JP2004510147A

JP2004510147A - High density array

Info

Publication number: JP2004510147A
Application number: JP2002530198A
Authority: JP
Inventors: スワンソン，メルビン　ジェイ．; ギア，パトリック　イー．
Original assignee: サーモディックス，インコーポレイティド
Priority date: 2000-09-27
Filing date: 2001-09-06
Publication date: 2004-04-02
Also published as: EP1326707A2; WO2002026376A3; WO2002026376A2; CA2423924A1; AU2001288960A1; MXPA03002748A

Abstract

本発明は、さまざまな密度のアレイ、中でも高密度アレイの製造法を提供する。一般に、この方法は、印刷ステップと照射ステップを含んでいる。印刷ステップでは、受容体分子を含む所定体積の試薬溶液を望むパターンになるようにして固体支持体に付着させる。一実施態様では、受容体分子を光反応剤で誘導体化する。別の実施態様では、固体支持体が光反応剤を備える。好ましい一実施態様では、受容体分子は核酸である。照射ステップでは、光反応基に照射を行なって受容体分子を固体支持体に固定化する。一実施態様では、中心間距離（すなわち“ピッチ”）は印刷されたスポットと同じだが直径がスポットの直径よりも小さい開口部を有するマスクを印刷されたパターンの上に被せ、照射を行なう。マスクは、印刷されたスポットよりも小さな直径の領域を照射できるようなものが好ましい。したがって本発明によれば、固定化される試薬スポットは、印刷された元のスポットよりも直径が小さくなる。別の実施態様では、照射ステップを、レーザーをミラーで反射させる技術を利用して実行することができる。望むのであれば、このプロセス全体を複数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。The present invention provides methods for producing arrays of various densities, especially high density arrays. Generally, the method includes a printing step and an irradiation step. In the printing step, a predetermined volume of the reagent solution containing the receptor molecules is applied to the solid support in a desired pattern. In one embodiment, the receptor molecule is derivatized with a photoreactive agent. In another embodiment, the solid support comprises a photoreactive agent. In one preferred embodiment, the receptor molecule is a nucleic acid. In the irradiation step, the photoreactive group is irradiated to immobilize the receptor molecule on the solid support. In one embodiment, a mask having an opening with the same center-to-center distance (or "pitch") as the printed spot but with a diameter smaller than the diameter of the spot is placed over the printed pattern and irradiated. The mask is preferably such that it can illuminate an area of smaller diameter than the printed spot. Thus, according to the invention, the reagent spot to be immobilized has a smaller diameter than the original printed spot. In another embodiment, the illuminating step may be performed using a technique that reflects the laser off a mirror. If desired, the entire process can be repeated multiple times to produce a high density array.

