JP2004528817A - Foggy - Google Patents

Abstract

The present invention relates to nucleotide and amino acid sequences having homology to the zebrafish transcription elongation factor foggy, methods for neurogenesis, differentiation of progenitor cells into dopaminergic or serotonergic neurons, and dopaminergic and serotonergic A method for treating a disease characterized by neuronal abnormalities and activities.

Description

【００４０】

【００４１】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．foggyはニューロン発生の主要な分化のマーカーである
本発明は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現に影響する突然変異の遺伝的スクリーニングで最初に同定された表現型をもつゼブラフィッシュ突然変異に相当するポリペプチドであるfoggyのヌクレオチド及びアミノ酸配列を説明し、特徴とする。現在、foggyはドーパミン作動性（ＤＡ）及びノルアドレナリン作動性（ＮＡ）ニューロンの主要な分化のマーカーとして認識されている。Guo等, 1999, Devel. Biol. 208:473-87。foggy突然変異胚は形態学的に正常であるが、視床下部及び網膜のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロン、後脳ノルアドレナリン作動性（ＮＡ）ニューロン及び神経堤由来交感神経ＮＡニューロンに欠陥が見られる。驚くべきことに、視床下部のＤＡニューロンの欠陥は近くのセロトニン作動性（５ＨＴ）ニューロン数の増加を伴っていた。また、神経発生は、無軸索及び光受容ニューロンの欠陥が観察された発達した網膜にも影響していた。対照的に、網膜神経節ニューロンは欠陥がなく、さらに、少ない増加を示した。５ＨＴを含むニューロン及び後脳のマウスナーニューロン、脊髄のＧＡＢＡ作動性介在及び運動ニューロン、神経堤由来後根神経節及びＮＡアーチ関連ＣＡ（ＡＡＣ）細胞の多くの他の場合には、foggy突然変異体において正常に発生した。位置クローニングは、突然変異表現型の分子的な原因が酵母及びヒトＳｐｔ５に構造的に関連する核タンパク質の部位突然変異であることを示した。foggyの生化学分析は、それがｍＲＮＡ転写伸長及の二重調節であること、及び突然変異はその抑制性活性を崩壊させるが刺激性活性は崩壊しないことを明らかにした。まとめると、これらの発見は、実際に転写伸長が脊椎動物の遺伝子発現の主要な調節意義を有すること、及び転写伸長の的確な制御は、転写開始の調節と共に適切な神経発生に不可欠であることの分子的、遺伝的及び生化学的証拠を提供する。出願人はここで、中枢（ＣＮＳ）及び末梢（ＰＮＳ）神経系における多数のニューロンタイプの発達及び識別に選択的に影響するゼブラフィッシュ突然変異を説明する。更なる分子的、遺伝的及び生化学的分析は、突然変異の表現型が転写伸長におけるｚＳｐｔ５の抑制性機能を崩壊させるが刺激性機能は崩壊させない突然変異によって引き起こされることを示す。これらの発見は、転写伸長の調節が神経発生の間における遺伝子発現の必須の生理的制御段階を構成することを示す。
【００４２】
１．調節された過程としての転写伸長
突然変異foggy表現型は、インビボでの調節された過程としての転写伸長の意義を明らかにする。このタイプの調節は、転写開始の機構に利用できないレベルの制御を提供する。まず、それは環境の変化に対する又は細胞外刺激に対する非常に素速い反応を可能にする。例えば、ショウジョウバエは、その熱ショックタンパク質ｈｐｓ７０転写が、熱さの刺激をなくす抗終結機構により調節されるので熱さに耐えることができ；従って、転写は素速く完了し、タンパク質合成に利用できる。また、転写伸長の調節は、遺伝子転写の進行中の制御を可能にする。例えば、ヒトジストロフィン遺伝子は2000kb以上にわたり、完全に転写するのに５０時間以上かかるだろう。Uptain等, 上掲。転写伸長の段階での干渉なしに、いったん開始され、このような遺伝子の転写は２日以上の間調節されないであろう。逆に、制止されたＲＡＮ Ｐｏｌ ＩＩを有するほとんど完成したｍＲＮＡのプール保持又はジストロフィン転写の終わり近くでの停止は、抗終結シグナルに対する応答において、このタンパク質の素速い生成を可能にするだろう。最後に、転写開始及び伸長因子の組み合わせた使用は、比較的少数の因子での空間的及び時間的遺伝子発現の制御を可能にするであろう。遺伝子発現の柔軟性、素速い反応及び精巧な制御は、神経系の発生の間に特に重要である。結果として、先駆細胞は、細胞外環境の変化を絶えず監視して応答し、数時間の間隔で多大な細胞多様化を達成しなければならない。Anderson及びJan, 1997; Ericson等, 1996, Cell 87: 661-73。
【００４３】
２．foggy突然変異表現型の特異性
出願人は、転写伸長においてＳｐｔ５の阻害性の活性を崩壊するが刺激性の活性を崩壊せず、その結果それらの発生を完成させる特定サブクラスのニューロン及び細胞の不全を生じる部位突然変異をここで説明する。突然変異表現型は、ＣＮＳ及びＰＮＳの両方にわたり、複数のクラスのニューロンに影響する著しく空間的な特異性を与える。例えば、神経堤由来細胞系の中で虹色素胞、メラノサイト、及び交感神経で見ることができるが、後根神経節ニューロンでは見られない。細胞ＣＮＳの場合、ＤＡ及びＮＡにおいて欠陥があるが、５ＨＴ又はマウスナーニューロンでは見られない。欠陥は、ドーパミン、ノルアドレナリン及びアセチルコリン生成ニューロンが全て影響するので、単に一つのタイプの神経伝達物質生成には影響しない。また、所定の神経伝達物質における影響は、ＮＡ産生細胞が後脳（ＬＣニューロン）にないが心臓（ＡＡＣ細胞）近くに通常あるのに対して、５ＨＴ＋ニューロンは視床下部で増加するが後脳では増加しないという事実によって示されるように、特定の領域にあるようにみえる。
【００４４】
時間的に、突然変異は、分化の後ステージ及びおそらくはニューロン識別のサブプログラムに影響するように見える。この結論は幾つかの発見によって支持される。まず、Ｐａｎニューロンマーカー、チューブリンの発現は、４８ｈｐｆ胚で正常にみえる。Guo等, 上掲。第２に、ＬＣ及び交感神経でのＮＡ識別を制御する遺伝子phox2a（Guo等, 1999, Neuron 24: 555-66; Morin等, 1997, Neuron 18: 411-423）を含むホメオボックスは、これらの細胞の前駆体ので正常に発現されるが、その後これらの細胞が任意の神経伝達物質合成酵素を発現する前に消失する。最後に、視床下部において、余分な５ＨＴニューロンが観察されるのは、ＤＡニューロンの犠牲にして得られるようだ。foggyが最終的な神経伝達物質の識別に影響するという考えは、foggyのままであるニューロンはそれらの分化を完了できないという事実によって更に支持される。例えば、foggy視床下部にあるいくつかのＤＡニューロンは低レベルのＴＨを発現する（図１Ｂ及びＣ）が、使い残した無軸索ニューロンは低レベルのＧＡＢＡ合成酵素ＧＡＤを発現するようである（図２Ｅ及びＦ）。
網膜において、複数のニューロンの欠陥が観察され、神経節ニューロンの顕著に低い増加であった。網膜において、神経節ニューロンは最初に、foggyがない場合に神経前駆体が未熟な分化を受け、もはや後者の細胞運命を呈するのに利用できないという可能性を上昇させるようである。視床下部において、欠陥を被ったＤＡニューロン及び過剰に存在する５ＨＴニューロンは、同時に発生するようにみえる（データは示さない）。しかしながら、ニワトリの中脳／後脳領域において、５ＨＴニューロンの発生は、ＤＮＡと５ＨＴの間の発生時期の小さな時間的な違いが魚類にも存在しうることを示唆するＤＮＡ対のもの（未公開データ）に先行する。
【００４５】
３．foggyによる転写伸長の空間的及び時間的調節
foggyは、発生の間に広く発現され、生体では偏在して発現されるようである。Yamaguchi等, 上掲。さらに、ＤＳＩＰに依存する活性を有する薬剤ＤＲＢは、９５％以上の細胞性Ｐｏｌ ＩＩ転写のｍＲＮＡ合成を阻害し（Sehgal等, 1976, Cell 9:473-80）、Ｓｐｔ４及びＳｐｔ５は、クラスＩＩ遺伝子の全部ではないがそのほとんどの転写調節に関与することを示唆する。にもかかわらず、foggy突然変異は、選択的な発生の変化を生じ、遺伝子のあるサブセットにのみ影響するようである。細胞型に特異的な細胞運命変化を引き起こす、広く発現されるタンパク質における突然変異現象がしばしば見られるが、これについてはよく分かっていない。例えば、ＣＮＳで広く発現されるオルファンステロイドレセプターＮｕｒｒＩの崩壊は、マウスの中脳ＤＡニューロンの欠損を制限させる。Saucedo-Cardenas等, 1998, Proc. Natl. Sci. USA 95: 4013-4018; Zetterstrom等, 1997, Science 276: 248-250。同様に、広範囲に分布するＥＧＦ関連分子、on-eyed pinheadは、これらの組織でともに発現されるのう胚形成の間でさえも、脊索前板において欠陥を引き起こすが、脊索では引き起こされない。Zhang等, 1998, Cell 92:241-51。
【００４６】
foggyの細胞特異的表現型について少なくとも３つの可能性のある解釈がある。まず、foggy突然変異は、推定上のfoggy/zSpt5ファミリーメンバーによって、又はfoggy ｍＲＮＡの母性寄与によって補われる。あるいは、広く発現されるが、foggy/zSpt5は遺伝子のあるサブセットのみに生理的に影響することができ、それについて伸長は律速段階となる。この可能性との一致するのは、伸長率を低下させるＰｏｌ ＩＩの突然変異はショウジョウバエのホメオティック形質転換を引き起こすという発見である。Chen等, 1993; Mol.Cell. Biol. 13:4214-22; Coulter及びGreenleaf, 1985, J. Biol. Chem. 260: 13190-8。最後に、fogg/zSpt5の発現よりもむしろ活性又は核局在化が、組織又は時間的に特有の様式で、又は細胞外シグナルに応答して他の因子に依って調節されうる可能性がある。突然変異は、foggy/zSpt5の阻害的機能に影響するので、観察された表現型は、遺伝子の異常な発現に依って引き起こされ、その転写は早すぎる終結によって正常に制限又は封じられるようである。ふさわしくない細胞型での、又は不適切な発生段階の間のこのような遺伝子の過剰発現は、ニューロンの欠損を生じうる。foggy表現型の特異性は、影響する遺伝子がハウスキーピングタンパク質よりもむしろ調節性のタンパク質をコードするらしいということを説明する。発生異常が観察されるものを統一する背景にあるメカニズムのより深い理解は、foggy/zSpt5標的遺伝子の同定を必要とするだろう。
【００４７】
foggyは全てのＰｏｌ ＩＩ遺伝子の転写に影響する能力を有するけれども、幾つかの筋の証拠は、それは遺伝子発現における調節性の役割を正常に果たすことを示唆する。第１に、foggy/zSpt5並びにその哺乳動物相同体は、インビトロで転写伸長に必要とされない（図８）。第２に、foggy/zSpt5は、転写伸長で二重の影響を有するようであり、異なる環境条件でネガティブな又はポジティブな調節物質として働くことができる（それぞれ、ＤＲＢ又は低濃度のヌクレオチドの存在、図８）。第３に、foggy/zSpt5突然変異がその阻害性の活性を失うという事実は、表現型がＲＮＡ転写を広げるＰｏｌ ＩＩの根本的な不能の結果ではないことを説明する。
Ｓｐｔ５は、Ｓｐｔ４、Ｐｏｌ ＩＩの大サブユニット及びＮＥＬＦタンパク質複合体に結合し、この相互作用によってＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩによる転写伸長を阻害することが示された。Ｓｐｔ５はＰｏｌ ＩＩのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）に結合しないが、その阻害活性は、ＤＲＢ感受性キナーゼＰ-ＴＥＦｂによるＣＴＤのリン酸化によって相殺される。
【００４８】
ｈＳｐｔ５の構造機能分析（Yamaguchi等, 上掲）は、アミノ酸１７６−２７０がＳｐｔ４への結合をもたらすが、アミノ酸３１３−４３０はＰｏｌ ＩＩへの結合に必要であることを示した。Ｓｐｔ５のＣ末端ドメインの機能は、これまで分かっていなかった。本出願は、１０１２位のｚＳｐｔ５の１つのアミノ酸（ｈＳｐｔ５のアミノ酸１０１４に相当する）置換は、ＤＳＩＦのネガティブな機能を不活性化することを実証する。Ｓｐｔ５のＣ末端ドメインの可能性のある機能は、Ｓｐｔ５の阻害性の活性に重大に要求されるＮＥＬＦ複合体の結合ドメインとしてのものである。Yamaguchi等, 上掲。あるいは、Ｃ末端ドメインは転写伸長の未確認の調節物質に結合されうる。１つの可能性としては、ＤＳＩＦ/ＮＥＬＦ複合体は、細菌のＮｕｓＡ/Ｎｕｍ複合体のように機能しうる。細菌において、ＮｕｓＡタンパク質は、大腸菌ファージＨＫ０２２伸長阻害Ｎｕｍによって転写の終結が活性化されることを示し、それは、ＮｕｓｅＡの存在下においてＤＮＡ及びＲＮＡの両方に結合し、その二重鎖ＤＮＡ鋳型に対する発生期の転写を停止する。Watnick及びGottesman, 1999, Science 286:2337-2339。４つのＮｕｓ相同性ドメイン及びＮＥＬＦを含み−その後者はＲＮＡ結合成分を含むＳｐｔ５は、それぞれ同様のメカニズムによって作用しうる。Yamaguchi等, 上掲。あるいは、Ｓｐｔ４と結合したＳｐｔ５、ＮＥＬＦ、、転写伸長及びタンパク質Ｓｐｔ６に結合するクロマチン及びＳｐｔタンパク質の更なるメンバーは、ヒストンのコンパクト化及び構造化に影響し、ヌクレオソームによってＰｏｌ ＩＩの移動を抑制する。Bortvin及びWinston, 1996, Science 272: 1473-6; Compagnone-Post及びOsley, 1996, Genetics 143: 1543-54; Swanson及びWinston, 上掲。その阻害性の活性に加えて、Ｓｐｔ５は、低いヌクレオチド濃度で転写伸長の刺激物質として働く。驚くべきことに、このＳｐｔ５の刺激性の活性は、突然変異に保持される。これらの発見は、Ｓｐｔ５の阻害性及び刺激性の活性が別個のドメインにある、又はＳｐｔ５の刺激性の機能がＮＥＦＬと無関係であるという見解を支持する。
【００４９】
４．外因性シグナルによるfoggyの調節
多くのシグナル伝達経路及び細胞外刺激による転写開始の制御の十分な証拠があるが、これまで、唯一報告された多細胞生物の転写伸長と外来因子の間のつながりは線虫のNotchシグナルの研究に由来する。Notchシグナル伝達システムは、ニューロンになるか表皮細胞になるか、神経節細胞、円錐又は棒状光受容体として発達するか、及び定められた神経堤由来細胞運命をとるかの決定を含む細胞運命の選択を複合的に、時には二つに関与する。Notchによるシグナル伝達の一般的なモデルは、次のリガンド結合を切断するその細胞質ドメイン、及び無毛の転写開始因子（Ｓｕ(Ｈ)）の相同体の間の直接的な相互作用に関与する。しかしながら、Ｓｕ(Ｈ)に加えて、NotchはＮＦ-κＢ、Groucho、及びMastermind等の転写開始の他の活性化物質又はサプレッサーによって（Artavanis-Tsakonas等, 上掲; Lewis, 1998, Sem. Cell Devel. Biol. 9:583-9; Milner及びBigas, 1999, Blood 93: 2431-2448）並びに未だ同定されていない因子によってシグナル伝達に媒介する用である。Shawber等, 1996, De el. 122:3765-3773; Wang等, 1997, Devel. 124: 4435-46。
【００５０】
興味深いことに、線虫のNotchの下流に作用する酵母の２ハイブリッドスクリーニング同定成分はNotchがＥＭＢ-５、Ｓｐｔ６の虫相同体と物理的に相互作用することを示す。更に、遺伝的研究は、ＥＭＢ/Ｓｐｔ６の突然変異が細胞運命の決定での構成的活性又は突然変異したNotchの浸透度に影響することを立証した。Hubbard等, 1996, Science 273: 112-5。Ｓｐｔ６及びＳｐｔ５は遺伝的及び物理的に相互作用するという報告（Swanson及びWinston, 1992, 上掲）と一緒に考えると、これらの発見は、Ｓｐｔ５活性はNotchの経路の下流媒介物質でありうるという可能性を上昇させる。あるいは、ＦＧＦタンパク質ファミリーの哺乳動物のメンバーは、中脳のＤＡニューロンの代償として５ＨＴニューロンを誘導することが示された（Ye等, 1998, Cell 93:755-66）ので、foggy/zSpt5はＦＧＦシグナル伝達システムに関連する可能性がある。
【００５１】
Ｂ．foggy変異体
ここに記載した全長天然配列foggyポリペプチドに加えて、foggy変異体も調製できると考えられる。foggy変異体は、foggy ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のfoggyポリペプチドを合成することにより、調製できる。当業者であれば、グリコシル化部位の数又は位置を変えたりあるいは膜固着特性を変えるように、アミノ酸変化がfoggyの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列foggy又はここに記載したfoggyの様々なドメインにおける変異は、例えば米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の何れかを用いてなすことができる。変異は、天然配列foggyと比較してfoggyのアミノ酸配列が変化することになるfoggyをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一つのアミノ酸のfoggyの１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。アミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されうるかの指針は、foggyの配列を、相同な既知のタンパク質分子のものと比較し、相同性の高い領域になされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出されうる。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学的性質を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、得られた変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定されうる。
【００５２】
foggyポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ末端又はＣ末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、foggyポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
foggy断片は、多くの一般的な技術の任意のものによって調製されうる。所望のペプチド断片は化学合成されてもよい。代替方法は、酵素での消化、例えば特定のアミノ酸残基によって定まる部位でタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによりfoggy断片を産生することを含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーに用いられる。好ましくは、foggyポリペプチド断片は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示した天然foggyポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特定の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換との表題で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と標記され、又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
【００５３】
表６

【００５４】
foggyポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(２)中性の親水性：cys, ser, thr;
(３)酸性：asp, glu;
(４)塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：gly, pro; 及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
【００５５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野において公知の技術を使用して行わせることができる。部位特異的突然変異誘発［Carterら, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wellsら, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術が、foggy変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析法を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。典型的には、アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085 (1989)］。アラニンもまた最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の両方に見いだされることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５６】
Ｃ．foggyの修飾
foggyの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つのタイプは、foggyポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、foggyの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性剤での誘導体化は、例えば、抗foggy抗体の精製方法及びその逆で用いるためにfoggyを水不溶性支持体マトリクスあるいは表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸エステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミデート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., サン フランシスコ, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５７】
本発明の範囲に含まれるfoggyポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」は、この目的に対しては、天然配列foggyに見いだされる１つ又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び／又は天然配列foggyに存在していない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味することが意図されている。さらに、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
foggyポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１つ又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列foggy(Ｏ-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。foggyアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、foggyポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
foggyポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に公開された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 (1981)に記載されている。
【００５８】
foggyポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
foggyの共有結合的修飾の他の型は、foggyポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
また、本発明のfoggyは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したfoggyを含むキメラ分子を生成するように修飾されてもよい。
【００５９】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとfoggyとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはfoggyのアミノ末端又はカルボキシル末端に位置する。このようなfoggyのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってfoggyを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は当該分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体［Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinら, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
別の実施態様では、キメラ分子はfoggyの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一つの可変領域に代えてfoggyポリペプチドの可溶性(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００６０】
Ｄ．foggyの調製
以下の説明は、主として、foggy核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりfoggyを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてfoggyを調製することもできると考えられる。例えば、foggy配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成法によって生産してもよい［例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動の技術又は自動によるインビトロタンパク質合成法を実施してもよい。自動合成法は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスターシティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示により実施することができる。foggyの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長foggyを生産してもよい。
【００６１】
１．foggyをコードするＤＮＡの単離
foggyをコードするＤＮＡは、foggy ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトfoggy ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またfoggy-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、関心ある遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(foggyに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。foggyをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００６２】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【００６３】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したfoggy生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＰＯ_４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６４】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１，４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１，５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７，３２５)及びＫ５７７２(ＡＴＣＣ５３，６３５)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａｎ^rを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎ^ｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、foggyコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス セレビシエは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981];１９８５年５月２日公開のＥＰ １３９，３８３)；クルベロミセス ホスツ(Kluyveromyces hosts)(米国特許第４，９４３，５２９号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばケー・ラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol. 154(2): 737-742 [1983])、ケー・フラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ １２，４２４)、ケー・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ １６，０４５)、ケー・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ ２４，１７８)、ケー・ワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ５６，５００)、ケー・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ ３６，９０６; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケー・テモトレランス(K. thermotolerans)及びケー・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(ＥＰ ４０２，２２６)；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(ＥＰ １８３，０７０; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(ＥＰ ２４４，２３４)；アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(１９９０年１０月３１日公開のＥＰ ３９４，５３８)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(１９９１年１月１０日公開のＷＯ ９１／００３５７)；及びコウジ菌、例えばアスペルギルス ニダランス(Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００６６】
グリコシル化foggyの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００６７】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
foggyをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
foggyは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるfoggy-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日公開のＥＰ ３６２１７９)、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６８】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞の適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、foggy-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub らにより, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcombら, Nature, 282：39(1979)；Kingmanら, Gene, 7：141(1979)；Tschemperら, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００６９】
発現及びクローニングベクターは、通常、foggy-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Changら, Nature, 275:615 (1978)；Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で用いるプロモーターもまたfoggyをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hessら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７０】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターはＥＰ ７３，６５７に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのfoggy転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ ２，２１１，５０４)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００７１】
より高等の真核生物による所望のfoggyをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作用要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、foggyコード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、foggyをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのfoggyの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); ＥＰ １１７，０６０; 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【００７２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列foggyポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はfoggy ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７３】
５．ポリペプチドの精製
foggyの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。foggyの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
foggyを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びfoggyのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のfoggyの性質に依存する。
【００７４】
Ｅ．foggyの一般的な用途
foggyをコードするヌクレオチド配列(又はそれらの補体)は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、foggy核酸も、ここに記載される組換え技術によるfoggyポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列foggy遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、全長foggyｃＤＮＡの単離又はＦｉｇ．１（配列番号：１）に示したfoggy配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、foggyの天然に生じる変異体又は他の種からのfoggyをコードするもの)の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に配列番号：１のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列foggyのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、foggy遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、^３２Ｐ又は^３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のfoggy遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【００７５】
本出願で開示する任意のＥＳＴ配列はプローブとして、ここに記載した方法で用いることができる。
foggy核酸の他の有用な断片は、標的foggyｍＲＮＡ(センス)又はfoggy ＤＮＡ(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、foggy ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krolら(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、foggyタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖-ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、ＷＯ ９１／０６６２９に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【００７６】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ_４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２(Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス)、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター(ＷＯ ９０／１３６４１参照)を含む。
【００７７】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は一般に、少なくとも約５塩基の長さ、約１０塩基の長さ、約１５塩基の長さ、約２０塩基の長さ、約２５塩基の長さ、約３０塩基の長さ、約３５塩基の長さ、約４０塩基の長さ、約４５塩基の長さ、約５０塩基の長さ約５５塩基の長さ、約６０塩基の長さ、約６５塩基の長さ、約７０塩基の長さ、約７５塩基の長さ、約８０塩基の長さ、約８５塩基の長さ、約９０塩基の長さ、約９５塩基の長さ、約１００塩基の長さである。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したfoggyコード配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、foggyをコードするヌクレオチド配列は、そのfoggyをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【００７８】
foggyのコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、foggyがレセプターである場合)、foggyは、結合性相互作用に係る他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターfoggyは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然foggy又はfoggyのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施することができる。
【００７９】
また、foggy又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、foggyをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりfoggyをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、foggyをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのfoggy導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたfoggyコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はfoggyをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【００８０】
あるいは、foggyの非ヒト相同体は、動物の胚性幹細胞に導入されたfoggyをコードする変更ゲノムＤＮＡと、foggyをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、foggyをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するfoggy「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、foggyをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、foggyをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。foggyをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【００８１】
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【００８２】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である(Dzauら, Trends, in Biotechnology 11, 205-210[1993])。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【００８３】
ここに記載したfoggyポリペプチドはまた、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したfoggyポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各foggy核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のfoggyポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のfoggyポリペプチドは一方の組織で、好ましくは同組織型の正常組織に比べて病的な組織で他方に比較して異なる発現をする。foggy核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したfoggyポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のfoggyポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このfoggy生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A. Ed., (1980))、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【００８５】
foggyポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(ｒｈＧＨ)、インターフェロン(ｒｈＩＦＮ-)、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; ＷＯ ９７／０３６９２，ＷＯ ９６／４００７２，ＷＯ ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００８６】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸(ＰＬＧＡ)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、foggyポリペプチドを模倣又は増大させる(アゴニスト)、又はfoggyポリペプチドの効果を予防又は阻害する(アンタゴニスト)を同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるfoggyポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
【００８７】
このアッセイは、この分野で知られた技術である、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるfoggyポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるfoggyポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるfoggyポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００８８】
候補化合物が相互作用するここに同定した遺伝子にコードされる特定のfoggyポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者ら（Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)）に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER（商品名）)は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【００８９】
ここで同定されたfoggyポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【００９０】
アンタゴニストをアッセイするために、foggyポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、foggyポリペプチド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力が化合物がfoggyポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、foggyポリペプチド及び膜結合foggyポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。foggyポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプターに結合したfoggyポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがfoggyポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はfoggyポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したfoggyポリペプチドに暴露する。foggyポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【００９１】
