JP2004524325A - Use of steroid derivatives for the treatment of benign and / or malignant tumors - Google Patents

Abstract

The present invention relates to steroid derivatives for use as medicaments. In particular, the present invention relates to an agent for the treatment of benign and / or malignant tumors, which is capable of interrupting interference in Wnt-signals, such as cell cycle arrest during G1 phase, and / or , 5-androstene-, 5-pregnenolone steroid derivatives or the corresponding saturated derivatives (androstane or pregnane-) in the manufacture of a medicament providing an angiostatinic effect. Examples of such steroid derivatives are Δ-5-androstene-17α-ol, androstene-17α-ol-pregnane-17α-ol or pregnane-17α-ol derivatives. In a further aspect, the present invention relates to 5-androstan-3β, 17α-diol or 5-androstene-17β-ol-3β-sulfate by contacting androstan-3βα-diol, an enzyme and a sulfotransferase. Providing the corresponding androstane derivative (17α-AEDS or 17-AADS); and combining 17α-AEDS or 17α-AADS with a suitable carrier; thereby as a ligand for peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) A method for the manufacture of a medicament for the treatment of benign and / or malignant tumors and / or inflammatory conditions, comprising the step of making a medicament capable of acting.

Description

ここで、これらのステロイドは、３β位にＲ_１Ｏ置換基を有し、１７α位にＲ_３置換基を有し、そして７及び１７β位に所望の置換基を有する。
【００１１】
３位の酸素上のＲ_１は、（ｉ）水素原子，（ｉｉ）ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰ（ＯＨ）_３、アシル基、及び無機酸及び有機酸とエステルを形成することのできる他の基、（ｉｉｉ）ＣＨ_３、ＣＨ_２ＯＭｅ、ＣＨ_２Ｏ−アルキルのような保護基（ｉｖ）直鎖もしくは枝分かれ鎖、飽和もしくは不飽和、置換もしくは未置換、環状の他の脂肪族鎖、例えば混合環状脂肪族基、飽和もしくは芳香族もしくは複素環式基であって、２０個以下の炭素原子を含むものでありうる。置換基は、例えば、ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アミノ、アルキルアミノあるいはジアルキルアミノから選ばれ得る。
【００１２】
さらに、具体的な実施態様においては、Ｒ_１は、ステロイドとエーテルあるいはエステルを形成することができ、Ｒ_２は式（ＩＩ）において水素であってよく、もしＲ_４がＨでなければ、式（Ｉ）において水素であってよく、さもなければ炭素番号７のαまたはβ位のＲ’Ｏであり得る。ここで Ｒ’は、Ｒ_１とは独立にＲ_１に認められる置換基でありうる。
Ｒ_２は＝Ｏあるいは＝Ｓであってもよい。
Ｒ_３は常に１７α位にあり、水酸基、アシル基またはＲ’’Ｏであってもよい。ここでＲ’’は、Ｒ_１で記載したエーテルあるいはエステルを形成する他の基、あるいはＲ_１とは独立にＲ_１について認められる置換基であってもよい。
Ｒ_４は、常に１７β−位にあり、水素原子、アルキル基、アシル基、アルコキシ基であってよく、該基は、式：Ｒ’’’Ｏ（式中、Ｒ’’’はエーテル基またはエステル基を形成する任意の基である）、また、Ｒ_１とは独立にＲ_１について認められる置換基であってもよい。
さらに、Ｒ_４は、水素原子もしくはアルコキシ基もしくはアルキル基がケト基に結合しうるアシル基であってもよい。
【００１３】
特定の実施態様では、１７ＯＨプレグネノロン（ここでメチルはケトン基に結合している）でのように、Ｒ_４はアセチル（ＣＨ_３ＣＯ）であり得る。この２０に番号付けられたこのケトンの炭素は、任意のアルキル基、アルケニル基、アリール基、例えば枝分かれした側鎖もしくは混合した芳香族及び脂肪族側鎖、例えば環式飽和炭化水素、並びに例えばＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓｉ、Ｆ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＮ、ハロゲンを含み、２０個までの炭素を含んでいる複素環もしくはヘテロ脂肪族鎖を有することができる。
【００１４】
１つの実施態様では、該ステロイドは、１７−ヒドロキシプレグネノロン（１７α−ＯＨ）、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール、Δ−５−アンドロステン−７−オキソ−３β，１７α−ジオール及び／または５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールである。
【００１５】
別の実施態様では、該ステロイドは、対応するプレグナン−及び／またはアンドロスタン誘導体である。
【００１６】
特定の実施態様において、上記の作用は、前述の腫瘍の細胞に対する直接のアポトーシス効果とは独立している。
【００１７】
本発明の新規なステロイドは、薬剤として有用であり、治療を必要とする患者に投与されると、Ｗｎｔシグナルリング経路の妨害により、１つ以上の抗腫瘍作用を提供することができる。そのような薬剤は、この経路を調節する因子中の変異により、この経路からの因子の過剰発現が生じている場合、または表現型の過剰発現が生じている場合、腫瘍が従来の治療のいくつかの形式に耐性であることが示されている場合の、腫瘍の治療には特に有利である。
【００１８】
最も有利な実施態様では、本発明によって１またはそれ以上のステロイドを含む薬剤が遺伝の過剰発現を伴う大腸癌サイクリンＤ１及び／またはβ−カテニン（エストロゲン受容体陰性の乳癌）の発現型のアップレギュレーションによって引き起こされた癌、肺癌、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、及びサイクリンD１の過剰発現によって特徴づけらる他のＢ細胞リンパ腫、副甲状腺腫、扁平上皮細胞起源の頭と首の腫瘍、食道癌、及び破壊的な血管新生（糖尿病網膜症）に支配される腫瘍及び他の病状、滲出型黄斑変性、角膜の血管新生、ヘマジオーマ（ｈｅｍａｎｇｉｏｍａｓ）のような血管腫、悪性の血管腫、正中線肉芽腫及びケロイド形成のような傷跡の制御できない成長から成る群から選ばれる病状の治療及び／または予防のためのものである。
【００１９】
第二の観点において、本発明は、良性または悪性の腫瘍の治療及び／または予防のための薬剤であって、Ｇ１相中の細胞周期阻止のようなＷｎｔ−シグナリング中の妨害を中断することができ、及び／またはアンジオスタチン性作用を提供する薬剤の製造における、５−アンドロステン−、５−プレグネノロンまたは対応する飽和誘導体（アンドロスタンあるいはプレグナン）のステロイド誘導体の使用に関する。
【００２０】
特定の実施態様では、該ステロイド誘導体は、上記で示した式（Ｉ）あるいは（ＩＩ）に示される。
【００２１】
上記のように、１つの実施態様において、前記式のＲ_１、Ｒ’及び／またはＲ”は、該ステロイドと１またはそれ以上のエーテル及び／またはエステルを形成する。特定の実施態様において、Ｒ_４は、水素、またはアルコキシまたはアルキル基がケト基に結合したアシル基であり得る。特定の実施態様において、メチルがケト基に結合する場合、Ｒ_４はアセチル（ＣＨ_３ＣＯ）である。また、２０位のケト基の炭素は、アルキル基、アルケニル基、アリール基、例えば枝分かれした側鎖あるいは混合芳香族と脂肪族の側鎖、例えば環状炭化水素並びに、Ｎ、Ｐ、０、Ｓｉ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＮ、あるいは１つ以上のハロゲンを含み、炭素数が２０以上である複素環またはヘテロ脂肪族鎖を有する。
【００２２】
２． 有利な実施態様では、該ステロイドは、１７ヒドロキシ−プレグネノロン（１７α−ＯＨ）、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール、Δ−５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール−７−オキソ、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール及び５−アンドロステン３β．１７α−ジオール−７−オン、５−アンドロスタン−３β，７β，１７α−トリオール、５−アンドロステン−３β，７α，１７α−トリオール、５−アンドロスタン−３β，７α，１７α−トリオール及び５−アンドロスタン−３β，１７α−ジオールから成る群から選択される。
【００２３】
該ステロイドに対応する１つ以上のプレグナン−及び／またはアンドロスタン誘導体は、本発明による薬剤の製造において使用することができる。
【００２４】
上記で議論された中断は、サイクリンＤ１及びβ−カテニンの過剰発現をダウンレギュレーションすることにより得られる。また、効果は、有利なことに、前述の腫瘍の細胞に対するいかなる直接のアポトーシス効果にも本質的に依存しない。本発明のこの観点によって製造された薬剤は、直腸癌、Ｗｎｔシグナル経路に属する因子の遺伝子型または発現型の過剰発現を伴う他の悪性腫瘍、例えば肺癌、黒色腫、乳癌、細胞リンパ腫及び他のリンパ腫、並びに前立腺癌の小片、前述の要因のアップレギュレーションによって特徴づけられる扁平上皮細胞起源の頭と首の癌、食道癌、副甲状腺癌また腺腫、あるいはＷｎｔシグナルの妨害により特徴づけられる他の腫瘍；糖尿病網膜症のような病的な血管新生によって支配される症状、滲出型黄斑変性、角膜の血管新生及び血管腫から成る群から選ばれた１つ以上の病状の治療及び／または予防のために有用である。
【００２５】
前立腺癌の症状における前記ステロイドの潜在的な有用性に関しては、Ｗｎｔシグナリングのデレギュレーションが前立腺癌の小さなサブフラクションにも存在し、これにより本発明によるステロイドが有用となる。ただし、下記の化合物は、下記の理由により例外となる：

【００２６】
アンドロゲン及びエストロゲン受容体（ＡＲ及びＥＲ）を完全に欠くＤｕｎｎｉｎｇ ＡＴ−１ラット前立腺癌モデルとは反対に、殆どのヒト前立腺癌は、ＡＲを、そして通常はさらにＥＲβをも大量に発現する。アンドロゲン不応性癌においては、ＡＲがさらにアップレギュレーションされる。アップレギュレーションされたβ−カテニンのアンドロゲン受容体（ＡＲ）転写に対する影響は、アンドロゲンからのＡＲ転写活性の増加並びにリガンド特異性の減少を導き、これはこの疾病における１７α−ＡＥＤの有用性を制限する。なぜならこれはエピテストステロンまたはＢ）１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートに容易に代謝されるからである。両方の潜在的なアンドロゲン受容体リガンドは、さらに他の既知のＡＲリガンド（議論における参考文献を参照）に容易に転化される。
【００２７】
アンドロゲン不応性進行では、ＡＲはさらに表皮増殖因子（ＥＧＦ）及びＩＬ−６のようなリガンド非依存性因子によっても活性化される。ＥＧＦ受容体の活性化は、さらにサイクリンＤ１（議論の参考文献を参照）の発現をアップレギュレーションする。上記２つの化合物Ｓ４及びＳ８は、これにより、常軌を逸したＷｎｔシグナリングを発現しているヒト前立腺癌の小さなサブフラクションでのみ有効な値となり、それらの有用性は、それらのアンドロゲン活性及び他のアンドロゲンへの代謝により、さらに制限される。
【００２８】
例証されるような常軌を逸したＷｎｔシグナリングによる細胞周期調節欠陥を伴う癌、あるいは例えば破壊的な血管新生においては、そのようなプロセスは、本発明によるステロイドを用いた治療を、単独で、前手術的または前放射線治療的な治療として、または細胞毒性薬、インターフェロン、サイトカインもしくはステロイドホルモンと組み合わせて行うことにより制限されるかまたは止められるかもしれない。
【００２９】
第三の観点において、本発明は（ａ）５−アンドロステン−３β，１７α−ジオールあるいはアンドロスタン−３β，１７α−ジオール、サルフェートドナー、３’ホスホ−アデノシン−５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）及びスルホトランスフェラーゼを接触させることにより、５’−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）あるいはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＡＤＳ）を提供し；そして（ｂ）これにより生成したサルフェート化１７α−ＡＥＤＳあるいは１７α−ＡＡＤＳを適当な担体と合わせ；これによりペルオキシゾーム増殖活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンドとして作用することができる薬剤を製造する工程を含む、良性及び悪性腫瘍の治療のための薬剤の製造方法に関する。本発明の内容において、該薬剤の有効成分は、対応するアンドロステン（またはアンドロスタン）誘導体またはそれらの有機酸もしくは無機酸とのエステルであり得る。有機酸の場合は、２５個以下の炭素からなるものであり得る（Ｓ４及びＳ８）。医薬の効果はスルファターゼインヒビター、例えばクーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）の同時投与により増強または延長され得る。
【００３０】
ｃ）アーノストヴァ，リブース他（Ａｒｎｏｓｔｏｖａ，Ｌｉｂｕｓｅ ｅｔ ａｌ）；Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｃｚｅｃｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐｒａｑｕｅ，Ｃｚｅｃｈ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９０），２０（１０），１５２１−９により記載された方法による３β−サルフェートＳ４（Ｒ_１＝ＳＯ_３Ｈ）及びＳ８（Ｒ_１＝ＳＯ_３Ｈ）の合成
【００３１】
対応するアンドロスタン誘導体（Ｓ８，上記式））は、１７α−または１７β−ＡＥＤ（Ｍ＆Ｍに記述されたミツノブ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ）反応による１７βから１７αへの変換）から、酢酸塩により水酸基を保護し、その後、二重結合をラネー触媒で還元することにより得られる。
【００３２】
有利な実施態様においては、前述の酵素は、ＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼあるいはフェノールスルホトランスフェラーゼである。特定の実施態様においては、本発明の薬剤は、エストロゲン受容体α（ＥＲ−α）遮断効果を増強する薬剤である。
本発明は、さらに、以下に例示されるように、上記方法自体により製造される薬剤を含む。
【００３３】
本発明により製造される薬剤は、尿道癌、胃癌、小腸癌、膵臓癌、腫瘍、内皮細胞に由来する癌、平滑筋肉腫、結腸癌、コリンサルコーマ（ｃｈｏｒｉｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺の腺腫及び脂肪肉腫、並びに眼組織の病変、例えば黒点及び緑内障の細胞からなる群から選ばれる病状の治療及び／または予防に有用である。
【００３４】
一つの実施態様において、本発明は、また、免疫調節剤、例えば、慢性関節リウマチ、関節あるいは炎症性腸疾病のような炎症性疾病あるいは多発性硬化症かギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ Ｂａｒｒｅ）症候群のような強調されたまたは持続性のＴ−ヘルパー−１応答により起きる疾病の治療及び／または予防のための薬剤の製造のための５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）及び／またはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェートの使用に関する。本発明はまた、薬剤として使用するための５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェート（１７α−ＡＥＤＳ）及び／またはアンドロスタン−１７α−オール−３β−サルフェートに関する。
【００３５】
本発明の薬剤はそのままの形態でまたは加水分解し得るプロドラッグ、即ち選択した環境において加水分解により不活性型の医薬から活性医薬となるもののいずれの形態で投与するのにも適している。そのようなプロドラッグは該医薬のエーテルあるいはエステルであり得る。そのような医薬またはプロドラッグは、局所的な注射により、腫瘍内への注射により、非経口投与により、動脈内投与により、腫瘍あるいは病原性新血管新生物の部分を支持する動脈の選択的なカテーテル法により、薬理学的に許容され得る無菌溶液または懸濁液の形態で適切に投与される。水溶性デンプン粒子（スフェレックス（Ｓｐｈｅｒｅｘ）（登録商標））の同時の注入は、該薬剤の効果を増強または延長するであろう。また、生じる低酸素状態によって生じる腫瘍の血管新生及び再生への刺激をさらに打ち消すであろう。
【００３６】
該薬剤は、薬理学的に許容され得る、例えば目、または口、鼻、膣もしくは直腸の粘膜に塗布可能なシクロデキストリンによる溶液、クリームあるいはゼリーの形態で、局所的に使用することもできる。皮膚においては、例えば過剰な傷跡形成の防止のために、薬剤溶液に浸漬した湿布を使用してもよい。該薬剤は、経口投与で、直腸もしくは膣用の座剤、クリームあるいは浣腸剤として投与することもできる。
【００３７】
Ｓ４（Ｒ_１＝ＳＯ_３Ｈ）あるいはＳ８（Ｒ_１＝ＳＯ_３Ｈ）による３β−サルフェートも、胃癌の場合の胃粘膜中の標的に達するために、プロトンポンプ抑制剤（適切なｐＨとするために）と混合して、カプセル剤または錠剤の形態で経口的に投与してもよい。
【００３８】
小腸腫瘍またはクローン病においては、該薬剤はＤＨＥＡ−スルホトランスフェラーゼが小腸内で存在するように、適当なサルフェート型または本来のステロイド（Ｓ４またはＳ８）の形態で、腸溶プセル剤として投与してもよい。
【００３９】
薬剤Ｓ４あるいはＳ８のサルフェートは、上皮膀胱癌の場合は、無菌溶液のデミュア（ｄｅｍｕｒｅ）として、カテーテルによって尿膀胱に投与してもよい。
【００４０】
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）により定義される本発明の化合物は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンあるいはミトキサントロンのようなアントラサイクリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンあるいはビノレルビンのようなビンカアルカロイド類、ドセタキサルあるいはパクリタキセルのようなタキサン類、イホスファミド、シクロホスファミド、ブスルファン、チオテパのようなアルキル化剤、ロムスチン、クロラムブチル、ダカルバジン、シスプラチン、パラプラチンかオキサリプラチンのようなニトロソ尿素、エトポシドまたはテニポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ−抑制剤、トポテカンまたはイリノテカンのようなトポイソメラーゼＩ−抑制剤、メトトレキサート、メルカプトプリン、チタラビン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ブレオマイシン、マイトマイシン、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ヒドロキシカルバミド、ミルテフォスチン、エストラムスチン、プロカルバジンあるいはＤＴＩＣのような代謝拮抗剤等の細胞毒性医薬と組み合わせてもよい。
【００４１】
１つの実施態様において、式（Ｉ）及び（ＩＩ）により定義される本発明による新規化合物の効果は、コルチコイド、レチノイド、デルタノイド、甲状腺ホルモン、性ステロイド及び他の核受容体リガンドの使用により弱められ得る。
【００４２】
図面の詳細な記載
【００４３】
図１は、分化していないコントロール及び１７α＋１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍の写真である。
【００４４】
図２は表ＩＶに関して議論されているウェスタンブロットを示す。
α＝１７α−ＡＥＤに接触させたラット腫瘍（他の治療と比較した接触時間の差を指摘するためのコントロールの左側に表わされている）。薬剤は、９６時間作用させた。
β＝８倍高い投与量の１７β−ＡＥＤで４５６時間治療した腫瘍。
α＋βは、αで９６時間に続き、βで３６０時間の連続治療を示す。
【００４５】
図３は、α−ＡＥＤ、β−ＡＥＤ、５−アンドロステン３β，７β，１７α−トリオール及び１７αＯＨ−プレグネノロンのＶＥＧＦの発現に対する影響を説明する。
Ａ：未治療のコントロール；左側の染色された部分。続いて同じ腫瘍のネガティブコントロールが示される。
Ｂ：１７α−ＡＥＤ；左側の染色された部分。続いて同じ腫瘍のネガティブコントロールが示される Ｃ：１７β−ＡＥＤ；
Ｄ：左から右まで、アンドロステン−３β，１７α，７β−トリオールで治療された１−３の腫瘍サンプル；ＶＥＧＦについて染色、４つのネガティブコントロール，同じ治療
【００４６】
図４は、α−ＡＥＤ、１７α−ＯＨ−プレグネノロン及びβ−ＡＥＤで治療されたＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット腫瘍のサンプル、並びに未治療のサンプル（Ｃ１−Ｃ３）のタンパク質ブロットを示す。
β−カテニン、サイクリン Ｄ１及びＣＯＸ−２の発現に対する治療の影響が、代表的な例によって実証されている。
【００４７】
図５は、未治療の腫瘍（ＣＡ−ＣＤ）と比較した１７α−ＡＥＤ（αＡ−Ｄ）で治療したＤｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌の細胞周期に対する影響の代表的な例を示す。未治療の腫瘍は、Ｇ１における大量の細胞によりサイクリンＤ１の強い発現を示す。１７α−ＡＥＤで治療された腫瘍では、Ｇ１における減少とＳ期の細胞の増加、及びサイクリン Ｄ１の減少が平行した。Ｇ２の細胞の増加がないので、蛋白質ブロッティングの結果と組み合わせたパターンと、アポトーシスの欠如が示されたことは、ＳまたはＧ２におけるアポトーシスではない自然の細胞死を示す。
【００４８】
図６は、リガンド誘導したコアクチベーターアッセーにおいてどのようにα−ＡＥＤ、１７ＯＨ−プレグネノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール及びそれらの対応する３β−サルフェートに対するＰＰＡＲγリガンド活性を調べたかを説明する。陽性コントロールとしてＳＲＣ−１を使用し、陰性コントロールとして雄ラットからのラット肝臓細胞質ゾルを使用した。
【００４９】
ＰＰＡＲγリガンド活性を示した唯一のサンプルは５−アンドロステン−１７α−オール−３β−サルフェートである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
実施例１： ３β，７β，１７β−トリヒドロキシアンドロステ−５−エンの合成
本実施例において下記のスキーム１に示されるように、３β，７β，１７β−トリヒドロキシアンドロステ−５−エン（化合物６）が合成された。ここで、（ａ）はＮａＢＨ_４，エタノールであり；（ｂ）はＡｃ_２Ｏ，ピリジン，ＤＭＡＰであり、（ｃ）はｔ−ＢｕＯＯＨ、Ｃｕ（Ｉ）Ｉ、アセトニトリルであり；（ｄ）はＮａＢＨ_４、ＣｅＣ１_３＊７Ｈ２０、エタノールであり；そして（ｅ）はＫＯＨ、ＭｅＯＨである。
スキーム１

