【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連する出願の相互参照
本出願は、２００１年５月１７日に出願された、米国仮出願連続番号第６０／２９１，３２６号の利益を主張する。
【０００２】
１． 発明の分野
この発明は、表皮水疱症およびそのすべてのサブタイプが原因で発症する、皮膚および周辺組織の炎症性変性疾患、免疫学的疾患および他の疾患を治すかまたは予防する分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
２． 背景技術の説明
表皮水疱症（ＥＢ）と称される現象は、すべての人種および民族群を苦しめる稀な遺伝的疾患である。ＥＢは、皮膚への軽い外傷後に起こる水疱形成により特徴付けられる疾患群である。これは、開放性びらん、潰瘍および瘢痕に繋がるおそれがある。このファミリーの疾患の重症度は、皮膚についての、軽度なものから、重篤な能力障害を生じたり、切断したり、生命を脅かしたりするような疾病にまで及ぶ。熱傷とは違い、これらの病気は時として決して完治しないことがある。最も重篤な症例の場合、ライフスタイルを大幅に変える必要がある。通常の子供の遊びでも慢性的なびらんが生じるので、この疾患を患う小児は、自転車に乗ったり、スケートをしたり、スポーツに参加したりすべきではない。このようなびらんは小児の身体の７５％までも覆う可能性がある。水疱形成および瘢痕化が口および食道にも発生する。したがって、しばしば流動食または軟食しか取ることができない。瘢痕化はまた、手足の指を融合させ、機能を著しく制限する変形を残す。彼らの生活のうち大部分が、治療、輸血、生検および外科手術のために病院に拘束される。目には、しばしば、何日も視界を妨げる水疱が形成される。慢性的な貧血によりエネルギが減じ、成長が遅れる。ＥＢを患う個人の寿命は、通常３０年未満である。
【０００４】
ＥＢには３つの主要な種類、すなわち、単純型表皮水疱症（EB Simplex）、栄養障害型表皮水疱症（Dystrophic EB）（優性または劣性）、および接合部型表皮水疱症（Junctional EB）がある。これらの種類によって症状の重症度は異なる。一般的には、ＥＢにより、特定の部位、たとえば手または足に制限される可能性のある、または身体の広範な部位を冒す可能性のある水疱が生じる。軽症である場合、水疱は、通常皮膚に永久的な損傷を残さずに治癒する。他の種類の場合、水疱が治癒しても皮膚に永久的な変化をもたらす可能性のある瘢痕が残り、たとえば、指が融合し、手が収縮して運動が減じられるおそれがある。接合部型表皮水疱症のうちいくつかの種類は、乳児期においては生命にかかわるものとなる。
【０００５】
ＥＢは、皮膚の生理学的、生化学的および免疫学的特性における有害な変化に起因する。すべての種類のＥＢは元々遺伝的なものであり、いくつかの異なるサブタイプの症状の原因である遺伝子が現在知られている。この遺伝的欠陥により、皮膚層が互いに適切に癒着せず、構造的に弱い部位が生じることとなる。この脆弱な皮膚は、特に、軽い摩擦から損傷を受けやすく、この症状の特徴的な特性である水疱を生ずる。皮膚は、感染に対する重要なバリアであり、免疫系を防御する第一線である。ＥＢに冒された人の脆弱な皮膚はこの重要な防御機構を失う。血管系におけるこのような変化により、損傷を修復する能力が減じられ、扁平上皮癌等の皮膚癌になりやすくなり、感染のリスクが増す。加えて、口腔および消化管腔における開放性びらんは、脱水および栄養不良の進行につながるおそれがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＥＢを治療しようとする多くの試みがなされたが、いずれもＥＢの予防または治療に実質的な効果はなかった。さまざまな成長因子、人工皮膚、抗生物質および他の治療法では、適切および効果的にＥＢを治療することができなかった。ＥＢが遺伝病であるとはいえ、びらんをより迅速にまたはより良く治し得る治療が極めて重要である。さらに、予防的治療は、実質的な、おそらくは命を救う恩恵を患者に明確にもたらすだろう。
【０００７】
多くの医薬的、栄養補助的または美容的な処方が、ＥＢまたはその影響を減じるかまたはなくすよう提案されている。
【０００８】
ＥＢに関連付けられる水疱およびびらんを治すかまたは予防するための改善された方法および組成物が、当該技術において依然として必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
この発明に従えば、ＥＢに関連付けられる水疱、びらんまたは皮膚変性の治癒または予防を促進するための治療方法は、このような治療を必要とする被験体または患者に対して、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたは、その、ＥＢ抑制活性を有する保存的な変異型を含むＥＢ抑制ポリペプチドを含有する有効な量の組成物を投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
