JP2004513611A - Lipid metabolizing enzymes - Google Patents
Lipid metabolizing enzymes Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004513611A JP2004513611A JP2001582545A JP2001582545A JP2004513611A JP 2004513611 A JP2004513611 A JP 2004513611A JP 2001582545 A JP2001582545 A JP 2001582545A JP 2001582545 A JP2001582545 A JP 2001582545A JP 2004513611 A JP2004513611 A JP 2004513611A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- polynucleotide
- lme
- seq
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明はヒト脂質代謝酵素(LME)およびLMEを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、LMEの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。The present invention provides human lipid metabolizing enzymes (LMEs) and polynucleotides that identify and encode LMEs. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disease associated with abnormal expression of LME.
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、脂質代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。 本発明はまた、これらの配列を利用した癌、神経系疾患、自己免疫/炎症疾患、胃腸系疾患、および心血管疾患の診断・治療・予防に関する。 本発明はさらに、脂質代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【0002】
(発明の背景)
脂質は、クロロフォルムやエーテルのような無極性の溶媒に溶性で、非水溶性で油性又は脂肪性の物質である。中性脂肪(トライアシルグリセロール)は、主要な燃料源とエネルギー貯蔵の役割を果たす。燐脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、コレステロールのような極性脂質は、重要な細胞膜の構造要素である(脂質代謝は、Stryer, L. (1995) Biochemistry, W.H. Freeman and Company, New York NY、Lehninger, A. (1982) Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Inc. New York NY、及びベーリンガーマンハイムのウエッブサイト「http://www.expasy.ch/cgibin/searchbiochemindex」のExPASy 「Biochemical Pathways」インデックスに概説されている)。
【0003】
脂肪酸は、1つのカルボキシル基と1つの長い無極性の炭化水素の尾をもった、長鎖の有機酸である。長鎖脂肪酸は、生物膜の構成単位である糖脂質、燐脂質、及びコレステロールの重要な成分であり、生物での燃料分子であるトリグリセリドの重要な成分でもある。長鎖脂肪酸は、エイコサノイドの基質ともなり、ある種の複雑な炭水化物とタンパク質の機能的な修飾にも重要である。炭素数が16及び18の脂肪酸が最も一般である。脂肪酸の合成は細胞質内で起こる。第一ステップでは、アセチルコエンザイムA(ConA)カルボキシラーゼ(ACC)が、アセチルConAと重炭酸からマロニルConAを合成する。残りの反応を触媒する酵素が、多機能酵素脂肪酸合成酵素(FAS)と呼ばれる、1つのポリペプチド鎖に共有結合で結合されている。FASは、ConAとマロニルConAからパルミチン酸を合成する。FASには、アセチルトランスフェーラゼ、マロニルトランスフェラーゼ、βケトアセチルシンターゼ、アシルキャリヤータンパク質、βケトアシル還元酵素、脱水酵素、及びチオエステラーゼ作用が含まれる。FAS反応の最終的産物は炭素数16の脂肪酸パルミチン酸である。ERの付属酵素による、パルミチン酸のさらなる伸長と不飽和化によって、個々の細胞で必要な様々の長鎖脂肪酸を生じる。これらの酵素にはNADHシトクロムb5還元酵素、シトクロムb5、及び不飽和化酵素が含まれる。
【0004】
トリグリセロイドや中性脂肪とも呼ばれるトライアシルグリセロールは、動物内の主要なエネルギー貯蔵である。トライアシルグリセロールは、3つの脂肪酸鎖の付いたグリセロールのエステルである。グリセロール−3リン酸は、グリセロールリン酸脱水素酵素によってジヒドロキシアセトンリン酸から、又はグリセロールキナーゼによってグリセロールから生成される。脂肪酸CoAは、脂肪酸CoA合成酵素によって脂肪酸から生成される。グリセロール−3リン酸は、グリセロールリン酸 アシルトランスフェラーゼによって2個の脂肪酸CoAからアシル化され、燐脂質を生じる。燐脂質ホスファターゼは、燐脂質をジアシルグリセロールに変換し、このジアシルグリセロールは次にジグリセリド アシルトランスフェラーゼによってトライアシルグリセロールにアシル化される。燐脂質ホスファターゼとジグリセロイド アシルトランスフェラーゼは、小胞体(ER)膜に結合したトライアシルグリセロール合成酵素を形成する。
【0005】
リン脂質の主要な種類として、グリセロールのバックボーン、2つの脂肪酸鎖、及びリン酸化アルコールからなるホスホグリセリドがある。ホスホグリセリドは細胞膜の成分である。主要なホスホグリセリドは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールがある。ホスホグリセリド合成に関与する多くの酵素は膜に結合している(Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers Inc., New York NY, 494−501ページ)。ホスファチジン酸塩は、ホスファチジン シチジリル転移酵素(ExPASy ENZYME EC 2.7.7.41)によってCDPジアシルグリセロールに変換される。CDPジアシルグリセロールのジアシルグリセロール基からセリン基への転移によってホスファチジルセリンを生じ、また同ジアシルグリセロール基からイノシトール基への転移によってホスファチジルイノシトールを生じる。これらの転移は、それぞれCDPジアシルグリセロールセリンO−ホスファチジル転移酵素、及びCDPジアシルグリセロールイノシトール3ホスファチジル転移酵素(ExPASy ENZYME EC 2.7.8.8、 ExPASy ENZYME EC 2.7.8.11)によって触媒される。ホスファチジルセリン デカルボキシラーゼは、ピルビン酸塩の補助因子を用いて、ホスファチジルセリンからホスファチジルエタノールアミンへの変換を触媒する(Voelker, D.R. (1997) Biochim. Biophys. Acta 1348:236−244)。ホスファチジルコリンは、食物から由来するコリンを用いて、ジアシルグリセロール コリンホスホトラスフェラーゼ(ExPASy ENZYME 2.7.8.2)によって、CDPコリンと1,2ジアシルグリセロールとの反応によって形成される。
【0006】
アルコールが一端に付いた、4個の環状の炭化水素から成るコレステロールは、コレステロールが組み込まれた膜の流動性を弱める。さらに、コレステロールは、コルチゾール、プロゲステロン、エストロゲン、及びテストステロンのようなステロイドホルモンの合成に使用される。コレステロールから誘導される胆汁酸塩は、脂質の消化を促進する。皮膚内のコレステロールは、身体から過剰の水が蒸発するのを防ぐ障壁を形成する。コレステロール生合成の中間生成物から由来する、ファルネソール基とゲラニルゲラニル基は、Rasのようなシグナル伝達に関連するタンパク質、及びタンパク質輸送に関連するタンパク質に翻訳後に加えられる。これらの修飾は、これらのタンパク質の活性に重要である(Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, W.B. Saunders Company, Philadelphia PA, 760−763ページ; Stryer, 前出, 279−280, 691−702, 934の各ページ)。哺乳動物は、de novo生合成と食物の両方から由来するコレステロールを得る。
【0007】
スフィンゴ脂質は、膜脂質の重要なクラスで、長鎖のアミノアルコールであるスフィンゴシンを含む。スフィンゴ脂質は、1つの長鎖脂肪酸、1つの極性ヘッドグループのアルコール、及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体から成る。スフィンゴ脂質の3つのクラスには、スフィンゴミエリン、セレブロシド、及びガングリオシドがある。ヘッドグループとしてホスホコリン又はホスホエタノールアミンを含むスフィンゴミエリンは、神経細胞を取り巻くミエリン鞘に豊富に存在する。グルコース又はガラクトースのヘッドグループを含むガレクトセレブロシドは、脳の特徴である。他のセレブロシドは非神経組織に見つけられる。ヘッドグループが複数の糖ユニットを含むガングリオシドは脳に豊富に存在するが、非神経組織には見られない。
【0008】
プロスタグランジン、プロスタシクリン、トロンボキサン、及びロイコトリエンを含むエイコサノイドは、脂肪酸から由来した20炭素数の分子である。エイコサノイドはシグナル伝達分子で、痛み、発熱及び炎症に関与している。すべてのエイコサノイドの前駆体はアラキドン酸塩で、アラキドン酸塩はホスホリパーゼA2によってリン脂質から、及びジアシルグリセロールリパーゼによってジアシルグリセロールから生成される。ロイコトリエンは、リポキシゲナーゼの作用によってアラキドン酸塩から産出される。
【0009】
細胞内では、脂肪酸は細胞質内の脂肪酸結合タンパク質によって輸送される(Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) *134650 Fatty Acid−Binding Protein 1, Liver; FABP1)。エンドゼピン及びCoA結合タンパク質としても知られるジアゼパム結合阻害剤(DBI)は、内在性のガンマアミノ酪酸(GABA)受容体のリガンドで、GABAの効果を下方調節すると考えられる。DBIは長鎖及び中間の長さの鎖をもつ脂肪酸CoAエステルと非常に強い親和性で結合し、脂肪酸CoAエステルのキャリヤーとして機能している可能性がある(OMIM *125950 ジアゼパム結合阻害剤; DBI; PROSITE PDOC00686 脂肪酸CoA結合タンパク質シグネチャ)。
【0010】
肝臓に貯蔵された脂肪、及び脂肪トリグリセリドは加水分解されて血液中に放出され、運ばれる。遊離の脂肪酸は、アルブミンによって血液中を運ばれる。トライアシルグリセロールとコレステロールのエステルは、リポ蛋白粒子によって運ばれる。粒子は、極性の脂質とアポリポタンパク質によって囲まれた疎水性脂質のコアから構成されている。タンパク質成分が疎水性脂質の溶解性を提供し、また細胞標的シグナルをも含んでいる。リポタンパク質には、乳状脂粒、乳状脂粒残余、超低密度リポ蛋白(VLDL)、中間密度リポ蛋白(IDL)、低密度リポ蛋白(LDL)、及び高密度リポ蛋白(HDL)が含まれる。血漿中のHDLレベルと早発冠状動脈性心疾患の危険性には、強い逆相関関係がある。
【0011】
ミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化酵素は、CoA活性化脂肪酸から2個の炭素のユニットを次々に除くことによって、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸を分解する。主要なベータ酸化経路は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の両方を分解するが、補助経路は不飽和脂肪酸の分解に必要な付加的ステップを行う。ミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化経路は同様の酵素を使用するが、異なる基質特異性と機能をもつ。ミトコンドリアは短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸を酸化して、細胞のためのエネルギーを産生する。ミトコンドリアのベータ酸化は心筋と骨格筋の主要なエネルギー源となっている。飢餓、持久運動、及び糖尿病の場合のようにグルコースレベルが低くなった時は、肝臓でのベータ酸化がケトン体を末梢の循環へ提供する(Eaton, S. 他(1996) Biochem. J. 320:345−357)。ペルオキシソームは短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸、ジカルボン脂肪酸、分岐脂肪酸、プロスタグランジン、生体異物、胆汁酸中間物を酸化する。ペルオキシソームのベータ酸化の主な役割は、毒性の脂肪親和性カルボン酸を短くしてそれらの分泌を促進させ、ミトコンドリアのベータ酸化の前に非常に長い長鎖脂肪酸を短くすることにある(Mannaerts, G.P. 及び P.P. Van Veldhoven (1993) Biochimie 75:147−158)。ベータ酸化に関与する酵素には、CoAシンセターゼ、カルニチンアシルトランスフェラーゼ、アシルCoA脱水素酵素、エノイルCoAヒドラターゼ、L−3ヒドロキシアシルCoA脱水素酵素、β−ケトチオラーゼ、2,4−ジエノイルCoA還元酵素、及びイソメらーゼが含まれる。
【0012】
3つのクラスの脂質代謝酵素をさらに詳細に考察する。その3つのクラスとは、リパーゼ、ホスホリパーゼ、及びリポキシゲナーゼである。
【0013】
リパーゼ
トリグリセリドは、リパーゼによって脂肪酸とグリセロールに加水分解される。脂肪細胞は、貯蔵されたトライアシルグリセロールを分解するリパーゼを含み、脂肪酸を燃料として必要とする他の組織へ輸送するために、脂肪酸を放出する。リパーゼは、動物、植物、及び原核生物に広範囲に分布する。トライアシルグリセロールリパーゼ及びトリブチラーゼとも知られる、トリグリセリドリパーゼ(ExPASy ENZYME EC 3.1.1.3)は、トリグリセリドのエステル結合を加水分解する。高度の脊椎動物には、胃、肝臓、膵臓の各リパーゼを含む、少なくとも3種類の組織特異的アイソザイムが存在する。これらの3つのタイプのリパーゼは、構造的に互いに密接に関連しており、リポ蛋白リパーゼにも構造的に密接に関連している。胃、肝臓、膵臓の各リパーゼで最も保存された部分は、セリン残基を中心とした当たりにあり、そのセリン残基は原核生物のリパーゼにも存在する。セリン残基での変異は、酵素を不活性にする。胃、肝臓、膵臓の各リパーゼは、リポ蛋白トリグリセリドとリン脂質を加水分解する。腸内の胃リパーゼは食物の脂肪の消化と吸収を助ける。肝臓リパーゼは、肝臓組織の内皮表面に結合して、そこで作用する。肝臓リパーゼは、また血漿の脂肪の調整にも主要な役割を果たしている。効率的な食物脂肪の加水分解のために、膵臓リパーゼは補リパーゼと呼ばれる小さいタンパク質補助因子が必要である。補リパーゼはリパーゼのC末端の非触媒ドメインに結合し、それによって活性型コンフォーメーションを安定化させ、全体的な疎水性結合サイトを大きく増加させる。これらの酵素の欠失はヒトで同定されており、すべては異常なレベルの循環リポ蛋白粒子に関連している(Gargouri, Y. 他 (1989) Biochim. Biophys. Acta 1006:255271; Connelly, P.W. (1999) Clin. Chim. Acta 286:243255; van Tilbeurgh, H. 他 (1999) Biochim Biophys Acta 1441:173184)。
【0014】
クリアリング因子リパーゼ、ジグリセリドリパーゼ、又はジアシルグリセロールリパーゼとも知られる、リポプロテインリパーゼ(ExPASy ENZYME EC 3.1.1.34)は、循環血漿中のリポ蛋白中に存在するトリグリセリドとリン脂質を加水分解する。そのリポ蛋白には、乳状脂粒、超低比重と中間比重のリポ蛋白質、及び高比重リポ蛋白質(HDL)が含まれる。リポプロテインリパーゼ(LPL)は、膵臓リパーゼと肝臓リパーゼと共に、高度の一次配列相同性を共有している。リポプロテインリパーゼと肝臓リパーゼは、どちらもグリコサミノグリカンを介して毛細血管の内皮細胞につなぎ留められており、静脈注射によるヘパリン投与によって放出される。LPLは主に脂肪細胞、筋細胞、マクロファージによって合成される。LPLの触媒作用はアポリポ蛋白質C−IIによって活性化され、1M塩化ナトリウムのような高イオン強度条件下で抑制される。ヒトのLPL欠失は、トリグリセリド過剰血、HDL2欠乏症、及び肥満などの代謝の病気の一因となる(Jackson, R.L. (1983), The Enzymes (Boyer, P.D.編集) Vol. XVI, 141186ページ, Academic Press, New York NY; Eckel, R.H. (1989) New Engl. J. Med. 320:10601068)。
【0015】
ホスホリパーゼ
膜のリン脂質の加水分解を触媒する酵素グループであるホスホリパーゼは、リン脂質中で切断される結合によって分類される。ホスホリパーゼはPLA1、PLA2、PLB、PLC、及びPLDのファミリーに分類される。ホスホリパーゼは、エイコサノイド生合成に利用されるアラキドン酸を作ることによって、多くの炎症反応に関与する。アラキドン酸は、リゾ血小板活性因子(lyso−platelet−activating factor)やエイコサノイドのような、炎症の生物活性のある脂肪の媒介物にプロセスされる。膜のリン脂質からアラキドン酸合成は、エイコサノイドの4種類の主要なクラス(プロスタグランジン、プロスタシクリン、トロンボキサン、ロイコトリエン)の合成の速度制限ステップである。これらのエイコサノイドは痛み、発熱、及び炎症に関与する(Kaiser, E. 他 (1990) Clin. Biochem. 23:349−370)。さらに、ロイコトリエン−B4は、フィードバックループに機能することが知られており、そのフィードバックループがさらにPLA2活性を増加させる(Wijkander, J. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:26543−26549)。
【0016】
分泌性ホスホリパーゼA2(PLA2)スーパーファミリーは、いくつかの異種の酵素より成っており、その共通の特徴はホスホグリセリドのsn−2脂肪酸アシルエステル結合を加水分解することである。グリセロリン脂質の加水分解によって、脂肪酸とリゾリン酸が放出される。PLA2活性は、生物活性のある脂肪、ヒドロキシ脂肪酸、及び血小板活性因子の前駆体を産生する。PLA2は蛇毒の成分として記述されたのを始めとして、後には多くの種で特徴づけられている。PLA2は従来、アミノ酸配列、2価陽イオン要求性、及びジスルフィド結合の位置を基に、いくつかの主要なグループとサブグループに分類されてきた。グループI、II、及びIIIのPLA2は、低分子量をもつ分泌型のCa2+依存性タンパク質から構成されている。グループIVのPLAは主に85キロダルトンのCa2+依存性細胞質内ホスホリパーゼである。最後に、いくつかのCa2+非依存性のPLA2が記述されており、それらがグループVを構成する(Davidson, F.F. 及び E.A. Dennis (1990) J. Mol. Evol. 31:228238; Dennis, E.F. (1994) J. Biol Chem. 269:13057−13060)。
【0017】
非常に良く特徴付けられた最初のPLA2は、蛇毒と蜂毒に見つけられるグループI、II、IIIのPLA2であった。これらの毒のPLA2は、共通の触媒作用、同じCa2+要求性、及び保存された1次構造と3次構造を含めた多くの特徴を動物のPLA2と共有する。えじきの消化の役割に加え、毒のPLA2は、動物組織で神経毒性、筋毒性、抗凝血性、及び炎症誘発性の効果を示す。この幅広い病態生理学的効果は、様々な細胞と組織上のこれらの酵素への特異的で高親和性の受容体の存在による(Lambeau, G. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:5534−5540)。
【0018】
グループI、IIA、IIC、及びVからのPLA2は哺乳類と鳥類の細胞ですでに記述されており、当初は組織分布によって分類されたが、その区別はもはや絶対的ではない。グループIのPLA2は膵臓に見つかり、グループIIAとIICは炎症に関連する組織(例えば、滑膜)から、またグループVは心臓組織から見つかる。膵臓のPLA2は食物脂質の消化機能を果たし、細胞増殖、平滑筋収縮、及び急性肺損傷で、ある種の役割を果たすと提案されている。グループIIの炎症PLA2は、炎症過程の強力な媒介物であり、炎症障害をもつ患者の血清と滑液に高度なレベルで発現されている。グループIIの炎症PLA2は、アッセイされたほとんどのヒト細胞タイプで見つかっており、敗血性ショック、腸癌、慢性関節リューマチ、上皮過形成などの広範囲の病理学的過程で発現されている。グループVのPLA2は脳組織よりクローンされており、心臓組織で強度に発現されている。ヒトのPLA2は胎児の肺から最近クローンされ、その構造的特性に基づくと、グループXと呼ばれる、哺乳類PLA2の新しいグループの最初のタンパク質となる様相である。他のPLA2が種々のヒト組織と細胞株からクローンされており、PLA2の広い多様性を示唆している(Chen, J. 他 (1994) J. Biol. Chem. 269:23652368; Kennedy, B.P. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270: 22378−22385; Komada, M. 他 (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 168:1059−1065; Cupillard, L. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:15745−15752; Nalefski, E.A. 他 (1994) J. Biol. Chem. 269:18239−18249)。
【0019】
リゾホスホリパーゼ、レシチナーゼB、又はリゾレシチナーゼとも知られる、ホスホリパーゼB(PLB)(ExPASy ENZYME EC 3.1.1.5)は、細胞内の脂質を代謝し、広範囲に分布する酵素であり、多くのアイソフォームがある。約15〜30kDの小さいアイソフォームは加水分解酵素として機能し、60kDを越える大きなアイソフォームは加水分解酵素とアシル基転移酵素の両方の機能をする。PLBの特別の基質であるリゾホスファチジルコリンは、形成された時又は細胞内に輸送された時に、細胞膜の溶解を起こさせる。PLBは、アシルカルニチン、アラキドン酸、及びホスファチジン酸を含む脂質因子によって調節されている。これらの脂質因子は、炎症反応を含む多くの経路で重要なシグナル分子である(Anderson, R. 他 (1994) Toxicol. Appl. Pharmacol. 125:176−183; Selle, H. 他 (1993); Eur. J. Biochem. 212:411−416)。
【0020】
ホスホリパーゼC(PLC)(ExPASy ENZYME EC 3.1.4.10)は、膜貫通シグナル伝達に重要な役割を果たしている。ホルモン、成長因子、神経伝達物質、及び免疫グロブリンを含む多くの細胞外シグナル分子は、それぞれに対応する細胞表面受容体に結合し、PLCを活性化する。活性化したPLCの役割は、細胞膜の少量の成分である、ホスファチジルイノシトール−4、5−2リン酸(PIP2)を加水分解し、ジアシルグリセロールとイノシトール1、4、5−3リン酸(IP3)を産生する。IP3とジアシルグリセロールは、それぞれの生化学的経路でセカンドメッセンジャーとして働き、一続きの細胞内反応を誘発する。IP3は細胞内の貯蔵からCa2+を放出し、ジアシルグリセロールはタンパク質キナーゼC(PKC)を活性化させる。両方の経路も、分泌、神経作用、代謝、及び細胞増殖を含んだ細胞過程を調節する膜貫通シグナル伝達メカニズムの一部である。
【0021】
いくつかの異なるPLCのアイソフォームが同定されており、PLC−β、PLC−γ、PLC−Δと分類されている。サブタイプは、PLC−β−1のようにギリシャ文字の後にアラビア数字を加えることによって名付けられる。PLCは62〜68kDaの分子量をもち、そのアミノ酸配列は2つの領域に相当の類似性を示す。Xと名づけられた、この最初の領域は約170アミノ酸があり、2番目のY領域は約260アミノ酸を含んでいる。
【0022】
PLCの3つのアイソフォームの触媒作用は、Ca2+に依存する。PLC中のCa2+の結合部位は、2ヵ所の保存領域の1つであるY領域に位置すると考えられている。ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトール4−1リン酸(PIP)、及びホスファチジルイノシトール4、5−2リン酸(PIP2)のような共通のイノシトールを含んだリン脂質の、これらのアイソフォームのいずれによる加水分解は、環状及び非環状のイノシトールリン酸を生じる(Rhee, S.G. 及び Y.S. Bae (1997) J. Biol. Chem. 272:1504515048)。
【0023】
すべての哺乳類のPLCには、約100アミノ酸の長さで、両親和性のαへリックスの側面に位置する2個の逆平行のβシートから成る、プレックストリン相同性(PH)ドメインがある。PHドメインは、Gタンパク質のβ/γサブユニット又はPIP2のいずれかと相互作用して、PLCを膜の表面に導く(PROSITE PDOC50003)。
【0024】
レシチナーゼD、リポホスホジエステラーゼII、及びコリンホスファターゼとも知られる、ホスホリパーゼD(PLD)(ExPASy ENZYME EC 3.1.4.4)は、ホスファチジルコリンおよび他のリン酸の加水分解を触媒してホスファチジン酸を産生する。PLDは、膜小胞の輸送、細胞骨格ダイナミックス、及び膜貫通シグナル伝達に重要な役割を果たしている。さらに、PLDの活性化が細胞分化及び成長に関与する(Liscovitch, M. (2000) Biochem. J. 345:401415の概説を参照)。
【0025】
ホルモン、神経伝達、成長因子、サイトカイン、タンパク質キナーゼCの活性剤、及びGタンパク質に連結された受容体に結合するアゴニストを含む広範囲な刺激に反応して、哺乳類細胞内でPLDが活性化される。少なくとも2種類のタイプのPLD、PLD1とPLD2、が同定されている。PLD1はタンパク質キナーゼCαと小さいGTPaseのARFとRhoAによって活性化される(Houle, M.G. 及び S. Bourgoin (1999) Biochim. Biophys. Acta 1439:135149)。PLD2は、オレイン酸のような不飽和脂肪酸によって選択的に活性化され得る(Kim, J.H. (1999) FEBS Lett. 454:4246)。
【0026】
リポキシゲナーゼ
リポキシゲナーゼ(ExPASy ENZYME EC 1.13.11.12)は非ヘム鉄を含む酵素で、リポ蛋白のような、ある種の多価不飽和の脂肪酸の二原子酸化添加を触媒する。リポキシゲナーゼは植物、真菌、及び動物に広範囲に見つけられる。いくつかの異なるリポキシゲナーゼが知られており、それぞれが特徴のある酸化作用をもっている。動物では、炭素−3、5、8、11、12、15の位置でアラキドン酸の二原子酸化添加を触媒する特殊なリポキシゲナーゼがある。これらの酵素は、二原子酸化添加するアラキドン酸の位置によって名前がついている。動物のリポキシゲナーゼは、約75〜80 kDaの分子量をもつ一本鎖のポリペプチド鎖をもつ。リポキシゲナーゼはN末端バレルドメインと非ヘム鉄の一原子を含んだ大きな触媒ドメインをもつ。その鉄を含んだ酵素が酸化されて活性状態になることが、触媒に必要である(Yamamoto, S. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1128:117−131; Brash, A.R. (1999) J. Biol. Chem. 274:2367923682)。様々のリポキシゲナーゼ阻害剤が存在し、阻害メカニズムによって5種類の主要カテゴリに分類される。これらのカテゴリには、鉄キレート、基質類似体、リポキシゲナーゼ活性化タンパク質阻害剤、そして最後に表皮成長因子受容体阻害剤が含まれる。
【0027】
LOX3又はAloxe3とも知られる3−リポキシゲナーゼが最近、マウス表皮からクローンされた。Aloxe3はマウスの染色体11にあり、Aloex3の推定アミノ酸配列は12−リポキシゲナーゼの配列と54%同一である(Kinzig, A. (1999) Genomics 58:158−164)。
【0028】
アラキドン酸:酸素5−酸化還元酵素とも知られる、5−リポキシゲナーゼ(5−LOX、ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.34)は、主に白血球、マクロファージ、及びマスト細胞に見つかっている。5−LOXはアラキドン酸をまず5−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸に変換し、次にロイコトリエン(LTA4(5,6−オキシド−7、9、11、14−エイコサテトラエン酸)に変換する。次に起こるロイコトリエンA4加水分解酵素によるロイコトリエンA4の変換によって、潜在的な好中球の化学誘引物質であるロイコトリエンB4を生じる。或いは、ロイコトリエンC4シンターゼによるLTA4のグルタチオン結合とそれに引き続く代謝によって、特に喘息で気管反応性と粘液分泌に影響を与えるシステイニルロイコトリエンが生じる。大半のリポキシゲナーゼは、その他の補助因子やタンパク質を活性のために必要としない。対照的に、哺乳類の5−LOXはカルシウムとATPを必要とし、5−LOX活性化タンパク質(FLAP)の存在下で活性化される。FLAP自体がアラキドン酸に結合し、5−LOXに基質を供給する(Lewis, R.A. 他 (1990) New Engl. J. Med. 323:645655)。5−LOXとFLAPの発現が、叢状(原発)肺高血圧症で増加していているのが見つけられている(Wright, L. 他(1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:219229)。
【0029】
12−リポキシゲナーゼ(12−LOX、ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.31)は、アラキドン酸を酸素添加して、12−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸(12−HPETE)を形成する。哺乳類の12−リポキシゲナーゼは、その発現の原型の組織をとって命名されている(従って、白血球タイプ、血小板タイプ、または表皮タイプ)。血小板タイプの12−LOXは表皮標本と類表皮細胞中で最も多いアイソフォームであることが見つけられている。白血球タイプの12−LOXは最初にブタの白血球で非常に良く特徴付けられ、免疫化学アッセイで哺乳類の組織に広範囲な分布を示すことが見つけられた。組織分布に加え、白血球タイプの12−LOXは、アラキドン酸基質から12−HPETE(ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸)に加え15−HPETEを産生する能力で血小板タイプの酵素と区別できる。白血球タイプ12−LOXは15リポキシゲナーゼ(15−LOX)に非常に関連している。その両者は二重特異性リポキシゲナーゼであり、より高度な哺乳類でその1次構造が約85%一致している。白血球タイプ12−LOXは気管上皮、白血球、およびマクロファージに見つけられる(Conrad, D.J. (1999) Clin. Rev. Allergy Immunol.17:7189)。
【0030】
15−リポキシゲナーゼ(15−LOX、ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.33)は、ヒトの網赤血球、気管表皮、及びエオシン好性白血球に見つかっている。15−LOXは哺乳類、特にウサギとヒトのアテローム動脈硬化病変部に検知されている。リポ蛋白の酸化修飾の他に、この酵素はアテローム動脈硬化病変部での炎症反応に重要である。15−LOXはサイトカインIL−4でヒトの単球に誘導されることが示されており、このIL−4は炎症過程に関与することが知られている(Kuhn, H. 他 S. Borngraber (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 447:528)。
【0031】
疾患との相関関係
脂質代謝は、ヒトの疾患と傷害に関与する。動脈疾患のアテローム性動脈硬化では、動脈壁の内側に脂肪性病変が形成する。これらの病変は動脈の柔軟性を失わせ、血塊形成を助長する(Guyton、前出)。テイーサックス病では、Nアセチルヘキソサミニダーゼ酵素の欠如により、GM2ガングリオシド(ある種のスフィンゴ脂質)が中枢神経系のリソゾームに蓄積する。患者は早期の死に至る神経系変性をこうむる(Fauci, A.S. et al. (1998) Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw−Hill, New York NY, 2171ページ)。ニーマンピック病は脂質代謝の欠陥によって起こる。ニーマンピック病のAとBタイプでは、スフィンゴミエリン分解酵素の欠陥により、スフィンゴミエリン(ある種のスフィンゴ脂質)と他の脂質が中枢神経系に蓄積し、神経系変性と肺病を起こさせる。ニーマンピック病のCタイプは、コレステロールの輸送の欠陥から起こり、スフィンゴミエリンとコレステロールがリソゾームに蓄積とスフィンゴミエリン分解酵素の活性の二次的な減少に至らせる。大発作、失調症、以前に学んだ言語能力の損失等の神経系症状が生後1〜2年後に現れる。推定上のコレステロール感知ドメインを含むNPCタンパク質でのある突然変異が、ニーマンピック病タイプCのマウスモデルで見つかった(Fauci, 前出 2175ページ; Loftus, S.K. 他 (1997) Science 277:232−235)。
【0032】
PLAは様々な病気の過程に関与していると考えられる。例えば、PLAは膵臓、心臓組織、炎症に関連する組織に見つけられている。膵臓のPLAは食物脂質の消化機能を果たし、細胞増殖、平滑筋収縮、及び急性肺損傷で、ある種の役割を果たすと提案されている。炎症PLAは、炎症過程の強力な媒介であり、炎症障害をもつ患者の血清と滑液に高度なレベルで発現されている。炎症PLAは、ほとんどのヒト細胞タイプで見つかっており、敗血ショック、腸癌、慢性関節リューマチ、上皮過形成などの広範囲の病理学的過程で発現されている。
【0033】
ヒトの組織でのPLBの役割が様々な研究で調べられてきた。PLBによるリゾホスファチジルコリンの加水分解が赤血球膜で溶解を起こさせる(Selle、前出)。同様に、Endersen,M.J.他(1993; Scand. J. Clin. Invest. 53:733739)は、子かん前症の女性でPLBによるリゾホスファチジルコリンの増加した加水分解が、遊離の脂肪酸を血清に放出させることを報告した。腎臓の研究では、PLBがNa+,K+−ATPaseをシクロスポリンAの細胞毒性と細胞融解性の効果から保護することが示された(Anderson、前出)。
【0034】
リパーゼ、ホスホリパーゼ、及びリポキシゲナーゼは、アテローム性動脈硬化、肥満、喘息、及び癌のような複雑な疾患に寄与し、またウォルマン病やタイプ1高リポ蛋白症のようなシングル遺伝子欠陥に寄与しているとも考えられる。
【0035】
新規の脂質代謝酵素、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。 この新規の組成物は、癌、神経疾患、自己免疫/炎症の障害、胃腸疾患、および心臓血管系障害の診断・治療・予防において有用であり、また、脂質代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【0036】
(発明の要約)
本発明は、総称して「LME」、個別にはそれぞれ「LME−1」、「LME−2」、「LME−3」、「LME−4」、および「LME−5」と呼ぶ脂質代謝酵素である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片を含む群から選択した実質上単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、SEQ ID NO:1−5のアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチドを提供する。
【0037】
また、本発明は(a)SEQ ID NO:1−5(配列番号1乃至5)を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードするような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号1乃至5を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:6−10(配列番号6乃至10)を有する群から選択される。
【0038】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列からなる天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【0039】
また、本発明は(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む実質上単離されたポリペプチドを製造する方法を提供する。 製造方法は、(a)組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、(b)そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有する。
【0040】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような実質上単離された抗体を提供する。
【0041】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列、(b)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも60の連続したヌクレオチドを有する。
【0042】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)SEQ ID NO:6−36を有する群から選択したポリヌクレオチド配列、(b)SEQ ID NO:6−36を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、(a)サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(b)ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む。
【0043】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)SEQ ID NO:6−36を有する群から選択したポリヌクレオチド配列、(b)SEQ ID NO:6−36を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(b)標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【0044】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む。一実施例では、SEQ ID NO:1−5からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的LMEの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0045】
本発明はまた、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的LMEの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0046】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的LMEの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0047】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【0048】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列、(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物と混合させる過程と、(b)ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、(c)試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【0049】
更に本発明は、SEQ ID NO:6−10からなる一群から選択された配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、(a)この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、(b)この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【0050】
本発明は更に、(a)核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、(b)(i)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも20の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む天然のポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、(c)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(d)処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【0051】
(発明の記載について)
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【0052】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体が含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【0053】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【0054】
(定義)
用語「LME」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種(特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物)から得られる実質的に精製されたLMEのアミノ酸配列を指す。
【0055】
用語「アゴニスト」は、LMEの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、LMEに直接相互作用するか、或いはLMEが関与する生物学的経路の成分と作用して、LMEの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【0056】
用語「対立遺伝子変異配列」は、LMEをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも1つの突然変異から作製し得る。また、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、1個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【0057】
LMEをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、LMEと同じポリペプチド或いはLMEの機能特性の少なくとも1つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、LMEをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにLMEをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なLMEとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にLMEの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【0058】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【0059】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて行う。
【0060】
用語「アンタゴニスト」は、LMEの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、LMEに直接相互作用するか、或いはLMEが関与する生物学的経路の成分と作用して、LMEの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【0061】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab’)2、及びそれらの断片、Fv断片などの無傷の分子を指す。LMEポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。動物(マウス、ラット、ウサギ等)を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好みに応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等がある。結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【0062】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域(即ちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基(タンパク質の特定の領域または3次元構造)に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原(即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原)と競合し得る。
【0063】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス(コーディング)鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAや、RNAや、ペプチド核酸(PNA)や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、2’−メトキシエチル糖または2’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5−メチルシトシン、2−デオキシウラシルまたは7−デアザ−2’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現はアンチセンス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。
【0064】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のLME、合成のLMEまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【0065】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする2つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「5’A−G−T3’」は、相補配列「3’T−C−A5’」に結合する。
【0066】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。LME若しくはLMEの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。 このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム;SDS)及びその他の構成エレメント(例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のDNA等)を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【0067】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL−PCRキット(PE Biosystems,Foster City CA)を用いて5’及び/または3’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム(GCG, Madison, WI)またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて1つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及びアセンブルの両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【0068】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。 即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
保存アミノ酸置換では通常、(a)置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、(b)置換部位における分子の電荷または疎水性、及び/または(c)側鎖の大部分を保持する。
【0069】
用語「欠失」は、1個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは1個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【0070】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも1つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化(pegylation)、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドから少なくとも1つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【0071】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【0072】
「示差発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加、または非調節、あるいは減少、下方調節、または欠損遺伝子またはタンパク発現を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【0073】
用語「断片」は、LME またはLME をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列(parent sequence)と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、画定された配列の全長から1ヌクレオチド/アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、5〜1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の250または500アミノ酸(またはポリペプチドの最初の25%または50%)から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【0074】
SEQ ID NO:6−10の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:6−10を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:6−10のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:6−10を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:6−10の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【0075】
SEQ ID NO:1−5のある断片は、SEQ ID NO:6−10を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−5のある断片は、SEQ ID NO:1−5を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−5の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【0076】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも1つの翻訳開始コドン(例えばメチオニン)、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【0077】
「相同性」の語は、配列類似性即ち2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。
【0078】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「一致性%」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、2つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、2つの配列をより有意に比較できる。
【0079】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定できる。 このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム(DNASTAR, Madison WI)である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151−153及びHiggins, D.G.他 (1992) CABIOS 8:189−191の文献に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性パーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【0080】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)から提供されており(Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410)、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を含む幾つかの情報源から入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、2つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp(以下に記載)の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、2つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April−21−2000)でblastnを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【0081】
一致率は、完全に画定された(例えば特定の配列番号で画定された)配列長さと比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配列から得られた断片(例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片)の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【0082】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【0083】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性%」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる2つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を(従って機能も)保存する。
【0084】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる(既に説明したのでそれを参照されたい)。CLUSTAL Vを用いて、ポリぺプチド配列を2つ1組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性パーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【0085】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、2つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr−21−2000)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【0086】
一致率は、完全に画定された(例えば特定の配列番号で画定された)ポリペプチド配列の長さと比較して測定し得る。一致率は、配列或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片(例えば少なくとも15、20、30、40、50、70または150の連続した残基の断片)の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【0087】
「ヒト人工染色体(HAC)」は、約6kb(キロベース)〜10MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【0088】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【0089】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。アニーリングが許容される条件下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合(即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合)が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定する。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1%(w/v)のSDS、並びに約100μg/mlのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【0090】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点(Tm)より約5〜20℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の50%がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【0091】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約0.2x SSC及び約1%のSDSの存在の下、約68℃で1時間の洗浄過程を含む。別法では、65℃、60℃、55℃、42℃の温度で行う。SSC濃度は、約0.1%のSDS存在下で、約0.1〜2×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異的ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。 ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【0092】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された2つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析等)。 或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若しくはその核酸が固定される基質)に固定されているような2つの核酸配列間に形成され得る。
【0093】
用語「挿入」或いは「付加」は、1個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【0094】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。 これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【0095】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすLMEのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なLMEのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【0096】
用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【0097】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【0098】
用語「調節」は、LMEの活性の変化を指す。例えば、調節によって、LMEのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【0099】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【0100】
「機能的にリンクした」は、第1の核酸配列と第2の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的にリンクしている。同一のリーディングフレーム内で2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的にリンクしたDNA配列は非常に近接するか、或いは連続し得る。
【0101】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【0102】
LMEの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。 これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、LMEの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【0103】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、LMEやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸配列の増幅(及び同定)に用い得る。
【0104】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80、90、100または150の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【0105】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubi. Assoc. & Wiley−Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer(Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【0106】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各100ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大5,000までの大きめのポリヌクレオチドであって32キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge MA1より入手可能)によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ(mispriming libaray)」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。)PrimerGenプログラム(英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能)は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【0107】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのSambrookらの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメントであって例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。
【0108】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであって例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。ワクシニアウイルスは組換え核酸が発現する哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防御免疫応答を誘導する。
【0109】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び5’及び3’の非翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【0110】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【0111】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【0112】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。LME、LMEをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【0113】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基即ちエピトープ)であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、結合していない標識した「A」及び抗体を含む反応液に、エピトープAを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「A」が存在すると、抗体と結合する標識Aの量が減少する。
【0114】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約60%除去されたものであり、好ましくは約75%以上の除去、最も好ましいくは90%以上除去されたものを指す。
【0115】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【0116】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【0117】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【0118】
「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。 さらに、限られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【0119】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではないが動植物を含み、有機体の1個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989) 等の参考文献に与えられている。
【0120】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May−07−1999)を用いるblastnによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも40%と決定された核酸配列のことである。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の相同性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列(上述)または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多形性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の1つのヌクレオチドが異なる「1塩基多型性」(SNP)も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【0121】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May−07−1999)を用いるblastpによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも40%と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【0122】
(発明)
本発明は、新規なヒト脂質代謝酵素(LME)、LMEをコードするポリヌクレオチド、及び、癌、神経疾患、自己免疫/炎症疾患、胃腸疾患、及び心臓血管系疾患の診断、治療並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくものである。
【0123】
表1は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、1つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号(ポリペプチドSEQ ID NO)とIncyteポリペプチド配列番号(IncyteポリペプチドID)によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号(ポリヌクレオチドSEQ ID NO)とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(IncyteポリヌクレオチドID)によって表示した。
【0124】
表2は、GenBankタンパク質(genpept)データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号(Polypeptide SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリペプチド配列番号(Incyte Polypeptide ID)を示す。列3は、GenBankの最も近い相同体のGenBankの識別番号(Genbank ID NO :)を示す。列4は、各ポリペプチドとそのGenBank相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列5は、GwnBank相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。 これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【0125】
表3は、本発明の各ポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号(SEQ ID NO :)およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号(Incyte Polypeptide ID)を示す。列3は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列4および列5はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列6は、シグネチャ(signature)配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列7は、タンパク質の構造/機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【0126】
表2及び表3は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが脂質代謝酵素であることを確立している。例えば、SEQ ID NO:1はウシのホスホリパーゼC(g304241)とP52残基からQ1052残基まで94%の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。確率スコアは0.00であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している(表2)。代わりの例として、SEQ ID NO:2はマウスグループIIF分泌ホスホリパーゼA2(g6174881)と67%の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。その確立スコアは6.9e−74である(表2)。もう1つの例として、SEQ ID NO:3はネズミのリポキシゲナーゼ3とM1残基からI711残基まで87%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。その確立スコアは0.0である(表2)。SEQ ID NO:3はまた、リポキシゲナーゼドメインとPLAT(ポリシスチン−1、リポキシゲナーゼ、アルファ毒素)/LH2(リポキシゲナーゼ相同性)ドメインを有する。これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された(表3参照)。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:3 がリポキシゲナーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:4はウシのホスホリパーゼC(g163522)とM1残基からL1216残基まで89%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された(表2参照)。そのBLAST確立スコアは0.0である(表2)。SEQ ID NO:4はまた、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCのXとYドメインを有する。これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPSとMOTIFSの分析からのデータは、SEQ ID NO:4がホスホリパーゼCであることをさらに確証する証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:5はネズミのホスホリパーゼC−L2(g6705987)とA3残基からM489残基まで38%同一であり、V624残基からG914まで40%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された。そのBLAST確立スコアは、それぞれ3e−88及び3e−62である。SEQ ID NO:5はまた、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼのXとYドメインを有する。これは、隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された(表3参照)。BLIMPS及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:5がホスホリパーゼであることをさらに確証する証拠を提供する。SEQ ID NO:1−5の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表7で記述されている。
【0127】
表4に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、或いはこれら2種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列1および列2はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号(Polynucleotide SEQ ID NO :)およびそれに対応するIncyte ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号(Incyte Polynucleotide ID)を示す。列3は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列4は、例えば、SEQ ID NO:6−10を同定するため、或いはSEQ ID NO:6−10と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列5はcDNA配列、ゲノムDNAから予想されたコード配列(エキソン)及び/またはcDNA及びゲノムDNAを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表4の列6および列7はそれぞれ、列5の配列に対応するcDNA配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド(5’)位置および終了ヌクレオチド(3’)位置を示す。
【0128】
表4の列5の識別番号は、特に例えばIncyte cDNAとそれに対応するcDNAライブラリに照会し得る。例えば、7412054H1はIncytecDNA配列の識別番号であり、BLADNOR02はそれが由来するcDNAライブラリの識別番号である。cDNAライブラリが示されていないIncyte cDNAは、プールされているcDNAライブラリ(例えば、71200138V1)に由来する。または、列5の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたGenBankのcDNAすなわちEST(例えば、g5514658)の識別番号の場合もある。或いは列5の識別番号は、ゲノムDNAのGenscan分析により予想されるコード領域に照会し得る。例えば、GNN.g6983515_000028_002は、Genscan推定コード配列の識別番号であって、g6983515 がGenscan分析によって得られたGenBankの配列の識別番号である。このGenscan推定コード配列は、配列を組み立てる前に編集する場合がある(例IVを参照)。または列5の識別番号は、「エキソンスティッチング(exon−stitching)」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方の集合に照会し得る。例えば、FL1078033_00001は、1078033がアルゴリズムが採用された配列のクラスタの識別番号であり、00001がアルゴリズムによって生成された予測数である、ステッチ配列を示している(実施例5を参照)。または、列5の識別番号は、「エキソンストレッチング」アルゴリズムによってcDNAおよびGenscan推定エキソンの両方からなる群の場合もある(実施例5を参照)。場合によっては、列5に示されている配列の範囲と重複するIncyte cDNAの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列が決定されるが、それに相当するIncyte cDNAの識別番号は示されていない。