【００５１】
化合物２：３β，１７β−ジヒドロキシ−アンドロステン−５−エンの合成
化合物１（１．００ｇ，３．４６ｍｍｏｌ）を乾燥エタノール（１５ｍｌ）に溶解し、ＮａＢＨ_４（１９６ｍｇ、５．２０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。１時間後、室温で、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、６ｍｌ）を注意深く添加し、この混合物をジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。
収率：９１％
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）０．７６（ｓ，１８−Ｈ）、１．０５（ｓ，１９−Ｈ）、３．５２（ｍ，３α−Ｈ）、３．６５（ｔ，１７α−Ｈ）、５．３５（ｄ，６−Ｈ）
【００５２】
化合物３：３β，１７β−ジアセトキシ−アンドロステ−５−エン
化合物２（８８０ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ）、ピリジン（２５ｍｌ）、無水酢酸（２当量）及びＤＭＡＰ（１０ｍｏｌ％、２９ｍｇ）を、１００℃で２時間加熱した。反応混合物を水に注ぎ、固体を濾去し、希塩酸、ＮａＨＣＯ_３及び水で洗浄し、最後にエタノールから結晶させた。
収率：８７％。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）２．０３（ｓ，１７β−ＯＡｃ）、２．０５（ｓ，３β−ＯＡＣ）、５．３８（ｄ，６−Ｈ）
【００５３】
化合物４：３β，１７β−ジアセトキシ−アンドロステ−５−エン（サルバドール，ジェイ．エイ．アール．（Ｓａｌｖａｄｏｒ，Ｊ．Ａ．Ｒ．）；ｅｌｏ，Ｍ．Ｌ．Ｓ．；Ｎｅｖｅｓ，Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９７，１１９−１２２）
アルゴン下、アセトニトリル（１２ｍｌ）中の化合物３（６５０ｍｇ、１．８０ ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ化銅（Ｉ） （３．６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチル過酸化水素（２．５ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。マグネティックスターラーで５５℃で２４時間撹拌した後、溶液をＮａ_２Ｓ０_３溶液（１０％水溶液）に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。その抽出物をＭｇＳＯ_４で乾燥し、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液、塩水及び水で洗浄した。また、溶媒を蒸発させた。
収率：４５％。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）５．７２．（ｄ，６−Ｈ）
【００５４】
化合物５：３β，１７β−ジアセトキシ，７β−ヒドロキシ−アンドロステ−５−エン
ルシェ（Ｌｕｃｈｅ）の還元法（Ｌｕｃｈｅ，Ｊ．−Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７８、１００，２２２６）を行った。乾燥エタノール（１０ｍｌ）中の化合物４（３３０ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の溶液を、攪拌しながら−７８℃に冷却した。ＣｅＣｌ_３＊７Ｈ_２０（３３５ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、続いてＮａＢＨ_４（４８ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加した。
【００５５】
反応混合物を、０℃にゆっくり暖め、３０分間撹拌した。ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、６ｍｌ）を、注意深く添加し、混合物をジエチルエーテルで３回抽出した。合わせた抽出物を、ＭｇＳＯ_４で乾燥した。また、溶媒を蒸発させた。このようにして製造された化合物５（１５０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、メタノール中の５％の水酸化カルシウム中で１時間還流することにより鹸化した。混合物を処理した後、生成物をアセトン／水から再結晶した。収率：８０％。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ，４００ＭＨｚ）３．４０（ｍ，３α−Ｈ）、３．５７（ｔ，１７α−Ｈ）、３．８５（ｄ，７α−Ｈ）、５．２１（ｓ，６−Ｈ）
【００５６】
実施例２：３β，７β，１７α−トリヒドロキシアンドロステ−５−エンの合成
本実施例においては、スキーム２で示されるように、３β，７β，１７α−トリヒドロキシアンドロステ−５−エン（化合物１２）を製造した。ここで（ａ）はｔ−ブチルジメチルシリルクロライド、イミダゾール、ＤＭＦであり；（ｂ）はＮａＢＨ４、ＣｅＣ１３＊７Ｈ２Ｏ，ＥｔＯＨであり；（ｃ）はｐ−ニトロ安息香酸、ＰＰｈ_３、ＤＥＡＤ、トルエンであり；（ｄ）はｔＢｕＯＯＨ、Ｃｕ（Ｉ）Ｉ、アセトニトリルであり；そして、（ｆ）はｎ−ＢＵ_４ＮＦ、ＴＨＦ、ＫＯＨ、ＭｅＯＨである。
【００５７】
スキーム２

【００５８】
化合物７：３β−（ジメチルｔ−ブチルシロキシ）アンドロステ−５−エン−７−オンの合成（ミツノブ反応）
乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の、化合物１（２．８８ｇ、１０ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１．７ｇ、２５ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（１．８ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下で一晩維持し、その後水に注ぎ、クロロホルムで抽出し、溶媒を蒸発させた。収率：９８％
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）０．０６（ｓ，Ｍｅ_２Ｓｉ、０．８８（ｓ，１８−Ｈ）、０．８９（ｓ，ｔＢｕ）、１．０２（ｓ，１９Ｈ）、２．４１（ｄｄ，１６−Ｈ）、３．５０（ｍ，３α−Ｈ）、５．３７（ｄ、６−Ｈ）
【００５９】
化合物８：３β−（ジメチルｔ−ブチルシロキシ），１７β−ヒドロキシ−アンドロステ−５−エン
収率：９２％。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）３．６４（ｔ，１７α−Ｈ）
【００６０】
化合物９：３β（ジメチルｔ−ブチルシロキシ），１７α−ベンゾイルオキシ−アンドロステ−５−エン
化合物８（１．７ｇ，４．１９ｍｍｏｌ）、β−ニトロ安息香酸（１．８ｇ、１１ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（２．８ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でトルエン（２５ｍｌ）に溶解し、３０℃に加熱した。ＤＥＡＤ（１．５３ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。その混合物を２時間還流し、溶媒を蒸発させ、固体残渣をペンタン／ジエチルエーテル＝９５／５によりクロマトグラフィ分離した。
収率：６８％。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）５．２（ｄ，１７β−Ｈ），８．２−８．３５（Ａｒ）
【００６１】
化合物１０：３β−（ジメチルｔ−ブチルシロキシ），１７α−ベンゾイルオキシ−アンドロステ−５−エン−７−オン
収率：３６％
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）５．６８（ｄ，６Ｈ）
化合物１２：３β，７β，１７α−トリヒドロキシ−アンドロステ−５−エン
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）３．５７（ｍ，３α−Ｈ）、３．７５（１７α−Ｈ）、３．８０（ｄ，７α−Ｈ）：
【００６２】
実施例３：作用の評価
材料及び方法
【００６３】
動物１
予めコペンハーゲンフィッシャーラット（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ−Ｆｉｓｃｈｅｒ ｒａｔｓ）で成長させ下記のように治療したＤｕｎｎｉｎｇＲ３３２７，ＡＴ−１ラット前立腺癌の生存腫瘍片を試験のために採取した。
【００６４】
群１：Δ５−アンドロステン−３β，１７βジオール（シグマ ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））８０ｍｇの皮下一回投与。
【００６５】
群２及び３：Δ５−アンドロステン−３β，１７α−ジオール（ステロイド社（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄ Ｉｎｃ．））１０ｍｇの一回投与
【００６６】
群４：未治療の腫瘍のコントロールとして用いた。すべての治療において、等量のＰＥＧ４００（シグマケミカルズ）及びエタノール０．５ｍｌをビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）として使用し、腫瘍部位の近くに皮下注射した。
【００６７】
９６時間後、あらかじめ１０ｍｇのΔ５アンドロステン−３β，１７α−ジオールで治療した群３に、群１と同様に８０ｍｇのΔ５−アンドロステン−３β，１７β−ジオールの単回注射を受けさせた。
【００６８】
群２では、二酸化炭素でラットを窒息させることによって、９６時間の後に実験を終了し、残りの群については１９日後に終了した。地方の動物倫理学委員会はこの実験を許可した。この実験のその他の詳細は、Ａｔｉｔｕｍｏｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １７α−ＡＥＤ ａｎｄ １７−β ｅｐｉｍｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ， ｉｎ Ｄｕｎｎｉｎｇ ＡＴ−１ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｒａｔ： Ｈａｇｓｔｏｍ ｅｔ ａｌ． ｕｎｐｕｂｌ．に記載されている。
【００６９】
免疫染色
免疫染色は、ホルマリンに固定されたセクションについて、ＶＥＧＦ、クローンＣ−１、ＩｇＧ２ａ、ｓｃ７２６９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ．ワーキング（Ｗｏｒｋｉｎｇ）稀釈１：１００で行った。ネガティブコントロール抗体として、マウスＩｇＧ、ＤＡＫ−ＧＯ１，ｋａｐｐａ，ｘ９３１、Ｄａｋｏを１：５０のワーキング稀釈液と共に使用した。
【００７０】
腫瘍は、Ａｐｐｏ−Ｔａｇ ｉｎ ｓｉｔｕアポトーシス検知キット（オンコー（Ｏｎｃｏｒ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、増加したアポトーシスについて調べた。
【００７１】
動物２
上記の動物実験を繰り返した。
群１は、１０ｍｇの１７α−ＡＥＤを腫瘍の近くに単回皮下投与した。
群２は、同じ方法で８０ｍｇの１７β−ＡＥＤを単回投与した。
群３は、同じ方法で２５ｍｇの１７α−ＯＨプレグネノロンを単回投与した。
群４は、７，５ｍｇの５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールを単回投与した。
群５は、腫瘍のコントロールである。
【００７２】
細胞系
ヒト前立腺癌細胞系、ＰＣ−３及びＤＵ−１４５を使用した。凍結した細胞系を培地中で確立した。まず、腫瘍部分として見なされたＵ−１４５を、はさみを使用して無菌ペトリ皿中で崩し入れた。崩した腫瘍を、培地を含む７５ｃｍ^３の細胞培養フラスコに移した。培地は、ＰＣ−３についてはＨａｍ’ｓＦ１０を、ＤＵ−１４５についてはＲＰＭＩ １６４０を使用した。
【００７３】
ＦＢＳ１０％，０．２％ＮａＨＣＯ３（７．５％）、２ｍＭのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）及び０．００５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（５ｍｇ／ｍ）を両方の細胞系用の培養液に添加した。
【００７４】
細胞は７５ｃｍ^３細胞培養フラスコ中で殆どコンフルエントになるまで培養した。また、培地は週に二度交換した。培地で希釈された１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤ、並びにその混合物の等量のＤＭＳＯ及びエタノール中の溶液を、培養フラスコ中のＤＭＳＯの濃度が０．１５％を超えないように、それぞれ添加した。
【００７５】
各培養フラスコ中のＡＥＤの濃度は１００ｎＭであった。コントロールは、培地中、同じ濃度ＤＭＳＯ及びエタノールに曝した。
【００７６】
接触は９６時間維持し、その後、培養フラスコ中の細胞は、ＰＣ−３についてはトリプシン（０．２５％）５ｍｌ、ＤＵ−１４５についてはトリプシン及びヴァーシーン（０．２ｍＭ）３ｍｌで治療した。その後、細胞をガラススパーテルを用いて機械的にほぐした。１００μｌのアリコートをトリパンブルー排除試験のために取り出した。２００μｌのアリコートをサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）プレパレーションのために取り出した。その後、残る７００μｌのサンプルを、４℃、５１０ｘｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１ｍｌの昆虫溶菌バッファー（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ） ２１４２５Ａ）中の培地に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞溶解液を分析まで−７０℃で保存した。
【００７７】
アポトーシス分析
細胞溶解物の１００μｌのアリコートを、カスパーゼ分析のために取り出した。各部分を、１ｍｌのプロテアーゼ分析バッファー、及び２０μＭの最終濃度のＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質（ファーミンゲン＃６６０８１Ｕ）と混合した。溶液を３７℃で６０分間インキュベ−トした。
【００７８】
バックグラウンド蛍光を調べるために、細胞溶解物を含まず、同量のプロテアーゼアッセーバッファー、細胞溶解バッファー及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質を含むコントロールを調製した。
【００７９】
蛍光を、蛍光分光光度計（ＲＦ５４０、島津データ・レコーダーＤＲ３、インストルメンツＡＢ、ラムダ）を使用して、３８０ｎｍの励起波長で、４１５−４５０ｎｍで測定した。
【００８０】
トリパンブルー排除試験
ＰＢＳの中の初期細胞懸濁液のアリコート１００μｌを、トリパンブルー排除分析により集めた細胞の生存率を測定するために使用した。細胞懸濁液１０μｌを、１０μｌのトリパンブルー溶液（シグマ ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） ＃Ｔ８１５４）と混合し、３分間静置した。細胞の生存数及び死滅数を血球計数器で数えた。
【００８１】
フォトレジストレーション
生長抑制作用を見るために、１７α−ＡＥＤを含む培養物並びに同数の細胞を含むコントロールを、グリッドを備えたペトリ皿中で成長させ、特定領域の同定を可能にした。細胞を２４時間ごとにコンフルエントになるまで撮影した。
【００８２】
乳癌及び前立腺癌の細胞系におけるＨＥＲ−２及び１７α−ＡＥＤサルフェートの効果
前立腺癌細胞系ＰＣ−３及びＤＵ−１４５及び乳癌細胞系ＭＣＦ−７及びＳＫＢＲ−３の細胞培養物を、２００ｎＭの１７α−ＡＥＤの存在下または不存在下で、前記のようにフラスコ中で成長させた。１７α−ＡＥＤを含有する培養液をさらに細分し、それらの培養物をハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）(登録商標)，ｈｅｒ−２抗体の存在下または不存在下で、希釈して細胞懸濁液中の濃度を１：１５０とした１ｍｇ／ｍｌ幹溶液を用いて培養した。ｈｅｒ−２抗体には保存料は添加されないので、７２時間のインキュベーションの間２４時間あけて２回添加した（抗体の短い半減期を考慮して）。
【００８３】
ステロイドを含んでいない各細胞系の代表例も上記のようにハーセプチンで治療した。各細胞系及び異なる治療について、３個の異なる培養フラスコを使用した。
さらに、１００μｌのラット肝臓細胞質ゾルと約０．１６ｍｇのＰＡＰＳに対応する２０μｌの３’−ホスホアデノシン−５’ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）の混合物をシェアし、１７α−ＡＥＤを含有する培養液に添加した。
最後に、各細胞系について、３つのサンプルを未治療のコントロールとして保存した。生存細胞の数を評価するために、クロロフルオレセインジアセテートの溶液を培養の最後の日に培養液に添加した。この化学薬品は、細胞に自由に入り込むが、生細胞中で代謝され緑色の蛍光を有する型を形成し、細胞から出ることができない。死んでいる細胞を検知するために、赤い蛍光を与えるプロピジウムヨーダイドを、ファクスキャン（Ｆａｃｓｃａｎ）中でサンプルを分析する１５分前に添加した。ファクスキャンの中の検知器を１００００個の細胞が通過するための時間を、細胞死には至らない可能な成長抑制効果を検出するために評価した。
【００８４】
ＤＵ−１４５及びＰＣ−３細胞培養物におけるエストロゲン受容体遮断、１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェート及びＨＥＲ−２抗体の複合的な影響
前の実験に基づいて、細胞培養実験を、二つの前立腺癌細胞系で繰り返した。文献によれば、エストロゲン受容体βは両方の細胞系で発現し、エストロゲン受容体αはＰＣ−３細胞でのみ発現する。エストロゲン受容体を遮断するために、５０ｎｍの濃度でのＩＣＩ１７２，７８０を使用し、３６時間あけて２回添加した。その後、エストロゲン受容体を遮断した培養物を、＋／−ＨＥＲ２抗体及び＋／−１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートで、上記のようにエストロゲン受容体が遮断されていること以外は、ＰＣ−３及びＤＵ１４５の実験に記載された濃度及び方法で治療した。
【００８５】
３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の培養
ＡＴＣＣ（胚の筋細胞系）バッチＦ−１２７３２（バッチ日９３０３０１）からの３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞を、５００ｍｌのＤＭＥＭ、５０ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１１ｍｌのＰＥＳＴ中で生長させた。培地は一日おきに交換した。細胞は８０％コンフルエントになるまて経過させた。
【００８６】
識別するために、繊維芽細胞をの区別のために、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋５μｇ／ｍｌインシュリン中でインキュベ−トした。０．１ｍＭのＩＢＭＸの及び０．２５μＭのデキサメタゾンを添加した。２日後に、細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋５μｇ／ｍｌインシュリンに移した。その後、培地は一日おきに交換され、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳから成る。蒸留水中のエタノールを添加し、エタノール濃度を０．１％未満に維持した。これを識別用陽性コントロールとした。
【００８７】
培養中の１７α−ＡＥＤ濃度を１００あるいは２００ｎＭとして、ＩＢＭＸとデキサメタゾンを、エタノールと水中の１７α−ＡＥＤの溶液に換える以外は同じ溶液を用いて、繊維芽細胞をインキュベ−トした。コンフルエントになるまで、培養物をインキュベーター中で維持した。
【００８８】
タンパク質ブロッティング
両方の上記の実験からの溶かされたラット腫瘍を、氷冷細胞溶解バッファー中でホモジナイズした（１６０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、５％のＳＤＳ、０．５％のトリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び２μｇ／ｍｌのアプロチニン）。氷上に１５分間置き、続いて１３，０００ｇで１０分間遠心分離した。ホモジネートの蛋白含有量をラウリー（Ｌｏｗｒｙ）分析により決定した。
【００８９】
溶解物（９０μｇ）中の蛋白質を、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳働により分離し、分離された蛋白質をトランスブロット電気泳動転移細胞（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ）；バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でニトロセルロース膜（アメーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上に転写した。
【００９０】
トランスブロット（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ）及びＴＴＢＳ（ｌｘＴＴＢＳ：２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０））中の脱脂乳によるブロックの後、ブロットを３％（ｗ／ｖ）の脱脂乾燥乳を含むＴＴＢＳ中１：４００に希釈されたマウスモノクローナルＩｇＧ１ ＰＰＡＲγ抗体（抗ＰＰＡＲγ（Ｅ８）サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））でプローブした。
【００９１】
ＴＴＢＳ中で洗浄した後、ブロットをワサビペルオキシダーゼと共に１時間再インキュベートし、３％（ｗ／ｖ）脱脂乳を含むＴＴＢＳ中で１：４０００に希釈された第２抗体（抗ヤギ抗体２０２０（サンタクルーズ））に結合させた。ブロットを増強された化学発光システム（ＥＣＬ、アメーシャム）を使用して現像し、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ（アメーシャム）に接触させた。光電密度はデンシトメトリーにより測定した。
【００９２】
ブロットを取り、β−カテニン（Ｃ−１８，ｓｃ．１４９６））及びＣＯＸ−２（Ｃ−２０、ｓｃ １７４５）に対する抗体に再ハイブリダイズさせた。
【００９３】
実験はすべて、各分析で２度繰り返した。
【００９４】
第２の動物実験において、腫瘍をβ−カテニン、ＣＯＸ−２及びサイクリン Ｄ１（Ａ−１２、ｓｃ、８３９６）の発現について調べた。
蛋白質ブロッティングを、ＤＵ−１４５及びＰＣ−３細胞系について繰り返し、さらに、抗体（Ｈ−７４、ｓｃ７１９７）によりＰＰＡＲγの発現について調べた。
【００９５】
（^３５Ｓ）メチオニン標識ＳＲＣ−１の調製
ＡｐｃＤＮＡ３−ＳＲＣ−１構築物を鋳型として使用し、ＴＮＴ（登録商標）結合網状赤血球溶解液システム（Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用するインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写及び翻訳によって（３５Ｓ）メチオニン標識ＳＲＣ−１を調製した。
【００９６】
ＧＳＴ−ＰＰＡＲγとＳＲＣ−１の間のリガンド誘導相互作用：
ＧＳＴ−ＰＰＡＲγ融合蛋白質を生成させるために、マウスＰＰＡＲγｃＤＮＡをｐＧＥＸ−ＫＧのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、タンパク質をＥｃｏｌｉ Ｙ１０９０株で発現させた。該菌を、下記のプロテアーゼ阻害剤を含んでいるＴＥＤＧバッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ ７．４）、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセリン、０．４ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＤＴＴ）中の超音波治療によって溶解した：０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアンチパイン及び１０μｇ／ｍｌアプロチニン。溶菌液をＳＷ４１ローター中、１００，０００ｘｇで６０分間、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ８−７０Ｍ超遠心分離機をを用いて遠心分離した。融合蛋白質をＧＳＨセファロースビーズ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を固定し、その後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１２ＭのＫＣｌ、８％グリセリン、４ｍＭのＤＴＴ、及び０．５％ＣＨＡＰＳ（緩衝液ＡＡ）中、室温で３０分間インキュベートした（図５）。その後、（^３５Ｓメチオニン）ＳＲＣ−１（約０．１μＣｉ）を添加し、該ビーズをさらに１時間４℃でインキュベートし、緩衝液Ａで洗浄した。ＳＤＳサンプルバッファーを該ビーズに添加し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離する前にサンプルを煮沸した。放射活性をオートラジオグラフィーで検出した。
【００９７】
リガンド誘導コアクチベーター相互作用分析
α−ＡＥＤ及びβ−ＡＥＤを、上記のＰＰＡＲγリガンド活性についての分析で、エタノール１０％、蒸留水中、の１０及び１００μＭ溶液中で調べた。α−ＡＥＤ溶液またはβ−ＡＥＤ溶液の１０μｌのアリコートを、下記のように調製した雄ラットの肝臓の細胞質ゾル調製物に添加した。
【００９８】
ラット肝臓ホモジネートは、公知のステロイドスルホトランスフェラーゼ活性源であり、フードプロセッサーを使用して調製した。肝臓ホモジネートは、２ｍｍｏｌのＰＭＳＦ、１ｍｍｏｌのＥＤＴＡ及び１０ｍｍｏｌのトリスＨＣｌを添加してｐＨを７．４０とすることによってセリンプロテアーゼから保護した。このホモジネートは４℃で調製し、その後１５０００ｇで１０分間遠心分離し、その後４℃で１０００００ｇで１時間遠心分離を行った。上清を下記のステロイドの一つを含む試験管に分割した：肝臓細胞質ゾル１００μｌと共に５μＭ濃度の１７β−ＡＥＤあるいは１７α−ＡＥＤ。１つの試験管を陽性コントロールとし、ＳＲＣ−１を含有させた。
【００９９】
第二の実験において、下記のステロイドの活性を試験した：１７α−ＡＥＤ、１７ＯＨ−プレグネノロン及び５−アンドロステン−３β、７β、１７α−トリオール、１０μｌの５’−ホスホアデノシン−３’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ），シグマケミカルズ（０．１ｍｇのＰＡＰＳに相当）を伴うまたは伴わない。１つの試験管を、陽性コントロールとし、ステロイドの代わりにＳＲＣ−１を含有させた。ステロイドスルホトランスフェラーゼを３０分間４５℃に加熱することにより不活性化した場合、１つの試験管は肝臓細胞質ゾルを含有させた。該管を２０℃で１時間撹拌し、その内容物をリガンド活性に対する受容体コアクチベーターアッセーで調べた（図５）。
【０１００】
１７α−ＡＥＤの３βサルフェートの合成、分子構造の同定及びリガンド誘導コアクチベーター相互作用アッセー１における活性の確認
【０１０１】
１７α−ＡＥＤを、アーノストヴァ，リブース エム．（Ａｒｎｏｓｔｏｖａ，Ｌｉｂｕｓｅ Ｍ．）；Ｐｏｕｚａｒ，Ｖｌａｄｉｍｉｒ；Ｄｒａｓａｒ，Ｐａｖｅｌ，Ｉｎｓｔ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｃｚｅｃｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｐｒａｑｕｅ，Ｃｚｅｃｈ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９０），２０（１０），１５２１−９に記載の方法により処理した。アセテートを保護基として使用し、ピリジン−ＳＯ_３−複合体をサルフェート剤として使用した。メタノール−水中の０．８ＭＮａＯＨの過剰量で脱保護し、所望のヒドロキシサルフェートを得た。これを、上記のリガンド活性化コアクチベーター受容体活性におけるＰＰＡＲγ活性について調べた。これにより、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートのＰＰＡＲγ活性が示された。
【０１０２】
結果
形態学
ＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌における最初の１７α−ＡＥＤ及びこれに続く１７β−ＡＥＤによる連続治療により、ラット前立腺癌は、形成手術のパターンから腺の分化を示す腫瘍へ腫瘍外観が変化した。ヒト前立腺癌がＰＰＡＲγを発現し、この受容体の活性化はＰＰＡＲγを発現する他のタイプの組織における分化を導くことができるので、この核受容体の発現のアテニュエーションがこの分化を説明することができるか見るために、ＰＰＡＲγに対する抗体によるタンパク質ブロッティングを行った。
【０１０３】
３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞
アディポサイトの（ａｄｉｐｏｃｙｔｉｃ）発現型への分化が起こるかどうか確かめるために、３Ｔ３Ｌ１マウス繊維芽細胞のプレコンフルエント培養物を、１００及び２００ｎｍｏｌの１７α−またはβ−ＡＥＤに接触させた。ＩＢＭＸとデキサメタゾンを含む陽性コントロールは、コンフルエントに達した後に予想通りに分化した。
分化はアンドロステンジオールについては見られなかったが、２００ｎＭの１７α−ＡＥＤに接触させた繊維芽細胞培養物において細胞増殖の著しい抑制が見られた。、
【０１０４】
アポトーシス、細胞生存率及び成長抑制
１７α−ＡＥＤで治療されたラット前立腺癌の切片のアポトーシスの増加をＴＵＮＥＬ法により調べたところ、コントロールと比較してプログラムされた細胞死の増加は認められなかった（ハグストロム他（Ｈａｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）；Ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １７α−ＡＥＤ ａｎｄ １７−βｅｐｉｍｅｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ， ｉｎ Ｄｕｎｎｉｎｇ Ａｔ−１ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｒａｔ）。
【０１０５】
カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の変化の測定（ＤＵ−１４５はアポトーシス中カスパーゼ−３活性を欠く。代わりに、カスパーゼ３に比べてアポトーシスを媒介する効果は弱いカスパーゼ−７を有する。しかしながら、両カスパーゼとも同じアミノ酸モチーフを認識し、従って使用した基質はいずれの検出にも適する）は、ＤＵ−１４５が１７α−ＡＥＤの存在下で成長させた場合に、１７β−ＡＥＤあるいはコントロールの成長と比較して、著しい減少を示した。興味深いことに、ＤＵ−１４５細胞の１７α−ＡＥＤ治療後に、細胞総数の著しい減少が見られた。これは、ＤＵ−１４５細胞における両ステロイドの成長抑制効果を示す。蛍光強度の測定は、細胞数の差について補正されたが、１７α−ＡＥＤ治療されたサンプルのコントロール及び他のステロイドと比較した蛍光強度の減少は残った。このことは、ＤＵ−１４５並びにＰＣ−３における１７α−ＡＥＤからのアポトーシスの効果に対する保護効果を示唆する。
【０１０６】
１７α−ＡＥＤで治療されたＰＣ−３細胞におけるカスパーゼ３媒介蛍光は、未治療のコントロールと比較して本質的に変化しない強度を示す。しかしながら、細胞数について強度を補正すると、アポトーシスの減少に応じて、おそらく顕著になる。アポトーシスの増加に応じて１７β−ＡＥＤが約２倍の蛍光強度になるのが見られる。ＰＣ−３培養における細胞総数を見ると、コントロールと比べて、１７α−ＡＥＤで治療された培養物は細胞総数が５９％増加することがわかる。
【０１０７】
１７β−ＡＥＤで治療されたサンプルでは、細胞数の増加は、２９％とより小さかった。
【０１０８】
生存細胞の割合の減少は、１７α−ＡＥＤあるいは１７β−ＡＥＤで治療されたＰＣ−３培養での生存細胞割合の小さな減少を示す。しかしながら、これらの培養中の細胞総数の増加は、これより重要であり、これらの培養中で生存細胞の数が該培養中の細胞の総数と等しくなる。
【０１０９】
従って、この実験は、１７α−ＡＥＤがアンドロゲン不応性ヒト前立腺癌の２つの共通の例；細胞系ＰＣ−３またはＤＵ−１４５でのアポトーシスに対し重要な保護を与えることを実証する。さらに、１７β−ＡＥＤは、ＰＣ−３細胞におけるアポトーシスは増加するが、ＤＵ−１４５においてはしない。
【０１１０】
ロリア（Ｌｏｒｉａ）によるより早い日付の乳癌細胞系中の観察に反して、両ステロイドの組み合わせは、前立腺癌のアポトーシスに顕著な効果を与えることはなかった。１７α−ＡＥＤ及び１７β−ＡＥＤはＰＣ−３細胞の細胞死を増加させるが、生存細胞数も増加させる。
【０１１１】
以下、表Iは、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤあるいはその両方で治療されたＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞、及び致死及び生存細胞の数を、未治療のコントロールと比較して示す。各群の評価は、３つの異なる培養フラスコからの異なる測定値に基づく。
【表１】

