JP2004518615A - Indole compounds useful for treating cancer - Google Patents

Abstract

｛式中、Ｒ^１は、低級アルキル、低級アルケニル、（ヒドロキシ）低級アルキル、低級アルキニル、フェニル、ベンジルまたは２−チエニルであり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５は、同一または相違して各々水素または低級アルキルであり、各Ｒ^６は、独立的に水素、低級アルキル、ヒドロキシ、（ヒドロキシ）低級アルキル、低級アルコキシ、ベンジルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ニトロまたはハロであり、ｎは、１−３であり、Ｒ^７は、水素、低級アルキルまたは低級アルケニルであり、Ｘは、オキシまたはチオであり、Ｙは、カルボニル（ＣＨ_２）_１−３、（ＣＨ_２）_１−３Ｃ（Ｏ）または（ＣＨ_２）_１−３ＳＯ_２であり、Ｚは、（ω−（４−ピリジル）（Ｃ_２−Ｃ_４アルコキシ）、（ω−（（Ｒ^８）（Ｒ^９）アミノ）（Ｃ_２−Ｃ_４アルコキシ）［うち、Ｒ^８ および Ｒ^９ は各々Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルまたはＮと一緒に１−３Ｎ（Ｒ^８）、Ｓもしくは非過酸化物Ｏを含む５または６員の複素環である］、（ω−（ＯＨ）（Ｃ_２−Ｃ_４））アルコキシのアミノ酸エステル、Ｎ（Ｒ^８）ＣＨ（Ｒ^８）ＣＯ_２Ｈ、１’−Ｄ−グルクロニルオキシであり、Ｙ−Ｚは、（ＣＨ_２）_１−３Ｒ^８［うち、Ｒ^８は、ＯＨ、（Ｃ_２−Ｃ_４）アシルオキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＰＯ_４Ｈ_２、Ｎ（ＮＯ）（ＯＨ）、ＳＯ_２ＮＨ_２、ＰＯ（ＯＨ）ＮＨ_２またはテトラゾール］である｝。The present invention relates to compounds of formula (I) below and their pharmaceutically acceptable salts useful for inhibiting cancer cells or sensitizing cancer cells to chemotherapeutic agents, radiation or other anti-cancer treatments. About:
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Wherein R ¹ is lower alkyl, lower alkenyl, (hydroxy) lower alkyl, lower alkynyl, phenyl, benzyl or 2-thienyl, and R ² , R ³ , R ⁴ , and R ⁵ are the same or different And each R ⁶ is independently hydrogen, lower alkyl, hydroxy, (hydroxy) lower alkyl, lower alkoxy, benzyloxy, lower alkanoyloxy, nitro or halo; -3, R ⁷ is hydrogen, lower alkyl or lower alkenyl, X is oxy or thio, and Y is carbonyl (CH ₂ ) _1-3 , (CH ₂ ) _1-3 C (O ) Or (CH ₂ ) _1-3 SO ₂ , wherein Z is (ω- (4-pyridyl) (C ₂ -C ₄ alkoxy), (ω-((R ⁸ ) (R ⁹ ) Mino) (C ₂ -C ₄ alkoxy) wherein R ⁸ and R ⁹ together with H, (C ₁ -C ₃ ) alkyl or N together with 1-3N (R ⁸ ), S or non-peroxide O And (ω- (OH) (C ₂ -C ₄ )) alkoxy amino acid ester, N (R ⁸ ) CH (R ⁸ ) CO ₂ H, 1′-D -Glucuronyloxy, wherein YZ is (CH ₂ ) _1-3 R ⁸ [where R ⁸ is OH, (C ₂ -C ₄ ) acyloxy, SO ₃ H, PO ₄ H ₂ , N (NO) (OH), SO ₂ NH ₂ , PO (OH) NH ₂ or tetrazole].

Description

式中、Ｒ^１は、低級アルキル、低級アルケニル、（ヒドロキシ）低級アルキル、低級アルキニル、フェニル、ベンジルまたは２−チエニルであり、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５は、同一または相違して各々水素または低級アルキルであり、各Ｒ^６は、独立的に水素、低級アルキル、ヒドロキシ、（ヒドロキシ）低級アルキル、低級アルコキシ、ベンジルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ニトロまたはハロであり、ｎは、１−３であり、Ｒ^７は、水素、低級アルキルまたは低級アルケニルであり、Ｘは、オキシまたはチオであり、Ｙは、カルボニル（ＣＨ_２）_１−３、（ＣＨ_２）_１−３Ｃ（Ｏ）または（ＣＨ_２）_１−３ＳＯ_２であり、Ｚは、（ω−（４−ピリジル）（Ｃ_２−Ｃ_４アルコキシ）、（ω−（（Ｒ^８）（Ｒ^９）アミノ）（Ｃ_２−Ｃ_４アルコキシ）［うち、Ｒ^８ および Ｒ^９ は各々Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルまたはＮと一緒に１−３Ｎ（Ｒ^８）、Ｓもしくは非過酸化物Ｏを含む５または６員の複素環である］、（ω−（ＯＨ）（Ｃ_２−Ｃ_４））アルコキシ、Ｎ（Ｒ^８）ＣＨ（Ｒ^８）ＣＯ_２Ｈ、１’−Ｄ−グルクロニルオキシのアミノ酸エステルであり、Ｙ−Ｚは、（ＣＨ_２）_１−３Ｒ^８［うち、Ｒ^８は、ＯＨ、（Ｃ_２−Ｃ_４）アシルオキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＰＯ_４Ｈ_２、Ｎ（ＮＯ）（ＯＨ）、ＳＯ_２ＮＨ_２、ＰＯ（ＯＨ）ＮＨ_２またはテトラゾール］である。
【００１１】
本発明はまた、癌細胞の成長を阻害し、および／または癌細胞を化学療法剤による阻害に敏感にする治療方法に関する。この方法は、癌細胞を有効量の式（Ｉ）の化合物に、好ましくは薬学的に許容される担体と組合せて、接触せしめることを含む。本発明化合物を用いて、ヒト癌患者などの癌罹患の哺乳動物を処置できる。好ましくは、本発明化合物を、アルキル化剤や抗アンドロゲンなどの化学療法剤、放射線および／または他の抗癌治療法と合わせて、投与する。
【００１２】
本発明化合物は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む白血病および骨髄癌などの造血性癌に対して効果がある。本発明化合物は予想外にも、高レベルの核ホルモン受容体、ペルオキシソム増殖物質活性化受容体−γ（ＰＰＡＲ−γ）、および／または高レベルの抗アポトーシスタンパク質、Ｍｃｌ−１および／またはＢａｇ−１を発現する癌細胞に対して効果がある。このような癌細胞は、少なくともいくつかの型の前立腺癌細胞を含む。
【００１３】
活性ＰＰＡＲ−γは、コアクチベーター・タンパク質（ＣＢＰ）、ホルモン抵抗性前立腺癌において過発現されることが知られているアンドロゲン受容体のコアクチベーターを結合する。従って、本発明化合物は、通常の抗アンドロゲン治療の効果を高め、前立腺癌の拡大を阻害するのに作用し得る。
【００１４】
本発明は、ラセミのエトドラクが精製ＣＬＬまたはＭＭ細胞の生存能を、正常な末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の生存能を阻害しない濃度で、阻害することを本発明者が見出したことに基づく。予想外にも、エトドラクのＲ（−）エナンチオマーがＳ（＋）エナンチオマーと同様にＣＬＬ細胞に対して毒性であることが分かった。次いで、エトドラクがフルダラビンおよび２−クロロアデノシンと相乗的に相互作用して、化学療法剤単独では不活性である濃度でＣＬＬ細胞を殺すことが分かった。最後に、両Ｒ（−）およびＳ（＋）エトドラクが多くの前立腺癌細胞系を阻害することが分かった。さらに、Ｒ（−）エナンチオマーがＳ（＋）「抗炎症性」エナンチオマーと少なくとも同等に効果的であった。このことは予想外であった。なぜなら、エトドラクのＲ（−）エナンチオマーが意味のある抗炎症活性を有していないし、またＳ（＋）エナンチオマーにインビボで有意な量に転換されないからである。上記のように、他のＲ−２−アリールプロピオン酸塩ＮＳＡＩＤのＲ−エナンチオマーは「活性」抗炎症性Ｓ−エナンチオマーにインビボで転換され、ＮＳＡＩＤのプロドラッグとして機能する。
【００１５】
阻害の程度は、細胞系によるＰＰＡＲ−γの発現レベルに非常に関係する。高いレベルのＰＰＡＲ−γ発現を有する細胞系が、比較的低いレベルでＰＰＡＲ−γを発現する細胞系よりも非常に効果的に阻害される。このことは参考例に開示する。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物は、いくつかのＮＳＡＩＤがもたらすシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害による望ましくない生物活性を発揮しないような本発明の治療法に好ましい。しかし、式（Ｉ）の好ましい化合物は、顕著な抗炎症活性を示さないので、当技術分野でＮＳＡＩＤとみるべきでない。
【００１７】
本発明はまた、前立腺癌などの特定の癌患者が式（Ｉ）の化合物による処置に適用できるかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、癌細胞を単離し、ＰＰＡＲ−γおよび／またはＭｃｌ−１および／またはＢａｇ−１の相対的レベルをインビトロで、式（Ｉ）の化合物による処置に感受的であることが知られている前立腺癌細胞系などの癌細胞系におけるレベルと比較して評価することを含む。
【００１８】
本発明はまた、前立腺癌などの癌細胞を阻害する試験薬剤の能力を決定する方法を提供する。この方法は、前立腺癌細胞系などに由来する癌細胞の集団を該薬剤に接触せしめ、薬剤がＰＰＡＲ−γの発現を増加するか、またはＭｃｌ−１および／またはＢａｇ−１の発現を減少するか（または両者）どうかを測定することを含む。本発明はまた、エトドラク同族体や他のＮＳＡＩＤなどの薬剤を、癌、好ましくは、前立腺癌、ＣＬＬ、ＭＭなどのエトドラク感受性癌を阻害する能力について評価する一般的な多レベルスクリーニング法を提供する。陽性活性を示す、Ｒ（−）エトドラクの活性に少なくとも等しい薬剤、または陰性活性を示さない、すなわちＲ（−）エトドラクを越える活性でない薬剤を次ぎのスクリーニングに移す。
【００１９】
試験薬剤について、エトドラク、例えば、放射標識されたＲ（−）エトドラクの、ＣＬＬ細胞などのエトドラク感受性癌細胞上のその受容体との結合を競合的に阻害する能力を検査する。細胞上のエトドラク結合部位についてＲ（−）エトドラクと効果的に競合し得る薬剤は、ＣＬＬ細胞などの癌細胞におけるＣａ^＋２取りこみを、好ましくは、Ｒ（−）エトドラクと同様に効果的に、増加し得るかを測定するアッセイで検査する。細胞内Ｃａ^＋２取りこみを誘導し得る薬剤のスクリーニングを行い、Ｂ−ＣＬＬリンパ球などのリンパ球集団における化学運動性活性（化学運動性または化学走化性）を、好ましくは、Ｒ（−）エトドラクと同様に効果的に、その薬剤が誘導し得るかを調べる。ついで、このスクリーニングで陽性である薬剤を検査して、ＣＬＬやエトドラクに対する感受性が知られている他の癌細胞などの癌細胞におけるアポトーシスやプロアポトーシス因子、例えばカスパーゼ活性の増加を、少なくともＲ（−）エトドラクと同様に効果的に、誘導し得るかどうかを調べる。
【００２０】
このスクリーニングで陽性であった薬剤について、マウスでリンパ球を欠失する能力を検査し、ついでＲ（−）エトドラク以上の活性でない薬剤を癌の動物モデルで検査して、癌の誘発または拡大を阻害できるかどうかを調べる。
【００２１】
癌および癌細胞に関しての使用において、用語「阻害」または「阻害する」は、細胞増殖の減少、細胞増殖の遮断、該細胞のいくつかまたはすべてを殺すことを含む。すなわち、この用語は、癌の発生を防止する予防的処置または発生している癌の拡大を阻止または遅延する治療の両方の意味で使用し得る。エトドラク処置に感受性のマーカーの発現レベルがエトドラクまたはそのアナログでの処置を継続するのに十分高いかどうかを、下記するように、抵抗性および感受性の癌細胞系における該マーカーの相対的レベルの比較により決定する。
【００２２】
図面の簡単な説明
図１は、正常な末梢性血リンパ球（ＰＢＬ）のラセミ・エトドラクに対する感受性を表示するグラフである。
図２は、ＣＬＬのラセミ・エトドラクに対する感受性を表示するグラフである。
図３は、ラセミ・エトドラクとフルダラビンの併用のＣＬＬ細胞に対する相乗作用を表示するグラフである。
図４は、５０μＭのエトドラクと１０μＭの２ＣｄＡまたは１０ｍＭのフルダラの併用のＣＬＬ細胞に対する相乗作用を表示するグラフである。
図５は、ＣＬＬ細胞のＳ−およびＲ−エトドラクに対する感受性を表示するグラフである。
【００２３】
図６および７は、エトドラク投与の前と後での２患者に由来するＣＬＬ細胞の生存能を表示する。
図８は、エトドラク投与の前と後でのＣＬＬ細胞についてのフローサイトメトリー分析を表示する。
図９および１０は、Ｒ（−）エトドラクの２患者由来のＭＭ細胞に対する選択的作用を表示する。
【００２４】
図１１は、ＭＧ−１３２により遮断されるＭｃｌ−１（パネルＡ）およびＢａｇ−１（パネルＢ）における急速な下方調整をエトドラクが誘導することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
図１２は、７癌細胞系によるＰＰＡＲ−γ発現を表示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
図１３は、エトドラクおよびインドメタシンによるＰＰＡＲ−γ発現の誘導を表示するグラフである。
図１４は、ヒト単球におけるＴＰＡの存在または不存在で、エトドラクおよびＴＧＺにより誘導されるＣＤ３６の発現を表示するグラフである。
図１５は、エトドラクで非処置（Ａ）および処置（Ｂ、Ｃ、Ｄ）の前立腺癌組織切片の写真である。
【００２５】
本発明のインドール化合物は、下記式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、例えば、有機酸または無機酸との塩を含む。
【化４】