この発明は、サイモシンβ４（Ｔβ４）等のアクチン重合抑制ペプチド、およびアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたはその保存的な変異型を含む他のアクチン重合抑制ペプチドまたはペプチドフラグメントが、表皮水疱症に関連付けられる水疱、びらん、および皮膚変性の治癒または予防を促進するという発見に基づく。ＫＬＫＫＴＥＴおよびＬＫＫＴＥＴＱ等のＮ−末端変異型またはＣ−末端変異型が含まれる。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、これらのペプチドは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を誘導し、１つまたはそれ以上の炎症性サイトカインまたはケモカインのレベルを下げ、内皮細胞に対して走化性因子および／または脈管形成因子として作用する能力を有することにより、修復、治癒および予防を促進する能力を有し得、これにより、たとえＥＢが遺伝による欠陥によってもたらされるものであるとしても、ＥＢに冒された患者の皮膚における退行性変化を治しかつ予防し得る。
【００１１】
サイモシンβ４は当初は、インビトロでの内皮細胞の遊走および分化中にアップレギュレートされるタンパク質として同定された。サイモシンβ４は元々胸腺から単離されており、４３アミノ酸、すなわち、種々の組織において同定される４．９ｋＤａの偏在的なポリペプチドである。内皮細胞の分化および遊走、Ｔ細胞分化、アクチン重合抑制ならびに血管新生における役割を含むいくつかの役割は、このタンパク質に起因している。
【００１２】
１つの実施形態に従えば、この発明は、ＥＢに関連付けられる水疱、びらんおよび皮膚変性の治癒および予防を促進するための治療方法であり、このような治療を必要とする被験体に対して、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたは、その、ＥＢ抑制活性を有する保存的な変異型を含むＥＢ抑制ペプチド、好ましくはサイモシンβ４、サイモシンβ４のアイソフォーム、酸化サイモシンβ４、サイモシンβ４スルホキシドまたはサイモシンβ４のアンタゴニストを含有する有効な量の組成物を投与することを含む。
【００１３】
この発明に従って用いることのできる組成物は、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４アイソフォーム、酸化Ｔβ４、サイモシンβ４スルホキシド、アクチン結合ドメインを有するポリペプチドまたは他のアクチン重合抑制もしくは束化タンパク質、または、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴもしくは、その、ＥＢ抑制活性を有する保存的な変異型を含むか、もしくは本質的にそれからなるペプチドフラグメントを含む。引用によりこの明細書中に援用される、国際出願連続番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２は、この発明に従って有用であり得るＴβ４のアイソフォーム、ならびに、この発明で利用することのできるアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴおよび、その、ＥＢ抑制活性を有する保存的な変異型を開示する。引用によりこの明細書中に援用される、国際出願連続番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／００８３３（ＷＯ ９９／４９８８３）は、この発明に従って利用することのできる酸化サイモシンβ４を開示する。この発明は、主として、Ｔβ４およびＴβ４アイソフォームに関して以下に記載されるが、以下の記載が、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴまたはその、ＥＢ抑制活性を有する保存的な変異型を含むかまたは本質的にそれからなるペプチドおよびフラグメント、ならびに酸化サイモシンβ４に等しく適用できることが意図されることを理解すべきである。
【００１４】
１つの実施形態では、この発明は、Ｔβ４またはＴβ４アイソフォームを含有する、ＥＢの抑制に有効な量の組成物を皮膚に接触させることにより、被験体の皮膚の水疱およびびらんを治しかつ予防するための方法を提供する。この接触は局所的または全身的であり得る。局所投与の実施例には、たとえば、Ｔβ４を含むローション、軟膏、ゲル、クリーム、泥膏、噴霧液、懸濁液、分散液、ヒドロゲル、軟膏剤または油剤を、単独で、または、治療されるべき部位へのＴβ４の浸透を高めるかまたはＴβ４ペプチドの放出を遅延もしくは減速させる少なくとも１つの製剤と組合せて、皮膚に接触させることが含まれる。全身投与には、たとえば、Ｔβ４またはＴβ４アイソフォームなどを含有する組成物の静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射もしくは皮下注射、吸入、または経皮投与もしくは経口投与が含まれる。被験体は、哺乳類、好ましくはヒトであり得る。
【００１５】
Ｔβ４またはその類似体、アイソフォームもしくは誘導体は、好適なＥＢ抑制量で投与され得る。たとえば、Ｔβ４は、Ｔβ４の約０．１〜５０μｇの範囲内の用量で、より好ましくは約１〜２５μｇの量で投与され得る。
【００１６】
この発明に従った組成物は、単回投与で、またはたとえば１日に２、３、４回以上などの複数回投与で、毎日、隔日などで投与され得る。
【００１７】