【0129】
表5は、Incyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列をアセンブル及び確認するために用いられるIncyte cDNA配列によって最も頻繁に表されるIncyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表5に示し、表6で説明している。
【0130】
本発明はまた、LMEの変異体も含む。好適なLMEの変異体は、LMEの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつLMEアミノ酸配列に対して少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有する。
【0131】
本発明はまた、LMEをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、LMEをコードするSEQ ID NO:6−10からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID NO:6−10のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配列を含む。
【0132】
本発明はまた、LMEをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、LMEをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70%のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも85%のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:6−10からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約70%、或いは少なくとも約85%、または少なくとも約95%もの一致率を有するようなSEQ ID NO:6−10からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。 上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、LMEの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも1つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【0133】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るLMEをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のLMEのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【0134】
LMEをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のLMEのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するLME或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、LME及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【0135】
本発明はまた、LME及びその誘導体をコードするDNA配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてLMEまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【0136】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:6−10及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399−407、Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507−511を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【0137】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Applied Biosystems)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)を用いることができる。 或いは、例えばELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム(Hamilton, Reno, NV)、PTC200サーマルサイクラー(MJ Research, Watertown MA)及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー(Applied Biosystems)等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシークエンシングシステム(Applied Biosystems)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。(Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856−853ページ.等を参照)。
【0138】
当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、LMEをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の1つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318−322等を参照)。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限酵素断片から得る(Triglia, T.他 (1988) Nucleic Acids Res 16:8186等を参照)。第3の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111−119等を参照)。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及び連結反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている(Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055−3060等を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder(商標)ライブラリ(Clontech, Palo Alto CA)を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50%以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【0139】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の5’領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、5’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【0140】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力/光の強度は、適切なソフトウェア(Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等)を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【0141】
本発明の別の実施例では、LMEをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にLME、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り、これらの配列をLMEのクローン化及び発現に利用可能である。
【0142】
種々の目的でLMEをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。 この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び/または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る。
【0143】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.−C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793−797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259−264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315−319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、LMEの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのLMEの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択/スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【0144】
別の実施例によれば、LMEをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.ら(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215−223; 及びHorn, T.他(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225−232を参照)。別法として、化学的方法を用いてLME自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55−60ページ、Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202−204等を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer)を用いて達成し得る。更にLMEのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び/または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【0145】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である(Chiez, R.M.及び F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392−421等を参照)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる(前出のCreighton, 28−53ページ等を参照)。
【0146】
生物学的に活性なLMEを発現させるために、LMEをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びLMEをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、5’及び3’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、LMEをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。LMEをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18−162.を参照)。
【0147】
当業者に周知の方法を用いて、LMEをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び16−17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。
【0148】
種々の発現ベクター/宿主系を利用して、LMEをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター/宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある(前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. 及び S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509、Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307−311、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191−196ページ、Logan, J. 及び T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655−3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345−355等を参照)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる(Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350−356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340−6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813−815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219−226、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239−242等を参照)。
【0149】
本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、LMEをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、LMEをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT1プラスミド(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にLMEをコードする配列をライゲーションするとlacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(Van Heeke, G. 及び S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509.等を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のLMEが必要な場合は、LMEの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導T5バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【0150】
LMEの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、酵母菌Saccharomyces cerevisiae またはPichia pastorisに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内への保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組込みを可能にする(前出のAusubel (1995)、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol. 153:516544、 Scorer, C.A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181−184等を参照)。
【0151】
植物系もLMEの発現に使用可能である。LMEをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV(Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307−311)由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい(Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3:16711680、 Broglie, R. 他 (1984) Science 224:838843、 Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85105等を参照)。これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。(『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191−196ページ等を参照。)
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物/翻訳複合体にLMEをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のE1またはE3領域への挿入により、感染した宿主細胞にLMEを発現する生ウイルスを得ることが可能である(Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655−3659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【0152】
ヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療目的のために約6kb〜10MbのHACを作製し、従来の送達方法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル)で供給する(Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:345−355.等を参照)。
【0153】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるLMEの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、LMEをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。 このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び/または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1〜2日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【0154】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223−232、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817−823等を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567−3570、Colbere−Garapin, F. 他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1−14 等を参照)。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載されている(Hartman, S.C.及び R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047−8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121−131等を参照)。
【0155】
マーカー遺伝子発現の存在/不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、LMEをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、LMEをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、1つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がLMEをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【0156】
一般に、LMEをコードする核酸配列を含み且つLMEを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【0157】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてLMEの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。 このような技術の例としては、酵素に結合した免疫吸着剤検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、フローサイトメーター(FACS)などが挙げられる。LME上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2部位のモノクローナルベースイムノアッセイ(two−site, monoclonal−based immunoassay)が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である(Hampton. R. ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照)。
【0158】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。LMEをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、LMEをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega(Madison WI)、U.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【0159】
LMEをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。LMEをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するLMEの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【0160】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び/または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等)は、American Type Culture Collection(ATCC, Bethesda, VA)から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【0161】
本発明の別の実施例では、LMEをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラLMEタンパク質が、LME活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6−His、FLAG、c−myc、赤血球凝集素(HA)がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6−Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c−myc及び赤血球凝集素(HA)は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、LMEをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、LMEが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【0162】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したLMEの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【0163】
本発明のLMEまたはその断片を用いて、LMEに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも1つまたは複数の試験化合物を用いて、LMEへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば受容体)または小分子が挙げられる。
【0164】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのLMEの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している(Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照)。同様に、化合物は、LMEが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてLMEを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。LMEを発現する細胞またはLMEを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、LMEまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【0165】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたLMEと結合させるステップと、LMEとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【0166】
本発明のLMEまたはその断片を用いて、LMEの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、LMEが少なくとも1つの試験化合物と結合する、LMEの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのLMEの活性が試験化合物不在下でのLMEの活性と比較する。試験化合物の存在下でのLMEの活性の変化は、LMEの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をLMEの活性に適した条件下でLMEを含むin vitroまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、LMEの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも1つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【0167】
別の実施例では、胚性幹細胞(ES細胞)における相同組換えを用いて動物モデル系内で、LMEまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照)。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288−1292)等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre−loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999−2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323−43 30)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【0168】
LMEをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも8つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する(Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145−1 147)。
【0169】
LMEをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換え動物(マウスまたはラット)を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、LMEをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばLMEを乳汁内に分泌するなどLMEを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る(Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55−74)。
【0170】
(治療)
LMEのある領域と脂質代謝酵素のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、LMEの発現は、病変組織、癌組織、炎症組織、心臓血管組織、および神経組織に密接に関連する。従ってLMEは、癌、神経系障害、自己免疫/炎症疾患、胃腸疾患、及び心臓血管系疾患において或る役割を果たすものと考えられる。LMEの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、LMEの発現または活性を低下させることが望ましい。また、LMEの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、LMEの発現または活性を増大させることが望ましい。
【0171】
従って、一実施例において、LMEの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にLMEまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、精神薄弱、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害(SAD)と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また自己免疫/炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群(AIDS)腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術(balloon angioplasty)、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術(coronary artery bypass graft surgery)などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性2尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化(mitral annular calcification)、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎(pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans−organizing pneumonia)、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まる。
【0172】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むLMEの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、LMEまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【0173】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むLMEの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたLMEを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【0174】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むLMEの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、LMEの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【0175】
更なる実施例では、LMEの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にLMEのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、上記した癌、神経系障害、自己免疫/炎症疾患、胃腸疾患、及び心臓血管系疾患がある。一実施態様では、LMEと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはLMEを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【0176】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むLMEの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、LMEをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【0177】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【0178】
LMEのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたLMEを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてLMEと特異的に結合するものの同定が可能である。LMEの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体(即ち二量体の形成を阻害する抗体)は通常、治療用に好適である。
【0179】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、LMEまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【0180】
LMEに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約5個のアミノ酸からなり、一般的には約10個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。LMEアミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【0181】
LMEに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びEBV−ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495−497、Kozbor, D. 他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31−42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026−2030、Cole, S.P. 他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109−120等を参照)。
【0182】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる(例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604−608; Takeda, S.他 (1985) Nature 314:452,454を参照)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、LME特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる(Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134−10137等を参照)。
【0183】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような非常に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833−3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293−299等を参照)。
【0184】
LMEに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab’)2 断片と、F(ab’)2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D. 他 (1989) Science 256:1275−1281等を参照)。
【0185】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性の検定ための数々のプロトコルが、当分野では周知である。 通常このような免疫学的検定には、LMEとその特異性抗体との間の複合体の計測が含まれる。二つの非干渉性LMEエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【0186】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、LMEに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でLME抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のLMEエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のKaは、LMEに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のLMEエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が109〜1012liter/molの高親和性抗体医薬は、LME抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106〜107liter/molの低親和性抗体医薬は、LMEが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製(immunopurification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【0187】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、LME抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である(前出のCattyの文献、同Coligan らの文献等を参照)。
【0188】
本発明の別の実施例では、LMEをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、LMEをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子(DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド)を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、LMEをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(例えば、Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参考)。
【0189】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である(Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469−475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288−1296.等を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. 及び W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323−347等を参照)。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる(Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217−225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308−1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730−2736. 等を参照)。
【0190】
本発明の別の実施例では、LMEをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、(i)遺伝子欠損症(例えばX染色体鎖遺伝(Cavazzana−Calvo, M.他 (2000) Science 288:669−672)により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損症(SCID)−X1の場合)、先天性アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損症(Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475−480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470−475)、嚢胞性繊維症(Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207−216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643−666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667−703)、サラセミア(thalassamia)、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病(Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404−410、Verma, I.M. 及び Somia. N. (1997) Nature 389:239−242)を治療し、(ii)条件的致死性遺伝子産物を発現させ(例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合)、(iii)細胞内の寄生生物(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Baltimore, D. (1988) Nature 335:395−396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395−11399)、B型若しくはC型肝炎ウイルス(HBV、HCV)、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラリア原虫及びクルーズトリパノソーマ等の原虫寄生生物に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。LMEの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からLMEを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【0191】
本発明の更なる実施例では、LMEの欠損による疾患や異常症は、LMEをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってLME欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、及び(v)DNAトランスポソンの使用(Morgan, R.A. 及び W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191−217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501−510; Boulay, J−L. 及びH. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445−450)がある。
【0192】
LMEの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXの各ベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV−SCRIPT、PCMV−TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET−OFF、PTET−ON、PTRE2、PTRE2−LUC、PTK−HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。LMEを発現させるために、(i)恒常的に活性なプロモーター(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ(TK)、若しくはβ−アクチン遺伝子等)、(ii)誘導性プロモーター(例えば、市販されているT−REXプラスミド(Invitrogen)に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター(Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547−5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766−1769; Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451−456))、エクジソン誘導性プロモーター(市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている:Invitrogen)、FK506/ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486/ミフェプリストーン誘導性プロモーター(Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau, 前出)、または(iii)正常な個体に由来するLMEをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【0193】
市販のリポソーム形質転換キット(例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit)を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法(Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456−467)若しくは電気穿孔法(Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841−845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【0194】
本発明の別の実施例では、LMEの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でLMEをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適なRNAパッケージングシグナルと、(iii)追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント(RRE)とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター(例えばPFB及びPFBNEO)はStratagene社から市販されており、刊行データ(Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733−6737)に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。
ベクターは、好適なベクター産生細胞系(VPCL)において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する(Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647−1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Virol. 61:1639−1646、Adam, M.A. 及び A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802−3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463−8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873−9880)。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号(「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」)において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団(例えばCD4+ T細胞)の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている(Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020−7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259−2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707−4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201−1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283−2290)。
【0195】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、LMEの発現に関連する1つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にLMEをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。 複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された(Csete, M.E. 他 (1995) Transplantation 27:263−268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号(”Adenovirus vectors for gene therapy”)に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511−544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239−242も参照されたい。 両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【0196】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、LMEの発現に関連する1つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にLMEをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス(HSV)系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細胞にLMEを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス(HSV)I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた(Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385−395)。HSV−1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(”Herpes simplex virus swains for gene transfer”)に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも1つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. ら (1999) J. Virol. 73:519−532 及び Xu, H. ら (1994) Dev. Biol. 163:152−161も参照されたい。 両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【0197】
別法では、αウイルス(正の一本鎖RNAウイルス)ベクターを用いてLMEをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(Semliki Forest Virus, SFV)の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かった(Garoff, H. 及び K.−J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464−469)。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性(例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ)を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、LMEをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のLMEをコードするRNAが産生され、高いレベルでLMEが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス(SIN)の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞(BHK−21)の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している(Dryga, S.A. 他 (1997) Virology 228 :74−83)。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にLMEを導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【0198】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。 転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−10と約+10の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E. 他 (1994) in: Huber, B.E.及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163−177ページ等を参照)。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【0199】
リボザイムは酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。例えば、LMEをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【0200】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような2次構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【0201】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、LMEをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【0202】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の5’末端、3’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2’ O−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。 それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン(queosine)、ワイブトシン(wybutosine)等を加えることができる。
【0203】
本発明の更なる実施例は、LMEをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、LMEの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、LMEをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、LMEの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、LMEをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【0204】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも1個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。 このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び/または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。LMEをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも1つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。LMEをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、LMEをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって1つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばSchizosaccharomyces pombe遺伝子発現系(Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)またはHeLa細胞等のヒト細胞系(Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8−13)を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド)の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している(Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号)。
【0205】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる(Goldman, C.K. 他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462−466.等を参照)。
【0206】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【0207】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA)の最新版に記載されている。このような組成物は、LME、LMEの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはLMEのインヒビターなどからなる。
【0208】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【0209】
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子(例えば伝統的な低分子量有機薬)の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。 高分子(例えばより大きなペプチド及びタンパク質)の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした(Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照)。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【0210】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【0211】
LMEまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、LMEまたはその断片をHIV Tat−1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている(Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569−1572)。
【0212】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【0213】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばLMEまたはその断片、LMEの抗体、LMEのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50(集団の50%の医薬的有効量)またはLD50(集団の50%の致死量)を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【0214】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって3〜4日毎に1度、1週間に1度、或いは2週間に1度の間隔で投与し得る。
【0215】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100,000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。 当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【0216】
(診断)
別の実施例では、LMEに特異的に結合する抗体が、LMEの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはLMEやLMEのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。LMEの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからLMEを検出する方法が含まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様なレポーター分子が本技術分野で知られており、それらを用いることができる。幾つかのレポーター分子については上記した。
【0217】
LMEを測定するためのELISA,RIA,及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのLMEの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なLMEの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とLMEに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのLMEの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【0218】
本発明の別の実施例によれば、LMEをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るLMEを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、LMEの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のLME値の調節を監視する。
【0219】
一実施形態では、LMEまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、LMEをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば5’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがLMEをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【0220】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、LMEをコードする任意の配列と少なくとも50%の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:6−10の配列、或いはLME遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【0221】
LMEをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、LME及びLME誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。mRNAプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン/ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【0222】
LMEをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、LMEの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症(cerebelloretinal hemangioblastomatosis)、脳3叉神経血管症候群、精神薄弱、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害(SAD)と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また自己免疫/炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群(AIDS)腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術(balloon angioplasty)、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術(coronary artery bypass graft surgery)などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性2尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化(mitral annular calcification)、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎(pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans−organizing pneumonia)、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まる。LMEをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック(dipstick)、ピン(pin)、ELISA式アッセイ、及び変異LMEの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【0223】
ある実施態様では、LMEをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。LMEをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のLMEをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【0224】
LMEの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、LMEをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【0225】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【0226】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物(過少発現または過剰発現)の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【0227】
LMEをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはLMEをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはLMEをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【0228】
或る実施態様において、LMEをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP(single−stranded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP(fSSCP)がある。SSCPでは、LMEをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でDNAを増幅する。DNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の2次及び3次構造に差異を生じさせる。 差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。 それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー(amplimer)の検出が可能になる。更に、インシリコSNP(in silico SNP, isSNP)と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較することにより、多形性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調整及び統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc., San Diego CA)を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【0229】
LMEの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅(coamplification)、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる(例えば、Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods, 159:235−44;Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229−236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【0230】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多形性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行/後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【0231】
別の実施例では、LME、LMEの断片、LMEに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【0232】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る(Seilliamer らの米国特許第5,840,484号 ”Comparative Gene Transcript Analysis” を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす)。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【0233】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【0234】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性サインと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する(Nuwaysir, E.F. ら. (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3−159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112−113:467−471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のサインと同一のサインを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはサインは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のサインを提供する。自己の発現が任意の試験された化合物により変化しない遺伝子が同様に重要であっても、このような遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを規準化する。規準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性サインの要素への遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの阻止に役立つが、毒性の予測につながるサインの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない(例えば2000年2月29日にNational Institute of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00−02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である)。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性サインを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【0235】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な1つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、非処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【0236】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、1次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、2次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような2次元ゲル電気泳動により分離が達成される(前出のSteiner and Anderson)。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または非処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも5個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【0237】
プロテオームのプロファイルは、LMEに特異的な抗体を用いてLME発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する(Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103−111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778−788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【0238】
プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性サインと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので(Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533−537)、転写イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性サインは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はmRNA急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【0239】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【0240】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【0241】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する(Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614−10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150−2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【0242】
本発明の別の実施例ではまた、LMEをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J. 他 (1997) Nat Genet. 15:345−355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127−134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149−154等を参照)。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限酵素断片長多型(RFLP)の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である(Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353−7357を参照)。
【0243】
蛍光原位置ハイブリッド形成法(FISH)は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る(前出のHeinz−Ulrich, 他 (1995) in Meyers, 965−968ページ.等を参照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のLMEをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するDNA領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【0244】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を調査する研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の11q22−23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対する任意のマッピングにより更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる(Gatti, R.A.他 (1988) Nature 336:577−580等を参照)。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【0245】
本発明の別の実施例では、LME、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。LMEと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【0246】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen,他の (1984) PCT出願番号 WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、LME、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したLMEを検出する。精製したLMEはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【0247】
別の実施例では、LMEと結合可能な中和抗体がLMEと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、LMEと1つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【0248】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にLMEをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【0249】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【0250】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願第60/203,511号、同第60/207,903号、同第60/210,150号、および同第60/213,392号に言及することをもって本明細書の一部とする。
【0251】
(実施例)
1 cDNA ライブラリの作製
Incyte cDNAは、LIFESEQ GOLDデータベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリに由来するものであり、表4の列5に列記した。 ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。 変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるTRIZOL(Life Technologies)等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【0252】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)、OLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN, Valencia CA)またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【0253】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム(Life Technologies)を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した(前出のAusubel, 1997, unit 5.1−6.6等を参照)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ(300〜1000bp)選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。 好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)またはplNCY(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)等である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1−Blue、XL1−BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【0254】
2 cDNA クローンの単離
UNIZAPベクターシステム(Stratagene)を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、AGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミドキットの中から少なくとも1つを用いて、プラスミドを精製した。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【0255】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1−14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFLUOROSKAN II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光分析的に定量した。
【0256】
3 シークエンシング及び分析
実施例2に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー(Applied Biosystems)またはPTC−200 サーマルサイクラー(MJ Research)をHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)またはMICROLAB 2200(Hamilton)液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems)の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム(Applied Biosystems)か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法(前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例8に記載した方法で配列を伸長させた。
【0257】
IncyteのcDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列の除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース(例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)及びPFAM等隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせた(HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス1次構造を分析する確率的アプローチであるEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361−365等を参照)。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築された。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列(実施例4及び5を参照)を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース(genpept)、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア(日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム(DNASTAR)に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【0258】
Incyte cDNA及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表5の列1に、それらの簡単な説明を列2に示す。 列3は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。 適用可能な場合には、列4は2つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す(スコアが高ければ高いほど2配列間の相同性が高くなる)。
【0259】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:6−10のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約20〜約4000ヌクレオチドの断片を表4の列4に示した。
【0260】
4 ゲノム DNA からのコード配列の同定及び編集
推定上の脂質代謝酵素は、公共のゲノム配列データベース(例えば、gbpriやgbhtg)においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである(Burge, C. 及び S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78−94、Burge, C. 及び S. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346−354参照)。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。これらのGenscan推定cDNA配列の内、どの配列が脂質代謝酵素をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて脂質代謝酵素について問合せて分析した。脂質代謝酵素としてアノテーションが付けられたIncyteのcDNA配列に対する相同性を基に、可能性のある脂質代謝酵素が同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgbpri及びgbhtgと比較した。必要であれば、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのGenscanにより予測された配列のエラーを修正する。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例3に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び/または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【0261】
5 ゲノム配列データのcDNA配列データへのアセンブリ
ステッチ配列( Stiched Sequence )
部分cDNA配列は、実施例4に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例3に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び1つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の2以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、1つのcDNA及び2つのゲノム配列に間隔が存在する場合、3つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列(parent sequence)に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。1種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖(cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列)は、親の種類を変える連鎖(cDNA−ゲノム配列)に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからヒットしたトップのBLASTと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【0262】
ストレッチ配列( Stretched Sequence )
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例3に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例4に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対(HSP)を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【0263】
6 LMEをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:6−10を構築するために用いた配列を、BLAST及びSmith−Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:6−10と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及び重複した配列のクラスターに構築した(表7)。スタンフォード・ヒトゲノムセンター(SHGC)、ホワイトヘッド・ゲノム研究所(WIGR)、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【0264】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。 (センチモルガン(cM)は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、1cMは、ヒト中のDNAの1メガベース(Mb)にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。)cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap99」(http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap)などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【0265】
7 ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している(前出のSambrook, 7章、同Ausubel. F.M. 他, 4章及び16章等を参照)。
【0266】
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq(Incyte Pharmaceuticals)等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【0267】
【数1】
スコアは、2つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、0〜100の規準化された値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアリングセグメント対(HSP)に一致する各塩基に+5のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−4を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得る(ギャップにより隔離され得る)。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100%一致する場合のみ得られる。積スコア70は、一端が100%一致し、70%重畳しているか、他端が88%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100%一致し、50%重畳しているか、他端が79%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【0268】
或いは、LMEをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列(実施例3を参照)と少なくとも一部は重畳するように構築される。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能/混合、または尿管などの1つの生物/組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患/病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の1つに分類される。 各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、LMEをコードするcDNAの疾患特異的な発現を反映する。 cDNA配列およびcDNAライブラリ/組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース(Incyte Genomics, Palo Alto CA)から得ることができる。
【0269】
8 LMEをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の5’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が50%以上となり、約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【0270】
配列を伸長するために、選択されたヒトcDNAライブラリを用いた。2段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【0271】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。 PCRは、PTC−200 サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)を用いて96穴プレート内で行った。反応混合液には、DNA鋳型、各プライマー200nmolと、Mg2+、(NH4)2SO4 及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)と、ELONGASE酵素(Life Technologies)と、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)が含まれていた。 プライマー対PCI A、PCI Bに対して用いたパラメータは次の通りである。 ステップ1: 94℃で3分間 ステップ2: 94℃で15秒 ステップ3: 60度で1分間 ステップ4: 68℃で2分間 ステップ5: ステップ2、3、4を20回繰り返す ステップ6: 68℃で5分間 ステップ7: 4℃で保存。 プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを用いた。 ステップ1: 94℃で3分間 ステップ2: 94℃で15秒 ステップ3: 57℃で1分間 ステップ4: 68℃で2分間 ステップ5: ステップ2、3、4を20回繰り返す ステップ6: 68℃で5分間 ステップ7: 4℃で保存
各ウェルのDNA濃度は、1X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンした。反応混合物のアリコート5〜10μlを1%アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【0272】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)を用いて消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE(Promega)で消化した。伸長させたクローンをT4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いてpUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で処理して制限部位の張出部(overhang)を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに37℃で一晩培養した。
【0273】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いてPCRによってDNAを増幅した。 その際用いたパラメータは次の通りである。 ステップ1: 94℃で3分間 ステップ2: 94℃で15秒 ステップ3: 60℃で1分間 ステップ4: 72℃で2分間 ステップ5: ステップ2、3、4を29回繰り返す ステップ6: 72℃で5分間 ステップ7: 4℃で保存 DNAは、上記のPICOGREEN試薬(Molecular Probes)によって定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20%ジメチルスルホキシド(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット(Terminator cycle sequencing ready reaction kit)(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0274】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて5’調節配列を得る。
【0275】
9 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
SEQ ID NO:6−10由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー50pmolと、[γ−32P]アデノシン3リン酸 (Amersham Pharmacia Biotech)250μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G−25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて十分に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II(DuPont NEN)のいずれか1つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【0276】
各消化物から得たDNAは、0.7%アガロースゲル上で分画してナイロン膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【0277】
1 0 マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷(インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照)、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである(Schena (1999) 前出)。推奨する基質には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. 他 (1995) Science 270:467−470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639−645、Marshall, A. 及び J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27−31.を参照)。
【0278】
完全長cDNA、発現配列タグ(EST)、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザGENEソフトウェア(DNASTAR)等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【0279】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー(21mer)、1×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP−Cy3(BDS)またはdCTP−Cy5(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte)を用いて、200ngのポリ(A)+RNAを含む25ml容量で行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。各反応サンプル(1つはCy3、もう1つはCy5標識)は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、2つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム(CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA)を用いて精製する。 結合後、2つの反応サンプルは、1mlのグリコーゲン(1mg/ml)を用いて析出させたエタノール、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100%エタノールである。サンプルは次に、SpeedVAC(Savant Instruments Inc., Holbrook NY)を用いて乾燥して仕上げ、14μl 5×SSC/0.2% SDS中で再懸濁する。
【0280】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。30サイクルのPCRによって、1〜2ngの初期量から5μgを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL−400(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製される。
【0281】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡用スライドグラス(Corning)は、処理中及び処理後に0.1%のSDS及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、95%エタノール中で0.05%アミノプロピルシラン(Sigma)を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、110℃の天火で硬化させる。
【0282】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA1μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント(open capillary printing element)に充填する。装置はここで、スライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【0283】
マイクロアレイには、STRATALINKER UV架橋剤(Stratagene)を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2%SDSで1度洗浄し、蒸留水で3度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)(Tropix, Inc., Bedford MA)中の0.2%カゼイン中において60℃で30分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように0.2%SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【0284】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、5×SSC,0.2%SDSハイブリダイゼーション緩衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各0.2μg含む9μlのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、65℃まで5分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して1.8cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第1洗浄緩衝液中(1×SSC,0.1%SDS)において45℃で10分間洗浄し、第2洗浄緩衝液中(0.1×SSC)において45℃で10分間各々3度洗浄して乾燥させる。
【0285】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには488nm、Cy5の励起のためには632nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Wレーザ(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出する。20×顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX−Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンした。
【0286】
2つの異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは2つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、2つの蛍光色素に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素1つにつき1度スキャンし、各アレイを通常2度スキャンする。
【0287】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比1:100,000に相関させる。異なる源泉(例えば試験される細胞及び対照細胞など)からの2つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、2つの蛍光色素で較正するcDNAのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【0288】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI−835Hアナログ−ディジタル(A/D)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラー範囲へのリニア20色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。2つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク(発光スペクトルの重なりに起因する)を補正する。
【0289】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte)である。
【0290】
11 相補的ポリヌクレオチド
LMEをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のLMEの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア(National Biosciences)及びLMEのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがLMEをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【0291】
12 LMEの発現
LMEの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でLMEが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp−lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとLMEを発現する。真核細胞でのLMEの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、LMEをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945.等を参照)。
【0292】
殆どの発現系では、LMEが、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6−Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く1回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする(Amersham Pharmacia Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でLMEからタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いて免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6−Hisは、金属キレート樹脂(QIAGEN)上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel(1995)10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したLMEを直接用いて以下の実施例16、及び17のアッセイを行うことができる。
【0293】
13 機能的アッセイ
LME機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのLMEをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターには、pCMV SPORTプラスミド(Life Technologies)及びpCR 3.1プラスミド(Invitrogen)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、CD64またはCD64−GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー(FCM)を用いて、GFPまたはCD64−GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるDNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【0294】
遺伝子発現におけるLMEの影響は、LMEをコードする配列とCD64またはCD64−GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64−GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG(IgG)の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。LME及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【0295】
14 LMEに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE;例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088−495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたLMEを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【0296】
或いは、レーザGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いてLMEアミノ酸配列を解析し、免疫抗原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばC末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である(前出のAusubel, 1995, 11章等を参照)。
【0297】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)を用いて合成し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)を用いた反応によってKLH(Sigma−Aldrich, St. Louis MO)に結合させて、免疫抗原性を高める(前出のAusubel, 1995 等を参照)。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗LME活性を検査するには、ペプチドまたはLMEを基板に結合し、1%BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【0298】
15 特異的抗体を用いる天然LMEの精製
天然LME或いは組換えLMEを、LMEに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr−活性化SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biotech)のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗LME抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【0299】
LMEを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、LMEを優先的に吸着できる条件で(例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで)そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とLMEとの結合を切るような条件で(例えば、pH2〜3のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで)溶出させ、LMEを回収する。
【0300】
16 LMEと相互作用する分子の同定
LMEまたは生物学的に活性なその断片を、125Iボルトンハンター試薬(例えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照)で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したLMEと共にインキュベートし、洗浄して、標識したLME複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なLME濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したLMEの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【0301】
別法では、LMEと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245−246)に記載の酵母2−ハイブリッドシステム(yeast two−hybrid system)やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの2−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【0302】
LMEはまた、高処理型の酵母2ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス(CuraGen Corp., New Haven CT)に用いて、遺伝子の2つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる(Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号)。
【0303】
17 LME活性の実証
LME活性は、1−パルミトイル−2−[1−14C]オレオイル ホスファチジルコリン(Sigma−Aldrich社)を含む小胞を使ったin vitro加水分解アッセイによって立証できる。LMEのトリグリセリドリパーゼ活性とホスホリパーゼA2活性は、加水分解反応混合液から単離された切断生成物の分析によって立証できる。
【0304】
1−パルミトイル−2−[1−14C]オレオイル ホスファチジルコリン(Amersham Pharmacia Biotech社)を含む小胞は、2.0μCiの放射標識されたリン脂質を12.5mgの無標識の1−パルミトイル−2−[1−14C]オレオイル ホスファチジルコリンに混ぜ、窒素ガスで混合液を乾燥させることによって調製する。2.5mlの150mM Tris−HCl(pH7.5)が加えられ、混合液は超音波処理にかけられ遠心される。上澄みは4℃で保管され得る。最終的な反応混合液は、0.25mlのHanksバッファー(pH7.4)の入った塩溶液に2.0mMタウロケノデオキシコール酸(taurochenodeoxycholate)、1.0%のウシ血清アルブミン、1.0mM塩化カルシウム、150μgの1−パルミトイル−2−[1−14C]オレオイル ホスファチジルコリン小胞、及びPBSに希釈された種々の量のLMEが含まれる。37℃で30分インキュベーションした後、リゾホスファチジルコリンとオレイン酸をそれぞれ20μg、キャリアとして加え、全脂質を得るために各サンプルを抽出する。脂質は、溶媒の前面がプレートの半分に来るまではクロロフォルム:メタノール:酢酸:水(65:35:8:4)の2溶媒システムを使って、薄層クロマトグラフィーで分離する。このプロセスは、その後、溶媒の前面がプレートの一番上に来るまでヘキサン:エーテル:酢酸(86:16:1)で続ける。脂質を含む領域はヨウ素蒸気で視覚化し、そのスポットをすりはがして、その放射能をシンチレーション計数で決定する。より多量のLMEがアッセイ混合液に加えられると、脂肪酸として放出された放射能量が増加し、リゾホスファチジルコリンとして放出される放射能量は低いままになる。これは、ホスホリパーゼA2活性の特性として、LMEがsn−1位置ではなくsn−2位置を切断することを立証する。
【0305】
或いは、LMEのホスホリパーゼ活性は、ホスファチジルセリンのsn−1位置で脂肪酸残基の加水分解を測定される。LMEが、好適なバッファー中で三重水素[3H]標識された基質のホスファチジルセリンとを化学量論的な量で組み合わされる。好適なインキュベーション時間の後、クロマトグラフィー法によって加水分解反応生成物が基質から分離される。生成されたアシルグリセロホスホセリンの量を、シンチレーションカウンターを使って、トリチウム化された生成物をカウントして測定する。バックグラウンドノイズと組み込まれなかった基質を説明するために、種々の対照グループが設定される。最終的なカウントは、トリチウム化酵素生成物である[3H]アシルグリセロホスホセリンを表している。[3H]アシルグリセロホスホセリンは、生物サンプルでのLME活性に直接比例する。
【0306】
LMEリポキシゲナーゼ活性はクロマトグラフィー法で測定できる。抽出されたLMEリポキシゲナーゼタンパク質(200μg)を100μMの[I−14C]アラキドン酸、又は他の無標識脂肪酸と15〜30分間37℃でインキュベーションする。インキュベーション後、停止溶液(アセトニトリル:メタノール:水、350:150:1)が加えられる。サンプルを抽出し、メタノール/水/酢酸(85:15:0.01)(容積/容積)の溶媒システムを1ml/分の流速で使って、逆相HPLCで分析する。画分もまた液体シンチレーション計数にかけられる。最終的なカウントは、生物サンプルでのLME活性に直接比例する生成物を表す。立体化学的分析のために、アラキドン酸の代謝産物はさらにキラルHPLC及び質量分析器で分析される(Sun, D. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:3354033547)。
【0307】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【0308】
(表の簡単な説明)
表1は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【0309】
表2は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【0310】
表3は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【0311】
表4は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【0312】
表5は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【0313】
表6は、表5に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【0314】
表7は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
[0001]
(Technical field)
The present invention relates to a nucleic acid sequence and an amino acid sequence of a lipid metabolizing enzyme. The present invention also relates to the diagnosis, treatment and prevention of cancer, nervous system diseases, autoimmune / inflammatory diseases, gastrointestinal diseases, and cardiovascular diseases using these sequences. The invention further relates to the evaluation of the effects of foreign compounds on the expression of nucleic acid and amino acid sequences of lipid metabolizing enzymes.
[0002]
(Background of the Invention)
Lipids are water-insoluble, oily or fatty substances that are soluble in nonpolar solvents such as chloroform and ether. Neutral fats (triacylglycerols) play a major fuel source and energy storage role. Polar lipids such as phospholipids, sphingolipids, glycolipids, and cholesterol are important structural elements of cell membranes (lipid metabolism is described by Stryer, L. (1995)).Biochemistry, W.S. H. Freeman and Company, New York NY, Lehninger, A .; (1982)Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Inc. New York NY, and the ExPASy “Biochemical Pathways” index on the Boehringer Mannheim website “http://www.expasy.ch/cgibin/searchbiochemindex”).
[0003]
Fatty acids are long-chain organic acids with one carboxyl group and one long non-polar hydrocarbon tail. Long chain fatty acids are important components of glycolipids, phospholipids, and cholesterol, which are constituent units of biofilms, and also triglycerides, which are fuel molecules in living organisms. Long-chain fatty acids also serve as substrates for eicosanoids and are important for the functional modification of certain complex carbohydrates and proteins. Fatty acids having 16 and 18 carbon atoms are most common. Fatty acid synthesis occurs in the cytoplasm. In the first step, acetyl coenzyme A (ConA) carboxylase (ACC) synthesizes malonyl ConA from acetyl ConA and bicarbonate. The enzyme that catalyzes the remaining reaction is covalently linked to one polypeptide chain, called the multifunctional enzyme fatty acid synthase (FAS). FAS synthesizes palmitic acid from ConA and malonyl ConA. FAS includes acetyltransferase, malonyltransferase, β-ketoacetyl synthase, acyl carrier protein, β-ketoacyl reductase, dehydratase, and thioesterase activities. The end product of the FAS reaction is the C16 fatty acid palmitic acid. Further elongation and desaturation of palmitic acid by the accessory enzymes of the ER yields the various long-chain fatty acids required in individual cells. These enzymes include NADH cytochrome b5Reductase, cytochrome b5, And desaturases.
[0004]
Triacylglycerols, also called triglycerides and triglycerides, are the major energy stores in animals. Triacylglycerol is an ester of glycerol with three fatty acid chains. Glycerol-3 phosphate is produced from dihydroxyacetone phosphate by glycerol phosphate dehydrogenase or from glycerol by glycerol kinase. Fatty acid CoA is produced from fatty acids by fatty acid CoA synthase. Glycerol-3 phosphate is acylated from two fatty acids CoA by glycerol phosphate acyltransferase to yield phospholipids. Phospholipid phosphatases convert phospholipids to diacylglycerol, which is then acylated to triacylglycerol by diglyceride acyltransferase. Phospholipid phosphatases and diglyceroid acyltransferases form triacylglycerol synthase bound to the endoplasmic reticulum (ER) membrane.
[0005]
The major types of phospholipids are the phosphoglycerides, which consist of a glycerol backbone, two fatty acid chains, and phosphorylated alcohols. Phosphoglycerides are components of cell membranes. The major phosphoglycerides are phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, diphosphatidylglycerol. Many enzymes involved in phosphoglyceride synthesis are membrane bound (Meyers, RA (1995)).Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers Inc. , New York NY, pp. 494-501). Phosphatidates are converted to CDP diacylglycerol by phosphatidine cytidylyltransferase (ExPASy ENZYME EC 2.7.7.41). Transfer of CDP diacylglycerol from a diacylglycerol group to a serine group produces phosphatidylserine, and transfer of the same from a diacylglycerol group to an inositol group produces phosphatidylinositol. These transfers are catalyzed by CDP diacylglycerol serine O-phosphatidyl transferase and CDP diacylglycerol inositol 3 phosphatidyl transferase (ExPASy ENZYME EC 2.7.8.8, ExPASy ENZYME EC 2.7.8.11), respectively. Is done. Phosphatidylserine decarboxylase catalyzes the conversion of phosphatidylserine to phosphatidylethanolamine using a cofactor for pyruvate (Voelker, DR (1997) Biochim. Biophys. Acta 1348: 236-244). Phosphatidylcholine is formed by the reaction of CDP choline with 1,2 diacylglycerol by diacylglycerol choline phosphotransferase (ExPASy ENZYME 2.7.8.2) using choline from food.
[0006]
Cholesterol, consisting of four cyclic hydrocarbons with alcohol at one end, reduces the fluidity of the membrane in which cholesterol is incorporated. In addition, cholesterol is used for the synthesis of steroid hormones such as cortisol, progesterone, estrogen, and testosterone. Bile salts derived from cholesterol promote the digestion of lipids. Cholesterol in the skin forms a barrier that prevents excess water from evaporating from the body. Farnesol and geranylgeranyl groups, derived from intermediate products of cholesterol biosynthesis, are added post-translationally to proteins involved in signal transduction, such as Ras, and proteins involved in protein transport. These modifications are important for the activity of these proteins (Guyton, AC (1991)).Textbook of Medical Physiology, W.S. B. Saunders Company, Philadelphia PA, pages 760-763; Stryer, supra, pages 279-280, 691-702, 934). Mammalsde novoObtain cholesterol from both biosynthesis and food.
[0007]
Sphingolipids are an important class of membrane lipids and include sphingosine, a long-chain amino alcohol. Sphingolipids consist of one long-chain fatty acid, one polar headgroup of alcohol, and sphingosine or a sphingosine derivative. Three classes of sphingolipids include sphingomyelin, cerebroside, and ganglioside. Sphingomyelin, which contains phosphocholine or phosphoethanolamine as a head group, is abundant in the myelin sheath surrounding nerve cells. Galectocerebroside, which contains a glucose or galactose headgroup, is a hallmark of the brain. Other cerebrosides are found in non-neural tissues. Gangliosides whose head group contains multiple sugar units are abundant in the brain but not found in non-neural tissues.
[0008]
Eicosanoids, including prostaglandins, prostacyclins, thromboxanes, and leukotrienes, are 20-carbon molecules derived from fatty acids. Eicosanoids are signaling molecules and are involved in pain, fever and inflammation. The precursor of all eicosanoids is arachidonic acid, which is phospholipase A2From phospholipids and from diacylglycerol by diacylglycerol lipase. Leukotrienes are produced from arachidonic acid salts by the action of lipoxygenase.
[0009]
In cells, fatty acids are transported by fatty acid binding proteins in the cytoplasm (Online Mandelian Inheritance in Man (OMIM) * 134650 Fatty Acid-Binding Protein 1, Liver; FABP1). The diazepam binding inhibitor (DBI), also known as endozepine and CoA binding protein, is a ligand for the endogenous gamma aminobutyric acid (GABA) receptor and is thought to down-regulate the effects of GABA. DBI binds with very strong affinity to fatty acid CoA esters with long and medium chain lengths and may function as a carrier for fatty acid CoA esters (OMIM * 125950 diazepam binding inhibitor; DBI PROSITE PDOC00686 fatty acid CoA binding protein signature).
[0010]
Fat and fatty triglycerides stored in the liver are hydrolyzed, released into the blood, and carried. Free fatty acids are carried in the blood by albumin. Esters of triacylglycerol and cholesterol are carried by lipoprotein particles. Particles are composed of a core of hydrophobic lipids surrounded by polar lipids and apolipoproteins. The protein component provides the solubility of the hydrophobic lipid and also contains the cell targeting signal. Lipoproteins include milky grit, milky grit residue, very low density lipoprotein (VLDL), medium density lipoprotein (IDL), low density lipoprotein (LDL), and high density lipoprotein (HDL) . There is a strong inverse correlation between HDL levels in plasma and the risk of premature coronary heart disease.
[0011]
Mitochondrial and peroxisomal beta oxidases degrade saturated and unsaturated fatty acids by successively removing two carbon units from CoA-activated fatty acids. The main beta-oxidation pathway degrades both saturated and unsaturated fatty acids, while the auxiliary pathway performs the additional steps required for the degradation of unsaturated fatty acids. The mitochondrial and peroxisome beta-oxidation pathways use similar enzymes but have different substrate specificities and functions. Mitochondria oxidize short, medium and long chain fatty acids to produce energy for cells. Mitochondrial beta oxidation is a major energy source for heart and skeletal muscle. When glucose levels are low, as in the case of starvation, endurance exercise, and diabetes, hepatic beta oxidation provides ketone bodies to the peripheral circulation (Eaton, S. et al. (1996) Biochem. J. 320). : 345-357). Peroxisomes oxidize short, medium and long chain fatty acids, dicarboxylic fatty acids, branched fatty acids, prostaglandins, xenobiotics, and bile acid intermediates. The main role of peroxisomal beta-oxidation is to shorten toxic lipophilic carboxylic acids and promote their secretion, shortening very long-chain fatty acids prior to mitochondrial beta-oxidation (Mannaerts, GP and PP Van Veldhoven (1993) Biochimie 75: 147-158). Enzymes involved in beta oxidation include CoA synthetase, carnitine acyltransferase, acyl CoA dehydrogenase, enoyl CoA hydratase, L-3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase, β-ketothiolase, 2,4-dienoyl CoA reductase, and Includes isomerase.
[0012]
The three classes of lipid metabolizing enzymes are discussed in more detail. The three classes are lipase, phospholipase, and lipoxygenase.
[0013]
Lipase
Triglycerides are hydrolyzed by lipase to fatty acids and glycerol. Adipocytes contain lipases that degrade stored triacylglycerols and release fatty acids to transport the fatty acids to other tissues that require them. Lipases are widely distributed in animals, plants, and prokaryotes. Triglyceride lipase (ExPASy ENZYME EC 3.1.1.3), also known as triacylglycerol lipase and tributyrase, hydrolyzes the ester bonds of triglycerides. In highly vertebrates, there are at least three tissue-specific isozymes, including stomach, liver, and pancreatic lipases. These three types of lipases are structurally closely related to each other and also structurally closely related to lipoprotein lipase. The most conserved parts of the stomach, liver and pancreas lipases are located around the serine residue, which is also present in prokaryotic lipases. Mutation at the serine residue renders the enzyme inactive. Stomach, liver and pancreas lipases hydrolyze lipoprotein triglycerides and phospholipids. Intestinal gastric lipase aids in the digestion and absorption of food fat. Liver lipase binds to and acts on the endothelial surface of liver tissue. Liver lipase also plays a major role in regulating plasma fat. For efficient dietary fat hydrolysis, pancreatic lipase requires a small protein cofactor called colipase. Colipase binds to the non-catalytic domain at the C-terminus of lipase, thereby stabilizing the active conformation and greatly increasing the overall hydrophobic binding site. Deletions of these enzymes have been identified in humans, all associated with abnormal levels of circulating lipoprotein particles (Gargouri, Y. et al. (1989) Biochim. Biophys. Acta 1006: 255271; Connelly, P. W. (1999) Clin. Chim. Acta 286: 243255; van Tilbeurgh, H. et al. (1999) Biochim Biophys Acta 1441: 173184).
[0014]
Lipoprotein lipase (ExPASy ENZYME EC 3.1.1.34), also known as clearing factor lipase, diglyceride lipase, or diacylglycerol lipase, hydrolyzes triglycerides and phospholipids present in lipoproteins in circulating plasma. I do. The lipoproteins include milky fat grains, lipoproteins of very low and intermediate specific gravity, and high density lipoprotein (HDL). Lipoprotein lipase (LPL) shares a high degree of primary sequence homology with pancreatic lipase and liver lipase. Both lipoprotein lipase and liver lipase are anchored to the endothelial cells of the capillaries via glycosaminoglycans and are released by intravenous administration of heparin. LPL is synthesized mainly by adipocytes, muscle cells, and macrophages. The catalysis of LPL is activated by apolipoprotein C-II and is suppressed under high ionic strength conditions such as 1 M sodium chloride. LPL deficiency in humans contributes to metabolic diseases such as hypertriglyceride hyperemia, HDL2 deficiency, and obesity (Jackson, RL (1983),The Enzymes (Boyer, edited by PD) Vol. XVI, p. 141186, Academic Press, New York NY; H. (1989) New Engl. J. Med. 320: 10610068).
[0015]
Phospholipase
Phospholipases, a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of membrane phospholipids, are classified by bonds that are cleaved in phospholipids. Phospholipases fall into the families of PLA1, PLA2, PLB, PLC, and PLD. Phospholipases are involved in many inflammatory reactions by making arachidonic acid available for eicosanoid biosynthesis. Arachidonic acid is processed into bioactive fat mediators of inflammation, such as lyso-platelet-activating factor and eicosanoids. Arachidonic acid synthesis from membrane phospholipids is a rate-limiting step in the synthesis of four major classes of eicosanoids (prostaglandins, prostacyclins, thromboxanes, leukotrienes). These eicosanoids are involved in pain, fever, and inflammation (Kaiser, E. et al. (1990) Clin. Biochem. 23: 349-370). Furthermore, leukotriene-B4 is known to function in a feedback loop, which further increases PLA2 activity (Wijkander, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 26543-26549). .
