【０００１】
（技術分野）
本発明は、皮膚の状態及び外観を改善する化粧方法、並びに、皮膚の状態及び外観を改善する外用組成物を製造するためのピノレン酸の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
皮膚は、皮膚科学的な異常、苛酷な環境（風、エアコンディショニング、セントラルヒーティング）、または、正常な老化の進行（加齢老化）などによって衰える。皮膚が日光を浴びると皮膚の老化が加速される（光老化）。皮膚の外観及び状態を改善する化粧組成物及び化粧方法に対する要望は近年になって著しく増大した。
【０００３】
消費者は、小じわ、深いしわ、たるみ、色素沈着過剰及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を治療したりまたはその出現を延期させる“老化防止用”化粧品を益々求めるようになっている。
【０００４】
消費者が老化防止に加えて別の有益な効果を化粧品に求めることも少なくはない。また、“敏感肌”という概念は、敏感肌、乾燥肌及び／または剥落肌の外観及び状態を改善し、赤焼け肌および／または刺激肌を鎮静する化粧品に対する消費者の要望を喚起した。しみ、吹出物、汚点などを治療する化粧品も消費者の要望の対象になっている。
【０００５】
全身治療用の化粧用配合物にピノレン酸のような脂肪酸を使用することは公知である。例えば、松果油（ピノレン酸含有）が抗炎症作用を有し得ることは（例えばＷＯ９８／４３５１３から）公知であり、この物質は爪やすりの使用によって感染症が生じることを防ぐ目的で爪やすりをコートするために使用されている。
【０００６】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする課題）
我々はここに意外にも、明らかにされていなかったピノレン酸の別の特性を発見し、皮膚に外用塗布する化粧組成物中でこれらの特性はこれまで明らかにされていなかったスキンケア効果を与えるために有効であることを知見した。
【０００７】
我々はいまや、小じわ、深いしわ、たるみ、色素沈着過剰及び老人斑のような加齢老化または光老化に起因する正常な皮膚状態の有効な治療及び予防がピノレン酸またはその誘導体を含む化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。我々はまた、化粧組成物中にピノレン酸を使用すると、老化防止に加えて、敏感肌及び／または刺激肌の鎮静、皮膚の弾力的回復力の改善、皮膚の乾燥／剥落の抑制、皮膚の増殖過剰の抑制のような別の有益な効果が有利に得られることを知見した。
【０００８】
（課題を解決するための手段）
従って、本発明の第一の目的は、有効量のピノレン酸を含んでおりヒトの皮膚に塗布される外用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的によれば、ピノレン酸及び／またはその誘導体を含む外用組成物を皮膚に塗布することから成る、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える化粧方法が提供される。
【００１０】
本発明はまた、しわ、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈着の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の促進；関門形成の促進による皮膚の状態及び弾力的回復力の改善；乾燥肌及び剥落肌の治療；増殖過剰の抑制；刺激肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静；皮膚のきめ、滑らかさ及び／または緻密さの改善；から選択された少なくとも１つのスキンケア効果を与える外用組成物中のピノレン酸及び／またはその誘導体の使用を包含する。
【００１１】
従って、本発明による方法及びピノレン酸の使用は、肌の弾力性を改善して肌の滑らかさ及びしなやかさを向上させ、しわ及び老化肌の出現を抑制または延期し、皮膚の色を改善するという老化防止効果を与える。皮膚の外観、きめ及び状態の全般的な改善、特に輝き、透明さに関する改善が達成され、全体的に若々しい外観が得られる。本発明の方法及び使用はまた、敏感肌及び／または刺激肌の軽減及び鎮静に有益である。従って本発明方法は広い範囲のスキンケア効果を有利に提供する。
【００１２】
本文中に使用された“治療する”という用語は、しわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または刺激肌のような上述の皮膚状態の出現を抑制、延期及び／または予防すること、皮膚の質を全般的に強化すること、また、ひふのしわを減らし、皮膚の柔軟性、緻密さ、滑らかさ、しなやかさ及び弾力性を増すことによって皮膚の外観及びきめを改善することをその範囲内に包含する。本発明による化粧方法及びピノレン酸及びその誘導体の使用は、しわ、老化、光損傷、乾燥及び刺激の状態が既に生じている皮膚の治療に有効であり、あるいは、正常な老化／光老化過程による上記のような劣化性変化を予防または抑制するために若年者の治療にも有効であろう。
【００１３】
ピノレン酸は５、９及び１２位に３つの二重結合を有している不飽和長鎖（Ｃ１８）脂肪酸である。ピノレン酸は例えば松果油中に約２５％のレベルで見出されるであろう。
【００１４】
本発明はまた、ピノレン酸部分を含む遊離酸の誘導体を包含する。好ましい誘導体としては、エステル（例えば、レチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩、アンモニウム塩）のような酸のカルボキシル基の置換によって得られた誘導体、及び／または、アルファヒドロキシ及び／またはベータヒドロキシ誘導体のようなＣ１８炭素鎖の置換によって得られた誘導体がある。
【００１５】
トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖のピノレン酸置換基の全ての位置異性体が包含される。トリグリセリドは少なくとも１つのピノレン酸部分を含有していなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３つのエステル化可能な位置のうちで、１位または２位がピノレン酸でエステル化され、３位が別の脂質でエステル化されていてもよく、あるいは、グリセロール主鎖の１位及び３位がＰＡによってエステル化され、２位が別の脂質によってエステル化されていてもよい。
【００１６】
従って、ピノレン酸トリグリセリドに富む油も本発明に使用されるのに適しているであろう。
【００１７】
本明細書で“ピノレン酸”という用語を使用するとき、この用語が常にピノレン酸部分を含む誘導体も含意することを理解されたい。“ピノレン酸部分”という用語はピノレン酸誘導体の（１つまたは複数の）ピノレン酸脂肪アシル部分を意味する。
【００１８】
本発明に有効成分として使用されるピノレン酸は外用組成物中に有効量で存在する。通常は有効成分の全量が組成物の０．０００１重量％−５０重量％の量で存在する。より好ましい量は０．０１重量％−１０重量％であり、最小コストで最大効果をあげるための最も好ましい量は０．１重量％−５重量％である。
【００１９】