レセプター同定の代替的方法として、標識foggyポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識foggyポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとfoggyポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってfoggyポリペプチドの作用を競合的に阻害するfoggyポリペプチドの変異形態であってもよい。
【００９２】
他の潜在的なfoggyポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟foggyポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 ; Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりfoggyポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: ボーカラトーン, フロリダ, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、foggyポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００９３】
潜在的アンタゴニストは、foggyポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりfoggyポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
また、ここで開示した分子の診断的及び治療的使用は、以下に開示及び説明される潜在的な機能的アッセイのヒットに基づきうる。
Ｆ．抗foggy抗体
本発明は抗foggy抗体を更に提供する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【００９４】
１．ポリクローナル抗体
抗foggy抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、foggyポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９５】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗foggy抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはfoggyポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する１つ又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００９６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、foggyに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００９７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００９８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；上掲のMorrisonら］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００９９】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗foggy抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１００】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学刊行物：Marksら, 1992, Bio/Technology 10, 779-783; Lonbergら, 1994, Nature 368 856-859; Morrison, 1994, Nature 368, 812-13); Fishwildら, 1996, Nature Biotechnology 14, 845-51; Neuberger,1996, Nature Biotechnology 14, 826 ; Lonberg及びHuszar,1995, Intern.Rev. Immunol. 13 65-93 に記載されている。
抗体はまた、上記されているような既知の選択及び／又は突然変異誘発の方法を用いて親和性成熟されうる。好ましく親和性成熟された抗体は、成熟抗体が調製される最初の抗体（一般にマウス、ヒト化又はヒト）よりも５倍、より好ましくは１０倍、更に好ましくは２０又は３０倍高い親和性を有する。
【０１０１】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はfoggyに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１０２】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ')_２二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81(1985) は無傷の抗体をタンパク分解的に切断してＦ(ａｂ')_２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１０３】
大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')_２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１０４】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたfoggyポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗foggyポリペプチドのアームは、特定のfoggyポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のfoggyポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はfoggy結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はfoggyポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(ＴＦ)に結合する。
【０１０５】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１０６】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolffら, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照。
【０１０７】
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートされた抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、α-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例として、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)にコンジュゲートされてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートされた「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【０１０８】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１０９】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるfoggyポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
foggyポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つを越える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、例えば、細胞毒性薬、サイトカイン、化学治療薬又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１１０】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Scienceに開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出性製剤を調製してもよい。持続放出性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第３，７７３，９１９号)、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商品名）(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１１１】
Ｇ．抗foggy抗体の用途
本発明の抗foggy抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗foggy抗体は、foggyの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現（場合によっては、異なる発現）の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位をコンジュゲートさせるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature, 144:945 (1962)；Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗foggy抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのfoggyのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、foggyに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するfoggyを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したfoggy以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、foggyを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示目的でのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１１２】
実施例
実施例において言及されている市販の試薬は、特段の指示がない限り製造者の説明に従って使用された。以下の実施例及び本明細書全体を通じてＡＴＣＣ登録番号により同定される細胞出所は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）, マナサス, バージニアである。
【実施例１】
【０１１３】
Ｉ．例示的な方法：
魚の保存と維持
魚の飼育及び維持は、Guo等, 上掲に記載されるようにして実施した。胚は、２８．５℃ｈで飼育し、Kimmel等, 1995, Dev. Dynam. 203:253-310に従って保存した。
インサイツハイブリダイゼーション及び免疫染色
ＲＮＡプローブをＲＮＡ標識試薬（Boehringer社）を用いて直線上の鋳型から合成した。ＴＨ及び５ＨＴ抗体をChemicon社から購入した。ＦＬＡＧ抗体をKodak社から購入した。Ｚｎ-８（Trevarrow等, 1990, Neuron 4: 669-79）及び抗Ｈｕ抗体（Marusich等, 1994, J. Neurobiol. 25:143-55）をオレゴン大学から入手した。Thomas Jessellにより開発された３Ａ１０モノクローナル抗体を発生研究ハイブリドーマバンク(Developmental Studies Hybridoma Bank)から入手した。インサイツハイブリダイゼーション及び抗体染色を前記のようにして実施した。
【０１１４】
ＡＦＬＰによる非常に関連したＤＮＡ多形の単離
foggy突然変異を有するヘテロ接合のメスの魚（ＡＢ/ＥＫ）を様々な遺伝子的バックグラウンドからのＷＴオスの魚と交雑し（Ｔｕ）、Ｆ１の子孫を成体まで育てた。ヘテロ接合Ｆ１の魚を、姉妹細胞対交配によって同定した。Ｆ２の子孫をヘテロ接合交配から回収し、表現型に基づいて２つのプール（それぞれ４０個体を収容）に分けた：野生型＋ヘテロ接合（ＷＴ＋Ｈｅｔ）及び突然変異（ｍｔ）のプール。遺伝子ＤＮＡをプールの魚から抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩで消化し、合成したＤＮＡアダプターに結合させ、ＰＣＲ分析に使用した。ＰＣＲプライマー（アダプター＋ＥｃｏＲＩ＋ＮＮＮ、アダプター＋ＭｓｅＩ＋ＮＮＮ）を合成し、ジェネンテックオリゴ合成装置によって染色標識し、ＰＣＲ条件は前記のようにした。Vos等, 上掲。ＰＣＲ試料をＡＢＩ自動シーケンサー３１０にかけ、データの結果をＡＢＩ遺伝子スキャン(Genescan)ソフトウェアを用いて分析した。プールの大きさ４０はfoggy遺伝子座まで約２．５ｃＭｓ以内にある多形マーカーの同定を可能にした。
【０１１５】
遺伝子マッピングと位置クローニング
同定したＡＦＬＰマーカーをfoggy突然変異個体での試験に使用して、より正確な遺伝子の距離を定めた：第１に、結合したＡＦＬＰ断片をゲル精製し、クローン化して配列決定した。第２に、配列決定の情報に基づいて、特異的なＰＣＲプライマーを設計し、ほとんどのＡＦＬＰマーカーをＰＣＲ断片長の多形又は一本鎖高次構造多形に変換した。ＡＦＬＰマーカーをマイクロサテライト遺伝子マップ上に位置づけした。次いで２つの最も近接して結合したＡＦＬＰマーカーに相当するＰＣＲプライマーを、標準的なＰＣＲ条件を用いて、マイクロアレイしたＢＡＣライブラリ（Genome Systems社）及びＹＡＣライブラリ（Research Genetics社）に使用した。ＹＡＣ及びＢＡＣ ＤＮＡを製造業者の使用説明書に従って単離し、自動サイクルシーケンサー（ＡＢＩ社）で末端を配列決定した。特定のＰＣＲプライマーを末端の配列に従って設計し、放射線ハイブリッドパネルを用いて試験し（Geisler等, 1999, Nature Genetics 23: 86-9; Hukriede等, 1999, Proc. Natl. Acad. Scil USA 96: 9745-50）、全てのfoggy領域が遺伝子ＤＮＡクローンに覆われるまでＢＡＣライブラリをスクリーニングし続けるように使用した。
【０１１６】
ＢＡＣｓ及びｃＤＮＡｓでの形質転換レスキュー
個々のＢＡＣのＤＮＡをfoggyヘテロ接合交配から誘導した１〜４の細胞ステージのゼブラフィッシュ胚に40-60ng/μlの濃度で注入した。注入した胚を４８時間まで発生させ、解剖顕微鏡下で調べ、ＴＨ抗体を用いて免疫組織化学を実施した。染色パターンの調査及び写真撮影の後に、遺伝子ＤＮＡを個々の胚から抽出し、foggy遺伝子座に強く結合したＰＣＲプライマーを用いて遺伝子型の決定に使用した。foggy突然変異表現型をレスキューしたＢＡＣ Ｂ１０８Ｊ１１をＥｃｏＲＩで消化し、ｐ３２でランダムプライマー化して３３時間胚のゼブラフィッシュｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。全長ｃＤＮＡをβアクチンプロモーターを含むベクターにクローン化し、15-30ng/μlの濃度で胚に注入し、上記のようなレスキューについて分析した。
【０１１７】
配列分析及び突然変異の検出
配列分析をUnixシステム及びジェネンテックバイオインフォマティクスグループによって開発されたソフトウェアで実施した。突然変異の検出、遺伝子特異的プライマーを約５つのfoggy突然変異及びＷＴ姉妹胚のプールから遺伝子ＤＮＡを増幅するのに使用した。突然変異及びＷＴ姉妹胚からのＰＣＲ産物（３つの別々のセット）を自動サイクルシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて直接配列決定した。突然変異及びＷＴ姉妹胚からのｃＤＮＡをＲＴ-ＰＣＲによって合成し、配列決定した。部位特異的突然変異をStratagene社の試薬を用いて実施し、１つのヌクレオチドの変化Ｔ→Ａを導入した。誘導した突然変異を含むｃＤＮＡをアクチンプロモーターの後にクローン化し、前記したようにして形態形質転換レスキューをアッセイした。
ＣＯＳ-７細胞のタンパク質発現
ＣＯＳ-７細胞を1mlのマイクロタイター皿に約６０％コンフルエンスで蒔き、ＦＬＡＧをタグしたＷＴfoggyｃＤＮＡ又は突然変異foggyｃＤＮＡを含む1μgのプラスミドをＧＩＢＣＯ-ＢＲＬ試薬を用いてトランスフェクトした。２４時間後、細胞を固定し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫染色した。
【０１１８】
転写アッセイのための組換えタンパク質
ＮｄｅＩ部位をＰＣＲ突然変異によってzfSpt5 ORFの５'末端で切断した。ＮｄｅＩ(一部)-全長を含むＮｏｔＩ断片、野生型又は突然変異ＯＲＦをｐＥＴ-１４ｂ（Novagen社）のＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ部位に挿入し、pET-agSpt5 ＷＴ及びpET-zfSpt5 mtを生産した。ヒスチジンをタグしたzfSpt5タンパク質の発現及び精製を上記のようにして実施した。Yamaguchi等, 1999, Cell 97:41-51。簡略すると、ライセートをそれぞれpET-zfSpt5 mtで形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から調製した。His-zfSpt5タンパク質をＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、全長ポリペプチドをゲル薄片から回収した。
転写アッセイ
欠乏/添加(add-back)アッセイを上記のようにして実施した。Wada等, 上掲。表示された量のhSpt4及びhSpt5、又はＷＴ又は突然変異sfSpt5の何れかを、抗DSIF p160/hSpt5モノクローナル抗体を用いて免疫枯渇したＨｅＬａ核抽出物（2μl）に戻し添加した。ＰＴＦ３-６Ｃ２ＡＴ（25ng）又はｐＳＬＧ４０２（125ng、Lee及びGreenleaf, 上掲）を鋳型に使用した。４５分のインキュベーション後、転写を50μMのＤＲＢと共に又はそれなしにＮＴＰｓの添加によって表示された時間で開始を行った。ｐＳＬＧ４０２については、低いＮＴＰの濃度（30mMのＡＴＰ、30mMのＧＴＰ、300mMのＣＴＰ、2.5mMのＵＴＰ）を使用した。Ｇなしの転写を精製し、８％の尿素ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１９】
ＩＩ．結果：
顕著なニューロン集合の欠損又は過剰に対するfoggy突然変異の誘導
神経発生に影響するゼブラフィッシュ突然変異を、ＤＡ及びＮＡニューロンの複合グループの分子マーカーとして神経伝達物質合成酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を使用する遺伝子スクリーニングで事前に単離した。Guo等, 上掲。foggyを表す突然変異の一つは形態学的に正常に現れる（図１Ａ及びＢ）が、このようなニューロンが最初に典型的に現れるような場合に視床下部のＤＡニューロンにおいて２８ｈｐｆ（受精を達成する時間）の早期に回復不能な欠陥を被る。欠陥は、ＴＨ及びＤＡニューロンの数の減少及び幾つかの残ったＤＡ細胞体におけるＴＨレベルの低下に示されるように（図１Ｃ及びＤ）、４８ｈｐｆまでにさらに顕著となる。ゼブラフィッシュの胚において、５ＨＴニューロンのグループは視床下部ＤＡニューロンに極めて近くに発生する（図１Ｅと図１Ｃの比較）。これは、foggy突然変異の５ＨＴニューロンの運命に関心をよせた。ＷＴの魚において、５ＨＴ＋ニューロンはまず２２−２８ｈｐｆの間に現れる。続いて、４８ｈｐｆまでにそれらは５−７のニューロンの２つの別々のクラスターを構成し、それはＤＡニューロンの内側の背側視床下部/後結節となる（図１Ｅ、１Ｇ）。驚くべきことに、ＴＨ＋ＤＡニューロンの数はfoggy視床下部の何れかの側で約17+/-3から約8+/-2に減少するが、５ＨＴ＋ニューロンの数はこの位置で約6+/-1から約15+/-2までおよそ２倍となった（図１Ｆ、１Ｈ）。驚くべきことに、foggy突然変異でのＴＨ及び５ＨＴの免疫蛍光二重標識は、幾つかのニューロンが両方のマーカーにポジティブであることを示した（図１Ｈ）。ＴＨ及び５ＨＴの両方を発現するニューロンはＷＴ胚では見られなかった（図１Ｇ）。foggyはＤＡ及び５ＨＴニューロンに別々に影響する可能性を形式的に排除することができなかったが、これらの発見は、視床下部ＤＡ及び５ＨＴニューロンが通常の前駆体から誘導され、foggy突然変異がこの系において細胞運命の決定を有しうることを示唆する。視床下部とは対照的に、foggy後脳の５ＨＴ＋ニューロンは正常に発生した（図１Ｉ-Ｊ）
【０１２０】
欠損がＴＨ＋ＤＡニューロンにおいて観察された他の脳の領域は網膜であった（図２Ａ-Ｂ）。網膜は、外因性の合図に応答して共通の前駆体から順次特定化される、主に６つに分類されるニューロンを含む。Cepko,1999, Curr. Opin. Neurobiol. 9: 37-46。網膜神経節ニューロンがまず現れ、続いて錐体光受容体、水平細胞無軸索介在ニューロン、杆体光受容体及び双極ニューロンが現れる。ＴＨ＋ＤＡ無軸作介在ニューロンは更なる試験又はfoggy突然変異網膜の他のニューロンを保証した。分析は、foggyがレドプシン＋錐体（図２Ｃ-Ｄ）及びロドプシン＋杆体光受容体並びにＧＡＢＡ＋無軸索介在ニューロン（図２Ｅ-Ｆ）に欠陥を与えることを明らかにした。興味深いことに、網膜で発達する最初の細胞タイプである神経節の数は正常に現れ、更に増加するものもありうる（図２Ｇ-Ｈ）。網膜とは対照的に、レンズ及び視神経の分化は、組織学的に（示さない）及びγ-クリスタリンの発現（図２Ｉ-Ｊ）によって判断されるように、foggy突然変異胚において正常に現れた。foggy網膜の組織学的分析は４８ｈｐｆ（示さない）で層状組織は全体的に正常であり、７２ｈｐｆ（図２Ｋ-Ｌ）で光受容体及び無軸索細胞はともに正常であったことを明らかにした。
【０１２１】
さらに、foggyは後脳の青斑核（ＬＣ）でＴＨ＋ＤＢＨ＋ＮＡニューロンを発生しなかったが、後脳マウスナーニューロン（図３Ｉ-Ｊ）、脊髄ＧＡＢＡ＋介在ニューロン（図３Ｍ-Ｎ）及び脊髄運動ニューロン（データは示さない）の正常補体を有していた。神経堤由来交換ＮＡニューロン（図３Ｃ-Ｄ）もないが、神経堤由来後根神経節感覚ニューロンは正常に現れる（図３Ｋ-Ｌ）。心臓の近くにあるＮＡ細胞の一つのグループであるＴＨ＋、ＤＢＨ＋アーチ関連細胞（ＡＡＣ）は、foggy突然変異において正常なままであった。Guo等, 上掲。ＮＡニューロンの同定の獲得に必要である転写因子Phox2a（Guo等, 1999, Neuron 24: 555-66; Morin等, 1997, Neuron 18:411-423）は、ＬＣ初期前駆体で正常に発現した（図３Ｅ-Ｆ）。しかしながら、成熟ＬＣ及び交感ニューロンは存在すべきである領域にほとんどなかった（図３Ｇ-Ｈ及びデータは示さない）。しかしながら、２４、４８、６０及び７２ｈｐｆで全ての胚のトンネル染色により、異常な細胞死は検出されなかった（データは示さない）。神経系の外側で、foggy胚は２８ｈｐｆでの外観検査により野生型（ＷＴ）姉妹細胞から識別できなかった。この発生段階で、それらはまた、局所的なマーカーソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、線維芽成長因子-８（Ｆｇｆ８）、Ｏｔｘ１、Ｏｔｘ２及びＫｒｏｘ-２０の正常な発現パターンを示した（データは示さず）。４８ｈｐｆfoggy胚はまた、組織学的に正常な脊索、脊髄、体節(somits)、耳胞、目、口陥入、肝臓の内胚葉原基、前腎、卵黄嚢、心臓、血液細胞、咽頭弓、脳及び脳室を有していた（データは示さない）。７２ｈｐｆまで、ほとんどの組織及び器官が正常なままであるが、胚は神経堤由来メラノサイトの減少、循環の阻害により拡大した心膜、薄い心筋壁、小さい目及び小さい体格を示した（図１Ａ及びＢ、２Ｍ及びＮ及びデータは示さない）。まとめると、foggyは、それらが神経伝達物質の合成酵素を発現する前の段階で中枢及び末梢神経系の多種類のニューロンの正常な発生に不可欠であるという考えが、突然変異表現型によって構成される。
【０１２２】
foggy遺伝子の単離
foggy遺伝子は、foggy遺伝子座に接近して結合した多形ＤＮＡマーカーのゲノムワイドサーチを可能にする、ＡＦＬＰ（増幅断片長多形、Vos等, Nucl.Acids Res. 23: 4407-14）と呼ばれるＤＮＡフィンガープリンティング技術によって単離した（図４Ａ）。２つのＡＦＬＰマーカー、ETACMTCT155及びETACMGAT270が単離され、foggy遺伝子座に強く結合されたことが分かった（試験された２００の別々の突然変異から０の組換え）。約５０００の別々の突然変異の更なる系列は、各ＡＦＬＰマーカーがfoggy遺伝子座の何れかの側で0.06+/-0.02cM離れていることを明らかにした。ＡＦＬＰ分析の過程の間に、２０００マイクロサテライトマーカーからなる遺伝子マップが発表された。Shimoda等, 1999, Genomics 58:219-32。ＡＦＬＰマーカーは、このマップ上に位置し、染色体１５にfoggy遺伝子座を配置させる。残念ながら、この領域の染色体１５にある利用可能な全てのマイクロサテライトマーカーは、foggy遺伝子座から1cM離れてマッピングされた（図４Ｂ）。よって、ＡＦＬＰにより、我々が多形ＤＮＡマーカーETACMTCT155及びETACMGAT270の間にあるとしてfoggy遺伝子座の間隔を同定していた遺伝子マッピング及び結合分析は、それが0.12+/-0.04cMの遺伝子距離を有することが決定された。
【０１２３】
酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、ＢＡＣｓ及びＰＡＣｓからなる遺伝子クローンを２つのＡＦＬＰマーカーを用いて単離した。これらの大きなＤＮＡクローンの端を配列決定し、完全長foggy遺伝子座にかかる更なるクローンを単離するために使用した（図４Ｂ）。精密な細胞系譜解析を、ＢＡＣ/ＰＡＣ末端配列決定により同定されたＰＣＲ断片長多形（ＰＦＬＰ）又は一本鎖染色体多形（ＳＳＣＰ）を用いて実施した。この分析によって、４つのＢＡＣｓにわたる間隔にfoggy遺伝子座を位置づけすることができた。Ｂａｃがfoggy遺伝子を含むことを決定するために、レスキュー実験をYan等, 1998, Genomics 50:287-9に記載されているようにして実施した。ＢＡＣクローン（表１）をfoggyヘテロ接合交配から誘導された１又は２細胞段階のゼブラフィッシュ胚に注入し、胚を約４８ｈｐｆでＴＨ＋ＤＡ及びＮＡニューロンの出現をＴＨ抗体で免疫組織化学により分析した。ＢＡＣ Ｂ１０８Ｊ１１及びＢＡＣ Ｂ３５Ｉ１１は、ホモ接合foggy突然変異にメラノサイト並びにＴＨ＋ＤＡ及びＮＡニューロンの正常な発生の修復を可能にし（図５Ｂ、表１及びデータなし）、それらがＷＴfoggy遺伝子を含むことを示唆した。完全長ＢＡＣ Ｂ１０８Ｊ１１のショットガン配列決定はfoggy遺伝子であったようである（表１）。この可能性を更に試験するために、この転写単位に相当する全長ｃＤＮＡを単離し、ゼブラフィッシュβアクチンプロモーターを含むベクターでｃＤＮＡをクローン化させ（Higashijima等, 1997, Devel.Biol. 192: 289-99）、ゼブラフィッシュ胚内の構築物を単離した。ｃＤＮＡはfoggy突然変異胚を正常な発生に修復することができ（表１）、この転写単位がfoggy遺伝子に相当することを強力に立証した。このｃＤＮＡの異所性発現は、ＷＴ胚の発生を妨げなかった（データは示さない）。
【０１２４】
foggyは転写伸長の調節物質Ｓｐｔ５に相同な広発現核タンパク質をコードする
ｃＤＮＡレスキューのＤＮＡ配列決定分析及びデータベース検索は、推定上のfoggyタンパク質が１０８４アミノ酸残基を含み（図６Ａ）、酵母Ｓｐｔ５と相同性を有する進化的に保存されるファミリーのタンパク質に属する（図６Ｂ）ことを明らかにした。Swanson等, 上掲。インビトロ研究は、このタンパク質ファミリーが転写伸長のポジティブとネガティブ両方の調節物質として機能することを示唆したが、脊椎動物で使えるこの役割についての証拠はなかった。foggyは１０５のアミノ酸のＮ末端酸性領域を含み、その５３がＡｓｐ又はＧｌｕの何れかであり（図６Ａ）及びその中心のドメインは未知の機能を有するＮｕｓＢ/ＫＯＷからなる。同様のＮｕｓＧ/ＫＯＷドメインが、転写伸長を調節する原核生物ＮｕｓＧ（Sullivan及びGottesman, 1992, Cell 68:989-94Sullivan等, 1992, J.Bact.174:1339-44）及び翻訳に関与するタンパク質のクラスで見つかっている。Kyrpides等, 1996, Trends Biochem. Sci. 21:425-6。foggyのカルボキシル末端は、アミノ酸セリン、トレオニン、及びチロシンが多く、潜在的なリン酸化部位を形成し、３つの型のヘキサペプチド反復：4xXTPXYG、2xQTPLHD及び2xNPQTPGを示す。Ｃ末端（から＝１００アミノ酸）は全ての多細胞生物で保存されているが、酵母Ｓｐｔ５にはない（図６Ｃ）。foggy突然変異及びそれらのＷＴ姉妹から作成されたゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの配列決定分析は、ＴからＡへの１つのヌクレオチドの変化を同定し、バリン１０１２からアスパラギン酸へのコードアミノ酸を変化させた（図６Ｄ）。バリン１０１２はこのタンパク質ファミリーの様々な異種間メンバーに完全に保存されたアミノ酸であり、保存されたＣ末端ドメインに位置する（図６Ｃ）。バリン１０１２のアスパラギン酸への突然変異が実際に機能的な因果関係を有しているか、不活性な多形を示さないかどうかを更に認識するために、突然変異を担持する構築物をゼブラフィッシュ胚に注入し、突然変異多形をレスキューする可能性を評価した。ＷＴfoggyｃＤＮＡを突然変異多形を容易にレスキューしたが、１つのヌクレオチド変化を有する構築物は同じ条件で効果がなかった（図１）。まとめると、これらの発見は、単離されたｃＤＮＡが実際にfoggyをコードし、１つのヌクレオチド変化がfoggy突然変異多形をもたらすことを示す。
【０１２５】
foggyを特徴付けするために、発生の間の空間的及び時間的発現パターンを試験した。ホールマウント原位置ハイブリダイゼーションによって、母性foggyｍＲＮＡは初期胚の全ての割球で検出された（図７Ａ）。尾芽期胚（１０ｈｐｆ）において、foggy発現は腹部表皮に低レベルな発現を有して背側神経板に集中している（図７Ｂ）。約２８ｈｐｆで、foggyｍＲＮＡは、他に低レベルの発現で主に発達脳に検出され（図７Ｃ）、その発現パターンはfoggy突然変異胚でも変わりはない（図７Ｄ）。４８ｈｐｆまでに、胚全体にfoggy翻訳の顕著な下方制御がある（図７Ｃと７Ｅの比較）。foggyタンパク質が核に入ることができるか、foggy突然変異が入核を妨害するかどうかを決定するために、哺乳動物Ｃｏｓ７細胞でエピトープタグＷＴ及び突然変異タンパク質を発現させ、免疫蛍光標識によってそれらの細胞下分布を試験した。図７Ｇ-Ｊに示されるように、foggyのＷＴ及びＶａｌ１０１２のＡｓｐ突然変異形態の両方が検出され、foggyが核タンパク質であり、突然変異は核へのタンパク質進入を妨害しないことを示唆した。
【０１２６】
foggyはインビトロの転写伸長を調節し、突然変異形態は抑制物質として選択的に不活性である
また、ＷＴfoggyが実際にＳｐｔ５の機能的相同体であるか、もしそうであればｖａｌ１０１２のＡｓｐ突然変異がその転写活性を妨害するかどうかを分析した。使用したアッセイは、粗製のＨｅｌａ核抽出物における転写阻害化合物ＤＲＢによる転写伸長のＳｐｔ４/Ｓｐｔ５依存性阻害であった。Wada等, 1998, 上掲。大腸菌で発現させて精製したＷＴ及び突然変異foggyは、ヒトの対応物及び互いに対して大きさ及び移動性において同一であるように見えた（図８Ａ）。さらに、ＷＴfoggyは薬剤ＤＲＢに対する応答の修復においてｈＳｐｔ５と同程度の効果があり（図８Ｄ、レーン５及び６）、これら２つのタンパク質は実際に機能的な相同体であるという考えを示唆した。対照的に、９倍高い濃度で添加されても、突然変異foggyは伸長阻害薬剤ＤＲＢ感受性を与えなかった（図８Ｂ、レーン７-１２）。これらのデータは、foggyが転写伸長の抑制物質として生化学的に作用し、１０１２ＶａｌのＡｓｐ突然変異はこの活性を消失させることを示唆する。
【０１２７】
上記されるように、低濃度のＳｐｔ４/Ｓｐｔ５（ＤＳＩＦ）複合体は、転写伸長を抑制するよりもむしろ促進する。Wada等, 上掲。ＤＮＡ鋳型は、ＷＴ及び突然変異ｚＳｐｔ５の可能性のある促進活性を定量するのに使用され（Lee及びGreenleaf, 1997, J. Biol. Chem. 272:10990-10993）、２つのＧなしのカセット、位置＋４０から＋１２４のプロモーター近位８５-ｎｔカセット、及び位置＋１５１２から＋１８８８のプロモーター遠位３７７ｎｔカセットを含む。これら２つのカセットはＲＮａｓｅＴ１消化に耐性があり、Ｇの多い、ＲＮａｓｅＴ１感受性領域で隔てられる。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ及びＲＮａｓｅＴ１消化に続く転写は、２つのカセットが転写物から離れ、ゲル電気泳動により分離することができる。それらの関係は転写の伸長影響に量的に反映される。正常な核抽出物が使用される場合には、転写物の遠位から近位の領域の間のモル比は時間と共に増加し、０．５の値に近づく（図９、レーン１-４；Lee及びGreenleaf, 上掲）。抽出物でのＤＳＩＦの欠乏は伸長能力の有意な減少を生じる。図９Ｃ-Ｄ、レーン５-８。ヒト又はゼブラフィッシュＳｐｔ５を用いたｒＤＳＩＦでの欠乏した抽出物の再構成は、１５分で４．６倍及び２０分で３．８倍まで転写伸長を増大させ、欠乏していない抽出物のレベルまで回復した（図９Ｃ-Ｄ、及びデータは示さない）。驚いたことに、突然変異ｚＳｐｔ５は、このアッセイにおいて伸長促進においてＷＴｚＳｐｔ５と同程度の効果を有し、１５分で４．３倍及び２０分で３．６倍まで伸長能力を増大させた（図９Ｃ-Ｄ、レーン９-１６）。まとめると、これらの結果は、これらの条件下で突然変異foggy/zSpt5が転写伸長のポジティブ制御因子としてではなくネガティブとして作用するその能力を失っていることを示す。
【実施例２】
【０１２８】
大腸菌中でのfoggyの発現
本実施例は、大腸菌での組換え発現によるfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストポリペプチド（「foggy」）の非グリコシル化形態の調製を示す。
foggyをコードするＤＮＡ配列は、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅される。プライマーには、選択される発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位が含まれるべきである。種々の発現ベクターが用いられる。適当なベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivarら,Gene, 2:95 (1977)参照のこと）などである。ベクターは制限酵素で切断し、脱リン酸化する。次いで、このＰＣＲで増幅された配列を、ベクターへライゲーションする。好ましくは、ベクターには、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写停止部位、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列が含まれる。
その後、ライゲーション混合物は、Sambrookら,上掲中に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換させるのに使用される。形質転換体は、ＬＢプレート上での生育能により同定され、抗生物質耐性コロニーが選択される。プラスミドＤＮＡは単離され、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定により配列確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢ培地のような液体培養液中で一晩増殖させることが可能である。この一晩かけて培養した産物は、引き続き、大規模培養に植菌するために使用されてもよい。その後、細胞は所望の吸光度になるまで増殖させ、その間に発現プロモーターが始動される。
さらに数時間細胞を培養した後、細胞は遠心により回収することができる。遠心により得られた細胞ペレットは、当該技術分野において既知の種々の試薬を用いて可溶化することができ、その後、可溶化されたfoggyタンパク質は、当該タンパク質との強固な結合を可能にする条件下にて金属キレートカラムを用い、精製することができる。
【０１２９】
foggyは、以下の方法に従い、ポリｈｉｓタグ形態で、大腸菌中で発現される。foggyをコードするＤＮＡは、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅される。プライマーには選択される発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び有効かつ信頼性のある翻訳開始部位、金属キレートカラムによる迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク切断的除去を提供する他の有用な配列が含まれている。その後、ＰＣＲで増幅され、ポリｈｉｓでタグ化された配列は、発現ベクターに連結され株５２（W3110fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)）由来の大腸菌宿主を形質転換するのに使用される。形質転換体は、最初に、５０ｍｇ/ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ中で、Ｏ．Ｄ．６００に到達するまで３０℃で３−５時間振盪しながら増殖させる。培養物は５０−１００倍にＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ，１．０７ｇのＫＣｌ，５．３６ｇのディフコ イーストエキストラクト，５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦを５００ｍＬの水に溶解し、さらに、１１０ｍＭ ＭＰＯＳ，ｐＨ７．３，０．５５％（Ｗ/Ｖ）グルコース及び７ｍＭ ＭｇＳＯ_４になるように添加する）中にて希釈し、おおよそ、２０−３０時間、３０℃にて振盪させながら増殖させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を検証するために試験サンプルをとり、全培養物は細胞を沈降させるために遠心する。細胞ペレットは、精製及び巻き戻しまで凍結させる。
【０１３０】
０．５から１Ｌの発酵槽からの大腸菌のペースト（６−１０ｇペレット）を１０倍量（Ｗ/Ｖ）の７Ｍ グアニジン，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８のバッファーに再懸濁させる。固体の亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを、各々、最終濃度０．１Ｍ及び０．０２Ｍになるように添加し、溶液は一晩、４℃にて撹拌される。このステップの結果、全てのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質が得られる。溶液は、ベックマンの超遠心機にて４０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心される。上清は３−５倍容量の金属キレートカラムバッファー（６Ｍ グアニジン，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）で希釈され、夾雑物を除くため、０．２２μフィルターを通してろ過される。浄化された抽出液を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍＬのキアゲンＮｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにかける。カラムは、５０ｍＭ イミダゾール（Calbiochem, Utrol grade），ｐＨ７．４を含む別途のバッファーにより洗浄される。タンパク質は２５０ｍＭ イミダゾールを含むバッファーにて溶出される。所望のタンパク質を含む画分がプールされ４℃にて保存される。タンパク質濃度は、タンパクのアミノ酸配列に基づく計算上の吸光係数を用いて吸光度２８０ｎｍにより見積もられる。
【０１３１】
タンパク質は、次のような構成物で構成される新しく調製された巻戻しバッファー中で、サンプルをゆっくりと希釈することにより巻き戻される；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６，０．３Ｍ ＮａＣｌ，２．５Ｍ 尿素，５ｍＭ システイン，２０ｍＭ グリシン，及び１ｍＭ ＥＤＴＡ。巻戻し容積は、最終的なタンパク質濃度が５０から１００ｍｇ/ｍｌの間になるように選択される。巻戻し溶液は、４℃にて１２−３６時間穏やかに撹拌される。巻戻し反応は、ＴＦＡを最終濃度０．４％（ｐＨおよそ３）になるように添加することにより停止される。タンパク質の更なる精製の前に、容積は０．２２μフィルターを通してろ過され、アセトニトリルが最終濃度２−１０％になるように添加される。巻き戻されたタンパク質は、アセトニトリル濃度勾配が１０から８０％である、０．１％ ＴＦＡの移動抽出バッファーを用いて、ＰｏｒｏｓＲ１/Ｈ逆相カラムにてクロマトされる。Ａ２８０の吸収をもつ画分のアリコットがＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析され、均一な巻戻しタンパク質を含む画分がプールされる。通常、適切にも巻き戻されたほとんどのタンパク質は、逆相レジンとの相互作用から遮蔽される疎水性内部を有する最もコンパクトなもののため、これらの種のタンパク質は最も低いアセトニトリル濃度にて溶出される。凝縮体は、通常、高いアセトニトリル濃度にて溶出される。望ましい形態から誤って巻き戻されたタンパク質の形態を分離することに加え、逆相のステップは、サンプルからエンドトキシンをも除去する。
所望の巻戻されたfoggyを含む画分はプールされ、アセトニトリルはタンパク質溶液に直接、窒素を穏やかに吹き付けることにより除去される。タンパク質は、透析又は製剤化バッファーで平衡化されたＧ２５ Superfine(Pharmacia)レジンを用いたゲルろ過、及び滅菌的にろ過されることにより、０．１４Ｍ 塩化ナトリウム，及び４％ マンニトールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ６．８中に製剤化される。
【実施例３】
【０１３２】
哺乳類細胞におけるＰＲＯの発現
本実施例は、哺乳類細胞における組換え発現によりfoggyポリペプチド又はfoggyポリペプチドアンタゴニストの潜在的にグリコシル化された形態の調製を示す。
ベクター、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７，２４７号、１９８９年３月１５日発行を参照のこと）は、発現ベクターとして用いた。 随意に、foggyＤＮＡは、foggyＤＮＡの挿入を可能にするように選択された制限酵素により、Sambrookら,上掲中で記載されているような連結方法を用いて、ｐＲＫ５に連結される。その結果得られるベクターはｐＲＫ５−foggyと呼ばれる。
一の実施態様において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２３９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び、任意に栄養素構成成分及び/又は抗生物質を添加されたＤＭＥＭなどの培養液中、組織培養プレート中でコンフルエントになるまで生育させる。約１０μｇのｐＲＫ５−foggyＤＮＡは、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子（Thimmappayaら,Cell, 31:543 (1982)）をコードする約１μｇのＤＮＡと混合され、５００μｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２２７Ｍ ＣａＣｌ_２， に溶解させる。この混合物に対し、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５），２８０ｍＭ ＮａＣｌ，１．５ｍＭ ＮａＰＯ_４を一滴ずつ添加し、２５℃で１０分間、沈殿を形成させる。沈殿物は懸濁して２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間おいた。培養液は、アスピレーターで除去し、２０％グリセロールを含む２ｍｌのＰＢＳを３０秒間添加する。２９３細胞は、無血清培地で洗浄し、新しい培地を添加し、細胞を約５日間培養する。
【０１３３】
おおよそ、形質移入２４時間後、培養液を除去し、培養液（のみ）、又は２００μＣｉ/ｍｌ^３５Ｓ-システイン及び２００μＣｉ/ｍｌ^３５Ｓ-メチオニンを含む培養液で置換する。培養１２時間後、条件培地を回収し、スピンフィルターにて濃縮し、１５％ＳＤＳゲルで泳動する。泳動後ゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を示すように選択された時間、フィルムを露光させる。軽質移入された細胞を含む培地は、さらに培養され（無血清培地中）、培養液は選択されたバイオアッセイで試験される。
それに代わる技術により、foggyはSomparyracら, Proc.Natl.Acad.Sci., 12：7575(1981)により記述された硫酸デキストラン法を用い、２９３細胞へ一過的に導入されてもよい。２９３細胞はスピナーフラスコ中で最大密度になるように生育させ、７００μｇのｐＲＫ５−foggyＤＮＡが添加される。まず、細胞は遠心によりスピナーフラスコから濃縮され、ＰＢＳにて洗浄される。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物は、４時間、細胞ペレット上でインキュベートされる。細胞は、９０秒間２０％グリセロールで処理し、組織培養液で洗浄し、組織培養液、５μｇ/ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ/ｍｌのウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコへ再び移される。約５日後、条件培地は、遠心され細胞及び細胞片を除去するためにろ過される。その後、発現されたfoggyを含むサンプルは、濃縮され、透析及び/又はカラムクロマトグラフィーのような選択されたいずれかの方法により精製され得る。
【０１３４】
他の実施態様において、foggyはＣＨＯ細胞中にて発現され得る。ｐＲＫ５−foggyは、ＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥデキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞へ形質移入され得る。上述したように、細胞培養物はインキュベートされ、培地は、培養液（のみ）又は^３５Ｓ−メチオニンのような放射標識物を含む培養液に置換される。foggyポリペプチドの存在を定量後、培養液は無血清培地で置換される。好ましくは、培養は約６日間行われ、その後条件培地を回収する。発現されたfoggyを含む培養液は、いずれか選択された方法により濃縮され、精製される。
また、エピトープタグ化されたfoggyは、宿主ＣＨＯ細胞中でも発現される。foggyは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングされる。サブクローン化されたインサートは、ポリｈｉｓタグのような選択されたエピトープタグと共にフレームが合うように、バキュロウイルスの発現ベクターへ融合されるようにＰＣＲを行うことも可能である。ポリｈｉｓタグfoggyインサートは、安定クローンの選択のためにＤＨＦＲのような選択マーカーを含むＳＶ４０作動性ベクターへサブクローニングすることができる。最終的に、ＣＨＯ細胞は、ＳＶ４０作動性ベクターで形質移入されること（上述のように）が可能である。上述のように、発現を確認するために標識化することを行ってもよい。その後、発現されたポリＨｉｓタグ化foggyを含む培養液は、濃縮することも可能であり、Ｎｉ^２＋キレートアフィニティークロマトグラフィーのような、いずれか選択された方法で精製される。
【０１３５】
また、foggyはＣＨＯ及び/又はＣＯＳ細胞中で一過的発現方法により発現してもよく、ＣＨＯ細胞中で、他の安定発現法によってもよい。
ＣＨＯ細胞中での安定発現は、以下の方法を用いて実施される。タンパク質は、ＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現され、この場合、各タンパク質の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）に対するコード化配列は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合され、及び／又は、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態である。