[0016]
Secretory phospholipase A2The (PLA2) superfamily consists of several heterologous enzymes, a common feature of which is the hydrolysis of the sn-2 fatty acid acyl ester bond of phosphoglycerides. The hydrolysis of glycerophospholipids releases fatty acids and lysophosphoric acid. PLA2 activity produces precursors of bioactive fats, hydroxy fatty acids, and platelet activating factors. PLA2 has been characterized in many species, beginning with being described as a component of snake venom. PLA2 has traditionally been classified into several major groups and subgroups based on amino acid sequence, divalent cation requirements, and disulfide bond positions. Group I, II, and III PLA2s are secreted Ca with low molecular weight.2+It is composed of dependent proteins. Group IV PLAs consist primarily of 85 kilodaltons of Ca2+It is a dependent cytoplasmic phospholipase. Finally, some Ca2+Independent PLA2 have been described, which make up Group V (Davidson, FF and EA Dennis (1990) J. Mol. Evol. 31: 228238; Dennis, EF. (1994) J. Biol Chem. 269: 13057-13060).
[0017]
The first PLA2 that was very well characterized were Group I, II, III PLA2 found in snake venom and bee venom. PLA2 of these poisons has a common catalysis, the same Ca2+It shares many features with animal PLA2, including requirements and conserved primary and tertiary structures. In addition to the digestive role of prey, the toxic PLA2 has neurotoxic, myotoxic, anticoagulant, and pro-inflammatory effects in animal tissues. This broad pathophysiological effect is due to the presence of specific, high-affinity receptors for these enzymes on various cells and tissues (Lambeau, G. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 5534). -5540).
[0018]
PLA2 from groups I, IIA, IIC, and V have already been described in mammalian and avian cells and were initially classified by tissue distribution, but their distinction is no longer absolute. Group I PLA2 is found in the pancreas, Group IIA and IIC are found in tissues associated with inflammation (eg, synovium), and Group V is found in heart tissue. Pancreatic PLA2 performs the digestive function of dietary lipids and has been proposed to play a role in cell proliferation, smooth muscle contraction, and acute lung injury. Group II inflammatory PLA2 is a potent mediator of the inflammatory process and is expressed at high levels in serum and synovial fluid of patients with inflammatory disorders. Group II inflammatory PLA2 is found in most human cell types assayed and is expressed in a wide range of pathological processes such as septic shock, bowel cancer, rheumatoid arthritis, and epithelial hyperplasia. Group V PLA2 has been cloned from brain tissue and is strongly expressed in heart tissue. Human PLA2 has recently been cloned from fetal lung and appears to be the first protein in a new group of mammalian PLAs, called group X, based on its structural properties. Other PLAs have been cloned from various human tissues and cell lines, suggesting a wide diversity of PLAs (Chen, J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 236652368; Kennedy, B. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 22378-22385; Komada, M. et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1059-1065; Cupillard, L. et al. (1997) J. Biol. Biol. Chem. 272: 15745-15575; Nalefski, EA et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 18239-18249).
[0019]
Phospholipase B (PLB) (ExPASy ENZYME EC 3.1.1.5), also known as lysophospholipase, lecithinase B, or lysolecitinase, is an enzyme that metabolizes lipids in cells and is widely distributed, and many isoforms. There is a form. Small isoforms of about 15-30 kD function as hydrolases, and large isoforms above 60 kD function as both hydrolases and acyltransferases. Lysophosphatidylcholine, a special substrate of PLB, causes lysis of cell membranes when formed or transported into cells. PLB is regulated by lipid factors including acylcarnitine, arachidonic acid, and phosphatidic acid. These lipid factors are important signaling molecules in many pathways, including the inflammatory response (Anderson, R. et al. (1994) Toxicol. Appl. Pharmacol. 125: 176-183; Selle, H. et al. (1993); Eur. J. Biochem. 212: 411-416).
[0020]
Phospholipase C (PLC) (ExPASy ENZYME EC 3.1.4.10) plays an important role in transmembrane signaling. Many extracellular signaling molecules, including hormones, growth factors, neurotransmitters, and immunoglobulins, bind to their respective cell surface receptors and activate PLC. The role of the activated PLC is to hydrolyze phosphatidylinositol-4, 5-2 phosphate (PIP2), a small component of the cell membrane, to diacylglycerol and inositol 1,4,5-3 phosphate (IP3). To produce IP3 and diacylglycerol act as second messengers in their respective biochemical pathways, triggering a series of intracellular responses. IP3 is converted to Ca from intracellular storage.2+And diacylglycerol activates protein kinase C (PKC). Both pathways are also part of transmembrane signaling mechanisms that regulate cellular processes, including secretion, neural action, metabolism, and cell growth.
[0021]
Several different PLC isoforms have been identified and have been classified as PLC-β, PLC-γ, PLC-Δ. Subtypes are named by adding Greek letters followed by Arabic numerals, such as PLC-β-1. PLC has a molecular weight of 62-68 kDa and its amino acid sequence shows considerable similarity between the two regions. This first region, designated X, has about 170 amino acids and the second Y region contains about 260 amino acids.
[0022]
The catalysis of the three isoforms of PLC is Ca2+Depends on. Ca in PLC2+Is believed to be located in the Y region, one of the two conserved regions. Any of these isoforms of a phospholipid containing a common inositol such as phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol 4-1 phosphate (PIP), and phosphatidylinositol 4, 5-2 phosphate (PIP2). Hydrolysis results in cyclic and acyclic inositol phosphates (Rhee, SG and YS Bae (1997) J. Biol. Chem. 272: 1504515048).
[0023]
All mammalian PLCs have a plextrin homology (PH) domain that is approximately 100 amino acids in length and consists of two antiparallel β-sheets flanking an amphoteric α-helix. The PH domain interacts with either the β / γ subunit of G protein or PIP2 to direct PLC to the surface of the membrane (PROSITE PDOC 50003).
[0024]
Phospholipase D (PLD) (ExPASy ENZYME EC 3.1.4.4), also known as lecithinase D, lipophosphodiesterase II, and choline phosphatase, catalyzes the hydrolysis of phosphatidylcholine and other phosphates to produce phosphatidic acid I do. PLDs play important roles in membrane vesicle trafficking, cytoskeletal dynamics, and transmembrane signaling. In addition, activation of PLD is involved in cell differentiation and growth (see review in Liscovitch, M. (2000) Biochem. J. 345: 401415).
[0025]
PLD is activated in mammalian cells in response to a wide range of stimuli, including hormones, neurotransmission, growth factors, cytokines, activators of protein kinase C, and agonists that bind to receptors linked to G proteins . At least two types of PLDs have been identified, PLD1 and PLD2. PLD1 is activated by the protein kinase Cα and the small GTPases ARF and RhoA (Houle, MG and S. Bourgoin (1999) Biochim. Biophys. Acta 1439: 135149). PLD2 can be selectively activated by unsaturated fatty acids such as oleic acid (Kim, JH (1999) FEBS Lett. 454: 4246).
[0026]
Lipoxygenase
Lipoxygenase (ExPASy ENZYME EC 1.13.11.12) is a non-heme iron containing enzyme that catalyzes the diatomic oxidation of certain polyunsaturated fatty acids, such as lipoproteins. Lipoxygenases are found extensively in plants, fungi, and animals. Several different lipoxygenases are known, each with a characteristic oxidative effect. In animals, there is a special lipoxygenase that catalyzes the diatomic oxidation addition of arachidonic acid at carbon-3, 5, 8, 11, 12, 15. These enzymes are named by the position of arachidonic acid to add diatomic oxidation. Animal lipoxygenase has a single polypeptide chain with a molecular weight of about 75-80 kDa. Lipoxygenase has a large catalytic domain containing an N-terminal barrel domain and one atom of non-heme iron. It is necessary for the catalyst that the enzyme containing iron is oxidized to an active state (Yamamoto, S. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1128: 117-131; Brash, AR (1999)). J. Biol. Chem. 274: 2367923682). Various lipoxygenase inhibitors exist and fall into five major categories depending on the mechanism of inhibition. These categories include iron chelates, substrate analogs, lipoxygenase activating protein inhibitors, and finally epidermal growth factor receptor inhibitors.
[0027]
3-Lipoxygenase, also known as LOX3 or Aloxe3, has recently been cloned from mouse epidermis. Aloxe3 is on chromosome 11 of the mouse and the deduced amino acid sequence of Aloxex3 is 54% identical to the sequence of 12-lipoxygenase (Kinzig, A. (1999) Genomics 58: 158-164).
[0028]
Arachidonic acid: 5-lipoxygenase (5-LOX, ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.34), also known as oxygen 5-oxidoreductase, is found mainly in leukocytes, macrophages, and mast cells. 5-LOX first converts arachidonic acid to 5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid and then to leukotriene (LTA4 (5,6-oxide-7,9,11,14-eicosatetraenoic acid)). Subsequent conversion of leukotriene A4 by leukotriene A4 hydrolase yields leukotriene B4, a potential neutrophil chemoattractant, or glutathione binding of LTA4 by leukotriene C4 synthase and subsequent metabolism, especially Asthma produces cysteinyl leukotrienes that affect tracheal responsiveness and mucus secretion Most lipoxygenases do not require other cofactors or proteins for activity, whereas mammalian 5-LOX is calcium And ATP, and 5-LOX activating protein Activated in the presence of quality (FLAP), which itself binds arachidonic acid and provides a substrate for 5-LOX (Lewis, RA et al. (1990) New Engl. J. Med. 323: 645655) 5-LOX and FLAP expression has been found to be increased in plexiform (primary) pulmonary hypertension (Wright, L. et al. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 157: 219229).
[0029]
12-lipoxygenase (12-LOX, ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.31) oxygenates arachidonic acid to form 12-hydroperoxyeicosatetraenoic acid (12-HPETE). Mammalian 12-lipoxygenase has been named for the archetypal tissue of its expression (hence the leukocyte, platelet, or epidermal type). Platelet-type 12-LOX has been found to be the most abundant isoform in epidermal specimens and epidermoid cells. The leukocyte-type 12-LOX was first characterized very well in porcine leukocytes and was found to show a wide distribution in mammalian tissues by immunochemical assays. In addition to tissue distribution, leukocyte-type 12-LOX can be distinguished from platelet-type enzymes by its ability to produce 15-HPETE in addition to 12-HPETE (hydroperoxyeicosatetraenoic acid) from arachidonic acid substrates. Leukocyte type 12-LOX is highly related to 15 lipoxygenase (15-LOX). Both are bispecific lipoxygenases, whose primary structures are approximately 85% identical in higher mammals. Leukocyte type 12-LOX is found in tracheal epithelium, leukocytes, and macrophages (Conrad, DJ (1999) Clin. Rev. Allergy Immunol. 17: 7189).
[0030]
15-Lipoxygenase (15-LOX, ExPASy ENZYME: EC 1.13.11.33) has been found in human reticulocytes, tracheal epidermis, and eosinophil leukocytes. 15-LOX has been detected in atherosclerotic lesions in mammals, especially rabbits and humans. In addition to the oxidative modification of lipoproteins, this enzyme is important for the inflammatory response in atherosclerotic lesions. 15-LOX has been shown to be induced on human monocytes by the cytokine IL-4, which is known to be involved in the inflammatory process (Kuhn, H. et al. S. Borngraber ( 1999) Adv. Exp. Med. Biol. 447: 528).
[0031]
Correlation with disease
Lipid metabolism is involved in human diseases and injuries. In atherosclerosis, an arterial disease, fatty lesions form inside the arterial wall. These lesions make the arteries less flexible and promote clot formation (Guyton, supra). In Teissax disease, GM2 gangliosides (a type of sphingolipid) accumulate in lysosomes of the central nervous system due to the lack of the N-acetylhexosaminidase enzyme. Patients suffer from nervous system degeneration leading to premature death (Fauci, AS et al. (1998).Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY, p. 2171). Niemann-Pick disease is caused by a defect in lipid metabolism. In types A and B of Niemann-Pick disease, sphingomyelin-degrading enzyme deficiency causes sphingomyelin (a type of sphingolipid) and other lipids to accumulate in the central nervous system, causing nervous system degeneration and lung disease. The C type of Niemann-Pick disease results from defects in cholesterol transport, leading to accumulation of sphingomyelin and cholesterol in lysosomes and a secondary decrease in sphingomyelin degrading enzyme activity. Nervous system symptoms such as major seizures, ataxia, and loss of previously learned language skills appear 1-2 years after birth. Certain mutations in the NPC protein containing a putative cholesterol sensing domain were found in a mouse model of Niemann-Pick disease type C (Fauci,Above 2175 p .; Loftus, S .; K. (1997) Science 277: 232-235).
[0032]
PLA is thought to be involved in various disease processes. For example, PLA has been found in pancreas, heart tissue, and tissues associated with inflammation. Pancreatic PLA performs the digestive function of dietary lipids and has been proposed to play a role in cell proliferation, smooth muscle contraction, and acute lung injury. Inflammatory PLA is a potent mediator of the inflammatory process and is expressed at high levels in serum and synovial fluid of patients with inflammatory disorders. Inflammatory PLA has been found in most human cell types and is expressed in a wide range of pathological processes such as septic shock, bowel cancer, rheumatoid arthritis, and epithelial hyperplasia.
[0033]
The role of PLB in human tissues has been investigated in various studies. Hydrolysis of lysophosphatidylcholine by PLB causes lysis at the erythrocyte membrane (Selle, supra). Similarly, Endersen, M .; J. Et al. (1993; Scand. J. Clin. Invest. 53: 733337) reported that increased hydrolysis of lysophosphatidylcholine by PLB in preeclamptic women released free fatty acids into the serum. In kidney studies, PLB was+, K+-Has been shown to protect ATPase from the cytotoxic and cytolytic effects of cyclosporin A (Anderson, supra).
[0034]
Lipases, phospholipases, and lipoxygenases contribute to complex diseases such as atherosclerosis, obesity, asthma, and cancer, and single gene defects such as Wolman disease and type 1 hyperlipoproteinosis You might also say that.
[0035]
The discovery of novel lipid metabolizing enzymes, and polynucleotides encoding them, can meet the needs in the art by providing new compositions. This novel composition is useful in the diagnosis, treatment and prevention of cancer, neurological diseases, disorders of autoimmunity / inflammation, gastrointestinal diseases, and cardiovascular disorders, and has the nucleic acid and amino acid sequences of lipid metabolizing enzymes. It is also useful for evaluating the effects of foreign compounds on expression.
[0036]
(Summary of the Invention)
The present invention relates to lipid metabolizing enzymes collectively referred to as "LME", individually "LME-1", "LME-2", "LME-3", "LME-4", and "LME-5". A purified polypeptide is provided. In certain embodiments, the present invention relates to (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5; (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. A natural polypeptide having an amino acid sequence at least 90% identical to (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) Provided is a substantially isolated polypeptide selected from the group comprising an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. In one embodiment, there is provided a substantially isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-5.
[0037]
Further, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1 to 5 (SEQ ID NOS: 1 to 5), (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1 to 5, A natural amino acid sequence having at least 90% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) SEQ ID NOs: 1-5. A substantially isolated polynucleotide is provided which encodes a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. In another embodiment, the polynucleotide is selected from the group having SEQ ID NOs: 6-10 (SEQ ID NOs: 6-10).
[0038]
The invention further provides (a) a polypeptide consisting of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) at least 90% of the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) a SEQ ID NO: : A recombinant polypeptide having a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having 1-5 Provide nucleotides. In one embodiment, the invention provides a cell transformed with the recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a genetic transformant comprising the recombinant polynucleotide.
[0039]
The present invention also provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-5, and (b) at least 90% homology with the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-5. (C) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. A method for producing a substantially isolated polypeptide comprising an immunogenic fragment of The production method comprises the steps of (a) culturing cells transformed with the recombinant polynucleotide under conditions suitable for expressing the polypeptide, and (b) receiving the polypeptide thus expressed. The recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide.
[0040]
The invention further relates to (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) at least 90% of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. A natural polypeptide having the same amino acid sequence, (c) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) SEQ ID NO: 1. A substantially isolated antibody that specifically binds to a polypeptide selected from the group consisting of an immunogenic fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having -5.
[0041]
The invention further relates to (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-10, and (b) at least 90% homology to a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-10. (C) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), or (e) RNA of (a) to (d) Provided is a substantially isolated polynucleotide, including equivalents. In one embodiment, the polynucleotide has at least 60 contiguous nucleotides.
[0042]
The present invention further provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-36, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-36 by at least 90%. (C) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), or (e) (a) to (d). A substantially isolated polynucleotide comprising the RNA equivalent of is provided. The detection method comprises: (a) hybridizing the sample with a probe containing at least 20 consecutive nucleotides consisting of a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample; and (b) the presence of a hybridization complex. Detecting the absence and optionally detecting the amount of complex, if present, under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide; Hybridizes specifically to a target polynucleotide. In one embodiment, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0043]
The invention also provides a method for detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide is (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-36, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-36 by at least 90%. (C) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), or (e) (a) to (d). A substantially isolated polynucleotide comprising the RNA equivalent of is provided. The detection method includes (a) a process of amplifying a target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification, and (b) detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof, and Optionally, detecting the amount of fragments, if any, is included.
[0044]
The invention further provides a component comprising an effective amount of the polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient. An effective amount of the polypeptide has at least 90% homology with (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. (C) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) a biologically active fragment selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. Includes immunogenic fragments of the amino acid sequence. In one embodiment, there is provided a composition comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-5. Further, the present invention provides a method for treating a disease or a symptom thereof associated with reduced expression of functional LME, comprising administering the composition to a patient.
[0045]
The present invention also provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) at least 90% homology with an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. (C) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. The present invention provides a method for screening a compound for confirming the effectiveness of a polypeptide containing an immunogenic fragment of the above as an agonist. The screening method includes (a) exposing a sample having the polypeptide to the compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. Alternatively, the invention provides a composition comprising an agonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional LME, comprising administering the composition to a patient.
[0046]
The invention further provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) at least 90% homology with an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. (C) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. The present invention provides a method for screening a compound for confirming the effectiveness of a polypeptide containing an immunogenic fragment of the above as an antagonist. The screening method includes (a) exposing a sample containing the polypeptide to the compound, and (b) detecting agonist activity in the sample. In one embodiment, the invention provides a component comprising an antagonist compound identified by this method and a pharmaceutically acceptable excipient. In yet another alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with over-expression of functional LME, comprising administering the composition to a patient.
[0047]
The invention further provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) at least 90% homology with an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. (C) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. And a method of screening for a compound that specifically binds to a polypeptide containing the immunogenic fragment of the above. The screening method comprises: (a) binding the polypeptide to at least one test compound under appropriate conditions; and (b) detecting the binding of the polypeptide to the test compound, whereby the compound specifically binds to the polypeptide. And identifying.
[0048]
The invention further provides (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, and (b) at least 90% homology with an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. (C) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5, or (d) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. The present invention provides a method for screening for a compound that modulates the activity of a polypeptide comprising an immunogenic fragment of the above. The screening method comprises: (a) mixing the polypeptide with at least one test compound under conditions permitting the activity of the polypeptide; and (b) calculating the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, wherein the change in the activity of the polypeptide in the presence of the test compound Means that the compound modulates the activity of the polypeptide.
[0049]
The invention further provides a method of screening for a compound effective to alter expression of a target polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-10, comprising: The present invention provides the screening method, comprising: exposing a sample containing nucleotides to a compound; and (b) detecting a change in expression of the target polynucleotide.
[0050]
The invention further provides (a) treating a biological sample containing nucleic acids with a test compound, and (b) (i) a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 6-10. (Ii) a natural polynucleotide comprising a polynucleotide sequence having at least 90% homology to a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 6-10, (iii) a sequence complementary to (i). (Iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), (v) at least 20 contiguous nucleotides of a polynucleotide selected from the group comprising the RNA equivalents of (i)-(iv) Hybridizing the nucleic acid of the processed biological sample using a probe consisting of It provides a method for calculating the toxicity of a compound. Hybridization occurs under conditions such that a particular hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide in a biological sample, wherein the target polynucleotide comprises (i) SEQ ID NO: A polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group having 6-10, (ii) comprising a polynucleotide sequence having at least 90% homology with a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-10 A natural polynucleotide, (iii) a polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of (i), (iv) a polynucleotide complementary to the polynucleotide of (ii), (v) (i) to (iv) Selected from the group containing the RNA equivalents of Alternatively, the target polynucleotide may be a fragment of a polynucleotide sequence selected from the group including the above (i) to (v), (c) a step of quantifying the amount of the hybridization complex, and (d) Comparing the amount of hybridization complex in the untreated biological sample with the amount of hybridization complex in the untreated biological sample. Shows the toxicity of the compound.
[0051]
(About the description of the invention)
Before describing the proteins, nucleotide sequences and methods of the present invention, it is to be understood that the invention is not limited to the particular devices, materials and methods described, as such may be modified. It is also understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which is limited only by the claims. Please understand at the same time.
[0052]
It should be noted that in the specification and claims, the terms "a", "an", and the like include "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, "a host cell" includes a plurality of host cells, and the "antibody" includes a plurality of antibodies, including equivalents well known to those skilled in the art.
[0053]
All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise defined. Although any apparatus, materials, and methods similar or equivalent to those described herein can be used to practice or test the present invention, the preferred devices, materials, and methods are now described. All publications mentioned in the present invention are cited for the purpose of describing and disclosing the cells, protocols, reagents and vectors that are reported in the publications and that may be of interest to the present invention. . Nothing herein is an admission that the present invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
[0054]
(Definition)
The term "LME" refers to substantially purified LME amino acids obtained from all species, including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, especially mammals, including cows, sheep, pigs, mice, horses and humans. Points to an array.
[0055]
The term "agonist" refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of LME. The agonist may interact directly with LME or interact with components of the biological pathway involving LME to regulate the activity of LME, such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds, It may include a composition.
[0056]
The term "allelic variant" refers to another form of the gene encoding LME. Allelic variants can be made from at least one mutation in the nucleic acid sequence. It can also be made from mutant RNA or polypeptide. The structure or function of a polypeptide may or may not be mutated. A gene may have no natural allelic variants or one or several natural allelic variants. Common mutational changes that generally result in allelic variants are those that result from spontaneous deletion, addition or substitution of nucleotides. Each of these changes, alone or together with other changes, may occur once or several times within a given sequence.
[0057]
A “mutated” nucleic acid sequence that encodes an LME refers to a polypeptide that has the same polypeptide as LME or has at least one of the functional properties of LME despite the deletion, insertion, or substitution of various nucleotides. This definition includes inappropriate or unexpected hybridization of the LME-encoding polynucleotide sequence with an allelic variant at a position that is not a normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotides of the LME-encoding polynucleotide. Includes polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using probes. The encoded protein may also be "mutated" and may include deletions, insertions or substitutions of amino acid residues that produce a silent change and result in a functionally equivalent LME. Intentional amino acid substitutions may result in similarity in residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity, as long as LME activity is retained biologically or immunologically. It can be done based on For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids with uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, and serine and threonine. Amino acids with uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine and isoleucine and valine, glycine and alanine, and phenylalanine and tyrosine.
[0058]
The terms "amino acid" and "amino acid sequence" refer to oligopeptides, peptides, polypeptides, protein sequences, or any fragment thereof, and include natural and synthetic molecules. Where "amino acid sequence" refers to the sequence of a naturally occurring protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms are not limited to the complete, intact amino acid sequence associated with the described protein molecule.
[0059]
The term "amplification" relates to making a copy of a nucleic acid sequence. Amplification is typically performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known to those skilled in the art.
[0060]
The term "antagonist" is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of LME. Antagonists may interact with LME directly or with components of the biological pathway involving LME to modulate the activity of LME, such as antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds or compositions. It can include proteins such as objects.
[0061]
The term "antibody" refers to Fab and F (ab ') that are capable of binding an antigenic determinant.2, And their fragments, Fv fragments and the like. Antibodies that bind LME polypeptides can be made using intact molecules or fragments thereof, including small peptides that immunize the antibody. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (mouse, rat, rabbit, etc.) can be derived from translated or chemically synthesized RNA, and can be conjugated to a carrier protein if desired. is there. Commonly used carriers that chemically bond to the peptide include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemocyanin (KLH). The binding peptide is used to immunize the animal.
[0062]
The term "antigenic determinant" refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that contacts a particular antibody. When immunizing a host animal with a protein or protein fragment, a number of regions of the protein can induce the production of antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a particular region or three-dimensional structure of the protein). Antigenic determinants can compete with the intact antigen for binding to the antibody (ie, the immunogen used to elicit the immune response).
[0063]
As used herein, "antisense" refers to any composition capable of base-pairing with the sense (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense components include DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), oligonucleotides having a modified backbone linkage such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, 2′-methoxyethyl sugar or 2 ′ Oligonucleotides having a modified saccharide such as -methoxyethoxy sugar or oligonucleotides having a modified base such as 5-methylcytosine, 2-deoxyuracil or 7-deaza-2'-deoxyguanosine. Antisense molecules can be produced by any method, including chemical synthesis or transcription. Once introduced into a cell, the complementary antisense molecule will base pair with the natural nucleic acid sequence formed by the cell, forming a duplex that prevents transcription or translation. The expression "negative" or "minus" is the antisense strand, and the expression "positive" or "plus" is the sense strand.
[0064]
The term "biologically active" refers to a protein having structural, regulatory, or biochemical functions of a natural molecule. Similarly, the term "immunologically active" or "immunogenic" refers to natural or recombinant LME, synthetic LME, or any of their oligopeptides, that is capable of inducing a particular animal or cell-specific immune response. Refers to the ability to trigger and bind to a particular antibody.
[0065]
The term "complementary" refers to the relationship between two single-stranded nucleic acid sequences that anneal by base pairing. For example, the sequence "5'A-G-T3 '" binds to the complementary sequence "3'TC-A5'".
[0066]
"Composition comprising a given polynucleotide sequence" or "composition comprising a given amino acid sequence" refers in a broad sense to any composition comprising a given polynucleotide or amino acid sequence. This component can include a dry formulation or an aqueous solution. Compositions comprising a polynucleotide sequence encoding LME or a fragment of LME can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, a probe is dispersed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, sodium dodecyl sulfate; SDS) and other constituent elements (eg, denhardt solution, skim milk powder, DNA of salmon sperm, etc.). Can be done.
[0067]
The “consensus sequence” is repeatedly subjected to DNA sequence analysis to separate unnecessary bases, and is extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), One or more overlapping cDNAs using a resequenced nucleic acid sequence or a computer program for fragment construction such as the GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA). And ESTs, or nucleic acid sequences constructed from genomic DNA fragments. Some sequences both extend and assemble to determine a consensus sequence.
[0068]
The term "conservative amino acid substitution" refers to a substitution that does not significantly alter the properties of the original protein. That is, the structure and function of the protein are not significantly changed by the substitution, and the structure of the protein, particularly its function, is preserved. The following table shows the amino acids that can be substituted for the original amino acid in the protein and those that are recognized as conservative amino acid substitutions.
Conservative amino acid substitutions typically involve (a) the backbone structure of the polypeptide in the substitution region, such as a β-sheet or α-helical structure, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substitution site, and / or (c) the majority of the side chain. Hold.
[0069]
The term "deletion" refers to a change in the amino acid sequence that lacks one or more amino acid residues, or a change in the nucleic acid sequence that lacks one or more nucleotides.
[0070]
The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. For example, replacement of a hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group can be included in chemical modification of the polynucleotide sequence. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains at least one of the biological or immunological functions of the natural molecule. The polypeptide derivative may be modified by glycosylation, polyethylene glycolation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function from the polypeptide of inducible origin. Polypeptide.
[0071]
"Detectable label" refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of producing a measurable signal, covalently or non-covalently linked to a polynucleotide or polypeptide.
[0072]
"Differential expression" refers to increased or unregulated, or decreased, down-regulated, or defective gene or protein expression, determined by comparing at least two different samples. Such comparisons can be made, for example, between a post-treatment sample and an untreated sample or between a diseased sample and a normal sample.
[0073]
The term "fragment" refers to a unique portion of an LME or a polynucleotide encoding an LME that is identical to, but shorter in length than, its parent sequence. A fragment may have a length that is less than the total length of the defined sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have from 5 to 1000 contiguous nucleotide or amino acid residues. Fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes may be at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 or It can be as long as 500 contiguous nucleotides or amino acid residues. Fragments can be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment can have a length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids (or first 25% or 50% of the polypeptide) as set forth in the given sequence. These lengths are clearly given by way of example, and in the embodiments of the present invention may be of any length supported by the description, including the sequence listings, tables and figures.
[0074]
Fragments of SEQ ID NOs: 6-10 include, for example, regions of unique polynucleotide sequence that unambiguously identify SEQ ID NOs: 6-10 that are distinct from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. Certain fragments of SEQ ID NO: 6-10 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NO: 6-10 from related polynucleotide sequences. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 6-10 that corresponds to a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0075]
Certain fragments of SEQ ID NOs: 1-5 contain a region of a unique amino acid sequence that specifically identifies SEQ ID NOs: 6-10. For example, certain fragments of SEQ ID NO: 1-5 are useful as immunogenic peptides in the development of antibodies that specifically recognize SEQ ID NO: 1-5. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 1-5 that corresponds to a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0076]
A “full-length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine), an open reading frame, and a translation stop codon. A "full length" polynucleotide sequence encodes a "full length" polypeptide sequence.
[0077]
The term "homology" refers to sequence similarity, ie, interchangeable sequence identity between the sequences of two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences.
[0078]
The term “percent identity” or “percent identity” for a polynucleotide sequence refers to the percentage of matching residues between two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm can more significantly compare two sequences because it inserts gaps in a standardized and reproducible manner in the sequences that are compared to optimize alignment between the two sequences.
[0079]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm as incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package and is a suite of molecular biology analysis programs (DNASTAR, Madison WI). For CLUSTAL V, see Higgins, D.W. G. FIG. And P. M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153 and Higgins, D.W. G. FIG. Et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For alignments that make a pair of polynucleotide sequences, the default parameters are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, and “diagonals saved” = 4. Select a "weighted" residue weight table as the default. The percent identity is reported by CLUSTAL V as the "percent similarity" between the aligned polynucleotide sequences.
[0080]
Alternatively, a commonly used and freely available set of sequence comparison algorithms is provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, SF et al., 1990). J. Mol. Biol. 215: 403-410), which is available from several sources including NCBI and the Internet at Bethesda, MD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Available. The BLAST software suite includes various sequence analysis programs, including "blastn" used to align known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is available and is used to directly compare pairs of two nucleotide sequences. “BLAST 2 Sequences” is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorf / b12. You can access html and use it interactively. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are typically used with gaps and other parameters set to default settings. For example, when comparing two nucleotide sequences, one would use blastn with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set to default parameters. An example of setting default parameters is shown below.