式中、Ｒ^１は、低級アルキル、低級アルケニル、（ヒドロキシ）低級アルキル、低級アルキニル、フェニル、ベンジルおよび２−チエニルよりなる群から選ばれ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５は、同一または相違して各々水素および低級アルキルよりなる群から選ばれ、各Ｒ^６は、独立的に水素、低級アルキル、ヒドロキシ、（ヒドロキシ）低級アルキル、低級アルコキシ、ベンジルオキシ、低級アルカノイルオキシ、ニトロおよびハロよりなる群から選ばれ、ｎは、１−３であり、Ｒ^７は、水素、低級アルキルおよび低級アルケニルよりなる群から選ばれ、Ｘは、オキシおよびチオよりなる群から選ばれ、Ｙは、カルボニル（ＣＨ_２）_１−３、（ＣＨ_２）_１−３Ｃ（Ｏ）および（ＣＨ_２）_１−３ＳＯ_２よりなる群から選ばれ、Ｚは、ヒドロキシ、低級アルコキシ｛ＯＨ、４−ピリジル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ（低級アルキル）アミノまたはＮ−モルホリノで選択的に置換されている｝、アミノ、低級アルキルアミノ、［（カルボキシ）（低級アルキル）］アミノ、ジ（低級）アルキルアミノおよびフェニルアミノよりなる群から選ばれ、Ｙ−Ｚは、（ＣＨ_２）_１−３Ｒ^８［うち、Ｒ^８は、ＯＨ、（Ｃ_２−Ｃ_４）アシルオキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＰＯ_４Ｈ_２、Ｎ（ＮＯ）（ＯＨ）、ＳＯ_２ＮＨ_２、ＰＯ（ＯＨ）ＮＨ_２またはテトラゾール］である。低級アルキル、アルケニル、アルカノイルなどは、分枝、環状または直鎖のＣ_１−Ｃ_６基、好ましくはＣ_１−Ｃ_４基を意味し、シクロアルキルおよび（シクロアルキル）アルキルを含む。（ヒドロキシ）低級アルキルまたはアルコキシは、好ましくは１−または２−ヒドロキシエチルである。
【００２６】
上記で説明したように、エトドラクのＲ（−）エナンチオマーの比較的低い水溶性が、経口投与または水性運搬体での投与のときに、癌に対する有用性を低くすることがある。従って、本発明はまた、エトドラクの遊離酸または簡単なアルキルエステルを越える高い水溶性および／またはバイオアベイラビリティを発揮する新規のインドール化合物を提供する。このようなアナログには、エトドラクの（ピリジニル）低級アルキルエステル、（アミノ）低級アルキルエステル、（ヒドロキシ）低級アルキルエステル、１’−Ｄ−グルクロン酸エステル、例えば、式（ＩＩ）の化合物がある。式中、（ａ）Ｙはカルボニル、および（ｂ）Ｚは、（ω−（４−ピリジル）（Ｃ_２−Ｃ_４アルコキシ）、（ω−（（Ｒ^８）（Ｒ^９）アミノ）（Ｃ_２−Ｃ_４アルコキシ）［うち、Ｒ^８ および Ｒ^９ は、各々Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルまたはＮと一緒に１−３Ｎ（Ｒ^８）、Ｓもしくは非過酸化物Ｏを含む５または６員の複素環である］、（ω−（ＯＨ）（Ｃ_２−Ｃ_４））アルコキシのアミノ酸エステル、例えば、２−ヒドロキシエトキシ、１’−Ｄ−グルクロニルオキシのＬ−バレリンまたはＬ−グリシン・エステルである。水溶性の増加した他のアナログには、アミノ酸アミドがあり、Ｙがカルボニルであり、ＺがＮ（Ｒ^８）ＣＨ（Ｒ^８）ＣＯＯＨである。
【００２７】
このような化合物は、下記文献に開示のように調製できる。米国特許３，８４３，６８１、米国特許出願０９／３１３，０４８、ドイツ特許２，２２６，３４０（Ａｍｅｒ． Ｈｏｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｒ． Ｒ． Ｎａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４， ２４５ （１９７６）、Ｄｅｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅ．， １９， ３９１ （１９７６）、ＰＣＴ出願ＵＳ／００／１３４１０、米国特許４，３３７，７６０（Ｒｕｂｉｎ）。
【００２８】
式（Ｉ）のラセミ化合物の分割は、通常の手段、例えば、光学活性分割アミンとのジアステレオマー塩の形成などを用いて行い得る。参照、例えば、”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，” ｂｙ Ｅ． Ｌ． Ｅｌｉｅｌ （ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， １９６２）； Ｃ． Ｈ． Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．， １１３， ２８３ （１９７５）； ”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ， Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，” ｂｙ Ｊ． Ｊａｃｑｕｅｓ， Ａ． Ｃｏｌｌｅｔ， ａｎｄ Ｓ． Ｈ． Ｗｉｌｅｎ， （Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）； Ｓ． Ｈ． Ｗｉｌｅｎ， Ａ． Ｃｏｌｌｅｔ ａｎｄ Ｊ． Ｊａｃｑｕｅｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ３３， ２７２５ （１９７７）。例えば、ラセミ体の分割は、光学活性１−フェニルエチルアミンを用いるＲＳ−エトドラクの分別結晶により行われ、ＨＰＬＣを用いて、尿中のエトドラクと２ヒドロキシ化代謝体のラセミ・エトドラクとエナンチオマーの比率が測定されている（Ｕ． Ｂｅｃｋｅｒ−Ｓｃｈａｒｆｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．， ６２１， １９９ （１９９３）。Ｂ． Ｍ． Ａｄｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許５，８１１，５５８）は、グルタミンとＮ（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）グルタミン塩を用いるエトドラクの分割を開示している。
【００２９】
エトドラク自体（１，８−ジエチル−１，３，４，９−テトラヒドロ［３，４−６］インドール−１−酢酸は、ピラノカルボン酸類のＮＳＡＩＤであり、１９７０年代の前半に開発された。その構造を下記に式（ＩＩ）で示す。式中（＊）はキラル中心である。参照、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ （１１ｔｈ ｅｄ．） ６０８ 頁。
【化５】