本発明に使用される組成物はまた、有効成分となるピノレン酸またはその誘導体の希釈剤、分散剤または担体として作用するための皮膚科学的／化粧的に許容されるビヒクルを含有する。ビヒクルは、水、液体もしくは固体の皮膚緩和剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのようなスキンケア製品に常用の物質を含み得る。
【００２０】
ビヒクルは通常は組成物の５重量％−９９．９重量％、好ましくは２５重量％−８０重量％を形成するであろう。また、別の化粧品アジュバントが存在しない場合には組成物のバランスを形成するであろう。
【００２１】
有効成分であるピノレン酸以外の皮膚に有益な別の特別な有効成分、例えば、日光遮断剤、別の皮膚美白剤、日焼け剤も含有され得る。ビヒクルは更に、香料、乳白剤、保存料、色素及びバッファも含有し得る。
【００２２】
本発明方法に使用される外用組成物を調製するために、スキンケア製品の常用の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で添合する。有効成分を先ず、組成物に添合すべき水または別の溶媒または液体の一部分に適宜溶解または分散させる。好ましい組成物は水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンである。
【００２３】
組成物は、クリーム、ジェルまたはローションなどのような慣用のスキンケア製品の形態でよい。組成物はまた、いわゆる“ウォッシュ−オフ”製品、例えば浴用もしくはシャワー用のジェルでもよく、これらは場合によっては、すすぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリー系を含有している。最も好ましくは、製品が“リーブ−オン”製品、即ち、皮膚に塗布されるが塗布直後のすすぎ段階の予定が不要な製品である。
【００２４】
組成物は従来同様に、ジャー、びん、チューブ、ロールボールなどのような適当な容器に適当な方法で包装できる。
【００２５】
本発明の方法は、治療を必要とする皮膚に毎日１回または数回行えばよい。皮膚の外観の改善は、皮膚の状態、本発明方法に使用した有効成分の濃度、組成物の使用量及び組成物の塗布頻度などに依存して通常は３−６カ月後に目に見えて明らかになる。一般に、少量の組成物、例えば０．１−５ｍｌの組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手、指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り拡げたり及び／または擦り込んだりする。組成物が“リーブ−オン”製品として処方されたかまたは“リンス−オフ”製品として処方されたかに従って、場合によっては後のすすぎ段階が必要である。
【００２６】
本発明をいっそう容易に理解できるように、以下の実施例を単なる代表として示す。
【００２７】
添付図面を参照しながら以下の実施例によって本発明を説明する。
【００２８】
図１及び図２は、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの正の調節に対するピノレン酸の効果を示す。
図３及び図４は、線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ｓＩＣＡＭ−１レベル及び線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ＰＧＥ２レベルに対するピノレン酸の効果をそれぞれ示す。
図５は、角質化エンベロープ形成に対するピノレン酸の効果を示す。
図６は、ケラチノサイト分化に対するピノレン酸の効果を示す。
【００２９】
（実施例）
以下の実施例はピノレン酸の老化防止効果を証明する。
【００３０】
プロコラーゲンＩ及びデコリンの正の調節をｉｎ ｖｉｖｏで惹起するためにピノレン酸の外用による治療を使用できることは我々の同時係属出願Ｎｏ．９９９０８９５６．８から公知である。
【００３１】
このため、該出願中の“比較目的のレチノイン酸の外用による治療後のｉｎ ｖｉｖｏ皮膚中のプロコラーゲンＩ及びデコリンの正の調節の同定”という見出しの付いた文節はその全部が参照によって本発明に含まれるものとする。
【００３２】
実施例１
ヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成を測定する手順
皮膚線維芽細胞ならし培地の調製
ヒト包皮の継代２（Ｐ２）の一次線維芽細胞を１２ウェルのプレートに１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、５％炭酸ガス及び４％酸素の雰囲気下、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ中で更に６０時間インキュベートした。次に線維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。被験試薬及びビヒクル対照を最終用量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中の細胞に３重複で加えて更に２４時間インキュベートした。この線維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するように液体窒素中で瞬間凍結し−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、引き続いてドットブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００３３】
皮膚線維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドットブロットアッセイ
（対照として）ビヒクルまたは被験試薬で処理した皮膚線維芽細胞から得られたならし培地のサンプルに２０ｍＭのジチオトレイトール（１：１０に希釈した２００ｍＭの予製液）と０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１：１００に希釈した１０％の予製液）を補充し、十分に混合し、次いで７５℃で２分間インキュベートした。１７５ｃｍ２容のフラスコに１０，０００細胞／ｃｍ２で播種した線維芽細胞から得られた純粋な線維芽細胞ならし培地を系列希釈することによってアッセイ標準を調製し、上述のように無血清ＤＭＥＭ中に維持した。
【００３４】
次にＢｉｏ−Ｒａｄの９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の指示通りに使用して予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜シートにアッセイサンプルを３重複で塗布した。ウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。重力によって培地を膜濾過（３０分間）した後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗液を重力によって膜濾過した（２×１５分間）。次にＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドに接続し、３回目及び最終回のＰＢＳ洗浄を吸引下で行った。装置を分解し、膜を取り出し、必要に応じて速やかに裁断してからブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。