[0081]
The percent identity can be measured relative to a fully defined sequence length (eg, defined by a particular SEQ ID NO). Alternatively, the percent identity compared to shorter lengths, eg, fragments obtained from larger defined sequences (eg, fragments of at least 20, 30, 40, 50, 70, 100 or 200 contiguous nucleotides) May be measured. The lengths listed here are merely exemplary, and using any sequence length fragment backed by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, It can be understood that the length over which the can be measured can be explained.
[0082]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of homology may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It is to be understood that this degeneracy can be used to effect changes in a nucleic acid sequence to produce a large number of nucleic acid sequences such that all nucleic acid sequences encode substantially the same protein.
[0083]
The term “percent identity” or “percent identity” as used for a polypeptide sequence refers to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. Methods for polypeptide sequence alignment are known. There are also alignment methods that take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, as detailed above, generally preserve the acidity and hydrophobicity of the site of substitution, thus preserving the structure (and therefore function) of the polypeptide.
[0084]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm, such as that incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (see already described). The default parameters for aligning the polypeptide sequences in pairs using CLUSTAL V are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. Select the PAM250 matrix as the default residue weight table. Similar to polynucleotide alignments, the percent identity of a pair of aligned polypeptide sequences is reported by CLUSTAL V as "percent similarity".
[0085]
Alternatively, a set of NCBI BLAST software may be used. For example, when comparing two polypeptide sequences in pairs, one may use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (Apr-21-2000) set with default parameters. There will be. An example of setting default parameters is shown below.
[0086]
The percent identity can be measured relative to the length of a fully defined (eg, defined by a particular SEQ ID NO) polypeptide sequence. The percent identity is determined by the sequence or fragments obtained from shorter lengths, eg, larger defined polypeptide sequences (eg, fragments of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70 or 150 contiguous residues). May be measured in comparison with the length of the match. The lengths listed here are merely exemplary, and using fragments of any sequence length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings, It should be understood that the length may explain the length over which the percent match can be measured.
[0087]
"Human artificial chromosome (HAC)" is a linear small chromosome that contains all the elements necessary for the isolation and maintenance of stable chromosomal replication, which can include DNA sequences of about 6 kb (kilobases) to 10 Mb in size. is there.
[0088]
The term "humanized antibody" refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been changed to more closely resemble a human antibody while retaining its original binding ability.
[0089]
“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms a base pair with a complementary single-strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization indicates that two nucleic acid sequences share a high degree of homology. Under conditions that permit annealing, a specific hybridization complex is formed and remains hybridized after the washing step. Wash steps are particularly important in determining the stringency of the hybridization process, and under more stringent conditions, non-specific binding (ie, pair binding between nucleic acid strands that are not perfectly matched) is reduced. The permissive conditions for annealing a nucleic acid sequence are routinely determined by those skilled in the art. The permissive conditions may be constant during the hybridization experiment, but the washing conditions may be varied during the experiment to obtain the desired stringency and thus also the hybridization specificity. Conditions that permit annealing include, for example, about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS at about 68 ° C., and about 100 μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.
[0090]
In general, the stringency of hybridization can be expressed, in part, in reference to the temperature at which the washing step is performed. Such a washing temperature is usually selected to be about 5 to 20 ° C. lower than the melting point (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under given ionic strength and pH conditions. The equation for calculating Tm and nucleic acid hybridization conditions are well known and are described in Sambrook et al. (1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, particularly see Volume 9, Chapter 9.
[0091]
High stringency hybridization between polynucleotides of the present invention involves a washing step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS. Alternatively, it is performed at a temperature of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. SSC concentrations can vary from about 0.1 to 2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, blocking agents are used to block non-specific hybridization. Such blocking agents include, for example, denatured salmon sperm DNA at about 100-200 μg / ml. Under certain conditions, for example, for the hybridization of RNA and DNA, an organic solvent such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can also be used. Useful variations of washing conditions will be apparent to those skilled in the art. Hybridization can indicate evolutionary similarity between nucleotides, especially under high stringency conditions. Such similarities strongly suggest a similar role for nucleotides and polypeptides encoded by nucleotides.
[0092]
The term "hybridization complex" refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonding between complementary bases. Hybridization complexes can be formed in solution (C0t or R0t analysis). Alternatively, one nucleic acid sequence is in solution and the other nucleic acid sequence is a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin, or glass slide, or other suitable substrate, such as a cell or its nucleic acid). Can be formed between two nucleic acid sequences such that they are immobilized on a substrate to which they are immobilized.
[0093]
The term "insertion" or "addition" refers to a change in the amino acid or nucleic acid sequence to which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0094]
“Immune response” can refer to a condition associated with inflammation, trauma, immune disorders, infectious diseases or genetic diseases. These conditions can be characterized by the expression of various factors, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules, that can act on cells and the systemic defense system.
[0095]
The term "immunogenic fragment" refers to a polypeptide or oligopeptide fragment of LME that elicits an immune response when introduced into a living animal, such as a mammal. The term “immunogenic fragment” also includes polypeptide or oligopeptide fragments of LME useful herein for any of the methods for producing antibodies disclosed herein or known in the art.
[0096]
The term "microarray" refers to an arrangement of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0097]
The term "element" or "array element" refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound that has a unique, designated location on a microarray.
[0098]
The term "modulation" refers to a change in the activity of LME. For example, modulation results in a change in LME protein activity, or binding, or other biological, functional, or immunological properties.
[0099]
The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin that may be single-stranded or double-stranded or represent a sense or antisense strand. , Peptide nucleic acid (PNA), or any DNA-like or RNA-like substance.
[0100]
"Operably linked" refers to the state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. In cases where it is necessary to join two protein coding regions in the same reading frame, generally the functionally linked DNA sequences can be very close or contiguous.
[0101]
“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or an anti-gene agent that comprises an oligonucleotide at least about 5 nucleotides in length attached to the peptide backbone at amino acid residues terminating in lysine. Terminal lysine confers solubility to the component. PNAs preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA and stop transcription elongation, and can be polyethyleneglycolated to extend the lifespan of PNAs in cells.
[0102]
"Post-translational modifications" of LME may include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of the LME and can vary from cell type to cell type.
[0103]
The term "probe" refers to a nucleic acid sequence encoding LME, its complementary sequence, or a fragment thereof, which is used to detect the same or allelic nucleic acid sequence or a related nucleic acid sequence. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide that is attached to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioisotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide. The primer can then be extended to the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme. Primer pairs can be used for amplification (and identification) of nucleic acid sequences, for example, by the polymerase chain reaction (PCR).
[0104]
Probes and primers as used in the present invention typically contain at least 15 contiguous nucleotides of a known sequence. Longer probes and primers to increase specificity, such as probes consisting of at least 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or 150 contiguous nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences; Primers may be used. Some probes and primers are considerably longer. It is understood that any length of nucleotide supported by the specification, including tables, figures and sequence listings, can be used.
[0105]
Methods for preparing and using probes and primers are described in Sambrook, J .; And others (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Ausubel, F.C. M. Et al., (1987)Current Protocols in Molecular Biology, Green Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY, Innis et al. (1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications See Academic Press, San Diego CA, and the like. A PCR primer pair can be obtained from a known sequence using a computer program for that purpose, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA).
[0106]
The selection of oligonucleotides to use as primers is made using software well known in the art for such purpose. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs of up to 100 nucleotides each, oligonucleotides and up to 5,000 larger polynucleotides derived from input polynucleotide sequences up to 32 kilobases. It is also useful for analyzing data. Similar primer selection programs incorporate additional features for expansion capabilities. For example, the PrimOU primer selection program (available publicly from the Genome Center at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) is capable of selecting specific primers from megabase sequences, and thus covers the entire genome. Useful for designing primers. The Primer3 primer selection program (available from Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Cambridge MA1) allows the user to enter a "non-priming library" that allows the designation of sequences to be avoided as primer binding sites. Primer 3 is particularly useful for selecting oligonucleotides for microarrays. (The source code of the latter two primer selection programs may be obtained from their own source and modified to meet the specific needs of the user.) PrimerGen program (Human Genome Mapping Project in Cambridge, UK-General Information from Resource Center Designed primers based on multiple sequence alignments, thereby allowing the selection of primers that hybridize to either the largest or the smallest conserved region of the aligned nucleic acid sequences . Thus, the program is useful for identifying unique and conserved fragments of oligonucleotides and polynucleotides. Oligonucleotides and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods can be used to identify fully or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, eg, as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples. It is useful as a specific probe to perform. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
[0107]
As used herein, a “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence, but a sequence in which two or more separate segments of a sequence are artificially combined. This artificial combination is often achieved by chemical synthesis, but more generally by the artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, for example, by genetic engineering techniques such as those described in Sambrook et al., Supra. Achieved by. The term recombinant nucleic acid also includes a mutant nucleic acid in which a part of the nucleic acid is simply added, substituted or deleted. Frequently, recombinant nucleic acids include nucleic acid sequences operably linked to a promoter sequence. Such a recombinant nucleic acid can be an essential element of the vector, for example, as used to transform a cell.
[0108]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid may be an essential element of a viral vector, for example based on vaccinia virus. Vaccinia virus is used to vaccinate a mammal in which the recombinant nucleic acid is expressed and induces a protective immune response in the mammal.
[0109]
A "regulatory element" is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene, and includes enhancers, promoters, introns, and 5 'and 3' untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that regulate transcription, translation or RNA stability.
[0110]
A “reporter molecule” is a chemical or biochemical moiety used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and other components known in the art.
[0111]
As used herein, the term "RNA equivalent" for a DNA sequence is composed of the same linear nucleic acid sequence as a reference DNA sequence, except that thymine, a nitrogenous base, is substituted with uracil, and the sugar chain backbone is Consists of ribose, not deoxyribose.
[0112]
The term "sample" is used in its broadest sense. A sample presumed to contain LME, a nucleic acid encoding LME, or a fragment thereof is obtained by analyzing a body fluid, an extract from a cell or a chromosome or an organelle or a membrane isolated from a cell, a membrane, a cell, Genomic DNA, RNA, cDNA present in or immobilized on a substrate, tissue, tissue prints and the like.
[0113]
The terms "specific binding" and "specifically bind" refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction means that it depends on the presence or absence of a particular structure of the protein (eg, an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if the antibody is specific for the epitope "A", the unbound labeled "A" and the reaction solution containing the antibody may contain the polypeptide containing epitope A or the unlabeled "A" ”Reduces the amount of label A that binds to the antibody.
[0114]
The term "substantially purified" refers to an isolated or isolated nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from its natural environment and has at least about 60% of its naturally associated composition removed. Preferably at least about 75% removed, most preferably at least 90% removed.
[0115]
"Substitution" refers to the replacement of one or more amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
[0116]
The term "substrate" refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate can have various surface morphologies, such as walls, grooves, pins, channels, pores, etc., to which polynucleotides or polypeptides bind.
[0117]
"Transcription image" refers to the pattern of collective gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under given conditions.
[0118]
"Transformation" refers to the process by which foreign DNA is introduced into recipient cells. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to various methods known in the art, and include any known method for inserting foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. Can be based. The method of transformation is selected depending on the type of host cell to be transformed. Transformation methods include, but are not limited to, viral infection, electroporation, heat shock, lipofection and microprojectile bombardment. "Transformed" cells include stably transformed cells in which the introduced DNA is capable of replicating autonomously as a plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that express the introduced DNA or introduced RNA temporarily for a limited time are also included.
[0119]
As used herein, a “genetically transformant” is any organism, including but not limited to animals and plants, wherein one or several cells of the organism are involved, for example, in the art, by the involvement of humans. It has a heterologous nucleic acid introduced by well known transformation techniques. The nucleic acid is introduced into the cell either directly or indirectly, by introducing it into a precursor of the cell, by deliberate genetic manipulation, for example by microinjection or by introducing a recombinant virus. The term genetic manipulation refers to classical cross breeding orin in vitroIt does not refer to fertilization but to the introduction of a recombinant DNA molecule. Genetic transformants contemplated according to the present invention include bacteria, cyanobacteria, fungi and plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods known in the art, for example, infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the present invention into such organisms are well known and are provided in references such as Sambrook et al. (1989), supra.
[0120]
The “variant sequence” of a specific nucleic acid sequence is defined as a specific sequence for a certain nucleic acid sequence by blastn using a “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May-07-1999) with default parameter settings. Is a nucleic acid sequence whose identity is determined to be at least 40%. Such a nucleic acid pair can be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It may show 96%, 97%, 98%, 99% or more homology. Certain variant sequences can be referred to, for example, as "allelic" variant sequences (described above) or "splice" variant sequences, "species" variant sequences, "polymorphic" variant sequences. Splice variants may have significant homology to a reference molecule, but will usually have a large or small number of polynucleotides due to alternate splicing of exons during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional functional domains or may lack domains present in the reference molecule. Species variants are polynucleotide sequences that differ from one another by species. The resulting polypeptides usually have significant amino acid homology to one another. Polymorphic variants vary in the polynucleotide sequence of a particular gene between individuals of a given species. Polymorphic variant sequences can also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which one nucleotide of the polynucleotide sequence differs. The presence of a SNP may be indicative of, for example, a particular population, condition or propensity for a condition.
[0121]
A "variant" of a particular polypeptide sequence is defined as the blastp using a "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.9 (May-07-1999) with default parameter settings, for a given length of a nucleic acid sequence. A polypeptide sequence whose identity is determined to be at least 40% for a particular polypeptide sequence. Such a pair of polypeptides may be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, for a given length. , 97%, 98%, 99% or more sequence identity.
[0122]
(invention)
The present invention relates to novel human lipid metabolizing enzymes (LMEs), polynucleotides encoding LMEs, and to the diagnosis, treatment and prevention of cancer, neurological diseases, autoimmune / inflammatory diseases, gastrointestinal diseases, and cardiovascular diseases. It is based on the discovery of a method using the sequence of
[0123]
Table 1 is a summary of the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. Each polynucleotide and its corresponding polypeptide correlates with one Incyte project identification number (Incyte project ID). Each polypeptide sequence was designated by a polypeptide sequence identification number (polypeptide SEQ ID NO) and an Incyte polypeptide sequence number (Incyte polypeptide ID). Each polynucleotide sequence was designated by a polynucleotide sequence identification number (polynucleotide SEQ ID NO) and an Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte polynucleotide ID).
[0124]
Table 2 shows sequences with homology to the polypeptides of the invention, as identified by BLAST analysis against the GenBank protein (genpept) database. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (Polypeptide SEQ ID NO :) for each polypeptide of the invention and the corresponding Incyte polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID). Column 3 shows the GenBank identification number (Genbank ID NO :) of the closest homolog of GenBank. Column 4 shows the probability score representing the match between each polypeptide and its GenBank homolog. Column 5 shows the annotation of the GwnBank homolog, with the appropriate citation in place. These are incorporated herein by reference.
[0125]
Table 3 shows various structural features of each polypeptide of the invention. Columns 1 and 2 show the polypeptide sequence identification number (SEQ ID NO :) and the corresponding insite polypeptide sequence number (Incyte Polypeptide ID) of each polypeptide of the invention. Column 3 shows the number of amino acid residues in each polypeptide. Rows 4 and 5 show potential phosphorylation and glycosylation sites, respectively, as determined by the MOTIFS program (Genetics Computer Group, Madison WI) of the GCG sequence analysis software package. Column 6 shows the amino acid residues that include the signature sequence, domain, and motif. Column 7 shows the analysis method for analysis of the structure / function of the protein, and the relevant part shows a searchable database used for the analysis method.
[0126]
Tables 2 and 3 together summarize the properties of each polypeptide of the present invention, and those properties establish that the claimed polypeptides are lipid metabolizing enzymes. For example, SEQ ID NO: 1 was shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 94% identity from bovine phospholipase C (g304241) from residue P52 to residue Q1052. The probability score was 0.00, indicating the probability that the observed polypeptide sequence alignment would be obtained by chance (Table 2). As an alternative example, SEQ ID NO: 2 was shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to have 67% identity with mouse group IIF secreted phospholipase A2 (g6174881). Its established score is 6.9e-74 (Table 2). As another example, SEQ ID NO: 3 was shown by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to be 87% identical to murine lipoxygenase 3 from residue M1 to residue I711. Its probability score is 0.0 (Table 2). SEQ ID NO: 3 also has a lipoxygenase domain and a PLAT (polycystin-1, lipoxygenase, alpha toxin) / LH2 (lipoxygenase homology) domain. This was determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM) (see Table 3). Data from BLIMPS, MOTIFS, and PROFILESCAN analysis provide further empirical evidence that SEQ ID NO: 3 is a lipoxygenase. As another example, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) showed that SEQ ID NO: 4 was 89% identical from bovine phospholipase C (g163522) to residues M1 to L1216 (Table 2). reference). Its BLAST probability score is 0.0 (Table 2). SEQ ID NO: 4 also has the X and Y domains of phosphatidylinositol-specific phospholipase C. This was determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM) (see Table 3). Data from the analysis of BLIMPS and MOTIFS provide evidence further confirming that SEQ ID NO: 4 is phospholipase C. In another example, SEQ ID NO: 5 is 38% identical to murine phospholipase C-L2 (g6705987) from residue A3 to M489, and 40% identical from residue V624 to G914. Indicated by Local Alignment Search Tool (BLAST). Its BLAST probability scores are 3e-88 and 3e-62, respectively. SEQ ID NO: 5 also has the X and Y domains of a phosphatidylinositol-specific phospholipase. This was determined by searching for statistically significant matches in the PFAM database of conserved protein family domains based on the Hidden Markov Model (HMM) (see Table 3). Data from BLIMPS and PROFILESCAN analysis provide evidence to further confirm that SEQ ID NO: 5 is a phospholipase. The algorithm and parameters for the analysis of SEQ ID NOs: 1-5 are described in Table 7.
[0127]
As shown in Table 4, the full-length polynucleotide sequence of the present invention was constructed using a cDNA sequence or a coding (exon) sequence derived from genomic DNA, or any combination of these two sequences. Columns 1 and 2 show the polynucleotide sequence identification number (Polynucleotide SEQ ID NO :) and the corresponding Incyte polynucleotide consensus sequence number (Incyte Polynucleotide ID) of each polynucleotide of the present invention, respectively. Column 3 shows the length of each polynucleotide sequence in base pairs. Column 4 contains polynucleotide sequences useful for hybridization or amplification techniques, eg, to identify SEQ ID NOs: 6-10 or to distinguish SEQ ID NOs: 6-10 from related polynucleotide sequences. Shows a fragment. Column 5 shows the identification number corresponding to the cDNA sequence, the coding sequence (exon) predicted from genomic DNA and / or the sequence set having both cDNA and genomic DNA. These sequences were used to construct the full length polynucleotide sequences of the present invention. Columns 6 and 7 of Table 4 indicate the starting nucleotide (5 ') and ending nucleotide (3') positions of the cDNA and genomic sequences, respectively, corresponding to the sequence of column 5.
[0128]
The identification number in column 5 of Table 4 may refer in particular to, for example, Incyte cDNA and its corresponding cDNA library. For example, 7412054H1 is the identification number of the Incyte cDNA sequence, and BLADNOR02 is the identification number of the cDNA library from which it was derived. Incyte cDNAs for which no cDNA library is shown are derived from pooled cDNA libraries (eg, 71200138V1). Alternatively, the identification number in row 5 may be the identification number of the GenBank cDNA or EST (eg, g5514658) used to assemble the polynucleotide sequence. Alternatively, the identification number in column 5 may refer to the coding region predicted by Genscan analysis of genomic DNA. For example, GNN. g6983515 — 000028 — 002 is the identification number of the Genscan deduced coding sequence, and g6983515 is the identification number of the GenBank sequence obtained by Genscan analysis. This Genscan putative coding sequence may be edited before the sequence is assembled (see Example IV). Alternatively, the identification number in column 5 may refer to both the set of cDNA and Genscan predicted exons combined by the "exon-stitching" algorithm. For example, FL1078033_00001 indicates a stitch array in which 1078033 is an identification number of a cluster of an array in which the algorithm is adopted, and 00001 is a predicted number generated by the algorithm (see Example 5). Alternatively, the identification number in column 5 may be a group consisting of both cDNA and Genscan putative exons by the "exon stretching" algorithm (see Example 5). In some cases, a range of Incyte cDNA that overlaps with the range of the sequence shown in column 5 is obtained and the final consensus sequence is determined, but the identification number of the corresponding Incyte cDNA is not shown.
[0129]
Table 5 shows a representative cDNA library for full-length polynucleotide sequences constructed using Incyte cDNA sequences. A representative cDNA library is the Incyte cDNA library most frequently represented by the Incyte cDNA sequence used to assemble and verify the above polynucleotide sequences. The tissues and vectors used to prepare the cDNA library are shown in Table 5 and described in Table 6.
[0130]
The present invention also includes variants of LME. Preferred LME variants have at least one of LME functional and / or structural characteristics and have at least about 80% amino acid sequence identity to the LME amino acid sequence, or at least about 90% amino acid sequence. Have identity, and even at least about 95% amino acid sequence identity.
[0131]
The present invention also provides a polynucleotide encoding LME. In certain embodiments, the invention provides a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-10 that encodes an LME. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 6-10 shown in the sequence listing includes an equivalent RNA sequence in which thymine of a nitrogenous base is substituted with uracil and the backbone of the sugar chain is not deoxyribose but ribose.
[0132]
The invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding LME. In particular, such a variant of the polynucleotide sequence will have at least 70% polynucleotide sequence identity to the LME-encoding polynucleotide sequence, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 95%. Has polynucleotide sequence identity. In some embodiments of the present invention, the SEQ ID NO: 6-10 has at least about 70%, or at least about 85%, or at least about 95% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-10. Includes a variant of the polynucleotide sequence having a sequence selected from the group consisting of ID NOs: 6-10. A variant of any of the above polynucleotides may encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of LME.
[0133]
One of skill in the art will appreciate that the various polynucleotide sequences encoding LME that can be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known naturally occurring genes. Will understand. Thus, the present invention may cover any and all possible variants of the polynucleotide sequence that can be generated by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are made based on the standard triplet genetic code as applied to the polynucleotide sequence of native LME, and all variations are considered to be expressly disclosed.
[0134]
The nucleotide sequence encoding LME and its variant sequences are generally capable of hybridizing to the nucleotide sequence of native LME under suitably selected stringent conditions, but are substantially free of non-naturally occurring codons, including codons. It may be advantageous to generate nucleotide sequences encoding LME or derivatives thereof with different usage codons. Based on the frequency with which a host utilizes a particular codon, it is possible to select codons to enhance the expression of a peptide that occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding LME and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that RNA transcripts with favorable properties, such as longer half-lives, than transcripts made from the native sequence Is to make things.
[0135]
The invention also includes the generation of DNA sequences encoding LME and its derivatives or fragments thereof entirely by synthetic chemistry. Once made, the synthetic sequence may be inserted into any of the various available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry may be used to induce mutations in the sequence encoding LME or any fragment thereof.
[0136]
The present invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing under various stringent conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NOs: 6-10 and fragments thereof ( See, for example, Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, Kimmel.AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in Definitions.
[0137]
Methods for DNA sequencing are known in the art, and any of the embodiments of the present invention can be practiced using DNA sequencing methods. Enzymes can be used in the DNA sequencing method. For example, Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (Applied Biosystems), and thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia, N. Biocia, Japan) ) Can be used. Alternatively, a polymerase and a calibrated exonuclease can be used in combination, for example, as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD). Preferably, an apparatus such as a MICROLAB 2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), a PTC 200 thermal cycler (MJ Research, Watertown MA) and an ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) are used to automate the arrangement. Next, sequencing is performed using an ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Applied Biosystems), a MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) or other methods well known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art. (Ausubel, FM (1997)Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7, Meyers, R.A. A. (1995)Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853. Etc.).
[0138]
Various methods based on the PCR method known in the art are used to extend the LME-encoding nucleic acid sequence using partial nucleotide sequences to detect upstream sequences such as promoters and regulatory elements. For example, one of the methods that can be used, restriction site PCR, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using universal primers and nested primers (Sarkar, G. (1993) PCR). Methods Appl 2: 318-322, etc.). Another method is the inverse PCR method, which amplifies an unknown sequence from a circularized template using primers extended in a wide range of directions. The template is obtained from a restriction enzyme fragment consisting of a known genomic locus and its surrounding sequences (see Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). A third method is the capture PCR method, which involves a method of PCR amplifying a DNA fragment adjacent to a known sequence of human and yeast artificial chromosome DNA (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods). Appl. 1: 111-119 etc.). In this method, it is possible to insert a recombinant double-stranded sequence into an unknown sequence region using digestion and ligation of a plurality of restriction enzymes before performing PCR. Other methods that can be used to search for unknown sequences are known in the art (see, for example, Parker, JD, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). In addition, genomic DNA can be walked using PCR, nested primers and PromoterFinder ™ library (Clontech, Palo Alto CA). This procedure is useful for finding intron / exon junctions without having to screen the library. For all PCR-based methods, commercially available software, such as OLIGO 4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program, may be about 22-30 nucleotides in length, Primers can be designed to anneal to the template at a GC content of about 50% or more and a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
[0139]
When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been size-selected to include larger cDNAs. In addition, libraries of random primers often include sequences having the 5 'region of the gene and are suitable for situations where the oligo d (T) library cannot produce full-length cDNA. Genomic libraries will be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
[0140]
A commercially available capillary electrophoresis system can be used to analyze the size of the sequencing or PCR product or to confirm its nucleotide sequence. Specifically, capillary sequencing consists of a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye that is specific for four different nucleotides, and detection of the emitted wavelength. And a CCD camera used for The output / light intensity can be converted to an electrical signal using appropriate software (such as GENOTYPER, SEQUENCE NAVIGATOR from Applied Biosystems). The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that are present in small amounts in a particular sample.
[0141]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding LME, or a fragment thereof, can be cloned into a recombinant DNA molecule to express LME, a fragment thereof, or a functional equivalent in a suitable host cell. It is. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, alternative DNA sequences encoding substantially the same or functionally equivalent amino acid sequences can be made, and these sequences can be used for cloning and expression of LME.
[0142]
The nucleotide sequence of the present invention can be recombined using methods generally known in the art to change the sequence encoding the LME for various purposes. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Nucleotide sequences can be recombined using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, site-directed mutagenesis via oligonucleotides can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variants, and the like.
[0143]
The nucleotides of the present invention may be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; U.S. Pat. No. 5,837,458; Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-797; Christians, F. C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319). The biological or enzymatic activity of the LME, or the ability to bind to other molecules or compounds, can be altered or improved. DNA shuffling is the process of generating a library of gene variants using PCR-mediated recombination of gene fragments. The library is then subjected to selection or screening to identify the gene variant with the desired properties. These suitable mutants may then be pooled and subjected to repeated DNA shuffling and selection / screening. Thus, diverse genes are created by artificial breeding and rapid molecular evolution. For example, a single gene fragment having a random point mutation can be recombined, screened, and then shuffled until the desired property is optimized. Alternatively, a given gene is recombined with a homologous gene of the same gene family, obtained from either the same species or a different species, thereby maximizing the genetic diversity of multiple naturally occurring genes in a directed and controllable manner. be able to.
[0144]
According to another embodiment, the sequence encoding LME can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH, et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232. Alternatively, LME itself or a fragment thereof can be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid or solid phase techniques (Creightton, T. (1984)).Proteins, Structures and Molecular PropertiesWH Freeman, New York NY, pp. 55-60, Robert, J. et al. Y. Et al. (1995) Science 269: 202-204). Automated synthesis can be achieved using an ABI 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). Further, the amino acid sequence of LME, or any portion thereof, may be altered by direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins or any portion thereof, using chemical methods, to produce the native amino acid. It is possible to produce a polypeptide having a polypeptide sequence or a variant polypeptide.
[0145]
Peptides can be substantially purified using high performance liquid chromatography for separation (see, eg, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see Creighton, supra, pages 28-53, etc.).
[0146]
To express a biologically active LME, the nucleotide sequence encoding LME or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the necessary elements for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding the LME. Such elements vary in length and specificity. With certain initiation signals, it is possible to achieve more efficient translation of the sequence encoding the LME. Such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding LME, its initiation codon, and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be necessary. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal including an in-frame ATG initiation codon should be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be of various natural and synthetic origin. Increasing the efficiency of expression can be achieved by including an enhancer suitable for the particular host cell line used (see, eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 201-18-162.). ).
[0147]
Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to create an expression vector containing a sequence encoding LME and suitable transcriptional and translational regulatory elements. These methods include:in in vitroRecombinant DNA technology, synthetic technology, andin VivoGenetic recombination techniques are included (eg, Sambrook, J. et al. (1989)).Molecular Cloning. A Laboratory ManualAusubel, F., Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; M. other. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. (See Chapters 9 and 13 1-4).
[0148]
A variety of expression vector / host systems can be used to retain and express sequences encoding LME. Such expression vector / host systems include, but are not limited to, bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viruses. Insect cell lines infected with an expression vector (eg, baculovirus), plant cell lines transformed with a viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus CaMV or tobacco mosaic virus TMV) or a bacterial expression vector (eg, Ti or pBR322 plasmid), Microorganisms such as animal cell lines (Sambrook, supra, Ausubel, Van Heke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509, Engelh) Ard, EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987). EMBOJ 6: 307-311, The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill New York, 1971-Jan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15:34. See, etc. -355). Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses, or expression vectors derived from various bacterial plasmids can be used to transport nucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, 5 (6): 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, R. M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. (1985) Nature 317 (6040): 813-815; McGregor, DP et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM, and N. Somia ( 1997) Nat See 239-242, etc.): re 389.
[0149]
The present invention is not limited by the host cell used. In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use intended for the LME-encoding polynucleotide sequence. For example, for routine cloning, subcloning, and propagation of a polynucleotide sequence encoding LME, a multifunctional E. coli vector such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1 plasmid (GIBCO BRL) can be used. Ligation of the LME-encoding sequence into multiple cloning sites of the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, these vectors are used in the cloned sequence.in in vitroIt may also be useful for transcription, dideoxy sequencing, single-stranded rescue by helper phage, generation of nested deletions (Van Heake, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.). For example, when a large amount of LME is required for production of an antibody or the like, a vector that induces LME expression at a high level can be used. For example, vectors containing a strong inducible T5 or inducible T7 bacteriophage promoter can be used.
[0150]
A yeast expression system can be used to express LME. Numerous vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase, PGH promoter, etc.Saccharomyces cerevisiae OrPichia pastorisIt can be used for In addition, such vectors direct the expressed protein either to secretion or retention in the cell, allowing integration of foreign sequences into the host genome for stable growth (Ausubel (supra). (1995), Bitter, GA, et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516544, Scorer, CA, et al. (1994) Bio / Technology 12: 181-184).