ＰＣＲ増幅の後、各ＤＮＡは、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)中に記載の標準的な技術を用いてＣＨＯ発現ベクターへサブクローン化される。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡの簡便なシャトリング（入替え）を可能にするために、目的のＤＮＡの５’及び３’と適合する制限酵素部位をもつように構築される。ＣＨＯ細胞で発現に用いられるベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996))中に記載されているように使用され、目的のｃＤＮＡ及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を誘起するために、ＳＶ４０初期プロモーター/エンハンサーを使用する。ＤＨＦＲ発現はトランスフェクションに続いてプラスミドの安定した維持の選択を可能にする。
【０１３６】
所望のプラスミドＤＮＡ１２μｇを、市販の形質移入試薬、Superfect（登録商標）(Quiagen)、Dosper（登録商標）又はFugene（登録商標）(Boehringer Mannheim)を使用して、およそ１０，０００，０００のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、Lucasら, 上掲中で記載されているように生育される。およそ３ｘ１０^{- ７}細胞が、その後の増殖及び後述の産生に使用するため、アンプル中に凍結される。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルは、水浴中に静置し、ボルテックスを行うことにより解凍される。内容物は、ピペッティングにより１０ｍｌの培養液を含む遠心用チューブに移され、５分間、１０００ｒｐｍで遠心される。上清はアスピレーターで除去され、細胞は１０ｍｌの選択培地（０．２μｍでフィルターろ過された５％ウシ胎児血清を含み、０．２μｍフィルターでろ過されたＰＳ２０）に再懸濁される。その後、細胞は、９０ｍｌの選択培地を含む１００ｍＬのスピナーへ分取される。１−２日後、細胞は、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たされた２５０ｍＬのスピナーへ移され、３７℃で培養される。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、及び２０００ｍＬのスピナーに３ｘ１０^５細胞/ｍｌになるように播種される。細胞培養液は、遠心により新しい培地と交換し産生培地へ再懸濁させる。適切ないずれかのＣＨＯ培地が用いられ、１９９２年６月１６日発行の米国特許第５，１２２，４６９号中に記載の産生培地が実際には使用された。３Ｌの産生スピナーに１．２ｘ１０^６細胞/ｍＬで播種される。０日目、細胞数、ｐＨが決定される。１日目、スピナーからサンプリングされ、ろ過された空気の散布が開始される。２日目、スピナーからサンプリングされ、温度が３３℃へ変更され、５００ｇ/Ｌのグルコース３０ｍＬ及び１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサン エマルジョン、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）、０，６ｍｌが加えられる。生産の過程を通じて、ｐＨは必ず７．２付近を保つように調整される。１０日後、又は生存率が７０％以下に落ち込むまで、細胞培養物は、遠心及び０．２２μｍのフィルターを通してろ過することにより回収される。ろ過産物は、４℃で保存されるか、即時に精製用のカラムに通されるかのいずれかとなる。
【０１３７】
ポリ−Ｈｉｓタグ化構築物に関しては、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）を使用してタンパク質の精製が行われる。精製の前に、イミダゾールが５ｍＭの濃度になるように条件培地に添加される。条件培地は、０．３Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４バッファーで平衡化された６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ/ｍｉｎの流速で４℃で送り込まれる。カラムに添加後、カラムはさらに平衡化バッファーで洗浄され、タンパク質は０．２５Ｍ イミダゾールを含む平衡化バッファーで溶出される。続いて、高度に精製されたタンパク質は、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，０．１４Ｍ ＮａＣｌ及び４％ マンニトール，ｐＨ６．８を含む保存用バッファーへ、２５ｍｌＧ２５Superfine(Pharmacia)カラムで脱塩され、−８０℃で保存される。
イムノアドヘシン（Ｆｃ−包含）構築物は、以下のように条件培地から精製される。条件培地は２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化された５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）へ送り込まれる。カラムに添加後、カラムは１００ｍＭ クエン酸，ｐＨ３．５で溶出される前に平衡化バッファーで大規模に洗浄される。溶出されたタンパク質は、２７５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ９を含むチューブへ１ｍｌ画分を回収することにより、即座に中和される。高度に精製されたタンパク質は、次いで、ポリ−Ｈｉｓタグ化タンパク質に関して上述されているように保存用バッファー中で脱塩される。均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン分解法によるＮ末端アミノ酸配列決定により評価される。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドが上記されるように成功裏に発現した。
【実施例４】
【０１３８】
酵母におけるfoggyの発現
以下に示す方法は、酵母におけるfoggy及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）の組換え発現について記述したものである。
まず最初に、酵母の発現ベクターが、ＡＤＨ２/ＧＡＰＤＨプロモーターからのfoggyの細胞内生産又は分泌のために構築される。foggyの細胞内発現をさせるために、foggyをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適した制限酵素部位に挿入する。分泌のために、foggyをコードするＤＮＡは、ＡＤＨ２/ＧＡＰＤＨプロモーター、天然のfoggyシグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチド、又は、例えば、foggyの発現のために（必要ならば）酵母α−因子若しくはインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及びリンカー配列をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミド中へクローン化することができる。
その後、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞は上述の発現プラスミドで形質転換することができ、選択された発酵培地で培養できる。形質転換された酵母の上清は、１０％のトリクロロ酢酸で沈殿化することにより分析することが可能で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマーシブルーによるゲルの染色が行われる。
次いで、組換体foggyを単離し、発酵培地から遠心にて酵母細胞を除くことにより精製することができ、その後、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮する。foggyを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィーレジンを用いて、さらに精製される。
ここで開示された多くのＰＲＯポリペプチドが上記されるように成功裏に発現した。
【実施例５】
【０１３９】
バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるfoggyの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるfoggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）の組換え発現について記述したものである。
foggyをコードする配列は、バキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流と融合される。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及びイムノグロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域に類似の）を含む。種々のプラスミドが用いられるが、市販のｐＶＬ１３９３（Novagen）のようなプラスミド由来のプラスミドが含まれる。大まかには、foggyをコードする配列、又は膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列のようなfoggyのコード配列のうち所望の部分、又はタンパク質が細胞外タンパクの場合は成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーによりＰＣＲ法で増幅される。５’プライマーは隣接する制限酵素部位（選択された）を含んでいてもよい。その後、増幅産物は、選択された制限酵素により切断され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換体バキュロウィルスは、上記のプラスミド及びBaculo Gold(商品名)ウィルスＤＮＡ（Pharmingen）をSpodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販されている）を用いて共形質転換により産生される。２８℃にて４−５日培養後、放出されたウィルスは回収され、さらに増幅させるため利用される。ウィルス感染及びタンパク質発現は、上述のようにO'Reilleyら, Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual, Oxford:Oxford University Press(1994)の方法により行われる。
【０１４０】
発現されたポリ−ｈｉｓタグ化ＰＲＯは、例えば、以下のようにＮｉ^２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。抽出物は、Rupertら,Nature, 362:175-179 (1993)において記載されているように、組換体ウィルスを感染させたＳｆ９細胞から調製される。大まかには、Ｓｆ９細胞は洗浄され、超音波処理バッファー（２５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％ グリセロール；０．１％ ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）中に再懸濁され、氷上にて２０秒間２度超音波処理される。超音波処理された産物は、遠心にて夾雑物が除かれ、その上清はローディングバッファー（５０ｍＭ リン酸、３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％ グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈され、０．４５μｍのフィルターでろ過される。Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販されている）は、総容積５ｍＬで調製され、２５ｍＬの水で洗浄され、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡化される。ろ過された細胞抽出物液は、１分間に０．５ｍＬの流速でカラムに添加される。カラムは、ベースラインのＡ_２８０になるまでローディングバッファーで洗浄され、その時点で分取が開始される。次に、カラムは第二の洗浄バッファー（５０ｍＭ リン酸；３００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％ グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄され、非特異的に結合したタンパク質を溶出させる。Ａ_２８０がベースラインにまで再度到達した後に、カラムは、第二の洗浄バッファー中０から５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配により展開される。１ｍＬずつ分取され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はＮｉ^２＋−ＮＴＡ結合アルカリホスファターゼ（Qiagen）によるウェスタンブロットにより解析される。溶出されたＨｉｓ_１０タグ化ＰＲＯを含む画分がプールされローディングバッファーに対して透析される。
あるいは、ＩｇＧタグ化（又はＦｃタグ化）ＰＲＯの精製は、既知のクロマトグラフィー技術、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを用いることにより行うことができる。
【実施例６】
【０１４１】
foggyと結合する抗体の調製
本実施例は、foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）と特異的に結合するモノクローナル抗体の調製について示すものである。
モノクローナル抗体を産生するための技術は、当該技術の分野において周知であり、例えば、Goding、上掲中に記載されている。用いられる免疫原には、精製されたfoggy、foggyを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換体foggyを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、過度の実験を行うことなく、当業者により行われ得るものである。
Ｂａｌｂ/ｃなどのマウスが、完全フロイントアジュバント中でエマルジョン化されたfoggy免疫原で免疫され、１−１００μｇの量で皮下又は腹腔内に注射される。あるいは、免疫源はＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）中でエマルジョン化され、動物の後足のパッド部分に注射される。その後、免疫されたマウスは、１０から１２日後に選択したアジュバント中でエマルジョン化された追加の免疫原により追加免疫される。その後、数週間の後、マウスはさらに免疫注射により追加免疫される。血清サンプルは、抗foggy抗体を検出するためにエライザアッセイによりテストのために定期的にマウスから眼窩球出血により採取される。
【０１４２】
適当な抗体価が検出された後、抗体に対し「陽性」の動物は最終的にfoggyの静脈注射によりインジェクトされる。３から４日後、マウスは処理され、脾臓細胞が回収される。脾臓細胞は、ＡＴＣＣ，Ｎｏ．ＣＲＬ１５９７より入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選択されたマウスミエローマ細胞株と融合される（３５％ポリエチレングリコールを使用）。融合細胞は、その後、非融合細胞、ミエローマ同士のハイブリッド、脾臓細胞同士のハイブリッドの生育を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレート中にプレーティングされ得るようなハイブリドーマを産生する。
ハイブリドーマ細胞は、foggyに対する反応性に関し、エライザによりスクリーニングされることになる。foggyに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」のハイブリドーマ細胞の同定は、当該技術の範囲内のことである。
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗foggyモノクローナル抗体を含む腹水を産生するために、同系のＢａｌｂ/ｃマウスへ腹腔内にインジェクトされる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコ又はローラーボトル中で生育させることが可能である。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿を用いたのち、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行うことができる。あるいは、プロテインＡ又はプロテインＧに対する抗体の結合性に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【実施例７】
【０１４３】
特異的な抗体を用いたfoggyポリペプチドの精製
天然又は組換体foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）は、タンパク質精製の分野において様々な標準的な技術により精製される。例えばfoggyは、目的のfoggyポリペプチドに対して特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。通常、イムノアフィニティーカラムは活性化されたクロマトグラフィー用の樹脂に抗foggyポリペプチド抗体を共有結合的にカップリングさせることにより構築される。
ポリクローナルイムノグロブリンは、免疫された血清から硫安沈殿法、又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, ニュージャージー）による精製のいずれかの方法により調整される。同様に、モノクローナル抗体はマウス腹水液から硫安沈殿又は固定化プロテインＡによるクロマトグラフィーにより精製される。部分精製されたイムノグロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）（Pharmacia LKB Biotechnology）のようなクロマトグラフィー用樹脂に共有結合的に結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂はブロッキングされ、生じた樹脂は製造者の指示に従い洗浄される。
【０１４４】
このようなイムノアフィニティーカラムは、可溶性形態のfoggyポリペプチドを含む細胞から画分を調製することによりfoggyポリペプチドの精製に用いられる。本精製法は、細胞全体の可溶化又は界面活性剤の添加による分画遠心法により得られる細胞成分分画の可溶化、又は当該技術分野において周知のその他の方法により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶性foggyポリペプチドは、細胞が生育する培地中に有効量分泌される。
可溶性foggyポリペプチドを含む調製物は、イムノアフィニティーカラムに通され、カラムはfoggyポリペプチドの優先的な吸収を可能にする条件下にて洗浄される（例えば、界面活性剤の存在下、高イオン強度のバッファー中）。その後、カラムは抗体/foggyポリペプチドの結合を壊すような条件下にて溶出され（例えば、およそｐＨ２−３の低ｐＨバッファー、又は尿素又はチオシアン酸イオンのようなカオトロピック因子の高濃度下）、foggyポリペプチドが回収される。
【実施例８】
【０１４５】
薬物スクリーニング
本発明は、特に、foggyポリペプチド及びfoggyポリペプチドアンタゴニスト（「foggy」）又はその結合フラグメントを用い、様々な薬物スクリーニングのいずれかの技術において有用である。そのような試験において用いたfoggyは、液体に可溶状態であるか、固体状の支持体に添付されているか、細胞表面上に出現されているか、細胞内に局在している。ある薬物スクリーニング方法においては、foggyを発現する組換体核酸で、安定に形質転換された真核又は原核宿主細胞が利用される。薬物は、そのような形質転換された細胞に対し、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。このような細胞は、生きた状態又は固定化形態であり、標準的な結合アッセイに対し使用され得る。例えば、foggyと、試験される薬物との間の複合体形成を測定する。あるいは、試験される薬物によって引き起こされるfoggyポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの複合体形成の減少を調べることができる。
従って、本発明は、foggyポリペプチド関連疾病又は疾患に影響を及ぼし得る薬剤又は他のいずれかの薬物についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、そのような薬物をfoggyに接触させることを含み、（ｉ）薬物とfoggy間の複合体の存在、又は（ｉｉ）foggyと細胞との複合体の存在を、当該技術分野において周知な方法によりアッセイすることを含む。このような競合結合アッセイにおいて、典型的には、foggyは標識される。適当なインキュベーションの後、遊離型のfoggyは結合型で存在するものと分離され、遊離型又は非複合体型の標識の量は、特定の薬物がfoggyに結合し、foggy/細胞の複合体を阻害する特定の薬物の能力の測定値である。
【０１４６】
薬物スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドと適切な結合親和性を持つ化合物に対するハイスループットのスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に発行の国際公開第８４/０３５６４号において詳細に記載されている。簡単に述べると、大量の異なる小ペプチド試験化合物は、プラスチックピン、又は何らかの表面のような固体基質上で合成される。foggyポリペプチドに適用されるとき、ペプチド試験化合物はfoggyと反応し、洗浄される。結合されたfoggyポリペプチドは、当該分野において周知の方法により検出される。また、精製されたfoggyは、上述の薬物スクリーニング技術において使用するためにプレート上に直接コートされ得る。さらに、非中和抗体はペプチドを捕獲し、固体支持体上に固定化するために用いられる。
また、本発明は、foggyと結合し得る中和抗体が、試験化合物とfoggyポリペプチド又はそのフラグメントとの結合に対し競合するような、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用においても考慮される。このように、抗体は、foggyポリペプチドと１つ又は複数の抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を検出するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１Ａ−ＪはＤＡニューロンが欠損したfoggy突然変異体と視床下部の対応する過剰な5HTニューロンを示す。左側のパネルはＷＴを示し、右側のパネルはfoggy胚を示す。（Ａ−Ｂ）側面から見たもので、２０日齢のfoggy胚を示しており、極めて正常な形態を持ち、神経冠由来メラノサイトが減少し、循環のブロックのために心臓近傍に血液の蓄積がある。図１Ｃ−Ｈは、TH抗体（１Ｃ−Ｄ）、5HT抗体（１Ｅ−Ｆ）及びTH（緑）及び5HT（赤）二重染色（１Ｇ−Ｈ）で標識された２日齢の胚を腹側から見たもので、TH＋DAニューロンの減少と視床下部中の5HTirニューロンの対応する増加を示している。THと5HT（黄色）の双方を発現する細胞は矢じるしで示している（図１Ｈ）。図１Ｉ−Ｊは5HT抗体で標識された胚を背側から見たものであり、後脳5HT＋ニューロンはfoggy胚において正常であるように見えることを示している。増加した視床下部5HT＋ニューロンは焦点面から外れている。
【図２】図２Ａ−Ｌはfoggy網膜におけるニューロン表現型を示している。ＷＴは左側でfoggy胚は右側である。図２Ａ−ＢはTH抗体で標識された３日齢の網膜であり、TH＋DA無軸索ニューロンがfoggy突然変異体では失われることを示している。図２Ｃ−Ｆは、赤オプシン（Ｃ−Ｄ）及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD-67）での２日齢の網膜のホールマウントインサイツハイブリダイゼーションであり、（Ｅ−Ｆ）はfoggy突然変異体中のGAD67＋GABA作動性無軸索ニューロンと赤オプシン＋錐体光受容体の欠損を示している。図２Ｇ−Ｈは神経節ニューロンを認識するZn-8抗体で標識された２日齢の網膜であり、foggy突然変異体では神経節ニューロンは減少せず、おそらく僅かに増加していることを示している。図Ｉ−Ｊはγ-クリスタリンでの２日齢の網膜のホールマウントインサイツハイブリダイゼーションであり、foggy突然変異体ではその発現が正常であることを示している。図２Ｋ−Ｌは７２hpfＷＴ（図２Ｋ）及び突然変異体ゼブラフィッシュ（図２Ｌ）胚からの眼の組織学的分析である。突然変異体胚の眼はＷＴに対しておよそ５０μｍ直径が小さい。全ての網膜の突然変異胚が存在し、gcl（神経節細胞層(ganglion cell layer)）、ipl（内網状層(inner plexiform layer)）、inl（内核層(inner nuclear layer)）、opl（外網状層(outer plexiform layer)）、及びpcl光受容体層と示される。軽く好塩基性の細胞（無軸索細胞）は突然変異体の内核層内には欠けている。
【図３】図３Ａ−Ｌは後脳のノルアドレナリン作動性のLCニューロンを示しており、ＰＮＳ中の神経冠由来交感ニューロンはfoggy突然変異胚では欠損している。左側はＷＴであり、右側は突然変異foggy胚を示している。図３Ａ−Ｂは３６hpf胚を背側から見たもので、DBH＋LCニューロンがfoggy突然変異体において欠損していることを示している。図３Ｃ−ＤはTH抗体で標識された２日齢の胚を腹側から見たもので、交感ニューロンがfoggy突然変異体において欠損していることを示している。図３Ｅ−Ｆは１２の体節ＷＴ及び突然変異胚を側面から見たもので、LC前駆体中でのzphox2aｍＲＮＡの正常な発現を示している。図３Ｇ−Ｈは２日齢の胚を腹側から見たもので、交感ニューロンからのzphox2aＲＮＡがないことを示している。図３Ｉ−Ｊは3A10抗体で標識された３６hpf胚を背側から見たもので、foggy突然変異体における後脳マウスナーニューロンの正常な補充を示している。図３Ｋ−ＬはHu抗体で標識された２日齢の胚を側方から見たもので、foggy突然変異体における神経冠由来後根神経節（DRG）ニューロンの正常な補充を示している。
【図４】図４Ａ−Ｂはfoggy領域における物理的地図の作製とＡＦＬＰにより密接に関連したＤＮＡ多形性マーカーを同定する。図４Ａは自動シークエンサーＡＢＩ３１０で実施されたＰＣＲ断片分析のGenescanソフトウェア出力を示す例である。各ピークはＰＣＲ断片を示し、赤の矢によって示された独特のピークはＰＣＲ断片を表し、赤の矢で示された独特のピークはfoggy遺伝子座に結合したＤＮＡマーカーを表す。図４Ｂは二つの密接に関連したAFLPマーカーであるETACMTCT155とETACMGAT270を示し、これらは全体のfoggy領域にわたる大きなゲノムＤＮＡクローン（YACs、BACs及びPACs）を単離する出発点として使用した。全てのYAC、BAC及びPACクローンのサイズはパルスフィールド電気泳動及び制限酵素切断によって決定した。全てのクローンの末端を配列決定し、その配列決定情報を用いて、次のウォークのため、ＳＳＣＰ及びＰＦＬＰによる遺伝連鎖分析のため、また放射線ハイブリッドパネル解析のために使用される特異的ＰＣＲプライマーを設計した。B108J11は形質転換レスキューアッセイ（図５を参照）によるfoggy遺伝子を含むことが見出され、つづいてその全体が配列決定された。それはまた単離foggyｃＤＮＡに対してｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのプローブとして使用された。
【図５】図５Ａ−ＣはBACクローンの注入によるfoggy突然変異表現型のレスキューを示す。図５Ａは、コントロールＤＮＡ又はP21917の注入がfoggy突然変異表現型をレスキューしなかったことを示している。例えば、突然変異胚は減少したメラノサイト、ブロックされた血液循環及びDA及びLCニューロンの欠損を示した。図５Ｂは、B109J11の注入がfoggy突然変異表現型をレスキューしたことを示している：メラノサイト、血液循環及びDA及びLCニューロンの回復によって判断して、２２の注入突然変異動物に対して、１０が完全にレスキューされ（Ｂ、左側パネル）、１２が部分的にレスキューされた（Ｂ、右側パネル）。図５Ｃは、foggy遺伝子座：B172K17ｐ（foggyから0.04+/-0.02ｃM）及びETACMGAT270（foggyから0.06+/-ｃM）の側方の堅く連結した多形性マーカーでの注入胚のＰＣＲ遺伝子型特定を示す。これは、レスキューされた胚が確かにfoggyの遺伝子型の突然変異体であったことを特定した。
【図６】図６Ａ−Ｄはfoggyポリペプチドのコード化アミノ酸配列、タンパク質のSpt5/foggyファミリーの比較、及びfoggy中の変異の検出を示している。図６Ａはゼブラフィッシュfoggyの推定アミノ酸配列を示しており、Ｎ末端の酸性領域に下線が付されている。中央とＣ末端の保存領域は括弧で印が付けられている。４つのKOWモチーフに下線が付され、kow1-４と標識されている。２つの推定核局在化シグナルはボックスで印が付けられている。ヘキサペプチド反復には二重下線が付されている。図６Ｂはfoggyと他の種からのその相同体の間の相同性を示す棒を示しており、酸性、Ｎ末端保存中央領域、ヘキサペプチド反復及び保存Ｃ末端ドメインを含む。図６Ｃは、四角で囲った保存された残基と星印をつけたインバリアントアミノ酸を有するＣ末端ドメインのアミノ酸配列の並びを示す。foggy^ｍ８０６変異は不変のアミノ酸１０１２−バリンをアスパラギン酸に変化させる。図６ＤはAbi-自動化シークエンサーでつくり出したクロマトグラフであり、T→Aの単一のヌクレオチド変化はfoggy^ｍ８０６におけるＷＴ１０１２-Valから変異Aspへのアミノ酸変化を導く。
【図７】図７Ａ−Ｊはfoggyの発現を示している。foggyＲＮＡプローブ（A-F）を用いたホールマウントインサイツハイブリダイゼーションは、母性foggyｍＲＮＡが球段階胚の全ての芽細胞腫中に存在している（Ａ）ことを示している。尾芽期の胚（図７Ｂに示される）において、foggyｍＲＮＡは神経板に高く濃縮されているが、低レベルの発現も他で検出される。体節形成の間、２８hpfの胚において、foggyｍＲＮＡが脳に多く発現されている（図７Ｃ）。２日齢の胚では、foggyｍＲＮＡは他の場所よりも脳においてより多く検出されるが、初期段階と比較して若干ダウンレギュレートされていた（図７Ｅ）。foggyｍＲＮＡの発現パターンはＷＴ（図Ｃ、Ｅ）とfoggy変異胚（図Ｄ、Ｆ）の間に差異がなかった。FLAGタグＷＴfoggyコンストラクトでトランスフェクションし、DAPI（図７Ｇ）及びFLAG抗体染色（図７Ｈ）によって可視化された哺乳動物のCos-７細胞は、ＷＴfoggyタンパク質が細胞核内に入ることを示している。FLAGタグ変異foggyコンストラクトでトランスフェクションしたCos-７細胞（図７Ｈ及び７Ｊ）は、変異foggyタンパク質が尚も細胞核に入ることができることを示している。
【図８】図８Ａ−Ｃは、foggy変異がインビトロでfoggy/zSpt5の負の機能を消失させるが正の機能は消失させないことを示している。図８Ａは次のアッセイで使用されるfoggy/zSpt5タンパク質が７．５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離され、クーマシーブリリアントブルーで染色されたことを示している。図８Ｂは、天然のＨｅＬａ核抽出物を用いた欠損／加減アッセイを示す。ヒトSpt4（5ng）と、hSpt5（50ng）か、又は野生型もしくは突然変異foggy/zSpt5（50,150,450ng）の何れかをDSIF欠損抽出物に加減し、転写応答をＤＲＢの存在下又は不存在下で１０分間、開始させた。プラスミドTF3-6C2Atは、アデノウイルスE4プロモーターの下流に３８０-ntのＧフリーカセットを含むが、鋳型として用いた。図８Ｃは、制限ＮＴＰ濃度下で鋳型としてpSLG402を用いて実施した欠損／加減アッセイを示しており、このアッセイはfoggy/zSpt5の刺激活性を測定することを可能にする。上部に概略的に図示しているように、pSLG402はアデノウイルス主要後期プロモーターの下流に２つのＧフリーカセットを含んでいる。２つのＲＮＡバンドの量はＦＬＡ２０００画像アナライザー（Fuji）を使用して定量し、近接比に対して遠位のプロモーターを計算した。
【図９】図９Ａ−Ｃはfoggy/zSpt5の陽性の機能に対するfoggy変異の効果を示している。欠損／加減アッセイを、制限されたＮＴＰ濃度下で鋳型としてpSLG402を使用して実施し、それにより、foggy/zSpt5の刺激活性の測定が可能になった。図９Ａに概略的に示されているように、pSLG402はアデノウイルス主要後期プロモーターの下流に２つのＧフリーのカセットを含む。実際のゲル像は図９Ｂに示す。２つのＲＮＡバンドの量はＦＬＡ２０００画像アナライザー（Fuji）を用いて定量した。図９Ｃはプロモーターの遠位対近位比の計算を示す。
【図１０】図１０は図１１（配列番号：１）の天然配列foggyポリペプチドをコードしている天然配列の核酸配列（配列番号：２）を示す。３文字の開始及び停止コドンは太字フォント及び下線で示されている。T→A変異の位置がまた太字及び下線で特定されている。
【図１１】図１１は天然のfoggyアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。１０１２番の位置におけるVal→Asp変異の位置がまた太字及び下線で特定されている。FIELD OF THE INVENTION
[0001]
The present invention is characterized by nucleotide and amino acid sequences having homology to the zebrafish transcription elongation factor foggy, neurogenesis, and abnormalities and activities of dopaminergic (DA) and serotonergic (5HT) neurons. A method for treating a disease.
BACKGROUND OF THE INVENTION
[0002]
During the development of the animal nervous system, progenitor cells with slight variability in the distribution, date or location of cytoplasmic components may have hundreds of different classes, differentially responding to localized foreign signals. Of neurons and non-neuronal cells. Both the initial difference between progenitor cells and their final phenotype appear to be partially affected by unique temporal or cytological changes. For example, nested expression of the Hox gene predicts segmentation along the anterior-posterior axis of the vertebrate hindbrain. Lumsden and Krumlauf, 1996, Science 274: 1109-1114. On the other hand, a unique combination of Lim, Islet and Lim-HD transcription factors precedes and predicts vertebrate motor neuron subtypes and their future axonal trajectories. Tsuchida et al., 1994, Cell 79: 957-70; Sharma et al., 1998, Cell 95: 817-28. Differential responses to extracellular factors are also identified by a history of gene expression, which subsequently translates into a unique pattern of expressed genes. Thus, response to hedgehog (Hh) in the neural plate requires the presence of the Gli family of transcription factors (Ruizi Altaba, 1997, Cell 90: 193-6) and that different concentrations of Hh are phenotypically uniform. Elicit distinct transcriptional responses in different groups of cells. Tanabe and Jessell, 1996, Science 274: 1115-1123. Similarly, the response of sensory organ progenitor cells (SOPs) to the Notch ligand Delta in flies is affected by the asymmetric distribution of the proteins Numb and Prospero and is translated into distinct daughter cell fate. Artavanis-Tsakonas et al., 1999, Science 284: 770-776; Jan and Jan, 1998, Nature 392: 775-78. In rare cases, the pattern of gene expression is affected by gene rearrangement or inheritance from the mother of the mRNA, but expression of most genes appears to be regulated at the transcriptional level.
[0003]
To date, the key regulatory step in gene expression is thought to be the transcription initiation step. Thus, studies in Drosophila embryos indicate that gradual intracellular signals are carried by transcription initiation factors, and that their promoters vary with different types and the number of affinities of their binding sites, so that genes respond in a different way. Proved to be different. Burz et al., 1998, EMBO J 17; 5998-6009; Jiang and Levine, 1993, Cell 72: 741-52. Similarly, foreign signals Hh, Wnt (Eastman and Grosschedl, 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11: 233-40), BMP (Massague, 1998, Ann. Rev. Biochemistry 67: 753-91), Delta / The unique transcriptional response to Serrate (such as Artavanis-Tsakonas, supra) and retinoic acid is thought to be the result of the use of distinct transcription initiation factors with different distributions of promoter binding sites. However, production of translatable mRNA is a complex process subject to multi-step regulation. For example, a region that has been relatively neglected for the control of spatial and temporal gene expression in vertebrate development is the mRNA elongation stage. Greenblatt, 1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9: 310-9; Shilatifard, 1998, FASEB J. 12: 1437-46; Uptain et al., 1997, Ann. Rev. Biochem. 66: 117-72. Some eukaryotic viruses, including adenovirus, vaccinia and human immunodeficiency virus (HIV), use transcription elongation to regulate the expression of early and late genes and adapt replication to the physiological state of their host. It has been known. Garber and Jones, 1999, Curr.Opin. Immunol. 11: 460-65; Kim et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19: 5960-68; Wu-Baer et al., 1998, J. Mol. Biol. 277: 179-97. It has also been pointed out that in cell culture, the expression of some vertebrate genes, including proto-oncogenes c-fms, c-fos, c-myb and c-myc, is partially regulated at the transcription elongation stage. Uptain, supra. Further supporting the possible importance of regulating transcription elongation, the Hipple-Lindau tumor suppressor gene product binds to transcription elongation factors (Duan et al., 1995, Science 269: 1402-6) and the myeloid-lymphocytic leukemia gene Often comes from the finding that it fuses with other elongation factors. Shilatifard above. Similarly, growth retardation, high incidence of cancer and / or premature aging are caused by mutations in DNA helicase, which are typical of Bloom and Warner syndrome, but are also considered essential for elongation by RNA polymerase (Pol) I. It is. Gray et al., 1997, Nature Genetics 17: 100-3.
[0004]
Biochemical studies using in vitro systems have further revealed the existence of more than a dozen different protein complexes that stimulate or repress transcription elongation. Greenblatt above. These include the transcription elongation inhibitor 5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) and stimulating factors that cause Pol II to ignore or avoid a temporary pause or permanent restriction at H8. It is. Wada et al., 1998, Genes & Devel. 12: 343-56. Subsequently, this complex was shown to consist of 14Kd and 160Kd nuclear proteins (Wada et al., Supra), which are the transcription elongation factors Spt4 and 5 of Saccharomyces cerevisiae (SuPressors ofTy insertion mutation). Hartzog et al., 1998, Genes & Devel. 12: 357-69; Swanson et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 3009-19; Swanson and Winston, 1992, Genetics 132: 325-36. In vitro, DSIF is partially involved in physical interaction with the negative elongation factor (NELF) complex (Yamaguchi et al., 1998, Genes Cells 3: 9-15) and the large subunit of Pol II, 30 After the synthesis of -60 nucleotides, the elongation activity of hypophosphorylated Pol II is inhibited. Yamaguchi et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 8085-92. The inhibitory effect of Spt5 / DSIF is not constitutive and appears to be regulated by post-translational modifications. For example, phosphorylation of Pol II CTD by DRB consisting of CDK9 and cyclin T and H8-sensitive P-TEFb kinase has been shown to facilitate release of DSIF and NELF from the elongation complex. Wada et al., 1998, EMBO J. 17: 7395-403; Yamaguchi et al., 1998, supra. Also, at low concentrations of ribonucleotides, the DSIF complex acts as a stimulant rather than an inhibitor of in vitro elongation. Wada et al., Supra, 1998. It also acts as a positive elongation factor for HIV transcripts (Kim et al., Supra; Wu-Baer et al., Supra), supporting the notion that it is a versatile elongation regulator. Taken together, these studies suggest that while vertebrates possess mechanisms for regulated transcriptional elongation, the physiological function, pervasiveness, and importance of such regulation in vivo must still be elucidated. Provided evidence of what must be done.
