイディオタイプ抗体(すなわち、抗IgG抗体に独特のエピトープに結合する抗体)、および抗IgGアイソタイプ抗体が挙げられる。好ましい三次分子は、この二次分子の特徴に基づいて当業者により選択され得る。同じストラテジーが引き続く階層に適用される。
【0121】
1つの実施形態において、Der HMW−mapタンパク質は、基材(例えば、マイクロタイターディッシュウェルまたはディップスティック)に固定化されることにより捕捉分子として用いられる。動物から集められる生物学的サンプルは、基材に適用され、そして基材に結合されるDer HMW−mapタンパク質:抗体複合体形成を可能にする(すなわち、サンプル中のIgEもしくはIgGが、基材上に固定化されたDer HMW−mapタンパク質に結合する)に適切な(すなわち、十分な)条件下でインキュベートされる。過剰な非結合物質(すなわち、Der HMW−mapタンパク質に結合していない生物学的サンプル由来の物質)は、存在するならば、基材に結合している抗原:抗体複合体を保持する条件下で基材から除去される。好ましい条件は、一般に、Sambrookら(同書)に開示される。抗原に結合したIgEもしくはIgGに選択的に結合し得る指標分子が基材に添加され、この指標分子とDer HMW−mapタンパク質:抗体複合体との間で複合体を形成するようにインキュベートされる。過剰な指標分子は除去され、発色剤が必要ならば添加され、基材は、分析のために検出デバイスに供される。この実施形態に好ましい指標分子は、Der HMW−mapタンパク質に結合したIgG抗体を検出するための抗IgG抗体、またはDer HMW−mapタンパク質に結合したIgE抗体を検出するための抗IgE抗体である。好ましくは、この抗IgG抗体または抗IgE抗体は、ビオチン、蛍光標識または酵素標識に結合体化される。
【0122】
1つの実施形態において、この抗IgE抗体または抗IgG抗体(すなわち、アイソタイプ特異的抗体またはイディオタイプ特異的抗体)は、基材(例えば、マイクロタイターディッシュウェルまたはディップスティック)上に固定化されることにより捕捉分子として用いられる。動物から集められた生物学的サンプルは、この基材に適用され、この基材に結合した、抗IgE抗体:IgE複合体または抗IgG抗体:IgG複合体それぞれの形成を可能にするに適切な条件下でインキュベートされる。過剰な非結合物質は、存在するならば、基材に結合している抗IgE抗体:IgE複合体または抗IgG抗体:IgG複合体を保持する条件下で基材から除去される。Der HMW−mapタンパク質がこの基材に添加され、Der HMW−mapタンパク質と抗IgE抗体:IgE複合体または抗IgG抗体:IgG複合体との間で複合体の形成を可能にするようにインキュベートされる。好ましくは、Der HMW−mapタンパク質は、検出可能なマーカー(好ましくは、ビオチン、酵素標識または蛍光標識)に結合体化される。過剰なDer HMW−mapタンパク質は除去され、発色剤が必要ならば添加され、この基材は、分析のために検出デバイスに供される。
【0123】
1つの実施形態において、本発明の免疫吸着アッセイは、捕捉分子を利用しない。この実施形態において、動物から集められた生物学的サンプルは、基材(例えば、マイクロタイターディッシュウェルまたはディップスティック)に適用され、基材へのIgEもしくはIgGの結合を可能にするに適切な条件下でインキュベートされる。体液中に存在する任意のIgEもしくはIgGは、基材に固定化される。過剰な非結合物質は、存在するならば、基材へのIgEもしくはIgGの結合を保持する条件下で基材から除去される。Der HMW−mapタンパク質がこの基材に添加され、Der HMW−mapタンパク質とIgEもしくはIgGとの間の複合体の形成を可能にするようにインキュベートされる。好ましくは、Der HMW−mapタンパク質は、検出可能なマーカー(好ましくは、ビオチン、酵素標識または蛍光標識)に結合体化される。過剰なDer HMW−mapタンパク質は除去され、発色剤が必要ならば添加され、この基材は、分析のために検出デバイスに供される。
【0124】
IgEもしくはIgGを検出するための別の好ましい方法は、側流アッセイであり、この例は、Pronovost et alによる米国特許第5,424,193号(1995年6月13日発行);Imrich et alによる米国特許第5,415,994号(1995年5月16日発行);Miller et alによるWO94/29696(1994年12月22日公開);およびPawlak et alによるWO94/01775(1994年1月20日公開)に開示される。1つの実施形態において、生物学的サンプルは、以下の構成要素を備える側流装置に配置される:(a)流路を規定する支持体構造;(b)Der HMW−mapタンパク質に結合体化したビーズを含む標識試薬(この標識試薬は、標識ゾーンにおける支持体構造内に注入される);および(c)IgE結合組成物またはIgG結合組成物を含む捕捉試薬。この捕捉試薬は、標識試薬が、標識ゾーンから捕捉ゾーンへ流れ得る様式で、標識ゾーンに流体接続された捕捉ゾーン内で標識試薬の下流に配置される。この支持体構造は、標識ゾーンから捕捉ゾーンへビーズの流れを妨害しない物質を含む。支持体構造として使用するに適切な材料としては、イオン性(すなわち、陰イオン性または陽イオン性)物質が挙げられる。このような材料の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ニトロセルロース(NC)、PVDF、カルボキシメチルセルロース(CM)。この支持体構造は、流路を規定し、この流路は、側方にあり、ゾーン(すなわち、標識ゾーンおよび捕捉ゾーン)に分けられる。この装置は、流路に沿って位置した、より好ましくは標識試薬の上流に位置したサンプル受容ゾーンをさらに備え得る。この支持体構造中の流路は、捕捉ゾーンの下流、好ましくは流路の端部の支持体構造の一部と、標識ゾーンおよび捕捉ゾーンからの過剰な試薬を吸着し得る吸着剤とを接触させることにより作製される。
【0125】
この実施形態において、生物学的サンプルは、支持体構造の一部を備えるサンプル受容ゾーンに適用される。この標識ゾーンは、サンプルを、流路により下流に方向付けられたサンプル受容ゾーンから受容する。標識ゾーンは、IgEもしくはIgG、またはその両方に結合する標識試薬を含む。好ましい標識試薬は、直接またはリンカーを介してかのいずれかでプラスチックビーズ基材(例えば、ラテックスビーズ)に結合体化されたDer HMW−mapタンパク質である。この基材はまた、検出可能なマーカー(好ましくは、色素生成マーカー)を含む。代表的には、標識試薬は、乾燥または凍結乾燥することにより支持体構造に注入される。サンプル構造はまた、標識ゾーンの下流にある捕捉ゾーンを備える。この捕捉ゾーンは、流路により下流に方向付けられた標識ゾーンから標識試薬を受容する。この捕捉ゾーンは、捕捉ゾーンにおいてDer HMW−mapタンパク質に複合体化されたIgEおよび/もしくはIgGを固定化する捕捉試薬(この場合、上記の抗IgE抗体または抗IgG抗体、またはその両方)を含む。この捕捉試薬は、好ましくは、乾燥または凍結乾燥することにより支持体構造に固定される。この標識試薬は、捕捉ゾーンに蓄積し、この蓄積は、肉眼でまたは光学検出デバイスにより評価される。
【0126】
別の実施形態において、IgEもしくはIgGを検出するために用いられる側流装置は、以下を備える:(a)流路を規定する支持体構造;(b)上記の抗IgE抗体もしくは抗IgG抗体、またはその両方を含む標識試薬(この標識試薬は、標識ゾーンにおける支持体構造内に注入される);および(c)Der HMW−mapタンパク質を含む捕捉試薬(この捕捉試薬は、標識試薬が、標識ゾーンから捕捉ゾーンへ流れ得る様式で、標識ゾーンに流体接続された捕捉ゾーン内で標識試薬の下流に位置している)。この装置はまた、好ましくは、流路に沿って位置した、好ましくは、標識試薬の上流に位置したサンプル受容ゾーンを備える。この装置はまた、好ましくは、流路の端部に位置した吸着剤を含む。
【0127】
Der HMW−mapタンパク質に過剰に感受性の動物は、体液のサンプルを用いた免疫複合体形成のレベルと、コントロールサンプルを用いた免疫複合体形成のレベルとを比較することにより同定される。免疫複合体とは、抗体およびDer HMW−mapタンパク質を含む複合体(すなわち、Der HMW−mapタンパク質:抗体複合体)をいう。このように、陽性コントロールサンプルを用いると、免疫複合体が形成され、陰性コントロールサンプルを用いると形成されない。このように、体液サンプルが陽性コントロールサンプルを用いた免疫複合体形成以上の免疫複合体形成を生じる場合、この体液が採取された動物は、基材に結合したDer HMW−mapタンパク質に過剰に感受性である。逆に、体液サンプルが陰性コントロールサンプルを用いた免疫複合体形成に類似の免疫複合体形成を生じる場合、この体液が採取された動物は、基材に結合したDer HMW−mapタンパク質に過剰に感受性ではない。
【0128】
2以上の異なる皮膚試験および/またはインビトロ試験が、診断目的で用いられ得ることは、本発明の範囲内である。例えば、動物がDer HMW−mapタンパク質に対して直ぐに過剰反応することは、動物の体液中のDer HMW−mapタンパク質に特異的なIgE抗体を検出し得るインビトロ免疫吸着アッセイを用いて試験され得る。Der HMW−mapタンパク質に対する遅延型過敏症を示す大部分の動物はまた、アレルゲンに対する即時型過敏症を示す一方、アレルゲンに対して遅延型過敏症を示す少数の動物は、このアレルゲンに対する即時型過敏症を示さない。このような場合、IgE特異的インビトロ試験からのネガティブな結果に従って、動物のDer HMW−mapタンパク質に対する遅延型過敏症は、本発明の皮膚試験を用いて試験され得る。
【0129】
本発明はまた、開示された検出方法の各々に基づいて、Der HMW−mapタンパク質に特異的に結合する抗体を検出するためのキットを含む。1つの実施形態は、Der HMW−mapタンパク質特異的抗体を検出するためのキットであり、このキットは、Der HMW−mapタンパク質およびIgEおよび/もしくはIgGを検出するための手段を含む。検出の適切な手段は、Der HMW−mapタンパク質またはIgEおよび/もしくはIgGのいずれかに結合する、本明細書中に開示された化合物を含む。本発明の好ましいキットは、本明細書中に開示されたIgEもしくはIgGに選択的に結合し得る抗体および/またはDer HMW−mapタンパク質に結合体化した検出可能なマーカーに結合し得る化合物(例えば、検出可能なマーカーがビオチンの場合に、アビジン、ストレプトアビジンおよびImmunoPure(登録商標)NeutrAvidin)を含む検出手段を含む。
【0130】
本発明の別の好ましいキットは、アレルゲンキットであり、このキットは、Der HMW−mapタンパク質、およびダニアレルゲンと同じ環境中で一般に検出されるアレルゲンを含む。本発明のキットとともに使用するための適切かつ好ましいダニ関連アレルゲンは、本明細書中に開示されるダニ関連アレルゲンが挙げられる。
【0131】
本発明の好ましいキットは、Der HMW−mapタンパク質が基材に固定化されたキットを含む。キットがDer HMW−mapタンパク質および別のアレルゲンを含む場合、このキットは、1以上の組成物を含み、各組成物は、1つのアレルゲンを含む。このように、各アレルゲンは、別々に試験され得る。キットはまた、IgEもしくはIgGのための2以上の診断試薬、または本明細書中に開示される他の化合物を含み得る。側流アッセイ形式に用いられるキットが特に好ましい。側流アッセイキットが1以上の側流アッセイ装置を備え得ることは、本発明の範囲内である。複数の側流装置は、各々の装置の一方の端部で互いに結合され得、それにより、扇様構造が生じ得る。
【0132】
本発明の別の局面としては、ダニアレルギーに罹りやすいかまたはダニアレルギーを有する動物を、本発明のDer HMW−mapタンパク質処方物で処置する工程を包含する。本発明に従って、用語処置とは、ダニアレルゲンに対する、動物による過敏応答の調節をいい得る。調節は例えば、動物の過敏応答に関与する細胞の免疫調節を含み得る。免疫調節は、免疫応答に代表的に関与する分子(例えば、抗体、抗原、主要組織適合遺伝子分子(MHC)およびMHC分子と同時に反応する分子)の活性を調節することを含み得る。特に、免疫調節とは、過敏応答に関与する細胞の炎症応答、免疫抑制および免疫寛容化をもたらす、抗原:抗体相互作用の調節をいう。免疫抑制とは、例えば、免疫応答に関与する特定の細胞を殺傷することによって、免疫応答を阻害することをいう。免疫寛容化とは、免疫応答に関与する特定の細胞をアネルギー化(anergizing)する(すなわち、抗原に対するT細胞の反応性を減少させる)ことによって、免疫応答を阻害することをいう。
【0133】
本発明の1つの実施形態は、本発明のDer HMW−mapタンパク質に対する免疫応答を阻害し得る脱感作化合物を含む治療組成物である。このような脱感作化合物としては、ブロッキング化合物、寛容原(toleragen)および/またはサプレッサー化合物が挙げられる。ブロッキング化合物としては、炎症応答をもたらし得る抗原:抗体相互作用を調節し得る化合物が挙げられ、寛容原は、動物を免疫寛容化し得る化合物であり、そしてサプレッサー化合物は、動物を免疫抑制し得る。本発明の脱感作化合物は、可溶性または膜結合性であり得る。膜結合性脱感作化合物は、生体膜(細胞、リポソーム、平面膜またはミセルを含む)と会合し得る。本発明の可溶性脱感作化合物は、以下の目的に有用である:(1)IgE:抗原媒介性の肥満細胞の脱顆粒をブロックすることによってI型過敏性反応を阻害すること;(2)細胞の補体破壊に至るIgG:抗原複合体形成をブロックすることによってIII型過敏性反応を阻害すること;および(3)マクロファージによるサイトカイン分泌のTヘルパー細胞刺激をブロックすることによってIV型過敏性反応を阻害すること。本発明の膜結合性脱感作化合物は、以下の目的に有用である:(1)細胞の補体破壊に至る、細胞表面でのIgG:抗原複合体形成をブロックすることによってII型過敏性反応を阻害すること;(2)免疫細胞におけるIgGによって調節されるシグナル伝達をブロックすることによってII型過敏性反応を阻害すること;および(3)抗原保有細胞のT細胞傷害性細胞殺傷をブロックすることによってIV型過敏性反応を阻害すること。脱感作化合物の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:本発明のムテイン、ミメトープ(mimetope)および抗体、ならびに本発明のタンパク質とIgEとの間の結合を阻害する、本発明の他のインヒビター。
【0134】
本発明の脱感作化合物はまた、脱感作化合物を、Der HMW−mapタンパク質に対する過敏応答に関与する特定の細胞へと標的化し得るリガンド分子に共有結合によって連結され得る。脱感作化合物を連結するために用いられる適切なリガンドとしては、例えば、免疫グロブリン分子、サイトカイン、レクチン、異種アレルゲン、CD8分子または主要組織適合遺伝子分子(例えば、MHCクラスIまたはMHCクラスII分子)の、少なくとも一部が挙げられる。脱感作化合物に連結するための、免疫グロブリン分子の好ましい部分としては、免疫細胞特異的表面分子に結合し得る可変領域、および免疫細胞上のFcレセプターに結合し得る定常領域(特に、IgEの定常領域)が挙げられる。好ましいCD8分子としては、CD8のα鎖の少なくとも細胞外機能ドメインが挙げられる。免疫細胞とは、免疫応答に関与する細胞(特に、MHCクラスI分子またはMHCクラスII分子を有する細胞)をいう。好ましい免疫細胞としては、抗原提示細胞、T細胞およびB細胞が挙げられる。
【0135】
1つの実施形態では、本発明の治療組成物は、本発明のDer HMW−mapタンパク質、そのミメトープもしくはムテイン、または本発明のDer HMW−map核酸分子を含む。ダニアレルギーを処置するための本発明の適切な治療組成物は、Der HMW−mapタンパク質、そのミメトープもしくはムテイン、または本発明のDer HMW−map核酸分子を含む。好ましい治療組成物は、以下を含む:ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41および配列番号44からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体とハイブリダイズする、単離されたダニアレルゲン性タンパク質をコードする核酸分子;ダニアレルゲン性タンパク質のミメトープ;ダニアレルゲン性タンパク質のムテイン;ならびに以下からなる群より選択される単離された核酸分子:少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここで、少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中で、約50℃の温度で、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45からなる群より選択される核酸配列、ならびに配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列およびその相補体に対してハイブリダイズする、核酸分子;ならびに少なくとも約150ヌクレオチドを含む、上記の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子。好ましいDer HMW−mapムテインは、Der HMW−mapタンパク質の少なくとも一部を含み、ここで、適切な数のシステイン残基は、除去されているかまたは非システイン残基で置換されており、その結果、変更されたDer HMW−mapタンパク質は、動物に対して毒性ではない(例えば、アナフィラキシーを引き起こさない)。
【0136】
別の実施形態では、本発明の治療組成物は、動物中で、Der HMW−mapタンパク質へのその核酸分子の発現を可能にする様式でその動物に投与され得る、Der HMW−mapタンパク質をコードする核酸分子を含む。核酸分子は、以下を含むがそれらに限定されない種々の方法で、動物へと送達され得る:(a)裸の(すなわち、ウイルスのコートにも細胞膜にもパッケージングされていない)核酸分子(例えば、例えば、Wolfら、1990,Science 247,1465−1468に教示されるように、裸のDNA分子またはRNA分子として)を投与すること、または(b)組換えウイルスまたは組換え細胞としてパッケージングされた核酸分子を投与すること(すなわち、核酸分子は、ウイルスビヒクルまたは細胞ビヒクルによって送達される)。
【0137】
本発明の裸の核酸分子としては、本発明の核酸分子が挙げられ、そして好ましくは、好ましくは複製能力、さもなければ増幅能力のある、本発明の組換え分子が挙げられる。本発明の裸の核酸は、例えば、二シストロン性組換え分子の形態の、例えば、1以上の内部リボゾーム侵入部位を有する、本発明の1以上の核酸分子を含み得る。好ましい裸の核酸分子は、ウイルスゲノムの少なくとも一部(すなわち、ウイルスベクター)を含む。好ましいウイルスベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルスおよびレトロウイルスに基づくウイルスベクターが挙げられ、アルファウイルス(例えば、シンドビスウイルスまたはセムリキウイルス)、種特異的ヘルペスウイルスおよび種特異的ポックスウイルスに基づくウイルスベクターが特に好ましい。タンパク質産生に適切であると開示されている転写制御配列を含め、任意の適切な転写制御配列が用いられ得る。特に好ましい転写制御配列としては、サイトメガロウイルスの前初期(好ましくは、イントロン−Aに関連して)、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復、および組織特異的転写制御配列、ならびにウイルスベクターを用いる場合は、ウイルスベクターに対して内因性である転写制御配列が挙げられる。「強力な」ポリ(A)配列の取り込みもまた好ましい。
【0138】
本発明の裸の核酸分子は、種々の方法によって投与され得る。適切な送達方法としては、例えば、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、皮内乱切、パーティクルボンバードメント、経口適用および鼻適用が挙げられ、筋肉内注射、皮内注射、皮内乱切およびパーティクルボンバードメントが好ましく、そして筋肉内注射がさらにより好ましい。好ましい単一用量の裸のDNA分子は、当業者によって決定され得るように、投与経路および/または送達方法に依存して、約1ナノグラム(ng)〜約1ミリグラム(mg)の範囲にわたる。投与方法の例は、例えば、米国特許第5,204,253号(Brunerらによる、1993年4月20日発行)、PCT公開番号WO 95/19799(1995年7月27日公開、McCabeによる)およびPCT公開番号WO 95/05853(1995年3月2日公開、Carsonらによる)に開示される。本発明の裸のDNA分子は、水性賦形剤(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水)中に、および/もしくはキャリア(例えば、脂質に基づくビヒクル)を伴って含まれ得るか、または微粒子(例えば、金粒子)に結合され得る。
【0139】
本発明の組換えウイルスは、ウイルスコート中にパッケージングされ、かつ投与後に動物中で発現され得る、本発明の組換え分子を含む。好ましくは、この組換え分子は、パッケージングが欠損しているか、そして/または弱毒化ウイルスをコードする。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルスおよびレトロウイルスに基づくウイルスを含むがこれらに限定されない、多数の組換えウイルスが用いられ得る。好ましい組換えウイルスは、アルファウイルス(例えば、シンドビスウイルス)、ラクーンポックスウイルス、種特異的ヘルペスウイルスおよび種特異的ポックスウイルスに基づくウイルスである。アルファウイルス組換えウイルスを産生しそして使用するための方法の一例は、PCT公開番号WO 94/17813号(Xiongらによる、1994年8月18日公開)に開示される。
【0140】
動物に投与される場合、本発明の組換えウイルスは、レシピエント動物内で細胞に感染し、そしてDer HMW−mapタンパク質媒介生物学的応答をその動物内で減少させ得る、タンパク質またはRNA核酸分子の産生を指向する。例えば、本発明のDer HMW−map核酸分子を含む組換えウイルスは、その動物内で、Der HMW−mapタンパク質媒介生物学的応答を減少させるに充分な量のタンパク質またはRNAの産生をもたらすプロトコルに従って投与される。好ましい単回用量の本発明の組換えウイルスは、その動物の体重1キログラムあたり約1×104〜約1×107ウイルスプラーク形成単位(pfu)である。投与プロトコルは、タンパク質に基づく組成物について本明細書中に記載された投与プロトコルと類似し、皮下投与経路、筋肉内投与経路、鼻腔内投与経路および経口投与経路が好ましい。
【0141】
本発明の組換え細胞ワクチンは、本発明の少なくとも1つのタンパク質を発現する、本発明の組換え細胞を含む。この実施形態のために好ましい組換え細胞としては、Salmonella、E.coli、Listeria、Mycobacterium、S.frugiperda、酵母(Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む)、BHK、CV−1、筋芽細胞G8、COS(例えば、COS−7)、Vero、MDCKおよびCRFK組換え細胞が挙げられる。本発明の組換え細胞ワクチンは、種々の方法で投与され得るが、これらは、経口的に(好ましくは、体重1キログラムあたり約108細胞〜約1012細胞の範囲にわたる用量で)投与され得るという利点を有し得る。投与プロトコルは、タンパク質に基づくワクチンについて本明細書中に記載された投与プロトコルと類似する。組換え細胞ワクチンは、細胞全体、細胞壁が剥がれた細胞または細胞溶解産物を含み得る。
【0142】
本発明の治療組成物が、ダニアレルギーに対して動物を脱感作する効力(有効性)を、本明細書に記載されるインビボ皮膚試験方法、処置される動物における細胞免疫活性の検出、または、本発明のDer HMW−mapタンパク質に対して特異的に結合するIgEのレベルの決定を用いるがこれに限定されない種々の方法で試験し得る。動物における細胞免疫活性およびIgEレベルを決定する方法は、当業者に公知である。1つの実施形態において治療組成物は、イヌ、ネコ、ウサギ、およびマウスのような動物モデルにおいて試験され得、そしてまたヒトにおいて試験され得る。このような技術は、当業者に公知である。
【0143】
本発明の治療組成物とともに使用するための好ましい核酸分子としては、本明細書に開示される任意のDer HMW−map核酸分子、詳細には、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および/またはアミノ酸配列である配列番号33を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそれらの相補体が挙げられる。
【0144】
本発明の治療組成物において有用な組み換え細胞としては、本発明のDer HMW−mapタンパク質を含む、本発明の組み換え細胞が挙げられる。本実施形態に好ましい組み換え細胞としては、Salmonella,E.coli,Listeria,Mycobacterium,S.frugiperda、酵母(Saccharomyces cerevisiaeを含む)、BHK、CV−1、筋芽細胞G8、COS(例えば、COS−7)、Vero、MDCK、およびCRFKの組み換え細胞が挙げられる。本発明の組み換え細胞は、種々の方法で投与され得るが、好ましくは体重1kgあたり約108〜約1012細胞の範囲の用量で、経口的に投与され得るという利点を有する。投与プロトコールは、タンパク質組成物について本明細書において記載されたプロトコールと同様である。組み換え細胞とは、細胞全体、細胞壁を剥がした細胞、または細胞溶解物を含み得る。
【0145】
本発明の1つの実施形態は、免疫療法の方法であり、この方法は、本発明のDer HMW−mapタンパク質を含む治療組成物の有効量を動物に投与する工程を包含する。適切な治療組成物および投与方法が本明細書において開示されている。本発明によれば、本発明の治療組成物および方法を用いて、ダニアレルゲン病因に関連する症状を予防または緩和し得る。
【0146】
本発明の治療組成物がDer HMW−mapタンパク質に対するアレルギー反応をもたらす効力(有効性)を、Der HMW−mapタンパク質媒介免疫を決定するための標準的方法(即時型過敏、遅延型過敏、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)、免疫複合体活性、分裂促進活性、ヒスタミン放出アッセイ、およびJanewayら(同書)に記載の方法のような他の方法が挙げられるがこれらに限定されない)を用いて試験し得る。
【0147】
本発明はまた、本発明の1つ以上の治療用化合物を含む治療組成物を包含する。このような治療用化合物の例としては、例えば、本明細書に開示された他のアレルゲンが挙げられる。
【0148】
本発明の治療組成物は、処置されるべき動物が耐性であり得る賦形剤中に処方され得る。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストラン溶液、ハンクス溶液、および他の生理学的に平衡な塩の水溶液が挙げられる。非水性ビヒクル(例えば、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド)もまた用いられ得る。他の有用な処方物は、増粘剤(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン)を含む懸濁液を含む。賦形剤はまた、少量の添加物(例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質)を含み得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、およびTris緩衝液が挙げられるが、保存剤(防腐剤)の例としては、チメロサール、o−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方物は、注射可能な液体か、または注射のための懸濁液もしくは溶液として適切な液体に取り込まれ得る固体のいずれかであり得る。従って、非液体処方物において、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤(防腐剤)などを含み得、投与前に無菌の水または生理食塩水がこれに添加され得る。
【0149】
本発明の1つの実施形態において、治療組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、特異的な抗原に対する動物の免疫応答を増強し得る薬剤である。適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:サイトカイン、ケモカイン、ならびにサイトカインおよびケモカインの生成を誘導する化合物(例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、コロニー刺激因子(CSF)、Flt−3リガンド、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン2(IL−2)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン4(IL−4)、インターロイキン5(IL−5)、インターロイキン6(IL−6)、インターロイキン7(IL−7)、インターロイキン8(IL−8)、インターロイキン10(IL−10)、インターロイキン12(IL−12)、インターフェロンγ、インターフェロンγ誘導性因子I(IGIF)、トランスフォーミング成長因子β、RANTES(regulated upon activation、normal T cell expressed and presumably secreted(活性化の際に調節された、正常なT細胞が発現し、そしておそらく分泌した))、マクロファージ炎症性タンパク質(例えば、MIP−1α、およびMIP−1β)、およびリーシュマニア伸長開始因子(LEIF);細菌成分(例えば、エンドトキシン、詳細には、スーパー抗原、外毒素および細胞壁成分);アルミニウムベースの塩;カルシウムベースの塩;シリカ;ポリヌクレオチド;トキソイド;血清タンパク質、ウイルスコート(外殻)タンパク質;ブロックコポリマーアジュバント(例えば、HunterのTitermaxTMアジュバント(VaxcelTM,Inc.Norcross,GA)、Ribiアジュバント(Ribi ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MT);ならびにサポニンおよびそれらの誘導体(例えば、Quil A(Superfos Biosector A/S,Denmark)。本発明のタンパク質アジュバントは、本明細書に記載の方法を用いて、タンパク質自体の形態で、またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子の形態で送達され得る。
【0150】
本発明の1つの実施形態において、治療組成物は、キャリアを含み得る。キャリアとしては、処置された動物における治療組成物の半減期を延長する化合物が挙げられる。適切なキャリアとしては、ポリマー性徐放性ビヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、オイル(油)、エステル、およびグリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【0151】
本発明の1つの実施形態は、本発明の組成物を動物に緩徐に放出し得る徐放性処方物である。本明細書において用いる場合、徐放性処方物は、徐放性ビヒクル中に本発明の組成物を含む。適切な徐放性ビヒクルとしては、生体適合性ポリマー、他のポリマー性基質、カプセル、マイクロカプセル、微小粒子、ボーラス調製物、浸透性ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア(liposphere)、および経皮送達システムが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の他の徐放性処方物としては、動物への投与の際に、その場で(インサイチュで)固体またはゲルを形成する液体が挙げられる。好ましい徐放性処方物は、生分解性(すなわち、生体腐食性)である。
【0152】
本発明の好ましい徐放性処方物は、動物におけるダニアレルギーを減弱するための組成物の治療用量レベルを達成するのに十分な一定速度で、動物の血中に本発明の治療組成物を放出し得る。本明細書において用いる場合、ダニアレルギーとは、ダニアレルゲンが動物と接触するときに生じる細胞応答をいう。例えば、ダニアレルゲンに特異的に結合するIgEは、Fcεレセプターに結合するようになり、これが、アレルギーの臨床症状を誘引し得る生物学的メディエーター(例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン、および/またはプロテアーゼ)の放出を含む、Fcεレセプター媒介性の生物学的応答を生じる。この治療組成物は、好ましくは、約1〜約12ヶ月におよぶ時間間隔にわたって放出される。本発明の好ましい徐放性処方物は、好ましくは少なくとも約1ヶ月間、より好ましくは少なくとも3ヶ月間、なおより好ましくは少なくとも6ヶ月間、なおより好ましくは少なくとも約9ヶ月間、そしてなおより好ましくは少なくとも約12ヶ月間、処置を及ぼし得る。
【0153】
本発明の治療組成物は、タンパク質分解を生じない従来方法(例えば、濾過)によって滅菌され得るか、そして/または凍結乾燥され得る。
【0154】
本発明の治療組成物は、本明細書において記載されるように、ダニアレルギーに対して感受性の任意の動物に対して投与され得る。有効な様式で本発明の治療組成物を投与する受容可能なプロトコールは、個々の用量サイズ、用量の回数、用量投与の頻度、および投与の様式によって変化し得る。このようなプロトコールの決定は、当業者によって達成され得る。有効な用量とは、ダニアレルゲンに対する過敏性に対して動物を処置し得る用量をいう。有効用量は、例えば、用いられる治療組成物、ならびにレシピエント動物のサイズおよびタイプに依存して変化し得る。ダニアレルゲンに対して動物を免疫調節する有効用量は、ダニアレルゲンに対する動物による過敏性応答を緩和し得る時間を超えて投与された用量を含む。例えば、第一の寛容化用量は、過敏性の動物に投与されたときに生じる過敏性応答が最小である、本発明の治療組成物の量を含み得る。第二の寛容化用量は、同じ治療組成物の第一の用量よりも多い量を含み得る。有効な寛容化用量は、動物がダニアレルゲンに対する曝露に対する過敏性応答を有さないように、この動物を寛容化するのに必要な治療組成物の漸増する濃度を含み得る。動物を脱感作するために有効な用量は、その動物の環境に存在するダニアレルゲンに対する曝露に対して過敏性応答を有することから動物をブロックするのに十分な、本発明の治療組成物の濃度を含み得る。有効な脱感作用量は、過敏性動物に投与されたときに生じる過敏性応答が最小である、治療組成物の濃度を有する反復用量を含み得る。
【0155】
適切な単一用量は、適切な時間間隔を超えて、1回以上投与された場合、ダニアレルゲンに対する過敏性に対して動物を処置し得る用量である。例えば、ダニアレルゲン、またはミメトープ(mimetope)治療組成物の好ましい単回用量は、動物の体重1キログラムあたり、この治療組成物の約0.5ng〜約1gである。治療組成物でのさらなる処置は、もとの投与の後、約1日〜1年で投与され得る。治療組成物でのさらなる処置は好ましくは、この動物がダニアレルゲンに対する過敏性応答からもはや防御されていない場合、投与される。特定の投与用量およびスケジュールは、上記に考察されたパラメーターに基づいて、当業者によって開発され得る。投与の様式としては、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、経鼻経路、経口経路、経皮経路、および筋肉内経路が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【0156】
本発明の治療組成物は、ダニアレルゲンに対する動物の過敏性を改変し得る他の化合物と組み合わせて用いられ得る。例えば、動物は、全身剤または抗炎症性剤(例えば、抗ヒスタミン、抗ステロイド試薬、抗炎症性試薬、およびIgEからIgGへの免疫グロブリン重鎖クラスの切り替えを駆動する試薬)などによって、過敏性応答に関与する細胞の機能を改変し得る化合物(この化合物はアレルギー反応を減弱する)を用いて処置され得る。過敏性応答に関与する細胞の機能を改変するために有用な適切な化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:抗ヒスタミン、クロモリンナトリウム、テオフィリン、サイクロスポリンA、アドレナリン、コルチゾン、細胞シグナル伝達を調節し得る化合物、アデノシン3’,5’−サイクリックホスフェート(cAMP)活性を調節し得る化合物、およびIgE活性をブロックする化合物(例えば、IgE由来のペプチドもしくはIgE特異的Fcレセプター、IgE由来のペプチドもしくはIgE特異的Fcレセプターに特異的な抗体、またはFcレセプターに対するIgEの結合をブロックし得る抗体)。
【0157】
本発明の組成物は、ダニアレルゲン過敏性を有するかまたは、それに対して過敏な任意の動物に対して投与され得る。処置するのが好ましい動物としては、哺乳動物および鳥類(ネコ、イヌ、ウマ、ヒト、および他のペット、労役動物、および/または経済的食用動物を含む)が挙げられる。防御するのに特に好ましい動物は、ネコおよびイヌである。
【0158】
本発明の別の局面は、本発明の処方物を用いて、ダニアレルゲンに対する過敏症を受け易いか、もしくはダニアレルゲンに対する過敏症を有する動物のための処置を処方するための方法を含む。ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方するための好ましい方法は、例えば、(1)本発明のダニアレルゲンまたはそのミメトープ(mimetope)を含む有効量の処方物(適切かつ好ましい処方物が、本明細書中に開示される)を動物の1つ目の部位に皮内注射する工程;(2)有効量のコントロール溶液をこの動物の第2の部位に皮内注射する工程;(3)この処方物の注射から生じる膨疹サイズとコントロール溶液の注射から生じる膨疹サイズとを測定して、比較することによって、この動物がダニアレルゲン過敏症を有するか否かを評価する工程;ならびに(4)ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方する工程、を包含する。
【0159】
ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方するための代替的な好ましい方法は、(1)試験される動物から得られた体液サンプルの第1の部分を、ダニアレルゲンまたはそのミメトープを含む有効量の処方物(適切かつ好ましい処方物が、本明細書中に開示される)と接触させ、第1の免疫複合体溶液を形成する工程;(2)陽性コントロール抗体と接触させて、第2の免疫複合体溶液を形成する工程;(3)第1の免疫複合体溶液および第2の免疫複合体溶液の中の免疫複合体形成の量を測定および比較することによって、この動物がダニアレルゲン過敏症を有するか否かを評価する工程;ならびに(4)ダニアレルゲン過敏症に対する処置を処方する工程を包含する。本明細書中に開示されるダニアレルゲン処方物を用いて、アレルギーに対する処置を処方するために類似の方法が使用され得ることに、注意すべきである。
【0160】
本発明の別の局面は、本発明の処方物を用いて、ダニアレルゲン過敏症を受け易いか、もしくはダニアレルゲンに対する過敏症を有する動物をモニタリングするための方法を含む。本発明のインビボ試験およびインビトロ試験は、ダニアレルゲン過敏症に対する任意の処置の前および後に、ダニアレルゲン過敏症について動物を試験するために使用され得る。ダニアレルゲン過敏症の処置をモニターするための好ましい方法(これはまた、他のアレルギーの処置をモニターするためにも適用され得る)は、(1)ダニアレルゲンまたはそのミメトープを含む有効量の処方物(適切かつ好ましい処方物は、本明細書中に開示される)を動物の1つ目の部位に皮内注射する工程;(2)有効量のコントロール溶液をこの動物の第2の部位に皮内注射する工程;ならびに(3)この処方物の注射から生じる膨疹サイズとコントロール溶液の注射から生じる膨疹サイズとを測定および比較することによって、この動物がダニアレルゲンに対して脱感作されるか否かを決定する工程を包含する。
【0161】
ダニアレルゲン過敏症に対する処置をモニターするための代替的な好ましい方法(これはまた、他のアレルギーの処置をモニターするためにも適用され得る)は、(1)試験される動物から得られた体液サンプルの第1の部分を、ダニアレルゲンまたはそのミメトープを含む有効量の処方物(適切かつ好ましい処方物が、本明細書中に開示される)と接触させ、第1の免疫複合体溶液を形成する工程;(2)陽性コントロール抗体と接触させて、第2の免疫複合体溶液を形成する工程;ならびに(3)第1の免疫複合体溶液および第2の免疫複合体溶液の中の免疫複合体形成の量を測定および比較することによって、この動物がダニアレルゲンに対して脱感作されるか否かを決定する工程を包含する。
【0162】
本発明はまた、ダニアレルゲンまたはそのミメトープに選択的に結合し得る抗体を含む。このような抗体は、本明細書において、抗ダニアレルゲン抗体と称される。本明細書中に使用される場合、用語「選択的に結合する」とは、このような抗体がダニアレルゲンまたはそのミメトープに優先的に結合する能力をいう。特に、本発明は、Der HMW−mapタンパク質に選択的に結合し得る抗体を含む。結合は、免疫ブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光抗体アッセイおよび免疫電子顕微鏡を含む当業者に公知の種々の方法を用いて、測定され得る;例えば、Sambrookら(同書)を参照のこと。
【0163】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであり得る。本発明の抗体は、機能的等価物(例えば、抗体を得るために使用されるタンパク質またはミメトープの少なくとも1つのエピトープに選択的に結合し得る、抗体フラグメントおよび遺伝子操作された抗体(単鎖抗体を含む))を含む。好ましい抗体は、Der HMW−mapタンパク質またはそのミメトープに応答して惹起される。抗体が惹起されるより好ましいDer HMW−mapタンパク質は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および/もしくは配列番号44のアミノ酸配列、またはこれらのホモログを有するタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましくは、本発明の抗体は、本発明のDer HMW−mapタンパク質に対して約103M−1〜約1012M−1の単一部位結合親和性を有する。
【0164】
本発明の抗体を産生するための好ましい方法は、Der HMW−mapタンパク質またはそのミメトープの有効量を動物に投与して、抗体を生成する工程、およびその抗体を回収する工程を包含する。規定された生成物またはミメトープに対して惹起された抗体は、利点を有し得る。なぜなら、このような抗体は、さもなければ診断アッセイにおける妨害、または治療組成物中で使用された場合の副作用を生じ得る、他の物質に対する抗体を、実質的に混入していないからである。
【0165】
本発明の抗体は、種々の潜在的な用途(これらは、本発明の範囲内である)を有する。例えば、このような抗体は、(a)ワクチンとして使用されて、動物を受動的に免疫して、その動物をダニアレルゲン過敏症から保護し得、(b)試験キットにおける陽性コントロールとして使用され得、そして/または(c)タンパク質および他の夾雑物の混合物から所望のダニアレルゲンを回収するための手段として使用され得る。
【0166】
以下の実施例は、例示目的のために提供され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【0167】
(実施例)
本実施例は、当業者に公知であると考えられる、多数の分子生物学的技術、微生物学的技術、免疫学的技術および生化学的技術を含むことに、注意すべきである。このような技術の開示は、例えば、Sambrookら(同書)および関連する参考文献中に見出され得る。
【0168】
(実施例1)
本実施例は、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが既知であるイヌ由来のIgEに結合する、高分子量タンパク質の同定を記載する。
【0169】