Description

【０００１】
本出願は、サーモディックス社（アメリカ合衆国の会社）を出願人とし、２００１年９月６日にＰＣＴ国際特許出願としてアメリカ合衆国を除くすべての国を指定して出願されたものである。
【０００２】
発明が属する技術分野
本発明は、固体支持体表面への核酸の固定化に関する。さらに詳細には、本発明は高密度核酸アレイに関する。
【０００３】
発明の背景
マイクロアレイは、さまざまな核酸配列を表面に固定化した小面積の物体（一般に２〜３ｃｍ^２のシリコン・ウエファーまたはガラス・スライド）である。一般に、核酸は、核酸のインサイチュ固相合成または共有結合固定化により、表面上の正確な位置に固定化される。核酸は、相補的な核酸配列を検出するためのプローブとして機能する。アレイは、固定化された核酸を数百〜数千個備えることができる。密なアレイは、１平方センチメートル当たり１０００個を超える核酸配列を有する。
【０００４】
マイクロアレイを使用するときには、蛍光標識したＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（合成されたもの、または興味の対象となる細胞から得られたもの）をそのアレイと接触させる。蛍光標識した断片のハイブリダイゼーション・パターンから、豊富な情報が得られる。
【０００５】
マイクロアレイは、１つの細胞に含まれる多数の遺伝子の発現を一度に追跡する能力を有するため、研究者は数千個の遺伝子の挙動を同時に見ることができる。したがって、アレイは診断に役立つ。独特な遺伝子発現パターンが検出されると、ガン、アルツハイマー病、骨粗鬆症、心臓病などの疾患にかかったことを医師が指摘する際の助けになる。アレイは、どの遺伝子が特定の疾患において活性化しているかを理解するのにも役立つ。アレイは、病因の同定、法医学への応用、ｍＲＮＡの発現の観察、新規なシークエンシングにも役立つ。例えば、ＬｉｐｓｈｕｔｚらのＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１９巻（３）、４４２〜４４７ページ、１９９５年を参照のこと。
【０００６】
マイクロアレイは、さまざまな方法で製造することができる。例えば、さまざまなオリゴヌクレオチドを固相合成によってアレイ表面に作り出すことができる。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／１００９２号（アフィマックス・テクノロジーズＮ．Ｖ．社）を参照のこと。固相合成によって比較的高密度のアレイを製造できるとはいえ、核酸配列の長さは限られている。現在の技術では、核酸の合成を行なうすべての付加ステップにおいて配列の間違いや配列の切断がいくつか発生するのが一般的である。しかしインサイチュ固相合成によって製造したオリゴヌクレオチド・マイクロチップでは、合成後の精製（例えばＨＰＬＣ）は不可能である。したがって、このようなアレイは、エラーの量が制限されるよう、一般に比較的短い核酸配列（約２０マー）にする。
【０００７】
別の方法として、マイクロアレイは、既存の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物）をアレイ表面に固定化することによって製造できる。例えばシンテニ社（パロアルト、カリフォルニア州）は、ポリリシンをガラス・スライドに付着させることによってｃＤＮＡアレイを製造している。ｃＤＮＡアレイは、コーティングされたスライドの表面に印刷される。次に、印刷されたスライドをＵＶ光に曝露してＤＮＡをポリリシンと架橋させ、そのことによってｃＤＮＡをアレイに固定化する。
【０００８】
発明のまとめ
本発明は、さまざまな密度のアレイ、中でも高密度アレイ（例えば密度が１平方センチメートル当たり約１０，０００〜１００，０００スポット、またはスポット間のピッチが約３０〜約１００ミクロン）の製造法を提供する。
【０００９】
一般に、この方法は、印刷ステップと照射ステップを含んでいる。印刷ステップでは、受容体分子を含む所定体積（約０．５ピコリットル〜５００ピコリットル）の試薬溶液を望むパターンになるようにして固体支持体に付着させる。一実施態様では、受容体分子を光反応剤で誘導体化する。別の実施態様では、固体支持体が光反応剤を備えている。一般に、パターンになったスポット相互の中心間距離は約２００μｍ〜１ｍｍであり、スポットの直径は一般に約１００μｍ〜５００μｍである。好ましい一実施態様では、受容体分子は核酸である（例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物）。
【００１０】
照射ステップでは、光反応基に照射を行なって受容体分子を固体支持体に固定化する。一実施態様では、中心間距離（すなわち“ピッチ”）は印刷されたスポットと同じだが直径がスポットの直径よりも小さい開口部を有するマスクを印刷されたパターンの上に被せ、照射を行なう。マスクは、印刷されたスポットよりも小さな直径の領域を照射できるようなものが好ましい。したがって本発明によれば、固定化される試薬スポットは、印刷された元のスポットよりも直径が小さくなる。別の実施態様では、照射ステップを、レーザーをミラーで反射させる技術を利用して実行することができる。
【００１１】
一般に、照射ステップの後には、固定化されなかった試薬（例えば受容体分子）を洗浄ステップによって除去する。このプロセス全体は、元のパターンとずらして（オフセットさせて）繰り返すことができる。望むのであれば、このプロセス全体を複数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。
【００１２】
詳細な説明
“フォトリソグラフィ”という用語は、所定のパターンになった表面を電磁放射に曝露し、その表面にそのパターン（またはそのパターンのネガ）を生成させるプロセスのことを意味する。一般に、パターンは、結合の形成または破壊によって生成される。“フォトリソグラフィ”には、マスク技術や、それ以外にレーザーをミラーで反射させる技術などを含めることができる。
【００１３】
この明細書で用いる“試薬溶液”とは、受容体分子を含む溶液のことを意味する。試薬溶液は、緩衝液も含んでいるのが普通である。一般に、アレイは、少なくとも１つの、より一般的には複数の“試薬溶液”を用いて製造する。個々の試薬溶液には異なる受容体分子が含まれているため、異なる位置に異なる受容体分子が位置したアレイが形成される。
【００１４】
この明細書で用いる“受容体分子”とは、固体支持体に固定化される結合対の１つの構成要素を意味する。好ましい一実施態様では、受容体分子は核酸である。しかし受容体分子としては、リガンドと特異的に結合する他の任意の分子が可能である。受容体分子としては、例えば免疫グロブリンや細胞受容体などのタンパク質（レクチンなど）、またはこれらの断片（例えばＦ_ａｂ断片、Ｆ_ａｂ’断片など）が可能である。
【００１５】
この明細書で用いる“標的リガンド”または“標的”とは、リガンドのことを意味する。具体的には、サンプル中に存在していると考えられ、本発明の方法またはシステムで検出および／または定量する核酸配列が挙げられる。一実施態様では、核酸は、サンプルから検出されることになる遺伝子または遺伝子断片を含んでいる。“サンプル”という用語は、最も広い意味で用いられる。この用語には、標的リガンドを含むと考えられる試料または培養物が含まれる。
【００１６】
この明細書で用いる“相補的”または“相補性”という用語は、核酸（すなわち、核酸または標的核酸などのヌクレオチド配列）に関して使用するときには、ワトソンとクリックが発見した塩基対規則によって関係づけられた配列を意味する。例えば配列“Ｔ−Ｇ−Ａ”に対する相補的配列は、“Ａ−Ｃ−Ｔ”である。相補性は“部分的”であってもよい。その場合、核酸を構成する塩基のほんのいくつかだけが塩基対規則に従ってマッチしている。また、核酸相互の間に“完全な”相補性または“全体的”相補性が存在していてもよい。核酸の鎖相互間の相補性の程度は、核酸の鎖相互間のハイブリダイゼーションの効率と強さに影響する。
【００１７】
“相補的”または“相補性”という用語は、核酸以外の分子と組み合わせて使用するときには、結合のパートナーと結合できる分子を意味する。具体的には、特定の結合対の構成要素である分子が挙げられる。
【００１８】
“ハイブリダイゼーション”という用語は、互いに相補的な核酸がペアになることに関して使用する。ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションの強さ（すなわち核酸同士の結合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関係する条件の厳しさ、形成されたハイブリッドの融点（Ｔ_ｍ）、核酸中のＧ：ＣとＡ：Ｔの比などの因子によって影響される。
【００１９】
この明細書で用いる“核酸”という用語は、プリンおよびピリミジンに由来する塩基を含む一群のポリヌクレオチド化合物のうちの任意のものを意味する。“核酸”という用語は、核酸の個々の塩基、またはオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合によって互いに結合した短鎖の核酸配列。その典型的な長さは、約５００ヌクレオチド未満、より一般的には２０〜１００ヌクレオチドである）を指すのに用いることもできる。“核酸”という用語は、ｃＤＮＡやＰＣＲ産物に見られるような長い核酸配列（例えば長さが数百〜数千ヌクレオチド）を指すのに用いることもできる。核酸配列の正確なサイズは多くの因子に依存することになろう。これら因子はさらに、核酸の最終的な機能または用途に依存している。
【００２０】
核酸は、固体支持体核酸合成、ＤＮＡ複製、逆転写など、現在利用可能な技術を用いて調製することができる。別の方法として、核酸を天然の供給源から単離することもできる。核酸は、適切な任意の形態にすることができる。例えば一本鎖、二本鎖、核タンパク質にすることが可能である。核酸は、一般にホスホジエステル結合を含んでいるが、場合によっては、ヌクレオチドが同様の骨格、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を備えていてもよい。核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、あるいはその両方を含んでいてよい。その場合、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。さらに、核酸としては、ウラシル、アデニン、グアニン、チミン、シトシンのほか、イノシン、キサンテン、ヒポキサンチンや、他の標準的でない塩基または人工塩基を任意に組み合わせたものが挙げられる。
【００２１】
ＰＮＡは、元の糖リン酸ＤＮＡ骨格がポリペプチドで置き換えられたＤＮＡ類似物である。この置換によって分子の安定性が増大するとともに、アフィニティと特異性の両方が大きくなると言われている。
【００２２】
概要
本発明は、全体として、マイクロアレイの製造方法を提供する。マイクロアレイは、一般に、異なる複数の受容体分子が付着した固体支持体を備えている。それぞれの受容体分子は、他の領域とは物理的に離れた所定の領域に位置している。
【００２３】
特に核酸（と核酸がハイブリダイゼーションを通じて特異的に“結合する”能力）について本発明を説明するが、本発明は他の特異的結合剤（例えば、免疫における結合対、他のリガンド／抗リガンド結合対や、さらには、リガンドがまだ見つかっておらず、ドラッグ・デリバリーの標的となっているようなタンパク質）にも適用できる。
【００２４】
本発明の方法はさまざまな密度のアレイを製造するのに適しているが、中でも高密度アレイの製造に適している。この明細書で用いる“高密度アレイ”という用語は、１平方センチメートル当たり受容体分子が１，０００スポットを超える密度のマイクロアレイを意味する。この密度は、一般に１平方センチメートル当たり５，０００スポットを超え、より一般的なのは、１平方センチメートル当たり１０，０００〜１００，０００スポットである。一般に、“高密度アレイ”では、スポットを約３０〜約１００ミクロンの“ピッチ”（例えば、中心間の距離が約３０〜約１００ミクロン）にして固定化する。これとは対照的に、印刷技術によって製造された市販のマイクロアレイは、密度が１平方センチメートル当たり約１００〜１０００スポットである。一般に、市販されているほとんどのアレイでは、スポットは、中心間のピッチが約１００〜約２００ミクロンとなるようにして固定化される。
【００２５】
この明細書で用いる“スポット”とは、特定の受容体分子を少なくとも１個、より一般的には複数個含む局在領域を意味する。それぞれの“スポット”が異なる受容体分子を含んでいることが好ましい。“スポット・パターン”とは、固体支持体の表面におけるスポットの配置を意味する。場合によっては、各スポットが隣接するすべてのスポットから所定の距離離れた一様なスポット・パターンになっていることが望ましい。しかし必ずしも一様なスポット・パターンである必要はない（例えば、１つのスポットと隣接するすべてのスポットの間の距離は同じでなくてもよい）。
【００２６】
一般に、本発明の方法は、印刷ステップと照射ステップを含んでいる。この方法を図１と図２に図示してある。印刷ステップ（図１のステップＡと図２Ａのステップ１）では、所定体積の試薬溶液（約０．５ピコリットル〜５００ピコリットル）を望むパターンになるようにして固体支持体に付着させる。一般に、印刷されたスポットの中心間距離（Ｐ）は約２００μｍ〜１０００μｍであり、印刷されたスポットの直径（Ｄ）は一般に約１００μｍ〜５００μｍである。
【００２７】
一実施態様では、受容体分子を少なくとも１種類の光反応基で誘導体化する。この明細書で用いる“種類”という用語は、光反応基に関して使用する。例えば、光反応基の１つの“種類”はアジドであり、別の“種類”の光反応基はアリールケトンである。したがって１つの受容体分子は、１種類の光反応基の複数コピーを用いて誘導体化することができる。別の方法として、さまざまな種類の光反応基の１つ以上のコピーを用いてその受容体分子を誘導体化することもできる。（同じ考え方を以下の別法に適用することができる。）別の実施態様では、固体支持体が少なくとも１種類の光反応基を備えている。これら以外の方法も考えられる。例えば、受容体分子と固体支持体の両方が少なくとも１種類の光反応基を備えるようにすることができる。別の実施態様では、受容体分子と固体支持体がそれぞれ光反応基の互いに相補的な要素を備え、照射時にその要素が相互作用して安定な結合、好ましくは共有結合を形成するようにできる。さらに別の実施態様では、照射前に固体支持体に付着させる試薬溶液が、少なくとも１種類の光反応基を含むようにすることができる。
【００２８】
照射ステップ（図１のステップＢと図２Ａのステップ２）では、光反応基に照射を行なうことで反応を開始させ、受容体分子を固体支持体に固定化させる。一実施態様では、中心間の距離、すなわち“ピッチ”（Ｐ）が印刷されたスポットと同じマスクを印刷されたパターンの上に被せ、照射を行なう。この明細書で用いる“同じ”という用語は、スポットのピッチが、使用する装置の精度内で同じであることを意味する。したがって、中心間距離にはわずかな分散があってもよいが、その分散は一般に無視できる。
【００２９】
マスクは、印刷されたスポットに対し、その印刷されたスポットそのものの直径（Ｄ）よりも小さい直径（Ｄ’）に対して照射線を照射できるようになっていて、その結果として固定化された受容体分子のスポットが、印刷されたスポットの直径（Ｄ）よりも小さい直径（Ｄ’）になることが好ましい。別の方法として、照射ステップは、レーザーをミラーで反射させる技術を利用して実行することができる。
【００３０】
一般に、照射ステップの後、固定化されなかった受容体分子を洗浄ステップで除去する（図１のステップＣと図２Ａのステップ３）。次に、すでに存在しているスポット・パターンからずらしてこのプロセス全体を繰り返すことができる（図１のステップＤと図２Ｂ）。この明細書で用いる“ずらす”（オフセット）という用語は、固定化されたスポットの位置に関して使用する。印刷されたスポットは、互いに重なっていてもいなくてもよい。この明細書で用いる“すでに存在しているスポット”という用語は、表面に固定化されている任意のスポット・パターンを意味する。望むのであれば、このプロセス全体を多数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。