【００３０】
エトドラクの薬物動態は、Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．， ２６， ２５６ （１９９４） に詳細に総説されている。エトドラクはラセミ体で市販されている。エナンチオマーの絶対立体配置はＳ（＋）およびＲ（−）であることが知られており、多くの他のＮＳＡＩＤと同じである。しかし、Ｄｅｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２６， １７７８ （１９８３） によると、アジュバント多関節炎のラットの足掌量の減少および薬物のプロスタグランジン・シンテアーゼ阻害活性による測定で、エトドラクのＳ（＋）エナンチオマーがラセミ体のほとんどすべての抗炎遮症活性を保有していた。抗炎症活性が（−）エナンチオマーでは認められず、このものがインビボでＳ（＋）エナンチオマーに有意に転換していない。しかし、下記するように、Ｒ（−）エトドラクは、Ｓ（＋）エナンチオマーに少なくとも同等の、癌細胞に対する活性を有することが分かった。
【００３１】
エトドラクは、その立体選択的薬物動態からして、いくつかの特殊な配置特性を有する。血漿において、ＲＳ−エトドラク投与後、「不活性」Ｒ−エナンチオマーの濃度が活性Ｓ−エナンチオマーの濃度よりも約１０倍高い。このことはキラルＮＳＡＩＤで新しいことである。参照、Ｄ． Ｒ． Ｂｒｏｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．， ２６， ２５６ （１９９４）。６人の高齢患者に２００ｍｇを投与後、血漿でのＲ−エナンチオマーの濃度が約３３μＭであった。一方、Ｓ−エナンチオマーの濃度は５倍低かった。エトドラクのラセミ混合物の典型的な用量は４００ｍｇＢＩＤであり、その消失半減期は６−８時間である。さらに、精製されたＲ−エナンチオマーの投与が、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤に関連する副作用、潰瘍や腎不全を示さないようである。従って、かなりの高用量で投与できる。それにもかかわらず、Ｒ（−）エトドラクの比較的低い水溶性が、ヒトで癌細胞、特に前立腺癌細胞を阻害し得るような血漿レベルを保持するのに障害になることがある。しかし、式（Ｉ）の化合物は、水などの水性媒体中に、Ｒ（−）エトドラクよりも実質的に高い濃度で溶解し得る。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物はまた、その薬学的に許容される塩または薬学的に許容されない塩の形態で調製できる。薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩の製造の中間体として有用である。薬学的に許容される塩は、親化合物の望ましい生物活性を保持する塩であり、望ましくない毒性作用を有しない。このような塩の例には、（ａ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などとの酸付加塩；および有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリグルクロン酸などと形成される塩、（ｂ）元素性アニオン、例えば、塩素、臭素、ヨウ素から形成される塩がある。好ましいカルボン酸塩は親水性アミンのもので、例えば、グルカミンやＮ−（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルグルカミンである（参照、Ａｄｇｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許５，８１１，５５８）。
【００３３】
癌、すなわち前立腺癌の急性または慢性的処置における式（Ｉ）化合物の予防または治療用量の大きさは、癌の型および／または段階、使用された補助の化学療法剤などの抗癌治療、投与経路により変ってくる。用量および投与頻度も個々の患者の年齢、体重、状態、反応により変わる。一般的に、式（Ｉ）の化合物の全１日用量は、本明細書に記載の状態について、単回または分割投与で約５０ｍｇから約５０００ｍｇである。好ましくは、１日用量は、単回または分割投与で約１００ｍｇから約４０００ｍｇである。さらに好ましくは、約１０００ｍｇから約３０００ｍｇであり、例えば、６時間ごとに７５０ｍｇを経口投与する。これにより、約５００−７５０μＭの血漿濃度が得られ、癌細胞を殺すのに効果的であり得る。患者を処置する場合に、治療を低い量から始め、患者の全身的状態に応じて増量する。さらに、幼児、小児、６５歳以上の患者および腎や肝の機能に障害のある患者には、特にＣＯＸ阻害活性を保持するアナログの低量で始め、その全身的応答および血中レベルに基づいて用量を定めることが推奨される。ある場合には、この範囲外の用量が必要となることもある。さらに、臨床家や担当医が個々の患者の反応に応じて、どのように、いつ治療を中断、調整、中止するのかを知っているであろう。用語「有効な阻害量」または「有効な感受量」は、上記の投与量および投与頻度スケジュールに含まれる。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物の有効量を患者に与えるために、適当な投与経路を用い得る。例えば、経口、経直腸、非経口（皮下、静脈内、筋肉内）、鞘内、経皮などの投与形態をとることができる。用量形態には、錠剤、トローチ、分散剤、懸濁液、溶液、カプセル、パッチなどがある。化合物の投与は、化学療法剤の投与の前、同時または後に、または継続的に１日量で、化学療法の全体または一部分として行い得る。ある場合、抗癌化学療法剤の運搬に使用されるのと同じ担体または運搬体と組合すことができる。
【００３５】
すなわち、本発明化合物は、例えば経口で、不活性稀釈剤または適応性の担体などの薬学的に許容される運搬体と組合せて、全身的に投与できる。本発明化合物は、硬または軟カプセルとすることも、錠剤に打錠することも、患者の食物に直接入れることもできる。経口治療での投与では、活性化合物を１以上の賦形剤と組合せ、服用錠、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェファーなどとし得る。このような組成物および製剤は、活性化合物を少なくとも０．１％含有する。この組成物および製剤の％は、もちろん変るものであって、通常は所定の単位用量形態の重量の約２〜６０％である。この治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効な用量レベルが得られるであろう量である。
【００３６】
錠剤，トローチ、丸剤、カプセルは、下記のものも含有し得る：トラガントガム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；スクロース、フルクトース、ラクトース、アスパラテームなどの甘味剤；ペパミント、アカモノ油、チェリーフレイバーなどの香料。単位用量形態がカプセルの場合、上記のものに加えて、植物油やポリエチレングリコールなどの液体担体を含有し得る。種々の他の物質が、被膜として、あるいは固体単位用量の物理的形態を改変するものとして存し得る。例えば、錠剤、丸剤、カプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラック、糖などで被膜し得る。錠剤、丸剤、カプセル、顆粒、微粒子などは、腸溶被覆することができる。例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）ポリマーのひとつでの被覆で、腸で活性化合物を放出するが、胃の酸性状態では放出しない形態にできる。このものは、顕著なＣＯＸ阻害活性をもつ化合物で高齢または虚弱体質の癌患者を処置する場合や潰瘍が併存する場合に利点がある。
【００３７】
シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、チェリーやオレンジ風味などの色素および香料を含有し得る。もちろん、単位用量形態の調製に使用される物質は、適用量で、薬学的に許容され、実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物を持続放出製剤や装具に組込むこともできる。
【００３８】
活性化合物は、注入や注射で静脈内または腹腔内に投与できる。活性化合物またはその塩の溶液を水で、選択的に非毒性の界面活性剤と混合して、調製できる。分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびこれらの混合物中で、または油中で調製できる。貯蔵または使用についての通常の状態で、これらの製剤は微生物の発生を防ぐために保存剤を含有する。
【００３９】
注射や注入に適する薬学的用量形態には、無菌の注射または注入可能の溶液または分散液の即席調製に適合するようになされた活性成分を、リポソーム中に選択的に封入、含有する無菌の水溶液または分散液または無菌の粉末がある。すべての場合、最終用量形態は、製造および貯蔵の条件で、無菌、流動的、安定でなければならない。液体の担体および運搬体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルグリコール、およびこれらの適当な混合物を含む溶媒または液体分散媒体である。適当な流動性は、リポソームの形成、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、または界面活性剤の使用により保持できる。微生物作用の防止は種々の抗菌剤または抗真菌剤により行い得る。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサルなどによる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤、塩化ナトリウムなどを含むのが好ましい。注射用組成物を長時間で吸収さすには、吸収を遅らす物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの組成物を使用する。
【００４０】
無菌注射液は、活性化合物を必要量で適当な溶媒中に上記の種々の成分とともに組込み、必要に応じてろ過滅菌を行って調製できる。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌ろ過した溶液中に活性成分および追加の所望成分を得る。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物の有用な用量は、インビトロ活性および動物モデルでのインビボ活性を比較することで決定できる。マウスなどの動物での有効用量をヒトに外挿する方法は当技術分野で既知である。例えば、参照、米国特許４，９３８，９４９。
【００４２】
ＰＰＡＲ−γレベルを高め、ホルモン無反応性前立腺癌において過剰発現されることが知られているアンドロゲン発現を減少する式（Ｉ）の化合物の能力からして、ＰＰＡＲ−γを上方調節する化合物は、前立腺癌の処置において使用されるステロイドまたは非ステロイド性の抗アンドロゲン剤と併用して、好都合に用い得る。抗アンドロゲン剤には、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、シクロプロテロンなどがある。
【００４３】
前立腺癌細胞を感受性とするＰＰＡＲ−γレベルを通常の化学療法剤の有効レベルまで低下せしめる式（Ｉ）の化合物の能力からして、この化合物は、前立腺癌などの癌の処置に用いられる化学療法剤と併用できる。この化学療法剤には、エストラムスチン、ビンブラスチン、ミトキサントロン、プレドニソンなどがあり、またはＭＭの処置のメルファレンがある。他の化学療法剤、放射線、または抗腫瘍性抗体やサイトカインなどの他の抗癌剤を本発明化合物とともに使用し得る。参照、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１８ｔｈ ｅｄ． １９９０） １１３８−１１６２ 頁。
本発明を下記の詳細な実施例でさらに説明する。
【００４４】
実施例１ 正常な末梢血リンパ球およびＣＬＬ細胞のエトドラクに対する感受性
単核細胞を、Ｂ−ＣＬＬ患者および正常ドナーの末梢血から、密度勾配遠心法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ） を用いて単離した。細胞を２Ｘ１０^６細胞／ｍＬでＲＰＭＩ中２０％自己血漿とともに９６ウエルプレートにおいて、表示のμＭ濃度のエトドラク（ラセミ、Ｓ−エトドラク、Ｒ−エトドラク）の存在または不存在で、および２−クロロ−２’−デオキシアデノシン（２ＣｄＡ）またはフルダラビンと組合せて、培養した。表示の時間（１２、２４、３６、４８、６０、７０時間）で、生存能アッセイを、エリスロシンＢ排除アッセイ法（Ｄ． Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ８９， ２９７０ （１９９２） に記載）を用いて行った。
図１に示すように、正常ＰＢＬの有意の死が、インビボで得られない濃度、８００μＭのラセミ・エトドラクで生じた。
【００４５】
正常ドナーからの末梢血リンパ球を１．０ｍＭエトドラクとともに２４時間培養した。Ｂリンパ球を抗ＣＤ１９抗体での着色で同定し、生存能をＤｉＯＣ_６蛍光法で検査した。この条件でエトドラクは正常Ｂ細胞の生存能を対照培養物に比して減少せしめなかった。同じ生存能アッセイをＣＬＬ患者の末梢血からの精製ＣＬＬ細胞で行うと、結果が異なった。図２に示すように、５０％のＣＬＬが２００μＭラセミ・エトドラクへの４８時間曝露で死滅した。処置された細胞の９５％以上が悪性Ｂリンパ球であった。
【００４６】
実施例２ エトドラクと化学療法剤の相乗的併用
フルダラビンはＣＬＬの治療に普通に使用されるヌクレオシド・アナログである。この試験において、ＣＬＬ細胞のインビトロ生存を表示時間点で、媒体のみ（「Ｃｏｎ」、四角）、１０ｎＭフルダラビン（菱形）、１０μＭエトドラク（黒丸）、１０ｎＭフルダラビン＋１０μＭエトドラク（白丸）を含有する培地で比較した。２薬剤は一緒になって相乗的な細胞毒性効果を発揮した。図３は、この組合せが４８時間の培養において５０％のＣＬＬ細胞を殺したことを示す。一方、いずれの薬剤も単独では効果がなかった。図４は、同じ試験条件での５０μＭエトドラクおよび１０ｎＭの２−クロロデオキシアデノシンおよびフルダラビンの相乗作用を示す。
【００４７】
実施例３ Ｒ（−）およびＳ（＋）エトドラクのＣＬＬ細胞に対する作用
エトドラク錠を乳鉢で砕き、酢酸エチルで抽出した。得たエナンチオマーのラセミ混合物を、Ｂｅｃｋｅｒ−Ｓｃｈａｒｆｅｎｋａｍｐ ａｎｄ Ｂｌａｓｃｈｋｅ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．， ６２１， １９９ （１９９３） 法のフラクション結晶化により分取スケールで分離した。すなわち、ラセミ混合物固体を絶対２−プロパノールに溶解し、その溶液にＳ−１−フェニルエチルアミンを加えた。得た塩溶液を冷蔵庫に４日間貯蔵した。結晶性の白色塩産物をろ過し、冷２−プロパノールで洗い、２−プロパノールから２回以上再結晶した。分割剤としてＲ−１−フェニルエチルアミンを用いる以外は同じ方法をＲ異性体に繰り返した。最後にＲおよびＳ塩を１０％硫酸（ｖ／ｖ）で分解、酢酸エチルで抽出した。キラル純粋の各異性体を、Ｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈ の Ｃｈｉｒａｌ−ＡＧＰ カラムを用いるＨＰＬＣで確認した。
【００４８】
１０％自己血漿を有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養したＣＬＬ細胞に対する２エナンチオマーの毒性を表示の濃度および時間点で比較した。図５に示す。Ｒ−およびＳ−エナンチオマーは等しくＣＬＬ細胞に対し細胞毒性である。
【００４９】
実施例４ エトドラク処置の前と後のＣＬＬ細胞生存能
ＣＬＬの２人の患者（ＪＫおよびＮＡ）からの血液を取り、ヘパリン処理した。ついで、各患者はすぐに４００ｍｇエトドラク錠を服用し、１２時間後に第２錠を服用した。１２時間後に、第２血液標本を採取した。ＣＬＬ細胞を単離し、実施例１のように、そのインビトロでの生存を１０％自己血漿含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で比較した。黒丸はエトドラク処置前のＣＬＬ細胞を示す。図６および７において、上向き三角はエトドラク処置後のＣＬＬ細胞生存能を示す。なお、細胞は前処置血漿を含有する培地に分散されている。下向き三角は処置後血漿の培地に保持されている処置後ＣＬＬ細胞である。
【００５０】
図６は、患者ＪＫからの２細胞集団の生存を示す。処置後の細胞は処置前の細胞よりも生存が短い。図７は、患者ＮＡでの劇的でないが同様の効果を示す。図８は、患者ＪＫのＣＬＬ細胞についてエトドラク処置の前および後でのフローサイトメトリー分析を示す。ＤｉＯＣ_６はミトコンドリアにより捕捉される染料である。細胞がアポトーシスにより死ぬと、染色強度が低下する。図８の４パネルのＸ軸はＤｉＯＣ_６染色を示す。左下ボックス中のドット数の増加がアポトーシスによる死を表す。患者からの細胞をエトドラク処置前と処置後で比較すると、左下ボックス中のドット数が薬剤投与後に非常に高いことがわかる。この効果は１２時間で検出でき、２４時間後にさらに増加する。
【００５１】
フローサイトメトリー分析を行うために、ミトコンドリア膜貫通能を３，３’−ジヘキシルオキサカルボンシアナミドヨウ化物（ＤｉＯＣ_６）により、細胞膜浸透性をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）^３により、ミトコンドリア呼吸をジヒドロローダニン１２３（ＤＨＲ）により分析した（参照、Ｊ． Ａ． Ｒｏｙａｌｌ ｅｔ ａｌ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ３０２， ３４８ （１９９３））。ＣＬＬ細胞を１２時間または２４時間、表示量のエトドラクとともに培養した後、４０ｎＭのＤｉＯＣ_６および５μｇ／ｍｌのＰＩを含有する培地で、細胞を１０分間３７℃で培養した。細胞をまた、表示量のエトドラクとともに３時間培養し、２００ｘｇで１０分間回転沈降し、新鮮な呼吸緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＫ／Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４））に再懸濁し、１０分間３７℃で０．０４％ジギトニンとともに培養した。細胞を５分間０．１μＭジヒドロローダニン（ＤＨＲ）で処理した。細胞を３０分間 Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣ−Ｓｃａｌｉｂｕｒ サイトフルオロメーターで解析した。適当な処理の後、蛍光を異なる波長で記録した：ＤｉＯＣ_６およびＤＨＲを５２５ｎｍ（ＦＬ−１）、ＰＩを６００ｎｍ（ＦＬ）。
【００５２】
一般的に、インビトロ培養１６時間後で、処置後の悪性細胞の生存に１０％の減少が前処置悪性細胞に比してあり、この試験で「陽性」であり、ＣＬＬなどの癌治療におけるエトドラク、すなわちＲ（−）エトドラクの有用性を表す。
【００５３】
実施例５ ＭＭ細胞を選択的に殺すＲ（−）エトドラクの能力
骨髄を多発性骨髄腫の２患者から得た。骨髄は、高レベル発現のＣＤ３８膜抗原を含む悪性細胞と正常細胞の混合物を含有していた。懸濁した骨髄細胞を、７２時間、ＲＰＭＩ−１６４０培地で１０％ウシ胎児血清および種々の濃度の精製エトドラクのＲ−エナンチオマーとともにインキュベートした。ついで、死細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、多発性骨髄腫細胞を蛍光モノクローナル抗ＣＤ３８抗体で着色した。データを蛍光活性化細胞ソーティングで分析した。図９および１０は、両患者に由来する骨髄細胞において、Ｒ−エトドラクが正常の骨髄細胞を殺さなかったが、多発性骨髄腫を用量依存的に殺したことを示す。
【００５４】
実施例６ エトドラクの癌細胞系に対する細胞毒性
表１に要約するように、Ｒ（−）エトドラクの前立腺癌細胞およびひとつの大腸癌細胞に対する細胞毒性効果を、１ｇ用量のＲ（−）エトドラクがヒトにおいて最大血漿濃度約４００μＭをもたらすとすると、臨床的に達し得る濃度で発揮する。Ｒ（−）およびＳ（＋）エナンチオマーの両者が細胞毒性であることから、抗前立腺癌活性はＣＯＸ依存性であるといえる。Ｒ（−）エトドラクは、抗炎症活性を欠くにもかかわらず、Ｓ（＋）エナンチオマーよりも前立腺癌細胞に対し毒性である。
【００５５】
【表１】