【００３５】
デコリン分析用に調製した膜はＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥィーン２０でブロックし、プロコラーゲン−Ｉ分析用に調製した膜はＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳／０．０５％トゥィーン２０でブロックした。翌日、１：１０，０００に希釈したヒトプロコラーゲン−Ｉに対する第一抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトデコリンに対する第一抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）で膜を室温で２時間プローブした。その後、膜をＴＢＳ／０．０５％トゥィーン２０で洗浄し（３×５分間）、次いで必要に応じて１：１，０００に希釈した１２５Ｉ−コンジュゲート抗ラットまたは抗ウサギＦ（ａｂ′）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に室温で１時間インキュベートした。
【００３６】
上記の処理後、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥィーン２０で再度洗浄（３×５分間）した後、室温で風乾した。乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ蓄積リン光スクリーンに１６−１８時間露光した。この時間の経過後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用し、露光されたスクリーンをりん光イメージング装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ＳＦ）によって走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量ツールを使用するコンピューター支援画像解析によってドット強度を評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に対する種々の被験試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位に対する相対値として決定した。
【００３７】
以下の表１は、ヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成に対するピノレン酸の効果とピノレン酸の塗布量とを示す。結果を正規化するために、被験物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位に対する相対値として決定した。図１及び図２はもっと多いデータ点で得られた結果を示すグラフである。
【００３８】
比較のために、レチノイン酸を使用して試験し、ヒトの皮膚線維芽細胞中のデコリン合成に対するレチノイン酸の効果を評価した。試験に使用した試薬の濃度は細胞の生存率に全く影響しなかった。
【００３９】
【表１】
【００４０】
表１の結果は、ピノレン酸が対照に比べてヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの双方の合成について有意に正の調節を行うことを示す。
【００４１】
皮膚のデコリンレベルは皮膚の状態及び外観の改善に関係する。しわの消去及び光損傷肌の皮膚修復のような皮膚に有益な多くの効果に関係があるコラーゲンが皮膚に調節されて正しく沈着するためには皮膚のデコリンレベルの上昇が重要である。
【００４２】
実施例２
この実施例では皮膚線維芽細胞の炎症反応の軽減に対するピノレン酸の効果を測定する。
【００４３】
線維芽細胞ＰＧＥ ２ 及びＩＣＡＭアッセイ
ヒトの皮膚線維芽細胞による細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）及びＰＥＧ２の産生は炎症刺激物質ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）によって誘発され得る。ＰＭＡは細胞内で酸化ストレス及び炎症反応を誘発する外部ストレス物質を代表する。ｉｎ ｖｉｖｏ炎症モデルの作製にこのモデルを使用する。
【００４４】
ヒト包皮の継代２（Ｐ２）の一次線維芽細胞を３５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、５％炭酸ガスの雰囲気下、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間維持した。ジメチルスルホキシド（エタノール、最終濃度１％）中の新しい細胞培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清を補充）にピノレン酸を３重複で添加し、更に２４時間インキュベートした。１０ｎＭのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を培地に添加し、細胞を更に２４時間インキュベートした。対照は被験化合物もＰＭＡも全く含有していなかった。この線維芽細胞／培地を直ちに以下に記載のように分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で瞬間凍結し−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、引き続いてドットブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００４５】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイ：培養プレートを静かに振盪した後で各５０μｌ量の培養培地をＰＧＥ２アッセイのために採取した。培地中のＰＧＥ２レベルをＢｉｏｔｒａｋ ＰＧＥ２イムノアッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）によって測定した。アッセイは、限定量の固定されたＰＧＥ２特異的抗体に対するサンプル中の非標識ＰＧＥ２と一定量の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＰＧＥ２との競合に基づく。サンプル中の非標識ＰＧＥ２の濃度は、同時に得られた標準曲線に従って決定する。
【００４６】
ＩＣＡＭ−１アッセイ：培地を廃棄し、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞に、１５０μｌの０．１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を３分間添加して細胞膜からＩＣＡＭを抽出した。抽出物をエッペンドルフ遠心管に移して１，０００ｇで２分間遠心して細胞破片を除去した。１００μｌ量の上清をＩＣＡＭアッセイに使用した。可溶性ＩＣＡＭ−１を市販の酵素免疫検定用（ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で評価した。サンプル中のＩＣＡＭ−１の濃度を平行処理標準曲線に基づいて決定した。
