JP2004511207A - Comparative phenotypic analysis to evaluate biologically active compounds such as antimicrobial agents - Google Patents

Abstract

The present invention is directed to a multi-test panel for improving the effectiveness, throughput, and efficiency of testing and commercial development of biologically active compounds, especially compounds useful for human, animal, and plant health. About use. In particular, the present invention provides phenotypic microarrays suitable for testing biologically active compounds for potential applications in clinical, veterinary, and plant health.

Description

^★モイア（Ｍｏｉｒ）ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４３：４３９−４４６［１９９９］による
【０００８】
別の主要なＢＡＣカテゴリーは、ヒト疾患を妨げるように設計された医薬品（すなわち、薬物）である。疾患は、細胞の生理学的経路における異常と考えることができる。これらの経路の主な成分は、遺伝子によりコードされ、疾患に冒された細胞内で発現されるタンパク質（酵素、受容体など）である。薬物は、通常、鍵タンパク質の正常機能を回復するように、または鍵タンパク質を不活化させ、生理学的経路の異常を打ち消すように鍵タンパク質（すなわち、薬物標的）と相互作用することによって薬学的効果を発揮する。
【０００９】
抗菌剤と同様に、この医薬品を開発するプロセスは２つの段階を伴う：（１）薬物標的を特定する段階、次いで、（２）標的と特異的に相互作用して、望ましくない副作用のない望ましい効果を生じる化学物質を発見するために、候補となる活性な化学物質をスクリーニングする段階。この分野において多くの研究がなされているが、依然として、これらの化学物質のスクリーニングおよび評価の効率および有効性の改善が必要とされる。
【００１０】
より期待が持てそうな薬物を作成するプレッシャーに対応して、製薬会社およびバイオテクノロジー会社は、リード化合物を発見および評価するために高速ハイスループット法に頼ろうとするようになってきた。これらのリード化合物は、一般的に、抽出物コレクションを用いて様々な供給源から集められた化合物、コンビナトリアルケミストリー法または合理的薬物設計によって合成された化学物質の大きなライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。
【００１１】
しかしながら、これらの方法は良いこともあるが悪いこともあった。コンビナトリアルケミストリーなどの技術を用いると、候補となる薬物標的に対する化合物ライブラリーを迅速に作成およびスクリーニングすることができる。残念なことに、これらの技術は、提案された標的に及ぼす薬物の影響を調べるだけであり、他の細胞プロセスに及ぼす影響を測定しない。ある化学物質は、標的タンパク質との相互作用に基づいて優れた候補であるかもしれないが、この化学物質はまた細胞内の他のタンパク質と相互作用し、副作用を引き起こすかもしれない。従って、薬物開発業者は、期待が持てそうな薬物候補が細胞機能の他の局面をどのように生じさせるか、ならびに同時に使用する可能性のある他の薬物とどのように相互作用するかを理解するために薬物候補を調べなければならないという点で大きな問題が残っている。これらの分野での進歩にもかかわらず、依然として、疾患治療に有効なＢＡＣを同定および開発するための、非常に感度が高く特異的でありながら、費用効率が高く使いやすい方法が必要とされる。
【００１２】
発明の概要
本発明は、生物学的に活性な化合物（特に、ヒト、動物、および植物の健康に有用な化合物）の試験および商品開発の有効性、処理量、および効率を改善するためのマルチテストパネルの使用に関する。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する少なくとも２つの細胞の応答を試験する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：ａ）試験装置の各ウェルが、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む限定培地を含む、少なくとも２つのウェルを有する試験装置；第１の細胞および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の懸濁液；および第２の細胞および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の懸濁液を提供する段階；（ｂ）懸濁液を試験装置のウェルに接種する段階；および（ｃ）少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する第１の細胞および第２の細胞の応答を観察する段階。
【００１４】
前記方法のある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、懸濁液はゲル化剤をさらに含む。なおさらなる態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある態様において、懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含み、他の態様において、懸濁液および試験装置のウェルは両方とも比色指示薬を含む。ある好ましい態様において、観察は視覚によるのに対して、他の好ましい態様では計器で行われる。ある特に好ましい態様において、第１の細胞および第２の細胞の応答は非放射性である。別の態様において、第１の細胞および第２の細胞は真核細胞である。ある好ましい態様において、真核細胞は動物細胞であるのに対して、他の好ましい態様において、動物細胞は哺乳動物細胞であり、ある特に好ましい態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞は変異体細胞である。なおさらなる態様において、第１の細胞および第２の細胞は菌類細胞であるのに対して、他の態様において、第１の細胞および第２の細胞は原核細胞である。ある好ましい態様において、薬物は少なくとも１つの抗菌剤を含む。
【００１５】
本発明は、少なくとも２つの生物学的に活性な化学物質の影響を比較する方法であって、以下の段階を含む方法をさらに提供する：ａ）少なくとも１つの細胞タイプおよび少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の細胞懸濁液；第１の細胞懸濁液と同じ細胞タイプおよび第１の細胞懸濁液中の生物学的に活性な化学物質と異なる少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の細胞懸濁液；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む限定培地を含むウェルを有する第１の試験装置；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、薬物、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第２の試験装置を提供する段階；ｂ）第１の細胞懸濁液を第１の試験装置のウェルに添加して、第１の表現型アレイを提供する段階；ｃ）第２の細胞懸濁液を第２の試験装置のウェルに添加して、第２の表現型アレイを提供する段階；ｄ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイをインキュベートする段階；ｅ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を観察する段階；およびｆ）第１の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答と第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を比較する段階。
【００１６】
前記方法のある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、懸濁液はゲル化剤をさらに含む。なおさらなる態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある態様において、懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含み、他の態様において、懸濁液および試験装置のウェルは両方とも比色指示薬を含む。ある好ましい態様において、観察は視覚によるのに対して、他の好ましい態様では計器で行われる。ある特に好ましい態様において、第１の細胞および第２の細胞の応答は非放射性である。別の態様において、第１の細胞および第２の細胞は真核細胞である。ある好ましい態様において、真核細胞は動物細胞であるのに対して、他の好ましい態様において、動物細胞は哺乳動物細胞であり、ある特に好ましい態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞は変異体細胞である。なおさらなる態様において、第１の細胞および第２の細胞は菌類細胞であるのに対して、他の態様において、第１の細胞および第２の細胞は原核細胞である。ある好ましい態様において、薬物は少なくとも１つの抗菌剤を含む。ある態様において、試験装置は第２の試験装置と同じ基質を含む。なおさらなる態様において、応答の比較は多次元パターン分析を用いて行われる。
【００１７】
本発明は、少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質に対する生物の応答を試験する方法であって、以下の段階を含む方法をさらに提供する：ａ）試験装置の各ウェルが、炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む、少なくとも２つのウェルを有する試験装置；ならびに生物および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む懸濁液を提供する段階；（ｂ）懸濁液を試験装置のウェルに接種する段階；および（ｃ）１つまたはそれ以上の生物学的に活性な化学物質に対する生物の応答を観察する段階。ある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、懸濁液はゲル化剤をさらに含む。なおさらなる態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある好ましい態様において、懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の好ましい態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含む。さらなる態様において、観察は視覚によるのに対して、他の特に好ましい態様では計器で行われる。
【００１８】
本発明はまた、少なくとも２つの生物学的に活性な化学物質の影響を比較する方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：ａ）生物および少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第１の細胞懸濁液；第１の細胞懸濁液と同じ生物および第１の細胞懸濁液中の生物学的に活性な化学物質と異なる少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む第２の細胞懸濁液；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第１の試験装置；炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含むウェルを有する第２の試験装置を提供する段階；ｂ）細胞懸濁液を第１の試験装置のウェルに添加して、第１の表現型アレイを提供する段階；ｃ）細胞懸濁液を第２の試験装置のウェルに添加して、第２の表現型アレイを提供する段階；ｄ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイをインキュベートする段階；ｅ）第１の表現型アレイおよび第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を観察する段階；およびｆ）第１の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答と第２の表現型アレイにおける細胞懸濁液の応答を比較する段階。ある態様において、第１の試験装置および第２の試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。他の態様において、第１の細胞懸濁液および第２の細胞懸濁液はゲル化剤をさらに含む。さらに他の態様において、第１の試験装置および第２の試験装置はウェル内にゲル化開始剤をさらに含む。ある好ましい態様において、第１の細胞懸濁液および第２の細胞懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、他の態様において、第１の試験装置および第２の試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含む。ある特に好ましい態様において、第１の試験装置は第２の試験装置と同じ基質を含む。ある好ましい態様において、観察は視覚によるのに対して、他の好ましい態様では計器で行われる。特に好ましい態様において、応答の比較は多次元パターン分析を用いて行われる。
【００１９】
本発明はまた、以下を含む、少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質の影響を試験するためのマルチウェルキットを提供する：炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成試験基質からなる群より選択される少なくとも１つの基質を含む少なくとも２つのウェルを有する少なくとも１つの試験装置；ならびに少なくとも１つの生物学的に活性な化学物質を含む細胞懸濁培地。ある態様において、試験装置は、マイクロタイタープレートおよびマイクロカードからなる群より選択される。ある好ましい態様において、細胞懸濁培地はゲル化剤を含むのに対して、他の態様において、試験装置はウェル内にゲル化開始剤を含む。ある態様において、細胞懸濁液は比色指示薬をさらに含むのに対して、さらに他の態様において、試験装置はウェル内に比色指示薬をさらに含む。
【００２０】
発明の説明
本発明は、生物学的に活性な化合物（ＢＡＣ）（特に、ヒト、動物、および植物の健康に有用なＢＡＣ）の試験および商品開発の有効性、処理量、および効率を改善するための、本明細書で「表現型マイクロアレイ」または「ＰＭ」と呼ばれるマルチテストパネルの使用に関する。
【００２１】
本発明の特に好ましい態様は、疾患または疾患症状を治療するのに一般的に用いられるＢＡＣ（例えば、抗菌剤および他の化合物）を必要とするが、本発明はまた広範囲のＢＡＣを含み、ＢＡＣとして栄養分、ホルモン、増殖刺激化合物、栄養剤、ビタミン、代謝改変化合物、殺虫剤、殺鼠剤、抗真菌剤、除草剤、殺藻剤などが挙げられるが、これに限定されない。本発明は任意の供給源からのＢＡＣを含むことがさらに意図される。従って、本発明は、任意の供給源に由来するＢＡＣを評価する手段ならびに任意の適切な用途についてＢＡＣを評価する手段を提供する。
【００２２】
前記のように、大きな問題が、薬物発見および開発において用いられる従来の方法と関連している。例えば、薬物開発業者は、まず最初に、期待が持てそうな薬物候補を発見するために期待が持てそうな薬物候補を調べなければならず、次いで、期待が持てそうな薬物候補が細胞機能の他の局面をどのように生じさせるか、ならびに同時に使用する可能性のある他の薬物とどのように相互作用するかを理解するために期待が持てそうな薬物候補を調べなければならないという点で大きな問題が残っている。本発明は、ＰＭが費用効率が高くかつ迅速な生理学に基づくインビボ薬物活性分析を提供するので、これを効率的かつ効果的に試験する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、効率的にかつ高処理量で化学物質ライブラリースクリーニングを支援するのに加えて、詳細な毒物学的分析において用いられる。例えば、哺乳動物細胞を用いたアッセイにおいて、使いやすく、高処理量、高速で、かつ費用効率が高く複数の薬物候補をアッセイするのに様々な器官を代表する一組の細胞系が用いられることが意図される。これらの結果に基づいて、最初に期待が持てそうに見えたが、実際には容認できない副作用を引き起こす化合物を、費用のかかる臨床試験を開始する前に選考から外すことができる。
【００２４】
重要なことに、本発明はまた併用される薬物を分析する方法を提供する。この態様の利点は、複数の薬物のインビボでの可能性のある相互作用を評価できることを含む。例えば、ある場合では、薬物の併用は有害なまたは拮抗する相互作用を発揮するのに対して、他の場合では、相乗作用して患者にさらなる利益をもたらす。後者の例として、サルファ薬とトリメトプリムおよびペニシリンとβ−ラクタマーゼ阻害剤などの併用が挙げられる。
【００２５】
薬物開発および治療レジメにおいて費用が常に考慮すべき事項であるので、本発明は、現在用いられている方法より優れた独特の利点を提供する。本発明は薬物開発の時間および費用をかなり節約する。例えば、最新の見積もりでは、最初の合成から最終的な食品医薬品局（ＦＤＡ）認可まで薬物を開発するのに現在、平均１４．９年かかることが分かっている（Ｒ．ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ；Ｓ．Ｎ．ウィギング（Ｗｉｇｇｉｎｇ）、Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｊ．Ａ．ディマシ（Ｄｉｍａｓｉ）、Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、「医療市場ガイドリサーチレポート ２０００（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｒｋｅｔｐｌａｃｅ Ｇｕｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０００）」、第１５版、第１巻、Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ １９１０２、［１９９９−２０００］、１−１７２頁を参照のこと）。１つの新薬の開発費は、１９７６年の５４００万ドルから現在では平均３億５９００万ドルに増加していることが報告されている（ハンセン、前記）。さらに、臨床試験中、１０個の薬物うち約９個が失敗するために、何十億ドルも費やされている（ハンセン、前記）。新薬候補を効率的に特定し、特徴付けることができ、薬物発見プロセスにおいて初期に不満足な候補を排除できれば、製薬会社は年に何十億ドルも節約することができる。
【００２６】
本発明はまた、目的のＢＡＣの作用形態を決定するのに適した方法および組成物を提供する。この態様において、本発明は、様々な細胞機能の広範なアッセイにおいてＰＭを用いる。ＰＭを用いると、ＢＡＣによって最も感度よく変えられる機能を決定することができる。例えば、ＢＡＣが細胞壁合成を阻害することが示された場合（例えば、バンコマイシン）、この試験ＢＡＣと、同様に細胞壁合成を阻害する他のＢＡＣ（例えば、セファロスポリン、ペニシリンなど）との相乗作用レベルを容易にかつ効率的に評価することができる。本発明は、ＢＡＣ間の相乗作用のタイプおよびレベルに関して定量的および定性的な測定を行うのに使用することができる。別の例において、イソロイシンなどのアミノ酸の生合成に関与する酵素活性を阻害するＢＡＣ（例えば、スルホメツロンメチル）の活性は最小表現型培地上で観察することができ（すなわち、毒性と予想される）、この影響は側鎖アミノ酸を含む表現型培地において特異的に逆転される。
【００２７】
本発明はまた、細胞に存在するＢＡＣ標的のタイプおよび数の決定に用いられる。このような決定は、好ましいＢＡＣが特異的な作用形態を有し、副作用がないという点で重要である。それぞれの候補となる新規のＢＡＣは、使用のために認可される前に多くの基準を満たさなければならない。
【００２８】
標的の選択は、新たなＢＡＣの開発において重要な初期の段階である。一般的に、標的は、十分な選択性および範囲を生じるべきである（すなわち、抗菌剤は、ヒト宿主に関連する微生物に対して特異性および／または選択性が高く、また、望ましい病原体範囲に対して活性がある）。標的は、病原体の増殖または生存能力に必須のものであるべきである（すなわち、少なくとも感染条件下で必須のものであるべきである）。アッセイおよびハイスループットスクリーニング（例えば、本発明のアッセイおよびハイスループットスクリーニング）が利用できるように、標的の機能は既知であるべきである。本発明はまた、ＢＡＣの選択性および範囲ならびに様々な標的の機能および重要度を決定および評価する手段を提供する。
【００２９】
本発明のある態様において、ＢＡＣの活性は、複数の標的との相互作用などの副作用が観察されるような方法で決定される。例えば、ある試験では、ＢＡＣ１は、１つの標的であるタンパク質１を阻害する特異的薬物である。これは、タンパク質１ならびにタンパク質５を阻害する非特異的薬物であることが分かっているＢＡＣ２と区別される。タンパク質５の阻害が有害である場合、このＢＡＣは使用に適さないことが決定される。
【００３０】
図１は、ＰＭを用いて細胞に及ぼすＢＡＣの影響を測定するように設計された本発明の１つの態様の単純化した模式図である。この図および図２において、「ｐｈｅ」の名称は細胞の表現型（例えば、表現型マイクロアレイの特定のウェルにおける細胞の増殖および／または呼吸）を示す。図１および２は、上部左に、正常細胞、および通常コードされるタンパク質の機能的活性（この例では候補となる薬物標的）を欠く変異体細胞（例えば、遺伝子ノックアウト）を示す。図１および２において、「ｇ１」は、候補となる薬物標的であるタンパク質「ｐ１」をコードする遺伝子を示す。ほとんどの薬物はタンパク質の活性をブロックすることで作用するので、薬物が添加されると、細胞には標的タンパク質の機能が無い。従って、いずれの場合でも（すなわち、薬物に変異体細胞を曝露しても正常細胞を曝露しても）、細胞には標的タンパク質（例えば、ｐ１）の機能が無い。これらの細胞の主な違いは、変異体細胞の場合、タンパク質機能は遺伝学的手段によって無くなったが、薬物に曝露された正常細胞の場合、タンパク質機能は化学的手段によって無くなったことである。図１において、薬物１は活性があり特異的であるので（すなわち、薬物１だけが表現型１を生じるので）、標的タンパク質（ｐ１）を不活化するのに良い候補である。対照的に、薬物２は、タンパク質５（ｐ５）と呼ばれる別のタンパク質ならびにｐ１を不活化するので（すなわち、薬物２は表現型１および５の両方に影響を及ぼすので）、悪い候補である。薬物２は細胞に非特異的な影響を及ぼすので、副作用を引き起こす可能性が高く、治療レジメにおいて使用するのに望ましくない化合物である可能性が高い。
【００３１】
従って、本発明のある態様において、ＢＡＣの活性は、複数の標的との相互作用などの副作用が観察されるような方法で決定される。例えば、ある試験では、ＢＡＣ１は、１つの標的であるタンパク質１を阻害する特異的薬物である。これは、タンパク質１ならびにタンパク質５を阻害する非特異的薬物であることが分かっているＢＡＣ２と区別される。タンパク質５の阻害が有害である場合、このＢＡＣは使用に適さないことが決定される。
【００３２】
図２は、ＰＭが薬物相互作用をどのように検出できるかを示す単純化した模式図である。細胞を「薬物１」および「薬物２」に同時に曝露すると、その結果として起きる影響は、薬物１の影響（すなわち、ｐｈｅ１の変化）および薬物２の影響（すなわち、ｐｈｅ５の変化）だけでなく、ｐｈｅ６およびｐｈｅ７も変化したようにそれ以上である。これは、単独で用いられた薬物の既知の影響に基づいて予測できない薬物の余分な影響を示している。この余分な影響（すなわち、ｐｈｅ６およびｐｈｅ７の変化）は有益な場合も（すなわち、相乗作用）、有害な場合もある（すなわち、拮抗作用）。
【００３３】
図３に図示したように、試験プロセス間に、様々なウェル内の細胞は異なる環境ストレス下に置かれる。これらのストレスは、適応して生き残るように細胞に圧力を加える。例えば、あるウェルでは、細胞はリンなどの元素が部分的に不足していてもよく、その一方で、他のウェルでは、細胞は高塩条件に適応していてもよく、ＤＮＡ修復を受けていてもよく、低ｐＨで増殖していてもよく、部分的に欠陥のある細胞壁を生成していてもよく、リボソーム機能が低下していてもよい。従って、本発明は、単一の培養（または細胞集団）から始めて、その培養物を様々な環境条件に曝露し、それによって異なる生理学的状態の細胞アレイを作成する手段を提供する。培養物に抗菌剤薬物または他のＢＡＣも添加する場合、本発明は、多くの環境条件下および生理学的条件下で培養物に及ぼすＢＡＣの影響を同時に観察する手段を提供する。これは、生物の抗菌剤感受性パターンを決定するような作業のための（一般的に、生物の急速な増殖をもたらす条件下でしか、すなわち最適増殖条件下でしか培養物を増殖させない）現在の実施とは非常に異なり、それより非常に強力である。
【００３４】
抗菌剤感受性試験のための従来の方法および現在の方法では、手順およびその解釈を統一するためにあらゆる努力がなされている。これらの方法は比較的簡単であるが（例えば、キルビーバウアー（Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ）ディスク拡散法およびチューブ希釈法）、国立臨床検査標準協議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ：ＮＣＣＬＳ）によって臨床の場において厳しく管理されている（ヒンドラー（Ｈｉｎｄｌｅｒ）「抗菌剤感受性試験（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）」イセンベルグ（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）（編）「臨床微生物学手順ハンドブック（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」第１巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、［１９９４］、５．０．１〜５．２５．１頁を参照のこと）。実際に、医師は標準的方法から逸脱せず、誤解を招く結果を得ないように命じられている。
【００３５】
しかしながら、抗菌剤感受性試験は臨床微生物学研究室の最も重要な作業の１つであるが、これらの試験は、患者の疾患を治療するのに特定の抗菌剤がどのくらい良く作用するかをインビトロで予測するだけであると認識されている（ジョーゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）およびシャーム（Ｓａｈｍ）、「抗菌剤感受性試験：概論（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ：Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）、マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら（編）「臨床微生物学マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第６版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９５］、１２７７−１２８０頁を参照のこと）。認可されている試験手順はかなり統一されているので、異なる環境ストレス下で生物の感受性を試験する機構はない。これは、生物がインビボで遭遇する可能性がある条件などの複数の大いに異なる条件下での抗菌剤感受性の決定（ならびに特定の培養物の他の特徴の決定）を可能にする本発明とは全く対照的である。
【００３６】