＊エトドラクＲ／Ｓ，ＲまたはＳのＩＣ_５０（μＭ）。細胞毒性を、減少さした濃度の薬剤に対する連続的曝露の３日間後にＭＴＴアッセイで検査した。結果はヨウ化プロピジウム摂取を用いるＦＡＣＳで検定した。
【００５６】
平面的疎水性化合物として、エトドラクおよび他のＮＳＡＩＤは、細胞および器官の膜を容易に通過し、その構造および機能を破壊する（Ｓ． Ｂ． Ａｂｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ， ３２， １ （１９８９））。タンパク質Ｍｃｌ−１およびＢａｇ−１はミトコンドリアに存するｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス性メンバーである（Ｘ． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２３５， ２１０ （１９９７））。１００μＭエトドラクとのインキュベーション後早くも２時間で、Ｍｃｌ−１およびＢａｇ−１がエトドラク感受性前立腺癌細胞系（ＬＮＣａＰ）において低下した。Ｍｃｌ−１およびＢａｇ−１レベルの低下は、５．０μＭのＭＧ−１３２（最近発表されたプロテアソーム阻害剤）との前立腺細胞のインキュベーションで防止できる（夫々、図１１のパネルＡおよびＢ）（Ｄ． Ｈ． Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ８， ３９７ （１９９８）。洗剤分解物（レーンごと２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗Ｍｃｌ−１および抗Ｂａｇ−１抗体でイムノブロットした。広スペクトル・カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤとの前インキュベーションはＭｃｌ−１およびＢａｇ−１下方調整を防止しなかった。エトドラクのインキュベーションはＢｃｌ−２およびＢａｘレベルを変えなかった（データを表示しない）。すなわち、エトドラクはＭｃｌ−１合成を妨害しないが、その取り込みをおそらく加速する。両Ｒ−およびＳ−エトドラクがＭｃｌ−１変性を等しい量で誘導した。
【００５７】
実施例８ 癌細胞系におけるＰＰＡＲ−γの発現
エトドラクについては前に検討されていないが、高濃度の他のＮＳＡＩＤが核ホルモン受容体ＰＰＡＲ−γを活性化すると報告されている（Ｊ． Ｍ． Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３４０６ （１９９７）。さらに、ＰＰＡＲ−γの最大活性化がヒトのマクロファージでアポトーシスを誘導する（Ｇ． Ｃｈｉｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ２５５７９ （１９９８））。前立腺細胞がＰＰＡＲ−γを発現するかを調べ、他の癌型と発現レベルを比較することは興味深い。サブコンフルエント細胞系から得た洗剤分解物（レーンごと２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＰＰＡＲ−γ抗体でイムノブロットした。ＰＰＡＲ−γ内容物を正常にするために、膜を抗アクチン・モノクローナル抗体で再ブロットした。レーン１：ＰＣ−３、レーン２：ＳＷ２６０、レーン３：Ａ５４９、レーン４：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、レーン５：Ａｌｖａ−３１、レーン６：ＬＮＣａＰ、レーン７：ＨＣＴ−１１６（参照、表１）。いくつかのエトドラク感受性前立腺細胞（特にＰＣ３）が非常に高レベルの免疫反応性ＰＰＡＲ−γを発現したことがわかる（図１２）。
【００５８】
実施例９ エトドラクによるＰＰＡＲ−γの活性化
ＲＡＷ２６４．７細胞を密度３ｘ１０^５細胞／ｍｌで６ウエルプレートにおいて、リポフェクタミンをＰＰＡＲ−γ発現ベクターｐＣＭＸ−ＰＰＡＲ−γ（０．１μｇ）およびＰＰＡＲ−γ受容体構築体（ＡＯｘ）_３−ＴＫ−Ｌｕｃ（１μｇ）とともに用いて、Ｍ． Ｒｉｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ７９ （１９９８） に記載のように、トランスフェクトした。細胞を２４時間、図１３に表示の化合物で処理し、採取し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。結果を平均±ＳＤで示す。図１３に示すように、エトドラクの両Ｒ−およびＳ−エナンチオマーがＰＰＡＲ−γレポーター遺伝子構築体を、ヒト血漿で容易に活性化される濃度で、インビボ投与後に活性化した。ＴＨＰ−１ヒト単球細胞（ＡＴＣＣ）をホルボルエステル（４０ｎｇＴＰＡ）および２００μＭラセミ・エトドラクまたは２０μＭトログリタゾンの存在または不存在で、インキュベートした。培養３日後に、スカベンジャー受容体ＣＤ３６の表面発現をフローサイトメトリーで測定した。図１４に示すように、両Ｒ−およびＳ−エトドラクがＣＤ３６、ＰＰＡＲ−γ活性化のマーカーの発現を、ヒト細胞系ＴＨＰ−１においてマクロファージ分化の際に起こした。
【００５９】
実施例１０ 前立腺癌組織サンプルのエトドラク処置
新たに得た前立腺切除サンプルを３ｍｍ^３片に切断し、７２時間１０％ＦＢＳおよび抗体を補充したＲＰＭＩ−１６４０中で、ラセミ・エトドラクの不存在（Ａ、４００ｘ）または存在（Ｂ、４００ｘ）、または精製Ｒエナンチオマーの不存在（Ｃ、４００ｘ）または存在（Ｄ、４００ｘ）でインキュベートした。組織を４％パラホルムアルデヒドＰＢＳに固定し、パラフィンに埋没し、切片とし、エキサトキシリンおよびエオシンで着色した。図１５Ａは、浸潤腫瘍細胞（大核）およびいくつかの残留正常上皮を示す。図１５Ｂから１５Ｄは、エトドラクの作用を示す：濃縮アポトーシス性核の豊富な存在（黒矢印、ＢおよびＤ）および新生の腺構築の崩壊（Ｂ＋Ｃ）に注意。エトドラクは、腫瘍細胞に選択的に毒性であるが、正常な基細胞に影響を与えなかった。ラセミ混合物（Ｒ／Ｓ）ならびに精製ＲおよびＳアナログはともに活性であった。
【００６０】
実施例１１ エトドラク・アナログを同定するスクリーニングのための予期プロトコール
Ａ．放射標識Ｒ−エトドラクとの競合によるアナログのスクリーニング
エトドラク感受性の慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）細胞などの癌細胞を放射受容体結合アッセイにおける薬剤スクリーニングに用いる。簡単にいうと、冷凍ＣＬＬを３回ハンクス・バランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗い、ＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳに再懸濁する。約２百万の細胞、［３Ｈ］−Ｒ−エトドラク（ｓｐ．ａｃｔ． ２０−２５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｓｉｂｔｅｃｈ 調製）、および可能性ある競合物または緩衝液を含有する全量２００μｌを、温度（４および３７℃）および時間（０−６０分）を変えてインキュベートする。各サンプルにつき、３回の５０μｌアリコットを、３００μｌの２０％スクロースＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳ上に１．５ｍｌポリプロピレン・スナップ・トップ・チューブ中で重ね、ベックマン ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ 中で２．５分間１５０００ｒｐｍでペレット化する。この操作により細胞結合と細胞遊離のエトドラクを迅速に分離する。チューブ・チップを切除し、細胞ペレットを可溶化し、シンチレーション計数器で数える。いくつかのインキュベーション混合物は対照として過剰の非標識エトドラクを含有する。特異的結合は、放射標識エトドラク含有のチューブでの結合ｃｐｍ引く放射標識エトドラクおよび非標識冷競合エトドラク含有のチューブでのｃｐｍの差である。試験薬剤を非標識冷競合エトドラクと、放射標識エトドラク結合を阻害する能力について比較する。放射標識エトドラクのその受容体との結合を阻害し得る化合物を次ぎのスクリーニングにかける。
【００６１】
Ｂ．ＣＬＬにおける細胞内Ｃａ^２＋の動員
エトドラク・アナログなどの試験化合物によるＣＬＬ細胞中のカルシウムレベルの増加を、フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）により、およびＦｌｕｏ−４染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ） を用いる蛍光造影プレートリーダー・システム（ＦＬＩＰＲ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）により測定する。簡単にいうと、ＣＬＬ細胞（５ｘ１０^６／ｍｌ）を３０分間４μＭのＦｌｕｏ−４染料で３７℃、血清なしの培地中で処理し、２回洗い、さらに３０分間、通常の細胞培養基中に再懸濁する。処理細胞をＦＡＣＳチューブ中で試験薬剤含有の培地に混合し、直ちに３分間以上ＦＡＣＳ分析で蛍光を調べる。高情報量スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイのために、同じ蛍光染料（Ｆｌｕｏ−４）を用いて、ＦＬＩＰＲに基づくアッセイにより９６ウエル・プレート・ホーマットでスクリーニングを行う。正対照として、カルシウム・イオノフォア・イオノマイシンを５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で、ＳＤＦ−１およびＩＰ−１０などのケモカインとともに、および抗ＩｇＭ架橋抗体とともに使用する。ＣＬＬ細胞によるＣａ^＋２摂取を増加する化合物、好ましくはＲ（−）エトドラクにより誘導されるレベルまで増加する化合物を次ぎのスクリーニングにかける。
【００６２】
Ｃ．化学走性および化学運動性アッセイ
細胞移動を２４ウエル修飾Ｂｏｙｄｅｎチェンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ， Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ， ＮＹ） で調べる。組換えヒトＩＰ−１０ケモカイン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭｃＫｉｎｌｅｙ Ｐｌａｃｅ， ＮＥ）をＲＰＭＩ−１６４０培地に２００ｎｇ／ｍｌに稀釈して、Ｂ−ＣＬＬ患者からのリンパ球の化学走性を検査するのに用いる。３ｍｍの孔サイズのポリカルボン酸塩膜を使用する。全６００ｍｌのケモカインまた対照培地をウエル底に入れて、ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁された１００ｍＬの２〜５．０ｘ１０^６細胞／ｍｌ細胞をウエルの上方に加える。チェンバーを３７℃で５％ＣＯ_２とともに２時間インキュベートする。ついで膜を除き、底に存在する細胞をフローサイトメトリーで定量する。細胞定量のために、固定された獲得時間３０秒をサンプルごとに用い、ビードを各試験中用い、再製可能な獲得を確認する。化学走性応答などのリンパ球中の化学運動性応答を誘導する試験薬剤、少なくともＲ（−）エトドラクと同等に有効な試験薬剤を次ぎのスクリーニングに進める。
【００６３】
Ｄ．癌細胞におけるアポトーシスの誘発
試験薬剤、例えば、Ｒ−エトドラク・アナログのアポトーシス性活性を、主要なＣＬＬ細胞および他の腫瘍細胞において、ＭＴＴアッセイを用いることにより、および蛍光アッセイを用いるカスパーゼ−３の触媒性活性化の測定により試験する。簡単にいうと、細胞を３日まで、連続的稀釈の選択された試験薬剤の存在でインキュベートする。細胞生存性を９６ウエルプレート中で、ＭＴＴ試薬（最終１ｍｇ／ｍｌ）を２４時間加え、次いでＳＤＳ細胞分解および分光測光分析に５７０ｎｍでかけて、定量する。カスパーゼ触媒活性を９６ウエル・プレート・アッセイで、特異的蛍光測定基質（ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）を用いて、ＣＨＡＰＳ／ＮＰ−４０分解緩衝液で処理細胞を分解し、蛍光測定アッセイにより測定する。アポトーシス性活性を発揮する試験薬剤、例えば、好ましくは少なくともＲ（−）エトドラクと同様に効果的に増加する試験薬剤を次のスクリーニングにかける。
【００６４】
Ｅ．マウスにおけるリンパ球除去
選択された試験薬剤を種々の経歴のマウスに単回量２５および１００ｍｇ／ｋｇで与える。白血球細胞の数を、ノイバウエル・チェンバーを用い、処置の４および２４時間後、７および１４日後に数える。白血球レベルを実質的に減少しない試験薬剤、好ましくはＲ（−）エトドラクよりも減少しない薬剤を次ぎのスクリーニングに進める。
【００６５】
Ｆ．腫瘍動物モデル
Ｒ−エトドラク・アナログの抗癌および予防的活性をプリスタン誘導マウス骨髄腫モデルおよびトランスジェニック腺癌マウス前立腺（ＴＲＡＭＰ）モデルを用いて試験する。マウスに、０．０５〜０．５％の選択試験薬剤または対照を補充した食餌を与える。試験の食餌は試験薬剤を含有する無菌のペレットの形態にある。マウス骨髄腫モデルにおける癌予防試験について、最初のプリスタン注射と同じ時に食餌投与を開始する。トランスジェニック前立腺癌モデルについては、食餌投与を出生時に始める。治療試験について、食餌投与をＴＲＡＭＰマウスで１０週で始め、その時に最初の組織学的病理マーカーを常に調べる。これらのスクリーニングの少なくとも１つで癌を阻害する活性に基づき、アナログを臨床試験またはさらなる開発に進める。
【００６６】
上記で引用した発表文献および特許文献のすべてを出典明示により本明細書の一部とする。本発明を種々の具体的で好ましい実施態様および技術で説明した。しかし、多くの変更および修飾を本発明の精神および範囲の内でなし得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常な末梢性血リンパ球（ＰＢＬ）のラセミ・エトドラクに対する感受性を表示するグラフである。
【図２】図２は、ＣＬＬのラセミ・エトドラクに対する感受性を表示するグラフである。
【図３】図３は、ラセミ・エトドラクとフルダラビンの併用のＣＬＬ細胞に対する相乗作用を表示するグラフである。
【図４】図４は、５０μＭのエトドラクと１０μＭの２ＣｄＡまたは１０ｍＭのフルダラビンの併用のＣＬＬ細胞に対する相乗作用を表示するグラフである。
【図５】図５は、ＣＬＬ細胞のＳ−およびＲ−エトドラクに対する感受性を表示するグラフである。
【図６】図６は、エトドラク投与の前と後での２患者に由来するＣＬＬ細胞の生存能を表示する。
【図７】図７は、エトドラク投与の前と後での２患者に由来するＣＬＬ細胞の生存能を表示する。
【図８】図８は、エトドラク投与の前と後でのＣＬＬ細胞についてのフローサイトメトリー分析を表示する。
【図９】図９は、Ｒ（−）エトドラクの２患者由来のＭＭ細胞に対する選択的作用を表示する。
【図１０】図１０は、Ｒ（−）エトドラクの２患者由来のＭＭ細胞に対する選択的作用を表示する。
【図１１】図１１は、ＭＧ−１３２により遮断されるＭｃｌ−１（パネルＡ）およびＢａｇ−１（パネルＢ）における急速な下方調整をエトドラクが誘導することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図１２】図１２は、７癌細胞系によるＰＰＡＲ−γ発現を表示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図１３】図１３は、エトドラクおよびインドメタシンによるＰＰＡＲ−γ発現の誘導を表示するグラフである。
【図１４】図１４は、ヒト単球におけるＴＰＡの存在または不存在で、エトドラクおよびＴＧＺにより誘導されるＣＤ３６の発現を表示するグラフである。
【図１５】図１５は、エトドラクで非処置（Ａ）および処置（Ｂ、Ｃ、Ｄ）の前立腺癌組織切片の写真である。[0001]
(Technical field)
Reference to related application
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[0002]
Background of the Invention
This invention was made with government support under Grant No. 5ROI GM23200-24 awarded by the United States Health Institute. The government has certain rights in the invention.
[0003]
Prostate cancer is the second leading cause of death from male cancer in the United States. Approximately 185,000 people were diagnosed with prostate cancer in 1998, and it is estimated that more than 39,000 people died from the disease. See, S.D. H. Landies et al. , Cancer Statistics, CA Cancer J. et al. Clin. , 48, 6 (1998). Prostate cancer survival is good at an early diagnosis, but treatment of advanced disease is limited to hormone ablation and palliative treatment. Hormone ablation (orchiectomy and antiandrogen treatment) generally only results in a temporary relief of the disease. It usually recurs in 1-3 years, and recurrent tumors do not require androgens for their growth and survival. D. G. FIG. Tang et al. Prostate, 32, 284 (1997). Treatment with conventional chemotherapeutic agents, such as progesterone, estramustine, and vinblastine, has not been effective in stopping disease progression.
[0004]
The number of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is increasing so that a separate classification is required. In addition to aspirin, NSAIDs marketed in the United States include sodium meclofenamate, oxyphenbutazone, phenylbutazone, indomethacin, piroxicam, sulindac, tolmetin for arthritis; mefenamic acid, zomepirac for pain; ibuprofen, fenoprofen for pain and arthritis , There is naproxen. Ibuprofen, mefenamic acid, and naproxen are also useful in treating dysmenorrhea.
[0005]
The clinical utility of NSAIDs is limited by a number of adverse effects. Phenylbutazone is associated with hepatic necrosis and granulomatosis, and sulindac, indomethacin, ibuprofen, and naproxen are associated with hepatitis and cholestatic hepatitis. A transient increase in serum aminotransferases, especially alanine aminotransferase, has been reported. All of these drugs, including aspirin, inhibit cyclooxygenase and, in turn, inhibit prostaglandin synthesis. Prostaglandins help regulate glomerular filtration and renal sodium and water excretion. Thus, NSAIDs can cause fluid retention and reduce sodium excretion, followed by hyperkalemia, hypouria, and anuria. In addition, all of these drugs can cause gastric ulcers. See Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co. , Easton, PA (18th ed., 1990) 1115-1122.
[0006]
There is a great deal of literature on the effects of NSAIDs on cancer, especially colon cancer. See, e.g. A. Weiss et al. , Scand J .; Gastroent. , 31, 137 (1996) (suppl. 220) and Shiff et al. , Exp. Cell Res. , 222, 179 (1996). More recently, B.A. Bellosillo et al. According to Blood, 92, 1406 (1998), aspirin and salicylate reduce the viability of B cells, CLL cells in vitro, but not indomethacin, ketralac, NS-398.
[0007]
C. P. Duffy et al. , Eur. J. According to Cancer, 34, 1250 (1998), the cytotoxicity of certain chemotherapeutic agents is increased in combination with certain non-steroidal anti-inflammatory drugs. The effects on human lung cancer cells and human leukemia cells are highly specific and unpredictable. That is, a combination of a certain NSAID and a drug is effective, and another combination is not effective. It can be concluded that this effect is not due to the cyclooxygenase inhibitory activity of NSAIDs.
[0008]
The Duffy group filed a PCT application on October 24, 1997 for a combination of a "substrate of MRS" that could be an anticancer agent and an NSAID that could increase the strength of the anticancer agent (WO 98/18490). The claimed NSAIDs are acemetacin, indomethacin, sulindac, sulindac sulfide, sulindac sulfone, tolmetin, zomepirac. Naproxen and piroxican are said to be inactive.
[0009]
A recent report, Wechter et al. , Cancer Res. , 60, 2203 (2000), the NSAID, R-flurbiprofen, inhibited the progression of prostate cancer in TRAMP mice, a prostate cancer model. The Wechter group filed a PCT application on September 8, 1997 with the disclosure that R-NSAIDs including R (-) etodolac and R-flurbiprofen can treat prostate cancer (WO 98/09603). Contrary to R (-) etodolac, the R-enantiomer of flurbiprofen and other (R) -2-arylpropionate NSAIDs are converted in the body to anti-inflammatory S-enantiomers and are therefore prodrugs of NSAIDs. is there. Note that R (-) etodolac is not itself an NSAID. Therefore, there is a continuing need to use these preliminary findings to develop new compounds that treat neoplastic diseases, including cancer, such as prostate cancer.
[0010]
Summary of the invention
The present invention relates to compounds of the following formula (I) and pharmaceutically acceptable salts thereof.
Embedded image