約5.5グラム(g)の凍結湿潤Dermataphagoides farinae(Der f)ダニ(Bayer Allergy,Spokane,WAから入手可能である)を、30mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)または0.1M Tris−HCl(pH8)(各々、完全なプロテアーゼインヒビター(Boehringer Mannheim,Indianapolis,INから入手可能である)を含む)のいずれかの中で、丸底ガラスホモジナイザーでホモジナイズし、Der f粗抽出物を得た。得られる上清を収集し、そして各々を16,000×gで約30分間の遠心分離によって、Centriprep 30濃縮器(Amicon,Beverly,MAから入手可能である)中で濃縮した。濃縮した上清を、それぞれ、PBSまたは0.1M Tris−HCl(pH8)中、分離Sephacryl S−100カラム(2.7×70cm;Pharmacia,Piscataway,NJから入手可能である)に適用した。各カラムから排除された画分をプールした。PBSを用いた場合、画分を10mM Tris−HC(pH 8)に対して透析した。画分を、分離Q−Sepharoseカラム(2.5×5cm;Pharmaciaから入手可能である)に適用した。0.1M Tris−HCl(pH8)を含む画分を使用した場合、Q−Sepharoseカラムを10mM Tris−HCl(pH8)中で予備平衡させた。各カラムを、約45mlの10mM Tris−HCl(pH8)、次いで0.1M Tris−HCl(pH8)、次いで0.2M Tris−HCl(pH8)、次いで0.3M Tris−HCl(pH8)、次いで0.4M Tris−HCl(pH8)、そして次いで、0.5M Tris−HCl(pH8)を用いて連続的に溶出した。画分を、各溶出工程から収集した。各画分を、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知であるイヌから単離したイヌ血清(本明細書中、ダニアレルギー性イヌの抗血清またはダニアレルギー性抗血清と称する)中に存在するIgE抗体に結合するタンパク質の存在について、ウエスタンブロットによって分析した。詳細には、画分中に含まれるタンパク質を、12% Tris−グリシン SDS−PAGEによって分解し、次いで、ニトロセルロース上にブロットした。このブロットを、標準的な緩衝液を用いて1:20で希釈した、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが公知のイヌから得られた血清プールと共にインキュベートした。このブロットを、インキュベートし、次いで、標準的な手順を用いて洗浄した。次いで、このブロットを、マウスモノクローナル抗イヌIgE抗体DEI38(1mg/ml;1:1000希釈)と共にインキュベートした。このブロットをインキュベートし、次いで標準的な手順を用いて洗浄した。次いで、このブロットを、西洋ワサビベルオキシダーゼに結合体化したロバ抗マウスIgG抗体(1:1000希釈;Jackson Labs,Maineから入手可能である)と共にインキュベートした。このブロットに結合したHRP結合体化抗体の存在を、標準的な技術を用いて検出した。約70kDのタンパク質を、0.2M Tris−HCl(pH8)画分中で同定し、約98kDのタンパク質および約109kDのタンパク質を、0.3M Tris−HCl(pH8)画分中で同定した。
【0170】
0.3M Tris−HCl(pH8)を用いて溶出した上記の画分を、Centriprep 30濃縮器中で濃縮し、次いで、20mM Na−Ac(pH5.6)中で希釈した。次いで、溶出した画分を、PolyCat A HPLC陽イオン交換カラム(PolyLC,Columbia,MDから入手可能である)に適用した。このカラムを、約10mlの20mM Na−Ac(pH5.6)を用いて溶出し、次いで、20mM Na−Ac(pH5.6)緩衝液中の0〜0.5M 直線勾配のNaClの約45mlを流速約1ml/分で用いて溶出した。画分を、溶出手順から収集し、そして上記のダニアレルギー性抗血清およびウエスタンブロットプロトコルを用いて高分子量タンパク質の存在についてアッセイした。高分子量タンパク質を含む画分をプールした。トリフルオロ酢酸(TFA)を、約0.05%の濃度に添加した。この溶液を、80% 溶媒Aおよび20% 溶媒Bで予備平衡させたTSK−Gel TMS−250 Cl逆相カラム(TosoHaas,Montgomeryville,PAから市販)に適用した。溶媒Aは、水中に約0.05% TFAを含み、そして溶媒Bは、水中の90%アセトニトリル中に約0.05% TFAを含む。このカラムを、約5mlの20% 溶媒Bを用いて溶出し、次いで、約20%〜約70% 直線勾配の溶媒B 36mlを0.6ml/分の流速にて用いて溶出した。このカラムから溶出されたタンパク質を、12% Tris−グリシンPAGEによって分解した。このゲルを、クマシーブルーを用いて染色した。染色したゲルを、図1に示す。レーン1は、Mark−12タンパク質分子量マーカー(Novex,San Diego,CAから入手可能である)を含み、レーン2は、逆相カラムから溶出されたタンパク質を含み、そしてレーン3は、SeeBlueTMタンパク質分子量マーカー(Novexから入手可能である)を含む。2つの主要なタンパク質を、溶出物中で同定した。このタンパク質の分子量を、BioRadTM Multi−AnalystTM/PC Image System(BioRad Corp.から入手可能である)を用いて決定した。図1のレーン2の中のより高い分子量のタンパク質を、約109kDであると決定し、本明細書中においてダニアレルゲンタンパク質A(mapA)と称する。図1のレーン2の中のより低い分子量のタンパク質を、約98kDであると決定し、本明細書中においてダニアレルゲンタンパク質B(mapB)と称する。合わせたタンパク質の純度は、85%純度よりも高く、すなわち、15%未満の不純物であった。この精製された溶出物を、本明細書中においてD.farinae高分子量map(HMW−map)組成物と称する。
【0171】
(実施例2)
本実施例は、D.farinae HMW−map組成物中のタンパク質のN末端配列決定を記載する。
【0172】
実施例1において上記のようにして得た0.3M Tris−HCl(pH8)画分中に含まれるタンパク質を、12% Tris−グリシンポリアクリルアミド−SDSゲルを用いたSDS−PAGEによって分離し、続いてクマシー染色をした。タンパク質を、PVDF上にブロットさせ、クマシーR−250で染色し、標準的な手順を用いて脱色した。約98kDのバンドおよび約109kDのバンドに対応するタンパク質を切り出し、そして当業者に公知の技術を用いて別々にN末端アミノ酸配列決定に供した。約14アミノ酸の部分的なN末端アミノ酸配列を、両方のタンパク質について推定し、そしてこれらの配列が同一であると決定した。N末端アミノ酸配列を、アミノ酸配列:Ser Ile Lys Arg Asp His Asn Asp Tyr Ser Lys Asn Pro Metを有する配列番号1として本明細書中に示す。
【0173】
D.farinae HMW−map組成物中のタンパク質をまた、タンパク質分解性切断に供して、内部アミノ酸配列データを得た。詳細には、このD.farinae HMW−map組成物を、当該分野で標準的な方法を使用して、エンドプロテイナーゼAsp−N(Boehringer Mannheim Biochemica,Indianapolis,INから入手可能である)を用いて切断した。次いで、消化したタンパク質を、Stoneら、Enzymatic Digestion of Proteins and HPLC Peptide Isolation(A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing,PT Matsudaira編,Academic Press,San Diego,CA.)によって記載される方法を用いて、HPLCによって分離した。12個のタンパク質分解性フラグメントを単離し、これらを、本明細書中においてmap(1)、map(2)、map(3)、map(4)、map(5)、map(6)、map(7)、map(8)、map(9)、map(10)、map(11)およびmap(12)と称する。
【0174】
map(1)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Tyr Glu Tyr Pro Gly Ser Arg Leu Gly Asn Pro Lys Ala Pro Leu Tyr Lys Arg Proであると決定し、配列番号2とも称する。map(2)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Ile Pro His Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Cys Glu Ser Val Asn Gly Glyであると決定し、配列番号3とも称する。map(3)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser Pro Pro Gly Phe Ile Val Gly Glu Glu Gly Val Leu Serであると決定し、配列番号4とも称する。map(4)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Glu Lys Asn Ser Phe Glu Cys Ile Leu Gly Proであると決定し、配列番号5とも称する。map(5)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Ala Phe Glu Pro His Gly Tyr Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Pro Gly Lysであると決定し、配列番号6とも称する。map(6)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Leu Val Arg Glu Leu Lysであると決定し、配列番号7とも称する。map(7)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Met Ala Gln Asn Tyr Lys Tyr Arg Gln Gln Phe Ile Gln Ser Val Leu Asn Asn Gly Ala Thr Arg Glnであると決定し、配列番号8とも称する。map(8)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Glu Xaa Asn Val Met Xaa Tyr Val Leu Tyr Thr Met His Tyr Tyr Leu Asn Asn Gly Ala Thr Argであると決定し、配列番号9とも称する(ここで、Xaaは、任意のアミノ酸を示す)。map(9)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Lys Leu Val Met Gly Val Pro Phe Tyr Gly Arg Ala Xaa Ser Ile Gluであると決定し、配列番号10とも称する(ここで、Xaaは、任意のアミノ酸を示す)。map(10)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Ile Pro His Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Cys Glu Ser Val Asn Glyであると決定し、配列番号11とも称する。map(11)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Tyr Ala Lys Asn Pro Lys Arg Ile Val Cys Ile Val Gly Thr Glu Gly Val Leu Serであると決定し、配列番号12とも称する。map(12)のN末端部分アミノ酸配列を、Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser Pro Pro Gly He Ile Val Gly Glu Glu Gly Val Leu Serであると決定し、配列番号13とも称する。map(1)、map(2)、map(3)、map(4)、map(5)、map(6)、map(7)、map(8)、map(9)、map(10)、map(11)、map(12)およびmap(13)についてのアミノ酸配列は、mapAタンパク質およびmapBタンパク質の混合物から生成されたので、これらの配列は、シグナルタンパク質の部分的な配列を必ずしも表さない。
【0175】
(実施例3)
本実施例は、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知であるイヌ由来のIgEに結合する70kDタンパク質の精製を記載する。
【0176】
0.2M Tris−HCl(pH8)を用いて溶出した実施例1に記載の上記画分を、Centriprep 30濃縮器中で濃縮し、次いで、20mM Na−Ac(pH5.6)で溶出した。次いで、希釈したタンパク質を、PolyCat A HPLC陽イオン交換カラムに適用した。このカラムを、約10mlの20mM Na−Ac(pH5.6)を用いて溶出し、次いで、20mM Na−Ac(pH5.6)緩衝液中の0〜0.5Mの直線勾配のNaClの約45mlを流速約1ml/分で用いて溶出した。画分を、溶出手順から収集し、そして上記のダニアレルギー性抗血清およびウエスタンブロットプロトコルを用いて70kDタンパク質の存在についてアッセイした。この70kDタンパク質を含む画分をプールした。トリフルオロ酢酸(TFA)を、約0.05%の濃度に添加した。この溶液を、80% 溶媒Aおよび20% 溶媒Bで予備平衡させたTSK−Gel TMS−250 Cl逆相カラムに適用した。溶媒Aは、水中に約0.05% TFAを含み、そして溶媒Bは、水中の90%アセトニトリル中に約0.05% TFAを含む。このカラムを、約3mlの20% 溶媒Bを用いて溶出し、次いで、約20%〜約70%の直線勾配の溶媒B 36mlを0.6ml/分の流速にて用いて溶出した。90%より高い純度の約70kDタンパク質を得た。この約70kDタンパク質を、本明細書中においてmapCと称する。
【0177】
この70kDタンパク質(mapC)に対応するSDS−PAGE上の領域のN末端配列を、実施例2に記載されるように得た。約21アミノ酸のN末端アミノ酸配列を、80% 信頼水準で推定し、そしてこれは本明細書中において配列番号33として表され、これは、以下:Gln Ser Arg Asp Arg Asn Asp Lys Pro Tyr Xaa Ile Val Lys Lys Lys Lys Lys Ala Leu Aspのアミノ酸配列を有する。
【0178】
(実施例4)
本実施例は、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知であるイヌから単離されたイヌ血清中のイヌIgEに対する、D.farinae HMW−map組成物(すなわち、mapAおよびmapBを含む)の結合を記載する。
【0179】
Immulon IIマイクロタイタープレートの複数ウェルを、CBC緩衝液中で希釈した約100ナノグラム/ウェル(ng/ウェル)のD.farinae HMW−map組成物(これは、実施例1の上記の方法に従って単離した)を用いてコーティングした。このプレートを、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、このD.farinae HMW−map組成物含有溶液を、プレートから除去し、そしてこのプレートをブロット乾燥させた(blotted dry)。次いで、このプレートを、0.05% Tween−20を有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に含まれる4.0% 胎仔ウシ血清(PBSTFCS)を約200μl/ウェルで用いて、室温で約1時間ブロックした。次いで、このプレートを、自動洗浄器(Dynatech,Chantilly,VAから入手可能である)を使用して、PBS中の0.05% Tween−20(PBST)を用いて4回洗浄した。皮内の皮膚試験においてダニアレルゲンに対する感受性が既知である異なるイヌから単離した血清サンプルの、PBSTFCS中1:10希釈の約100μl(1ウェル当たり)を、このプレートに添加した。血清のネガティブコントロール群もまた、遮断設備にて惹起された6匹のイヌ由来の血清(Harlan Bioproducts,Indianapolis,INから入手可能である)の組合わせを含むプレートに、添加した。いくつかのウェルは、イヌ血清を受けず、故に、バックグラウンドの結合レベルが、決定され得た。このプレートを室温で約1時間インキュベートし、ついで、PBSTを用いて4回洗浄した。PBSTFCS中に含まれる40μg/ml ビオチン化ヒトFcεRα鎖タンパク質(Frankら、WO 98/23964(1997年11月24日公開)に記載されるように生成される)の1:4000希釈の約100μl(1ウェル当たり)を、添加した。このプレートを室温にて約1時間インキュベートし、次いで、PBSTを用いて4回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した約0.25μg/ml ストレプトアビジン(KirkegaardおよびPerry Laboratories(KPL)、Gaithersburg,MDから入手可能;PBST中で希釈)の約100μlを、実験サンプルまたはコントロールサンプルを受けた各ウェルに添加した。次いで、このプレートを室温にて1時間インキュベートし、PBSTを用いて4回洗浄した。室温に予め温めておいた約100μlのTMB基質(KPLから入手可能である)を各ウェルに添加した。次いで、このプレートを、室温にて約10分間インキュベートし、次いで、約100μl/ウェルの停止溶液(KPLから入手可能である)を添加した。ウェルの光学密度(O.D.)を、停止溶液を添加した10分以内に、Spectramax Microtiter Plate(Molecular Devices Inc.から入手可能である)読み取り機で450nmにて読み取った。
【0180】
ネガティブコントロールサンプルのウェルおよびバックグラウンドのウェルを用いて得たO.D.読み取りは、0O.D.であった。26匹のダニアレルゲン感受性のイヌのうち5匹由来の血清は、約2,000O.D.と約3,200O.D.との間のO.D.読み取りを生成した。他3匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約1,000O.D.と2,000O.D.との間のO.D.読み取りを生成した。他3匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約500O.D.と1,000O.D.との間のO.D.読み取りを生じた。他7匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約200O.D.と500O.D.との間のO.D.読み取りを生じた。他6匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の活性は、50O.D.未満のO.D.読み取りを生成した。従って、これらの結果は、ダニアレルゲンに対して感受性であることが既知のイヌ由来の血清が、本発明のmapAタンパク質およびmapBタンパク質に特異的に結合するIgE抗体を含むことを示す。
【0181】
(実施例5)
本実施例は、ダニアレルゲンに対するアレルギー性が既知のイヌから単離されたイヌ血清中のイヌIgEに対する、70kD D.farinaeタンパク質の結合を記載する。
【0182】
Immulon IIマイクロタイタープレートの複数ウェルを、CBC緩衝液中で希釈した約100ng/ウェルの70kD D.farinaeタンパク質(本明細書中においてmapCと称する)(このタンパク質は、実施例1および3の上記のような方法に従った単離した)を用いてコーティングした。このプレートを、4℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例4に記載される方法を用いてブロックおよび洗浄した。皮内の皮膚試験においてダニアレルゲンに対する感受性が既知である異なるイヌから単離した血清サンプルの、PBSTFCS中1:10希釈の約100μl(1ウェル当たり)を、このプレートに添加した。ネガティブコントロールサンプルもまた、SPF血清サンプル(遮断設備にて維持され、ゆえにダニアレルゲンに決して曝されなかったイヌ由来の血清)を含むプレートに添加した。いくつかのウェルは、イヌ血清を受けず、ゆえに、バックグラウンドの結合レベルが、決定され得た。このプレートを室温で約1時間インキュベートし、次いで、PBSTを用いて4回洗浄した。次いで、ビオチン化ヒトFcεRα鎖タンパク質を添加し、そして実施例4に記載される方法を用いてプレートに結合したIgEの存在を検出した。
【0183】
ネガティブコントロールサンプルのウェルおよびバックグラウンドのウェルを用いて得たO.D.読み取りは、0O.D.であった。26匹のダニアレルゲン感受性のイヌのうち3匹由来の血清は、約1,500O.D.と約2,700O.D.との間のO.D.読み取りを生成した。他5匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約800O.D.と約1,500O.D.との間のO.D.読み取りを生成した。他4匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約500O.D.と約800O.D.との間のO.D.読み取りを生じた。他6匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の血清は、約200O.D.と約500O.D.との間のO.D.読み取りを生じた。他8匹のダニアレルゲン感受性のイヌ由来の活性は、50O.D.未満のO.D.読み取りを生成した。従って、これらの結果は、ダニアレルゲンに対して感受性であることが既知のイヌ由来の血清が、本発明のmapCタンパク質に特異的に結合するIgE抗体を含むことを示す。
【0184】
(実施例6)
本実施例は、ダニアレルゲンに対して過敏であることをインビトロで試験することによって示される、ネコから単離されたネコ血清中のネコIgEに対する、mapAタンパク質、mapBタンパク質、またはmapCタンパク質の結合を記載する。
【0185】
Immulon IIマイクロタイタープレートの複数ウェルを、約100ng/ウェルのD.farinae HMW−map組成物(実施例1の上記の方法に従って単離した)および70kD D.farinaeタンパク質(実施例3の上記の方法に従って単離した)を用いてコーティングした。このプレートの他のウェルを、400ng/ウェルの全Dermatophagoides pteronyssius抽出物(Greer Laboratories,Inc.,Lenoir,NCから入手可能;使用前に8倍に濃縮する)または全D.farinae抽出物(Miles,Inc.,Elkhart,INから入手可能である)を用いてコーティングした。全サンプルを、CBC緩衝液で希釈した。このプレートを、4℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例4に記載の方法を用いてブロックおよび洗浄した。インビトロアレルゲン試験においてダニアレルゲンに対して感受性であることが既知である異なるネコから単離した血清サンプルの、PBSTFCS中1:10希釈の約100μl(1ウェルあたり)を、このプレートに添加した。7匹のコントロールネコ(#15、#16、#17、#18、#19、#20、および#21)(これらは、インビトロ試験によってダニアレルゲン粉末(dust)に対して感受性でないことが示されている)由来の血清もまた、試験した。いくつかのウェルは、ネコ血清を受けず、従って、バックグラウンドの結合レベルが、決定され得る。このプレートを室温にて約1時間インキュベートし、ついで、PBSTを用いて4回洗浄した。次いで、ビオチン化ヒトFcεRα鎖タンパク質を添加し、そして実施例4に記載される方法を用いてプレートに結合したIgEの存在を検出した。
【0186】
結果を、以下の表1に示す。全ての値は、O.D.値の1,000倍を示す。HDMは、(血清学的試験(すなわち、全てのD.farinae抽出物に対するELISA)によって)粉末(dust)家ダニのアレルゲンに感受性なネコをいう。
(表1)
【0187】
【表1】
これらの結果は、ダニアレルゲンに感受性であることが既知のネコの数匹からの血清が、本発明のmapAタンパク質、mapBタンパク質またはmapCタンパク質に特異的に結合するIgE抗体を含むことを示す。さらに、mapAタンパク質、mapBタンパク質またはmapCタンパク質に結合するIgEを含むいくつかの血清はまた、全てのD.pteronyssius抽出物に結合するIgE抗体を含む。コントロール血清は、本発明のmapAタンパク質、mapBタンパク質またはmapCタンパク質のいずれかに結合するIgE抗体を含まなかった。
【0188】
(実施例7)
本実施例は、イヌにおいて高感受性応答を誘導するD.farinae HMW−map組成物の能力を例証する。
【0189】
実施例1に記載されるD.farinae HMW−map組成物が粉末ダニアレルギー応答に感受性である動物においてアレルギー応答を誘導し得るか否かを決定するために、粉末ダニアレルギーに対する臨床的兆候を活性に示すイヌ(本明細書中、アトピー性イヌという)に対して、皮膚試験を実施した。正常なイヌは、ダニアレルギーの症状を示さないがダニアレルギー応答に感受性であり得るイヌを含む。各イヌ(すなわち、4匹の正常イヌおよび4匹のアトピー性イヌ)を、外側胸部/腹部領域で剃毛し、その領域中の異なる部位に、実施例1に記載される方法によって分離された約1:50,000希釈のD.farinae粗抽出物を用いて約2μgの精製したD.farinae HMW−map組成物および/またはコントロール溶液(すなわち、ネガティブコントロールとしての生理食塩水、およびポジティブコントロールとしての1:1000希釈のヒスタミン)とともに皮内注射した。4匹の正常イヌ全ておよび4匹のアトピー性イヌ全てが、D.farinae全抽出物を受けた。正常イヌの3匹およびアトピー性イヌの2匹は、D.farinae HMW−map組成物を受けた。8匹のイヌ全てが、ネガティブコントロールサンプルおよびポジティブコントロールサンプルの両方を受けた。注射当たりの総容量は、50マイクロリットル(μl)であり、生理食塩水中に希釈された組成物およびコントロールを有した。これらの注射を、単回の注射として投与した。
【0190】
全ての注射部位を、15分時のミリメートル(mm)で客観的に測定し、そしてコントロールサンプルと比較した場合に(+)または(−)のいずれかでスコア付けした。客観的スコア付けを、Ohio State University,Columbus,OHのAndrew Hillier,D.V.M.によって実施した。結果を、表2に示す。
(表2)
【0191】
【表2】
これらの結果は、D.farinae HMW−map組成物がアトピー性イヌを含むイヌにおいて即時高感受性応答を誘導し得たことを示す。従って、HMW−map組成物は、アトピー性イヌを含むイヌにおいて高感受性応答を誘導するために十分アレルギー性である。
【0192】
表3は、以下の実験の結果を記載する。HMW−map組成物に対するIgEを、以下の3群のイヌの血清においてELISAを使用して測定した:D.farinaeアレルギー性のイヌ(HDM−AD)、(他のアレルゲンに対して)アトピー性であるがHDMアレルギー性ではないイヌ(AD)、およびナイーブなイヌ。3群のイヌをまた、D.farinae全抽出物およびHMW−map組成物に対する皮内皮膚試験によって試験した。
【0193】
(表3.D.farinaeアレルギー性のイヌ、アトピー性であるがHDM−アレルギー性ではないイヌおよびナイーブなイヌにおける、D.farinae全抽出物およびHMW−map組成物についての皮膚試験およびELISAデータ)
【0194】
【表3A】
【0195】
【表3B】
D.farinae全抽出物に対してELISAによってポジティブであった全てのイヌはまた、HMW−map組成物アレルゲンに対してもポジティブであった。D.farinae全抽出物に対してELISAによってネガティブであった8匹のイヌについて、8匹中7匹がまた、HMW−map組成物に対してもネガティブであった。
【0196】
(実施例8)
本実施例は、本発明のDer HMW−map組成物をコードする核酸分子の単離を記載する。
【0197】
Der HMW−map組成物核酸分子を、以下のように同定しそして単離した。
【0198】
(A.Dermatophagoides farinae cDNAライブラリーの調製)
Dermatophagoides farinae cDNAライブラリーを、以下のように調製した。総RNAを、約2gの瞬間凍結しかつ破砕した粉末家ダニから、Chomzynskiら、1987、Anal.Biochem.162,156−159によって記載されるものと類似の酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法を使用して抽出した。ポリA+選択されたRNAを、製造業者によって推奨される方法に従って、mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech,Newark,NJから入手可能)を使用するオリゴ−dTセルロースクロマトグラフィーによって総RNA調製物から分離した。cDNAライブラリーを、StratageneのZAP−cDNA Synthesis Kitプロトコルを使用して、λ−Uni−ZAPTMXRベクター(Stratageneから入手可能)中に構築した。約5μgのポリA+RNAを使用して、Dermatophagoides farinae cDNAライブラリーを生成した。
【0199】
(B.PCRプライマーの調製)
さらなるN末端アミノ酸配列分析を、実施例2に上記した方法に従って実施した。34アミノ酸のN末端アミノ酸部分配列を推測し、そして以下のアミノ酸配列を有する配列番号24によって示す:
【0200】
【化1】
(ここで、「Xaa」は、任意のアミノ酸残基を示す)。配列番号4のアミノ酸配列(実施例2に上記した)および配列番号24を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。以下のヌクレオチド配列:
【0201】
【化2】
を有する配列番号24由来のセンスプライマーDerf1(配列番号25と称する)(ここで、YはCまたはTを示し、RはAまたはGを示し、そしてNはA、C、TまたはGを示す)、または以下のヌクレオチド配列:
【0202】
【化3】
を有する配列番号4由来のセンスプライマーDerf2(配列番号26と称する)を、以下のヌクレオチド配列:
【0203】
【化4】
を有する配列番号4由来のアンチセンスプライマーDerf3(配列番号27と称する)、または以下のヌクレオチド配列:
【0204】
【化5】
を有する配列番号24由来のアンチセンスプライマーDerf4(配列番号28と称する)と組合わせて使用した。
【0205】
次いで、前述のプライマーを使用して、Derf cDNAライブラリーを、標準的ポリメラーゼ連鎖反応増幅(PCR)技術を用いてスクリーニングした。これらのプライマーにハイブリダイズするcDNAを同定する試み全てが、失敗した。
【0206】
(C.抗Der HMW−map組成物抗体を使用するD.farinae cDNAライブラリーの免疫スクリーニング)
PCR法を使用したcDNAクローン単離の試みが失敗したので、本発明者らは、以下のように生成した抗血清を使用してD.farinae cDNAライブラリーをスクリーニングした。実施例1に上記した方法に従って単離したタンパク質を抗原の供給源として使用して、本明細書中で抗Der HMW−map組成物抗体といわれるウサギポリクローナル抗体を生成した。ウサギポリクローナル抗体の調製を、標準的技術を使用して実施した。
【0207】
約7.5mlのEscherichia coli(XL1 Blue、O.D.600=0.5)を、Dermatophagoides farinae ZAP−cDNAライブラリー(1.8×109pfu/ml)からの3.0×104pfuのファージとともに37℃で15分間インキュベートし、30mlのLuria−Bertani(LB)培地アガープレート(150mm)にプレートした。このプレートを、37℃で一晩インキュベートした。次いで、各プレートを、IPTG(10mM)処理したニトロセルロースフィルターで37℃で約4時間オーバーレイした。次いで、このフィルターを取り外し、0.1% Tweenを含むTris緩衝化生理食塩水(pH7.5)(TBST)で5分間洗浄した。このフィルターを、TBST中に1%脱脂粉乳、1%BSA、2%ヤギ血清および0.15%ゼラチンを調製した溶液で、室温にて2時間ブロックした。次いで、フィルターを、1:1000希釈の抗Der HMW−map組成物抗体を含む上記のブロッキング溶液とともに4℃で一晩インキュベートした。次いで、この混合物を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化したロバ抗ウサギIgG抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PNより入手可能)とともに、室温で2時間インキュベートした。全てのフィルターを、各インキュベーションの間に、TBST中に含まれたブロッキング溶液で洗浄(1洗浄あたり3×15分)した。次いで、全てのフィルターを、Tris緩衝化生理食塩水(pH7.5)で室温にて5分間の最後の洗浄に付した。免疫複合体化プラークを、顕色化溶液(Kirkegaard&Perry LaboratoriesからのTMB Peroxidase Substrate/TMB Peroxidase Solution/TMB Membrane Enhancerを1/1/0.1の容量比で)にこのフィルターを浸して着色反応を生成することによって同定した。123プラークを同定し、50プラークをさらに、上記と同様な免疫スクリーニング条件下で2回以上精製した。
【0208】
(D.精製したファージプラグのPCRスクリーニング)
次いで、前出の免疫スクリーニング研究において同定したファージプラグをさらに、8B項で上記したプライマーを使用するPCR増幅によって分析した。配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28によって同定された4つのプライマーの混合物を使用して、50プラークからのDNAを増幅した。PCR増幅を、標準的技術を使用して行った。得られたPCR増幅産物の1つは、約700ヌクレオチドのフラグメントを構成した。このPCR産物を、InVitrogen,Corp.,TATMクローニングベクター(In Vitrogen,Corp.によって提供される手順)にクローニングし、標準的技術を使用するDNA配列分析に供した。700bpのPCR産物中にコードされる配列を含むことを決定された、精製したファージ由来のファージミドを回収し、標準的技術を使用するDNA配列分析に供した。
【0209】
約1752ヌクレオチド挿入物を含むクローンを単離し、本明細書中でnDerf981752と呼ぶ。核酸配列を、標準的技術を使用してnDerf981752から得て、核酸配列配列番号14を有するコード鎖および核酸配列配列番号16を有する相補鎖から構成されるnDerf981752と呼ばれるDermatophagoides farinae核酸分子を得た。配列番号14の翻訳は、nDerf981752核酸分子がアミノ酸配列配列番号15を有する全長fleaタンパク質の約555アミノ酸(本明細書中でPDerf98555と呼ぶ)をコードすることを示唆する。ここで、開始コドンは、配列番号14のヌクレオチド1〜ヌクレオチド3にわたり、終止コドンは、配列番号14のヌクレオチド1666〜ヌクレオチド1668にわたるオープンリーディングフレームが予想される。PDerf98555のアミノ酸配列は、核酸配列配列番号17を有するコード鎖および核酸配列配列番号19を有する相補鎖を有する核酸分子nDerf981665によってコードされる。配列番号18としても示されるPDerf98555は、推定分子量約63.2kDおよび推定pI約5.33を有する。配列番号15の分析は、およそのアミノ酸1〜およそのアミノ酸19にわたるシグナルペプチドの存在を示唆する。PDerf98536と本明細書中で示される、提唱した成熟タンパク質は、約536アミノ酸を含み、この配列は、配列番号21として本明細書中に示され、そして、配列番号20(コード鎖)および配列番号22(相補鎖)によって示される、nDerf981608と本明細書中で示される核酸分子によってコードされる。flea PDerf98536のアミノ酸配列(すなわち、配列番号21)は、PDerf98536が推定分子量61.2kDおよび推定pI約5.26を有することを予測する。
【0210】
アミノ酸配列配列番号15とGenBankに報告されたアミノ酸配列との比較は、配列番号15がAnopheles gambiae由来のキチナーゼタンパク質(GenBank登録番号2654602)に最大の相同性(すなわち、約42%の同一性)を示したことを示す。核酸配列配列番号17とGenBankに報告された核酸配列との比較は、配列番号17が、配列番号17とChelonus sp.venomキチナーゼmRNA(GenBank登録番号U10422)との間で最大の相同性(すなわち、約58%の同一性)を示したことを示す。
【0211】
(実施例9)
本実施例は、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが既知のイヌ由来のIgEに結合する60kDタンパク質の精製、およびこの60kDタンパク質由来の部分アミノ酸配列を記載する。
【0212】
(A.60kDタンパク質の精製)
D.farinae抽出物を調製し、実施例1に上記された方法に従ってSephacryl S−100カラムで分画した。排除ピーク(画分29〜35)後の画分を、Sephacryl S−100カラムから回収し、そしてプールした。次いで、プールした画分を、10mM Tris−HCl(pH8)で1:1に希釈し、Q−sepharoseカラムに適用して実施例1で上記した方法を使用して画分を得た。0.4M Tris−HClで溶出した画分を濃縮し、実施例1で上記した方法を使用してTMS250逆相HPLCカラムによってさらに精製した。この各文中のタンパク質を、実施例1において12%ゲルでのタンパク質分離について記載した同様の方法を使用して、14%Tris−グリシンSDS−PAGEによって分離した。染色したゲルを、図2に示す。約50% B(90%アセトニトリル中0.05%TA)で溶出した、約90%の純度の約60kDの分子量を有するタンパク質を同定した(図2、レーン4)。示した60kdタンパク質の分子量を、BioRad Multi−Analyst/PC Version 1.1プログラムおよびMark−12タンパク質分子量マーカーを使用して、56.11kdであると見積もった。約60kdタンパク質は、本明細書中でmapDタンパク質という。
【0213】
(B.60kdタンパク質より得たN末端部分配列および内部配列)
上記のパートAから溶出したタンパク質を、PVDF上にブロットし、これを、Coomassie R−250で染色し、標準的手順を使用して脱色した。約60kdのバンドに対応するタンパク質を抽出し、当業者に公知の技術を使用するN末端アミノ酸配列決定に供した。約25アミノ酸のN末端アミノ酸部分配列を、このタンパク質について推定し、配列番号23として本明細書中で示されるアミノ酸配列を、以下:
【0214】
【化6】
であると推定した(ここで、Xaaは任意のアミノ酸をいう)。
【0215】
この60kdの領域に対応するタンパク質をまた、内部アミノ酸配列データを得るために、蛋白質分解切断に供した。60kdタンパク質の消化および逆相クロマトグラフィーを、実施例1に記載したように実施した。4つの蛋白質分解フラグメントを、単離および配列決定し、これらを、本明細書中でmap(13)、map(14)、map(15)およびmap(16)という。
【0216】
map(13)のN末端部分アミノ酸配列を、以下:
【0217】
【化7】
として決定し、これをまた、配列番号29と示した。map(14)のN末端部分アミノ酸配列を、以下:
【0218】
【化8】
として決定し、これをまた、配列番号30と示した。map(15)のN末端部分アミノ酸配列を、以下:
【0219】
【化9】
として決定し、これをまた、配列番号31と示した。map(16)のN末端部分アミノ酸配列を、以下:
【0220】
【化10】
として決定し、これをまた、配列番号32と示した。
【0221】
(実施例10)
本実施例は、D.farinae 60kD(mapD)アレルゲンの一部をコードする核酸分子の単離および配列決定を記載する。
【0222】
実施例8で先に記載したように、D.farinaeライブラリーを調製した。D.farinae 60kDタンパク質(配列番号23)について推定されるN末端アミノ酸配列より、縮重合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した:配列番号23の約3〜約11のアミノ酸残基に対応するセンスプライマーであるプライマー1は、配列番号46としても識別される配列:
【0223】
【化11】
を有し、ここで、Hは、AまたはCまたはTを示し、Nは、AまたはCまたはGまたはTを示し、そしてYは、CまたはTを示す。D.farinaeライブラリー由来のフラグメントのPCR増幅を、標準的技術を使用して行った。配列番号46(プライマー1)、および配列番号47として示されるM13順方向ユニバーサルプライマー:
【0224】
【化12】
の組合わせを使用して、PCR増幅産物を生成した。
【0225】
第二の入れ子(nested)PCR反応を、第一のPCR反応の産物に対して行った。60kDタンパク質内部アミノ酸配列(配列番号31)のおよそのアミノ酸残基1〜アミノ酸残基10にわたる領域に対応する、合成オリゴヌクレオチドを合成した。このプライマー(プライマー2)は、配列番号48として示される以下の核酸配列:
【0226】
【化13】
を有し、ここで、Rは、AまたはGを示す。プライマー2(配列番号48)、および配列番号49として示されるT7標準プライマー:
【0227】
【化14】
の組合わせを使用して、PCR増幅産物を生成した。生じたPCR産物を、標準的技術を使用するDNA配列分析に供した。
【0228】
このPCR産物を配列決定し、510ヌクレオチドを含むことを見出し、これは、nDer60510として識別される。nDerf60510のコード鎖のヌクレオチド配列を、本明細書中で配列番号43として示し、そしてその相補体を、配列番号45として示す。配列番号43の翻訳は、nDerf60510が、配列番号44に示されるアミノ酸配列を有する約170アミノ酸の部分D.farinae 60kDタンパク質(本明細書中でPDerf60170と呼ぶ)をコードすることを示唆する。ここで、開始コドンは配列番号43のおよそのヌクレオチド1〜およそのヌクレオチド3にわたり、終止コドンは、配列番号43のおよそのヌクレオチド508〜およそのヌクレオチド510にわたるオープンリーディングフレームを推定する。PDerf60170は、推定分子量約19.2kDおよび推定pI約6.51を有する。
【0229】
核酸分子nDerf60510をプローブとして使用して、全長D.farinae 60kDタンパク質またはより大きな部分のD.farinae 60kDタンパク質に対応するタンパク質をコードする核酸分子を単離した。実施例8の上記に示した手順を使用して、標準的技術を使用して32Pで放射標識した核酸配列番号43を用いて、全D.farinaeライブラリーをスクリーニングした。6×SSC、5×Denhardt溶液、0.5% SDS、100mg/ml ssDNA中で55℃にて約36時間、ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、2×SSC、0.2% SDS中で55℃にて1洗浄あたり30分間3回洗浄した後、0.2×SSC、0.2% SDS中で約30分間最終洗浄した。
【0230】
PCR増幅を、最初のファージプラグに対して行った。配列番号46として示されるプライマー1、および配列番号49として示されるT7標準プライマーをプライマーとして使用して、PCR産物を生成した。この1.6キロベースのPCR産物を予備的配列分析することによって、これがPDerf60全長タンパク質をコードする完全配列を含む核酸配列を示すことが示された。
【0231】
配列番号44のアミノ酸配列PDerf60170とGenBankに報告されたアミノ酸配列との比較は、PDerf60170がAphanodidium album.由来のキチナーゼタンパク質前駆体(GenBank登録番号P32470)と最も高い相同性(すなわち約39%の同一性)を示したことを示す。核酸配列配列番号43は、GenBankに提出された配列のいずれにも顕著な相同性を示さなかった。
【0232】
(実施例11)
本実施例は、Dermatophagoides pteronyssius 98kDアレルゲンタンパク質をコードする核酸分子の単離を記載する。
【0233】
D.farinae HMW−map組成物をコードする32−P標識したcDNAを用いるハイブリダイゼーションによって、D.farinae 98kDアレルゲン(mapB)に高い相同性を有する核酸分子を、D.pteronyssius cDNAライブラリーより単離した。
【0234】
D.pteronyssius cDNAライブラリーを、以下のように調製した。総RNAを、約2gのD.pteronyssiusダニから、Chomzynskiら、1987、Anal.Biochem.162:pp156−159によって記載される酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法を使用して抽出した。ポリA+選択されたRNAを、製造業者によって推奨される方法に従って、mRNA Purification Kit(Pharmacia,Newark,NJから入手可能)を使用するオリゴ−dTセルロースクロマトグラフィーによって、総RNA調製物から分離した。全D.pteronyssius cDNAライブラリーを、StratageneのZAP−cDNA Synthesis Kitプロトコルを使用して、λ−Uni−ZAPTMXRベクター(Stratagene,La Jolla,CAから入手可能)中に構築した。約5ミリグラム(mg)のポリA+RNAを使用して、D.pteronyssius cDNAライブラリーを生成した。