従って、前記のように、本発明は相乗作用および拮抗作用の決定においてさらに用いられる。当技術分野において周知なように、使用した時に、どのＢＡＣの併用が相乗作用するか、どのＢＡＣの併用が拮抗作用するかまたは有害であるかを知ることは重要である。本発明は、これらの関係を決定するための方法および組成物を提供する。
【００３７】
本発明を用いて得られた結果は単純または複雑なパターンを生じることがあり、このパターンは、定量的に記録され、当技術分野において周知の標準的な方法を用いて分析することができる。特に、多次元パターン分析法として、ノンメトリック多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）、主成分分析法および正準変数分析法、ヒューリスティッククラスタリング分析法、距離行列および類似性行列の作成、データ抽出およびマイニング活動、ならびにバイオインフォマティクスのツールおよび実施が挙げられるが、これに限定されない。ＡＮＯＶＡなどの方法において、試料セットは、どのくらい厳密に同程度のばらつきを有するかに基づいて比較される。ＡＮＣＯＶＡは、データセットの結合のばらつき（ｊｏｉｎｔ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）についての情報を提供する。主成分分析法（ＰＣＡ）および正準変数分析法（ＣＶＡ）が本発明に用いられることも意図される。ＰＣＡはデータ行列の代数解析を行うのに対して、ＣＶＡは、データの同じ代数解析に関連する距離行列または類似性行列に適用される。対応分析および判別分析は、基本的なＰＣＡアルゴリズムを使用するための方法を提供する。ＣＶＡと同様に、違いはこのアルゴリズムを適用する前のデータ処理法である。モンテカルロ置換検定もまた本発明と組み合わせた使用を検討される。これらの検定は、クラスター分析結果の安定性および信頼性を示す。
【００３８】
さらに、本発明を用いて得られたデータの分析においてジニ係数の使用が用いられることが意図される（例えば、ハーチ（Ｈａｒｃｈ）ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．、３０：９１−１０１［１９９７］を参照のこと）。例えば、この分析において、ある基質またはＢＡＣの不平等な使用を定量するための尺度としてジニ係数を用いることができる。しかしながら、統計方法の選択は本発明の用途によって決まる。従って、本発明はデータ分析の特定の任意の方法に限定されることが意図されない。実際に、本発明を用いて得られたデータを分析するために、シャノン指数などの方法ならびに他の適切な方法が用いられることが意図される（ガーランド（Ｇａｒｌａｎｄ）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．、２４：２８９−３００［１９９７］も参照のこと）。
【００３９】
さらに、本発明は、ＢＡＣ感受性プロフィールにおけるデータを決定し、データベースにおける容易な保存を可能にする方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、微生物ならびに他の細胞の比較表現型試験に適している。
【００４０】
１つの好ましい方法において、本発明は、多くの生物系の重要な原核「モデル」生物および真核「モデル」生物である大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の表現型試験のための方法および組成物を含む。しかしながら、本発明はこれらの生物に限定されることが意図されない。実際に、本発明は、医学、獣医学、産業、および環境に重要なおよび／または関心のある生物の分析に用いられることが意図される。
【００４１】
本発明は、特定の属、種にも生物群または細胞群にも限定されることが意図されない。一般的に単離される生物に加えて、本発明の方法および組成物を用いて試験することができる細胞タイプの範囲には、複雑な形の分化、フィラメント化、胞子形成などを受ける細胞が含まれる。実際に、本発明は任意のタイプの細胞と共に用いられることも意図され、細胞として、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および植物細胞を含む、細胞培養において維持される細胞、細胞系などが挙げられるが、これに限定されない。本発明の組成物および方法は、最も経済的に重要な生物の一部ならびに臨床的に重要な種を特に対象としている。本発明のＰＭを用いて様々な細胞を特徴付けることができるので、初代単離培地および初代培養培地の選択は特定の配合に限定されることが意図されない。
【００４２】
前記のように、本発明は、原核生物（例えば、細菌）細胞ならびに真核細胞と共に用いられる。例えば、本発明は、様々な動物および他の真核生物種から得られた細胞と共に用いられる。例えば、本発明は、哺乳動物、昆虫、鳥類、魚類、爬虫類、および両生類の細胞と共に用いられる。従って、哺乳動物細胞が本発明と共に用いられ、哺乳動物細胞として、ヒト細胞および非ヒト動物細胞（実験動物、ペット、および家畜 （例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウなど）、ウサギ（例えば、アナウサギおよび野ウサギ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、テンジクネズミなど）、および非ヒト霊長類）に由来する細胞を含む）、ならびに動物園の動物、野生化した動物、および野生動物から得られた細胞が挙げられるが、これに限定されない。従って、本発明は、任意の数の脊椎動物ならびに無脊椎動物動物と共に用いられる。本発明と共に用いられる無脊椎動物細胞の例として、昆虫（例えば、ショウジョウバエ、ゴキブリ、カ、甲虫、ガ、チョウ）および線虫（例えば、Ｃ． エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））が挙げられるが、これに限定されない。実際に、本発明は任意の特定の種に由来する細胞に限定されることが意図されない。様々なクラスの動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、および昆虫）に由来する細胞を細胞培養する方法および技術が当業者に周知であるので、当業者は、本発明が任意の動物供給源に由来する細胞との使用に適していることを理解する。
【００４３】
動物細胞に加えて、本発明は他の真核細胞と共に用いられ、他の真核細胞として菌類細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、本発明は、酵母（例えば、カンジタ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ））ならびにカビ（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、パラコクシジオデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）など）と共に用いられる。従って、本発明は、二形性菌類ならびに形が一つしかない菌類種（すなわち、カビまたは酵母）との使用を含む。
【００４４】
動物細胞に加えて、本発明は植物から得られた細胞と共に用いられ、植物としてイネ、タバコ、トウモロコシ、シロイヌナズナが挙げられるが、これに限定されない。実際に、本発明は、農業に有用な植物（例えば、食料および飼料用の穀物）ならびに園芸に有用な植物（例えば、装飾用の植物および花）、および野生植物と共に用いられる。本発明は、任意の特定の植物または植物タイプに限定されることが意図されない。さらに、様々な植物細胞（例えば、根、茎、葉、花など）が本発明と共に用いられる。
【００４５】
さらに、本発明は、様々な器官および組織（例えば、皮膚、呼吸器系、消化器系、尿路、生殖路、循環系、骨格系、感覚系（例えば、視覚、嗅覚、味覚など）、筋肉、および結合組織に由来する細胞と共に用いられる。さらに、本発明は、様々な発生学的な細胞タイプおよび発生の様々な段階にある細胞（例えば、幹細胞、卵母細胞、接合子、胞胚腔、線維芽細胞など）と共に用いられる。従って、本発明は任意の特定のタイプの細胞に限定されることが意図されない。実際に、様々な器官、組織、および身体の系（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、および昆虫）に由来する細胞を細胞培養する方法および技術が当業者に周知であるので、当業者は、本発明が任意の供給源に由来する細胞との使用に適していることを理解する。
【００４６】
本発明は、正常な真核細胞および原核細胞ならびに異常細胞（例えば、癌細胞、アポトーシスを受けている細胞、変異体細胞、前癌細胞、罹患細胞など）と共に用いられる。病原性生物または他の生物（例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生生物、菌類など）に感染している細胞もまた本発明と共に用いられる。従って、本発明は、任意の特定の発生段階（例えば、胎児、成人、老人の細胞）または任意の特定の健康状態の細胞に限定されることが意図されない。変異体細胞（例えば、天然に生じる変異体細胞）ならびに遺伝子操作された細胞（例えば、ノックアウト、ノックイン）、プラスミド含有細胞、トランスフェクトされた細胞、形質転換細胞、化学的に誘導された変異体細胞、放射線で誘導された変異体細胞などもまた本発明と共に用いられる。以下の表は、本発明と共に用いられる、いくつかのインビトロ腫瘍細胞系を示す。しかしながら、本発明は、本明細書に列挙したいくつかの細胞系に限定されることが意図されない。
【００４７】
【表２】インビトロヒト腫瘍細胞系の例

【００４８】
本発明は培養細胞と共にさらに用いられ、培養細胞として初代培養細胞、細胞系、細胞株、および細胞培養において維持される他の細胞が挙げられるが、これに限定されない。非常に多くの細胞系および細胞株が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）などの寄託機関から入手することができる。例えば、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫ、Ａ−９、ＨＦＦ、ＣＨＯ、ＭＲＣ−５、ＨｅＰ−２、ＣＶ−１、ＢＧＭＫ、ＢＨＫ、ＢＨＫ−２１、Ａ５４９、ＭｖｌＬｕ、ＨＥＫ−２９３、ＨＴ−２９、ＭＣＦ−７、ＡＣ−１３３、ＣＤ−４、Ｃ３Ａ、ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１、ＫＢ、３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、ＩＭＲ−９０、Ｆ９、ＰＣ１３、ＬＮＣａＰ、ＰＣ−３、ＵＳ７、ＨＵＨ−７、ＮＣＩ−４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＭＢ−ＭＤＡ−２３７、ＨＭＥ、ＭＫＮ４５、ＣＤ８０−ＡＴ、Ａ２７８０、ＯＶＣＡＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＢＳ−１ＬＢ、ＭＣＦ−１０、Ｒａｔ−１、ＲＴＳ３４Ｓｔなどの細胞系、ならびに本物の細胞および培養系において維持される他の細胞。
【００４９】
さらに、本発明は、選択マーカーを含む細胞と共に用いられる（すなわち、抗生物質または薬物に対する耐性を、選択マーカーが発現される細胞に付与する酵素活性をコードする遺伝子が用いられる）。選択マーカーは「優性」でもよい。優性選択マーカーは、任意の哺乳動物細胞系において検出することができる酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例として、哺乳動物細胞に薬物Ｇ４１８耐性を付与するアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、ミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を付与する細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ遺伝子とも呼ばれる）が挙げられる。他の選択マーカーは、関連する酵素活性を欠く細胞系と共に使用しなければならない点で優性でない。非優性選択マーカーの例として、ｔｋ⁻細胞系と共に用いられるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞（すなわちＵｒｄＡ変異体）と共に用いられるｃａｄ遺伝子（すなわち、新規ウリジン生合成の最初の３つの酵素活性を有するＣＡＤタンパク質をコードする）、およびｈｐｒｔ⁻細胞系と共に用いられる哺乳動物ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞系における選択マーカーの使用の概要は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）（サンブルックら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９８９］、１６．９−１６．１５頁）に示されている。
【００５０】
本発明は、当技術分野において一般的に用いられ、多くの科学用品供給元（例えば、バイオログ（Ｂｉｏｌｏｇ）、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）など）から市販されているマイクロタイタープレート（「マイクロプレート」または「マイクロプレート（ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ）（商標）」マイクロタイタープレート）と構造が本質的に似たマルチウェル試験装置の使用を意図する。本発明は、様々な試験形式を含むことも意図される。従って、標準的なマイクロタイタープレート試験法に加えて、本発明は、様々なゲル化剤（米国特許第５，６２７，０４５号、同第５，８８２，８８２号、および同第５，９８９，８５３号に記載のようなアルギナート、カラゲーナン、およびゲランガム（例えば、ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（商標）および／またはフィタゲル（Ｐｈｙｔａｇｅｌ）（商標））が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに米国特許第５，５８９，３５０号および同第５，８００，７８５号に記載のマイクロカード（ＭｉｃｒｏＣａｒｄ）（商標）小型試験プレートと共に用いられることが意図される（これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる）。
【００５１】
従って、１つの態様において、マイクロプレート（例えば、マイクロプレート（商標）マイクロタイタープレート）形式が用いられる。この態様において、マイクロプレート（商標）、マイクロカード（商標）、または別の容器のウェルを接種するために、懸濁細胞を含むゲル形成マトリックスが用いられる。接種の際に、ゲル形成マトリックスは液状であり、そのため、懸濁液を区画に容易に分配することができる。これらの区画は乾燥した生化学物質およびカチオンを含んでいる。ゲル形成マトリックスとカチオンが接触すると、懸濁液は固化して軟らかいゲルを形成し、細胞は均一に分配される。このゲルは、懸濁された細胞を保持するのに十分に粘度があるか、または硬く、その結果、細胞はウェルまたは試験アレイの底に沈まない。
【００５２】
別の態様において、マイクロカード（商標）小型試験形式が用いられる。本発明の装置の１つの態様は、試料が導入される液体入口を有するハウジングを含む。ハウジングはさらに、液体が複数のウェルまたは区画に流れるように試験領域と連絡する流路を含む。流路は、ウェルの一面を形成するように合わせられ、ハウジングの一方の側に取り付けられた、ガスを逃がす疎水性膜の面で囲まれている。ハウジングは、その反対側で、固形基剤によって封止されてもよい。他の態様において、可撓性のあるテープを固形基剤の代わりに用いてもよく、固形基剤をハウジングと一体になるように成形してもよい。
【００５３】
装置を、細胞を含む溶液またはゲル形成マトリックスで満たした後、装置内のゲルマトリックスがガスを逃がす膜を通って蒸発しないように装置を封止するために、テープ（例えば、ポリエステルフィルム）などのガスを逃がさない任意の材料を、ガスを逃がす膜の外面に貼り付けてもよい。供給の際に、懸濁細胞を含むゲル形成マトリックスは液状である。一度試験領域に存在するゲル開始化合物と液体が接触すると、ゲルマトリックスが生成され、懸濁細胞をトラップする。
【００５４】
本発明はキットとして使用するのに特に適している。特に、キットの形をとる本発明は、哺乳動物、昆虫、および植物の細胞に加えて一般的に単離される細菌ならびに放線菌および菌類（すなわち、酵母およびカビ）を含む様々な細胞の容易かつ迅速な表現型試験に適している。特に、本発明は、細胞を表現型分析するための（特に、候補となるＢＡＣ活性を有する様々な化合物に対する細胞の感受性および耐性を分析するための）組成物および方法を提供する。
【００５５】
本発明のＰＭは視覚的に読み取られることが意図されるが、その一方で、アッセイの結果を読み出し、読み取るのに計器が用いられることも意図される。例えば、試験パネルを読み出すための実用的で、効率的な、かつ費用効率が高いシステムが、参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第０９／２７７，３５３号で述べられている。この計器を用いると、細胞および細胞系を数千もの表現型について直接的かつ同時に分析するのが容易になる。本発明は、原核細胞ならびに真核細胞を表現型分析するための方法および組成物を提供する。実際に、本発明は、任意の特定の生物、細胞、または試験形式に限定されない。
【００５６】
多くの態様において、本発明は１つまたはそれ以上の試験パネルを提供し、各試験パネルは９５の表現型試験のための基質を含んでいる。特に、本発明は非常に多くのＢＡＣ化合物の試験を可能にする。しかしながら、本発明は特定の試験数に限定されることが意図されない。例えば、現在入手できるパネルの中には、１つのアレイにおいて３８４個または１５３６個の基質を試験できるものもある。従って、本発明は非常に多くのＢＡＣ化合物の試験を可能にする。しかしながら、本発明は１つのＢＡＣ化合物の試験だけに限定されることが意図されない。従って、本発明は、様々な細胞の表現型試験に適した任意のタイプの試験基質を有する試験パネルを含むことが意図される。実際に、本発明の方法において、個々のＢＡＣ、候補となるＢＡＣ、ＢＡＣの組み合わせ、および他の基質（例えば、炭素源または窒素源）と共に試験されるＢＡＣを含む、基質の組み合わせが用いられることが意図される。
【００５７】
定義
本明細書および特許請求の範囲における「試料」および「標本」という用語は、それらの最も広い意味で用いられる。他方で、これらの用語は、標本または培養物を含むことが意図される。他方で、これらの用語は生物学的試料および環境試料を含むことが意図される。これらの用語はヒトおよび他の動物から得られる全てのタイプの試料を含み、試料として体液（例えば、尿、血液、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、および唾液）ならびに固形組織が挙げられるが、これに限定されない。これらの用語はまた、微生物培養用の試料を得るために一般的に用いられるスワブおよび他のサンプリング装置を意味する。
【００５８】
生物学的試料は、ヒトを含む動物、液体または組織、食品および食品成分（例えば、乳製品、野菜、肉および肉以外の有用な部分）、ならびに廃棄物でもよい。環境試料として、環境物質（例えば、表層物質、土壌、水、および産業試料）、ならびに食品および乳製品を加工する計器、装置、設備、使い捨て製品、および使い捨てでない製品から得られた試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用できる試料のタイプを限定すると解釈されるべきでない。
【００５９】
生物学的試料でも環境試料でも、微生物を「純粋培養」するために、まず最初に、微生物を含むと考えられる試料を濃縮手段にかけてもよく、かけなくてもよい。「濃縮手段」または「濃縮処理」によって、本発明は、（ｉ）液体、固形、半固形、または他の任意の培地および／または技術によって他の微生物から目的の特定の微生物を単離する従来の技術、ならびに（ｉｉ）他の微生物から特定の微生物を単離する新規の技術を意図する。本発明は、１つの濃縮段階または濃縮手段のタイプだけに限定されることが意図されない。例えば、試料を従来の濃縮手段にかけた後に、目的の種の株の純粋培養物が得られるように、結果として得られた調製物をさらなる精製にかけることは本発明の範囲内である。次いで、この純粋培養物を本発明の培地および方法によって分析してもよい。
【００６０】
本明細書で使用する「初代単離」という用語は、試料から直接、生物を培養するプロセスを意味する。従って、初代単離は、培養スワブ、尿試料、環境試料などから寒天プレートを接種するようなプロセスを伴う。初代単離は、固形または半固形寒天培地を用いて、または液体中で行われてもよい。本明細書で使用する「単離」という用語は、初代培養でもその後のいずれの培養（維持および／または使用のための生物の保存培養物の「継代」または「移動」を含む）でも生物の任意の培養を意味する。
【００６１】
本明細書で使用する「培養物」という用語は、１つまたはそれ以上の種類の微生物または細胞を含むと考えられる任意の試料または標本を意味する。特に好ましい態様において、この用語は細菌および菌類に関して用いられる。「純粋培養物」は、存在する生物が特定の属および種の１種類の株しかない培養物である。これは、１種類を超える微生物の属および／または種が存在する培養物である「混合培養物」と対照をなしている。
【００６２】
本明細書で使用する「真核生物」という用語は、単位膜に結合した（すなわち、真の）核を有し、通常、他の細胞小器官を有する細胞または生物を意味する。ほとんどの真核生物には、ヒストンと複合体化し、数本の染色体に存在するＤＮＡがある。真核生物として、藻類、菌類、原生動物、植物、および動物が挙げられる。本発明は、任意の特定の真核細胞または真核生物に限定されることが意図されない。実際に、この用語は、一般的に真核細胞に関連した特徴を有する任意の生物または細胞を含むことが意図される（例えば、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）ら（編）「微生物生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」第７版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ［１９９４］、８６−８７頁を参照のこと）。
【００６３】
本明細書で使用する「原核生物」という用語は、単位膜に結合した（すなわち、真の）核および他の細胞小器官を欠く（すなわち核小体がない）、一般的に、単一の環状ＤＮＡからなるゲノムを有する生物または細胞を意味する。ほとんどの場合、細胞壁が存在する。原核生物として、細菌（すなわち、真正細菌）および原始の細菌（すなわち、古細菌）が挙げられる。本発明は、任意の特定の原核細胞または原核生物に限定されることが意図されない。実際に、この用語は、一般的に原核細胞に関連した特徴を有する任意の生物または細胞を含むことが意図される（例えば、ブロックら（編）「微生物生物学」、第７版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ［１９９４］、８６−８７頁を参照のこと）。
【００６４】
本明細書で使用する「生物」という用語は微生物の任意の種またはタイプをいうために用いられ、微生物として細菌、酵母、および他の菌類が挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用する「菌類」という用語は、二形性菌類を含むカビおよび酵母などの真核生物に関して用いられる。
【００６５】
本明細書で使用する「胞子」という用語は、細菌、菌類、藻類、原生動物などの生物によって無性生殖で生じた（例えば、分生胞子）または有性生殖で生じた任意の形態の生殖要素を意味する。これはまた、過酷な環境条件下での生存に関して個々の細胞に有利な点をもたらす、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の一員などの微生物内の構造に関して用いられる。この用語は、「内生胞子」または「外生胞子」などの胞子の任意の特定のタイプまたは位置に限定されることが意図されない。もっと正確に言うと、この用語は最も広い意味で用いられる。
【００６６】
本明細書で使用する「微生物培地」および「微生物培養培地」および「培地」という用語は、微生物の増殖および再生のための任意の培養基を意味する。「培地」は、微生物増殖を支援する、プレートに入れられた固形培地に関して用いられてもよい。また、この定義には、半固形および液体の微生物増殖システム（生きている宿主生物を取り込んだシステムを含む）ならびに任意のタイプの培地も含まれる。
【００６７】
本明細書で使用する「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、インビトロでの細胞増殖（すなわち、細胞培養）を支援するのに適した培地を意味する。この用語は任意の特定の細胞培養培地に限定されることが意図されない。例えば、この定義は成長培地ならびに維持培地を含むことが意図される。実際に、この用語は目的の細胞培養物の増殖に適した任意の培養培地を含むことが意図される。
【００６８】
本明細書で使用する「限定培地」という用語は、成分が既知の培地を意味する。例えば、この用語は、組成が既知の特定の成分を用いて調製された合成培地を含む。しかしながら、本発明は、任意の特定の培地または培地のタイプに限定されることが意図されない。さらに、本発明は、追加の特徴付けられていない成分を含む限定培地を含む（すなわち、限定培地は基本培地であり、これに様々な化合物が添加される）。限定培地とは対照的に、「非限定培地」は、特徴付けられていない、または未知の構成成分（例えば、トリプカーゼソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、酵母エキス、血清、血漿など）を含む培地である。
【００６９】
本明細書で使用する「単層」、「単層培養」、および「単層細胞培養」という用語は、培養基に付着しており、細胞一つ分の厚さの層として増殖する細胞を意味する。単層は、フラスコ、チューブ、カバーガラス（例えば、シェルバイアル）、ローラーボトルなどが挙げられるが、これに限定されない任意の様式中で増殖されてもよい。細胞はまた、ビーズが挙げられるが、これに限定されないマイクロキャリアに付着して増殖されてもよい。
【００７０】
本明細書で使用する「コンフルエント」という用語は、細胞で覆われていない培養基がないように互いに接触している付着細胞を意味する。
【００７１】
本明細書で使用する「付着」という用語は、「足場依存性」であり（すなわち、生存および／または増殖のために固形培養基または表面への接着を必要し）、固形培養基に接着している細胞を意味する。対照的に、「足場非依存性」細胞は、生存および／または増殖のために固形培養基または表面への接着を必要としない。
【００７２】
本明細書で使用する「接触阻止」という用語は、細胞が他の隣接する細胞と完全に接触している（例えば、コンフルエントな培養状態にある）時の、細胞膜の波打ち運動および細胞運動の阻止を意味する。この段階の後に細胞増殖が停止することが多いが、この２つは必ずしも因果関係があるとは限らない。
【００７３】
本明細書で使用する「懸濁液」および「懸濁培養」という用語は、培養基に接着せずに生存および増殖する細胞を意味する。懸濁培養は、一般的に、造血細胞、形質転換細胞系、悪性腫瘍に由来する細胞を用いて生成される。
【００７４】
本明細書で使用する「マイクロキャリアビーズ」という用語は、細胞の接着および増殖に適したビーズを意味する。これらのビーズは市販されており、培養における細胞の増殖および維持に一般的に用いられている。特に好ましい態様において、細胞をビーズに接着させ、液体増殖培地に入れて増殖させる。従って、ある態様において、細胞を懸濁液中で増殖させるが、マイクロキャリアビーズに接着させる。
【００７５】
本明細書で使用する「細胞タイプ」という用語は、細胞の供給源または特徴にかかわらず任意の細胞を意味する。
【００７６】
本明細書で使用する「細胞系」という用語は、初代細胞系、有限継代性細胞系、連続継代性細胞系、および形質転換細胞系を含むインビトロで培養された細胞を意味する。
【００７７】
本明細書で使用する「初代細胞培養」および「初代培養」という用語は、動物、植物、または昆虫の組織から直接得られた細胞培養物を意味する。これらの培養物は成人ならびに胎児の組織から得られてもよい。
【００７８】
