JP2004509611A - Visual servo control optical microscope - Google Patents

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キャラハン ダニエル イー.
パルビン バハラム
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ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア
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    • G01N15/1468Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N15/1475Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle using image analysis for extracting features of the particle
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Abstract

本発明は、細胞種間の差異を知識ベースで発見および最適化するための方法および装置を提供する。 The present invention provides a method and apparatus for discovering and optimizing the differences between cell types in the knowledge base. 特に本発明は視覚的サーボ制御光学顕微鏡および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscopy and analytical methods. 本発明は、数百個の別々の生細胞を経時的に詳しくモニターする手段;多チャネルにおける動的生理学的反応の定量化;リアルタイムのデジタル画像分割および分析;インテリジェントなかつ繰り返しの、コンピュータ印加による細胞ストレスおよび細胞刺激;ならびに、長期的な研究および観察のための細胞が同じ視野に戻る能力を提供する。 The present invention, hundreds of separate live cells means that over time closely monitored; quantification of dynamic physiological responses in a multi-channel; real-time digital image segmentation and analysis; intelligent Nakatsu repeated, the cells of the computer application stress and cell stimulation; and cells for long-term research and observation provides the ability to return to the same field of view. 本発明はさらに、細胞の特定部分母集団(subpopulation)のために培養条件を最適化する手段を提供する。 The present invention further provides a means for optimizing the culture conditions for cell specific subpopulations (Subpopulation).

Description

【0001】 [0001]
本発明の一部は、米国エネルギー省による政府支援を受けた(契約番号DE−AC03−76SF00098)。 Part of the present invention, received a government support by the US Department of Energy (Contract No. DE-AC03-76SF00098). 米国政府は本発明において一定の権利を有する。 The United States Government has certain rights in this invention.
【0002】 [0002]
本出願は、2000年6月8日に出願された米国特許仮出願第60/210,543号、および2001年5月14日に出願された米国特許仮出願60/290,755号の恩典を主張するものである。 This application is 2000 June 8 U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 210,543, filed, and the benefit of U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 290,755, filed May 14, 2001 it is those that claim to.
【0003】 [0003]
発明の分野本発明は、細胞種間の差異を知識ベースで発見および最適化するための方法および装置を提供する。 Field of the Invention The present invention provides methods and apparatus for discovering and optimizing the differences between cell types in the knowledge base. 特に本発明は、視覚的サーボ制御光学顕微鏡および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscopy and analytical methods. 本発明はさらに、特定の細胞部分母集団用に培養条件を最適化する手段を提供する。 The present invention further provides a means for optimizing the culture conditions for a particular cell subpopulations.
【0004】 [0004]
発明の背景現在、テレプレゼンス(telepresence)研究においては、地理的に分散した場所に存在する専門家および施設を一つにまとめることが主流となっている(Hadida−Hassanら、J.Struct. Biol.、125:229−234 [1999]; Parvinら、「オンライン施設用視覚的サーボ制御(Visual Servoing for Background of the Invention Currently, in the telepresence (telepresence) research, professionals and putting together a facility to one that has become the mainstream (Hadida-Hassan et al present in geographically dispersed locations, J.Struct. Biol ., 125: 229-234 [1999]; Parvin et al., "online facility for visual servo control (visual Servoing for
On−Line Facilities)」、IEEE Computer Mag. On-Line Facilities) ", IEEE Computer Mag. 、56−62頁[1997]; Potterら、UltraMicros. , Pp. 56-62 [1997]; Potter et al., UltraMicros. 、77:153−161[1999]; Youngら、J. , 77: 153-161 [1999]; Young et al, J. Supercomputer Appl. Supercomputer Appl. High Perf. High Perf. Comput、pp. Comput, pp. 170−181 [1996];およびParvinら、「分散型鏡検のための協調的フレームワーク(A 170-181 [1996]; and Parvin et al., "Collaborative framework for distributed microscopy (A
Collaborative Framework for Distributed Microscopy)」、IEEE Conf. Collaborative Framework for Distributed Microscopy) ", IEEE Conf. on on
SuperComputing [1998])。 SuperComputing [1998]). このシステムは、協調的フレームワーク(Parvinら、[1997]、前述)とともに現場で広く使用されている。 The system collaborative framework (Parvin et al., [1997], supra) have been widely used in the field with. テレプレゼンス研究の焦点は、機器の遠隔機能性、ならびに、大規模なデータ収集および分析に必要な自動化に当てられてきた。 The focus of telepresence research, remote functionality of the equipment, as well as, have been applied to the automation needed for large-scale data collection and analysis. カリフォルニア(California)大学バークレー(Berkley)校でのMASHプロジェクト(McCanne、IEEE California (California) MASH project at the University of Berkeley (Berkley) school (McCanne, IEEE
Internet Comput. Internet Comput. 、3:33−44 [1999])では、不均質な環境でMBoneツールを使用して、完全に分散したシステムで、協調的アプリケーション用の拡大縮小可能なマルチメディアアーキテクチャを開発している。 , 3: 33-44 In [1999]), using the MBone tool heterogeneous environments, a fully distributed system, has developed a scalable multimedia architecture for collaborative applications. NCSAのHaveneroプロジェクトでは、主としてJavaで記述されたコンピュータベースの集中システムにおける共有情報の円滑な管理と全クライアントへの同時配布とが実現されている。 In Havenero project of NCSA, it is mainly simultaneous distribution and the realization of the smooth management and all clients of shared information in a computer-based centralized system written in Java. ラトガー(Rutger)大学のDISCIPLEは、共有バーチャル空間を実現するためのサービスベースの集中システムにおける分散アクセス用にCORBAフレームワークを使用している。 Rutgers (Rutger) Disciple universities, using CORBA framework for distributed access in service-based centralized system for realizing a shared virtual space. サン・マイクロシステム社(Sun Sun Microsystems, Inc. (Sun
Microsystem)のJava共有開発ツールキット(Java Shared Development tool kit)には、通信セッションの参加者にデータを送信するための協調認識性の(collaborative−aware)Javaコードが用意されている。 The Microsystem) Java shared development toolkit (Java Shared Development tool kit), coordinated recognition of the order to send the data to the participants of the communication session (collaborative-aware) Java code are prepared. このコードは、TCP/IPソケット、軽量高信頼マルチキャスト、および遠隔呼び出し法という3種類の転送プロトコルをサポートしている。 This code supports the TCP / IP sockets, light weight reliable multicast, and that the remote access mode three transport protocol. このフレームワークでは、全オブジェクトが管理可能であり、協調はチャネル、トークン、ブロブ、およびリスナーを含むセッション内で発生する。 In this framework, all objects are manageable, cooperation occurs within a session, including channel, token, blobs, and listeners. ミシガン(Michigan)大学のUpper Michigan (Michigan) Upper of the University
Atmosphere Research Collaboratory(UARC)はウェブベースの分散システムであり、大部分がJavaで記述されている。 Atmosphere Research Collaboratory (UARC) is a web-based distributed systems, for the most part has been written in Java. このシステムは宇宙空間物理学研究用の40以上の観察プラットフォームからデータを収集し、同期協調および非同期協調の両方が可能である。 The system collects data from more than 40 of the observation platform for space physics, it is possible to both synchronous coordination and asynchronous coordination. このシステムでは、データ提供者はデータ散布サーバー上で各自のデータを発表する。 In this system, data providers will announce their own data on the data scatter server. 次に、クライアントは所望の情報を受け取るためにシステムに加入する。 Next, the client subscribes to the system in order to receive the desired information.
【0005】 [0005]
テレプレゼンス法は物理科学に加えて生物科学においても使用されている。 Telepresence methods are also used in the biological sciences in addition to the physical sciences. 例えば、ポストゲノム配列決定の時代において、複雑な生物材料の定量的な画像化が重大な課題となっている。 For example, in the era of post-genome sequencing, quantitative imaging of complex biological material is a significant challenge. 事実、種々の鏡検法で得られる逐次的な測定結果には、多次元反応(例えば時間および空間における反応)の詳細な分析が含まれていない。 In fact, the sequential measurement results obtained by various microscopic examination method, does not contain detailed analysis of multidimensional reaction (for example, the reaction in time and space). 多細胞集合体の大きな母集団における複数のマーカーの空間的および時間的な同時挙動を定量化することは、方法が労働集約的であること、定量化ツールが存在しないこと、および情報のインデックス化ができないことにより困難となっている。 Quantifying the spatial and temporal simultaneous behavior of a plurality of markers in a large population of multicellular aggregates, that the method is labor intensive, the absence of quantification tools, and indexing information It has become difficult due to can not. 理想的には、複数の標的タンパク質について、動態および量、細胞内の状況、ならびに形態学的特徴を大きな母集団を用いて三次元的に追跡できる方法が望ましい。 Ideally, for a plurality of target proteins, kinetics and amount, the status of the cell, and methods of morphological features can be tracked in three dimensions using a large population it is desired.
【0006】 [0006]
例えば、細胞内の特定のタンパク質成分を識別できる数千の抗体およびその他の試薬が利用可能である。 For example, antibodies and other reagents thousands that can identify a specific protein components of the cell are available. 一部の抗体はさらに、リン酸化状態、タンパク質の配座、および複合体生成などの修飾により生じるタンパク質の機能的変異体を識別することができる。 Some antibodies further can be identified phosphorylation state, protein conformation, and functional variants of proteins caused by modifications such as complexation. 細胞内タンパク質の多くはシグナル伝達経路に関与している。 Many intracellular proteins involved in signal transduction pathways. 電位事象が複雑であること、タンパク質の機能に影響する複数の修飾が存在する可能性があること、ならびに、信号伝達においてタンパク質が活性を示す場所および時点に関する情報が不足していることから、これらの信号伝達経路の詳細は現在のところ明らかになっていない。 It potential event is complicated, there is a possibility that a plurality of modifications that affect the function of the protein is present, and, since the information proteins in signal transduction about the location and time showing the activity is insufficient, these the signal transduction pathway of details not disclosed at present. 本来的に存在する生物学的なばらつきおよびゲノムの不安定性も、大きな母集団を対象とした分析の必要性を裏付ける要素である。 Instability inherently biological variability and genomic also present an element supporting the need for analysis with a large population of interest. このように、細胞シグナル伝達に関するより詳細な像を描くのに有用な鏡検法および画像分析法が求められている。 Thus, useful microscopy methods and image analysis methods to draw a more detailed picture on cell signaling is required. このことは、疾患の診断および治療の方法の開発において特に当てはまる。 This is particularly true in the development of diagnostic and therapeutic methods of the disease.