【0235】
cDNA Synthesis Kit(Stratageneより入手可能)に記載されるプロトコルの改変を使用して、32P−標識した、D.farinae 97kD MapBアレルゲン(すなわち、配列番号17)をコードするcDNAで、全D.pteronyssius cDNAライブラリーを二連のプラークリフト(plaque lift)を使用してスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、6×SSC(処方について、Sambrookら、同書を参照のこと)、5×Denhardt溶液(処方について、Sambrookら、同書を参照のこと)、0.5% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(Sigmaより入手可能)、および100mg/mlの一本鎖DNA(Sigmaより入手可能)中で、55℃にて約36時間行った。2×SSC、0.2% SDS中で55℃にてフィルターを3回洗浄し(1洗浄あたり約30分間)、続いて、0.2×SSC、0.2% SDS中で55℃にて約30分間フィルターを最終洗浄した。D.pteronyssius 97kDアレルゲン(mapB)をコードする、D.pteronyssius核酸分子のプラーク精製したクローンを、ZAP−cDNA Synthesis Kit(Stratageneより入手可能)に記載されるインビボ切除プロトコルに従って、ExAssistTMヘルパーファージおよびSOLRTM E.coliを用いて二本鎖組換え分子に変換した。D.pteronyssiusクローンを含むプラスミドを、標準的技術を使用するDNA配列分析に供した。DNA配列分析(分子量および等電点(pI)の決定を含む)を、GCGTMプログラムを使用して行った。
【0236】
約1621ヌクレオチド挿入物を含むクローンを単離した。これは、本明細書中でnDerp981621と呼ぶ、配列番号34として示されるコード鎖および配列番号36として示される相補鎖を有する全長コード領域を含む。明白な開始コドンおよび終止コドンは、それぞれ配列番号34のヌクレオチド14〜ヌクレオチド16、およびヌクレオチド1541〜ヌクレオチド1543にわたる。推定のポリアデニル化シグナル(5’AATAAA3’)は、配列番号34のヌクレオチド1584〜ヌクレオチド1589にわたる領域に位置する。
【0237】
配列番号34の翻訳は、配列番号35として示されるアミノ酸配列であり、PDerp98509として示される、約509アミノ酸のタンパク質を生じる。PDerp98509をコードするコード領域からなる核酸分子は、本明細書中でnDerp981527として呼ばれ、その核酸配列は、配列番号37(コード鎖)および配列番号39(相補鎖)として示される。本明細書中で配列番号38としても示されるPDerp98509のアミノ酸配列は、推定分子量約58.9kDおよび推定pI約5.61を有する。PDerp98509の分析は、およそのアミノ酸1〜およそのアミノ酸19にわたるシグナルペプチドの存在を示唆する。提唱した成熟タンパク質(本明細書中でPDerp98490として示される)は、約490アミノ酸を含み、そして本明細書中で配列番号41として示される。PDerp98490のアミノ酸配列によって、このタンパク質が、推定分子量約56.8kDおよび推定pI約5.49、ならびに2つのアスパラギン連結グリコシル化部位(それぞれ、およそのアミノ酸115〜およそのアミノ酸117、およびおよそのアミノ酸240〜アミノ酸242に伸展する)を有することを予想する。PDerp98490をコードする核酸分子は、配列番号40によって示されるコード鎖および配列番号42によって示される相補鎖を有するnDerp981470として公知である。
【0238】
BLAST検索を、以前に記載されるように実施した。PDerp98509(配列番号35)は、Manduca sextaキチナーゼ(SwissProt登録番号p36362)とアミノ酸レベルで最も高い相同性を示し、約34%の同一性を有した。nDerp981621(配列番号34)は、Chelonus sp.キチナーゼ(登録番号U10422)に核酸レベルで最も高い相同性を示し、約49%の同一性を有した。D.farinaeの98kDのアレルゲンタンパク質についてのコード領域に対応するcDNA領域と、D.pteronyssiusの98kDのアレルゲンタンパク質についてのコード領域に対応するcDNA領域との比較は、約84%の同一性を示す。
【0239】
(実施例14)
本実施例は、D.farinae HMW−map組成物の、ダニアレルゲンに対してアレルギー性であることが公知の、ヒトから単離されたヒト血清中のヒトIgEへの結合を示す。
【0240】
RASTすなわちラスト法(radio−allergo−absorbent test)と呼ばれる技術を使用した。なぜなら、ヒト血清中に存在するヒトIgEの量が非常に低いためである。RASTを、本質的に、Aalberse,RCら(1981)J.Allergy Clin Immun.68:356〜364頁において記載されるように実施した。単位IU/mlを計算するために、標準曲線を、Derp2に対する十分に特徴付けられたキメラヒト/マウスIgEモノクローナル抗体(ヒトIgE/モノクローナル抗Derp2、Schuurmanら(1997)J Allergy Clin Immunol.99:545〜550頁の手順に従う)のいくつかの希釈物を用いてRASTを行なうことによって導き出した。
【0241】
手短に言うと、50μgのHMW−map組成物(実施例1に記載されるように精製した)を、製造業者のプロトコルに従って、50mgのCNBr活性型Sepharose4B(Pharmacia,Piscataway,NJより入手可能)に結合させた。ヒト血清を、全ダニD.farinae抽出物についてポジティブなRASTに基づいて選択し(全部で17個の異なるサンプル)、ポジティブなRAST数は、1IU/mlより大きい。2つのネガティブ(0.3IU未満)コントロール血清もまた含んだ。
【0242】
各々の個体の血清サンプルを試験するために、0.5mgのD.farinae HMW−map組成物結合Sepharoseを、総容量300μlのPBS−T(0.1%容量/容量Tween−20(Sigmaより入手可能)を添加したリン酸緩衝化生理食塩水)中50μlの血清と共にインキュベートした。インキュベーションは、振盪しながら27℃で一晩行なった。インキュベーション後、結合したSepharoseをPBS−Tで5回洗浄した。総容量750μl中(4.5%(v/v)ウシ血清および0.5%(v/v)ヒツジ血清を含むPBS−T中で希釈した)放射性標識した(125−ヨウ素)ヒツジ抗ヒトIgE(標準的な放射ヨウ素化標識プロトコルによって作製された)を添加し、そして27℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合したSepharoseを、PBS−Tで4回洗浄し、そしてγカウンターでカウントしてHMW−map組成物結合Sepharoseに結合した放射性標識したヒツジ抗ヒトIgEの量を決定した。結果を表4に示す。
【0243】
(表4.D.farinae由来のHMW−map組成物へのヒトIgEの結合)
【0244】
【表4】
D.farinae全ダニ抽出物に対して感受性を示した患者の約75%(15人中11人)は、HMW−map組成物抗原に対して感受性であり、このことは、HMW−map組成物抗原が、D.farinae感受性ヒトに対する主要な抗原であることを示す。HMW−map組成物に対する感受性は、0.5IU以上のRASTとして規定された。
【0245】
(実施例15)
本実施例は、実施例1に記載されるD.farinae HMW−map組成物が糖タンパク質を含むことを実証する。
【0246】
実施例1に従って調製された約5.4μgのD.farinae HMW−map組成物を、SDS PAGEに適用し、そして電気泳動を標準的な技術に従って行なった。このタンパク質を、標準的な技術に従ってニトロセルロース膜にブロットし、そして糖タンパク質を、製造業者のプロトコルを使用して、DIGTMグリシン検出キット(Boehringer Mannheim,Indianapolis,INより入手可能)を使用して検出した。HMW−map領域に対応する領域は、キットを用いて陽性反応を示し、このことは、HMW−map組成物が糖タンパク質を含むことを示す。
【0247】
(実施例16)
本実施例は、D.farinae HMW−map組成物が、化学的手段および酵素的手段の両方によって、アミノ酸残基が取り除かれる場合でさえ、アレルゲンとしてのその特徴を保持することを示す。この結果は、主なエピトープが、HMW−map組成物上のN連結グリコシル化部位またはO連結グリコシル化部位に結合した多糖を含む、炭水化物エピトープであり得ることを示唆する。
【0248】
(A.化学的手段によるタンパク質除去(タンパク質のβ除去))
12μg(マイクログラム)のHMW−map組成物(実施例1に記載されるように精製された)を、100μl(マイクロリットル)の蒸留した脱イオン水中に溶解した。この混合物に、5μlの10M(モーラー)NaOHおよび3.8mg(ミリグラム)NaBH4(Sigmaより入手可能)を添加して、0.5M NaOHおよび1M NaBH4の最終濃度を得た。この反応混合物を、50℃で30分間加熱し、次いで冷却し、そして100μlのアセトンを添加した。この混合物に、十分な量(すなわち、約150μl)のDowex50(H+)(Pharmaciaより入手可能)を添加して、わずかに酸性の溶液を作製した。Dowex50は、タンパク質を吸収および除去し、上清に任意の糖部分を残す。この混合物を、マイクロ遠心分離機で遠心分離し、そして100μlの水で3回洗浄した。遠心分離からの上清を合わせて、乾燥するまで蒸発させて、メタノール:HCl溶液(1000:1 v/v)で5回洗浄し、各洗浄後、乾燥するまで蒸発させて塩を取り除く。この混合物を、100μlの水に溶解し、そして一部(20μl)を標準的な技術を使用するSDS−PAGEによって分析し、そしてクマシーブルー染色および銀染色の両方を使用して、化学的に処理されたサンプル中のタンパク質の量を決定した。クマシーブルー染色および銀染色のいずれによってもタンパク質は検出されず、このことは、タンパク質の除去を示す。タンパク質上の任意の糖部分は、これらの条件によって影響されなかった。
【0249】
各サンプルからの残渣の残りを、実施例4に記載されるように、ELISA分析に供した。手短に言うと、100ngのHMW−map組成物のβ除去サンプルまたは非β除去サンプルのいずれかをImmulonプレートにコーティングし、そしてD.farinae感受性イヌ血清プール、D.farinae感受性ネコ血清プール、および(ELISAによって測定される場合)D.farinae感受性または非感受性のいずれかである種々の別々のイヌ血清を用いて、ELISAを、実施例4に記載されるように実行した。結果を表5に示す。
【0250】
(表5.HMW−map組成物およびβ除去HMW−map組成物(これは、炭水化物のみである)に対するイヌ血清およびネコ血清の反応性)
【0251】
【表5】
表5からの結果は、β除去HMW−map組成物サンプルが、D.farinae HMW−map組成物に感受性であるイヌ血清およびネコ血清由来のIgEを結合する能力をまだ保持することを示し、このことは、タンパク質に結合したグリカンが、HMW−map組成物アレルゲンタンパク質の主要なエピトープを構成することを示す。
【0252】
(B.酵素的手段によるタンパク質除去)
14μgのHMW−map組成物(実施例1に記載されるように精製した)を、1μg エンドプロテイナーゼK(Sigmaより入手可能)で消化して、分子のタンパク質部分を除去する。消化反応を、56℃で24時間行ない、その後、反応物中のエンドプロテイナーゼを、煮沸水中で10分間熱変性させた。
【0253】
この反応物の一部を、標準的な技術を使用するSDS−PAGEによって分析し、そしてクマシーブルー染色および銀染色の両方を使用して、酵素的に消化したサンプル中のタンパク質の存在を検出した。HMW−map組成物は、クマシーブルー染色および銀染色のいずれによっても検出されず、このことは、HMW−map組成物の除去を示す。タンパク質上のグリコシル化部位を介して結合したグリカンはいずれも、これらの条件によって影響されなかった。
【0254】
酵素的に消化した反応物の残りを、実施例4に記載される様式で、ELISAによって試験した。手短に言うと、100ngのHMW−map組成物のプロテイナーゼK消化サンプルまたはプロテイナーゼK未消化サンプルのいずれかをImmulonプレートにコーティングし、そしてELISAを、(ELISAによって測定される場合)D.farinae感受性または非感受性のいずれかである種々の別々のイヌ血清を用いて、実施例4に記載されるように実行した。結果を表6に示す。
【0255】
(表6.HMW−map組成物およびエンドプロテイナーゼK消化HMW−map組成物に対するイヌ血清の反応性)
【0256】
【表6】
表6からの結果は、プロテイナーゼK消化HMW−map組成物サンプルが、D.farinae HMW−map組成物に感受性であるイヌ血清およびネコ血清由来のIgEを結合する能力をまだ保持することを示し、このことは、タンパク質に結合したグリカンが、HMW−map組成物上の主要なエピトープを構成することを示唆する。
【0257】
(実施例17)
本実施例は、HMW−map組成物からN連結グリカンを除去する試みを記載する。
【0258】
HMW−map組成物(2μg)(実施例1におけるように精製された)を、製造業者の指示に従って、N−グリコシダーゼF(Boehringer−Mannheimより入手可能)を用いて消化した。消化物を、SDS−PAGEによって分析し、そして標準的なプロトコルに従って染色した。2μg Fetuin(Sigmaより入手可能)を、ポジティブなN連結グリコシル化タンパク質コントロールとして使用した。SDS−PAGEの分析は、インタクトなmap Bタンパク質および消化したmap Bタンパク質の分子量の間に見かけの差異は存在しないことを示した。ポジティブコントロールのfetuinは、N−グリコシダーゼFでの消化後に分子量の減少を示さなかった。この結果は、HMW−map組成物上にN連結グリカンが存在しないこと、またはHMW−map組成物上に小さいサイズのNグリカンのみが存在することを示す。
【0259】
(実施例18)
本実施例は、全長Dermatophagoides farinaeの60kDアレルゲンをコードする核酸分子の単離および配列決定を記載する。
【0260】
この核酸分子を、実施例10に記載されるDermatophagoides farinaeの60kDアレルゲンの一部をコードする32P−標識されたcDNAとハイブリダイズする能力によって、Dermatophagoides farinaeのcDNAライブラリーから単離した。
【0261】
Dermatophagoides farinae cDNA ライブラリーを、以下のように調製した。全RNAを、Chomzynskiら、1987、Anal.Biochem.162,156〜159によって記載される方法に類似の、酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法を用いて、約2グラムのD.farinaeダニから抽出した。ポリA+選択したRNAを、製造者によって推奨される方法に従って、mRNA精製キット(Pharmacia Biotech,Newark,NJから入手可能)を用いて、オリゴdTセルロースクロマトグラフィーによって、全RNA調製物から分離した。全ダニcDNAライブラリーを、StratageneのZAP−cDNA Synthesis Kitプロトコルを用いて、lambda−Uni−ZAPTM XRベクター(Stratageneから入手可能)中に構築した。約5μgのポリA+RNAを使用して、D.farinae cDNAライブラリーを生成した。
【0262】
cDNA Synthesis Kit中に記載されるプロトコルの改変を用いて、32P−標識されたcDNA nDerf60510を有する複数のプラークリフトを用いて、全ダニcDNAライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、6×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、100mg/mlのssDNAで、52℃で18時間行った。フィルターを、各洗浄あたり、2×SSC、0.2%のSDS中、55℃で30分で、2回洗浄した後、約0.2×SSCを用いる以外は同じ緩衝液中で、30分間最終の洗浄を行った。D.farinaeの60kDアレルゲンをコードする核酸分子のプラーク精製クローンを、ZAP−cDNA Synthesis Kit(Stratageneから入手可能)中に記載されるインビボでの切り出しプロトコルに従って、ExAssistTMヘルパーファージおよびSOLRTM E.coliを用いて、二本鎖組換え分子へと変換し、これを本明細書中において、nDerf601455として示す。二本鎖プラスミドDNAを、アルカリ溶解プロトコル(例えば、Sambrookら、前出に記載される)を用いて調製した。
【0263】
(実施例19)
本実施例は、本発明のD.farinae核酸分子の配列決定を記載する。
【0264】
nDerf601455を含むプラスミドを、Sangerジデオキシ鎖停止法によって、Ampli Taq DNAポリメラーゼ、FS(Perkin Elmer Corporation,Norwalk,CTから入手可能)を用いたPRISMTM Ready Dye Terminator Cycle Sequencing Kitを用いて、配列決定した。PCR伸長を、GeneAmpTM PCR System 9600(Perkin−Elmerから入手可能)中で行った。過剰の色素ターミネーターを、製造者の標準的なプロトコルに従って、CentriflexTM Gel Filtration Cartridge (Advanced Genetics Technologies Corporation,Gaithersburg,MDから入手可能)を用いて、伸長産物から除去した。サンプルを、ABIプロトコルに従って再懸濁し、そして、Perkin−Elmer ABI PRISMTM 377 Automated DNA Sequencerにかけた。配列の編集およびオープンリーディングフレームの決定を含むDNA配列分析を、GCGTMプログラム(Genetics Computer Group,Madison,WIから入手可能)を用いて行った。分子量および当電点(pI)の決定を含むタンパク質配列分析を、GCGTMプログラムを用いて行った。
【0265】
完全なnDerf601455核酸分子の約1455ヌクレオチドコンセンサス配列を決定した;2つの相補鎖の配列が、配列番号50(コード鎖)および配列番号52(相補鎖)として存在する。この2つの相補的な鎖の配列を、配列番号50(コード鎖)および配列番号52(相補鎖)として示す。nDerf601455配列は、全長のコード領域を含む。明らかな開始コドンおよび停止コドン範囲は、それぞれ、配列番号50の14〜16および1400〜1402のヌクレオチドにわたる。推定ポリアデニル化シグナル(5’AATAAA3’)は、配列番号50のヌクレオチド約1408〜1413にわたる領域内に配置される。
【0266】
配列番号50の翻訳は、PDerf60462と示される、462アミノ酸のタンパク質を生じ、このアミノ酸配列は、配列番号51に示される。PDerf60462をコードするコード領域からなる核酸分子は、本明細書中で、nDerf601386といい、この核酸配列は、配列番号53(コード鎖)および配列番号54(相補鎖)に示される。PDerf60462のアミノ酸配列(すなわち、配列番号51)は、PDerf60462が、約52.1kDの推定分子量を有し、約5.73の推定PIを有することを予測する。配列番号51の分析は、アミノ酸1〜アミノ酸25にわたるアミノ酸の範囲によってコードされるシグナルペプチドの存在を示唆する。提唱された成熟タンパク質は、本明細書中でPDerf60437と示され、このタンパク質は、本明細書中で配列番号56と示される約437アミノ酸を含む。PDerf60437のアミノ酸配列(すなわち、配列番号56)は、PDerf60462が、約50.0kDの推定分子量を有し、約5.61の推定PI、およびアミノ酸313〜アミノ酸315にわたる1つの推定アスパラギン連結グリコシル化部位を有することを予測する。この成熟タンパク質をコードする核酸分子を、配列番号55と示し、その逆位相補体を、配列番号57と示す。
【0267】
BLASTp検索を、以下に従って行った:Altschulら,(1990),J.Mol.Biol.215:403〜410;およびAltschulら,(1997),Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402。タンパク質検索を、配列番号51を用いて行い、この配列番号51は、キチナーゼ分子に対して有意な相同性を示した。アミノ酸レベルでの相同性検索のスコア一致が最も高いのは、PIR受託番号A53918:Chelonus spキチナーゼ前駆体であり、これは、配列番号51と約32%同一であった。ヌクレオチドレベルで、この検索を、配列番号53を用いて行い、この配列番号53は、データベース中の任意の配列と有意な類似性を示さなかった。配列分析を、上述のようにGCG GAPプログラムを用いて行った。
【0268】
(実施例20)
本実施例は、D.farinae HMW−map組成物(これは、Der f 15ともいわれる)の特徴付けをさらに記載する。
【0269】
実施例8の核酸分子nDerf981752を、適切な発現ベクターに挿入し、E.coliおよびP.pastors中で発現させた。得られたタンパク質(PDerf98555)が、E.coliまたはP.pastoris中で発現される場合、実施例4に記載されるように産生した、感作されたイヌ血清は、組換えタンパク質を認識できなかった。このことは、実施例1のネイティブなD.farinae HMW−map組成物(これはまた、ネイティブなDerf15ともいう)が使用される場合に得られる陽性の結果と対照的である;実施例4を参照のこと。
【0270】
E.coli中で発現されるタンパク質の非反応性は、実施例16に示される結果と一致し、この結果は、ネイティブなHMWアレルゲンが、アミノ酸が除去された後でさえ、アレルゲンとしての特性を保持していることを示した。
【0271】
これらの結果を全て合わせると、主要なエピトープは、分子または他の二次的改変のいくつかの炭化水素領域であることが示唆される。
【0272】
ネイティブなDerf15タンパク質の抗原性は、過ヨウ素酸処理の後に失われず;一般的に、炭化水素エピトープは、さらなる基でさらに置換されたエピトープ、またはジェミナルでないヒドロキシル基を有する珍しい糖を有するエピトープを除いて、過ヨウ素酸塩によって破壊される。
【0273】
ネイティブなDerf15抗原を、炭化水素含量に関して分析した。炭化水素の実質的な量が見い出された(約30重量%)。特に、約2.8重量%の抗原から構成されるマンノース;ガラクトース約23.2%;グルコース約4.3%(グリコシル残基の存在は、グルコースがしばしば糖タンパク質を含むため、仮の値であるとみなされなければならない);そして検出可能なレベルでのHexNAc;さらなる観察により、HexNAcがGlcNAcおよびGalNAcであることが明らかとなった。
【0274】
ネイティブなDerf15タンパク質を、NaBH4存在下にて塩基で処理して、P−4サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。Derf15中に存在するO−連結オリゴ糖によって、このカラムが役に立たないことを見い出した。この結果は、非常に大きなO−連結オリゴ糖、またはオリゴ糖上のサルフェートのような酸性基の存在のいずれかと一致する。サルフェートの存在または非存在をより直接的に決定するための試みは、あいまいな結果を与えた。
【0275】
Derf15を、pH4、pH5、およびpH7で、37℃にて一晩処理した。次いで、得られたサンプルを、このタンパク質に対する抗体またはDerf15と反応性であることが公知のイヌ血清でプローブした。pH5およびpH7で処理したサンプルにおいて、イヌ抗血清エピトープの全てが破壊されたが、pH4で処理されたサンプルにおいて、いくらか活性が残った。抗Derf15抗体は、脱グリコシル化が起こったかのように、全てのpHで、Derf15の分子量が減少したことを示し、pH4では元の物質がいくらか残っている。この変化が、Derf15タンパク質による自己触媒であったかまたは化学的に生じたか否かは、知られていない;理論に縛られないが、エピトープの喪失がこのような温和な条件下で生じるため、自己触媒作用が起こったと考えられる。
【0276】
(実施例21)
本実施例は、ネコ血清中のネコIgEに対する、いくつかのイエダニ(HDM)アレルゲンの結合を記載する。
【0277】
イエダニに対するネコのIgE応答のアレルゲンプロフィールは、イヌのものとは異なっているようである。Heska’s Veterinary Diagnostic Laboratories(VDL)に2000年1月に提出されたネコ血清に対するIgE試験の結果の検査は、全てのアレルゲン特異的なIgE陽性のネコの40%が、抗HDM IgEを有したことを示した。これらのネコの全ては、D.farinaeおよびD.pteronyssinusの両方に対して陽性であった。D.farinaeに関して陽性であることが公知の88の血清を、Derf1、Derf2、Derf15、および60kDアレルゲンの高度に精製された調製物に対して、ELISAによってアッセイした。このアッセイにおいて、32%のネコが、Derf1について陽性であり、42%が、Derf2について陽性であり、68%がDerf15について陽性であり、そして86%が、60kDアレルゲンについて陽性であった。
【0278】
本発明の種々の実施形態が詳細に記載されているが、これらの実施形態の改変および適応が、当業者に思い浮かぶことは、明らかである。しかし、このような改変および適応が、添付の特許請求の範囲に記載されるような、本発明の範囲内であることが明らかに理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、12%Tris−グリシンSDS−PAGEにより分離された高分子量のDer fタンパク質を示す。
【図2】
図2は、14%Tris−グリシンSDS−PAGEにより分離された約60kDのDer fタンパク質を示す。[0001]
(Field of the Invention)
The present invention relates to high molecular weight Dermatophagoides proteins, nucleic acid molecules, and therapeutic and diagnostic agents derived from such proteins.
[0002]
(Background of the Invention)
Immunoglobulin E (IgE), which mediates allergic symptoms, afflicts many animals. IgE antibody products in animals can induce pathogenic IgE responses, including, for example, atopic diseases, asthma and rhinitis. Allergens are proteins or peptides that are characterized by their ability to induce a pathogenic IgE response in susceptible individuals.
[0003]
House dust mite (eg, Dermatophagoides farinae and Dermatophagoides pteronyssinus; Der f and Der p, respectively) allergens are major causative agents associated with IgE-mediated etiology. Previous investigators have reported two major groups of house dust mite allergy in humans (Group I (Der fI and Der pI, Mr 25,000) and Group 2 (Der fII and Der pII, Mr 14,000); Chapman et al., Allergy, 52, pp. 37-379, 1997). Previous investigators have disclosed nucleotide and / or amino acid sequences for: Der fI, Der fII, Der pI, and Der pII, US Pat. No. 5,552,142 (Thomas et al., Published September 3, 1996), US Patent No. 5,460,977 (Ando et al., Published October 24, 1995), PCT Patent Application Publication No. WO 95/28424 (Chen et al., Published October 26, 1995). ), US Patent No. 5,433,948 (Thomas et al., Issued July 18, 1995), PCT Patent Application Publication No. WO93 / 08279 (Garmen et al., Issued March 4, 1993) or Chapman, supra. Der pIII, PCT Patent Application Publication No. WO 95/15976 (Thomas et al., 1995). Der pVII, PCT Patent Application Publication No. WO 94/20614 (Thomas et al., September 15, 1994); 40 kilodalton (kd) Der f allergen, US Pat. No. 5,405,758 (Oka). Et al., April 11, 1995); U.S. Pat. No. 5,314,991 (Oka et al., May 24, 1994); 70-kd Der f allergen, a heat shock protein (Hsp70); Aki et al., J. . Biochem. 115, 435-440, 1994; or Noli et al., Vet. Immunol. Immunopath. Vol. 52, pp. 147-157, 1996; and 98-k Der f paramyosin-like allergen, Tsai et al. Allergy Clin. Immunol. 102, 295-303, 1998. These published sequences disclose neither the tick allergy nucleic acid molecules nor the proteins of the invention, and also the relevance of such proteins that are immunoreactive with IgE antibodies in dog, cat or human serum. Neither suggest nor predict.
[0004]
The products and processes of the present invention are needed in the field of providing specific detection and treatment of mite allergy.
[0005]
(Summary of the Invention)
The present invention relates to novel proteins having a molecular weight of about 60 (kd or kD) 70 kD or about 98 kD to about 109 kD. Such proteins comprise at least one epitope of a Dermatophagoides mite protein allergen and are designated herein as Der HMW-map proteins. Preferred proteins are Dermatophagoides farinae or Dermatophagoides pteronyssius proteins. The invention also provides proteins that are fragments or peptides of the full-length or mature proteins, as well as any antibodies, mimetopes, or muteins of such proteins. The invention also provides nucleic acid molecules encoding any of such proteins, as well as the complements thereof. The invention also provides methods for obtaining such proteins, nucleic acid molecules, antibodies, mimetopes, or muteins, as well as methods for using such compounds in diagnostic or therapeutic applications. The present invention also relates to reagents containing non-proteinaceous epitopes that bind to mite allergic dog or cat IgE, as well as antibodies raised against such epitopes. The present invention also relates to therapeutic compositions or assay kits comprising such non-proteinaceous epitopes, as well as methods for identifying and / or desensitizing animals susceptible to an allergic response to ticks, the method comprising: Includes the use of non-proteinaceous epitopes.
[0006]
One embodiment of the invention is at least one of the following isolated nucleic acid molecules: (a) a nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein such a nucleic acid molecule comprises 1 × SSC and Hybridizes to a nucleic acid molecule comprising at least one of the following nucleic acid sequences in a solution containing 0% formamide at a temperature of about 50 ° C.): SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 33 And (b) a nucleic acid molecule comprising any fragment of the nucleic acid molecule of (a), wherein Instrument comprises at least about 15 nucleotides). The present invention also includes recombinant molecules, recombinant viruses and cells containing such nucleic acid sequences, and methods of producing them.
[0007]
Another embodiment of the invention is an isolated protein encoded by at least one of the following nucleic acid molecules: (a) a nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein such a nucleic acid molecule is Hybridizes to a nucleic acid molecule comprising at least one of the following nucleic acid sequences in a solution containing 1 × SSC and 0% formamide at a temperature of about 50 ° C.): SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 A nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 33; and (b) any fragment of the nucleic acid molecule of (a). A nucleic acid molecule, wherein the fragment comprises at least about 15 nucleotides. An isolated protein of the invention can also be encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent hybridization conditions to the complement of a nucleic acid molecule that encodes a protein having at least one of the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 44. The invention also includes antibodies that selectively bind to a protein of the invention, as well as methods of producing and using such proteins or antibodies.
[0008]
The invention also includes therapeutic compositions for treating an allergic response to mites. Such therapeutic compositions comprise at least one of the following desensitizing compounds: (a) an isolated nucleic acid molecule of the invention; (b) an isolated mite allergic protein of the invention; ) Mimetopes of such mite allergic proteins; muteins of such mite allergic proteins; (e) antibodies to such mite allergic proteins; and (f) inhibitors of the binding of mite allergic proteins to IgE. Also included are methods of desensitizing a host animal to an allergic response to mites. Such methods include administering a therapeutic composition of the present invention to an animal.
[0009]
One embodiment of the present invention is an assay kit that tests whether an animal is susceptible to or has an allergic response to mites. Such a kit comprises an isolated protein of the invention, as well as means for determining whether the animal is susceptible to, or has, the allergic response. Such means include the use of such proteins to identify animals that are susceptible to or have an allergic response to mites. The invention also includes a method of identifying an animal susceptible to or having an allergic response to mites. Such methods include the following steps: (a) contacting the isolated protein of the present invention with an animal antibody; and (b) determining the formation of an immune complex between the protein and the antibody. (Where the formation of the immune complex indicates that the animal is susceptible to or has this allergic response to ticks).
[0010]
The invention includes a reagent comprising a non-proteinaceous epitope having at least one of the following identified properties: (a) the epitope is resistant to β-elimination of the peptide; (b) the epitope is protein kinase K. Is resistant to digestion; and (c) the epitope is responsive to a test designed to detect glycosylated proteins. Such epitopes bind to at least one of the following antibodies: dog IgE from dogs allergic to ticks, and cat IgE from cats allergic to ticks. Also included are isolated antibodies that selectively bind such non-proteinaceous epitopes and derivatives of such epitopes.
[0011]
The present invention also relates to therapeutic compositions and assay kits comprising the non-proteinaceous epitopes of the invention, and methods for identifying and / or desensitizing animals susceptible to an allergic response to mites, the method comprising Includes the use of proteinaceous epitopes.