本明細書で使用する「有限継代性細胞系」という用語は、老化の前に有限数の集団倍加が可能な細胞培養物を意味する。
【００７９】
本明細書で使用する「連続継代性細胞系」という用語は、無限の寿命を有する細胞培養物を意味する。自然形質転換から生じた細胞系もあれば、操作によって（例えば、テロメリゼーション（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって）得られた細胞系もある。多くの場合、この細胞は、初代細胞系または有限継代性細胞系の細胞集団が外見上増殖を止める「危機」期を経ているが、それにもかかわらず細胞サイズが小さく、増殖速度が速く、クローニング効率が高く、腫瘍形成性が増大し、様々な染色体組があるという一般的な特徴を有する細胞集団が現れる。これらの細胞はインビトロでの自然形質転換から生じる場合が多い。これらの細胞は無限の寿命を有する。
【００８０】
本明細書で使用する「形質転換細胞系」という用語は、前記のような特徴を有する連続継代性細胞系に形質転換されている細胞培養物を意味する。形質転換細胞系は腫瘍組織から直接得られてもよく、また、ウイルス全体（例えば、ＳＶ４０もしくはＥＢＶ）またはベクター系を用いて形質転換ウイルスから得られたＤＮＡ断片を用いた細胞のインビトロ形質転換によって得られてもよい。
【００８１】
本明細書で使用する「混合細胞培養」という用語は２種類の細胞の混合物を意味する。ある態様において、細胞は遺伝子操作されていない細胞系であるのに対して、他の好ましい態様において、細胞は遺伝子操作されている細胞系である。
【００８２】
本明細書で使用する「栄養要求株」という用語は、栄養剤（例えば、増殖因子）の存在下でのみ増殖することができる生物または細胞系に関して用いられる。従って、栄養要求性試験において、栄養要求株は、その増殖に必要な１つまたはそれ以上の栄養剤の存在下でしか増殖せず、必要な１つまたはそれ以上の栄養剤を欠く培地では増殖しない。
【００８３】
本明細書で使用する「炭素源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のための炭素の供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。炭素源は様々な形をとってもよく、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、およびペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用する「窒素源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のための窒素の供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。炭素源と同様に、窒素源は、遊離窒素ならびに窒素含有化合物などの様々な形をとってもよく、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、および窒素塩が挙げられるが、これに限定されない。
【００８５】
本明細書で使用する「リン源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のためのリンの供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。他の元素（例えば、炭素および窒素）の供給源と同様に、リン源は、遊離リンならびにリン含有化合物などの様々な形をとってもよい。
【００８６】
本明細書で使用する「硫黄源」という用語は、細胞の増殖および／または代謝のための硫黄の供給源として利用することができる任意の化合物に関して用いられる。炭素源、窒素源、およびリン源と同様に、硫黄源は、遊離硫黄ならびに硫黄含有化合物などの様々な形をとってもよい。
【００８７】
本明細書で使用する「増殖刺激栄養分」という用語は、生物の増殖を促進する任意の化合物に関して用いられる。本発明は任意の特定の増殖刺激栄養分に限定されることが意図されないが、特に好ましい態様において、本発明は、増殖因子、アミノ酸、核酸前駆体、脂質、細胞膜および細胞壁前駆体、ビタミン、ホルモン、無機質、ならびに細胞増殖を刺激する他の要素および化合物の使用を意図する。
【００８８】
本明細書で使用する「薬物」という用語は、生物学的活性を有する任意の化合物を意味する。ある態様において、この用語は抗菌剤に関して用いられるが、抗菌剤に限定されることが意図されない。実際に、この用語は、細胞の成長、代謝、および／または増殖を変える化合物、ならびに微生物および／または他の細胞（例えば、動物細胞）に影響を及ぼす化合物を含む。従って、この用語は、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、吐剤、制吐剤、ならびに生物系および／または細胞に影響を及ぼす他の化合物などの化合物を含む。
【００８９】
本明細書で使用する「抗菌剤」という用語は、微生物の増殖を阻害するか、または微生物を死滅させる任意の化合物に関して用いられる。この用語はその最も広い意味で用いられ、天然に産生されるか、または合成によって製造される抗生物質などの化合物を含むが、これに限定されないことが意図される。この用語は、微生物の増殖を阻害するか、または微生物を死滅させるのに有用な他の任意の有機化合物および無機化合物を含むことも意図される。
【００９０】
本明細書で使用する「試験基質」という用語は、生化学的特徴に基づいて細菌を区別するのに利用することができる任意の栄養源（例えば、炭素源、窒素源、リン源、および硫黄源、ならびに増殖刺激栄養分、抗菌剤、および色素生成基質）に関して用いられる。例えば、ある細胞種は、別の種に利用されない試験基質を利用することができる。次いで、これらの２つの種を区別するために、この利用を用いることができる。非常に多くの試験基質を組み合わせて用いられることが意図される。試験基質は個々に試験されてもよく（例えば、試験ウェルもしくは試験区画または試験領域１つにつき１つの基質）、組み合わせて試験されてもよい（例えば、複数の試験基質が一緒に混合され、「カクテル」として供給される）。
【００９１】
本明細書で使用する「ＢＡＣ」という用語は、細胞に影響を及ぼす任意の化合物に関して用いられる。この影響は、細胞の増殖または呼吸の刺激または阻害でもよく、任意の細胞成分への結合でもよく、細胞の任意の機能またはタンパク質触媒活性の活性への影響でもよい。従って、本発明は任意の化合物または化合物クラスに限定されることが意図されない。実際に、本発明のＢＡＣは特定の細胞に影響を及ぼす任意の化合物を含む。
【００９２】
試験基質（例えば、１つまたはそれ以上のＢＡＣ、炭素源または窒素源など）に曝露した後、生物または細胞系の応答を検出することができる。この検出は視覚（すなわち、目）によるものでもよく、１つまたはそれ以上の機械（例えば、バイオログマイクロステーションリーダー（Ｂｉｏｌｏｇ ＭｉｃｒｏＳｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ）（商標））を用いて行われてもよい。例えば、炭素源に対する生物の応答を、生物が試験基質を利用したことによる懸濁液中の濁りとして検出することができる。同様に、あるＢＡＣによって生物が阻害されない指標として増殖を用いることができる。１つの態様において、生物の増殖／代謝の有無を示すために、色が用いられる。
【００９３】
本明細書で使用する「比色指示薬」という用語、反応が起こったことを、または細胞もしくは生物が特定の化合物を代謝できることを色の変化によって示すのに用いられる任意の化合物を意味する。これは、藍色、青色、赤色、黄色、緑色、オレンジ色、茶色などの「色」の従来の意味で用いられるような任意の色、ならびに蛍光によって検出可能な色（例えば、フルオレセインの黄緑色、ローダミンの赤色など）を生じる蛍光化合物または蛍光原化合物を含むが、これに限定されない。色素（例えば、ｐＨおよびレドックス）ならびに発光原化合物などの他の指示薬が、この定義に含まれることが意図される。好ましい態様において、本発明の比色指示薬として、色素生成基質、酸化還元指示薬、およびｐＨ指示薬が挙げられるが、これに限定されない。ある特に好ましい態様において、酸化還元指示薬はテトラゾリウムバイオレットであるのに対して、他の態様では、レドックスパープルである。比色指示薬は視覚的に、または装置もしくは機械（例えば、色彩計、光度計、もしくはカメラ）によってモニターすることができる。
【００９４】
本明細書で使用する「色素生成化合物」および「色素生成基質」という用語は、その光吸収または発光の特徴によって検出システムにおいて有用な任意の化合物を意味する。この用語は、視覚的にまたは光学機械を用いて検出することができる、任意の酵素切断産物（可溶性および不溶性）を含むことが意図される。名称「色素生成」には、色の変化として検出することができる最終生成物を生成する全ての酵素基質が含まれる。これは、藍色、青色、赤色、黄色、緑色、オレンジ色、茶色などの「色」の従来の意味で用いられるような任意の色、ならびに蛍光によって検出可能な色（例えば、フルオレセインの黄緑色、ローダミンの赤色など）を生じる蛍光化合物または蛍光原化合物を含むが、これに限定されない。色素（例えば、ｐＨおよびレドックス）ならびに発光原化合物などの他の指示薬が、この定義に含まれることが意図される。
【００９５】
本明細書で使用する「ｐＨ指示薬」、「レドックス指示薬」、および「酸化還元指示薬」という用語の一般的に用いられる意味が意図される。従って、「ｐＨ指示薬」は、ｐＨ変化の検出に一般的に用いられる全ての化合物を含む。ｐＨ指示薬として、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクロロフェノールブルー、ｍ−クレゾールパープル、チモールブルー、ブロモクレゾールパープル、キシレノールブルー、メチルレッド、メチルオレンジ、およびクレゾールレッドが挙げられるが、これに限定されない。「レドックス指示薬」および「酸化還元指示薬」という用語は、酸化還元電位（すなわち「ｅＨ」）の検出に一般的に用いられる全ての化合物を含む。この指示薬として、様々なタイプまたは形態のテトラゾリウム、レサズリン、メチレンブルー、およびキノンイミドレドックス色素（「メチルパープル」およびメチルパープル誘導体として知られる化合物を含む）が挙げられるが、これに限定されない。メチルパープルとして知られるキノンイミドレドックス色素は、本明細書で「レドックスパープル」（例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，８８２，８８２号を参照のこと）と呼ばれる。特に好ましい態様において、「レドックスパープル」は、米国特許第５，８８２，８８２号の図５、ＩＶに示される化学構造を有する化合物を含む。特性（例えば、溶解度、細胞浸透性、毒性）が改変された、および／または色／吸収波長が改変された、試薬の類似する誘導体（例えば、アルカリ塩、アルキルＯ−エステル）が、添付の実施例に記載の方法にわずかに変更を加えた方法を用いて生成されることが意図される。本発明において、レドックス指示薬として様々な形態の「レドックスパープル」（例えば、塩など）を効果的に併用できることも意図される。
【００９６】
本明細書で使用する「試験手段」および「試験装置」という用語は、少なくとも１つの生物が少なくとも１つの特徴（例えば、特定の炭素源、窒素源、もしくは色素生成基質の利用、および／またはＢＡＣ薬剤に対する感受性）について試験される試験システムに関して用いられる。この定義は、反応混合物、懸濁液、または試験を含む任意の適切な手段を含むことが意図される。この用語は、マイクロプレート、ペトリ皿、マイクロカード装置、または使用に適した他の任意の支援構造を含むことが意図される。例えば、少なくとも１つのゲル化開始剤が複数のウェルまたは区画のそれぞれに含まれるマイクロプレートが試験手段を構成する。試験手段の他の例として、ゲル開始手段がウェルに含まれないマイクロプレートが挙げられる。炭素源またはＢＡＣなどの他の化合物が区画内に含まれることも意図される。この定義は、微生物を特徴付けるためのマイクロプレート（商標）マイクロタイタープレート（バイオログから入手可能）を含む。この定義はまた、機能が似ているが、標準的なマイクロタイタープレートよりかなり小さい「マイクロカード」または小型プレートもしくはカード（例えば、多くの試験装置は都合よく使用者の手で保持することができる）を含むことが意図される。特に好ましい態様において、マイクロカードは、米国特許第５，５８９，３５０号および同第５，８００，７８５号（両方とも参照として本明細書に組み入れられる）に記載のマイクロカード（商標）装置（バイオログから入手可能）である。本発明は、特定のサイズまたは配置の試験装置または試験手段に限定されることが意図されない。例えば、様々な形式が本発明と共に用いられることが意図される。形式として、マイクロタイタープレート（マイクロプレート（商標）が挙げられるが、これに限定されない）、小型試験プレート（例えば、マイクロカード（商標）小型試験カード）、ペトリプレート、プレート内に入れられる別個の異なる培地を分けるために用いられる内部分配器を備えたペトリプレート、試験管、ならびに他の多くの形式が挙げられるが、これに限定されない。
【００９７】
本明細書で使用する「ゲル化剤」という用語は広い一般的な意味で用いられ、天然供給源から得られた化合物ならびに合成によって調製された化合物を含む。本明細書で使用する、この用語は、ある特定の条件が満たされた時に少なくとも部分的に固化する任意の物質を意味する。例えば、この定義に含まれるゲル化剤の１つは、二価カチオン（例えば、Ｍｇ^２＋またはＣａ^２＋）に曝露されるとゲルを形成するゲランであるゲルライト（商標）である。ゲルライト（商標）は、シュードモナス・エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）によって産生された天然多糖を脱アセチル化することによって生成されるゲランガムであリ、カン（Ｋａｎｇ）ら（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第４，３２６，０５２号および同第４，３２６，０５３号）によって述べられている。
【００９８】
この定義には、タンパク質ベースのゲル化剤ならびに炭水化物ベースのゲル化剤を含む、天然供給源から得られた様々なゲル化剤が含まれる。一例は、ケルプから抽出される多糖複合体である細菌学用寒天である。この定義には、ゼラチン（例えば、コラーゲンから得られる高分子量タンパク質の水溶性混合物）、ペクチン（例えば、植物から得られる多糖類）、カラゲーナンおよびアルギン酸（例えば、海草から得られる多糖類）、ならびにゴム（例えば、ある植物および細菌からの粘着性分泌物）などの化合物も含まれる。様々なカラゲーナン調製物が本発明において用いられることが意図され、ιカラゲーナンが好ましい態様を構成する。本発明において用いられるゲル化剤は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ＢＢＬ、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）、マーコール（Ｍａｒｃｏｒ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、または他の供給元などの供給会社から市販され入手できることも意図される。
【００９９】
「ゲル化剤」という用語は、硬いゲル物質を形成する化合物に限定されることが意図されない。単に、とろみがあるか、または粘性のあるコロイド懸濁液から、硬いゲルまでの範囲が意図される。また、本発明は懸濁液がゲル化するのにかかる時間に限定されることが意図されない。
【０１００】
重要なことに、本発明は、生物が増殖することができるマトリックス（すなわち、「ゲルマトリックス」）の生成に適したゲル化剤を提供することが意図される。本発明のゲルマトリックスは、生物をゲル化剤を含有する水溶液と混合し、この懸濁液をゲル化開始剤に曝露した時に生成される、生物のコロイド型懸濁液である。このコロイド型ゲル懸濁液は、重力の影響によってマトリックスから沈殿することなく、生物が均一に分散されている連続マトリックス培地であることが意図される。ゲルマトリックスは、ゲル懸濁液の内部で、ゲル懸濁液の下部で、およびゲル懸濁液の上部で生物の増殖を支援する。
【０１０１】
本明細書で使用する「ゲル化開始剤」という用語は、ゲル化剤をある特定の条件または試薬に曝露した後にゲルマトリックス形成をもたらす任意の化合物または要素を意味する。「ゲル化開始剤」は、カチオン（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、およびＫ^＋）などの試薬を含むことが意図される。ゲル化剤が少なくとも１つのゲル化開始剤と接触するまで、ゲル化剤を含む懸濁液は「ゲル化しない」ままである（すなわち、懸濁液はとろみがつかず、粘度が増えず、固化しない）。接触後、懸濁液は粘性を帯び、硬いゲルを形成してもよく、形成しなくてもよい（すなわち、接触により「ゲル化」が起こる）。
【０１０２】
本明細書で使用する「接種懸濁液」または「接種物」という用語は、試験しようとする生物を接種することができる懸濁液に関して用いられる。「接種懸濁液」という用語は、特定の液体または液体物質に限定されることが意図されない。例えば、接種懸濁液は、少なくとも１つのゲル化剤を含む、水、食塩水、または水溶液からなってもよい。接種懸濁液は、水、食塩水、または任意の水性材料が添加される成分を含んでもよいことも意図される。１つの態様において、この成分は、目的の微生物に有用な少なくとも１つの成分を含むことが意図される。本発明は特定の成分に限定されることが意図されない。
【０１０３】
本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の材料の組み合わせに関して用いられる。キットは、ＢＡＣ、炭素源、窒素源、色素生成基質、希釈剤、および他の水溶液などの試薬、ならびに専用のマイクロプレート（例えば、バイオログから得られるＧＮ、ＧＰ、ＥＳ、ＹＴ、ＳＦ−Ｎ、ＳＦ−Ｐ、および他のマイクロプレート（商標））、接種物、小型試験カード（例えば、マイクロカード（商標））、およびプレートに入れられた寒天培地を含んでもよいことが意図される。本発明は、微生物の増殖、同定、および／またはＢＡＣ感受性決定に有用な他の試薬を意図する。例えば、キットは、キット成分の接種後に、微生物の増殖を検出するための試薬を含んでもよい（例えば、テトラゾリウムまたはレサズリンが本発明のある態様に含まれる）。「キット」という用語は、試薬および／または他の材料の特定の組み合わせに限定されることが意図されない。さらに、生物を、寒天表面またはブロスなどの予め成形したマトリックス上にまたはマトリックス中に接種することを伴う方法およびキットとは対照的に、本発明は、生物がゲル形成マトリックス内に懸濁されている試験プレートの接種を伴う。
【０１０４】
本明細書で使用する「卵母細胞」という用語は雌性配偶子細胞を意味し、一次卵母細胞、二次卵母細胞、および成熟した未受精卵を含む。卵母細胞は、卵質で囲まれた大きな核（すなわち、胚胞）を有する大きな細胞である。卵質は、ｍＲＮＡ、リボソーム、ミトコンドリア、卵黄タンパク質などを含む、核でない細胞質成分を含んでいる。卵母細胞の膜は本明細書では「原形質膜」と呼ばれる。
【０１０５】
本明細書で使用する「成熟前卵母細胞」という用語は、（例えば、吸引によって）卵巣から単離されたが、インビトロで成熟培地に曝露されていない、卵原細胞段階後の（すなわち、有糸分裂増殖が生じた後の）雌性配偶子細胞を意味する。吸引プロセスによって卵母細胞は成熟プロセスを始めるが、インビトロでの成熟プロセスの完了（すなわち、一次極体を押し出した二次卵母細胞の形成）には吸引された卵母細胞を成熟培地に曝露することが必要なことが当業者に知られている。成熟前卵母細胞は、一般的に、減数分裂の第一後期で止まっている。
【０１０６】
本明細書で使用する「受精前卵母細胞」という用語は、インビトロで成熟培地に曝露された後であるが、精子に曝露される前の成熟前卵母細胞などの、すなわわち、成熟しているが受精していない雌性配偶子細胞を意味する。受精前卵母細胞は第一減数分裂を完了し、一次極体を放出しており、核膜がない（受精が行われるまで核膜は改造されない。受精後、二次極体の押し出しおよび雄性前核および雌性前核の形成と共に第二減数分裂が行われる）。受精前卵母細胞はまた、第二減数分裂の中期ＩＩにある成熟卵母細胞と呼ばれることもある。
【０１０７】
本明細書で使用する「未受精卵」または「未受精卵母細胞」という用語は受精していない任意の雌性配偶子細胞を意味し、これらの用語は成熟前卵母細胞および受精前卵母細胞の両方を含む。
【０１０８】
態様をいくらか詳細に説明したが、好ましい態様の多くの変更および変化が本発明から逸脱することなく可能である。
【０１０９】
実験
以下の実施例は、本発明のある特定の好ましい態様および局面を証明し、さらに例示するために示され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【０１１０】
以下の実験例開示では、以下の略語が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ＴＳＡ（トリプカーゼソイ寒天）；ＹＭＥまたはＹＥＭＥ（酵母エキス−麦芽エキス寒天；レジゲル（Ｒｅｄｉｇｅｌ）（ピーシーアールサイエンティフィック（ＲＣＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｇｏｓｈｅｎ、ＩＮ）；ゲルライト（商標）（メルクアンドカンパニー（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．）、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；レメル（Ｒｅｍｅｌ）（レメル、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；オキソイド（オキソイド、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）；ＢＢＬ（ベクトンディキンソンマイクロバイオロジーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ディフコ（ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、現在、ベクトンディキンソンの一部）；アクメディア（Ａｃｕｍｅｄｉａ）（アクメディア、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）；ユーエスバイオケミカル（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（ユーエスバイオケミカルコーポレーション（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）（フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）；シグマ（シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）；バイオログ（バイオログインク（Ｂｉｏｌｏｇ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）；ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）；ＮＣＹＣ（ナショナルコレクションオブイーストカルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ）；ＮＣＣＬＳ（国立臨床検査標準協議会）；およびモレュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（モレュラーデバイシーズ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。アミノ酸に従来用いられる３文字略語（例えば、「ａｌａ」はアラニンまたはアラニン残基を示す）もまた以下の実施例の一部において用いられる。
【０１１１】
実施例１
細菌のＢＡＣ試験
本実施例において、大腸菌（ＭＧ１６５５）の感受性を、バンコマイシン（１０μｇ／ｍｌ）またはスルファメトキサゾール（２３５μｇ／ｍｌ）の存在下で様々な追加化合物を含有するマイクロアレイにおいて試験した。マイクロアレイは、ＥＳ１、ＥＳ２、およびＥＳ３マイクロプレート（商標）と呼ばれる３種類のバイオログ（商標）感受性試験パネルにあった。０．４０％ＮａＣｌ、０．０３％プルロニックＦ６８、０．０１％フィタゲル、および０．０１％テトラゾリウムバイオレットを含有する滅菌懸濁水溶液に、８５％透過率（バイオログ（商標）濁度計を用いて測定した）の細胞密度まで生物を添加した。生物（１００μｌ／ウェル）をマイクロアレイウェルに接種する直前に、試験しようとするＢＡＣを懸濁液に添加した。これらのＥＳマイクロプレート（商標）のウェルは、トリプトン（２ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１ｇ／Ｌ）、およびＮａＣｌ（１ｇ／Ｌ）からなる基本ブロス培地を含んでいた。
【０１１２】
１個の陽性対照ウェルに加えて、ＥＳ１プレートのウェルは以下の抗菌剤を含んでいた（ウェル１個につき特定の濃度の１つの化合物）：アクリフラビン（４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、および１６μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、および１６μｇ／ｍｌ）、ナフシリン（７５μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、および６００μｇ／ｍｌ）、リンコマイシン（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、および０．８μｇ／ｍｌ）、クロロテトラサイクリン（０．１２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、および１．０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（０．０３３μｇ／ｍｌ、０．０６６μｇ／ｍｌ、０．１３３μｇ／ｍｌ、および０．２６６μｇ／ｍｌ）、ジェンタマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０ｇ／ｍｌ）、カナマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、バシトラシン（２０８μｇ／ｍｌ、４１６μｇ／ｍｌ、８３３μｇ／ｍｌ、および１６６６μｇ／ｍｌ）、クリンダマイシン（３．３μｇ／ｍｌ、６．６μｇ／ｍｌ、１３．２μｇ／ｍｌ、および２６．４μｇ／ｍｌ）、クロキサシリン（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）、ペニシリンＧ（５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌ）、ノボビオシン（３３μｇ／ｍｌ、６６μｇ／ｍｌ、１３３μｇ／ｍｌ、および２６６μｇ／ｍｌ）、スピラマイシン（５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌ）、トリメトプリム（０．１７μｇ／ｍｌ、０．３３μｇ／ｍｌ、０．６７μｇ／ｍｌ、および１．３μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．３８μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、および３．０μｇ／ｍｌ）、セファロリジン（０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０μｇ／ｍｌ）、セフロキシム（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌ）、ロキシスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、およびピペラシリン（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌ）。
【０１１３】