【０１１２】
さらに、下記の表IIは、カスパーゼ−３、アポトーシス分析における分光蛍光学で評価されたＤＵ−１４５及びＰＣ−３サンプルの蛍光の平均値を示す。
【表２】

【０１１３】
表IIIは、ＤＵ−１４５及びＰＣ−３−アンドロゲン不応性 ヒト前立腺癌細胞系及びヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７（エストロゲン受容体陽性）及びＳＫＢＲ−３（エストロゲン受容体陰性）を発現しているＨＥＲ−２／ｎｅｕにおける生存率及びアポトーシスの評価、並びにＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体ヘルセプチン、１７α−ＡＥＤの３β−サルフェート及びそれらのの組み合わせの影響を示す。
【表３】

ファクスキャン中の蛍光細胞の測定は下記のように解釈される。
主な２つの細胞集団が見出された。一つはクロロフルオロセインジアセテート（ＣＦＡ）で強く着色し、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）で非常に弱く着色され、生存しているものと数えられ、もう一つはその逆のパターンで着色され、死んでいるものとして数えられた。
【０１１４】
小さな細胞集団は両方に強く着色され、初期のアポトーシスを含むと考えられる。
これらの結果は、すべての細胞系のコントロールにおいて生存しているか死んでいるものとして評価された細胞間の割合について同様の図を示した。
【０１１５】
１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートは、ＰＣ−３及びＳＫＢＲ−３において反対であるが、効果を示した。ＰＣ−３培養物において生存細胞のパーセンテージは増加し、死んでいる細胞は減少した。ＳＫＢＲ−３で、生存細胞の減少及び死んでいる細胞の増加が、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートは培養物で見られた。ＨＥＲ−２抗体による細胞培養物の治療は、生存細胞と死亡細胞の割合に対する著しい影響を示さなかった。ＨＥＲ−２抗体及び１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートの組み合わせは、細胞生存率を著しく増加し、ＳＫＢＲ−３細胞を保護すると考えられる。他の細胞についても、弱いが同様の傾向が見られるが、ＤＵ−１４５については、この組み合わせは生存細胞を減少させる。
【０１１６】
従って、この実験は、ＨＥＲ−２発現が、おそらくはＤＵ−１４５を除くこれらの細胞系中で１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートがアポトーシス効果を欠くことの理由であるという理論を支持しない。１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートで治療したＳＫＢＲ−３において見られる結果は、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートの効果を得るにはエストロゲンを遮断する必要があることを示す。
【０１１７】
ヒトアンドロゲン不応性癌細胞系ＰＣ−３及びＤＵ−１４５におけるエストロゲン受容体の遮断
【０１１８】
ＩＣＩ１７２，７８０のエストロゲン遮断の結果は、ＰＣ−３細胞における、生存細胞の著しい減少と、両方のマーカー、ＤＣＦＡ、及びＰＩ（後者はアポトーシス細胞を示唆する）に弱く染色される細胞の増加を示す。
【０１１９】
ＤＵ−１４５の結果において、死んでいる細胞の数の明白な増加がないことはあまり明らかにはならなかった。ＰＣ−３細胞における１７α−ＡＥＤ−３βサルフェート及びＩＣＩ１７２，４８０の併用治療は、およそ８０％の細胞死に帰着した。細胞死の増加はＤＵ−１４５細胞で見られなかった。ＰＩで強く染色される細胞の数は特に併用治療を施した細胞において減少した。
【０１２０】
従って、この実験は、ＰＣ−３培養物中のエストロゲン受容体の遮断の後に増加する細胞死がどのように観察されるかを説明する。１７α−ＡＥＤ３βサルフェートが添加される場合、相乗効果が観察される。ＤＵ−１４５細胞においては明白な効果は観察されなかった。
【０１２１】
細胞系のウェスタンブロッティング
ノーザンブロッティングと同様に、１７α−ＡＥＤで治療したＰＣ−３及びＤＵ−１４５細胞系及び未治療のコントロール（各々の３つのサンプル）のウェスタンブロッティング、ＰＣ−３中のＣＯＸ−２及びβ−カテニンの弱い発現及びＤＵ−１４５におけるはるかに強い発現を示した。
【０１２２】
ＰＰＡＲγの発現は、ＤＵ−１４５よりＰＣ−３においてはるかに強かった。ＰＰＡＲγは、ＤＵ−１４５で強く発現するが、ＰＣ−３においては弱くしか発現しない。アンドロステンジオールによる単独のまたは併用した治療は、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδ、ＣＯＸ−２またはβ−カテニンの発現に対して調節効果を示さなかった。これに対して、ＡＥＤＳは、両方の細胞系においてＰＰＡＲγの発現を著しく増加させたが、ＡＥＤＳはＰＰＡＲδの発現には効果がなかった。
【０１２３】
１７α−ＡＥＤＳで治療された細胞系のウェスタンブロッティング
上記と同じ細胞系で実験を繰り返した。１７α−ＡＥＤＳの１００ｎＭ溶液を１７α−ＡＥＤの代わりに使用した。ＰＣ−３細胞では、ＰＰＡＲγ発現が増加した。ＤＵ−１４５でＰＰＡＲγの発現の増加が見られた。
【０１２４】
動物Ｉのウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤ及び両者による連続的治療により治療された３つの異なる腫瘍からのサンプルを使用して実行した。ＰＰＡＲγ、ＣＯＸ−２及びβ−カテニンに対する抗体を使用した。この実験を異なるコントロール腫瘍を用いて繰り返し、同じ結果を得た。
コントロールの数の値は１００にセットした。平均値、範囲及びｐ値を下記の表IVに示す。
【表４】