【００４７】
ＰＧＥ２及びＩＣＡＭのアッセイから得られた結果を以下の表２に要約し、図３及び図４のグラフに示す。
【００４８】
【表２】
＊エンザイムイムノアッセイによって検出可能な最大レベル
【００４９】
上記結果は、ＰＭＡ（ホルボールミリスチルアセテート）のような炎症刺激物質で刺激された細胞がプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生によって測定される炎症反応の増加を生じたことを示す。ピノレン酸はたとえ０．１μｍのレベルであっても、ＰＧＥ２産生によって測定される炎症反応を劇的に減少させる。従って結果は、ピノレン酸が優れた抗炎症活性を有することを証明する。
【００５０】
上記の結果はまた、ＰＭＡで刺激された細胞はＩＣＡＭ産生量の増加を生じることを示す。ピノレン酸は、もう１つの炎症マーカーである細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）の産生量を減少させる。従ってこれらの結果もまた、ピノレン酸が優れた抗炎症作用を有することを証明する。
【００５１】
実施例３
ヒト包皮の継代３（Ｐ３）のケラチノサイトをダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ），０．０３ｍＭカルシウム中、９６ウェルプレートに４，０００細胞／ウェルで播種した。処理前に細胞を３日間増殖させた。処理ビヒクルはＤＭＳＯであった。４日間の処理後、細胞を採取し、１００μｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで細胞を１％のトリトンＸ１００、５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０、０．０２ｍＭのロイペプチン、０．０２ｍＭのペプスタチンで抽出した。次にＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＡアッセイ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓを使用し、６０μｌ／ウェルの抽出物でＤＮＡ濃度（ｎｇ／ウェル）を検定した。
【００５２】
次に細胞を２００μｌのＰＢＳ、次いで１００μｌの２％のＳＤＳで洗浄し、２０ｍＭのＤＴＴを各ウェルに添加した。次に、プレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートシーラー（ＩＣＮ）でシールし、気密給湿環境（即ち、給湿紙で裏張りした密閉サンドイッチボックス）中で６０℃で一夜インキュベートした。次に、Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用し、抽出物をＰＶＤＦ転移膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で重力濾過した。次に膜を蒸留水で洗浄した後、銀染色した（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎキット）。次に、染色したドットブロット膜をＰｈｏｒｅｔｉｘアレイソフトウェア（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して分析した。
【００５３】
結果
結果を以下の表３に示し、図５及び図６にグラフで表す。
【００５４】
【表３】
＊０に対する相対値。ＤＮＡ値の場合はＰ＜０．００１。
【００５５】
結果は、０．１−２０μＭのピノレン酸の塗布に応じて角質化エンベロープの産生がどの程度増加したか及びＤＮＡレベルがどのように低下したかを示す。これは、ケラチノサイト分化の増進を示す指標であり、ピノレン酸がｉｎ ｓｉｔｕの皮膚関門形成及び弾力的回復力を改善し、水の経皮的損失とケラチノサイト増殖とを抑制することを示唆する。
【００５６】
実施例４
以下の配合表は本発明の方法及び使用に適した水中油型クリームである。指定したパーセンテージは組成物の重量％である。
【００５７】
【表４】
＊Ｂｒｉｊ ５６はセチルアルコールＰＯＥ（１０）
＊＊Ａｌｆｏｌ １６ＲＤはセチルアルコール
【００５８】
実施例５
以下の配合表は本発明のエマルジョンクリームである。
【００５９】
【表５】
【００６０】
上記の実施例４及び５の外用組成物はいずれも、老化または光老化によって衰えた皮膚に塗布されたときにはしわ肌、老化肌、光損傷肌及び／または刺激肌の外観を改善するため、若年者の皮膚に塗布されたときには上記のような劣化性変化の予防または延期を助長するために有効な化粧的治療効果を提供する。組成物は慣用の方法で加工できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの正の調節に対するピノレン酸の効果を示す。
【図２】
デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの正の調節に対するピノレン酸の効果を示す。
【図３】
線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ｓＩＣＡＭ−１レベルに対するピノレン酸の効果を示す。
【図４】
線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ＰＧＥ２レベルに対するピノレン酸の効果を示す。
【図５】
角質化エンベロープ形成に対するピノレン酸の効果を示す。
【図６】
ケラチノサイト分化に対するピノレン酸の効果を示す。[0001]
(Technical field)
The present invention relates to a cosmetic method for improving skin condition and appearance, and to the use of pinolenic acid for producing an external composition for improving skin condition and appearance.
[0002]
(Background technology)
The skin deteriorates due to dermatological abnormalities, harsh environment (wind, air conditioning, central heating), or normal aging process (aging aging). When the skin is exposed to sunlight, the aging of the skin is accelerated (photoaging). The demand for cosmetic compositions and methods for improving the appearance and condition of the skin has increased significantly in recent years.