ＥＳ２プレートのウェルは以下の抗菌剤を含んでいた（ウェル１個につき特定の濃度の１つの化合物）。アゾマイシン（０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌ）、リファンピン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、タイロシン酒石酸塩（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）、セファゾリン（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌ）、セファロチン（２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）、セファクロール（０．６６μｇ／ｍｌ、１．３３μｇ／ｍｌ、２．６６μｇ／ｍｌ、および５．３３μｇ／ｍｌ）、リファマイシンＳＶ（１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、６．０μｇ／ｍｌ、および１２μｇ／ｍｌ）、セフスロジン（４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、および３２μｇ／ｍｌ）、セフォタキシム（０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、および０．４μｇ／ｍｌ）、セホキシチン（０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０μｇ／ｍｌ）、ピューロマイシン（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（３．５μｇ／ｍｌ、７．０μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、および２８μｇ／ｍｌ）、フシジン酸（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、ホスホマイシン（０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌ）、フレオマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、アミカシン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、イソニアジド（３００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、２４００μｇ／ｍｌ）、エチオナミド（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）、ＳＤＳ（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、ＢＩＧＣＨＡＰ（２０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、８０００μｇ／ｍｌ、および１６，０００μｇ／ｍｌ）、ニアプルーフ（ｎｉａｐｒｏｏｆ）（０．０８％、０．１６％、０．３２％、および０．６４％）、ＣＨＡＰＳ（１５００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、６０００μｇ／ｍｌ、１２，０００μｇ／ｍｌ）、およびＮ−ラウリルサルコシン（１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、および８０００μｇ／ｍｌ）。
【０１１４】
ＥＳ３プレートのウェルは以下の抗菌剤を含んでいた（ウェル１個につき特定の濃度の１つの化合物）：ナリジキン酸（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ）、タウロコール酸（６００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、２４００μｇ／ｍｌ、および４８００μｇ／ｍｌ）、コリスチン（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）、プロカイン（２５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、１０，０００μｇ／ｍｌ、および２０，０００μｇ／ｍｌ）、ジアミド（１６．６μｇ／ｍｌ、３３．３μｇ／ｍｌ、６６．６μｇ／ｍｌ、および１３３μｇ／ｍｌ）、ヒドロキシアミン（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）、グアニジン（５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、および４０００μｇ／ｍｌ）、塩化銅（ＩＩ）（２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌ）、塩化亜鉛（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、塩化カドミウム（５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および４０μｇ／ｍｌ）、塩化ニッケル（２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、および１６０μｇ／ｍｌ）、塩化クロム（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、テルル酸カリ（０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌ）、硫酸マンガン（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、塩化コバルト（１２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌ）、塩化銀（２．０μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、８．０μｇ／ｍｌ、および１６μｇ／ｍｌ）、クロム酸カリウム（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌ）、臭化カリウム（２２５μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、および１８００μｇ／ｍｌ）、シアン酸ナトリウム（１５５μｇ／ｍｌ、３１０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、および１２００μｇ／ｍｌ）、アジ化ナトリウム（５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、および４０００μｇ／ｍｌ）、ピコリン酸（５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ）、超酸化カリウム（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ）、ならびにメナジオン（３．３μｇ／ｍｌ、６．６μｇ／ｍｌ、１３．３μｇ／ｍｌ、および２６．６μｇ／ｍｌ）。
【０１１５】
第１の実験の結果から、１０μｇ／ｍｌバンコマイシンの存在下で、試験された大腸菌株は１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、および８０μｇ／ｍｌのバンコマイシンにのみ一過的な感受性増大を示したことが分かった。さらに、この株は、３３μｇ／ｍｌおよび６６μｇ／ｍｌのノボビオシン、０．１７ｎｇ／ｍｌ、０．３３ｎｇ／ｍｌ、０．６７ｎｇ／ｍｌ、および１．３ｎｇ／ｍｌのトリメトプリム、２．０μｇ／ｍｌおよび４．０μｇ／ｍｌのセファゾリン、１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのセファロチン、０．７５μｇ／ｍｌおよび１．５μｇ／ｍｌのセホキシチン、２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌのフシジン酸、ならびに１．０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、および４．０μｇ／ｍｌのナリジキン酸に対する感受性の増大しか示さなかった。正常な感受性レベルが、ＥＳ１、ＥＳ２およびＥＳ３マイクロアレイパネルにおける他の試験について観察された。
【０１１６】
結果からまた、２３５μｇ／ｍｌスフファメトキサゾールの存在下で、大腸菌株は、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５０μｇ／ｍｌ、および１．０μｇ／ｍｌのクロロテトラサイクリン、０．０３３μｇ／ｍｌ、０．０６６μｇ／ｍｌ、０．１３３μｇ／ｍｌ、および０．２６６μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、６６μｇ／ｍｌおよび１３３μｇ／ｍｌのノボビオシンに対する耐性の増大を示したが、０．１７ｎｇ／ｍｌ、０．３３ｎｇ／ｍｌ、０．６７ｎｇ／ｍｌ、および１．３ｎｇ／ｍｌのトリメトプリム、０．７５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、および６．０ｇ／ｍｌのセファロリジン、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、および１．６μｇ／ｍｌのアゾマイシン、０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ 、２．０μｇ／ｍｌ 、および４．０μｇ／ｍｌのセファゾリン、５．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌのセファロチン、１．３３μｇ／ｍｌ、２．６６μｇ／ｍｌ、および５．３３μｇ／ｍｌのセファクロール、８μｇ／ｍｌおよび１６μｇ／ｍｌのセフスロジン、２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌの塩化ニッケル、２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌの塩化クロム、ならびに１２μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの塩化コバルトに対する感受性の増大を示したことが分かった。正常な感受性レベルが、ＥＳ１、ＥＳ２およびＥＳ３マイクロアレイパネルにおける他の試験について観察された。従って、本実施例は、ＢＡＣの組み合わせを用いて相乗作用および／または拮抗作用を試験するために本発明が用いられることを明確に例示する。
【０１１７】
実施例２
抗菌剤試験
本実施例において、抗菌剤化合物の代謝影響および作用機構を分析するためにＰＭを使用することが実行可能かどうかを調べた実験について述べる。詳細に述べると、この実験は、特定の細菌タンパク質との（「標的特異的」）相互作用を介して作用する化合物を、非特異的機構を介して作用する化合物と単にシグネチャー代謝プロフィール（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ）の差に基づいて区別できるかどうかを確かめるように設計された。さらに、この実験は、同じ経路の異なる相互作用物質が似たシグネチャープロフィールを生じるかどうか、ならびに異なる経路の相互作用物質がはっきりと異なるプロフィールを生じるかどうかを確かめるように設計された。
【０１１８】
これらの実験に組み入れるために２０種類の化学物質を選択した。これらの化学物質のうち１５個は比較的特異的な作用形態を有すると考えられるが（以下の表３に「単一標的抗菌剤」として列挙した）、５つの抗菌剤は非特異的作用形態を有すると考えられる（「複数標的抗菌剤」として列挙した）。単一標的化合物の中には、細胞壁（アンピシリン、セファロチン、ホスホマイシン、およびバシトラシン）、リボソーム（クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリン）、またはＤＮＡジャイレース（ナリジキン酸、オキソリン酸、およびクーママイシン）に対する類似した作用形態を有する３組の抗菌剤ある。
【０１１９】
部分的に発育を阻止する濃度を使用することが望ましいので、各化学物質の濃度を選択するために最初の実験セットを行った。完全に発育を阻止する濃度または発育を阻止する濃度より下の濃度を用いても情報は全く得られない。テトラゾリウムバイオレット還元（すなわち、呼吸）の阻害による紫色減少の判断基準を用いて、部分的に発育を阻止する濃度を決定した。各化合物を、部分的な呼吸阻害を生じる２種類の濃度で試験した。「１×」と呼ばれる低い方の濃度は、検出可能な呼吸阻害を生じる最低濃度であった。「２×」と呼ばれる高い方の濃度は１×濃度の２倍であった。大部分の化学物質について、４×まで倍加すると、有用でない完全に発育を阻止する濃度になった。従って、１×濃度および２×濃度のみが用いられた。化学物質濃度の選択は管理に重要なパラメータであることが確かめられた。しかしながら、本明細書で用いられた選択基準は全く妥当なものであることが分かった。唯一、カナバニンは、同等の結果を生じるのにわずかに高い濃度を必要とするように見えた。濃度が適切に選択された場合、アッセイには１種類の濃度しか必要とされない。
【０１２０】
【表３】使用化合物およびその作用形態

【０１２１】
これらの実験では、大腸菌ＭＧ１６５５を２種類の濃度の２０種類の抗菌剤に対して試験した（それぞれ７個のＰＭ、合計２８０個のＰＭを使用した）。対照として抗菌剤を全く含まないＰＭ（７個一組）を毎日測定した（この合計は対照株からのデータを含まない）。これらの実験では各ＰＭは９５の表現型を含むので、ここで分析された表現型の総数は２６，６００であった。米国特許出願第０９／２７７，３５３号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載の専門の計器を用いて、４８時間のインキュベーション期間１５分毎に、各ＰＭを速度論的にモニターした。従って、この実験のデータ点の総数は５，１０７，２００であった。これらのデータを分析するためにバイオインフォマティクスソフトウェア（バイオログ（商標））を用いた。
【０１２２】
１回の測定に集められるデータの結果は、重層された抗菌剤に曝露された細胞の速度論的表現型であり、抗菌剤に曝露されていない細胞の表現型と比較される。テトラゾリウム還元（すなわち、細胞呼吸）の２つの速度論的追跡記録が重なる時、この表現型に対する応答の差はない（「０」と示される）。対照追跡記録が抗菌剤追跡記録を超えている時、生物は「感受性」すなわち「Ｓ」とスコア付けされる。抗菌剤追跡記録が対照追跡記録を超えている時、生物は「耐性」すなわち「Ｒ」とスコア付けされる。インキュベーション後のＰＭの目視検査に基づいて、Ｓ結果とＲ結果を判断するための閾値が決定された。次いで、ソフトウェアは差異的追跡記録による面積を自動的に計算し、閾値を適用して、２６，６００全ての表現型をＳ、０、またはＲとスコア付けした。
【０１２３】
Ｓ−０−Ｒデータから距離行列を作成した。ある抗菌剤のＳ−０−Ｒ応答（一連の６６５の値）を別の抗菌剤についての応答と比較し、差を合計した。０とＳの差または０とＲの差は値１とし、ＳとＲの差は値２とした。次いで、一連の６６５の差を合計した。応答が似ている抗菌剤対は差の値が少なく、応答が非常に異なる抗菌剤対は差の値が大きい。全ての対を比較すると距離行列が得られ、この距離行列は、データを単純化および要約するのを助ける様々なクラスター図を作成するアルゴリズムの入力として使用することができる。
【０１２４】
結果から、異なるクラスの抗菌剤に対する生物の応答のばらつきが大きいことが分かった。例えば、図４は、１×濃度レベルの各抗菌剤で得られたデータの系統樹を示す。４つの細胞壁阻害剤（アンピシリン、セファロチン、ホスホマイシン、およびバシトラシン）クラスターがクラスター化し、同様に、３つのリボソーム阻害剤（クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリン）もクラスター化している。また、ＤＮＡジャイレース阻害剤の３つのうち２つ（オキソリン酸およびクーママイシン）がクラスター化した。スルファチアゾールおよびポリミキシンＢを除く全ての単一標的抗菌剤が系統樹の密にクラスター化した中心にあるのに対して、カナバニンを除く全ての複数標的抗菌剤が系統樹の周辺部にある。
【０１２５】
第１に、これらの結果から、本発明は、単一標的抗菌剤と複数標的抗菌剤を区別するのに使用できることが分かる。複数標的抗菌剤は細胞を広くかつ非特異的に高感受性にするが、単一標的抗菌剤は特異的な「フィンガープリント」を有する。第２に、このフィンガープリントパターンを用いると、抗菌剤をその作用形態に基づいて首尾よく分類し、異なる作用形態を有する他の抗菌剤と区別できるように思われる。
【０１２６】
１つの場合において、結果は予想するほど単純ではなかった。この場合、ナリジキン酸は、他の２つのＤＮＡジャイレース阻害化学物質とクラスター化しなかった。これは、この薬物の作用機構の何かを示しているのかもしれない。さらに、ポリミキシンＢ、セルレニン、およびスルファチアゾールは、複数標的抗菌剤に非常によく似ているという結果を生じた。ポリミキシンＢおよびセルレニンは両方とも膜合成に影響を及ぼし、これは多くの細胞特性を破壊し、ならびに他の抗菌剤の非特異的透過を促進することができる。
【０１２７】
実施例３
酵母のＢＡＣ試験
本実施例では、様々な化合物に対する酵母の応答を試験した。これらの実験で用いられた酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４１、マーク・ジョンストン（Ｍａｒｋ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）博士、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手した）であった。この株の遺伝子型は、Ｍａｔ ａ（すなわち、交配型「ａ」）、ｕｒａ−、ｈｉｓ−、ｌｅｕ−、およびｍｅｔ−であると示された。
【０１２８】
これらの実験では、この株がメチオニンを含まない培養培地において増殖できるかどうかを調べた。メチオニンは、この生物が他の候補となる硫黄源を利用できるかを試験するのを妨げる（すなわち、メチオニンが培養培地に添加されている場合、生物は硫黄源としてメチオニンを優先的に用いる）。
【０１２９】
酵母を、Ｒ２Ａ寒天培地（アクメディア（Ａｃｕｍｅｄｉａ））上で３０℃で４８時間増殖させた。滅菌した綿棒を用いて寒天表面から細胞を取り出し、６５％透過率（バイオログ（商標）濁度計を用いて測定した）の細胞密度まで接種液（５０ｍＭグルコース、０．１５ｍＭウラシル、０．１５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、０．１５ｍＭ Ｌ−ロイシン、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．０ｍＭ ＣａＣｌ_２、２．０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＫＣｌ、３．０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１．０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、０．０１％ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、０．０１％フィタゲル（ゲランガム）、０．０３％プルロニックＦ−６８を含む）に懸濁した。ｐＨを６．０に調節した。
【０１３０】
次いで、細胞が一組９５種類の異なる栄養分によって刺激される能力を試験するバイオログ（商標）ＥＡマイクロプレート（商標）に接種するために、細胞懸濁液（１００μｌ／ウェル）を用いた。マイクロアレイに含まれる栄養分は以下の通りであった：ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、および５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）、Ｌ−アラニン（２５μＭ）、Ｌ−アルギニン（２５μＭ）、Ｌ−アスパラギン（２５μＭ）、Ｌ−アスパラギン酸（２５μＭ）、Ｌ−システイン（２５μＭ）、Ｌ−グルタミン酸（２５μＭ）、アデノシン３’，５’−環状モノリン酸（１００μＭ）、アデニン（１００μＭ）、アデノシン（１００μＭ）、２’−デオキシアデノシン（１００μＭ）、Ｌ−グルタミン（２５μＭ）、グリシン（２５μＭ）、Ｌ−ヒスチジン（２５μＭ）、Ｌ−イソロイシン（２５μＭ）、Ｌ−ロイシン（２５μＭ）、Ｌ−リジン（２５μＭ）、Ｌ−メチオニン（２５μＭ）、Ｌ−フェニルアラニン（２５μＭ）、グアノシン３’，５’−環状モノリン酸（１００μＭ）、グアニン（１００μＭ）、グアノシン（１００μＭ）、２’−デオキシグアノシン（１００μＭ）、Ｌ−プロリン（２５μＭ）、Ｌ−セリン（２５μＭ）、Ｌ−スレオニン（２５μＭ）、Ｌ−トリプトファン（２５μＭ）、Ｌ−チロシン（２５μＭ）、Ｌ−バリン（２５μＭ）、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン（各２５μＭ）、トランス−４−ヒドロキシＬ−プロリン（２５μＭ）、（５）４−アミノイミダゾール−４（５）−カルボキサミド（１ｍＭ）、ヒポキサンチン（１００μＭ）、イノシン（１００μＭ）、２’−デオキシイノシン（１００μＭ）、Ｌ−オルニチン（１００μＭ）、Ｌ−シトルリン（１００μＭ）、コリスミン酸（１００μＭ）、（−）シキミ酸（１００μＭ）、Ｌ−ホモセリンラクトン（１００μＭ）、Ｄ−アラニン（２５μＭ）、Ｄ−アスパラギン酸（２５μＭ）、Ｄ−グルタミン酸（２５μＭ）、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（２５μＭ）、シトシン（１００μＭ）、シチジン（１００μＭ）、２−デオキシシチジン（１００μＭ）、プトレッシン（２５μＭ）、スペルミジン（２５μＭ）、スペルミン（２５μＭ）、ピリドキシン（０．２５μＭ）、ピリドキサール（０．２５μＭ）、ピリドキサミン（０．２５μＭ）、β−アラニン（０．２５μＭ）、Ｄ−パントテン酸（０．２５μＭ）、オロチン酸（１ｍＭ）、ウラシル（１００μＭ）、ウリジン（１００μＭ）、２’−デオキシウリジン（１００μＭ）、キノリン酸（０．２５μＭ）、ニコチン酸（０．２５μＭ）、ニコチンアミド（０．２５μＭ）、β−ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（０．２５Ｍ）、δ−アミノ−レブリン酸（０．２５μＭ）、ヘマチン（０．２５μＭ）、メシル酸デフェロキサミン（０．２５μＭ）、グルコース（１ｍＭ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（１００μＭ）、チミン（１００μＭ）、グルタチオン（還元型；１００μＭ）、チミジン（１００μＭ）、オキサロ酢酸（１ｍＭ）、ｄ−ビオチン（０．２５μＭ）、シアノバラミン（ｃｙａｎｏｂａｌａｍｉｎｅ）（０．２５μＭ）、ｐ−アミノ安息香酸（０．２５μＭ）、葉酸（０．２５μＭ）、イノシン（１００μＭ）、チアミン（２５μＭ）、チアミン（０．２５μＭ）、チアミンピロリン酸（０．２５μＭ）、リボフラビン（０．２５μＭ）、ピロロキノリンキノン（０．２５μＭ）、メナジオン（０．２５μＭ）、ミオイノシトール（０．２５μＭ）、酪酸（１００μＭ）、ＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸（１００μＭ）、α−ケト酪酸（１００μＭ）、カプリル酸（１００μＭ）、ＤＬ−α−リポ酸（酸化型；０．２５μＭ）、ＤＬ−メバロン酸（０．２５μＭ）、ＤＬ−カルニチン（０．２５μＭ）、コリン（０．２５μＭ）、Ｔｗｅｅｎ（ツィーン）−２０（０．０１％）、ツィーン−４０（０．０１％）、ツィーン−６０（０．０１％）、およびツィーン−８０（０．０１％）。１つのウェル（Ａ−１）は栄養分を含まず、基準（すなわち、対照）ウェルとして用いる。
【０１３１】
接種後、マイクロアレイを３０℃で２日間インキュベートし、視覚的に観察した。細胞増殖を刺激した栄養分を含むウェルはどれも、細胞呼吸の増加およびヨードニトロテトラゾリウムバイオレット色素の減少のために濃いピンク色をしていた。
【０１３２】
３つのウェルが濃いピンク色を示した。これらのウェルは、Ｌ−メチオニン、グルタチオン、およびピリドキシンを含むウェルであった。メチオニンは増殖を刺激することが予想されたが、グルタチオンおよびピリドキシンは増殖を刺激し、メチオニンの代わりに使用できると予想しなかった。この場合、生物が様々な硫黄源を利用する能力が調べられていたので、グルタチオンは、これも硫黄を含むので使用することができなかった。しかしながら、ピリドキシンは硫黄を含まず、サッカロミセス・セレビシエＢＹ４７４１株の栄養分としてメチオニンの完全に満足のいく代用品として使用することができた。従って、ウラシル、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−メチオニンを含む最小培地上でＢＹ４７４１を増殖および試験する代わりに、この株を、ウラシル、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、およびピリドキシンを含む最小培地上で増殖および試験することが可能である。
【０１３３】
前記実施例から、本発明は、多くの用途および形式（または配置）におけるＢＡＣを用いた微生物および／または他の細胞タイプの広範囲で迅速な表現型アレイ試験のための、ならびに抗菌剤の開発および研究のための、予期しないかつ非常に改善したシステムであることが明らかである。さらに、一定の時点または速度論を読み取る自動システムおよび手動システムを本発明と共に用いることができる。例えば、結果は、機械の助けなしで、試験を行う人間によって視覚的に（すなわち、目で）観察されてもよい。または、結果は、マイクロタイター試験プレート（例えば、マイクロプレート（商標））または小型試験カード（例えば、マイクロカード（商標））などのマルチテスト装置の各ウェルを通る、各ウェル内の、または各ウェルからの透過率、吸光度、または反射率を測定する装置（例えば、マイクロタイタープレートリーダー）を用いて得ることができる。頻繁に間隔をあけて読み取りを行うことで速度論を読み取ってもよく、または経時的に連続して試験結果を読み取ることで速度論を読み取ってもよい。インキュベート、および本発明の方法の実施に特に適した装置の一例として、同時係属中の米国特許出願第０９／２７７，３５３号および同第０９／２６７，０３９号（両方とも参照として本明細書に組み入れられる）に記載の装置が挙げられる。
【０１３４】
マルチテストゲルマトリックスを利用する態様において、本発明は、以下を含む、先行技術より優れた非常に多くの進歩および利点をもたらす：（１）実施し、試験ウェルに接種しながら、細胞、菌糸、胞子がこぼれることもなく、またはエアロゾルにもならないので、安全性が非常に高い；（２）生化学反応が迅速に起こるので、一般的に用いられる方法より時間または日数が早く最終結果が得られる；（３）明確な生化学反応または表現型反応が得られるので、微生物の代謝特徴の正しい画像が得られる；（４）濃い、はっきりした生化学反応および色の変化が得られる；（５）細胞、菌糸、および／または胞子がウェルの底に沈殿も凝集もせず、ウェルの側面に付着しないので、均一な色および／または濁度が得られる；（６）反応が、視覚的に、または光学計器（例えば、バイオログマイクロステーションリーダー（商標））を用いて非常に観察しやすい；ならびに（７）複数の試験を行う全プロセスが極めて簡単かつ効率的であるので、生物学者側での仕事はほとんど必要とされない。これらの利点の全てが、微生物株を含む任意の細胞タイプを用いたＢＡＣの評価のための比較表現型分析を行う研究において試験結果をスコア付けする速度および精度を高める。
【図面の簡単な説明】
【図１】薬物を細胞に添加することによって細胞内の薬物標的が不活化される本発明の１つの態様の簡単な模式図である。この試験はＰＭを用いて行われる。
【図２】相乗作用薬および拮抗薬の相互作用が検出され、特徴付けられる本発明の１つの態様の簡単な模式図である。この試験もまたＰＭを用いて行われる。
【図３】マイクロタイタープレート内の様々なウェル内の環境条件およびウェル内の細胞に及ぼすこれらの条件の影響の単純化した模式図である。
【図４】様々な抗菌剤に対する大腸菌の応答を示す系統樹である。[0001]
Field of the invention
The present invention is directed to a multi-test panel for improving the effectiveness, throughput, and efficiency of testing and commercial development of biologically active compounds, especially compounds useful for human, animal, and plant health. About use.