【０１２５】
ＰＰＡＲγの発現が２倍になりβ−カテニンの発現が著しく減少し、同時に、α−ＡＥＤで治療された腫瘍中のＣＯＸ−２が２倍になるという予期しなかった発見は、ＰＰＡＲγリガンドから予測されるもの（α及びβ−ＡＥＤの組み合わせとは明らかに反対の効果）と矛盾する。
薬への接触の時間は治療アーム（ａｒｍ）間で非常に異なるので、異なる治療間ではデータの比較を非常に用心深く行わなければならない。
【０１２６】
動物ＩＩのウェスタンブロッティング
コントロールは、β−カテニン、サイクリンＤ１及びＣＯＸ−２の高い発現を示した。
α−ＡＥＤで治療したサンプルにおいて、β−カテニン及びサイクリン Ｄ１の発現の著しい減少が見られた。
【０１２７】
同じパターンであるが、さらに著しい結果が、１７ＯＨプレグネノロンで治療された腫瘍で見られた。
【０１２８】
β−ＡＥＤは、β−カテニンあるいはサイクリンＤ１の発現を減少しなかった。
ステロイドはすべて同様にＣＯＸ−２を増加させた。
【０１２９】
ステロイドへの接触は全てのアームで８０時間とした（腫瘍を９６時間（α−ＡＥＤ）あるいは４５６時間（β−ＡＥＤ及びα＋β−ＡＥＤ）接触させた前の実験に反して）。
【０１３０】
腫瘍成長に対するα−ＡＥＤ、β−ＡＥＤ及び１７α−ＯＨ−プレグネノロンの効果
上記セクション「材料及び方法」に記述した腫瘍の近傍への皮下注射の効果の評価は、β−ＡＥＤで治療したラットの腫瘍体積及び未治療のコントロール中の腫瘍体積が約２倍になったこと（２００％）及びα−ＡＥＤで治療したラットでは約５０％増加し（１５０％）、１７α−ＯＨ−プレグネノロンで治療した動物では約半分になったこと（−５０％）を示す。
【０１３１】
α−ＡＥＤ、β−ＡＥＤ、１７α−ＯＨ−プレグレノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールのＶＥＧＦに対する効果
【０１３２】
α−ＡＥＤで治療された腫瘍の形態学的調査は、顕微鏡により継ぎはぎの外観を呈し、限定されたエリアで活力を奪われた腫瘍組織を示した。抗腫瘍効果は即時に開始した。β−ＡＥＤで治療した腫瘍における作用の遅れた開始、及びヒト前立腺癌細胞系でインヴィトロでトログリタゾンを用いると作用の開始が非常に遅いと報告されていることを考慮すると、ＰＰＡＲγの活性化によるアポトーシスの増加とは異なるメカニズムが予測されるであろう。
【０１３３】
上記の「材料及び方法」のセクションに記述されるような免疫染色をコントロール腫瘍及び１７α−ＡＥＤで治療した腫瘍に行った。血管内皮生長因子（ＶＥＧＦ）の強い発現はコントロール（４／４）で示され、非常に弱い発現が１７α−ＡＥＤで治療したサンプル（３／４）で示された。
【０１３４】
免疫染色を「動物II」からの腫瘍に繰り返した。ＶＥＧＦのための強い着色がコントロール（４／４）及び１７β−ＡＥＤ（３／４）に示された。ＶＥＧＦについてのほとんど完全な消失が、（４／４）及び１７α−ＯＨ−プレグネノロン（３／３）で示された。５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール（ββα−トリオール）で治療された腫瘍において、２つのケースでの腫瘍の検知できるＶＥＧＦのほとんど完全な消失があり、一のケースでは中程度のダウンレギュレーション、一のケースでは不変の外観であった。
【０１３５】
結果を、図３に示す。全腫瘍の５μ切片である。Ａは未治療のコントロールからの腫瘍切片であり、各秒のサンプルはネガティブコントロールである。Ｂは１７α−ＡＥＤで治療した腫瘍であり、各秒のサンプルはネガティブコントロールである。Ｃは１７β−ＡＥＤで治療した腫瘍であり、各秒のサンプルはネガティブコントロールである。
【０１３６】
Ｄは５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールで治療された三つのサンプルであり、左側にネガティブコントロールが示されている。右側の三つのサンプルは１７ＯＨ−プレグネノロンで治療したものであり、これにネガティブコントロールが続く。
【０１３７】
１７ＯＨプレグネノロンで治療された腫瘍の優れた増殖抑制は注目すべきである。また、１７ＯＨ−プレグネノロンで治療された腫瘍中のアンジオスタチン性効果の欠如は注目すべきである。
【０１３８】
未治療のコントロールと１７α−ＡＥＤ−治療された後のサンプルにおける、Ｇ１、Ｓ期の中の細胞比率の比較
【０１３９】
未治療のＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１サンプルにおけるＳ期は、平均Ｓ期２５．５％（２４、２４、２４、３０）を示したのに対し、１７α−ＡＥＤ−で治療されたサンプルの平均Ｓ期は４５．３％であった（４５、３８、５３、）。
【０１４０】
Ｇ１の細胞の比率は治療されたコントロールの腫瘍において５９％（５５、５２、６５、６７）であり、治療したものでは３５％（３０、４１、４３）であった。Ｇ２期の細胞の比較は、値が広く分散しているため算定が困難であった。
【０１４１】
図４は、１７α−ＡＥＤで治療した四つの異なる腫瘍を未治療のコントロールの四つの異なる腫瘍と比較した細胞周期分析を示す。細胞周期分析は、Ｇ２期ではかなりの部分の細胞が壊死し、細胞の解釈に妨害をもたらすので、複雑になる。
【０１４２】
ＰＰＡＲγリガンド活性分析
α−及びβ−アンドロステンジオールを、リガンド誘導コアクチベーターアッセーにおけるＰＰＡＲγ−リガンド活性について調べた。調べられたアンドロステンジオールそれ自体におけるリガンド活性を示す転写の兆候は見られなかった。
【０１４３】
αまたはβ−ＡＥＤで２時間インキュベートされた肝臓細胞質ゾルを、リガンドに誘導されたコアクチベーターアッセーで調べた。陽性コントロールに対応する位置の弱いバンドが肝臓細胞質ゾルの中に存在した。同じ結果は、１７β−ＡＥＤを肝臓細胞質ゾルに添加した場合に見られた。
【０１４４】
１７α−ＡＥＤ及び肝臓細胞質ゾルを含んでいるサンプルでは、バンドが消えた。
【０１４５】
実験を、１７α−ＡＥＤ、３β，７β，１７α−アンドロステントリオール及び１７α−ＯＨプレグネノロンプラス／マイナスＰＡＰＳ及びプラス肝臓細胞質ゾルで繰り返した。これも、ＰＡＰＳ及び１７α−ＡＥＤと一緒に熱不活性化され試験された。結果は１７α−ＡＥＤ＋ＰＡＰＳ及び活発な肝臓細胞質ゾルを含んでいるサンプル中でのみリガンド活性が示された（図５）。
【０１４６】
実験を、ＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼを不活性化するために４５℃で１５分間肝臓細胞質ゾルを加熱することにより、α−ＡＥＤ及び１７β−ＡＥＤ＋／−ＰＡＰＳ及び肝臓細胞質ゾル＋／−について繰り返した。
【０１４７】
陽性コントロールとして、ＳＲＣを使用した。１７α−ＡＥＤ＋ＰＡＰＳ及び活性肝臓細胞質ゾルを含んでいるサンプル以外では活性は示されなかった。
【０１４８】
図５は、左に向かって、陽性コントロール（ＳＲＣ−１）、陰性コントロール及び従来のステロイド１７α−ＡＥＤ、１７ＯＨ−プレグネノロン及び３β，７β，１７α−アンドロステントリオール＋肝臓細胞質ゾル、これに続いてステロイド＋肝臓細胞質ゾル＋ＰＡＰＳを示す。シグナルの顕著な差が、１７α−ＡＥＤ＋肝臓細胞質ゾル＋ＰＡＰＳの組み合わせで見い出された。他のすべての組み合わせ、陽性コントロール以外は顕著な応答を示さなかった。
【０１４９】
α−ＡＥＤ及びβ−ＡＥＤのいずれも本来人体の中に存在する。ヒト成人で１：２、ヒト胎児で１０：１の割合である。ラットの実験では、１：８の比率を使用した。
【０１５０】
上記のように、米国特許第５，９１２２４０、ロリアには、「エストロゲンあるいはアンドロゲン受容体とは独立した」単球の腫瘍細胞系中のアポトーシス及び増殖阻害及び乳癌細胞系の増殖阻害について記載されている。しかしながら、メカニズムに関する示唆はなく、したがって、ロリアの前述の教示の実際的な適用可能性は制限されている。
【０１５１】
さらに、上記米国特許第５，９１２ ２４０号には、任意のタイプの悪性細胞において、抗腫瘍効果がプログラムされた細胞死（アポトーシス）の増加に依存することが示唆される。しかしながら、本発明の発明者は、ラット前立腺癌ＡＴ−１におけるα−ＡＥＤの効果がインヴィヴォでアポトーシスに依存することを確認することができない。同様に、本発明の発明者によって、５０−２００ｎＭの濃度の１７α−ＡＥＤの濃度に接触させた、ヒトアンドロゲン不応性前立腺癌細胞系ＤＵ−１４５あるいはＰＣ−３において、アポトーシスの増加を示すことができないことを示すことができた。まったく反対に、これらの細胞系中でアポトーシス抑制効果を実証することができた。ＰＰＡＲγ活性と純粋な１７α−ＡＥＤ間にはなんのつながりもないので、本発明の発明者は１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートに依存したＰＰＡＲγ活性を予測した。実験をこの化合物で繰り返したが、効果はなかった。
【０１５２】
本出願において、エストロゲンまたはアンドロゲン受容体の依存について議論する場合、ＰＣ−３及びＤＵ−１４５の両方で機能しない腫瘍細胞が議論される。一方では、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）は、両方の細胞系で発現する。エストロゲン受容体α（ＥＲα）はＰＣ−３でのみ発現する。両方の細胞系を、両方の受容体を遮断するＩＣＩ１７２，７８０で治療すると、ＰＣ−３細胞においてかなりの増殖抑制と細胞死自体が得られる。
【０１５３】
この効果は、１７α−ＡＥＤ−３０サルフェートの添加により、かなり増強される。
【０１５４】
ＤＵ−１４５では、明白な効果は認められなかった。この理由は、この細胞系に存在するＰ５３変異による機能しないＥＲβシグナル経路、遅れたまたは抑制された腫瘍細胞死、またはＤＵ−１４５がＰＰＡＲγの非常に弱い発現を有するという事実であり得る。その代わりに、それはＰＰＡＲδを発現し、これはＰＰＡＲγリガンド１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートによって調節されない。
【０１５５】
他のものが、チアゾリジンジオンで治療された同じ細胞系の増殖阻害に関する同様の結果をもたらし、本発明の発明者が完全なＥＲ遮断にもかかわらず、エストロゲン受容体を遮断する治療に感受性のＰＣ−３中のＰＰＡＲγ発現に対する本発明のリガンドの調整効果を実証することができず、ＤＵ−１４５中のＰＰＡＲγとδの発現に対する我々のリガンドの調整効果を完全に欠くという事実は、以下の議論を支持する。
【０１５６】
２つの乳癌細胞系、ＥＲ陽性ＭＣＦ−７、ｐ５３野生型と、ＡＲ陽性且つＥＲ陰性、ｐ５３変異ＳＫＢＲ−３（後者はｃ−ｅｒｂＢ２を強く発現する）を、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェート＋／−ＨＥＲ２抗体で治療した。
【０１５７】
前立腺癌細胞系の中で使用したのと同じ濃度でＳＫＢＲ−３を治療すると、細胞死の中程度の増加に帰着した。しかしながら、米国特許５，９１２，２４０号に行われた濃度の４倍の濃度を用いたにもかかわらずＥＲ＋ＭＣＦでは効果が見られなかった。いずれの、乳癌においても、抗体によるｃ−ｅｒｂＢ２−受容体の遮断からの相加効果は見られなかった。ＳＫＢＲ−３にあるＰ５３変異は１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートの増殖抑制作用を妨げなかった。ＥＲ陽性であるが、野生型のＰ５３を含んでいるＭＣＦ−７は、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートによる治療にもかかわらず増殖し続けた。ＰＣ−３及びＤＵ−１４５の実験の結果と共に、これは、１７α−ＡＥＤ−３βサルフェートがエストロゲン受容体と相互作用すること、そしてエストロゲン受容体を発現する組織での使用を考慮する場合エストロゲン受容体とのこの相互作用をブロックすることが必要であることを強く示唆する。
【０１５８】
抗腫瘍効果は、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺腫瘍において生体内で実証された。この効果は、Ｔ細胞またはマクロファージのような免疫系のエフェクター細胞とは無関係に、またアポトーシスと無関係に、開始が早い。抗腫瘍効果には、継ぎはぎパターンでの失活及び腫瘍組織中のＶＥＧＦ発現の著しい変化が伴う。これはアンジオスタチン性なメカニズムを強く示唆する。このことは腫瘍の微視的なセクションでも実証された。より進んだ調査により、さらにサイクリン Ｄ１及びβ−カテニンのダウンレギュレーションが示された。この効果は１７α−ＡＥＤに排他的でなく、また代謝物質（１７α−アンドロステンジオール−３β−サルフェート）に結び付けられるＰＰＡＲγ活性に依存もしないことは、同じラット腫瘍が１７α−ＯＨ−プレグネノロンで治療された場合、さらに強い抗腫瘍効果が見られたという発見に支持される。この物質はＰＰＡＲγ活性を有さず、また、その３β−サルフェートもそうである。この調査を拡張するために、新しいステロイドを促進する、５−アンドロステン３β，７β，１７α−トリオールが構築された。このステロイドには例証可能なＰＰＡＲγ活性はなく、その３β−サルフェートにもなかった。しかしながら、ＶＥＧＦ、β−カテニン及びサイクリンＤ１に対するダウンレギュレーション効果は実証された。プラスミノーゲン活性化因子を阻害するプラスミノーゲンアクチベーター因子抑制剤に対するアップレギュレーション効果（ＰＡＩ−１）が、アンジオスタチン性ステロイド（アンジオスタチン性ステロイドの効果のメカニズムとして提案されている（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄｓ：ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｂｌｅｉ Ｆ ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌ １９９３ Ｊｕｎ；１５５（３）：５６８−７８）。
【０１５９】
血管形成に対するＰＰＡＲγ活性の見解は異なる。ある証拠によれば、アンジオスタチン性よりもむしろ血管形成について言えば、ＰＡＩ−１はダウンレギュレーションされ、従ってＰＡはアップレギュレーションされる。（Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｒａｔｅ ＰＡＩ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＨＵＶＥＣ： Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＰＰＡＲγ ｉｎ ｅｎｄｔｈｅｌｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｋａｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，Ｍａｙ １０； ２５８（２）：４３１−５）。
【０１６０】
β−カテニンはＷｎｔシグナル経路の一部であり、細胞周期レギュレーション及びエントリーに影響を及ぼすことが示されている。（Ｗｎｔ−５ａ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍａｒｚｉｅｈ Ｊｏｎｓｓｏｎ． Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｄｉｓｓｅｒｔａｉｏｎ， Ｌｕｎｄ， Ｓｅｐｔ． ２０００）
【０１６１】
抗腫瘍効果とβ−カテニンの低下との間の一致は、サイクリンＤ１，ｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｍｅｔのようなこの経路に沿った成長調節遺伝子に対する影響を暗示する。
【０１６２】
ＣＯＸ−２の重要性は、例えば結腸癌だけでなく、前立腺癌においても指摘された。本発明の結果は、一方ではＣＯＸ−２、他方ではサイクリンＤ１、β−カテニン及びＶＥＧＦの可能なコレギュレーションに関する矛盾がある。言及されたステロイドで治療された腫瘍においては、サイクリンＤ１、β−カテニン及びＶＥＧＦに対する同時のダウンレギュレーションの影響で、ＣＯＸ−２は同時にアップレギュレーションされ、腫瘍の明らかな増殖阻害が観察される。ＰＧＥＪとＰＧＥ２の綿密な関係及び増加した血管形成が存在する。
（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ ＶＥＧＦ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｕ９３７ ｃｅｌｌｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０００ Ｊｕｌ５， ２７３（２）； ４８５−９１）
【０１６３】
したがって、本発明によって実証されたＶＥＧＦ及びＣＯＸ−２の分岐する調節は、非常に驚くべきことであり、予測できないものである。
【０１６４】
１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍において、腫瘍中のこの化合物の増殖刺激的な効果を、これが免疫学的抗腫瘍反応によって中断される前に１週間以上観察した。この効果はエストロゲン受容体及びアンドロゲン受容体の活性化には依存しない。使用されたＡＴ−１腫瘍は完全にそのような受容体を欠くからである。１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍中のβ−カテニン及びＣＯＸ−２発現の最初の調査は、それらが１９日間の治療の後の腫瘍調査に基づくものであり、１７α−ＡＥＤで治療した腫瘍は９６時間だけ治療されたものであるため、完全に信頼できるものではなかったので、この実験を、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤについて繰り返した。
【０１６５】
１７ＯＨプレグネノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオール。この実験では、ラットが犠牲にされる前に、腫瘍はすべて８０時間ステロイドに接触させた。ウェスタンブロッティングは、１７β−ＡＥＤで治療されたβ−カテニン、ＶＥＧＦ及びサイクリンD１の腫瘍中の高い発現にもかかわらずＣＯＸ−２のダウンレギュレーションを示さなかった。
【０１６６】
したがって、これらの三つのアンジオスタチン性ステロイドによる一方では、β−カテニン、ＶＥＧＦ及びサイクリンＤ１、他方ではＣＯＸ−２の逆の調節にもかかわらず、１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍におけるＣＯＸ−２の反対の調節は見出されなかった。四つのステロイドのアップレギュレーションは全て、未治療のコントロール腫瘍と比較して、ＣＯＸ２の発現をアップレギュレーションする。
【０１６７】
通常はアンドロゲン非依存性の進行を示す癌の場合である機能性ＡＲシグナルを伴うヒトあるいは他の起源の前立腺癌におけるステロイドＳ４及びＳ８の有用性は、１７α−ＡＥＤあるいは１７α−ＡＡＤ自体の使用を考慮する場合にはおそらく非常に限定される。それらは潜在的なＡＲリガンドであり、容易に他の有力なＡＲリガンドへ変換するからである。
【０１６８】
例えば１７α−ＡＥＤは、エピテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオンあるいはエストラジオールに変換される。
Ａ） エピテストステロンは疾病進行に伴い、ＡＲ内の転写活性を刺激するであろう。
Ｂ） アップレギュレーションされた場合、β−カテニンは、ＡＲに対する潜在的なリガンドの効果を増強するであろう。アンドロステンジオン、アンドロステンジオール、デヒドロ−エピアンドロステロン、また、エストラジオール（全て１７α−ＡＥＤの可能な代謝物質）、及び一般的なアンドロゲン受容体ブロッカー、例えばビカルタミドは、ＡＲにおける転写活性を増加することが示され、これにより病態は進行する（β−カテニンはアンドロゲン受容体活性及びリガンド特異性に影響する：トルシア シイアイ他（Ｔｒｕｉｃａ ＣＩ ｅｔ ａｌ）;Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０（１７）： ４７０９−１３，２０００ Ｓｅｐ１．）。
Ｃ）有機体が、アンドロゲン受容体転写の他の潜在的な刺激因子を奪われた場合、１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートの効率が増加するであろう。言及されたＡＲリガンドは、受容体活性化に必要なコファクター用のＰＰＡＲγリガンドであるサルフェート、特にＳＲＣ−１及びＡＲＡ−７０と競合するであろう。サイクリンＤ１の過剰発現は１つの出所による前立腺癌の４．２％と算定されるが、おそらくはそれ以上に一般的であり、疾病進行に一般的なメカニズムであるＥＧＦ受容体刺激によるアンドロゲン非依存性の進行として、サイクリンＤ１のアップレギュレーションを引き起こす。（サイクリンＤ１の過剰発現はヒト前立腺の癌においてまれである：ガンビナー他（Gｕｍｂｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ）；Ｐｒｏｓｔａｔｅ．３８（１）：４０−５，Ｊａｎ１．）（表皮増殖因子はヒト前立腺癌細胞系でサイクリンＤ１を誘導する：ペリー他（Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ）；Ｐｒｏｓｔａｔｅ．３５（２）：１１７−２４，１９９８ Ｍａｙ）。
【０１６９】
ワックスマン他による上記の実験（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏ−ｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｓ ａ ｐｅｒｏｘｉｓｏｒｎｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ．Ｊ． ｏｆ Ｅｍｄｐｃｒｏｍｐ；ｐｇｕ ｖｏｌ１５０， ｓｕｐｐｌ， Ｓｅｐｔ １９９６）内分泌学ｖｏＩ１５０の、ｓｕｐｐｌ、１９９６年９月、）において、ＰＰＡＲα活性の間接的な証拠は、１７β−ＡＥＤについて生体内で実証されたが生体外ではされていない。また、１７β−ＡＥＤあるいはＤＨＥＡの３β−サルフェートがＰＰＡＲαに連結された遺伝子の活性化において対応する在来のステロイドより効率的だったことがさらに実証された。アンドロステンジオールが密接に化学的に関連づけられるとともに、それらが代謝経路に対応しているようである。また、ＰＰＡＲγリガンド活性が１７α−ＡＥＤの３βサルフェートに依存するという仮説は、本発明の発明者によって示唆された。この仮説はリガンド活性がサルフェートドナー、ＰＡＰＳに依存し、ステロイドスルホトランスフェラーゼの主要な源である肝臓細胞質ゾルが存在する必要があるという発見により支持される。ＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼは、特に３β−ＯＨステロイド中の３β−位置へのサルフェートのトランスファーに触媒作用を及ぼす。
【０１７０】
カスパーゼ３または７の発現により細胞を調べたにもかかわらず、細胞系ＤＵ−１４５あるいはＰＣ３をインヴィトロで１００あるいは２００のｎＭ濃度１７α−アンドロステンジオールに接触した場合に、アポトーシスか壊死である細胞死の増加は見られなかった。生存細胞及び死んでいる細胞を区別するためのエバンスブルーによる染色も、治療したサンプルにおける細胞死亡率の増加を示さなかった。規則的な時間間隔で未治療のコントロールと１７α−ＡＥＤで治療された培養フラスコ中の菌体数を比較したが、１７α−ＡＥＤで治療された培養中で菌体数の減少は見られず、これらの細胞系においては１７α−ＡＥＤの増殖抑制効果に反すると言える。
【０１７１】
トリパンブルー排除試験における活力を奪われた細胞の数の増加を示さなかったことも、これらの発見を支持する。
【０１７２】
ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ及びＤＵ−１４５におけるＴＺＤによるインヴィトロでの実験は、ＰＣ−３中で明白な抗腫瘍効果を示し、ＬＮＣａＰ中で中間の効果を示し、及びＤＵ−１４５（ＰＰＡＲγのリガンド（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））中で効果を示さず、生体外と生体内とでヒト前立腺癌に有力な抗腫瘍作用を有する：（クボタ他（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ）： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８， ３３４４−３３５２， Ａｙｇ １， １９９８）。しかしながら、この結果はかなりの時間を要した。本実験において、ＤＵ−１４５中で抗腫瘍効果が見られなかったことは、上記で引用したＴＺＤの実験に従うものである。この効果の欠如はＤＵ−１４５細胞のＰＰＡＲγの非常に弱い発現についての本発明の発見により説明される。しかし、ＰＰＡＲδは強く発現する。１７α−ＡＥＤで治療された培養物中ではＰＰＡＲγまたはＰＰＡＲδの発現の変化は観察されなかった。
【０１７３】
ＰＰＡＲγリガンド及び同じヒト前立腺癌細胞系を用いる他の実験においては、増加した細胞死が電子顕微鏡検査法を用いることにより実証された。この細胞死は、非アポトーシス現象であった（ＰＰＡＲγリガンド１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンJ２による前立腺癌細胞のＳ期の停止に関連したアポトーシスでない細胞死：場とラー他（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ）： Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ．１１， ４９−６１， Ｊａｎ ２０００）。受容体アッセイにおいて、単一の物質として１７α−あるいは１７β−ＡＥＤを使用すると、リガンド活性化は見られなかった。予測できないことではないが、弱いＰＰＡＲγリガンド活性は肝臓細胞質ゾルに存在し、この活性は１７β−ＡＥＤを添加しても変化しなかったが１７α−ＡＥＤを１７β−エピマーと交換すると顕著になった。それと共に、このことは、両エピマーがＰＰＡＲγアゴニスト性を欠き、１７α−ＡＥＤがＰＰＡＲγアンタゴニスト機能を有する可能性を示唆する。
【０１７４】
１７α−ＡＥＤで治療されたＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌におけるインヴィヴォでのＰＰＡＲγのアップレギュレーション、接触を延長した場合に見られる分化並びにＣＯＸ−２のダウンレギュレーション、ＰＰＡＲγリガンドから期待される効果は、ＰＰＡＲγ活性化能力が、１７α−ＡＥＤ自体に依存するよりは、むしろ代謝物質、サルフェート型に結び付けられることを示唆する。
【０１７５】
ウェスタンブロッティングで見られた予期しない結果、すなわち１７α−ＡＥＤがＰＰＡＲγ活性のアップレギュレーションに帰し、同時にＣＯＸ−２がアップレギュレーションされ、同時にβカテニンが１７α−ＡＥＤ及び１７β−ＡＥＤによりダウンレギュレーションされることは、次の方法で説明されるかもしれない：インヴィヴォでのスルホトランスフェラーゼ活性の結果、生体内で、１７α−ＡＥＤは硫酸塩となり、これによりＰＰＡＲのアップレギュレーションが説明される。１７β−ＡＥＤは同じ方法で硫酸塩となる。１７β−ＡＥＤのサルフェート型はＰＰＡＲα活性化化合物であり、βカテニン並びに、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｅｔ、また、サイクリンＤ１の増加が期待される。（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃ−ｍｅｔ， ｃ−ｍｉｃ ａｎｄ ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ ＷＹ−１４， ６４３（ミラー アールティー他（Ｍｉｌｌｅｒ ＲＴ ｅｔ ａｌ．）， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １９９６ Ｊｕｎ； １７（６）：１３３７−４１）。この期待に従って、９６時間１７β−ＡＥＤに接触させたＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１腫瘍に実際に見られる増殖速度の増加が予期される。これが動物実験を繰り返し、８０時間のステロイドへの一定の接触時間がすべての腫瘍について選ばれた理由の１つである。
【０１７６】
本発明の理論に従い、これらの腫瘍のウェスタンブロッティングが、１７β−ＡＥＤへの接触がβ−カテニン及びサイクリンＤ１のダウンレギュレーションに帰着しないことが示された。１７α−ＡＥＤ、１７ヒドロキシ−プレグネノロン、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールへの接触で見られたダウンレギュレーション（後者は７位の置換基のため、容易に１７α−ＡＥＤに転化せず、従ってその３β−サルフェートへも転化しない）は、後者の二つの物質は硫酸化したときに、ＰＰＡＲγ−リガンドに転化しないので、ＰＰＡＲγ非依存性であることを示す。１７β−ＡＥＤへの延長された接触を行った後に見られる腫瘍の減少は、主としてストロマ細胞（それらは微視的に見ることでそうであるように見えた）を含む失活した腫瘍、従ってより少ないβ−カテニンを反映する。
【０１７７】
１７β−ＡＥＤ及び１７α−ＡＥＤが組み合わせられた場合に見られるＣＯＸ−２のダウンレギュレーションは、結合したＰＰＡＲα及びγ活性化の組み合わせの結果またはＰＰＡＲγ活性化の結果であり得る。
【０１７８】
既知の血管形成特性を有するＣＯＸ−２が２倍になったにもかかわらず、ＶＥＧＦのダウンレギュレーション及び抗腫瘍効果が１７α−ＡＥＤに接触された腫瘍中で観察された。ＰＰＡＲγの発現が抗腫瘍効果に本質的に結びつかないことが、３β−サルフェートのＰＣ−３細胞系における抗腫瘍効果の不足によって実証された。エストロゲン受容体が遮断される場合に限り、増殖阻害及び細胞死が生じるので、効力の不足はエストロゲン受容体への１７α−ＡＥＤの結合を示唆する。
【０１７９】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）でトランスフェクトしたサッカロミケス種の実験では、１７β−ＡＥＤがこの受容体に結合して、それを活性化した場合に、コファクターＡＲＡ−７０が本質的な役割を果たすことが示された。ＡＲＡ−７０は、さらにＰＰＡＲγにおいてもコファクターの役割を果たし、受容体リガンド反応を増幅した。また、それ自体も受容体を活性化することができた。ＡＲの同時の存在は、活性化されたＰＰＡＲγ―リガンド複合体を消し、コファクターへの競合を示唆する。
【０１８０】
ＥＲ中のＡＲＡ−７０の影響は無視できる程度である。（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＲＡ７０ ａｓ ａ ｌｉｇａｎｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＰＡＲγ： ヘインレイン シンシア他（Ｈｅｉｎｌｅｉｎ Ｃｙｎｔｈｉａ ｅｔ ａｌ）：Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏl. Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２７４，Ｎｏ．２３，Ｊｕｌ４，１６１４７−１６１５２，１９９９）。これは、摂護腺のようなアンドロゲンに支配されたシステムでのいくつかの予測可能な結果を指摘する。
【０１８１】
１．テストステロン、ジヒドロテストステロン及び１７β−ＡＥＤ及び恐らく１７α−ＡＥＤに対する他のリガンド、または少なくともその代謝物質、エピテストステロンは、ＰＰＡＲγ―リガンドの効果を打ち消すであろう。アンドロゲンの特性が、アップレギュレーションされたβ−カテニンの場合と同様にＡＲＡ−７０がある状態でこれらの物質中で活性化されるので、ＡＲ活性化を阻む手段としてのフルタミド及びビカルタミドは疑わしいか、あるいは少なくとも不完全である。
【０１８２】
アンドロゲン受容体は多くの器官で発現している。この受容体のダウンレギュレーションについて知られていることは、ダウンレギュレーション効果を有するＥＲαにより部分的に影響を受けるということである。それは、もちろん、テストステロンまたはジヒドロテストステロンのようなリガンドへのアクセスの減少により影響を受ける。さらに、それは、レスヴェラトロールによって、及び芳香族炭化水素の受容体の活性化によってダウンレギュレーションを受ける。
【０１８３】
アンドロゲン受容体を活性化する他の影響は、ＥＧＦまたはＨＥＲ−２の受容体並びにインターロイキン−６（ＩＬ−６）によるシグナリングである。しかしながら、ＩＬ−６によるシグナリングはＰＰＡＲγによって阻害される。
他の因子は、抗体によって、あるいはヒドロキシリノレン酸のようなＥＧＦ−Ｒリガンドの生産を止めるメラトニンの使用によって阻害することができた。
【０１８４】
２．この受容体の活性化がＴ−ヘルパー２タイプの応答に帰着するサイトカイン、ＩＬ−４を特徴づける多くの効果を与えるので、１７β−ＡＥＤの抗腫瘍効果をもたらす免疫強調作用は、ＰＰＡＲγ―リガンドによって打ち消される。このことは、腫瘍免疫療法に有用であることとまさに反対である。まず１７α−ＡＥＤ、続いて１７β−ＡＥＤによる連続的治療を使用する概念は、抗腫瘍効果を達成するにはまったく有用でない。オリジナルの実験で実証されたように、この組み合わせには抗腫瘍効果がなく、逆に腫瘍の増殖を刺激さえした。
【０１８５】
３．ＥＲαとＥＲβの存在は有効な受容体遮断を要する。タモキシフェンまたはラロキシフェンをこの目的のために使用することができる。今日、ＥＲβの機能の制御に関して知られていることから、これはそのリガンド３β，１７β−アンドロスタンジオールによってＥＲα活性を抑える受容体であるので、この受容体の活性を制御する必要はない。腫瘍系では、細胞シグナリングが欠陥かもしれないので、これは必ずしも該当しない。
【０１８６】
ＰＰＡＲγを発現すると知られている内皮細胞からのｃ−ｆｏｓに対する効果により付与されたＰＤＧＦ−ＢＢによるＶＥＧＦのアップレギュレーションが記載されている（ＰＰＡＲγ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ＶＥＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ：ヤマカワ ケイ 他（Ｙａｍａｋａｗａ Ｋ ｅｔ ａｌ）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０００ Ｍａｙ １９， ２７１（３）：５７１−４)。ＭＭＰ−９の減少も、ＰＰＡＲγリガンドによる治療の後に観察した。出版物は、主としてＰＰＡＲγによるＶＥＧＦのアップレギュレーションを報告している。ｐ５３変異腫瘍中のＶＥＧＦの強いアップレギュレーションも報告されている。
【０１８７】
要約すると、本発明は、いくつかの新生細胞系で観察された増殖阻害、及びＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌に生体内で見られた抗腫瘍効果を裏付ける異なるメカニズムの証拠を提供する。
【０１８８】
まず第１にスルホトランスフェラーゼの作用による１７α−ＡＥＤのサルフェート型への転化は、細胞成長の抑制、アポトーシスあるいは細胞周期阻止の原因である。これはＰＰＡＲγの作用により提供される。
【０１８９】
この型の効果は、主にスルホトランスフェラーゼ活性に、好ましくは肝臓、副腎、睾丸及び小腸に存在するＤＨＥＡスルホトランスフェラーゼに依存する。胎盤中の存在はまだ証明されていないが、関連するプレグネノロンスルホトランスフェラーゼは存在する。はるかに低い基質特異性を備えたスルホトラスファーがさらに、特にプレグネノロンスルホトランスフェラーゼ及びエストロゲンスルホトランスフェラーゼ（後者は多くの組織の中にある）により、どこか他のところで起きている可能性が高い。１７α−ＡＥＤＳのＰＰＡＲγの活性化効果を維持するために、治療すべき器官のスルファターゼ活性を縮小することは重要である。そうでなければこのプロセスは１７α−ＡＥＤＳを非活性化する。これは、スルファターゼの非エストロゲン抑制剤である適量のクーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）の投与により回避することができる。
【０１９０】
本発明の発明者は、１７α−ＡＥＤ−３β−サルフェートで治療された３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞中の、及びＥＲ陰性乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３中の増殖阻害を実証した。
【０１９１】
ヒトアンドロゲン不応性前立腺癌細胞系ＰＣ−３及びＤＵ−１４５で、エストロゲン受容体が遮断された時、ＰＣ−３細胞でかなりの細胞死が見られた。しかしながら、そのような効果はＤＵ−１４５では見られなかった。後者は恐らくこの細胞系でＰＰＡＲγの非常に低い発現に依存しており、代わりにＰＰＡＲδの強い発現によって支配されている。
【０１９２】
ＰＰＡＲγを発現すると知られている、従って１７αＡＥＤの３β−サルフェートに反応すると予想されている他の腫瘍は、尿道癌である、胃癌、内皮細胞、平滑筋細胞に由来する悪性腫瘍、結腸癌、コリンカルシノーマ、肺の腺癌、胃癌及び脂肪肉腫、並びに黒点及び緑内障の細胞のようなＰＰＡＲγリガンドによる治療によって影響を受ける眼組織の病理のいくつかの様相である。
【０１９３】
単球とリンパ細胞はプロ炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦａ、またＩＬ−６）並びにＴ細胞の中のＴ−ヘルパー １(Ｔ-ｈｅｌｐｅｒ１)プロフィールのサイトカイン（ＩＦＮ−ｙ、ＴＮＦＰ及びＩＬ−２）の生産でダウンレギュレーションを受ける。代わりに、ＩＬ−４効果はＴ−ヘルパー ２（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ２）−プロフィールの刺激と一致して促進される。これは、さらにクローン病のような炎症性腸疾病、胎盤の組織の疾病、慢性関節リウマチのような自己免疫性の炎症性疾病、多発性硬化症のような神経組織変成の疾病及びギランバレー症候群の疾病及びその他多くのものを含む。
【０１９４】
第２の作用機構は、１７α−ＡＥＤよりも強い１７ＯＨプレグネノロンの抗腫瘍効果によって実証されるように、細胞周期調節および血管形成阻害であり、ＰＰＡＲγによって媒介されない。
【０１９５】
ラット前立腺癌の中のにおいて１７β−ＡＥＤなしに１７α−ＡＥＤで治療した後のβ−カテニンのダウンレギュレーションについての本発明の観察は、２つのアンドロステンジオールエピマーがこの点における調節対かもしれないことを示唆する。
【０１９６】
１７α−ＡＥＤにおけるこの効果が、さらに１７αＯＨ−プレグネノロン、５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールにも存在することは、後者の物質のサルフェートはＰＰＡＲγリガンド活性を欠くので、これらの物質の抗腫瘍効果がＰＰＡＲγに依存しないことを示唆する。３つの物質すべては、腫瘍増殖に重要な要因であるβ−カテニンを著しくダウンレギュレーションする。β−カテニンの増加した発現は、１７β−ＡＥＤにインヴィヴォで接触させたラット前立腺癌で最初に見られる増殖刺激について説明するかもしれない。エストロゲンまたはアンドロゲン受容体による効果は、ＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１ラット前立腺癌はこれらの三つの受容体を測定可能な量で有しないので、説明として不十分である。
【０１９７】
細胞周期エントリー及び血管形成に対する影響による他の腫瘍中の効果も、本発明に含まれる。
【０１９８】
従って、増殖の抑制及びアンジオスタチン効果が望ましい場合は、１７ＯＨプレグネノロンあるいはサルフェートへの転化により直接ＰＰＡＲγを刺激しない他のステロイドが選択される。アンドロゲン環境の完全な動物の使用により、ＰＰＡＲγ活性の危険は共同因子の競合（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）によりさらに縮小される。アンドロゲンはさらにスルホトランスフェラーゼ活性を遮断する。
【０１９９】
他方では、ＰＰＡＲγ活性化が望まれる場合、アンドロゲンは最小限にし、クーメイト（Ｃｏｕｍａｔｅ）（登録商標）のような抑制剤によってスルファターゼ活性を低くしておき、β−カテニンまたはサイクリンの増加した発現による腫瘍を回避すべきである。後者の可能なサインは、ＥＧＦ−Ｒシグナリングを増加させる。
【０２００】
本発明のデータは、良性および悪性の腫瘍の治療に用いた場合、本発明の化合物が治療上有効であることを示す。
【０２０１】
本発明は、さらに本発明の化合物のプロドラッグも含む。そのようなプロドラッグは、エステルその他、水酸基が保護されたプロドラッグである。それらの保護基は新陳代謝中にはずされる。
【０２０２】
本発明の化合物は、治療上有効な量で、好ましくは血清濃度が５０〜５００ｎＭに達するような量の中で投与される。本発明の医薬組成物は、有効成分を治療上不活性な補形薬と共に含む顆粒剤、錠剤または注射用溶液の形態で調製される。
【０２０３】
該組成物は、活性医薬を０．５〜９９．５重量％を含み得る。
【０２０４】
化合物の延長された放出を得るために、カチオン性デキストランと組み合わせて投与してもよく、炭素番号７，１１および１６の１またはそれ以上が置換されたアミノ置換化合物の形態で投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】は未分化のコントロール及び１７α＋１７β−ＡＥＤで治療された腫瘍の写真である。
【図２】は表ＩＶに関して議論されるウェスタンブロットを示す。
【図３】は、１７α−ＡＥＤ、１７β−ＡＥＤ、１７αＯＨ−プレグネノロン及び５−アンドロステン−３β，７β，１７α−トリオールのＶＥＧＦに対する作用を説明する。
【図４】は、１７α−ＡＥＤ、１７α−ＯＨプレグネノロン及び１７β−ＡＥＤのＤｕｎｎｉｎｇＡＴ−１（ラット前立腺腫瘍）におけるβ−カテニン、サイクリン Ｄ１及びＣＯＸ−２の発現に対する効果を説明するウェスタンブロットを示す。
【図５】は、代表的な例によって説明された、未治療のコントロール中のＧ１，Ｓ期の中の細胞（ＣＡＣＤ）と１７α−ＡＥＤ（ａｌｆａＡ−Ｄ）で治療した後の細胞の比率の比較を示す。
【図６】は、リガンド誘導コアクチベーター分析において、ＰＰＡＲγリガンド活性について、どのように１７α−ＡＥＤ、１７０Ｈプレグネノロン、５−アンドロステン−３β，７β，１７α及びそれぞれの３β−サルフェートを調べたかを説明する。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to novel steroid derivatives useful as medicaments. The invention further relates to the use of steroid derivatives in the manufacture of a medicament, for example for benign and / or malignant tumors, such pharmaceutical compositions and methods of treating benign and malignant tumors.
[Background Art]
[0002]
U.S. Pat. No. 5,912,240 (Loria) discloses that steroid androstene-3.beta., 17.alpha.-diol (17.alpha.-AED) and antitumors by inhibiting growth in all neoplastic cell lines and causing apoptosis. It describes tumor effects. Apoptosis has been demonstrated in vitro in three neoplastic myeloid cell lines. Growth inhibition has been demonstrated in two breast cancer cell lines. However, apoptosis has not been demonstrated in these two breast cancer cell lines.
[0003]
Nuclear receptor PPARγ is a transcription factor belonging to the steroid hormone receptor superfamily. Nuclear receptors link extracellular hormonal signals to the transcriptional response. This is done by binding the receptor to a response element within the promoter region of the target gene. Some nuclear receptors in this family have only ligand-dependent effects, while others function without ligand. Members of the steroid hormone receptor superfamily include the glucocorticoid receptor and receptors for estrogens, androgens, progestins, thyroid hormone, retinoic acid, retinoic acid in the 9-cis form, peroxisome growth factor, vitamin D and ecdysone .
[0004]
The receptor consists of six regions. Counting from the N-terminal AF, the ligand-independent function (AF-1) is in A / B and the ligand-dependent function is in E in AF-2. The C region is a DNA binding region (DBD).
[0005]
Waxman (Role of metabolism in the activation of dehydro-epiandrosterone as a peroxisome proliferators, DJ Waxman, J.E.P.E. -Indirectly demonstrated the ligand activity of sulfate on PPARα.
[0006]
Summary of the Invention
One object of the present invention is to provide novel compounds that can suppress cell cycle arrest and / or angiostatin effects and are useful as drugs. This and other objects of the invention are achieved as set forth in the appended claims.
[0007]
More specifically, the present invention relates to the use of cyclin D1 or β-catenin to down-regulate when these factors are overexpressed and interfere with treatment, to eliminate cell cycle blocks, or It involves administering therapeutic doses of such steroids to down regulate vascular invasion. An example of such an instance is colorectal cancer. Examples of such cases are colon cancer, often mutated within the APC gene, causing up-regulation of β-catenin, cyclin D1 or There are a small number of prostate cancers with increased expression of β-catenin, as well as some breast cancers with increased expression of β-catenin for phenotypic reasons. In the area of lymphoma, there is a particularly interesting subgroup of mantle cell lymphomas, which are known to be resistant to virtually all known treatments and are characterized by the expression of cyclin D1.
[0008]
The effects obtained by the present invention can be used alone or in combination with conventional cytostatic or radiation gland therapy. In some cases, a better substrate may be used to block the undesirable affinity of the steroid for unrelated nuclear receptors (eg, affinity for progesterone, androgen or estrogen receptors), or for processes that compete with the steroid used. In order to increase the efficacy of treatment by suppressing competing processes by supplying (androgen receptor that successfully competes with PPARγ for cofactor ARA70 and suppresses undesired PPARγ activity) It may be useful or necessary to combine steroids with ligands for nuclear receptors such as androgens, antiandrogens, estrogens, antiestrogens, retinoic acid derivatives, deltaoids, levaxin and the like.
[0009]
The present invention further deals with the novel PPARγ ligand and PPARγ ligand activity of 3β-steroid sulfates, methods of promoting or blocking such activity, and their advantageous uses. The present invention includes the novel steroids themselves and their effects.
[0010]
Detailed description of the invention
In a first aspect, the present invention relates to novel steroid derivatives useful as medicaments. The derivatives according to the invention are described by either of the following general formulas (I) and (II). The only difference between these formulas is the nature of the bond between carbon atoms 5 and 6, which in formula (I) is a double bond as shown below.