【００３１】
例えば、印刷されたスポットの直径が１００μｍでピッチ（中心間距離）が２００μｍであり、光によって活性化されたスポットの直径が２０μｍで（ピッチが印刷されたスポットと同じで）あるならば、マスクをずらすことで同じスペースに２５個のアレイを収容することができる。するとアレイの密度が２５倍になる。したがって、印刷によって１ｃｍ^２当たり２５００個のスポットを有するアレイを製造する能力があるならば、本発明の方法を利用して１ｃｍ^２当たり６２，５００個のスポットを有するアレイを製造することができる。
【００３２】
本発明の方法に必要なマスクは１つだけであることが望ましい（望むのであれば、２つ以上のマスクを使用することもできる）。ミラーで反射させたレーザーを照射する場合には、マスクは不要である。したがって、本発明の方法により、高密度アレイの製造コストが、多数のマスクを必要とするフォトリソグラフィによるインサイチュ固相合成と比べて大きく低下する。さらに、インサイチュ固相合成の場合よりも長い核酸配列（ｃＤＮＡさえも）を固定化することや、固定化前に配列を精製することもできる。
【００３３】
アレイ１つ当たりのスポット数は、アレイのサイズと構成、ならびにアレイの最終用途によって異なる可能性がある。ある種の診断用アレイでは、異なる数種類のスポットだけが必要とされる。それに対して発現分析などの別の用途では、望む情報を収集するのにより多数のスポットが必要となる可能性がある。
【００３４】
核酸
本発明の方法によれば、受容体分子を含む試薬溶液を固体支持体の表面に印刷する。受容体分子は、天然の供給源から得られた核酸、または適切な任意の方法を用いて合成した核酸であることが好ましい。核酸の合成法は公知である。核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、または生化学的合成などの従来からある方法で調製した後、精製することができる。
【００３５】
核酸の長さ（すなわちヌクレオチド塩基の数）は、５塩基〜数千塩基までの広い範囲が可能である。核酸は、長さが少なくとも１０塩基あって特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが好ましい。約１０〜５００塩基の配列（例えば約２０〜２００塩基の配列や、４０〜１００塩基の配列）を有する核酸が一般的である。本発明の方法を利用して、フォトリソグラフィによるインサイチュ固相合成によって容易に得られる核酸配列よりも長い核酸配列を基板表面に有するアレイを製造できることが望ましい。例えば、３０塩基を超える核酸（例えば４０塩基を超える配列や５０塩基を超える配列、さらには１００塩基を超える配列）を利用することができる。すなわち、本発明の方法を利用すると、ｃＤＮＡやＰＣＲ産物を固体支持体の表面に固定化することができる。一般に、より長い配列（例えば２５塩基超）を有する核酸が好ましい。というのも、高めのストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件と洗浄条件を利用することにより、非特異的ハイブリダイゼーションを減らすこと、または排除することができるからである。しかし望むのであれば、より短い核酸も用いることができる。
【００３６】
基板
本発明によれば、受容体分子を固体支持体（この明細書では、今後は基板とも呼ぶ）の表面に固定化する。一般に、“固体支持体”または“基板”という用語は、使用する溶媒に溶けず、核酸を表面に固定化できる２次元または３次元の表面を提供する材料を意味する。固体支持体の構成は、受容体分子を好ましくは共有結合によって付着させうる任意のものが可能である。固体支持体は、受容体分子を付着させる方法に応じてさまざまな構成にすることが可能である。
【００３７】
支持体の表面は、受容体−リガンド間の結合と相互作用せず、大量の非特異的結合の影響を受けないことが好ましい。適切な材料としては、生物または非生物に由来する有機または無機の材料が挙げられる。適切な固体支持体としては、プラスチック、機能性セラミック、樹脂、多糖、機能化されたシリカ、シリカをベースとした材料、機能性ガラス、機能性金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、天然繊維（例えば絹、羊毛、木綿）、ポリマーなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。この明細書では、“機能性”という用語は、無機表面に公知の方法で有機的変更を施し、光反応基が反応できるような結合を設けたことを意味する。ポリマー表面が好ましい。適切なポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、テレフタル酸ポリエチレン、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、ポリアクリルニトリル、メタクリル酸ポリメチル、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネート、ポリメチルペンテンなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００３８】
すでに説明したように、固体支持体は、２次元または３次元の表面を提供することができる。３次元表面は、望む長さ、幅、厚さがあって、核酸が透過して孔またはマトリックスの中に移動できる固体支持体を利用して提供することができる。核酸は固体支持体の長さ、幅、高さ（厚さ）の方向に沿って固定化できるため、３次元表面だと２次元表面よりも所定の領域に高密度の核酸を固定化することができる。
【００３９】
表面は、固体支持体に対する核酸の非特異的吸着が減るようなものを選択することが望ましい。一般に、親水性表面だと、非特異的吸着が減るであろう。
【００４０】
この明細書では、“親水性”および“疎水性”という用語は、水を好む組成物および水を嫌う組成物をそれぞれ記述するのに用いる。一般に、親水性化合物は、比較的極性があり、イオン化可能であることがしばしばある。このような化合物は、通常、水分子と強く結合する。疎水性化合物は、通常、比較的極性がなく、イオン化しない。疎水性表面は、一般に、表面またはその近傍で水分子を氷のような構造にする。疎水性と親水性は相対的な用語であり、この明細書では、さまざまな組成物、液体、表面が、互いに比較して疎水性であるか親水性であるかという意味で用いる。
【００４１】
固体支持体の大きさはさまざまであり、望むアレイの大きさ、望む多様性の程度などの因子によって決めることができる。一実施態様では、シートまたはフィルムの形態になった基板の表面に核酸を固定化し、その基板を個別のアレイに切断する。別の方法として、個々のアレイを独立に製造することもできる。１個または多数個の固体支持体を顕微鏡用スライドなどの他の支持体の上に載せることも可能である。
【００４２】
印刷
本発明によれば、受容体を含む所定体積の試薬溶液を固体支持体上の選択した領域に付着させる。試薬溶液は、公知の技術である例えば市販の印刷装置を改造したものを利用して基板に付着させる。例えば、市販の印刷装置は、本発明の照射ステップが可能なように改造する必要があろう。自動ｘ−ｙ−ｚ位置決め装置を利用し、試薬を固体支持体の表面に正確に繰り返して付着させてスポットを形成することが好ましい。ｘ−ｙ−ｚ位置決め装置は、３つの方向（ｘ、ｙ、ｚ）すべてで精度が少なくとも１０μｍになっていることが好ましい。一般に、スポット形成ロボットは、センサーまたは視認可能な参照物を必要としない。
【００４３】
一般に、印刷段階では、望む受容体分子を含む少体積（例えば０．１ピコリットル〜１ナノリットル、より一般的には０．５ピコリットル〜５００ピコリットル）の試薬溶液を基板表面に付着させる。印刷されるスポットの直径は、基板表面、付着させる溶液の体積や粘度などに応じてさまざまである。一般に、印刷されるスポットの直径（Ｄ）は約１００〜５００μｍである。ピッチ（Ｐ）は、一般にスポットの直径に影響される。一般に、ピッチ（Ｐ）はスポットの直径の２倍以上である（例えば、ピッチは一般に２００μｍ〜１０００μｍである）。
【００４４】
基板表面の光反応基
一実施態様では、固体支持体は、少なくとも１種類の光反応基でコーティングされた表面を備えている。この明細書では、“光反応基”として、特別な外部エネルギー源（例えば放射線）に応答して活性な種（例えばフリーラジカルであるニトレン、カルベン、励起したケトン状態など）を発生させ、隣接する化学構造と共有結合する少なくとも１つの反応部分などが挙げられる。光反応基は、電磁スペクトルのさまざまな部分（典型的にはスペクトルの紫外部、可視部、赤外部）に応答するように選択するとよい。“照射”とは、表面に電磁照射を当てることを意味する。
【００４５】
一実施態様によれば、表面に固定化する受容体分子は、光反応基を用いて修飾してもしなくてもよい。
【００４６】
例えば固体支持体として、ポリカチオン性ポリマー・コーティングを有するガラス基板が挙げられる。この実施態様では、ポリマー・コーティングとして、カチオン性ポリペプチド（例えばポリリシンやポリアルギニン）が挙げられる。このような固体支持体は、公知の方法で製造することができる。例えば、スライドの表面にポリカチオン性ポリマーからなる均一なフィルムを被せた後、このフィルムを乾燥させてコーティングを形成すると、スライドができる。添加するポリカチオン性ポリマーは、固体支持体の表面に少なくとも１つの単層ポリマーを形成するのに十分な量であることが好ましい。フィルムは、一般に、表面にある負のシリル−ＯＨ基と、ポリマー中の荷電したアミノ基の間に静電結合が形成されることによって表面に結合する。ポリ−１−リシンでコーティングされたガラス製スライドも、例えばシグマ・ケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）から入手可能である。核酸配列はこのような表面に印刷することが可能であり、印刷後に照射を行なって核酸をカチオン性ポリマーと架橋させる。
【００４７】
受容体分子に付着した光反応基
別の実施態様では、少なくとも１種類以上の光反応基を用いて受容体分子を誘導体化し、その光反応基を活性化させることにより、支持体表面に受容体分子を固定化することができる。この実施態様によれば、光で誘導体化する受容体分子は、適切な照射を行なうことで、支持体表面に共有結合によって固定化させる。
【００４８】
光反応基は、受容体分子に沿った１つ以上の位置で直接または間接に受容体分子と共有結合することが好ましい。１つ以上の光反応基を適切な任意の方法で受容体分子と結合させることができる。例えば、受容体分子が核酸である場合には、その核酸を、誘導体化した少なくとも１つの核酸塩基を用いて合成することができる。別の方法として、天然の核酸または以前に合成した核酸を誘導体化し、光反応基が、３’末端に、または５’末端に、または核酸そのものの長さ方向に沿って、またはこれらを任意に組み合わせた位置に存在するようにすることもできる。
【００４９】
光反応基によって受容体分子を誘導体化し、この受容体分子を選択的かつ特異的に活性化できるようにすることで、この受容体分子を支持体に付着させたときにこの受容体分子の化学的および／または生物学的機能が実質的に保持されるようにする。この実施態様によれば、光反応基の“直接的な”付着とは、光反応性化合物が受容体分子に直接付着することを意味する。他方、“間接的な”付着とは、光反応性化合物と受容体分子が、合成ポリマーや天然ポリマーなどの共通の構造体に付着することを意味する。光によって誘導体化される受容体分子は、適切な照射により、しかも通常は表面の予備処理を必要とすることなく、共有結合を通じてさまざまな基板表面に固体化される。この実施態様の方法には、１つ以上の光反応基が受容体分子に熱化学的に付着させる方法と、この受容体分子の誘導体を基板表面に光化学的に固定化する方法の両方が含まれる。
【００５０】
受容体分子は、任意の固体支持体に付着させることができるが、好ましい固体支持体は、炭素−水素結合を有する固体支持体である。この結合と光反応基が反応するため、核酸が表面に固定化される。適切な基板の具体例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリ（メタクリル酸メチル）、パリレンのほか、ガラスその他の無機表面を予備処理するのに用いられる多数の有機シランのうちの任意のものが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５１】
光で誘導体化した受容体分子を用いて高密度アレイを製造する方法は、一般に、固体支持体の表面に光反応基を用いる方法よりも好ましい。というのも、核酸（または他の化合物）の非特異的吸着を減らす表面を用いることができるからである。
【００５２】
光で誘導体化した核酸ならびにその製造方法は、共同して譲渡された「光活性化可能な核酸誘導体」という名称のアメリカ合衆国特許出願第０９／０２８，８０６号に詳細に開示されている。この出願は、本出願の譲受人によって共有されており、その開示内容のすべてがここに参考として組み込まれているものとする。
【００５３】
光反応基
一実施態様によれば、受容体分子は、光反応基を用いて誘導体化する。好ましいのは、光反応性アリールケトンであるアセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン、アントロン様複素環（すなわちアントロンの複素環類似体で、例えば１０位にＮ、Ｏ、Ｓのいずれかを有するもの）、あるいはこれらに関する置換された誘導体（例えば、環が置換された誘導体）である。好ましいアリールケトンの具体例としては、アントロンの複素環誘導体である例えばアクリドン、キサントン、チオキサントンや、これらに関して環が置換された誘導体が挙げられる。特に好ましいのは、励起波長が約３６０ｎｍよりも長いチオキサントンとその誘導体である。
【００５４】
アジドも適切な光反応基のグループであり、具体的には、アリールアジド（Ｃ_６Ｒ_５Ｎ_３）（例えばフェニルアジドや４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、中でも４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド）、アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ_３）（例えばアジドギ酸エチルやアジドギ酸フェニル）、スルホニルアジド（−ＳＯ_２−Ｎ_３）（例えばベンゼンスルホニルアジド）、ホスホリルアジド（（ＲＯ） _２ＰＯＮ_３）（例えばジフェニルホスホリルアジドやジエチルホスホリルアジド）などが挙げられる。ジアゾ化合物は光反応基の別のグループであり、具体的には、ジアゾアルカン（−ＣＨＮ_２）（例えばジアゾメタンやジフェニルジアゾメタン）、ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ_２）（例えばジアゾアセトフェノンや１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン）、ジアゾ酢酸塩（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ_２）（例えばジアゾ酢酸ｔ−ブチルやジアゾ酢酸フェニル）、β−ケト−α−ジアゾ酢酸塩（−ＣＯ−ＣＮ_２−ＣＯ−Ｏ−）（例えば３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン）、ケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）（例えばジフェニルケテン）などが挙げられる。
【００５５】
光反応基を活性化させると、受容体分子が、光反応基の残基を通じて共有結合によって互いに、および／または材料の表面に共有結合する。活性化される光反応基の具体例とその残基を以下に示す。
【表１】