Ｔβ４アイソフォームは、公知のＴβ４のアミノ酸配列に対して約７０％、約７５％、または約８０％以上の相同性を有することが同定されている。このようなアイソフォームは、たとえば、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５を含む。Ｔβ４と同様に、Ｔβ１０およびＴβ１５アイソフォームはアクチンを重合抑制することが明らかにされた。Ｔβ４、Ｔβ１０およびＴβ１５、ならびにこれらの他のアイソフォームは、アクチン重合抑制または結合の媒介に関与していると思われるアミノ酸配列、すなわちＬＫＫＴＥＴを共有する。いかなる特定の理論にも束縛されないことを望むが、Ｔβ４アイソフォームの活性は、ある程度、アクチンの重合を調節する能力によるものであり得る。たとえば、Ｔβ４は皮膚におけるアクチンの重合を調節し得る（たとえば、β−サイモシンは、遊離Ｇ−アクチンを重合抑制することによりＦ−アクチンを脱重合すると思われる）。したがって、アクチンの重合を調節するＴβ４の能力は、すべてまたはある程度まで、ＬＫＫＴＥＴ配列を介して、アクチンに結合するかまたはアクチンを重合抑制するというその能力によるものであり得る。こうして、Ｔβ４と同様に、アクチンを結合もしくは重合抑制するか、またはアクチンの重合を調節する他のタンパク質は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを有するＴβ４アイソフォームを含んでおり、この明細書中に述べられるように、単独でまたはＴβ４と組合されて、ＥＢを緩和する可能性がある。
【００１８】
したがって、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５等の公知のＴβ４アイソフォーム、ならびに依然として同定されていないＴβ４アイソフォームが、この発明の方法において有用であることが特に企図される。そのような訳で、Ｔβ４アイソフォームは、被験体において実施される方法を含む、この発明の方法において有用である。したがって、この発明は、さらに、Ｔβ４、ならびにＴβ４アイソフォーム、Ｔβ４ala、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４およびＴβ１５を含む医薬組成物と、医薬的に許容される担体とを提供する。
【００１９】
加えて、アクチン重合抑制もしくは結合能力を有するか、または、アクチンを可動化し得るかもしくはアクチンの重合を調節し得る他のタンパク質は、適切な重合抑制、結合、可動化もしくは重合検定において示されるように、または、アクチン結合を媒介する、ＬＫＫＴＥＴ等のアミノ酸配列の存在により同定されるように、たとえば、この発明の方法において同様に用いることができる。このようなタンパク質は、たとえば、ゲルソリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、アドセベルチン、プロポミオシン、フィンシリン、デパクチン、ＤｎアーゼＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンおよびアクメンチンを含む。このような方法は被験体において実施される上述の方法を含むので、この発明はさらに、この明細書中に述べられるように、ゲルソリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎアーゼＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンおよびアクメンチンを含む医薬組成物を提供する。こうして、この発明は、（一次アミノ酸配列内にあり得る）アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、およびその保存的な変異型を含むＥＢ抑制ポリペプチドの使用を含む。
【００２０】
この明細書で用いられるように、「保存的な変異型」という用語、またはその文法的な変形は、アミノ酸残基を別の生物学的に類似の残基に置換することを示す。保存的な変異型の実施例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン等の疎水性残基を別のものと置換すること、極性残基を別のものと置換すること、たとえば、リシンをアルギニンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、アスパラギンをグルタミン酸に置換すること等を含む。
【００２１】
Ｔβ４はいくつかの組織および細胞タイプに局在しており、このため、Ｔβ４の生成を促進する製剤は、組織および／または細胞からのＴβ４生成をもたらす組成物に添加され得るか、またはこれを含み得る。このような製剤は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、β型トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、サイモシンα１（Ｔα１）、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）等の成長因子のファミリーのメンバーを含む。より好ましくは、この製剤は、β型トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーである。この発明のＴβ４組成物は、細胞外基質沈着、細胞遊走、および皮膚の血管新生を通じて、結合組織の成長を実現することにより、ＥＢの影響を緩和し得る。
【００２２】