Here, these steroids have R at position 3β. ₁ It has an O substituent and has an R ₃ It has substituents and the desired substituents at positions 7 and 17β.
[0011]
R on oxygen at position 3 ₁ Is (i) a hydrogen atom, (ii) NO ₂ , SO ₃ H, -OP (OH) ₃ , Acyl groups and other groups capable of forming esters with inorganic and organic acids, (iii) CH ₃ , CH ₂ OMe, CH ₂ Protecting groups such as O-alkyl (iv) straight or branched, saturated or unsaturated, substituted or unsubstituted, cyclic other aliphatic chains, eg mixed cycloaliphatic groups, saturated or aromatic or heterocyclic Groups that contain up to 20 carbon atoms. The substituent may be selected from, for example, OH, halogen (F, Cl, Br, I), amino, alkylamino or dialkylamino.
[0012]
Further, in specific embodiments, R ₁ Is capable of forming an ether or ester with a steroid; ₂ May be hydrogen in formula (II), and if R ₄ If is not H, it may be hydrogen in formula (I), otherwise it may be R'O at the α or β position of carbon number 7. Where R ′ is R ₁ Independently of R ₁ May be a substituent recognized.
R ₂ May be = O or = S.
R ₃ Is always at the 17α position and may be a hydroxyl group, an acyl group or R ″ O. Where R ″ is R ₁ Other groups forming an ether or ester as described in ₁ Independently of R ₁ May be a substituent recognized for.
R ₄ Is always at the 17β-position and may be a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an alkoxy group, which is represented by the formula: R ′ ″ O, wherein R ′ ″ is an ether group or an ester group And any group that forms ₁ Independently of R ₁ May be a substituent recognized for.
Further, R ₄ May be an acyl group in which a hydrogen atom or an alkoxy group or an alkyl group can bind to a keto group.
[0013]
In certain embodiments, as in 17OH pregnenolone, where methyl is attached to the ketone group, R ₄ Is acetyl (CH ₃ CO). The carbons of the ketone numbered 20 may be any alkyl, alkenyl, aryl groups such as branched or mixed aromatic and aliphatic side chains, such as cyclic saturated hydrocarbons, and N 2 , P, O, Si, F, S, Se, CN, halogen, and can have a heterocyclic or heteroaliphatic chain containing up to 20 carbons.
[0014]
In one embodiment, the steroid is 17-hydroxypregnenolone (17α-OH), Δ-5-androstene-3β, 17α-diol, Δ-5-androstene-7-oxo-3β, 17α-diol and And / or 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol.
[0015]
In another embodiment, the steroid is the corresponding pregnane- and / or androstane derivative.
[0016]
In certain embodiments, the above effects are independent of the aforementioned direct apoptotic effects on cells of the tumor.
[0017]
The novel steroids of the present invention are useful as medicaments and, when administered to a patient in need of treatment, may provide one or more anti-tumor effects by interfering with the Wnt signaling pathway. Such a drug may reduce the number of conventional treatments if mutations in the factors that regulate this pathway result in overexpression of factors from this pathway or phenotype. It is particularly advantageous for the treatment of tumors where such forms have been shown to be resistant.
[0018]
In a most advantageous embodiment, an agent comprising one or more steroids according to the invention upregulates the phenotype of colorectal cancer cyclin D1 and / or β-catenin (estrogen receptor negative breast cancer) with genetic overexpression. , Lung cancer, melanoma, mantle cell lymphoma, and other B-cell lymphomas characterized by overexpression of cyclin D1, parathyroid adenoma, head and neck tumors of squamous cell origin, esophageal cancer, Tumors and other pathologies governed by destructive angiogenesis (diabetic retinopathy), wet macular degeneration, corneal neovascularization, hemangiomas such as hemangiomas, malignant hemangiomas, midline granuloma And the treatment and / or prevention of conditions selected from the group consisting of uncontrolled growth of scars, such as keloid formation. Than it is.
[0019]
In a second aspect, the present invention relates to an agent for the treatment and / or prevention of benign or malignant tumors, which disrupts disruptions during Wnt-signaling, such as cell cycle arrest during G1 phase. It relates to the use of steroid derivatives of 5-androstene-, 5-pregnenolone or the corresponding saturated derivatives (androstane or pregnane) in the manufacture of a medicament capable of providing and / or providing angiostatin action.
[0020]
In certain embodiments, the steroid derivative is of formula (I) or (II) as shown above.
[0021]
As noted above, in one embodiment, R in the above formula ₁ , R ′ and / or R ″ form one or more ethers and / or esters with the steroid. In certain embodiments, ₄ May be hydrogen or an acyl group in which an alkoxy or alkyl group is attached to a keto group. In certain embodiments, when methyl is attached to the keto group, R ₄ Is acetyl (CH ₃ CO). Further, the carbon of the keto group at position 20 is an alkyl group, an alkenyl group, an aryl group, for example, a branched side chain or a mixed aromatic and aliphatic side chain, for example, a cyclic hydrocarbon, and N, P, 0, Si, It has a heterocyclic or heteroaliphatic chain containing S, Se, CN, or at least one halogen and having 20 or more carbon atoms.
[0022]
2. In an advantageous embodiment, the steroid is 17 hydroxy-pregnenolone (17α-OH), Δ-5-androstene-3β, 17α-diol, Δ-5-androstene-3β, 17α-diol-7-oxo, 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol, 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol and 5-androstene-3β. 17α-diol-7-one, 5-androstane-3β, 7β, 17α-triol, 5-androstene-3β, 7α, 17α-triol, 5-androstane-3β, 7α, 17α-triol and 5-andro It is selected from the group consisting of stane-3β, 17α-diol.
[0023]
One or more pregnane- and / or androstane derivatives corresponding to the steroid can be used in the manufacture of a medicament according to the invention.
[0024]
The interruption discussed above is obtained by down-regulating cyclin D1 and β-catenin overexpression. Also, the effect is advantageously essentially independent of any direct apoptotic effects on the cells of the aforementioned tumors. Drugs produced according to this aspect of the invention include rectal cancer, other malignancies with overexpression of genotypes or phenotypes of factors belonging to the Wnt signaling pathway, such as lung cancer, melanoma, breast cancer, cell lymphoma and other Lymphoma, and small pieces of prostate cancer, head and neck cancers of squamous cell origin characterized by up-regulation of the aforementioned factors, esophageal cancer, parathyroid carcinoma or adenoma, or other tumors characterized by interference with Wnt signaling For the treatment and / or prevention of one or more pathologies selected from the group consisting of pathological angiogenic conditions such as diabetic retinopathy, wet macular degeneration, corneal neovascularization and hemangiomas. Useful for
[0025]
Regarding the potential utility of said steroids in the symptoms of prostate cancer, deregulation of Wnt signaling is also present in a small subfraction of prostate cancer, which makes the steroids according to the invention useful. However, the following compounds are exceptional for the following reasons:

[0026]
In contrast to the Dunning AT-1 rat prostate cancer model, which completely lacks androgen and estrogen receptors (AR and ER), most human prostate cancers express high amounts of AR and usually also ERβ. AR is further up-regulated in androgen refractory cancers. The effect of up-regulated β-catenin on androgen receptor (AR) transcription leads to increased AR transcriptional activity from androgens as well as decreased ligand specificity, which limits the usefulness of 17α-AED in this disease . This is because it is readily metabolized to epitestosterone or B) 17α-AED-3β-sulphate. Both potential androgen receptor ligands are readily converted to yet other known AR ligands (see references in the discussion).
[0027]
In androgen-refractory progression, AR is also activated by ligand-independent factors such as epidermal growth factor (EGF) and IL-6. Activation of the EGF receptor further up-regulates cyclin D1 (see discussion reference). The two compounds S4 and S8 thereby result in values that are only effective in a small subfraction of human prostate cancer expressing eccentric Wnt signaling, and their utility is due to their androgenic activity and other Further limitation by metabolism to androgens.
[0028]
In cancers with cell cycle dysregulation due to erratic Wnt signaling as exemplified, or for example, in destructive angiogenesis, such a process is not required for treatment with steroids according to the invention alone, It may be limited or stopped as a surgical or pre-radiotherapy treatment or in combination with cytotoxic drugs, interferons, cytokines or steroid hormones.
[0029]
In a third aspect, the present invention provides (a) 5-androstene-3β, 17α-diol or androstan-3β, 17α-diol, a sulfate donor, 3 ′ phospho-adenosine-5′-phosphosulfate (PAPS) and Contacting the sulfotransferase to provide 5'-androstene-17α-ol-3β-sulfate (17α-AEDS) or androstan-17α-ol-3β-sulfate (17α-AADS); and (b) Combining the resulting sulphated 17α-AEDS or 17α-AADS with a suitable carrier; thereby producing a medicament capable of acting as a ligand for peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ). And drugs for the treatment of malignant tumors And a method for producing the same. In the context of the present invention, the active ingredient of the medicament can be the corresponding androstene (or androstane) derivative or their esters with organic or inorganic acids. In the case of an organic acid, it can consist of up to 25 carbons (S4 and S8). The effect of the medicament can be enhanced or prolonged by co-administration of a sulfatase inhibitor, such as Coumeate®.
[0030]
c) Arnostova, Libuse et al; Org. Chem. Biochem. , Czech. Acad. Sci. , Praque, Czech. Synth. Commun. (1990), 20 (10), 1521-9 by 3β-sulfate S4 (R ₁ = SO ₃ H) and S8 (R ₁ = SO ₃ Synthesis of H)
[0031]
The corresponding androstane derivative (S8, formula above)) protects the hydroxyl group from 17α- or 17β-AED (the conversion of 17β to 17α by the Mitsunobu reaction described in M & M) with acetate, followed by Obtained by reducing a double bond with a Raney catalyst.
[0032]
In a preferred embodiment, said enzyme is DHEA sulfotransferase or phenol sulfotransferase. In certain embodiments, the agent of the invention is an agent that enhances estrogen receptor alpha (ER-alpha) blocking effect.
The invention further includes a medicament produced by the method itself, as exemplified below.
[0033]
The medicament produced according to the present invention includes urethral cancer, gastric cancer, small intestine cancer, pancreatic cancer, tumor, cancer derived from endothelial cells, leiomyosarcoma, colon cancer, cholinecarcinoma, adenoma and liposarcoma of the lung, It is also useful for treating and / or preventing pathologies of eye tissues, for example, pathologies selected from the group consisting of sunspot and glaucoma cells.
[0034]
In one embodiment, the invention also relates to immunomodulatory agents, such as inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, joint or inflammatory bowel disease or multiple sclerosis or Guillain Barre syndrome. 5-androstene-17α-ol-3β-sulfate (17α-AEDS) and / or for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases caused by an enhanced or sustained T-helper-1 response Or the use of androstan-17α-ol-3β-sulphate. The present invention also relates to 5-androstene-17α-ol-3β-sulfate (17α-AEDS) and / or androstan-17α-ol-3β-sulfate for use as a medicament.
[0035]
The agents of the present invention are suitable for administration in either the neat form or in the form of a hydrolyzable prodrug, i.e., one that will hydrolyze in the selected environment from an inactive form to an active form. Such a prodrug may be an ether or ester of the drug. Such drugs or prodrugs can be selectively injected into the arteries that support tumors or portions of pathogenic neovascular neoplasms by local injection, by injection into tumors, by parenteral administration, by intraarterial administration. It is suitably administered by catheterization in the form of a pharmaceutically acceptable sterile solution or suspension. Simultaneous injection of water-soluble starch particles (Spherex®) will enhance or prolong the effect of the drug. It will further counteract the stimulation of tumor angiogenesis and regeneration caused by the resulting hypoxia.
[0036]
The drug may also be used topically in the form of a pharmacologically acceptable solution, cream or jelly, for example, with a cyclodextrin which can be applied to the eye or the mucous membranes of the mouth, nose, vagina or rectum. On the skin, for example, a compress soaked in a drug solution may be used to prevent excessive scarring. The drug can also be administered orally, as a rectal or vaginal suppository, cream or enema.
[0037]
S4 (R ₁ = SO ₃ H) or S8 (R ₁ = SO ₃ 3β-Sulfate according to H) is also mixed orally with a proton pump inhibitor (to reach a suitable pH) in the form of capsules or tablets, in order to reach the target in the gastric mucosa in case of gastric cancer. May be administered.
[0038]
In small intestinal tumors or Crohn's disease, the drug may also be administered as an enteric coated cellulase in the form of a suitable sulfate or native steroid (S4 or S8), such that DHEA-sulfotransferase is present in the small intestine. Good.
[0039]
The sulfate of the drug S4 or S8 may be administered to the urinary bladder via a catheter as a demure of a sterile solution in the case of epithelial bladder cancer.
[0040]
The compounds of the present invention defined by the above formulas (I) and (II) include anthracyclines such as doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, epirubicin, idarubicin or mitoxantrone, vinblastine, vincristine, vindesine or vinorelbine. Alkaloids, taxanes such as docetaxal or paclitaxel, alkylating agents such as ifosfamide, cyclophosphamide, busulfan, thiotepa, lomustine, chlorambutyl, dacarbazine, nitrosourea such as cisplatin, paraplatin or oxaliplatin, etoposide or teniposide A topoisomerase II-inhibitor such as, topotecan or irinotecan, a topoisomerase I-inhibitor, methotrexate Mercaptopurine, titarabin, 5-fluorouracil, gemcitabine, bleomycin, mitomycin, amsacrine, asparaginase, artretamine, hydroxycarbamide, miltefostine, estramustine, procarbazine, or a combination of cytotoxic drugs such as antimetabolites such as DTIC Good.
[0041]
In one embodiment, the effect of the novel compounds according to the invention as defined by formulas (I) and (II) is attenuated by the use of corticoids, retinoids, deltaoids, thyroid hormones, sex steroids and other nuclear receptor ligands. obtain.
[0042]
Detailed description of drawings
[0043]
FIG. 1 is a photograph of a non-differentiated control and a tumor treated with 17α + 17β-AED.
[0044]
FIG. 2 shows a Western blot as discussed with respect to Table IV.
Rat tumors exposed to α = 17α-AED (represented on the left side of the control to indicate differences in contact time compared to other treatments). The drug was allowed to act for 96 hours.
β = tumors treated with an 8-fold higher dose of 17β-AED for 456 hours.
α + β indicates continuous treatment at α for 96 hours followed by β for 360 hours.
[0045]
FIG. 3 illustrates the effect of α-AED, β-AED, 5-androstene 3β, 7β, 17α-triol and 17αOH-pregnenolone on VEGF expression.
A: untreated control; left stained area. Subsequently, a negative control of the same tumor is shown.
B: 17α-AED; left stained part. Subsequently a negative control of the same tumor is shown C: 17β-AED;
D: From left to right, 1-3 tumor samples treated with androstene-3β, 17α, 7β-triol; stained for VEGF, 4 negative controls, same treatment
[0046]
FIG. 4 shows protein blots of samples of DunningAT-1 rat tumors treated with α-AED, 17α-OH-pregnenolone and β-AED, and untreated samples (C1-C3).
The effect of treatment on the expression of β-catenin, cyclin D1 and COX-2 is demonstrated by representative examples.
[0047]
FIG. 5 shows a representative example of the effect on cell cycle of Dunning rat prostate cancer treated with 17α-AED (αA-D) compared to untreated tumor (CA-CD). Untreated tumors show strong expression of cyclin D1 due to the large number of cells in G1. In tumors treated with 17α-AED, a decrease in G1 was paralleled by an increase in cells in S phase and a decrease in cyclin D1. The lack of apoptosis combined with the results of protein blotting and lack of apoptosis, as there is no increase in G2 cells, indicates spontaneous non-apoptotic cell death in S or G2.
[0048]
FIG. 6 shows how PPARγ ligand activity on α-AED, 17OH-pregnenolone and 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol and their corresponding 3β-sulfate in ligand-induced coactivator assays. I will explain. SRC-1 was used as a positive control and rat liver cytosol from a male rat was used as a negative control.
[0049]
The only sample that showed PPARγ ligand activity was 5-androstene-17α-ol-3β-sulfate.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0050]
Example 1: Synthesis of 3β, 7β, 17β-trihydroxyandrost-5-ene
In this example, 3β, 7β, 17β-trihydroxyandroste-5-ene (compound 6) was synthesized as shown in Scheme 1 below. Here, (a) is NaBH ₄ , Ethanol; (b) is Ac ₂ O, pyridine, DMAP, (c) is t-BuOOH, Cu (I) I, acetonitrile; (d) is NaBH ₄ , CeC1 ₃ * 7H20, ethanol; and (e) is KOH, MeOH.
Scheme 1