[0151]
Plant systems can also be used for expression of LME. Transcription of the LME-encoding sequence may be by viral promoters, such as CaMV-derived 35S and 19S, used alone or in combination with an omega leader sequence from TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6: 307-311). Promoted by a promoter. Alternatively, a plant promoter such as a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter may be used (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 16711680, Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838843, Winter). , J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85105). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. (Maglow Hill Science and Technology Yearbook (The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196. )
In mammalian cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding LME may be ligated to an adenovirus transcript / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion of the viral genome into a non-essential E1 or E3 region makes it possible to obtain a live virus expressing LME in infected host cells (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. High levels of protein expression can also be achieved using vectors based on SV40 or EBV.
[0152]
Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to transport fragments of DNA larger than those contained in and expressed from the plasmid. Approximately 6 kb to 10 Mb HACs are made for therapeutic purposes and supplied by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles) (Harrington. JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 345). -355.).
[0153]
For long-term production of recombinant mammalian proteins, stable expression of LME in cell lines is desirable. For example, it is possible to transform an LME-encoding sequence into a cell line using an expression vector. Such expression vectors include replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells can be allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to the selection medium, and the presence of the selectable marker allows for the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
[0154]
The transformed cell line can be recovered using any number of selection systems. Such selection systems include, but are not limited to, tk−A herpesvirus thymidine kinase gene used for cells, apr−There are adenine phosphoribosyltransferase genes used for cells (see Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232, Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823, etc.). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, als confer resistance to chlorsulfuron, pat confer resistance to phosphinothricin acetyltransferase, respectively (Wigler, M., et al. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-3570, Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14. Other selectable genes, such as trpB and hisD, which alter cell requirements for metabolism, have been described in the literature (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 85: 8047-8051 etc.). Visible markers such as anthocyanins, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin may be used. These markers can be used not only to identify transformants, but also to quantify transient or stable protein expression due to a particular vector system (Rhodes, CA (1995)). Methods Mol. Biol. 55: 121-131).
[0155]
Even if the presence / absence of marker gene expression indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if the sequence encoding LME is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding LME can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be aligned with the sequence encoding LME under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
[0156]
In general, host cells that contain the nucleic acid sequence encoding LME and that express LME can be identified using a variety of methods well known to those of skill in the art. Non-limiting methods well known to those skilled in the art include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR, nucleic acid or protein detection, quantification, or both, membrane systems and solutions. There are protein bioassays or immunoassays, including base or chip based techniques.
[0157]
Immunological methods for detecting and measuring LME expression using specific polyclonal or monoclonal antibodies are known in the art. Examples of such techniques include enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA), flow cytometers (FACS) and the like. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on the LME is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are known in the art (Hampton. R. et al. (1990).Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV, Coligan, J.M. E. FIG. Others (1997)Current Protocols in Immunology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY, Pound, J .; D. (1998)Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ, etc.).
[0158]
A wide variety of methods for labeling and conjugation are known to those skilled in the art and may be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization or PCR probes to detect sequences related to the LME-encoding polynucleotide include oligo-labeling, nick translation, end-labeling, or labeled nucleotides. The PCR amplification used is included. Alternatively, the sequence encoding LME, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are known in the art and commercially available, with the addition of a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides.in in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. Such methods are described, for example, in Amersham Pharmacia Biotech, Promega (Madison WI), U.S.A. S. It can be performed using various kits commercially available from Biochemical or the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, as well as radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
[0159]
Host cells transformed with the nucleotide sequence encoding LME are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the protein from cell culture. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains in the cell depends on the sequence, the vector, or both. Those skilled in the art will appreciate that expression vectors containing a polynucleotide encoding LME can be designed to include a signal sequence that directs secretion of LME across prokaryotic and eukaryotic cell membranes.
[0160]
In addition, selection of a host cell strain may be made by its ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify the target protein, folding and / or activity. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38, etc.) with unique cellular devices and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Va.). It is possible and can be chosen to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0161]
In another embodiment of the present invention, the natural or altered or recombinant nucleic acid sequence encoding LME is linked to a heterologous sequence which translates into a fusion protein in any of the host systems described above. For example, a chimeric LME protein containing a heterologous moiety that can be recognized by commercially available antibodies can facilitate screening of peptide libraries for inhibitors of LME activity. Heterologous protein moieties and heterologous peptide moieties can also facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity substrates. Such portions include, but are not limited to, glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, There is hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-His on metal chelating resin allow purification of homologous fusion proteins. FLAG, c-myc and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, genetic manipulation of the fusion protein to include a proteolytic cleavage site between the sequence encoding LME and the heterologous protein sequence can result in cleavage of the LME from the heterologous portion after purification. Methods for expression and purification of the fusion protein are described in Ausubel (1995), Chapter 10, supra. Various commercially available kits can also be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
[0162]
In another embodiment of the invention, a TNT rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract system (Promega) is used.in in vitroThe synthesis of LME radioactively labeled with is possible. These systems couple the transcription and translation of a protein coding sequence operably linked to a T7, T3 or SP6 promoter. Translation, for example35It occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor such as S-methionine.
[0163]
A compound that specifically binds to LME can be screened using the LME of the present invention or a fragment thereof. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to LME. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, receptors) or small molecules.
[0164]
In one embodiment, the compound so identified is closely related to the natural ligand of the LME, eg, a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE, et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). Similarly, the compound may be closely related to the natural receptor to which the LME binds, or at least some fragment of the receptor, eg, a ligand binding site. In each case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one embodiment, screening for such compounds involves producing suitable cells that express LME as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, E. coli. Cells expressing LME or cell membrane fragments containing LME are contacted with a test compound and analyzed for binding, stimulation or inhibition of either LME or the compound.
[0165]
Some assays simply allow the test compound to be conjugated experimentally to the polypeptide and the binding detected by a fluorescent dye, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay can include binding at least one test compound to LME in solution or immobilized on a solid support, and detecting binding of the LME to the compound. Alternatively, detection and measurement of binding of a test compound in the presence of a labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed with cell-free reconstituted specimens, chemical libraries or natural product mixtures, where the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0166]
Using the LME of the present invention or a fragment thereof, it is possible to screen for a compound that regulates the activity of LME. Such compounds include agonists, antagonists, or partial or inverse agonists and the like. In one example, the assay is performed under conditions where the activity of the LME is acceptable, wherein the LME binds to at least one test compound, and the activity of the LME in the presence of the test compound is determined by the activity of the LME in the absence of the test compound. Compare with activity. A change in the activity of LME in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of LME. Alternatively, the test compound comprises LME under conditions suitable for the activity of LME.in in vitroAlternatively, the assay is performed in combination with a cell-free reconstitution system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of LME can bind indirectly and does not need to be in direct contact with the test compound. At least one and a plurality of test compounds can be screened.
[0167]
In another example, a polynucleotide encoding LME or a mammalian homolog thereof is "knocked out" in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells). Such techniques are well known in the art and are useful for generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from an early mouse embryo and can be grown in a medium. These ES cells are transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, MR (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. In another method, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system to knock out the target gene in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002). Wagner, KU, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). The transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected, for example, from the C57BL / 6 mouse line. The blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are determined, and they are bred to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced can be tested with potential therapeutic or toxic agents.
[0168]
A polynucleotide encoding LME.in in vitroIt is possible to operate on ES cells derived from human blastocysts. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight distinct cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neurons, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, JA, et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0169]
Using LME-encoding polynucleotides, it is possible to create "knock-in" humanized animals (pigs) or transgenic animals (mouse or rat) using human disease as a model. Using knock-in technology, a region of a polynucleotide encoding LME is injected into animal ES cells, and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. The transformed cells are injected into a blastula and the blastula is implanted as described above. Study transgenic progeny or inbred lines and treat with potential medicines to obtain information on the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress LME, eg, secrete LME into milk, can be a convenient source of proteins (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55). -74).
[0170]
(Treatment)
There is chemical and structural similarity between certain regions of the LME and certain regions of the lipid metabolizing enzymes, for example, in sequence and motif content. Furthermore, LME expression is closely associated with diseased, cancerous, inflamed, cardiovascular, and nervous tissues. Thus, LME is thought to play a role in cancer, nervous system disorders, autoimmune / inflammatory diseases, gastrointestinal diseases, and cardiovascular diseases. In treating diseases associated with increased LME expression or activity, it is desirable to reduce LME expression or activity. In the treatment of a disease associated with a decrease in the expression or activity of LME, it is desirable to increase the expression or activity of LME.
[0171]
Thus, in one embodiment, it is possible to administer LME or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced LME expression or activity. Examples of such disorders include, but are not limited to, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast Includes cervical, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, etc. Neurological disorders include epilepsy, ischemic cerebrovascular disorder, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal tract disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neurons Disorder, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural pyometra, epidural Abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, spinal cord And radiculitis, viral central nervous system diseases, prion diseases including Kuru, Creutzfeldt-Jakob disease and Gastmann-Straussler-Scheinker syndrome, fatal familial insomnia, nervous nutritional and metabolic diseases Neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastomatosis, trigeminal neurovascular syndrome, mental retardation, other central nervous system development disorders including Down syndrome, cerebral palsy, neuroskeletal abnormalities , Autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord diseases, muscular dystrophy and other neuromuscular diseases, peripheral nerve diseases, dermatomyositis and polymyositis, and hereditary, metabolic, endocrine and toxic myopathy, and myasthenia gravis, Periodic quadriplegia, mental disorders including mood disorders, anxiety disorders and schizophrenia, Nodular affective disorder (SAD), restlessness, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, schizophrenic psychiatric disorder, postherpetic neuralgia, Tourette's disease, progressive nucleus Includes paraplegia, corticobasal degeneration, familial frontotemporal dementia, and also includes autoimmune / inflammatory diseases, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Addison's disease, adulthood Respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyendocrine disorders (APECED), bronchi Inflammation, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocotoxin temporary phosphorus Cytopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis Myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic erythematous Lupus, systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, uveitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasitism Insect and protozoal infections, helminth infections and trauma, and also includes gastrointestinal disorders, including dysphagia, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, indigestion, and digestion. Disability, gastritis Gastric cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, sinus or pyloric edema, abdominal angina, heartburn, gastroenteritis, ileus, intestinal infection, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis, pancreas Cancer, biliary tract disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss syndrome, Colon cancer, colon obstruction, irritable bowel syndrome, small intestine syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, hepatitis, hemochromatosis, Wilson disease, α1Antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal venous obstruction and thrombus, centrilobular necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein obstruction, preeclampsia, eclampsia, pregnancy Includes acute hepatic fat, gestational intrahepatic cholestasis, liver cancer including nodular regeneration and adenomas, carcinomas, and also includes cardiovascular disorders, including arteriovenous fistulas, atherosclerosis, and hypertension Vasculitis, Raynaud's disease, venous malformation, arterial dissection, varicose veins, thrombophlebitis and venous thrombosis, vascular tumors, thrombolytic complications, balloon angioplasty, vascular replacement, aortic coronary artery bypass Vascular diseases such as coronary artery bypass graft surgery, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina pectoris, myocardial infarction, hypertension Heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart disease, infectious Endocarditis, nonbacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus lupus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart disease, Heart disease such as complications of heart transplantation, congenital lung abnormalities, pulmonary dysfunction, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism, pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, vascular sclerosis, obstructive pulmonary disease, restricted type Pulmonary disease, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, bacterial pneumonia, viral pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis, sarcoid Disease, idiopathic Pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia, hypersensitivity pneumonia, pulmonary eosinophilic obstructive bronchiolitis-pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary bleeding syndrome, special pulmonary bleeding syndrome Pulmonary hemorrhagic disease, pulmonary paraangiogenesis complicated lung disease, alveolar proteinosis, lung tumor, inflammatory and non-inflammatory pleural effusion, pneumothorax, pleural tumor, drug-induced lung disease, radiation-induced lung disease, and lung Includes transplant complications.
[0172]
In another embodiment, a vector capable of expressing LME or a fragment or derivative thereof for the treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of LME, including, but not limited to, the diseases listed above. It can also be administered to patients.
[0173]
In yet another embodiment, a composition comprising substantially purified LME for the treatment or prevention of a disease associated with reduced LME expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. Can be administered to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0174]
In yet another embodiment, an agonist that modulates LME activity is administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced LME expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible.
[0175]
In a further embodiment, an LME antagonist can be administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with increased LME expression or activity. Examples of such disorders include, but are not limited to, the cancers described above, nervous system disorders, autoimmune / inflammatory disorders, gastrointestinal disorders, and cardiovascular disorders. In one embodiment, an antibody that specifically binds LME can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver the agent to cells or tissues that express LME.
[0176]
In another embodiment, the complement of a polynucleotide encoding LME is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with increased LME expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. The vector can be administered to the patient.
[0177]
In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, or vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy can be selected by one skilled in the art according to conventional pharmaceutical principles. Combination with a therapeutic agent can have a synergistic effect in the treatment or prevention of the various diseases described above. By using this method, a medicinal effect can be obtained with a small amount of each drug, thereby reducing the possibility of side effects.
[0178]
LME antagonists can be prepared using methods common in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified LME, or a therapeutic drug library can be screened to identify those that specifically bind to LME. LME antibodies can also be produced using methods common in the art. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. However, it is not limited to these. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are generally suitable for therapeutic use.
[0179]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, are immunized by injection of LME or any fragment, or oligopeptide thereof with immunogenic properties. Can be done. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol And the like. Among adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferred.
[0180]
Oligopeptides, peptides, or fragments used to elicit antibodies against LME are composed of at least about 5 amino acids, and generally are preferably composed of about 10 or more amino acids. Desirably, these oligopeptides, peptides or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and include the entire amino acid sequence of the small native molecule. Short stretches of LME amino acids can be fused to sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies against the chimeric molecule.
[0181]
Monoclonal antibodies to LME can be made by any technique which produces antibody molecules by continuous cell lines in culture. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497, Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote, RJ, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, Cole, SP, et al. (1984) Mol. Cell Biol.62: 109-120 etc.).
[0182]
In addition, techniques such as splicing a mouse antibody gene to a human antibody gene developed for the production of a “chimeric antibody” are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg, Morrison (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81-4855-14855; Neuberger, MS, et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. (1985). Nature 314: 452,454). Alternatively, LME-specific single-chain antibodies are generated using the techniques described for the production of single-chain antibodies using methods well known in the art. Antibodies with related specificities but differing idiotypic compositions can also be produced by chain shuffling from random combinations of immunoglobulin libraries (Bulton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 88: 10134-10137 etc.).
[0183]
Antibody production in the lymphocyte populationin VivoIt can be done by inducing production or by screening immunoglobulin libraries or a panel of very specific binding reagents as disclosed in the literature (Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 3833-3837, Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0184]
Antibodies containing specific binding sites for LME can also be obtained. For example, but not by way of limitation, such fragments may include F (ab ') 2 produced by pepsin digestion of the antibody molecule.2 Fragment and F (ab ')2 Some Fab fragments are made by reducing the disulfide bridges of the fragment. Alternatively, it is possible to identify a monoclonal Fab fragment with desired specificity quickly and easily by preparing an Fab expression library (Huse, WD, et al. (1989) Science 256: 1275-1281). reference).
[0185]
Screening can be performed using various immunoassays to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding, using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity, or for immunoradioactivity, are well known in the art. Usually such immunoassays involve the measurement of the complex between the LME and its specific antibody. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering LME epitopes is commonly used, but a competitive binding assay can also be used (Pound, supra).
[0186]
Various methods, such as Scatchard analysis, are used in conjunction with radioimmunoassay techniques to assess the affinity of the antibody for LME. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is a value obtained by dividing the molar concentration of the LME antibody complex by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The Ka of a polyclonal antibody reagent with heterogeneous affinity for multiple LME epitopes represents the average affinity or avidity of the antibody for LME. The Ka of a monoclonal antibody drug monospecific for a particular LME epitope represents a true measure of affinity. Ka value is 109-1012The liter / mol high affinity antibody drug is preferably used in immunoassays where the LME antibody conjugate must withstand harsh treatments. Ka value is 106-107The liter / mol low-affinity antibody drug is preferably used for immunopurification and similar treatments where the LME must eventually dissociate in an activated state from the antibody. (Catty, D. (1988)Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; E. FIG. And Cryer, A .; (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0187]
The titer and avidity of the polyclonal antibody reagents can be further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain subsequent applications. For example, polyclonal antibody medicaments containing at least 1-2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, are generally used in processes where LME antibody complexes must be precipitated. Antibody specificity, antibody titer, avidity, and guidelines for antibody quality and use in various applications are generally available (see Catty, supra, and Colligan et al., Supra).
[0188]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding LME, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In one embodiment, gene expression can be altered by designing sequences and antisense molecules (DNA and RNA, modified nucleotides) that are complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding LME. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the LME encoding sequence or from various locations along the coding region (eg, Agrawal, S., Editing (1996)Antisense Therapeutics, Humana Press Inc. , Totawa NJ).
[0189]
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing the antisense sequences into suitable target cells can be used. The antisense sequence can be delivered intracellularly in the form of an expression plasmid that, upon transcription, expresses a sequence complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein (Slater, JE et al. 1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475 and Scanlon, KJ. Et al. (1995) 9 (13): 1288-1296. Antisense sequences can also be introduced into cells using, for example, viral vectors such as retroviruses and adeno-associated virus vectors (Miller, AD (1990) Blood 76: 271, Ausubel, Uckert, supra). , W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323-347). Other gene delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes and other systems known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217). -225; Bodo, RJ, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315, Morris, MC, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736. Etc.).
[0190]
In another embodiment of the present invention, LME-encoding polynucleotides can be used for somatic or germ cell gene therapy. Gene therapy results in (i) severe combined immunodeficiency (SCID) characterized by a gene deficiency (eg, X chromosomal strand inheritance (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)). ) -X1), severe combined immunodeficiency associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480, Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene @ Therapy 6: 643-666, Crystal, RG, etc. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassemia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to deficiency of factor VIII or factor IX (Crystal, 35 @ RG. ) Science 270: 404-410, Verma, IM and Somia N. (1997) Nature 389: 239-242), and (ii) expressing a conditional lethal gene product (e.g., (In the case of cancer caused by cell proliferation), (iii) intracellular parasites such as the human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396, Poescbla, E. et al. (1996) Proc.Natl.Ac ... D Sci USA 93: 11395-11399), B-type or C hepatitis virus (HBV, HCV),Candida albicansas well asParacoccidioides brasiliensisFungal parasites, etc., andPlasmodium falciparumas well asCruise TrypanosomaAnd other proteins having a protective function against protozoan parasites. If a deficiency in the gene required for LME expression or regulation causes the disease, LME can be expressed from a suitable population of the introduced cells to alleviate the symptoms caused by the deficiency.
[0191]
In a further embodiment of the invention, diseases and disorders due to LME deficiency are treated by creating mammalian expression vectors encoding LME and introducing these vectors into LME-deficient cells by mechanical means. .in VivoOrex in vitroThe mechanical transfection techniques used for cells of (i) include (i) direct DNA microinjection into individual cells, (ii) gene guns, (iii) transfection via liposomes, and (iv) receptors. Mediated gene transfer and (v) the use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217, Ivics, Z. (1997) Cell. 91: 501-510; Boulay, JL and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0192]
Expression vectors that can affect LME expression include, but are not limited to, PCDNA3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX vectors (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA), PTT-OFF, PTT-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA) are included. To express LME, (i) a constitutively active promoter (eg, cytomegalovirus (CMV), Rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene); (Ii) Inducible promoters (eg, a tetracycline-regulated promoter (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Inc.) contained in a commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). U.S.A. 89: 5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456)), an ecdysone inducible promoter (included in commercially available plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), an FK506 / rapamycin inducible promoter, or a RU486 / mifepristone inducible promoter (Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) the natural or tissue-specific promoter of the endogenous gene encoding LME from a normal individual. .
[0193]
The use of commercially available liposome transformation kits (eg, PerFect Lipid Transfection Kit from Invitrogen) allows those skilled in the art to introduce polynucleotides into target cells in culture without much experience. Alternative methods include the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or the electroporation method (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845. ). The introduction of DNA into primary cultures requires modification of standardized mammalian transfection protocols.
[0194]
In another embodiment of the invention, the disease or disorder caused by a genetic defect associated with LME expression comprises: (i) a polymorphism encoding LME under the control of a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter. Nucleotides and (ii) a suitable RNA packaging signal and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences necessary for efficient vector propagation. Retrovirus vectors can be produced and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are commercially available from Stratagene and are described in published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6773-6737). Based on. The above data is incorporated herein by reference.
The vector is propagated in a suitable vector-producing cell line (VPCL), which expresses an envelope gene or a promiscuous envelope protein such as VSVg that is tropic for a receptor on the target cell (Armentano, D. et al. 1987) J. Virol. 61: 1647-1650; Bender, MA et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646, Adam, MA. And AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806, Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880). U.S. Patent No. 5,910,434 to RIGG ("Method for observing retrovirus packaging cell lines producing high transducing effect"; a method for disseminating the virus in a retrospective system) Citation is incorporated herein by reference. Propagation of retroviral vectors, cell populations (eg, CD4+ Transduction of (T cells) and the return of the transduced cells to the patient are methods known to those skilled in the art of gene therapy and are described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997). J. Virol. 71: 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U. et al. 1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283- 2290).
[0195]
Alternatively, an LME-encoding polynucleotide is delivered to cells that have one or more genetic abnormalities associated with LME expression using an adenovirus-based gene therapy delivery system. The production and packaging of adenovirus-based vectors are known to those skilled in the art. Replication-defective adenovirus vectors have been shown to be variable for introducing genes encoding immunomodulatory proteins into intact pancreatic islets of the pancreas (Csete, ME et al. (1995) Transplantation 27). : 263-268). Adenoviral vectors that may be used are described in US Patent No. 5,707,618 to Armentano ("Adenovirus vectors for gene therapy"), which is hereby incorporated by reference. And For adenovirus vectors, see Antinozzi, P. et al. A. Et al. (1999) Annu. Rev .. Nutr. 19: 511-544 and Verma, I .; M. And N.I. See also Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242. Both documents are incorporated herein by reference.
[0196]
Alternatively, a herpes-based gene therapy delivery system is used to deliver a LME-encoding polynucleotide to target cells that have one or more genetic abnormalities associated with LME expression. Herpes simplex virus (HSV) -based vectors are particularly important in introducing LME into HSV-affected central nervous cells. The production and packaging of herpes-based vectors is known to those skilled in the art. Vectors of the replication-competent herpes simplex virus (HSV) type I system have been used to deliver reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385-385). 395). The construction of the HSV-1 viral vector is also disclosed in U.S. Patent No. 5,804,413 to DeLuca ("Herpes simplex viruses against genes transfer"), which is hereby incorporated by reference. Partial. US Patent No. 5,804,413 describes a recombinant HSV d92 comprising a genome having at least one exogenous gene introduced into a cell under the control of a promoter suitable for purposes including human gene therapy. There is a description. The patent also discloses the generation and use of recombinant HSV strains that are eliminated for ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see Goins, W. et al. F. (1999) J. Am. Virol. 73: 519-532 and Xu, H .; (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are incorporated herein by reference. Manipulation of the cloned herpesvirus sequence, production of recombinant virus after transfection of multiple plasmids containing different parts of the genome of the herpesvirus giant, growth and propagation of the herpesvirus, and infection of cells with the herpesvirus This is a technique known to those skilled in the art.
[0197]
Alternatively, the LME-encoding polynucleotide is delivered to target cells using an alphavirus (positive single-stranded RNA virus) vector. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV), have been extensively performed, and gene transfer vectors have been found to be based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During the replication of alpha viral RNA, subgenomic RNA is created, usually encoding the viral capsid protein. This subgenomic RNA is replicated to a higher level than full-length genomic RNA, resulting in overproduction of capsid proteins relative to viral proteins having enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding LME into the region encoding the capsid of the alphavirus genome, a large number of RNAs encoding LME are produced in the vector-transfected cells, and LME is synthesized at a high level. The ability to establish persistent infection of hamster normal kidney cells (BHK-21) harboring a mutant of Sindbis virus (SIN), while infection of the alpha virus is usually associated with cell lysis within a few days, , Suggest that the lytic replication of the α virus can be suitably modified to be applicable to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). Since the α virus can be introduced into various hosts, LME can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require sorting of cells prior to transduction. Methods for treating infectious cDNA clones of the α virus, transfecting the cDNA and RNA of the α virus, and infecting the α virus are known to those skilled in the art.
[0198]
It is also possible to inhibit gene expression using an oligonucleotide derived from the transcription start site. The transcription start site is, for example, between about -10 and about +10 counted from the start site. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing methods. Triple helix base pairing is useful because triple helix base pairing inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent therapeutic advances using triple helical DNA are described in the literature (Gee, JE et al. (1994) in: Huber, BE and BI Carr,Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing Co., Ltd. , Mt. Kisco, NY, pp. 163-177). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to prevent translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome.
[0199]
Ribozymes are enzymatic RNA molecules, and ribozymes can also be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA prior to nucleotide strand breaks. For example, a recombinant hammerhead ribozyme molecule that specifically and effectively catalyzes the cleavage of the nucleotide chain of the sequence encoding LME is included.
[0200]
Specific ribozyme cleavage sites within any RNA target are first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites, including GUA, GUU, GUC sequences. Once identified, short RNA sequences of 15-20 ribonucleotides corresponding to regions of the target gene containing cleavage sites for secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional can be evaluated become. Evaluation of the suitability of a candidate target can also be performed by testing the feasibility of hybridization with a complementary oligonucleotide using a ribonuclease protection assay.
[0201]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made using any method well known in the art for nucleic acid molecule synthesis. Optional methods include chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, the DNA sequence encoding LMEin in vitroas well asin VivoRNA molecules can be produced by transcription. Such a DNA sequence can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA products that constitutively or inducibly synthesize complementary RNA can be introduced into a cell line, cell or tissue.
[0202]
RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible, but not limiting, modifications include the addition of flanking sequences at the 5 ′ end, 3 ′ end, or both, of the molecule, and phosphorothioate or 2 ′ rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. 'Using O-methyl. This concept is unique to the production of PNA and can be extended to all these molecules. These include adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases, with acetyl-, methyl-, thio-, and similar modifications, as well as non-conventional bases such as inosine, queosine. (Queousine), wybutosine and the like.
[0203]
A further embodiment of the invention includes a method of screening for a compound that is effective in altering the expression of a polynucleotide encoding LME. Compounds useful for, but not limited to, mutagenesis of specific polynucleotides include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcriptional regulators, and interact with specific polynucleotide sequences. There are non-polymeric entities that can act. Effective compounds can mutate polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Therefore, in the treatment of diseases associated with increased LME expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of a polynucleotide encoding LME are therapeutically useful, and are associated with reduced LME expression or activity. In treating disease, compounds that specifically promote the expression of a polynucleotide encoding LME may be therapeutically useful.
[0204]
At least one to a plurality of test compounds may be screened for efficacy in mutagenizing a specific polynucleotide. Test compounds are obtained by any method commonly known in the art. Such methods include mutating the expression of the polynucleotide, selecting from existing, commercially available or proprietary, natural or non-natural compound libraries, and chemically and / or structurally modifying the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective when rationally designing compounds based on properties and when selecting from libraries of combinatorially or randomly generated compounds. A sample comprising a polynucleotide encoding LME is obtained by exposing to at least one test compound. The sample can be, for example, an intact cell, a permeabilized cell, a cell-free reconstituted system or a reconstituted biochemical system. Changes in the expression of the polynucleotide encoding LME are assayed by any method commonly known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding LME. The amount of hybridization can be quantified, thereby forming the basis for a comparison of the expression of polynucleotides exposed and unexposed to one or more test compounds. Detection of a change in expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in mutating expression of the polynucleotide. For a compound effective for mutation expression of a specific polynucleotide, for example,Schizosaccharomyces pombeGene expression system (Atkins, D. et al. (1999) U.S. Pat. No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell lines such as HeLa cells (Clarke) , ML, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). Certain embodiments of the invention involve screening a combinatorial library of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against a specific polynucleotide sequence ( Bruice, TW, et al. (1997) U.S. Patent No. 5,686,242, Bruice, TW, et al. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691).
[0205]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in Vivo,in in vitroas well asex VivoEqually suitable for the use ofex VivoFor treatment, the vector can be introduced into stem cells taken from a patient, cloned and propagated and returned to the same patient by autotransplantation. Transfection, ribosome injection or delivery by polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 462-). 466.).
[0206]
Any of the above treatment methods can be applied to all subjects in need of treatment, including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and the like.
[0207]
An additional embodiment of the present invention involves the administration of an ingredient having an active ingredient usually formulated in a pharmaceutically acceptable excipient. Excipients include, for example, sugars, starches, celluloses, gums and proteins. Various prescriptions are usually known,Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton PA). Such compositions comprise LME, antibodies, mimetics, agonists, antagonists, or inhibitors of LME of LME.
[0208]
The components used in the present invention can be administered by any number of routes, including but not limited to oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, Intraventricular, lung, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal.
[0209]
Components for pulmonary administration can be prepared in liquid or dry powder form. Such components typically aerosolize shortly before inhalation by the patient. For small molecules (eg, traditional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast-acting formulations is known in the art. In the case of macromolecules (eg, larger peptides and proteins), the recent improvement in the art of pulmonary delivery through the alveolar region of the lung results in the transport of drugs such as insulin substantially into the blood circulation. (See Patton, JS, et al., US Pat. No. 5,997,848, etc.). Pulmonary delivery is advantageous in that it is administered without needle injection, eliminating the need for potentially toxic penetration enhancers.
[0210]
Ingredients suitable for use in the present invention include those that contain as much active ingredient as necessary to achieve the intended purpose. Determination of the effective dosage is within the ability of those skilled in the art.
[0211]
Preferably, the composition is prepared in a special form to deliver the macromolecule, including LME or a fragment thereof, directly into the cell. For example, a liposome formulation comprising a cell-impermeable polymer may facilitate cell fusion and intracellular delivery of the polymer. Alternatively, LME or a fragment thereof can be linked to the cationic N-terminus of the HIV Tat-1 protein. The fusion protein thus produced is known to transduce cells of all tissues including the mouse model system brain (Schwarze, SR, et al. (1999) Science 285: 1569-1572). .
[0212]
For any compound, an effective dosage of treatment can be initially estimated in cell culture assays, such as those for neoplastic cells, or in animal models such as mice, rabbits, dogs or pigs. . Animal models can also be used to determine suitable concentration ranges and routes of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration in humans.