[0003]
Consumers provide "anti-aging" cosmetics that treat or postpone the visible signs of aging and photoaging of the skin, such as fine lines, deep wrinkles, sagging, hyperpigmentation and senile plaques. They are increasingly seeking.
[0004]
Consumers often demand other beneficial effects from cosmetics in addition to anti-aging. Also, the concept of "sensitive skin" has improved consumer appearance and condition of sensitive, dry and / or exfoliated skin, and has stimulated consumer demand for cosmetics to soothe red-burned and / or irritated skin. Cosmetics for treating spots, pimples, stains, and the like have also been targeted by consumers.
[0005]
It is known to use fatty acids such as pinolenic acid in cosmetic formulations for systemic treatment. For example, it is known (eg, from WO 98/43513) that pine nut oil (containing pinolenic acid) can have an anti-inflammatory effect, and this substance is used to prevent the use of nail files from causing infections. Has been used to coat.
[0006]
(Disclosure of the Invention)
(Problems to be solved by the invention)
We have here surprisingly discovered other properties of pinolenic acid that have not been revealed, and in cosmetic compositions topically applied to the skin, these properties provide a previously undisclosed skin care effect Was found to be effective.
[0007]
We now describe the effective treatment and prevention of normal skin conditions due to aging or photoaging such as fine lines, deep wrinkles, sagging, hyperpigmentation and senile plaques comprising a cosmetic composition comprising pinolenic acid or a derivative thereof. Was applied to the skin. We also note that the use of pinolenic acid in cosmetic compositions, in addition to anti-aging, soothes sensitive and / or irritated skin, improves elastic resilience of the skin, inhibits drying / exfoliation of the skin, It has been found that another beneficial effect, such as suppression of hyperproliferation, is advantageously obtained.
[0008]
(Means for solving the problem)
Accordingly, a first object of the present invention is to provide a topical composition containing an effective amount of pinolenic acid and applied to human skin.
[0009]
According to another object of the present invention, treatment / prevention of wrinkles, sagging, aging skin and / or photodamaged skin, comprising applying an external composition comprising pinolenic acid and / or a derivative thereof to the skin; Increase collagen deposition, increase skin decorin production, promote tissue repair; improve barrier condition and elastic resilience by promoting barrier formation; treat dry and exfoliated skin; suppress hyperproliferation; stimulated skin, red There is provided a cosmetic method for providing at least one skin care effect selected from calming of burnt skin and / or sensitive skin; improving skin texture, smoothness and / or compactness.
[0010]
The present invention also provides for the treatment / prevention of wrinkles, sagging, aging skin and / or photodamaged skin; increasing skin collagen deposition, increasing skin decorin production, promoting tissue repair; promoting skin formation by promoting barrier formation. Improve elastic resilience; treat dry and exfoliated skin; suppress hyperproliferation; calm irritated, burnt and / or sensitive skin; improve skin texture, smoothness and / or tightness And the use of pinolenic acid and / or derivatives thereof in topical compositions that provide at least one skin care effect.
[0011]
Therefore, the method and the use of pinolenic acid according to the present invention improve skin elasticity, improve skin smoothness and suppleness, suppress or prolong the appearance of wrinkles and aging skin, and improve skin color. The anti-aging effect is given. A general improvement in the appearance, texture and condition of the skin, especially with regard to shine, clarity, is achieved, giving an overall youthful appearance. The methods and uses of the present invention are also beneficial in reducing and soothing sensitive and / or irritated skin. Thus, the method of the present invention advantageously provides a wide range of skin care benefits.
[0012]
As used herein, the term "treat" refers to inhibiting, prolonging and / or preventing the appearance of the aforementioned skin conditions, such as wrinkled, aging, photodamaged and / or irritated skin, The scope is to generally enhance the quality and to improve the appearance and texture of the skin by reducing wrinkles and increasing the softness, tightness, smoothness, suppleness and elasticity of the skin Within. The cosmetic method according to the present invention and the use of pinolenic acid and its derivatives are effective for treating skin with wrinkles, aging, photodamage, dryness and irritation, or due to normal aging / photoaging process It would also be effective in treating young people to prevent or control such degenerative changes.
[0013]
Pinolenic acid is an unsaturated long-chain (C18) fatty acid having three double bonds at positions 5, 9, and 12. Pinolenic acid will be found, for example, in pine nut oil at a level of about 25%.
[0014]
The present invention also includes derivatives of the free acid that include a pinolenic acid moiety. Preferred derivatives include esters (eg, retinyl esters, triglyceride esters, monoglyceride esters, diglyceride esters, phosphoesters), amides (eg, ceramide derivatives), salts (eg, alkali metal and alkaline earth metal salts, ammonium salts) ), And / or derivatives obtained by substitution of the C18 carbon chain, such as alpha-hydroxy and / or beta-hydroxy derivatives.
[0015]
In the case of triglyceride ester derivatives, all regioisomers of the pinolenic acid substituent of the glycerol backbone are included. Triglycerides must contain at least one pinolenic acid moiety. For example, among the three esterifiable positions of the glycerol main chain, the first or second position may be esterified with pinolenic acid and the third position may be esterified with another lipid, or the glycerol main chain. 1 and 3 may be esterified by PA and position 2 may be esterified by another lipid.