[0005]
Serotonergic neurons are important in food intake, secretion of hormones, response to stress, regulation of pain and immune function. Serotonergic neurons stimulate almost all areas of the central nervous system, including the cerebral cortex, limbic system and spinal cord, and include activities such as behavior, appetite, pain, sexual activity, cardiovascular function, hormone secretion, and thermoregulation. It can affect multiple functions of the brain. Serotonergic dysfunction appears to play a role in the pathophysiology of various psychiatric, neurological and neuron-related other diseases. For example, mental depression, Asberg et al., J. Clin. Psychiatry 47 (4): 23-35 (1986); suicide, supra, Asberg et al., Lester, D. Pharmacopsychiatry 28 (2); 45-50 (1995). Aggressive behavior in schizophrenia and violence, Brown et al., J. Clin. Psychiatry 54 (4): 31-41 (1990), Eichelman, BS, Annu. Rev. Med. 41: 149-158 (1990). ), Jacobs and Gelperin (1981) Seretonin Neurotransmission and Behavior, The MIT Press, Cambridge, MA. Serotonin intake inhibitors have been used to treat mental depression, obsessive-compulsive disorder and bulimia. Fuller, R.W., "Serotonin uptake inhibtors: Uses in clinical therapy and in laboratory research," Progress in Drug Research 45: 167-204, Birkhaeuser-Varlag, Basel (1995). Since serotonergic neurons stimulate cerebral blood flow, serotonin receptor agonists, such as sumatriptan, have been used to stop the onset of migraine. Plosker G.L. et al., Drugs 94 (4); 622-651 (1994). Most of the known cloned serotonin receptors belong to the G protein-coupled receptor superfamily with seven transmembrane domains. Hoyer et al., Pharmacol. Rev. 46 (2): 157-203 (1994). Certain serotonin receptor subtypes are negatively linked to adenylate cyclase, others are positively linked, and others are linked to activation of phospholipase C or ligand-gated ion channels. Fuller, R.W., Ann. N.Y. Acad. Sci. 780: 176-184 (1996).
[0006]
Dopaminergic neurons control movement and reward-related behavior. These neurons stimulate multiple structures of the forebrain, whose degenerative or abnormal functions are associated with Parkinson's disease, schizophrenia and drug use. Hynes et al., Cell 80: 95-101 (1995). Dopaminergic neurons located in the substantia nigra are observable motor dysfunction in which lesions on both sides of the substantia nigra striatal pathway are observed in Parkinson's disease: resting tremor, rigidity, immobility and abnormal posture It has significant effects on striatal activity because it produces symptoms very similar to those in experimental animals. Bilateral foci of the substantia nigra striatal pathway caused by 6-hydroxydopamine (OHDA) have caused severe immobility, aphagia, anorexia and sensory neglect in rodents, Ungerstedt, U., Acta Physiol. Scand. 1971 (Suppl. 367): 95-121; Yirek and Sladek, 1990, Annu. Rev. Neurosci. 13: 415-440.
Loss of striatal DA is associated with an altered number of target receptors located on striatal cells. In parkinsonism, changes in DA receptor status may depend on the stage of disease progression. A salient feature of Parkinsonism is a severe decrease in dopamine in all components of the basal ganglia. Hornykiewicz, O., 1988, Mt. Sinai J. Med. 55: 11-20. Dopamine and its metabolites are depleted in the caudate nucleus, putamen, pallidum, and nigra compacts. Moderate loss of DA has been found in the nucleus accumbens, lateral hypothalamus, medial olfactory, and lateral amygdala. Changes in the non-dopaminergic neuronal system include a decrease in the tissue concentration of norepinephrine, serotonin, substance P, neurotension and some neuropeptides in most basal ganglia structures, cerebellar cortex, and spinal cord.
[0007]
Schizophrenia is often characterized by idiosyncratic thinking disorders, disrupted emotional or emotional responses to the environment, and autism-withdrawal from interaction with others. Hallucinations have also been implicated as a sign of schizophrenia. Phenothiazine drugs are generally recognized as being effective in reducing the symptoms of schizophrenia. Other medicaments include neurotransmitters. Snyder et al., Science 184: 1243-1253 (1974). Prolonged use and toxic doses of amphetamine also induce schizophrenia-like signs.
Considerable attention has been paid to nerve transplantation in patients with Parkinson's disease. These clinical experiments have essentially evolved from basic scientific studies using various animal models of parkinsonism as recipients of fetal embryonic nerve cell or paraneuronal tissue transplantation into the area of brain injury. Although the concept of nerve transplantation is fairly old, major advances have been made only in the last two decades, and the potential long term potential of nerve transplantation to restore and maintain normalized function in animal models of various diseases. Many problems remain, such as effects. Animal studies with fetal DA neuronal transplantation have provided encouraging results that such transplantation reverses DA deficiency and restores motor function in animals with experimental foci of the substantia nigra striatal DA system. However, a number of ethical, legal and safety issues have arisen simultaneously with the use of fetal tissue in clinical trials, a factor that has only amplified the limited supply, all of which are dopaminergic. There is an urgent need for alternative sources of neurons.
Summary of the Invention
[0008]
The present invention generally provides the nucleotide, amino acid sequence and biochemical characterization of foggy, a transcription elongation factor essential for proper neuronal development. Mutants that produce defective foggy polypeptides appear morphologically normal at first glance, but upon closer examination, hypothalamus and retinal dopaminergic (DA) neurons, hindbrain noradrenergic (NA) neurons and Defects in neural crest-derived sympathetic (NA) neurons are shown. Interestingly, the foggy mutant was characterized by a loss of hypothalamic DA neurons in the foggy mutant, but also surprisingly by an increased number of adjacent serotonergic (5HT) neurons. . These foggy mutants also showed defects in neuronal development in the developing retina, and axonal and photoreceptor neuronal deficits were observed. In contrast, retinal ganglion neurons were intact and even showed a slight increase in number.
In one embodiment, the invention provides a method of forming a dopaminergic neuron, comprising contacting a neural progenitor cell with an effective amount of a foggy polypeptide. In one aspect, the foggy polypeptide comprises SEQ ID NO: 1 of FIG. In certain aspects, the contacting is made in vitro.
In another embodiment, the invention provides a method of forming a serotonergic neuron comprising contacting a neural progenitor cell with an effective amount of a foggy polypeptide antagonist. In one aspect, the foggy polypeptide antagonist comprises SEQ ID NO: 3. In certain aspects, the contacting is made in vitro.
[0009]
In another embodiment, the present invention relates to a method of treating a disease in a mammal wherein the disease is characterized by degeneration of dopaminergic neurons, comprising treating a therapeutically effective amount previously treated with an effective amount of a foggy polypeptide. A neural progenitor cell is transplanted into said mammal. In another embodiment, the present invention is directed to a method of treating a disease in a mammal wherein the disease is characterized by degeneration of serotonergic neurons, comprising treating a therapeutically effective foggy polypeptide antagonist previously with an effective amount of a foggy polypeptide antagonist. There is provided a method comprising transplanting an amount of neural progenitor cells into said mammal.
In another embodiment, the present invention provides a method for treating neurological disorders characterized by abnormal regulation of food intake, hormone secretion, stress response, pain and immune function, sexual activity, cardiovascular function and / or thermoregulation. Methods for using serotonergic neurons resulting from the application of foggy polypeptide to progenitor cells are provided. In certain aspects, such diseases include various mental, nervous and other diseases, such as mental depression, suicidal feelings, violent aggressive behavior, obsessive-compulsive behavior, anorexia / bulimia and schizophrenia. It is.
In another embodiment, the present invention relates to dopaminergic treatment resulting from the application of foggy polypeptide antagonists to neural progenitor cells for the treatment of diseases characterized by abnormalities in postural reflex, motor and / or reward-related behavioral regulation. Methods for using sex neurons are provided. In certain aspects, such diseases include Parkinson's disease, schizophrenia, and drug addiction. Alternatively, the disease may be a trauma or other trauma that results in a Parkinson-like condition, such as resting tremor, rigidity, ataxia and postural abnormalities, including akinesia, alexia, anorexia and numbness. It can result from disability from illness.
[0010]
In another embodiment, the invention provides a method of co-administering one or more neuronal survival factors to a mammal in combination with a foggy polypeptide or a foggy polypeptide antagonist for the treatment of a neurological disorder. In certain aspects, the co-administration of the neuronal survival factor occurs before, after, or simultaneously with the administration of the foggy polypeptide or antagonist. In another aspect, the neuron survival factor can also be administered with a transplant of neural progenitor cells. In other specific aspects, the neuron survival factor is nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), neurotrophin. Trophin-4 (NT-4), FGF-x, IL-1β, TNF-α, insulin-like growth factor (IGF-1, IGF-2), transforming growth factor β (TGF-β, TGF-β1) Or it may be a skeletal muscle extract.
In yet another embodiment, the invention provides a composition of matter comprising a neural progenitor cell and an effective amount of a foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist.
In yet another embodiment, the present invention provides for releasing neural progenitor cells and an effective amount of foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist to stimulate differentiation of neural progenitor cells into serotonergic or dopaminergic neurons, respectively. And a medical device comprising:
In yet another embodiment, the invention provides a pharmaceutically acceptable carrier and an effective amount of a foggy polypeptide or foggy polypeptide for stimulating differentiation of neural progenitor cells into serotonergic or dopaminergic neurons, respectively. A composition containing an antagonist is provided.
In yet another embodiment, the invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a foggy polypeptide or a foggy polypeptide antagonist.
[0011]
In one aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a foggy polypeptide or foggy having the full length amino acid sequence disclosed herein, or any other specifically defined fragment of the full length amino acid sequence disclosed herein. At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about at least about 81% nucleic acid sequence identity to the DNA molecule encoding the polypeptide antagonist, or (b) the complement of the DNA molecule of (a). 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity Or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or At least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% Nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or Include nucleotide sequences having at least about 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity.
[0012]
In one aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises (a) a full length foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist cDNA disclosed herein, or any other specifically defined fragment of a full length amino acid sequence disclosed herein. At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% to a DNA molecule comprising the coding sequence of (b) or the complement of the DNA molecule of (a). % Nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity Or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence identity, or at least About 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence Identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about Comprise nucleotide sequences having 98% nucleic acid sequence identity, or at least about 99% nucleic acid sequence identity.
[0013]
In another embodiment, the invention provides an isolated foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist encoded by any of the isolated nucleic acid sequences identified above.
In one aspect, the invention relates to foggy polypeptides or foggy polypeptide antagonists having the full-length amino acid sequences disclosed herein, or any other specifically defined fragment of the full-length amino acid sequences disclosed herein. At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, or at least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, or at least about 84% Amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or at least about 88% amino acid sequence identity, Alternatively, at least about 89% amino acid sequence identity Or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% Amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% amino acid sequence identity, or at least about 98% amino acid sequence identity, And, alternatively, provided is an isolated foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist comprising an amino acid sequence having at least about 99% amino acid sequence identity.
[0014]
In yet another embodiment, the present invention provides agonists and antagonists of the native foggy polypeptide as defined herein. In certain embodiments, the agonist or antagonist is an anti-foggy antibody or small molecule.
In a further embodiment, the present invention relates to a method of identifying an agonist or antagonist for a foggy polypeptide, comprising contacting the foggy polypeptide with a candidate molecule and effecting a biological activity mediated by said foggy polypeptide (eg, (Transcription elongation). Preferably, the foggy polypeptide is a native foggy polypeptide.
In another embodiment, the invention provides a chimeric molecule comprising any of the polypeptides described herein fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules include any of the polypeptides described herein fused to an epitope tag sequence or the Fc region of an immunoglobulin.
In another embodiment, the invention provides an antibody that binds, preferably specifically, to any of the above or below described polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment, or a single chain antibody.
In yet another embodiment, the present invention provides oligonucleotide probes which can be useful for isolating genomic and cDNA nucleotide sequences and measuring or detecting expression of related genes, or as antisense probes, Can be derived from any of the above or below nucleotide sequences.
In yet another embodiment, the invention provides methods of using the foggy polypeptides of the invention for various applications based on the functional biological assay data set forth in the Examples below.
[0015]
(Detailed description of preferred embodiments)
I. Definition
The terms "foggy polypeptide" and "foggy" as used herein contemplate the various polypeptides described herein. These terms include both native sequence polypeptides as well as variants thereof (as defined herein in more detail) and antagonists thereof. Foggy polypeptides and foggy polypeptide variants may be isolated from various sources, such as human tissue types or other sources, or may be prepared by recombinant and / or synthetic methods.
"Native sequence foggy polypeptide" includes polypeptides having the same amino acid sequence as a naturally occurring foggy polypeptide. Such native sequence foggy polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant and / or synthetic means. The term "native sequence foggy polypeptide" specifically includes naturally occurring truncations of the polypeptide, naturally occurring variant forms (eg, alternatively spliced forms) and naturally occurring allelic variants. In various embodiments of the invention, the native sequence foggy polypeptide is a mature or full length native sequence polypeptide comprising the full length amino acid sequence shown in the accompanying figures. Start and stop codons are shown in bold and underlined in the figure.
[0016]
A "foggy polypeptide variant" or a "foggy polypeptide antagonist variant" refers to the full-length native sequence foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist disclosed herein, or the full-length native sequence foggy polypeptide disclosed herein, respectively. Or an active foggy polypeptide as defined herein having at least about 80% amino acid sequence identity to a fragment of a foggy polypeptide antagonist. Such foggy polypeptide variants can be in a variety of forms. For example, a "substitution" variant is one in which at least one amino acid residue in the native sequence has been removed and a different amino acid inserted in the same site. Substitutions include single substitutions where only one amino acid in the molecule is substituted, or multiple substitutions where two or more amino acids are substituted in the same molecule. "Insertion" variants are those with one or more amino acids inserted immediately adjacent to an amino acid at a particular position in a native sequence. Immediately adjacent to an amino acid means attached to either the α-carboxyl or α-amino functional group of the amino acid. “Deletion” variants are those with one or more amino acids in the native sequence removed. Usually, deletion variants have one or two amino acids deleted in a particular region of the molecule. Polypeptide variants also include covalent modifications at residues in addition to the epitope-tagged heterofoggy polypeptide and antagonist.
[0017]
Alternatively, a foggy polypeptide variant or foggy polypeptide antagonist variant can be a full-length native sequence foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist sequence disclosed herein, or any of the full-length foggy polypeptide sequences disclosed herein. At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, or at least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity to other specifically defined fragments. Amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence identity, or at least about 87% amino acid sequence identity, or At least about 88% amino acid sequence Identity, or at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% amino acid sequence identity, or at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% amino acid sequence identity Or at least about 98% amino acid sequence identity, and / or at least about 99% amino acid sequence identity. Typically, the foggy mutant polypeptide or foggy mutant polypeptide antagonist will be at least about 100 amino acids in length, alternatively at least about 200 amino acids in length, alternatively at least about 300 amino acids in length, alternatively at least about 400 amino acids in length, or at least about 500 amino acids in length. At least about 600 amino acids, or at least about 700 amino acids, or at least about 800 amino acids, or at least about 850 amino acids, or at least about 900 amino acids, or at least about 950 amino acids, or at least about 975 amino acids Long, or at least about 1000 amino acids long, or at least about 1025 amino acids long, or at least about 1050 amino acids long, or at least It is about 1075 amino acids long, or at least about 1100 amino acids long or longer.
[0018]
"Percent (%) amino acid sequence identity" to a foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist identified herein refers to aligning the sequences and introducing gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity. Is defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues of the particular foggy polypeptide / foggy polypeptide antagonist sequence, with no conservative substitutions considered part of the sequence identity . Alignments for the purpose of determining percent amino acid sequence identity are publicly available using various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using simple computer software. One of skill in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. However, for purposes herein, the% amino acid sequence identity values were obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program, as described in Table 1 below, and the complete source code of the ALIGN-2 program was Provided in Table 1 below. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code shown in Table 1 below was obtained from the United States Copyright Office, Washington, D.C. C. , 20559, along with user material, and is registered under U.S. Copyright Registration Number TXU510087. The ALIGN-2 program is publicly available through Genentech, Inc. (South San Francisco, California) or may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program must be compiled for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0019]
When ALIGN-2 is used for the amino acid sequence comparison, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity thereto (or the given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A with or including some% amino acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score consistent with being identical by the program alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues of B. Where the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, it will be appreciated that the percent amino acid sequence identity of A to B is different from the percent amino acid sequence identity of B to A. As an example of the calculation of% amino acid sequence identity, Tables 2 and 3 show how to calculate the% amino acid sequence identity of an amino acid sequence called "Comparative protein" to an amino acid sequence called "PRO". And "PRO" represents the amino acid sequence of the hypothetical PRO polypeptide of interest, and "Comparative protein" represents the amino acid sequence of the polypeptide relative to the "PRO" polypeptide of interest, "X", "Y" And "Z" represent different hypothetical amino acid residues, respectively.
[0020]
Unless otherwise indicated, all% amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described above. However,% amino acid sequence identity values may be obtained using the sequence comparison program WU-BLAST2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) as follows. Most WU-BLAST-2 search parameters are set to default values. Not set to default values, ie the adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. When using WU-BLAST-2, the% amino acid sequence identity value is determined by (a) the amino acid sequence of the foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist of interest having a sequence derived from a native foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist. And the comparison amino acid sequence of interest (i.e., the sequence of the foggy mutant polypeptide to which the foggy polypeptide of interest is compared / the sequence that may be an antagonist thereof) as determined by WU-BLAST-2 The number of identical amino acid residues is determined by the quotient of (b) the total number of residues of the foggy polypeptide or foggy polypeptide variant of interest. For example, in the expression "a polypeptide comprising amino acid sequence A having or having at least 80% amino acid sequence identity to amino acid sequence B", amino acid sequence A is a comparative amino acid sequence of interest, and Sequence B is the amino acid sequence of the foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist of interest.
[0021]
The percent amino acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://ww.ncbi.nlm.nih.gov or obtained from the National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to default values, for example, unmask = OK, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5 , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
In situations where NCBI-BLAST2 is used for amino acid sequence comparison, the given amino acid sequence A, the given amino acid sequence B, or the% amino acid sequence identity thereto (or the given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A with or including some% amino acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score consistent with being identical by the program alignment of A and B of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Y is the total number of amino acid residues of B. If the length of amino acid sequence A differs from the length of amino acid sequence B, the percent amino acid sequence identity of A to B will be assessed as different from the percent amino acid sequence identity of B to A.
[0022]
By "foggy mutant polynucleotide" or "foggy mutant nucleic acid sequence" is meant a nucleic acid molecule encoding an active foggy polypeptide as defined below, and is a full-length native sequence foggy polypeptide sequence disclosed herein. Or at least about 80% nucleic acid sequence identity to the nucleic acid sequence encoding the antagonist or its antagonist, or any other fragment of the full length foggy polypeptide or antagonist sequence disclosed herein. Typically, a foggy mutant polynucleotide comprises a full length native sequence foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist sequence disclosed herein, or any other fragment of a full length foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist sequence disclosed herein. At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity, or at least about 82% nucleic acid sequence identity to the encoding nucleic acid sequence, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least About 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86% nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity, or at least about 88% nucleic acid sequence Identity, or at least about 89% nucleic acid sequence identity, or at least about 90% nucleic acid sequence Identity, or at least about 91% nucleic acid sequence identity, or at least about 92% nucleic acid sequence identity, or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, or at least about 97% nucleic acid sequence identity, or at least about 98% nucleic acid sequence identity, and / or at least about 99% nucleic acid sequence Have the same identity. A variant does not include the native nucleotide sequence.
[0023]
"Percent (%) nucleic acid sequence identity" to a foggy or foggy antagonist-encoding nucleic acid sequence identified herein refers to aligning sequences, introducing gaps if necessary to obtain maximum percent sequence identity, Defined as the percentage of nucleotides in the candidate sequence that are identical to the nucleotides in the foggy or foggy antagonist nucleic acid sequence. Alignments for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity can be obtained by various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or publicly available such as Megalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using computer software. However, for purposes herein, the% nucleic acid sequence identity values are calculated using the sequence comparison computer program ALIGN-, whose complete source code for the ALIGN-2 program is given in Table 1, as described below. Obtained using 2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc. and the source code shown in Table 1 was submitted to the United States Copyright Office, Washington DC, 20559 with user documentation and registered under United States copyright registration number TXU510087 Have been. The ALIGN-2 program is publicly available through Genentech, South San Francisco, California and may be compiled from the source code provided in Table 1. The ALIGN-2 program is compiled for use on a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0024]
In situations where ALIGN-2 is used for nucleic acid sequence comparisons, the given nucleic acid sequence C, the given nucleic acid sequence D, or the% nucleic acid sequence identity thereto (or the given nucleic acid sequence D, or On the other hand, a given amino acid sequence C with or including some% nucleic acid sequence identity) can be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleotides having a score that is consistent with the program alignment of C and D of the sequence alignment program ALIGN-2, and Z is the total number of nucleotides of D. If the length of the nucleic acid sequence C differs from the length of the nucleic acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity of C to D will be assessed as different from the% nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of the calculation of% nucleic acid sequence identity, Tables 4 and 5 show how to calculate% nucleic acid sequence identity of a nucleic acid sequence referred to as “Comparative DNA” to a nucleic acid sequence referred to as “PRO-DNA”. Where "PRO-DNA" represents the hypothetical PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, "Comparative DNA" is compared to the "PRO-DNA" nucleic acid molecule of interest and represents the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule thereto, “N”, “L” and “V” represent different hypothetical nucleotides, respectively.
[0025]
Unless otherwise specified, all% nucleic acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However, the percent nucleic acid sequence identity may also be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://ww.ncbi.nlm.nih.gov or obtained from the National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to default values, for example, unmask = OK, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low complex length = 15/5 , Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
In situations where NCBI-BLAST2 is used for sequence comparison, the% nucleic acid sequence identity of a given nucleic acid sequence C to or to a given nucleic acid sequence D (with or to a given nucleic acid sequence D) A given nucleic acid sequence C with or including some% nucleic acid sequence identity) may be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleotides having a score consistent with being identical by the program alignment of C and D of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Z is the total number of nucleotides of D. If the length of the nucleic acid sequence C differs from the length of the nucleic acid sequence D, the% nucleic acid sequence identity of C to D will be assessed as different from the% nucleic acid sequence identity of D to C.
In another embodiment, the foggy mutant or foggy mutant antagonist polynucleotide encodes an active foggy polypeptide or foggy mutant antagonist and is disclosed herein, preferably under stringent hybridization and washing conditions. A nucleic acid molecule that hybridizes to a nucleotide sequence encoding a full length foggy polypeptide or a foggy polypeptide antagonist. The foggy mutant polypeptide or antagonist thereof may be one encoded by the fighy mutant polynucleotide or antagonist, respectively.
[0026]
"Isolated," as used to describe the various polypeptides disclosed herein, means a polypeptide that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is (1) sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by using a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue or Preferably, it is purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. Isolated polypeptide includes the protein in situ within recombinant cells, since at least one component of the foggy polypeptide's natural environment will not be present. However, usually, an isolated polypeptide is prepared by at least one purification step.
An "isolated" foggy polypeptide-encoding nucleic acid or foggy polypeptide antagonist-encoding nucleic acid is a nucleic acid molecule that has been identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule normally associated with the natural source of the polypeptide-encoding nucleic acid. . An isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule is other than in the form or setting in which it is found in nature. Thus, an isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule is distinct from the particular polypeptide-encoding nucleic acid molecule that is present in natural cells. However, an isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecule includes, for example, a polypeptide-encoding nucleic acid molecule contained in a cell that normally expresses the polypeptide at a different chromosomal location than that of the natural cell.
[0027]
The term "control sequence" refers to a DNA sequence necessary to express an operably linked coding sequence in a particular host organism. For example, control sequences suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals and enhancers.
A nucleic acid is “operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the presequence or secretory leader DNA is operably linked to the polypeptide DNA if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer affects transcription of the sequence. Or ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is in a position that facilitates translation. Generally, "operably linked" means that the DNA sequences being linked are contiguous, and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading phase. However, enhancers need not be in close proximity. Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional techniques.
The term "antibody" is used in the broadest sense, particularly to single anti-foggy monoclonal antibodies (including agonists, antagonists and neutralizing antibodies), and anti-foggy antibody compositions with multiepitope specificity, single-chain antibodies. Includes foggy antibodies and fragments of anti-foggy antibodies (see below). As used herein, the term "monoclonal antibody" means an antibody that is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., where the individual antibodies that make up the population are naturally occurring, potentially abruptly present in small amounts. Identical except for the mutation.
[0028]
"Stringency" of hybridization reactions is readily determinable by one of ordinary skill in the art, and generally is an empirical calculation dependent upon probe length, washing temperature, and salt concentration. In general, longer probes have higher temperatures for proper annealing, while shorter probes have lower temperatures. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment below its melting point. The higher the degree of desired homology between the probe and the hybridizable sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures make the reaction conditions more stringent, while lower temperatures reduce stringency. See Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) for further details and explanation of the stringency of the hybridization reaction.
As defined herein, "stringent conditions" or "high stringent conditions" means (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example, 0.015M sodium chloride / 0.0015M at 50 ° C. Using sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) denaturing agents such as formamide during hybridization, eg, 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin at 42 ° C. /0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50mM sodium phosphate buffer pH 6.5 and 750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate; (3) 50% formamide at 42 ° C; 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM phosphoric acid Thorium (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate with 0% at 42 ° C. Identified by washing in 2 × SSC (sodium chloride / sodium citrate) and 50% formamide at 55 ° C. followed by a high stringency wash consisting of 0.1 × SSC with EDTA at 55 ° C.
`` Medium stringency conditions '' were identified as described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), and were used for washing solutions with less stringency than those described above. Includes the use of hybridization conditions (eg, temperature, ionic strength and% SDS). Moderate stringency conditions included 20% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × denhard solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / mL. Conditions include overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing denatured sheared salmon sperm DNA, followed by filter washing at 37-50 ° C. in 1 × SSC. One skilled in the art will recognize how to adjust temperature, ionic strength, etc. as necessary to accommodate factors such as probe length.
[0029]
The term "epitope tag", as used herein, refers to a foggy polypeptide fused to a "tag polypeptide", or a chimeric polypeptide comprising their domain sequence. A tag polypeptide has a sufficient number of residues to provide an epitope over which the antibody can be produced, or an epitope identifiable by some other reagent, but the length of the polypeptide of interest Short enough not to inhibit the activity of Also, the tag polypeptide is preferably quite unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually about 8 to about 50 amino acid residues (preferably, about 10 to about 20 residues).
The term "immunoadhesin" as used herein refers to an antibody-like molecule that binds the binding specificity of a heterologous protein ("adhesin") to an immunoglobulin constant domain. Structurally, immunoadhesins comprise a fusion of an amino acid sequence with the desired binding specificity, other than the antigen recognition and binding site of an antibody (ie, "heterologous"), and an immunoglobulin constant domain sequence. . The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least the receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin can be any of IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. From immunoglobulins.
[0030]
As used herein, "active" and "activity" refer to forms of a foggy polypeptide that retain the ability to promote, cause or cause transcription elongation. In certain embodiments, transcription elongation results in the formation of dopaminergic neurons. In a similar context, "activity" of a foggy polypeptide antagonist means the ability to attenuate, disrupt, or terminate transcription elongation, particularly transcription elongation resulting in the formation of serotonergic neurons.
The term "antagonist" is used in the broadest sense and refers to any molecule that blocks, inhibits, or neutralizes the biological activity of a native foggy polypeptide disclosed herein. Similarly, the term "agonist" is used in the broadest sense and refers to any molecule that mimics the biological activity of a native foggy polypeptide disclosed herein. Suitable agonist or antagonist molecules include, in particular, agonist or antagonist antibodies or antibody fragments, fragments or amino acid sequence variants of native foggy polypeptides, peptides, small organic molecules, and the like. A method of identifying an agonist or antagonist of a foggy polypeptide can include contacting the foggy polypeptide with a candidate antagonist or agonist and measuring a change in one or more biological activities normally associated with the foggy polypeptide.
[0031]
"Treatment" refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, the purpose of which is to prevent or slow (reduce) the targeted pathological condition or disease. Thus, “treatment” refers to both curative treatment and prophylactic or preventative measures. Thus, “treatment” refers to both curative treatment and prophylactic methods of preventing recurrence. Those in need of treatment include those already with the disorder as well as those prone to have the disorder or those in which the disorder is to be prevented. In the treatment of diseases characterized by degeneration of dopaminergic or serotonergic neurons, therapeutic agents directly increase or decrease the magnitude of the response of pathological factors of the disease (eg, decreased neuronal function), or May be more susceptible to treatment with other therapeutic agents.
"Chronic" administration means administering the drug in a continuous manner, unlike the acute manner, and maintaining the initial therapeutic effect (activity) over a long period of time. "Intermittent" administration is treatment that is not consecutively done without interruption, but rather is cyclic in nature.
A "mammal" for a subject to be treated is classified as a mammal, including humans, domestic and agricultural animals, zoos, sports, or pet animals, such as dogs, cows, horses, sheep, pigs, goats, rabbits, cats, and the like. Means any animal to be. Preferably, the mammal is a human.
Administration "in combination" with one or more further therapeutic agents includes simultaneous (joint) and sequential administration in any order.
[0032]
As used herein, "carrier" includes a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer, and is non-toxic to cells or mammals exposed to them at the dosages and concentrations employed. . Physiologically acceptable carriers are often aqueous pH buffered solutions. Examples of physiologically acceptable carriers include phosphate, citrate, and other organic acid salts buffers; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; For example, serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophobic polymers, such as polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides, including glucose, mannose or dextran, and other carbohydrates; EDTA Chelating agents such as mannitol or rubitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or nonionic surfactants such as TWEEN (trade name), polyethylene glycol (PEG), and PLURONICS (trade name). )including.
"Antibody fragments" comprise a portion of an intact antibody, preferably the antigen binding or variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab')<sub>2</sub>Diabodies; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062); single-chain antibody molecules; and multispecific antibodies formed from antibody fragments. .
Papain digestion of antibodies produces two identical antibody-binding fragments, called "Fab" fragments, each of which has a single antigen-binding site, and the rest reflect "Fc", reflecting their ability to crystallize easily. Named fragment. Pepsin treatment is F (ab ')<sub>2</sub>Generates a fragment that has two antigen binding sites and is capable of cross-linking antigen.
[0033]
"Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable region in tight, non-covalent association. In this configuration, the three CDRs of each domain interact to determine an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs confer antigen binding to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind the antigen .
The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab fragments differ from Fab fragments by having additional few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Here, Fab'-SH represents Fab 'in which the cysteine residue of the constant domain has a free thiol group. F (ab ')<sub>2</sub>Antibody fragments are initially produced as pairs of Fab 'fragments, which have hinge cysteines between them. Other chemical linkages of antibody fragments are known.
The “light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species fall into one of two distinct types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequence of their constant domains.
Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be divided into different classes. There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further divided into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2.
[0034]
"Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments include antibody fragments that include the VH and VL domains of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which allows the sFv to form the desired structure for antigen binding. For a review of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, edited by Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
The term "diabodies" refers to small antibody fragments that have two antigen-binding sites, wherein the fragments are of the same polypeptide chain (V<sub>H</sub>-V<sub>L</sub>) Within the light chain variable domain (V<sub>L</sub>Heavy chain variable domain (V<sub>H</sub>)including. By using a linker that is too short to pair between the two domains of the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of the other chain and create two antigen-binding sites. Diabodies are described more fully, for example, in EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
An "isolated" antibody is one that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminants of the natural environment are substances that would interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody, including enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody is prepared by (1) using more than 95% of the antibody as determined by the Lowry method, most preferably to more than 99% by weight, and (2) using a spinning cup sequenator. Enough to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues, or (3) homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie blue or preferably silver staining. Purified. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. However, usually, an isolated antibody is prepared by at least one purification step.
[0035]
An antibody that “specifically binds” to or is “specific for” a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide does not substantially bind to any other polypeptide or polypeptide epitope It binds to the particular polypeptide or an epitope on the particular polypeptide.