[0012]
(Detailed description of the invention)
The present invention provides an isolated protein having a molecular weight in the range of about 60 kilodaltons (kD) to about 109 kilodaltons, which is useful for mites of the genus Dermatophagoides (especially Dermatophagoides farinae species and / or Dermatophagoides spteronyss sp.). At least one epitope of a protein allergen. Such a protein is referred to herein as a Der HMW-map protein. The invention further includes methods for isolating and identifying nucleic acid molecules encoding Der HMW-map protein, antibodies to Der HMW-map protein, and inhibitors of Der HMW-map protein activity. As used herein, the term "isolated Der HMW-map protein" refers to Dermatophagoides, more preferably Dermatophagoides farinae and / or Dermatophagoides pteronyssius, which are themselves derived from their natural sources. Or Der HMW-map protein (e.g., produced using recombinant nucleic acid technology or chemical synthesis). The invention includes methods for detecting immunoglobulins that specifically bind to Der HMW-map protein, methods for treating the pathogenesis of mite allergens, and in other applications as disclosed below. The use of proteins and antibodies is also included. The products and processes of the present invention are advantageous. Because they allow the detection of anti-Der HMW-map antibodies in the body fluids of animals and the inhibition of Der HMW-map protein activity involved in IgE or disease.
[0013]
One embodiment of the present invention is an isolated Dermatophagoides allergic composition comprising: (a) a composition produced by a method comprising: (1) a Dermatophagoides extract on a gel filtration column. (2) collecting the rejected protein from the gel filtration column and applying the rejected protein to an anion exchange column; and (3) about 0.3 M Tris-HCl (pH 8). Eluting the protein bound to the anion exchange column having an anion exchange column to obtain a Dermatophagoides allergic composition; and (b) a composition comprising a peptide of the protein produced with respect to step (a), wherein the allergic composition The composition comprises: binding to IgE; B Enabling biological functions, including stimulating lymphocyte responses and stimulating T lymphocyte responses). Such Dermatophagoides allergic compositions are also referred to herein as Der HMW-map compositions. Suitable gel filtration columns include any gel filtration columns that can exclude proteins having a molecular weight between about 50 kD and about 150 kD. Preferred gel filtration columns include, but are not limited to, Sephacryl S-100 columns. Suitable anion exchange columns include any anion exchange column capable of binding proteins having a pI of less than about pI6. Preferred anion exchange columns include, but are not limited to, Q-Sepharose columns. As used herein, "stimulating a B lymphocyte response" refers to a humoral response in an animal that is preferentially induced in an animal by a Der HMW-map of the invention and is associated with the activity of a B lymphocyte. Refers to an increase in the immune response. As used herein, "stimulating a T lymphocyte response" refers to a humoral response in an animal that is preferentially induced in an animal by a Der HMW-map of the invention and is associated with T lymphocyte activity. Refers to an increase in the immune response.
[0014]
One embodiment of the present invention is an isolated protein comprising a Der HMW-map protein. The term (a) ("a" or "an") entity specifically refers to one or more entities. For example, (a) protein, (a) nucleic acid molecule, (a) antibody, (a) inhibitor, (a) compound, or (a) therapeutic composition is "one or more" or "at least one", respectively. "One or more" or "at least one" nucleic acid molecule, "one or more" or "at least one" antibody, "one or more" or "at least one" inhibitor, "one "Or more" or "at least one" compound, or "one or more" or "at least one" therapeutic composition. As such, the terms "a" (or "an"), "one or more", and "at least one" may be used interchangeably herein. The terms “comprising,” “containing,” and “having” specifically refer to being able to be used interchangeably. According to the present invention, an isolated protein or a biologically pure protein is a protein that has been removed from its natural environment. As such, "isolated" and "biologically pure" need not reflect the degree to which the protein has been purified. An isolated protein of the present invention can be obtained from its natural source, can be produced using recombinant DNA technology, or can be produced by chemical synthesis.
[0015]
As used herein, a Der HMW-map protein can be a full-length protein, or any homolog of such a protein. As used herein, a protein can be a polypeptide or a peptide (the terms are used by those skilled in the art). Preferably, the Der HMW-map protein is recognized by an IgE antibody in the presence of a major histocompatibility complex (MHC) molecule from an animal exhibiting an IgE-mediated pathogenesis for the Der HMW-map protein (ie, At least one of the Der HMW-map proteins comprising at least one of the epitopes recognized by antibodies on the surface of B lymphocytes and / or recognized by T cell receptors. Including some.
[0016]
The peptides of the invention may bind to IgE, desensitize animals to mite allergens, stimulate B lymphocyte responses, and / or stimulate T lymphocyte responses. Includes HMW-map protein. Preferably, the peptides of the present invention comprise a B lymphocyte epitope, or a T lymphocyte epitope. Peptides having a B lymphocyte epitope can bind to the antibody. A peptide having a T lymphocyte epitope can bind to an MHC molecule in such a way that the peptide can stimulate T lymphocytes via a T cell receptor. In accordance with the present invention, a peptide comprising a B lymphocyte epitope can be from about 4 residues to about 50 residues in length, preferably from about 5 residues to about 20 residues in length. In accordance with the present invention, a peptide comprising a T lymphocyte epitope can be from about 4 to about 20 residues in length, preferably from about 8 to about 16 residues in length.
[0017]
The Der HMW-map proteins (including homologs) of the present invention can be identified in a simple manner by the ability of the protein to induce an allergic response to the Der HMW-map protein. Examples of Der HMW-map protein homologs include Der HMW-map proteins, where amino acids are deleted (eg, a truncated version of the protein such as a peptide), inserted, converted, substituted, and / or Or has been derivatized (eg, by glycosylation, phosphorylation, acetylation, myristoylation, prenylation, palmitoylation, amidation, and / or addition of glycerophosphatidylinositol) such that the homolog is naturally occurring Der Allergic response to HMW-map protein can be induced.
[0018]
Der HMW-map protein homologs can be the result of natural allelic alterations or natural mutations. The Der HMW-map protein homologues of the present invention also include genes that encode proteins, using classical or recombinant nucleic acid techniques that result in direct modifications to the protein or, for example, random or targeted mutations. Can be produced using techniques known in the art, including but not limited to modifications to
[0019]
One embodiment of the present invention is the Der HMW-map gene, which has SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, and SEQ ID NO: 45, and the complement of any of these nucleic acid sequences. These nucleic acid sequences are further described herein. For example, the nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 14) is a nucleic acid molecule nDerf98 of the Der HMW-map gene. 1752 (This generation is disclosed in the Examples) shows the degenerate sequence of the coding strand of the cDNA (complementary DNA) set forth herein. Nucleic acid molecule nDerf98 1752 Clearly contains the full-length coding region. The complement of SEQ ID NO: 14 (shown herein by SEQ ID NO: 16) refers to the nucleic acid sequence of a strand that is complementary to the strand having SEQ ID NO: 14, which can be readily determined by one skilled in the art. Similarly, the nucleic acid sequence complement of any nucleic acid sequence of the present invention refers to the nucleic acid sequence of a nucleic acid strand that is complementary to (ie, capable of forming a duplex with) the referenced strand. . SEQ ID NO: 14 (as well as the other nucleic acid and protein sequences set forth herein) provides a definitive description of the nucleic acid molecule encoding the Der HMW-map protein of the present invention, as nucleic acid sequencing techniques are not totally error free. It should be noted that the nucleic acid sequence is unique.
[0020]
In another embodiment, the Der HMW-map gene, or nucleic acid molecule, is an allelic variant that is similar, but not identical, to SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, or any other Der referred to herein. It may be an HMW-map nucleic acid sequence. For example, an allelic variant of the Der HMW-map gene comprising SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 occurs at the locus (s) of the genome that is essentially the same as the gene comprising SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16. Although they have genes, they have similar but not identical sequences, for example, due to natural variations caused by mutation or recombination. Since natural selection is typically a selection for mutations that affect function, allelic variants (ie, corresponding to or alleles of the cited nucleic acid sequence) are usually Encodes a protein having an activity similar to that of the protein encoded by the gene to be compared. An allelic variant of a gene or nucleic acid molecule can also include a change in the 5 ′ or 3 ′ untranslated region of the gene (eg, in regulating a control region) or involve alternative splicing of the early translation. Thus, exons can be alternated in parallel. Allelic variants are well known to those of skill in the art and are predicted to occur naturally in certain dust mites (eg, Dermatophagoides). Because the representative genome is diploid, and sexual reproduction results in allelic reclassification.
[0021]
In one embodiment of the invention, the isolated Der HMW-map protein is encoded by a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent hybridization conditions to a gene encoding a Der HMW-map protein. The minimal size of a Der HMW-map protein of the invention is capable of forming stable hybrids (ie, hybridizing under stringent hybridization conditions) with the complementary sequence of a nucleic acid molecule encoding the corresponding native protein. A) sufficient size to be encoded by the nucleic acid molecule. The size of a nucleic acid molecule encoding such a protein depends on the composition of the nucleic acid and the percent homology between the Der HMW-map nucleic acid molecule and the complementary nucleic acid sequence. The range of homology required to form a stable hybrid under stringent conditions is that homologous sequences are scattered throughout a given nucleic acid molecule or clustered in distinct regions of a given nucleic acid molecule It will be readily understood that this can vary depending on whether it is done (ie, localized).
[0022]
The minimum size of a nucleic acid molecule that can form a stable hybrid with the gene encoding the Der HMW-map protein is typically at least about 12 nucleotides to about 15 nucleotides long when the nucleic acid molecule is GC rich. And when it is AT-rich, it is at least about 15 nucleotides to about 17 bases in length. The minimum size of a nucleic acid molecule used to encode a Der HMW-map protein homolog of the present invention is from about 12 nucleotides to about 18 nucleotides in length, preferably about 12 nucleotides in length, about 15 nucleotides in length. Or about 18 nucleotides in length. Thus, the minimum length of a Der HMW-map protein homolog of the present invention is from about 4 to about 6 amino acids in length. There is no limit other than the particular limit on the minimum size of a nucleic acid molecule encoding a Der HMW-map protein of the present invention. This is because the nucleic acid molecule of the present invention can include a gene, an entire gene, or a part of a plurality of genes. The preferred size of a protein encoded by a nucleic acid molecule of the invention depends on whether a full-length, fusion, multivalent, or functional protein of such a protein is desired. Preferably, the preferred size of the protein encoded by the nucleic acid molecule of the invention is a portion of the protein that elicits an immune response, which is about 30 amino acids, more preferably about 35 amino acids, and even more preferably , About 44 amino acids in length.
[0023]
Stringent hybridization conditions are determined based on defined physical properties of the gene, to which the nucleic acid molecules will hybridize and can be mathematically defined. Stringent hybridization conditions are experimental parameters that enable one of ordinary skill in the art to identify significant similarities between heterologous nucleic acid molecules. These conditions are well known to those skilled in the art. See, eg, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, and Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284. As described in detail in the references, determination of hybridization conditions includes determination of ionic strength (M (moles / liter)), hybridization temperature (° C.), concentration of nucleic acid helix destabilizing agent (eg, formamide), It involves the manipulation of a set of variables including the average length (n) of the shortest hybrid duplex, and the percentage of the G + C composition of the fragment to which the unknown nucleic acid molecule hybridizes. For nucleic acid molecules of at least about 150 nucleotides, these variables can be substituted into standard mathematical equations to determine the melting temperature (ie, T.sub.T) of a given nucleic acid molecule. m ) Is calculated. As defined by the following equation, T m Is the temperature at which two complementary nucleic acid molecule strands dissociate, which is considered to be 100% complementary between the two strands:
T m = 81.5 ° C + 16.6 log M + 0.41 (% of G + C)-500 / n-0.61 (% of formamide). For nucleic acid molecules smaller than about 50 nucleotides, the hybrid stability is determined by the dissociation temperature (T d ) (Defined as the temperature at which 50% of the duplexes dissociate). For these smaller molecules, stability at standard ionic strength is defined by the following equation:
T d = 4 (G + C) +2 (A + T).
[0024]
T d Temperatures lower than 5 ° C. are used to determine hybridization between perfectly matched molecules.
[0025]
Also, how many base pair mismatches (ie, the differences between the two nucleic acid molecules being compared) include the non-complementarity of the base at a given position, and gaps are defined for any given nucleic acid molecule being compared. Due to the insertion or deletion of one or more bases at a position, the T for nucleic acid molecules of different sizes m Or T d It is also well known to those skilled in the art that it may affect For example, T m Decreases about 1 ° C. for each 1% mismatched base pair for hybrids greater than about 150 bp, and T d Decreases about 5 ° C. for each mismatched base pair for hybrids smaller than about 50 bp. Conditions for hybrids between about 50 to about 150 base pairs can be determined empirically and without undue experimentation using standard laboratory procedures well known to those skilled in the art. These simple procedures require one of skill in the art to understand that hybridization conditions (eg, by changing salt concentration, formamide concentration, or temperature) are such that only nucleic acid hybrids having less than a particular% base pair mismatch will hybridize. Allows setting of It is generally understood by those skilled in the art that stringent hybridization conditions are experimental conditions that allow hybridization between molecules having less than about 30% base pair mismatches (ie, about 70% or more identity). Is done. One of skill in the art can readily determine whether a given nucleic acid molecule to be tested is less than or greater than about 50 nucleotides, and therefore selects the appropriate formula to determine hybridization conditions. One skilled in the art will be able to determine whether a nucleic acid molecule will hybridize to a given gene under stringent hybridization conditions and, similarly, allow the nucleic acid molecule to have the desired amount of base pair mismatches. To hybridize under the conditions designed to do so.
[0026]
Hybridization reactions often involve attaching the nucleic acid molecule to be hybridized to a solid support, such as a membrane, followed by a labeled nucleic acid molecule (typically referred to as a probe) suspended in a hybridization solution. ) And a step of hybridization. Examples of common hybridization reaction techniques include, but are not limited to, well-known Southern and Northern blotting procedures. Typically, the actual hybridization reaction will be performed under non-stringent conditions (ie, lower temperature and / or higher salt concentration), and then increase the stringency to achieve the desired stringency. This is achieved by washing the membrane in a solution at high temperature and / or lower salt concentration.
[0027]
For example, if one of skill in the art desires to identify a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent hybridization conditions to an approximately 150 bp long nucleic acid molecule of Dermatophagoides farinae and / or Dermatophagoides pteronyssius, the following conditions are preferably used: Can be done. The average G + C content of the DNA of Dermatophagoides farinae and Dermatophagoides pteronyssius is about 39%. An unknown nucleic acid molecule is attached to the support membrane and the 150 bp probe is labeled (eg, using a radioactive tag). Hybridization reactions can be performed at a temperature of about 37 ° C. (low stringency conditions) in a solution containing 2 × SSC and 0% formamide. Solutions of different concentrations of SSC were prepared by combining a stock solution of 20 × SSC (175.3 g NaCl and about 88.2 g sodium citrate (pH 7) in 1 liter of water) to obtain the desired concentration of SSC. By dilution, it can be made by those skilled in the art. To achieve high stringency hybridization, one skilled in the art will calculate the wash conditions required to tolerate up to 30% base pair mismatch. For example, the complete hybrid T in a wash solution containing 1 × SSC and 0% formamide m Is about 80 ° C .:
81.5 ° C + 16.6 log (0.15M) + (0.41 x 39)-(500/150)-(0.61 x 0) = 80.4 ° C.
Thus, to achieve hybridization with a nucleic acid molecule having about 30% base pair mismatch, washing of the hybridization is performed at a temperature of about 50 ° C. Thus, it is within the skill of the artisan to calculate additional hybridization temperatures based on the desired% base pair mismatch, formula and G / C content disclosed herein. For example, a nucleic acid molecule to be tested for hybridization to a nucleic acid molecule of the invention having a sequence as specified herein is longer than 150 nucleotides, so that a hybridization reaction that allows up to 30% base pair mismatches. T for m It is understood by those skilled in the art that does not vary significantly from 50 ° C.
[0028]
In addition, it is known in the art that there are commercially available computer programs for determining the degree of similarity between two nucleic acid sequences. These computer programs include various known methods for determining the percent identity between hybrid nucleic acid molecules and the number and length of gaps. A preferred method for determining the percent identity between amino acid sequences and also between nucleic acid sequences involves analysis using one or more commercially available computer programs designed to compare and analyze nucleic acid or amino acid sequences. . These computer programs include, but are not limited to: GCG TM (Available from Genetics Computer Group, Madison, WI), DNAsis TM (Available from Hitachi Software, San Bruno, CA) and MacVector TM (Available from Eastman Kodak Company, New Haven, CT). A preferred method for determining the percent identity between amino acid sequences and also between nucleic acid sequences involves the use of the Compare function by maximum matching in the DNAsis version 2.1 program with default parameters.
[0029]
One embodiment of the invention comprises a Der HMW-map protein. In one embodiment, the Der HMW-map protein of the present invention, when presented on reduced 12% Tris glycine SDS-PAGE, as a band with a molecular weight of about 98 kD to about 109 kD, as shown in FIG. Including proteins that move. This band in FIG. 1 is obtained when the protein is collected from Dermatophagoides farinae mites using the method described in detail in Example 1. Preferably, the Der HMW-map proteins of the present invention include proteins having a molecular weight ranging from about 90 kD to about 120 kD, and more preferably, from about 98 kD to about 109 kD. Preferred Der HMW-map proteins of the present invention include mapA and mapB. This identification is described in the Examples section.
[0030]
In another embodiment, the Der HMW-map protein of the present invention is a protein that, when presented on reduced 14% Tris glycine SDS-PAGE, migrates as a band of approximately 60 kD molecular weight, as shown in FIG. including. This band in FIG. 2 is obtained when the protein is collected from a Dermatophagoides farinae mite using the method described in detail in Example 9. Preferably, the Der HMW-map protein of the present invention comprises a protein having a molecular weight of about 60kD. Preferred Der HMW-map proteins of the present invention include mapD. This identification is described in the Examples section.
[0031]
In another embodiment, preferred Der HMW-map proteins are at least about 50 nucleotides or about 150 nucleotides, and preferably under conditions that permit up to about 40% base pair mismatch, more preferably about Under conditions that allow up to 35% base pair mismatch, more preferably under conditions that allow up to about 30% base pair mismatch, more preferably under conditions that allow up to about 25% base pair mismatch, more preferably Under conditions that allow up to about 20% base pair mismatch, more preferably under conditions that allow up to about 15% base pair mismatch, more preferably under conditions that allow up to about 10% base pair mismatch, and More preferably, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: No. 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, and a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a complement thereof. Includes proteins encoded by nucleic acid molecules that hybridize to nucleic acid molecules.
[0032]
Another embodiment of the invention comprises a Der HMW-map protein encoded by a nucleic acid molecule selected from the group consisting of: a nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein at least about 150 nucleotides SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42 in a solution containing 1 × SSC and 0% formamide at a temperature of about 50 ° C. A nucleic acid selected from the group consisting of a complement of a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 33, and a nucleic acid molecule comprising a fragment of any of the above nucleic acid molecules comprising at least about 15 nucleotides Hybridize to the sequence.
[0033]
Yet another preferred Der HMW-map protein of the invention is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and / or SEQ ID NO: 33 Preferably, it is at least about 60% identical, more preferably at least about 65% identical, more preferably at least about 70% identical, more preferably Is encoded by a nucleic acid molecule that is at least about 75% identical, more preferably at least about 80% identical, more preferably at least about 85% identical, more preferably at least about 90% identical, and even more preferably at least about 95% identical. Including the protein to be purified. Fragments of such proteins are also preferred. Percent identity, as used herein, is determined by using the Compare function by maximum matching in the program DNAsis version 2.1 with default parameters.
[0034]
Further preferred Der HMW-map proteins of the present invention include: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, sequence No. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 A protein comprising a homolog of a protein having an amino acid sequence, wherein such homologs are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: No. 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44 Comprising at least one epitope to induce disease response protein. Similarly, a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 Or proteins encoded by nucleic acid molecules encoded by their homologs are also preferred.
[0035]
A preferred isolated protein of the present invention is a protein encoded by at least one of the following nucleic acid molecules: nDerf98 1752 , NDerf98 1665 , NDerf98 1608 , NDerp98 1621 , NDerp98 1527 , NDerp98 1470 , NDerf60 510 Or allelic variants of any of these nucleic acid molecules. Another preferred isolated protein is encoded by a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43; Or proteins encoded by allelic variants of any of these listed nucleic acid molecules.
[0036]
SEQ ID NO: 14 (nDerf98 1752 The translation of PDerf98 herein 555 This amino acid sequence is presented in SEQ ID NO: 15, and the first in-frame codon is believed to extend from nucleotide 1 to nucleotide 3 of SEQ ID NO: 14. The complement of SEQ ID NO: 14 is presented herein as SEQ ID NO: 16. PDerf98 555 The amino acid sequence of nDerf98 1665 Which has the coding strand set forth in SEQ ID NO: 17 and the complementary strand set forth in SEQ ID NO: 19. Analysis of SEQ ID NO: 15 suggests the presence of a signal peptide ranging from approximately amino acid 1 to approximately amino acid 19. In the present specification, PDerf98 536 The proposed mature protein, referred to as containing about 536 amino acids. This sequence is represented herein as SEQ ID NO: 21 and represented by nDerf98 herein, represented by SEQ ID NO: 20 (coding strand) and SEQ ID NO: 22 (complementary strand). 1608 Encoded by a nucleic acid molecule referred to as
[0037]
SEQ ID NO: 34 (nDerp98 1621 Translation of the PDerp98 herein 509 A protein of about 509 amino acids results, the amino acid sequence of which is presented in SEQ ID NO: 35, and the first in-frame codon is believed to extend from nucleotide 14 to nucleotide 16 of SEQ ID NO: 34. The complement of SEQ ID NO: 34 is presented herein as SEQ ID NO: 36. PDerpf98 509 The amino acid sequence of nDerp98 1527 Which has the coding strand set forth in SEQ ID NO: 37 and the complementary strand set forth in SEQ ID NO: 39. Analysis of SEQ ID NO: 35 suggests the presence of a signal peptide ranging from approximately amino acid 1 to approximately amino acid 19. In this specification, PDerp98 490 The proposed mature protein, referred to as containing about 490 amino acids. This sequence is represented herein as SEQ ID NO: 41 and represented by nDerp98 herein, represented by SEQ ID NO: 40 (coding strand) and SEQ ID NO: 42 (complementary strand). 1470 Encoded by a nucleic acid molecule referred to as
[0038]
D. SEQ ID NO: 43 (nDerf60), which is a nucleic acid molecule encoding a part of the farinae 60-kD antigen protein. 510 Translation of PDerf60 herein 170 This amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 44, and the first in-frame codon is believed to extend from nucleotide 1 to nucleotide 3 of SEQ ID NO: 43. The complementary sequence to SEQ ID NO: 43 is represented herein as SEQ ID NO: 45.
[0039]
A preferred Der HMW-map protein of the present invention is PDerf98 555 And at least about 45%, preferably at least about 50%, more preferably at least about 55%, even more preferably at least about 60%, even more preferably at least about 65%, even more preferably at least about 70%, More preferably, it comprises proteins that are at least about 75%, even more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 85%, even more preferably at least about 90%, and even more preferably about 95% identical. More preferred is PDerf98 555 , PDerf98 536 , PDerp98 509 , PDerp98 490 And / or PDerf60 170 A Der HMW-map protein comprising: 555 , PDerf98 536 , PDerp98 509 , PDerp98 490 And / or PDerf60 170 Is a protein that is encoded by an allelic variant of a nucleic acid molecule that encodes the protein.
[0040]
Other preferred Der HMW-map proteins of the invention include SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: No. 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44 and at least about 45%, preferably at least about 50%, more preferably at least about 55%, and even more. Preferably at least about 60%, even more preferably at least about 65%, even more preferably at least about 70%, even more preferably Is a protein comprising an amino acid sequence that is at least about 75%, even more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 85%, even more preferably at least about 90%, and even more preferably about 95% identical. Including. More preferred are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: No. 12, Sequence No. 13, Sequence No. 15, Sequence No. 18, Sequence No. 21, Sequence No. 23, Sequence No. 24, Sequence No. 29, Sequence No. 30, Sequence No. 31, Sequence No. 32, Sequence No. 33, Sequence No. 35 A Der HMW-map protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44; and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 2 3, having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44 Der HMW-map protein encoded by an allelic variant of a nucleic acid molecule encoding the HMW-map protein.
[0041]
In one embodiment of the invention, the Der HMW-map protein comprises the amino acids SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, and / or SEQ ID NO: 44 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, and / or SEQ ID NO: 44). (Including, but not limited to, proteins consisting of amino acid sequences, fragments thereof, fusion proteins, and multivalent proteins), and encodes proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, and / or SEQ ID NO: 44. And proteins encoded by allelic variants of the nucleic acid molecule.
[0042]
In one embodiment, a preferred Der HMW-map protein is at least about 35 amino acids in length, preferably at least about 50 amino acids in length, more preferably at least about 100 amino acids in length, more preferably at least about 200 amino acids in length, even more preferably It includes an amino acid sequence at least about 250 amino acids in length. In this embodiment, a preferred Der HMW-map protein of the invention has an amino acid sequence comprising at least a portion of SEQ ID NO: 15. In another embodiment, preferred Der HMW-map proteins include the full length protein (ie, the protein encoded by the full length coding region).
[0043]
A further preferred Der HMW-map protein of the present invention is nDerf98 1752 , NDerf98 1665 , NDerf98 1608 , NDerp98 1621 , NDerp98 1527 , NDerp98 1470 , And nDerf60 510 And Der HMW-map proteins encoded by allelic variants of such nucleic acid molecules.
[0044]
Also preferred is a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and / or SEQ ID NO: 33, And a Der HMW-map protein encoded by a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence comprising at least a portion of an allelic variant of these nucleic acid molecules.
[0045]
In another embodiment, a preferred Der HMW-map protein of the invention has at least about 12 nucleotides, preferably at least about 16 nucleotides, more preferably at least about 18 nucleotides, more preferably at least about 20 nucleotides, more preferably Is at least about 25 nucleotides, more preferably at least about 50 nucleotides, more preferably at least about 100 nucleotides, more preferably at least about 350 nucleotides, more preferably at least about 450 nucleotides, more preferably at least about 500 nucleotides. Encoded by a nucleic acid molecule comprising nucleotides, and even more preferably, at least about 800 nucleotides. Included in this embodiment is nDerf98 1752 , NDerp98 1621 And / or nDerf60 510 Or a Der HMW-map protein encoded by an allelic variant of these nucleic acid molecules. In yet another embodiment, a preferred Der HMW-map protein of the invention is a nucleic acid molecule comprising an apparently full length Der HMW-map coding region (ie, a nucleic acid molecule encoding an apparently full length Der HMW-map protein). Coded by
[0046]
One embodiment of a Der HMW-map protein of the invention is a fusion protein comprising a Der HMW-map protein containing domain linked to one or more fusion segments. Suitable fusion segments for use in the present invention include: a segment capable of enhancing protein stability; a segment capable of acting as an immunopotentiator for enhancing an immune response to Der HMW-map protein, a Der HMW-map protein And / or segments that can aid in the purification of Der HMW-map protein (eg, by affinity chromatography). Suitable fusion segments can be of any size having the desired function (eg, conferring increased stability, conferring increased immunogenicity on the protein, reducing the IgE response, and / or simplifying protein purification). Can be a domain. The fusion segment can be attached to the amino and / or carboxyl terminus of the Der HMW-map protein containing domain of the protein and is sensitive to cleavage to allow for easy recovery of the Der HMW-map protein. possible. The fusion protein is preferably cultured in a recombinant cell transformed with a fusion nucleic acid molecule encoding a protein comprising a fusion segment attached to either the carboxyl and / or amino terminus of the Der HMW-map protein containing domain. Generated by Preferred fusion segments include: metal binding domains (eg, poly-histidine segments); immunoglobulin binding domains (eg, protein A; protein G; T cells; B cells; antibodies to Fc receptors or complement proteins) A binding domain); a sugar binding domain (eg, a maltose binding domain); a “tag” domain (eg, galactosidase, strep tag peptide, other domains that can be purified using a compound that binds to this domain (eg, a monoclonal antibody) And / or a linker and an enzyme domain (e.g., an alkaline phosphatase domain linked to a Der HMW-map protein by a linker). More preferred fusion segments include: a metal binding domain (eg, a poly-histidine segment); a maltose binding domain; a strep tag peptide (eg, a peptide available from Biometer, Tampa, FL); a phage T7 S10 peptide .
[0047]
In another embodiment, a Der HMW-map protein of the invention also comprises at least one additional protein segment that can desensitize an animal from one or more allergens. Such multivalent desensitized proteins can be produced by culturing cells transformed with a nucleic acid molecule comprising two or more nucleic acid domains, wherein the two or more nucleic acid domains are Are linked together in such a way that they are expressed as multivalent desensitizing compounds, including at least two desensitizing compounds capable of desensitizing an animal from an allergen.
[0048]
Examples of multivalent desensitizing compounds include, but are not limited to: caused by one or more allergens (eg, plant allergens, animal allergens, parasite allergens, or ectoparasite allergens) A Der HMW-map protein of the invention conjugated to one or more compounds that desensitize to allergy. Allergens include, but are not limited to: Grasses, Meadow Fescue, Curly Dock, Plantain, Mexican Firebush, Mexican Firbush s Quarter, pigweed, ragweed, sage, elm, elm, cocklebur, box elder, box elder, walnut, cotwort, cotwow ), Birch, cedar, oak, mulberry-derived plants (pant) allergens, cockroaches Dermatophagoides, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Helminthosporium, Mucor, Penicillium, Pullularia, Rhizopus, Rhizopus, Trichophyte, Rhizophrenia, Rhizophrenia, Rhizophrenia, Rhizophrenia, Rhizophrenia, Rhinoceros (Black fly), horse flies, horn fly, horn flies, tsetse flies, stable fly, myiasis-causing fly and biting gnats, ants, spider mites, Winged insects (including winged insects) and leech The next ectoparasite allergen.
[0049]
The present invention also includes mimetopes of the Der HMW-map proteins of the present invention. As used herein, the mimetope of the Der HMW-map protein of the present invention refers to the activity of such a Der HMW-map protein (eg, binding to induce an immune response to the Der HMW-map protein). Ability to mimic the ability to mimic the Der HMW-map protein, often because the mimetope has a structure that mimics the Der HMW-map protein. However, it should be noted that the mimetope need not have a similar structure to the Der HMW-map protein, as long as the mimetope functionally mimics the Der HMW-map protein. A mimetope can be, but is not limited to: a peptide modified to reduce its susceptibility to degradation; anti-idiotype and / or catalytic antibodies, or fragments thereof; Non-proteinaceous immunogenic moieties (eg, carbohydrate structures); synthetic or natural organic or inorganic molecules (including nucleic acids); and / or any other peptidomimetic compound. The mimetopes of the invention can be designed using computer generated structures for the Der HMW-map proteins of the invention. Mimetopes also generate random samples of molecules (eg, oligonucleotides, peptides or other organic molecules) and use such samples with corresponding binding partners (eg, anti-Der HMW-map protein antibodies). And by screening by affinity chromatography techniques. Mimetopes can also be obtained, for example, by rational drug design. In a rational drug design procedure, the three-dimensional structure of a compound of the invention may be analyzed, for example, by nuclear magnetic resonance (NMR) or X-ray crystallography. The three-dimensional structure can then be used to predict the structure of a potential mimetope, for example, by computer modeling. The predicted mimetope structure can then be generated, for example, by chemical synthesis, recombinant DNA technology, or by isolating the mimetope from a natural source. Specific examples of mimetopes of the Der HMW-map protein include anti-idiotypic antibodies, Selex TM Oligonucleotides generated using the technology, peptides identified by random screening of peptide libraries, and proteins identified by phage display technology. Preferred mimetopes are peptidomimetic compounds that are structurally and / or functionally similar to the Der HMW-map protein of the invention, and in particular to an epitope of the Der HMW-map protein that induces an immune response.
[0050]
The present invention also includes muteins of the Der HMW-map proteins of the present invention. As used herein, mutein refers to a specific homolog of the Der HMW-map protein in which desired amino acid residues have been substituted or removed. Preferred muteins of the present invention include Der HMW-map protein homologs in which amino acid residues have been altered to reduce the anaphylactic response by the animal when the mutein is administered to the animal at a therapeutic dose. More preferred muteins of the invention include Der HMW-map protein homologs in which one or more cysteine residues of the Der HMW-map protein have been substituted or removed. Methods for producing muteins are known to those of skill in the art, and such methods are disclosed herein. Preferably, muteins are produced using recombinant techniques.
[0051]
Another embodiment of the present invention is an isolated nucleic acid molecule comprising a Der HMW-map nucleic acid molecule. The distinguishing features of such nucleic acid molecules have been described previously. The nucleic acid molecules of the present invention may include the isolated native Der HMW-map gene or a homolog thereof, the latter described in more detail below. A nucleic acid molecule of the invention may include one or more regulatory regions, full-length or partial coding regions, or a combination thereof. The minimum size of a nucleic acid molecule of the invention is large enough to allow the formation of a stable hybrid with the complementary sequence of another nucleic acid molecule (ie, hybridization under stringent hybridization conditions). .
[0052]
According to the present invention, an isolated nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been removed from its natural environment (ie, has been manipulated by a human), and the isolated nucleic acid molecule is DNA, RNA, or It may include derivatives of either DNA or RNA. Thus, "isolated" does not reflect the degree to which the nucleic acid molecule has been purified. An isolated Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention or a homolog thereof can be isolated from its natural source, or can be obtained by recombinant DNA technology (eg, polymerase chain reaction (PCR) amplification or cloning) or chemical synthesis. Can be generated using Isolated Der HMW-map nucleic acid molecules and homologs thereof include, for example, naturally occurring allelic variants and nucleotides in a manner that does not substantially interfere with the ability to encode the Der HMW-map protein of the present invention. Nucleic acid molecules that have been modified by insertions, deletions, substitutions, and / or inversions may be included.
[0053]
Der HMW-map nucleic acid molecule homologs can be prepared by a number of methods known to those skilled in the art (eg, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press; see Sambrook et al., Ibid.). Can be used and generated. For example, various techniques can be used to modify nucleic acid molecules, including classical mutagenesis techniques and recombinant DNA techniques (eg, site-directed mutagenesis, chemical treatment, restriction enzymes). Cleavage, ligation of nucleic acid fragments, PCR amplification, synthesis of oligonucleotide mixtures, and ligation of mixtures to "build" a mixture of nucleic acid molecules, and combinations thereof). Nucleic acid molecule homologs may be isolated by hybridization with a Der HMW-map nucleic acid molecule or by the function of a protein encoded by the nucleic acid molecule (e.g., the ability to elicit an immune response against at least one epitope of the Der HMW-map protein, Or the ability to effect Der HMW-map activity).
[0054]
An allelic variant typically encodes a protein that has an activity similar to that of the protein encoded by the gene to which the variant is being compared. An allelic variant can also include changes in the 5 'or 3' untranslated regions (eg, regulatory control regions) of the gene. Allelic variants are well known to those of skill in the art and are expected to be found in certain house dust mites. Because the genome is diploid and / or between two or more groups of house dust mites. The invention also includes variants resulting from laboratory operations, such as, but not limited to, variants produced during polymerase chain reaction amplification.
[0055]
An isolated nucleic acid molecule of the present invention may include a nucleic acid sequence encoding at least one Der HMW-map protein of the present invention, examples of such proteins being disclosed herein. Although the phrase "nucleic acid molecule" mainly refers to a physical nucleic acid molecule and the phrase "nucleic acid sequence" mainly refers to the sequence of nucleotides for the nucleic acid molecule, the two phrases may be used interchangeably. In particular, with respect to nucleic acid molecules or nucleic acid sequences capable of encoding a Der HMW-map protein, they may be used interchangeably.
[0056]
Preferred nucleic acid molecules of the invention, when administered to an animal, are capable of desensitizing the animal from an allergic reaction caused by a Der HMW-map allergen. As disclosed in more detail below, such nucleic acid molecules can be or encode antisense RNA, molecules capable of forming triple helices, ribozymes, or other nucleic acid based drug compounds. In a further embodiment, a nucleic acid molecule of the invention may encode a desensitizing protein (eg, a Der HMW-map protein of the invention), wherein the nucleic acid molecule is, for example, by direct injection (ie, as a DNA reagent). Or in a vehicle (eg, a recombinant viral or cellular reagent) to the animal.