【0007】 [0007]
今日では、種々の疾患が分子レベルおよび遺伝子レベルで理解されている。 Today, various diseases have been understood at the molecular and genetic levels. 疾患に関係する分子の分析は疾患の診断および予後判定において重要である。 Analysis of molecules involved in the disease are important in the diagnosis and prognosis of disease. しかし、癌などの疾患の研究には、現在のところ技術およびモデルシステムによる限界がある。 However, the study of diseases such as cancer, there is a limit due to currently techniques and model systems. 組織試料は通常複数の細胞種(例:異常な細胞、上皮細胞、ストローマ細胞、内皮細胞、炎症細胞など)を含んでおり、この多様な細胞母集団が、タンパク質および/または核酸の発現に関する定性的または定量的な研究の妨げとなっている。 Tissue samples are typically multiple cell types (eg aberrant cell, epithelial cells, stromal cells, endothelial cells, inflammatory cells, etc.) Includes, this diverse cell population, qualitative on the expression of proteins and / or nucleic acid or it has become an obstacle to quantitative research. 関心対象の細胞(例:腫瘍細胞)は全細胞母集団中に占める割合が比較的小さいことが多いため、典型的な標本中のタンパク質または核酸の実質的な変性についてその有意性を解釈することは困難である。 Cell of interest (e.g., tumor cells) is to interpret all because it is often a percentage of the cells in the population is relatively small, a substantial modification thereof significance for protein or nucleic acid of the typical specimens It is difficult. また、培養細胞の研究では、細胞間で生じる複雑な相互作用の詳細を明らかにできない。 Moreover, studies in cultured cells, can not reveal the details of complex interactions occurring between cells. さらに、現在広く用いられている技術は、組織の固定、抗原抗体認識、および/または組織染色などの方法に依存しており、これらの方法では通常、試料の処理中に分析対象の細胞が死ぬことを避けられない。 Furthermore, techniques currently used widely, fixation of tissue, rely on methods such as antigen-antibody recognition, and / or staining, typically, the analyte of cells during sample processing die by these methods inevitable that. このことにより、標本中の細胞に関して得られる情報の量が制限される。 Thus, the amount of information obtained for cells in the specimen is limited.
【0008】 [0008]
細胞生理学の研究では、実験で観察された現象に関して理論的仮説を設定する必要性があり、蛍光プローブおよび共焦点顕微鏡などのツールの使用によって、種々の分子種および細胞内構造物の細胞内での空間的配置が三次元で分解できるようになった。 The study of cell physiology, there is a need to set a theoretical hypothesis regarding phenomena observed in the experiment, the use of tools such as a fluorescent probe and confocal microscopy, in cells of various species and intracellular structures spatial arrangement of began to be decomposed in three dimensions. しばしばこれらの仮説は次に数学モデルとして構築される。 Often these hypotheses are then constructed as a mathematical model. 次に、これらのモデルは、実験結果とインビボで観察された現象とを相関させるため、シミュレーションに組み込まれる。 Then, these models, in order to correlate the phenomenon observed in the experimental results and in vivo, are incorporated in the simulation.
【0009】 [0009]
しかし、既存の技術には欠点がある。 However, there are drawbacks to the existing technology. 一般的にこれらの欠点は細胞の表現に関する現在の限界に由来するものである。 Generally these drawbacks are derived from the current limit for expression of a cell. これらの方法において、細胞は、空間的に均一な挙動(すなわち生理学的特徴)と構造(すなわち解剖学的特徴)とを有する、理想的かつ単純な幾何学的形状として表現される。 In these methods, cells have a spatially uniform behavior (i.e. physiological characteristics) and structure (i.e. anatomical features), is represented as an ideal and simple geometric shapes. このことは、無傷の細胞を用いた実際の実験と容易に相関するシミュレーションにおいて、観察される生理学的な現象を実際に表現しようとする研究者にとって妨げとなる。 This means that in the simulation to easily correlate the actual experiments with intact cells, hinder for researchers to be actually represent physiological phenomena observed. したがって、モデルおよび仮説の検証がしばしば非常に困難になる。 Therefore, verification of the model and hypothesis is often very difficult.
【0010】 [0010]
現在、細胞生理学のモデリングおよびシミュレーションにおける努力の多くは、個々の機序を対象にした非常に特異的なモデルか、またはより複雑な現象の抽象的な表現かのいずれかに向けられている。 Currently, many efforts in modeling and simulation of cell physiology, are directed to either abstract representation of highly specific models or more complex phenomena, that target individual mechanisms. 特異的モデルとしては、個々の分子の相互作用(例:イオンチャネルに関するもの)のモデルがある。 The specific model, the interaction of the individual molecules: There are models (eg ion relates channels). 抽象的モデルは、根底にある機序の単純化を適用するのが一般的であり、こうした機序は、限定されたクラスの生理学的問題および/または観察結果を説明することのみに適しているのが普通である。 Abstract model is a common practice to apply the simplification of the underlying mechanisms, such mechanisms are suitable only to explain the physiological problems and / or observations of restricted class the are common. このように、リアルタイムの観察、観察された現象と疾患状態との相関付け、およびインサイチューで経時的に細胞を観察するための手段を容易にする方法および装置が必要とされている。 Thus, real-time observation, there is a need for correlation, and in situ over time method and apparatus for facilitating the means for observing the cells with the observed phenomena and disease states.
【0011】 [0011]
さらに、いくつかの種類の癌(例:特定の白血病および精巣癌)では、化学療法が成功して患者に治癒をもたらしている。 In addition, some types of cancer: In (eg certain leukemias and testicular cancer), have led to healing patient chemotherapy is successful. しかし、固形癌(例:乳癌)については治療法向上の進歩は非常に少ない。 However, solid cancer: advances in treatment improvement for (for example, breast cancer) is very small. 固形癌でみられる先天性または後天性の多剤耐性(MDR)は、化学療法による治癒を妨げている重要な障害物の一つである。 Seen in solid tumors congenital or acquired multidrug resistance (MDR) is one of the key obstacles that impede healing by chemotherapy. 薬物反応の評価および患者反応の予測のためのインビトロ化学感受性アッセイが40年以上にわたって開発されているものの、真に成功したインビトロ化学感受性試験はまだ確立されていない。 Although in vitro chemosensitivity assay for prediction evaluation and patient response drug reactions have been developed over 40 years, in vitro chemosensitivity test truly successful not yet been established. したがって、信頼性がありかつ有意義なインビトロ化学感受性試験の必要性が依然として存在する。 Therefore, the need for reliable and meaningful vitro chemosensitivity test is still present.
【0012】 [0012]
発明の概要本発明は、細胞種間の差異を知識ベースで発見および最適化するための方法および装置を提供する。 The present invention provides methods and apparatus for discovering and optimizing the differences between cell types in the knowledge base. 特に本発明は視覚的サーボ制御光学顕微鏡および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscopy and analytical methods. 本発明は、数百の個々の生細胞を経時的に詳しくモニターする手段;多チャネルにおける動的生理学的反応の定量化;リアルタイムのデジタル画像分割および分析;インテリジェントなかつ繰り返しの、コンピュータ印加による細胞ストレスおよび細胞刺激;ならびに、長期的な研究および観察において同じ細胞視野に戻ることができる能力を提供する。 The present invention, hundreds of over time closely monitored to means an individual living cells; quantification of dynamic physiological responses in a multi-channel; real-time digital image segmentation and analysis; intelligent Nakatsu repeated, cellular stress by the computer application and cell stimulation; and to provide the ability to return to the same field of cells in long-term studies and observations. 本発明はさらに、特定の細胞部分母集団用に培養条件を最適化する手段を提供する。 The present invention further provides a means for optimizing the culture conditions for a particular cell subpopulations.
【0013】 [0013]
特に本発明は、細胞アレイに含まれる細胞の視野を自動的に検出および分割(segmentation)する方法、ならびに、特に母集団研究を目的として、種々の刺激に対する細胞の反応をコンピュータ制御および外的曝露の関数として計算する方法を提供する。 In particular, the present invention is a method for automatically detecting and dividing the field of view of the cells contained in the cell array (segmentation), and in particular for the purpose of population studies, computer control and external exposure of the reaction of cells to various stimuli to provide a method for calculating as a function. 外的曝露は、光学装置(例:顕微鏡)の近くに配置されたコンピュータ制御のシリンジ(またはその他適切な容器)に入った化合物の流れによって制御される。 External exposure optical device: is controlled by flux of the compound enters the syringe located computer controlled near (eg a microscope) (or other suitable container).
【0014】 [0014]
好ましい態様において、VSOMは、選択した各視野における各細胞の特定の副区画を構造的に描出する方法を提供する。 In a preferred embodiment, VSOM provides a method of structurally depicted the specific sub-compartment of each cell in each of the selected field of view. 視野はxyステージによってユーザーが位置決めする。 The field of view user positioned by the xy stage. さらに、VSOMは、視野内にある各細胞の特定の細胞内区画(subcellular Furthermore, it VSOM a particular subcellular compartment of each cell within the field of view (subcellular
compartment)における反応を測定する手段を提供する。 It provides a means of measuring the reaction in compartment). いくつかの態様において、細胞下レベルの反応は、a)プログラミングされた刺激周波数で、かつ、b)細胞アレイに注入された化合物に対する細胞曝露の関数として測定される。 In some embodiments, the reaction of the subcellular level, a) in programmed stimulation frequency, and, b) is measured as a function of cell exposure to compound injected into the cell array. さらに本発明は、関心対象の細胞の曝露を反応の測定結果の関数として調整するためのサーボループの制御を提供する。 The invention further provides a control of the servo loop for adjusting the exposure of cells of interest as a function of the measured result of the reaction. 本発明は最大限の柔軟性を提供する。 The present invention provides maximum flexibility. 例えば、いくつかの態様においては、視野内の関心対象の全細胞について細胞および/または細胞内区画の反応の平均がユーザー定義の閾値に達すると外的曝露が遮断される。 For example, in some embodiments, the average response of all cells for cell and / or subcellular compartment of interest in the field of view is blocked external exposure reaches a user-defined threshold. 別の態様においては、所望の割合の細胞および/または細胞内区画が、定義された閾値に達すると、外的曝露が遮断される。 In another embodiment, the cell and / or subcellular compartments in a desired ratio reaches a defined threshold, external exposure is interrupted. また別の態様においては、細胞の部分集合および/または細胞内区画の部分集合の反応の平均が特定のプロフィールに達すると外的曝露が遮断される。 In another embodiment, the average of the reaction of a subset of cells subsets and / or intracellular compartment of external exposure reaches a particular profile is blocked. これらの各態様は、任意の組合せで所望の回数繰り返すことができる。 Each of these aspects can be repeated a desired number of times in any combination.