The term "label" as used herein refers to a detectable compound or composition that conjugates directly or indirectly to the antibody to produce a "labeled" antibody. The label may itself be detectable (eg, a radioactive or fluorescent label), or, in the case of an enzymatic label, may catalyze a chemical transformation of a detectable substrate compound or composition.
By "solid phase" is meant a non-aqueous matrix to which the antibodies of the invention can be attached. Examples of solid phases contemplated herein include those formed in part or in whole from glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, and silicone. In certain embodiments, depending on the context, the solid phase can constitute the wells of an assay plate, and in others can be a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also encompasses a discrete solid phase of discrete particles, as described in US Pat. No. 4,275,149.
"Liposomes" are small vesicles composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactants, which are useful for delivering drugs (eg, foggy polypeptides or antibodies thereto) to mammals. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer format similar to the lipid arrangement of biological membranes.
"Small molecule" is defined herein as having a molecular weight of about 500 daltons or less.
[0036]
“Disease” is any condition that would benefit from treatment with or application of a molecule that results in the formation of dopaminergic or serotonergic neurons. Examples of diseases that would benefit from transplantation or formation of dopaminergic neurons include improper postural reflexes, modulation of exercise and / or reward-related behaviors, including Parkinson's disease, schizophrenia, and drug use. Related. Examples of diseases that would benefit from transplantation or formation of serotonergic neurons are consciousness, arousal, movement, and food intake, aggression, depression (including suicidal), schizophrenia, and anorexia / bulimia It is characterized by abnormalities, including those with disease.
An "effective amount" of a foggy polypeptide is at least a minimal amount sufficient to promote, cause or cause transcription elongation, such as, for example, one that results in the formation of serotonergic neurons from neural progenitor cells. Similarly, an `` effective amount '' of a foggy polypeptide antagonist is at least a minimal amount sufficient to reduce, disrupt, or terminate transcriptional elongation, such as, for example, that results in the formation of dopaminergic neurons from neural progenitor cells. . An “effective amount” of a neuronal survival factor is an amount that promotes survival of a larger population of neuronal cells that would otherwise be present in the absence of the survival factor.
A "neuron survival factor" is any substance that allows a neuron contacted by the factor to survive for a longer period of time than otherwise. For example, US Pat. No. 5,733,875 describes a method for protecting or preventing epileptic seizures using glial cell derived neurotrophic factor (GDNF). GDNF is a known drug that has trophic activity on embryonic midbrain ventral midbrain dopaminergic neurons in vitro. Lin et al., 1993, Science 260: 1130-1132; Lin et al., 1994, J. Neurochem. 63: 758-768. Recombinant human GDNF also induces sprouting of dopaminergic fibers in vivo (Hudson et al., 1993, Soc. Neurosci. Abstr. 19: 652) and increases dopamine production in rat substantia nigra (see above). Hudson et al., Miller et al., 1994, Soc. Neurosci. Abstr. 20: 535-7), protects neurons from 6-OHDA injury and promotes the growth and fibrosis of rat embryo transplantation of nigral tissue in inoculo. Proven to increase. Stromberg et al., 1993, Exp. Neurol. 124: 401-412.
[0037]
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a trophic factor for peripheral sensory neurons, dopaminergic neurons and retinal ganglia. Henderson et al., 1993, Restor. Neurol. Neurosci. 5: 15-28. BDNF has also been shown to prevent naturally occurring cell death both in vitro and in vivo. Hofer and Barde, 1988, Nature 331: 161-262. Neurotrophin-3 has been found in both the central and peripheral nervous systems and can promote the survival of sensory and sympathetic neurons, including dorsal root ganglion (DRG) explants. Ciliary neurotrophic factor (CTNF) has been found to promote the survival of fetal ciliary ganglia in chickens in vitro and to support the survival of cultured sympathetic, sensory and spinal motor neurons. Ip et al., 1991, J. Physiol. 85: 123-130. Local administration of this protein to the lesion site of newborn rats has been shown to prevent the corresponding motor neuron degeneration. CNTF also rescued motor neurons from developmental cell death. Henderson et al., 1993, Restor. Neurol. Neurosci. 5: 15-28.
Additional neuronal survival factors include nerve growth factor (NGF), neurotrophin-3 (NT-3), neurotrophin-4 (NT-4), aFGF, IL-1b, TNFa-, insulin-like growth factor (IGF-1, IGF-2) and transforming growth factor β (TGF-β, TGF-β1).
A “therapeutically effective amount” of a progenitor cell is an amount that arrests or ameliorates the physiological effects caused by the loss or damage to dopaminergic or serotonergic neurons. A suitable range of cells can range from about 100 to about 500,000 active neurons. Preferably, the range is from about 500 to about 500,000, and most preferably, from about 1000 to about 500,000. A `` therapeutically effective amount '' of a foggy polypeptide is a minimum amount sufficient to reduce, alleviate, ameliorate, or ameliorate the condition of a patient suffering from at least a disease characterized by a loss of serotonergic neurons. . A `` therapeutically effective amount '' of a foggy polypeptide is at least a minimum amount sufficient to reduce, alleviate or ameliorate the condition of a patient suffering from a disease characterized by a defect in dopaminergic neurons. .
[0038]
"Dopaminergic (DA) neuron" means a neuron that secretes the neurotransmitter dopamine. They innervate the striatum, limbic system, and neocortex, and reside in the ventral midbrain with several other classes of neurons, including motor neurons. DA neurons regulate postural reflexes, movement and / or reward-related behavior. Loss of DA neurons results in Parkinson's disease, an abnormal function of which is associated with schizophrenia and drug use.
"Serotonergic (5HT) neurons" refers to neurons that secrete the neurotransmitter serotonin (5-hydroxytryptamine). 5HT neurons typically have a slow, rhythmic firing pattern and are concentrated on the ventral and ventral sides of the hindbrain, with most of the central nervous system including the cerebral cortex, limbic system and spinal cord. Innervate the part. 5HT neurons regulate levels of consciousness, alertness, movement, and food intake. Abnormal functions of serotonergic neurons have been linked to aggression, depression (including suicide) and schizophrenia.
"Neural progenitor cells" are cells that give rise to or differentiate into neurons. They have been observed to differentiate into various neuronal classes depending on their relative position along the anterior-posterior and dorsal-ventral axes. Further, the neural progenitor cells used in the present invention differentiate into serotonergic neurons when contacted with an effective amount of a foggy polypeptide and differentiate into dopaminergic neurons when contacted with an effective amount of a foggy polypeptide antagonist.
[0039]

[0040]

[0041]
II. Compositions and Methods of the Invention
A. Foggy is a major differentiation marker for neuronal development
The present invention describes the nucleotide and amino acid sequences of foggy, a polypeptide corresponding to a zebrafish mutation with the phenotype initially identified in a genetic screen for mutations affecting tyrosine hydroxylase (TH) expression. And features. At present, foggy is recognized as a major marker of differentiation of dopaminergic (DA) and noradrenergic (NA) neurons. Guo et al., 1999, Devel. Biol. 208: 473-87. The foggy mutant embryo is morphologically normal, but is defective in hypothalamic and retinal dopaminergic (DA) neurons, hindbrain noradrenergic (NA) neurons, and neural crest-derived sympathetic NA neurons. Surprisingly, defects in DA neurons in the hypothalamus were accompanied by an increase in the number of nearby serotonergic (5HT) neurons. Neurogenesis also affected the developed retina where axonal and photoreceptor neuronal defects were observed. In contrast, retinal ganglion neurons were defect free and showed a small increase. 5HT-containing neurons and hindbrain Moutner neurons, spinal cord GABAergic intervening and motor neurons, neural crest derived dorsal root ganglia and many other cases of NA arch-associated CA (AAC) cells, the foggy mutation Occurs normally in the body. Positional cloning indicated that the molecular cause of the mutant phenotype was site mutations in nuclear proteins structurally related to yeast and human Spt5. Biochemical analysis of foggy revealed that it was a dual regulation of mRNA transcription elongation and that the mutation disrupted its inhibitory activity but not its stimulatory activity. Taken together, these findings demonstrate that transcription elongation has indeed a major regulatory role in vertebrate gene expression, and that proper regulation of transcription elongation, along with regulation of transcription initiation, is essential for proper neurogenesis. Provides molecular, genetic and biochemical evidence for Applicants now describe zebrafish mutations that selectively affect the development and discrimination of many neuronal types in the central (CNS) and peripheral (PNS) nervous systems. Further molecular, genetic and biochemical analysis indicate that the phenotype of the mutation is caused by mutations that disrupt the suppressive function of zSpt5 in transcription elongation but not the stimulatory function. These findings indicate that regulation of transcription elongation constitutes an essential physiological control step of gene expression during neurogenesis.
[0042]
1. Transcription elongation as a regulated process
The mutated foggy phenotype reveals the significance of transcription elongation as a regulated process in vivo. This type of regulation provides a level of control unavailable to the mechanism of transcription initiation. First, it allows for a very quick response to environmental changes or to extracellular stimuli. For example, Drosophila can tolerate heat as its heat shock protein hps70 transcript is regulated by an anti-termination mechanism that eliminates the heat stimulus; thus, transcription is completed quickly and is available for protein synthesis. Regulation of transcription elongation also allows for control during the course of gene transcription. For example, the human dystrophin gene spans over 2000 kb and may take over 50 hours to fully transcribe. Uptain et al., Supra. Once initiated, without interference at the stage of transcription elongation, transcription of such genes will not be regulated for more than two days. Conversely, pool retention of almost complete mRNAs with aborted RAN Pol II or termination near the end of dystrophin transcription will allow rapid production of this protein in response to anti-termination signals. Finally, the combined use of transcription initiation and elongation factors will allow control of spatial and temporal gene expression with relatively few factors. The flexibility, rapid response and fine control of gene expression are particularly important during nervous system development. As a result, pioneering cells must constantly monitor and respond to changes in the extracellular environment and achieve significant cell diversification at intervals of several hours. Anderson and Jan, 1997; Ericson et al., 1996, Cell 87: 661-73.
[0043]
2. Specificity of the foggy mutant phenotype
Applicants have identified here site mutations that disrupt the inhibitory but not stimulatory activity of Spt5 in transcription elongation, resulting in failure of certain subclasses of neurons and cells to complete their development. explain. The mutant phenotype confers significant spatial specificity affecting multiple classes of neurons across both the CNS and PNS. For example, it can be found in iridescent vesicles, melanocytes and sympathetic nerves in neural crest-derived cell lines, but not in dorsal root ganglion neurons. In the case of cellular CNS, it is defective in DA and NA, but not in 5HT or Moutner neurons. The defect does not affect only one type of neurotransmitter production, as dopamine, noradrenaline and acetylcholine-producing neurons all affect it. Also, the effect on certain neurotransmitters is that 5HT + neurons are increased in the hypothalamus, whereas NA-producing cells are normally absent in the hindbrain (LC neurons) but near the heart (AAC cells), whereas in the hindbrain It appears to be in a particular area, as indicated by the fact that it does not increase.
[0044]
In time, mutations appear to affect the later stages of differentiation and possibly the subprogram of neuronal discrimination. This conclusion is supported by several findings. First, the expression of the Pan neuron marker, tubulin, appears normal in 48 hpf embryos. Guo et al., Supra. Second, homeoboxes containing the gene phox2a (Guo et al., 1999, Neuron 24: 555-66; Morin et al., 1997, Neuron 18: 411-423), which controls NA discrimination in LC and sympathetic nerves, It is normally expressed as a precursor of cells, but then disappears before these cells express any neurotransmitter synthase. Finally, the observation of extra 5HT neurons in the hypothalamus appears to be at the expense of DA neurons. The notion that foggy affects the ultimate neurotransmitter discrimination is further supported by the fact that neurons that remain foggy cannot complete their differentiation. For example, some DA neurons in the foggy hypothalamus express low levels of TH (FIGS. 1B and C), while the remaining axonal neurons appear to express low levels of GABA synthase GAD ( Figures 2E and F).
In the retina, multiple neuronal defects were observed, with a significantly lower increase in ganglion neurons. In the retina, ganglion neurons initially appear to increase the likelihood that neural precursors undergo immature differentiation in the absence of foggy and are no longer available to exhibit the latter cell fate. In the hypothalamus, defective DA neurons and excess 5HT neurons appear to occur simultaneously (data not shown). However, in the midbrain / hindbrain region of the chicken, the development of 5HT neurons is that of a DNA pair suggesting that small temporal differences in the timing of development between DNA and 5HT may also be present in fish (unpublished). Data).
[0045]
3. Spatial and temporal regulation of transcription elongation by foggy
Foggy is widely expressed during development and appears to be ubiquitously expressed in living organisms. Yamaguchi et al., Supra. In addition, DRB, a drug with DSIP-dependent activity, inhibits 95% or more of cellular Pol II transcript mRNA synthesis (Sehgal et al., 1976, Cell 9: 473-80), and Spt4 and Spt5 are class II genes. Suggest that most, if not all, are involved in transcriptional regulation. Nevertheless, the foggy mutation appears to result in selective developmental changes, affecting only a subset of the genes. Mutations in widely expressed proteins that cause cell type-specific cell fate changes are often seen, but are not well understood. For example, disruption of the orphan steroid receptor NurrI, which is widely expressed in the CNS, limits the loss of midbrain DA neurons in mice. Saucedo-Cardenas et al., 1998, Proc. Natl. Sci. USA 95: 4013-4018; Zetterstrom et al., 1997, Science 276: 248-250. Similarly, the widely distributed EGF-related molecule, on-eyed pinhead, causes defects in the notochord but not in the notochord, even during germinal embryogenesis expressed together in these tissues. Zhang et al., 1998, Cell 92: 241-51.
[0046]
There are at least three possible interpretations of the cell-specific phenotype of foggy. First, the foggy mutation is complemented by a putative foggy / zSpt5 family member or by the maternal contribution of foggy mRNA. Alternatively, although widely expressed, foggy / zSpt5 can affect only a subset of genes physiologically, for which elongation is the rate-limiting step. Consistent with this possibility is the finding that Pol II mutations that reduce elongation rates cause Drosophila homeotic transformation. Chen et al., 1993; Mol. Cell. Biol. 13: 4214-22; Coulter and Greenleaf, 1985, J. Biol. Chem. 260: 13190-8. Finally, it is possible that activity or nuclear localization rather than expression of fogg / zSpt5 could be regulated in a tissue or temporally specific manner, or by other factors in response to extracellular signals . Since the mutation affects the inhibitory function of foggy / zSpt5, the observed phenotype is caused by abnormal expression of the gene, whose transcription appears to be normally restricted or closed by premature termination . Overexpression of such genes in inappropriate cell types or during inappropriate developmental stages can result in neuronal loss. The specificity of the foggy phenotype explains that the genes affected seem to encode regulatory rather than housekeeping proteins. A deeper understanding of the mechanisms behind unifying the observed developmental abnormalities will require the identification of foggy / zSpt5 target genes.
[0047]
Although foggy has the ability to affect the transcription of all Pol II genes, some muscle evidence suggests that it normally plays a regulatory role in gene expression. First, foggy / zSpt5 and its mammalian homologs are not required for transcription elongation in vitro (FIG. 8). Second, foggy / zSpt5 appears to have a dual effect on transcription elongation and can act as a negative or positive regulator in different environmental conditions (respectively, the presence of DRB or low concentrations of nucleotides, (FIG. 8). Third, the fact that the foggy / zSpt5 mutation loses its inhibitory activity explains that the phenotype is not the result of the fundamental inability of Pol II to spread RNA transcription.
Spt5 was shown to bind to Spt4, the large subunit of Pol II and the NELF protein complex, and to inhibit transcription elongation by RNA Pol II by this interaction. Although Spt5 does not bind to the carboxy-terminal domain (CTD) of Pol II, its inhibitory activity is offset by phosphorylation of CTD by DRB-sensitive kinase P-TEFb.
[0048]
Structure-function analysis of hSpt5 (Yamaguchi et al., supra) showed that amino acids 176-270 resulted in binding to Spt4, while amino acids 313-430 were required for binding to Pol II. The function of the C-terminal domain of Spt5 has not been previously known. The present application demonstrates that one amino acid substitution of zSpt5 at position 1012 (corresponding to amino acid 1014 of hSpt5) inactivates the negative function of DSIF. A possible function of the C-terminal domain of Spt5 is as a binding domain of the NELF complex that is critically required for the inhibitory activity of Spt5. Yamaguchi et al., Supra. Alternatively, the C-terminal domain can be linked to an unidentified regulator of transcription elongation. In one possibility, the DSIF / NELF complex may function like a bacterial NusA / Num complex. In bacteria, the NusA protein shows that transcription termination is activated by the E. coli phage HK022 elongation-inhibiting Num, which binds to both DNA and RNA in the presence of NuseA and generates against its double-stranded DNA template. Terminates transcription during the period. Watnick and Gottesman, 1999, Science 286: 2337-2339. Spt5 containing four Nus homology domains and NELF-the latter containing an RNA binding component, can each act by a similar mechanism. Yamaguchi et al., Supra. Alternatively, Spt5 linked to Spt4, NELF, transcription elongation and additional members of the chromatin and Spt proteins that bind to the protein Spt6 affect histone compaction and structuring and suppress Pol II migration by nucleosomes. Bortvin and Winston, 1996, Science 272: 1473-6; Compagnone-Post and Osley, 1996, Genetics 143: 1543-54; Swanson and Winston, supra. In addition to its inhibitory activity, Spt5 acts as a stimulator of transcription elongation at low nucleotide concentrations. Surprisingly, this stimulatory activity of Spt5 is retained in the mutation. These findings support the view that the inhibitory and stimulatory activities of Spt5 are in separate domains, or that the stimulatory function of Spt5 is independent of NEFL.
[0049]
4. Regulation of foggy by exogenous signals
Although there is ample evidence for the regulation of transcription initiation by many signaling pathways and extracellular stimuli, the only reported link between transcriptional elongation in multicellular organisms and exogenous factors has been the study of Notch signaling in nematodes Derived from The Notch signaling system determines cell fate, including the decision to become a neuron or epidermal cell, develop as a ganglion cell, cone or rod-shaped photoreceptor, and adopt a defined neural crest-derived cell fate. It involves a complex, sometimes two, choice. A general model of Notch signaling involves a direct interaction between its cytoplasmic domain, which cleaves the next ligand binding, and a homolog of the hairless transcription initiation factor (Su (H)). However, in addition to Su (H), Notch may be activated by other activators or suppressors of transcription initiation, such as NF-κB, Groucho, and Mastermind (Artavanis-Tsakonas et al., Supra; Lewis, 1998, Sem. Cell Devel. Biol. 9: 583-9; Milner and Bigas, 1999, Blood 93: 2431-2448) and for mediating signal transduction by factors not yet identified. Shawber et al., 1996, De el. 122: 3765-3773; Wang et al., 1997, Devel. 124: 4435-46.
[0050]
Interestingly, a two-hybrid screening identification component of yeast that acts downstream of the nematode Notch indicates that Notch physically interacts with worm homologs of EMB-5, Spt6. In addition, genetic studies have demonstrated that mutations in EMB / Spt6 affect constitutive activity in determining cell fate or penetrance of mutated Notch. Hubbard et al., 1996, Science 273: 112-5. Taken together with reports that Spt6 and Spt5 interact genetically and physically (Swanson and Winston, 1992, supra), these findings indicate that Spt5 activity may be a downstream mediator of the Notch pathway. Increase the possibility. Alternatively, mammalian members of the FGF protein family have been shown to induce 5HT neurons in return for midbrain DA neurons (Ye et al., 1998, Cell 93: 755-66), so that foggy / zSpt5 is May be related to signaling systems.
[0051]
B. foggy mutant
In addition to the full length native sequence foggy polypeptides described herein, it is contemplated that foggy variants may be prepared. Foggy variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into foggy DNA and / or by synthesizing the desired foggy polypeptide. One skilled in the art will appreciate that amino acid changes can alter the post-translational process of foggy, such as changing the number or position of glycosylation sites or altering membrane anchoring properties.
Mutations in the native full-length sequence foggy or various domains of the foggy described herein can be made using any of the techniques and guidelines for conservative and non-conservative mutations described, for example, in US Pat. No. 5,364,934. I can do it. The mutation may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding foggy that will change the amino acid sequence of foggy as compared to the native sequence foggy. In some instances, the mutation is the replacement of at least one amino acid by one or more domains of foggy with any other amino acid. Guidance as to whether amino acid residues can be inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity is made by comparing the sequence of foggy to that of a known homologous protein molecule, with regions of high homology. It can be found by minimizing the number of amino acid sequence changes. Amino acid substitutions can be the result of substitution of one amino acid for another amino acid of similar structure and / or chemical properties, for example, substitution of leucine for serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions or deletions can optionally be in the range of about 1 to 5 amino acids. Tolerable mutations can be determined by systematically inserting, deleting or substituting amino acids in the sequence and testing the resulting mutants for the activity exhibited by the full-length or mature native sequence.
[0052]
A foggy polypeptide fragment is provided herein. Such fragments may be truncated at the N-terminus or C-terminus, for example, as compared to the full-length native protein, or may lack internal residues. Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the foggy polypeptide.
Foggy fragments can be prepared by any of a number of common techniques. The desired peptide fragment may be chemically synthesized. Alternative methods include digestion with an enzyme, for example, treating the protein with an enzyme known to cleave the protein at a site defined by a particular amino acid residue, or digesting the DNA with appropriate restriction enzymes Producing a foggy fragment by isolating the fragment. Yet another suitable technique involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding the desired polypeptide fragment by the polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides that define the desired termini of the DNA fragment are used for the 5 'and 3' primers of the PCR. Preferably, the foggy polypeptide fragment is as shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) shares at least one biological and / or immunological activity with the native foggy polypeptide.
In certain embodiments, conservative substitutions of interest are shown in Table 6 under the heading of preferred substitutions. If such a substitution results in a change in biological activity, a more substantial change is introduced and the product is screened, such as those listed in Table 6 as substitution examples or as further described below with respect to amino acid classification. Is done.
[0053]
Table 6

[0054]
Substantial modifications of foggy polypeptide function or immunological identity include (a) the structure of the polypeptide backbone of the substitution region, such as a sheet or helical arrangement, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or ( c) Achieved by choosing substituents that differ significantly in their effect of maintaining side chain bulk. Naturally occurring residues can be grouped based on common side chain characteristics:
(1) Hydrophobicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) acidic: asp, glu;
(4) Basicity: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro; and
(6) Aromatic: trp, tyr, phe.
Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another. Also, such substituted residues may be introduced at conservative substitution sites, more preferably at the remaining (non-conserved) sites.
[0055]
Mutations can be made using techniques known in the art, such as oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-directed mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], restriction selection mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] or other well-known techniques for producing foggy mutant DNA. Can be performed on cloned DNA.
Also, scanning amino acid analysis can be used to identify one or more amino acids along a flanking sequence. Preferred scanning amino acids are relatively small, neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. Typically, alanine is a preferred scanning amino acid within this group because it eliminates side chains beyond the beta carbon and is less likely to alter the backbone structure of the mutant [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081. -1085 (1989)]. Alanine is also typically preferred because it is also the most common amino acid. In addition, it is often found in both buried and exposed locations [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. . If alanine substitution does not yield a sufficient amount of variant, isoteric amino acids can be used.
[0056]
C. Modification of foggy
Covalent modifications of foggy are included within the scope of the present invention. One type of covalent modification involves reacting the targeted amino acid residue of the foggy polypeptide with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with the selected side chain of the foggy or the N- or C-terminal residue. . Derivatization with a bifunctional agent is useful, for example, for crosslinking foggy to a water-insoluble support matrix or surface for use in the method of purifying anti-foggy antibodies and vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, for example, 4-azidosalicylate, 3,3′-dithiobis (succinimidate) Homobifunctional imide esters, including disuccinimidyl esters such as dipropionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane, and methyl-3-[(p-azidophenyl) dithio ] Including reagents such as propioimidate.
Other modifications include deamination of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and histidine, respectively. Methylation of α-amino group of side chain [TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-terminal amine acetylation, and optional Including amidation of the C-terminal carboxyl group.
[0057]
Another type of covalent modification of the foggy polypeptide that falls within the scope of the present invention involves altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. "Altering the native glycosylation pattern" refers, for this purpose, to the deletion of one or more carbohydrate moieties found in the native sequence foggy (removal of existing glycosylation sites or chemical and / or enzymatic means). And / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native sequence foggy. In addition, the phrase includes qualitative changes in glycosylation of the native protein, including changes in the nature and proportion of the various carbohydrate moieties present.
Addition of a glycosylation site to a foggy polypeptide may involve altering the amino acid sequence. The alteration may be made, for example, by the addition or substitution of one or more serine or threonine residues to the native sequence foggy (O-linked glycosylation site). The foggy amino acid sequence is optionally altered through changes at the DNA level, particularly by mutating the DNA encoding the foggy polypeptide at preselected bases to produce codons that are translated into the desired amino acids. Is also good.
Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on a foggy polypeptide is by chemical or enzymatic attachment of glycosides to the polypeptide. Such methods are described in the art, for example, in WO 87/05330 published Sep. 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 (1981). It is described in.
[0058]
Removal of the carbohydrate moiety present on the foggy polypeptide can be accomplished chemically or enzymatically, or by mutational substitution of the codon encoding the amino acid residue targeted for glucosylation. Chemical deglycosylation techniques are known in the art and are described, for example, by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), and by Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). ). Enzymatic cleavage of the carbohydrate moiety on the polypeptide is achieved by using various endo and exoglycosidases as described in Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
Another type of covalent modification of foggy is to convert a foggy polypeptide to one of a variety of non-proteinaceous polymers, such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, or polyoxyalkylene, US Pat. No. 4,835,689; No. 4,301,144; No. 4,670,417; No. 4,791,192 or No. 4,179,337. Including
Also, the foggy of the present invention may be modified to produce a chimeric molecule comprising the foggy fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.
[0059]
In one embodiment, such a chimeric molecule comprises a fusion of foggy with a tag polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. The epitope tag is generally located at the amino or carboxyl terminus of the foggy. The presence of such foggy epitope tag forms can be detected using an antibody against the tag polypeptide. Also, provision of the epitope tag allows the foggy to be easily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or another type of affinity matrix that binds to the epitope tag. Various tag polypeptides and their respective antibodies are well known in the art. Examples include poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-his-gly) tags; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159. -2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; and herpes simplex virus sugars Includes a protein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides are flag peptides [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptides [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; α-tubulin epitope peptides [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; and T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 ( 1990)].
In another embodiment, the chimeric molecule may comprise a fusion with a foggy immunoglobulin or a particular region of an immunoglobulin. For a bivalent form of the chimeric molecule (also called an "immunoadhesin"), such a fusion could be the Fc region of an IgG molecule. Ig fusions preferably comprise a soluble (transmembrane domain deleted or inactivated) form of a foggy polypeptide in place of at least one variable region within an Ig molecule. In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH2 and CH3, or the hinge, CH1, CH2 and CH3 regions of an IgG1 molecule. See U.S. Patent No. 5,428,130 issued June 27, 1995 for the production of immunoglobulin fusions.
[0060]
D. Preparation of foggy
The following description relates primarily to a method for producing foggy by culturing cells transformed or transfected with a vector containing foggy nucleic acids. Of course, it is contemplated that foggy may be prepared using other methods well known in the art. For example, a foggy sequence, or a portion thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid-phase technology [eg, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, California (1969). ); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. In vitro protein synthesis methods may be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis can be performed, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) according to the manufacturer's instructions. The various parts of the foggy are chemically synthesized separately and may be combined using chemical or enzymatic methods to produce full length foggy.
[0061]
1. Isolation of DNA encoding foggy
DNA encoding foggy can be obtained from a cDNA library prepared from a tissue that carries foggy mRNA and will express it at detectable levels. Thus, human foggy DNA can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue, as described in the Examples. Foggy-encoding genes can also be obtained from genomic libraries or by known synthetic methods (eg, automated nucleic acid synthesis).
Libraries can be screened with probes (such as antibodies to foggy or oligonucleotides of at least about 20-80 bases) designed to identify the gene of interest or the protein encoded by the gene. Screening of a cDNA or genomic library with the selected probe is performed using standard procedures described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). can do. Another method of isolating the gene encoding foggy uses the PCR method [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
[0062]
The following example describes a technique for screening a cDNA library. The oligonucleotide sequence selected as a probe must be of sufficient length and sufficiently distinct to minimize false positives. Preferably, the oligonucleotide is labeled such that it is detectable upon hybridization with DNA in the library being screened. Labeling methods are well known in the art,³²Includes the use of radiolabels, such as P-labeled ATP, biotinylation or enzyme labels. Hybridization conditions, including moderate and high stringency, are given in Sambrook et al., Supra.
The sequences identified in such a library screening method can be compared and aligned with known sequences that have been deposited in public databases such as GenBank or personal sequence databases and made available to the public. Sequence identity (at either the amino acid or nucleotide level) within a determined region or over the entire length of the molecule can be determined using methods known in the art and described herein. .
Nucleic acids having a protein coding sequence may for the first time use the deduced amino acid sequences disclosed herein and, if necessary, see Sambrook et al., Supra, for detecting intermediates and precursors of mRNA that were not reverse transcribed into cDNA. Obtained by screening selected cDNA or genomic libraries using conventional primer extension methods as described.
[0063]
2. Selection and transformation of host cells
A host cell is transfected or transformed with an expression or cloning vector for foggy production as described herein to induce a promoter, select transformants, or amplify a gene encoding the desired sequence. Culture in a suitably modified conventional nutrient medium. Culture conditions, such as medium, temperature, pH, etc., can be selected by those skilled in the art without undue experimentation. In general, principles, protocols, and practical techniques for maximizing cell culture productivity can be found in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, edited by M. Butler (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Supra. it can.
Methods for Prokaryotic Cell Transfection and Eukaryotic Cell Transformation, eg, CaCl 2₂, CaPO₄Liposome-mediated and electroporation are known to those skilled in the art. Transformation is accomplished using standard techniques appropriate to the host cell used. The calcium treatment using calcium chloride or electroporation described in Sambrook et al., Supra, is generally used for prokaryotes. Infection with Agrobacterium tumefaciens has been described as being described in Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and WO 89/05859 published June 29, 1989. Used for conversion. For mammalian cells without such cell walls, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) can be used. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in U.S. Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed as described by Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 (1979). It is performed according to the method. However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or bacterial protoplast fusion using polycations such as polybrene, polyornithine, etc., can also be used. For various techniques for transforming mammalian cells, see Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988).
[0064]
Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors described herein are prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells. Suitable prokaryotes include, but are not limited to, eubacteria, eg, Gram-negative or Gram-positive organisms, eg, Enterobacteriaceae such as E. coli. Various E. coli strains are available to the public, for example, E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC 53,635). Other preferred prokaryotic host cells are E. coli, such as E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, such as Salmonella typhimurium, Serratia, such as Serratia marcesans ( Serratia marcescans) and Shigella, and bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis (e.g., Vasiliricheni as described in DD266,710 published April 12, 1989). Formis 41P), Pseudomonas, for example, Enterobacteriaceae such as Pseudomonas muscle and Streptomyces. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for recombinant DNA production fermentations. Preferably, the host cells secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. For example, strain W3110 may be modified to carry a genetic mutation in a gene encoding a foreign protein in the cell; examples of such hosts include E. coli W3110 strain 1A2 with complete genotype tonA; Escherichia coli W3110 strain 9E4 having a large genotype tonA ptr3;^rE. coli W3110 strain 27C7 with ATCC (ATCC 55,244); complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ommpT rbs7ilvGkan^rEscherichia coli W3110 strain 37D6 having a non-kanamycin resistance degP deletion mutation; Escherichia coli W3110 strain 40B4, which is a 37D6 strain having a non-kanamycin-resistant degP deletion mutation; Includes E. coli strains with proteases. Alternatively, in vitro methods of cloning, such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions, are preferred.
[0065]
In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for foggy-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Other examples include Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985); Kluyveromyces hosts (U.S. Patent No. 4). , 943, 529; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), for example, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 ( 2): 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 (1990). ), K. thermotolerans and K. marxianus; Yarrow Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichodel Malaysia (reesia) ( EP 244, 234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, such as Occidentalis. (EP 394,538 published Oct. 31, 1990); and filamentous fungi, such as Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published Jan. 10, 1991); For example, Aspergillus nidarans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and black mold (Kelly and Hynes). , EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Preferred methylotropic yeasts herein include, but are not limited to, Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Rhodotorula. Includes yeast capable of growing in methanol selected from the genus. A list of specific species that are exemplary of this yeast taxonomy is provided in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
[0066]
Suitable host cells for the expression of glycosylated foggy are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include insect cells such as Drosophila S2 and Spodspera Sf9, and plant cells. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese Hamster Ovary (CHO) and COS cells. Many specific examples are the monkey kidney CV1 strain transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); the human embryonic kidney strain (293 or 293 subcloned for growth in suspension culture). Cells, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)). Mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)) human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatocytes (Hep G2, HB8065); and mouse breast tumors Cells (MMT 060562, ATTC CCL51). The selection of an appropriate host cell is within the skill of the art.