[0051]
Compound 2: Synthesis of 3β, 17β-dihydroxy-androstene-5-ene
Compound 1 (1.00 g, 3.46 mmol) was dissolved in dry ethanol (15 ml), and NaBH ₄ (196 mg, 5.20 mmol) was added slowly. After 1 hour, at room temperature, aqueous NaOH (2M, 6 ml) was carefully added and the mixture was extracted three times with diethyl ether. The combined extracts were washed with MgSO ₄ And the solvent was evaporated.
Yield: 91%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 0.76 (s, 18-H), 1.05 (s, 19-H), 3.52 (m, 3α-H), 3.65 (t, 17α-H), 5.35 (D, 6-H)
[0052]
Compound 3: 3β, 17β-diacetoxy-androst-5-ene
Compound 2 (880 mg, 2.93 mmol), pyridine (25 ml), acetic anhydride (2 eq) and DMAP (10 mol%, 29 mg) were heated at 100 ° C. for 2 hours. The reaction mixture was poured into water, the solid was filtered off, diluted hydrochloric acid, NaHCO ₃ And washed with water and finally crystallized from ethanol.
Yield: 87%.
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 2.03 (s, 17β-OAc), 2.05 (s, 3β-OAC), 5.38 (d, 6-H)
[0053]
Compound 4: 3β, 17β-diacetoxy-androst-5-ene (Salvador, J.A.R .; elo, MLS; Neves, AC; S. Tetrahedron Lett. 1997, 119-122).
Under argon, to a solution of compound 3 (650 mg, 1.80 mmol) in acetonitrile (12 ml) was added copper (I) iodide (3.6 mg, 0.18 mmol) and t-butyl hydrogen peroxide (2.5 ml, 10 mmol) was added. After stirring at 55 ° C. for 24 hours with a magnetic stirrer, the solution was washed with Na ₂ S0 ₃ Poured into the solution (10% aqueous solution) and extracted with diethyl ether. The extract was extracted with MgSO ₄ And dried over NaHCO ₃ Washed with saturated aqueous solution, brine and water. Also, the solvent was evaporated.
Yield: 45%.
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 5.72. (D, 6-H)
[0054]
Compound 5: 3β, 17β-diacetoxy, 7β-hydroxy-androst-5-ene
The Luce reduction method (Luche, J.-LJ. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 2226) was performed. A solution of compound 4 (330 mg, 0.86 mmol) in dry ethanol (10 ml) was cooled to -78 C with stirring. CeCl ₃ * 7H ₂ 0 (335 mg, 0.86 mmol) followed by NaBH ₄ (48 mg, 1.29 mmol) was added.
[0055]
The reaction mixture was slowly warmed to 0 ° C. and stirred for 30 minutes. Aqueous NaOH (2M, 6 ml) was carefully added and the mixture was extracted three times with diethyl ether. The combined extracts were washed with MgSO ₄ And dried. Also, the solvent was evaporated. Compound 5 (150 mg, 0.40 mmol) thus prepared was saponified by refluxing in 5% calcium hydroxide in methanol for 1 hour. After treating the mixture, the product was recrystallized from acetone / water. Yield: 80%.
¹ H-NMR (MeOH, 400 MHz) 3.40 (m, 3α-H), 3.57 (t, 17α-H), 3.85 (d, 7α-H), 5.21 (s, 6-H) )
[0056]
Example 2: Synthesis of 3β, 7β, 17α-trihydroxyandrost-5-ene
In this example, as shown in Scheme 2, 3β, 7β, 17α-trihydroxyandrost-5-ene (Compound 12) was produced. (A) is t-butyldimethylsilyl chloride, imidazole, DMF; (b) is NaBH4, CeC13 * 7H2O, EtOH; (c) is p-nitrobenzoic acid, PPh ₃ , DEAD, toluene; (d) is tBuOOH, Cu (I) I, acetonitrile; and (f) is n-BU. ₄ NF, THF, KOH, and MeOH.
[0057]
Scheme 2

[0058]
Compound 7: Synthesis of 3β- (dimethyl t-butylsiloxy) androste-5-en-7-one (Mitsunobu reaction)
A solution of compound 1 (2.88 g, 10 mmol), imidazole (1.7 g, 25 mmol) and t-butyldimethylsilyl chloride (1.8 g, 12 mmol) in dry DMF (20 ml) is maintained under argon overnight. Then, it was poured into water, extracted with chloroform, and the solvent was evaporated. Yield: 98%
¹ HNMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 0.06 (s, Me ₂ Si, 0.88 (s, 18-H), 0.89 (s, tBu), 1.02 (s, 19H), 2.41 (dd, 16-H), 3.50 (m, 3α-) H), 5.37 (d, 6-H)
[0059]
Compound 8: 3β- (dimethyl t-butylsiloxy), 17β-hydroxy-androst-5-ene
Yield: 92%.
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 3.64 (t, 17α-H)
[0060]
Compound 9: 3β (dimethyl t-butylsiloxy), 17α-benzoyloxy-androst-5-ene
Compound 8 (1.7 g, 4.19 mmol), β-nitrobenzoic acid (1.8 g, 11 mmol) and triphenylphosphine (2.8 g, 10.5 mmol) were dissolved in toluene (25 ml) under argon, Heated to 30 ° C. DEAD (1.53 ml, 10 mmol) was added slowly. The mixture was refluxed for 2 hours, the solvent was evaporated and the solid residue was chromatographed over pentane / diethyl ether = 95/5.
Yield: 68%.
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 5.2 (d, 17β-H), 8.2-8.35 (Ar)
[0061]
Compound 10: 3β- (dimethyl t-butylsiloxy), 17α-benzoyloxy-androst-5-en-7-one
Yield: 36%
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 5.68 (d, 6H)
Compound 12: 3β, 7β, 17α-trihydroxy-androst-5-ene
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz) 3.57 (m, 3α-H), 3.75 (17α-H), 3.80 (d, 7α-H):
[0062]
Example 3: Evaluation of action
Materials and methods
[0063]
Animal 1
Surviving tumor pieces of DunningR3327, AT-1 rat prostate cancer, previously grown in Copenhagen-Fischer rats and treated as described below, were harvested for testing.
[0064]
Group 1: A single subcutaneous administration of 80 mg of Δ5-androstene-3β, 17β diol (Sigma Chemicals).
[0065]
Groups 2 and 3: single dose of 10 mg of Δ5-androstene-3β, 17α-diol (Steraloid Inc.)
[0066]
Group 4: used as control for untreated tumors. In all treatments, equal volumes of PEG400 (Sigma Chemicals) and 0.5 ml of ethanol were used as vehicle and injected subcutaneously near the tumor site.
[0067]
96 hours later, Group 3 previously treated with 10 mg of Δ5 androstene-3β, 17α-diol received a single injection of 80 mg of Δ5-androstene-3β, 17β-diol as in Group 1.
[0068]
In Group 2, the experiment was terminated after 96 hours by suffocating the rats with carbon dioxide, and for the remaining groups was terminated after 19 days. The local animal ethics committee approved the experiment. Other details of this experiment can be found in Atomicoural activity of 17α-AED and 17-β epimer in vivo, in Dunning AT-1 prostate cancer in rat: Hagstom et al. unpubl. It is described in.
[0069]
Immunostaining
Immunostaining was performed on sections fixed in formalin using VEGF, clone C-1, IgG2a, sc7269, Santa Cruz. Working was performed at a dilution of 1: 100. As negative control antibodies, mouse IgG, DAK-GO1, kappa, x931, Dako were used with a 1:50 working dilution.
[0070]
Tumors were examined for increased apoptosis using the Appo-Tag in situ Apoptosis Detection Kit (Oncor, Gaithersburg, MD).
[0071]
Animal 2
The above animal experiment was repeated.
Group 1 received a single subcutaneous dose of 10 mg of 17α-AED near the tumor.
Group 2 received a single dose of 80 mg of 17β-AED in the same manner.
Group 3 received a single dose of 25 mg of 17α-OH pregnenolone in the same manner.
Group 4 received a single dose of 7.5 mg of 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol.
Group 5 is a tumor control.
[0072]
Cell line
Human prostate cancer cell lines, PC-3 and DU-145, were used. Frozen cell lines were established in the medium. First, U-145, which was considered as a tumor part, was broken up in a sterile petri dish using scissors. Disrupted tumor 75 cm containing medium ³ To a cell culture flask. As the medium, Ham's F10 was used for PC-3, and RPMI 1640 was used for DU-145.
[0073]
FBS 10%, 0.2% NaHCO3 (7.5%), 2 mM L-glutamine (200 mM) and 0.005 mg / ml gentamicin (5 mg / m) were added to the cultures for both cell lines.
[0074]
Cell is 75cm ³ The cells were cultured until almost confluent in a cell culture flask. The medium was changed twice a week. Equivalent solutions of 17α-AED, 17β-AED, and mixtures thereof in medium, in DMSO and ethanol, were each added such that the concentration of DMSO in the culture flask did not exceed 0.15%.
[0075]
The concentration of AED in each culture flask was 100 nM. Controls were exposed to the same concentrations of DMSO and ethanol in the medium.
[0076]
Contact was maintained for 96 hours, after which the cells in the culture flask were treated with 5 ml of trypsin (0.25%) for PC-3 and 3 ml of trypsin and vascine (0.2 mM) for DU-145. Thereafter, the cells were mechanically loosened using a glass spatula. A 100 μl aliquot was removed for trypan blue exclusion testing. A 200 μl aliquot was removed for cytospin preparation. Thereafter, the remaining 700 μl of sample was centrifuged at 510 × g for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed and the cells were resuspended in medium in 1 ml of insect lysis buffer (Pharmingen 21425A) and incubated on ice for 30 minutes. Thereafter, the cell lysate was stored at -70 ° C until analysis.
[0077]
Apoptosis analysis
A 100 μl aliquot of the cell lysate was removed for caspase analysis. Each portion was mixed with 1 ml of protease assay buffer and 20 μM final concentration of Ac-DEVD-AMC substrate (Pharmingen # 66081U). The solution was incubated at 37 ° C for 60 minutes.
[0078]
To check for background fluorescence, a control was prepared without cell lysate and with equal amounts of protease assay buffer, cell lysis buffer and Ac-DEVD-AMC substrate.
[0079]
Fluorescence was measured at 415-450 nm with an excitation wavelength of 380 nm using a fluorescence spectrophotometer (RF540, Shimadzu Data Recorder DR3, Instruments AB, Lambda).
[0080]
Trypan blue exclusion test
An aliquot of 100 μl of the initial cell suspension in PBS was used to determine the viability of the collected cells by trypan blue exclusion analysis. 10 μl of the cell suspension was mixed with 10 μl of a trypan blue solution (Sigma Chemical Co. # T8154) and allowed to stand for 3 minutes. Cell viability and death were counted with a hemocytometer.
[0081]
Photo registration
To see the growth inhibitory effect, cultures containing 17α-AED as well as controls containing the same number of cells were grown in Petri dishes with grids to allow the identification of specific regions. Cells were photographed every 24 hours until confluent.
[0082]
Effect of HER-2 and 17α-AED sulfate on breast and prostate cancer cell lines
Cell cultures of prostate cancer cell lines PC-3 and DU-145 and breast cancer cell lines MCF-7 and SKBR-3 were grown in flasks as described above in the presence or absence of 200 nM 17α-AED. I let it. Cultures containing 17α-AED are further subdivided and the cultures are diluted in the presence or absence of Herceptin®, her-2 antibody to a concentration in the cell suspension. Was cultured using a 1 mg / ml stem solution at 1: 150. Since no preservatives were added to the her-2 antibody, they were added twice (considering the short half-life of the antibody) with a 24-hour interval during the 72-hour incubation.
[0083]
Representatives of each cell line without steroid were also treated with Herceptin as described above. Three different culture flasks were used for each cell line and different treatments.
Furthermore, a mixture of 100 μl of rat liver cytosol and 20 μl of 3′-phosphoadenosine-5 ′ phosphosulphate (PAPS) corresponding to about 0.16 mg of PAPS was shared and added to the culture solution containing 17α-AED. .
Finally, for each cell line, three samples were saved as untreated controls. To assess the number of viable cells, a solution of chlorofluorescein diacetate was added to the culture on the last day of the culture. This chemical enters the cells freely, but is metabolized in living cells to form a form with green fluorescence and cannot exit the cells. To detect dead cells, propidium iodide, which gives red fluorescence, was added 15 minutes before analyzing the samples in a Facscan. The time for 10,000 cells to pass through the detector in the fax scan was evaluated to detect possible growth inhibitory effects that did not result in cell death.
[0084]
Estrogen receptor blockade in DU-145 and PC-3 cell cultures, combined effects of 17α-AED-3β-sulfate and HER-2 antibodies
Based on previous experiments, cell culture experiments were repeated on two prostate cancer cell lines. According to the literature, estrogen receptor β is expressed in both cell lines, and estrogen receptor α is expressed only in PC-3 cells. To block the estrogen receptor, ICI 172,780 at a concentration of 50 nm was used and added twice at 36 hours. The estrogen receptor blocked cultures were then treated with +/- HER2 antibody and +/- 17α-AED-3β-sulfate, except that the estrogen receptor was blocked as described above, except for PC-3 and PC-3. The DU145 was treated at the concentration and method described in the experiment.
[0085]
Culture of 3T3-L1 fibroblasts
3T3L1 fibroblasts from ATCC (embryonic myocyte line) batch F-12732 (batch day 930301) were grown in 500 ml DMEM, 50 ml fetal bovine serum (FBS) and 11 ml PEST. The medium was changed every other day. Cells were allowed to reach 80% confluence.
[0086]
For discrimination, fibroblasts were incubated in DMEM + 10% FCS + 5 μg / ml insulin for differentiation. 0.1 mM IBMX and 0.25 μM dexamethasone were added. Two days later, cells were transferred to DMEM + 10% FCS + 5 μg / ml insulin. Thereafter, the medium was changed every other day and consisted of DMEM + 10% FCS. Ethanol in distilled water was added to keep the ethanol concentration below 0.1%. This was used as a positive control for discrimination.
[0087]
Fibroblasts were incubated using the same solution except that IBMX and dexamethasone were replaced with a solution of 17α-AED in ethanol and water, with the concentration of 17α-AED in culture being 100 or 200 nM. Cultures were maintained in the incubator until confluent.
[0088]
Protein blotting
Lysed rat tumors from both above experiments were homogenized in ice cold cell lysis buffer (160 mM NaCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2). ₂ 5% SDS, 0.5% Triton X-100, 100 μg / ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg / ml leupeptin and 2 μg / ml aprotinin). Placed on ice for 15 minutes, followed by centrifugation at 13,000 g for 10 minutes. The protein content of the homogenate was determined by Lowry analysis.
[0089]
The proteins in the lysate (90 μg) were separated by electrophoresis using 8% SDS-PAGE, and the separated proteins were trans-blot electrophoretically transferred cells; Bio-Rad. Transferred onto nitrocellulose membrane (Amersham) in Laboratories (Bio-Rad-Laboratories).
[0090]
After trans-blot and blocking with skim milk in TTBS (IxTTBS: 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7.5, 0.1% Tween-20)), the blots were 3% (w / v) Probed with a mouse monoclonal IgG1 PPARγ antibody (anti-PPARγ (E8) Santa Cruz Biotechnology) diluted 1: 400 in TTBS containing skim dry milk.
[0091]
After washing in TTBS, the blot was re-incubated for 1 hour with horseradish peroxidase and a second antibody (anti-goat antibody 2020 (Santa Cruz) diluted 1: 4000 in TTBS containing 3% (w / v) nonfat milk. )). Blots were developed using an enhanced chemiluminescence system (ECL, Amersham) and contacted with Hyperfilm ECL (Amersham). The photoelectric density was measured by densitometry.
[0092]
Blots were taken and rehybridized to antibodies against β-catenin (C-18, sc. 1496)) and COX-2 (C-20, sc 1745).
[0093]
All experiments were repeated twice for each analysis.
[0094]
In a second animal experiment, tumors were examined for expression of β-catenin, COX-2 and cyclin D1 (A-12, sc, 8396).
Protein blotting was repeated on the DU-145 and PC-3 cell lines, and further examined for PPARγ expression with an antibody (H-74, sc7197).
[0095]
( ³⁵ S) Preparation of methionine labeled SRC-1
(35S) by in vitro transcription and translation using the ApcDNA3-SRC-1 construct as a template and using a TNT®-coupled reticulocyte lysate system (Coupled Reticulocyte Lysate System) (Promega). Methionine labeled SRC-1 was prepared.
[0096]
Ligand-induced interaction between GST-PPARγ and SRC-1:
To generate a GST-PPARγ fusion protein, the mouse PPARγ cDNA was inserted into the NcoI-HindIII site of pGEX-KG, and the protein was expressed in the Ecoli Y1090 strain. The bacteria were placed in TEDG buffer (50 mM Tris (pH 7.4), 1.5 mM EDTA, 10% glycerin, 0.4 M NaCl, 0.1 mM DTT) containing the following protease inhibitors: Dissolved by sonication: 0.5 mM PMSF, 1 mM benzamidine, 10 μg / ml leupeptin, 10 μg / ml antipain and 10 μg / ml aprotinin. The lysate was centrifuged in a SW41 rotor at 100,000 xg for 60 minutes using a Beckman L8-70M ultracentrifuge. The fusion protein was immobilized on GSH Sepharose beads (Pharmacia), followed by 10 mM Tris (pH 7.4), 0.12 M KCl, 8% glycerin, 4 mM DTT, and 0.5% CHAPS (buffer solution). Incubation for 30 minutes at room temperature in AA) (FIG. 5). afterwards,( ³⁵ (S-methionine) SRC-1 (about 0.1 μCi) was added and the beads were incubated for an additional hour at 4 ° C. and washed with buffer A. SDS sample buffer was added to the beads and the sample was boiled before separation on 7.5% SDS-PAGE. Radioactivity was detected by autoradiography.
[0097]
Ligand-induced coactivator interaction analysis
α-AED and β-AED were examined in 10 and 100 μM solutions of ethanol 10%, distilled water in assays for PPARγ ligand activity as described above. A 10 μl aliquot of the α-AED or β-AED solution was added to a male rat liver cytosol preparation prepared as described below.
[0098]
Rat liver homogenate is a known source of steroid sulfotransferase activity and was prepared using a food processor. Liver homogenates were protected from serine proteases by adding 2 mmol of PMSF, 1 mmol of EDTA and 10 mmol of Tris-HCl to a pH of 7.40. This homogenate was prepared at 4 ° C., then centrifuged at 15,000 g for 10 minutes, and then centrifuged at 4 ° C. at 100,000 g for 1 hour. The supernatant was divided into tubes containing one of the following steroids: 17 μ-AED or 17α-AED at a concentration of 5 μM with 100 μl of liver cytosol. One test tube served as a positive control and contained SRC-1.
[0099]
In a second experiment, the following steroids were tested for activity: 17α-AED, 17OH-pregnenolone and 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol, 10 μl of 5′-phosphoadenosine-3′-phosphosulfate ( PAPS), with or without Sigma Chemicals (equivalent to 0.1 mg PAPS). One tube served as a positive control and contained SRC-1 instead of steroid. When the steroid sulfotransferase was inactivated by heating to 45 ° C. for 30 minutes, one tube contained liver cytosol. The tubes were stirred at 20 ° C. for 1 hour and the contents were examined with a receptor coactivator assay for ligand activity (FIG. 5).
[0100]
Synthesis of 3α sulfate of 17α-AED, identification of molecular structure and confirmation of activity in ligand-induced coactivator interaction assay 1
[0101]
17α-AED was purchased from Arnostova, Reboot M. (Arnostova, Libuse M.); Pouzar, Vladimir; Drasar, Pavel, Inst. Org. Chem. Biochem. , Czech. Acad. Sci. , Praque, Czech. Synth. Commun. (1990), 20 (10), 1521-9. Using acetate as a protecting group, pyridine-SO ₃ -The conjugate was used as a sulphate. Deprotection with an excess of 0.8 M NaOH in methanol-water gave the desired hydroxysulfate. This was examined for PPARγ activity in the ligand-activated coactivator receptor activity described above. This indicated the PPARγ activity of 17α-AED-3β sulfate.
[0102]
result
Morphology
Following initial 17α-AED and subsequent treatment with 17β-AED in DunningAT-1 rat prostate cancer, rat prostate cancer changed its tumor appearance from a plastic surgery pattern to a tumor showing glandular differentiation. Attenuation of the expression of this nuclear receptor accounts for this differentiation, as human prostate cancer expresses PPARγ and activation of this receptor can lead to differentiation in other types of tissues that express PPARγ To see if this was possible, protein blotting with antibodies to PPARγ was performed.
[0103]
3T3-L1 mouse fibroblasts
Pre-confluent cultures of 3T3L1 mouse fibroblasts were contacted with 100 and 200 nmol of 17α- or β-AED to determine whether adipocytic differentiation to an adipocytic phenotype occurred. Positive controls containing IBMX and dexamethasone differentiated as expected after reaching confluence.
No differentiation was seen for androstenediol, but significant suppression of cell growth was seen in fibroblast cultures exposed to 200 nM 17α-AED. ,
[0104]
Apoptosis, cell viability and growth inhibition
Sections of rat prostate cancer treated with 17α-AED were examined for increased apoptosis by the TUNEL method and found no increase in programmed cell death compared to controls (Hagstrom et al.). Antitumal activity of 17α-AED and 17-β epimers in vivo, in Dunning At-1 prostate cancer in rat).
[0105]
Measurement of changes in caspase-3 and caspase-7 (DU-145 lacks caspase-3 activity during apoptosis; instead, caspase-7 has a weaker effect in mediating apoptosis compared to caspase-3. However, both caspases Both recognize the same amino acid motif and therefore the substrate used is suitable for any detection) when DU-145 is grown in the presence of 17α-AED compared to the growth of 17β-AED or control. , Showed a significant decrease. Interestingly, after 17α-AED treatment of DU-145 cells, a significant decrease in cell count was seen. This indicates the growth inhibitory effect of both steroids on DU-145 cells. Fluorescence intensity measurements were corrected for differences in cell number, but a decrease in fluorescence intensity compared to controls and other steroids in 17α-AED treated samples remained. This suggests a protective effect on the effects of apoptosis from 17α-AED in DU-145 as well as PC-3.
[0106]
Caspase-3 mediated fluorescence in PC-3 cells treated with 17α-AED shows an intensity that is essentially unchanged compared to untreated controls. However, correcting for intensity for cell number is likely to be significant, with decreasing apoptosis. It can be seen that the fluorescence intensity of 17β-AED is approximately doubled with increasing apoptosis. Looking at the total number of cells in PC-3 culture, it can be seen that the culture treated with 17α-AED has a 59% increase in total number of cells compared to the control.
[0107]
In the samples treated with 17β-AED, the increase in cell number was smaller, at 29%.
[0108]
A decrease in the percentage of viable cells indicates a small decrease in the percentage of viable cells in PC-3 cultures treated with 17α-AED or 17β-AED. However, the increase in the total number of cells in these cultures is more important, and the number of viable cells in these cultures will equal the total number of cells in the culture.
[0109]
Thus, this experiment demonstrates that 17α-AED confers significant protection against apoptosis in two common examples of androgen-refractory human prostate cancer; cell lines PC-3 or DU-145. Furthermore, 17β-AED increases apoptosis in PC-3 cells, but not DU-145.
[0110]
Contrary to the earlier date observation in breast cancer cell lines by Loria, the combination of both steroids had no significant effect on apoptosis of prostate cancer. 17α-AED and 17β-AED increase cell death of PC-3 cells, but also increase the number of viable cells.
[0111]
In the following, Table I shows the numbers of PC-3 and DU-145 cells treated with 17α-AED, 17β-AED or both, and lethal and viable cells in comparison to untreated controls. Evaluation of each group is based on different measurements from three different culture flasks.
[Table 1]