【0015】 [0015]
本発明の開発以前は、顕微鏡下で多数の個々の生細胞のデジタル画像を得ることは技術的に困難であった。 Previously the development of the present invention, to obtain a digital image of a large number of individual living cells under a microscope was technically difficult. また、多数の個々の生細胞について、細胞を損傷することなく長期間にわたって細胞内の複数の生理学的反応を同時にモニターすることも困難であった。 Moreover, for a number of individual living cells, it was also difficult to simultaneously monitor a plurality of physiological responses in the cell over a long period of time without damaging the cells. 第一の制限は、主として、いかなる倍率においても視野が限られていることに由来するものであった。 First restriction was primarily derived from the field of view is limited in any ratio. 使用されるデジタルカメラの内部の固体デジタル撮像装置(すなわち、電荷結合素子;CCD)のサイズおよび分解能が限られていることも、視野をさらに制限していた。 Internal solid state digital imaging device of the digital camera used (i.e., charge-coupled device; CCD) also had further restricted field of view size and resolution is limited. 本発明では、X、Y、Z顕微鏡ステージのソフトウェア制御によって、複数の視野(すなわち、多数の細胞)を迅速に、自動的に、かつ繰り返しモニターすることを容易にし、これにより上述の制限を克服する。 In the present invention, X, Y, by software control of the Z microscope stage, multiple fields of view (i.e., number of cells) quickly, automatically and make it easy to repeatedly monitored, thereby overcoming the limitations mentioned above to. また本発明により、中央コンピュータによる複数の顕微鏡の同時遠隔制御が容易になる。 Also the present invention facilitates the simultaneous remote control of a plurality of microscope according to the central computer. 事実、局所の顕微鏡周辺装置(例:走査ステージ、フィルタホイール、灌流ポンプ、ロボットアーム、シャッター、カメラ、等)を制御するために現在使用されているコンピュータ(すなわちクライアント)に関連する、メモリ、ソフトウェア、および処理資源の制限が本発明により克服される。 In fact, local microscope peripherals: related (eg scanning stage, filter wheel, perfusion pump, a robot arm, a shutter, the camera, etc.) a computer that is currently used to control (i.e. client), a memory, software , and limited processing resources are overcome by the present invention. 本発明により、インターネットを使用した遠隔制御と、遠隔値のユーザーから地理的に離れた場所に設置されたより強力な中央コンピュータ(サーバー)とでVSOM観察を実施することが可能になる。 The present invention, a remote control using Internet, it is possible to carry out VSOM observation de powerful central computer than installed from the user's remote value geographically remote (server). サーバーは、より処理集約的なタスクを実行または分配し、かつ、現在および過去の細胞反応を記録した非常に大規模のデータベースの中央ロケーションとして機能する。 The server performs or distribute more processing intensive tasks, and functions as a central location a large database of current and very which records a past cell response. このように、本発明のVSOMは、強力な中央サーバーへのネットワークアクセスの利点、および、単一細胞の反応に関する過去の観察結果と複数情報チャネル間の相関に関する過去の観察結果とが記録された大規模中央データベースの利点を活用するものである。 Thus, VSOM of the present invention, the advantages of network access to powerful central server, and the previous observations on correlation between past observations and more information channels for the reaction of a single cell is recorded it is intended to take advantage of large-scale central database. 特に好ましい態様においては、VSOMシステムは、細胞を繰り返し検出し、全チャネルについて観察されたすべての細胞反応を記録および分析し、現在の細胞反応を比較し、現在の各情報チャネルについて相関付けを行い、かつ、細胞反応に関する過去の観察結果および各情報チャネル間の相関に関する過去の観察結果が記録されたデータベースに対して問い合わせを行う。 In a particularly preferred embodiment, VSOM system cells repeatedly detected, the observed every cell responses were recorded and analyzed for all channels, by comparing the current cell response, performs correlation for the current of each information channel and, querying the database for historical observations regarding the correlation between past observations and the information channel for cell response was recorded. 単一の実験過程において、次にシステムは、実施中の実験の目的を達成するため、実験パラメータをどのように調整するかに関して知識ベースで一連の決定を行う。 In a single course of the experiment, then the system, in order to achieve the purpose of the experiment in the embodiment, a series of decisions in the knowledge base as to how to adjust the experimental parameters.
【0016】 [0016]
したがって、本発明により、単一の比較的短い実験過程の間に複数の完全な実験サイクルを実施することが可能となる。 Accordingly, the present invention makes it possible to implement a plurality of complete experimental cycles during a single relatively short experimental procedure. このことは、異なる細胞種間の差異を検索、発見、および最適化するプロセスを大幅に加速させる。 This search for differences between different cell types, the discovery, and greatly accelerates the process of optimization. 必要な細胞数は比較的少ない。 The number of cells required is relatively small. また、個々の細胞の反応がモニターされるため、分析用の標本は異なる種類の細胞を含んでいてもよい。 Further, since the response of the individual cells are monitored, the sample for analysis may contain different types of cells. 「細胞種」とは、ある群に含まれる各細胞が他群の細胞から識別されうる類似の特徴を有するような複数の群に一群の細胞を分けることができる任意の観察方法により達成される分類である。 A "cell type" is accomplished by any observation method can be divided a group of cells into a plurality of groups that have similar characteristics each cell can be identified from the other groups of cells contained in one group it is a classification. この分類は、個々の単一細胞レベルにおける比較的迅速な生理学的反応を繰り返し観察した結果(例:細胞内構成要素、形態学的変化、細胞分裂、細胞死、剥離などの観察)に基づいて行われるのが一般的である。 This classification is relatively quick repetitive physiological reaction observation in the individual single cell level: based on (eg intracellular components, morphological changes, cell division, cell death, the observation of peeling) it is generally carried out. しかし、この用語は、従来の組織学的基準(例:上皮細胞、腫瘍細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞など)に基づいて分類した種々の細胞種も含む。 However, the term conventional histologic criteria: including (eg epithelial cells, tumor cells, muscle cells, adipocytes, nerve cells, etc.) a variety of cell types were classified based on.
【0017】 [0017]
本発明の開発以前は、多数の細胞を対象とした場合に、実験過程中に実験パラメータをどのように変更するかに関する自動的かつ知識ベースの決定を迅速に行うことができなかった。 Previously the development of the present invention, when of a large number of cells, it was not possible to quickly perform the automatic and knowledge-based decisions as to how to change the experimental parameters during the course of the experiment. 本発明は、実験過程中に「試験/記憶/分析/学習/再設計/再試験」サイクルを多数回実行する能力を提供するものであり、この能力により、以前は実行不可能であった多くの実験および応用が可能となる。 The present invention, which provides the ability to run many times "test / storage / analytical / Learning / redesign / retest" cycle during the course of the experiment, many This capability was formerly infeasible it is possible to experiment and applications. 細胞が生存状態を維持し、かつ、実験が進行状態およびオンライン状態を維持する場合、刺激に対する過去の反応と未来の反応との相関は細胞単位で維持される。 Cells to remain viable state, and, when maintaining the experiment progress and online, the correlation between the reaction of past reaction and future to stimuli are maintained in the cell units. 比較的少量の細胞試料を使用して、単一の実験中に多様かつ繰り返しのコンピュータ生成刺激を印加および反復することができる。 Using a relatively small amount of cell sample, it can be applied and repeated diverse and repetitive computer-generated stimuli in a single experiment. このことは、細胞種間の差異を検索および最適化する際に大きな利点となる。 This is a great advantage when searching and optimize the differences between cell types. 「刺激」という用語は、単一の刺激、複数の刺激、または複数の刺激の組合せを単回、繰り返し、または連続的に与えることを意味する。 The term "stimulation" is meant to give a single stimulus, a plurality of stimulation, or a combination of stimuli single dose, repeated or continuously. 生理学的な反応を引き起こす刺激には、機械的、物理的、化学的、および生物学的な実体が含まれる。 The stimuli cause physiological reactions, mechanical, physical, chemical, and biological entities. したがって、本発明はいかなる刺激または刺激の種類にも限定されない。 Accordingly, the present invention is not limited to the type of any stimulus or stimuli.
【0018】 [0018]
生細胞は移動することができ、または形態を変化させることができる。 Viable cells can be changed to be able to move or form. したがって、細胞の形態測定的特徴、テクスチャ、およびその他の特徴を分析するための手段を提供することが重要である。 Therefore, cell morphology measurement characteristics, to provide a means for analyzing texture, and other characteristics are important. したがって、ある視野に戻る際、ソフトウェアは、焦点を調節し(z軸制御)、かつ視野を再取得および再登録するため横方向および縦方向にわずかな調整を行う(x,y軸制御)必要がある。 Therefore, when returning to a certain field of view, the software adjusts the focus (z-axis control), and performs a slight adjustment in the horizontal direction and the vertical direction to reacquire and re-register the field (x, y axis control) must there is. さらに、細胞の位置および形状の変化を追跡するため、個々の細胞の外形を規定する元の輪郭を修正する必要がある。 Further, for tracking the position and changes in cell shape, it is necessary to modify the original contour defining the external shape of the individual cells. したがって、1つの態様では、本発明のVSOMは画像内容の分析結果に基づいて機器の制御に関する決定を行うための手段を提供する。 Accordingly, in one aspect, VSOM of the present invention provides a means for making decisions regarding control of the equipment based on the analysis of image content. 事実、本発明は以下の手段を提供する:生細胞に刺激を繰り返しおよび/または連続的に印加するコンピュータ自動処理の手段;鏡検およびデジタル撮像を用いて、刺激に対する細胞または細胞レベル以下の1つまたは複数の生理学的反応を単一細胞レベルで繰り返しおよび/または連続的に検出およびモニターする手段;信頼性の高い細胞種同定に適した、および/または細胞種間の差異を最適化するための刺激の修正に適した基準を確立するために十分な数の個々の細胞の反応を迅速に観察する手段;細胞が観察および/または刺激に利用できる間に知識ベースの刺激制御を決定できるよう、現在の細胞反応と過去に保存された細胞反応(例:データベース情報)とを迅速に分析する手段;および、時間依存的に生じる事象間の相関を多 In fact, the present invention provides the following means: means of computer automated process to repeatedly and / or continuously applying a stimulus to the living cell; microscopy and using digital imaging, 1 of the following cells or cell level to stimuli One or more repeat physiological responses at the single cell level and / or continuously detecting and monitoring for means; suitable for reliable cell type identification, and / or for optimizing the differences between cell types to be able to determine the knowledge base stimulation control while the cells are available for viewing and / or stimulation; means for quickly observe the response of a sufficient number of individual cells to establish the criteria appropriate for the stimulation fixes , cellular response stored in past and present cell response (e.g. database information) and means for rapidly analyzing; and multi-correlation between a time-dependent manner resulting events ャネルにわたってモニターする手段。 It means for monitoring over Yaneru.
【0019】 [0019]
本発明はさらに、蛍光に加えて透過光を利用して生細胞の輪郭を規定するための手段を提供する。 The present invention further provides a means for defining the contour of the viable cells using transmitted light in addition to fluorescent. これにより、蛍光成分を含まない細胞の追跡が容易になる。 This facilitates the tracking of cells without fluorescent component. さらに、これにより、細胞毒性を示し得る蛍光標識化合物の使用量を少なくでき、かつ、蛍光発光を生じさせるために必要な強力な蛍光励起照射を回避することができる。 Further, thereby, possible to reduce the amount of fluorescent labeling compounds may exhibit cytotoxicity, and can avoid a strong fluorescence excitation irradiation required to produce a fluorescent emission. したがって、より長時間にわたる細胞の観察が可能となる。 Therefore, it is possible to more prolonged cell observation. さらに、特異的な挙動を示す細胞を実験の最後に個別に回収して、プール(貯蔵)、細胞株の樹立、クローニング、特定の分化状態への誘導、分析などに供することができる。 Furthermore, the cells exhibiting specific behaviors were collected individually at the end of the experiment, the pool (reservoir), established cell lines, cloning, induced to a particular differentiated state, analysis can be subjected to such.
【0020】 [0020]
本発明の機器では、撮像を透過光撮像と種々の波長の蛍光撮像とで迅速に循環させることによって、異なる生理学的反応を異なるチャネルで実質的に同時に観察することができるため、本発明により、多数の細胞をモニターすることに加えて、単一の実験中に多数の生理学的反応を観察することが可能となる。 The apparatus of the present invention, by rapidly circulated and fluorescence imaging of the transmitted light imaging and various wavelengths of imaging, it is possible to observe substantially simultaneously on different channels different physiological reactions, the present invention, in addition to monitoring the number of cells, it is possible to observe a number of physiological responses in a single experiment.