[0067]
3. Selection and use of replicable vectors
The nucleic acid encoding foggy (eg, cDNA or genomic DNA) is inserted into a replicable vector for cloning (amplification of the DNA) or expression. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, virus particle, or phage. The appropriate nucleic acid sequence is inserted into the vector by various techniques. Generally, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Construction of suitable vectors containing one or more of these components employs standard ligation techniques known to those of skill in the art.
Foggy is not only produced directly by recombinant techniques, but also as a fusion peptide with a heterologous polypeptide, which is a signal sequence or other polypeptide with a specific cleavage site at the N-terminus of the polypeptide. Is also produced. Generally, the signal sequence is a component of the vector or is part of the foggy-encoding DNA that is inserted into the vector. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, signal sequences include yeast invertase leaders, α-factor leaders (Saccharomyces and Kluyveromyces α-factor leaders, the latter described in US Pat. No. 5,010,182). Or an acid phosphatase leader, the C. albicans glucoamylase leader (EP 362179 published April 4, 1990), or WO 90/13646 published November 15, 1990. May be the signals described in the above. In mammalian cell expression, mammalian signal sequences may be used for signal secretion from the same or related secreted polypeptides as well as for direct secretion of proteins such as viral secretory leaders.
[0068]
Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known for many bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are mammalian. Useful for cloning vectors in animal cells.
Expression and cloning vectors typically contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes are (a) that confer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) supplement auxotrophic deficiencies, or (c) Encodes a protein that supplies important nutrients not available from complex media, such as D-alanine racemase.
Examples of suitable selectable markers for mammalian cells are those capable of identifying a cellular component capable of taking up the foggy-encoding nucleic acid, such as DHFR or thymidine kinase. A preferred host cell when using wild-type DHFR is DHFR activity prepared and grown as described by Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). Defective CHO cell line. A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al. Gene, 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
[0069]
Expression and cloning vectors usually contain a promoter operably linked to the foggy-encoding nucleic acid sequence and that controls mRNA synthesis. Promoters that are recognized by a variety of possible host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, tryptophan (trp ) Promoter systems [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776], and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983). )]including. Promoters for use in bacterial systems also will have a Shine-Dalgarno (S.D.) sequence operably linked to the DNA encoding foggy.
Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] or other glycolytic enzymes [Hess et al., J. Am. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)], such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, Glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, trioselate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
[0070]
Other yeast promoters include inducible promoters that have the additional effect of regulating transcription by growth conditions, such as alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, and glycerol. There are promoter regions for aldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and enzymes that govern maltose and galactose utilization. Vectors and promoters suitably used for expression in yeast are further described in EP 73,657.
Foggy transcription from vectors in mammalian host cells has been described, for example, by polyomavirus, infectious epithelioma virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine nipple Promoters derived from the genomes of viruses such as oncovirus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), heterologous mammalian promoters such as actin promoter or immunoglobulin promoter, And the promoter obtained from the heat shock promoter, as long as such a promoter is compatible with the host cell system.
[0071]
Transcription of the DNA encoding the desired foggy by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers, usually about 10 to 300 base pairs, are cis-acting elements of DNA that act on a promoter to enhance its transcription. Many enhancer sequences from mammalian genes are currently known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the SV40 enhancer on the late side of the replication origin (100-270 base pairs), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers. The enhancer may be spliced into the vector at a position 5 'or 3' to the foggy coding sequence, but is preferably located 5 'from the promoter.
Expression vectors used in eukaryotic host cells (nucleated cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) contain sequences necessary for termination of transcription and stabilization of mRNA. Including. Such sequences can be obtained from the usually 5 ', and sometimes 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding foggy.
Other methods, vectors and host cells suitable for adapting the synthesis of foggy in recombinant vertebrate cell culture are described in Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.
[0072]
4. Gene amplification / expression detection
Amplification and / or expression of the gene was carried out by using an appropriately labeled probe based on the sequence provided herein, for example, a conventional Southern blot method, a Northern blot method for quantifying mRNA transcription [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization. Alternatively, an antibody capable of recognizing a specific duplex, including a DNA duplex, an RNA duplex, and a DNA-RNA hybrid duplex or a DNA-protein duplex, can also be used. The antibody can then be labeled and the assay performed, wherein the duplex is bound to the surface, so that upon formation of the duplex at the surface, the antibody bound to the duplex Presence can be detected.
Alternatively, gene expression can be measured by immunological methods that directly quantify gene product expression, such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of a sample solution may be monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is directed against the native sequence foggy polypeptide or to a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein, or to an exogenous sequence fused to foggy DNA and encoding a specific antibody epitope. Can be prepared for
[0073]
5. Purification of polypeptide
Foggy forms can be recovered from culture media or lysates of host cells. If membrane-bound, they can be detached from the membrane using a suitable washing solution (eg, Triton-X100) or enzymatic cleavage. Cells used for foggy expression can be disrupted by various chemical or physical means, such as freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption, or cell lysing agents.
It is desirable to purify the foggy from recombinant cell proteins or polypeptides. Purified by the following procedure, which is an example of a suitable purification procedure: fractionation on an ion exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin such as DEAE; chromatofocusing; PAGE; ammonium sulfate precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; protein A Sepharose column to remove contaminants such as IgG; and metal chelation columns to bind epitope tag forms of foggy. Many protein purification methods known in the art and described in, for example, Deutcher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) can be used. it can. The purification process chosen will depend, for example, on the production method used and in particular on the nature of the particular foggy produced.
[0074]
E. FIG. Common uses of foggy
The nucleotide sequences encoding foggy (or their complements) have various uses in the field of molecular biology, including use as hybridization probes, in chromosome and gene mapping, and in the production of antisense RNA and DNA. are doing. Also, foggy nucleic acids will be useful for preparing foggy polypeptides by the recombinant techniques described herein.
The full-length native sequence foggy gene (SEQ ID NO: 1) or a portion thereof can be obtained by isolating full-length foggy cDNA or by using FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) of another gene having the desired sequence identity to the foggy sequence (eg, a naturally occurring variant of foggy or one encoding foggy from another species). It can be used as a hybridization probe for a cDNA library for separation. In some cases, the length of the probe is from about 20 to about 50 bases. Hybridization probes may be derived, at least in part, from novel regions of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which regions, without undue experimentation, may include promoters, enhancer components and introns of the native sequence foggy. Can be derived from genomic sequences containing For example, a screening method involves isolating the coding region of the foggy gene using a known DNA sequence to synthesize a selected probe of about 40 bases. The hybridization probe is³²P or³⁵It can be labeled with various labels, including radioactive nucleotides such as S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase linked to the probe via an avidin / biotin binding system. A labeled probe having a sequence complementary to the foggy gene of the present invention can be used to screen a library of human cDNA, genomic DNA or mRNA and determine which members of the library will hybridize to the probe. Can be used for Hybridization techniques are described in further detail in the Examples below.
[0075]
Any EST sequence disclosed in the present application can be used as a probe in the methods described herein.
Other useful fragments of foggy nucleic acids include antisense or sense oligonucleotides comprising single-stranded nucleic acid sequences (either RNA or DNA) that can bind to target foggy mRNA (sense) or foggy DNA (antisense) sequences. Antisense or sense oligonucleotides, according to the present invention, include fragments of the coding region of foggy DNA. Such a fragment generally comprises at least about 14 nucleotides, preferably about 14 to 30 nucleotides. The ability to derive antisense or sense oligonucleotides based on a cDNA sequence encoding a given protein is described, for example, by Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659: 1988) and van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, 1988).
Binding of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleic acid sequence results in duplex formation, which may be one of several methods, including promoting duplex resolution, premature termination of transcription or translation, or Other methods block transcription or translation of the target sequence. Thus, antisense oligonucleotides are used to block expression of the foggy protein. Antisense or sense oligonucleotides further include oligonucleotides having a modified sugar-phosphodiester backbone (or other sugar linkage, such as those described in WO 91/06629), wherein such sugar linkages are endogenous nuclease resistant. is there. Oligonucleotides with such resistant sugar linkages are stable in vivo (ie, can withstand enzymatic degradation), but retain sequence specificity for binding to a target nucleotide sequence.
[0076]
Other examples of sense or antisense oligonucleotides are organic moieties, such as those described in WO 90/10048, and other moieties that increase the affinity of the oligonucleotide for a target nucleic acid sequence, such as poly- ( (L-lysine). Furthermore, an intercalating agent such as ellipticine, an alkylating agent, or a metal construct may be linked to the sense or antisense oligonucleotide to modify the binding specificity of the antisense or sense oligonucleotide to the target nucleotide sequence.
Antisense or sense oligonucleotides include, for example, CaPO₄-Introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by any method of gene transformation, including mediated DNA transfection, electroporation, or by using a gene transformation vector such as Epstein-Barr virus. In a preferred method, the antisense or sense oligonucleotide is inserted into a suitable retroviral vector. Cells containing the target nucleic acid sequence are contacted with the recombinant retroviral vector in vivo or ex vivo. Suitable retroviral vectors include, but are not limited to, those derived from the murine retrovirus M-MuLV, N2 (retrovirus derived from M-MuLV), or the double named DCT5A, DCT5B and DCT5C. Includes copy vectors (see WO 90/13641).
[0077]
Also, sense or antisense oligonucleotides may be introduced into cells containing the target nucleotide sequence by forming a complex with a ligand binding molecule, as described in WO 91/04753. Suitable ligand binding molecules include, but are not limited to, cell surface receptors, growth factors, other cytokines, or other ligands that bind to cell surface receptors. Preferably, the complexing of the ligand binding molecule substantially inhibits the ability of the ligand binding molecule to bind to its corresponding molecule or receptor, or to block the entry of a sense or antisense oligonucleotide or complex thereof into cells. Does not inhibit.
Alternatively, sense or antisense oligonucleotides may be introduced into cells containing the target nucleic acid sequence by formation of an oligonucleotide-lipid complex, as described in WO 90/10448. The sense or antisense oligonucleotide-lipid complex is preferably degraded intracellularly by endogenous lipase.
Antisense or sense RNA or DNA molecules generally have a length of at least about 5 bases, about 10 bases, about 15 bases, about 20 bases, about 25 bases, about 30 bases. Length, about 35 bases long, about 40 bases long, about 45 bases long, about 50 bases long about 55 bases long, about 60 bases long, about 65 bases long About 70 bases long, about 75 bases long, about 80 bases long, about 85 bases long, about 90 bases long, about 95 bases long, about 100 bases long It is.
Probes can also be used in PCR techniques to create a pool of sequences for identification of closely related foggy coding sequences.
The nucleotide sequence encoding foggy can also be used for mapping a gene encoding the foggy and for preparing a hybridization probe for analyzing a gene of an individual having a genetic disease. The nucleotide sequences provided herein can be mapped to chromosomes and specific regions of chromosomes using well-known techniques such as in situ hybridization, binding analysis to known chromosomal markers, and hybridization screening in libraries. .
[0078]
Where the coding sequence of foggy encodes a protein that binds to another protein (e.g., where foggy is a receptor), foggy can be used in assays to identify other proteins or molecules involved in binding interactions. . In this way, inhibitors of the receptor / ligand binding interaction can be identified. Proteins involved in such binding interactions can also be used to screen for peptides or small molecule inhibitors or agonists of binding interactions. The receptor foggy can also be used to isolate related ligands. Screening assays are designed for the discovery of lead compounds that mimic the biological activity of native foggy or foggy receptors. Such screening assays are also used for high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates. Small molecules contemplated include synthetic organic or inorganic compounds. The assays can be performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biological screening assays, immunoassays and cell-based assays that are well known and characterized in the art.
[0079]
Nucleic acids encoding foggy or any modified form thereof can also be used to produce transgenic or "knockout" animals, which are useful for the development and screening of therapeutically useful reagents. A transgenic animal (eg, a mouse or rat) is an animal that has cells containing a transgene introduced into the animal or an ancestor of the animal before birth, eg, at the embryonic stage. A transgene is a DNA that has been integrated into the genome of the cell in which the transgenic animal develops. In one embodiment, the foggy-encoding cDNA can be used to clone foggy-encoding genomic DNA by established techniques, wherein the genomic sequence has cells expressing the foggy-encoding DNA. It can be used to produce transgenic animals. Methods for producing transgenic animals, particularly certain animals such as mice or rats, have become conventional in the art and are described, for example, in US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009. I have. Typically, particular cells are targeted for the transfer of the foggy transgene with a tissue-specific enhancer. Transgenic animals containing a copy of the foggy-encoding transgene introduced into the animal's germline at the embryonic stage can be used to study the effects of increased expression of foggy-encoding DNA. Such animals can be used, for example, as tester animals for reagents that would provide protection against pathological conditions involving their overexpression. In this aspect of the invention, treating an animal with a reagent and having a lower incidence of a pathological condition compared to an untreated animal having the transgene indicates a potential therapeutic treatment for the pathological condition. .
[0080]
Alternatively, a non-human homologue of foggy has a defect encoding foggy due to homologous recombination between the altered genomic DNA encoding foggy introduced into the embryonic stem cells of the animal and the endogenous gene encoding foggy. Alternatively, it can be used to create foggy "knockout" animals with altered genes. For example, cDNA encoding foggy can be used for cloning genomic DNA encoding foggy according to established techniques. A portion of the genomic DNA encoding foggy can be deleted or replaced with another gene, such as a gene encoding a selectable marker used to monitor integration. Typically, the vector contains several kilobases of unchanged flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) [eg, for homologous recombination vectors, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987). checking]. The vector is introduced into embryonic stem cells (eg, by electroporation), and cells in which the introduced DNA has been homologously recombined with the endogenous DNA are selected [eg, Li et al., Cell, 69: 915 (1992). )reference]. The selected cells are then injected into the blastocyst of an animal (e.g., a mouse or rat) to form an assembled chimera [e.g., Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, EJ Robertson, ed. , Oxford, 1987), pp. 113-152]. The chimeric embryos are then implanted into a suitable pseudopregnant female nanny to create "knock-out" animals at intervals. Progeny that have DNA homologously recombined in the embryonic cells are identified by standard techniques and can be used to propagate an animal in which all cells of the animal contain the homologously recombined DNA. . Knockout animals are characterized by certain pathological conditions due to the absence of the PRO polypeptide and the ability to protect against the development of that pathological condition.
[0081]
Nucleic acids encoding PRO polypeptides can also be used for gene therapy. In gene therapy applications, genes are introduced to achieve in vivo synthesis of a therapeutically effective amount of the gene product, for example, to replace a defective gene. "Gene therapy" includes both conventional gene therapy, in which a single treatment achieves a sustained effect, and administration of gene therapy agents, including single or repeated administration of a therapeutically effective DNA or mRNA. . Antisense RNA and DNA can be used as therapeutics to block the expression of certain genes in vivo. It has already been shown that short antisense oligonucleotides can be transferred into cells that act as inhibitors, despite low intracellular concentrations due to limited uptake by cell membranes (Zamecnik et al., Proc. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]). Oligonucleotides may be modified to facilitate incorporation, for example, by replacing their negatively charged phosphodiester groups with uncharged groups.
[0082]
Various techniques exist for introducing nucleic acids into viable cells. These techniques will vary depending on whether the nucleic acid is to be introduced into cultured cells in vitro or in vivo in cells of the intended host. Suitable methods for transferring nucleic acids to mammalian cells in vitro include liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, DEAE-dextran, calcium phosphate precipitation, and the like. Presently preferred in vivo gene transfer techniques are transfection with viral (typically retroviral) vectors and viral coat protein-liposome-mediated transfection (Dzau et al., Trends, in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). . In some situations, it may be desirable to provide the nucleic acid source with an agent that targets the target cell, such as a cell surface membrane protein or an antibody specific for the target cell, a ligand for a receptor on the target cell. When liposomes are used, proteins that bind to cell surface membrane proteins with endocytosis, such as capsid proteins or fragments thereof of a particular cell type tropism, antibodies to proteins that undergo internalization in the cycle, intracellular localization Proteins that target intracellular half-life are used for targeting and / or enhancing uptake. Techniques for receptor-mediated endocytosis are described, for example, in Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Is described by: For a review of gene marking and gene therapy protocols see Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).
[0083]
The foggy polypeptides described herein may also be used as molecular weight markers for protein electrophoresis purposes.
The nucleic acid molecules encoding the foggy polypeptides or fragments thereof described herein are useful for chromosome identification. In this regard, there is a need for the identification of new chromosomal markers since chromosome marking reagents based on actual sequences are scarcely available. Each foggy nucleic acid molecule of the present invention can be used as a chromosome marker.
The foggy polypeptides and nucleic acid molecules of the invention can also be used for tissue typing, wherein the foggy polypeptides of the invention can be used in one tissue, preferably in a pathological tissue as compared to a normal tissue of the same tissue type and as compared to the other. Different expression. Foggy nucleic acid molecules will find use for generating probes for PCR, Northern analysis, Southern analysis and Western analysis.
The foggy polypeptide described herein may be used as a therapeutic. The foggy polypeptides of the present invention are formulated according to known methods for preparing pharmaceutically useful compositions, whereby the foggy product is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier medium. Therapeutic formulations are prepared by mixing, in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution, an optional pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer with an active ingredient having the desired degree of purification ( Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., (1980)). Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and buffers such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid Agent; low molecular weight (less than 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; amino acid such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; Monosaccharides, disaccharides or other carbohydrates such as mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or TWEEN (trade name), PLURONICS (trade name) Or non-ionic surfactants such as PEG.
[0084]
Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by filtration through a sterile filter membrane before or after lyophilization and reconstitution.
Here, the therapeutic composition is typically placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.
The route of administration is by well-known methods, for example, injection or infusion by the intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial or intralesional route, topical administration, or sustained release system.
The dosage and desired drug concentration of the pharmaceutical composition of the invention will vary depending on the particular use intended. Determination of the proper dosage or route of administration is within the skill of the ordinary physician. Animal studies provide reliable guidance for determining effective amounts for human treatment. The effective amount of interspecies scaling is described in In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Ed., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96, Mordenti, J. and Chappell, W. `` The use of interspecies scaling in toxicokinetics. Can be implemented in accordance with the principles described in "1.
[0085]
When in vivo administration of a foggy polypeptide or an agonist or antagonist thereof is used, normal dosages can range from about 10 ng / kg to 100 mg / kg, preferably about 1 μg / day of the mammal's body weight per day, depending on the route of administration. / Kg / day to 10 mg / kg / day. Guidance on specific dosages and modes of delivery is provided in the literature; see, for example, U.S. Patent Nos. 4,657,760, 5,206,344, or 5,225,212. It is anticipated that different formulations will be effective against different therapeutic compounds and different diseases, for example, administration targeting one organ or tissue may require different transport than other organs or tissues Is done.
Where sustained release of the PRO polypeptide is desired in a formulation having release characteristics suitable for the treatment of any disease or disorder requiring administration of the PRO polypeptide, microencapsulation of the PRO polypeptide is contemplated. Microencapsulation of recombinant proteins for sustained release has been successfully performed with human growth hormone (rhGH), interferon (rhIFN-), interleukin-2, and MNrgp120. Johnson et al., Nat.Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed.Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio / Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland , `` Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, '' Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692. WO 96/40072, WO 96/07399; and U.S. Patent No. 5,654,010.
[0086]
Sustained release formulations of these proteins have been developed using poly-lactic-coglycolic acid (PLGA) polymers based on their biocompatibility and a wide range of biodegradable properties. Lactic acid and glycolic acid, degradation products of PLGA, are cleared immediately in the human body. Furthermore, the degradability of the polymer can be adjusted from months to years, depending on the molecular weight and composition. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide / glycolide polymer": M. Chasin and R. Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41.
The invention also encompasses methods of screening for compounds to identify or mimic or increase foggy polypeptide (agonists) or prevent or inhibit the effects of foggy polypeptide (antagonists). Screening assays for candidate antagonists include compounds that bind or complex with the foggy polypeptide encoded by the gene identified herein, or that otherwise inhibit the interaction of the encoded polypeptide with other cellular proteins. Is designed to identify Such screening assays include those applicable to high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for identifying small molecule drug candidates.
[0087]
The assay is performed in a variety of formats, including techniques known in the art, protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays.
All assays for antagonists require that they contact the candidate drug with a foggy polypeptide encoded by the nucleic acid identified herein under conditions and for a time sufficient for these two components to interact. And in common.
In a binding assay, the interaction is binding and the complex formed is isolated or detected in the reaction mixture. In a particular embodiment, the foggy polypeptide or candidate drug encoded by the gene identified herein is immobilized on a solid phase, eg, a microtiter plate, by covalent or non-covalent attachments. Non-covalent attachment is generally achieved by coating the solid surface with a solution of the polypeptide and drying. Alternatively, an immobilized antibody, eg, a monoclonal antibody, specific for the foggy polypeptide to be immobilized can be used to anchor it to a solid surface. The assay is performed by adding a non-immobilized component, which may be labeled with a detectable label, to the immobilized component, eg, the coated surface containing the anchored component. When the reaction is completed, unreacted components are removed, for example, by washing, and the complex fixed on the solid surface is detected. If the first non-immobilized component has a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complex formation has occurred. If the initial non-immobilized component has no label, complex formation can be detected, for example, by a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.
[0088]
If a candidate compound does not bind to a specific foggy polypeptide encoded by the interacting gene, the interaction with that polypeptide is assayed by well-known methods to detect protein-protein interactions. can do. Such assays include traditional techniques such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through a gradient or chromatography column. In addition, protein-protein interactions have been described by Fields and co-workers (Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582. (1991)), the yeast-based system disclosed in Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991). Can be monitored using Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically distinct modular domains, one acting as a DNA binding domain and the other as a transcriptional activation domain. The yeast expression system described in earlier literature (commonly referred to as the "two-hybrid system") takes advantage of this property and uses two hybrid proteins, while the target protein is the DNA binding domain of GAL4. And, on the other hand, the candidate activation protein is fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ reporter gene under the control of the GAL4 activating promoter depends on the reconstitution of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substance for β-galactosidase. A complete kit (MATCHMAKER®) for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using the two-hybrid technique is commercially available from Clontech. This system can be extended to map protein domains involved in a particular protein interaction, as well as to identify amino acid residues that are important for this interaction.
[0089]
Compounds that inhibit the interaction of the gene encoding the foggy polypeptide identified herein with an intracellular or extracellular component can be tested as follows: Usually, the reaction mixture is made up of the gene product and extracellular or intracellular The components are prepared to include the conditions and times under which the two products interact and bind. To test the ability of a candidate compound to inhibit binding, reactions are performed in the absence and presence of the test compound. In addition, a placebo may be added to the third reaction mixture to provide a positive control. The binding (complex formation) between the test compound and the intracellular or extracellular components present in the mixture is monitored as described above. Complex formation in the control reaction but not in the reaction mixture containing the test compound indicates that the test compound inhibits the interaction of the test compound with its binding partner.
[0090]
To assay an antagonist, a foggy polypeptide may be added with a compound that screens for a particular activity, and the ability of the compound to inhibit an activity of interest in the presence of the foggy polypeptide is such that the compound is an antagonist of the foggy polypeptide It indicates that. Alternatively, antagonists may be detected by binding the foggy polypeptide and a potential antagonist having a membrane-bound foggy polypeptide receptor or a recombinant receptor under conditions suitable for a competitive inhibition assay. The foggy polypeptide can be radioactively labeled and the number of foggy polypeptides bound to the receptor can be used to determine the effectiveness of the potential antagonist. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1 (2): Chapter 5 (1991). Preferably, expression cloning is used, polyadenylation RNA is prepared from cells responsive to foggy polypeptide, and a cDNA library generated from this RNA is partitioned into pools, and COS cells or other non-foggy polypeptide reactive. Used for transfection of cells. Transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled foggy polypeptide. A foggy polypeptide can be labeled by a variety of means, including iodination or inclusion of a recognition site for a site-specific protein kinase. After fixation and incubation, slides are subjected to autoradiographic analysis. A positive pool is identified and the subpool is prepared and re-transfected using an interactive subpooling and rescreening step, resulting in a single clone encoding the putative receptor.
[0091]
As an alternative method of receptor identification, labeled foggy polypeptides can be photoaffinity bound to cell membranes or extract preparations expressing the receptor molecule. The crosslinked material is dissolved in PAGE and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the receptor can be excited, separated into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained from microsequencing is used to design a set of degradable oligonucleotide probes to screen a cDNA library that identifies the gene encoding the putative receptor.
In another assay for antagonists, mammalian cells or membrane preparations expressing the receptor are incubated with labeled foggy polypeptide in the presence of the candidate compound. The ability of the compound to promote or block this interaction is then measured.
More specific examples of potential antagonists are oligonucleotides that bind to a fusion of an immunoglobulin and a foggy polypeptide, particularly, but not limited to, polypeptide- and monoclonal antibodies and antibody fragments, single-chain antibodies, anti- -Idiotype antibodies, and chimeric or humanized forms of these antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies and antibody fragments. Alternatively, the potential antagonist may be a closely related protein, eg, a mutated form of the foggy polypeptide that recognizes the receptor but has no effect, and thus competitively inhibits the action of the foggy polypeptide.
[0092]
Other potential foggy polypeptide antagonists are antisense RNA or DNA constructs prepared using antisense technology, for example, antisense RNA or DNA hybridizes to target mRNA and interferes with protein translation. By doing so, it acts to directly block the translation of mRNA. Antisense technology can be used to control gene expression through triple helix formation or antisense DNA or RNA, both of which methods are based on the binding of a polynucleotide to DNA or RNA. For example, the 5 'encoded portion of the polynucleotide sequence encoding the mature foggy polypeptide herein is used to design an antisense RNA oligonucleotide of about 10 to 40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription (triple helix-Lee et al., Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456). Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), thereby preventing transcription and production of foggy polypeptide. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo and block translation of the mRNA molecule into PRO polypeptide (antisense-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression ( CRC Press: Boca Raton, Florida, 1988)). The oligonucleotides described above can also be delivered to cells and express antisense RNA or DNA in vivo to inhibit foggy polypeptide production. When antisense DNA is used, oligodeoxyribonucleotides derived from the translation initiation site, eg, between positions -10 and +10 of the target gene nucleotide sequence, are preferred.
[0093]
Potential antagonists include small molecules that bind to the active site, receptor binding site, or growth factor or other relevant binding site of a foggy polypeptide, thereby blocking the normal biological activity of the foggy polypeptide. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules, preferably soluble peptides, and synthetic non-peptide organic or inorganic compounds.
Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozymes act by sequence-specific hybridization to complementary target RNA, followed by nucleolytic cleavage. Specific ribozyme cleavage sites within potential RNA targets can be identified by known techniques. For further details, see, for example, Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) and PCT Publication No. WO 97/33551 (published September 18, 1997).
The nucleic acid molecule in triple helix formation used for transcription inhibition is single-stranded and consists of deoxynucleotides. The basic composition of these oligonucleotides is designed to promote triple helix formation via Hoogstin base pairing, which generally requires a resizable extension of a purine or pyrimidine on one strand of the duplex . For further details see, for example, PCT Publication No. WO 97/33551, supra.
These small molecules can be identified by any one or more of the screening assays discussed above and / or by any other screening techniques well known to those skilled in the art.
Also, the diagnostic and therapeutic uses of the molecules disclosed herein can be based on potential functional assay hits disclosed and described below.
F. Anti-foggy antibody
The present invention further provides anti-foggy antibodies. Examples of antibodies include polyclonal, monoclonal, humanized, bispecific and heteroconjugate antibodies.
[0094]
1. Polyclonal antibody
Anti-foggy antibodies can include polyclonal antibodies. Methods for preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. In mammals, polyclonal antibodies can be raised, for example, by one or more injections of an immunizing agent and, if desired, an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant will be injected into the mammal by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections. The immunizing agent may include a foggy polypeptide or a fusion protein thereof. It is useful to couple the immunizing agent to a protein known to be immunogenic in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvants that can be used include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). The immunization protocol will be selected by one of skill in the art without undue experimentation.
[0095]
2. Monoclonal antibody
Alternatively, the anti-foggy antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In the hybridoma method, a mouse, hamster, or other suitable host animal is typically immunized with an immunizing agent to produce antibodies that specifically bind to the immunizing agent or to generate lymphocytes capable of producing the antibody. Trigger. Lymphocytes can also be immunized in vitro.
Immunizing agents typically include a foggy polypeptide or a fusion protein thereof. Generally, peripheral blood lymphocytes ("PBL") are used if cells of human origin are desired, or spleen cells or lymph node cells if non-human mammalian sources are desired. Subsequently, the lymphocytes are fused with the immortalized cell line using an appropriate fusion agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59- 103]. Immortalized cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells of rodent, bovine, and human origin. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells are preferably cultured in a suitable medium containing one or more substances that inhibit the survival or growth of the unfused, immortalized cells. For example, if the parental cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma medium typically contains hypoxanthine, aminopterin and thymidine (`` HAT medium ''). This substance blocks the growth of HGPRT deficient cells.
[0096]
Preferred immortalized cell lines are those that fuse efficiently, support stable high level expression of antibody by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortalized cell line is a mouse myeloma line, which is available, for example, from the Salk Institute Cell Distribution Center in San Diego, California or the American Type Culture Collection in Manassas, Virginia. Human myeloma and mouse-human xenomyeloma cell lines for producing human monoclonal antibodies have also been disclosed [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. , Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
The culture medium in which the hybridoma cells are cultured is then assayed for the presence of a monoclonal antibody to foggy. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of the monoclonal antibody can be measured, for example, by the Scatchard analysis according to Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
[0097]
After the desired hybridoma cells have been identified, clones can be subcloned by limiting dilution and grown by standard methods [Goding, supra]. Suitable media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown as ascites in vivo in a mammal.
Monoclonal antibodies secreted by the subclones can be isolated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification methods, such as, for example, protein A-sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography. Separated or purified.
[0098]
Monoclonal antibodies can be prepared by recombinant DNA methods, for example, the method described in US Pat. No. 4,816,567. DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be readily prepared using conventional methods (e.g., using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the mouse antibody). Can be isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector, which is transfected into host cells, such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce immunoglobulin proteins. Thus, monoclonal antibodies can be synthesized in recombinant host cells. DNA can also be obtained by substituting human heavy and light chain constant domain coding sequences, eg, for homologous mouse sequences [US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra], or immunoglobulin encoding The sequence can be modified by covalently attaching part or all of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the constant domains of the antibodies of the invention, or for the variable domains of one of the antigen binding sites of the antibodies of the invention, to produce chimeric bivalent antibodies.
The antibody may be a monovalent antibody. Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. For example, one method involves the recombinant expression of an immunoglobulin light chain and a modified heavy chain. The heavy chain is truncated generally at any point in the Fc region to prevent heavy chain crosslinking. Alternatively, the relevant cysteine residues are replaced or deleted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
In vitro methods are also suitable for preparing monovalent antibodies. Production of fragments thereof, particularly Fab fragments, by digestion of the antibody can be accomplished using conventional techniques known in the art.
[0099]
3. Human and humanized antibodies
The anti-foggy antibodies of the present invention further include humanized or human antibodies. A humanized form of a non-human (eg, mouse) antibody refers to a chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain or a fragment thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′)).₂Or another antigen-binding subsequence of an antibody), which comprises a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. Humanized antibodies are those in which the residues of the recipient's complementarity-determining regions (CDRs) are those of the CDRs of a non-human species (donor antibody) having the desired specificity, affinity and potency, such as mouse, rat or rabbit. Human immunoglobulins (recipient antibodies) replaced by In some examples, Fv framework residues of the human immunoglobulin have been replaced by corresponding non-human residues. Also, a humanized antibody may contain residues that are not found in the recipient antibody, nor in the imported CDR or framework sequences. In general, a humanized antibody will have at least one, typically at least one, typically all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions are of a human immunoglobulin consensus sequence. Contains substantially all of the two variable domains. The humanized antibody optimally comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
[0100]
Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, one or more amino acid residues from a non-human are introduced into a humanized antibody. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from an "import" variable domain. Humanization is basically performed by Winter and co-workers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239. : 1534-1536 (1988)] by replacing the rodent CDR or CDR sequence with the corresponding sequence of a human antibody. Thus, such "humanized" antibodies are chimeric antibodies (U.S. Pat. No. 4,816,567) in which substantially less than an intact human variable domain has been replaced by the corresponding sequence from a non-human species. is there. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues have been replaced by residues from analogous sites in rodent antibodies.