[0002]
Background of the Invention
Biologically active chemicals (BACs) constitute a major and important family of products. These compounds are generally focused on improving the health of humans, other animals and plants. The largest market is that of drugs, especially antimicrobials and pharmaceuticals for human use. For this large market, tremendous effort and expense is spent each year in search of better and more effective BACs.
[0003]
Antimicrobial agents make up the main category of BAC. Although many antibacterial agents have been developed and marketed, there is still a great need for new antibacterial agents that act on new targets. To some extent, this need has been driven by the rapid emergence of antimicrobial-resistant pathogens. Due to the emergence of strains resistant to all available drugs (eg, enterococci) and the delay in finding new antimicrobial agents, new compounds that are effective against these resistant organisms have been sought. Despite this significant need and considerable research effort, new chemical entities for the treatment of bacterial diseases have not been approved by the US Food and Drug Administration (FDA) for more than 20 years (Trias And Gordon, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 757-762 [1997]; Bianchi and Banayx, Appl. Environ. Microbiol., 65: 5023-5027 [1999]. thing).
[0004]
This situation suggests that the frequency of infections by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE) is increasingly increasing in the field. Especially severe. There is a real concern that a high degree of vancomycin resistance will spread to staphylococci. In fact, since 1996, vancomycin-insensitive S. aureus isolate (VISA; vancomycin minimum inhibitory concentration [MIC] 8-16 μg / ml) has been established in Europe, Asia, and the United States. Have been identified. The appearance of vancomycin hyposensitivity in S. aureus increases the likelihood that some strains will become fully resistant and currently used antimicrobial agents will be ineffective against such strains. This is of particular concern as the emergence of community-acquired MRSA infections has led to increased use of vancomycin for these organisms. Since few therapies can be used for treating MRSA, confirmed reports of VISA strains that are less sensitive to the drug vancomycin, the last resort of MRSA treatment, are very disturbing (eg, Crusid ( Khurshid et al., MMWR, 48: 1165-1167 [2000]; see also Baughman et al., MMWR 48: 1167-1171 [2000]).
[0005]
Currently, the most commonly used antimicrobial agents are targeted at a surprisingly small number of cellular functions (eg, cell wall, DNA, RNA, and protein biosynthesis). Table 1 summarizes these targets, gene products, and some classes of antimicrobial agents that interact with currently used targets. Examples of bioresistance to these antimicrobials are well documented and extensive. Thus, it is clear that new antimicrobial agents are needed to address the growing problem of antimicrobial resistance.
[0006]
The discovery of new and effective antimicrobial agents involves two stages. In the first stage, one or more drug targets are identified. Targeting new pathways other than those shown in Table 1 is likely to play an important role in this development phase. In the second stage, potentially active chemicals are screened and evaluated to find chemicals with the desired activity without causing undesirable side effects.
[0007]
Table 1 Targets of some widely used antimicrobial agents^★

^★See Moir et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43: 439-446 [1999].
[0008]
Another major BAC category is pharmaceuticals (ie, drugs) designed to prevent human disease. Diseases can be considered abnormalities in the physiological pathways of cells. The major components of these pathways are proteins (enzymes, receptors, etc.) encoded by genes and expressed in diseased cells. Drugs typically have a pharmacological effect by interacting with a key protein (ie, drug target) to restore the normal function of the key protein or to inactivate the key protein and counteract abnormalities in physiological pathways. Demonstrate.
[0009]
As with antimicrobial agents, the process of developing this drug involves two steps: (1) identifying the drug target, and then (2) interacting specifically with the target to produce the desired without undesired side effects. Screening candidate active chemicals to find those that produce an effect. Although much work has been done in this area, there is still a need for improved efficiency and effectiveness of screening and evaluating these chemicals.
[0010]
In response to the pressure to create more promising drugs, pharmaceutical and biotech companies have turned to fast, high-throughput methods to discover and evaluate lead compounds. These lead compounds are generally selected by using an extract collection to screen large libraries of chemicals synthesized from various sources, chemicals synthesized by combinatorial chemistry or rational drug design. Is done.
[0011]
However, these methods have been good or bad. Using techniques such as combinatorial chemistry, compound libraries for candidate drug targets can be rapidly generated and screened. Unfortunately, these techniques only examine the effect of the drug on the proposed target and do not measure its effect on other cellular processes. While certain chemicals may be good candidates based on their interaction with the target protein, the chemical may also interact with other proteins in the cell and cause side effects. Thus, drug developers understand how promising drug candidates can give rise to other aspects of cellular function, as well as interact with other drugs that may be used simultaneously. A major problem remains in that drug candidates must be examined in order to do so. Despite advances in these areas, there remains a need for very sensitive, specific, yet cost-effective, easy-to-use methods for identifying and developing BACs that are effective in treating disease. .
[0012]
Summary of the Invention
The present invention is directed to a multi-test panel for improving the effectiveness, throughput, and efficiency of testing and commercial development of biologically active compounds, especially compounds useful for human, animal, and plant health. About use.
[0013]
The present invention provides a method for testing the response of at least two cells to at least one biologically active chemical, comprising the steps of: a) each well of a test device comprising A test device having at least two wells comprising a defined medium comprising at least one substrate selected from the group consisting of a source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, a drug, and a chromogenic test substrate; A first suspension comprising one cell and at least one biologically active chemical; and a second suspension comprising the second cell and at least one biologically active chemical. Providing; (b) inoculating the wells of the test device with the suspension; and (c) observing the response of the first and second cells to the at least one biologically active chemical. Stage.
[0014]
In some embodiments of the method, the test device is selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. In another embodiment, the suspension further comprises a gelling agent. In a still further aspect, the test device further comprises a gelling initiator in the well. In some embodiments, the suspension further comprises a colorimetric indicator, while in other embodiments, the test device further comprises a colorimetric indicator in a well, and in other embodiments, the suspension and the well of the test device. Both contain colorimetric indicators. In one preferred embodiment, the observation is visual, while in another preferred embodiment, the observation is made with an instrument. In some particularly preferred embodiments, the response of the first and second cells is non-radioactive. In another aspect, the first cell and the second cell are eukaryotic cells. In some preferred embodiments, the eukaryotic cells are animal cells, while in other preferred embodiments, the animal cells are mammalian cells, and in some particularly preferred embodiments, the mammalian cells are human cells. In some embodiments, the mammalian cells are mutant cells. In a still further aspect, the first cell and the second cell are fungal cells, while in other aspects, the first cell and the second cell are prokaryotic cells. In certain preferred embodiments, the drug comprises at least one antimicrobial.
[0015]
The present invention further provides a method of comparing the effects of at least two biologically active chemicals, comprising the following steps: a) at least one cell type and at least one biological First cell suspension comprising a chemically active chemical; at least one organism different from the biologically active chemical in the first cell suspension and the same cell type as the first cell suspension A second cell suspension comprising a biologically active chemical; at least one selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, a drug, and a chromogenic test substrate. A first test device having a well containing a defined medium containing a substrate; at least one substrate selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, a drug, and a chromogenic test substrate. Including Providing a second test device having a well; b) adding a first cell suspension to the wells of the first test device to provide a first phenotypic array; c) providing a second phenotypic array; Adding the cell suspension to the wells of the second test device to provide a second phenotypic array; d) incubating the first phenotypic array and the second phenotypic array; e. A) observing the response of the cell suspension in the first and second phenotypic arrays; and f) observing the response of the cell suspension in the first phenotype array and in the second phenotypic array. Comparing the response of the cell suspension.
[0016]
In some embodiments of the method, the test device is selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. In another embodiment, the suspension further comprises a gelling agent. In a still further aspect, the test device further comprises a gelling initiator in the well. In some embodiments, the suspension further comprises a colorimetric indicator, while in other embodiments, the test device further comprises a colorimetric indicator in a well, and in other embodiments, the suspension and the well of the test device. Both contain colorimetric indicators. In one preferred embodiment, the observation is visual, while in another preferred embodiment, the observation is made with an instrument. In some particularly preferred embodiments, the response of the first and second cells is non-radioactive. In another aspect, the first cell and the second cell are eukaryotic cells. In some preferred embodiments, the eukaryotic cells are animal cells, while in other preferred embodiments, the animal cells are mammalian cells, and in some particularly preferred embodiments, the mammalian cells are human cells. In some embodiments, the mammalian cells are mutant cells. In a still further aspect, the first cell and the second cell are fungal cells, while in other aspects, the first cell and the second cell are prokaryotic cells. In certain preferred embodiments, the drug comprises at least one antimicrobial. In some embodiments, the test device includes the same substrate as the second test device. In a still further aspect, the comparison of the responses is performed using multi-dimensional pattern analysis.
[0017]
The present invention further provides a method of testing an organism's response to at least one biologically active chemical, comprising the following steps: a) each well of the test device comprises a carbon source; A test device having at least two wells comprising at least one substrate selected from the group consisting of a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, an antimicrobial agent, and a chromogenic test substrate; and an organism and at least one Providing a suspension comprising a biologically active chemical; (b) inoculating the suspension into a well of a test device; and (c) one or more biologically active chemicals. Observing the response of an organism to a chemical. In some embodiments, the test device is selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. In another embodiment, the suspension further comprises a gelling agent. In a still further aspect, the test device further comprises a gelling initiator in the well. In certain preferred embodiments, the suspension further comprises a colorimetric indicator, while in other preferred embodiments, the test device further comprises a colorimetric indicator in the well. In a further aspect, the observation is visual, while in another particularly preferred aspect, the observation is made with an instrument.
[0018]
The present invention also provides a method of comparing the effects of at least two biologically active chemicals, comprising: a) an organism and at least one biologically active chemical. A first cell suspension comprising the substance; at least one biologically active substance different from the same organism as the first cell suspension and a biologically active chemical substance in the first cell suspension; A second cell suspension containing a chemical; a well comprising at least one substrate selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, an antibacterial agent, and a chromogenic test substrate. A first test device having a well containing at least one substrate selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth stimulating nutrient, an antibacterial agent, and a chromogenic test substrate. Provide test equipment Floor; b) adding the cell suspension to the wells of the first test device to provide a first phenotypic array; c) adding the cell suspension to the wells of the second test device Providing a second phenotype array; d) incubating the first phenotype array and the second phenotype array; e) cell suspension in the first phenotype array and the second phenotype array. Observing the response of the suspension; and f) comparing the response of the cell suspension in the first phenotypic array to the response of the cell suspension in the second phenotypic array. In some embodiments, the first test device and the second test device are selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. In another embodiment, the first cell suspension and the second cell suspension further comprise a gelling agent. In yet another aspect, the first test device and the second test device further include a gelling initiator in the well. In certain preferred embodiments, the first cell suspension and the second cell suspension further comprise a colorimetric indicator, while in other embodiments, the first test device and the second test device are wells. And a colorimetric indicator therein. In some particularly preferred embodiments, the first test device includes the same substrate as the second test device. In one preferred embodiment, the observation is visual, while in another preferred embodiment, the observation is made with an instrument. In a particularly preferred embodiment, the comparison of the responses is performed using multi-dimensional pattern analysis.
[0019]
The invention also provides a multi-well kit for testing the effects of at least one biologically active chemical, including: a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, At least one test device having at least two wells containing at least one substrate selected from the group consisting of an antimicrobial agent and a chromogenic test substrate; and a cell suspension comprising at least one biologically active chemical. Culture medium. In some embodiments, the test device is selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. In certain preferred embodiments, the cell suspension medium includes a gelling agent, while in other embodiments, the test device includes a gelling initiator in the well. In some embodiments, the cell suspension further comprises a colorimetric indicator, while in yet other embodiments, the test device further comprises a colorimetric indicator in the well.
[0020]
Description of the invention
The present invention is directed to improving the efficacy, throughput, and efficiency of testing and commercial development of biologically active compounds (BACs), especially those useful for human, animal, and plant health. It relates to the use of a multi-test panel referred to herein as "phenotypic microarray" or "PM".
[0021]
Although a particularly preferred embodiment of the present invention requires BACs (eg, antimicrobial agents and other compounds) commonly used to treat a disease or disease condition, the present invention also encompasses a wide range of BACs, Examples include, but are not limited to, nutrients, hormones, growth stimulating compounds, nutrients, vitamins, metabolic modifying compounds, insecticides, rodenticides, antifungals, herbicides, algicides, and the like. It is further contemplated that the present invention includes BAC from any source. Thus, the present invention provides a means for assessing BAC from any source, as well as a means for assessing BAC for any suitable application.
[0022]
As noted above, a major problem is associated with conventional methods used in drug discovery and development. For example, drug developers must first look for promising drug candidates in order to find promising drug candidates, and then look for promising drug candidates for cell function. In order to understand how other aspects arise and how they interact with other drugs that may be used at the same time, we must look for promising drug candidates. The big problem remains. The present invention provides a method to test PM efficiently and effectively as PM provides a cost-effective and rapid physiology-based in vivo drug activity assay.
[0023]
The invention also finds use in detailed toxicological analyses, in addition to supporting chemical library screening efficiently and at high throughput. For example, a set of cell lines representing various organs may be used to assay multiple drug candidates in an easy-to-use, high-throughput, fast, and cost-effective assay in mammalian cells. Is intended. Based on these results, compounds that seem promising at first, but actually cause unacceptable side effects, can be eliminated from the selection before starting costly clinical trials.
[0024]
Importantly, the present invention also provides a method for analyzing concomitant drugs. Advantages of this embodiment include the ability to assess potential in vivo interactions of multiple drugs. For example, in some cases, drug combinations exert deleterious or antagonistic interactions, while in other cases, they synergize to provide additional benefits to the patient. Examples of the latter include a combination of a sulfa drug and trimethoprim and a combination of penicillin and a β-lactamase inhibitor.
[0025]
The present invention offers unique advantages over currently used methods, as cost is always a consideration in drug development and treatment regimes. The present invention saves considerable time and money in drug development. For example, recent estimates indicate that it takes currently an average of 14.9 years to develop a drug from initial synthesis to final Food and Drug Administration (FDA) approval (R. Hansen, University). SN Wigging, Texas A & M University; JA Dimasi, Tufts University Office of Technology Assessment, "Wigging", SN Wigging, Texas A & M University;Medical Market Guide Research Report 2000(Healthcare Marketplace Guide Research Reports 2000) ", 15th Edition, Volume 1, Dorland's Biomedical, Philadelphia, PA 19102, [1999-2000], pp. 1-172). The cost of developing one new drug has been reported to increase from $ 54 million in 1976 to an average of $ 359 million today (Hansen, supra). In addition, billions of dollars have been spent in clinical trials due to the failure of about 9 out of 10 drugs (Hansen, supra). Pharmaceutical companies can save billions of dollars annually if they can efficiently identify and characterize new drug candidates and eliminate early dissatisfied candidates in the drug discovery process.
[0026]
The present invention also provides methods and compositions suitable for determining the mode of action of a BAC of interest. In this embodiment, the invention uses PM in a wide range of assays for various cell functions. With PM, it is possible to determine the function that can be most sensitively changed by BAC. For example, if BACs have been shown to inhibit cell wall synthesis (eg, vancomycin), this test BAC will synergize with other BACs that also inhibit cell wall synthesis (eg, cephalosporins, penicillins, etc.). Levels can be easily and efficiently evaluated. The present invention can be used to make quantitative and qualitative measurements on the type and level of synergy between BACs. In another example, the activity of a BAC (eg, sulfometuronmethyl) that inhibits the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids such as isoleucine can be observed on minimal phenotypic media (ie, expected to be toxic) This effect is specifically reversed in phenotypic media containing side-chain amino acids.
[0027]
The invention also finds use in determining the type and number of BAC targets present on a cell. Such a determination is important in that the preferred BAC has a specific mode of action and no side effects. Each candidate new BAC must meet a number of criteria before being approved for use.
[0028]
Target selection is an important early step in the development of a new BAC. In general, the target should give rise to sufficient selectivity and range (ie, the antimicrobial agent is highly specific and / or selective for microorganisms associated with the human host and has a desired pathogen range). Active). The target should be essential for the growth or viability of the pathogen (ie, at least under the conditions of infection). The function of the target should be known so that assays and high-throughput screening (eg, assays and high-throughput screening of the present invention) can be used. The invention also provides a means to determine and evaluate the selectivity and range of BAC and the function and importance of various targets.
[0029]
In one aspect of the invention, the activity of BAC is determined in such a way that side effects such as interaction with multiple targets are observed. For example, in one test, BAC1 is a specific drug that inhibits one target, protein 1. This is distinguished from BAC2, which is known to be a non-specific drug that inhibits protein 1 as well as protein 5. If inhibition of protein 5 is deleterious, it is determined that this BAC is unsuitable for use.
[0030]
FIG. 1 is a simplified schematic diagram of one embodiment of the present invention designed to measure the effect of BAC on cells using PM. In this figure and FIG. 2, the designation "phe" indicates the phenotype of the cells (eg, proliferation and / or respiration of cells in a particular well of a phenotypic microarray). 1 and 2 show, in the upper left, normal cells and mutant cells (eg, gene knockouts) that lack the functional activity of a normally encoded protein (in this example, a candidate drug target). In FIGS. 1 and 2, “g1” indicates a gene encoding a protein “p1” which is a candidate drug target. Since most drugs work by blocking the activity of the protein, when the drug is added, the cell has no function of the target protein. Thus, in each case (ie, exposure of mutant or normal cells to the drug), the cells lack the function of the target protein (eg, p1). The main difference between these cells is that in mutant cells, protein function was abolished by genetic means, whereas in normal cells exposed to the drug, protein function was abolished by chemical means. In FIG. 1, Drug 1 is a good candidate for inactivating the target protein (p1) because it is active and specific (ie, only Drug 1 gives rise to phenotype 1). In contrast, Drug 2 is a bad candidate because it inactivates another protein called protein 5 (p5) as well as p1 (ie, because Drug 2 affects both phenotypes 1 and 5). Since Drug 2 has non-specific effects on cells, it is likely to cause side effects and is likely to be an undesirable compound for use in therapeutic regimes.
[0031]
Thus, in one aspect of the invention, the activity of BAC is determined in such a way that side effects such as interaction with multiple targets are observed. For example, in one test, BAC1 is a specific drug that inhibits one target, protein 1. This is distinguished from BAC2, which is known to be a non-specific drug that inhibits protein 1 as well as protein 5. If inhibition of protein 5 is deleterious, it is determined that this BAC is unsuitable for use.
[0032]
FIG. 2 is a simplified schematic diagram showing how PM can detect drug interactions. When cells are exposed to “drug 1” and “drug 2” simultaneously, the resulting effects are not only the effects of drug 1 (ie, changes in phe1) and the effects of drug 2 (ie, changes in phe5), but also phe6 and phe7 are also higher as varied. This indicates an extra effect of the drug that cannot be predicted based on the known effects of the drug used alone. This extra effect (ie, changes in phe6 and phe7) can be beneficial (ie, synergistic) or detrimental (ie, antagonistic).
[0033]
As illustrated in FIG. 3, during the testing process, the cells in the various wells are subjected to different environmental stresses. These stresses exert pressure on the cells to adapt and survive. For example, in some wells the cells may be partially deficient in elements such as phosphorus, while in other wells the cells may be adapted to high salt conditions and undergo DNA repair. May be growing at a low pH, producing a partially defective cell wall, or having reduced ribosome function. Thus, the present invention provides a means of starting with a single culture (or cell population) and exposing the culture to various environmental conditions, thereby creating a cell array of different physiological states. Where an antimicrobial drug or other BAC is also added to the culture, the present invention provides a means of simultaneously observing the effect of BAC on the culture under many environmental and physiological conditions. This is because of the current work for determining the antimicrobial susceptibility pattern of an organism (generally, growing the culture only under conditions that result in rapid growth of the organism, ie, under optimal growth conditions). It is very different from implementation and very powerful.
[0034]
Conventional and current methods for antimicrobial susceptibility testing have made every effort to unify the procedure and its interpretation. Although these methods are relatively simple (eg, Kirby-Bauer disk diffusion and tube dilution), they are used in clinical practice by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Strictly controlled (Hindler, "Antimicrobial Susceptibility Testing", Isenberg, Ed.)Handbook of Clinical Microbiology Procedures(Clinical Microbiology Procedures Handbook) ", Volume 1, American Society for Microbiology, Washington, D.C. C. , [1994], pages 5.0.1-5.25.1). In fact, physicians have been ordered not to deviate from standard practice and to obtain misleading results.