Where R ¹ Is lower alkyl, lower alkenyl, (hydroxy) lower alkyl, lower alkynyl, phenyl, benzyl or 2-thienyl; ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ Are the same or different and are each hydrogen or lower alkyl; ⁶ Is independently hydrogen, lower alkyl, hydroxy, (hydroxy) lower alkyl, lower alkoxy, benzyloxy, lower alkanoyloxy, nitro or halo; n is 1-3; ⁷ Is hydrogen, lower alkyl or lower alkenyl, X is oxy or thio, and Y is carbonyl (CH ₂ ) _1-3 , (CH ₂ ) _1-3 C (O) or (CH ₂ ) _1-3 SO ₂ And Z is (ω- (4-pyridyl) (C ₂ -C ₄ Alkoxy), (ω-((R ⁸ ) (R ⁹ ) Amino) (C ₂ -C ₄ Alkoxy) [of which, R ⁸ And R ⁹ Are H, (C ₁ -C ₃ ) Alkyl or N together with 1-3N (R ⁸ ), 5- or 6-membered heterocyclic ring containing S or non-peroxide O], (ω- (OH) (C ₂ -C ₄ )) Alkoxy, N (R ⁸ ) CH (R ⁸ ) CO ₂ H, an amino acid ester of 1′-D-glucuronyloxy, wherein YZ is (CH ₂ ) _1-3 R ⁸ [Of which, R ⁸ Is OH, (C ₂ -C ₄ ) Acyloxy, SO ₃ H, PO ₄ H ₂ , N (NO) (OH), SO ₂ NH ₂ , PO (OH) NH ₂ Or tetrazole].
[0011]
The invention also relates to methods of treatment that inhibit the growth of cancer cells and / or sensitize cancer cells to inhibition by chemotherapeutic agents. The method comprises contacting the cancer cells with an effective amount of a compound of formula (I), preferably in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. The compounds of the present invention can be used to treat mammals with cancer, such as human cancer patients. Preferably, the compounds of the present invention are administered in combination with chemotherapeutic agents such as alkylating agents and antiandrogens, radiation and / or other anti-cancer treatments.
[0012]
The compounds of the present invention are effective against hematopoietic cancers such as leukemias including chronic lymphocytic leukemia (CLL) and multiple myeloma (MM) and bone marrow cancer. Compounds of the invention unexpectedly exhibit high levels of nuclear hormone receptor, peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), and / or high levels of anti-apoptotic proteins, Mcl-1 and / or Bag. It has an effect on cancer cells expressing -1. Such cancer cells include at least some types of prostate cancer cells.
[0013]
Active PPAR-γ binds the coactivator protein (CBP), a coactivator of the androgen receptor known to be overexpressed in hormone-resistant prostate cancer. Thus, the compounds of the present invention may act to enhance the effects of conventional anti-androgen treatment and inhibit the spread of prostate cancer.
[0014]
The present invention is based on the inventors' finding that racemic etodolac inhibits the viability of purified CLL or MM cells at a concentration that does not inhibit the viability of normal peripheral blood lymphocytes (PBL). Unexpectedly, the R (-) enantiomer of etodolac was found to be as toxic to CLL cells as the S (+) enantiomer. It was then found that etodolac interacts synergistically with fludarabine and 2-chloroadenosine to kill CLL cells at concentrations that are inactive with chemotherapeutic agents alone. Finally, both R (-) and S (+) etodolac were found to inhibit many prostate cancer cell lines. Furthermore, the R (-) enantiomer was at least as effective as the S (+) "anti-inflammatory" enantiomer. This was unexpected. This is because the R (-) enantiomer of etodolac has no significant anti-inflammatory activity and is not converted to a significant amount in vivo to the S (+) enantiomer. As described above, the R-enantiomer of another R-2-arylpropionate NSAID is converted in vivo to the "active" anti-inflammatory S-enantiomer and functions as a prodrug of the NSAID.
[0015]
The degree of inhibition is highly related to the level of expression of PPAR-γ by the cell line. Cell lines with high levels of PPAR-γ expression are inhibited much more effectively than cell lines that express relatively low levels of PPAR-γ. This is disclosed in Reference Example.
[0016]
Compounds of formula (I) are preferred for the treatment methods of the invention such that some NSAIDs do not exert the undesired biological activity due to inhibition of cyclooxygenase (COX). However, preferred compounds of formula (I) do not exhibit significant anti-inflammatory activity and should not be considered NSAIDs in the art.
[0017]
The invention also provides a method of determining whether a particular cancer patient, such as prostate cancer, is amenable to treatment with a compound of formula (I). This method isolates cancer cells and is known to be sensitive to treatment of relative levels of PPAR-γ and / or Mcl-1 and / or Bag-1 in vitro with compounds of formula (I). Assessing levels in cancer cell lines, such as prostate cancer cell lines.
[0018]
The present invention also provides a method for determining the ability of a test agent to inhibit a cancer cell, such as prostate cancer. The method includes contacting a population of cancer cells, such as from a prostate cancer cell line, with the agent, wherein the agent increases PPAR-γ expression or decreases Mcl-1 and / or Bag-1 expression. Or (or both). The invention also provides a general multi-level screening method for evaluating agents such as etodolac homologs and other NSAIDs for the ability to inhibit cancer, preferably etodolac-sensitive cancers such as prostate cancer, CLL, MM. . Drugs that show positive activity, at least equal to the activity of R (-) etodolac, or drugs that do not show negative activity, ie, are less active than R (-) etodolac, are transferred to the next screen.
[0019]
Test agents are tested for their ability to competitively inhibit the binding of etodolac, eg, radiolabeled R (−) etodolac, to its receptor on etodolac-sensitive cancer cells, such as CLL cells. Agents that can effectively compete with R (−) etodolac for etodolac binding sites on cells are known as Ca in cancer cells such as CLL cells. ⁺² Incorporation is preferably tested in an assay that measures whether it can increase as effectively as R (-) etodolac. Intracellular Ca ⁺² A drug capable of inducing uptake is screened, and the effect of chemomotility (chemomotility or chemotaxis) in a lymphocyte population such as B-CLL lymphocyte is preferably exerted in the same manner as R (-) etodolac. Investigate whether the drug can be induced. Drugs that are positive in this screen are then tested to determine whether apoptosis or an increase in pro-apoptotic factors, eg, caspase activity, in cancer cells, such as CLL or other cancer cells known to be sensitive to etodolac, is at least R (− ) Check if it can be induced as effectively as etodolac.
[0020]
Drugs that tested positive in this screen were tested for their ability to deplete lymphocytes in mice, and drugs that were no more active than R (-) etodolac were tested in animal models of cancer to determine whether the cancer was induced or spread. Find out if it can be inhibited.
[0021]
In use with respect to cancer and cancer cells, the term "inhibit" or "inhibit" includes reducing cell growth, blocking cell growth, killing some or all of the cells. That is, the term can be used both as a prophylactic treatment to prevent the development of cancer or a therapy to prevent or delay the spread of developing cancer. A comparison of the relative levels of a marker sensitive to etodolac treatment in resistant and sensitive cancer cell lines, as described below, whether the expression level of the marker is high enough to continue treatment with etodolac or an analog thereof. Determined by
[0022]
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
FIG. 1 is a graph showing the sensitivity of normal peripheral blood lymphocytes (PBL) to racemic etodolac.
FIG. 2 is a graph showing the sensitivity of CLL to racemic etodolac.
FIG. 3 is a graph showing the synergistic effect of a combination of racemic etodolac and fludarabine on CLL cells.
FIG. 4 is a graph showing the synergistic effect of 50 μM etodolac in combination with 10 μM 2CdA or 10 mM Fludara on CLL cells.
FIG. 5 is a graph showing the sensitivity of CLL cells to S- and R-etodolac.
[0023]
6 and 7 display the viability of CLL cells from two patients before and after etodolac administration.
FIG. 8 displays flow cytometric analysis on CLL cells before and after etodolac administration.
Figures 9 and 10 display the selective effect of R (-) etodolac on MM cells from two patients.
[0024]
FIG. 11 is a photograph of an SDS-PAGE gel showing that etodolac induces a rapid down-regulation in Mcl-1 (Panel A) and Bag-1 (Panel B) blocked by MG-132.
FIG. 12 is a photograph of an SDS-PAGE gel displaying PPAR-γ expression by seven cancer cell lines.
FIG. 13 is a graph showing induction of PPAR-γ expression by etodolac and indomethacin.
FIG. 14 is a graph depicting etodolac and TGZ-induced CD36 expression in the presence or absence of TPA in human monocytes.
FIG. 15 is a photograph of prostate cancer tissue sections untreated (A) and treated (B, C, D) with etodolac.
[0025]
The indole compound of the present invention includes a compound of the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for example, a salt with an organic acid or an inorganic acid.
Embedded image