In addition, human antibodies include phage display libraries [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. It can also be created using various methods known in. In addition, the techniques of Cole et al. And Boerner et al. Can also be used to prepare human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss.p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol , 147 (1): 86-95 (1991).] Similarly, human antibodies introduce human immunoglobulin loci into transgenic animals, such as mice in which the endogenous immunoglobulin gene has been partially or completely inactivated. Upon administration, one observes the production of human antibodies that are very similar to those found in humans in every respect, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. Approaches are described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661 016, and the following scientific publications: Marks et al., 1992, Bio / Technology 10, 779-783; Lonberg et al., 1994, Nature 368 856-859; Morrison, 1994, Nature 368, 812-13); Fishwild et al. , 1996, Nature Biotechnology 14, 845-51; Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14, 826; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 136-93.
Antibodies can also be affinity-matured using known selection and / or mutagenesis methods as described above. Preferably affinity-matured antibodies have a 5-fold, more preferably 10-fold, even more preferably 20 or 30-fold higher affinity than the first antibody from which the mature antibody is prepared (generally mouse, humanized or human) .
[0101]
4. Bispecific antibodies
Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. In the present case, one of the binding specificities is for foggy and the other is for any other antigen, preferably a cell surface protein or receptor or receptor subunit.
Methods for making bispecific antibodies are well known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs in which the two heavy chains have different specificities [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Due to the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually achieved by an affinity chromatography step. Similar procedures are disclosed in WO 93/08829 published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. The fusion preferably is with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2, and CH3 regions. Desirably, at least one of the fusions has a first heavy chain constant region (CH1) containing sites necessary for light chain binding. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain, are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host organism. For further details on generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
[0102]
According to another method described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be manipulated to maximize the percentage of heterodimers recovered from recombinant cell culture. Preferred interfaces include at least a portion of the CH3 region of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan). A complementary "cavity" of the same or similar size as the large side chain is created at the interface of the second antibody molecule by replacing the large amino acid side chain with a smaller one (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.
Bispecific antibodies are full-length antibodies or antibody fragments (e.g., F (ab ')₂Bispecific antibodies). Techniques for producing bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) dissect proteolytically F (ab ')₂Describes a procedure for producing fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The Fab 'fragment produced is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab'-TNB derivatives is then reconverted to Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of another Fab'-TNB derivative to form a bispecific antibody. The produced bispecific antibody can be used as an agent for selective immobilization of an enzyme.
[0103]
Fab ′ fragments can be directly recovered from E. coli, which can be chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe a fully humanized bispecific antibody F (ab ').₂Describes the production of the molecule. Each Fab 'fragment is separately secreted from E. coli and undergoes directed chemical coupling in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed can bind to normal human T cells and cells overexpressing the ErbB2 receptor, triggering the cytolytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. Become.
Various methods for making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture have also been described. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from the Fos and Jun proteins are linked to the Fab 'portions of two different antibodies by gene fusion. The antibody homodimer is reduced at the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form the antibody heterodimer. This method can also be used for the production of antibody homodimers. The "diabody" technique described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) provided another mechanism for making bispecific antibody fragments. The fragments are joined by a linker that is short enough to allow pairing between the two domains on the same chain (V_L) To the heavy chain variable domain (V_H). Therefore, the V of one fragment_HAnd V_LThe domain is the complementary V of other fragments_LAnd V_HIt is forced to pair with a domain, forming two antigen-binding sites. Other strategies for producing bispecific antibody fragments by the use of single-chain Fv (sFv) dimers have also been reported. See Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Antibodies with more than two valencies are also contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
[0104]
Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes of a foggy polypeptide provided herein. Alternatively, the arm of the anti-foggy polypeptide can be a trigger molecule on a leukocyte, such as a T cell receptor molecule (eg, CD2, CD3, CD28, or B7), to focus the cell defense mechanism on a particular foggy polypeptide-expressing cell. Alternatively, it can bind to an arm that binds to an Fc receptor for IgG (FcγR) such as FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16). Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic drugs to cells that express a particular foggy polypeptide. These antibodies have a foggy binding arm and an arm that binds a cytotoxic drug or radiochelator, such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA. Other bispecific antibodies of interest bind to the foggy polypeptide and further bind to tissue factor (TF).
[0105]
5. Heteroconjugate antibodies
Heteroconjugate antibodies also fall within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies consist of two covalently linked antibodies. Such antibodies can be used, for example, to target immune system cells to unwanted cells [US Pat. No. 4,676,980] and to treat HIV infection [WO 91/00360; WO 92/200373]. EP 03089] has been proposed. It is contemplated that the antibodies can be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. For example, immunotoxins can be made using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate, and those disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.
[0106]
6. Processing effector functions
It is desirable to modify the antibody of the invention for effector function, for example to improve the effectiveness of the antibody in treating cancer. For example, a cysteine residue may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region. The homodimeric antibody so generated may have improved internalization capacity and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity can also be prepared using heterobifunctional crosslinks as described in Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, the antibody can be engineered to have two Fc regions, thereby improving complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
[0107]
7. Immune complex
The invention also provides conjugates to chemotherapeutic agents, cytotoxic drugs such as toxins (e.g., enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof), or radioisotopes (i.e., radioconjugates). The present invention also relates to an immune complex comprising the antibody obtained.
Chemotherapeutic agents useful for generating such immune complexes have been described above. Enzymatically active toxins and fragments thereof which can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain Α-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), momordica charantia inhibitor, crusin (curcin), crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and trichothecene. )including. A variety of radionucleotides are available for producing radioconjugate antibodies. As an example,²¹²Bi,¹³¹I,¹³¹In,⁹⁰Y and¹⁸⁶Including Re.
The conjugate of the antibody and the cytotoxic agent can be used to form various bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imidoester Derivatives (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium Using derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Can be created. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an example of a chelator for the conjugation of radionucleotide to an antibody. See WO 94/11026.
In other embodiments, the antibodies may be conjugated to a `` receptor '' (such as streptavidin) for use in pre-targeting the tumor, and the antibody-receptor complex is administered to the patient, and then the clarifying agent Is used to remove unbound complex from the circulation and then administer a "ligand" (such as avidin) conjugated to a cytotoxic drug (eg, a radionucleotide).
[0108]
8. Immunoliposome
Also, the antibodies disclosed herein may be prepared as immunoliposomes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); and U.S. Pat. It is prepared by methods known in the art, as described in 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with improved circulation times are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
Particularly useful liposomes are produced by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derived phosphatidylethanolamine (PEG-PE). The liposomes are extruded through a filter of a predetermined size to produce liposomes having a desired diameter. Fab 'fragments of the antibodies of the present invention can be conjugated to liposomes via a disulfide exchange reaction, as described in Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982). A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. See Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
[0109]
9. Antibody pharmaceutical composition
Antibodies that specifically bind to the foggy polypeptides identified herein, as well as other molecules identified in the screening assays disclosed above, may be administered in the form of pharmaceutical compositions for the treatment of various diseases. Can be.
Where the foggy polypeptide is intracellular and whole antibodies are used as inhibitors, internalizing antibodies are preferred. However, lipofections or liposomes can also be used to introduce antibodies, or antibody fragments, into cells. When antibody fragments are used, minimal inhibitory fragments that specifically bind to the binding domain of the target protein are preferred. For example, a peptide molecule that retains the ability to bind to a target protein sequence can be designed based on the variable region sequence of the antibody. Such peptides can be chemically synthesized and / or produced by recombinant DNA technology. See, for example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993). The formulations herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively or additionally, the composition may include, for example, a cytotoxic agent, a cytokine, a chemotherapeutic agent or a growth inhibitor. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
[0110]
The active ingredient may also be used in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, such as hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in a colloidal drug delivery system (e. Liposomes, albumin spherules, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or microemulsions. These techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, supra.
Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is easily achieved by filtration through a sterile filtration membrane.
Sustained-release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include a semipermeable matrix of a solid hydrophobic polymer containing the antibody, which matrix is in the form of a shaped article, eg, a film, or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly (vinyl alcohol)), polyactides (U.S. Pat.No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ Degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as -ethyl-L-glutamate copolymer, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT (trade name) (injectable globules of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), and Including poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid can release molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter time periods. When encapsulated antibodies remain in the body for extended periods of time, they denature or aggregate by exposure to 37 ° C. water, resulting in reduced biological activity and possible changes in immunogenicity. . Rational strategies can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular SS bond formation through thio-disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, control of water content, appropriate And the development of specific polymer matrix compositions.
[0111]
G. FIG. Uses for anti-foggy antibodies
The anti-foggy antibodies of the present invention have various utilities. For example, anti-foggy antibodies are used in diagnostic assays for foggy, for example, detecting its expression (possibly different expression) in specific cells, tissues, or serum. Such as competitive binding assays, direct or indirect sandwich assays and immunoprecipitation assays performed in heterogeneous or homogeneous phases [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Various diagnostic assay techniques known in the art are used. Antibodies used in diagnostic assays are labeled at a detectable site. A detectable site must directly or indirectly generate a detectable signal. For example, the detectable site is³H,¹⁴C,³²P,³⁵S or¹²⁵It may be a radioisotope such as I, a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin, or an enzyme such as alkaline phosphatase, beta-galactosidase or horseradish peroxidase. Any method known in the art can be used to conjugate the detectable site to the antibody, including Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974). Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); and Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30: 407 (1982).
Anti-foggy antibodies are also useful for the affinity purification of foggy from recombinant cell culture or natural sources. In this method, antibodies to foggy are immobilized on a suitable support such as Sephadex resin or filter paper using methods well known in the art. Next, the immobilized antibody is contacted with a sample containing foggy to be purified, and then the support is washed with a suitable solvent that removes substantially all substances in the sample other than the foggy bound to the immobilized antibody. Wash. Finally, the support is washed with another suitable solvent that will release the foggy from the antibody.
The following examples are provided for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
The entirety of all patents and references cited herein are hereby incorporated by reference.
[0112]
Example
Commercially available reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The cell source identified by the ATCC accession number in the examples below and throughout this specification is the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.
Embodiment 1
[0113]
I. An exemplary method:
Fish preservation and maintenance
Fish breeding and maintenance were performed as described by Guo et al., Supra. Embryos were bred at 28.5 ° C and stored according to Kimmel et al., 1995, Dev. Dynam. 203: 253-310.
In situ hybridization and immunostaining
RNA probes were synthesized from linear templates using an RNA labeling reagent (Boehringer). TH and 5HT antibodies were purchased from Chemicon. FLAG antibody was purchased from Kodak. Zn-8 (Trevarrow et al., 1990, Neuron 4: 669-79) and anti-Hu antibody (Marusich et al., 1994, J. Neurobiol. 25: 143-55) were obtained from the University of Oregon. The 3A10 monoclonal antibody developed by Thomas Jessell was obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank. In situ hybridization and antibody staining were performed as described above.
[0114]
Isolation of highly related DNA polymorphisms by AFLP
Heterozygous female fish with the foggy mutation (AB / EK) were crossed (Tu) with WT male fish from various genetic backgrounds and F1 offspring were raised to adulthood. Heterozygous F1 fish were identified by sister cell pair crosses. F2 progeny were recovered from heterozygous crosses and split into two pools (each containing 40 individuals) based on phenotype: wild type + heterozygous (WT + Het) and mutant (mt) pools. Genetic DNA was extracted from pooled fish, digested with restriction enzymes EcoRI and MseI, ligated to the synthesized DNA adapter, and used for PCR analysis. PCR primers (adapter + EcoRI + NNN, adapter + MseI + NNN) were synthesized, stained and labeled with a Genentech oligo synthesizer, and the PCR conditions were as described above. Vos et al., Supra. The PCR samples were run on the ABI Auto Sequencer 310 and the data results were analyzed using ABI Genescan software. Pool size 40 allowed the identification of polymorphic markers within about 2.5 cMs to the foggy locus.
[0115]
Gene mapping and positional cloning
The identified AFLP markers were used for testing in foggy mutant individuals to determine more precise gene distances: First, the bound AFLP fragments were gel purified, cloned and sequenced. Second, based on the sequencing information, specific PCR primers were designed to convert most AFLP markers to PCR fragment length polymorphisms or single-stranded conformation polymorphisms. AFLP markers were mapped on the microsatellite gene map. PCR primers corresponding to the two closest bound AFLP markers were then used for microarrayed BAC libraries (Genome Systems) and YAC libraries (Research Genetics) using standard PCR conditions. YAC and BAC DNA were isolated according to the manufacturer's instructions and the ends were sequenced on an automated cycle sequencer (ABI). Specific PCR primers were designed according to the terminal sequence and tested using a radiation hybrid panel (Geisler et al., 1999, Nature Genetics 23: 86-9; Hukriede et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Scil USA 96: 9745). -50), used to continue screening the BAC library until all foggy regions were covered by the gene DNA clone.
[0116]
Transformation rescue with BACs and cDNAs
Individual BAC DNA was injected at a concentration of 40-60 ng / μl into 1-4 cell stage zebrafish embryos derived from foggy heterozygous crosses. Injected embryos were developed for up to 48 hours, examined under a dissecting microscope, and immunohistochemistry was performed using TH antibodies. After examination of the staining pattern and photography, genomic DNA was extracted from individual embryos and used for genotyping using PCR primers strongly bound to the foggy locus. BAC B108J11 rescued from the foggy mutant phenotype was digested with EcoRI, randomized with p32 and used to screen a 33 hour embryo zebrafish cDNA library. The full-length cDNA was cloned into a vector containing the β-actin promoter, injected into embryos at a concentration of 15-30 ng / μl, and analyzed for rescue as described above.
[0117]
Sequence analysis and mutation detection
Sequence analysis was performed on a Unix system and software developed by the Genentech Bioinformatics Group. Mutation detection, gene-specific primers were used to amplify gene DNA from a pool of approximately 5 foggy mutations and WT sister embryos. Mutations and PCR products from WT sister embryos (three separate sets) were sequenced directly using an automated cycle sequencer (ABI). Mutant and cDNA from WT sister embryos were synthesized by RT-PCR and sequenced. Site-directed mutations were performed using Stratagene reagents to introduce a single nucleotide change T → A. The cDNA containing the induced mutation was cloned after the actin promoter and assayed for morphological transformation rescue as described above.
Protein expression in COS-7 cells
COS-7 cells were plated at approximately 60% confluence in a 1 ml microtiter dish and 1 μg of plasmid containing FLAG-tagged WT foggy cDNA or mutant foggy cDNA was transfected using GIBCO-BRL reagent. Twenty-four hours later, cells were fixed and immunostained with anti-FLAG antibody.
[0118]
Recombinant proteins for transcription assays
The NdeI site was cut at the 5 'end of the zfSpt5 ORF by PCR mutation. The NdeI (partial) -NotI fragment containing the full length, wild-type or mutant ORF was inserted into the NdeI-BamHI site of pET-14b (Novagen) to produce pET-agSpt5 WT and pET-zfSpt5 mt. Expression and purification of the histidine-tagged zfSpt5 protein was performed as described above. Yamaguchi et al., 1999, Cell 97: 41-51. Briefly, lysates were prepared from E. coli strain BL21 (DE3), each transduced with pET-zfSpt5mt. His-zfSpt5 protein was purified from the supernatant by Ni affinity chromatography, separated on SDS polyacrylamide gel, and full-length polypeptide was recovered from the gel slice.
Transcription assay
Depletion / add-back assays were performed as described above. Wada et al., Supra. The indicated amounts of hSpt4 and hSpt5, or either WT or mutant sfSpt5, were added back to HeLa nuclear extracts (2 μl) immunodepleted with anti-DSIF p160 / hSpt5 monoclonal antibody. PTF3-6C2AT (25 ng) or pSLG402 (125 ng, Lee and Greenleaf, supra) were used as templates. After a 45 minute incubation, transcription was initiated at the times indicated by addition of NTPs with or without 50 μM DRB. For pSLG402, low NTP concentrations (30 mM ATP, 30 mM GTP, 300 mM CTP, 2.5 mM UTP) were used. Transcripts without G were purified and analyzed by 8% urea PAGE.
[0119]
II. result:
Induction of foggy mutation for marked loss or excess of neuronal assembly
Zebrafish mutations affecting neurogenesis were previously isolated in a genetic screen using the neurotransmitter synthase tyrosine hydroxylase (TH) as a molecular marker for a combined group of DA and NA neurons. Guo et al., Supra. One of the mutations representing foggy appears morphologically normal (FIGS. 1A and B), but 28 hpf (achieve fertilization) in DA neurons in the hypothalamus when such neurons are first typically present Irreparable defects early in the day). The defect is even more pronounced by 48 hpf, as shown by a decrease in the number of TH and DA neurons and a decrease in TH levels in some remaining DA cell bodies (FIGS. 1C and D). In zebrafish embryos, a group of 5HT neurons develop very close to hypothalamic DA neurons (compare FIGS. 1E and 1C). This has intrigued the fate of foggy mutant 5HT neurons. In WT fish, 5HT + neurons first appear between 22-28 hpf. Subsequently, by 48 hpf they constitute two separate clusters of 5-7 neurons, which are the dorsal hypothalamus / posterior nodule inside DA neurons (FIGS. 1E, 1G). Surprisingly, the number of TH + DA neurons decreases from about 17 +/- 3 to about 8 +/- 2 on either side of the foggy hypothalamus, while the number of 5HT + neurons at this location is about 6 +/- Approximately doubled from 1 to about 15 +/- 2 (FIGS. 1F, 1H). Surprisingly, immunofluorescent double labeling of TH and 5HT with the foggy mutation showed that some neurons were positive for both markers (FIG. 1H). Neurons expressing both TH and 5HT were not found in WT embryos (FIG. 1G). Although foggy could not formally rule out the possibility of separately affecting DA and 5HT neurons, these findings indicate that hypothalamic DA and 5HT neurons were derived from normal precursors and that foggy mutations This suggests that this system may have cell fate decisions. In contrast to the hypothalamus, 5HT + neurons in the foggy hindbrain developed normally (FIGS. 1I-J).
[0120]
Another area of the brain where deficits were observed in TH + DA neurons was the retina (FIGS. 2A-B). The retina contains predominantly six-classified neurons that are specified sequentially from a common precursor in response to exogenous cues. Cepko, 1999, Curr. Opin. Neurobiol. 9: 37-46. Retinal ganglion neurons appear first, followed by cone photoreceptors, horizontal cell axonal interneurons, rod photoreceptors and bipolar neurons. TH + DA axisless interneurons warranted further testing or other neurons of the foggy mutant retina. Analysis revealed that foggy deficient in rhodopsin + cones (Fig. 2C-D) and rhodopsin + rod photoreceptors and GABA + axonal interneurons (Fig. 2E-F). Interestingly, the number of ganglia, the first cell type that develops in the retina, appears normal, and may even increase (FIGS. 2G-H). In contrast to the retina, lens and optic nerve differentiation appeared normally in foggy mutant embryos as judged histologically (not shown) and by expression of γ-crystallin (FIGS. 2I-J). . Histological analysis of the foggy retina revealed that at 48 hpf (not shown), the layered tissue was entirely normal, and at 72 hpf (FIG. 2K-L), both photoreceptors and axonal cells were normal. did.
[0121]
In addition, foggy did not generate TH + DBH + NA neurons in the locus nucleus (LC) of the hindbrain, but did not develop hindbrain mouse neurons (FIGS. 3I-J), spinal cord GABA + interneurons (FIG. 3M-N) and spinal motor neurons (FIG. (Data not shown). Neural crest-derived exchanged NA neurons (FIGS. 3C-D) do not, but neural crest-derived dorsal root ganglion sensory neurons appear normally (FIG. 3K-L). One group of NA cells near the heart, TH +, DBH + arch-associated cells (AAC), remained normal in the foggy mutation. Guo et al., Supra. The transcription factor Phox2a (Guo et al., 1999, Neuron 24: 555-66; Morin et al., 1997, Neuron 18: 411-423), which is required for gaining identification of NA neurons, was normally expressed in early LC precursors ( (FIG. 3E-F). However, there were few mature LCs and sympathetic neurons in the area where they should be present (FIG. 3G-H and data not shown). However, no abnormal cell death was detected by tunnel staining of all embryos at 24, 48, 60 and 72 hpf (data not shown). Outside the nervous system, foggy embryos were indistinguishable from wild type (WT) sister cells by visual inspection at 28 hpf. At this developmental stage, they also showed normal expression patterns of the local markers sonic hedgehog (Shh), fibroblast growth factor-8 (Fgf8), Otxl, Otx2 and Krox-20 (data not shown). ). 48 hpffoggy embryos also contain histologically normal chordae, spinal cord, somits, otocysts, eyes, invaginations, endoderm primordium of the liver, pronephros, yolk sac, heart, blood cells, pharyngeal arch , Brain and ventricles (data not shown). Up to 72 hpf, most tissues and organs remain normal, but the embryos exhibited reduced neural crest-derived melanocytes, enlarged pericardium due to impaired circulation, thin myocardial walls, small eyes and small physique (FIG. 1A and B, 2M and N and data not shown). In summary, foggy is thought to be essential for the normal development of many types of neurons of the central and peripheral nervous system before they express neurotransmitter synthases, which is constituted by the mutant phenotype. You.
[0122]
Isolation of foggy gene
The foggy gene is called AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, Vos et al., Nucl. Acids Res. 23: 4407-14), which allows for a genome-wide search for polymorphic DNA markers closely linked to the foggy locus. Isolated by DNA fingerprinting technique (FIG. 4A). Two AFLP markers, ETACMTCT155 and ETACMGAT270, were isolated and found to bind strongly to the foggy locus (0 recombination from 200 separate mutations tested). An additional series of approximately 5000 separate mutations revealed that each AFLP marker was 0.06 +/- 0.02 cM apart on either side of the foggy locus. During the course of the AFLP analysis, a genetic map consisting of 2000 microsatellite markers was published. Shimoda et al., 1999, Genomics 58: 219-32. The AFLP marker is located on this map, causing the foggy locus to be located on chromosome 15. Unfortunately, all available microsatellite markers on chromosome 15 in this region were mapped 1 cM from the foggy locus (FIG. 4B). Thus, by AFLP, gene mapping and binding analysis, which identified the interval of the foggy locus as being between the polymorphic DNA markers ETACMTCT155 and ETACMGAT270, showed that it had a gene distance of 0.12 +/- 0.04 cM. Was decided.
[0123]
A gene clone consisting of yeast artificial chromosomes (YACs), BACs and PACs was isolated using two AFLP markers. The ends of these large DNA clones were sequenced and used to isolate additional clones spanning the full-length foggy locus (FIG. 4B). Fine cell lineage analysis was performed using PCR fragment length polymorphism (PFLP) or single-stranded chromosomal polymorphism (SSCP) identified by BAC / PAC end sequencing. This analysis allowed the foggy locus to be located at intervals spanning four BACs. To determine that Bac contains the foggy gene, rescue experiments were performed as described in Yan et al., 1998, Genomics 50: 287-9. BAC clones (Table 1) were injected into one or two cell stage zebrafish embryos derived from foggy heterozygous crosses, and the embryos were analyzed by immunohistochemistry for TH + DA and NA neurons at approximately 48 hpf with TH antibodies. BAC B108J11 and BAC B35111 allowed homozygous foggy mutations to restore normal development of melanocytes and TH + DA and NA neurons (FIG. 5B, Table 1 and no data), suggesting that they contain the WTfoggy gene. Shotgun sequencing of full length BAC B108J11 appears to be the foggy gene (Table 1). To further test this possibility, the full-length cDNA corresponding to this transcription unit was isolated and cloned into a vector containing the zebrafish β-actin promoter (Higashijima et al., 1997, Devel. Biol. 192: 289-). 99), the construct in zebrafish embryos was isolated. The cDNA was able to restore foggy mutant embryos to normal development (Table 1), strongly demonstrating that this transcription unit corresponds to the foggy gene. Ectopic expression of this cDNA did not prevent WT embryo development (data not shown).
[0124]
foggy encodes a widely expressed nuclear protein homologous to the transcription elongation regulator Spt5
DNA sequencing analysis and database searches of cDNA rescue indicate that the putative foggy protein contains 1084 amino acid residues (FIG. 6A) and belongs to an evolutionarily conserved family of proteins with homology to yeast Spt5 (FIG. 6B). )It revealed that. Swanson et al., Supra. In vitro studies have suggested that this family of proteins functions as both positive and negative regulators of transcription elongation, but there is no evidence for this role in vertebrates. Foggy contains an N-terminal acidic region of 105 amino acids, 53 of which are either Asp or Glu (FIG. 6A) and whose central domain consists of NusB / KOW with unknown function. A similar NusG / KOW domain regulates the transcription elongation of prokaryotic NusG (Sullivan and Gottesman, 1992, Cell 68: 989-94 Sullivan et al., 1992, J. Bact. 174: 1339-44) and proteins involved in translation. Found in class. Kyrpides et al., 1996, Trends Biochem. Sci. 21: 425-6. The carboxyl terminus of foggy is rich in the amino acids serine, threonine, and tyrosine, forming potential phosphorylation sites, and shows three types of hexapeptide repeats: 4xXTPXYG, 2xQTPLHD, and 2xNPQTPG. The C-terminus (from = 100 amino acids) is conserved in all multicellular organisms, but not in yeast Spt5 (FIG. 6C). Sequencing analysis of genomic DNA and cDNA generated from foggy mutations and their WT sisters identified a single nucleotide change from T to A and changed the encoded amino acid from valine 1012 to aspartic acid ( (FIG. 6D). Valine 1012 is a fully conserved amino acid in various heterologous members of this protein family and is located in the conserved C-terminal domain (FIG. 6C). To further recognize whether the mutation of valine 1012 to aspartic acid is indeed functionally causal or not an inactive polymorph, constructs carrying the mutation were identified in zebrafish embryos. To assess the likelihood of rescue of the mutant polymorphism. The WTfoggy cDNA easily rescued the mutant polymorphism, but the construct with one nucleotide change was ineffective under the same conditions (FIG. 1). Taken together, these findings indicate that the isolated cDNA actually encodes foggy, and that one nucleotide change results in a foggy mutant polymorphism.
[0125]
To characterize foggy, the spatial and temporal expression patterns during development were examined. By whole mount in situ hybridization, maternal foggy mRNA was detected in all blastomeres of early embryos (FIG. 7A). In tail bud embryos (10 hpf), foggy expression is concentrated in the dorsal neural plate with low levels of expression in the abdominal epidermis (FIG. 7B). At about 28 hpf, foggy mRNA is detected mainly in the developing brain at other low levels of expression (FIG. 7C), and its expression pattern is unchanged in foggy mutant embryos (FIG. 7D). By 48 hpf, there is a marked down-regulation of foggy translation throughout the embryo (compare FIGS. 7C and 7E). To determine whether the foggy proteins can enter the nucleus and whether the foggy mutation interferes with nucleation, the epitope tags WT and muteins are expressed in mammalian Cos7 cells and their The subcellular distribution was tested. As shown in FIGS. 7G-J, both the WT of foggy and the Asp mutant form of Val1012 were detected, suggesting that foggy is a nuclear protein and that the mutation does not interfere with protein entry into the nucleus.
[0126]
Foggy regulates in vitro transcription elongation and mutant forms are selectively inactive as repressors
We also analyzed whether WTfoggy was indeed a functional homolog of Spt5, and if so, whether the Asp mutation of val1012 interfered with its transcriptional activity. The assay used was a Spt4 / Spt5-dependent inhibition of transcription elongation by the transcription inhibitory compound DRB in crude Hela nuclear extracts. Wada et al., 1998, supra. The WT and mutant foggy expressed and purified in E. coli appeared identical in size and mobility to their human counterparts and to each other (FIG. 8A). Furthermore, WTfoggy was as effective as hSpt5 in repairing the response to the drug DRB (FIG. 8D, lanes 5 and 6), suggesting the idea that these two proteins are indeed functional homologs. In contrast, even when added at a 9-fold higher concentration, the mutant foggy did not confer sensitivity to the growth inhibitor DRB (FIG. 8B, lanes 7-12). These data suggest that foggy acts biochemically as an inhibitor of transcription elongation, and that the 1012 Val Asp mutation abolishes this activity.
[0127]
As noted above, low concentrations of the Spt4 / Spt5 (DSIF) complex promote rather than suppress transcription elongation. Wada et al., Supra. DNA templates were used to quantify the potential facilitating activity of WT and mutant zSpt5 (Lee and Greenleaf, 1997, J. Biol. Chem. 272: 10990-10993), two G-less cassettes, Includes the promoter proximal 85-nt cassette from positions +40 to +124 and the promoter distal 377 nt cassette from positions +1512 to +1888. These two cassettes are resistant to RNase T1 digestion and are separated by a G-rich, RNase T1 sensitive region. Transcription following RNA Pol II and RNase T1 digestion allows the two cassettes to separate from the transcript and be separated by gel electrophoresis. These relationships are quantitatively reflected in the effect of transcription elongation. When a normal nuclear extract is used, the molar ratio between the distal and proximal regions of the transcript increases with time, approaching a value of 0.5 (FIG. 9, lanes 1-4; Lee and Greenleaf, supra). Deficiency of DSIF in the extract results in a significant decrease in elongation capacity. Figures 9C-D, lanes 5-8. Reconstitution of the deficient extract with rDSIF using human or zebrafish Spt5 increased transcriptional elongation by 4.6 fold at 15 min and 3.8 fold at 20 min, and the level of non-deficient extract (Figures 9C-D, and data not shown). Surprisingly, mutant zSpt5 had a comparable effect on WTzSpt5 in promoting elongation in this assay, increasing elongation capacity by 4.3-fold at 15 minutes and 3.6-fold at 20 minutes (FIG. 9C-D, lanes 9-16). Taken together, these results indicate that under these conditions, the mutant foggy / zSpt5 has lost its ability to act as a negative rather than a positive regulator of transcription elongation.
Embodiment 2
[0128]
Expression of foggy in E. coli
This example demonstrates the preparation of an unglycosylated form of a foggy polypeptide or a foggy polypeptide antagonist polypeptide ("foggy") by recombinant expression in E. coli.
The DNA sequence encoding foggy is first amplified using the selected PCR primers. The primer should contain a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site on the expression vector selected. Various expression vectors are used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) containing the ampicillin and tetracycline resistance genes. The vector is cut with a restriction enzyme and dephosphorylated. Next, the sequence amplified by this PCR is ligated to a vector. Preferably, the vector contains an antibiotic resistance gene, a trp promoter, a polyhis leader (including the first six STII codons, a polyhis sequence, and an enterokinase cleavage site), a PRO coding region, a lambda transcription termination site, and The sequence encoding the argU gene is included.
The ligation mixture is then used to transform the selected E. coli strain using the methods described in Sambrook et al., Supra. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates, and antibiotic resistant colonies are selected. Plasmid DNA is isolated and sequence confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.
Selected clones can be grown overnight in a liquid culture such as LB medium supplemented with antibiotics. This overnight culture may be subsequently used to inoculate a large-scale culture. Thereafter, the cells are grown until the desired absorbance is reached, during which the expression promoter is turned on.
After culturing the cells for several more hours, the cells can be harvested by centrifugation. The cell pellet obtained by centrifugation can be solubilized using various reagents known in the art, and then the solubilized foggy protein is subjected to conditions that allow strong binding to the protein. It can be purified using a metal chelate column below.
[0129]
Foggy is expressed in E. coli in poly-his tag form according to the following method. DNA encoding foggy is first amplified using the selected PCR primers. Primers provide restriction sites corresponding to the restriction sites on the selected expression vector, and an efficient and reliable translation initiation site, rapid purification on metal chelate columns, and proteolytic removal with enterokinase Other useful sequences are included. The sequence amplified by PCR and tagged with polyhis was then ligated into an expression vector to transform an E. coli host from strain 52 (W3110fuhA (tonA) lon galErpoHts (htpRts) clpP (lacIq)). used. Transformants were first isolated in LB containing 50 mg / ml carbenicillin by O.D. D. Grow with shaking at 30 ° C. for 3-5 hours until 600 is reached. Cultures were grown 50-100 times in CRAP medium (3.57 g of (NH₄)₂SO₄, 0.71 g of sodium citrate.2H₂O, 1.07 g of KCl, 5.36 g of Difco yeast extract, 5.36 g of Sheffield hycase SF are dissolved in 500 mL of water, and further, 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (W / V). Glucose and 7 mM MgSO₄And grow for approximately 20-30 hours at 30 ° C. with shaking. Test samples are taken to verify expression by SDS-PAGE analysis, and all cultures are centrifuged to sediment cells. The cell pellet is frozen until purification and unwinding.