【0021】 [0021]
マルチウェル蛍光プレートリーダーを使用すると、生細胞の全母集団が発する進行中の蛍光シグナルを検出することができるが、単一の細胞の反応を観測することはできない。 With multi-well fluorescence plate reader, it is possible to detect the fluorescent signal of the ongoing total population of viable cells emitted, it can not be observed response of a single cell. しかし、本発明のVSOMの1つの態様においては、マルチウェルプレートリーダーに適した蛍光アッセイの発見および最適化が可能である。 However, in one embodiment of the VSOM of the present invention, it is possible the discovery and optimization of assays suitable for the multi-well plate reader. また、一般的な技術では、個々の生細胞が発する多チャネル蛍光シグナルをフローサイトメトリーを使用して瞬時に検出することができる。 In a general technique, it can be detected instantly using flow cytometry multichannel fluorescence signal emitted by the individual living cells. 細胞を蛍光シグナルに応じてソーティングすることができ、かつ、回収することもできる。 Cells can be sorted according to fluorescence signal, and can also be recovered. しかし、細胞は検出器を高速で通過し、得られる測定結果は単一のものである(もしくは多チャネルの可能性もある)。 However, the cells pass through the detector at a high speed, the measurement results obtained (possibly in or multi-channel) is of single. 個々の細胞が一定の長さの時間にわたって追跡されることはなく、過去の反応と現在の反応とを相関させた同一細胞の繰り返し観察も不可能である。 Never individual cells are tracked over time of a certain length, it is impossible repeated observations of past reaction the same cells were correlated with the current response. 本発明はこれらの制限を克服するものであり、フローサイトメトリーおよび活性細胞ソーティングに適した蛍光アッセイの開発および最適化を容易にする。 The present invention overcomes these limitations, facilitates the development and optimization of assays suitable for flow cytometry and active cell sorting.
【0022】 [0022]
本発明は、任意の種類の細胞(例:動物細胞、植物細胞、微生物細胞など)に有用な細胞種特異的蛍光アッセイに用途を有する。 The present invention may be any type of cells: with (eg animal cells, plant cells, microbial cells, etc.) applications useful cell type-specific fluorescence assay. したがって本発明は、いかなる種類の細胞にも、またはいかなる特定の蛍光もしくは他のアッセイシステムにも限定されるものではない。 Accordingly, the present invention relates to any type of cells, or is not limited to any particular fluorescence or other assay system. 好ましい態様ではヒトの細胞を対象としているが、他の態様では他の哺乳類ならびに植物および微生物から取得された細胞も対象となる。 Although the preferred embodiments are directed to human cells, cells obtained from other mammals, as well as plants and microorganisms of interest in the other embodiments. 例えば本発明は、組織から取得された正常細胞、前悪性細胞、悪性細胞、および/または多剤耐性癌細胞を検出および識別する手段を提供する。 For example, the present invention provides normal cells obtained from the tissue, pre-malignant cells, malignant cells, and / or the means detecting and identifying a multidrug resistant cancer cells. さらに本発明は、稀な細胞種(例:幹細胞または母体血液中の胎児細胞)を選択的に標識するプロトコルを設計するための手段を提供する。 The invention further rare cell types: provide a means for designing protocols that selectively labeled (eg fetal cells in stem cells or maternal blood). いくつかの態様においては、これらのプロトコルは放射性およびその他の標識システムとともに使用するよう修正される。 In some aspects, these protocols are modified to be used with radioactive and other labeling system. 本発明はまた、個々の患者および/または患者の個々の腫瘍に合わせた化学療法レジメン(薬剤の組合せも含めて)を確立するためのアッセイの設計および応用を容易にする。 The present invention also facilitates the design and application of the assay to establish the chemotherapy regimen tailored to individual tumor individual patient and / or patient (combination of drugs be included). さらに本発明は、医薬品、農業、バイオテクノロジーなどにおける種々の使用について、候補となる多数の薬剤、殺虫剤、除草剤、およびその他の化合物を検索するうえで有用なアッセイを提供する。 The invention further pharmaceuticals, agriculture, for various use in biotechnology, a number of agents that are candidates, insecticide provides assays useful in order to search for herbicides, and other compounds. さらに本発明は、細胞増殖、細胞毒性、および/または分化における使用について、多数の候補薬剤を検索するうえで有用なアッセイを提供する。 The invention further cell growth, for use in cytotoxicity, and / or differentiation, to provide a useful assay in order to search a large number of candidate agents.
【0023】 [0023]
本発明はさらに、関心対象の細胞種を増殖上有利にすることによって、または、培養中に存在する他の細胞種に対して細胞毒性として作用する環境条件もしくはプロトコルを設計することによって、特定の細胞種の増殖をもたらす、インビトロの組織培養条件を設計する手段を提供する。 The present invention further provides by on growing cell type of interest Advantageously, or by designing the environmental conditions or protocols act as cytotoxic to other cell types present in the culture, a particular resulting in cell types proliferation, it provides a means for designing an in vitro tissue culture conditions. したがって本発明は、インビトロでの増殖がしばしば困難である細胞を培養するための手段を提供する。 Accordingly, the present invention provides a means for culturing the cell growth in vitro is often difficult. さらに本発明は、細胞を特定の分化終点へと誘導するのに適した細胞培養条件をつくるための手段を提供する。 The present invention provides a means for making a suitable cell culture conditions to induce cell into a specific differentiation endpoint. 例えば、本発明を用いて、幹細胞または胚性細胞を所望の最終終点へと誘導するために必要な条件を開発することができる。 For example, can be developed using the present invention, the conditions necessary to induce into the stem cells or embryonic cells desired final endpoint.
【0024】 [0024]
本発明はまた、種々の迅速インビトロ検査の開発および実施に用途を有する。 The present invention also has application in the development and implementation of various rapid in vitro testing. 例えば、ある患者に対して候補となる組織または骨髄ドナーが複数存在する場合は、種々のドナーの細胞を患者の免疫細胞と混合し、免疫拒絶反応を単一細胞レベルで観察する。 For example, if the tissue or bone marrow donors as candidates for a patient there are a plurality of cells of various donors was mixed with the patient's immune cells, to observe the immunological rejection at the single cell level. したがって、その特定の患者に対する最適なドナーの同定が容易になる。 Therefore, identification of the optimal donor for that particular patient is facilitated. さらに、これらの検査は、移植拒絶を抑制するよう設計された薬剤(または薬剤候補)の存在下で実施することができ、患者に対する最適なドナーの選択とあわせて、最適な抗拒絶薬の投与レジメン(すなわち、単剤使用または多剤併用)の選択が容易になる。 Moreover, these tests may be carried out in the presence of agents designed to inhibit transplant rejection (or drug candidate), in conjunction with the selection of optimal donor for patient administration of optimal anti-rejection drugs regimen (i.e., monotherapy use or multi-drug) selection of is facilitated.
【0025】 [0025]
本発明は、細胞または細胞の細胞内構成要素をモニターする検出装置から細胞画像データ(すなわち、細胞の生理学的特徴、形態学的特徴、および/またはその他の特徴に関する情報)を受け取る段階;細胞画像データを分析する段階;ならびに、分析された細胞画像データに応じて細胞または細胞内構成要素を刺激するよう適合させた複数の刺激装置を自動的に作動させる段階を含む方法を提供する。 The present invention, cell image data from the detector for monitoring the intracellular components of the cell or cells (i.e., cells physiological characteristics, morphological characteristics, and / or other features information about) stages receive; cell image step analyzing the data; and the method comprising the step of automatically actuating a plurality of stimulator adapted to stimulate the cells or subcellular components in accordance with the analysis cell image data. いくつかの態様においては、本発明はさらに、分析された細胞画像データに応じて細胞を刺激するため複数の刺激装置を自動的かつ独立的に作動させる段階を含む。 In some embodiments, the present invention further comprises the step of actuating a plurality of stimulating devices automatically and independently to stimulate cells in response to the analyzed cell image data. また別の態様においては、細胞画像データを分析する段階は、細胞のサイズの分析、細胞の色の分析、および細胞の動きの分析のうち少なくとも1つを含む。 In yet another embodiment, the step of analyzing the cell image data includes analysis of cell size, color analysis of the cells, and at least one analysis of cell movement. いくつかの好ましい態様においては、検出装置は視覚的サーボ制御光学顕微鏡(VSOM)を含み、この場合、方法はVSOMを用いて細胞をモニターする段階をさらに含む。 In some preferred embodiments, the detection device includes a visual servo control optical microscope (VSOM), in this case, the method further comprises monitoring the cells using VSOM. 別の態様において、刺激装置はシリンジである。 In another embodiment, the stimulation device is a syringe. さらに別の態様において、方法は、細胞画像データを時間の関数として保存する段階をさらに含む。 In yet another embodiment, the method further comprises the step of storing the cell image data as a function of time. いくつかの特に好ましい態様において、細胞は生細胞であり、かつ、細胞内構成要素は生細胞内の構成要素である。 In some particularly preferred embodiments, the cell is a living cell and the intracellular component is a component of a living cell. 別の態様において、方法は、前述の段階を所望の回数かつ所望の順序で繰り返す段階をさらに含む。 In another embodiment, the method further comprises the step of repeating the aforementioned steps in a desired number and desired order.