[0016]
Therefore, oils rich in pinolenic triglyceride would also be suitable for use in the present invention.
[0017]
When the term "pinolenic acid" is used herein, it is to be understood that this term also always includes derivatives containing a pinolenic acid moiety. The term “pinolenic acid moiety” means the fatty acyl moiety (s) of pinolenic acid derivative (s).
[0018]
The pinolenic acid used as an active ingredient in the present invention is present in the composition for external use in an effective amount. Usually the total amount of active ingredient will be present in an amount of from 0.0001% to 50% by weight of the composition. The more preferred amount is from 0.01% to 10% by weight, and the most preferred amount for maximal effect at minimum cost is from 0.1% to 5% by weight.
[0019]
The composition used in the present invention also contains a dermatologically / cosmetically acceptable vehicle to act as a diluent, dispersant or carrier for the active ingredient pinolenic acid or a derivative thereof. The vehicle may include substances commonly used in skin care products such as water, liquid or solid emollients, silicone oils, emulsifiers, solvents, humectants, thickeners, powders, propellants and the like.
[0020]
The vehicle will usually form from 5% to 99.9%, preferably from 25% to 80% by weight of the composition. It will also form a balance of the composition in the absence of another cosmetic adjuvant.
[0021]
Other special active ingredients that are beneficial to the skin other than the active ingredient pinolenic acid may also be included, for example, sunscreens, other skin lightening agents, tanning agents. The vehicle may also contain flavors, opacifiers, preservatives, dyes and buffers.
[0022]
Conventional methods of preparing skin care products may be used to prepare the topical compositions used in the method of the present invention. Generally, the active ingredient is incorporated into a dermatologically acceptable carrier in a conventional manner. The active ingredient is first dissolved or dispersed in water or another solvent or liquid, as appropriate, to be incorporated into the composition. Preferred compositions are oil-in-water emulsions or water-in-oil emulsions.
[0023]
The composition may be in the form of a conventional skin care product such as a cream, gel or lotion. The composition may also be a so-called "wash-off" product, for example a bath or shower gel, which optionally contains a delivery system which promotes the adhesion of the active ingredient to the skin during the rinse. . Most preferably, the product is a "leave-on" product, i.e., a product that is applied to the skin but does not require a scheduled rinsing step immediately after application.
[0024]
The composition can be conventionally packaged in any suitable container, such as a jar, bottle, tube, roll ball, or the like, in any suitable manner.
[0025]
The method of the present invention may be performed once or several times daily on the skin in need of treatment. The improvement in skin appearance is usually visibly apparent after 3-6 months, depending on the condition of the skin, the concentration of the active ingredient used in the method of the present invention, the amount of the composition used and the frequency of application of the composition. become. Generally, a small amount of the composition, for example 0.1-5 ml of the composition, is applied to the skin from a suitable container or applicator and spread and / or rubbed on the skin using a hand, finger or suitable device. I do. Depending on whether the composition was formulated as a "leave-on" product or as a "rinse-off" product, a subsequent rinsing step may be necessary.
[0026]
In order that the invention may be more readily understood, the following examples are given by way of representation only.
[0027]
The following examples illustrate the invention, with reference to the accompanying drawings.
[0028]
Figures 1 and 2 show the effect of pinolenic acid on the positive regulation of decorin and procollagen-I.
3 and 4 show the effect of pinolenic acid on PMA-stimulated sICAM-1 levels in fibroblasts and PMA-stimulated PGE2 levels in fibroblasts, respectively.
FIG. 5 shows the effect of pinolenic acid on keratinization envelope formation.
FIG. 6 shows the effect of pinolenic acid on keratinocyte differentiation.
[0029]
(Example)
The following examples demonstrate the anti-aging effect of pinolenic acid.
[0030]
The topical application of pinolenic acid can be used to elicit the positive regulation of procollagen I and decorin in vivo in our co-pending application no. No. 99908956.8.
[0031]
For this reason, the section headed "Identifying positive regulation of procollagen I and decorin in in vivo skin after topical treatment with retinoic acid for comparative purposes" in this application is incorporated herein by reference in its entirety. Shall be included.
[0032]
Example 1
Procedure for measuring the synthesis of procollagen-I and decorin in human dermal fibroblasts
It if skin fibroblasts were seeded at 10,000 cells / cm 2 primary fibroblasts 12-well plates at passage 2 (P2) of the medium of the preparation <br/> human foreskin, 5% carbon dioxide and 4 Maintained for 24 hours in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum under an atmosphere of% oxygen. After this time, the cells were washed with serum-free DMEM and then incubated for a further 60 hours in fresh serum-free DMEM. Next, the fibroblast monolayer was washed again with serum-free DMEM. Test reagents and vehicle control were added in triplicate to cells in fresh serum-free DMEM at a final volume of 0.4 ml / well and incubated for an additional 24 hours. The fibroblast conditioned media was analyzed immediately or snap frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C for later analysis. The cells were then counted and the data obtained from the subsequent dot blot analysis was normalized to cell numbers.