[0035]
However, antimicrobial susceptibility testing is one of the most important tasks of clinical microbiology laboratories, but these tests are designed to determine how well a particular antimicrobial agent works in treating a patient's disease in vitro. (Jorgensen and Sahm), "Antimicrobial Susceptibility Testing: General Considencies, Murray et al. (Eds.)"Clinical microbiology manual(Manual of Clinical Microbiology) ", 6th Edition, American Society for Microbiology, Washington, D.C. C. [1995], pp. 1277-1280). Since the approved test procedures are fairly uniform, there is no mechanism to test the susceptibility of the organism under different environmental stresses. This is what the present invention allows to determine antimicrobial susceptibility (as well as other characteristics of a particular culture) under a number of very different conditions, such as those conditions that an organism may encounter in vivo. In stark contrast.
[0036]
Thus, as described above, the present invention is further used in determining synergism and antagonism. As is well known in the art, it is important to know which BAC combination is synergistic when used, and which BAC combination is antagonizing or harmful. The present invention provides methods and compositions for determining these relationships.
[0037]
The results obtained with the present invention can result in simple or complex patterns, which are recorded quantitatively and can be analyzed using standard methods well known in the art. In particular, multi-dimensional pattern analysis includes non-metric multi-dimensional scaling (NMDS), principal component analysis and canonical variable analysis, heuristic clustering analysis, creation of distance and similarity matrices, data extraction and mining activities , And bioinformatics tools and implementations. In methods such as ANOVA, sample sets are compared based on how exactly they have the same variability. ANCOVA provides information about joint variability of datasets. Principal component analysis (PCA) and canonical variable analysis (CVA) are also contemplated for use in the present invention. PCA performs an algebraic analysis of the data matrix, while CVA applies to a distance or similarity matrix that is associated with the same algebraic analysis of the data. Correspondence analysis and discriminant analysis provide a method for using the basic PCA algorithm. Like CVA, the difference is in the data processing method before applying this algorithm. Monte Carlo permutation assays are also contemplated for use in combination with the present invention. These tests show the stability and reliability of the cluster analysis results.
[0038]
It is further contemplated that the use of Gini coefficients is used in the analysis of data obtained using the present invention (eg, Harch et al., J. Microbiol. Meth., 30: 91-101 [1997]. checking). For example, in this analysis, the Gini coefficient can be used as a measure to quantify the unequal use of a substrate or BAC. However, the choice of statistical method depends on the application of the present invention. Accordingly, the invention is not intended to be limited to any particular method of data analysis. Indeed, it is contemplated that methods such as the Shannon Index as well as other suitable methods will be used to analyze the data obtained using the present invention (Garland, FEMS Microbiol. Ecol., 24). : 289-300 [1997]).
[0039]
Further, the invention provides a method for determining data in a BAC sensitivity profile and allowing easy storage in a database. In a preferred embodiment, the invention is suitable for comparative phenotyping of microorganisms as well as other cells.
[0040]
In one preferred method, the present invention provides phenotypic testing of E. coli and S. cerevisiae, important prokaryotic and eukaryotic "model" organisms of many biological systems. And methods and compositions for However, the invention is not intended to be limited to these organisms. Indeed, the invention is intended for use in the analysis of organisms of medical and veterinary, industrial and environmental importance and / or interest.
[0041]
The present invention is not intended to be limited to any particular genus, species, or group of organisms or cells. In addition to commonly isolated organisms, a range of cell types that can be tested using the methods and compositions of the present invention include cells that undergo complex forms of differentiation, filamentation, sporulation, etc. It is. Indeed, the present invention is also contemplated for use with any type of cell, including cells maintained in cell culture, including mammalian cells, insect cells, and plant cells, cell lines, and the like. , But is not limited to this. The compositions and methods of the present invention are specifically targeted to some of the most economically important organisms as well as clinically important species. Since a variety of cells can be characterized using the PMs of the present invention, the choice of primary isolation medium and primary culture medium is not intended to be limited to any particular formulation.
[0042]
As noted above, the present invention is used with prokaryotic (eg, bacterial) cells as well as eukaryotic cells. For example, the invention can be used with cells obtained from various animals and other eukaryotic species. For example, the invention can be used with mammalian, insect, bird, fish, reptile, and amphibian cells. Accordingly, mammalian cells may be used with the present invention, wherein mammalian cells include human cells and non-human animal cells (eg, laboratory animals, pets, and livestock (eg, dogs, cats, horses, cows, pigs, goats, sheep, birds) (Including cells from chickens, turkeys, ostriches, etc.), rabbits (eg, rabbits and hares), rodents (eg, rats, mice, hamsters, guinea pigs, etc.), and non-human primates) And cells obtained from zoo animals, wild animals, and wild animals. Thus, the present invention may be used with any number of vertebrates as well as invertebrates. Examples of invertebrate cells used with the present invention include insects (eg, Drosophila, cockroaches, mosquitoes, beetles, moths, butterflies) and nematodes (eg, C. elegans). It is not limited to. Indeed, the invention is not intended to be limited to cells from any particular species. Because methods and techniques for cell culture of cells from various classes of animals (eg, mammals, reptiles, amphibians, and insects) are well known to those of skill in the art, the skilled artisan will appreciate that the present invention Understand that it is suitable for use with cells derived from.
[0043]
In addition to animal cells, the present invention can be used with other eukaryotic cells, including, but not limited to, fungal cells. For example, the present invention relates to yeasts such as Candida, Cryptococcus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsistro and Rhodostro and Rhodostro and Rhodostro and Rhodosto and Rhodostro Molds (e.g., Aspergillus, Alternaria, Coccidioides, Histoplasma, Blastomyces, Paracoccidioides, Picococcidioides Picococcidioides) , Fusarium (F sarium), etc.) used in conjunction with. Accordingly, the invention includes the use with dimorphic fungi as well as fungal species having only one form (ie, mold or yeast).
[0044]
In addition to animal cells, the invention can be used with cells obtained from plants, including but not limited to rice, tobacco, corn, and Arabidopsis. Indeed, the present invention is used with plants useful for agriculture (eg, cereals for food and feed) and plants useful for horticulture (eg, ornamental plants and flowers), and wild plants. The present invention is not intended to be limited to any particular plant or plant type. In addition, various plant cells (eg, roots, stems, leaves, flowers, etc.) can be used with the present invention.
[0045]
In addition, the present invention relates to various organs and tissues (eg, skin, respiratory, digestive, urinary, reproductive, circulatory, skeletal, sensory (eg, sight, smell, taste, etc.), muscle, In addition, the present invention is directed to cells of various developmental cell types and cells at various stages of development (eg, stem cells, oocytes, zygotes, blastocoel, Thus, the present invention is not intended to be limited to any particular type of cell.In fact, various organs, tissues, and bodily systems (eg, mammals, reptiles) , Cell amps, and insects) are well known to those of skill in the art, and those of skill in the art will appreciate that the present invention is suitable for use with cells derived from any source. to understand.
[0046]
The invention is used with normal eukaryotic and prokaryotic cells and with abnormal cells (eg, cancer cells, cells undergoing apoptosis, mutant cells, precancerous cells, diseased cells, etc.). Cells infected with pathogenic or other organisms (eg, viruses, bacteria, mycoplasmas, parasites, fungi, etc.) are also used with the present invention. Thus, the present invention is not intended to be limited to any particular stage of development (eg, cells of a fetus, adult, geriatric) or any particular state of health. Mutant cells (eg, naturally occurring mutant cells) as well as engineered cells (eg, knockouts, knockins), plasmid-containing cells, transfected cells, transformed cells, chemically induced mutant cells , Radiation-induced mutant cells and the like are also used with the present invention. The following table shows some in vitro tumor cell lines used with the present invention. However, the invention is not intended to be limited to any of the cell lines listed herein.
[0047]
Table 2 Examples of in vitro human tumor cell lines

[0048]
The invention is further used with cultured cells, including but not limited to primary cells, cell lines, cell lines, and other cells maintained in cell culture. Numerous cell lines and cell lines are available from depository institutions such as the American Type Culture Collection (ATCC). For example, HeLa, Vero, MDCK, A-9, HFF, CHO, MRC-5, HeP-2, CV-1, BGMK, BHK, BHK-21, A549, MvLLu, HEK-293, HT-29, MCF- 7, AC-133, CD-4, C3A, hTERT-RPE1, KB, 3T3, Jurkat, IMR-90, F9, PC13, LNCaP, PC-3, US7, HUH-7, NCI-460, NCI-H23, Cell lines such as MB-MDA-237, HME, MKN45, CD80-AT, A2780, OVCAR-3, SK-OV-3, NBS-1LB, MCF-10, Rat-1, RTS34St, and real cells and culture Other cells maintained in the system.
[0049]
In addition, the invention is used with cells that contain a selectable marker (ie, a gene that encodes an enzymatic activity that confers resistance to an antibiotic or drug on cells in which the selectable marker is expressed). The selectable marker may be "dominant". A dominant selectable marker encodes an enzymatic activity that can be detected in any mammalian cell line. Examples of dominant selectable markers include aminoglycoside 3 'phosphotransferase gene (also called neo gene) that confers drug G418 resistance to mammalian cells, hygromycin G phosphotransferase (hyg) gene that confers antibiotic hygromycin resistance, mycophenol A bacterial xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene (also called gpt gene) that confers the ability to grow in the presence of acid, and a chloramphenicol acetyltransferase gene (also called cat gene) that confers chloramphenicol acetyltransferase resistance. Is mentioned. Other selectable markers are not dominant in that they must be used with cell lines that lack the relevant enzyme activity. As an example of a non-dominant selectable marker, tk⁻A thymidine kinase (tk) gene for use with cell lines, a CAD gene for use with CAD-deficient cells (ie, UrdA mutant) (ie, encodes a CAD protein having the first three enzymatic activities of novel uridine biosynthesis), and hprt⁻Mammalian hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (hprt) gene used with cell lines. An overview of the use of selectable markers in mammalian cell lines can be found in Sambrook et al. (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York [1989], pp. 16.9-16.15).
[0050]
The present invention is a microtiter plate ("microplate" or "microplate") commonly used in the art and commercially available from many scientific supplies (eg, Biolog, Fisher, etc.). It contemplates the use of a multi-well test device that is essentially similar in structure to a MicroPlate ™ “microtiter plate”. The present invention is also intended to include various test formats. Thus, in addition to the standard microtiter plate test method, the present invention provides various gelling agents (US Pat. Nos. 5,627,045, 5,882,882, and 5,989, Alginates, carrageenans, and gellan gums such as, but not limited to, those described in US Pat. No. 853, such as, but not limited to, Gelrite ™ and / or Phytagel ™, and US Pat. No. 5,589,350 and 5,800,785, all intended to be used with the MicroCard ™ miniature test plates, all of which are incorporated herein by reference. .
[0051]
Thus, in one embodiment, a microplate (eg, Microplate ™ microtiter plate) format is used. In this embodiment, a gel-forming matrix containing suspended cells is used to inoculate the wells of a Microplate ™, MicroCard ™, or another container. Upon inoculation, the gel-forming matrix is liquid, so that the suspension can be easily distributed to the compartments. These compartments contain dried biochemicals and cations. Upon contact of the cations with the gel-forming matrix, the suspension solidifies to form a soft gel and the cells are evenly distributed. The gel is viscous or hard enough to retain the suspended cells so that the cells do not settle to the bottom of the well or test array.
[0052]
In another embodiment, the MicroCard ™ miniature test format is used. One aspect of the device of the present invention includes a housing having a liquid inlet into which a sample is introduced. The housing further includes a flow path in communication with the test area such that the liquid flows to the plurality of wells or compartments. The flow passages are mated to form one side of the well and are surrounded by a gas permeable hydrophobic membrane attached to one side of the housing. The housing may be sealed on the other side with a solid base. In other embodiments, a flexible tape may be used instead of a solid base, and the solid base may be molded to be integral with the housing.
[0053]
After the device is filled with a solution containing cells or a gel-forming matrix, a tape (e.g., a polyester film) or the like is used to seal the device so that the gel matrix in the device does not evaporate through the gas escaping membrane. Any material that does not allow gas to escape may be affixed to the outer surface of the gas-releasing membrane. Upon delivery, the gel-forming matrix containing the suspended cells is liquid. Once the liquid comes into contact with the gel initiator compound present in the test area, a gel matrix is formed, trapping the suspended cells.
[0054]
The present invention is particularly suitable for use as a kit. In particular, the present invention, in the form of a kit, provides easy and easy access to a variety of cells including mammalian, insect, and plant cells as well as commonly isolated bacteria and actinomycetes and fungi (ie, yeasts and molds). Suitable for rapid phenotyping. In particular, the present invention provides compositions and methods for phenotyping cells, particularly for analyzing the sensitivity and resistance of cells to various compounds having candidate BAC activity.
[0055]
The PM of the present invention is intended to be read visually, while it is also intended that an instrument be used to read and read the results of the assay. For example, a practical, efficient and cost-effective system for reading out test panels is described in US patent application Ser. No. 09 / 277,353, which is incorporated herein by reference. This instrument facilitates direct and simultaneous analysis of cells and cell lines for thousands of phenotypes. The present invention provides methods and compositions for phenotyping prokaryotic as well as eukaryotic cells. Indeed, the invention is not limited to any particular organism, cell or test format.
[0056]
In many embodiments, the present invention provides one or more test panels, each test panel comprising 95 substrates for phenotypic testing. In particular, the present invention allows for the testing of a large number of BAC compounds. However, the invention is not intended to be limited to a particular number of tests. For example, some currently available panels can test 384 or 1536 substrates in an array. Thus, the present invention allows for the testing of a large number of BAC compounds. However, the invention is not intended to be limited to testing only one BAC compound. Thus, the present invention is intended to include test panels having any type of test substrate suitable for phenotypic testing of various cells. Indeed, in the method of the present invention, a combination of substrates is used, including individual BACs, candidate BACs, combinations of BACs, and BACs tested with other substrates (eg, carbon or nitrogen sources). Is intended.
[0057]
Definition
The terms "sample" and "specimen" in the present description and claims are used in their broadest sense. On the other hand, these terms are intended to include specimens or cultures. On the other hand, these terms are intended to include biological and environmental samples. These terms include all types of samples obtained from humans and other animals, including samples of body fluids (eg, urine, blood, feces, cerebrospinal fluid (CSF), semen, and saliva) and solid tissues However, the present invention is not limited to this. These terms also refer to swabs and other sampling devices commonly used to obtain samples for culturing microorganisms.
[0058]
Biological samples may be animals, including humans, liquids or tissues, food and food ingredients (eg, dairy products, vegetables, meat and useful parts other than meat), and waste. Environmental samples include environmental materials (eg, surface materials, soil, water, and industrial samples), as well as samples obtained from instruments, devices, equipment, disposable products, and non-disposable products that process food and dairy products. . These examples should not be construed as limiting the sample types applicable to the present invention.
[0059]
In order to “pure culture” a microorganism, whether a biological sample or an environmental sample, first a sample that is thought to contain the microorganism may or may not be subjected to enrichment means. By "concentrating means" or "concentrating process", the present invention provides a method for isolating a particular microorganism of interest from other microorganisms by (i) liquid, solid, semi-solid, or any other medium and / or technique. And (ii) novel techniques for isolating specific microorganisms from other microorganisms. The invention is not intended to be limited to only one type of concentration step or concentration means. For example, it is within the scope of the present invention to subject the resulting preparation to further purification, such that after subjecting the sample to conventional means of concentration, a pure culture of the strain of the species of interest is obtained. This pure culture may then be analyzed by the media and methods of the present invention.
[0060]
As used herein, the term “primary isolation” refers to the process of culturing an organism directly from a sample. Thus, primary isolation involves processes such as inoculating agar plates from cultured swabs, urine samples, environmental samples, and the like. Primary isolation may be performed using solid or semi-solid agar, or in liquid. As used herein, the term "isolated" refers to an organism, whether in primary culture or any subsequent culture, including "passage" or "migration" of a stock culture of the organism for maintenance and / or use. Means any culture of
[0061]
The term “culture” as used herein refers to any sample or specimen that is thought to contain one or more types of microorganisms or cells. In a particularly preferred embodiment, the term is used for bacteria and fungi. A “pure culture” is a culture in which the organism present is only one strain of a particular genus and species. This is in contrast to "mixed cultures", which are cultures in which there is more than one microorganism genus and / or species.
[0062]
The term “eukaryote” as used herein refers to a cell or organism that has a nucleus (ie, a true) nucleus attached to a unit membrane and usually has other organelles. Most eukaryotes have DNA complexed with histones and present on several chromosomes. Eukaryotes include algae, fungi, protozoa, plants, and animals. The present invention is not intended to be limited to any particular eukaryotic cell or eukaryote. Indeed, the term is intended to include any organism or cell that has characteristics generally associated with eukaryotic cells (see, eg, Brock et al. (Eds.)Microbial biology(Biology of Microorganisms) ", 7th Edition, Prentice Hall, New Jersey [1994], pp. 86-87).
[0063]
As used herein, the term "prokaryote" refers to a single unit that lacks the nucleus and other organelles associated with the unit membrane (i.e., true) and generally lacks An organism or cell having a genome consisting of circular DNA is meant. In most cases, cell walls are present. Prokaryotes include bacteria (ie, eubacteria) and primitive bacteria (ie, archaebacteria). The present invention is not intended to be limited to any particular prokaryotic cell or prokaryote. Indeed, the term is intended to include any organism or cell that has characteristics generally associated with prokaryotic cells (eg, Block et al., Eds.Microbial biology, Seventh Edition, Prentice Hall, New Jersey [1994], pp. 86-87).
[0064]
As used herein, the term "organism" is used to refer to any species or type of microorganism, including, but not limited to, bacteria, yeast, and other fungi. The term "fungi" as used herein is used with reference to eukaryotes such as molds and yeasts, including dimorphic fungi.
[0065]
As used herein, the term "spore" refers to any form of reproductive (eg, conidia) or sexually produced by an organism, such as a bacterium, fungus, algae, protozoa. Means the element. It is also used for structures within microorganisms, such as members of the genus Bacillus, which provide individual cells with an advantage in survival under harsh environmental conditions. The term is not intended to be limited to any particular type or location of spore, such as "endospore" or "exospore". More precisely, the term is used in the broadest sense.
[0066]
As used herein, the terms "microbial medium" and "microorganism culture medium" and "medium" refer to any culture medium for the growth and regeneration of microorganisms. "Media" may be used in reference to a plated solid media that supports microbial growth. The definition also includes semi-solid and liquid microbial growth systems, including systems incorporating live host organisms, as well as any type of media.
[0067]
As used herein, the terms “culture medium” and “cell culture medium” refer to a medium that is suitable for supporting cell growth in vitro (ie, cell culture). The term is not intended to be limited to any particular cell culture medium. For example, this definition is intended to include growth media as well as maintenance media. In fact, the term is intended to include any culture medium suitable for growing the cell culture of interest.
[0068]
As used herein, the term “limited medium” refers to a medium whose components are known. For example, the term includes synthetic media prepared using certain components of known composition. However, it is not intended that the invention be limited to any particular medium or type of medium. Further, the present invention includes a defined medium that contains additional uncharacterized components (ie, the defined medium is a basal medium to which various compounds are added). In contrast to a defined medium, a “non-limited medium” is a medium that contains uncharacterized or unknown components (eg, trypticase soy broth, yeast extract, serum, plasma, etc.). It is.
[0069]
As used herein, the terms "monolayer", "monolayer culture", and "monolayer cell culture" refer to cells that are attached to a culture medium and grow as a layer one cell thick. I do. The monolayer may be grown in any manner, including, but not limited to, flasks, tubes, coverslips (eg, shell vials), roller bottles, and the like. Cells may also be grown attached to microcarriers, including but not limited to beads.
[0070]
As used herein, the term “confluent” refers to adherent cells that are in contact with each other such that there is no uncovered culture medium.
[0071]
The term "attachment" as used herein is "anchorage-dependent" (ie, requires adherence to a solid medium or surface for survival and / or growth) and is adhered to the solid medium. Means cell. In contrast, "anchorage-independent" cells do not require adherence to a solid medium or surface for survival and / or growth.
[0072]
As used herein, the term "contact inhibition" refers to the inhibition of cell membrane waving and cell movement when the cell is in complete contact with other adjacent cells (eg, in a confluent culture). Means Cell growth often stops after this stage, but the two are not always causally related.
[0073]
As used herein, the terms “suspension” and “suspension culture” refer to cells that survive and grow without adhering to the culture medium. Suspension cultures are generally generated using cells from hematopoietic cells, transformed cell lines, malignancies.
[0074]
The term "microcarrier beads" as used herein refers to beads suitable for cell attachment and growth. These beads are commercially available and are commonly used for growing and maintaining cells in culture. In a particularly preferred embodiment, the cells are attached to beads and grown in liquid growth medium. Thus, in some embodiments, cells are grown in suspension but attached to microcarrier beads.
[0075]
The term "cell type" as used herein refers to any cell, regardless of the source or characteristics of the cell.
[0076]
As used herein, the term "cell line" refers to cells cultured in vitro, including primary cell lines, finite passage cell lines, continuous passage cell lines, and transformed cell lines.
[0077]
As used herein, the terms “primary cell culture” and “primary culture” refer to a cell culture obtained directly from animal, plant, or insect tissue. These cultures may be obtained from adult as well as fetal tissues.
[0078]
As used herein, the term "finite passage cell line" refers to a cell culture that allows a finite number of population doublings before senescence.
[0079]
As used herein, the term "continuous cell line" refers to a cell culture that has an infinite life span. Some cell lines have resulted from natural transformation, while others have been obtained by manipulation (eg, by telomerization). In many cases, the cells have undergone a `` crisis '' period in which a cell population of a primary or finite cell line apparently ceases to grow, but nevertheless has a small cell size, a fast growth rate, A cell population appears that has the general characteristics of high cloning efficiency, increased tumorigenicity, and different chromosome sets. These cells often result from in vitro natural transformation. These cells have an infinite lifetime.
[0080]
As used herein, the term "transformed cell line" refers to a cell culture that has been transformed into a continuous cell line having the characteristics described above. Transformed cell lines may be obtained directly from tumor tissue, or may be obtained by in vitro transformation of cells with whole virus (eg, SV40 or EBV) or DNA fragments obtained from the transformed virus using a vector system. May be obtained.
[0081]
As used herein, the term "mixed cell culture" refers to a mixture of two types of cells. In some embodiments, the cells are non-engineered cell lines, while in other preferred embodiments, the cells are genetically engineered cell lines.
[0082]
As used herein, the term “auxotroph” is used with reference to an organism or cell line that can grow only in the presence of a nutrient (eg, a growth factor). Thus, in an auxotrophic test, an auxotroph grows only in the presence of one or more nutrients required for its growth, and grows in a medium lacking one or more nutrients required. do not do.