Where R ¹ Is selected from the group consisting of lower alkyl, lower alkenyl, (hydroxy) lower alkyl, lower alkynyl, phenyl, benzyl and 2-thienyl; ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ Are the same or different and are each selected from the group consisting of hydrogen and lower alkyl; ⁶ Is independently selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl, hydroxy, (hydroxy) lower alkyl, lower alkoxy, benzyloxy, lower alkanoyloxy, nitro and halo; n is 1-3; ⁷ Is selected from the group consisting of hydrogen, lower alkyl and lower alkenyl, X is selected from the group consisting of oxy and thio, and Y is carbonyl (CH ₂ ) _1-3 , (CH ₂ ) _1-3 C (O) and (CH ₂ ) _1-3 SO ₂ Z is selected from the group consisting of hydroxy, lower alkoxy {OH, 4-pyridyl, amino, lower alkylamino, di (lower alkyl) amino or N-morpholino}, amino, lower Alkylamino, [(carboxy) (lower alkyl)] amino, di (lower) alkylamino and phenylamino, wherein YZ is (CH ₂ ) _1-3 R ⁸ [Of which, R ⁸ Is OH, (C ₂ -C ₄ ) Acyloxy, SO ₃ H, PO ₄ H ₂ , N (NO) (OH), SO ₂ NH ₂ , PO (OH) NH ₂ Or tetrazole]. Lower alkyl, alkenyl, alkanoyl and the like can be a branched, cyclic or straight-chain C ₁ -C ₆ Group, preferably C ₁ -C ₄ Group and includes cycloalkyl and (cycloalkyl) alkyl. (Hydroxy) lower alkyl or alkoxy is preferably 1- or 2-hydroxyethyl.
[0026]
As explained above, the relatively low water solubility of the R (-) enantiomer of etodolac may reduce its utility against cancer when administered orally or in an aqueous carrier. Accordingly, the present invention also provides novel indole compounds that exhibit high water solubility and / or bioavailability over the free acid or simple alkyl ester of etodolac. Such analogs include (pyridinyl) lower alkyl esters, (amino) lower alkyl esters, (hydroxy) lower alkyl esters, 1'-D-glucuronic acid esters of etodolac, for example, compounds of formula (II). Wherein (a) Y is carbonyl and (b) Z is (ω- (4-pyridyl) (C ₂ -C ₄ Alkoxy), (ω-((R ⁸ ) (R ⁹ ) Amino) (C ₂ -C ₄ Alkoxy) [of which, R ⁸ And R ⁹ Are H, (C ₁ -C ₃ ) Alkyl or N together with 1-3N (R ⁸ ), 5- or 6-membered heterocyclic ring containing S or non-peroxide O], (ω- (OH) (C ₂ -C ₄ )) Amino acid esters of alkoxy, for example L-valerin or L-glycine esters of 2-hydroxyethoxy, 1′-D-glucuronyloxy. Other analogs with increased water solubility include amino acid amides, where Y is carbonyl and Z is N (R ⁸ ) CH (R ⁸ ) COOH.
[0027]
Such compounds can be prepared as disclosed in the following references. U.S. Patent No. 3,843,681, U.S. Patent Application No. 09 / 313,048, German Patent No. 2,226,340 (Amer. Home Products), R.A. R. Nartel et al. , Can. J. Pharmacol. , 54, 245 (1976); Demerson et al. , J. et al. Med. Che. , 19, 391 (1976); PCT application US / 0013410; U.S. Patent 4,337,760 (Rubin).
[0028]
Resolution of the racemic compound of formula (I) may be accomplished using conventional means, for example, formation of diastereomeric salts with optically active resolution amines. See, for example, "Stereochemistry of carbon Compounds," by E.I. L. Eliel (McGraw Hill, 1962); H. See Lochmuller et al. , J Chromatog. , 113, 283 (1975); "Enantiomers, Racemates and Resolutions," by J.M. Jacques, A .; Collet, and S.M. H. S. Wilen, (Wiley-Interscience, New York, 1981); H. Wilen, A .; Collet and J.M. Jacques, Tetrahedron, 33, 2725 (1977). For example, the resolution of the racemate is performed by fractional crystallization of RS-etodolac using optically active 1-phenylethylamine. (U. Becker-Scharfenkamp et al., J. Chromatog., 621, 199 (1993). B. M. Adger et al. (U.S. Pat. No. 5,811,558) discloses glutamine and N (C). ₁ -C ₄ Dissolution of etodolac using an (alkyl) glutamine salt is disclosed.
[0029]
Etodolac itself (1,8-diethyl-1,3,4,9-tetrahydro [3,4-6] indole-1-acetic acid is an NSAID of pyranocarboxylic acids and was developed in the early 1970's. Its structure Is represented by the following formula (II), wherein (*) is a chiral center, see, The Merck Index (11th ed.) P.
Embedded image

[0030]
The pharmacokinetics of etodolac are described in R. Blocker et al. , Clin. Pharmacokinet. , 26, 256 (1994). Etodolac is commercially available in racemic form. The absolute configurations of the enantiomers are known to be S (+) and R (-), and are the same as many other NSAIDs. However, Demerson et al. , J. et al. Med. Chem. , 26, 1778 (1983) show that the S (+) enantiomer of etodolac shows almost all the anti-racemic activity of the racemate, as measured by reduced paw mass in rats with adjuvant polyarthritis and the drug's prostaglandin synthase inhibitory activity. He had flame-blocking activity. No anti-inflammatory activity was observed for the (-) enantiomer, which is not significantly converted to the S (+) enantiomer in vivo. However, as described below, R (-) etodolac was found to have at least as much activity on cancer cells as the S (+) enantiomer.
[0031]
Etodolac has some special configurational properties due to its stereoselective pharmacokinetics. In plasma, after RS-etodolac administration, the concentration of the "inactive" R-enantiomer is about 10 times higher than the concentration of the active S-enantiomer. This is new with chiral NSAIDs. Cf. R. Blockers et al. , Clin. Pharmacokinet. , 26, 256 (1994). After administration of 200 mg to six elderly patients, the concentration of R-enantiomer in plasma was about 33 μM. On the other hand, the concentration of the S-enantiomer was 5 times lower. A typical dose of a racemic mixture of etodolac is 400 mg BID and its elimination half-life is 6-8 hours. Furthermore, administration of the purified R-enantiomer does not appear to show the side effects associated with cyclooxygenase (COX) inhibitors, ulcers or renal failure. Thus, it can be administered in significantly higher doses. Nevertheless, the relatively low water solubility of R (-) etodolac can be an obstacle to maintaining plasma levels in humans that can inhibit cancer cells, especially prostate cancer cells. However, the compounds of formula (I) may dissolve in aqueous media such as water at substantially higher concentrations than R (-) etodolac.
[0032]
The compounds of formula (I) can also be prepared in the form of their pharmaceutically acceptable or non-pharmaceutically acceptable salts. Non-pharmaceutically acceptable salts are useful as intermediates in preparing pharmaceutically acceptable salts. Pharmaceutically acceptable salts are salts that retain the desired biological activity of the parent compound and do not have undesired toxicological effects. Examples of such salts include (a) acid addition salts with inorganic acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, and the like; and organic acids such as acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, Succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannic acid, palmitic acid, arginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, Salts formed with naphthalenedisulfonic acid, polyglucuronic acid and the like, and (b) salts formed from elemental anions such as chlorine, bromine and iodine. Preferred carboxylate salts are those of hydrophilic amines, such as glucamine or N- (C ₁ -C ₄ ) Alkylglucamine (see, U.S. Patent No. 5,811,558 to Adger et al.).
[0033]
The size of a prophylactic or therapeutic dose of a compound of formula (I) in the acute or chronic treatment of cancer, i.e., prostate cancer, will depend on the type and / or stage of the cancer, the anti-cancer therapy, administration, such as the adjuvant chemotherapeutic agent used. It depends on the route. Dosage and frequency of administration will also vary with the age, weight, condition, and response of the individual patient. Generally, the total daily dose of a compound of formula (I) will be from about 50 mg to about 5000 mg, in single or divided doses, for the conditions described herein. Preferably, a daily dose is from about 100 mg to about 4000 mg, in single or divided doses. More preferably, the dose is from about 1000 mg to about 3000 mg, for example, 750 mg is orally administered every 6 hours. This gives a plasma concentration of about 500-750 μM, which may be effective in killing cancer cells. When treating a patient, the therapy is started at a lower dose and increased according to the patient's general condition. In addition, infants, children, patients over the age of 65 and patients with impaired renal and hepatic function, especially starting with low doses of analogs that retain COX inhibitory activity, may be subject to their systemic response and blood levels. It is recommended to determine the dose. In some cases, doses outside this range may be required. In addition, clinicians and attending physicians will know how and when to interrupt, adjust, and discontinue treatment, depending on the response of the individual patient. The terms "effective inhibitory dose" or "effective receive dose" are included in the above mentioned dosage and dosing frequency schedules.
[0034]
Any suitable route of administration may be employed for providing a patient with an effective amount of a compound of formula (I). For example, dosage forms such as oral, rectal, parenteral (subcutaneous, intravenous, intramuscular), intrathecal, transdermal, and the like can be employed. Dosage forms include tablets, troches, dispersions, suspensions, solutions, capsules, patches and the like. Administration of the compound may be effected as a whole or part of chemotherapy before, simultaneously with or after administration of the chemotherapeutic agent, or in a continuous daily dose. In some cases, they can be combined with the same carrier or carrier used to deliver the anticancer chemotherapeutic agent.
[0035]
That is, the compounds of the present invention can be administered systemically, for example orally, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier such as an inert diluent or an adaptive carrier. The compounds of the present invention can be made into hard or soft capsules, compressed into tablets, or placed directly into the patient's food. For administration in oral therapy, the active compound may be combined with one or more excipients and taken into tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like. Such compositions and preparations should contain at least 0.1% of active compound. The percentage of the compositions and preparations may, of course, be varied and will usually be between about 2 to 60% of the weight of a given unit dosage form. The amount of active compound in the therapeutically useful compositions is such that an effective dosage level will be obtained.
[0036]
Tablets, troches, pills, capsules may also contain: binders such as tragacanth gum, gum arabic, corn starch, gelatin; lubricants such as magnesium stearate; sucrose, fructose, lactose, aspartame and the like. Sweeteners; flavors such as peppermint, reddish oil and cherry flavor. When the unit dosage form is a capsule, it may contain, in addition to those described above, a liquid carrier such as a vegetable oil or a polyethylene glycol. Various other materials may be present as coatings or to modify the physical form of the solid unit dose. For example, tablets, pills, capsules can be coated with gelatin, wax, shellac, sugar and the like. Tablets, pills, capsules, granules, microparticles and the like can be enteric coated. For example, coating with one of the Eudragit ™ polymers may result in the release of the active compound in the intestine, but not in the acidic state of the stomach. It is advantageous when treating elderly or frail cancer patients with compounds having significant COX inhibitory activity or when ulcers coexist.
[0037]
A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose or fructose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a dye and flavoring such as cherry or orange flavor. Of course, the materials used in preparing unit dosage forms must be pharmaceutically acceptable and substantially non-toxic in the amount applied. In addition, the active compounds can be incorporated into sustained release formulations and devices.
[0038]
The active compounds can be administered intravenously or intraperitoneally by injection or injection. A solution of the active compound or a salt thereof can be prepared with water, optionally mixed with a non-toxic surfactant. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols, triacetin and mixtures thereof, or in oils. Under ordinary conditions for storage or use, these preparations contain a preservative to prevent the development of microorganisms.
[0039]
Pharmaceutical dosage forms suitable for injection or infusion include sterile aqueous solutions containing the active ingredient in a liposome, wherein the active ingredient is adapted for extemporaneous preparation of sterile injectable or injectable solutions or dispersions. Or dispersions or sterile powders. In all cases, the final dosage form must be sterile, fluid and stable under the conditions of manufacture and storage. Liquid carriers and vehicles are solvents or liquid dispersion media containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like), vegetable oils, non-toxic glyceryl glycol, and suitable mixtures thereof. is there. Proper fluidity can be maintained by liposome formation, maintenance of the required particle size in the case of dispersion, or use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial or antifungal agents. For example, with parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, buffers, sodium chloride and the like. For long-term absorption of the injectable composition, substances which delay the absorption, for example, compositions such as aluminum monostearate and gelatin, are used.
[0040]
Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the active compound in the required amount in the appropriate solvent with the various components and sterilizing by filtration, if necessary. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred preparation methods are vacuum drying and lyophilization to obtain the active ingredient and the additional desired ingredients in a previously sterile filtered solution.
[0041]
Useful doses of the compounds of formula (I) can be determined by comparing in vitro activity and in vivo activity in animal models. Methods for extrapolating an effective dose in animals, such as mice, to humans are known in the art. See, for example, U.S. Pat. No. 4,938,949.
[0042]
Given the ability of compounds of formula (I) to increase PPAR-γ levels and decrease androgen expression known to be overexpressed in hormone-refractory prostate cancer, compounds that up-regulate PPAR-γ May be used advantageously in combination with steroids or non-steroidal antiandrogens used in the treatment of prostate cancer. Antiandrogens include leuprolide acetate, goserelin acetate, bicalutamide, flutamide, nilutamide, cycloproterone and the like.
[0043]
Given the ability of the compounds of formula (I) to reduce the level of PPAR-γ that renders prostate cancer cells susceptible to effective levels of conventional chemotherapeutic agents, the compounds are useful in the treatment of cancer such as prostate cancer. Can be used in combination with therapeutic agents. The chemotherapeutic agent includes estramustine, vinblastine, mitoxantrone, prednisone, and the like, or melphalen for the treatment of MM. Other chemotherapeutic agents, radiation, or other anti-cancer agents such as anti-tumor antibodies or cytokines may be used with the compounds of the present invention. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990) 1138-1162.
The present invention is further described in the following detailed examples.
[0044]
Example 1 Sensitivity of normal peripheral blood lymphocytes and CLL cells to etodolac
Mononuclear cells were isolated from peripheral blood of B-CLL patients and normal donors using density gradient centrifugation (Ficoll-Paque). 2X10 cells ⁶ In a 96-well plate with 20% autologous plasma in RPMI at cells / mL in the presence or absence of etodolac (racemic, S-etodolac, R-etodolac) at the indicated μM concentration, and 2-chloro-2′-deoxyadenosine (2CdA) or in combination with fludarabine. At the indicated times (12, 24, 36, 48, 60, 70 hours), the viability assay was performed using the erythrosin B exclusion assay (described in D. Carson et al., PNAS USA, 89, 2970 (1992)). It was carried out using.
As shown in FIG. 1, significant death of normal PBL occurred at 800 μM racemic etodolac, a concentration not available in vivo.
[0045]
Peripheral blood lymphocytes from normal donors were cultured with 1.0 mM etodolac for 24 hours. B lymphocytes were identified by staining with an anti-CD19 antibody and the viability was determined by DiOC. ₆ Inspection was performed by the fluorescence method. Under these conditions, etodolac did not reduce the viability of normal B cells as compared to control cultures. When the same viability assay was performed on purified CLL cells from peripheral blood of CLL patients, the results were different. As shown in FIG. 2, 50% of CLL died on exposure to 200 μM racemic etodolac for 48 hours. More than 95% of the treated cells were malignant B lymphocytes.
[0046]
Example 2 Synergistic Combination of Etodolac and Chemotherapeutic Agent
Fludarabine is a nucleoside analog commonly used to treat CLL. In this test, the in vitro survival of CLL cells was compared at the indicated time points with medium containing only vehicle (“Con”, squares), 10 nM fludarabine (diamond), 10 μM etodolac (closed circle), 10 nM fludarabine + 10 μM etodolac (open circle). did. The two drugs together exerted a synergistic cytotoxic effect. FIG. 3 shows that this combination killed 50% of CLL cells in 48 hours of culture. On the other hand, neither drug was effective alone. FIG. 4 shows the synergy of 50 μM etodolac and 10 nM 2-chlorodeoxyadenosine and fludarabine under the same test conditions.
[0047]
Example 3 Effect of R (-) and S (+) etodolac on CLL cells
The etodolac tablets were crushed in a mortar and extracted with ethyl acetate. The resulting racemic mixture of enantiomers was prepared as described in Becker-Scharfenkamp and Blaschke, J. Am. Chromatog. , 621, 199 (1993) fractionation by preparative scale by fraction crystallization. That is, the racemic mixture solid was dissolved in absolute 2-propanol and S-1-phenylethylamine was added to the solution. The resulting salt solution was stored in the refrigerator for 4 days. The crystalline white salt product was filtered, washed with cold 2-propanol and recrystallized twice from 2-propanol. The same procedure was repeated for the R isomer except that R-1-phenylethylamine was used as the resolving agent. Finally, the R and S salts were decomposed with 10% sulfuric acid (v / v) and extracted with ethyl acetate. Each chiral pure isomer was confirmed by HPLC using a Chiral-AGP column from Chrom Tech.
[0048]
Toxicity of the two enantiomers to CLL cells cultured in RPMI-1640 medium with 10% autologous plasma was compared at the indicated concentrations and time points. As shown in FIG. The R- and S-enantiomers are equally cytotoxic to CLL cells.
[0049]
Example 4 CLL cell viability before and after etodolac treatment
Blood from two patients with CLL (JK and NA) was drawn and heparinized. Each patient then immediately took 400 mg etodolac tablets, and 12 hours later, the second tablet. Twelve hours later, a second blood sample was collected. CLL cells were isolated and their in vitro survival was compared in 10% autologous plasma-containing RPMI-1640 medium as in Example 1. Closed circles indicate CLL cells before etodolac treatment. 6 and 7, the upward triangle indicates CLL cell viability after etodolac treatment. The cells are dispersed in a medium containing pretreated plasma. The downward triangle is the post-treatment CLL cells held in the post-treatment plasma medium.
[0050]
FIG. 6 shows the survival of two cell populations from patient JK. Cells after treatment have a shorter survival than cells before treatment. FIG. 7 shows a similar but less dramatic effect on patient NA. FIG. 8 shows flow cytometry analysis of CLL cells of patient JK before and after etodolac treatment. DiOC ₆ Is a dye trapped by mitochondria. As cells die by apoptosis, the intensity of staining decreases. The X axis of the four panels in FIG. 8 is DiOC ₆ Shows staining. An increase in the number of dots in the lower left box indicates death by apoptosis. Comparison of the cells from the patient before and after etodolac treatment shows that the number of dots in the lower left box is very high after drug administration. This effect can be detected at 12 hours and further increases after 24 hours.
[0051]
In order to perform flow cytometry analysis, mitochondrial transmembrane ability was measured using 3,3′-dihexyloxacarboxy cyanamide iodide (DiOC). ₆ ) To increase cell membrane permeability by propidium iodide (PI) ³ Mitochondrial respiration was analyzed by dihydrorhodanine 123 (DHR) (see JA Royall et al., Arch. Biochem. Biophys., 302, 348 (1993)). After culturing CLL cells for 12 or 24 hours with the indicated amount of etodolac, 40 nM DiOC ₆ The cells were cultured for 10 minutes at 37 ° C. in a medium containing 5 μg / ml and PI. Cells were also cultured for 3 hours with the indicated amount of etodolac, spun down at 200 xg for 10 minutes, and fresh respiratory buffer (250 mM sucrose, 1 g / L bovine serum albumin, 10 mM MgCl2). ₂ 10 mM K / Hepes, 5 mM KH ₂ PO ₄ (PH 7.4)) and incubated for 10 minutes at 37 ° C. with 0.04% digitonin. Cells were treated with 0.1 μM dihydrorhodanine (DHR) for 5 minutes. Cells were analyzed on a Becton Dickinson FAC-Scalibur cytofluorometer for 30 minutes. After appropriate treatment, the fluorescence was recorded at different wavelengths: DiOC ₆ And DHR at 525 nm (FL-1) and PI at 600 nm (FL).
[0052]
In general, after 16 hours of in vitro culture, a 10% decrease in the survival of malignant cells after treatment compared to pre-treated malignant cells, which was "positive" in this test, was etodolac in cancer treatment such as CLL. , Ie, the usefulness of R (-) etodolac.
[0053]
Example 5 Ability of R (-) etodolac to selectively kill MM cells
Bone marrow was obtained from two patients with multiple myeloma. Bone marrow contained a mixture of malignant and normal cells with high levels of expression of the CD38 membrane antigen. Suspended bone marrow cells were incubated for 72 hours in RPMI-1640 medium with 10% fetal calf serum and various concentrations of the R-enantiomer of purified etodolac. The dead cells were then stained with propidium iodide and multiple myeloma cells were stained with a fluorescent monoclonal anti-CD38 antibody. Data was analyzed by fluorescence activated cell sorting. Figures 9 and 10 show that in bone marrow cells from both patients, R-etodolac did not kill normal bone marrow cells, but did kill multiple myeloma in a dose-dependent manner.
[0054]
Example 6 Cytotoxicity of etodolac on cancer cell lines
As summarized in Table 1, the cytotoxic effect of R (-) etodolac on prostate cancer cells and one colon cancer cell is that if a 1 g dose of R (-) etodolac results in a maximum plasma concentration of about 400 μM in humans, It works at clinically achievable concentrations. Since both the R (-) and S (+) enantiomers are cytotoxic, it can be said that anti-prostate cancer activity is COX dependent. R (-) etodolac, despite lacking anti-inflammatory activity, is more toxic to prostate cancer cells than the S (+) enantiomer.
[0055]
[Table 1]