[0057]
One embodiment of the invention is an isolated nucleic acid molecule that hybridizes under stringent hybridization conditions to a Der HMW-map gene. Stringent hybridization conditions refer to standard hybridization conditions described herein. Preferred nucleic acid molecules of the invention are those which, under stringent hybridization conditions, have SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, No. 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 An isolated nucleic acid molecule that hybridizes to a gene encoding a protein comprising an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44. Including. A more preferred nucleic acid molecule of the present invention comprises, under stringent hybridization conditions, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, which hybridizes with the complement of a nucleic acid sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44. Nucleic acid molecules.
[0058]
More preferred nucleic acid molecules of the invention include isolated nucleic acid molecules selected from the group consisting of nucleic acid molecules comprising at least about 150 nucleotides, wherein the nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides comprises 1 × SSC and SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 at a temperature of about 50 ° C. in a solution containing 0% formamide SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and / or a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a complement thereof. Hybridizes to a more selected nucleic acid sequence.
[0059]
The invention also encompasses fragments of any of the nucleic acid molecules disclosed herein. In accordance with the present invention, fragments may range in size between a length smaller than the sequence identified by the SEQ ID NOs of the present invention and the minimum size of the oligonucleotide as defined herein. , Any nucleic acid molecule or nucleic acid sequence. For example, the size of a fragment of the invention can be any size that is less than about 1752 nucleotides in length and greater than 11 nucleotides.
[0060]
In one embodiment of the invention, a preferred Der HMW-map nucleic acid molecule comprises an isolated nucleic acid molecule, wherein the isolated nucleic acid molecule is at least about 50 nucleotides or at least about 150 nucleotides and An isolated nucleic acid molecule can be isolated under conditions that allow for up to about 40% base pair mismatch, more preferably under conditions that allow up to about 35% base pair mismatch, and more preferably about 30% or less. %, More preferably under conditions that allow up to about 25% base pair mismatch, and more preferably under conditions that allow up to about 20% base pair mismatch. More preferably, under conditions that allow up to about 15% base pair mismatch, more preferably, up to about 10% base pair mismatch. SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 under acceptable conditions, and even more preferably under conditions permitting about 5% or less base pair mismatch. SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and Hybridizes to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the complements of
[0061]
Another embodiment of the present invention includes a nucleic acid molecule comprising at least about 150 base pairs, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 14 in a solution comprising 1 × SSC and 0% formamide at a temperature of about 50 ° C. SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, Sequence Hybridizes to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the nucleic acid sequence of No. 45 and / or a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID No. 33, and a complement thereof. A further preferred nucleic acid molecule of the invention comprises a fragment of the isolated nucleic acid molecule comprising at least about 150 base pairs, wherein the nucleic acid molecule is in a solution comprising 1 × SSC and 0% formamide at a temperature of about 50 ° C. , SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a nucleic acid sequence selected from the group consisting of complements thereof.
[0062]
Further preferred Der HMW-map nucleic acid molecules of the invention include an isolated nucleic acid molecule that is at least about 50 nucleotides or at least about 150 nucleotides, wherein the isolated nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, Nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 , And a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the complements thereof, preferably at least about 60%, and more preferably at least about 65%. At least about 70% identical, more preferably at least about 70% identical, more preferably at least about 70% identical 75% identical, more preferably at least about 80% identical, more preferably at least about 85% identical, more preferably at least about 90% identical, and even more preferably at least about 95% identical. Certain nucleic acid sequences. Fragments of any of such nucleic acid molecules are also preferred. Percent identity can be determined using the Compare by Maximum Match function using the default parameters within the program DNAsis Version 2.1.
[0063]
One embodiment of the present invention relates to the nucleic acid molecule nDerf98. 1752 , NDerf98 1665 , And nDerf98 1608 , NDerp98 1621 , NDerp98 1527 , NDerp98 1470 And / or nDerf60 510 Or all or part of an allelic variant of these nucleic acid molecules. Another preferred nucleic acid molecule of the present invention is SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, Nucleic acid sequences encoding proteins comprising the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and / or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and allelic modification of nucleic acid molecules having these nucleic acid sequences Preferably, such homologs comprise SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, Sequence No. 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or It encodes, or is complementary to, a nucleic acid molecule encoding at least one epitope that elicits an immune response against a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44. Such nucleic acid molecules can include, in addition to the nucleotides included in the above SEQ ID NOs, nucleotides, such as, for example, a full length gene, a full length coding region, a nucleic acid molecule encoding a fusion protein, or a multivalent defense compound. An encoding nucleic acid molecule, but is not limited thereto.
[0064]
In one embodiment, the Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention is PDerf98. 555 , PDerp98 509 And / or PDerf60 170 And at least about 45%, preferably at least about 50%, more preferably at least about 55%, even more preferably at least about 60%, even more preferably at least about 65%, even more preferably at least about 70%, More preferably, a protein that is at least about 75%, even more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 85%, even more preferably at least about 90%, and even more preferably at least about 95% identical Code. Still more preferred is PDerf98 555 , PDerf98 536 , PDerp98 509 , PDerp98 490 And / or PDerf60 170 And / or allelic variants of such nucleic acid molecules.
[0065]
In another embodiment, the Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention comprises SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, sequence No. 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44, at least about 45%, preferably at least about 50%, more preferably at least about 55%, More preferably at least about 60%, even more preferably at least about 65%, even more preferably at least about 70%, even more preferably at least about 60% Encodes a protein having an amino acid sequence that is 75%, even more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 85%, even more preferably at least about 90%, and even more preferably at least about 95% identical I do. The present invention also relates to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: No. 12, Sequence No. 13, Sequence No. 15, Sequence No. 18, Sequence No. 21, Sequence No. 23, Sequence No. 24, Sequence No. 29, Sequence No. 30, Sequence No. 31, Sequence No. 32, Sequence No. 33, Sequence No. 35 HMW-map nucleic acid molecules encoding proteins having at least a portion of SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44, and allelic variants of Der HMW-map nucleic acid molecules encoding proteins having these sequences Genetic variants, including nucleic acid molecules, that have been modified to match the codon usage characteristics of the cell in which they are expressed, are also included.
[0066]
In another embodiment, a preferred Der HMW-map nucleic acid molecule is at least about 35 amino acids in length, preferably at least about 50 amino acids in length, more preferably at least about 100 amino acids in length, more preferably at least about 200 amino acids in length, even more preferably. Encodes a Der HMW-map protein comprising at least about 250 amino acids in length.
[0067]
By knowing the nucleic acid sequence of a particular Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention, one of skill in the art can, for example, (a) make a copy of those nucleic acid molecules and (b) produce at least one such nucleic acid molecule. (E.g., nucleic acid molecules containing full length genes, full length coding regions, regulatory control sequences, truncated coding regions) and (c) obtaining other Der HMW-map nucleic acid molecules. it can. Such nucleic acid molecules can be obtained in a variety of ways, including screening an appropriate expression library using the antibodies of the present invention; Conventional cloning techniques using the oligonucleotide probes of the invention; and PCR amplification of appropriate libraries or DNA using the oligonucleotide primers of the invention. Preferred libraries for screening or amplifying nucleic acid molecules include the Dermatophagoides farinae library and / or the Dermatophagoides pteronyssius library (eg, the libraries disclosed in the Examples herein). Techniques for cloning and amplifying genes are disclosed, for example, in Sambrook et al. (Ibid).
[0068]
The present invention also provides, under stringent hybridization conditions, other nucleic acid molecules of the invention (preferably, other nucleic acid molecules that are longer) (eg, nucleic acid molecules including Der HMW-map nucleic acid molecules, or other Der HMW-map nucleic acid molecules). Nucleic acid molecules (including HMW-map nucleic acid molecules) that are oligonucleotides that are capable of hybridizing to complementary regions. The oligonucleotides of the present invention can be RNA, DNA, or any derivative. The minimum size of such an oligonucleotide is that required to form a stable hybrid between the oligonucleotide and a complementary sequence on a nucleic acid molecule of the invention. Preferred oligonucleotides of the invention have a maximum size of preferably about 200 nucleotides, more preferably about 150 nucleotides, and even more preferably about 100 nucleotides. The invention includes oligonucleotides that can be used, for example, as probes to identify nucleic acid molecules.
[0069]
One embodiment of the present invention encompasses a recombinant vector, wherein the recombinant vector is capable of delivering at least one isolated nucleic acid molecule of the present invention into a host cell. In a state of being inserted into the vector. Such a vector comprises a heterologous nucleic acid sequence, which is not naturally found in close proximity to the nucleic acid molecule of the invention, and preferably is in a species other than the species from which the nucleic acid molecule of the invention is derived. Derived nucleic acid sequence. The vector can be either RNA or DNA, can be either prokaryotic or eukaryotic, and is typically a virus or a plasmid. Recombinant vectors can be used in cloning, sequencing, and / or other manipulations of the Der HMW-map nucleic acid molecules of the invention.
[0070]
One type of recombinant vector (referred to herein as a recombinant molecule) comprises a nucleic acid molecule of the present invention operably linked to an expression vector. The phrase "operably linked" refers to the insertion of a nucleic acid molecule into an expression vector in a manner that allows the nucleic acid molecule to be expressed when transformed into a host cell. As used herein, an expression vector is a DNA or RNA vector capable of transforming a host cell and effecting the expression of a particular nucleic acid molecule. Preferably, the expression vector is also capable of replicating in the host cell. An expression vector can be either prokaryotic or eukaryotic, and the expression vector is typically a virus or a plasmid. The expression vector of the present invention functions in the recombinant cell of the present invention (including bacterial cells, fungal cells, endophytic cells, insect cells, other animal cells, and plant cells) (ie, directs gene expression). ) And any vector. Preferred expression vectors of the invention are capable of directing gene expression in bacterial cells, yeast cells, insect cells, and mammalian cells, and more preferably, in the cell types disclosed herein.
[0071]
In particular, the expression vectors of the present invention include regulatory sequences (eg, transcription control sequences, translation control sequences, origins of replication, and other regulatory sequences that are compatible with recombinant cells and that control the expression of a nucleic acid molecule of the present invention). including. In particular, the recombinant molecules of the present invention include a transcription control sequence. A transcription control sequence is a sequence that controls the initiation, elongation, and termination of transcription. Particularly important transcription control sequences are those that control transcription initiation (eg, promoter sequences, enhancer sequences, operator sequences, and repressor sequences). Suitable transcription control sequences include any transcription control sequence that can function in at least one of the recombinant cells of the present invention. A variety of such transcription control sequences are known to those skilled in the art. Preferred transcription control sequences include sequences that function in bacterial cells, yeast cells, insect cells, and mammalian cells, for example, tac promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, oxy-pro promoter, omp / lpp. Promoter, rrnB promoter, bacteriophage λ promoter (eg, λP L Promoter and λP R Promoters and fusions containing such promoters), bacteriophage T7 promoter, T7lac promoter, bacteriophage T3 promoter, bacteriophage SP6 promoter, bacteriophage SP01 promoter, metallothionein promoter, alpha mating factor promoter, Pichia alcohol oxidase promoter, alpha Viral subgenomic promoter (eg, Sindbis virus subgenomic promoter), antibiotic resistance gene promoter, baculovirus promoter, Heliothis zae insect virus promoter, vaccinia virus promoter, herpes virus promoter, raccoon poxvirus promoter, other poxvirus promoters Promoter, cytomegalovirus promoter (eg, the immediate early promoter), simian virus 40 promoter, retrovirus promoter, actin promoter, retrovirus long terminal repeat promoter, rous sarcoma virus promoter, heat shock promoter, phosphate and nitrate Transcription control sequences include, but are not limited to, other sequences capable of controlling gene expression in prokaryotic or eukaryotic cells. Additional suitable transcription control sequences include tissue-specific promoters and enhancers, and lymphokine-inducible promoters (eg, promoters induced by interferons or interleukins). The transcription control sequences of the present invention can also include naturally occurring transcription control sequences that are naturally associated with dogs or cats.
[0072]
Suitable and preferred nucleic acid molecules for inclusion in the recombinant vectors of the present invention are nucleic acid molecules as disclosed herein. Preferred nucleic acid molecules for inclusion in a recombinant vector, especially a recombinant molecule, include nDerf98 1752 , NDerf98 1665 , NDerf98 1608 , NDerp98 1621 , NDerp98 1527 , NDerp98 1470 , And nDerf60 510 Is included.
[0073]
The recombinant molecule of the present invention also comprises a secretory signal (ie, a signal segment nucleic acid sequence) such that (a) the expressed Der HMW-map protein of the present invention can be secreted from the cell producing the protein. And / or (b) a fusion sequence which results in expression of the nucleic acid molecule of the invention as a fusion protein. Examples of suitable signal segments include any signal segment that can direct the secretion of a protein of the invention. Preferred signal segments include tissue plasminogen activator (t-PA) signal segment, interferon signal segment, interleukin signal segment, growth hormone signal segment, histocompatibility signal segment and viral envelope glycoprotein signal segment, and native Signal segments include, but are not limited to. Suitable fusion segments encoded by the fusion segment nucleic acids are disclosed herein. Further, the nucleic acid molecules of the invention can be linked to a fusion segment (eg, a ubiquitin fusion segment) that directs the encoded protein to the proteosome. Recombinant molecules may also include intervening and / or untranslated sequences around and / or within the nucleic acid sequences of the nucleic acid molecules of the invention.
[0074]
Another embodiment of the present invention encompasses a recombinant cell, including a host cell transformed with one or more recombinant molecules of the present invention. Transformation of a nucleic acid molecule into a cell can be accomplished by any method that can insert a nucleic acid molecule into the cell. Transformation techniques include, but are not limited to, transfection, electroporation, microinjection, lipofection, adsorption, and protoplast fusion. Recombinant cells can remain single cells or can grow into tissues, organs, or multicellular organisms. The transformed nucleic acid molecule of the present invention can remain extrachromosomal in the transformed (ie, recombinant) cell in such a way that the ability of the nucleic acid molecule to be expressed is maintained, Alternatively, it may be integrated at one or more sites in the chromosome of the cell. Preferred nucleic acid molecules for transforming a cell include the Der HMW-map nucleic acid molecules disclosed herein. Particularly preferred nucleic acid molecules for transforming cells include nDerf98 1752 , NDerf98 1665 , NDerf98 1608 , NDerp98 1621 , NDerp98 1527 , NDerp98 1470 , And nDerf60 510 Is included.
[0075]
Suitable host cells for transformation include any cell that can be transformed with a nucleic acid molecule of the present invention. The host cell can be a non-transformed cell or a nucleic acid molecule encoding at least one nucleic acid molecule (eg, one or more proteins of the invention and / or other proteins useful for producing a multivalent vaccine). ) May have already been transformed. A host cell of the invention can produce the Der HMW-map protein of the invention endogenously (ie, naturally), or produce such a protein after being transformed with at least one nucleic acid molecule of the invention. You can either. A host cell of the invention can be any cell capable of producing at least one protein of the invention and includes bacterial cells, fungal cells (including yeast), other insect cells, other animal cells And plant cells. Preferred host cells include bacterial cells, mycobacterial cells, yeast cells, parasite cells, insect cells and mammalian cells. More preferred host cells include Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria, Trichoplusia, BHK (infant hamster kidney) cells, MDCK cells (infectious cells of canine normal necrositis virus C), MDCK cells (for normal canine herpes virus C virus). Cells (normal cat kidney cell line for feline herpes virus culture), CV-1 cells (eg, African monkey kidney cell line used to culture raccoon poxvirus), COS (eg, COS-7) ) Cells, and Vero cells. Particularly preferred host cells include Escherichia coli (including an E. coli K-12 derivative); Salmonella typhi; Salmonella typhimurium (UK-1). X 3987 and SR-11 X Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; BHK cells; MDCK cells; CRFK cells; CV-1 cells; COS cells; Vero cells and non-tumorigenic mouse myoblast G8 cells (eg, ATCC CRL 1246). Additional suitable mammalian cell hosts include other kidney cell lines, other fibroblast cell lines (eg, human, mouse, or chick embryo fibroblast cell lines), myeloma cell lines, Chinese hamster ovary cells, mice NIH / 3T3 cells, LMTK 31 And / or HeLa cells.
[0076]
The recombinant cells are preferably produced by transforming a host cell with one or more recombinant molecules, each recombinant molecule operably linked to an expression vector comprising one or more transcription control sequences. It comprises one or more nucleic acid molecules of the invention. The phrase "operably linked" refers to inserting a nucleic acid molecule into an expression vector in such a way that it can be expressed when the nucleic acid molecule is transformed into a host cell.
[0077]
A recombinant molecule of the present invention is a molecule that can include at least one of any of the above nucleic acid molecules operably linked to at least one of the optional transcription control sequences, wherein the transcription control sequence is , Can effectively regulate the expression of the nucleic acid molecule in the transformed cell. These examples are disclosed herein.
[0078]
A recombinant cell of the invention includes any cell transformed with at least one of the Der HMW-map nucleic acid molecules of the invention. Suitable and preferred Der HMW-map nucleic acid molecules as well as suitable and preferred recombinant molecules for transforming cells are disclosed herein.
[0079]
Recombinant DNA technology involves, for example, manipulating the copy number of nucleic acid molecules in a host cell, the efficiency with which those nucleic acid molecules are transcribed, the efficiency with which the resulting transcript is translated, and the efficiency of post-translational modifications. Can be used to improve the expression of the transformed nucleic acid molecule. Recombinant techniques useful for increasing expression of a nucleic acid molecule of the invention include, but are not limited to: operable linkage of a nucleic acid molecule to a high copy number plasmid, one or more host cells. Integration of nucleic acid molecules into chromosomes, addition of vector stability sequences to plasmids, substitution or modification of transcription control signals (eg, promoters, operators, enhancers), translation control signals (eg, ribosome binding sites, Shine-Dalgarno sequences) ), Modification of the nucleic acid molecules of the invention to correspond to the codon usage of the host cell, deletion of sequences that destabilize transcripts, and growth of recombinant cells from recombinant enzyme production during fermentation. The use of control signals to decouple time. The activity of the expressed recombinant proteins of the invention can be improved by fragmenting, modifying or derivatizing nucleic acid molecules encoding such proteins.
[0080]
The isolated Der HMW-map proteins of the present invention can be produced in various ways, including the production and recovery of native proteins, the production and recovery of recombinant proteins, and the chemical synthesis of these proteins. No. In one embodiment, an isolated protein of the invention is produced by culturing cells capable of expressing the protein under conditions effective to produce the protein, and recovering the protein. You. Preferred cells for culturing are the recombinant cells of the present invention. Effective culture conditions include, but are not limited to, effective media conditions, bioreactor conditions, temperature conditions, pH conditions, and oxygen conditions that allow for protein production. An effective medium refers to any medium in which cells are cultured to produce a Der HMW-map protein of the present invention. Such media typically includes an aqueous medium having assimilable carbon, nitrogen and phosphate sources, and appropriate salts, minerals, metals and other nutrients (eg, vitamins). The cells of the invention can be cultured in conventional fermentation bioreactors, shake flasks, test tubes, microtiter dishes, and Petri plates. The culturing can be performed at a temperature, pH and oxygen content appropriate for the recombinant cells. Such culture conditions are within the skill of those in the art.
[0081]
Depending on the vector and host system used for production, the resulting protein of the present invention may remain in the recombinant cell; may be secreted into the fermentation medium; It can either be secreted into space (eg, the periplasmic space of E. coli); or it can be retained on the outer surface of the cell or virus membrane. The phrase "recover protein", as well as similar phrases, refers to recovering the entire fermentation medium containing the protein, and need not include the additional steps of separation or purification. The proteins of the present invention can be prepared using various standard protein purification techniques (eg, affinity chromatography, ion exchange chromatography, filtration, electrophoresis, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, concanavalin A). (Including, but not limited to, chromatography, isoelectric focusing and differential solubilization). The proteins of the present invention can preferably be recovered in "substantially pure" form. As used herein, "substantially pure" refers to a purity that allows for the effective use of the protein as a therapeutic composition or diagnostic. For example, a therapeutic composition for an animal should not exhibit substantial toxicity and should preferably be able to desensitize the animal to be treated.
[0082]
The present invention also provides isolated (ie, removed from their natural environment) antibodies (ie, anti-Der HMW-map) that selectively bind to a Der HMW-map protein of the invention or its mimetope. Protein antibodies). As used herein, the term "selectively binds" to Der HMW-map means that the antibody of the invention preferentially binds to a specified protein of the invention or a mimetope thereof. Ability. Binding can be measured using various methods standard in the art, including enzyme immunoassays (eg, ELISA), immunoblot assays, and the like; see, eg, Sambrook et al., Ibid. The anti-Der HMW-map protein antibody preferably binds selectively to the portion of the Der HMW-map protein that elicits an immune response in the animal.
[0083]
An isolated antibody of the invention can include an antibody in a body fluid, such as, but not limited to, serum, or an antibody that has been purified to various degrees. The antibodies of the present invention can be polyclonal or monoclonal. Functional equivalents of such antibodies (eg, antibody fragments and engineered antibodies, including single-chain or chimeric antibodies capable of binding more than one epitope) are also included in the invention.
[0084]
A preferred method for producing the antibodies of the present invention comprises: (a) administering an effective amount of the protein, peptide or mimetope thereof to an animal to produce the antibodies; and (b) recovering those antibodies. Performing the steps of: In another method, the antibodies of the invention are produced recombinantly, using techniques such as those disclosed above, to produce a Der HMW-map protein of the invention. Antibodies raised against the defined protein or mimetope may be advantageous. This is because such antibodies, when used in therapeutic compositions, are substantially free of antibodies to other substances that might otherwise cause interference or side effects in diagnostic assays.
[0085]
The antibodies of the present invention have various potential uses within the scope of the present invention. For example, such antibodies may be (a) used as a tool for detecting mite allergens (particularly Der HMW-map proteins); (b) as a tool for screening expression libraries; and / or (c) It can be used to recover the desired protein of the invention from a mixture of protein and other contaminants. The antibodies of the present invention also inhibit, for example, the binding of Der HMW-map protein to IgE, which specifically binds to Der HMW-map, and prevent immune complex formation, thereby reducing the hypersensitivity response to mite allergens. Can be used to reduce.
[0086]
The Der HMW-map protein of the present invention may be comprised in a chimeric molecule, wherein the chimeric molecule comprises at least a portion of a Der HMW-map protein that induces an immune response in an animal, and a second molecule. The second molecule has the chimeric molecule bound to the substrate in such a way that a portion of the Der HMW-map protein can bind IgE in essentially the same manner as the Der HMW-map protein not bound to the substrate. To be able to Examples of suitable second molecules include a portion of an immunoglobulin molecule or another ligand having a suitable binding partner that can be immobilized on a substrate (eg, biotin and avidin, or a metal binding protein and metal). (Eg, His), or a sugar-binding protein and a sugar (eg, maltose)).
[0087]
The Der HMW-map protein of the present invention may be included in a formulation and is referred to herein as a Der HMW-map protein formulation. For example, a Der HMW-map protein can be combined with a buffer and / or carrier in which the Der HMW-map protein is solubilized. Suitable buffers and carriers are known to those skilled in the art. Examples of suitable buffers include any buffer that can function to selectively bind an antibody that specifically binds to a Der HMW-map protein, such as a phosphate buffer. Saline, water, saline, phosphate buffer, bicarbonate buffer, HEPES buffer (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid buffered saline), TES buffer Liquid (Tris-EDTA buffered saline), Tris buffer and TAE buffer (Tris-acetic acid-EDTA). Examples of carriers include, but are not limited to, polymer matrices, toxoids, and serum albumin (eg, bovine serum albumin). The carrier can be mixed with the Der HMW-map protein in a manner that does not substantially interfere with the ability of the Der HMW-map protein to selectively bind to an antibody that specifically binds to the Der HMW-map protein, or It can be conjugated (ie, attached) to a Der HMW-map protein.
[0088]
The Der HMW-map protein of the present invention can be produced by a cell containing the Der HMW-map protein. Preferred Der HMW-map protein-bearing cells include recombinant cells containing a nucleic acid molecule encoding the Der HMW-map protein of the present invention.
[0089]
In addition, the Der HMW-map protein formulations of the present invention may comprise not only Der HMW-map protein, but also one or more additional antigens or antibodies useful in desensitizing animals to allergies or preventing or treating mite allergen pathogens. May be included. As used herein, antigen refers to any molecule that can be selectively bound by an antibody. As used herein, an allergen refers to any antigen that can stimulate the production of antibodies involved in an allergic response in an animal. As used herein, selective binding of a first molecule to a second molecule refers to the ability of the first molecule to bind to the third molecule as compared to the ability of the first molecule to bind to the third molecule. Refers to the ability to preferentially bind (eg, have higher affinity, higher avidity) to a second molecule. This first molecule need not necessarily be the natural ligand of the second molecule. The allergens of the present invention are preferably of mite origin and are mite associated allergens, including but not limited to other insect and plant allergens.
[0090]
In accordance with the present invention, virtually any substance can act as an antigen and elicit an antibody response (ie, can function as an epitope). For example, antibodies can be raised in response to a carbohydrate epitope (a saccharide and / or a polysaccharide (a so-called glycosylated protein) attached to a protein). However, saccharides and / or polysaccharides can act alone as antigens in the absence of proteins. The terminal and internal sugars of the carbohydrate moiety can act as epitopes. Polysaccharides can exist as branches, in which case the epitope can have sugars that are not consecutive but spatially adjacent. Unusual, insect-specific sugars not normally found in mammalian proteins can be present in glycoproteins derived from insect nucleic acid molecules, and these unusual sugars are recognized by the mammalian immune system It may include an epitope.
[0091]
One embodiment of the present invention relates to the ability to bind to IgE in animals that are allergic to mites, to desensitize animals to mite allergens, to stimulate B lymphocyte responses, And / or a reagent comprising a non-protein epitope capable of stimulating a T lymphocyte response. Such epitopes (referred to herein as Der NP epitopes) may be present as part of a Der HMW-map protein of the invention, or may be isolated from a Der HMW-map protein of the invention. Such epitopes are, for example, those of the D. cerevisiae produced according to Example 1. present on proteins contained in the farinae HMW-map composition. A Der NP epitope of the invention can be isolated from its natural source or can be produced synthetically. Such an epitope may be, but need not be, linked to a carrier or other molecule. A Der NP epitope has at least one of the following distinguishing characteristics: (a) the epitope is resistant to β-elimination of the peptide; (b) the epitope is proteinase K digested And (c) the epitope is reactive to a test designed to detect glycosylated proteins. Preferred Der NP epitopes have all of these identified features. Der NP epitopes can selectively bind to dog or cat IgE allergic to mites. Without being bound by theory, it is believed that the Der NP epitope includes a carbohydrate moiety that is apparently free of N-linked glycans. The identification of the structural features of such epitopes can be determined by one skilled in the art. In one embodiment, an isolated antibody that selectively binds to a Der NP epitope is provided. The present invention also provides for derivatives of a Der NP epitope (ie, mimics the activity of such an epitope (eg, is a mimetope of a Der NP epitope)), against a native (ie, naturally occurring) Der Np epitope. A compound capable of binding to the antibody obtained.
[0092]
Reagents containing a Der NP epitope of the invention can be used in various ways according to the invention. Such a reagent can be a desensitizing compound or a detection reagent for testing for susceptibility or sensitivity to mite allergy. In one embodiment, a therapeutic composition of the invention comprises a reagent comprising a Der NP epitope. In another embodiment, an assay kit of the invention comprises a reagent comprising a Der NP epitope. One embodiment of the invention is a method of identifying an animal susceptible to or having an allergic response to a tick. Such methods include contacting a reagent comprising the Der NP epitope with an antibody in an animal, and determining the formation of an immune complex between the reagent and the antibody, wherein the formation of the immune complex is Indicates that the animal is susceptible to or has the allergic response. Another embodiment of the present invention is a method for desensitizing a host animal to an allergic response to mites. Such methods include administering to the animal a therapeutic composition that includes a reagent that includes a Der NP epitope as a desensitizing compound.
[0093]
Another embodiment of the present invention is a Der HMW-map protein lacking a Der NP epitope. Without being bound by theory, such proteins are better desensitizing compounds. This is because such proteins are expected to have reduced ability to bind IgE. Such proteins can be produced, for example, by removing the Der NP epitope from the native Der HMW-map protein, or by producing the protein recombinantly (eg, in E. coli).
[0094]
One embodiment of the present invention is an in vivo test that can detect whether an animal is hypersensitive to Der HMW-map protein. The in vivo hypersensitivity test of the present invention is particularly useful for identifying animals that are susceptible to or have an allergy to mite allergens. A suitable in vivo hypersensitivity test of the present invention may be, but is not limited to, a skin test, which comprises administering an effective amount of a formulation comprising a Der HMW-map protein or a mimetope thereof (eg, a skin test). Internal injection or surface scratching). Methods for performing the skin tests of the present invention are known to those of skill in the art and are briefly disclosed herein.
[0095]
Suitable formulations for use in in vivo skin tests include Der HMW-map protein, homologues of Der HMW-map protein and / or mimetopes of Der HMW-map protein.
[0096]
The appropriate amount of Der HMW-map protein protein formulation for use in the skin test of the present invention will vary widely depending on the allergenicity of the formulation used in the test and the site at which the product is to be delivered. Can change. An appropriate amount of a Der HMW-map protein formulation for use in the skin test of the present invention may form a reaction, such as a detectable wheal or hardening (hardness) resulting from an allergic reaction to the formulation. Quantity. The preferred amount of Der HMW-map protein for use in the skin test of the present invention is about 1 x 10 -8 Micrograms (μg) to about 100 μg, more preferably about 1 × 10 -7 μg to about 10 μg, and even more preferably about 1 × 10 -6 It ranges from μg to about 1 μg Der HMW-map protein. It is understood by those skilled in the art that such amounts will vary depending on the allergenicity of the protein being administered.
[0097]
According to the present invention, the Der HMW-map protein of the present invention may be combined with an immunopotentiator, such as a carrier or adjuvant of the present invention, as defined in detail below. However, a new aspect of the invention is that the Der HMW-map protein of the invention can induce a hypersensitivity response in the absence of immunopotentiators, especially in dogs.
[0098]
The skin test of the present invention further comprises the step of administering a control solution to the animal. The control solution may include a negative control solution and / or a positive control solution. The positive control solution of the present invention contains an effective amount of at least one compound known to induce a hypersensitivity response when administered to an animal. Preferred compounds for use as a positive control solution include, but are not limited to, histamine. The negative control solution of the present invention may include a solution known to not induce a hypersensitivity response when administered to an animal. As such, a negative control solution may comprise a solution having a compound that is essentially unable to induce a hypersensitivity response, or may comprise a buffer (eg, saline) used to prepare the formulation. It may include a solution that simply has. An example of a preferred negative control solution is phenolated phosphate buffered saline (available from Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC).
[0099]
Hypersensitivity of an animal to one or more formulations of the present invention measures the response resulting from the administration of one or more experimental and control samples to the animal (eg, wheal, hardening or hardness; techniques known to those of skill in the art). Use) and by comparing the response to the experimental sample with the response resulting from the administration of one or more control solutions. Preferred devices for intradermal injection include individual syringes. Preferred devices for scratching include devices that allow administration of many samples at a time. The hypersensitivity of an animal is determined by determining whether the response resulting from administration of a formulation of the invention is greater than the response resulting from administration of a negative control, and / or the response resulting from administration of the formulation. By determining whether it is at least about the same size as the response resulting from administration of the positive control solution. As such, an animal is hypersensitive to the experimental sample if the experimental sample produces a response greater than or equal to the size of the wheal caused by administration of the positive control sample to the animal. Conversely, if the experimental sample produces a response similar to that produced by administration of the negative control sample to the animal, the animal is not hypersensitive to the experimental sample.
[0100]
Preferred wheal sizes for the assessment of animal hypersensitivity are diameters ranging from about 16 mm to about 8 mm, more preferably from about 15 mm to about 9 mm, and even more preferably from about 14 mm to about 10 mm.
[0101]
Preferably, the ability of the animal to produce an immediate or no hypersensitivity response to the formulation of the invention is from about 2 minutes to about 30 minutes after administration of the sample, more preferably From about 10 minutes to about 25 minutes after administration of the sample, and even more preferably about 15 minutes after administration of the sample.
[0102]
Preferably, the ability of the animal to produce a delayed-type hypersensitivity response to the formulation of the invention and the inability to produce the hypersensitivity response is from about 18 hours to about 30 hours after administration of the sample, more preferably About 20 hours to about 28 hours after administration of the sample, and even more preferably about 24 hours after administration of the sample, by measuring sclerosis and / or erythema. A delayed type hypersensitivity response may also be determined using other techniques (e.g., using techniques known to those skilled in the art, to determine the extent of cellular invasion at the site of administration during the period directly defined above). ) Can be measured.
[0103]
In a preferred embodiment, the skin test of the present invention comprises the steps of intradermally injecting an effective amount of a formulation comprising Der HMW-map protein into an animal at a predetermined site, and applying an effective amount of a control solution to the same animal at different sites. Intradermal injection is included. It is within the skill of the art to use a device that can deliver multiple samples simultaneously at many sites (preferably allowing for simultaneous evaluation of many formulations). Preferred Der HMW-map proteins for use in skin tests include the full length protein. A preferred positive control sample can be a sample containing histamine. A preferred negative control sample can be a sample containing a diluent.
[0104]
Suitable and preferred animals for testing for hypersensitivity to Der HMW-map protein using the skin test of the present invention are disclosed herein. Particularly preferred animals for testing in the skin test of the present invention include humans, dogs, cats and horses, with humans, dogs and cats being even more preferred. As used herein, canine refers to any member of the canine family, including domestic dogs, wild dogs, and zoo dogs. Examples of dogs include, but are not limited to, domestic dogs, wild dogs, foxes, wolves, jackals and coyotes. As used herein, cat refers to any member of the family Felidae, including domestic cats, wild cats and zoo cats. Examples of cats include, but are not limited to, cats, lions, tigers, leopards, leopards, panthers, pumas, bobcats, lynxes, jaguars, cheetahs and servals in the home. As used herein, horse refers to any member of the equid family, including horses, donkeys, mules, and zebras.
[0105]
One embodiment of the invention is a method of detecting an antibody that binds to a Der HMW-map protein (referred to herein as an anti-Der HMW-map antibody) in vitro. The method comprises the steps of: (a) combining the isolated HMW-map protein and a composition containing a putative anti-Der HMW-map antibody to form a Der HMW-map protein: antibody complex And (b) detecting the presence of the antibody by detecting the Der HMW-map protein: antibody complex. The presence of such a Der HMW-map protein: antibody complex indicates that the animal is producing antibodies to mite allergens. Preferred anti-Der HMW-map antibodies for detection include antibodies having the IgE or IgG isotype. Preferred anti-Der HMW-map antibodies for detection include cat, dog, horse, and human, with cat, dog and human being particularly preferred.
[0106]
As used herein, the term "contacting" refers in this case to combining or mixing the putative antibody-containing composition and the Der HMW-map protein. The formation of a complex between the Der HMW-map protein and the antibody indicates that the Der HMW-map protein selectively binds to the antibody to form a stable complex that can be measured (ie, detected). Ability to do. As used herein, the term selectively binds to an antibody refers to the Der HMW-map of the present invention without substantially binding to other antibodies that do not specifically bind to the Der HMW-map protein. Refers to the ability of a protein to bind preferentially to an antibody. Binding between the Der HMW-map protein and the antibody is effected under conditions suitable for forming a complex; such conditions (eg, appropriate concentrations, buffers, temperatures, reaction times), and the like. Methods for optimizing such conditions are known to those skilled in the art, and examples are disclosed herein. Examples of complex formation conditions are also described, for example, in Sambrook et al. , (Ibid.).
[0107]
As used herein, the term “detecting complex formation” refers to determining whether any complex has formed (ie, assaying for the presence (ie, presence) of the complex). That). Once the complex is formed, the amount of complex formed is determined, but not required. Complex formation, or selective binding, between the Der HMW-map protein and the antibody in the composition can be accomplished using a variety of methods standard in the art (see, eg, Sambrook et al., Ibid.). Measured (ie, detected, determined). These examples are disclosed herein.
[0108]
In one embodiment, the putative antibody-containing composition of the method of the invention comprises a biological sample from an animal. Suitable biological samples include, but are not limited to, body fluid compositions or cell compositions. Body fluid refers to any fluid that can be collected (ie, obtained) from an animal, such as blood, serum, plasma, urine, tears, aqueous humor, cerebrospinal fluid ( CSF), saliva, lymph, nasal secretions, milk, and feces. Such compositions of the invention may be pre-treated to remove at least some of the non-IgE or non-IgG isotypes of immunoglobulins and / or other proteins (eg, albumin) present in body fluids, It is not necessary. Such removal involves contacting the body fluid with a substance such as an antibody that specifically binds to the lectin jacalin or the constant region of an IgA immunoglobulin (ie, an anti-IgA isotype antibody) to remove the IgA antibody. And / or affinity purification of the IgE or IgG antibody from other components of the body fluid by, for example, exposing the body fluid to, for example, concanavalin A or protein G, respectively. In another embodiment, the composition comprises a collected bodily fluid that has been pre-processed to concentrate immunoglobulins contained in the bodily fluid. For example, immunoglobulins contained in body fluids can be precipitated from other proteins using ammonium sulfate. A preferred composition of the present invention is serum.