１つの実施形態に従えば、被験体は、上述に規定されるように、被験体内でのＥＢ抑制ペプチドの生成を促進する製剤で治療される。
【００２３】
加えて、ＥＢの緩和を助けるか促す製剤が、Ｔβ４またはＴβ４アイソフォームとともに組成物に加えられ得る。このような製剤は、脈管形成剤、成長因子、細胞の分化を導く製剤、細胞の遊走を促進する製剤、および皮膚における細胞外基質物質の供給を促進する製剤を含む。たとえば、限定のためではないが、Ｔβ４またはＴβ４アイソフォームは、単独でまたは組合されて、以下の製剤のうちの１つまたはそれ以上の製剤と組合せて添加され得る。すなわち、有効な量のＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＬ−１、プロサイモシンαおよびサイモシンα１である。
【００２４】
この発明はまた、医薬的に許容される担体における、治療上有効な量のＴβ４またはＴβ４アイソフォームを含有する医薬組成物を含む。このような担体は、非経口投与に関して上に列挙されるものを含む。
【００２５】
ＥＢに関連付けられる水疱、びらんおよび皮膚変性を治すかまたは予防する試薬、製剤または組成物の実際の用量は、被験体の大きさおよび健康状態を含む多くの要因に依存し得る。しかしながら、当業者は、上述のＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２およびそこで引用される参考文献に開示されるような、臨床用量を決定するための方法および技術を記載する教示を用いて、使用すべき適切な用量を決定することができる。
【００２６】
好適な局所的製剤は、約０．００１〜１０重量％の範囲内の濃度、より好ましくは約０．０１〜０．１重量％の範囲内の濃度、最も好ましくは約０．０５重量％の濃度のＴβ４またはＴβ４アイソフォームを含む。
【００２７】
この明細書中に記載される治療上の方策は、この発明のＴβ４または他の化合物を含有する試薬または組成物のさまざまな投与経路または送達経路を含み、被験体に対する従来のいかなる投与技術（たとえば、しかしこれに限定されないが、局所投与、局所注射、吸入または全身投与）をも含む。この発明のＴβ４または他の化合物を用いるかまたは含む方法および組成物は、医薬的に許容される非毒性賦形剤または担体との混合により、調合されて医薬組成物となり得る。
【００２８】
この発明は、Ｔβ４ペプチドまたはその機能フラグメントと相互作用する抗体の使用を含む。異なるエピトープの特異性を備える、貯留されたモノクローナル抗体を本質的に含む抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体製剤が提供される。モノクローナル抗体は、上述のＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２に開示されるような、当業者には周知の方法によって、タンパク質のフラグメントを含む抗原から作られる。この発明で用いられる抗原という用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことを意味する。
【００２９】
さらなる別の実施形態では、この発明は、Ｔβ４遺伝子発現を調節する、有効な量の製剤を投与することにより、被験体を治療する方法を提供する。「調節」という用語は、Ｔβ４が過剰に発現した場合のＴβ４発現の抑制または抑圧を意味し、Ｔβ４が十分に発現しない場合の発現の誘導を意味する。「有効な量」という用語は、Ｔβ４遺伝子発現を調節して、結果としてＴβ４関連のＥＢの症状を緩和するのに有効なＴβ４製剤の量を意味する。Ｔβ４またはＴβ４アイソフォーム遺伝子発現を調節する製剤は、たとえばポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、アンチセンス、三重らせん物質、またはリボザイムであり得る。たとえば、Ｔβ４の構造遺伝子領域またはプロモータ領域に向けられるアンチセンスが利用され得る。
【００３０】
別の実施形態では、この発明は、Ｔβ４活性を調節する化合物を利用するための方法を提供する。Ｔβ４活性に影響を及ぼす化合物（たとえば、アンタゴニストおよびアゴニスト）は、ペプチド、ペプチドミメティック、ポリペプチド、化学的化合物、亜鉛等の鉱物、および生物学的製剤を含む。
【００３１】
いかなる特定の理論にも束縛されないが、この発明は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を誘導して、１つまたはそれ以上の炎症性サイトカインまたはケモカインのレベルを減じ、内皮細胞に対して走化性因子として作用し、これにより、表皮水疱症または他の退行性因子もしくは環境的因子によってもたらされる皮膚における退行性変化の治癒または予防を促進することにより、表皮水疱症に関連付けられる水疱、びらん、および皮膚変性の治癒または予防を促進し得る。【Technical field】
[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION Cross Reference of Related Applications This application claims the benefit of US Provisional Application Serial No. 60 / 291,326, filed May 17, 2001.