* Etodolac R / S, R or S IC ₅₀ (ΜM). Cytotoxicity was examined in the MTT assay 3 days after continuous exposure to reduced concentrations of the drug. The results were assayed by FACS using propidium iodide intake.
[0056]
As planar hydrophobic compounds, etodolac and other NSAIDs readily cross cell and organ membranes and disrupt their structure and function (SB Abramson et al., Arthritis and Rheumatism, 32, 1 ( 1989)). The proteins Mcl-1 and Bag-1 are anti-apoptotic members of the bcl-2 family located in mitochondria (X. Wang et al., Exp. Cell Res., 235, 210 (1997)). As early as 2 hours after incubation with 100 μM etodolac, Mcl-1 and Bag-1 were reduced in the etodolac-sensitive prostate cancer cell line (LNCaP). Decreases in Mcl-1 and Bag-1 levels can be prevented by incubation of prostate cells with 5.0 μM MG-132, a recently published proteasome inhibitor (FIG. 11, panels A and B, respectively) (D H. Lee et al., Trends Cell Biol., 8, 397 (1998) Detergent degradants (20 μg per lane) were subjected to SDS-PAGE and immunoblotted with anti-Mcl-1 and anti-Bag-1 antibodies. Preincubation with the spectral caspase inhibitor, Z-VAD, did not prevent Mcl-1 and Bag-1 downregulation, and etodolac incubation did not change Bcl-2 and Bax levels (data not shown). That is, etodolac does not interfere with Mcl-1 synthesis, but its Possibly accelerate interrupt. Both R- and S- etodolac induced in an amount equal to McI-1 modified.
[0057]
Example 8 Expression of PPAR-γ in cancer cell lines
Although etodolac has not been previously investigated, high concentrations of other NSAIDs have been reported to activate the nuclear hormone receptor PPAR-γ (JM Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272, 3406 (1997) Furthermore, maximal activation of PPAR-γ induces apoptosis in human macrophages (G. Chinetti et al., J. Biol. Chem., 273, 25579 (1998)). It is interesting to determine if PPAR-γ expresses PPAR-γ and compare expression levels with other cancer types.Detergent degradants (20 μg per lane) from subconfluent cell lines were subjected to SDS-PAGE to generate anti-PPAR-γ. The membrane was anti-activated to normalize the PPAR-γ content. Lane 1: PC-3, Lane 2: SW260, Lane 3: A549, Lane 4: MDA-MB-231, Lane 5: Alva-31, Lane 6: LNCaP, Lane 7: HCT-116 (see, Table 1) It can be seen that some etodolac-sensitive prostate cells (especially PC3) expressed very high levels of immunoreactive PPAR-γ (FIG. 12).
[0058]
Example 9 Activation of PPAR-γ by etodolac
RAW 264.7 cells at a density of 3 × 10 ⁵ Lipofectamine was converted to PPAR-γ expression vector pCMX-PPAR-γ (0.1 μg) and PPAR-γ receptor construct (AOx) in a 6-well plate at cells / ml. ₃ Used with M.-TK-Luc (1 μg). Ricote et al. , Nature, 391, 79 (1998). Cells were treated with the compounds indicated in FIG. 13 for 24 hours, harvested, and assayed for luciferase activity. Results are shown as mean ± SD. As shown in FIG. 13, both R- and S-enantiomers of etodolac activated the PPAR-γ reporter gene construct at concentrations that were readily activated in human plasma after in vivo administration. THP-1 human monocyte cells (ATCC) were incubated with or without phorbol ester (40 ng TPA) and 200 μM racemic etodolac or 20 μM troglitazone. After 3 days of culture, surface expression of the scavenger receptor CD36 was measured by flow cytometry. As shown in FIG. 14, both R- and S-etodolac caused the expression of CD36, a marker of PPAR-γ activation, during macrophage differentiation in the human cell line THP-1.
[0059]
Example 10 Etodolac Treatment of Prostate Cancer Tissue Sample
Prostatectomy sample obtained 3mm ³ Absence (A, 400x) or absence (B, 400x) of racemic etodolac or absence of purified R enantiomer in RPMI-1640 supplemented with 10% FBS and antibody for 72 hours (C, 400x) or presence (D, 400x). Tissues were fixed in 4% paraformaldehyde PBS, embedded in paraffin, sectioned, and stained with exatoxylin and eosin. FIG. 15A shows infiltrating tumor cells (macronuclei) and some residual normal epithelium. Figures 15B to 15D show the effect of etodolac: note the abundance of concentrated apoptotic nuclei (black arrows, B and D) and the disruption of the nascent glandular architecture (B + C). Etodolac is selectively toxic to tumor cells, but did not affect normal basal cells. The racemic mixture (R / S) and the purified R and S analogs were both active.
[0060]
Example 11 Anticipated Protocol for Screening to Identify Etodolac Analogs
A. Screening of analogs by competition with radiolabeled R-etodolac
Cancer cells, such as etodolac-sensitive chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells, are used for drug screening in a radioreceptor binding assay. Briefly, the frozen CLL is washed three times with Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) and resuspended in HBSS-HEPES. A total of 200 μl containing approximately 2 million cells, [3H] -R-etodolac (sp.act. 20-25 Ci / mmol, prepared by Sibtech), and potential competitors or buffers, were added to the temperature (4 and 37 ° C) and time (0-60 minutes). For each sample, three 50 μl aliquots are overlaid in 300 μl 20% sucrose HBSS-HEPES in a 1.5 ml polypropylene snap top tube and pelleted in a Beckman microfuge for 2.5 minutes at 15000 rpm. By this operation, etodolac of cell binding and cell release is rapidly separated. The tube tip is excised, the cell pellet solubilized and counted on a scintillation counter. Some incubation mixtures contain an excess of unlabeled etodolac as a control. Specific binding is the difference in cpm in tubes containing radiolabeled etodolac minus the bound cpm in tubes containing radiolabeled etodolac and unlabeled cold competing etodolac. The test agent is compared to unlabeled cold competing etodolac for its ability to inhibit radiolabeled etodolac binding. Compounds that can inhibit the binding of radiolabeled etodolac to its receptor are subjected to a subsequent screen.
[0061]
B. Intracellular Ca in CLL ²⁺ Mobilization of
Increases in calcium levels in CLL cells by test compounds such as etodolac analogs were determined by flow cytometry assay (FACS) and by a fluorescence imaging plate reader system (FLIPR, Molecular Devices Corp) using Fluo-4 dye (Molecular Probes). , Sunnyvale, CA). Briefly, CLL cells (5 × 10 ⁶ / Ml) for 30 minutes with 4 μM Fluo-4 dye at 37 ° C. in serum-free medium, wash twice, and resuspend in normal cell culture medium for another 30 minutes. The treated cells are mixed with the medium containing the test agent in a FACS tube and immediately examined for fluorescence by FACS analysis for a minimum of 3 minutes. For high information content screening (HTS) assays, screens are performed in a 96-well plate format using the same fluorescent dye (Fluo-4) by a FLIPR-based assay. As a positive control, calcium ionophore ionomycin is used at a final concentration of 50 ng / ml with chemokines such as SDF-1 and IP-10, and with anti-IgM cross-linked antibodies. Ca by CLL cells ⁺² Compounds that increase uptake, preferably those that increase to levels induced by R (-) etodolac, are subjected to subsequent screening.
[0062]
C. Chemotaxis and chemotaxis assays
Cell migration is examined in a 24-well modified Boyden chamber (Transwell, Corning-Costar, NY). Recombinant human IP-10 chemokine (R & D Systems, McKinley Place, NE) is diluted to 200 ng / ml in RPMI-1640 medium and used to test the chemotaxis of lymphocytes from B-CLL patients. A 3 mm pore size polycarboxylate membrane is used. A total of 600 ml of chemokine or control medium was placed at the bottom of the wells and 100 mL of 2-5.0 x 10 ⁶ Add cells / ml cells above the wells. 5% CO at 37 ° C ₂ For 2 hours. The membrane is then removed and the cells at the bottom are quantified by flow cytometry. For cell quantification, a fixed acquisition time of 30 seconds is used per sample and beads are used during each test to confirm reproducible acquisition. A test agent that induces a chemotactic response in lymphocytes, such as a chemotactic response, a test agent that is at least as effective as R (-) etodolac, proceeds to the next screening.
[0063]
D. Induction of apoptosis in cancer cells
The apoptotic activity of test agents, eg, R-etodolac analogs, was measured in primary CLL cells and other tumor cells by using the MTT assay and by measuring the catalytic activation of caspase-3 using a fluorescence assay. test. Briefly, cells are incubated for up to 3 days in the presence of serial dilutions of a selected test agent. Cell viability is quantified in a 96-well plate by adding MTT reagent (final 1 mg / ml) for 24 hours, followed by SDS cell lysis and spectrophotometric analysis at 570 nm. Caspase catalytic activity is measured in a 96-well plate assay, using a specific fluorometric substrate (DEVD-AMC), lysing the treated cells with CHAPS / NP-40 degradation buffer, and measuring with a fluorometric assay. Test agents that exert apoptotic activity, for example, test agents that preferably increase at least as effectively as R (−) etodolac, are subjected to the next screen.
[0064]
E. FIG. Lymphocyte depletion in mice
The selected test drugs are given to mice of various histories in single doses of 25 and 100 mg / kg. The number of leukocytes is counted using a Neubauer chamber at 4 and 24 hours, 7 and 14 days after treatment. Test agents that do not substantially reduce leukocyte levels, preferably those that do not reduce more than R (−) etodolac, are advanced to the next screen.
[0065]
F. Tumor animal model
The anti-cancer and prophylactic activity of the R-etodolac analog is tested using a pristane-induced mouse myeloma model and a transgenic adenocarcinoma mouse prostate (TRAMP) model. Mice receive a diet supplemented with 0.05-0.5% of the selected test agent or control. The test diet is in the form of sterile pellets containing the test agent. For cancer prevention studies in a mouse myeloma model, food administration begins at the same time as the first pristane injection. For transgenic prostate cancer models, dietary administration begins at birth. For treatment studies, food administration is started in TRAMP mice at 10 weeks, at which time the first histological pathological marker is constantly examined. Based on the activity of inhibiting cancer in at least one of these screens, the analog is advanced to clinical trials or further development.
[0066]
All publications and patent documents cited above are hereby incorporated by reference. The invention has been described with various specific and preferred embodiments and techniques. However, it should be understood that many changes and modifications can be made within the spirit and scope of the invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the sensitivity of normal peripheral blood lymphocytes (PBL) to racemic etodolac.
FIG. 2 is a graph showing the sensitivity of CLL to racemic etodolac.
FIG. 3 is a graph showing the synergistic effect of a combination of racemic etodolac and fludarabine on CLL cells.
FIG. 4 is a graph showing the synergistic effect of a combination of 50 μM etodolac and 10 μM 2CdA or 10 mM fludarabine on CLL cells.
FIG. 5 is a graph showing the sensitivity of CLL cells to S- and R-etodolac.
FIG. 6 displays the viability of CLL cells from two patients before and after etodolac administration.
FIG. 7 displays the viability of CLL cells from two patients before and after etodolac administration.
FIG. 8 displays flow cytometry analysis on CLL cells before and after etodolac administration.
FIG. 9 displays the selective effect of R (−) etodolac on MM cells from two patients.
FIG. 10 displays the selective effect of R (−) etodolac on MM cells from two patients.
FIG. 11 is a photograph of an SDS-PAGE gel showing that etodolac induces a rapid down-regulation in Mcl-1 (Panel A) and Bag-1 (Panel B) blocked by MG-132. is there.
FIG. 12 is a photograph of an SDS-PAGE gel displaying PPAR-γ expression by seven cancer cell lines.
FIG. 13 is a graph showing induction of PPAR-γ expression by etodolac and indomethacin.
FIG. 14 is a graph depicting etodolac and TGZ-induced CD36 expression in the presence or absence of TPA in human monocytes.
FIG. 15 is a photograph of prostate cancer tissue sections untreated (A) and treated (B, C, D) with etodolac.