[0083]
As used herein, the term "carbon source" is used with respect to any compound that can be utilized as a source of carbon for cell growth and / or metabolism. The carbon source may take various forms, including, but not limited to, polymers, carbohydrates, acids, alcohols, aldehydes, ketones, amino acids, and peptides.
[0084]
As used herein, the term "nitrogen source" is used with respect to any compound that can be utilized as a source of nitrogen for cell growth and / or metabolism. Like the carbon source, the nitrogen source may take various forms, such as free nitrogen and nitrogen-containing compounds, including but not limited to amino acids, peptones, vitamins, and nitrogen salts.
[0085]
As used herein, the term “phosphorus source” is used with respect to any compound that can be utilized as a source of phosphorus for cell growth and / or metabolism. As with the sources of other elements (eg, carbon and nitrogen), the phosphorus source may take various forms, such as free phosphorus and phosphorus-containing compounds.
[0086]
As used herein, the term "sulfur source" is used with respect to any compound that can be utilized as a source of sulfur for cell growth and / or metabolism. Like the carbon, nitrogen, and phosphorus sources, the sulfur source may take various forms, such as free sulfur and sulfur-containing compounds.
[0087]
As used herein, the term "growth stimulating nutrient" is used with respect to any compound that promotes the growth of an organism. Although the invention is not intended to be limited to any particular growth stimulating nutrients, in particularly preferred embodiments, the invention relates to growth factors, amino acids, nucleic acid precursors, lipids, cell membrane and cell wall precursors, vitamins, hormones, The use of minerals and other factors and compounds that stimulate cell growth is contemplated.
[0088]
The term “drug” as used herein refers to any compound that has biological activity. In some embodiments, the term is used with respect to antimicrobial agents, but is not intended to be limited to antimicrobial agents. Indeed, the term includes compounds that alter cell growth, metabolism, and / or proliferation, as well as compounds that affect microorganisms and / or other cells (eg, animal cells). Thus, the term includes compounds such as anti-inflammatory agents, antihistamines, emetics, anti-emetics, and other compounds that affect biological systems and / or cells.
[0089]
As used herein, the term "antimicrobial agent" is used with respect to any compound that inhibits the growth of or kills microorganisms. The term is used in its broadest sense and is intended to include, but is not limited to, compounds such as antibiotics, which are naturally produced or synthetically produced. The term is also intended to include any other organic and inorganic compounds that are useful for inhibiting the growth of or killing microorganisms.
[0090]
As used herein, the term “test substrate” refers to any nutrient source (eg, carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur sources) that can be used to distinguish bacteria based on biochemical characteristics. Source, as well as growth stimulating nutrients, antimicrobial agents, and chromogenic substrates). For example, one cell type may utilize a test substrate that is not utilized by another. This use can then be used to distinguish these two species. It is contemplated that numerous test substrates may be used in combination. Test substrates may be tested individually (eg, one substrate per test well or test compartment or test area) or tested in combination (eg, multiple test substrates are mixed together, Supplied as "cocktail").
[0091]
As used herein, the term "BAC" is used with respect to any compound that affects cells. The effect may be stimulation or inhibition of cell growth or respiration, binding to any cellular component, or affecting any function of the cell or activity of protein catalytic activity. Accordingly, the invention is not intended to be limited to any compound or class of compounds. In fact, the BACs of the present invention include any compound that affects a particular cell.
[0092]
Following exposure to a test substrate (eg, one or more BACs, carbon or nitrogen sources, etc.), the response of the organism or cell line can be detected. This detection may be visual (i.e., eye) or may be performed using one or more machines (e.g., a Biolog MicroStation Reader (TM)). For example, the response of an organism to a carbon source can be detected as turbidity in suspension due to the organism utilizing the test substrate. Similarly, growth can be used as an indicator that an organism is not inhibited by a BAC. In one embodiment, color is used to indicate the presence or absence of growth / metabolism of the organism.
[0093]
As used herein, the term "colorimetric indicator" refers to any compound used to indicate by a change in color that a reaction has occurred or that a cell or organism is capable of metabolizing a particular compound. This can be any color as used in the conventional sense of "color" such as indigo, blue, red, yellow, green, orange, brown, as well as any color detectable by fluorescence (eg, the yellow-green color of fluorescein) , Or the red color of rhodamine) or a fluorogenic compound. Other indicators such as dyes (eg, pH and redox) and luminogenic compounds are intended to be included in this definition. In a preferred embodiment, colorimetric indicators of the present invention include, but are not limited to, chromogenic substrates, redox indicators, and pH indicators. In some particularly preferred embodiments, the redox indicator is tetrazolium violet, while in other embodiments, it is redox purple. The colorimetric indicator can be monitored visually or by an apparatus or machine (eg, a colorimeter, photometer, or camera).
[0094]
As used herein, the terms "chromogenic compound" and "chromogenic substrate" refer to any compound that is useful in a detection system due to its light absorption or emission characteristics. The term is intended to include any enzymatic cleavage products (soluble and insoluble) that can be detected visually or using an optical machine. The name "dye formation" includes all enzyme substrates that produce an end product that can be detected as a color change. This can be any color as used in the conventional sense of "color" such as indigo, blue, red, yellow, green, orange, brown, as well as any color detectable by fluorescence (eg, the yellow-green color of fluorescein) , Or the red color of rhodamine) or a fluorogenic compound. Other indicators such as dyes (eg, pH and redox) and luminogenic compounds are intended to be included in this definition.
[0095]
The commonly used meanings of the terms "pH indicator", "redox indicator", and "redox indicator" as used herein are intended. Thus, "pH indicator" includes all compounds commonly used for detecting pH changes. pH indicators include phenol red, neutral red, bromothymol blue, bromocresol purple, bromocresol green, bromochlorophenol blue, m-cresol purple, thymol blue, bromocresol purple, xylenol blue, methyl red, methyl orange, and cresol Red, but is not limited thereto. The terms "redox indicator" and "redox indicator" include all compounds commonly used for detecting redox potential (ie, "eH"). The indicators include, but are not limited to, various types or forms of tetrazolium, resazurin, methylene blue, and quinone imido redox dyes, including compounds known as "methyl purple" and methyl purple derivatives. The quinone imido redox dye known as methyl purple is referred to herein as "redox purple" (see, for example, US Pat. No. 5,882,882, which is incorporated herein by reference). In a particularly preferred embodiment, "redox purple" includes compounds having the chemical structure shown in FIG. 5, IV of US Pat. No. 5,882,882. Analogous derivatives of reagents (eg, alkali salts, alkyl O-esters) with altered properties (eg, solubility, cell permeability, toxicity) and / or altered color / absorption wavelength can be obtained from the accompanying It is intended to be generated using methods with minor modifications to the methods described in the examples. In the present invention, it is also intended that various forms of “redox purple” (eg, salt and the like) can be effectively used as a redox indicator.
[0096]
As used herein, the terms "test means" and "test device" refer to at least one organism having at least one characteristic (eg, utilizing a particular carbon source, nitrogen source, or chromogenic substrate, and / or BAC). Used for test systems to be tested for drug sensitivity). This definition is intended to include any suitable means, including reaction mixtures, suspensions, or tests. The term is intended to include microplates, petri dishes, microcard devices, or any other support structure suitable for use. For example, a microplate in which at least one gelling initiator is contained in each of a plurality of wells or compartments constitutes the test means. Another example of a testing means is a microplate in which the gel initiation means is not included in the well. It is also contemplated that other compounds such as a carbon source or BAC are included within the compartment. This definition includes Microplate ™ microtiter plates (available from Biolog) for characterizing microorganisms. This definition is also similar in function, but much smaller than a standard microtiter plate, "microcard" or small plate or card (e.g., many test devices can be conveniently held by the user's hand) ) Is intended. In a particularly preferred embodiment, the microcard is a microcard ™ device (Biotech) described in US Pat. Nos. 5,589,350 and 5,800,785, both of which are incorporated herein by reference. (Available from logs). The present invention is not intended to be limited to any particular size or arrangement of test equipment or means. For example, various formats are contemplated for use with the present invention. Formats include, but are not limited to, microtiter plates (including, but not limited to, Microplate ™), miniature test plates (eg, MicroCard ™ miniature test cards), Petri plates, and separate, separate plates. These include, but are not limited to, Petri plates with internal distributors used to separate media, test tubes, and many other formats.
[0097]
As used herein, the term "gelling agent" is used in a broad general sense and includes compounds obtained from natural sources as well as compounds prepared by synthesis. As used herein, the term refers to any substance that at least partially solidifies when certain conditions are met. For example, one of the gelling agents included in this definition is a divalent cation (eg, Mg²⁺Or Ca²⁺Gelrite, a gellan that forms a gel when exposed to). Gellite ™ is a gellan gum produced by deacetylating the natural polysaccharides produced by Pseudomonas elodea, Kang et al. (US Pat. Nos. 4,326,052 and 4,326,053).
[0098]
This definition includes various gelling agents obtained from natural sources, including protein-based gelling agents as well as carbohydrate-based gelling agents. One example is bacteriological agar, a polysaccharide complex extracted from kelp. This definition includes gelatin (eg, a water-soluble mixture of high molecular weight proteins obtained from collagen), pectin (eg, polysaccharides obtained from plants), carrageenan and alginic acid (eg, polysaccharides obtained from seaweed), and rubber. Also included are compounds such as (eg, sticky secretions from certain plants and bacteria). Various carrageenan preparations are contemplated for use in the present invention, with i-carrageenan constituting a preferred embodiment. It is also contemplated that the gelling agents used in the present invention are commercially available and available from suppliers such as Difco, BBL, Oxoid, Marcor, Sigma, or other sources. .
[0099]
The term "gelling agent" is not intended to be limited to compounds that form a hard gel material. Simply ranges from thick or viscous colloidal suspensions to hard gels are contemplated. Also, the invention is not intended to be limited to the time it takes for the suspension to gel.
[0100]
Importantly, the present invention is intended to provide a gelling agent suitable for producing a matrix in which an organism can grow (ie, a “gel matrix”). The gel matrix of the present invention is a colloidal suspension of an organism formed when an organism is mixed with an aqueous solution containing a gelling agent and the suspension is exposed to a gelling initiator. This colloidal gel suspension is intended to be a continuous matrix medium in which organisms are uniformly dispersed without sedimentation from the matrix under the influence of gravity. The gel matrix supports growth of the organism inside the gel suspension, at the bottom of the gel suspension, and at the top of the gel suspension.
[0101]
As used herein, the term "gelling initiator" means any compound or element that results in gel matrix formation after exposing the gelling agent to certain conditions or reagents. A “gelling initiator” is a cation (eg, Ca²⁺, Mg²⁺, And K⁺) Are intended to be included. The suspension containing the gelling agent remains “non-gelling” until the gelling agent contacts at least one gelling initiator (ie, the suspension is not thickened, does not increase in viscosity, Does not solidify). After contact, the suspension becomes viscous and may or may not form a hard gel (ie, "gelation" occurs upon contact).
[0102]
As used herein, the term "inoculum suspension" or "inoculum" is used in reference to a suspension that can inoculate the organism to be tested. The term "inoculation suspension" is not intended to be limited to a particular liquid or liquid substance. For example, the inoculum suspension may consist of water, saline, or an aqueous solution containing at least one gelling agent. It is also contemplated that the inoculum suspension may include components to which water, saline, or any aqueous material is added. In one embodiment, the component is intended to include at least one component useful for the microorganism of interest. The present invention is not intended to be limited to particular components.
[0103]
As used herein, the term "kit" is used in reference to combinations of reagents and other materials. Kits include reagents such as BACs, carbon sources, nitrogen sources, chromogenic substrates, diluents, and other aqueous solutions, and dedicated microplates (eg, GN, GP, ES, YT, SF-N obtained from biologs). , SF-P, and other microplates ™), inoculum, small test cards (eg, Microcard ™), and plated agar media are contemplated. The present invention contemplates other reagents useful for microbial growth, identification, and / or BAC susceptibility determination. For example, the kit may include reagents for detecting microbial growth after inoculation of the kit components (eg, tetrazolium or resazurin is included in certain embodiments of the invention). The term "kit" is not intended to be limited to any particular combination of reagents and / or other materials. Further, in contrast to methods and kits that involve inoculating the organism on or in a preformed matrix such as an agar surface or broth, the present invention provides that the organism is suspended in a gel-forming matrix. With test plate inoculation.
[0104]
As used herein, the term "oocyte" means a female gamete cell and includes primary oocytes, secondary oocytes, and mature unfertilized eggs. Oocytes are large cells that have a large nucleus (ie, germ vesicle) surrounded by egg quality. Egg quality contains non-nuclear cytoplasmic components, including mRNA, ribosomes, mitochondria, yolk proteins, and the like. The membrane of the oocyte is referred to herein as the "plasma membrane."
[0105]
As used herein, the term "pre-maturation oocyte" refers to a cell that has been isolated from the ovaries (e.g., by aspiration) but has not been exposed to maturation media in vitro, after the oocyte stage (i.e., Female gametes (after mitotic proliferation has occurred). The aspiration process initiates the oocyte maturation process, but the completion of the in vitro maturation process (ie, formation of a secondary oocyte that has extruded the primary polar body) exposes the aspirated oocyte to maturation media. It is known to those skilled in the art that Premature oocytes are generally arrested in the first late stages of meiosis.
[0106]
The term "pre-fertilized oocyte" as used herein, i.e., such as a pre-mature oocyte after exposure to a maturation medium in vitro but before exposure to sperm, Refers to mature but not fertilized female gamete cells. Pre-fertilized oocytes have completed first meiosis, have released the primary polar body, and have no nuclear membrane (the nuclear membrane is not remodeled until fertilization occurs. After fertilization, secondary polar body extrusion and male sex Second meiosis occurs with the formation of the pronucleus and the female pronucleus). Pre-fertilized oocytes may also be referred to as mature oocytes in metaphase II of second meiosis.
[0107]
As used herein, the term "unfertilized egg" or "unfertilized oocyte" means any non-fertilized female gamete cell, and these terms refer to pre-mature and pre-fertilized oocytes Contains both cells.
[0108]
Although the embodiments have been described in some detail, many modifications and variations of the preferred embodiments are possible without departing from the invention.
[0109]
Experiment
The following examples are provided to demonstrate and further illustrate certain preferred embodiments and aspects of the present invention, and are not to be construed as limiting the scope of the invention.
[0110]
In the following experimental example disclosure, the following abbreviations apply: eq (equivalent); M (molar); μM (micromolar); N (defined); mol (mol); mmol (mmol); G (gram); mg (milligram); μg (microgram); ng (nanogram); 1 or L (liter); ml (milliliter); μl (microliter); Mm (micrometers); nm (nanometers); ° C. (degrees Celsius); TSA (tripcase soy agar); YME or YEME (yeast extract-malt extract agar; Redigel) (PC) Gel Scientific (RCR Scientific, Goshen, IN); Mark) (Merck and Co., Rahway, NJ); Remel (Remel, Lenexa, KS); Oxoid (Oxoid, Basingstoke, England); BBL (Becton Dickinson Microbiology Systems (Decton) Microbiology Systems, Cockeysville, MD; Difco (Difco Laboratories), Detroit, MI, now a part of Becton Dickinson); Acummedia, Acummedia, Baltimore, Inc. US Biochemical) (U.S. Biochemical Corporation) (U.S. Biochemical Corp.), Cleveland, OH); Fisher (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA); Sigma (Sigma Chemical Co., Ltd.). Biolog (Biolog, Inc., Hayward, CA); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland); NCYC (National Collection of East Cultures). Yeast Cultures), Norwich, England); Laboratory Standards Council); and molecular Interview error devices seeds (Molecular Devices) (leakage Interview error devices seeds, Mountain View, CA). Three letter abbreviations conventionally used for amino acids (eg, “ala” indicates alanine or an alanine residue) are also used in some of the examples below.
[0111]
Example 1
BAC test of bacteria
In this example, the susceptibility of E. coli (MG1655) was tested on microarrays containing various additional compounds in the presence of vancomycin (10 μg / ml) or sulfamethoxazole (235 μg / ml). The microarrays were in three Biolog ™ susceptibility test panels called ES1, ES2, and ES3 Microplate ™. A sterile aqueous suspension containing 0.40% NaCl, 0.03% Pluronic F68, 0.01% phytagel, and 0.01% tetrazolium violet was subjected to 85% permeability (using a Biolog ™ turbidimeter). The organism was added to a cell density of Immediately before inoculating the microarray wells with the organism (100 μl / well), the BAC to be tested was added to the suspension. The wells of these ES Microplates ™ contained a basic broth medium consisting of tryptone (2 g / L), yeast extract (1 g / L), and NaCl (1 g / L).
[0112]
In addition to one positive control well, the wells of the ES1 plate contained the following antimicrobial agents (one compound at a specific concentration per well): acriflavine (4.0 μg / ml, 8.0 μg / ml) ml, and 16 μg / ml), ampicillin (2.0 μg / ml, 4.0 μg / ml, 8.0 μg / ml, and 16 μg / ml), nafcillin (75 μg / ml, 150 μg / ml, 300 μg / ml, and 600 μg) / Ml), lincomycin (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml, and 400 μg / ml), chloramphenicol (0.1 μg / ml, 0.2 μg / ml, 0.4 μg / ml, and 0 μg / ml) 0.8 μg / ml), chlorotetracycline (0.125 μg / ml, 0.25 μg / ml, 0.50 μg / ml, and 1.0 μg / ml). ml), tetracycline (0.033 μg / ml, 0.066 μg / ml, 0.133 μg / ml, and 0.266 μg / ml), gentamicin (0.25 μg / ml, 0.50 μg / ml, 1.0 μg / ml) ml, and 2.0 g / ml), kanamycin (0.25 μg / ml, 0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, and 2.0 μg / ml), neomycin (0.75 μg / ml, 1.5 μg / ml) ml, 3.0 μg / ml, and 6.0 μg / ml), vancomycin (10 μg / ml, 20 μg / ml, 40 μg / ml, and 80 μg / ml), bacitracin (208 μg / ml, 416 μg / ml, 833 μg / ml, And 1666 μg / ml), clindamycin (3.3 μg / ml, 6.6 μg / ml, 13.2 μg / ml, and 26. 4 μg / ml), cloxacillin (100 μg / ml, 200 μg / ml, 400 μg / ml, and 800 μg / ml), erythromycin (2.5 μg / ml, 5.0 μg / ml, 10 μg / ml, and 20 μg / ml), penicillin G (5 μg / ml, 10 μg / ml, 20 μg / ml, and 40 μg / ml), novobiocin (33 μg / ml, 66 μg / ml, 133 μg / ml, and 266 μg / ml), spiramycin (5.0 μg / ml, 10 μg) / Ml, 20 μg / ml, and 40 μg / ml), trimethoprim (0.17 μg / ml, 0.33 μg / ml, 0.67 μg / ml, and 1.3 μg / ml), streptomycin (0.38 μg / ml, 0 .75 μg / ml, 1.5 μg / ml, and 3.0 μg / ml), Gin (0.75 μg / ml, 1.5 μg / ml, 3.0 μg / ml, and 6.0 μg / ml), cefuroxime (0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, 2.0 μg / ml, and 4 μg / ml). 0.0 μg / ml), roxithromycin (10 μg / ml, 20 μg / ml, 40 μg / ml, and 80 μg / ml), and piperacillin (0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, 2.0 μg / ml, and 4.0 μg / ml).
[0113]
The wells of the ES2 plate contained the following antimicrobial agents (one compound at a specific concentration per well). Azomycin (0.2 μg / ml, 0.4 μg / ml, 0.8 μg / ml, and 1.6 μg / ml), rifampin (0.25 μg / ml, 0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, and 2 μg / ml) 0.0 μg / ml), tylosin tartrate (25 μg / ml, 50 μg / ml, 100 μg / ml, and 200 μg / ml), cefazolin (0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, 2.0 μg / ml, and 4 μg / ml) 0.0 μg / ml), cephalotin (2.5 μg / ml, 5.0 μg / ml, 10 μg / ml, and 20 μg / ml), cefaclor (0.66 μg / ml, 1.33 μg / ml, 2.66 μg / ml) And 5.33 μg / ml), rifamycin SV (1.5 μg / ml, 3.0 μg / ml, 6.0 μg / ml, and 12 μg / ml), cefsulosin 4.0 μg / ml, 8.0 μg / ml, 16 μg / ml, and 32 μg / ml), cefotaxime (0.05 μg / ml, 0.1 μg / ml, 0.2 μg / ml, and 0.4 μg / ml), Cefoxitin (0.75 μg / ml, 1.5 μg / ml, 3.0 μg / ml, and 6.0 μg / ml), puromycin (12 μg / ml, 25 μg / ml, 50 μg / ml, and 100 μg / ml), spec Tinomycin (3.5 μg / ml, 7.0 μg / ml, 14 μg / ml, and 28 μg / ml), fusidic acid (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml, and 400 μg / ml), fosfomycin (0. 2 μg / ml, 0.4 μg / ml, 0.8 μg / ml, and 1.6 μg / ml), phleomycin (0.25 μg / ml, 0. μg / ml, 1.0 μg / ml, and 2.0 μg / ml), amikacin (0.25 μg / ml, 0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, and 2.0 μg / ml), isoniazid (300 μg / ml ml, 600 μg / ml, 1200 μg / ml, 2400 μg / ml), ethionamide (25 μg / ml, 50 μg / ml, 100 μg / ml, and 200 μg / ml), SDS (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml, 400 μg) / Ml), dodecyltrimethylammonium bromide (10 μg / ml, 20 μg / ml, 40 μg / ml, and 80 μg / ml), BIGCHAP (2000 μg / ml, 4000 μg / ml, 8000 μg / ml, and 16,000 μg / ml), Niaproof (0.08%, 0.16%) , 0.32%, and 0.64%), CHAPS (1500 μg / ml, 3000 μg / ml, 6000 μg / ml, 12,000 μg / ml), and N-lauryl sarcosine (1000 μg / ml, 2000 μg / ml, 4000 μg / ml). ml, and 8000 μg / ml).