【0026】 [0026]
本発明はまた、細胞アレイ;細胞アレイが発する光を検出し、かつ細胞アレイで生成された光に対応する第一の信号を、第一の信号を受け取り第一の信号を用いて、被刺激細胞アレイを得るための細胞アレイへの少なくとも1つの検査刺激の送達を制御するための第二の信号を生成するコンピュータに提供する光学システム;および、第二の信号を受け取りかつ検査刺激を送達するロボットシステムを含む、細胞アレイを分析するための方法およびシステムであって、非刺激細胞アレイが発する光を光学システムがさらに検出する方法およびシステムを提供する。 The present invention also provides cells array; detecting the light emitted by the cell array, and a first signal corresponding to light generated in the cell array, the first signal using a first signal receiving, irritability the optical system provides a computer for generating a second signal for controlling the delivery of at least one test stimulus to cells array for obtaining a cell array; and, delivering the receive and test stimulus a second signal including the robot system, a method and system for analyzing cell array, provides a method and system for light unstimulated cells array emitted optical system further detection. いくつかの態様において、検査刺激は第一の信号に従って自動的に細胞アレイに与えられる。 In some embodiments, test stimulus is applied to automatically cell array according to the first signal. いくつかの好ましい態様において、ロボットシステムは少なくとも2つの微量液体チャネルを介して検査刺激を細胞アレイに送達する。 In some preferred embodiments, the robotic system the test stimulus through at least two microfluidic channels delivered to cells array. さらに別の態様において、光学システムは少なくとも1つの顕微鏡を含む。 In yet another embodiment, the optical system includes at least one microscope. いくつかの好ましい態様において顕微鏡は共焦点顕微鏡であり、別の態様において顕微鏡は蛍光顕微鏡である。 Microscope In some preferred embodiments is confocal microscopy, in another embodiment the microscope is a fluorescence microscope. いくつかの態様において、細胞アレイは少なくとも2つの細胞種を含む。 In some embodiments, the cell array comprises at least two cell types. さらに別の態様において、光学システムは細胞アレイを走査して、細胞アレイに含まれる細胞種の中の細胞内構成要素を検出する。 In yet another embodiment, the optical system scans the cell array, detecting the intracellular components in a cell type included in cell array. いくつかの好ましい態様において、細胞内構成要素は、核、核小体、ミトコンドリア、リソソーム、ファゴリソソーム、および貯蔵小胞からなる群より選択される。 In some preferred embodiments, the intracellular component, nucleus, nucleoli, mitochondria, lysosomes, are selected from the group consisting of phagolysosome and storage vesicle. いくつかの特に好ましい態様においては、少なくとも1つの細胞内構成要素が標識される。 In some particularly preferred embodiments, at least one cellular component is labeled. 別の好ましい態様において、細胞内構成要素は検査刺激により標識される。 In another preferred embodiment, the intracellular component is labeled by test stimulus. いくつかの態様において、細胞内構成要素は、蛍光染料、放射性化合物、酵素、および生体染料からなる群より選択される少なくとも1つの化合物で標識される。 In some embodiments, the intracellular components, fluorescent dyes, radioactive compounds, are labeled with at least one compound selected from the group consisting of enzymes and vital dye. 別の態様において、光学システムは標識をデジタルデータに変換する。 In another embodiment, the optical system for converting a label into digital data. さらに別の態様において、ロボットシステムはデジタルデータを利用して細胞アレイへの生物活性成分の送達を自動的に調整する。 In yet another embodiment, the robotic system automatically adjusts the delivery of biologically active ingredients to the cells array using digital data. 別の態様において、本発明は、コンピュータシステムの遠隔操作の手段を提供する。 In another aspect, the present invention provides a means of remote operation of a computer system. さらに別の態様において、本発明は、細胞情報(例:結果のプロフィールにおける情報)を、過去に取得された細胞情報およびデータを含む基準データベースと比較する手段を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides cell information: (eg information on the result of the profile), provides a means for comparing the reference database containing cell information and data obtained in the past.
【0027】 [0027]
本発明はまた、細胞または細胞内構成要素をモニターする検出装置から細胞画像データを受け取るためのコード;細胞画像データを分析するためのコード;および、分析された細胞画像データに応じて細胞または細胞内構成要素を刺激するよう適合された複数の刺激装置を自動的に調整するためのコードを含む、コンピュータ読み取り可能媒体を提供する。 The present invention also code for receiving cell image data from the sensing device to monitor cell or subcellular components; code for analyzing the cell image data; and a cell or cells according to the analysis cell image data including automatically code for adjusting adapted a plurality of stimulator to stimulate the internal components, a computer readable medium. いくつかの好ましい態様において、コンピュータ読み取り可能媒体は、細胞をモニターする視覚的サーボ制御光学顕微鏡(VSOM)を制御するためのコードをさらに含む。 In some preferred embodiments, the computer readable medium further includes code for controlling a visual servo control optical microscope (VSOM) to monitor cell. さらに別の態様において、コンピュータ読み取り可能媒体はさらに、細胞のサイズを分析するためのコード、細胞の色を分析するためのコード、および細胞の動きを分析するためのコードのうち少なくとも1つをさらに含む。 In yet another aspect, a computer-readable medium further code for analyzing the size of the cell, the cell code for analyzing the color, and the cells of at least one of code for analyzing the motion further including. また別の態様において、コンピュータ読み取り可能媒体は、分析された細胞画像データに応じて細胞を刺激するための複数の刺激装置を自動的かつ独立的に作動させるためのコードをさらに含む。 In yet another aspect, a computer-readable medium further comprises code for causing a plurality of stimulation devices for stimulating cellular according to the analysis cell image data is operated automatically and independently. さらに別の態様において、刺激装置はシリンジである。 In yet another embodiment, stimulation device is a syringe. いくつかの好ましい態様において、コンピュータ読み取り可能媒体は、細胞画像データを時間の関数として保存するためのコードをさらに含む。 In some preferred embodiments, the computer readable medium further comprises code for storing cell image data as a function of time. さらに別の好ましい態様において、細胞は生細胞であり、細胞内構成要素は生細胞内の構成要素である。 In yet another preferred embodiment, the cell is a living cell, subcellular component is a component of a living cell.
【0028】 [0028]
発明の全体的な説明本発明は、近年の大多数のネットワークコンピュータの処理能力、記憶能力および分析能力を、単一の生細胞の複雑かつ相互作用的な生物学的経路および生化学的経路または「回路構成」と結びつけるための手段を提供する。 Overall Description of the Invention The present invention has recently the majority of the network computer power, storage capacity and analytical skills, complex and interactive biological pathway of a single living cell and biochemical pathways or to provide a means for linking a "circuit configuration". さらに、この過程は数百または数千の細胞について繰り返し行うことが可能であり、人間がこの連結的かつ自動的なシステムに携わることはない。 Furthermore, this process is capable of performing repeated for hundreds or thousands of cells, human never involved in this connection and automatic systems. コンピュータ印加の刺激および摂動によって呼掛けを受けた生細胞がコンピュータによる検出および分析が可能な様式で「反応」する際に、通信またはフィードバックループが確立される。 When living cells undergoing interrogation by stimulating and perturbations of the computer application is "reaction" in the possible mode detection and analysis by a computer, communication or feedback loop is established. コンピュータ印加によるこれらの複雑な刺激および摂動は、繰り返し印加することができ、かつ、細胞から受け取った複雑な「反応」に基づいて適切に変化させることができる。 These complex stimuli and perturbations by the computer application may be repeatedly applied, and can be appropriately changed based on a complex received from cell "reaction".
【0029】 [0029]
本発明のいくつかの態様は、異なる細胞「種」の正味の生理学的反応における微妙な差異、および/または、異なる生理学的状態にある同じ「種」の細胞間の微妙な差異を迅速に発見するという用途を有する。 Some embodiments of the present invention is quickly discovered different subtle differences in net physiologic cellular response "seed", and / or, subtle differences between cells of the same "species" in different physiological states have application that. 本発明は、観察される差異を特定の生化学経路、特定の遺伝子もしくは遺伝子セットの発現、または他の特異的な差異に分離または局限するよう設計された一連の追加的な試験または刺激を与えることによって、異なる細胞種の正味の反応の差異を迅速、自動的、かつ効率的に精密化または最適化する手段を提供する。 The present invention provides certain biochemical pathways differences observed, the specific expression of the gene or gene set, or other series being designed to separate or confined to specific differences additional tests or stimulation it allows rapid differences reaction of different cell types of the net, automatically, and provides a means of efficiently refined or optimized. この方式により、特定の差異が非常に精密な方式で同定および標的化されるため、生きている複雑な系(生細胞)の2つ以上の異なる母集団間における生物学的反応の微妙な差異を増幅することが可能となる。 This scheme, since the specific differences are identified and targeted in a very precise manner, living complex systems nuances biological response between two or more different populations of (live cells) it is possible to amplify.
【0030】 [0030]
本発明は、細胞種間の差異を知識ベースで発見および最適化するための方法および装置を提供する。 The present invention provides a method and apparatus for discovering and optimizing the differences between cell types in the knowledge base. 特に本発明は、生細胞の大きな定義済みアレイの自動生成およびそれに続く自動分析のための視覚的サーボ制御光学顕微鏡(VSOM)および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscope (VSOM) and analysis methods for automatic generation and automatic analysis subsequent large predefined array of living cells. 本発明はさらに、印加された刺激または刺激の組合せに対する細胞の反応の差異を検索、定量化、および最適化するための手段を提供する。 The present invention further find the difference of the reaction of cells to a combination of applied stimuli or stimuli, provides a means to quantify, and optimization. 本発明は、種々の目的を達成するため、自動化された様式で、細胞反応の既知の差異を利用することができ、かつ/または、細胞反応の新しい差異を検索および発見することができる。 The present invention is to achieve a variety of purposes, in an automated manner, it is possible to use a known difference in cell response, and / or can search and discover new difference in cell response. したがって、本発明により、細胞反応の所望の差異を得るための刺激または刺激の組合せを発見および印加することが可能である。 Accordingly, the present invention, it is possible to find and apply a stimulation or stimulation combinations to obtain the desired difference in cell response.
【0031】 [0031]
さらに、本発明により、表面に付着されたまたはしっかり接着した多数の個々の細胞について、個々の細胞種の同定および個々の細胞の生理学的状態の同定が可能である。 Furthermore, the present invention, for a number of individual cells that the deposited or firmly adhered to the surface, it is possible to identify physiological state of the individual cell types identification and individual cells. この個々の細胞の同定に付随して、多数の隣接細胞に対する相対的な細胞位置が特定される。 In association with the identification of the individual cells, the relative cell positions for a number of neighboring cells is identified. この方式により、表面上に任意に置かれた生細胞の大きなアレイは、定義されたx,y,z位置に存在する同定済み細胞の大きなアレイに自動的な様式で変換される。 This scheme, a large array of living cells placed optionally on the surface, defined x, y, is converted in an automated manner to a large array of Identified cells present in z position. 次に、このようなアレイは、続いて行われるVSOM刺激、摂動、および呼掛けの実験の間モニターおよび追跡される。 Then, such an array can subsequently VSOM stimulation is performed, perturbations, and are between monitor and track the interrogation of the experiment. VSOM刺激、摂動、および呼掛けには、蛍光プローブの使用、化学的物質および生物学的物質の添加、および物理的刺激の印加が含まれる。 VSOM stimulation, perturbation, the and interrogation, the use of fluorescent probes include the addition of chemical substances and biological substances, and the application of physical stimulation. 種々の量、間隔および連続性で単独または組合せで印加されるこれらは、自動的に記録、分析、および最適化される。 Various amounts of these applied alone or in combination with spacing and continuity, automatically recording, analysis, and are optimized. このような刺激、摂動、および呼掛けは、良性のものであってもよく、細胞にとって致死的なストレスとなるものであってもよく、または中間的なある程度の影響を細胞に及ぼすものであってもよい。 Such stimulation, perturbations, and interrogation is be those exerted may be of benign, it may be composed lethal stress to the cell, or an intermediate degree of influence cell it may be. 本発明により、1つの実験過程の間に、自動的に印加された刺激、摂動、および呼掛けに対する生理学的反応の生物学的帰結を、細胞について細胞単位でかつ細胞小器官について細胞小器官単位で、長期間にわたって定量、モニター、および保存すること、ならびに他の反応と相関させることが可能である。 The present invention, during one experimental procedure, automatically applied stimuli, perturbations, and the biological consequences of physiological responses to challenge, a cell unit for cell and organelle for organelles units in quantitative over a long period of time, the monitor, and storage to be, and it is possible to correlate with other reactions.