[0109]
In another embodiment, the antibody-containing composition of the method of the present invention includes an IgE or IgG producing cell. Such cells may have IgE or IgG bound to the cell surface and / or may secrete IgE or IgG. Examples of such cells include myeloma cells. IgE or IgG can be bound to the surface of cells, either directly to the membrane of the cell or to a molecule (eg, an antigen) bound to the surface of the cell.
[0110]
The complex can be detected in various ways, including but not limited to the use of one or more of the following assays: enzyme-linked immunoassay, radioimmunoassay, fluorescence immunoassay, chemiluminescence assay, Lateral flow assays, agglutination assays, particle-based assays (eg, using particles such as, but not limited to, magnetic particles or particles such as plastic polymers (eg, latex or polystyrene beads)), immunoprecipitation Assay, BioCore TM Assays (eg, using colloidal gold), and immunoblotting assays (eg, Western blot). Such assays are well-known to those skilled in the art. Assays can be used to give qualitative or quantitative results, depending on how the results can be used. For example, some assays, such as agglutination, particle separation, and immunoprecipitation, can be visually observed without the need for detectable markers (eg, unaided or densitometric or spectrophotometric, such as By any of the machines).
[0111]
In other assays, the detectable marker Der HMW-map protein, an antibody bound to the Der HMW-map protein, or a reagent that selectively binds to the Der HMW-map protein or an antibody bound to the Der HMW-map protein ( Conjugation (i.e., binding), described in more detail below, assists in detecting complex formation. Examples of detectable markers include, but are not limited to, radioactive labels, enzymes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, chromogenic labels or ligands. A ligand refers to a molecule that selectively binds to another molecule. Preferred detectable markers include, but are not limited to: fluorescein, radioisotopes, phosphatases (eg, alkaline phosphatase), biotin, avidin, peroxidase (eg, horseradish peroxidase), and biotin-related compounds Or an avidin-related compound (eg, streptavidin or ImmunoPure® NeutrAvidin commercially available from Pierce, Rockford, IL).
[0112]
In one embodiment, the complex is detected by contacting the putative antibody-containing composition with a Der HMW-map protein conjugated to a detectable marker. Suitable detection markers for conjugation to Der HMW-map protein include, but are not limited to, radioactive labels, fluorescent labels, enzyme labels, chemiluminescent labels, chromogenic labels or ligands. The detectable marker is conjugated to the Der HMW-map protein such that it does not block the ability of the Der HMW-map protein to bind to the antibody to be detected.
[0113]
In another embodiment, the Der HMW-map protein: antibody complex is detected by contacting the putative antibody-containing composition with the Der HMW-map protein, and then contacting the complex with an indicator molecule. You. Suitable indicator molecules of the present invention include molecules that can bind to either the Der HMW-map protein or an antibody that binds to the Der HMW-map protein. Thus, indicator molecules can include, for example, antigens and antibodies, depending on which part of the Der HMW-map protein: antibody complex is detected. Preferred indicator molecules that are antibodies include, for example, anti-IgE antibodies, anti-IgG antibodies, and a putative antibody-containing composition that binds to a Der HMW-map protein, but is known to bind to a different epitope on the Der HMW-map protein. Antibodies other than the antibody identified in the product. Preferred lectins include those that bind to high mannose groups. The indicator molecule itself can be bound to a detectable marker of the invention. For example, the antibodies can be conjugated to biotin, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or fluorescein.
[0114]
In one preferred embodiment, the Der HMW-map protein: antibody conjugate is selected from a combination of the conjugate with an indicator molecule that selectively binds an IgE antibody (referred to herein as an anti-IgE reagent) or an IgG antibody. It is detected by contact with a specifically binding indicator molecule (herein referred to as an anti-IgG reagent). Examples of such anti-IgE or anti-IgG antibodies include secondary antibodies that are anti-isotype antibodies (eg, antibodies that selectively bind to the constant region of IgE or IgG), antibody-binding bacterial surface proteins (eg, protein A). Or protein G), antibody-binding cells (eg, B cells, T cells, natural killer cells, polymorphonuclear leukocytes, monocytes or macrophage cells), antibody-binding eukaryotic cell surface proteins (eg, Fc receptors), and Antibody binding complement proteins include, but are not limited to. Preferred indicator molecules include, but are not limited to: anti-cat IgE antibodies, anti-cat IgG antibodies, anti-dog IgE antibodies, anti-dog IgG antibodies, anti-human IgE antibodies, and anti-human IgG antibodies. As used herein, an anti-IgE or anti-IgG antibody includes not only whole antibodies, but also any subunits or portions thereof that can selectively bind to an IgE or IgG heavy chain constant region. obtain. For example, anti-IgE reagents or anti-IgG reagents include Fab fragments or F (ab ') 2 Fragments, both of which are described in Janeway et al. , Immunobiology, the Immun System in Health and Disease, Garland Publishing, Inc. , NY, 1996.
[0115]
In another preferred embodiment, the Der HMW-map protein: antibody conjugate comprises a Der HMW-map protein and a different epitope other than the epitope at which the antibody in the putative antibody-containing composition binds to the Der HMW-map protein. It is detected by contact with an indicator molecule that selectively binds to the map protein.
[0116]
In one embodiment, the complex is formed in solution and can be detected. In another embodiment, a complex is formed, wherein one or more members of the complex are immobilized on (eg, coated on) the substrate. Immobilization techniques are known to those skilled in the art. Suitable substrate materials include plastic, glass, gel, celluloid, paper, PVDF (poly-vinylidene-fluoride), nylon, nitrocellulose, and particulate matter (eg, latex, polystyrene, nylon, nitrocellulose, agarose and magnetic Resin), but is not limited thereto. Suitable shapes for the substrate material include wells (eg, microtiter dish wells), plates, dipsticks, beads, sidestream devices, membranes, filters, tubes, dishes, celluloid-type matrices, magnetic particles, and other particles Substances include, but are not limited to. Particularly preferred substrates include ELISA plates, dipsticks, radioimmunoassay plates, agarose beads, plastic beads, latex beads, immunoblot membranes and immunoblot papers. In one embodiment, the substrate (eg, particulate matter) can include a detectable marker.
[0117]
A preferred method for detecting antibodies that bind to Der HMW-map protein is an immunosorbent assay. The immunosorbent assay of the present invention includes a capture molecule and an indicator molecule. The capture molecules of the invention bind to IgE or IgG in such a way that the IgE or IgG is immobilized on the substrate. As such, the capture molecule is preferably immobilized on the substrate of the invention, after which the capture molecule is exposed to the putative IgE-containing composition or putative IgG-containing composition. The indicator molecule of the present invention detects the presence of IgE or IgG bound to the capture molecule. Thus, the indicator molecule is preferably not immobilized on the same substrate as the capture molecule prior to exposing the capture molecule to the putative IgE-containing composition or putative IgG-containing composition.
[0118]
A preferred immunosorbent assay involves any of the following steps: (a) After immobilizing the Der HMW-map protein on a substrate, the Der HMW-map protein and a putative IgE-containing composition or putative IgG. Contacting the Der HMW-map protein-immobilized substrate to form a Der HMW-map protein-immobilized substrate; and (b) contacting the Der HMW-map protein with a putative IgE-containing composition or a putative IgG-containing composition. Binding the putative IgE-containing composition or putative IgG-containing composition to the substrate prior to forming the putative IgE-containing composition-attached substrate or putative IgG-containing composition-binding substrate. Preferably, the substrate includes an uncoated substrate, a Der HMW-map protein-immobilized substrate, an anti-IgE antibody-immobilized substrate, and an anti-IgG antibody-immobilized substrate.
[0119]
Both the capture molecule and the indicator molecule of the invention can bind to IgE, IgG or Der HMW-map proteins. Preferably, the capture molecule binds to a region of the IgE, IgG or Der HMW-map protein that is different from the indicator molecule, whereby the capture molecule simultaneously binds to the IgE, IgG or Der HMW-map protein simultaneously with the indicator molecule. Make it possible. The use of a reagent as a capture or indicator molecule depends on whether the molecule is immobilized on a substrate when exposed to an IgE, IgG or Der HMW-map protein. For example, the Der HMW-map protein of the present invention is used as a capture molecule when the Der HMW-map protein is bound to a substrate. Alternatively, Der HMW-map protein is used as an indicator molecule when Der HMW-map protein is not bound to a substrate. Suitable molecules for use as capture or indicator molecules include, but are not limited to, a Der HMW-map protein of the invention, an anti-IgE or anti-IgG antibody reagent of the invention.
[0120]
An immunosorbent assay of the invention can include a second molecule or other binding molecule that can detect the presence of one or more layers and / or types of indicator molecules. For example, a non-tagged (ie, not conjugated to a detectable marker) secondary antibody that selectively binds to an indicator molecule can be a tagged antibody that selectively binds to the secondary antibody. (Ie, conjugated to a detectable marker). Appropriate secondary, tertiary and other secondary or tertiary molecules can be selected by those skilled in the art. Preferred secondary molecules of the invention include antigens, anti-IgE idiotype antibodies (ie, antibodies that bind to an epitope unique to anti-IgE antibodies), anti-IgE isotype antibodies, anti-IgG idiotype antibodies (ie, anti-IgG antibodies). Antibodies that bind to a unique epitope), and anti-IgG isotype antibodies. Preferred tertiary molecules can be selected by one skilled in the art based on the characteristics of the secondary molecule. The same strategy applies to subsequent hierarchies.
[0121]
In one embodiment, the Der HMW-map protein is used as a capture molecule by being immobilized on a substrate (eg, a microtiter dishwell or dipstick). The biological sample collected from the animal is applied to a substrate and allowed to bind to the substrate, allowing Der HMW-map protein: antibody complex formation (i.e., if the IgE or IgG in the sample is Incubate under conditions appropriate (ie, sufficient) to bind to the Der HMW-map protein immobilized above. Excess unbound material (i.e., material from a biological sample that is not bound to the Der HMW-map protein), if present, is present under conditions that retain the antigen: antibody complex bound to the substrate. Is removed from the substrate. Preferred conditions are generally disclosed in Sambrook et al. (Ibid). An indicator molecule capable of selectively binding to IgE or IgG bound to the antigen is added to the substrate and incubated to form a complex between the indicator molecule and the Der HMW-map protein: antibody complex. . Excess indicator molecules are removed, a chromogen is added if necessary, and the substrate is subjected to a detection device for analysis. A preferred indicator molecule for this embodiment is an anti-IgG antibody for detecting an IgG antibody bound to the Der HMW-map protein, or an anti-IgE antibody for detecting an IgE antibody bound to the Der HMW-map protein. Preferably, the anti-IgG or anti-IgE antibody is conjugated to biotin, a fluorescent label or an enzyme label.
[0122]
In one embodiment, the anti-IgE or anti-IgG antibody (ie, an isotype-specific antibody or an idiotype-specific antibody) is immobilized on a substrate (eg, a microtiter dishwell or dipstick). Is used as a capture molecule. A biological sample collected from an animal is applied to the substrate and the appropriate bound to allow the formation of an anti-IgE antibody: IgE complex or an anti-IgG antibody: IgG complex, respectively, bound to the substrate. Incubate under conditions. Excess unbound material, if present, is removed from the substrate under conditions that retain the anti-IgE antibody: IgE complex or anti-IgG antibody: IgG complex bound to the substrate. Der HMW-map protein is added to the substrate and incubated to allow the formation of a complex between the Der HMW-map protein and an anti-IgE antibody: IgE or anti-IgG antibody: IgG complex. You. Preferably, the Der HMW-map protein is conjugated to a detectable marker, preferably biotin, an enzyme label or a fluorescent label. Excess Der HMW-map protein is removed, a chromogen is added if necessary, and the substrate is subjected to a detection device for analysis.
[0123]
In one embodiment, the immunosorbent assays of the invention do not utilize a capture molecule. In this embodiment, the biological sample collected from the animal is applied to a substrate (eg, a microtiter dishwell or dipstick) and conditions appropriate to allow binding of IgE or IgG to the substrate. Incubate underneath. Any IgE or IgG present in the body fluid is immobilized on the substrate. Excess unbound material, if present, is removed from the substrate under conditions that retain the binding of IgE or IgG to the substrate. Der HMW-map protein is added to the substrate and incubated to allow for the formation of a complex between the Der HMW-map protein and IgE or IgG. Preferably, the Der HMW-map protein is conjugated to a detectable marker, preferably biotin, an enzyme label or a fluorescent label. Excess Der HMW-map protein is removed, a chromogen is added if necessary, and the substrate is subjected to a detection device for analysis.
[0124]
Another preferred method for detecting IgE or IgG is the sidestream assay, an example of which is U.S. Patent No. 5,424,193 by Pronovost et al, issued June 13, 1995; Imrich et al. U.S. Patent No. 5,415,994 issued May 16, 1995; WO94 / 29696 by Miller et al (published December 22, 1994); and WO94 / 01775 by Pawlak et al (January 1994). Published on 20th). In one embodiment, the biological sample is placed in a side stream device comprising the following components: (a) a support structure defining a flow path; (b) conjugated to a Der HMW-map protein. A labeling reagent comprising the labeled beads (the labeling reagent is injected into the support structure in the labeling zone); and (c) a capture reagent comprising an IgE binding composition or an IgG binding composition. The capture reagent is located downstream of the labeling reagent in a capture zone fluidly connected to the labeling zone in a manner that allows the labeling reagent to flow from the labeling zone to the capture zone. The support structure includes a substance that does not impede the flow of beads from the labeling zone to the capture zone. Suitable materials for use as the support structure include ionic (ie, anionic or cationic) materials. Examples of such materials include, but are not limited to, nitrocellulose (NC), PVDF, carboxymethylcellulose (CM). The support structure defines a flow path that is lateral and divided into zones (ie, a label zone and a capture zone). The device may further comprise a sample receiving zone located along the flow path, more preferably upstream of the labeling reagent. The flow path in this support structure contacts a portion of the support structure downstream of the capture zone, preferably at the end of the flow path, with an adsorbent capable of absorbing excess reagent from the labeling zone and the capture zone. It is produced by causing
[0125]
In this embodiment, a biological sample is applied to a sample receiving zone comprising a portion of the support structure. The labeling zone receives sample from a sample receiving zone directed downstream by a flow path. The labeling zone contains a labeling reagent that binds IgE or IgG, or both. A preferred labeling reagent is a Der HMW-map protein conjugated to a plastic bead substrate (eg, latex beads), either directly or via a linker. The substrate also includes a detectable marker, preferably a chromogenic marker. Typically, the labeling reagent is injected into the support structure by drying or lyophilization. The sample structure also comprises a capture zone downstream of the label zone. This capture zone receives the labeling reagent from a labeling zone directed downstream by a flow path. The capture zone contains a capture reagent that immobilizes IgE and / or IgG conjugated to the Der HMW-map protein in the capture zone (in this case, the anti-IgE and / or IgG antibodies described above, or both). . The capture reagent is preferably fixed to the support structure by drying or freeze-drying. The labeling reagent accumulates in the capture zone, and this accumulation is assessed visually or by an optical detection device.
[0126]
In another embodiment, the sidestream device used to detect IgE or IgG comprises: (a) a support structure defining a flow path; (b) an anti-IgE or anti-IgG antibody as described above; Or (c) a capture reagent comprising Der HMW-map protein, wherein the labeling reagent comprises a labeling reagent, wherein the labeling reagent comprises a labeling reagent. (Located downstream of the labeling reagent in a capture zone fluidly connected to the labeling zone in a manner that can flow from the zone to the capture zone). The apparatus also preferably comprises a sample receiving zone located along the flow path, preferably upstream of the labeling reagent. The device also preferably includes an adsorbent located at the end of the flow path.
[0127]
Animals that are hypersensitive to Der HMW-map protein are identified by comparing the level of immune complex formation using a sample of the body fluid with the level of immune complex formation using a control sample. An immune complex refers to a complex containing an antibody and a Der HMW-map protein (ie, a Der HMW-map protein: antibody complex). Thus, an immune complex is formed when a positive control sample is used, but not when a negative control sample is used. Thus, if the body fluid sample results in more immune complex formation than the immune complex formation using the positive control sample, the animal from which the body fluid was collected is overly sensitive to the Der HMW-map protein bound to the substrate. It is. Conversely, if the body fluid sample results in an immune complex formation similar to the immune complex formation with the negative control sample, the animal from which the body fluid was collected is over-sensitive to the Der HMW-map protein bound to the substrate. is not.
[0128]
It is within the scope of the present invention that two or more different skin tests and / or in vitro tests can be used for diagnostic purposes. For example, the immediate overreaction of an animal to the Der HMW-map protein can be tested using an in vitro immunosorbent assay that can detect IgE antibodies specific for the Der HMW-map protein in the body fluid of the animal. Most animals that show delayed hypersensitivity to Der HMW-map protein also show immediate hypersensitivity to allergens, while a few animals that show delayed hypersensitivity to allergens show immediate hypersensitivity to this allergen Does not show symptoms. In such cases, according to the negative results from the IgE-specific in vitro test, delayed hypersensitivity to Der HMW-map protein in animals can be tested using the skin test of the present invention.
[0129]
The invention also includes a kit for detecting an antibody that specifically binds to a Der HMW-map protein based on each of the disclosed detection methods. One embodiment is a kit for detecting a Der HMW-map protein specific antibody, the kit comprising a means for detecting Der HMW-map protein and IgE and / or IgG. Suitable means of detection include compounds disclosed herein that bind to either the Der HMW-map protein or IgE and / or IgG. Preferred kits of the present invention include antibodies capable of selectively binding to IgE or IgG disclosed herein and / or compounds capable of binding to a detectable marker conjugated to a Der HMW-map protein (e.g., If the detectable marker is biotin, the detection means includes avidin, streptavidin and ImmunoPure® NeutrAvidin).
[0130]
Another preferred kit of the present invention is an allergen kit, which contains the Der HMW-map protein and an allergen commonly detected in the same environment as the mite allergen. Suitable and preferred mite-related allergens for use with the kits of the present invention include the tick-related allergens disclosed herein.
[0131]
A preferred kit of the present invention includes a kit in which Der HMW-map protein is immobilized on a substrate. If the kit includes a Der HMW-map protein and another allergen, the kit includes one or more compositions, each composition including one allergen. In this way, each allergen can be tested separately. The kit may also include more than one diagnostic reagent for IgE or IgG, or other compounds disclosed herein. Kits used in a side-stream assay format are particularly preferred. It is within the scope of the present invention that the sidestream assay kit may include one or more sidestream assay devices. A plurality of sidestream devices may be joined together at one end of each device, thereby creating a fan-like structure.
[0132]
Another aspect of the invention involves treating an animal susceptible to or having a tick allergy with a Der HMW-map protein formulation of the invention. According to the invention, the term treatment may refer to the modulation of a hypersensitivity response by an animal to mite allergens. Modulation can include, for example, immunomodulation of cells involved in an animal's hypersensitive response. Immunomodulation can include modulating the activity of molecules typically involved in the immune response, such as antibodies, antigens, major histocompatibility gene molecules (MHCs) and molecules that react simultaneously with MHC molecules. In particular, immunomodulation refers to the modulation of an antigen: antibody interaction that results in an inflammatory response, immunosuppression and tolerance of the cells involved in the hypersensitivity response. Immunosuppression refers to inhibiting the immune response, for example, by killing specific cells involved in the immune response. Immunotolerization refers to inhibiting the immune response by anerizing (ie, reducing T cell responsiveness to an antigen) specific cells involved in the immune response.
[0133]
One embodiment of the present invention is a therapeutic composition comprising a desensitizing compound capable of inhibiting an immune response to a Der HMW-map protein of the present invention. Such desensitizing compounds include blocking compounds, tolerogens and / or suppressor compounds. Blocking compounds include compounds that can modulate antigen: antibody interactions that can produce an inflammatory response, tolerogens are compounds that can tolerize an animal, and suppressor compounds can immunosuppress an animal. The desensitizing compounds of the present invention can be soluble or membrane-bound. Membrane-bound desensitizing compounds can associate with biological membranes, including cells, liposomes, planar membranes or micelles. The soluble desensitizing compounds of the present invention are useful for the following purposes: (1) IgE: inhibiting type I hypersensitivity reactions by blocking antigen-mediated mast cell degranulation; (2) Inhibiting the type III hypersensitivity response by blocking IgG: antigen complex formation leading to cell complement destruction; and (3) Type IV hypersensitivity by blocking T helper cell stimulation of cytokine secretion by macrophages Inhibiting a reaction. The membrane-bound desensitizing compounds of the present invention are useful for the following purposes: (1) Type II hypersensitivity by blocking IgG: antigen complex formation on the cell surface leading to complement destruction of the cell Inhibiting a response; (2) inhibiting a type II hypersensitivity response by blocking IgG-regulated signaling in immune cells; and (3) blocking T cell killing of antigen bearing cells. Inhibit type IV hypersensitivity reactions by doing so. Examples of desensitizing compounds include, but are not limited to, the muteins, mimetopes and antibodies of the present invention, and the compounds of the present invention that inhibit the binding between a protein of the present invention and IgE. Other inhibitors.
[0134]
The desensitizing compound of the present invention can also be covalently linked to a ligand molecule that can target the desensitizing compound to specific cells involved in a hypersensitivity response to Der HMW-map protein. Suitable ligands used to link desensitizing compounds include, for example, immunoglobulin molecules, cytokines, lectins, heterologous allergens, CD8 molecules or major histocompatibility molecule molecules (eg, MHC class I or MHC class II molecules) At least a part thereof. Preferred portions of immunoglobulin molecules for linking to desensitizing compounds include variable regions capable of binding to immune cell-specific surface molecules and constant regions capable of binding to Fc receptors on immune cells (particularly IgE Constant region). Preferred CD8 molecules include at least the extracellular functional domain of the α chain of CD8. An immune cell refers to a cell involved in an immune response (particularly, a cell having an MHC class I molecule or an MHC class II molecule). Preferred immune cells include antigen presenting cells, T cells and B cells.
[0135]
In one embodiment, a therapeutic composition of the invention comprises a Der HMW-map protein of the invention, a mimetope or mutein thereof, or a Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention. Suitable therapeutic compositions of the invention for treating mite allergy comprise a Der HMW-map protein, its mimetope or mutein, or a Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention. Preferred therapeutic compositions include: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 under stringent hybridization conditions SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, Sequence SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 44, hybridizing with the complement of a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of Nucleic acid molecule encoding mite allergenic protein; mimetope of mite allergenic protein; mutein of mite allergenic protein And an isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of: a nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein the nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides comprises 1 × SSC and 0% formamide SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 in solution at a temperature of about 50 ° C. , SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 and its complement. A fragment of any of the foregoing nucleic acid molecules, comprising at least about 150 nucleotides. Nucleic acid molecules containing Preferred Der HMW-map muteins comprise at least a portion of a Der HMW-map protein, wherein an appropriate number of cysteine residues have been removed or replaced with non-cysteine residues, so that The modified Der HMW-map protein is not toxic to animals (eg, does not cause anaphylaxis).
[0136]
In another embodiment, a therapeutic composition of the present invention encodes a Der HMW-map protein that can be administered to the animal in a manner that allows expression of the nucleic acid molecule to the Der HMW-map protein in the animal. Nucleic acid molecules. Nucleic acid molecules can be delivered to an animal in a variety of ways, including but not limited to: (a) nucleic acid molecules that are naked (ie, not packaged in a virus coat or cell membrane) (eg, (Eg, as a naked DNA or RNA molecule, as taught in, for example, Wolf et al., 1990, Science 247, 1465-1468), or (b) packaged as a recombinant virus or cell. Administering the nucleic acid molecule (ie, the nucleic acid molecule is delivered by a viral or cell vehicle).
[0137]
A naked nucleic acid molecule of the invention includes a nucleic acid molecule of the invention, and preferably includes a recombinant molecule of the invention that is preferably capable of replication or otherwise amplifying. A naked nucleic acid of the invention can include one or more nucleic acid molecules of the invention, eg, having one or more internal ribosome entry sites, eg, in the form of a bicistronic recombinant molecule. Preferred naked nucleic acid molecules comprise at least a portion of a viral genome (ie, a viral vector). Preferred viral vectors include viral vectors based on alphavirus, poxvirus, adenovirus, herpesvirus, picornavirus, and retrovirus, including alphaviruses (eg, Sindbis virus or Semlikivirus), species-specific herpes. Particularly preferred are viral vectors based on viruses and species-specific poxviruses. Any suitable transcription control sequence may be used, including those disclosed as being suitable for protein production. Particularly preferred transcription control sequences include the immediate early (preferably in the context of intron-A) cytomegalovirus, the Rous sarcoma virus long terminal repeat, and tissue-specific transcription control sequences, and when using viral vectors. And transcription control sequences that are endogenous to the viral vector. Incorporation of "strong" poly (A) sequences is also preferred.
[0138]
The naked nucleic acid molecules of the present invention can be administered by various methods. Suitable delivery methods include, e.g., intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intradermal ablation, particle bombardment, oral and nasal application, intramuscular injection, intradermal injection, intradermal ablation and particle Bombardment is preferred, and intramuscular injection is even more preferred. Preferred single doses of naked DNA molecules range from about 1 nanogram (ng) to about 1 milligram (mg), as can be determined by one of skill in the art, depending on the route of administration and / or method of delivery. Examples of methods of administration are described, for example, in US Pat. No. 5,204,253 (Bruner et al., Issued Apr. 20, 1993), PCT Publication No. WO 95/19799 (published Jul. 27, 1995, by McCabe). And PCT Publication No. WO 95/05853 (published March 2, 1995, by Carson et al.). The naked DNA molecules of the present invention can be included in an aqueous vehicle (eg, phosphate buffered saline) and / or with a carrier (eg, a lipid-based vehicle) or can contain fine particles (eg, (Eg, gold particles).
[0139]
A recombinant virus of the invention comprises a recombinant molecule of the invention that is packaged in a virus coat and that can be expressed in an animal after administration. Preferably, the recombinant molecule is defective in packaging and / or encodes an attenuated virus. Numerous recombinant viruses can be used, including, but not limited to, viruses based on alphavirus, poxvirus, adenovirus, herpes virus, picornavirus, and retrovirus. Preferred recombinant viruses are viruses based on alphavirus (eg, Sindbis virus), raccoon poxvirus, species-specific herpes virus and species-specific poxvirus. One example of a method for producing and using an alphavirus recombinant virus is disclosed in PCT Publication No. WO 94/17813 (published August 18, 1994 by Xiong et al.).
[0140]
When administered to an animal, the recombinant virus of the invention can infect cells in a recipient animal and reduce the Der HMW-map protein-mediated biological response in that animal. Directed to the production of For example, a recombinant virus comprising a Der HMW-map nucleic acid molecule of the invention can be produced according to a protocol that results in the production of a protein or RNA in the animal in an amount sufficient to reduce the Der HMW-map protein-mediated biological response. Is administered. A preferred single dose of the recombinant virus of the present invention is about 1 × 10 5 per kilogram of animal body weight. 4 ~ About 1 × 10 7 Viral plaque forming units (pfu). The administration protocol is similar to the administration protocol described herein for protein-based compositions, with subcutaneous, intramuscular, intranasal and oral routes of administration being preferred.
[0141]
The recombinant cell vaccine of the present invention includes the recombinant cell of the present invention that expresses at least one protein of the present invention. Preferred recombinant cells for this embodiment include Salmonella, E. coli, Listeria, Mycobacterium, S. coli. frugiperda, yeast (including Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris), BHK, CV-1, myoblast G8, COS (eg, COS-7), Vero, MDCK and CRCK recombinant cells. The recombinant cell vaccines of the present invention can be administered in a variety of ways, but they can be administered orally (preferably, at about 10 8 Cells to about 10 12 May be administered (at doses that span the range of cells). The administration protocol is similar to the administration protocol described herein for protein-based vaccines. Recombinant cell vaccines can include whole cells, cells with detached cell walls, or cell lysates.
[0142]
The efficacy of the therapeutic composition of the present invention in desensitizing an animal to mite allergy can be determined by the in vivo skin test method described herein, the detection of cellular immune activity in the treated animal, or The determination of the level of IgE that specifically binds to the Der HMW-map protein of the present invention can be tested in a variety of ways, including but not limited to. Methods for determining cellular immune activity and IgE levels in animals are known to those skilled in the art. In one embodiment, the therapeutic compositions can be tested in animal models such as dogs, cats, rabbits, and mice, and can also be tested in humans. Such techniques are known to those skilled in the art.
[0143]
Preferred nucleic acid molecules for use with the therapeutic compositions of the present invention include any of the Der HMW-map nucleic acid molecules disclosed herein, specifically SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, sequence SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, and / or amino acid sequence Nucleic acid sequences encoding a protein comprising SEQ ID NO: 33, as well as the complements thereof.
[0144]
Recombinant cells useful in the therapeutic compositions of the present invention include the recombinant cells of the present invention that include a Der HMW-map protein of the present invention. Preferred recombinant cells for this embodiment include Salmonella, E. coli, Listeria, Mycobacterium, S.E. frugiperda, yeast (including Saccharomyces cerevisiae), BHK, CV-1, myoblast G8, COS (for example, COS-7), Vero, MDCK, and recombinant cells of CRRF. The recombinant cells of the present invention can be administered in a variety of ways, but are preferably 8 ~ About 10 12 It has the advantage that it can be administered orally in doses in the range of cells. The administration protocol is similar to the protocol described herein for the protein composition. Recombinant cells can include whole cells, cells with detached cell walls, or cell lysates.
[0145]
One embodiment of the present invention is a method of immunotherapy, comprising administering to an animal an effective amount of a therapeutic composition comprising a Der HMW-map protein of the present invention. Suitable therapeutic compositions and modes of administration are disclosed herein. According to the present invention, the therapeutic compositions and methods of the present invention can be used to prevent or alleviate symptoms associated with mite allergen pathogenesis.
[0146]
The efficacy (efficacy) of the therapeutic compositions of the present invention in producing an allergic response to Der HMW-map protein can be determined by standard methods for determining Der HMW-map protein-mediated immunity (immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, antibody dependence (Including, but not limited to, inflammatory cytotoxicity (ADCC), immune complex activity, mitogenic activity, histamine release assays, and other methods such as those described in Janeway et al., Ibid.) I can do it.
[0147]
The present invention also includes therapeutic compositions that include one or more therapeutic compounds of the present invention. Examples of such therapeutic compounds include, for example, other allergens disclosed herein.
[0148]
Therapeutic compositions of the invention can be formulated in excipients to which the animal to be treated can be resistant. Examples of such excipients include water, saline, Ringer's solution, dextran solution, Hanks solution, and other aqueous solutions of physiologically balanced salts. Non-aqueous vehicles such as fixed oils, sesame oil, ethyl oleate, or triglycerides can also be used. Other useful formulations include suspensions containing a thickening agent (eg, sodium carboxymethylcellulose, sorbitol, or dextran). Excipients may also contain minor amounts of additives, such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Examples of buffers include phosphate buffer, bicarbonate buffer, and Tris buffer, while examples of preservatives (preservatives) include thimerosal, o-cresol, formalin, and benzyl alcohol. Can be Standard formulations can be either injectable liquids or solids which can be incorporated into a suitable liquid as a suspension or solution for injection. Thus, in non-liquid formulations, excipients may include dextrose, human serum albumin, preservatives (preservatives) and the like, to which sterile water or saline may be added prior to administration.
[0149]
In one embodiment of the invention, the therapeutic composition may include an adjuvant. Adjuvants are agents that can enhance an animal's immune response to a specific antigen. Suitable adjuvants include, but are not limited to: cytokines, chemokines, and compounds that induce the production of cytokines and chemokines (eg, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), colony stimulating factor (CSF), Flt-3 ligand, erythropoietin (EPO), interleukin 2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3) ), Interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-8), interleukin 10 (IL-10), interleukin 12 (IL- 2), interferon γ, interferon γ-inducible factor I (IGIF), transforming growth factor β, RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and presumably secreted (normal T cells regulated during activation) Expressed and possibly secreted)), macrophage inflammatory proteins (eg, MIP-1α, and MIP-1β), and Leishmania elongation initiation factor (LEIF); bacterial components (eg, endotoxin, specifically superantigen Aluminum-based salts; calcium-based salts; silica; polynucleotides; toxoids; serum proteins, virus coat (shell) proteins; Lock copolymer adjuvant (for example, Titermax of Hunter TM Adjuvant (Vaxcel TM , Inc. Norcross, GA), Ribi adjuvant (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); and saponins and their derivatives (for example, Quil A (Superfos Biosector A / S, Denmark protein of the present invention). Using the methods described herein, it can be delivered in the form of the protein itself or in the form of a nucleic acid molecule encoding such a protein.
[0150]
In one embodiment of the invention, the therapeutic composition can include a carrier. Carriers include compounds that increase the half-life of the therapeutic composition in the treated animal. Suitable carriers include, but are not limited to, polymeric sustained release vehicles, biodegradable implants, liposomes, bacteria, viruses, other cells, oils, esters, and glycols.
[0151]
One embodiment of the present invention is a sustained release formulation that is capable of slow release of a composition of the present invention to an animal. As used herein, a sustained release formulation comprises a composition of the present invention in a sustained release vehicle. Suitable sustained release vehicles include biocompatible polymers, other polymeric matrices, capsules, microcapsules, microparticles, bolus preparations, osmotic pumps, diffusion devices, liposomes, lipospheres, and transdermal delivery Systems include, but are not limited to. Other sustained release formulations of the present invention include liquids that form a solid or gel in situ (in situ) upon administration to an animal. Preferred sustained release formulations are biodegradable (ie, bioerodible).
[0152]
Preferred sustained release formulations of the present invention release a therapeutic composition of the present invention into the blood of an animal at a constant rate sufficient to achieve a therapeutic dose level of the composition for attenuating mite allergy in an animal. I can do it. As used herein, mite allergy refers to the cellular response that occurs when a mite allergen contacts an animal. For example, IgE, which specifically binds mite allergens, becomes bound to the Fcε receptor, which is a biological mediator (eg, histamine, prostaglandin, and / or protease) that can trigger clinical symptoms of allergy. Produces an Fcε receptor-mediated biological response, including the release of The therapeutic composition is preferably released over a time interval ranging from about 1 to about 12 months. Preferred sustained release formulations of the present invention are preferably for at least about 1 month, more preferably for at least 3 months, even more preferably for at least 6 months, even more preferably for at least about 9 months, and even more preferably Can provide treatment for at least about 12 months.
[0153]
The therapeutic compositions of the present invention can be sterilized by conventional methods that do not produce proteolysis, such as filtration, and / or can be lyophilized.
[0154]
The therapeutic compositions of the present invention can be administered to any animal susceptible to mite allergy, as described herein. Acceptable protocols for administering the therapeutic compositions of the present invention in an effective manner can vary with the particular dosage size, number of doses, frequency of dose administration, and mode of administration. Determining such a protocol can be accomplished by one skilled in the art. An effective dose refers to a dose that can treat an animal for hypersensitivity to mite allergens. Effective doses may vary, for example, depending on the therapeutic composition used, and the size and type of the recipient animal. Effective doses for immunomodulating an animal for mite allergens include doses administered over a period of time that can alleviate the hypersensitivity response by the animal to mite allergens. For example, a first tolerizing dose can include an amount of a therapeutic composition of the invention that produces a minimal hypersensitivity response when administered to a hypersensitive animal. The second tolerizing dose may include a greater amount than the first dose of the same therapeutic composition. Effective tolerizing doses may include increasing concentrations of the therapeutic composition necessary to tolerize the animal such that the animal does not have a hypersensitivity response to exposure to mite allergens. An effective dose for desensitizing an animal is that of a therapeutic composition of the invention sufficient to block the animal from having a hypersensitive response to exposure to mite allergens present in the animal's environment. Concentration may be included. An effective desensitizing amount can include repeated doses having a concentration of the therapeutic composition that produces a minimal hypersensitivity response when administered to a hypersensitive animal.