[0213]
A medically effective dosage relates to the amount of active ingredient that ameliorates the symptoms or condition, eg, LME or a fragment thereof, an antibody to LME, an agonist or antagonist of LME, an inhibitor, and the like. Medicinal efficacy and toxicity can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal studies, for example, ED50(Pharmaceutically effective amount of 50% of the population) or LD50(A lethal dose of 50% of the population). The dose ratio of toxic to therapeutic effects is the therapeutic index, and the LD50/ ED50It can be expressed as a ratio. Components that exhibit a high therapeutic index are desirable. The data obtained from the cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for use in humans. Dosages containing such compositions will contain little or no toxicity, ED50It is preferable that the concentration be in the blood concentration range containing Depending on the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration, the dosage will vary within this range.
[0214]
The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors relating to the subject include the severity of the disease, the patient's general health, the patient's age, weight and gender, the time and frequency of administration, drug combination, response sensitivity and response to treatment. Components with a longer duration of action may be administered once every 3 to 4 days, once a week, or once every two weeks depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0215]
Normal dosage amounts range from about 0.1 to 100,000 μg, depending on the route of administration, up to a total of about 1 g. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to physicians in the field. One skilled in the art will utilize formulations for nucleotides that are different from those for proteins or inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, location, etc.
[0216]
(Diagnosis)
In another embodiment, assays for the diagnosis of diseases characterized by expression of LME, or for monitoring patients being treated with LME or LME agonists or antagonists or inhibitors, wherein the antibody that specifically binds to LME is used. Used for Antibodies useful for diagnostic purposes are prepared in the same manner as described above for treatment. LME diagnostic assays include methods of detecting LME from human body fluids or from cells or tissues using antibodies and labels. The antibodies may be used with or without modification, and may be labeled by covalent or non-covalent attachment of a reporter molecule. A variety of reporter molecules are known in the art and can be used. Some reporter molecules have been described above.
[0217]
Various protocols for measuring LME, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide a basis for diagnosing unusual or abnormal levels of LME expression. Normal or standard LME expression values are determined by combining an antibody against LME with body fluids or cells collected from a subject, such as a normal mammal, eg, a human, under conditions suitable for complex formation. I do. The amount of the standard complex formed can be determined by various methods, for example, by photometry. The amount of LME expression in each sample from the subject, control, and disease biopsy tissue is compared to a reference value. The deviation between the standard value and the subject is a parameter for diagnosing the disease.
[0218]
According to another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding LME may be used for diagnosis. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. The polynucleotide is used to detect and quantify gene expression in biopsied tissues that express LME that can correlate with disease. This diagnostic assay is used to check for the presence of LME, as well as overexpression, and to monitor modulation of LME levels during treatment.
[0219]
In one embodiment, a nucleic acid sequence encoding an LME can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising the gene sequence encoding the LME or closely related molecule. The specificity of a probe, whether it is made from a highly specific region, for example, a 5 'regulatory region, or a region of somewhat conserved motifs, and the stringency of hybridization or amplification, Will identify only the natural sequence that encodes the LME, or only the natural sequence that encodes the allele or related sequence.
[0220]
Probes can also be used to detect related sequences and have at least 50% sequence identity with any sequence encoding LME. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 6-10 or a genomic sequence containing the LME gene promoter, enhancer, and intron.
[0221]
As a method for producing a hybridization probe specific to DNA encoding LME, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding LME and an LME derivative into a vector for producing an mRNA probe. Vectors for making mRNA probes are known to those of skill in the art and are commercially available, by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in in vitroCan be used to synthesize RNA probes. Hybridization probes can be labeled with a population of different reporters. Examples of reporter populations include:32P or35Radionuclides such as S; or enzyme labels such as alkaline phosphatase bound to the probe via an avidin / biotin binding system.
[0222]
LME-encoding polynucleotide sequences can be used to diagnose diseases associated with LME expression. Examples of such disorders include, but are not limited to, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast Includes cervical, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, etc. Neurological disorders include epilepsy, ischemic cerebrovascular disorder, stroke, cerebral neoplasm, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal tract disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neurons Disorder, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural pyometra, epidural Abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, spinal cord And radiculitis, viral central nervous system diseases, prion diseases including Kuru, Creutzfeldt-Jakob disease and Gastmann-Straussler-Scheinker syndrome, fatal familial insomnia, nervous nutritional and metabolic diseases Neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastomatosis, trigeminal neurovascular syndrome, mental retardation, other central nervous system development disorders including Down syndrome, cerebral palsy, neuroskeletal abnormalities , Autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord diseases, muscular dystrophy and other neuromuscular diseases, peripheral nerve diseases, dermatomyositis and polymyositis, and hereditary, metabolic, endocrine and toxic myopathy, and myasthenia gravis, Periodic quadriplegia, mental disorders including mood disorders, anxiety disorders and schizophrenia, Nodular affective disorder (SAD), restlessness, amnesia, catatonia, diabetic neuropathy, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, schizophrenic psychiatric disorder, postherpetic neuralgia, Tourette's disease, progressive nucleus Includes paraplegia, corticobasal degeneration, familial frontotemporal dementia, and also includes autoimmune / inflammatory diseases, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Addison's disease, adulthood Respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyendocrine disorders (APECED), bronchi Inflammation, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocotoxin temporary phosphorus Cytopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis Myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic erythematous Lupus, systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, uveitis, Werner syndrome, cancer complications, hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infection, bacterial infection, fungal infection, parasitism Insect and protozoal infections, helminth infections and trauma, and also includes gastrointestinal disorders, including dysphagia, peptic esophagitis, esophageal spasm, esophageal stricture, esophageal cancer, indigestion, and digestion. Disability, gastritis Gastric cancer, anorexia, nausea, vomiting, gastroparesis, sinus or pyloric edema, abdominal angina, heartburn, gastroenteritis, ileus, intestinal infection, peptic ulcer, cholelithiasis, cholecystitis, cholestasis, pancreatitis, pancreas Cancer, biliary tract disease, hepatitis, hyperbilirubinemia, cirrhosis, passive congestion of the liver, hepatome, infectious colitis, ulcerative colitis, ulcerative proctitis, Crohn's disease, Whipple's disease, Mallory-Weiss syndrome, Colon cancer, colon obstruction, irritable bowel syndrome, small intestine syndrome, diarrhea, constipation, gastrointestinal bleeding, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) enteropathy, jaundice, hepatic encephalopathy, hepatorenal syndrome, hepatitis, hemochromatosis, Wilson disease, α1Antitrypsin deficiency, Reye's syndrome, primary sclerosing cholangitis, hepatic infarction, portal venous obstruction and thrombus, centrilobular necrosis, hepatic purpura, hepatic vein thrombosis, hepatic vein obstruction, preeclampsia, eclampsia, pregnancy Includes acute hepatic fat, gestational intrahepatic cholestasis, liver cancer including nodular regeneration and adenomas, carcinomas, and also includes cardiovascular disorders, including arteriovenous fistulas, atherosclerosis, and hypertension Vasculitis, Raynaud's disease, venous malformation, arterial dissection, varicose veins, thrombophlebitis and venous thrombosis, vascular tumors, thrombolytic complications, balloon angioplasty, vascular replacement, aortic coronary artery bypass Vascular diseases such as coronary artery bypass graft surgery, congestive heart failure, ischemic heart disease, angina pectoris, myocardial infarction, hypertension Heart disease, degenerative valvular heart disease, calcified aortic stenosis, congenital bicuspid aortic valve, mitral annular calcification, mitral prolapse, rheumatic fever, rheumatic heart disease, infectious Endocarditis, nonbacterial thrombotic endocarditis, systemic lupus lupus endocarditis, carcinoid heart disease, cardiomyopathy, myocarditis, pericarditis, neoplastic heart disease, congenital heart disease, Heart disease such as complications of heart transplantation, congenital lung abnormalities, pulmonary dysfunction, pulmonary congestion and pulmonary edema, pulmonary embolism, pulmonary hemorrhage, pulmonary infarction, pulmonary hypertension, vascular sclerosis, obstructive pulmonary disease, restricted type Pulmonary disease, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, chronic bronchitis, bronchial asthma, bronchiectasis, bacterial pneumonia, viral pneumonia and mycoplasma pneumonia, lung abscess, pulmonary tuberculosis, diffuse interstitial disease, pneumoconiosis, sarcoid Disease, idiopathic Pulmonary fibrosis, exfoliative interstitial pneumonia, hypersensitivity pneumonia, pulmonary eosinophilic obstructive bronchiolitis-pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, diffuse pulmonary bleeding syndrome, special pulmonary bleeding syndrome Pulmonary hemorrhagic disease, pulmonary paraangiogenesis complicated lung disease, alveolar proteinosis, lung tumor, inflammatory and non-inflammatory pleural effusion, pneumothorax, pleural tumor, drug-induced lung disease, radiation-induced lung disease, and lung Includes transplant complications. The LME-encoding polynucleotide sequence can be obtained by Southern, Northern, dot blot, or other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin, ELISA, and assay of mutant LME. Can be used for microarrays utilizing body fluids or tissues collected from patients to detect Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
[0223]
In certain embodiments, a nucleotide sequence encoding an LME may be useful in an assay to detect a related disease, particularly those described above. The nucleotide sequence encoding LME could be labeled by standard methods and added to a sample of body fluid or tissue taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient's sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding LME in the sample will reveal the presence of the associated disease. Such assays can also be used to estimate the effect of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or to monitor the treatment of individual patients.
[0224]
A normal or standard profile of expression is established to provide a basis for diagnosis of a disease associated with LME expression. This can be achieved by combining the LME-encoding sequence or a fragment thereof with a body fluid or cell extracted from a normal subject, either animal or human, under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from experiments performed with known amounts of the substantially purified polynucleotide to values obtained from normal subjects. The standard values thus obtained can be compared to values obtained from samples obtained from patients showing signs of the disease. Deviation from standard values is used to determine the presence of disease.
[0225]
Once the presence of the disease has been determined and the treatment protocol has begun, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to determine whether the patient's expression levels have begun to approach those observed in normal subjects. The results from serial assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
[0226]
With respect to cancer, the presence of abnormal amounts of transcripts (under- or over-expression) in living tissue from an individual indicates the predisposition of the disease or a method of detecting the disease before actual clinical symptoms appear. Or offer. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early on, thereby preventing the development or further progression of cancer.
[0227]
Additional diagnostic uses for oligonucleotides designed from LME-encoding sequences may include the use of PCR. These oligomers can be chemically synthesized, produced enzymatically, orin in vitroCan be produced in Oligomers, preferably including fragments of a polynucleotide encoding LME, or fragments of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding LME, are used under optimal conditions to identify a particular gene or condition. You. Oligomers can also be used under relatively mild stringent conditions for detection, quantification, or both, of closely related DNA or RNA sequences.
[0228]
In certain embodiments, single nucleotide polymorphisms (SNPs) may be detected using oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding LME. SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause a congenital or acquired genetic disease in humans. Non-limiting methods for detecting SNPs include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, DNA is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers derived from the polynucleotide sequence encoding LME. DNA can be derived, for example, from diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. SNPs in DNA cause differences in the secondary and tertiary structure of single-stranded PCR products. Differences can be detected using gel electrophoresis in a non-denaturing gel. In fSCCP, oligonucleotide primers are fluorescently labeled. This allows the detection of amplimers on high throughput equipment such as DNA sequencing machines. Furthermore, a sequence database analysis method called in silico SNP (isSNP) identifies polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as arranged in a common consensus sequence. obtain. These computer-based methods filter out sequence variations due to sequencing errors using laboratory preparation and statistical models of DNA and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another embodiment, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry, for example, using a high-throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0229]
Methods that can be used to quantify LME expression include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, co-amplification of regulatory nucleic acids, and standard curves with results added (eg, (See Melby, PC, et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159: 235-44; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). The rate of quantification of multiple samples can be accelerated by performing high-throughput assays where the oligomer of interest is present in various diluents and quantitation is rapid by spectrophotometry or colorimetric reactions. .
[0230]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as elements in a microarray. Microarrays can be used in transcription imaging techniques to simultaneously monitor the relevant expression levels of multiple genes. This is described below. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. This information can be used to determine gene function, understand the genetic basis of disease, diagnose disease, monitor disease progression / regression as a function of gene expression, and develop drug activity in disease treatment And can be monitored. In particular, this information can be used to develop a patient's pharmacogenomic profile to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, a therapeutic agent that is highly effective and has few side effects for the patient can be selected.
[0231]
In another embodiment, LME, fragments of LME, antibodies specific for LME can be used as elements on the microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0232]
Certain embodiments relate to the use of a polynucleotide of the invention to produce a transcribed image of a tissue or cell type. The transcribed image represents the global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Global gene expression patterns can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at a given time under given conditions (Seilliamer et al., US Pat. No. 5,840,484 "Comparative"). Gene Transcript Analysis, which is hereby incorporated by reference.) Thus, transcribed images can be generated by hybridizing the polynucleotide of the present invention or its complement to the entire transcription or reverse transcription of a particular tissue or cell type. In certain embodiments, hybridization occurs in a high-throughput format such that the polynucleotide of the invention or its complement comprises a plurality of subsets of the elements on the microarray. The resulting transcribed image can provide a profile of gene activity.
[0233]
Transcript images can be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies, or biological samples thereof. The transcribed image is therefore in the case of a tissue or biopsy samplein VivoOr in the case of cell linesin in vitroReflects gene expression at
[0234]
Transcribed images that generate the expression profile of the polynucleotides of the present invention can also be used for toxicity testing of industrial or natural environmental compounds,in in vitroIt can be used in connection with preclinical evaluation of model systems and drugs. All compounds elicit a characteristic pattern of gene expression, often referred to as molecular fingerprints or toxicity signatures, which implies a mechanism of action and toxicity (Nuwayysir, EF et al. (1999) Mol. 24: 153-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, which are hereby incorporated by reference. Department). If the test compounds have the same signature as that of a compound with known toxicity, they may share toxic properties. Fingerprints or signatures are most useful and accurate if they contain expression information from a large number of genes and gene families. Ideally, a genome-wide measurement of expression provides the highest quality signature. Even if genes whose expression is not altered by any of the tested compounds are equally important, the expression levels of such genes are used to normalize the remaining expression data. The normalization procedure is useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene function to elements of the toxic signature helps to stop the toxic mechanism, but knowledge of the gene function is not required to statistically match the signature to predict toxicity (eg, February 29, 2000). See Press Release 00-02, published by the National Institute of Environmental Health Sciences at http://www.newhs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm. Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences using toxicological signatures during toxicological screening.
[0235]
In certain embodiments, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound. Nucleic acids expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for a polynucleotide of the invention, thereby quantifying the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the invention. The transcript level in the treated biological sample is compared to the level in an untreated biological sample. The difference in transcription level between the two samples indicates a toxic reaction caused by the test compound in the treated sample.
[0236]
Another example involves analyzing a tissue or cell type proteome using the polypeptide sequences of the invention. The term proteome refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein component of the proteome can be individually further analyzed. Proteome expression patterns or profiles can be analyzed by quantifying the number and relative abundance of proteins expressed at a given time under given conditions. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by separating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, separation is achieved by two-dimensional gel electrophoresis, such as separating proteins from a sample by one-dimensional isoelectric focusing and separating according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis ( Steiner and Anderson, supra). Proteins are visualized in the gel as dispersed, uniquely located points, usually by staining the gel with a substance such as Coomassie blue or silver or a fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. The optical densities of protein spots obtained from different samples, eg, biological samples, either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, are compared to identify changes in protein spot density associated with the treatment. The proteins in the spots are partially sequenced using standard methods using, for example, chemical or enzymatic cleavage followed by mass spectrometry. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its subsequence, preferably at least 5 consecutive amino acid residues, to a polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequences are obtained for definitive protein identification.
[0237]
Proteome profiles can also be generated by quantifying LME expression levels using antibodies specific for LME. In one embodiment, protein expression levels are quantified by using antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to a sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999) Anal. 270: 103-111, Mendose, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed by various methods known in the art, for example, the proteins in the sample can be reacted with a thiol or amino-reactive fluorescent compound to detect the amount of fluorescent binding at the elements of each array.
[0238]
Toxicity signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with those at the transcript level. For some proteins in certain tissues, the correlation between transcription and protein abundance may be poor (Anderson, NL and J. Seilhammer (1997) Electrophoresis 18: 533-537), and the transcript image The proteome toxicity signature can be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect but alter the profile of the protein. In addition, protein profiling is more reliable and informative in such cases, since the analysis of transcription in body fluids is difficult due to the rapid degradation of mRNA.
[0239]
In another example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The proteins expressed in the processed biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in the untreated biological sample. The difference in protein amount between the two samples indicates the response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing the amino acid residues of the individual proteins and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0240]
In another example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing the protein with the test compound. Proteins obtained from a biological sample are incubated with an antibody specific for a polypeptide of the invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. The difference in protein amount between the two samples indicates the response to the test compound in the treated sample.
[0241]
Microarrays are prepared, used, and analyzed using methods well known in the art (Brennan, TM et al. (1995) US Pat. No. 5,474,796; Schena, M.). Natl.Acad.Sci.USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No.WO95 / 35505. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155; Heller, MJ. Et al. (1997) U.S. Patent No. 5,605,662, etc.). . Various types of microarrays are known, and for details, seeDNA Microarrays: A Practical Approach, M .; Schena, Editing. (1999) Oxford University Press, London. This reference is specifically incorporated by reference.
[0242]
In another embodiment of the invention, nucleic acid sequences encoding LME can also be used to generate hybridization probes useful for mapping native genomic sequences. Either coding or non-coding sequences can be used; in certain instances, non-coding sequences are preferred throughout the coding sequence. For example, conservation of a coding sequence within a member of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. The nucleic acid sequence can be a specific chromosome, a specific region of a chromosome or an artificially formed chromosome, such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 product, or a single chromosomal cDNA. Mapped to a library (Harrington, JJ, et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355, Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127-134, Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7: 149-154 and the like). Once mapped, a nucleic acid sequence of the present invention can be used to create a genetic linkage map, for example, in which the inheritance of a disease state is correlated with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP) ( Lander, ES and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357).
[0243]
Fluorescence in situ hybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see Heinz-Ulrich, et al., Supra, (1995) in Meyers, 965-968, etc.). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or on the website of the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Since the correlation between the location of the LME-encoding gene on the physical chromosomal map and a particular disease, or a predisposition to a particular disease, can help determine the DNA region associated with such a disease, additional locations may be needed. Determining cloning is performed.
[0244]
The genetic map can be extended using physical mapping techniques such as binding analysis using established chromosomal markers and chromosome sample in situ hybridization. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, can reveal relevant markers even when the number or arm of a particular human chromosome is not known. This information is valuable to researchers investigating genetic diseases using positional cloning and other gene discovery techniques. Once the disease or syndrome is roughly located by genetic linkage to a particular gene region, such as the 11q22-23 region of ataxia telangiectasia, any mapping to that region will allow the relevant gene for further investigation. Alternatively, it can represent a regulatory gene (see Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580). The nucleotide sequence of the present invention may be used to discover differences in chromosomal location among healthy subjects, carriers, and infected individuals due to translocation, inversion, and the like.
[0245]
In another embodiment of the present invention, LME, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof can be used to screen libraries of compounds in any of a variety of drug screening techniques. The fragments used for drug screening will be free in solution, fixed to a solid support, retained on the cell surface, or located intracellularly. Complex formation due to binding of LME to the agent to be tested may be measured.
[0246]
Another drug screening method is used to screen compounds with suitable binding affinity for the protein of interest with high throughput (see, eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. WO84 / 03564). . In this method, a number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is reacted with LME, or a fragment thereof, and then washed. The bound LME is then detected by methods well known in the art. Purified LME can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, the peptide can be captured using a non-neutralizing antibody and the peptide immobilized on a solid support.
[0247]
In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding LME specifically compete with the test compound for binding to LME. In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with the LME.
[0248]
In another embodiment, the nucleotide sequence encoding LME is used in developing molecular biology techniques to characterize nucleotide sequences such as, but not limited to, the currently known triplet code and specific base pairing interactions. Can provide new technologies that depend on
[0249]
Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent. Accordingly, the examples described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention in any way.
[0250]
All patent applications, patents, and publications mentioned above and below, particularly U.S. Patent Application Nos. 60 / 203,511, 60 / 207,903, 60 / 210,150, and No. 60 / 213,392 is incorporated herein by reference.
[0251]
(Example)
1 cDNA Creating a library
Incyte cDNA is derived from the cDNA library described in the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA) and listed in column 5 of Table 4. Some tissues are homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, while others are homogenized and dissolved in a mixture of phenol or a suitable denaturant. The mixture of the denaturing agent is, for example, TRIZOL (Life Technologies) which is a single-phase solution of phenol and guanidinium isothiocyanate. The resulting lysate was centrifuged in cesium chloride or extracted with chloroform. RNA was precipitated from the lysate using isopropanol, sodium acetate and ethanol, or either, or another method.
[0252]
Extraction and precipitation of RNA with phenol were repeated as necessary to increase the purity of the RNA. In some cases, the RNA was treated with DNase. For most libraries, poly (A +) RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Valencia CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, RNA was isolated directly from tissue lysates using another RNA isolation kit, such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0253]
In some cases, RNA was provided to Stratagene, and a corresponding cDNA library was sometimes produced by Stratagene. Otherwise, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) according to the recommended method known in the art or a similar method, and a cDNA library was prepared (Ausubel, supra). , 1997, unit 5.1-6.6 etc.). Reverse transcription was started with oligo d (T) or random primer. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme. For most libraries, cDNA size (300-1000 bp) selection was performed using SEPHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech) or preparative agarose gel electrophoresis. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme or enzyme. Suitable plasmids are, for example, PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene), pSPORT1 plasmid (Life Technologies) or plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA). The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli cells containing XL1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR from Stratagene, or DH5α, DH10B or ELECTROMAX DH10B from Life Technologies.
[0254]
2 cDNA Clone isolation
UNIZAP vector system (Stratagene) was used.in VivoBy excision or by cell lysisExample 1The plasmid obtained as described above was recovered from the host cells. Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep Purification Kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAWELL 8PlaimPlasmid, QIAWELLPlasmid, QIAWELLPlasmid, QIAWELLPlasmid E. FIG. A. L. Plasmids were purified using at least one of the Prep 96 plasmid kits. After precipitation, the plasmid was resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without lyophilization.
[0255]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates using direct binding PCR in a high-throughput format (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). The lysis and thermal cycling process of the host cells was performed in a single reaction mixture. Samples were processed, stored in 384-well plates, and the concentration of amplified plasmid DNA was determined fluorometrically using a PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and a FLUOROSKAN II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Quantified.
[0256]
3 Sequencing and analysis
Example 2The Incyte cDNA recovered from the plasmid as described in, was sequenced as shown below. The cDNA sequencing reaction can be performed using standard methods or high-throughput equipment such as an ABI CATALYST 800 thermal cycler (Applied Biosystems) or a PTC-200 thermal cycler (MJ Research) with a HYDRA microdispenser (Robbins ScientificLMIBlOMIBOMICRiMbO2MCR) Treated in conjunction with the system. The cDNA sequencing reaction was performed using a reagent provided by Amersham Pharmacia Biotech or an ABI sequencing kit, for example, an ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied reagent prepared from Applied reagent kit). For electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics) or the ABI PRISM 373 or 377 sequencing system using standard ABI protocols and base pairing software ( Applied Biosystems) or other sequence analysis systems well known in the art. The reading frame within the cDNA sequence was determined using standard methods (reviewed in Ausubel, 1997, unit 7.7, supra). Select some of the cDNA sequences,Example 8The sequence was extended by the method described in (1).
[0257]
The polynucleotide sequence derived from the Incyte cDNA sequence was validated by removing the vector, linker and poly (A) sequences and masking ambiguous base pairs. At that time, algorithms and programs based on BLAST, dynamic programming and adjacent dinucleotide frequency analysis were used. Incyte cDNA sequences, or their translations, into public databases (eg, GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotes and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM) and hidden Markov models such as PFAM (HMM) -based protein family databases were queried (HMM is a probabilistic approach to analyzing consensus primary structure of gene families, Eddy, SR (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6 : 361-365 etc.). Queries were made using programs based on BLAST, FASTA, BLIMPS and HMMER. The Incyte cDNA sequence was constructed to yield a full-length polynucleotide sequence. Alternatively, GenBank cDNA, GenBank EST, stitched sequence, stretched sequence or Genscan predicted coding sequence (Examples 4 and 5) Was used to extend the population of Incyte cDNA to full length. A population of cDNAs was screened for open reading frames using a program based on Phred, Prap and Consed, and a program based on GenMark, BLAST and FASTA. The full length polynucleotide sequence was translated to derive the corresponding full length polypeptide sequence. Alternatively, the polypeptides of the invention may start at any methionine residue of the full length translated polypeptide. Subsequently, full-length polypeptide sequences were analyzed by queries against the GenBank protein database (genpept), databases such as SwissProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, and Hidden Markov Model (HMM) based protein family databases such as PFAM. . Full-length polynucleotide sequences were also analyzed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Polynucleotide and polypeptide sequence alignments are generated using default parameters specified by the CLUSTAL algorithm, such as that incorporated into the MEGALIGN Multi-Sequence Alignment Program (DNASTAR), which also calculates the percent identity between aligned sequences.
[0258]
Table 7 outlines the tools, programs and algorithms used for analysis and assembly of Incyte cDNA and full-length sequences, along with applicable descriptions, references and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of Table 5 and a brief description of them in column 2. Column 3 is a preferred citation, all of which are incorporated by reference in their entirety. If applicable, column 4 shows the score, probability value and other parameters used to evaluate the strength of the match between the two sequences (the higher the score, the higher the homology between the two sequences) ).
[0259]
The programs described above for the construction and analysis of full length polynucleotide and polypeptide sequences can also be used to identify polynucleotide sequence fragments of SEQ ID NOs: 6-10. Fragments of about 20 to about 4000 nucleotides that are useful for hybridization and amplification techniques are set forth in Table 4, column 4.
[0260]
4 Genome DNA Identification and editing of coding sequences from
Putative lipid-metabolizing enzymes were first identified by running the Genscan gene identification program in public genomic sequence databases (eg, gbpri and gbhtg). Genscan is a versatile gene identification program that analyzes genomic DNA sequences from various organisms (Burge, C. and S. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94, Burge, C., and S. K.) Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8: 346-354). The program ligates the predicted exons to form a constructed cDNA sequence that extends from methionine to the stop codon. The output of Genscan is a FASTA database of polynucleotide and polypeptide sequences. The maximum range of sequences analyzed at one time by Genscan was set at 30 kb. To determine which of these Genscan deduced cDNA sequences encode lipid metabolizing enzymes, the encoded polypeptides were queried and analyzed for lipid metabolizing enzymes in a PFAM model. Based on homology to the Incyte cDNA sequence annotated as a lipid metabolizing enzyme, potential lipid metabolizing enzymes were identified. The Genscan predicted sequences thus selected were then compared by BLAST analysis to the public databases gbpri and gbhtg. If necessary, edit the Genscan predicted sequence by comparing to the top BLAST hit from genpept to correct errors in the Genscan predicted sequence, such as extra or removed exons. BLAST analysis also provides evidence of transcription as it is used to find the public cDNA coverage of any Incyte cDNA or Genscan predicted sequence. If Incyte cDNA coverage was available, this information was used to correct or confirm the Genscan predicted sequence. The full-length polynucleotide sequence isExample 3Obtained by constructing the Genscan predicted coding sequence with the Incyte cDNA sequence and / or the public cDNA sequence using the construction process described in US Pat. Alternatively, the full-length polynucleotide sequence is completely derived from the edited or unedited Genscan predicted coding sequence.
[0261]
5) Assembly of genomic sequence data into cDNA sequence data
Stitch arrangement ( Stitched Sequence )
The partial cDNA sequence isExample 4Were extended using the exons predicted by the Genscan gene identification program described in (1).Example 3The partial cDNAs constructed as described in were mapped to genomic DNA and decomposed into clusters containing the related cDNA and Genscan exons predicted from one or more genomic sequences. Analyze each cluster using algorithms based on graph theory and dynamic programming to integrate cDNA and genomic information, and subsequently confirm, edit or extend to generate potential splice variants that yield full-length sequences did. Sequences were identified in which the length of the entire interval was present in more than one sequence in the cluster, and the intervals so identified were considered equal over time. For example, if there is an interval between one cDNA and two genomic sequences, all three intervals are considered equal. This process can link unrelated but contiguous genomic sequences together by cDNA sequences. The sections thus identified are stitched together with a stitching algorithm so that they appear along the parent sequence to create the longest possible sequence and variant sequences. The linkage of intervals generated along one parent sequence (cDNA-cDNA or genomic sequence-genomic sequence) took precedence over the linkage that changed parent type (cDNA-genomic sequence). The resulting stitch sequences were translated into public databases genpept and gbpri by BLAST analysis and compared. Incorrect exons predicted by Genscan were corrected by comparing to the top BLAST hit from genpept. If necessary, the sequence was further extended using additional cDNA sequences or by inspection of genomic DNA.
[0262]
Stretch array ( Stretched Sequence )
The partial DNA sequence was extended to full length by an algorithm based on BLAST analysis. First, the BLAST program was used to access public databases such as GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes databases.Example 3Were queried for the partial cDNAs constructed as described in. Next, the closest GenBank protein homolog was analyzed by BLAST analysis for the Incyte cDNA sequence orExample 4As described in any of the GenScan exon predicted sequences described above. The resulting high scoring segment pair (HSP) was used to generate a chimeric protein and the translated sequence was mapped onto a GenBank protein homolog. Insertions or deletions can occur within the chimeric protein relative to the original GenBank protein homolog. GenBank protein homologs, chimeric proteins or both were used as probes to search homologous genomic sequences from public human genome databases. In this way, the partial DNA sequence was stretched or extended by the addition of a homologous genomic sequence. The resulting stretch sequences were examined to determine if they contained the complete gene.
[0263]
6 Chromosome mapping of LME-encoding polynucleotide
The sequences used to construct SEQ ID NOs: 6-10 were compared to those in the Incyte LIFESEQ database and the public domain database using the BLAST and Smith-Waterman algorithms. Sequences of these databases, consistent with SEQ ID NOs: 6-10, were assembled into contiguous and overlapping sequence clusters using construction algorithms such as Phrap (Table 7). Whether clustered sequences were previously mapped using radiation hybrid and genetic map data available from public sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Institute (WIGR), and Genethon Was measured. As a result of the inclusion of the mapped sequence in a cluster, the entire sequence of that cluster, including the individual sequence numbers, was assigned to locations on the map.