【0032】 [0032]
印加された刺激、摂動、および呼掛けの履歴、ならびに、複数のチャネルで同時に観察した数百または数千の細胞の、相関付けされた複数の個々の細胞の反応の履歴は、遠隔または局所のデータベースに保存される。 Applied stimuli, perturbations, and interrogation of history, as well as hundreds or thousands of cells observed at the same time in a plurality of channels, the reaction history of the correlation is a plurality of individual cells, remote or local It is stored in the database. さらに、このような刺激の最終的な生物学的帰結が以後のVSOM実験用に収集される。 Furthermore, the final biological consequences of such stimuli are collected for subsequent VSOM experiments. このデータベースが増大するにつれて、VSOMアッセイおよびプロトコルはその予測能力が向上し、かつ、機器および処理の制御および最適化により有用なものとなる。 As this database increases, VSOM assays and protocols improve the prediction ability, and a useful by the control and optimization of equipment and processing.
【0033】 [0033]
本発明では、適用されたプローブ、刺激、摂動、および呼掛けに対する過去の細胞反応の知識に基づいて刺激、検索、最適化、およびVSOM機器制御が行われるよう、VSOM実験過程の間にリアルタイムで局所的または遠隔的にデータベースにアクセスすることが可能である。 In the present invention, the applied probe, stimulation, perturbation, and stimulation based on the knowledge of past cell response to interrogation, search, optimization, and to VSOM equipment control is performed in real time during the VSOM experimental procedure it is possible to access the local or remotely database. 本発明により、細胞種および/または細胞の生理学的状態に特異的な種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを開発することができる。 The present invention makes it possible to develop a specific variety of in vitro and in vivo assays to physiological state of cell types and / or cells. 本発明の方法およびシステムと保存された知識の蓄積と基づくアッセイの開発により、よく特徴付けされた大規模な生細胞アレイの自動生成に用いることができる、より迅速で、良性で、かつ特異的なアッセイが可能となる。 The development of an assay based accumulation and methods and systems and stored knowledge of the present invention, well-characterized may be used for automatic generation of a large viable cells arrays, more rapid, benign, and specific an assay is made possible. これにより、最小限の刺激または摂動を受けた生細胞アレイを、迅速かつ自動的に生成し、かつ、その後細胞種間の際を利用する新しいまたは改善されたレシピ(recipe)およびプロトコルを検索するためのVSOMに使用することができる、有効なサイクルが提供される。 Accordingly, living cells array that have undergone minimal irritation or perturbations quickly and automatically generate and to search for new or improved recipe (recipe) and protocol utilizes a time between subsequent cell types can be used VSOM for valid cycle is provided. 次に、種々の目的を達成する目的で、このプロセスと、機器制御知識と、その結果得られるレシピおよびプロトコルであって細胞種特異的な生理学的反応および細胞種特異的な生物学的帰結を生成するレシピおよびプロトコルとを、VSOM環境および非VSOM環境で使用することができる。 Next, in order to achieve a variety of purposes, and this process, a device control knowledge, the result was obtained recipes and protocols cell type specific physiological response and cell-type specific biological consequences a recipe and protocol produced can be used in VSOM environment and non VSOM environment.
【0034】 [0034]
これらの目的には以下(i)〜(xiii)が含まれるがこれらに限定されることはない:(i)細胞の特定の部分母集団のみに有利なインビトロ培養条件およびプロトコルを迅速かつ自動的に最適化すること、(ii)非VSOMの機器または状況に適した、細胞種特異的なアッセイ、プロトコル、および診断キットを開発すること、(iii)VSOM機器のみに適した細胞種特異的なアッセイを開発すること、(iv)薬剤開発の標的となる、細胞種間の特異的な差異を発見すること、(v)幹細胞から種々の特定種の細胞を得る場合のように、所望の分化状態で細胞を得るためのインビトロの条件およびプロトコルを発見すること、(vi)生細胞の複雑かつ相互作用的な生化学ネットワークにおける特定の遺伝子または遺伝子セッ Although for these purposes include the following (i) ~ (xiii) will not be limited to: (i) rapid and automatic favorable in vitro culture conditions and protocols only certain subpopulations of cells be optimized, (ii) suitable for the non VSOM equipment or conditions, to develop a cell-type specific assay, the protocol, and a diagnostic kit, (iii) a cell-type specific to only suitable for VSOM equipment to develop assays, (iv) a target for drug development, to discover the specific differences between cell types, as in the case of obtaining the various specific types of cells (v) a stem cell, desired differentiated finding in vitro conditions and protocols for obtaining cells in the state, a particular gene or gene set in a complex and interactive biochemical networks (vi) live cells の機能を発見すること、(vii)遺伝子または遺伝子セットの発現または非発現、およびその結果である細胞表現型の間の関係を発見すること、(viii)個々の生細胞の複雑かつ相互作用的な生化学ネットワークにおける薬剤またはその他の物質の影響を発見すること、(ix)薬剤またはプローブの細胞特異的な送達に適した物質およびプロトコルを発見すること、(x)個々の患者の腫瘍、特に多剤耐性を示す可能性のある腫瘍に合わせて設計された化学療法レジメンを発見すること、(xi)特定の個人に対する、物質の相対的な化学感受性または毒性を発見すること、(xii)特定の個人に対する特定の臓器ドナーの適合性を発見すること、ならびに、(xiii)生きているヒトにおける特定遺伝子の発現の3D撮像に Finding the functions, (vii) expression or non-expression of a gene or gene set, and finding the relationship between the cell phenotype is the result, (viii) complex and interactive individual living cells finding the influence of drugs or other substances in a biochemical network, (ix) to discover materials and protocol suitable for cell specific delivery of drugs or probe, (x) a tumor of the individual patient, especially finding chemotherapy regimens that are specifically designed for the tumor that may indicate a multidrug resistance, (xi) for a particular individual, to find the relative chemical sensitivity or toxicity of substances, (xii) a specific finding the suitability of a particular organ donors to individuals, as well as the 3D imaging of the expression of specific genes in the human living (xiii) した放射線標識プローブを利用するものなどの、インビボアッセイを開発すること。 And such as those utilizing radiolabeled probe, to develop an in vivo assay. 本発明はさらに、各分析の間にインキュベーション期間が設けられる(すなわち、培養物が細胞培養インキュベータ内に置かれる)場合においても、培養中に存在する特定の細胞を複数回特異的に特定する手段を提供することにより、経時的に繰り返し細胞を分析する手段を提供する。 The present invention further provides the incubation period provided between each analysis (i.e., placed are the culture cell culture incubator) even when a plurality of times specifically identify a means of specific cells present in the culture by providing, to provide a means for analyzing the time and repeatedly cells.
【0035】 [0035]
VSOMアプローチの1つの態様においては、個々の分散した生細胞(または、細胞もしくは組織片の非常に小さな集塊)を含む溶液が滅菌容器内に置かれる(すなわち、インビトロ)。 In one embodiment of the VSOM approach, individual dispersed live cells (or a very small agglomerates of a cell or tissue piece) solution containing is placed in a sterile container (i.e., in vitro). 容器の壁に細胞を付着させる手段がない限り細胞は容器の底に沈降し、次に(条件が正しければ)容器の底に付着を始める。 Cells Unless means for attaching the cells to the walls of the vessel settled to the bottom of the container, then (if conditions are correct) begin attached to the bottom of the container. この過程の間、細胞は扁平化し、次に(条件が正しければ)成長、分裂、および増殖を始める。 During this process, the cells were flattened and (if conditions are correct) then begin growth, division, and proliferation. 一部の場合においては、扁平化および表面付着の傾向をまったく示さない例えば円形の細胞が容器の底面に付着して液体の交換によって洗い流されなくなるよう、容器の底面を処理する必要がある。 In some cases, for example, circular cells show no tendency of flattening and surface adhesion adheres to the bottom surface of the container so that not washed away by the exchange of the liquid, it is necessary to process the bottom surface of the container.
【0036】 [0036]
いくつかの好ましい態様において、本発明は、典型的には倒立顕微鏡である顕微鏡を、拡大レンズ(すなわち対物レンズ)が細胞溶液の入った容器の下に位置する状態で使用する。 In some preferred embodiments, the present invention is typically a microscope is an inverted microscope, a magnifying lens (i.e. objective lens) is used in a state that is located below the container with cell solution. デジタル画像を自動的に取得できるようデジタルカメラが顕微鏡に取り付けられ、(一部の場合においては)標準的なハロゲン電球を光源とする標準的な白色光が細胞に照射される。 Digital camera to be able to automatically acquire the digital image is attached to the microscope, (in some cases) standard white light for a standard halogen bulb as a light source is irradiated to the cells. 次に、標準的な透過光技術(位相差法、微分干渉法、明視野法、暗視野法など)を用いて、デジタルカメラ撮像に適した細胞像を得る。 Next, to obtain a standard transmitted light technique (phase difference method, a differential interference method, bright-field method, a dark-field method) using a cell image suitable for digital camera imaging. 一部の場合においては、水銀アークランプまたはキセノンアークランプなどを光源とする非常に明るい照射光を用いて追加の画像を連続的に高速で取得する。 In some cases, to obtain additional images continuously fast with irradiation light very bright to a light source such as a mercury arc lamp or a xenon arc lamp. この照明光はコンピュータ制御の回転光学フィルタホイールに収容された1つまたは複数の光学フィルタを通過し、細胞にはフィルタリングされた紫、青、または黄色の照明光が照射され、一連のデジタル画像が連続的に取得される。 The illuminating light passes through one or more optical filters housed in rotating optical filter wheel of the computer control, purple the cells were filtered, blue or yellow illumination light is irradiated, a series of digital images continuously it is obtained. 表面蛍光鏡検法用に適切に装備された顕微鏡では、1つまたは複数の蛍光プローブを含む細胞は適切な色の蛍光励起光を照射すると特定の色の蛍光を発する。 The surface fluorescence microscopy appropriately equipped microscope for the cells when irradiated with fluorescence excitation light of appropriate color emit fluorescence of a specific color, including one or more fluorescent probes. したがって、光学フィルタホイールの位置を変えて取得した連続デジタル画像では、細胞が発する青、緑、および赤の蛍光が別々の連続デジタル画像またはデジタル「チャネル」に写った画像が得られる。 Thus, the running digital image acquired by changing the position of the optical filter wheel, the cells emit blue, green, and red image fluorescence was captured in separate consecutive digital images or digital "channel" is obtained. この方式により、細胞中の(例えば)青、緑、または赤の蛍光プローブの量および相対的分布を青、緑、または赤の蛍光発光のデジタル画像(青、緑、および赤のチャネル)でモニターすることができ、細胞の全体的な形状およびテクスチャは透過光デジタル画像(透過光チャネル)で観察することができる。 This scheme monitored in the cell (for example) blue, green or the amount and relative distribution of the red fluorescent probes blue, green or red fluorescence of the digital image, (blue, green, and red channels), it can be, overall shape and texture of the cells can be observed in transmitted light digital image (transmitted light channel).