[0002]
1. FIELD OF THE INVENTION This invention relates to the field of treating or preventing inflammatory degenerative diseases of the skin and surrounding tissues, immunological diseases and other diseases caused by epidermolysis bullosa and all subtypes thereof.
[Background Art]
[0003]
2. Description of the Background Art A phenomenon called epidermolysis bullosa (EB) is a rare genetic disease that afflicts all races and ethnic groups. EBs are a group of diseases characterized by blistering that occurs after minor trauma to the skin. This can lead to open erosions, ulcers and scarring. Diseases in this family range in severity from mild to severe, disabling, amputating, or life-threatening diseases of the skin. Unlike burns, these illnesses can sometimes never be cured. In the most severe cases, lifestyle changes are needed. Children with this disease should not ride, cycle, skate, or participate in sports, as chronic erosion also occurs in normal child play. Such erosions can cover up to 75% of a child's body. Blistering and scarring also occur in the mouth and esophagus. Therefore, often only liquid or soft food can be taken. Scarring also fuses the fingers and toes, leaving deformities that severely limit their function. Most of their lives are detained in hospitals for treatment, blood transfusions, biopsies and surgery. Eyes often form blisters that obstruct vision for many days. Chronic anemia reduces energy and slows growth. The life span of an individual with EB is typically less than 30 years.
[0004]
There are three main types of EBs: epidermolysis bullosa simplex (EB Simplex), dystrophic epidermolysis bullosa (Dystrophic EB) (dominant or recessive), and junctional epidermolysis bullosa (Junctional EB) . These types vary in severity of symptoms. In general, EBs cause blisters that can be restricted to specific sites, such as the hands or feet, or that can affect large areas of the body. When mild, the blisters usually heal without leaving any permanent damage to the skin. In other types, scars remain that can cause permanent changes to the skin even if the blisters heal, for example, the fingers may fuse and the hands may contract and reduce movement. Some types of junctional epidermolysis bullosa are life-threatening in infancy.
[0005]
EB results from deleterious changes in the physiological, biochemical and immunological properties of the skin. All types of EBs are genetic in nature, and the genes responsible for several different subtypes of the condition are now known. This genetic defect causes the skin layers to not properly adhere to each other, resulting in structurally weak sites. This fragile skin is particularly susceptible to damage from light friction and produces blisters, a characteristic feature of this condition. Skin is an important barrier to infection and the first line of defense of the immune system. The fragile skin of a person affected by EB loses this important defense mechanism. Such changes in the vasculature diminish the ability to repair damage, predispose to skin cancers such as squamous cell carcinomas, and increase the risk of infection. In addition, open erosions in the oral cavity and gastrointestinal tract can lead to the development of dehydration and malnutrition.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Problems to be solved by the invention]
[0006]
Many attempts have been made to treat EB, but none have had a substantial effect in preventing or treating EB. Various growth factors, artificial skin, antibiotics and other therapies have failed to properly and effectively treat EB. Although EB is a genetic disease, treatments that can cure erosions more quickly or better are crucial. In addition, prophylactic treatment will clearly provide patients with substantial, perhaps life-saving benefits.