[0033]
Dot blot assay for procollagen-I and decorin proteins in dermal fibroblast conditioned medium (as control) 20 mM dithiothreitol in conditioned medium samples obtained from dermal fibroblasts treated with vehicle or test reagents (200 mM stock solution diluted 1:10) and 0.1% sodium dodecyl sulfate (10% stock solution diluted 1: 100), supplement well, then mix at 75 ° C. Incubated for minutes. Assay standards were prepared by serial dilution of pure fibroblast conditioned medium obtained from fibroblasts seeded at 10,000 cells / cm 2 in 175 cm 2 flasks and serum-free DMEM as described above. Kept inside.
[0034]
The assay sample was then applied in triplicate to a pre-wetted Immobilon-P transfer membrane sheet using a Bio-Rad 96-well Bio-Dot apparatus as per the manufacturer's instructions. About 200 μl of medium was applied per well. After membrane filtration of the medium by gravity (30 minutes), the membrane was washed twice with PBS (200 μl). These PBS washes were membrane filtered by gravity (2 × 15 minutes). Next, the Bio-Dot apparatus was connected to a vacuum manifold, and the third and final PBS washing was performed under suction. The device was disassembled, the membrane was removed, cut quickly as needed, then placed in blocking buffer and maintained at 4 ° C. overnight.
[0035]
The membrane prepared for decorin analysis was blocked with 3% (w / v) BSA / 0.1% (v / v) Tween 20 in PBS, and the membrane prepared for procollagen-I analysis was 5% in PBS. % (W / v) skim milk powder / 0.05% Tween 20. The next day, membranes were diluted with a first antibody against human procollagen-I (MAB 1912; rat monoclonal; Chemicon Int. Inc., Temecula, Calif.) Or a first antibody against human decorin (rabbit polyclonal; Biogenesis) diluted 1: 10,000. Probed at room temperature for 2 hours. Thereafter, the membrane was washed with TBS / 0.05% Tween 20 (3 × 5 minutes) and then 125 I-conjugated anti-rat or anti-rabbit F (ab ′) diluted 1: 1,000 as needed. Incubated with 2 fragments (Amersham) for 1 hour at room temperature.
[0036]
After the above treatment, the Immobilon strip was washed again with TBS / Tween 20 (3 × 5 minutes) and air-dried at room temperature. The dried film was wrapped in cellophane and exposed to a Molecular Dynamics storage phosphor screen for 16-18 hours. After this time, the exposed screen was scanned by a phosphorescent imaging device (Molecular Dynamics Phosphorimager SF) using ImageQuant ™ software. Dot intensity was assessed by computer-assisted image analysis using quantification tools in ImageQuant ™ , normalized to cell number, and the effect of various test reagents on decorin and procollagen-I synthesis was compared to 100 arbitrary units of vehicle-treated controls. It was determined as a relative value.
[0037]
Table 1 below shows the effect of pinolenic acid on the synthesis of procollagen-I and decorin in human dermal fibroblasts and the amount of pinolenic acid applied. To normalize the results, the effect of the test substance was determined relative to 100 arbitrary units of the vehicle treated control. 1 and 2 are graphs showing the results obtained with more data points.
[0038]
For comparison, a test was performed using retinoic acid to evaluate the effect of retinoic acid on decorin synthesis in human dermal fibroblasts. The concentration of the reagent used in the test had no effect on cell viability.
[0039]
[Table 1]
[0040]
The results in Table 1 show that pinolenic acid significantly modulates the synthesis of both procollagen-I and decorin in human dermal fibroblasts compared to controls.
[0041]
Skin decorin levels are associated with improved skin condition and appearance. Elevated skin decorin levels are important for the regulation and proper deposition of collagen in the skin, which is involved in many beneficial effects on the skin, such as wrinkle elimination and skin repair of light damaged skin.
[0042]
Example 2
This example measures the effect of pinolenic acid on reducing the inflammatory response of dermal fibroblasts.
[0043]
Production of fibroblasts PGE 2 and ICAM Assay <br/> intercellular adhesion molecule by skin fibroblasts of human (ICAM) and PEG 2 may be induced by the inflammatory stimulator PMA (phorbol myristate acetate). PMA represents an external stress agent that induces oxidative stress and inflammatory responses in cells. This model is used to generate an in vivo inflammation model.
[0044]
Primary fibroblasts of human foreskin passage 2 (P2) were seeded at 35,000 cells / well in a 96-well plate and modified with Dulbecco supplemented with 10% fetal bovine serum under an atmosphere of 5% carbon dioxide. Maintained in Eagle's medium (DMEM) for 24 hours. Pinolenic acid was added in triplicate to fresh cell media (supplemented with DMEM, 10% fetal calf serum) in dimethyl sulfoxide (ethanol, 1% final concentration) and incubated for an additional 24 hours. 10 nM phorbol myristate acetate (PMA) (Sigma) was added to the medium and the cells were incubated for an additional 24 hours. Controls contained no test compound and no PMA. The fibroblasts / medium were analyzed immediately as described below or snap frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C for later analysis. The cells were then counted and the data obtained from the subsequent dot blot analysis was normalized to cell numbers.