【0037】 [0037]
異なる細胞内区画で観察される蛍光の相対的な強度および色によって、異なる蛍光プローブの取込みおよび保持の比率を表すことができ、細胞内でこの蛍光強度が分断および再配分される様子は、細胞に関する重要な生理学的、解剖学的、および形態学的情報を提供する。 By the relative intensity and color of fluorescence observed in different subcellular compartments, uptake and the ratio of retention of different fluorescent probes can represent, how the fluorescence intensity in the cells is divided and redistributed, the cell important physiological relating to provide anatomical and morphological information. 形態学的な情報は透過光デジタル画像でも得られる。 Morphological information is obtained even by transmitted light digital images. 時間または印加した刺激の関数としてこれらのいずれかまたはすべてのパラメータに生じた変化は、使用された蛍光プローブに対する、および、細胞またはその環境に印加された他の刺激または摂動に対する、細胞の「反応」として解釈することができる。 Changes occurring in these any or all of the parameters as a function of time or the applied stimulus, for fluorescent probe used, and the cells or to other stimulus or perturbation applied to the environment, the cell "reaction it can be interpreted as ". さらに、1つの反応が赤のチャネルで、1つの反応が緑のチャネルで、1つの反応が青のチャネルで、および、1つの反応が透過光チャネルで観察できるよう、個別の反応を複数の別々のデジタルチャネルでモニターおよび追跡することができる。 Furthermore, in one reaction is red channel, in one reaction a green channel, in one reaction is blue channels, and such that one reaction can be observed by transmitted light channel, a plurality of separate reaction separately it can be monitored and tracked by the digital channel. この方式により、コンピュータ印加の刺激、摂動、および呼掛けに対する生理学的な反応が連続デジタル画像中にコードされる。 This scheme, stimulation of the computer application, the perturbation, and physiological responses to interrogation is encoded in the continuous digital image. これらの反応は、デジタル画像をコンピュータに通過させる際に、各デジタル画像に含まれる情報を抽出しかつある意味コンピュータ印加刺激に対する「応答」である細胞の反応を検出するアルゴリズムによって、デコードされる。 These reactions, when passing the digital image to the computer, the algorithm for detecting the response of cells is a "response" to mean computer applying stimulating the information contained in each digital image with One only extracted and decoded.
【0038】 [0038]
本発明の特に好ましい態様の1つでは、ストレス、刺激、抑制、または摂動の形でコンピュータにより印加される呼掛け(または「質問」)に対する細胞の反応または「応答」とは、実験過程中に迅速に(すなわち、「リアルタイム」で)デコードおよび解釈される。 Particularly In one particular embodiment of the present invention, stress, stimulation, inhibition, or reaction, or a "response" of the cell to the interrogation (or "question") applied by the computer in the form of perturbations, in the course of the experiment rapidly (i.e., in "real time") is decoded and interpreted. したがって、前の「応答」または細胞反応の解釈に基づいて追加の「質問」をすることができる。 Therefore, it is possible to add the the "question" based on the interpretation of the previous "response" or cellular response. このプロセスは細胞とコンピュータとの間の通信ループを構成し、かつ、個々の生細胞の現在の生物学的状態および現在の生物学的「回路構成」(例:現在の生物学的および生化学的なプロセス)に関する情報を「読み出す」手段に相当する。 This process constitutes the communication loop between the cells and the computer, and the current biological status and current biological "circuitry" (example of individual living cells: current biological and biochemical the specific process) information about the equivalent to the "read" means.
【0039】 [0039]
コンピュータ制御の刺激、摂動、および呼掛けを印加する1つの手段は、コンピュータ制御のシリンジポンプを経由させることである。 Stimulation of computer control, perturbation, and one means for applying an interrogation is to via a syringe pump of the computer control. この方式により、種々の蛍光プローブ、ならびに化学物質および生物学的物質の溶液を、付着した生細胞に通過させることができ、かつ、物質およびプローブを細胞標本容器に添加する際または細胞標本容器から洗い流す際にこれらの物質に対する細胞の反応をモニターすることができる。 This scheme, various fluorescent probes, and the solution of chemical and biological agents, can be passed through the raw cells attached and from or during cell preparation vessel adding a substance and the probe to the cell sample container it is possible to monitor the reaction of the cells to these agents when washing out. このようなプロセスは、細胞の微小環境の変動または摂動として説明してもよい。 Such a process may be described as variations or perturbations cellular microenvironment. 細胞容器の温度を変化させる、細胞に強いUV光を照射する、または容器内の細胞に電場をかけるなど、細胞環境を摂動させる他の物理的手段も存在する。 Changing the temperature of the cell container is irradiated with intense UV light to cells, or the like applying an electric field to the cells in the vessel, other physical means to perturb the cellular environment also present. このような環境の物理的変動はコンピュータで制御してもよく、かつ、シリンジポンプを必要としない。 Physical variations of this environment may be controlled by a computer, and does not require a syringe pump. 特に好ましいいくつかの態様においては、ユーザーは、膨大な数に及ぶこのような刺激の過去の組合せ、ならびに、それらがどのように印加されたかおよび細胞の反応がどうであったか、を追跡できるコンピュータの能力を利用する。 In a particularly preferred some embodiments, the user of the vast over several past such stimuli combinations, as well as how they were applied and whether the reaction of the cells were what can track the computer advantage of the ability. これは、実施中の実験をモニターすることだけでなく、過去の細胞の刺激と反応とが記録された、オンラインの非常に大規模なコンピュータデータベースを参照することによって実施してもよい。 This not only monitoring the experiment being conducted, a reaction with the stimulus of the past cells is recorded, may be carried out by reference to the very large computer databases online. 生細胞を用いたリアルタイム実験の過程でこのような大規模データベースにアクセスできる能力は、広く用いられている方法に対する大きな利点である。 Ability to access such a large database in the course of the real-time experiments with live cells is a major advantage for the method is widely used.
【0040】 [0040]
さらに、異なる種の生細胞を同定、識別、および分類する手段が、特別に変調した(コンピュータ制御の様式で生成した)細胞種特異的かつ時間変動的な動的生理学的反応により提供される。 Furthermore, identification of different species of live cells, identification, and classification to means is provided by a specially modulated (produced in the manner of a computer control) cell type-specific and time-varying kinetic physiological response. 本発明は、このように特有の細胞種特異的な「生理学的フィンガープリント」を、生細胞に対して侵襲が最低限でありかつ比較的良性である点まで発見および精密化する手段を提供する。 The present invention, in this way specific cell type specific "physiological fingerprint", provides a means for discovering and refinement to the point a is and relatively benign minimal invasive with respect to living cells . 環境の良性な摂動に対する反応を定量化するために形態測定パラメータ(蛍光プローブ不在化で透過光チャネルで取得される)を使用することは、高度に精密化された同定アッセイの一例である。 The use of forms to quantify the measured parameter (obtained by transmitted light channel with a fluorescent probe absence of) the response to benign perturbations environment is an example of a highly refined been identified assay.
【0041】 [0041]
本発明の開発中に克服された課題の1つは、生細胞とその個々の細胞内区画との外形(輪郭)を描くための標準的なデジタル画像分析技術が、しばしば生細胞の研究には不十分であるという問題点である。 One of the challenges that have been overcome during the development of the present invention, standard digital image analysis techniques for drawing the outer shape (outline) of living cells and their respective intracellular compartment, often live cells studies is a problem that it is insufficient. これらのアルゴリズムでは多くの場合、細胞が物理的に離れていること(すなわち、細胞が接触または重複していないこと)が必要とされ、また、比較的明るい蛍光色素で非常に均一に標識されていることも必要とされる。 Often in these algorithms, the cells are physically separated (i.e., cells contacted or non-overlapping) is a need, also, it is very uniformly labeled with relatively bright fluorescent dye it is also necessary that you are. 染色が不均一である場合(すなわち、他の細胞より明るい細胞がある場合)、または、照明パターンが不均一である場合、これらのアルゴリズムは失敗する。 If staining is heterogeneous (i.e., if a bright cells than other cells), or, if the illumination pattern is not uniform, these algorithms fail. 多くの場合、これらのアルゴリズムを成功させるために必要な長時間の蛍光曝露は生細胞にとって毒性として作用する。 Often, prolonged fluorescence exposure required for successful these algorithms act as toxic to living cells.
【0042】 [0042]
適切なコンピュータアルゴリズムによりデジタル画像中の個々の細胞(および、理想的には特定の細胞内区画)の検出および輪郭取得が成功すると、コンピュータ印加の刺激に対して生じる蛍光プローブの量の変化(すなわち蛍光顕微鏡の場合)または形態学的な変化を、コンピュータにより定量化、記録、および分析することが可能となる。 Individual cells in digital images by a suitable computer algorithm (and, ideally specific subcellular compartments in) detection and the contour acquisition is successful, change in the amount of fluorescent probes generated against irritation computer application (i.e. the cases) or morphological changes fluorescence microscopy, quantified by computer, recording, and it becomes possible to analyze. 次にコンピュータはこれらの分析結果に基づいて、生細胞から追加の情報を引き出すことを目的として判断をおこなうことができ、かつ、シリンジポンプまたはコンピュータ制御されたその他の顕微鏡周辺装置に対して命令を送ることができる。 The computer then based on these analysis results, to draw additional information from the live cells can make decisions for the purpose of, and instructions to other microscope peripheral devices syringe pump or computer control it can be sent. この追加の情報および以後のサイクルで得られる以後のすべての情報は、単一の刺激の後に観察された、細胞種間の最初の小さな差異を最適化および増幅するうえで有用である。 All information subsequent obtained by the additional information and subsequent cycles was observed after a single stimulation, which is useful for optimizing and amplifying the first small differences between cell types.
【0043】 [0043]
個々の生細胞間には(同種の細胞であっても)正常な不均質性および変動があるため、同時に多数の細胞を観察しない限り、生細胞の反応を解釈することは困難または不可能であることが多い。 Since the inter-individual living cells have (be cells of the same type) normal heterogeneity and variations, unless observing the number of cells at the same time, interpreting the response of living cells is difficult or impossible there often. 多数の細胞を観察する必要があること、および、それに付随して大量のデジタルデータを迅速に処理する必要があることも、本発明により解決される。 Numerous the cell needs to be monitored, and also it is necessary to rapidly process large amounts of digital data Concomitantly, are solved by the present invention. 局所のコンピュータは通常このような計算能力を備えておらず、備えている場合は機器の費用が大幅に増加する。 Local computers typically not provided with such computing power, if provided with equipment costs are greatly increased. したがって、本発明のいくつかの態様では、より強力な遠隔コンピュータによる機器の制御が提供される。 Thus, in some embodiments of the present invention, the control equipment is provided by the more powerful remote computer. さらに、必要数の細胞が単一のデジタル画像または単一の顕微鏡視野内で常に見えるとは限らない。 Further, the required number of cells is not always visible within a single digital image or a single microscopic field. したがって、本発明の別の態様では、ごく近傍で追加のデジタル画像を取得することによってより多くの細胞を観察できる能力が提供される。 Accordingly, in another aspect of the present invention, there is provided the ability to observe more cells by obtaining the additional digital images in close vicinity.