【００５６】
照射
本発明によれば、試薬溶液を固体支持体に印刷した後、照射ステップにおいて受容体分子の少なくとも一部を固体支持体に固定化する。
【００５７】
一実施態様では、すでに説明したように、照射ステップを利用して、印刷されたスポットの直径よりも小さい直径を持つ実質的に円形の構成になるように核酸を固定化する。この明細書では、“実質的に円形”とは、形が全体的に円形であるが、幾分かの不規則性は存在していてもよいことを意味する。例えば、形がわずかに楕円形であるとか、形を規定している縁部が完全には滑らかでない状態ことが可能である。さらに、照射ステップを利用して、円形でない構成になった固定化された核酸の“スポット”を生成させることができる。例えば核酸を、正方形、三角形、十字形、長い線などの形に固定化することができる。特別な形の“スポット”になっていると、ハイブリダイゼーション・パターンが検出しやすくなろう。一般に、照射されたスポットによって規定される面積は、印刷されたスポットの直径によって規定される面積よりも狭い。実質的に円形である印刷されたスポットの直径（Ｄ）によって規定される面積（Ａ）とは、公式：面積＝π（Ｄ／２）^２によって計算される面積を意味する。
【００５８】
別の実施態様では、形が異なる“スポット”を互いに重ねることができる（図３）。例えば、第１の核酸配列を固体支持体の表面に印刷し（図３（１）（Ａ））、（核酸が正方形の形状に固定化されるよう）正方形の形をした光パターンで照射を行なうことができよう（図３（１）（Ｂ））。固定化されなかった核酸を除去した（図３（１）（Ｃ））後、第２の核酸を固体支持体の表面に印刷する（図３（２）（Ａ））。今度は、核酸に対して三角形の光パターンで照射を行なう（図３（２）（Ｂ））。再び過剰な核酸を除去する。この方法を利用すると、１種類目の標的リガンドの存在下で正方形のスポットが検出され、異なるリガンドの存在下で三角形のスポットが検出されるアレイを製造することができる。別の実施態様では、異なる構成のスポットを互いにずらすことができる。
【００５９】
マスクを利用した照射
一実施態様では、マスクを利用して照射を行ない、受容体分子を固体支持体に固定化する。この明細書では、“固定化”という用語は、受容体分子が支持体表面に安定に付着していることを意味する。このような付着は共有結合であることが好ましいが、適切な他の安定な付着も可能である。
【００６０】
一般に、マスクを用いて照射を制御することにより受容体分子を固体支持体に固定化する方法が知られている。簡単に説明すると、本発明では、マスク（例えばクロム・マスクまたはガラス・マスク）を用いて受容体分子を固体支持体の表面に固定化する。本発明によれば、印刷されたスポットに対し、印刷されたスポットと同じピッチ（中心間の距離）の位置に開口部を有するマスクを通じて照射を行なう。しかし印刷された各スポットにおける照射光の直径は、印刷されたスポット自身の直径よりも小さいことが好ましい。したがって、固定化される受容体分子の直径は、印刷されたスポットの直径よりも小さくなる。
【００６１】
マスクはスポットの中心間距離であるピッチが約１００μｍ〜約５００μｍであることが好ましい。ピッチのさらに好ましい値は、約１００μｍ〜約２００μｍである。各スポットに当てる照射光の直径は、１００μｍ未満であることが好ましく、５０μｍ未満であることがさらに好ましい。照射光の直径は、約１０μｍ〜５０μｍが可能であるが、より一般的なのは２０μｍ〜４０μｍである。場合によっては、照射光の直径を１０μｍ未満にすることが望ましい。制限因子は、使用する光の波長および／または検出システムの解像度になろう。
【００６２】
波長は、受容体分子を固定化するのに用いる光反応基を少なくとも判断材料の一部として決定することになろう。すなわち、所定の光反応基には、特定の波長の光を照射することが好ましい。
【００６３】
ミラーで反射したレーザーの照射
フォトリソグラフィの代替法として、ミラーで反射したレーザーを用いて受容体分子を固体支持体に固体化することができる。この実施態様によれば、ディジタル・マイクロメータを用いて照射光を印刷されたスポットの特定の領域に向け、受容体分子を固体支持体の表面に固体化する。例えば適切なディジタル・マイクロメータ・アレイは、コンピュータ・ディスプレイの投影システムとして一般に用いられているテキサス・インスツルメント社（ダラス、テキサス州）のディジタル・マイクロメータ・デバイス（ＤＭＤ）である。複数のミラーを個別に配置すると、これらのミラーを用いて所定のどのようなパターンまたは画像でも幅広い波長で生成させることができる。
【００６４】
ミラーで反射したレーザーを照射することの利点として、核酸をフォトリソグラフィによってインサイチュ固相合成する場合と比べてコストが少ないことが挙げられる（例えば、マイクロメータ・デバイス内でミラーを調節するのは、多数のマスクを製造することに比べると安上がりである）。
【００６５】
使用法
本発明のマイクロアレイは、複雑な混合物をハイスループット（大規模ハイブリダイゼーション・アッセイ）かつコスト効率よく分析するのに用いることができる。このアレイは、例えば、ＤＮＡシークエンシング、遺伝子診断、生物の遺伝子型決定といった遺伝子分野への応用に適している。
【００６６】
このアレイを調節して生物サンプル中のさまざまな核酸を検出できるようにすることができる。このアレイを使用する際には、１つ以上の標的リガンドを含んでいると考えられるサンプルに対し、この標的リガンドをアレイ上の対応する相補配列とハイブリダイズさせるのに適した条件下でアレイを接触させるとよい。標的とする核酸がアレイ上に存在しているかいないかは、検出システムを用い、選択した信号が生成したかどうかを調べることによって明らかにすることができる。このような検出法は従来技術において公知である。
【００６７】
遺伝子マッピングを行なうためには、遺伝子またはクローニングしたＤＮＡ断片を、ＤＮＡ配列が秩序正しく並んだアレイとハイブリダイズさせる。そしてこのアレイに付着させたＤＮＡ要素を、このアレイ上で検出したパターンによって同定する。ゲノムの物理的地図を構成する際には、クローニングしたＤＮＡ断片からなるアレイを、クローニングした別のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、プローブ混合物中のクローニングした断片が重なっているかどうか、したがってアレイ上の固定化したクローンと連続しているかどうかを明らかにする。
【００６８】
固定化されたＤＮＡ配列からなるアレイは、遺伝子診断にも用いることができる。例えば、突然変異した１つまたは複数の遺伝子の多彩な形態を含むアレイは、患者のＤＮＡに標識した混合物を用いて調べることができる。この標識混合物は、固定化した遺伝子のうちのたった１つとだけ選択的に相互作用することになる。
【００６９】
固定化されたＤＮＡ配列からなるアレイは、ＤＮＡプローブ診断にも用いることができる。例えば、病原性微生物は、未知の病原体についてのＤＮＡサンプルを、既知の病原性ＤＮＡを多数含むアレイとハイブリダイズさせることによって同定することができる。同様の方法を用いて生物の遺伝子型を明らかにすることもできる。遺伝子として興味深い他の分子（例えばｃＤＮＡやＲＮＡ）をアレイに固定化したり、アレイに付着させる標識したプローブとして使用したりすることができる。
【００７０】
一実施態様では、標的となる核酸（この明細書では“リガンド”と呼ぶ）に検出可能な標識を付けることができる。標識は、５’末端部位、３’末端部位、長い核酸の内部部位のいずれかに組み込むことができる。別の方法として、“サンドイッチ”アッセイを利用することもできる。サンドイッチ・アッセイでは、捕獲プローブを基板表面に固定化し、標的リガンドと接触させて付着複合体を形成する。この捕獲プローブは、リガンドの特定の一部と結合するように設計されている。次に、付着複合体を、このリガンドの別の一部と結合する標識した検出プローブと接触させる。検出可能な好ましい標識としては、放射性同位体、安定な同位体、酵素（発色性基板と組み合わせて使用するのが一般的である）、蛍光性化学物質、発光性化学物質、色素化学物質などが挙げられる。検出可能な標識を核酸に組み込むための方法は多数知られている。
【００７１】
以上、本発明を説明してきた。当業者には、説明した実施態様に対し、本発明の範囲をはずれることなく多くの変更をなしうることが明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、この明細書で説明した実施態様に限定されてはならず、請求の範囲における用語で説明した実施態様や、これら実施態様と同等な態様だけに限定されてもならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明による方法のフローチャートである。
【図２】
図２Ａと図２Ｂは、本発明による方法の概略図である。
【図３】
図３は、本発明による別の方法の概略図である。[0001]
This application was filed on September 6, 2001 by PCT International as a PCT international patent application, specifying all countries except the United States of America.
[0002]
Technical field to which the invention belongs
The present invention relates to the immobilization of nucleic acids on the surface of a solid support. More specifically, the present invention relates to high density nucleic acid arrays.
[0003]
Background of the Invention
Microarrays are small-area objects (typically 2-3 cm) with various nucleic acid sequences immobilized on the surface. ² Silicon wafer or glass slide). Generally, nucleic acids are immobilized at precise locations on a surface by in situ solid-phase synthesis or covalent immobilization of the nucleic acid. The nucleic acid functions as a probe for detecting a complementary nucleic acid sequence. An array can include hundreds to thousands of immobilized nucleic acids. Dense arrays have more than 1000 nucleic acid sequences per square centimeter.
[0004]
When using a microarray, a fluorescently labeled DNA or RNA sequence (synthesized or obtained from a cell of interest) is contacted with the array. The hybridization pattern of the fluorescently labeled fragments provides a wealth of information.
[0005]
Microarrays have the ability to track the expression of many genes in a cell at once, allowing researchers to view the behavior of thousands of genes simultaneously. Therefore, the array is useful for diagnosis. The detection of unique gene expression patterns will help physicians point out that they have a disease such as cancer, Alzheimer's disease, osteoporosis, or heart disease. Arrays are also useful for understanding which genes are activated in a particular disease. Arrays are also useful for identifying etiology, forensic applications, observing mRNA expression, and novel sequencing. See, for example, Lipshutz et al., BioTechniques, 19 (3), 442-447, 1995.
[0006]
Microarrays can be manufactured in various ways. For example, various oligonucleotides can be created on the array surface by solid phase synthesis. See, for example, PCT Application No. WO 92/10092 (Affimax Technologies NV). Although solid-phase synthesis can produce relatively high-density arrays, the length of nucleic acid sequences is limited. In current technology, it is common that some sequence errors or sequence truncations occur in all the additional steps of nucleic acid synthesis. However, post-synthesis purification (eg, HPLC) is not possible with oligonucleotide microchips produced by in situ solid-phase synthesis. Accordingly, such arrays are generally relatively short nucleic acid sequences (about 20 mer) so that the amount of error is limited.
[0007]
Alternatively, microarrays can be manufactured by immobilizing existing nucleic acids (eg, oligonucleotides, cDNA, PCR products) on the surface of the array. For example, Synteni (Palo Alto, Calif.) Manufactures cDNA arrays by attaching polylysine to glass slides. The cDNA array is printed on the surface of the coated slide. The printed slide is then exposed to UV light to crosslink the DNA with polylysine, thereby immobilizing the cDNA on the array.
[0008]
Summary of the Invention
The present invention provides a method of manufacturing arrays of varying densities, especially high density arrays (e.g., densities of about 10,000 to 100,000 spots per square centimeter, or a pitch between spots of about 30 to about 100 microns). .
[0009]
Generally, the method includes a printing step and an irradiation step. In the printing step, a predetermined volume (about 0.5 picoliters to 500 picoliters) of the reagent solution containing the receptor molecules is applied to the solid support in a desired pattern. In one embodiment, the receptor molecule is derivatized with a photoreactive agent. In another embodiment, the solid support comprises a photoreactive agent. Generally, the center-to-center distance between the patterned spots is about 200 μm to 1 mm, and the diameter of the spots is generally about 100 μm to 500 μm. In one preferred embodiment, the receptor molecule is a nucleic acid (eg, an oligonucleotide, a cDNA, a PCR product).
[0010]
In the irradiation step, the photoreactive group is irradiated to immobilize the receptor molecule on the solid support. In one embodiment, a mask having an opening with the same center-to-center distance (or "pitch") as the printed spot but with a diameter smaller than the diameter of the spot is placed over the printed pattern and irradiated. The mask is preferably such that it can illuminate an area of smaller diameter than the printed spot. Thus, according to the invention, the reagent spot to be immobilized has a smaller diameter than the original printed spot. In another embodiment, the illuminating step may be performed using a technique that reflects the laser off a mirror.
[0011]
Generally, after the irradiation step, non-immobilized reagents (eg, receptor molecules) are removed by a washing step. This entire process can be repeated offset (offset) from the original pattern. If desired, the entire process can be repeated multiple times to produce a high density array.
[0012]
Detailed description
The term "photolithography" refers to the process of exposing a patterned surface to electromagnetic radiation to produce the pattern (or a negative of the pattern) on the surface. Generally, patterns are created by the formation or breaking of bonds. “Photolithography” can include mask technology and other technologies that reflect a laser with a mirror.
[0013]
As used herein, "reagent solution" refers to a solution containing receptor molecules. The reagent solution usually also contains a buffer. Generally, arrays are made using at least one, and more usually, a plurality of "reagent solutions". Since each reagent solution contains different receptor molecules, an array is formed in which different receptor molecules are located at different locations.
[0014]
As used herein, "acceptor molecule" refers to one member of a binding pair that is immobilized on a solid support. In one preferred embodiment, the receptor molecule is a nucleic acid. However, the receptor molecule can be any other molecule that specifically binds the ligand. The receptor molecule includes, for example, proteins (such as lectins) such as immunoglobulins and cell receptors, or fragments thereof (eg, F _ab Fragment, F _{ab '} Fragments) are possible.
[0015]
As used herein, "target ligand" or "target" means a ligand. Specifically, it includes a nucleic acid sequence that is considered to be present in a sample and that is detected and / or quantified by the method or system of the present invention. In one embodiment, the nucleic acid comprises a gene or gene fragment to be detected from a sample. The term "sample" is used in the broadest sense. The term includes a sample or culture suspected of containing the target ligand.
[0016]
As used herein, the terms “complementary” or “complementarity” when used in reference to nucleic acids (ie, nucleotide sequences such as nucleic acids or target nucleic acids) are related by the base pairing rules discovered by Watson and Crick. Means an array. For example, the complementary sequence to the sequence "TGA" is "ACT". Complementarity may be "partial." In that case, only a few of the bases that make up the nucleic acid match according to the base pairing rules. Also, there may be "complete" or "total" complementarity between the nucleic acids. The degree of complementarity between nucleic acid strands affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands.
[0017]