[0045]
Prostaglandin E2 (PGE 2 ) assay: A volume of 50 μl of culture medium was removed for the PGE 2 assay after gently shaking the culture plate. Was measured by the PGE 2 levels in the media Biotrak PGE 2 immunoassay kit (Amersham, UK). Assay is based on the limited amount of fixed PGE 2 specific antibody competition with unlabeled PGE 2 in the sample with an amount of horseradish peroxidase-labeled PGE 2 for. Unlabeled PGE 2 concentration in the sample is determined according to a standard curve obtained at the same time.
[0046]
ICAM-1 assay: Medium was discarded and cells were washed with Dulbecco PBS. ICAM was extracted from the cell membrane by adding 150 μl of 0.1% Triton X-100 (Sigma) to the washed cells for 3 minutes. The extract was transferred to an Eppendorf centrifuge tube and centrifuged at 1,000 g for 2 minutes to remove cell debris. A 100 μl volume of the supernatant was used for the ICAM assay. Soluble ICAM-1 was evaluated with a commercially available immunoenzymatic assay kit (R & D Systems). The concentration of ICAM-1 in the sample was determined based on a parallel run standard curve.
[0047]
The results obtained from the PGE 2 and ICAM assays are summarized in Table 2 below and shown in the graphs of FIGS.
[0048]
[Table 2]
* Maximum level detectable by enzyme immunoassay
The above results indicate that cells stimulated with an inflammatory stimulant such as PMA (phorbol myristyl acetate) caused an increased inflammatory response as measured by prostaglandin E2 (PGE 2 ) production. Pinolenic acid even at 0.1μm level, dramatically reduces the inflammatory response as measured by production of PGE 2. Thus, the results demonstrate that pinolenic acid has excellent anti-inflammatory activity.
[0050]
The above results also indicate that cells stimulated with PMA result in increased ICAM production. Pinolenic acid reduces the production of another marker of inflammation, intercellular adhesion molecule (ICAM). Thus, these results also demonstrate that pinolenic acid has an excellent anti-inflammatory effect.
[0051]
Example 3
Keratinocytes from human foreskin passage 3 (P3) were seeded at 4,000 cells / well in 96-well plates in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 0.03 mM calcium. Cells were grown for 3 days before treatment. The treatment vehicle was DMSO. After four days of treatment, cells were harvested and washed three times with 100 μl of phosphate buffered saline (PBS). The cells were then extracted with 1% Triton X100, 50 mM Tris, pH 8.0, 0.02 mM leupeptin, 0.02 mM pepstatin. The DNA concentration (ng / well) was then assayed using 60 μl / well extract using the Pico Green DNA Assay, Molecular Probes.
[0052]
The cells were then washed with 200 μl of PBS followed by 100 μl of 2% SDS and 20 mM DTT was added to each well. The plates were then sealed with a Titertek plate sealer (ICN) and incubated overnight at 60 ° C. in an airtight humidified environment (ie, a closed sandwich box lined with humidifying paper). The extract was then gravity filtered through a PVDF transfer membrane (Bio-rad) using a Dot-Blot apparatus (Bio-rad). Next, the membrane was washed with distilled water and stained with silver (Bio-rad Silver Stain kit). Next, the stained dot blot membranes were analyzed using Holeix array software (Phoreix International).
[0053]
Results The results are shown in Table 3 below and are represented graphically in FIGS.
[0054]
[Table 3]
* Relative to 0. P <0.001 for DNA values.
[0055]
The results show how production of the keratinized envelope was increased and how DNA levels were reduced in response to application of 0.1-20 μM pinolenic acid. This is an indicator of increased keratinocyte differentiation, suggesting that pinolenic acid improves in situ skin barrier formation and elastic resilience, and suppresses percutaneous water loss and keratinocyte proliferation.
[0056]
Example 4
The following recipe is an oil-in-water cream suitable for the method and use of the present invention. The specified percentages are by weight of the composition.
[0057]
[Table 4]
* Brij 56 is cetyl alcohol POE (10)
** Alfol 16RD is cetyl alcohol.
Example 5
The following recipe is the emulsion cream of the present invention.
[0059]
[Table 5]
[0060]
Both topical compositions of Examples 4 and 5 above improve the appearance of wrinkled, aging, photodamaged and / or irritated skin when applied to skin that has been weakened by aging or photoaging, and When applied to the skin of an individual, it provides an effective cosmetic therapeutic effect for promoting prevention or postponement of the above-mentioned degradative changes. The composition can be processed in a conventional manner.
[Brief description of the drawings]
FIG.
Figure 4 shows the effect of pinolenic acid on positive regulation of decorin and procollagen-I.
FIG. 2
Figure 4 shows the effect of pinolenic acid on positive regulation of decorin and procollagen-I.
FIG. 3
4 shows the effect of pinolenic acid on PMA-stimulated sICAM-1 levels in fibroblasts.
FIG. 4
Figure 4 shows the effect of pinolenic acid on PMA stimulated PGE2 levels in fibroblasts.
FIG. 5
Figure 4 shows the effect of pinolenic acid on keratinization envelope formation.
FIG. 6
3 shows the effect of pinolenic acid on keratinocyte differentiation.