Claims (50)

The following formula (I):

Wherein R ¹ is lower alkyl, lower alkenyl, (hydroxy) lower alkyl, lower alkynyl, phenyl, benzyl or 2-thienyl, and R ² , R ³ , R ⁴ , and R ⁵ are the same or different And each R ⁶ is independently hydrogen, lower alkyl, hydroxy, (hydroxy) lower alkyl, lower alkoxy, benzyloxy, lower alkanoyloxy, nitro or halo; -3, R ⁷ is hydrogen, lower alkyl or lower alkenyl, X is oxy or thio, Y is carbonyl, (CH ₂ ) _1-3 or (CH ₂ ) _1-3 SO ₂ in it, Z is, (ω- (4- _{pyridyl) (C} 2 -C ₄ ^{alkoxy), (ω - ((R} 8) (R 9) _{amino) (C} 2 -C ₄ alkoxycarbonyl Shi) [out, ^{R 8} and R ⁹ are each _{H, (C 1 -C 3)} 1-3N with alkyl or N ^(R 8), a 5 or 6 membered containing S or non-peroxide O A heterocycle]; (ω- (OH) (C ₂ -C ₄ )) alkoxy, N (R ⁸ ) CH (R ⁸ ) CO ₂ H, and an amino acid ester of 1′-D-glucuronyloxy. , XZ are (CH) _1-3 R ⁸ [where R ⁸ is OH, (C ₂ -C ₄ ) acyloxy, SO ₃ H, PO ₄ H ₂ , N (NO) (OH), SO ₂ NH ₂ , PO (OH) NH ₂ or tetrazolyl], and pharmaceutically acceptable salts thereof. The compound of claim 1, wherein Z is an ester of L-valine or L-glycine of 2-hydroxyethoxy. 2. The compound of claim 1, wherein Z is N-morpholinoethoxy. Each ^{R 8} is H, CH ₃ or i-Pr, the compound of claim 1. Z is ^{_{+ OCH 2 CH 2 N (CH}} 3) 3, compound of claim 1. A composition comprising a compound of claim 1 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 7. The composition of claim 6, which is a tablet, granule or capsule. 7. The composition of claim 6, wherein the carrier is an aqueous carrier. 9. The composition of claim 8, which is an aqueous solution. A method of inhibiting cancer comprising administering an effective amount of a compound of claim 1 to a mammal suffering from cancer. A method of inhibiting cancer comprising administering an effective amount of the composition of claim 6 to a mammal afflicted with cancer. 12. The method of claim 10 or 11, wherein the cancer is prostate cancer. 12. The method of claim 10 or 11, wherein the cancer is multiple myeloma. 12. The method of claim 10 or 11, wherein the cancer is chronic lymphocytic leukemia. 12. The method of claim 11, wherein the composition is administered orally. 16. The method of claim 15, wherein the method is administered in an enteric coating dosage form. 12. The method of claim 11, wherein the composition is administered parenterally. 12. The method of claim 11, wherein the composition is administered in combination with a chemotherapeutic agent. 13. The method of claim 12, wherein the composition is administered in combination with a chemotherapeutic agent. 19. The method of claim 18, wherein the chemotherapeutic agent is mitoxantrone, prednisone, estramustine, vinblastine or a combination thereof. 13. The method of claim 12, wherein the chemotherapeutic agent is an antiandrogen. 22. The method of claim 21, wherein the antiandrogen is bicalutamide, nilutamide, flutamide, cycloproterone acetate, or a combination thereof. 22. The method of claim 21, wherein the antiandrogen is leuprolide acetate, goserelin acetate, or a combination thereof. (A) examining at least one level of PPAR-γ, Mcl-1 or Bag-1 in a cancer cell isolated from a patient suffering from prostate cancer, wherein the cell is a compound of the following formula (I): Determine if the level is high enough to be sensitive to inhibition by its pharmaceutically acceptable salt:

Wherein R ¹ is lower alkyl, lower alkenyl, (hydroxy) lower alkyl, lower alkynyl, phenyl, benzyl or 2-thienyl, and R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ are the same or different And each R ⁶ is independently hydrogen, lower alkyl, hydroxy, (hydroxy) lower alkyl, lower alkoxy, benzyloxy, lower alkanoyloxy, nitro or halo, and n is 1 -3, R ⁷ is hydrogen, lower alkyl or lower alkenyl, X is oxy or thio, Y is carbonyl, (CH ₂ ) _1-3 , (CH ₂ ) _1-3 C ( O) or (CH ₂ ) _1-3 SO ₂ , and Z represents (ω- (4-pyridyl) (C ₂ -C ₄ alkoxy), (ω-((R ⁸ ) (R ⁹ ) Amino) (C ₂ -C ₄ alkoxy) wherein R ⁸ and R ⁹ are each _1-3 H (R ⁸ ), S or non-peroxide together with H, (C ₁ -C ₃ ) alkyl or N A 5- or 6-membered heterocycle containing O]; (ω- (OH) (C ₂ -C ₄ )) alkoxy, N (R ⁸ ) CH (R ⁸ ) CO ₂ H, 1′-D-glu. X-Y is (CH ₂ ) _1-3 R ⁸ [where R ⁸ is OH, (C ₂ -C ₄ ) acyloxy, SO ₃ H, PO ₄ H ₂ , N (NO) (OH), SO ₂ NH ₂ , P (O) (OH) (NH ₂ ) or tetrazolyl], and (b) inhibiting the compound of formula (I) in the patient and inhibiting the cells Or an amount effective to sensitize the cells to inhibition by administration of a chemotherapeutic agent. To be administered at
A therapeutic method comprising: 25. The method of claim 24, wherein YZ is a pyridylalkyl ester, a morpholinoalkyl ester, an aminoalkyl ester or a hydroxyalkyl ester. Y-Z is _CH 2 CO ₂ H glucamine ester or N- _(C 1 -C ₄₎ alkyl - is a glucamine ester The method of claim 24. Y-Z is a 1'-D-glucuronic acid ester of _{CH 2} CO 2 H, The method of claim 24. Y-Z is a water-soluble amide of _{CH 2} CO 2 H, The method of claim 24. Y-Z is an amino acid amide of _{CH 2} CO 2 H, The method of claim 28. 25. The method of claim 24, wherein the PPAR-γ level is tested. Contacting a population of cells from a prostate cancer cell line that expresses PPAR-γ with a test agent, and inhibiting prostate cancer cells, comprising determining whether the agent increases PPAR-γ expression in the cells A method to determine the ability of a test drug. Prostate cancer, comprising contacting a population of cells from a prostate cancer cell line expressing Mcl-1 or Bag-1 with a test agent and determining whether the agent reduces Mcl-1 expression in the cells. A method to determine the ability of a test agent to inhibit cells. A method of determining the ability of a test agent to inhibit cancer, comprising determining whether the test agent competitively inhibits receptor-mediated binding of radiolabeled etodolac to cancer cells. 34. The method of claim 33, wherein the cancer cells are etodolac-sensitive. 34. The method of claim 33, wherein the etodolac is R (-) etodolac. 36. The method of claim 31-35, comprising determining whether the agent increases calcium uptake by the cancer cells. 37. The method of claim 36, further comprising determining whether the test agent induces a chemokinetic response in the lymphocyte population. 38. The method of claim 37, wherein the response enhances the ability of the lymphocytes to exert chemotaxis. 39. The method of claim 38, wherein the lymphocytes comprise B-CLL lymphocytes. 38. The method of claim 37, comprising determining whether the test agent is capable of inducing apoptosis in the cancer cells. 41. The method of claim 40, wherein the cancer cells are CLL cells. 41. The method of claim 40, comprising determining whether the test agent is capable of increasing caspase-3 activity. 41. The method of claim 40, further comprising determining whether the test agent reduces the white blood cell count of the test animal. 44. The method of claim 43, wherein the test animal is a mouse. 44. The method of claim 43, comprising determining whether the test agent is capable of inhibiting cancer induction in a pristane-induced murine MLL model. 44. The method of claim 43, further comprising determining whether the test compound is capable of inhibiting cancer in a transgenic adenocarcinoma mouse prostate cancer model. (A) isolating prostate cancer cells from a human subject;
(B) testing whether the cells express PPAR-γ at a level sufficient to provide the subject with inhibition by a compound that activates PPAR-γ in prostate cancer cells;
A method for determining the susceptibility of prostate cancer to treatment with said compound, comprising: (A) isolating prostate cancer cells from a human subject;
(B) testing whether the cells express Mcl-1 at a level sufficient to provide the subject with inhibition by a compound that downregulates Mcl-1 or Bag-1 expression in prostate cancer cells;
A method for determining the susceptibility of prostate cancer to treatment with said compound, comprising: A compound according to claim 1 for use in medical therapy. Use of a compound according to claim 1 for the manufacture of a medicament useful for the treatment of a disease in a mammal such as a human.

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