The terms "complementary" or "complementarity," when used in combination with a molecule other than a nucleic acid, refer to a molecule that can bind to a binding partner. Specifically, a molecule that is a component of a specific binding pair may be mentioned.
[0018]
The term "hybridization" is used in reference to nucleic acids that are complementary to each other. Hybridization and the strength of hybridization (ie, the strength of binding between nucleic acids) depends on the degree of complementarity between the nucleic acids, the severity of the conditions involved, and the melting point (T _m ), And the ratio of G: C to A: T in nucleic acids.
[0019]
The term "nucleic acid" as used herein refers to any of a group of polynucleotide compounds that include bases derived from purines and pyrimidines. The term "nucleic acid" refers to the individual bases of a nucleic acid, or an oligonucleotide (eg, a short nucleic acid sequence in which at least two nucleotides are covalently linked together. Its typical length is less than about 500 nucleotides, (Generally 20-100 nucleotides). The term “nucleic acid” can also be used to refer to long nucleic acid sequences (eg, hundreds to thousands of nucleotides in length) as found in cDNA and PCR products. The exact size of the nucleic acid sequence will depend on many factors. These factors further depend on the ultimate function or use of the nucleic acid.
[0020]
Nucleic acids can be prepared using currently available techniques, such as solid support nucleic acid synthesis, DNA replication, reverse transcription. Alternatively, nucleic acids can be isolated from natural sources. The nucleic acid can be in any suitable form. For example, it can be single-stranded, double-stranded, or nucleoprotein. Nucleic acids generally contain a phosphodiester bond, but in some cases, the nucleotides may have a similar backbone, such as a peptide nucleic acid (PNA). Examples of the nucleic acid include deoxyribonucleic acid (DNA) (eg, complementary DNA (cDNA)), ribonucleic acid (RNA), and peptide nucleic acid (PNA). Nucleic acids may include DNA (both genomic DNA and cDNA), RNA, or both. In that case, the nucleic acid comprises any combination of deoxyribonucleotides and ribonucleotides. Further, examples of the nucleic acid include uracil, adenine, guanine, thymine, cytosine, inosine, xanthene, hypoxanthine, and any combination of other non-standard bases or artificial bases.
[0021]
PNA is a DNA analog in which the original sugar phosphate DNA backbone has been replaced by a polypeptide. It is said that this substitution increases the stability of the molecule as well as increases both affinity and specificity.
[0022]
Overview
The present invention generally provides a method for manufacturing a microarray. Microarrays generally comprise a solid support to which different receptor molecules are attached. Each receptor molecule is located in a predetermined area physically separated from other areas.
[0023]
Although the invention is described with particular reference to nucleic acids (and the ability of nucleic acids to specifically “bind” through hybridization), the invention is directed to other specific binding agents (eg, binding pairs in immunity, other ligand / antiligand binding). Pairs and even proteins whose ligands have not yet been discovered and are targeted for drug delivery).
[0024]
The method of the present invention is suitable for producing arrays of various densities, but is particularly suitable for producing high density arrays. As used herein, the term "high-density array" refers to a microarray having a density of more than 1,000 spots of receptor molecules per square centimeter. This density is generally above 5,000 spots per square centimeter, and more commonly between 10,000 and 100,000 spots per square centimeter. Generally, in a "high-density array", the spots are immobilized with a "pitch" of about 30 to about 100 microns (e.g., a center-to-center distance of about 30 to about 100 microns). In contrast, commercial microarrays made by printing technology have a density of about 100-1000 spots per square centimeter. In general, in most arrays on the market, spots are immobilized with a center-to-center pitch of about 100 to about 200 microns.
[0025]
As used herein, "spot" refers to a localized region that includes at least one, and more generally, a plurality of specific receptor molecules. Preferably, each "spot" contains a different receptor molecule. "Spot pattern" refers to the arrangement of spots on the surface of a solid support. In some cases, it is desirable that each spot has a uniform spot pattern that is a predetermined distance from all adjacent spots. However, the spot pattern does not need to be uniform (for example, the distance between one spot and all adjacent spots does not have to be the same).
[0026]
Generally, the method of the present invention includes a printing step and an irradiation step. This method is illustrated in FIGS. In the printing step (Step A in FIG. 1 and Step 1 in FIG. 2A), a predetermined volume of the reagent solution (about 0.5 picoliter to 500 picoliter) is attached to the solid support in a desired pattern. Generally, the center-to-center distance (P) of the printed spots is between about 200 μm and 1000 μm, and the diameter (D) of the printed spots is generally between about 100 μm and 500 μm.
[0027]
In one embodiment, the receptor molecule is derivatized with at least one photoreactive group. The term "type" as used herein refers to a photoreactive group. For example, one "class" of photoreactive groups is an azide and another "class" of photoreactive groups is an aryl ketone. Thus, one receptor molecule can be derivatized with multiple copies of one photoreactive group. Alternatively, the receptor molecule can be derivatized with one or more copies of various types of photoreactive groups. (The same concept can be applied to the following alternatives.) In another embodiment, the solid support comprises at least one photoreactive group. Other methods are also conceivable. For example, both the receptor molecule and the solid support can have at least one photoreactive group. In another embodiment, the receptor molecule and the solid support each comprise a mutually complementary element of the photoreactive group, such that upon irradiation, the elements can interact to form a stable bond, preferably a covalent bond. . In yet another embodiment, the reagent solution deposited on the solid support prior to irradiation can include at least one photoreactive group.
[0028]
In the irradiation step (step B in FIG. 1 and step 2 in FIG. 2A), the reaction is started by irradiating the photoreactive group to immobilize the receptor molecule on the solid support. In one embodiment, the center-to-center distance, or "pitch" (P), is the same mask as the printed spot over the printed pattern and irradiation is performed. As used herein, the term "same" means that the pitch of the spots is the same within the accuracy of the equipment used. Thus, there may be a slight variance in the center-to-center distance, but that variance is generally negligible.
[0029]
The mask is adapted to irradiate the printed spot with a radiation (D ') smaller than the diameter (D') of the printed spot itself, and consequently immobilized. Preferably, the spot of receptor molecules has a smaller diameter (D ') than the diameter (D) of the printed spot. Alternatively, the illuminating step can be performed using a technique that reflects the laser off a mirror.
[0030]
Generally, after the irradiation step, the non-immobilized receptor molecules are removed in a washing step (step C in FIG. 1 and step 3 in FIG. 2A). The entire process can then be repeated, offset from the already existing spot pattern (step D in FIG. 1 and FIG. 2B). As used herein, the term "offset" is used with respect to the location of a fixed spot. The printed spots may or may not overlap each other. As used herein, the term "existing spots" refers to any spot pattern immobilized on a surface. If desired, the entire process can be repeated many times to produce a high density array.
[0031]
For example, if the diameter of the printed spot is 100 μm and the pitch (center-to-center distance) is 200 μm, and the diameter of the spot activated by light is 20 μm (the same as the pitch of the printed spot), the mask Can be accommodated in the same space to accommodate 25 arrays. This increases the array density by a factor of 25. Therefore, 1cm by printing ² If one has the ability to produce an array with 2500 spots per cm using the method of the present invention, ² Arrays with 62,500 spots per can be produced.
[0032]
Preferably, only one mask is required for the method of the present invention (two or more masks can be used if desired). When irradiating the laser reflected by the mirror, a mask is unnecessary. Thus, the method of the present invention greatly reduces the cost of manufacturing a high-density array compared to in-situ solid-phase synthesis by photolithography, which requires a large number of masks. In addition, longer nucleic acid sequences (even cDNAs) than in situ solid phase synthesis can be immobilized, or the sequences can be purified before immobilization.
[0033]
The number of spots per array may vary depending on the size and configuration of the array, as well as the end use of the array. In some diagnostic arrays, only a few different types of spots are needed. In contrast, in other applications, such as expression analysis, more spots may be needed to gather the desired information.
[0034]
Nucleic acid
According to the method of the present invention, a reagent solution containing receptor molecules is printed on the surface of a solid support. Preferably, the receptor molecule is a nucleic acid obtained from a natural source or synthesized using any suitable method. Methods for synthesizing nucleic acids are known. Nucleic acids can be purified by conventional methods such as, for example, polymerase chain reaction or biochemical synthesis.
[0035]
The length of the nucleic acid (i.e., the number of nucleotide bases) can vary widely from 5 bases to thousands of bases. Preferably, the nucleic acids are at least 10 bases in length and capable of specific hybridization. A nucleic acid having a sequence of about 10 to 500 bases (for example, a sequence of about 20 to 200 bases or a sequence of 40 to 100 bases) is generally used. It is desirable that the method of the present invention can be used to produce an array having a nucleic acid sequence longer on the substrate surface than a nucleic acid sequence easily obtained by in situ solid-phase synthesis by photolithography. For example, a nucleic acid having more than 30 bases (for example, a sequence having more than 40 bases, a sequence having more than 50 bases, or a sequence having more than 100 bases) can be used. That is, using the method of the present invention, cDNA and PCR products can be immobilized on the surface of a solid support. Generally, nucleic acids having longer sequences (eg, greater than 25 bases) are preferred. This is because by utilizing higher stringency hybridization and washing conditions, non-specific hybridization can be reduced or eliminated. However, shorter nucleic acids can be used if desired.
[0036]
substrate
According to the invention, receptor molecules are immobilized on the surface of a solid support (hereinafter also referred to as a substrate). Generally, the term "solid support" or "substrate" refers to a material that is insoluble in the solvent used and provides a two- or three-dimensional surface on which nucleic acids can be immobilized. The configuration of the solid support can be anything that allows the receptor molecule to be attached, preferably by a covalent bond. The solid support can be of various configurations depending on the method of attaching the receptor molecule.