[0114]
The wells of the ES3 plate contained the following antimicrobial agents (one compound at a specific concentration per well): nalidixic acid (0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, 2.0 μg / ml, 4. 0 μg / ml), taurocholic acid (600 μg / ml, 1200 μg / ml, 2400 μg / ml, and 4800 μg / ml), colistin (0.25 μg / ml, 0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, and 2.0 μg) / Ml), procaine (2500 μg / ml, 5000 μg / ml, 10,000 μg / ml, and 20,000 μg / ml), diamide (16.6 μg / ml, 33.3 μg / ml, 66.6 μg / ml, and 133 μg) / Ml), hydroxyamine (12 μg / ml, 25 μg / ml, 50 μg / ml, and 100 μg / ml), guanidinium (500 μg / ml, 1000 μg / ml, 2000 μg / ml, and 4000 μg / ml), copper (II) chloride (20 μg / ml, 40 μg / ml, 80 μg / ml, and 160 μg / ml), zinc chloride (10 μg / ml, 20 μg / ml, 40 μg / ml, and 80 μg / ml), cadmium chloride (5.0 μg / ml, 10 μg / ml, 20 μg / ml, and 40 μg / ml), nickel chloride (20 μg / ml, 40 μg / ml, 80 μg / ml) ml, and 160 μg / ml), chromium chloride (100 μg / ml, 200 μg / ml, 400 μg / ml, and 800 μg / ml), sodium selenite (100 μg / ml, 200 μg / ml, 300 μg / ml, and 400 μg / ml) ), Potassium tellurate (0.2 μg / ml, 0.4 μg / ml, 0 8 μg / ml, and 1.6 μg / ml), manganese sulfate (100 μg / ml, 200 μg / ml, 400 μg / ml, and 800 μg / ml), cobalt chloride (12 μg / ml, 25 μg / ml, 50 μg / ml, and 100 μg) / Ml), silver chloride (2.0 μg / ml, 4.0 μg / ml, 8.0 μg / ml, and 16 μg / ml), potassium chromate (10 μg / ml, 20 μg / ml, 40 μg / ml, and 80 μg / ml). ml), potassium bromide (225 μg / ml, 450 μg / ml, 900 μg / ml, and 1800 μg / ml), sodium cyanate (155 μg / ml, 310 μg / ml, 600 μg / ml, and 1200 μg / ml), sodium azide (500 μg / ml, 1000 μg / ml, 2000 μg / ml, and 400 μg / ml μg / ml), picolinic acid (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml, and 400 μg / ml), potassium superoxide (100 μg / ml, 200 μg / ml, 400 μg / ml, and 800 μg / ml), and menadione (3.3 μg / ml, 6.6 μg / ml, 13.3 μg / ml, and 26.6 μg / ml).
[0115]
From the results of the first experiment, in the presence of 10 μg / ml vancomycin, the E. coli strains tested showed a transient increase in sensitivity only to 10 μg / ml, 20 μg / ml, 40 μg / ml, and 80 μg / ml vancomycin. It turned out that it showed. In addition, this strain contains 33 μg / ml and 66 μg / ml novobiocin, 0.17 ng / ml, 0.33 ng / ml, 0.67 ng / ml, and 1.3 ng / ml trimethoprim, 2.0 μg / ml and 4 μg / ml. 0.0 μg / ml cefazolin, 10 μg / ml and 20 μg / ml cephalothin, 0.75 μg / ml and 1.5 μg / ml cefoxitin, 200 μg / ml and 400 μg / ml fusidic acid, and 1.0 μg / ml, It showed only an increased sensitivity to nalidixic acid at 0.0 μg / ml, and 4.0 μg / ml. Normal sensitivity levels were observed for other tests on ES1, ES2 and ES3 microarray panels.
[0116]
The results also show that, in the presence of 235 μg / ml sufamethoxazole, E. coli strains were 0.25 μg / ml, 0.50 μg / ml, and 1.0 μg / ml chlorotetracycline, 0.033 μg / ml, 0 Showed increased resistance to 0.066 μg / ml, 0.133 μg / ml, and 0.266 μg / ml of tetracycline, 66 μg / ml and 133 μg / ml of novobiocin, but 0.17 ng / ml, 0.33 ng / ml, 0.67 ng / ml, and 1.3 ng / ml trimethoprim, 0.75 μg / ml, 1.5 μg / ml, 3.0 μg / ml, and 6.0 g / ml cephaloridine, 0.2 μg / ml, 0 Azomycin at 0.4 μg / ml, 0.8 μg / ml, and 1.6 μg / ml, 0.5 μg / ml, 1.0 μg / ml, Cefazolin at 5.0 μg / ml, and 4.0 μg / ml, 5.0 μg / ml, 10 μg / ml, and 20 μg / ml cephalotin, 1.33 μg / ml, 2.66 μg / ml, and 5.33 μg / ml. Increased sensitivity to cefaclor, 8 μg / ml and 16 μg / ml cefsulosin, 20 μg / ml and 40 μg / ml nickel chloride, 200 μg / ml and 400 μg / ml chromium chloride, and 12 μg / ml and 25 μg / ml cobalt chloride It turned out that it showed. Normal sensitivity levels were observed for other tests on ES1, ES2 and ES3 microarray panels. Thus, this example clearly illustrates that the present invention can be used to test synergy and / or antagonism using a combination of BACs.
[0117]
Example 2
Antibacterial agent test
In this example, experiments are described to determine whether it is feasible to use PM to analyze the metabolic effects and mechanisms of action of antimicrobial compounds. In particular, this experiment shows that compounds acting through (“target-specific”) interactions with specific bacterial proteins can be distinguished from compounds acting through non-specific mechanisms simply by a signature metabolic profile. It was designed to see if it could be distinguished based on the differences in the profiles. In addition, this experiment was designed to ascertain whether different interactors of the same pathway produced similar signature profiles, as well as whether different pathways of interactors produced distinctly different profiles.
[0118]
Twenty chemicals were selected for inclusion in these experiments. While fifteen of these chemicals are believed to have relatively specific modes of action (listed as "single target antimicrobials" in Table 3 below), five antimicrobial agents have non-specific modes of action. (Listed as "multi-target antimicrobial agents"). Among the single target compounds are cell wall (ampicillin, cephalotin, fosfomycin, and bacitracin), ribosomes (chloramphenicol, streptomycin, and tetracycline), or DNA gyrase (naridikinic acid, oxophosphoric acid, and coomamycin). There are three sets of antimicrobial agents with similar modes of action.
[0119]
Since it is desirable to use concentrations that partially inhibit growth, an initial set of experiments was performed to select the concentration of each chemical. Using a concentration that completely blocks growth or below the concentration that blocks growth does not provide any information. The criterion for purple reduction due to inhibition of tetrazolium violet reduction (ie, respiration) was used to determine the concentration that partially inhibited growth. Each compound was tested at two concentrations that resulted in partial respiratory inhibition. The lower concentration, called “1 ×”, was the lowest concentration that produced detectable respiratory inhibition. The higher density, called "2x", was twice the 1x density. For most chemicals, doubling up to 4x resulted in concentrations that were not useful and completely inhibited growth. Therefore, only 1 × and 2 × concentrations were used. It was confirmed that the choice of chemical concentration was an important parameter for management. However, the selection criteria used herein turned out to be quite reasonable. Only canavanine appeared to require slightly higher concentrations to produce comparable results. If the concentrations are properly chosen, only one concentration is required for the assay.
[0120]
[Table 3] Compounds used and their modes of action

[0121]
In these experiments, E. coli MG1655 was tested against two concentrations of 20 antimicrobial agents (7 PM each, for a total of 280 PMs). PM without any antimicrobial (a set of 7) was measured daily as a control (this total excludes data from control strains). In each of these experiments, each PM contained 95 phenotypes, so the total number of phenotypes analyzed here was 26,600. Each PM was monitored kinetically every 15 minutes for a 48 hour incubation period using a specialized instrument described in US patent application Ser. No. 09 / 277,353, which is incorporated herein by reference. Therefore, the total number of data points in this experiment was 5,107,200. Bioinformatics software (Biolog ™) was used to analyze these data.
[0122]
The result of the data collected in a single measurement is the kinetic phenotype of cells exposed to the layered antimicrobial agent and compared to the phenotype of cells not exposed to the antimicrobial agent. When the two kinetic traces of tetrazolium reduction (ie, cell respiration) overlap, there is no difference in response to this phenotype (indicated as "0"). The organism is scored "susceptible" or "S" when the control trail exceeds the antimicrobial trail. When the antimicrobial tracking record exceeds the control tracking record, the organism is scored as "resistant" or "R". Based on a visual inspection of the PM after incubation, a threshold for determining the S and R results was determined. The software then automatically calculated the area from differential tracking and applied a threshold to score all 26,600 phenotypes as S, 0, or R.
[0123]
A distance matrix was created from the S-0-R data. The S-0-R response of one antimicrobial (a series of 665 values) was compared to the response for another antimicrobial and the differences were summed. The difference between 0 and S or the difference between 0 and R was set to a value of 1, and the difference between S and R was set to a value of 2. Then a series of 665 differences were summed. Antimicrobial pairs with similar responses have lower differences, and antimicrobial pairs with very different responses have higher differences. Comparing all pairs yields a distance matrix, which can be used as input to an algorithm that creates various cluster diagrams that help to simplify and summarize the data.
[0124]
The results show that the response of the organism to the different classes of antimicrobial agents varies widely. For example, FIG. 4 shows a phylogenetic tree of data obtained with 1 × concentration levels of each antimicrobial. Four clusters of cell wall inhibitors (ampicillin, cephalotin, fosfomycin, and bacitracin) cluster, as well as three ribosome inhibitors (chloramphenicol, streptomycin, and tetracycline). Also, two of the three DNA gyrase inhibitors (oxophosphoric acid and coomamycin) clustered. All single target antimicrobial agents except sulfathiazole and polymyxin B are in the densely clustered center of the phylogenetic tree, while all multitarget antimicrobial agents except canavanine are at the periphery of the phylogenetic tree.
[0125]
First, these results show that the present invention can be used to distinguish single-target and multi-target antimicrobials. While multi-target antimicrobials make cells broad and non-specifically hypersensitive, single-target antimicrobials have a specific “fingerprint”. Second, with this fingerprint pattern, it appears that antimicrobial agents can be successfully classified based on their mode of action and distinguished from other antimicrobial agents having different modes of action.
[0126]
In one case, the results were not as simple as expected. In this case, nalidixic acid did not cluster with the other two DNA gyrase inhibiting chemicals. This may indicate some of the mechanism of action of the drug. In addition, polymyxin B, cerulenin, and sulfathiazole resulted in very similar multi-target antimicrobial agents. Polymyxin B and cerulenin both affect membrane synthesis, which can disrupt many cellular properties as well as promote nonspecific permeation of other antimicrobial agents.
[0127]
Example 3
BAC test of yeast
In this example, the response of yeast to various compounds was tested. The yeast used in these experiments was Saccharomyces cerevisiae (BY4741; obtained from Dr. Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). The genotype of this strain was shown to be Mata (ie, mating type "a"), ura-, his-, leu-, and met-.
[0128]
In these experiments, it was determined whether this strain could grow in culture media without methionine. Methionine prevents the organism from testing for the availability of other candidate sulfur sources (ie, if methionine is added to the culture medium, the organism preferentially uses methionine as the sulfur source).
[0129]
Yeast was grown on R2A agar medium (Accumdia) at 30 ° C. for 48 hours. Cells are removed from the agar surface using a sterile cotton swab and inoculated (50 mM glucose, 0.15 mM uracil, 0.15 mM) to a cell density of 65% permeability (measured using a Biolog ™ turbidimeter). L-histidine, 0.15 mM L-leucine, 0.15 mM MgCl₂, 1.0 mM CaCl₂, 2.0 mM NaCl, 1.0 mM KCl, 3.0 mM NH₄Cl, 1.0 mM NaH₂PO₄, 0.1 mM Na₂SO₄, 0.01% iodonitrotetrazolium violet, 0.01% phytagel (gellan gum) and 0.03% pluronic F-68). The pH was adjusted to 6.0.
[0130]
The cell suspension (100 μl / well) was then used to inoculate a Biolog ™ EA Microplate ™ that tests the ability of the cells to be stimulated by a set of 95 different nutrients. The nutrients contained in the microarray were as follows: LB medium (10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, and 5 g / L NaCl), L-alanine (25 μM), L-arginine (25 μM), L- Asparagine (25 μM), L-aspartic acid (25 μM), L-cysteine (25 μM), L-glutamic acid (25 μM), adenosine 3 ′, 5′-cyclic monophosphate (100 μM), adenine (100 μM), adenosine (100 μM) 2′-deoxyadenosine (100 μM), L-glutamine (25 μM), glycine (25 μM), L-histidine (25 μM), L-isoleucine (25 μM), L-leucine (25 μM), L-lysine (25 μM), L-methionine (25 μM), L-phenylalanine (25 μM), guanosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate (100 μM), guanine (100 μM), guanosine (100 μM), 2′-deoxyguanosine (100 μM), L-proline (25 μM), L-serine (25 μM), L-threonine (25 μM) ), L-tryptophan (25 μM), L-tyrosine (25 μM), L-valine (25 μM), L-isoleucine and L-valine (25 μM each), trans-4-hydroxy L-proline (25 μM), (5) 4-aminoimidazole-4 (5) -carboxamide (1 mM), hypoxanthine (100 μM), inosine (100 μM), 2′-deoxyinosine (100 μM), L-ornithine (100 μM), L-citrulline (100 μM), chorismin Acid (100 μM), (−) shikimic acid (100 μM), L-homoserine Cuton (100 μM), D-alanine (25 μM), D-aspartic acid (25 μM), D-glutamic acid (25 μM), DL-α, ε-diaminopimelic acid (25 μM), cytosine (100 μM), cytidine (100 μM), 2, -Deoxycytidine (100 μM), putrescine (25 μM), spermidine (25 μM), spermine (25 μM), pyridoxine (0.25 μM), pyridoxal (0.25 μM), pyridoxamine (0.25 μM), β-alanine (0.25 μM) ), D-pantothenic acid (0.25 μM), orotic acid (1 mM), uracil (100 μM), uridine (100 μM), 2′-deoxyuridine (100 μM), quinolinic acid (0.25 μM), nicotinic acid (0. 25 μM), nicotinamide (0.25 μM), β-nicotine Midadenosine dinucleotide (0.25 M), δ-amino-levulinic acid (0.25 μM), hematin (0.25 μM), deferoxamine mesylate (0.25 μM), glucose (1 mM), N-acetyl-D-glucosamine (100 μM), thymine (100 μM), glutathione (reduced form; 100 μM), thymidine (100 μM), oxaloacetate (1 mM), d-biotin (0.25 μM), cyanobalamine (0.25 μM), p-amino Benzoic acid (0.25 μM), folic acid (0.25 μM), inosine (100 μM), thiamine (25 μM), thiamine (0.25 μM), thiamine pyrophosphate (0.25 μM), riboflavin (0.25 μM), pyrroloquinoline Quinone (0.25 μM), Menadione (0.25 μM) Myo-inositol (0.25 μM), butyric acid (100 μM), DL-α-hydroxybutyric acid (100 μM), α-ketobutyric acid (100 μM), caprylic acid (100 μM), DL-α-lipoic acid (oxidized form; 0.25 μM) ), DL-mevalonic acid (0.25 μM), DL-carnitine (0.25 μM), choline (0.25 μM), Tween (Tween) -20 (0.01%), Tween-40 (0.01%) , Tween-60 (0.01%), and Tween-80 (0.01%). One well (A-1) contains no nutrients and is used as a reference (ie, control) well.
[0131]
After inoculation, the microarray was incubated at 30 ° C. for 2 days and visually observed. All wells containing nutrients that stimulated cell growth were dark pink due to increased cell respiration and decreased iodonitrotetrazolium violet dye.
[0132]
Three wells showed a dark pink color. These wells were those containing L-methionine, glutathione, and pyridoxine. Although methionine was expected to stimulate proliferation, glutathione and pyridoxine stimulated proliferation and were not expected to be a substitute for methionine. In this case, glutathione could not be used because the ability of the organism to utilize various sulfur sources was also investigated, as it also contained sulfur. However, pyridoxine does not contain sulfur and could be used as a completely satisfactory substitute for methionine as a nutrient for Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain. Thus, instead of growing and testing BY4741 on a minimal medium containing uracil, L-histidine, L-leucine, and L-methionine, this strain is transformed into a minimal medium containing uracil, L-histidine, L-leucine, and pyridoxine. It is possible to grow and test on media.
[0133]
From the foregoing examples, the present invention is directed to the widespread and rapid phenotypic array testing of microorganisms and / or other cell types using BACs in many applications and formats (or arrangements), as well as to the development and development of antimicrobial agents. It is clear that this is an unexpected and highly improved system for research. In addition, automatic and manual systems that read a point in time or kinetics can be used with the present invention. For example, the results may be visually (ie, visually) observed by a person performing the test without the aid of a machine. Alternatively, the results may be passed through, within, or within each well of a multi-test device, such as a microtiter test plate (eg, Microplate ™) or a miniature test card (eg, MicroCard ™). Can be obtained using an apparatus (e.g., a microtiter plate reader) that measures the transmittance, absorbance, or reflectivity of the DNA. The kinetics may be read by taking readings at frequent intervals, or by reading the test results continuously over time. Examples of devices particularly suitable for incubating and performing the methods of the present invention include co-pending U.S. patent applications Ser. Nos. 09 / 277,353 and 09 / 267,039, both incorporated herein by reference. (Incorporated).
[0134]
In an embodiment utilizing a multi-test gel matrix, the present invention provides numerous advances and advantages over the prior art, including: (1) performing, inoculating test wells while cells, mycelia, Extremely safe because spores do not spill or become aerosols; (2) biochemical reactions occur quickly, resulting in faster time or days than commonly used methods and final results (3) a clear image of the metabolic characteristics of the microorganism is obtained because a clear biochemical or phenotypic reaction is obtained; (4) a dark, sharp biochemical reaction and color change are obtained; (5) A uniform color and / or turbidity is obtained because the cells, hyphae and / or spores do not settle or clump to the bottom of the well and do not adhere to the sides of the well; Very easy to observe, visually or using an optical instrument (eg, Biolog Microstation Reader ™); and (7) The biological process is extremely simple and efficient, making multiple tests Little work is needed on the part of the scholar. All of these advantages increase the speed and accuracy of scoring test results in studies that perform comparative phenotypic analysis for the assessment of BAC using any cell type, including microbial strains.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a simplified schematic diagram of one embodiment of the present invention in which an intracellular drug target is inactivated by adding a drug to the cell. This test is performed using PM.
FIG. 2 is a simplified schematic diagram of one embodiment of the present invention in which synergistic and antagonist interactions are detected and characterized. This test is also performed using PM.
FIG. 3 is a simplified schematic diagram of the environmental conditions in various wells in a microtiter plate and the effect of these conditions on cells in the wells.
FIG. 4 is a phylogenetic tree showing the response of E. coli to various antimicrobial agents.

Claims (38)

A method for testing the response of at least two cells to at least one biologically active chemical, comprising the steps of:
a) i) A defined medium in which each well of the test device contains at least one substrate selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, a drug, and a chromogenic test substrate. A test device having at least two wells comprising:
ii) a first suspension comprising a first cell and at least one biologically active chemical; and iii) a second suspension comprising a second cell and at least one biologically active chemical. Providing a suspension of
(B) inoculating said first suspension and said second suspension into a well of a test device; and (c) said first cells for at least one biologically active chemical; Observing the response of the second cell. The method of claim 1, wherein the test device is selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. The method of claim 1, wherein the suspension further comprises a gelling agent. The method of claim 1, wherein the test device further comprises a gelling initiator in the well. The method of claim 1, wherein the suspension further comprises a colorimetric indicator. The method of claim 1, wherein the test device further comprises a colorimetric indicator in the well. The method of claim 1, wherein the observation is visual. The method of claim 1, wherein the observation is made with an instrument. 2. The method of claim 1, wherein the response of the first and second cells is non-radioactive. 2. The method of claim 1, wherein the first cell and the second cell are eukaryotic cells. 11. The method according to claim 10, wherein the eukaryotic cell is an animal cell. The method according to claim 11, wherein the animal cell is a mammalian cell. 13. The method according to claim 12, wherein the mammalian cell is a human cell. 12. The method according to claim 11, wherein the mammalian cell is a mutant cell. The method according to claim 10, wherein the first cell and the second cell are fungal cells. 2. The method of claim 1, wherein the first cell and the second cell are prokaryotic cells. 17. The method of claim 16, wherein the prokaryotic cells are selected from the group consisting of eubacteria and archaebacteria. 2. The method of claim 1, wherein the drug comprises at least one antimicrobial agent. A method for comparing the effects of at least two biologically active chemicals, comprising the following steps:
a) i) a first cell suspension comprising at least one cell type and at least one biologically active chemical;
ii) a second comprising the same at least one cell type as in step i) and at least one biologically active chemical different from the biologically active chemical in the first cell suspension. Cell suspension,
iii) a first test device having a well containing a defined medium containing at least one substrate selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth-stimulating nutrient, a drug, and a chromogenic test substrate. ,
iv) providing a second test device having a well containing at least one substrate selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, a sulfur source, a growth stimulating nutrient, a drug, and a chromogenic test substrate. ;
b) adding the first cell suspension to the wells of the first test device to provide a first phenotypic array;
c) adding the second cell suspension to the wells of the second test device to provide a second phenotypic array;
d) incubating the first phenotypic array and the second phenotypic array;
e) observing the response of the cell suspension in the first phenotype array and the second phenotype array; and f) monitoring the response of the first cell suspension in the first phenotype array. Comparing the response to the response of the second cell suspension in the second phenotypic array. 20. The method of claim 19, wherein the first test device and the second test device are selected from the group consisting of a microtiter plate and a microcard. 20. The method of claim 19, wherein the first cell suspension and the second cell suspension further comprise a gelling agent. 20. The method of claim 19, wherein the first test device and the second test device further comprise a gelling initiator in the well. 20. The method of claim 19, wherein the first cell suspension and the second cell suspension further comprise a colorimetric indicator. 20. The method of claim 19, wherein the first test device and the second test device further include a colorimetric indicator in the well. 20. The method of claim 19, wherein the first test device comprises the same substrate as the second test device. 20. The method of claim 19, wherein the observation is visual. 20. The method of claim 19, wherein the observation is made with an instrument. 20. The method of claim 19, wherein the response of the first and second cells is non-radioactive. 20. The method of claim 19, wherein comparing the responses is performed using multi-dimensional pattern analysis. 20. The method of claim 19, wherein the first and second cells are eukaryotic cells. 31. The method according to claim 30, wherein the eukaryotic cell is an animal cell. 31. The method of claim 30, wherein the animal cell is a mammalian cell. 33. The method of claim 32, wherein said mammalian cells are human cells. 33. The method of claim 32, wherein the mammalian cell is a mutant cell. 31. The method of claim 30, wherein the first cell and the second cell are fungal cells. 20. The method of claim 19, wherein the first cell and the second cell are prokaryotic cells. 37. The method of claim 36, wherein the prokaryotic cells are selected from the group consisting of eubacteria and archaebacteria. 18. The method of claim 17, wherein the drug comprises at least one antimicrobial agent.

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