[0155]
An appropriate single dose is one that, when administered one or more times over an appropriate time interval, can treat the animal for hypersensitivity to mite allergens. For example, a preferred single dose of a mite allergen, or mimetope therapeutic composition is from about 0.5 ng to about 1 g of the therapeutic composition per kilogram of animal body weight. Further treatment with the therapeutic composition can be administered about one day to one year after the original administration. Further treatment with the therapeutic composition is preferably administered if the animal is no longer protected from a hypersensitivity response to mite allergen. Particular dosages and schedules can be developed by those skilled in the art based on the parameters discussed above. Modes of administration can include, but are not limited to, subcutaneous, intradermal, intravenous, nasal, oral, transdermal, and intramuscular routes.
[0156]
The therapeutic compositions of the present invention can be used in combination with other compounds that can modify the sensitivity of an animal to mite allergens. For example, animals may be sensitized by systemic or anti-inflammatory agents (eg, antihistamines, anti-steroidal, anti-inflammatory, and reagents that drive the switching of the immunoglobulin heavy chain class from IgE to IgG). It can be treated with a compound that can alter the function of cells involved in the response, which compound attenuates allergic reactions. Suitable compounds useful for altering the function of cells involved in the hypersensitivity response include, but are not limited to: antihistamine, cromolyn sodium, theophylline, cyclosporin A, adrenaline, cortisone, Compounds that can modulate cell signaling, compounds that can modulate adenosine 3 ′, 5′-cyclic phosphate (cAMP) activity, and compounds that block IgE activity (eg, IgE-derived peptides or IgE-specific Fc receptors; A peptide derived from IgE or an antibody specific to an IgE-specific Fc receptor, or an antibody capable of blocking the binding of IgE to the Fc receptor).
[0157]
The compositions of the present invention may be administered to any animal that has or is hypersensitive to mite allergen sensitivity. Animals that are preferred to be treated include mammals and birds, including cats, dogs, horses, humans, and other pets, working animals, and / or economic food animals. Particularly preferred animals for protection are cats and dogs.
[0158]
Another aspect of the present invention includes a method for using the formulations of the present invention to prescribe treatment for animals susceptible to or having hypersensitivity to mite allergens. Preferred methods for prescribing a treatment for mite allergic hypersensitivity include, for example, (1) an effective amount of a formulation comprising a mite allergen of the invention or a mimetope thereof (suitable and preferred formulations are described herein). (2) intradermally injecting an effective amount of a control solution into a second site of the animal; and (3) injecting an effective amount of a control solution into a second site of the animal. Measuring and comparing the wheal size resulting from the injection with the wheal size resulting from the injection of the control solution to assess whether the animal has mite allergic hypersensitivity; and (4) mite allergic hypersensitivity Prescribing treatment for
[0159]
An alternative preferred method for prescribing a treatment for mite allergic hypersensitivity comprises: (1) providing a first portion of a body fluid sample obtained from the animal to be tested with an effective amount of a formulation comprising mite allergen or a mimetope thereof. (A suitable and preferred formulation is disclosed herein) to form a first immune complex solution; (2) contacting with a positive control antibody to form a second immune complex Forming a solution; (3) the animal has mite allergic hypersensitivity by measuring and comparing the amount of immune complex formation in the first immune complex solution and the second immune complex solution Assessing whether or not; and (4) prescribing a treatment for mite allergic hypersensitivity. It should be noted that similar methods can be used to prescribe treatment for allergies using the mite allergen formulations disclosed herein.
[0160]
Another aspect of the invention includes a method for monitoring an animal susceptible to or having hypersensitivity to mite allergens using a formulation of the invention. The in vivo and in vitro tests of the present invention can be used to test animals for mite allergic hypersensitivity before and after any treatment for mite allergic hypersensitivity. Preferred methods for monitoring the treatment of mite allergic hypersensitivity, which may also be applied to monitor the treatment of other allergies, include: (1) an effective amount of a formulation comprising mite allergen or a mimetope thereof. (A suitable and preferred formulation is disclosed herein) intradermally at a first site in an animal; (2) applying an effective amount of a control solution to a second site in the animal. Intra-injection; and (3) determining whether the animal is desensitized to mite allergen by measuring and comparing the wheal size resulting from the injection of the formulation with the wheal size resulting from the injection of the control solution. Deciding whether or not it is not.
[0161]
An alternative preferred method for monitoring treatment for mite allergic hypersensitivity, which may also be applied to monitor the treatment of other allergies, comprises: (1) fluid obtained from the animal being tested A first portion of the sample is contacted with an effective amount of a formulation comprising a mite allergen or mimetope thereof (a suitable and preferred formulation is disclosed herein) to form a first immune complex solution. (2) contacting with a positive control antibody to form a second immune complex solution; and (3) immunocomplex in the first immune complex solution and the second immune complex solution. Determining whether the animal is desensitized to mite allergen by measuring and comparing the amount of body formation.
[0162]
The invention also includes antibodies that can selectively bind to mite allergens or mimetopes thereof. Such antibodies are referred to herein as anti-mite allergen antibodies. As used herein, the term "selectively binds" refers to the ability of such an antibody to preferentially bind to mite allergen or its mimetope. In particular, the invention includes antibodies that can selectively bind to a Der HMW-map protein. Binding can be measured using various methods known to those of skill in the art, including immunoblot assays, immunoprecipitation assays, enzyme immunoassays (eg, ELISA), radioimmunoassays, immunofluorescent antibody assays, and immunoelectron microscopy; See, Sambrook et al., Ibid.
[0163]
The antibodies of the present invention can be either polyclonal or monoclonal antibodies. The antibodies of the present invention include functional equivalents, such as antibody fragments and engineered antibodies (single-chain antibodies, which can selectively bind to at least one epitope of the protein or mimetope used to obtain the antibody). Including))). Preferred antibodies are raised in response to the Der HMW-map protein or its mimetope. More preferred Der HMW-map proteins from which antibodies are raised are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and / or SEQ ID NO: 44, or at least a portion of a protein having a homolog thereof. Preferably, the antibody of the present invention has about 10 to the Der HMW-map protein of the present invention. 3 M -1 ~ About 10 12 M -1 Has a single-site binding affinity of
[0164]
A preferred method for producing an antibody of the invention comprises administering an effective amount of a Der HMW-map protein or a mimetope thereof to an animal to produce the antibody, and collecting the antibody. Antibodies raised against defined products or mimetopes may have advantages. This is because such antibodies are substantially free of antibodies to other substances that might otherwise interfere with diagnostic assays or cause side effects when used in therapeutic compositions.
[0165]
The antibodies of the present invention have a variety of potential uses, which are within the scope of the present invention. For example, such antibodies can be used as (a) a vaccine to passively immunize an animal to protect it from mite allergic hypersensitivity and (b) used as a positive control in a test kit. And / or (c) may be used as a means to recover the desired mite allergen from a mixture of proteins and other contaminants.
[0166]
The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to limit the scope of the invention.
[0167]
(Example)
It should be noted that this example includes a number of molecular biological, microbiological, immunological and biochemical techniques that would be known to those skilled in the art. Disclosures of such techniques can be found, for example, in Sambrook et al. (Ibid.) And related references.
[0168]
(Example 1)
This example describes the identification of a high molecular weight protein that binds to IgE from dogs known to be allergic to mite allergens.
[0169]
Approximately 5.5 grams (g) of frozen wet Dermatophagoides farinae (Derf) mite (available from Bayer Allergy, Spokane, WA) was added to 30 ml of phosphate buffered saline (PBS) or 0.1 M Tris. -HCl, pH 8 (each containing a complete protease inhibitor (available from Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)) with a round bottom glass homogenizer to obtain a crude Der f extract. Was. The resulting supernatants were collected and each was concentrated in a Centriprep 30 concentrator (available from Amicon, Beverly, Mass.) By centrifugation at 16,000 × g for about 30 minutes. The concentrated supernatant was applied to a separate Sephacryl S-100 column (2.7 × 70 cm; available from Pharmacia, Piscataway, NJ) in PBS or 0.1 M Tris-HCl (pH 8), respectively. Fractions excluded from each column were pooled. When using PBS, the fraction was dialyzed against 10 mM Tris-HC (pH 8). The fractions were applied to a separating Q-Sepharose column (2.5 × 5 cm; available from Pharmacia). When a fraction containing 0.1 M Tris-HCl (pH 8) was used, the Q-Sepharose column was pre-equilibrated in 10 mM Tris-HCl (pH 8). Approximately 45 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8), then 0.1 M Tris-HCl (pH 8), then 0.2 M Tris-HCl (pH 8), then 0.3 M Tris-HCl (pH 8), then 0 Elution was carried out sequentially with 0.4 M Tris-HCl (pH 8) and then with 0.5 M Tris-HCl (pH 8). Fractions were collected from each elution step. Each fraction was isolated from IgE antibodies present in dog serum isolated from dogs of known allergy to mite allergen (herein referred to as mite allergic dog antiserum or mite allergic antiserum). The presence of binding proteins was analyzed by Western blot. Specifically, the proteins contained in the fractions were digested by 12% Tris-glycine SDS-PAGE and then blotted on nitrocellulose. The blot was incubated with a serum pool from a dog known to be allergic to mite allergen, diluted 1:20 with standard buffer. The blot was incubated and then washed using standard procedures. The blot was then incubated with the mouse monoclonal anti-dog IgE antibody DEI38 (1 mg / ml; 1: 1000 dilution). The blot was incubated and then washed using standard procedures. The blot was then incubated with a donkey anti-mouse IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase (1: 1000 dilution; available from Jackson Labs, Maine). The presence of HRP-conjugated antibody bound to the blot was detected using standard techniques. A protein of about 70 kD was identified in the 0.2 M Tris-HCl (pH 8) fraction, and a protein of about 98 kD and about 109 kD was identified in the 0.3 M Tris-HCl (pH 8) fraction.
[0170]
The above fraction eluted with 0.3 M Tris-HCl (pH 8) was concentrated in a Centriprep 30 concentrator and then diluted in 20 mM Na-Ac (pH 5.6). The eluted fraction was then applied to a PolyCat A HPLC cation exchange column (available from PolyLC, Columbia, MD). The column was eluted with about 10 ml of 20 mM Na-Ac, pH 5.6, followed by about 45 ml of a 0-0.5 M linear gradient of NaCl in 20 mM Na-Ac, pH 5.6. Elution was performed using a flow rate of about 1 ml / min. Fractions were collected from the elution procedure and assayed for the presence of high molecular weight proteins using the mite allergic antisera and Western blot protocol described above. Fractions containing high molecular weight proteins were pooled. Trifluoroacetic acid (TFA) was added to a concentration of about 0.05%. This solution was applied to a TSK-Gel TMS-250 Cl reverse phase column (commercially available from TosoHaas, Montgomeryville, PA) pre-equilibrated with 80% solvent A and 20% solvent B. Solvent A contains about 0.05% TFA in water and solvent B contains about 0.05% TFA in 90% acetonitrile in water. The column was eluted with about 5 ml of 20% solvent B, then eluted with a linear gradient of about 20% to about 70% solvent B at a flow rate of 0.6 ml / min. The protein eluted from this column was resolved by 12% Tris-glycine PAGE. The gel was stained with Coomassie Blue. The stained gel is shown in FIG. Lane 1 contains the Mark-12 protein molecular weight marker (available from Novex, San Diego, CA), lane 2 contains the protein eluted from the reversed phase column, and lane 3 contains the SeeBlue TM Protein molecular weight markers (available from Novex). Two major proteins were identified in the eluate. The molecular weight of this protein is determined by BioRad TM Multi-Analyst TM / PC Image System (available from BioRad Corp.). The higher molecular weight protein in lane 2 of FIG. 1 was determined to be about 109 kD and is referred to herein as mite allergen protein A (mapA). The lower molecular weight protein in lane 2 of FIG. 1 was determined to be about 98 kD and is referred to herein as mite allergen protein B (mapB). The purity of the combined protein was higher than 85% purity, ie less than 15% impurities. This purified eluate is referred to herein as D.E. It is referred to as a farinae high molecular weight map (HMW-map) composition.
[0171]
(Example 2)
In the present embodiment, N-terminal sequencing of proteins in farinae HMW-map compositions is described.
[0172]
The protein contained in the 0.3 M Tris-HCl (pH 8) fraction obtained as described above in Example 1 was separated by SDS-PAGE using a 12% Tris-glycine polyacrylamide-SDS gel, and subsequently separated. And stained with Coomassie. Proteins were blotted onto PVDF, stained with Coomassie R-250, and decolorized using standard procedures. The proteins corresponding to the approximately 98 kD band and the approximately 109 kD band were excised and separately subjected to N-terminal amino acid sequencing using techniques known to those skilled in the art. A partial N-terminal amino acid sequence of about 14 amino acids was deduced for both proteins and these sequences were determined to be identical. The N-terminal amino acid sequence is shown herein as SEQ ID NO: 1 having the amino acid sequence: Ser Ile Lys Arg Asp His Asn Asp Tyr Ser Lys Asn Pro Met.
[0173]
D. The protein in the farinae HMW-map composition was also subjected to proteolytic cleavage to obtain internal amino acid sequence data. In detail, this D. The farinae HMW-map composition was cut using the endoproteinase Asp-N (available from Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN) using methods standard in the art. The digested protein was then purified by the method of Stoney et al., Enzymatic Digestion of Proteins and HPLC Peptide Isolation (A Practical Guide to Protein and PeptidePulse Quantification Scheme by Microelectronics, Peptide, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals) And separated by HPLC. Twelve proteolytic fragments were isolated and referred to herein as map (1), map (2), map (3), map (4), map (5), map (6), map (6). (7), map (8), map (9), map (10), map (11) and map (12).
[0174]
The N-terminal partial amino acid sequence of map (1) was determined to be Asp Tyr Glu Tyr Pro Gly Ser Arg Leu Gly Asn Pro Lys Ala Pro Leu Tyr Lys Arg Pro and is also referred to as SEQ ID NO: 2. The N-terminal partial amino acid sequence of map (2) was determined to be Asp Ile Pro His His Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Cys Glu Ser Val Asn Gly Gly, and is also referred to as SEQ ID NO: 3. The N-terminal partial amino acid sequence of map (3) was determined to be Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser Pro Pro Gly Phe Ile Val Gly Glu Glu Gly Val Leu Ser and is also referred to as SEQ ID NO: 4. The N-terminal partial amino acid sequence of map (4) was determined to be Asp Glu Lys Asn Ser Plu Glu Cys Ile Leu Gly Pro and is also referred to as SEQ ID NO: 5. The N-terminal partial amino acid sequence of map (5) was determined to be Asp Ala Phe Glu Pro His Gly Tyr Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Pro Gly Lys and is also referred to as SEQ ID NO: 6. The N-terminal partial amino acid sequence of map (6) was determined to be Asp Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Leu Val Arg Glu Leu Lys and is also referred to as SEQ ID NO: 7. The N-terminal partial amino acid sequence of map (7) is Asp Met Ala Gln Asn Tyr Lys Tyr Arg Gln Gln Phe Ile Gln Ser Val Leu Asn Asn Gly Ala, which is also referred to as Arg Arg. The N-terminal partial amino acid sequence of map (8) is Asp Glu Xaa Asn Val Met Xaa Tyr Val Leu Tyr Thr Met His Tyr Tyr Leu Asn Asn Gly Ala, which is also referred to as A9, which is also referred to as Ar9, which is also referred to as Ar9. Xaa represents any amino acid). The N-terminal partial amino acid sequence of map (9) was determined to be Asp Lys Leu Val Met Gly Val Pro Pro Tyr Gly Arg Ala Xaa Ser Ile Glu and is also referred to as SEQ ID NO: 10 (where Xaa is an arbitrary amino acid). Is shown). The N-terminal partial amino acid sequence of map (10) was determined to be Asp Ile Pro His His Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Cys Glu Ser Val Asn Gly and is also referred to as SEQ ID NO: 11. The N-terminal partial amino acid sequence of map (11) was determined to be Asp Tyr Ala Lys Asn Pro Lys Arg Ile Val Cys Ile Val Gly Thr Glu Gly Val Leu Ser and is also referred to as SEQ ID NO: 12. The N-terminal partial amino acid sequence of map (12) was determined to be Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser Pro Pro Gly He Ile Val Gly Glu Glu Gly Val Leu Ser and is also referred to as SEQ ID NO: 13. map (1), map (2), map (3), map (4), map (5), map (6), map (7), map (8), map (9), map (10), Since the amino acid sequences for map (11), map (12) and map (13) were generated from a mixture of mapA and mapB proteins, these sequences do not necessarily represent a partial sequence of the signal protein. .
[0175]
(Example 3)
This example describes the purification of a 70 kD protein that binds IgE from dogs known to be allergic to mite allergens.
[0176]
The fraction described in Example 1 eluted with 0.2 M Tris-HCl (pH 8) was concentrated in a Centriprep 30 concentrator and then eluted with 20 mM Na-Ac (pH 5.6). The diluted protein was then applied to a PolyCat A HPLC cation exchange column. The column was eluted with about 10 ml of 20 mM Na-Ac, pH 5.6, followed by about 45 ml of a linear gradient of 0-0.5 M NaCl in 20 mM Na-Ac, pH 5.6 buffer. Was eluted using a flow rate of about 1 ml / min. Fractions were collected from the elution procedure and assayed for the presence of the 70 kD protein using the mite allergic antiserum and Western blot protocol described above. The fractions containing the 70 kD protein were pooled. Trifluoroacetic acid (TFA) was added to a concentration of about 0.05%. This solution was applied to a TSK-Gel TMS-250Cl reverse phase column that had been pre-equilibrated with 80% solvent A and 20% solvent B. Solvent A contains about 0.05% TFA in water and solvent B contains about 0.05% TFA in 90% acetonitrile in water. The column was eluted with about 3 ml of 20% solvent B and then with a linear gradient of about 20% to about 70% of solvent B at a flow rate of 0.6 ml / min. An approximately 70 kD protein of greater than 90% purity was obtained. This approximately 70 kD protein is referred to herein as mapC.
[0177]
The N-terminal sequence of the region on SDS-PAGE corresponding to this 70 kD protein (mapC) was obtained as described in Example 2. The N-terminal amino acid sequence of about 21 amino acids was deduced at an 80% confidence level, and is represented herein as SEQ ID NO: 33, which is: Gln Ser Arg Asp Arg Asn Asp Lys Pro Tyr Xaa Ile It has an amino acid sequence of Val Lys Lys Lys Lys Lys Ala Leu Asp.
[0178]
(Example 4)
This example demonstrates the ability of D. cerevisiae against dog IgE in dog serum isolated from dogs known to be allergic to mite allergens. The binding of the farinae HMW-map composition (ie, including mapA and mapB) is described.
[0179]
Multiple wells of an Immulon II microtiter plate were prepared at approximately 100 nanograms / well (ng / well) diluted in CBC buffer. coated with the farinae HMW-map composition, which was isolated according to the method described above in Example 1. The plate was incubated overnight at 4 ° C. After incubation, the D.C. The solution containing the farinae HMW-map composition was removed from the plate and the plate was blotted dry. The plate was then incubated at room temperature with about 200 μl / well of 4.0% fetal calf serum (PBSTFCS) in phosphate buffered saline (PBS) with 0.05% Tween-20. Blocked for about 1 hour. The plate was then washed four times with 0.05% Tween-20 in PBS (PBST) using an automatic washer (available from Dynatech, Chantilly, VA). Approximately 100 μl (per well) of a 1:10 dilution of a serum sample isolated from a different dog with known sensitivity to mite allergen in the intradermal skin test was added to the plate. A negative control group of sera was also added to a plate containing a combination of sera from six dogs (available from Harlan Bioproducts, Indianapolis, IN) raised in a blocking facility. Some wells did not receive dog serum, and therefore, background binding levels could be determined. The plate was incubated for about 1 hour at room temperature and then washed four times with PBST. Approximately 100 μl of a 1: 4000 dilution of 40 μg / ml biotinylated human FcεRα chain protein (produced as described in Frank et al., WO 98/23964 (published November 24, 1997)) contained in PBSTFCS ( Per well) was added. The plate was incubated at room temperature for about 1 hour and then washed four times with PBST. Approximately 100 μl of approximately 0.25 μg / ml streptavidin (available from Kirkegaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersburg, MD; diluted in PBST) conjugated to horseradish peroxidase received an experimental or control sample. Added to each well. The plate was then incubated for 1 hour at room temperature and washed four times with PBST. About 100 μl of TMB substrate (available from KPL) pre-warmed to room temperature was added to each well. The plate was then incubated for about 10 minutes at room temperature, then about 100 μl / well of stop solution (available from KPL) was added. The optical density (OD) of the wells was read at 450 nm on a Spectramax Microtiter Plate (available from Molecular Devices Inc.) reader within 10 minutes of adding the stop solution.
[0180]
O.D. obtained using the negative control sample wells and background wells. D. The reading is 0. D. Met. Serum from 5 of the 26 mite allergen-sensitive dogs was approximately 2,000 O.D. D. And about 3,200O. D. Between O. D. Generated read. Serum from three other mite allergen-sensitive dogs was approximately 1,000 O.D. D. And 2,000O. D. Between O. D. Generated read. Serum from three other mite allergen-sensitive dogs was approximately 500 O.D. D. And 1,000O. D. Between O. D. A reading occurred. Serum from seven other mite allergen-sensitive dogs was approximately 200O. D. And 500O. D. Between O. D. A reading occurred. Activity from six other mite allergen-sensitive dogs was 50O.D. D. O. less than D. Generated read. Thus, these results indicate that serum from dogs known to be sensitive to mite allergens contains IgE antibodies that specifically bind to the mapA and mapB proteins of the invention.
[0181]
(Example 5)
This example demonstrates a 70 kD D.E. against canine IgE in dog serum isolated from dogs known to be allergic to mite allergens. The binding of the farinae protein is described.
[0182]
Multiple wells of an Immulon II microtiter plate were prepared at approximately 100 ng / well 70 kD D.I. diluted in CBC buffer. Farinae protein (referred to herein as mapC), which was isolated according to the methods described above in Examples 1 and 3, was coated. The plate was incubated overnight at 4 ° C. The plate was blocked and washed using the method described in Example 4. Approximately 100 μl (per well) of a 1:10 dilution of a serum sample isolated from a different dog with known sensitivity to mite allergen in the intradermal skin test was added to the plate. A negative control sample was also added to the plate containing the SPF serum sample (serum from a dog that was maintained in a blocking facility and was therefore never exposed to mite allergen). Some wells did not receive dog serum, and therefore, background binding levels could be determined. The plate was incubated for about 1 hour at room temperature and then washed four times with PBST. Biotinylated human FcεRα chain protein was then added and the presence of IgE bound to the plate was detected using the method described in Example 4.
[0183]
O.D. obtained using the negative control sample wells and background wells. D. The reading is 0. D. Met. Serum from three of the 26 mite allergen-sensitive dogs was approximately 1,500 O.D. D. And about 2,700O. D. Between O. D. Generated read. Serum from five other mite allergen-sensitive dogs was approximately 800 O.D. D. And about 1,500O. D. Between O. D. Generated read. Sera from four other mite allergen-sensitive dogs had about 500 O.D. D. And about 800O. D. Between O. D. A reading occurred. Serum from six other mite allergen-sensitive dogs was approximately 200O. D. And about 500O. D. Between O. D. A reading occurred. The activity from eight other mite allergen-sensitive dogs was 50O. D. O. less than D. Generated read. Thus, these results indicate that sera from dogs known to be sensitive to mite allergens contain IgE antibodies that specifically bind to the mapC protein of the invention.
[0184]
(Example 6)
This example demonstrates the binding of the mapA, mapB, or mapC protein to cat IgE in cat serum isolated from cats, as demonstrated by in vitro testing for hypersensitivity to mite allergens. Describe.
[0185]
Multiple wells of an Immulon II microtiter plate were prepared with approximately 100 ng / well of D.I. farinae HMW-map composition (isolated according to the method described above in Example 1) and 70 kD Coated with farinae protein (isolated according to the method described above in Example 3). The other wells of this plate are either 400 ng / well of total Dermatophagoides pteronyssius extract (available from Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC; concentrated 8-fold prior to use) or total D.I. Coated with farinae extract (available from Miles, Inc., Elkhart, IN). All samples were diluted in CBC buffer. The plate was incubated overnight at 4 ° C. The plate was blocked and washed using the method described in Example 4. Approximately 100 μl (per well) of a 1:10 dilution of serum samples from different cats known to be sensitive to mite allergens in an in vitro allergen test in PBSTFCS was added to the plate. Seven control cats (# 15, # 16, # 17, # 18, # 19, # 20, and # 21) (these were shown by in vitro tests to be insensitive to mite allergen dust) ) Were also tested. Some wells do not receive cat serum, so background binding levels can be determined. The plate was incubated for about 1 hour at room temperature and then washed four times with PBST. Biotinylated human FcεRα chain protein was then added and the presence of IgE bound to the plate was detected using the method described in Example 4.
[0186]
The results are shown in Table 1 below. All values are O.D. D. Indicates 1,000 times the value. HDM refers to cats that are sensitive to dust mite allergens (by serologic testing (ie, ELISA against all D. farinae extracts)).
(Table 1)
[0187]
[Table 1]
These results indicate that sera from several cats known to be sensitive to mite allergens contain IgE antibodies that specifically bind to the mapA, mapB or mapC proteins of the invention. In addition, some sera containing IgE binding to the mapA, mapB or mapC proteins are also found in all D.A. and IgE antibodies that bind to P. teronyssius extract. Control sera did not contain IgE antibodies that bind to any of the mapA, mapB or mapC proteins of the invention.
[0188]
(Example 7)
This example demonstrates that D. elegans induces a hypersensitive response in dogs. 3 illustrates the performance of a farinae HMW-map composition.
[0189]
D. described in Example 1. To determine whether a farinae HMW-map composition can induce an allergic response in an animal susceptible to a powdered mite allergic response, dogs exhibiting clinical signs of powdered mite allergy, Skin test was carried out on the atopic dog). Normal dogs include dogs that do not show symptoms of mite allergy but may be susceptible to a mite allergic response. Each dog (ie, 4 normal dogs and 4 atopic dogs) was shaved in the outer thoracic / abdominal region and separated at different sites in that region by the method described in Example 1. D. at a dilution of about 1: 50,000. Approximately 2 μg of purified D. farinae extract was used. It was injected intradermally with the farinae HMW-map composition and / or control solution (i.e., saline as a negative control and histamine at a 1: 1000 dilution as a positive control). All 4 normal dogs and all 4 atopic dogs had farinae whole extract was received. Three of the normal dogs and two of the atopic dogs were farinae HMW-map composition. All eight dogs received both negative and positive control samples. The total volume per injection was 50 microliters (μl), with the composition and controls diluted in saline. These injections were administered as a single injection.
[0190]
All injection sites were objectively measured in millimeters (mm) at 15 minutes and scored as either (+) or (-) when compared to control samples. Objective scoring was performed as described by Ohio State University, Columbia, OH, Andrew Hillier, D .; V. M. It was carried out by. Table 2 shows the results.
(Table 2)
[0191]
[Table 2]
These results are described in 2 shows that the farinae HMW-map composition was able to induce an immediate hypersensitive response in dogs, including atopic dogs. Thus, the HMW-map composition is sufficiently allergic to induce a hypersensitive response in dogs, including atopic dogs.
[0192]
Table 3 describes the results of the following experiments. IgE against the HMW-map composition was measured using ELISA in the following three groups of dog sera: farinae allergic dogs (HDM-AD), atopic (but not allergen) but not HDM allergic dogs (AD), and naive dogs. Three groups of dogs were also given D.D. The farinae total extract and the HMW-map composition were tested by an intradermal skin test.
[0193]
Table 3. Skin tests and ELISA data for D. farinae total extract and HMW-map compositions in D. farinae allergic dogs, atopic but not HDM-allergic dogs and na ナ イ ve dogs.
[0194]
[Table 3A]
[0195]
[Table 3B]
D. All dogs that were positive by ELISA for farinae total extract were also positive for the HMW-map composition allergen. D. Of the eight dogs that were negative by ELISA for farinae total extract, seven out of eight dogs were also negative for the HMW-map composition.
[0196]
(Example 8)
This example describes the isolation of a nucleic acid molecule encoding a Der HMW-map composition of the invention.
[0197]
Der HMW-map composition nucleic acid molecules were identified and isolated as follows.
[0198]
(A. Preparation of Dermatophagoides farinae cDNA Library)
A Dermatophagoides farinae cDNA library was prepared as follows. Total RNA was obtained from approximately 2 g of flash frozen and crushed house dust mites by Chomzynski et al., 1987, Anal. Biochem. Extracted using a similar acid-guanidium-phenol-chloroform method as described by 162,156-159. Poly A + Selected RNA was separated from total RNA preparations by oligo-dT cellulose chromatography using the mRNA Purification Kit (available from Pharmacia Biotech, Newark, NJ) according to the method recommended by the manufacturer. The cDNA library was subjected to λ-Uni-ZAP using Stratagene's ZAP-cDNA Synthesis Kit protocol. TM Constructed in XR vector (available from Stratagene). About 5 μg of poly A + RNA was used to generate a Dermatophagoides farinae cDNA library.
[0199]
(B. Preparation of PCR primer)
Further N-terminal amino acid sequence analysis was performed according to the method described above in Example 2. The N-terminal amino acid subsequence of 34 amino acids is deduced and is shown by SEQ ID NO: 24 having the following amino acid sequence:
[0200]
Embedded image
(Where "Xaa" indicates any amino acid residue). Using the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (described above in Example 2) and SEQ ID NO: 24, a synthetic oligonucleotide primer was designed. The following nucleotide sequence:
[0201]
Embedded image
(SEQ ID NO: 25) wherein Y indicates C or T, R indicates A or G, and N indicates A, C, T or G Or the following nucleotide sequence:
[0202]
Embedded image
A sense primer Derf2 (referred to as SEQ ID NO: 26) derived from SEQ ID NO: 4 having the following nucleotide sequence:
[0203]
Embedded image
Or the antisense primer Derf3 from SEQ ID NO: 4 (designated SEQ ID NO: 27), or the following nucleotide sequence:
[0204]
Embedded image
And used in combination with the antisense primer Derf4 (referred to as SEQ ID NO: 28) derived from SEQ ID NO: 24 having
[0205]
The Derf cDNA library was then screened using standard polymerase chain reaction amplification (PCR) techniques using the primers described above. All attempts to identify cDNAs that hybridized to these primers failed.
[0206]
(C. Immunoscreening of D. farinae cDNA library using anti-Der HMW-map composition antibody)
Since an attempt to isolate a cDNA clone using the PCR method failed, we used the antiserum generated as follows to obtain a DNA clone. The farinae cDNA library was screened. The protein isolated according to the method described above in Example 1 was used as a source of antigen to generate a rabbit polyclonal antibody, referred to herein as an anti-Der HMW-map composition antibody. Preparation of rabbit polyclonal antibodies was performed using standard techniques.
[0207]
About 7.5 ml of Escherichia coli (XL1 Blue, OD. 600 = 0.5) with a Dermatophagoides farinae ZAP-cDNA library (1.8 × 10 9 3.0 × 10 from pfu / ml) 4 Incubated with pfu phage at 37 ° C. for 15 minutes and plated on 30 ml Luria-Bertani (LB) medium agar plate (150 mm). The plate was incubated overnight at 37 ° C. Each plate was then overlaid on a nitrocellulose filter treated with IPTG (10 mM) at 37 ° C. for about 4 hours. The filter was then removed and washed with Tris-buffered saline (pH 7.5) containing 0.1% Tween (TBST) for 5 minutes. The filter was blocked with a solution of 1% skim milk powder, 1% BSA, 2% goat serum and 0.15% gelatin in TBST for 2 hours at room temperature. The filters were then incubated overnight at 4 ° C. with the above blocking solution containing the anti-Der HMW-map composition antibody at a 1: 1000 dilution. This mixture was then incubated for 2 hours at room temperature with donkey anti-rabbit IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase (available from Jackson ImmunoResearch, West Grove, PN). All filters were washed (3 × 15 minutes per wash) between each incubation with the blocking solution contained in TBST. All filters were then subjected to a final wash for 5 minutes at room temperature with Tris-buffered saline (pH 7.5). The immunocomplexed plaques were stained with a color developing solution (TMB Peroxidase Substrate / TMB Peroxidase Solution / TMB Membrane Enhancer from Kirkegaard & Perry Laboratories, and the filter was immersed in this filter at a volume ratio of 1/1 / 0.1). Identified. 123 plaques were identified and 50 plaques were further purified two or more times under the same immunoscreening conditions as described above.
[0208]
(D. PCR screening of purified phage plug)
The phage plugs identified in the above immunoscreening studies were then further analyzed by PCR amplification using the primers described above in Section 8B. DNA from 50 plaques was amplified using a mixture of the four primers identified by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28. PCR amplification was performed using standard techniques. One of the resulting PCR amplification products constituted a fragment of about 700 nucleotides. This PCR product was obtained from InVitrogen, Corp. , TA TM It was cloned into a cloning vector (a procedure provided by In Vitrogen, Corp.) and subjected to DNA sequence analysis using standard techniques. Phagemids from the purified phage, determined to contain the encoded sequence in the 700 bp PCR product, were recovered and subjected to DNA sequence analysis using standard techniques.
[0209]
A clone containing the approximately 1752 nucleotide insert was isolated and described herein as nDerf98. 1752 Call. The nucleic acid sequence can be converted to nDerf98 using standard techniques. 1752 From the coding strand having the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 14 and the complementary strand having the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 16 1752 A Dermatophagoides farinae nucleic acid molecule was obtained. The translation of SEQ ID NO: 14 is from nDerf98 1752 The nucleic acid molecule comprises about 555 amino acids of the full length flea protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 15 (PDerf98 herein) 555 Code). Here, an open reading frame extending from nucleotide 1 to nucleotide 3 of SEQ ID NO: 14 and an end codon extending from nucleotide 1666 to nucleotide 1668 of SEQ ID NO: 14 is expected. PDerf98 555 Is a nucleic acid molecule nDerf98 having a coding strand having the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 17 and a complementary strand having the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19. 1665 Coded by PDerf98, also shown as SEQ ID NO: 18 555 Has an estimated molecular weight of about 63.2 kD and an estimated pI of about 5.33. Analysis of SEQ ID NO: 15 indicates the presence of a signal peptide spanning from about amino acid 1 to about amino acid 19. PDerf98 536 The proposed mature protein, shown herein as comprises about 536 amino acids, the sequence is shown herein as SEQ ID NO: 21, and SEQ ID NO: 20 (coding strand) and SEQ ID NO: 22. NDerf98, indicated by (complementary strand) 1608 And encoded by the nucleic acid molecule set forth herein. flea PDerf98 536 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (ie, SEQ ID NO: 21) 536 Has an estimated molecular weight of 61.2 kD and an estimated pI of about 5.26.
[0210]
Comparison of amino acid sequence SEQ ID NO: 15 with the amino acid sequence reported in GenBank shows that SEQ ID NO: 15 has the greatest homology (ie, about 42% identity) to a chitinase protein from Anopheles gambiae (GenBank accession number 2654602). Indicates what was shown. A comparison of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 17 with the nucleic acid sequence reported in GenBank shows that SEQ ID NO: 17 differs from SEQ ID NO: 17 and Chelonus sp. 4 shows that it exhibited the greatest homology (ie, approximately 58% identity) with the venom chitinase mRNA (GenBank accession number U10422).
[0211]
(Example 9)
This example describes the purification of a 60 kD protein that binds to IgE from a dog known to be allergic to mite allergen, and the partial amino acid sequence from this 60 kD protein.
[0212]
(A. Purification of 60 kD protein)
D. The farinae extract was prepared and fractionated on a Sephacryl S-100 column according to the method described above in Example 1. Fractions after the exclusion peak (fractions 29-35) were collected from a Sephacryl S-100 column and pooled. The pooled fractions were then diluted 1: 1 with 10 mM Tris-HCl (pH 8) and applied to a Q-sepharose column to obtain fractions using the method described in Example 1. The fraction eluted with 0.4 M Tris-HCl was concentrated and further purified by a TMS250 reverse phase HPLC column using the method described above in Example 1. The proteins in each sentence were separated by 14% Tris-glycine SDS-PAGE using the same method described in Example 1 for protein separation on a 12% gel. The stained gel is shown in FIG. A protein with a molecular weight of about 60 kD of about 90% purity, eluted at about 50% B (0.05% TA in 90% acetonitrile) was identified (FIG. 2, lane 4). The molecular weight of the indicated 60 kd protein was estimated to be 56.11 kd using the BioRad Multi-Analyst / PC Version 1.1 program and the Mark-12 protein molecular weight marker. The approximately 60 kd protein is referred to herein as a mapD protein.