[0007]
Many pharmaceutical, nutritional or cosmetic formulations have been proposed to reduce or eliminate EB or its effects.
[0008]
There remains a need in the art for improved methods and compositions for curing or preventing blisters and erosions associated with EB.
[Means for Solving the Problems]
[0009]
SUMMARY OF THE INVENTION In accordance with the present invention, a method of treatment for promoting the healing or prevention of blisters, erosions or skin degenerations associated with EBs comprises providing a subject or patient in need of such treatment with an amino acid sequence Administering an effective amount of a composition comprising LKKTET or an EB-suppressing polypeptide comprising a conservative variant thereof having EB-suppressing activity.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an actin polymerization inhibitory peptide, such as thymosin β4 (Tβ4), and other actin polymerization inhibitory peptides or peptide fragments, including the amino acid sequence LKKETET or a conservative variant thereof, are associated with epidermolysis bullosa It is based on the finding that it promotes the healing or prevention of blisters, erosions, and skin degeneration that occur. Includes N-terminal or C-terminal variants such as KLKKTET and LKKTETQ. Without being bound by any particular theory, these peptides induce terminal deoxynucleotidyl transferase (a template-independent DNA polymerase), reduce the level of one or more inflammatory cytokines or chemokines, By having the ability to act as a chemotactic and / or angiogenic factor on endothelial cells, it may have the ability to promote repair, healing and prevention, so that even if EBs are caused by genetic defects If so, it can cure and prevent degenerative changes in the skin of patients affected by EB.
[0011]
Thymosin β4 was originally identified as a protein that is up-regulated during endothelial cell migration and differentiation in vitro. Thymosin β4 was originally isolated from the thymus and is a 43 amino acid, 4.9 kDa, ubiquitous polypeptide identified in various tissues. Several roles have been attributed to this protein, including its role in endothelial cell differentiation and migration, T cell differentiation, actin polymerization inhibition and angiogenesis.
[0012]
According to one embodiment, the present invention is a method of treatment for promoting the healing and prevention of blisters, erosions and skin degenerations associated with EBs, wherein the method comprises: Effectiveness containing an amino acid sequence LKKETET or an EB inhibitory peptide thereof containing a conservative variant having EB inhibitory activity, preferably thymosin β4, an isoform of thymosin β4, oxidized thymosin β4, thymosin β4 sulfoxide or an antagonist of thymosin β4. Administering an effective amount of the composition.
[0013]
Compositions that can be used in accordance with this invention include thymosin β4 (Tβ4), Tβ4 isoforms, oxidized Tβ4, thymosin β4 sulfoxide, a polypeptide having an actin binding domain or other actin polymerization inhibiting or bundling protein, or amino acid sequence LKTET or a conservative variant thereof having EB inhibitory activity, or a peptide fragment consisting essentially thereof. International Application Serial No. PCT / US99 / 17282, which is hereby incorporated by reference, describes Tβ4 isoforms that may be useful in accordance with the present invention, as well as the amino acid sequence LKKETET and the amino acid sequence LKKTET that may be utilized in the present invention. Discloses conservative variants having EB inhibitory activity. International Application Serial No. PCT / GB99 / 00833 (WO 99/49883), which is incorporated herein by reference, discloses oxidized thymosin β4 that can be utilized in accordance with the present invention. The present invention is described primarily below with respect to Tβ4 and Tβ4 isoforms, but the following description includes or essentially consists of the amino acid sequence LKKTET, LKKTET or a conservative variant thereof having EB inhibitory activity. It should be understood that it is intended to be equally applicable to the resulting peptides and fragments, and oxidized thymosin β4.
[0014]
In one embodiment, the present invention cures and prevents blisters and erosions in a subject's skin by contacting the skin with an EB-inhibiting effective amount of a composition comprising Tβ4 or a Tβ4 isoform. To provide a way to: This contact can be local or systemic. Examples of topical administration include, for example, a lotion, ointment, gel, cream, plaster, spray, suspension, dispersion, hydrogel, ointment or oil containing Tβ4, alone or treated. Contacting the skin in combination with at least one formulation that enhances the penetration of Tβ4 into the site of interest or that delays or slows the release of the Tβ4 peptide is included. Systemic administration includes, for example, intravenous, intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous, inhalation, or transdermal or oral administration of a composition containing Tβ4 or a Tβ4 isoform and the like. The subject can be a mammal, preferably a human.