[0130]
E. coli paste (6-10 g pellet) from a 0.5 to 1 L fermentor is resuspended in 10 volumes (W / V) of a 7 M guanidine, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Solid sodium sulfite and sodium tetrathionate are added to final concentrations of 0.1 M and 0.02 M, respectively, and the solution is stirred overnight at 4 ° C. The result of this step is a denatured protein in which all cysteine residues have been blocked by sulfitation. The solution is centrifuged at 40,000 rpm for 30 minutes in a Beckman ultracentrifuge. The supernatant is diluted with 3-5 volumes of metal chelate column buffer (6M guanidine, 20 mM Tris, pH 7.4) and filtered through a 0.22μ filter to remove contaminants. The clarified extract is applied to a 5 mL Qiagen Ni-NTA metal chelate column equilibrated with a metal chelate column buffer. The column is washed with a separate buffer containing 50 mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. The protein is eluted in a buffer containing 250 mM imidazole. Fractions containing the desired protein are pooled and stored at 4 ° C. Protein concentration is estimated by absorbance at 280 nm using a calculated extinction coefficient based on the amino acid sequence of the protein.
[0131]
The protein is unwound by slowly diluting the sample in a freshly prepared unwind buffer composed of the following components: 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M Urea, 5 mM cysteine, 20 mM glycine, and 1 mM EDTA. The unwind volume is chosen so that the final protein concentration is between 50 and 100 mg / ml. The unwind solution is gently stirred at 4 ° C for 12-36 hours. The unwinding reaction is stopped by adding TFA to a final concentration of 0.4% (pH approx. 3). Prior to further purification of the protein, the volume is filtered through a 0.22μ filter and acetonitrile is added to a final concentration of 2-10%. The unwound protein is chromatographed on a Poros R1 / H reverse phase column using a mobile extraction buffer of 0.1% TFA with a gradient of acetonitrile from 10 to 80%. Aliquots of the fractions with A280 absorbance are analyzed on an SDS polyacrylamide gel and the fractions containing the uniform unwound protein are pooled. Usually, most proteins that have been properly unwound are the most compact with a hydrophobic interior that is shielded from interaction with the reversed-phase resin, so these species of proteins elute at the lowest acetonitrile concentration. You. Condensates are usually eluted at high acetonitrile concentrations. In addition to separating the incorrectly unwound protein form from the desired form, the reverse phase step also removes endotoxin from the sample.
Fractions containing the desired unwound foggy are pooled and acetonitrile is removed by gently blowing nitrogen directly onto the protein solution. The protein was gel filtered using G25 Superfine (Pharmacia) resin equilibrated with dialysis or formulation buffer, and sterile filtered to give 20 mM Hepes, containing 0.14 M sodium chloride and 4% mannitol. Formulated in pH 6.8.
Embodiment 3
[0132]
Expression of PRO in mammalian cells
This example demonstrates the preparation of a potentially glycosylated form of a foggy polypeptide or foggy polypeptide antagonist by recombinant expression in mammalian cells.
The vector, pRK5 (see EP 307,247, issued March 15, 1989) was used as the expression vector. Optionally, the foggy DNA is ligated to pRK5 using a ligation method as described in Sambrook et al., Supra, with a restriction enzyme chosen to allow insertion of the foggy DNA. The resulting vector is called pRK5-foggy.
In one embodiment, the selected host cells may be 293 cells. Human 239 cells (ATCC CCL 1573) are grown to confluence in tissue culture plates in culture medium such as fetal bovine serum and DMEM, optionally supplemented with nutrient components and / or antibiotics. About 10 μg of pRK5-foggy DNA was mixed with about 1 μg of DNA encoding the VA RNA gene (Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)) and 500 μl of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂Dissolve in,. To this mixture, 500 μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄Is added dropwise and a precipitate is formed at 25 ° C. for 10 minutes. The precipitate was suspended and added to 293 cells and kept at 37 ° C. for about 4 hours. The culture solution is removed with an aspirator, and 2 ml of PBS containing 20% glycerol is added for 30 seconds. 293 cells are washed with serum-free medium, fresh medium is added, and the cells are cultured for about 5 days.
[0133]
Approximately 24 hours after transfection, the culture is removed and the culture (only) or 200 μCi / ml³⁵S-cysteine and 200 μCi / ml³⁵Replace with a culture solution containing S-methionine. After 12 hours of culture, the conditioned medium is collected, concentrated with a spin filter, and run on a 15% SDS gel. After the run, the gel is dried and the film is exposed for a time selected to indicate the presence of the PRO polypeptide. The medium containing the lightly transfected cells is further cultured (in serum-free medium) and the culture is tested in a selected bioassay.
By an alternative technique, foggy may be transiently introduced into 293 cells using the dextran sulfate method described by Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). 293 cells are grown to maximum density in spinner flasks and 700 μg of pRK5-foggy DNA is added. First, cells are concentrated from the spinner flask by centrifugation and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate is incubated on the cell pellet for 4 hours. Cells are treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue culture medium, and transferred again to a spinner flask containing tissue culture medium, 5 μg / ml bovine insulin and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 5 days, the conditioned medium is centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. Thereafter, the sample containing the expressed foggy can be concentrated and purified by any selected method, such as dialysis and / or column chromatography.
[0134]
In another embodiment, foggy can be expressed in CHO cells. pRK5-foggy is CaPO₄Alternatively, CHO cells can be transfected using known reagents such as DEAE dextran. As described above, the cell culture is incubated and the medium is either culture medium (only) or³⁵It is replaced with a culture solution containing a radiolabel such as S-methionine. After quantifying the presence of the foggy polypeptide, the culture is replaced with a serum-free medium. Preferably, the culturing is performed for about 6 days, after which the conditioned medium is recovered. The culture containing the expressed foggy is concentrated and purified by any selected method.
The epitope-tagged foggy is also expressed in host CHO cells. foggy is subcloned from the pRK5 vector. The subcloned insert can also be subjected to PCR so that it is fused to a baculovirus expression vector in frame with a selected epitope tag such as a poly-his tag. The poly-his tag foggy insert can be subcloned into an SV40 operable vector containing a selectable marker such as DHFR for selection of stable clones. Finally, the CHO cells can be transfected (as described above) with the SV40 operable vector. As described above, labeling may be performed to confirm expression. Thereafter, the culture solution containing the expressed poly-His-tagged foggy can be concentrated,²⁺Purified by any selected method, such as chelate affinity chromatography.
[0135]
Foggy may also be expressed in CHO and / or COS cells by transient expression methods, or in CHO cells by other stable expression methods.
Stable expression in CHO cells is performed using the following method. The proteins are expressed as an IgG construct (immunoadhesin), where the coding sequence for the soluble form of each protein (eg, extracellular domain) is fused to an IgG1 constant region sequence that includes the hinge, CH2 and CH2 domains. And / or poly-His tagged form.
After PCR amplification, each DNA is subcloned into a CHO expression vector using standard techniques described in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). CHO expression vectors are constructed to have restriction enzyme sites compatible with the 5 'and 3' of the DNA of interest to allow for convenient shuttling (replacement) of the cDNA. Vectors used for expression in CHO cells are used as described in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774-1779 (1996)), and contain cDNA of interest and dihydrofolate reductase (DHFR). Use the SV40 early promoter / enhancer to induce expression of DHFR expression allows selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.
[0136]
12 μg of the desired plasmid DNA was added to approximately 10,000,000 CHO cells using a commercially available transfection reagent, Superfect® (Quiagen), Dosper® or Fugene® (Boehringer Mannheim). To be introduced. Cells are grown as described in Lucas et al., Supra. About 3x10^{- 7}The cells are frozen in ampoules for use in subsequent growth and production as described below.
The ampoule containing the plasmid DNA is left in a water bath and thawing by vortexing. The contents are transferred by pipetting to a centrifuge tube containing 10 ml of the culture solution and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant is removed with an aspirator, and the cells are resuspended in 10 ml of selection medium (PS20 containing 5% fetal bovine serum filtered through 0.2 μm and filtered through a 0.2 μm filter). Thereafter, the cells are sorted into 100 mL spinners containing 90 mL of selective medium. After 1-2 days, the cells are transferred to a 250 mL spinner filled with 150 mL of selective growth medium and cultured at 37 ° C. After another 2-3 days, 3 × 10 3 in 250 mL, 500 mL, and 2000 mL spinners.⁵Seeded to cells / ml. The cell culture is replaced with a fresh medium by centrifugation and resuspended in the production medium. Any suitable CHO medium was used, and the production medium described in U.S. Patent No. 5,122,469, issued June 16, 1992, was in fact used. 1.2x10 for 3L production spinner⁶Seeded at cells / mL. On day 0, cell number and pH are determined. On the first day, sparging of air sampled and filtered from the spinner is started. On the second day, sampled from the spinner, the temperature was changed to 33 ° C., 30 mL of 500 g / L glucose and 10% antifoam (eg, 35% polydimethylsiloxane emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion), 0.6 ml Is added. Throughout the production process, the pH is always adjusted to keep around 7.2. After 10 days, or until the viability drops below 70%, the cell culture is harvested by centrifugation and filtration through a 0.22 μm filter. The filtered product is either stored at 4 ° C or immediately passed through a column for purification.
[0137]
For poly-His tagged constructs, protein purification is performed using Ni-NTA columns (Qiagen). Prior to purification, imidazole is added to the conditioned medium to a concentration of 5 mM. The conditioned medium is pumped onto a 6 ml Ni-NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole at 4 ° C. at a flow rate of 4-5 ml / min. After loading on the column, the column is further washed with equilibration buffer and the protein is eluted with equilibration buffer containing 0.25M imidazole. Subsequently, the highly purified protein is desalted on a 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) column into a storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8 and stored at -80 ° C. .
The immunoadhesin (Fc-containing) construct is purified from the conditioned medium as follows. The conditioned medium is loaded onto a 5 ml Protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After loading on the column, the column is extensively washed with equilibration buffer before eluting with 100 mM citric acid, pH 3.5. The eluted protein is immediately neutralized by collecting the 1 ml fraction into a tube containing 275 μl of 1 M Tris buffer, pH 9. The highly purified protein is then desalted in a storage buffer as described above for the poly-His tagged protein. Homogeneity is assessed by SDS polyacrylamide gel and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
Embodiment 4
[0138]
Expression of foggy in yeast
The method described below describes the recombinant expression of foggy and foggy polypeptide antagonists ("foggy") in yeast.
First, a yeast expression vector is constructed for intracellular production or secretion of foggy from the ADH2 / GAPDH promoter. For intracellular expression of foggy, DNA encoding foggy and a promoter are inserted into suitable restriction enzyme sites of the selected plasmid. For secretion, the DNA encoding foggy may be the ADH2 / GAPDH promoter, the native foggy signal peptide or other mammalian signal peptide, or, for example, yeast α-factor or invertase (if necessary) for expression of foggy. The DNA encoding the secretion signal / leader sequence and the linker sequence can be cloned into a selected plasmid.
Thereafter, yeast cells such as yeast strain AB110 can be transformed with the expression plasmids described above and cultured in a selected fermentation medium. The supernatant of the transformed yeast can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid, separated by SDS-PAGE, and the gel is stained with Coomassie blue.
The recombinant foggy can then be isolated and purified by removing the yeast cells from the fermentation medium by centrifugation, after which the medium is concentrated using a selected cartridge filter. The concentrate containing foggy is further purified using a selected column chromatography resin.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein have been successfully expressed as described above.
Embodiment 5
[0139]
Foggy expression in insect cells infected with baculovirus
The following method describes the recombinant expression of foggy polypeptide and foggy polypeptide antagonist ("foggy") in baculovirus-infected insect cells.
The sequence encoding foggy is fused upstream of an epitope tag contained in a baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-his tags and immunoglobulin tags (similar to the Fc region of an IgG). A variety of plasmids may be used, including plasmids derived from plasmids such as the commercially available pVL1393 (Novagen). Broadly, a desired portion of the foggy coding sequence, such as a sequence encoding a foggy, or a sequence encoding the extracellular domain of a transmembrane protein, or a sequence encoding a mature protein if the protein is an extracellular protein Is amplified by PCR using primers complementary to the 5 ′ and 3 ′ regions. The 5 'primer may include an adjacent restriction enzyme site (selected). Thereafter, the amplification product is cut with the selected restriction enzyme and subcloned into an expression vector.
Recombinant baculovirus was prepared by transferring the above plasmid and Baculo Gold (trade name) viral DNA (Pharmingen) to Spodoptera frugiperda (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL). Produced by co-transformation. After culturing at 28 ° C. for 4-5 days, the released virus is recovered and used for further amplification. Virus infection and protein expression are performed by the methods of O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), as described above.
[0140]
The expressed poly-his-tagged PRO is, for example, NiNi as follows.²⁺-It can be purified by chelate affinity chromatography. Extracts are prepared from Sf9 cells infected with the recombinant virus as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Roughly, Sf9 cells were washed and sonicated buffer (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl 2₂0.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) and sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicated product was subjected to centrifugation to remove contaminants, and the supernatant was diluted 50-fold with a loading buffer (50 mM phosphoric acid, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8). Filtered with a filter. Ni²⁺-NTA agarose column (commercially available from Qiagen) is prepared in a total volume of 5 mL, washed with 25 mL of water and equilibrated with 25 mL of loading buffer. The filtered cell extract is applied to the column at a flow rate of 0.5 mL per minute. Column is baseline A₂₈₀Wash with loading buffer until, at which point fractionation starts. Next, the column is washed with a second wash buffer (50 mM phosphoric acid; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0) to elute non-specifically bound proteins. A₂₈₀After reaching the baseline again, the column is developed with a 0 to 500 mM imidazole gradient in the second wash buffer. Aliquots of 1 mL were taken, and SDS-PAGE and silver staining or Ni²⁺-Analyzed by Western blot with NTA binding alkaline phosphatase (Qiagen). Eluted His₁₀Fractions containing tagged PRO are pooled and dialyzed against loading buffer.
Alternatively, purification of IgG-tagged (or Fc-tagged) PRO can be performed by using known chromatography techniques, for example, protein A or protein G column chromatography.
Embodiment 6
[0141]
Preparation of antibodies that bind to foggy
This example demonstrates the preparation of a monoclonal antibody that specifically binds a foggy polypeptide and a foggy polypeptide antagonist ("foggy").
Techniques for producing monoclonal antibodies are well known in the art and are described, for example, in Goding, supra. Immunogens used include purified foggy, fusion proteins containing foggy, and cells expressing recombinant foggy on the cell surface. The selection of an immunogen can be made by one skilled in the art without undue experimentation.
Mice, such as Balb / c, are immunized with the foggy immunogen emulsified in complete Freund's adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally in an amount of 1-100 μg. Alternatively, the immunogen is emulsified in MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) and injected into the animal's hind foot pad. The immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with an additional immunogen emulsified in the selected adjuvant. Several weeks later, the mice are further boosted by immunization. Serum samples are collected by orbital bleeding from mice periodically for testing by the ELISA assay to detect anti-foggy antibodies.
[0142]
After the appropriate antibody titer is detected, animals "positive" for the antibody are finally injected by intravenous foggy. Three to four days later, the mice are processed and spleen cells are collected. Spleen cells were obtained from ATCC, No. P3X63AgU. Available from CRL1597. Fused with a selected mouse myeloma cell line such as 1 (using 35% polyethylene glycol). The fused cells were then plated in 96-well tissue culture plates containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) medium to inhibit the growth of non-fused cells, hybrids of myeloma, and hybrids of spleen cells. The resulting hybridoma is produced.
The hybridoma cells will be screened by an ELISA for reactivity to foggy. Identification of “positive” hybridoma cells secreting the desired monoclonal antibody to foggy is within the skill of the art.
Positive hybridoma cells are injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to produce ascites containing anti-foggy monoclonal antibodies. Alternatively, the hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Purification of the monoclonal antibody produced in ascites can be performed by gel filtration chromatography after using ammonium sulfate precipitation. Alternatively, affinity chromatography based on the binding of the antibody to protein A or protein G can be used.
Embodiment 7
[0143]
Purification of foggy polypeptide using specific antibodies
Natural or recombinant foggy polypeptides and foggy polypeptide antagonists ("foggy") are purified by various standard techniques in the field of protein purification. For example, foggy is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for the foggy polypeptide of interest. Typically, immunoaffinity columns are constructed by covalently coupling an anti-foggy polypeptide antibody to an activated chromatography resin.
Polyclonal immunoglobulins are prepared from the immunized sera by either ammonium sulfate precipitation or by purification with immobilized Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Similarly, monoclonal antibodies are purified from mouse ascites fluid by ammonium sulfate precipitation or chromatography on immobilized protein A. The partially purified immunoglobulin is covalently bound to a chromatography resin such as CnBr-activated SEPHAROSE (Pharmacia LKB Biotechnology). The antibody is bound to the resin, the resin is blocked, and the resulting resin is washed according to the manufacturer's instructions.
[0144]
Such an immunoaffinity column is used for purification of foggy polypeptide by preparing a fraction from cells containing the foggy polypeptide in a soluble form. This purification method can be obtained by solubilization of whole cells, or solubilization of a cell component fraction obtained by fractionation centrifugation by addition of a surfactant, or other methods well known in the art. Alternatively, a soluble foggy polypeptide containing a signal sequence is secreted in an effective amount into the medium in which the cells grow.
The preparation containing the soluble foggy polypeptide is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow for preferential absorption of the foggy polypeptide (eg, in the presence of detergent, high ionicity). In strong buffer). The column is then eluted under conditions that disrupt antibody / foggy polypeptide binding (eg, under a low pH buffer of approximately pH 2-3, or under high concentrations of chaotropic factors such as urea or thiocyanate ions), The foggy polypeptide is recovered.
Embodiment 8
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Drug screening
The invention is particularly useful in any of a variety of drug screening techniques using foggy polypeptides and foggy polypeptide antagonists ("foggy") or binding fragments thereof. The foggy used in such tests is soluble in a liquid, attached to a solid support, appears on the cell surface, or is localized intracellularly. Certain drug screening methods utilize eukaryotic or prokaryotic host cells that have been stably transformed with recombinant nucleic acids that express foggy. Drugs are screened against such transformed cells in a competitive binding assay. Such cells are in a live or immobilized form and can be used for standard binding assays. For example, the complex formation between foggy and the drug being tested is measured. Alternatively, one can examine the decrease in complex formation between the foggy polypeptide and its target cell or target receptor caused by the drug being tested.
Accordingly, the present invention provides methods of screening for drugs or any other drugs that can affect a foggy polypeptide-related disease or disorder. These methods include contacting such a drug with foggy, and determining whether (i) the presence of a complex between the drug and foggy, or (ii) the complex of foggy and a cell, in the art. Assaying by well known methods. In such competitive binding assays, the foggy is typically labeled. After appropriate incubation, free foggy is separated from that present in bound form, and the amount of free or uncomplexed label indicates that the specific drug binds to foggy and inhibits the foggy / cell complex. It is a measure of the ability of a particular drug to:
[0146]
Other techniques for drug screening provide high-throughput screening for compounds with appropriate binding affinity to the polypeptide, and are described in detail in WO 84/03564, published September 13, 1984. Have been. Briefly, large amounts of different small peptide test compounds are synthesized on a solid substrate such as a plastic pin or some surface. When applied to a foggy polypeptide, the peptide test compound reacts with the foggy and is washed. Bound foggy polypeptide is detected by methods well known in the art. Also, the purified foggy can be coated directly on a plate for use in the drug screening techniques described above. In addition, non-neutralizing antibodies are used to capture and immobilize the peptide on a solid support.
The invention also contemplates the use of competitive drug screening assays in which neutralizing antibodies capable of binding foggy compete for binding of the test compound to the foggy polypeptide or a fragment thereof. Thus, an antibody can be used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with a foggy polypeptide.
[Brief description of the drawings]
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1A-J show foggy mutants deficient in DA neurons and a corresponding excess of 5HT neurons in the hypothalamus. The left panel shows WT and the right panel shows foggy embryos. (AB) Viewed from the side, showing a 20-day-old foggy embryo, having a very normal morphology, reduced neural crest-derived melanocytes, and blood accumulation near the heart due to blocked circulation. There is. FIG. 1C-H shows a two-day-old embryo labeled with TH antibody (1C-D), 5HT antibody (1E-F) and TH (green) and 5HT (red) double staining (1G-H). Viewed from the side, shows a decrease in TH + DA neurons and a corresponding increase in 5HTir neurons in the hypothalamus. Cells expressing both TH and 5HT (yellow) are indicated by arrowheads (FIG. 1H). FIGS. 1I-J are dorsal views of embryos labeled with the 5HT antibody, showing that hindbrain 5HT + neurons appear normal in foggy embryos. Increased hypothalamic 5HT + neurons are out of focus.
FIGS. 2A-L show the neuronal phenotype in the foggy retina. The WT is on the left and the foggy embryo is on the right. FIGS. 2A-B are 3 day old retinas labeled with TH antibody, showing that TH + DA axonal neurons are lost in foggy mutants. FIGS. 2C-F are two-day-old retinal whole mount in situ hybridizations with red opsin (CD) and glutamate decarboxylase (GAD-67), and (EF) in foggy mutants. GAD67 + GABAergic axonal neurons and red opsin + cone photoreceptor deficiency. 2G-H are 2-day-old retinas labeled with a Zn-8 antibody that recognizes ganglion neurons, indicating that foggy mutants have not lost, but probably slightly increased, ganglion neurons. ing. Figures IJ are whole mount in situ hybridizations of retinas at 2 days of age with γ-crystallin, demonstrating normal expression of the foggy mutant. FIGS. 2K-L are histological analyzes of eyes from 72 hpf WT (FIG. 2K) and mutant zebrafish (FIG. 2L) embryos. Mutant embryo eyes are approximately 50 μm smaller in diameter relative to WT. All mutant retinal embryos are present, gcl (ganglion cell layer), ipl (inner plexiform layer), inl (inner nuclear layer), opl (outer The outer plexiform layer), and the pcl photoreceptor layer. Lightly basophilic cells (axonless cells) are missing in the inner nuclear layer of the mutant.
FIGS. 3A-L show hindbrain noradrenergic LC neurons, and neural crest-derived sympathetic neurons in the PNS are missing in foggy mutant embryos. The left side is the WT and the right side shows the mutant foggy embryo. FIGS. 3A-B show a 36 hpf embryo viewed from the dorsal side and show that DBH + LC neurons are missing in the foggy mutant. 3C-D are two-day-old embryos labeled with the TH antibody viewed from the ventral side and show that sympathetic neurons are missing in the foggy mutant. Figures 3E-F show a side view of 12 segment WT and mutant embryos, showing normal expression of zphox2a mRNA in LC precursors. FIGS. 3G-H show a 2-day-old embryo viewed from the ventral side and show the absence of zphox2aRNA from sympathetic neurons. FIGS. 3I-J show a 36 hpf embryo labeled with the 3A10 antibody from the dorsal side and show normal recruitment of hindbrain Mauthner neurons in the foggy mutant. FIG. 3K-L shows a side view of a two-day-old embryo labeled with Hu antibody, showing normal recruitment of neural crest-derived dorsal root ganglion (DRG) neurons in foggy mutants.
FIGS. 4A-B generate a physical map of the foggy region and identify DNA polymorphic markers more closely related to AFLP. FIG. 4A is an example showing Genescan software output of PCR fragment analysis performed on the automatic sequencer ABI310. Each peak represents a PCR fragment, the unique peak indicated by a red arrow represents a PCR fragment, and the unique peak indicated by a red arrow represents a DNA marker bound to the foggy locus. FIG. 4B shows two closely related AFLP markers, ETACMTCT155 and ETACMGAT270, which were used as starting points to isolate large genomic DNA clones (YACs, BACs and PACs) spanning the entire foggy region. The size of all YAC, BAC and PAC clones was determined by pulse field electrophoresis and restriction digestion. The ends of all clones were sequenced and the sequencing information was used to identify specific PCR primers used for the next walk, for genetic linkage analysis with SSCP and PFLP, and for radiation hybrid panel analysis. Designed. B108J11 was found to contain the foggy gene by a transformation rescue assay (see FIG. 5) and was subsequently sequenced in its entirety. It was also used as a probe to screen a cDNA library against isolated foggy cDNA.
FIGS. 5A-C show the rescue of the foggy mutant phenotype by injection of BAC clones. FIG. 5A shows that injection of control DNA or P21917 did not rescue the foggy mutant phenotype. For example, mutant embryos showed reduced melanocytes, blocked blood circulation and loss of DA and LC neurons. FIG. 5B shows that injection of B109J11 rescued the foggy mutant phenotype: 10 for 22 injected mutant animals, as judged by melanocyte, blood circulation and recovery of DA and LC neurons. Complete rescue (B, left panel) and 12 partially rescued (B, right panel). FIG. 5C shows PCR genotyping of injected embryos with laterally tightly linked polymorphic markers at the foggy locus: B172K17p (0.04 +/− 0.02 cM from foggy) and ETACMGAT270 (0.06 +/− cM from foggy). Is shown. This identified that the rescued embryos were indeed mutants of the foggy genotype.
Figures 6A-D show the encoded amino acid sequence of the foggy polypeptide, a comparison of the Spt5 / foggy family of proteins, and the detection of mutations in foggy. FIG. 6A shows the deduced amino acid sequence of zebrafish foggy, with the N-terminal acidic region underlined. Central and C-terminal conserved regions are marked in parentheses. The four KOW motifs are underlined and labeled kow1-4. The two putative nuclear localization signals are marked with boxes. Hexapeptide repeats are double underlined. FIG. 6B shows a bar showing the homology between foggy and its homologues from other species, including acidic, N-terminal conserved central region, hexapeptide repeats and conserved C-terminal domain. FIG. 6C shows the amino acid sequence of the C-terminal domain with the conserved residues boxed and the invariant amino acids starred. foggy^m806The mutation changes the unchanged amino acid 1012-valine to aspartic acid. FIG. 6D is a chromatograph created with an Abi-automated sequencer, where a single nucleotide change from T → A is foggy.^m806Leads to an amino acid change from WT1012-Val to a mutated Asp.
FIGS. 7A-J show foggy expression. Whole mount in situ hybridization using a foggy RNA probe (A-F) indicates that maternal foggy mRNA is present in all blastomas of the ball stage embryo (A). In tail-budding embryos (shown in FIG. 7B), foggy mRNA is highly enriched in neural plates, but low levels of expression are also detected elsewhere. During somitogenesis, foggy mRNA is highly expressed in the brain in 28 hpf embryos (FIG. 7C). In 2-day-old embryos, foggy mRNA was detected more in the brain than elsewhere, but was slightly down-regulated compared to the early stages (FIG. 7E). The expression pattern of foggy mRNA did not differ between WT (FIGS. C, E) and foggy mutant embryos (FIGS. D, F). Mammalian Cos-7 cells transfected with the FLAG-tagged WTfoggy construct and visualized by DAPI (FIG. 7G) and FLAG antibody staining (FIG. 7H) show that the WTfoggy protein enters the cell nucleus. Cos-7 cells transfected with the FLAG tag mutant foggy construct (FIGS. 7H and 7J) show that the mutant foggy protein can still enter the cell nucleus.
FIGS. 8A-C show that the foggy mutation abolishes the negative but not the positive function of foggy / zSpt5 in vitro. FIG. 8A shows that the foggy / zSpt5 protein used in the next assay was separated by 7.5% SDS-PAGE and stained with Coomassie brilliant blue. FIG. 8B shows a deletion / adjustment assay using native HeLa nuclear extracts. Either human Spt4 (5 ng) and either hSpt5 (50 ng) or wild-type or mutant foggy / zSpt5 (50, 150, 450 ng) were added or subtracted from the DSIF-deficient extract and the transcriptional response was determined in the presence or absence of DRB. Started for 10 minutes. Plasmid TF3-6C2At contains a 380-nt G-free cassette downstream of the adenovirus E4 promoter and was used as a template. FIG. 8C shows a deletion / adjustment assay performed using pSLG402 as a template under limiting NTP concentrations, which allows the stimulating activity of foggy / zSpt5 to be measured. As shown schematically at the top, pSLG402 contains two G-free cassettes downstream of the adenovirus major late promoter. The amount of the two RNA bands was quantified using the FLA2000 image analyzer (Fuji) and the distal promoter was calculated relative to the proximity ratio.
FIGS. 9A-C show the effect of foggy mutation on foggy / zSpt5 positive function. Deletion / adjustment assays were performed using pSLG402 as template under limited NTP concentrations, which allowed the measurement of foggy / zSpt5 stimulatory activity. As shown schematically in FIG. 9A, pSLG402 contains two G-free cassettes downstream of the adenovirus major late promoter. The actual gel image is shown in FIG. 9B. The amounts of the two RNA bands were quantified using a FLA2000 image analyzer (Fuji). FIG. 9C shows the calculation of the distal to proximal ratio of the promoter.
FIG. 10 shows the native sequence nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoding the native sequence foggy polypeptide of FIG. 11 (SEQ ID NO: 1). The three letter start and stop codons are shown in bold font and underlined. The location of the T → A mutation is also specified in bold and underlined.
FIG. 11 shows the native foggy amino acid sequence (SEQ ID NO: 1). The position of the Val → Asp mutation at position 1012 is also specified in bold and underlined.

Claims (22)

A method of forming dopaminergic neurons by contacting neural progenitor cells with an effective amount of a foggy polypeptide in vitro. 2. The method of claim 1, wherein the contacting is made in vitro. The method of claim 1 wherein the foggy polypeptide is active and is encoded by a nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of FIG. 11 (SEQ ID NO: 1). . 2. The method of claim 1, wherein the foggy polypeptide comprises an active foggy amino acid sequence having the sequence of FIG. 11 (SEQ ID NO: 1) with at least 80% amino acid sequence identity. The method of claim 1, wherein the foggy polypeptide is SEQ ID NO: 1. A method of forming serotonergic neurons by contacting neural progenitor cells in vitro with an effective amount of a foggy polypeptide antagonist. 7. The method of claim 6, wherein the contacting is made in vitro. 7. The method of claim 6, wherein the foggy polypeptide antagonist is active and is encoded by a nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 7. The method of claim 6, wherein the foggy polypeptide antagonist comprises an amino acid sequence that is an active foggy antagonist having at least 80% amino acid sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 3. 7. The method of claim 6, wherein the foggy polypeptide is SEQ ID NO: 3. A method of treating a disease in a mammal, wherein the disease is characterized by degeneration of dopaminergic neurons, wherein the mammal is treated with a therapeutically effective amount of neural progenitor cells previously treated with an effective amount of a foggy polypeptide. A method comprising implanting into a subject. A method of treating a disease in a mammal, wherein the disease is characterized by degeneration of serotonergic neurons, wherein the therapeutically effective amount of neural progenitor cells previously treated with an effective amount of a foggy polypeptide antagonist is administered to the mammal. A method comprising implanting in an animal. 12. The method of claim 11, further comprising administering at least one neuronal survival factor in a therapeutically effective amount. Neuronal survival factors include: nerve growth factor (NGF); ciliary neurotrophic factor (CNTF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), and neurotrophin-4 (NT -4); aFGF; group consisting of IL-1β, TNF-α, insulin-like growth factor (IGF-1, IGF-2), transforming growth factor β (TGF-β, TGF-β1) and skeletal muscle extract 14. The method of claim 13, wherein the method is selected from: 12. The method of claim 11, wherein the disease is characterized by abnormalities in postural reflex, motor and reward-related behavioral regulation. 12. The disease of claim 11, wherein the disease is selected from the group consisting of: Parkinson's disease, schizophrenia, drug addiction and rest tremor, stiffness, inability to move, and symptoms caused by trauma or disease resulting in postural abnormalities. the method of. 17. The method of claim 16, wherein the disease is selected from the group consisting of anorexia, anorexia, or numbness. 13. The method of claim 12, further comprising administering a therapeutically effective amount of a neuronal survival factor. 13. The method of claim 12, wherein the disease is characterized by abnormal regulation of food intake, hormone secretion, stress response, pain and immune function, sexual activity, cardiovascular function and thermoregulation. 13. The method of claim 12, wherein the disease is selected from the group consisting of: depression; suicidal feelings; violent aggressive behavior; obsessive-compulsive behavior; anorexia / bulimia and schizophrenia. A composition of matter comprising a neural progenitor cell and an effective amount of a foggy polypeptide antagonist. A medical device comprising neural progenitor cells and an effective amount of a foggy polypeptide antagonist.

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