[0213]
(B. N-terminal partial sequence and internal sequence obtained from 60 kd protein)
The protein eluted from Part A above was blotted onto PVDF, which was stained with Coomassie R-250 and decolorized using standard procedures. The protein corresponding to the band at about 60 kd was extracted and subjected to N-terminal amino acid sequencing using techniques known to those skilled in the art. An N-terminal amino acid subsequence of about 25 amino acids was deduced for this protein, and the amino acid sequence shown herein as SEQ ID NO: 23 was replaced with:
[0214]
Embedded image
(Where Xaa refers to any amino acid).
[0215]
The protein corresponding to this 60 kd region was also subjected to proteolytic cleavage to obtain internal amino acid sequence data. Digestion and reverse phase chromatography of the 60 kd protein were performed as described in Example 1. The four proteolytic fragments were isolated and sequenced and are referred to herein as map (13), map (14), map (15) and map (16).
[0216]
The N-terminal partial amino acid sequence of map (13) is as follows:
[0219]
Embedded image
As shown in SEQ ID NO: 29. The N-terminal partial amino acid sequence of map (14) is as follows:
[0218]
Embedded image
And this was also set forth as SEQ ID NO: 30. The N-terminal partial amino acid sequence of map (15) is as follows:
[0219]
Embedded image
And this was also set forth as SEQ ID NO: 31. The N-terminal partial amino acid sequence of map (16) is as follows:
[0220]
Embedded image
And this was also set forth as SEQ ID NO: 32.
[0221]
(Example 10)
In the present embodiment, The isolation and sequencing of a nucleic acid molecule encoding a part of the farinae 60 kD (mapD) allergen is described.
[0222]
As described above in Example 8, D.I. A farinae library was prepared. D. From the deduced N-terminal amino acid sequence for the farinae 60 kD protein (SEQ ID NO: 23), a degenerate synthetic oligonucleotide primer was designed: Primer 1, a sense primer corresponding to amino acid residues from about 3 to about 11 of SEQ ID NO: 23 Is a sequence also identified as SEQ ID NO: 46:
[0223]
Embedded image
Where H denotes A or C or T, N denotes A or C or G or T, and Y denotes C or T. D. PCR amplification of fragments from the farinae library was performed using standard techniques. SEQ ID NO: 46 (primer 1) and M13 forward universal primer shown as SEQ ID NO: 47:
[0224]
Embedded image
Was used to generate PCR amplification products.
[0225]
A second nested PCR reaction was performed on the products of the first PCR reaction. Synthetic oligonucleotides were synthesized that corresponded to the region spanning approximately amino acid residues 1 to 10 of the 60 kD protein internal amino acid sequence (SEQ ID NO: 31). This primer (primer 2) has the following nucleic acid sequence shown as SEQ ID NO: 48:
[0226]
Embedded image
Wherein R represents A or G. Primer 2 (SEQ ID NO: 48), and T7 standard primer shown as SEQ ID NO: 49:
[0227]
Embedded image
Was used to generate PCR amplification products. The resulting PCR product was subjected to DNA sequence analysis using standard techniques.
[0228]
The PCR product was sequenced and found to contain 510 nucleotides, indicating that nDer60 510 Identified as nDerf60 510 The nucleotide sequence of the coding strand of is shown herein as SEQ ID NO: 43, and its complement is shown as SEQ ID NO: 45. The translation of SEQ ID NO: 43 is based on nDerf60 510 Has a portion of about 170 amino acids having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44. farinae 60 kD protein (PDerf60 herein) 170 Code). Here, the start codon presumes an open reading frame spanning from about nucleotide 1 to about nucleotide 3 of SEQ ID NO: 43 and the stop codon spanning from about nucleotide 508 to about nucleotide 510 of SEQ ID NO: 43. PDerf60 170 Has an estimated molecular weight of about 19.2 kD and an estimated pI of about 6.51.
[0229]
Nucleic acid molecule nDerf60 510 Was used as a probe to generate farinae 60 kD protein or a larger portion of A nucleic acid molecule encoding a protein corresponding to the farinae 60 kD protein was isolated. Using the procedure set forth above in Example 8, using standard techniques 32 Using nucleic acid SEQ ID NO: 43 radiolabeled with P, all D.P. The farinae library was screened. Hybridization was carried out in 6 × SSC, 5 × Denhardt solution, 0.5% SDS, 100 mg / ml ssDNA at 55 ° C. for about 36 hours. The filters were washed three times for 30 minutes per wash at 55 ° C. in 2 × SSC, 0.2% SDS for 30 minutes, followed by a final wash in 0.2 × SSC, 0.2% SDS for about 30 minutes.
[0230]
PCR amplification was performed on the first phage plug. PCR products were generated using primer 1 as SEQ ID NO: 46 and the T7 standard primer as SEQ ID NO: 49 as primers. Preliminary sequence analysis of this 1.6 kb PCR product indicated that it exhibited the nucleic acid sequence including the complete sequence encoding the PDerf60 full length protein.
[0231]
Amino acid sequence PDerf60 of SEQ ID NO: 44 170 And the amino acid sequence reported in GenBank were compared to PDerf60 170 Is Aphanodium album. 4 shows that it showed the highest homology (ie, about 39% identity) with the chitinase protein precursor from the original (GenBank accession number P32470). Nucleic acid sequence SEQ ID NO: 43 did not show significant homology to any of the sequences submitted to GenBank.
[0232]
(Example 11)
This example describes the isolation of a nucleic acid molecule encoding a Dermatophagoides pteronyssius 98 kD allergen protein.
[0233]
D. Hybridization with a 32-P labeled cDNA encoding a F. farinae HMW-map composition resulted in a D. tertiary HMW-map composition. A nucleic acid molecule having high homology to the F. farinae 98 kD allergen (mapB) was identified as pteronyssius cDNA library.
[0234]
D. A pteronyssius cDNA library was prepared as follows. About 2 g of D.E. pteronyssius mite, Chonzynski et al., 1987, Anal. Biochem. 162: Extracted using the acid-guanidium-phenol-chloroform method described by pp 156-159. Poly A + selected RNA was separated from total RNA preparation by oligo-dT cellulose chromatography using the mRNA Purification Kit (available from Pharmacia, Newark, NJ) according to the method recommended by the manufacturer. All D. The Pteronyssius cDNA library was constructed using the Stratagene ZAP-cDNA Synthesis Kit protocol with λ-Uni-ZAP. TM Constructed in the XR vector (available from Stratagene, La Jolla, CA). Using about 5 milligrams (mg) of poly A + RNA, A Pteronyssius cDNA library was generated.
[0235]
Using a modification of the protocol described in the cDNA Synthesis Kit (available from Stratagene), 32P-labeled D.C. cDNA encoding the F. farinae 97 kD MapB allergen (ie, SEQ ID NO: 17); The pteronyssius cDNA library was screened using a duplicate plaque lift. Hybridization was performed with 6 × SSC (for formulation, see Sambrook et al., Ibid), 5 × Denhardt solution (for formulation, Sambrook et al., Ibid), 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) ( Sigma) and 100 mg / ml single-stranded DNA (available from Sigma) at 55 ° C. for about 36 hours. Wash the filters three times at 55 ° C. in 2 × SSC, 0.2% SDS (about 30 minutes per wash), followed by 55 ° C. in 0.2 × SSC, 0.2% SDS. The filter was finally washed for about 30 minutes. D. pteronyssius, which encodes a 97 kD allergen (mapB); Plasterically purified clones of P. teronysius nucleic acid molecules were subjected to the ExAssist method according to the in vivo excision protocol described in the ZAP-cDNA Synthesis Kit (available from Stratagene). TM Helper phage and SOLR TM E. FIG. It was converted to a double-stranded recombinant molecule using E. coli. D. Plasmids containing the Pteronyssius clone were subjected to DNA sequence analysis using standard techniques. DNA sequence analysis (including determination of molecular weight and isoelectric point (pI)) was performed by GCG TM Made using the program.
[0236]
Clones containing an approximately 1621 nucleotide insert were isolated. This is referred to herein as nDerp98. 1621 And a full length coding region having the coding strand shown as SEQ ID NO: 34 and the complementary strand shown as SEQ ID NO: 36. Distinct start and stop codons range from nucleotide 14 to nucleotide 16 and nucleotide 1541 to nucleotide 1543 of SEQ ID NO: 34, respectively. The putative polyadenylation signal (5'AATAAA3 ') is located in the region spanning nucleotide 1584 to nucleotide 1589 of SEQ ID NO: 34.
[0237]
The translation of SEQ ID NO: 34 is the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 35, and PDerp98 509 Yields a protein of about 509 amino acids, denoted as PDerp98 509 The nucleic acid molecule consisting of the coding region encoding is referred to herein as nDerp98. 1527 And the nucleic acid sequences are shown as SEQ ID NO: 37 (coding strand) and SEQ ID NO: 39 (complementary strand). PDerp98, also designated herein as SEQ ID NO: 38 509 Has an estimated molecular weight of about 58.9 kD and an estimated pI of about 5.61. PDerp98 509 Analysis suggests the presence of a signal peptide ranging from approximately amino acids 1 to approximately amino acids 19. The proposed mature protein (PDerp98 herein) 490 ) Comprises about 490 amino acids and is designated herein as SEQ ID NO: 41. PDerp98 490 Shows that the protein has a predicted molecular weight of about 56.8 kD and a predicted pI of about 5.49, and two asparagine-linked glycosylation sites (about amino acid 115 to about amino acid 117, and about amino acid 240 to 240, respectively). (Extending to amino acid 242). PDerp98 490 Has a coding strand represented by SEQ ID NO: 40 and a complementary strand represented by SEQ ID NO: 42. 1470 It is known as
[0238]
BLAST searches were performed as described previously. PDerp98 509 (SEQ ID NO: 35) showed the highest homology at the amino acid level with Manduca sexta chitinase (SwissProt accession number p36362), with approximately 34% identity. nDerp98 1621 (SEQ ID NO: 34) is a Chelonus sp. It showed the highest homology to the chitinase (Accession No. U10422) at the nucleic acid level, with about 49% identity. D. a cDNA region corresponding to the coding region for the 98 kD allergen protein of F. farinae; Comparison with the cDNA region corresponding to the coding region for the 98 kD allergen protein of Pteronyssius shows about 84% identity.
[0239]
(Example 14)
In the present embodiment, Figure 2 shows the binding of the farinae HMW-map composition to human IgE in human serum isolated from humans, which is known to be allergic to mite allergens.
[0240]
A technique called RAST, the last method (radio-allergo-absorbent test), was used. This is because the amount of human IgE present in human serum is very low. RAST is essentially described in Aalberse, RC et al. Allergy Clin Immun. 68: 356-364. To calculate unit IU / ml, a standard curve was generated using a well-characterized chimeric human / mouse IgE monoclonal antibody against Derp2 (human IgE / monoclonal anti-Derp2, Schuurman et al. (1997) J Allergy Clin Immunol. 99: 545-45). (Following the procedure on page 550) was performed by performing a RAST with several dilutions.
[0241]
Briefly, 50 μg of the HMW-map composition (purified as described in Example 1) was combined with 50 mg of CNBr activated Sepharose 4B (available from Pharmacia, Piscataway, NJ) according to the manufacturer's protocol. Combined. Human serum was used for whole mite D. Selection based on the positive RAST for the farinae extract (17 different samples in total), the number of positive RAST is greater than 1 IU / ml. Two negative (less than 0.3 IU) control sera were also included.
[0242]
To test a serum sample of each individual, 0.5 mg of D.E. farinae HMW-map composition-conjugated Sepharose with 50 μl serum in a total volume of 300 μl PBS-T (phosphate buffered saline with 0.1% volume / volume Tween-20 (available from Sigma)). Incubated. Incubation was performed overnight at 27 ° C. with shaking. After incubation, the bound Sepharose was washed 5 times with PBS-T. Radiolabeled (diluted in PBS-T with 4.5% (v / v) bovine serum and 0.5% (v / v) sheep serum) in a total volume of 750 μl ( 125 -Iodine) Sheep anti-human IgE (generated by a standard radioiodination labeling protocol) was added and incubated overnight at 27 ° C. After incubation, the bound Sepharose was washed four times with PBS-T and counted in a gamma counter to determine the amount of radiolabeled sheep anti-human IgE bound to the HMW-map composition-bound Sepharose. Table 4 shows the results.
[0243]
(Table 4. Binding of human IgE to HMW-map composition from D. farinae)
[0244]
[Table 4]
D. Approximately 75% (11/15) of the patients who were sensitive to the farinae whole mite extract were sensitive to the HMW-map composition antigen, indicating that the HMW-map composition antigen was , D. It is a major antigen for farinae-sensitive humans. Sensitivity to the HMW-map composition was defined as a RAST of 0.5 IU or more.
[0245]
(Example 15)
This embodiment is similar to D.O. 7 demonstrates that the farinae HMW-map composition comprises a glycoprotein.
[0246]
About 5.4 μg of D.I. The farinae HMW-map composition was applied to SDS PAGE and electrophoresis was performed according to standard techniques. The protein is blotted to nitrocellulose membrane according to standard techniques, and the glycoprotein is analyzed by DIG using the manufacturer's protocol. TM Detection was performed using a glycine detection kit (available from Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). The region corresponding to the HMW-map region showed a positive reaction using the kit, indicating that the HMW-map composition contains a glycoprotein.
[0247]
(Example 16)
In the present embodiment, It is shown that the farinae HMW-map composition retains its characteristics as an allergen even when amino acid residues are removed by both chemical and enzymatic means. This result suggests that the major epitope may be a carbohydrate epitope, including a polysaccharide linked to an N-linked or an O-linked glycosylation site on the HMW-map composition.
[0248]
(A. Removal of protein by chemical means (β removal of protein))
12 μg (microgram) of the HMW-map composition (purified as described in Example 1) was dissolved in 100 μl (microliter) of distilled deionized water. To this mixture, 5 μl of 10 M (molar) NaOH and 3.8 mg (milligram) NaBH 4 (Available from Sigma) was added and 0.5M NaOH and 1M NaBH 4 Was obtained. The reaction mixture was heated at 50 ° C. for 30 minutes, then cooled and 100 μl of acetone was added. To this mixture, a sufficient amount (ie, about 150 μl) of Dowex 50 (H +) (available from Pharmacia) was added to make a slightly acidic solution. Dowex 50 absorbs and removes proteins, leaving any sugar moieties in the supernatant. The mixture was centrifuged in a microcentrifuge and washed three times with 100 μl of water. Combine the supernatants from the centrifugations, evaporate to dryness and wash 5 times with a methanol: HCl solution (1000: 1 v / v), after each wash evaporate to dryness to remove salts. The mixture is dissolved in 100 μl water and an aliquot (20 μl) is analyzed by SDS-PAGE using standard techniques and chemically treated using both Coomassie blue and silver stains The amount of protein in the sample was determined. No protein was detected by either Coomassie blue or silver staining, indicating protein removal. Any sugar moieties on the protein were not affected by these conditions.
[0249]
The remainder of the residue from each sample was subjected to an ELISA analysis as described in Example 4. Briefly, 100 ng of either the β- or non-β-depleted sample of the HMW-map composition was coated on Immulon plates, and D.C. farinae-sensitive dog serum pool, F. farinae-sensitive cat serum pool, and (as measured by ELISA). An ELISA was performed as described in Example 4 using various separate canine sera that were either sensitive or insensitive to farinae. Table 5 shows the results.
[0250]
Table 5. Reactivity of dog serum and cat serum to HMW-map and β-depleted HMW-map compositions, which are carbohydrates only
[0251]
[Table 5]
The results from Table 5 indicate that the β-removed HMW-map composition sample was show that they still retain the ability to bind IgE from dog and cat sera that are sensitive to the farinae HMW-map composition, indicating that glycans bound to the protein are a major component of the HMW-map composition allergen protein. It constitutes a novel epitope.
[0252]
(B. Protein removal by enzymatic means)
14 μg of the HMW-map composition (purified as described in Example 1) is digested with 1 μg of endoproteinase K (available from Sigma) to remove the protein portion of the molecule. The digestion reaction was performed at 56 ° C. for 24 hours, after which the endoproteinase in the reaction was heat denatured in boiling water for 10 minutes.
[0253]
A portion of this reaction was analyzed by SDS-PAGE using standard techniques, and both Coomassie blue and silver staining were used to detect the presence of protein in the enzymatically digested sample . The HMW-map composition was not detected by either Coomassie blue staining or silver staining, indicating removal of the HMW-map composition. Any glycans attached via glycosylation sites on the protein were not affected by these conditions.
[0254]
The remainder of the enzymatically digested reaction was tested by ELISA in the manner described in Example 4. Briefly, 100 ng of either the proteinase K digested sample or the proteinase K undigested sample of the HMW-map composition was coated on Immulon plates, and the ELISA was performed (as measured by ELISA). Performed as described in Example 4 using a variety of separate canine sera that were either sensitive or insensitive to farinae. Table 6 shows the results.
[0255]
(Table 6. Reactivity of dog serum to HMW-map composition and endoproteinase K digested HMW-map composition)
[0256]
[Table 6]
The results from Table 6 show that the proteinase K digested HMW-map composition sample was D.E. It is shown that the ability to bind IgE from dog serum and cat serum that is sensitive to the farinae HMW-map composition is still retained, indicating that the glycans attached to the protein are the major components on the HMW-map composition. Suggests that it constitutes an epitope.
[0257]
(Example 17)
This example describes an attempt to remove N-linked glycans from a HMW-map composition.
[0258]
HMW-map composition (2 μg) (purified as in Example 1) was digested with N-glycosidase F (available from Boehringer-Mannheim) according to the manufacturer's instructions. Digests were analyzed by SDS-PAGE and stained according to standard protocols. 2 μg Fetuin (available from Sigma) was used as a positive N-linked glycosylated protein control. SDS-PAGE analysis showed that there was no apparent difference between the molecular weights of intact map B protein and digested map B protein. The positive control fetuin did not show a decrease in molecular weight after digestion with N-glycosidase F. This result indicates that no N-linked glycans are present on the HMW-map composition, or that only small sized N-glycans are present on the HMW-map composition.
[0259]
(Example 18)
This example describes the isolation and sequencing of a nucleic acid molecule encoding a full-length Dermatophagoides farinae 60 kD allergen.
[0260]
This nucleic acid molecule encodes a portion of the Dermatophagoides farinae 60 kD allergen described in Example 10. 32 It was isolated from a Dermatophagoides farinae cDNA library by its ability to hybridize to P-labeled cDNA.
[0261]
A Dermatophagoides farinae cDNA library was prepared as follows. Total RNA was prepared as described in Chonzynski et al., 1987, Anal. Biochem. Using an acid guanidinium-phenol-chloroform method similar to the method described by 162, 156-159, about 2 grams of D.E. farinae mite. Poly A + Selected RNA was separated from total RNA preparations by oligo dT cellulose chromatography using an mRNA purification kit (available from Pharmacia Biotech, Newark, NJ) according to the method recommended by the manufacturer. The whole mite cDNA library was subjected to lambda-Uni-ZAP using Stratagene's ZAP-cDNA Synthesis Kit protocol. TM Constructed in XR vector (available from Stratagene). About 5 μg of poly A + Using RNA, A farinae cDNA library was generated.
[0262]
Using a modification of the protocol described in the cDNA Synthesis Kit, 32 P-labeled cDNA nDerf60 510 The entire mite cDNA library was screened using multiple plaque lifts with Hybridization was performed with 6 × SSC, 5 × Denhardt solution, 0.5% SDS, 100 mg / ml ssDNA at 52 ° C. for 18 hours. Filters were washed twice at 55 ° C. for 30 minutes in 2 × SSC, 0.2% SDS for each wash, followed by 30 minutes in the same buffer except using about 0.2 × SSC. A final wash was performed. D. Plaque-purified clones of the nucleic acid molecule encoding the F. farinae 60 kD allergen were prepared according to the in vivo excision protocol described in the ZAP-cDNA Synthesis Kit (available from Stratagene) using the ExAssist system. TM Helper phage and SOLR TM E. FIG. E. coli was used to convert it into a double-stranded recombinant molecule, which is referred to herein as nDerf60. 1455 As shown. Double-stranded plasmid DNA was prepared using an alkaline lysis protocol (eg, as described in Sambrook et al., Supra).
[0263]
(Example 19)
This embodiment describes the D.D. Describes the sequencing of a farinae nucleic acid molecule.
[0264]
nDerf60 1455 PRISM using Ampli Taq DNA polymerase, FS (available from Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT) by the Sanger dideoxy chain termination method. TM The sequence was determined using the Ready Dye Terminator Cycle Sequencing Kit. PCR extension to GeneAmp TM Performed in a PCR System 9600 (available from Perkin-Elmer). Excess dye terminator is added to Centriflex according to the manufacturer's standard protocol. TM The gel was removed from the extension product using Gel Filtration Cartridge (available from Advanced Genetics Technologies Corporation, Gaithersburg, MD). Samples were resuspended according to the ABI protocol, and the Perkin-Elmer ABI PRISM TM 377 Automated DNA Sequencer. DNA sequence analysis, including sequence editing and open reading frame determination, was performed by GCG. TM This was done using a program (available from Genetics Computer Group, Madison, WI). Protein sequence analysis, including determination of molecular weight and isoelectric point (pI), was performed by GCG TM Performed using the program.
[0265]
Complete nDerf60 1455 An approximately 1455 nucleotide consensus sequence of the nucleic acid molecule was determined; the sequences of the two complementary strands are present as SEQ ID NO: 50 (coding strand) and SEQ ID NO: 52 (complementary strand). The sequences of the two complementary strands are shown as SEQ ID NO: 50 (coding strand) and SEQ ID NO: 52 (complementary strand). nDerf60 1455 The sequence includes the full length coding region. The apparent start and stop codon ranges extend from nucleotides 14 to 16 and 1400 to 1402 of SEQ ID NO: 50, respectively. The putative polyadenylation signal (5'AATAAA3 ') is located within the region spanning nucleotides about 1408-1413 of SEQ ID NO: 50.
[0266]
Translation of SEQ ID NO: 50 is PDerf60 462 Which results in a protein of 462 amino acids, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 51. PDerf60 462 The nucleic acid molecule consisting of the coding region encoding is referred to herein as nDerf60. 1386 This nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 53 (coding strand) and SEQ ID NO: 54 (complementary strand). PDerf60 462 Of SEQ ID NO: 51 (ie, SEQ ID NO: 51) 462 Would have an estimated molecular weight of about 52.1 kD and an estimated PI of about 5.73. Analysis of SEQ ID NO: 51 indicates the presence of a signal peptide encoded by a range of amino acids ranging from amino acid 1 to amino acid 25. The proposed mature protein is referred to herein as PDerf60. 437 The protein comprises about 437 amino acids, designated herein as SEQ ID NO: 56. PDerf60 437 Of SEQ ID NO: 56 (ie, SEQ ID NO: 56) 462 Has a predicted molecular weight of about 50.0 kD, a predicted PI of about 5.61, and one putative asparagine-linked glycosylation site spanning amino acids 313 to 315. The nucleic acid molecule encoding this mature protein is shown as SEQ ID NO: 55, and its inverted complement is shown as SEQ ID NO: 57.
[0267]
BLASTp searches were performed according to the following: Altschul et al., (1990), J. Am. Mol. Biol. 215: 403-410; and Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. A protein search was performed using SEQ ID NO: 51, which showed significant homology to the chitinase molecule. The highest homology search score match at the amino acid level was PIR accession number A53918: Chelonus sp chitinase precursor, which was approximately 32% identical to SEQ ID NO: 51. At the nucleotide level, this search was performed using SEQ ID NO: 53, which did not show significant similarity to any of the sequences in the database. Sequence analysis was performed using the GCG GAP program as described above.
[0268]
(Example 20)
In the present embodiment, The characterization of the farinae HMW-map composition (also referred to as Der f 15) is further described.
[0269]
The nucleic acid molecule nDerf98 of Example 8 1752 Was inserted into an appropriate expression vector. coli and P. coli. Pastors were expressed. Obtained protein (PDerf98 555 ) Is E. coli or P. coli. When expressed in P. pastoris, sensitized dog sera produced as described in Example 4 failed to recognize the recombinant protein. This is the same as the native D.F. In contrast to the positive results obtained when a farinae HMW-map composition (also referred to as native Derfl5) is used; see Example 4.
[0270]
E. FIG. The non-reactivity of the protein expressed in E. coli is consistent with the results shown in Example 16, indicating that the native HMW allergen retains its properties as an allergen even after amino acids have been removed. Showed that.
[0271]
Taken together, these results suggest that the major epitope is some hydrocarbon region of the molecule or other secondary modification.
[0272]
The antigenicity of the native Derfl5 protein is not lost after periodate treatment; generally, carbohydrate epitopes exclude epitopes further substituted with additional groups or epitopes with rare sugars having non-geminal hydroxyl groups. And is destroyed by periodate.
[0273]
The native Derfl5 antigen was analyzed for hydrocarbon content. Substantial amounts of hydrocarbons were found (about 30% by weight). In particular, mannose composed of about 2.8% by weight of antigen; galactose about 23.2%; glucose about 4.3% (the presence of glycosyl residues is a tentative value since glucose often contains glycoproteins). HexNAc at detectable levels; further observations revealed that HexNAc was GlcNAc and GalNAc.
[0274]
NaBH 4 Treated with base in the presence and analyzed by P-4 size exclusion chromatography. The column was found useless due to the O-linked oligosaccharides present in Derf15. This result is consistent with either very large O-linked oligosaccharides, or the presence of acidic groups such as sulfate on the oligosaccharide. Attempts to determine the presence or absence of sulfate more directly have given ambiguous results.
[0275]
Derf15 was treated at pH 4, pH 5, and pH 7 at 37 ° C. overnight. The resulting sample was then probed with an antibody against this protein or canine serum known to be reactive with Derfl5. All of the canine antiserum epitopes were destroyed in the samples treated at pH 5 and pH 7, but some activity remained in the samples treated at pH 4. The anti-Derfl5 antibody shows a decrease in the molecular weight of Derfl5 at all pHs, as if deglycosylation had occurred, and at pH 4 some original material remains. It is not known whether this change was autocatalytic by the Derfl5 protein or caused chemically; without being bound by theory, the loss of epitopes occurs under such mild conditions and therefore, the autocatalytic It is considered that the effect has occurred.
[0276]
(Example 21)
This example describes the binding of some house dust mite (HDM) allergens to cat IgE in cat serum.
[0277]
The allergen profile of the cat's IgE response to house dust mites appears to be different from that of the dog. Examination of the results of the IgE test on cat serum submitted to Heska's Veterinary Diagnostic Laboratories (VDL) in January 2000 revealed that 40% of all allergen-specific IgE-positive cats had anti-HDM IgE. That was shown. All of these cats are farinae and D.M. pteronyssinus was positive. D. 88 sera known to be positive for farinae were assayed by ELISA against highly purified preparations of Derfl, Derfl, Derfl5, and 60 kD allergen. In this assay, 32% of the cats were positive for Derfl, 42% were positive for Derf2, 68% were positive for Derfl5, and 86% were positive for the 60kD allergen.
[0278]
While various embodiments of the present invention have been described in detail, it is evident that modifications and adaptations of these embodiments will occur to those skilled in the art. However, it should be clearly understood that such modifications and adaptations are within the scope of the present invention, as set forth in the appended claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows high molecular weight Derf proteins separated by 12% Tris-glycine SDS-PAGE.
FIG. 2
FIG. 2 shows an approximately 60 kD Derf protein separated by 14% Tris-glycine SDS-PAGE.
Claims (30)
(a)少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子であって、該核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中で、約50℃の温度で、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45からなる群から選択される核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列およびそれらの相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも約150ヌクレオチドを含む、核酸分子;ならびに
(b)(a)の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子であって、該フラグメントは、少なくとも約15ヌクレオチドを含む、核酸分子、
からなる群から選択される、核酸分子。An isolated nucleic acid molecule, comprising:
(A) a nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 16 in a solution containing 1 × SSC and 0% formamide at a temperature of about 50 ° C. 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 A nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, which hybridizes to a nucleic acid sequence encoding a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 and a complement thereof, and (b) (a A) a nucleic acid molecule comprising at least about 15 nucleotides of any of the nucleic acid molecules of No, nucleic acid molecule,
A nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
(a)配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号37、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号43、配列番号45からなる群から選択される核酸配列を含む、核酸分子;および
(b)(a)の核酸分子の対立遺伝子改変体を含む、核酸分子、
からなる群から選択される、核酸分子。2. The nucleic acid molecule according to claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises:
(A) SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 A nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45; and (b) a nucleic acid molecule comprising an allelic variant of the nucleic acid molecule of (a);
A nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および配列番号44からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子;ならびに
(b)(a)のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体を含む、核酸分子、
からなる群から選択される、核酸分子。2. The nucleic acid molecule according to claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises:
(A) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, Sequence A nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 38, 41 and 44; and (b) encoding a protein having the amino acid sequence of (a) A nucleic acid molecule, including an allelic variant of the nucleic acid molecule;
A nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
(a)少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子であって、該核酸分子は、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中で、約50℃の温度で、配列番号16、配列番号19、配列番号22、配列番号36、配列番号39、配列番号42、配列番号45からなる群から選択される核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体、を含む核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも約150ヌクレオチドを含む、核酸分子;ならびに
(b)(a)の核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子であって、該フラグメントは、少なくとも約15ヌクレオチドを含む、核酸分子、
からなる群から選択される核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。An isolated protein, wherein the isolated protein comprises:
(A) a nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 19 in a solution comprising 1 × SSC and 0% formamide at a temperature of about 50 ° C. 22, a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, and a complement of a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 A nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides that hybridizes to the nucleic acid molecule; and (b) a nucleic acid molecule comprising any fragment of the nucleic acid molecule of (a), wherein the fragment comprises at least about 15 nucleotides. molecule,
An isolated protein encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of:
(a)配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号34、配列番号37、配列番号40、配列番号43からなる群から選択される核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列のコーディング鎖、を有する核酸分子によってコードされるタンパク質;および
(b)(a)の核酸分子のいずれかを含む核酸分子の対立遺伝子改変体を含む核酸分子によってコードされるタンパク質、
からなる群から選択される、タンパク質。10. The protein of claim 9, wherein the protein is:
(A) a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, and a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 A protein encoded by a nucleic acid molecule having a coding strand of a nucleic acid sequence encoding the nucleic acid molecule; and (b) a protein encoded by a nucleic acid molecule comprising an allelic variant of the nucleic acid molecule comprising any of the nucleic acid molecules of (a). ,
A protein selected from the group consisting of:
(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号38、配列番号41、および配列番号44からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質;ならびに
(b)(a)のアミノ酸配列のいずれかを含むタンパク質をコードする核酸分子の対立改変体によってコードされる、タンパク質、
からなる群から選択される、タンパク質。10. The protein of claim 9, wherein the protein is:
(A) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, Sequence A protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, and SEQ ID NO: 44; and (b) an allelic variant of a nucleic acid molecule encoding a protein comprising any of the amino acid sequences of (a) A protein, encoded by
A protein selected from the group consisting of:
(a)該エピトープが、ペプチドのβ−消失に耐性であり;
(b)該エピトープが、プロテイナーゼ−K消化に耐性であり;そして
(c)該エピトープが、グリコシル化タンパク質を検出するために設計された試験に対して反応性である、特性からなる群から選択され、ここで、該エピトープが、IgEに結合し、該IgEが、ダニに対してアレルギー性のイヌ由来のイヌIgEおよびダニに対してアレルギー性のネコ由来のネコIgEからなる群から選択される、タンパク質。10. The protein of claim 9, wherein the protein comprises an epitope having at least one identified property, wherein the property comprises:
(A) the epitope is resistant to β-elimination of the peptide;
(B) the epitope is resistant to proteinase-K digestion; and (c) the epitope is selected from the group consisting of properties that are reactive to tests designed to detect glycosylated proteins. Wherein the epitope binds to IgE, wherein the IgE is selected from the group consisting of dog IgE from a dog allergic to ticks and cat IgE from a cat allergic to ticks. ,protein.
(a)請求項9〜12に記載の単離されたタンパク質;
(b)該ダニアレルギー性タンパク質のミメトープ;
(c)該ダニアレルギー性タンパク質のムテイン;
(d)請求項1〜5に記載の単離された核酸分子;
(e)該ダニアレルギー性タンパク質に対する抗体;および
(f)該ダニアレルギー性タンパク質のIgEに対する結合のインヒビター、からなる群から選択される脱感作化合物を含む、治療組成物。A therapeutic composition for treating an allergic reaction to a tick, wherein the therapeutic composition comprises:
(A) the isolated protein of claims 9-12;
(B) a mimetope of the mite allergic protein;
(C) the mite allergic protein mutein;
(D) an isolated nucleic acid molecule according to claims 1-5;
A therapeutic composition comprising a desensitizing compound selected from the group consisting of: (e) an antibody against the mite allergic protein; and (f) an inhibitor of the binding of the mite allergic protein to IgE.
(a)請求項9〜12に記載の単離されたタンパク質;および
(b)該動物が、感受性であるかまたはアレルギー反応を有するか否かを決定するための手段であって、該手段が、ダニに対して感受性であるか、またはアレルギー反応を有する動物を同定するための該タンパク質の使用を含む、手段、を備える、アッセイキット。An assay kit for testing whether an animal is susceptible to a tick or has an allergic reaction, the kit comprising:
(A) an isolated protein according to claims 9 to 12; and (b) means for determining whether the animal is susceptible or has an allergic reaction, said means comprising: An assay kit comprising using said protein to identify an animal that is susceptible to a tick or has an allergic reaction.
(a)請求項9〜12に記載の単離されたタンパク質と、動物の抗体とを接触させる工程;および
(b)該タンパク質と該抗体との間の免疫複合体形成を決定する工程であって、該免疫複合体の形成は、該動物が、感受性であるかまたは該アレルギー反応を有することを示す、工程、
を含む、方法。A method for identifying an animal susceptible to a tick or having an allergic reaction, the method comprising the following steps:
(A) contacting the isolated protein of claims 9-12 with an animal antibody; and (b) determining the formation of an immune complex between the protein and the antibody. Wherein the formation of the immune complex is indicative of the animal being susceptible or having the allergic reaction.
Including, methods.
少なくとも約150ヌクレオチドを含む核酸分子であって、該核酸分子が、1×SSCおよび0%ホルムアミドを含む溶液中で、約50℃の温度で、配列番号16、配列番号19、配列番号22、配列番号36、配列番号39、配列番号42、配列番号45からなる群から選択される核酸配列、および配列番号33のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列の相補体;および該核酸分子のいずれかのフラグメントを含む核酸分子であって、該フラグメントが、少なくとも約15ヌクレオチドを含む核酸分子にハイブリダイズする、少なくとも約150ヌクレオチドを含む、核酸分子からなる群から選択される核酸分子で形質転換された細胞を培養する工程、を包含する、方法。A method for producing a mite allergic protein, comprising the following steps:
A nucleic acid molecule comprising at least about 150 nucleotides, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45 and a complement of a nucleic acid sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; and any of the nucleic acid molecules Wherein the fragment is transformed with a nucleic acid molecule selected from the group consisting of nucleic acid molecules comprising at least about 150 nucleotides that hybridizes to a nucleic acid molecule comprising at least about 15 nucleotides. Culturing the cells.
(a)該エピトープが、ペプチドのβ−消失に対して耐性であり;
(b)該エピトープが、プロテイナーゼ−K消化に耐性であり;そして
(c)該エピトープが、グリコシル化タンパク質を検出するために設計された試験に対して反応性である、特性から選択され、ここで、該エピトープが、IgEに結合し、該IgEが、ダニに対してアレルギー性のイヌ由来のイヌIgEおよびダニに対してアレルギー性のネコ由来のネコIgEからなる群から選択される、試薬。A reagent comprising a non-protein epitope having at least one identified property, wherein the property comprises:
(A) the epitope is resistant to β-elimination of the peptide;
(B) the epitope is resistant to proteinase-K digestion; and (c) the epitope is selected from properties that are reactive to a test designed to detect glycosylated proteins. Wherein the epitope binds to IgE, wherein the IgE is selected from the group consisting of dog IgE from a dog allergic to ticks and cat IgE from a cat allergic to ticks.
(a)請求項25の試薬と動物の抗体とを接触させる工程;および
(b)該試薬と該抗体の間の免疫複合体を決定する工程であって、該免疫複合体の形成は、該動物が、感受性であるかまたはアレルギー反応を有することを示す、工程、
を包含する、方法。A method for identifying an animal that is susceptible to a tick or has an allergic reaction, the method comprising:
(A) contacting the reagent of claim 25 with an animal antibody; and (b) determining an immune complex between the reagent and the antibody, wherein the formation of the immune complex comprises: Indicating that the animal is susceptible or has an allergic reaction,
A method comprising:
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