[0264]
Locations on the map are represented as ranges or intervals of human chromosomes. The location on the map of centiMorgan spacing is measured relative to the end of the p-arm of the chromosome. (Centimorgan (cM) is a unit of measure based on the frequency of recombination between chromosomal markers. On average, 1 cM is approximately equal to one megabase (Mb) of DNA in humans. The cM distance is a genetic marker mapped by Genethon such that the sequence provides a boundary for radiation hybrid markers such that the sequence is contained within each cluster. based on. The above sections have already been identified using human genetic maps and other sources available to the general public, such as the NCBI "GeneMap99" (http: //www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap). Whether it is located in or near the disease gene map can be determined.
[0265]
7. Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcribed genetic information and involves the hybridization of a labeled nucleotide sequence to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. (See Sambrook, supra, Chapter 7, and Ausubel. FM, et al., Chapters 4 and 16, etc.).
[0266]
Similar computer techniques applied to BLAST are used to search the same or related molecules in nucleotide databases such as GenBank and LifeSeq (Incyte Pharmaceuticals). Northern analysis is much faster than multiple membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be modified to determine whether to classify a particular identity as exact or homologous. The search criterion is the product score, which is defined by the following equation.
[0267]
(Equation 1)
The score takes into account both the similarity between the two sequences and the length at which the sequences match. The product score is a standardized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the percent sequence identity of the nucleotides and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. The BLAST score is calculated by assigning a score of +5 to each base matching the high scoring segment pair (HSP) and -4 to each mismatched base pair. The two sequences may share more than one HSP (can be separated by a gap). If there is more than one HSP, calculate the product score using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents a balance between fragmented overlap and the quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is a 100% match over the entire shorter length of the two sequences compared. The product score 70 is obtained when one end matches 100% and overlaps 70%, or the other end matches 88% and overlaps 100%. The product score 50 is obtained when either one end matches 100% and overlaps 50%, or the other end matches 79% and overlaps 100%.
[0268]
Alternatively, the polynucleotide sequence encoding LME is analyzed against the tissue from which it was derived. For example, one full-length sequence is the Incyte cDNA sequence (Example 3) Are constructed so as to at least partially overlap with the above. Each cDNA sequence is derived from a cDNA library made from human tissue. Each human tissue has a cardiovascular system, connective tissue, digestive system, embryo structure, endocrine system, exocrine glands, female genitalia, male genitalia, germ cells, blood and immune system, lung, musculoskeletal system, nervous system, pancreas, respiration Fall into one organism / tissue category such as organs, sensory organs, skin, stomatognathic system, unclassified / mixed, or ureter. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. Similarly, each human tissue is classified into one of the following disease / pathology categories: cancer, cell line, development, inflammation, nervous, trauma, cardiovascular, congestion, and others. Count the number of libraries in each category and divide by the total number of libraries in all categories. The percentage obtained reflects the disease-specific expression of the cDNA encoding LME. cDNA sequence and cDNA library / tissue information can be obtained from the LIFESEQ GOLD database (Incyte Genomics, Palo Alto CA).
[0269]
8. Elongation of polynucleotide encoding LME
Full-length polynucleotide sequences were also generated by extending the fragment using oligonucleotide primers designed from the appropriate fragment of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate 5 'extension of the known fragment, and the other primer was synthesized to initiate 3' extension of the known fragment. The design of the starting primers is such that OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or about 22-30 nucleotides in length, with a GC content of 50% or more and annealing to the target sequence at temperatures of about 68-72 ° C The cDNA was designed using another suitable program. All sections of nucleotides that resulted in hairpin structures and primer-primer dimers were avoided.
[0270]
To extend the sequence, a selected human cDNA library was used. If more than one step extension was needed or desired, additional primers or nested sets of primers were designed.
[0271]
High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those skilled in the art. PCR was performed in a 96-well plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture contains a DNA template, 200 nmol of each primer, and Mg2+, (NH4)2SO4 And a reaction buffer containing β-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), and Pfu DNA polymerase (Stratagene). The parameters used for the primer pair PCI A, PCI B are as follows. Step 1: 3 minutes at 94 ° C. Step 2: 15 seconds at 94 ° C. Step 3: 1 minute at 60 ° C. Step 4: 2 minutes at 68 ° C. Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6: 68 ° C. Step 7: Store at 4 ° C. For primer pair T7, SK +, the following parameters were used instead of the above parameters. Step 1: 3 minutes at 94 ° C. Step 2: 15 seconds at 94 ° C. Step 3: 1 minute at 57 ° C. Step 4: 2 minutes at 68 ° C. Step 5: Repeat steps 2, 3, and 4 20 times Step 6: 68 ° C. Step 7: Store at 4 ° C for 5 minutes
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25 (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to opaque fluorescence. The DNA is distributed to each well of a counting plate (Coming Costar, Acton MA) so that the DNA can bind to the reagent, and the measurement is performed. The plate was scanned with a Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) to measure the fluorescence of the sample and quantify the DNA concentration. Aliquots of 5-10 μl of the reaction mixture were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reactions were successful in extending the sequence.
[0272]
The extended nucleotides are desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested using CviJI cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and ligated into a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech). Sonicated or sheared before. For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, the fragments were excised, and the agar was digested with Agar ACE (Promega). The extended clone was religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA), treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene), and treated with Pfu DNA polymerase (Stratagene). And transfected into E. coli cells. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing an antibiotic, and each colony was cut out and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture at 37 ° C. overnight.
[0273]
Cells were lysed and DNA was amplified by PCR using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene). The parameters used at that time are as follows. Step 1: 94 ° C. for 3 minutes Step 2: 94 ° C. for 15 seconds Step 3: 60 ° C. for 1 minute Step 4: 72 ° C. for 2 minutes Step 5: Repeat steps 2, 3, 4 29 times Step 6: 72 ° C. Step 7: Store at 4 ° C. DNA was quantified with the PICOGREEN reagent (Molecular Probes) described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. Samples were diluted with 20% dimethyl sulfoxide (1: 2, v / v), DYENAMIC energy transfer sequencing primers, and DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE terminator cycle sequencing kit (Timer cycle kit) reaction kit) (Applied Biosystems).
[0274]
Similarly, the above procedure is used to verify full-length nucleotide sequences, or to obtain 5 'regulatory sequences using oligonucleotides designed for such extension and appropriate genomic libraries.
[0275]
9 Labeling and use of individual hybridization probes
Screen cDNA, mRNA, or genomic DNA using a hybridization probe from SEQ ID NO: 6-10. Although the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs is specifically described, the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using the latest software such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences) and 50 pmol of each oligomer and [γ-32P] Adenosine triphosphate (Amersham Pharmacia Biotech) 250 μCi is mixed with T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is sufficiently purified using a SEPHADEX G-25 ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). In a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one of the endonucleases of Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xbal or Pvu II (DuPont NEN), 10 per minute7An aliquot containing a count of labeled probes is used.
[0276]
DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blot is washed sequentially at room temperature, for example, under conditions consistent with 0.1 × sodium citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Hybridization patterns are visualized and compared using autoradiography or an alternative imaging means.
[0277]
1 0 Microarray
Chaining or synthesizing array elements on the surface of a microarray can be achieved using photolithography, piezoelectric printing (see inkjet printing, see Baldschweiler, supra), mechanical microspotting techniques and derivatives thereof. It is. In each of the above techniques, the substrate should be a uniform, non-porous solid (Schena (1999) supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, an array similar to dot blot or slot blot may be used to place and attach elements to the surface of the substrate using thermal, ultraviolet, chemical or mechanical binding procedures. Regular arrays can be made manually or using available methods and machines and can have any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470, Shalon. D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
[0278]
Full-length cDNA, expressed sequence tags (ESTs), or fragments or oligomers thereof, can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art, such as Laser GENE software (DNASTAR). Array elements are hybridized with polynucleotides in a biological sample. Polynucleotides in a biological sample are conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization is detected at each array element using a fluorescence scanner. Alternatively, hybridization can be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is described in detail below.
[0279]
Prepare tissue or cell samples
Total RNA was isolated from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) was isolated using the oligo (dT) cellulose method.+Purify the RNA. Each poly (A)+RNA samples were prepared using MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21 mer), 1 × first strand synthesis buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP , 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). The reverse transcription reaction was performed using a GEMBRIGT kit (Incyte) using 200 ng of poly (A).+Perform in a 25 ml volume containing RNA. Specific control poly (A)+RNA is derived from non-coding yeast genomic DNAin in vitroSynthesized by transcription. Each reaction sample (one labeled Cy3 and the other labeled Cy5) is treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 85 ° C. for 20 minutes to stop the reaction and degrade RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After binding, the two reaction samples are ethanol precipitated with 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. The sample is then dried and finished using a SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0280]
Preparation of microarray
Array elements are made using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from vector-containing bacterial cells by a cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence flanking the cDNA insert. The array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg by 30 cycles of PCR. The amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0281]
The purified array element is immobilized on a polymer-coated glass slide. Microscope slides (Corning) are washed during and after treatment by sonication in 0.1% SDS and acetone, and very well washed with distilled water. Slides are etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed very well in distilled water and 0.05% aminopropylsilane (95% ethanol). Sigma). The coated slide glass is cured by heating at 110 ° C.
[0282]
Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. The specification is incorporated herein by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed mechanical device. The device now adds approximately 5 nl of array element sample per slide.
[0283]
The microarray is UV cross-linked using a STRATALLINKER UV cross-linking agent (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. After incubating the microarray in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) for 30 minutes at 60 ° C., 0.2% SDS and Non-specific binding sites are blocked by washing with distilled water.
[0284]
Hybridization
The hybridization reaction has 9 μl of the sample mixture containing 0.2 μg each of Cy3 and Cy5 labeled cDNA synthesis products in 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture was heated to 65 ° C. for 5 minutes and aliquoted 1.8 cm on the microarray surface.2 Cover with cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber having a cavity slightly larger than the microscope slide. The interior of the chamber is kept at 100% humidity by adding 140 μl of 5 × SSC to the corner of the chamber. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for about 6.5 hours. The arrays were washed in the first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) at 45 ° C. for 10 minutes and in the second wash buffer (0.1 × SSC) at 45 ° C. for 10 minutes each. Wash and dry.
[0285]
detection
The reporter-labeled hybridization complex was equipped with an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) capable of generating spectral lines at 488 nm for Cy3 excitation and 632 nm for Cy5 excitation. Detect with a microscope. The excitation laser light is focused on the array using a 20 × microscope objective (Nikon, Inc., Melville NY). The slide containing the array is placed on a computer controlled XY stage of a microscope and raster scanned through an objective. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example was scanned at a resolution of 20 μm.
[0286]
At two different scans, the mixed gas multiline laser excites the two fluorescent dyes sequentially. The emitted light is separated based on the wavelength and sent to two photomultiplier detectors (PMT R1277, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two fluorescent dyes. The signal is filtered using a suitable filter placed between the array and the photomultiplier. The maximum emission wavelength of the fluorescent dye used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorochromes simultaneously, but scans once for each fluorochrome using a suitable filter in the laser source, and typically scans each array twice.
[0287]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by a cDNA control species added to a known concentration of the sample mixture. A specific location on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that location correlates to a 1: 100,000 weight ratio of hybridizing species. When two samples from different sources (eg, cells to be tested and control cells) are each labeled with a different fluorescent dye and hybridized to a single array to identify differentially expressed genes Is performed by labeling a sample of the cDNA to be calibrated with two fluorescent dyes and adding equal amounts of each to the hybridization mixture.
[0288]
The output of the photomultiplier is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (A / D) converter board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensities have been mapped using a linear 20-color conversion from a blue (low signal) to a pseudo-color range from red (high signal). The data is also analyzed quantitatively. If two different fluorochromes are excited and measured simultaneously, the data is first corrected for optical crosstalk between the fluorochromes (due to overlapping emission spectra) using the emission spectra of each fluorochrome.
[0289]
A grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected on each element of the grid. The fluorescent signal in each element is integrated, and a value corresponding to the average intensity of the signal is obtained. The software used for signal analysis is a GEMTOOOLS gene expression analysis program (Incyte).
[0290]
11 Complementary polynucleotide
The sequence that is complementary to the sequence encoding LME or any part thereof is used to reduce or inhibit the expression of native LME. Although the use of oligonucleotides containing about 15-30 base pairs is described, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. The appropriate oligonucleotides are designed using the Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the coding sequence of the LME. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to inhibit the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent ribosomes from binding to transcripts encoding LME.
[0291]
12 Expression of LME
Expression and purification of LME can be performed using a bacterial or viral based expression system. For expression of LME in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that increases antibiotic resistance and the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express LME when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of LME in eukaryotic cells is commonly known as baculovirus in insect or mammalian cell lines.Autographica californicaIt is performed by infecting nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is replaced with the cDNA encoding LME by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid-mediated. The infectivity of the virus is maintained and a strong polyhedron promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda(Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (See Engelhard. EK. Et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).
[0292]
In most expression systems, the LME will be a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, so that the recombinant fusion protein from crude cell lysate Can be performed quickly and in one go. GST is a 26 kDa enzyme from Schistosoma japonicum, which allows purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from the LME at specific operating sites. FLAG is an 8-amino acid peptide that allows immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His in which six histidine residues are continuously extended enables purification on a metal chelating resin (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995) supra, Chapters 10 and 16. Using LME purified by these methods directly,Examples 16 and 17Can be performed.
[0293]
13 Functional Assay
LME function is assessed by expression of sequences encoding LME at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Vectors of choice include the pCMV SPORT plasmid (Life Technologies) and the pCR 3.1 plasmid (Invitrogen), both with the cytomegalovirus promoter. Using a liposome formulation or electroporation, 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into a human cell line, eg, an endothelial or hematopoietic cell line. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein provides a means of distinguishing transfected from non-transfected cells. In addition, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. The labeling protein can be selected from, for example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or a CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells expressing GFP or CD64-GFP and evaluate their apoptotic status and other cellular properties using an automated, laser optics-based technique, flow cytometry (FCM) I do. FCM detects and quantifies the uptake of fluorescent molecules that diagnose a phenomenon that precedes or coincides with cell death. Such phenomena include changes in nuclear DNA content measured by DNA staining with propidium iodide, changes in cell size and granularity measured by forward light scattering and 90 ° side light scattering, Downregulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, changes in cell surface and intracellular protein expression as measured by reactivity with specific antibodies, and cells with fluorescent complex annexin V protein There is a change in plasma membrane composition as measured by binding to the surface. For flow cytometry, see Ormerod, M .; G. FIG. (1994)Flow Cytometry Oxford, New York, NY. There is a description.
[0294]
The effect of LME on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with the sequence encoding LME and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods well known in the art. Expression of mRNA encoding LME and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0295]
Preparation of 14 LME specific antibody
Using standard purified LME with polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 1816-3088-495) or other purification techniques. Immunize rabbits with a simple protocol to produce antibodies.
[0296]
Alternatively, the LME amino acid sequence is analyzed using laser GENE software (DNASTAR) to determine a region having high immunogenicity. Then, the corresponding oligopeptide is synthesized, and the oligopeptide is used to generate an antibody by a method well known to those skilled in the art. The selection of suitable epitopes, for example, near or adjacent to the C-terminus, is known in the art (see Ausubel, 1995, Chapter 11, supra).
[0297]
Usually, oligopeptides of about 15 residues in length are synthesized using an ABI 431A peptide synthesizer using Fmoc chemistry (Applied Biosystems) and reacted with N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). It binds to KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLM complex in complete Freund's adjuvant. In order to examine the anti-peptide activity and anti-LME activity of the obtained antiserum, the peptide or LME was bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and further radioactively washed. React with iodine-labeled goat anti-rabbit IgG.
[0298]
15 Purification of natural LME using specific antibodies
The natural or recombinant LME is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for LME. The immunoaffinity column is formed by covalently binding an anti-LME antibody to an activation chromatography resin such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, block and wash the resin according to the manufacturer's instructions.
[0299]
The culture solution containing LME is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of LME (for example, with a buffer having high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that disrupt the binding of the antibody to the LME (eg, with a buffer of pH 2-3 or a high concentration of chaotropic ions such as urea or thiocyanate ions) to recover the LME.
[0300]
16 Identification of molecules that interact with LME
LME or a biologically active fragment thereof,125Label with I Bolton Hunter reagent (see, for example, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529). Candidate molecules pre-arranged in a multiwell plate are incubated with labeled LME, washed, and all wells with labeled LME complexes are assayed. Using the data obtained at the various LME concentrations, values for the number and affinity of LME bound to the candidate molecule and values for association are calculated.
[0301]
Alternatively, molecules that interact with LME are identified in Fields, S .; And O. The analysis is performed using a commercially available kit based on a two-hybrid system such as the yeast two-hybrid system described in Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech).
[0302]
LME is also used in the PATHCHALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a high-throughput yeast two-hybrid system to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
[0303]
17 Demonstration of LME activity
LME activity was 1-palmitoyl-2- [1-14C] Vesicles containing oleoyl phosphatidylcholine (Sigma-Aldrich) were usedin in vitroThis can be demonstrated by a hydrolysis assay. Triglyceride lipase activity of LME and phospholipase A2Activity can be demonstrated by analysis of cleavage products isolated from the hydrolysis reaction mixture.
[0304]
1-palmitoyl-2- [1-14C] Vesicles containing oleoyl phosphatidylcholine (Amersham Pharmacia Biotech) contain 2.0 μCi of radiolabeled phospholipid and 12.5 mg of unlabeled 1-palmitoyl-2- [1-14C] It is prepared by mixing with oleoyl phosphatidylcholine and drying the mixture with nitrogen gas. 2.5 ml of 150 mM Tris-HCl (pH 7.5) is added, the mixture is sonicated and centrifuged. The supernatant can be stored at 4 ° C. The final reaction mixture was prepared by adding 2.0 mM taurochenodeoxycholate, 1.0% bovine serum albumin, 1.0 mM calcium chloride in a salt solution containing 0.25 ml of Hanks buffer (pH 7.4), 150 μg of 1-palmitoyl-2- [1-14C] Oleoyl phosphatidylcholine vesicles and various amounts of LME diluted in PBS. After incubation at 37 ° C. for 30 minutes, 20 μg each of lysophosphatidylcholine and oleic acid are added as carriers, and each sample is extracted to obtain total lipids. Lipids are separated by thin-layer chromatography using a two-solvent system of chloroform: methanol: acetic acid: water (65: 35: 8: 4) until the front of the solvent is half of the plate. The process is then continued with hexane: ether: acetic acid (86: 16: 1) until the solvent front is at the top of the plate. The area containing lipids is visualized with iodine vapor, the spots are scraped off and their radioactivity is determined by scintillation counting. As more LME is added to the assay mixture, the amount of radioactivity released as fatty acids increases and the amount of radioactivity released as lysophosphatidylcholine remains low. This is phospholipase A2As an active property, LMEsnNot the -1 positionsnDemonstrates cutting at position -2.
[0305]
Alternatively, the phospholipase activity of LME is determined by that of phosphatidylserine.snThe hydrolysis of fatty acid residues is measured at the -1 position. LME is treated with tritium [3[H] The labeled substrate phosphatidylserine is combined in stoichiometric amounts. After a suitable incubation time, the hydrolysis reaction products are separated from the substrate by chromatographic methods. The amount of acylglycerophosphoserine produced is determined by counting the tritiated product using a scintillation counter. Various control groups are set up to account for background noise and unincorporated substrate. The final count is the product of the tritiated enzyme [3H] represents acylglycerophosphoserine. [3[H] acylglycerophosphoserine is directly proportional to LME activity in biological samples.
[0306]
LME lipoxygenase activity can be measured by chromatography. Incubate the extracted LME lipoxygenase protein (200 μg) with 100 μM [I-14C] arachidonic acid or other unlabeled fatty acids for 15-30 minutes at 37 ° C. After incubation, a stop solution (acetonitrile: methanol: water, 350: 150: 1) is added. Samples are extracted and analyzed by reverse phase HPLC using a solvent system of methanol / water / acetic acid (85: 15: 0.01) (vol / vol) at a flow rate of 1 ml / min. Fractions are also subjected to liquid scintillation counting. The final count represents a product that is directly proportional to LME activity in the biological sample. For stereochemical analysis, metabolites of arachidonic acid are further analyzed by chiral HPLC and mass spectrometry (Sun, D. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 33540333547).
[0307]
Those skilled in the art may make various modifications to the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. While the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
[0308]
(Brief description of the table)
Table 1 outlines the nomenclature of the full length polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention.
[0309]
Table 2 shows the GenBank identification numbers and annotations of the closest GenBank homolog to the polypeptide of the invention. The probability score that each polypeptide matches its GenBank homolog is also shown.
[0310]
Table 3 shows the structural features of the polynucleotide sequences of the present invention, including predicted motifs and domains, along with methods, algorithms and searchable databases for use in analyzing polypeptides.
[0311]
Table 4 shows the cDNA and genomic DNA fragments used to construct the polynucleotide sequences of the present invention, along with selected fragments of the polynucleotide sequence.
[0312]
Table 5 shows a representative cDNA library of the polynucleotide of the present invention.
[0313]
Table 6 is a supplementary table explaining tissues and vectors used for preparing the cDNA library shown in Table 5.
[0314]
Table 7 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with applicable descriptions, references, and threshold parameters.
[Table 1]
[Table 2]
[Table 3]
[Table 4]
[Table 5]
[Table 6]
[Table 7]
[Table 8]
[Table 9]
[Table 10]
[Table 11]
[Table 12]
[Table 13]
[Table 14]
[Table 15]
[Table 16]
Claims (54)
(a)配列番号1乃至5(SEQ ID NO:1−5)を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一であるようなアミノ酸配列を有する天然のポリペプチド
(c)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
(d)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫抗原性断片A substantially isolated polypeptide selected from the group having the following (a) to (d):
(A) a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5 (SEQ ID NOs: 1-5); (b) at least 90 amino acid sequences selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5 (C) a biologically active fragment of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-5 (d) SEQ ID NO: Immunogenic fragments of a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having 1-5
(a)前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、
(b)そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、 前記組換えポリヌクレオチドが、請求項1に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有することを特徴とする方法。A method for producing the polypeptide of claim 1,
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. Steps and
(B) receiving the polypeptide thus expressed, wherein the recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. A method comprising:
(a)配列番号6乃至10(SEQ ID NO:6−10)を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
(b)SEQ ID NO:6−10を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一であるような天然のポリヌクレオチド
(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(e)(a)〜(d)のRNA等価物A substantially isolated polynucleotide selected from the group having the following (a) to (d):
(A) a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 6 to 10 (SEQ ID NO: 6-10); and (b) a polynucleotide sequence having a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 6-10. Polynucleotides (e) (a) to (e) (a) to polynucleotides (d) (b) that are complementary to the polynucleotides of the natural polynucleotides (c) (a) that are at least 90% identical RNA equivalent of (d)
(a)前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
(b)前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。A method for detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence according to claim 11 in a sample,
(A) hybridizing the sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample;
(B) detecting the presence / absence of the hybridization complex, and optionally detecting the amount of the complex, if any, and the hybridization complex between the probe and the target polynucleotide. A method wherein the probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions such that a body is formed.
(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
(b)前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。A method for detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence according to claim 11 in a sample,
(A) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) a method comprising detecting the presence or absence of the target polynucleotide or a fragment thereof, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or a fragment thereof, if present.
(a)請求項1のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
(b)前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method for screening a compound for confirming the efficacy of the polypeptide according to claim 1 as an agonist,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting agonist activity in the sample.
(a)請求項1のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
(b)前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method for screening a compound for confirming its efficacy as an antagonist of the polypeptide according to claim 1, comprising:
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting antagonist activity in the sample.
(a)適切な条件下で請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、
(b)請求項1に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項1に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide according to claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under appropriate conditions;
(B) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1.
(a)請求項1に記載のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、
(b)請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
(c)試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。A method for screening a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under conditions permitting the activity of the polypeptide of claim 1;
(B) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of a test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound. A method according to claim 1, wherein the change in the activity of the polypeptide according to claim 1 in the presence of is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1.
(a)前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、
(c)可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。A method for screening a compound effective for altering the expression of a target polynucleotide comprising the sequence of claim 5, comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound under conditions suitable for expression of the target polynucleotide;
(B) detecting the mutant expression of the target polynucleotide;
(C) comparing the expression of said target polynucleotide in the presence of said compound in a variable amount and in the absence of said compound.
(a)核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
(b)処理した前記生体サンプルの核酸と、請求項11のポリヌクレオチドの少なくとも20の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせるステップであって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項11のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記ステップと、
(c)ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、
(d)前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。A method for calculating the toxicity of a test compound, comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound;
(B) hybridizing the treated nucleic acid of the biological sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 11, wherein the hybridization comprises the hybridization of the probe and the biological sample. The method is carried out under conditions under which a specific hybridization complex is formed with the target polynucleotide, wherein the target polynucleotide is a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 11 or a fragment thereof. Said steps;
(C) quantifying the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the amount of the hybridization complex in the treated biological sample with the amount of the hybridization complex in an untreated biological sample. A method wherein the difference in the amount of said hybridization complex in a treated biological sample is indicative of the toxicity of said test compound.
(a)前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項10に記載の抗体と結合する過程と、
(b)前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。A diagnostic test for a condition or disease associated with the expression of LME in a biological sample, comprising:
(A) binding the biological sample to the antibody of claim 10 under conditions suitable for the antibody to bind to the polypeptide and form a complex between the antibody and the polypeptide. When,
(B) detecting the complex, wherein the presence of the complex correlates with the presence of the polypeptide in the biological sample.
(a)キメラ抗体
(b)単鎖抗体
(c)Fab断片
(d)F(ab’)2断片
(e)ヒト化抗体 のいずれかであることを特徴とする請求項10に記載の抗体。The antibody,
The antibody according to claim 10, which is any one of (a) a chimeric antibody, (b) a single-chain antibody, (c) a Fab fragment, (d) an F (ab ') 2 fragment, and (e) a humanized antibody.
(a)抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫抗原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
(b)前記動物から抗体を単離する過程と、
(c)前記単離された抗体をポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。A method for preparing a polyclonal antibody having the specificity of the antibody according to claim 10,
(A) immunizing an animal with a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5 or an immunogenic fragment thereof under conditions that induce an antibody response;
(B) isolating the antibody from the animal;
(C) screening the isolated antibody for a polypeptide, thereby identifying a polyclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5. A method comprising:
(a)抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫抗原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
(b)前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
(c)不死化の細胞を用いて前記抗体産出細胞を融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
(d)前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
(e)SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。A method for producing a monoclonal antibody using an antibody having the specificity of the antibody according to claim 10,
(A) immunizing an animal with a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5 or an immunogenic fragment thereof under conditions that induce an antibody response;
(B) isolating antibody-producing cells from the animal;
(C) fusing the antibody-producing cells using immortalized cells to form monoclonal antibody-producing hybridoma cells;
(D) culturing the hybridoma cells;
(E) isolating from the cultured monoclonal antibody that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5.
(a)前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項10に記載の抗体をインキュベートする過程と、
(b)特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを示唆することを特徴とする方法。A method for detecting a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5,
(A) incubating the antibody according to claim 10 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) detecting specific binding, said specific binding suggesting that a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1-5 is present in the sample. And how.
(a)前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項10に記載の抗体をインキュベートする過程と、
(b)前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1−5を有する群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。A method for purifying a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5,
(A) incubating the antibody according to claim 10 with a sample under conditions permitting specific binding between the antibody and the polypeptide;
(B) separating the antibody from the sample to obtain a purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-5.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20351100P | 2000-05-11 | 2000-05-11 | |
US20790300P | 2000-05-25 | 2000-05-25 | |
US21015000P | 2000-06-07 | 2000-06-07 | |
US21339200P | 2000-06-23 | 2000-06-23 | |
PCT/US2001/015210 WO2001085956A2 (en) | 2000-05-11 | 2001-05-11 | Lipid metabolism enzymes |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004513611A true JP2004513611A (en) | 2004-05-13 |
Family
ID=27498501
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001582545A Pending JP2004513611A (en) | 2000-05-11 | 2001-05-11 | Lipid metabolizing enzymes |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1280918A2 (en) |
JP (1) | JP2004513611A (en) |
AU (1) | AU2001261424A1 (en) |
CA (1) | CA2407864A1 (en) |
WO (1) | WO2001085956A2 (en) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001264753A1 (en) * | 2000-05-19 | 2001-12-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 46638, a putative family member of human lipoxygenase |
US6812017B2 (en) | 2000-10-11 | 2004-11-02 | Centre National De La Recherche Scientique - Cnrs | Mammalian secreted group IIF phospholipase A2 |
US6897056B2 (en) | 2000-11-08 | 2005-05-24 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 32544, a novel human phospholipase C and uses thereof |
WO2003033689A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-04-24 | Centre National De La Recherche Scientifique -Cnrs- | Cloning and recombinant expression of mammalian secreted group iif phopholipase a2 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1533372A1 (en) * | 1993-09-24 | 2005-05-25 | SHIONOGI & CO., LTD. | Human phospholipase C-Alpha and DNA sequence encoding the same |
AU2001252945A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of colon cancer |
-
2001
- 2001-05-11 EP EP01935320A patent/EP1280918A2/en not_active Withdrawn
- 2001-05-11 CA CA002407864A patent/CA2407864A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-11 JP JP2001582545A patent/JP2004513611A/en active Pending
- 2001-05-11 AU AU2001261424A patent/AU2001261424A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-11 WO PCT/US2001/015210 patent/WO2001085956A2/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001085956A3 (en) | 2002-09-19 |
AU2001261424A1 (en) | 2001-11-20 |
CA2407864A1 (en) | 2001-11-15 |
WO2001085956A2 (en) | 2001-11-15 |
EP1280918A2 (en) | 2003-02-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2005503112A (en) | Lipid binding molecule | |
US7368270B2 (en) | Human phospholipases | |
US20040248243A1 (en) | Lipid metabolism enzymes | |
WO2004044165A2 (en) | Lipid-associated proteins | |
JP2004519207A (en) | Lipid metabolism molecule | |
JP2004513611A (en) | Lipid metabolizing enzymes | |
US20040053367A1 (en) | Lipid-associated molecules | |
US20030113846A1 (en) | Lipid metabolism enzymes | |
US20040171009A1 (en) | Lipid-associated molecules | |
JP2004527216A (en) | Lipid metabolizing enzymes | |
JP2004537256A (en) | Lipid metabolizing enzymes | |
US20040023354A1 (en) | Lipid metabolism enzymes | |
US20070134680A1 (en) | Lipid metabolism molecules | |
JP2004537969A (en) | Lipid-related molecules | |
WO2003083081A2 (en) | Lipid-associated molecules | |
US20040048269A1 (en) | Lipid metabolism enzymes | |
JP2006514532A (en) | Lipid related molecules | |
WO2003025150A2 (en) | Lipid-associated molecules | |
JP2004512018A (en) | Secretory redox protein | |
JP2004510401A (en) | Enzyme utilizing coenzyme A |