[0015]
Tβ4 or an analog, isoform or derivative thereof can be administered in a suitable EB inhibiting amount. For example, Tβ4 can be administered at a dose in the range of about 0.1-50 μg of Tβ4, more preferably in an amount of about 1-25 μg.
[0016]
The composition according to the invention may be administered in a single dose or in multiple doses, for example 2, 3, 4 or more times a day, every day, every other day and the like.
[0017]
Tβ4 isoforms have been identified as having about 70%, about 75%, or about 80% or more homology to the known amino acid sequence of Tβ4. Such isoforms include, for example, Tβ4 ala , Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 and Tβ15. Like Tβ4, Tβ10 and Tβ15 isoforms were shown to inhibit actin polymerization. Tβ4, Tβ10 and Tβ15, and their other isoforms, share an amino acid sequence that is thought to be involved in actin polymerization inhibition or mediation of binding, ie, LKKETET. Without wishing to be bound by any particular theory, the activity of the Tβ4 isoform may be due in part to its ability to modulate actin polymerization. For example, Tβ4 may regulate actin polymerization in the skin (eg, β-thymosin appears to depolymerize F-actin by inhibiting the polymerization of free G-actin). Thus, the ability of Tβ4 to regulate actin polymerization may be due, in whole or to some extent, to its ability to bind to actin or inhibit actin polymerization via the LKKTET sequence. Thus, like Tβ4, other proteins that bind or inhibit actin polymerization or regulate actin polymerization include Tβ4 isoforms having the amino acid sequence LKKTET, as described herein. , Alone or in combination with Tβ4, may mitigate EB.
[0018]
Thus, it is specifically contemplated that known Tβ4 isoforms such as Tβ4 ala , Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 and Tβ15, as well as those Tβ4 isoforms that have not yet been identified, are useful in the methods of the invention. You. As such, Tβ4 isoforms are useful in the methods of the invention, including those practiced in a subject. Accordingly, the present invention further provides a pharmaceutical composition comprising Tβ4 and Tβ4 isoforms, Tβ4 ala , Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 and Tβ15, and a pharmaceutically acceptable carrier.
[0019]
In addition, other proteins that have the ability to inhibit or bind actin polymerization, or that can mobilize actin or modulate actin polymerization, as indicated in appropriate polymerization inhibition, binding, mobilization or polymerization assays. Or as identified by the presence of an amino acid sequence, such as LKKTET, that mediates actin binding, for example, can also be used in the methods of the invention. Such proteins include, for example, gelsolin, vitamin D binding protein (DBP), profilin, cofilin, adsevertin, propomyosin, fincillin, depactin, Dnase I, villin, fragmin, severin, capping proteins, β-actinin, and acmentin including. Since such methods include the methods described above performed in a subject, the invention further includes gelsolin, vitamin D binding protein (DBP), profilin, cofilin, depactin, as described herein. Provided is a pharmaceutical composition comprising Dnase I, villin, fragmin, severin, capping protein, β-actinin and acmentin. Thus, the invention includes the use of an EB inhibitory polypeptide comprising the amino acid sequence LKKTET (which may be within the primary amino acid sequence) and conservative variants thereof.
[0020]
As used herein, the term "conservative variant," or grammatical variations thereof, refers to the replacement of an amino acid residue with another, biologically similar residue. Examples of conservative variants include replacing a hydrophobic residue, such as isoleucine, valine, leucine or methionine, with another, replacing a polar residue with another, e.g., replacing lysine with arginine. , Substituting aspartic acid for glutamic acid and asparagine for glutamic acid, and the like.