[0037]
Preferably, the surface of the support does not interact with the receptor-ligand binding and is not affected by large amounts of non-specific binding. Suitable materials include organic or inorganic materials of biological or non-living origin. Suitable solid supports include plastics, functional ceramics, resins, polysaccharides, functionalized silica, silica-based materials, functional glasses, functional metals, films, gels, membranes, nylon, natural fibers ( Examples include, but are not limited to, silk, wool, cotton) and polymers. As used herein, the term "functional" means that the inorganic surface has been organically modified in a known manner to provide a linkage that allows the photoreactive group to react. Polymer surfaces are preferred. Suitable polymers include polystyrene, polyethylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate, butyl rubber, styrene butadiene rubber, natural rubber, polypropylene, polyvinylidene fluoride, polycarbonate, polymethylpentene, etc. But not limited to.
[0038]
As already explained, the solid support can provide a two-dimensional or three-dimensional surface. The three-dimensional surface can be provided utilizing a solid support having the desired length, width, and thickness, and through which nucleic acids can penetrate and move into pores or matrices. Nucleic acids can be immobilized along the length, width, and height (thickness) of the solid support, so if a three-dimensional surface is used, high-density nucleic acids will be immobilized in a predetermined area over a two-dimensional surface. Can be.
[0039]
It is desirable to select a surface that reduces non-specific adsorption of nucleic acids to the solid support. Generally, a hydrophilic surface will reduce non-specific adsorption.
[0040]
As used herein, the terms "hydrophilic" and "hydrophobic" are used to describe water-loving and water-hating compositions, respectively. Generally, hydrophilic compounds are often relatively polar and often ionizable. Such compounds usually bind strongly to water molecules. Hydrophobic compounds are usually relatively non-polar and do not ionize. Hydrophobic surfaces generally cause water molecules to have an ice-like structure at or near the surface. Hydrophobic and hydrophilic are relative terms and are used in this specification to mean that various compositions, liquids, and surfaces are hydrophobic or hydrophilic relative to one another.
[0041]
Solid supports vary in size and can be determined by factors such as the size of the array desired, the degree of diversity desired. In one embodiment, the nucleic acids are immobilized on the surface of a substrate in the form of a sheet or film, and the substrate is cut into individual arrays. Alternatively, the individual arrays can be manufactured independently. It is also possible for one or more solid supports to be mounted on another support such as a microscope slide.
[0042]
printing
According to the present invention, a predetermined volume of a reagent solution containing a receptor is applied to a selected area on a solid support. The reagent solution is attached to the substrate by using a known technique, for example, a modification of a commercially available printing apparatus. For example, a commercial printing device would need to be modified to allow the irradiation step of the present invention. Preferably, the spot is formed by using an automatic xyz positioning device to precisely and repeatedly adhere the reagent to the surface of the solid support. The xyz positioning device preferably has an accuracy of at least 10 μm in all three directions (x, y, z). In general, spot forming robots do not require sensors or visible references.
[0043]
Generally, during the printing step, a small volume (e.g., 0.1 picoliters to 1 nanoliter, more usually 0.5 picoliters to 500 picoliters) of a reagent solution containing the desired receptor molecule is deposited on the substrate surface. . The diameter of the spot to be printed varies depending on the substrate surface, the volume and viscosity of the solution to be attached, and the like. Generally, the diameter (D) of the spot to be printed is about 100-500 μm. The pitch (P) is generally affected by the spot diameter. Generally, the pitch (P) is at least twice the diameter of the spot (eg, the pitch is typically between 200 μm and 1000 μm).
[0044]
Photoreactive group on substrate surface
In one embodiment, the solid support has a surface coated with at least one photoreactive group. In this specification, a "photoreactive group" generates an active species (e.g., the free radical nitrene, carbene, excited ketone state, etc.) in response to a special external energy source (e.g., radiation), At least one reactive moiety covalently linked to the chemical structure. The photoreactive group may be selected to be responsive to various portions of the electromagnetic spectrum (typically, the ultraviolet, visible, infrared portions of the spectrum). "Irradiation" means applying electromagnetic radiation to a surface.
[0045]
According to one embodiment, the receptor molecule immobilized on the surface may or may not be modified with a photoreactive group.
[0046]
For example, a solid support includes a glass substrate having a polycationic polymer coating. In this embodiment, the polymer coating includes a cationic polypeptide (eg, polylysine or polyarginine). Such a solid support can be produced by a known method. For example, after a uniform film made of a polycationic polymer is put on the surface of a slide, and the film is dried to form a coating, a slide is formed. Preferably, the polycationic polymer added is in an amount sufficient to form at least one monolayer polymer on the surface of the solid support. The film generally binds to the surface by forming an electrostatic bond between negative silyl-OH groups on the surface and charged amino groups in the polymer. Glass slides coated with poly-1-lysine are also available, for example, from Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.). Nucleic acid sequences can be printed on such surfaces, and irradiation is performed after printing to crosslink the nucleic acids with the cationic polymer.
[0047]
Photoreactive groups attached to receptor molecules
In another embodiment, the receptor molecule can be immobilized on the support surface by derivatizing the receptor molecule with at least one or more photoreactive groups and activating the photoreactive group. According to this embodiment, the light-derivatized receptor molecule is covalently immobilized on the support surface by appropriate irradiation.
[0048]
Preferably, the photoreactive group is covalently linked directly or indirectly to the receptor molecule at one or more locations along the receptor molecule. One or more photoreactive groups can be attached to the receptor molecule in any suitable manner. For example, if the receptor molecule is a nucleic acid, the nucleic acid can be synthesized using at least one derivatized nucleobase. Alternatively, a naturally occurring or previously synthesized nucleic acid may be derivatized and the photoreactive group at the 3 'end, or at the 5' end, or along the length of the nucleic acid itself, or optionally, It can also be present in a combined position.
[0049]
By derivatizing the receptor molecule with a photoreactive group and allowing the receptor molecule to be selectively and specifically activated, the chemical nature of the receptor molecule when it is attached to a support And / or biological function is substantially retained. According to this embodiment, "direct" attachment of the photoreactive group means that the photoreactive compound is attached directly to the receptor molecule. On the other hand, "indirect" attachment means that the photoreactive compound and the receptor molecule attach to a common structure, such as a synthetic or natural polymer. Receptor molecules that are derivatized by light are solidified on various substrate surfaces through covalent bonds with appropriate irradiation, and usually without the need for surface pretreatment. The methods of this embodiment include both methods in which one or more photoreactive groups are thermochemically attached to a receptor molecule and methods in which a derivative of the receptor molecule is photochemically immobilized on a substrate surface. It is.
[0050]
The acceptor molecule can be attached to any solid support, but preferred solid supports are those having carbon-hydrogen bonds. Since the bond reacts with the photoreactive group, the nucleic acid is immobilized on the surface. Examples of suitable substrates include polypropylene, polystyrene, poly (vinyl chloride), polycarbonate, poly (methyl methacrylate), parylene, as well as numerous organosilanes used to pre-treat glass and other inorganic surfaces. Any of these may be mentioned, but not limited to.
[0051]
Methods for producing high-density arrays using photo-derivatized receptor molecules are generally preferred over methods using photoreactive groups on the surface of a solid support. This is because surfaces that reduce non-specific adsorption of nucleic acids (or other compounds) can be used.
[0052]
Photo-derivatized nucleic acids as well as methods for their preparation are disclosed in detail in co-assigned US patent application Ser. No. 09 / 028,806 entitled “Photoactivatable Nucleic Acid Derivatives”. This application is shared by the assignee of the present application, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.
[0053]
Photoreactive group
According to one embodiment, the receptor molecule is derivatized with a photoreactive group. Preferred are the photoreactive aryl ketones acetophenone, benzophenone, anthraquinone, anthrone, anthrone-like heterocycle (ie, a heterocycle analog of anthrone having, for example, any of N, O, S at the 10-position), Alternatively, it is a substituted derivative thereof (for example, a derivative having a substituted ring). Specific examples of preferred aryl ketones include anthrone heterocyclic derivatives such as acridone, xanthone, and thioxanthone, and derivatives in which the ring is substituted. Particularly preferred are thioxanthone and its derivatives whose excitation wavelength is longer than about 360 nm.
[0054]
Azides are also a group of suitable photoreactive groups, specifically aryl azides (C ₆ R ₅ N ₃ ) (E.g., phenylazide and 4-fluoro-3-nitrophenylazide, especially 4-fluoro-3-nitrophenylazide), acylazide (-CO-N ₃ ) (E.g., ethyl azidoformate and phenyl azidoformate), sulfonyl azide (-SO ₂ -N ₃ ) (Eg, benzenesulfonyl azide), phosphoryl azide ((RO) ₂ PON ₃ ) (For example, diphenylphosphorylazide and diethylphosphorylazide). Diazo compounds are another group of photoreactive groups, specifically, diazoalkanes (-CHN ₂ ) (For example, diazomethane and diphenyldiazomethane), diazoketone (—CO—CHN) ₂ ) (For example, diazoacetophenone or 1-trifluoromethyl-1-diazo-2-pentanone), diazoacetate (—O—CO—CHN) ₂ ) (For example, t-butyl diazoacetate or phenyl diazoacetate), β-keto-α-diazoacetate (—CO—CN ₂ —CO—O—) (for example, 3-trifluoromethyl-3-phenyldiazirine) and ketene (—CH ＝ CＯO) (for example, diphenylketene).
[0055]
Upon activation of the photoreactive group, the receptor molecules are covalently linked to each other and / or to the surface of the material through the residues of the photoreactive group. Specific examples of the photoreactive group to be activated and its residue are shown below.
[Table 1]