[0112]
In addition, Table II below shows the average fluorescence of caspase-3, DU-145 and PC-3 samples assessed by spectrofluorimetry in apoptosis assays.
[Table 2]

[0113]
Table III shows that HER expressing DU-145 and PC-3-androgen refractory human prostate and human breast cancer cell lines MCF-7 (estrogen receptor positive) and SKBR-3 (estrogen receptor negative). 2 shows the assessment of viability and apoptosis in -2 / neu and the effect of the HER-2 / neu antibody Herceptin, 3α-sulfate of 17α-AED and their combinations.
[Table 3]

The measurement of fluorescent cells during a fax scan is interpreted as follows.
Two main cell populations were found. One colored strongly with chlorofluorescein diacetate (CFA), very weakly colored with propidium iodide (PI) and counted as alive, the other colored in the opposite pattern, Counted as dead.
[0114]
The small cell population is strongly colored in both and is thought to contain early apoptosis.
These results showed a similar plot for the percentage of cells evaluated as alive or dead in controls of all cell lines.
[0115]
17α-AED-3β sulfate showed the opposite, but effective, effect on PC-3 and SKBR-3. The percentage of surviving cells increased and the number of dead cells decreased in PC-3 cultures. With SKBR-3, a decrease in viable cells and an increase in dead cells were seen with 17α-AED-3β sulfate in culture. Treatment of cell cultures with the HER-2 antibody had no significant effect on the percentage of live and dead cells. The combination of the HER-2 antibody and 17α-AED-3β sulfate appears to significantly increase cell viability and protect SKBR-3 cells. Similar but weaker trends are seen for other cells, but for DU-145 this combination reduces viable cells.
[0116]
Thus, this experiment does not support the theory that HER-2 expression is likely the reason why 17α-AED-3β sulfate lacks an apoptotic effect in these cell lines except for DU-145. The results seen in SKBR-3 treated with 17α-AED-3β sulfate indicate that estrogen must be blocked to obtain the effects of 17α-AED-3β sulfate.
[0117]
Estrogen receptor blockade in human androgen refractory cancer cell lines PC-3 and DU-145
[0118]
The results of estrogen blockade of ICI 172,780 indicate a significant decrease in viable cells and an increase in cells stained weakly for both markers, DCFA, and PI (the latter suggests apoptotic cells) in PC-3 cells. .
[0119]
It was less clear in the DU-145 results that there was no apparent increase in the number of dead cells. Combination treatment of 17α-AED-3β sulfate and ICI 172,480 in PC-3 cells resulted in approximately 80% cell death. No increase in cell death was seen in DU-145 cells. The number of cells that stained strongly with PI was reduced, especially in cells that received the combination treatment.
[0120]
Thus, this experiment illustrates how increased cell death is observed following estrogen receptor blockade in PC-3 cultures. When 17α-AED3β sulfate is added, a synergistic effect is observed. No apparent effect was observed in DU-145 cells.
[0121]
Western blotting of cell lines
Similar to Northern blotting, Western blotting of PC-3 and DU-145 cell lines treated with 17α-AED and untreated controls (three samples each), COX-2 and β-catenin in PC-3 It showed weak expression and much stronger expression in DU-145.
[0122]
PPARγ expression was much stronger in PC-3 than in DU-145. PPARγ is strongly expressed in DU-145, but only weakly in PC-3. Treatment with androstenediol, alone or in combination, had no regulatory effect on the expression of PPARγ, PPARδ, COX-2 or β-catenin. In contrast, AEDS significantly increased PPARγ expression in both cell lines, whereas AEDS had no effect on PPARδ expression.
[0123]
Western blotting of cell lines treated with 17α-AEDS
The experiment was repeated on the same cell line as above. A 100 nM solution of 17α-AEDS was used instead of 17α-AED. PPARγ expression was increased in PC-3 cells. DU-145 increased PPARγ expression.
[0124]
Western blotting of animal I
Western blotting was performed using samples from three different tumors treated with 17α-AED, 17β-AED and both consecutive treatments. Antibodies to PPARγ, COX-2 and β-catenin were used. This experiment was repeated with different control tumors with the same results.
The value for the number of controls was set to 100. The averages, ranges and p-values are shown in Table IV below.
[Table 4]

[0125]
The unexpected finding that expression of PPARγ doubled and β-catenin expression was significantly reduced, while COX-2 in tumors treated with α-AED was doubled, was predicted from PPARγ ligands. (Contrary to the combination of α and β-AED).
Since the time of drug contact is very different between treatment arms, the comparison of data between different treatments must be done very carefully.
[0126]
Animal II Western Blotting
Controls showed high expression of β-catenin, cyclin D1 and COX-2.
In samples treated with α-AED, there was a marked decrease in β-catenin and cyclin D1 expression.
[0127]
The same pattern, but more striking results were seen in tumors treated with 17OH pregnenolone.
[0128]
β-AED did not decrease the expression of β-catenin or cyclin D1.
All steroids similarly increased COX-2.
[0129]
Contact with steroids was 80 hours on all arms (contrary to previous experiments where tumors were exposed for 96 hours (α-AED) or 456 hours (β-AED and α + β-AED)).
[0130]
Effect of α-AED, β-AED and 17α-OH-pregnenolone on tumor growth
Evaluation of the effect of subcutaneous injection near the tumor described in the section "Materials and Methods" above showed that the tumor volume in rats treated with β-AED and in untreated controls was approximately doubled. (200%) and increased by about 50% (150%) in rats treated with α-AED and about half (-50%) in animals treated with 17α-OH-pregnenolone.
[0131]
Effect of α-AED, β-AED, 17α-OH-pregrenolone and 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol on VEGF
[0132]
Morphological examination of the tumors treated with α-AED showed a patch-like appearance by microscopy and showed deprived tumor tissue in a limited area. The antitumor effect started immediately. In view of the delayed onset of action in tumors treated with β-AED, and the onset of action reported in vitro using troglitazone in human prostate cancer cell lines, apoptosis by activation of PPARγ A different mechanism than the increase in
[0133]
Immunostaining as described in the "Materials and Methods" section above was performed on control tumors and tumors treated with 17α-AED. Strong expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was shown in controls (4/4) and very weak expression was shown in samples treated with 17α-AED (3/4).
[0134]
Immunostaining was repeated on tumors from "Animal II". Strong coloration for VEGF was shown in control (4/4) and 17β-AED (3/4). Almost complete elimination for VEGF was shown with (4/4) and 17α-OH-pregnenolone (3/3). In tumors treated with 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol (ββα-triol), there is almost complete loss of detectable VEGF in two cases and moderate down in one case. Regulation, in one case it had a constant appearance.
[0135]
The results are shown in FIG. 5μ section of all tumors. A is a tumor section from an untreated control, and each second sample is a negative control. B is a tumor treated with 17α-AED, and each second sample is a negative control. C is a tumor treated with 17β-AED, and each second sample is a negative control.
[0136]
D is three samples treated with 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol, with negative controls shown on the left. The three samples on the right are treated with 17OH-pregnenolone, followed by a negative control.
[0137]
Notable is the excellent growth inhibition of tumors treated with 17OH pregnenolone. Also noteworthy is the lack of angiostatin effect in tumors treated with 17OH-pregnenolone.
[0138]
Comparison of cell ratios during G1, S phase in untreated controls and samples after 17α-AED-treatment
[0139]
The S phase in the untreated DunningAT-1 sample showed an average S phase of 25.5% (24, 24, 24, 30), while the average S phase of the sample treated with 17α-AED- was 45%. 0.3% (45, 38, 53,).
[0140]
The percentage of G1 cells was 59% (55, 52, 65, 67) in treated control tumors and 35% (30, 41, 43) in treated ones. Comparison of cells in G2 phase was difficult to calculate due to the widely scattered values.
[0141]
FIG. 4 shows a cell cycle analysis comparing four different tumors treated with 17α-AED with four different tumors of an untreated control. Cell cycle analysis is complicated by the fact that in the G2 phase, a significant portion of the cells is necrotic and interferes with the interpretation of the cells.
[0142]
PPARγ ligand activity assay
α- and β-androstenediol were examined for PPARγ-ligand activity in a ligand-induced coactivator assay. There were no signs of transcription indicating ligand activity in the examined androstendiol itself.
[0143]
Hepatic cytosols incubated for 2 hours with α- or β-AED were examined with a ligand-induced coactivator assay. A weak band in the position corresponding to the positive control was present in the liver cytosol. The same result was seen when 17β-AED was added to liver cytosol.
[0144]
The band disappeared in the sample containing 17α-AED and liver cytosol.
[0145]
The experiment was repeated with 17α-AED, 3β, 7β, 17α-androstentriol and 17α-OH pregnenolone plus / minus PAPS and plus liver cytosol. This was also heat inactivated with PAPS and 17α-AED and tested. The results showed ligand activity only in samples containing 17α-AED + PAPS and active liver cytosol (FIG. 5).
[0146]
The experiment was repeated for α-AED and 17β-AED +/− PAPS and liver cytosol +/− by heating the liver cytosol at 45 ° C. for 15 minutes to inactivate DHEA sulfotransferase.
[0147]
SRC was used as a positive control. No activity was shown except for samples containing 17α-AED + PAPS and active liver cytosol.
[0148]
FIG. 5 shows, to the left, a positive control (SRC-1), a negative control and the conventional steroids 17α-AED, 17OH-pregnenolone and 3β, 7β, 17α-androstentriol + liver cytosol, followed by steroids. + Liver cytosol + PAPS. Significant differences in signal were found with the combination of 17α-AED + liver cytosol + PAPS. All other combinations, except the positive control, showed no significant response.
[0149]
Both α-AED and β-AED exist in the human body. The ratio is 1: 2 for human adults and 10: 1 for human fetuses. In rat experiments, a 1: 8 ratio was used.
[0150]
As noted above, U.S. Pat. No. 5,912,240, Loria describes the inhibition of apoptosis and growth of monocytes "independent of estrogen or androgen receptor" in tumor cell lines and of breast cancer cell lines. I have. However, there is no suggestion as to the mechanism, thus limiting the practical applicability of Loria's aforementioned teachings.
[0151]
Furthermore, the above-mentioned US Pat. No. 5,912,240 suggests that in any type of malignant cells, the antitumor effect depends on an increase in programmed cell death (apoptosis). However, the inventors of the present invention cannot confirm that the effect of α-AED on rat prostate cancer AT-1 depends on apoptosis in vivo. Similarly, the inventor of the present invention may show increased apoptosis in the human androgen refractory prostate cancer cell line DU-145 or PC-3 exposed to a concentration of 17α-AED at a concentration of 50-200 nM. I could show that I couldn't. Quite to the contrary, an apoptosis-suppressing effect could be demonstrated in these cell lines. Since there is no link between PPARγ activity and pure 17α-AED, the present inventors have predicted 17α-AED-3β sulfate dependent PPARγ activity. The experiment was repeated with this compound, with no effect.
[0152]
In this application, when discussing estrogen or androgen receptor dependence, tumor cells that do not function with both PC-3 and DU-145 are discussed. On the one hand, estrogen receptor β (ERβ) is expressed in both cell lines. Estrogen receptor α (ERα) is expressed only on PC-3. Treatment of both cell lines with ICI 172,780, which blocks both receptors, results in significant growth inhibition and cell death itself in PC-3 cells.
[0153]
This effect is significantly enhanced by the addition of 17α-AED-30 sulfate.
[0154]
DU-145 had no apparent effect. This may be due to a non-functional ERβ signaling pathway due to the P53 mutation present in this cell line, delayed or suppressed tumor cell death, or the fact that DU-145 has a very weak expression of PPARγ. Instead, it expresses PPARδ, which is not regulated by the PPARγ ligand 17α-AED-3β sulfate.
[0155]
Others have produced similar results with respect to the inhibition of growth of the same cell line treated with thiazolidinedione, and the inventors of the present invention have shown that PCs susceptible to treatment that block the estrogen receptor despite complete ER blockade The fact that the modulatory effect of the ligands of the present invention on PPARγ expression in P-3-3 could not be demonstrated, and the complete lack of the modulatory effect of our ligand on the expression of PPARγ and δ in DU-145, was due to the following discussion. Support.
[0156]
Two breast cancer cell lines, ER-positive MCF-7, p53 wild-type, and AR-positive and ER-negative, p53-mutated SKBR-3 (the latter strongly expresses c-erbB2) were expressed as 17α-AED-3β sulfate +/- Treated with HER2 antibody.
[0157]
Treatment of SKBR-3 at the same concentration used in the prostate cancer cell lines resulted in a moderate increase in cell death. However, no effect was seen with ER + MCF despite using a concentration four times that used in US Pat. No. 5,912,240. None of the breast cancers had any additive effect from c-erbB2-receptor blockade by the antibody. The P53 mutation in SKBR-3 did not prevent the growth inhibitory effect of 17α-AED-3β sulfate. MCF-7, which is ER-positive but contains wild-type P53, continued to proliferate despite treatment with 17α-AED-3β sulfate. Along with the results of the experiments with PC-3 and DU-145, this suggests that 17α-AED-3β sulfate interacts with the estrogen receptor, and that when used in tissues expressing the estrogen receptor, the estrogen receptor is considered. It strongly suggests that it is necessary to block this interaction with.
[0158]
Antitumor effects have been demonstrated in vivo in Dunning rat prostate tumors. This effect is initiated early, independent of effector cells of the immune system, such as T cells or macrophages, and independently of apoptosis. Antitumor effects are accompanied by inactivation in a patching pattern and significant changes in VEGF expression in tumor tissue. This strongly suggests an angiostatin mechanism. This was also demonstrated in the microscopic section of the tumor. Further investigation showed further down-regulation of cyclin D1 and β-catenin. This effect is neither exclusive to 17α-AED nor dependent on PPARγ activity associated with metabolites (17α-androstenediol-3β-sulfate), indicating that the same rat tumor was treated with 17α-OH-pregnenolone. Was supported by the discovery that a stronger antitumor effect was observed. This substance has no PPARγ activity, nor does its 3β-sulphate. To extend this study, a new steroid promoting 5-androstene 3β, 7β, 17α-triol was constructed. This steroid had no demonstrable PPARγ activity, nor did its 3β-sulfate. However, a down-regulating effect on VEGF, β-catenin and cyclin D1 was demonstrated. An up-regulation effect (PAI-1) on a plasminogen activator factor inhibitor that inhibits a plasminogen activator has been proposed as a mechanism of the effect of angiostatin steroids (angiostatin steroids) (Mechanism of action). of angiostatic stelloids: suppression of plasminogen activator activity via stimulation of plasminogen activatorJinti sol.
[0159]
Views on PPARγ activity on angiogenesis are different. According to some evidence, for angiogenesis rather than angiostatin, PAI-1 is down-regulated and thus PA is up-regulated. (Thiazolidinedions down-regulate PAI-1 expression in HUVEC: Apossible role for PPARγ in endfunctional function: Kato K et al: Biochem.
[0160]
β-catenin is part of the Wnt signaling pathway and has been shown to affect cell cycle regulation and entry. (Wnt-5a signaling in human mammary cells: Implications for the development of Breast Cancer: Marzieh Jonsson. Doctoral dissertation, Led.
[0161]
The concordance between antitumor effects and β-catenin reduction implies effects on growth regulatory genes along this pathway such as cyclin D1, c-myc and c-met.
[0162]
The importance of COX-2 has been pointed out, for example, not only in colon cancer but also in prostate cancer. The results of the present invention are inconsistent with possible co-regulation of COX-2 on the one hand and cyclin D1, β-catenin and VEGF on the other hand. In tumors treated with the mentioned steroids, COX-2 is simultaneously up-regulated with the effect of simultaneous down-regulation on cyclin D1, β-catenin and VEGF, and a clear inhibition of tumor growth is observed. There is a close relationship between PGEJ and PGE2 and increased angiogenesis.
(Prostaglandins up-regulate VEGF production through pathways in ways in differentiated U937 cells Biochem. Biophys.
[0163]
Thus, the divergent regulation of VEGF and COX-2 demonstrated by the present invention is very surprising and unpredictable.
[0164]
In tumors treated with 17β-AED, the growth stimulatory effect of this compound in the tumor was observed for more than one week before it was interrupted by the immunological antitumor response. This effect is independent of estrogen and androgen receptor activation. The AT-1 tumors used completely lack such receptors. Initial studies of β-catenin and COX-2 expression in tumors treated with 17β-AED were based on tumor studies after they were treated for 19 days, and tumors treated with 17α-AED This experiment was repeated for 17α-AED, 17β-AED, as it was not completely reliable because it was treated only for time.
[0165]
17OH pregnenolone and 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol. In this experiment, all tumors were exposed to steroids for 80 hours before the rats were sacrificed. Western blotting showed no down-regulation of COX-2 despite high tumor expression of β-catenin, VEGF and cyclin D1 treated with 17β-AED.
[0166]
Thus, despite the inverse regulation of β-catenin, VEGF and cyclin D1 on the one hand and COX-2 on the other hand, these three angiostatinic steroids regulate COX-2 in tumors treated with 17β-AED. No opposite regulation was found. Up-regulation of all four steroids up-regulates COX2 expression as compared to untreated control tumors.
[0167]
The usefulness of steroids S4 and S8 in human or other sources of prostate cancer with a functional AR signal, which is usually the case for cancers that show androgen-independent progression, is due to the use of 17α-AED or 17α-AAD itself. Perhaps very limited when considered. Because they are potential AR ligands, they readily convert to other potential AR ligands.
[0168]
For example, 17α-AED is converted to epitestosterone, dehydroepiandrosterone, androstenedione or estradiol.
A) Epitestosterone will stimulate transcriptional activity in the AR as the disease progresses.
B) When up-regulated, β-catenin will enhance the effect of potential ligands on AR. Androstenedione, androstendiol, dehydro-epiandrosterone, and also estradiol (all possible metabolites of 17α-AED), and common androgen receptor blockers, such as bicalutamide, increase transcriptional activity in the AR (Β-catenin affects androgen receptor activity and ligand specificity: Trucia CI et al; Cancer Research 60 (17): 4709-13, 2000 Sep1). .).
C) If the organism is deprived of other potential stimulators of androgen receptor transcription, the efficiency of 17α-AED-3β-sulfate will increase. The AR ligands mentioned will compete with sulfates, especially SRC-1 and ARA-70, which are PPARγ ligands for cofactors required for receptor activation. Overexpression of cyclin D1 is estimated to be 4.2% of prostate cancer from one source, but is probably more common and is an androgen independent by EGF receptor stimulation, a common mechanism for disease progression. Causes the up-regulation of cyclin D1. (Overexpression of cyclin D1 is rare in human prostate cancer: Gumbiner et al; Prostate. 38 (1): 40-5, Jan 1.) (Epidermal growth factor is a cyclin in human prostate cancer cell lines. Induce D1: Perry et al (Prory et al; Prostate. 35 (2): 117-24, 1998 May).
[0169]
(Role of metabolism in the activation of dehydro-epiandrosterone as a peroxizone proliferator. J. ed., 19, Ed. Pp. 150, p. 150, p. 150, pp. 150). Indirect evidence of PPARα activity has been demonstrated in vivo for 17β-AED but not in vitro. It was further demonstrated that 17β-AED or DHEA 3β-sulfate was more efficient than the corresponding native steroid in activating PPARα-linked genes. As androstenediols are closely related chemically, they appear to correspond to metabolic pathways. In addition, the hypothesis that PPARγ ligand activity depends on 3β sulfate of 17α-AED was suggested by the present inventors. This hypothesis is supported by the finding that ligand activity is dependent on the sulfate donor, PAPS, and that the primary source of steroid sulfotransferase, hepatic cytosol, needs to be present. DHEA sulfotransferase catalyzes the transfer of sulfate, especially to the 3β-position in 3β-OH steroids.
[0170]
Cell death that is apoptotic or necrotic when the cell line DU-145 or PC3 is exposed in vitro to 100 or 200 nM concentration of 17α-androstenediol, despite examining the cells for caspase 3 or 7 expression. No increase was seen. Staining with Evans blue to distinguish between live and dead cells also did not show an increase in cell mortality in the treated samples. At regular time intervals, the numbers of cells in untreated controls and culture flasks treated with 17α-AED were compared, but no decrease was seen in the cultures treated with 17α-AED, It can be said that these cell lines contradict the growth inhibitory effect of 17α-AED.
[0171]
The failure to show an increase in the number of cells deprived of trypan blue exclusion test also supports these findings.
[0172]
In vitro experiments with TZD on the human prostate cancer cell lines PC-3, LNCaP and DU-145 show a clear antitumor effect in PC-3, an intermediate effect in LNCaP, and DU-145 ( It has no effect in ligands of PPARγ (Troglitazone) and has potent antitumor effects on human prostate cancer in vitro and in vivo: (Kubota et al .: Cancer Research 58, 3344-3352). Ayg 1, 1998). However, this result took considerable time. In this experiment, no antitumor effect was observed in DU-145, which is in accordance with the TZD experiment cited above. The lack of this effect is explained by the discovery of the present invention for very weak expression of PPARγ in DU-145 cells. However, PPARδ is strongly expressed. No changes in PPARγ or PPARδ expression were observed in cultures treated with 17α-AED.
[0173]
In other experiments using PPARγ ligands and the same human prostate cancer cell line, increased cell death was demonstrated by using electron microscopy. This cell death was a non-apoptotic phenomenon (non-apoptotic cell death associated with arrest of the S phase of prostate cancer cells by PPARγ ligand 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2: Field and Rattle et al. al): Cell Growth & Differentiation, Vol. 11, 49-61, Jan 2000). No ligand activation was seen using 17α- or 17β-AED as a single substance in the receptor assay. Not surprisingly, weak PPARγ ligand activity was present in liver cytosol, which did not change with the addition of 17β-AED, but became prominent when 17α-AED was replaced with 17β-epimer. Together, this suggests that both epimers lack PPARγ agonisticity and that 17α-AED may have PPARγ antagonist function.
[0174]
The in vivo up-regulation of PPARγ, the differentiation seen with prolonged contact and the down-regulation of COX-2 in DunningAT-1 rat prostate cancer treated with 17α-AED, the expected effect of PPARγ ligands, is the PPARγ activity. This suggests that the capacity for metabolism is linked to the metabolite, sulfate type, rather than depending on 17α-AED itself.
[0175]
Unexpected results seen in Western blotting, that is, 17α-AED is attributed to up-regulation of PPARγ activity, at the same time COX-2 is up-regulated, while β-catenin is down-regulated by 17α-AED and 17β-AED May be described in the following way: In vivo, as a result of sulfotransferase activity in vivo, 17α-AED becomes sulfate, which explains the up-regulation of PPAR. 17β-AED becomes sulfate in the same way. The sulfate form of 17β-AED is a PPARα activating compound, and is expected to increase β-catenin, c-myc, c-met, and cyclin D1. (Effect on the expression of c-met, c-mic and PPAR-alpha in proliferators WY-14, 643 (Miller RT et al., Carcinogenesis 1996 (June 37, 1996); In accordance with this expectation, one would expect an increase in the growth rate that would actually be seen in DunningAT-1 tumors exposed to 17β-AED for 96 hours, which was repeated in animal experiments, with a constant 80 hour steroid exposure time being all This is one of the reasons why he was selected for his tumor.
[0176]
According to the theory of the present invention, Western blotting of these tumors showed that contact with 17β-AED did not result in down-regulation of β-catenin and cyclin D1. Down-regulation seen on contact with 17α-AED, 17 hydroxy-pregnenolone, 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol (the latter is not easily converted to 17α-AED due to the substituent at position 7) , And therefore also does not convert to 3β-sulfate) indicates that the latter two substances, when sulfated, do not convert to PPARγ-ligands and are therefore PPARγ-independent. The reduction in tumors seen after prolonged contact with 17β-AED was mainly due to the inactivated tumors containing stromal cells (which appeared to be microscopically so) and therefore more. Reflects less β-catenin.
[0177]
The down-regulation of COX-2 seen when 17β-AED and 17α-AED are combined can be the result of combined PPARα and γ activation or the result of PPARγ activation.
[0178]
Despite doubling COX-2 with known angiogenic properties, down-regulation and anti-tumor effects of VEGF were observed in tumors exposed to 17α-AED. The lack of antitumor effect of 3β-sulphate in the PC-3 cell line was demonstrated that the expression of PPARγ was essentially not linked to the antitumor effect. Lack of efficacy suggests binding of 17α-AED to the estrogen receptor, as growth inhibition and cell death occur only if the estrogen receptor is blocked.
[0179]
In experiments with Saccharomyces species transfected with the androgen receptor (AR), it was shown that cofactor ARA-70 plays an essential role when 17β-AED binds to and activates this receptor. Indicated. ARA-70 also played a cofactor role in PPARγ, amplifying the receptor ligand response. In addition, it itself was able to activate the receptor. The simultaneous presence of AR abolishes the activated PPARγ-ligand complex, suggesting competition for cofactors.
[0180]
The effect of ARA-70 in ER is negligible. (Identification of ARA70 as a ligand-enhanced coactivator for the PPARγ: Heinlein Cynthia et al .: J. of Biol. Chemistry, Vol. 17, 1964, 23, 164, Vol. 27, Vol. This points to some predictable results in androgen-controlled systems such as the gland.
[0181]
1. Testosterone, dihydrotestosterone and 17β-AED and possibly other ligands for 17α-AED, or at least its metabolites, epitestosterone, will counteract the effects of PPARγ-ligand. Since the properties of androgens are activated in these substances in the presence of ARA-70, as in the case of up-regulated β-catenin, flutamide and bicalutamide as a means of inhibiting AR activation are doubtful. Or at least incomplete.
[0182]
Androgen receptors are expressed in many organs. What is known about this receptor down-regulation is that it is partially affected by ERα which has a down-regulating effect. It is, of course, affected by reduced access to ligands such as testosterone or dihydrotestosterone. In addition, it is down-regulated by resveratrol and by activation of receptors for aromatic hydrocarbons.
[0183]
Other effects that activate the androgen receptor are signaling by EGF or HER-2 receptors as well as interleukin-6 (IL-6). However, signaling by IL-6 is inhibited by PPARγ.
Other factors could be inhibited by antibodies or by using melatonin to stop production of EGF-R ligands such as hydroxylinolenic acid.
[0184]
2. Since the activation of this receptor has many effects that characterize the cytokine, IL-4, that results in a T-helper 2 type response, the immune-enhancing effect of 17β-AED leading to an anti-tumor effect is due to the PPARγ-ligand Be countered. This is exactly the opposite of being useful for tumor immunotherapy. The concept of using 17α-AED followed by continuous treatment with 17β-AED is not at all useful for achieving antitumor effects. As demonstrated in the original experiment, this combination had no anti-tumor effect and even stimulated tumor growth.
[0185]
3. The presence of ERα and ERβ requires effective receptor blockade. Tamoxifen or raloxifene can be used for this purpose. It is not necessary to control the activity of this receptor, as it is a receptor that suppresses ERα activity by its ligand 3β, 17β-androstanediol, as is known today for controlling the function of ERβ. This is not always the case in tumor systems, as cell signaling may be defective.
[0186]
The up-regulation of VEGF by PDGF-BB conferred by its effect on c-fos from endothelial cells known to express PPARγ has been described (PPARγ agonists increase VEGF expression in human vascular smoother muscular mosquito musca lucifer, sculptor, etc.). (Yamakawa K et al), Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 May 19, 271 (3): 571-4). A decrease in MMP-9 was also observed after treatment with PPARγ ligand. Publications mainly report the up-regulation of VEGF by PPARγ. Strong up-regulation of VEGF in p53 mutant tumors has also been reported.
[0187]
In summary, the present invention provides evidence of growth inhibition observed in several neoplastic cell lines and different mechanisms supporting the anti-tumor effect seen in vivo in DunningAT-1 rat prostate cancer.
[0188]
First, the conversion of 17α-AED to sulfate by the action of sulfotransferase is a cause of cell growth inhibition, apoptosis or cell cycle arrest. This is provided by the action of PPARγ.
[0189]
This type of effect depends mainly on sulfotransferase activity, preferably on DHEA sulfotransferase present in the liver, adrenal glands, testes and small intestine. The presence in the placenta has not yet been proven, but there is a related pregnenolone sulfotransferase. Sulfotransfers with much lower substrate specificity are more likely to occur elsewhere, especially due to pregnenolone sulfotransferase and estrogen sulfotransferase, the latter being in many tissues. In order to maintain the activating effect of 17α-AEDS on PPARγ, it is important to reduce the sulfatase activity of the organ to be treated. Otherwise, this process deactivates 17α-AEDS. This can be avoided by administering an appropriate amount of Coumeate®, a non-estrogenic inhibitor of sulfatase.
[0190]
The inventors of the present invention have demonstrated growth inhibition in 3T3L1 fibroblasts treated with 17α-AED-3β-sulfate and in the ER-negative breast cancer cell line SKBR-3.
[0191]
In the human androgen refractory prostate cancer cell lines PC-3 and DU-145, significant cell death was seen in PC-3 cells when the estrogen receptor was blocked. However, no such effect was seen with DU-145. The latter probably relies on very low expression of PPARγ in this cell line, and is instead governed by strong expression of PPARδ.
[0192]
Other tumors known to express PPARγ and thus expected to respond to 17αAED 3β-sulfate are urethral cancers, gastric cancer, malignant tumors derived from endothelial cells, smooth muscle cells, colon cancer, choline. Some aspects of the pathology of ocular tissues affected by treatment with PPARγ ligands, such as carcinoma, adenocarcinoma of the lung, gastric carcinoma and liposarcoma, and sunspot and glaucoma cells.
[0193]
Monocytes and lymphocytes are pro-inflammatory cytokines (IL-1, TNFa, and IL-6) as well as cytokines with a T-helper 1 (T-helper1) profile in T cells (IFN-y, TNFP and IL-2). ) Receive down regulation in production. Instead, the IL-4 effect is enhanced consistent with stimulation of the T-helper 2 (T-helper2) -profile. This is further attributed to inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, placental tissue diseases, autoimmune inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis and Guillain-Barre syndrome. Disease and many others.
[0194]
The second mechanism of action is cell cycle regulation and angiogenesis inhibition, not mediated by PPARγ, as demonstrated by the stronger antitumor effect of 17OH pregnenolone than 17α-AED.
[0195]
The observation of the present invention on down-regulation of β-catenin after treatment with 17α-AED without 17β-AED in rat prostate cancer indicates that two androstenediol epimers may be a regulatory pair in this regard Suggests.
[0196]
The fact that this effect on 17α-AED is also present in 17αOH-pregnenolone, 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol, suggests that the latter, the sulfate, lacks PPARγ ligand activity, and thus has an anti-inflammatory effect on these substances. This suggests that the tumor effect is not dependent on PPARγ. All three substances significantly down-regulate β-catenin, a key factor in tumor growth. Increased expression of β-catenin may explain the growth stimulus first seen in rat prostate cancer exposed to 17β-AED in vivo. The effects of estrogen or androgen receptors are inadequate to explain, as DunningAT-1 rat prostate cancer has no measurable amounts of these three receptors.
[0197]
Other tumor effects due to effects on cell cycle entry and angiogenesis are also included in the invention.
[0198]
Thus, where growth inhibition and angiostatin effects are desired, 17OH pregnenolone or other steroids that do not directly stimulate PPARγ by conversion to sulfate are selected. With the use of an animal in an androgenic environment, the risk of PPARγ activity is further reduced by co-factor quenching. Androgens also block sulfotransferase activity.
[0199]
On the other hand, if PPARγ activation is desired, the androgen should be minimized and the sulfatase activity kept low by inhibitors such as Coumate® to reduce tumors due to increased expression of β-catenin or cyclin. Should be avoided. The latter possible sign increases EGF-R signaling.
[0200]
The data of the present invention show that the compounds of the present invention are therapeutically effective when used to treat benign and malignant tumors.
[0201]
The present invention further includes prodrugs of the compounds of the present invention. Such prodrugs are esters and other prodrugs in which the hydroxyl group is protected. Those protecting groups are removed during metabolism.
[0202]
The compounds of the present invention are administered in a therapeutically effective amount, preferably in an amount such that the serum concentration reaches 50-500 nM. The pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in the form of granules, tablets or injectable solutions containing the active ingredient together with a therapeutically inactive excipient.
[0203]
The composition may comprise from 0.5 to 99.5% by weight of the active drug.
[0204]
In order to obtain extended release of the compound, it may be administered in combination with a cationic dextran, or in the form of an amino-substituted compound in which one or more of carbon numbers 7, 11 and 16 have been substituted. .
[Brief description of the drawings]
[0205]
FIG. 1 is a photograph of an undifferentiated control and a tumor treated with 17α + 17β-AED.
FIG. 2 shows a Western blot discussed with respect to Table IV.
FIG. 3 illustrates the effects of 17α-AED, 17β-AED, 17αOH-pregnenolone and 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol on VEGF.
FIG. 4 shows a Western blot illustrating the effect of 17α-AED, 17α-OH pregnenolone and 17β-AED on expression of β-catenin, cyclin D1 and COX-2 in DunningAT-1 (rat prostate tumor).
FIG. 5 illustrates the ratio of cells in G1, S phase in untreated controls (CACD) to cells after treatment with 17α-AED (alphaA-D), described by representative examples. A comparison is shown.
FIG. 6 illustrates how 17α-AED, 170H pregnenolone, 5-androstene-3β, 7β, 17α and their respective 3β-sulfates were examined for PPARγ ligand activity in a ligand-induced coactivator assay. I do.