[0021]
Tβ4 is localized in several tissues and cell types, so formulations that promote the production of Tβ4 may be added to or added to compositions that result in Tβ4 production from tissues and / or cells. May be included. Such formulations include insulin-like growth factor (IGF-1), platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), beta transforming growth factor (TGF-β), basic fibroblast growth factor (BFGF), thymosin α1 (Tα1), and members of the family of growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF). More preferably, the formulation is β-type transforming growth factor (TGF-β), or another member of the TGF-β superfamily. The Tβ4 compositions of the present invention may mitigate the effects of EB by achieving connective tissue growth through extracellular matrix deposition, cell migration, and skin vascularization.
[0022]
According to one embodiment, the subject is treated with a formulation that promotes the production of an EB inhibitory peptide in the subject, as defined above.
[0023]
In addition, formulations that help or promote mitigation of EBs can be added to the composition along with Tβ4 or Tβ4 isoforms. Such formulations include angiogenic agents, growth factors, formulations that induce cell differentiation, formulations that promote cell migration, and formulations that promote the supply of extracellular matrix material to the skin. For example, but not by way of limitation, Tβ4 or Tβ4 isoforms, alone or in combination, can be added in combination with one or more of the following formulations. That is, an effective amount of VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFβ, IGF-1, IGF-2, IL-1, prothymosin α and thymosin α1.
[0024]
The invention also includes pharmaceutical compositions containing a therapeutically effective amount of Tβ4 or a Tβ4 isoform in a pharmaceutically acceptable carrier. Such carriers include those listed above for parenteral administration.
[0025]
The actual dose of a reagent, formulation or composition that cures or prevents blisters, erosions, and skin degeneration associated with EB may depend on many factors, including the size and health of the subject. However, one of ordinary skill in the art will be able to use the teachings describing methods and techniques for determining clinical dosages, as disclosed in PCT / US99 / 17282, supra, and references cited therein, The dose can be determined.
[0026]
Suitable topical formulations have a concentration in the range of about 0.001-10% by weight, more preferably in the range of about 0.01-0.1% by weight, most preferably about 0.05% by weight. Concentration of Tβ4 or Tβ4 isoform.
[0027]
The therapeutic strategies described herein include various routes of administration or delivery of reagents or compositions containing Tβ4 or other compounds of the invention, and include any conventional administration techniques for a subject (eg, , But not limited to, local administration, local injection, inhalation or systemic administration). The methods and compositions that use or include Tβ4 or other compounds of the present invention can be formulated into pharmaceutical compositions by mixing with pharmaceutically acceptable non-toxic excipients or carriers.
[0028]
This invention involves the use of antibodies that interact with the Tβ4 peptide or a functional fragment thereof. Antibodies that essentially comprise pooled monoclonal antibodies with different epitope specificities are provided, as well as separate monoclonal antibody formulations. Monoclonal antibodies are made from antigens, including fragments of proteins, by methods well known to those skilled in the art, as disclosed in PCT / US99 / 17282, supra. The term antigen as used in this invention is meant to include monoclonal and polyclonal antibodies.
[0029]
In yet another embodiment, the invention provides a method of treating a subject by administering an effective amount of a formulation that modulates Tβ4 gene expression. The term "modulation" refers to the suppression or suppression of Tβ4 expression when Tβ4 is overexpressed, and the induction of expression when Tβ4 is not sufficiently expressed. The term “effective amount” refers to an amount of a Tβ4 formulation effective to modulate Tβ4 gene expression and consequently alleviate the symptoms of Tβ4-related EB. A formulation that modulates Tβ4 or Tβ4 isoform gene expression can be, for example, a polynucleotide. The polynucleotide can be an antisense, triple helix, or ribozyme. For example, antisense directed against the structural gene region or promoter region of Tβ4 can be used.
[0030]
In another embodiment, the invention provides a method for utilizing a compound that modulates Tβ4 activity. Compounds that affect Tβ4 activity (eg, antagonists and agonists) include peptides, peptidomimetics, polypeptides, chemical compounds, minerals such as zinc, and biologicals.
[0031]
Without being bound by any particular theory, the present invention induces terminal deoxynucleotidyl transferase (a template-independent DNA polymerase) to reduce the level of one or more inflammatory cytokines or chemokines, Acts as a chemotactic factor against, thereby promoting the healing or prevention of epidermolysis bullosa or degenerative changes in the skin caused by other degenerative or environmental factors, thereby linking it to epidermolysis bullosa May help heal or prevent blisters, erosions, and skin degeneration that may occur.