[0056]
Irradiation
According to the invention, after printing the reagent solution on the solid support, at least part of the receptor molecules are immobilized on the solid support in an irradiation step.
[0057]
In one embodiment, as described above, the irradiation step is used to immobilize the nucleic acids into a substantially circular configuration having a diameter smaller than the diameter of the printed spot. As used herein, "substantially circular" means that the shape is generally circular, but some irregularities may be present. For example, it is possible that the shape is slightly elliptical or that the edges defining the shape are not perfectly smooth. In addition, the irradiation step can be used to generate a "spot" of immobilized nucleic acid in a non-circular configuration. For example, nucleic acids can be immobilized in the form of squares, triangles, crosses, long lines, and the like. Specially shaped "spots" will make it easier to detect hybridization patterns. Generally, the area defined by the illuminated spot is smaller than the area defined by the diameter of the printed spot. The area (A) defined by the diameter (D) of a substantially circular printed spot is the formula: Area = π (D / 2) ² Means the area calculated by
[0058]
In another embodiment, "spots" of different shapes can be overlaid on each other (FIG. 3). For example, a first nucleic acid sequence is printed on the surface of a solid support (FIG. 3 (1) (A)) and irradiated with a square shaped light pattern (so that the nucleic acids are immobilized in a square shape). It could be performed (FIG. 3 (1) (B)). After removing the non-immobilized nucleic acid (FIG. 3 (1) (C)), the second nucleic acid is printed on the surface of the solid support (FIG. 3 (2) (A)). This time, the nucleic acid is irradiated with a triangular light pattern (FIG. 3 (2) (B)). Remove excess nucleic acid again. Using this method, an array can be manufactured in which square spots are detected in the presence of a first type of target ligand and triangular spots are detected in the presence of a different ligand. In another embodiment, differently configured spots can be offset from one another.
[0059]
Irradiation using a mask
In one embodiment, irradiation is performed using a mask to immobilize the receptor molecules on the solid support. As used herein, the term "immobilized" means that the receptor molecule is stably attached to the support surface. Preferably, such attachment is covalent, although other suitable stable attachments are possible.
[0060]
In general, a method of immobilizing receptor molecules on a solid support by controlling irradiation using a mask is known. Briefly, in the present invention, a receptor molecule is immobilized on the surface of a solid support using a mask (eg, a chromium mask or a glass mask). According to the present invention, the printed spot is irradiated through a mask having an opening at the same pitch (distance between centers) as the printed spot. However, the diameter of the illuminating light at each printed spot is preferably smaller than the diameter of the printed spot itself. Thus, the diameter of the immobilized receptor molecule will be smaller than the diameter of the printed spot.
[0061]
Preferably, the pitch of the mask, which is the distance between the centers of the spots, is about 100 μm to about 500 μm. A more preferred value for the pitch is from about 100 μm to about 200 μm. The diameter of the irradiation light applied to each spot is preferably less than 100 μm, and more preferably less than 50 μm. The diameter of the illuminating light can be about 10 μm to 50 μm, but more commonly 20 μm to 40 μm. In some cases, it is desirable that the diameter of the irradiation light be less than 10 μm. The limiting factor will be the wavelength of light used and / or the resolution of the detection system.
[0062]
The wavelength will determine the photoreactive groups used to immobilize the receptor molecule, at least as part of the criterion. That is, it is preferable to irradiate a predetermined photoreactive group with light having a specific wavelength.
[0063]
Irradiation of laser reflected by mirror
As an alternative to photolithography, acceptor molecules can be solidified on a solid support using a laser reflected from a mirror. According to this embodiment, the receptor molecules are solidified on the surface of a solid support using a digital micrometer to direct the illuminating light to a particular area of the printed spot. For example, a suitable digital micrometer array is the Texas Instruments (Dallas, Tex.) Digital Micrometer Device (DMD) commonly used as a projection system for computer displays. When multiple mirrors are individually arranged, they can be used to generate any given pattern or image over a wide range of wavelengths.
[0064]
The advantage of irradiating the laser reflected by the mirror is that the cost is lower than in situ solid-phase synthesis of nucleic acids by photolithography (for example, adjusting the mirror in a micrometer device requires It is cheaper than manufacturing many masks).
[0065]
how to use
The microarrays of the invention can be used to analyze complex mixtures in a high throughput (large-scale hybridization assay) and cost-effectively. This array is suitable for applications in the genetic field, such as DNA sequencing, genetic diagnosis, and genotyping of organisms.
[0066]
The array can be adjusted to enable detection of various nucleic acids in the biological sample. When using the array, a sample suspected of containing one or more target ligands may be treated under conditions suitable for hybridizing the target ligand to the corresponding complementary sequence on the array. It is good to make contact. Whether or not the target nucleic acid is present on the array can be determined by using a detection system to determine whether the selected signal has been generated. Such detection methods are known in the prior art.
[0067]
To perform gene mapping, a gene or cloned DNA fragment is hybridized to an ordered array of DNA sequences. Then, the DNA element attached to the array is identified by the pattern detected on the array. In constructing a physical map of the genome, an array of cloned DNA fragments is hybridized with another cloned DNA fragment to determine whether the cloned fragments in the probe mixture overlap, and thus immobilize on the array. To determine if they are contiguous with cloned clones.
[0068]
An array consisting of immobilized DNA sequences can also be used for genetic diagnosis. For example, arrays containing various forms of the mutated gene or genes can be interrogated using a mixture labeled with the patient's DNA. This labeling mixture will selectively interact with only one of the immobilized genes.
[0069]
An array consisting of immobilized DNA sequences can also be used for DNA probe diagnosis. For example, pathogenic microorganisms can be identified by hybridizing a DNA sample for an unknown pathogen with an array containing a large number of known pathogenic DNA. Similar methods can be used to determine the genotype of an organism. Other molecules of interest as genes (eg, cDNA or RNA) can be immobilized on the array or used as labeled probes attached to the array.
[0070]
In one embodiment, the target nucleic acid (referred to herein as a "ligand") can be provided with a detectable label. Labels can be incorporated at any of the 5'-end, 3'-end, and internal sites of long nucleic acids. Alternatively, a "sandwich" assay can be utilized. In a sandwich assay, a capture probe is immobilized on a substrate surface and contacted with a target ligand to form an attachment complex. This capture probe is designed to bind to a specific part of the ligand. Next, the attachment complex is contacted with a labeled detection probe that binds another portion of the ligand. Preferred detectable labels include radioisotopes, stable isotopes, enzymes (typically used in combination with a chromogenic substrate), fluorescent chemicals, luminescent chemicals, and dye chemicals. No. Numerous methods are known for incorporating detectable labels into nucleic acids.
[0071]
The present invention has been described above. It will be apparent to those skilled in the art that many changes can be made to the embodiments described without departing from the scope of the invention. Accordingly, the scope of the present invention should not be limited to the embodiments described in this specification, nor should it be limited to only the embodiments described in terms of the claims and equivalents to these embodiments. .
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 is a flowchart of the method according to the present invention.
FIG. 2
2A and 2B are schematic diagrams of the method according to the invention.
FIG. 3
FIG. 3 is a schematic diagram of another method according to the present invention.