Claims (27)

Steroid derivatives selected from the group of compounds defined by the general formulas (I) and (II) below (the only difference between these formulas is the nature of the bond between carbon atoms 5 and 6)

(Wherein R ₁ O is at the β-position, R ₁ is a hydrogen atom; NO ₂ , SO ₃ H, OP (OH) ₃ , an acyl group, and an ester capable of forming an ester with an inorganic acid and an organic acid. Other groups; protecting groups such as CH ₃ , CH ₂ OMe, CH ₂ O-alkyl; other aliphatic chains, straight or branched, saturated or unsaturated or cyclic, for example saturated or aromatic or heterocyclic. A mixed cyclic aliphatic group containing up to 20 carbon atoms, wherein the substituents are selected from, for example, hydroxyl, halogen, amino, alkylamino, carboxylic acid or carboxylic ester groups;
R ₂ is R′O at the β-position of the carbon at the 7-position or a hydrogen atom in the case of formula II;
R ′ is independently R ₁ , R ₃ or R ₄ and is any one of the substituents defined for R ₁ above, R ₃ is in the α-position, a hydroxyl group, an acyl group or an alkoxy group R ″ O And
R "is independently R ₁ , R ₃ or R ₄ and is any one of the substituents defined for R ₁ above;
R ₄ is at the β-position, is a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an alkoxy group R ′ ″ O,
R ′ ″ is any group defined for R ₁ independently for R ₁ , R ₃ or R ₄ . ) The steroid derivative according to claim 1, wherein R ₁ , R ′ and / or R ″ form one or more ethers and / or esters with the steroid. The steroid derivative according to claim 1, wherein R ₄ is an acyl group in which a hydrogen atom or an alkoxy group or an alkyl group is bonded to the keto group. Wherein R ₄ is acetyl (CH ₃ CO) and the carbon of the ketone numbered 20 is any alkyl, alkenyl, aryl group, for example, branched or mixed aromatic and aliphatic side chains Having a heterocyclic or heteroaliphatic chain comprising, for example, cyclic saturated hydrocarbons and up to 20 carbons, including, for example, N, P, O, Si, F, S, Se, CN, halogen. The steroid derivative according to any one of the above items. The steroid is 5-androstene-3β, 7β, 17α-triol, 5-androstene-3β, 17α-diol-7-one, androstane-3β, 7β, 17α-triol and androstane-3β, 17α-triol. The steroid derivative according to any one of the preceding claims, selected from the group consisting of diol-7-one. An agent for the treatment and / or prevention of benign or malignant tumors, which can interrupt disturbances in Wnt-signals such as cell cycle arrest during G1 phase and / or angiostatin for use in the manufacture of a medicament for providing action, steroid derivatives (in formula selected from the group of the formula I or the compounds represented by II, all substituents other than R ₂ are as defined in claim 1 And R ₂ is in the α-position and R′O, O = or S =). An agent for the treatment and / or prevention of benign or malignant tumors, which is capable of interrupting interference in Wnt-signals, such as cell cycle arrest during G1 phase, and / or angiostatin Use of a 5-androstene-, 5-pregnenolone steroid derivative or a corresponding saturated derivative (androstane or pregnane-) in the manufacture of a medicament for providing an effect. The steroid derivative is a steroid derivative described by the following general formula (I) or (II) (the only difference between these formulas is the nature of the bond between carbon atoms 5 and 6)

In the formula, R ₁ O is in the β-position, and R ₁ is a hydrogen atom; NO ₂ , SO ₃ H, OP (OH) ₃ , an acyl group, and an ester capable of forming an ester with an inorganic acid and an organic acid. group; CH 3, _CH 2 _O-methyl, the protecting group such as CH 2 _O- alkyl; linear or branched chain, other aliphatic chain saturated or unsaturated or cyclic, such as saturated or aromatic or heterocyclic A mixed cyclic aliphatic group containing up to 20 carbon atoms, wherein the substituents are selected from, for example, hydroxyl, halogen, amino, alkylamino, carboxyl or carboxylic ester groups;
R ₂ is R′O at the α-position or β-position of the carbon at position 7, or R ₂ is O = or S =,
R ′ is independently R ₁ , R ₃ or R ₄ and is any one of the substituents described in the definition of R _{1 except} for the hydroxyl group in the formula (I), but R ₂ in the formula (II) Is a hydrogen atom, R ₃ is at the α-position, a hydroxyl group, an acyl group or an alkoxy group R ″ O,
R ″ is any one of the substituents defined for R ₁ above,
R ₄ is at the β-position, is a hydrogen atom, an alkyl group, an acyl group, an alkoxy group R ′ ″ O,
R '''is independently R _1, R ₂ or R _3, use of the which claim 7 is any of the groups defined R _1. R _{1, R} 'and / or R "use according to claim 8, wherein forming the steroid and one or more ether and / or ester. The use according to claim 8 or 9, wherein R ₄ is a hydrogen atom or an acyl group in which an alkoxy group or an alkyl group is bonded to the keto group. R ₄ is acetyl (CH ₃ CO) and the carbon of the ketone at position 20 is any alkyl, alkenyl, aryl group, such as a branched or mixed aromatic and aliphatic side chain, such as a cyclic 11. A saturated hydrocarbon as well as a heterocyclic or heteroaliphatic chain comprising up to 20 carbons, for example containing N, P, O, Si, F, S, Se, CN, one or more halogens. Use of the description. The steroid is 17-hydroxypregnenolone (17α-OH), Δ-5-androstene-3β, 17α-diol, Δ-5-androstene-3β, 7β, 17α-triol, 5-androstane-3β, 7β , 17α-triol, 5-androstane-3β, 17α-diol-7-one, 5-androstene-3β, 7α, 17α-triol, 5-androstane-3β, 7α, 17α-triol and 5-androstane The steroid derivative according to any one of claims 7 to 11, which is selected from the group consisting of -3β, 17α-diol. 13. Use according to any one of claims 7 to 12, wherein one or more pregnane- and / or androstane derivatives corresponding to the steroid are used for the manufacture of the medicament. 14. Use according to any one of claims 7 to 13, wherein said interruption is effected by down-regulation of cyclin Dl and [beta] -catein overexpression. 15. Use according to any one of claims 7-14, wherein said effect is essentially independent of a direct apoptotic effect on cells of said tumor. The agent may be a rectal cancer, other malignancies with overexpression of a genotype or phenotype of a factor belonging to the Wnt signaling pathway, such as lung cancer, melanoma, breast cancer, cellular lymphoma and other lymphomas, and small pieces of prostate cancer; Head and neck cancers of squamous cell origin, esophageal cancer, parathyroid cancer or adenomas characterized by up-regulation of the aforementioned factors, or other tumors characterized by disruption of Wnt signaling; diseases such as diabetic retinopathy 8. The method according to claim 7, which is for the treatment and / or prevention of at least one pathological condition selected from the group consisting of symptom governed by general angiogenesis, wet macular degeneration, corneal neovascularization and hemangioma. Use according to any one of claims 1 to 15. (A) Contacting 5-androstene-3β, 17α-diol or the corresponding saturated steroid, 5-androstane-3β, 17α-diol, sulfate donor, sulfotransferase and PAPS to form 5′-androstene-17α. -All-3β-sulphate (17α-AEDS) or 5-androstan-17α-ol-3β-sulphate (17α-AADS); and (b) the sulphated 17α-AEDS or 17α-AADS produced thereby. With a suitable carrier; thereby producing a medicament capable of acting as a ligand for peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ). The method according to claim 17, wherein the enzyme is DHEA-sulfotransferase or phenol sulfotransferase. The drug may be a urethral cancer, a stomach cancer, a small intestine cancer, a pancreatic cancer, a tumor, a cancer derived from endothelial cells, a leiomyosarcoma, a colon cancer, a choline carcinoma, an adenoma and a liposarcoma of the lung, and a lesion of an eye tissue. 19. The method according to claim 17 or 18, for treating and / or preventing a condition selected from the group consisting of, for example, sunspot and glaucoma cells. 5-Androstene in the manufacture of a medicament for attenuating the effects of androgens, deltaoids, estrogens, retinoids, HNF-4, COUPTF, RXR, RAR, progestins, lexinoids or cofactors thereof or ligands of PPAR-α, δ, γ Use of -17α-ol-3β-sulphate (17α-AEDS) or the corresponding androstane derivative 17α-AADS. Manufacture of immunomodulators, for example, medicaments for the treatment and / or prevention of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, joint or inflammatory bowel disease or diseases such as multiple sclerosis or Guillain Barre syndrome. Use of 5-androstene-17α-ol-3β-sulfate (17α-AEDS) and / or androstan-17α-ol-3β-sulfate for 20. A medicament produced by the method according to any one of claims 17 to 19, which is suitable for treating and / or preventing ocular inflammatory symptoms, or for dry macular. 20. A medicament produced by the method according to any one of claims 17 to 19, wherein a sustained effect has been achieved by inhibiting sulfatase activity by co-administration of an inhibitor such as Coumeate (R). The method according to any one of claims 17 to 19, wherein 5-androstene-17α-ol-3β-sulfate or androstan-17α-ol-3β-sulfate is synthesized. 9-cis retinoic acid, one or more corticosteroids or nuclear receptors such as androgens, deltaoids, estrogens, retinoids, HNF-4, COUPTF, RXR, RAR, progestins, lexinoids or cofactors thereof 20. A pharmaceutical composition produced by the method according to any one of claims 17 to 19, further comprising a ligand of PPAR-α, δ, γ, and having the same biological function to reduce the effect. 26. The pharmaceutical composition according to claim 25 which is an extended release composition comprising a cationic dextran. A method of treating a human suffering from a malignant or benign tumor with a therapeutically effective amount of a compound according to claims 1-6 and 7-16.

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