Claims

A method for producing a microarray, comprising:
(A) depositing at least one reagent solution containing a receptor molecule on a solid support to form a first deposition spot pattern, wherein spots within the first deposition spot pattern have a predetermined spot pattern; Occupying an area and any of the reagent solution, the receptor molecule, the solid support, or any combination thereof, comprises at least one photoreactive group;
(B) irradiating the first attached spot pattern to immobilize receptor molecules on the solid support in the first immobilized spot pattern, wherein the first immobilized spot pattern is then irradiated; The spot in the spot pattern occupies a predetermined area, and the area of the spot in the first fixed spot pattern is larger than the area of the spot in the first attached spot pattern. Narrowing.

The method of claim 1, wherein said attaching step comprises a printing operation.

The method according to claim 1, wherein the irradiating step includes an irradiating operation using a mask.

The method of claim 1, wherein the irradiating step comprises a laser irradiating operation reflected by a mirror.

2. The method of claim 1, wherein said acceptor molecule comprises at least one photoreactive group.

2. The method of claim 1, wherein said solid support comprises at least one photoreactive group.

A spot group in the first attachment spot pattern has a predetermined center-to-center distance, a spot group in the first fixed spot pattern has a predetermined center-to-center distance, The method of claim 1, wherein the center distance of the spot pattern is equal to the center distance of the first fixed spot pattern.

The method of claim 1, further comprising a cleaning step after the irradiating step.

(A) adhering at least one reagent solution containing a receptor molecule to the solid support to form a second attachment spot pattern, wherein a spot group is defined within the second attachment spot pattern; And wherein any of the reagent solution, the receptor molecule, the solid support, or any combination thereof, comprises at least one photoreactive group;
(B) irradiating said second attached spot pattern to immobilize receptor molecules on said solid support to form a second immobilized spot pattern, wherein said second immobilization is performed. The spot in the patterned spot pattern occupies a predetermined area, and the area of the spot in the second fixed spot pattern is the same as that of the spot in the second attached spot pattern. Smaller than the area, and wherein the spots in the second fixed spot pattern are shifted from the spots of the first fixed spot pattern. The method of claim 1.

(A) attaching at least one reagent solution containing receptor molecules to the solid support to form an attachment spot pattern, wherein the spot group occupies a predetermined area within the attachment spot pattern; And wherein any of the reagent solution, the receptor molecule, the solid support, or any combination thereof, comprises at least one photoreactive group;
(B) irradiating the adhering spot pattern to immobilize receptor molecules on the solid support in the immobilized spot pattern, wherein the spot in the immobilized spot pattern has a predetermined area; And the area of the spots in the fixed spot pattern is made smaller than the area of the spots in the attached spot pattern, and the spots in the fixed spot pattern are further reduced. Further comprises repeating the step of deviating from the existing fixed spot pattern,
The method of claim 9, wherein the high density array is formed using repetition of steps (a) and (b).

The first fixed spot pattern has a predetermined pitch, the second fixed spot pattern has a predetermined pitch, and the pitch of the second fixed spot pattern is 10. The method of claim 9, wherein the pitch is equal to the pitch of the first fixed spot pattern.

The method of claim 1, wherein the irradiating step comprises irradiating the first deposited spot pattern in a circular arrangement.

The method of claim 1, wherein the irradiating step includes irradiating the first deposited spot pattern in a non-circular configuration.

(A) adhering at least one reagent solution containing a receptor molecule to the solid support to form a second attachment spot pattern, wherein a spot group is defined within the second attachment spot pattern; And wherein any of the reagent solution, the receptor molecule, the solid support, or any combination thereof, comprises at least one photoreactive group;
(B) irradiating the second fixed spot pattern, which is arranged differently from the first fixed spot pattern, and is different from the first fixed spot pattern. The receptor molecules are immobilized on the solid support in a second immobilized spot pattern, wherein the spots in the second immobilized spot pattern occupy a predetermined area. And making the area of the spot in the second fixed spot pattern smaller than the area of the spot in the second attached spot pattern. 2. The method according to 1.

15. The method of claim 14, wherein the second fixed spot pattern is offset from the first fixed spot pattern.

15. The method of claim 14, wherein the second fixed spot pattern is overlaid on the first fixed spot pattern.

A microarray manufactured by the method according to claim 1.

A microarray manufactured by the method according to claim 10.

A microarray manufactured by the method according to claim 14.

A microarray comprising a solid support having a pattern of nucleic acid spots, the nucleic acid spots being less than 100 μm in diameter and containing nucleic acids having a sequence of at least 30 bases.

The microarray according to claim 20, wherein the nucleic acid has a sequence consisting of at least 40 bases.

The microarray according to claim 20, wherein the nucleic acid has a sequence consisting of at least 50 bases.

21. The microarray of claim 20, wherein said nucleic acid comprises cDNA.

21. The microarray of claim 20, wherein the diameter of the nucleic acid spot is less than 50m.

21. The microarray of claim 20, wherein the pattern of nucleic acid spots is at a density greater than 5,000 spots per square centimeter.

21. The microarray of claim 20, wherein the pattern of nucleic acid spots is at a density of 10,000 to 100,000 spots per square centimeter.

21. The microarray of claim 20, wherein said nucleic acid spots are in a substantially circular arrangement.

21. The microarray of claim 20, wherein the nucleic acid spots are in a non-circular configuration.

21. The microarray of claim 20, comprising differently arranged spots.

30. The microarray of claim 29, wherein the differently arranged spots are offset from one another.

30. The microarray of claim 29, wherein the differently arranged spots overlap each other.

21. The microarray of claim 20, wherein the solid support comprises a two-dimensional solid support.

21. The microarray of claim 20, wherein the solid support comprises a three-dimensional solid support.