【0044】 [0044]
本発明はさらに、以下の方式により多数の細胞を観察することを可能にしている。 The present invention further is it possible to observe the large number of cells by the following method. 印加された刺激に対する生物学的反応および生物学的帰結は常に迅速であるとは限らず、比較的遅いことが多い。 Biological reactions and biological consequences to the applied stimulus not necessarily is always quick, relatively slow in many cases. 刺激が制御化された遅い方式で印加される場合はとくにこれが当てはまる。 Especially if the stimulus is applied at a slow a controlled manner of this is true. したがって本発明では、異なる細胞群を連続的にデジタルカメラの視野内に入れることを可能としている。 In the present invention, therefore, it is made possible to put into the field of view of the continuously digital camera different cell groups. 5つの細胞群をモニターする場合、コンピュータ制御の顕微鏡ステージは、実験を通じて一定の間隔で常に同じ5つの細胞母集団に戻りながら、標本容器の5つの異なる領域間を連続的に繰り返し動く。 To monitor the five groups of cells, the microscope stage of computer control, while returns to always the same five cell populations at regular intervals throughout the experiment, moved repeatedly between five different areas of the specimen container continuously. この精度は、精密なxyステージのみによってもたらされるものではなく、細胞の輪郭の検出と付着した細胞の特定母集団を表す同じランダム分布パターンの再取得とを行い、かつ、同じ特定の細胞群がデジタル撮像用に再度適切に位置決めされるまで必要に応じてxyステージに微調整を行うコンピュータアルゴリズムの能力によってももたらされる。 This accuracy is not caused only by the precise xy stage performs a reacquisition of the same random distribution pattern representing a particular population of cells attached with the detection of cells of the contour, and the same specific cell populations also provided by the ability of a computer algorithm to make fine adjustments to the xy stage as necessary until again properly positioned for digital imaging.
【0045】 [0045]
上述の概念のいくつかの例を種々の図に略図で示した(例えば図4および図5を参照)。 Some examples of the above concepts shown schematically in the various figures (see FIGS. 4 and 5 for example). 必要な設備およびプロトコルの例も本明細書に詳述している。 Examples of the necessary equipment and protocols are also detailed herein.
【0046】 [0046]
図5に略図で示すように、多視野(MF)VSOM実験により本発明の多くの局面を実証することができる。 As shown schematically in FIG. 5, the multi-view (MF) VSOM experiment can demonstrate many aspects of the present invention. コンピュータ制御された4つのシリンジポンプ(A、B、C、D)が、生細胞と1つまたは複数の環境センサーとが入った円形の微小環境チャンバに種々の溶液を注入する。 Computer controlled four syringe pumps (A, B, C, D) is to inject various solutions to living cells and one or more environmental sensors and is entered circular microenvironment chamber. 溶液は、物理的に離れた2つの細胞のパッチが置かれた細胞チャンバに入る。 The solution enters into the two cells physically separate patch is placed cell chambers. インラインの流量センサーIおよびIIは注入された溶液の組成をモニターし、センサーIIIおよびIVはチャンバ内の環境条件をモニターする。 Flow sensor I and II inline monitors the composition of the infusion solution, sensors III and IV to monitor the environmental conditions within the chamber. この略図において、左側の細胞は、乳癌の生検標本の場合に(この単純化したモデルにおいて)予測されるような、正常細胞(斜線入りの円)と癌細胞(白抜きの円)とを含む不均質な混合物を表す。 In this schematic, left cell in the case of biopsy specimens of breast cancer and (open circles) (This simplified in the model), as expected, (circle hatched) normal cells and cancer cells It represents a heterogeneous mixture containing. 右側の細胞(斜線入りの円)は正常組織(例えば反対側の乳房)から得られた生検標本を表す。 Right cell (circle hatched) represents the biopsy specimens obtained from normal tissues (e.g., the opposite breast). 同じ細胞セット(1、2、3、および4)が繰り返し撮像されるよう、VSOM制御されたxyステージが顕微鏡の対物レンズ(チャンバの下に位置する)の上方で細胞チャンバを繰り返し再位置決めする。 The same sets of cells (1, 2, 3, and 4) so ​​that is repeatedly imaged, VSOM controlled xy stage is repeatedly reposition the cell chamber above the microscope objective (located under the chamber). 種々の摂動が印加されると同時にこれら生細胞の反応が連続的に定量化される。 Reaction of these cells at the same time various perturbation is applied is continuously quantified. これらの摂動には、種々の組成の溶液の注入、および、溶液として投与することができないその他の摂動の制御とが含まれる。 These perturbations, injection of a solution of various compositions, and includes the control of other perturbations that can not be administered as a solution. これらの摂動には、ガス、温度の変動、照射、電場または磁場、またはVSOMアルゴリズムまたはレシピで印加されるその他の物理的摂動が含まれ得る。 These perturbations, gas, temperature variations, radiation may include electric or magnetic fields, or other physical perturbations applied by VSOM algorithm or recipe. この図において、環境チャンバからの流出もインラインの流量センサーV、VI、VII、およびVIIIでモニターされる。 In this figure, the outflow from the environmental chamber inline flow sensor V, VI, is monitored by VII, and VIII. 細胞の反応は蛍光発光および透過光の両方の様式を用いてリアルタイムで分析される。 The reaction of the cells is analyzed in real time using the style of both fluorescence and transmitted light. 特定の実験目標を達成するため、摂動と環境変化とに対する個々の反応について実行中のVSOM分析に基づいて、適切なシリンジと適切な環境条件とがVSOMにより制御される。 To achieve specific experimental target, based on VSOM analysis running on individual responses to the perturbation and the environmental changes, a suitable syringe and the appropriate environmental conditions are controlled by VSOM. 本図に示した事例では、特定の細胞の近傍または中に微小毛管を置くことも可能である。 In the case shown in the figure, it is also possible to place a small capillary in the vicinity or in the particular cell.
【0047】 [0047]
図4は、VSOM実験の1つの態様を示した略図である。 Figure 4 is a schematic diagram showing one embodiment of VSOM experiments. 実験開始時(時点1)、細胞種AおよびBは表面上にランダムに配置され、不均一なアレイ中の未同定の細胞として存在する。 Start of experiment (time 1), cell type A and B are randomly placed on the surface, it exists as unidentified cells in heterogeneous array. この最初の時点では、各細胞は識別できないため「a」「b」および「?」と呼ばれる。 In this first time, each cell is referred to as a can not identify "a", "b" and "?". VSOMシステムは、細胞種Aを蛍光色素で選択的に標識する(本図ではこれが時点5で生じたことが示されている)プロトコルを検索しながら、一連の溶液を(シリンジi〜vから)添加し、かつ、一連の物理的刺激を印加する。 VSOM system selectively labeling cell types A with a fluorescent dye while searching (which has been shown to have occurred at time 5 in the figure) protocol, a series of solution (from the syringe l-V) It was added, and applies a set of physical stimuli. 時点5(図中にチェックマークで示す)で、2つの細胞種と成功プロトコルとが同定され、細胞反応がデータベースに記録される。 Point 5 (indicated by the check mark in the figure), two cell types and successful protocols have been identified, the cell reaction is recorded in the database. 一部の場合では、細胞種Bの存在下で細胞種Aを選択的に標識するための新しいプロトコルが発見された時点5の時点で実験が終了される。 In some cases, experiments on the new protocol is the time 5 found time for selectively label cells type A in the presence of a cell type B is completed. 次に、成功プロトコルが、時点3と時点5との間に実施された各段階として同定される。 Next, successful protocol is identified as each stage was carried out between the time point 3 and the point 5.
【0048】 [0048]
続く実験では、種類Aと種類Bの全細胞の同定と各細胞のアレイ内での位置の記録とが時点6の時点で完了しているよう、時点3〜時点6間の各段階のみが、場合によっては最適化された方式で、細胞に対して実施され、かつ、蛍光色素が洗い流される。 In subsequent experiments, so that the recording position in the array of identification and the cells of the whole cell type A and type B have been completed at the time point 6, only the phase of the period from the time point 3 to point 6, optionally in the optimized scheme is performed on the cell, and a fluorescent dye is washed away. この方式により(場合によっては標識プロトコルをさらに精密化した後に)、受けた摂動が最小限であり、かつ、異物の化合物またはマーカーを含まない、同定済みの細胞のアレイが得られる。 This scheme (after further refine the labeling protocol in some cases), received perturbation is minimal, and no compound or markers of the foreign matter, an array of previously identified cells are obtained. 次に、VSOMで生成されたこの同定済み生細胞のアレイを用いて、次のVSOM実験を開始してもよい。 Next, using an array of the Identified cells generated in VSOM, it may start the next VSOM experiments.
【0049】 [0049]
図4パネルAに示した一連の事象は大量の実験情報と結果とを含んでおり、これらはさらに詳細に説明することが可能である。 Sequence of events shown in FIG. 4 Panel A contains a large amount of experimental information and results, it can be described in more detail. 例えば、時点1〜時点2間で、細胞に物理的摂動(温度の低下など;図中、「物理的刺激」と書かれた上側の時間軸の上に白抜きの矢印で示されている)を与え、次に、シリンジ(i)内の溶液を注入する。 For example, in the period from the time point 1 point 2, physical perturbation in cells (reduced such as temperature; in the figure, indicated by hollow arrows on the time axis of the upper reading "physical stimulation") the given, then injecting the solution in the syringe (i). 溶液注入については、本図の「ポンプ動作」と書かれたグラフに、ポンプ(i)が一定の時間(時間軸上の斜線の入った長方形の幅で示す)、一定の流量(斜線の入った長方形の高さ)で作動したことが示されている。 The solution injection, the graph labeled "pumping" of the diagram (indicated by hatched containing rectangle of width on the time axis) Pump (i) a certain amount of time, enters a constant flow rate (diagonal lines has been shown to have operated a rectangular height) was. 時点2で形態学的な変化が生じ、これは画像分析技術を用いて各細胞について継続的に定量化されている。 Morphological changes at 2 occurs which has been continuously quantified for each cell using image analysis techniques. しかし、この細胞反応は両細胞種で同じである。 However, this cell reaction is the same in both cell types. したがって、この時点では細胞種間の識別は行われておらず、引き続き自動検索が行われる。 Therefore, not performed the discrimination between cell types at this time, the automatic search is performed subsequently. 時点2〜時点3間で、シリンジ(iii)内の溶液が注入され、続いて物理的刺激(UV光照射など)が行われる。 In the period from the time point 2 to point 3, the solution in the syringe (iii) is injected, followed by physical stimuli (such as UV irradiation) is performed. 時点3の時点でも両細胞種は依然として類似の挙動を示しており、したがって実験が継続される。 Both cell types at the time of time 3 still shows a similar behavior, therefore the experiment is continued. 時点3〜時点4間でシリンジ(v)から溶液が注入されて、その結果両細胞種が蛍光色素で標識され(灰色の影で示す)、続いて物理的刺激(電場をかけるなど)が与えられ、これとともに(概ね)時点4〜時点5間にシリンジ(ivおよびii)の溶液が添加される。 The solution from the syringe (v) in the period from the time point 3 to point 4 is injected, as a result both cell types are labeled with a fluorescent dye (indicated by gray shading), followed by physical stimuli (such as applying an electric field) is applied are, same time (roughly) a solution of the syringe (iv and ii) in the period from the time point 4 to point 5 is added. この結果、細胞種Bは細胞種Aより早く蛍光色素を失い、したがって時点5では細胞種Aのみが標識された状態となる。 As a result, cell type B loses earlier fluorochromes than cell type A, thus a state in which only the point 5 in cell type A is labeled. 時点5〜時点6間で、いずれの細胞も蛍光色素をまったく含まなくなるまで(時点6)、シリンジ(ii)からより大きな流量で溶液が注入される。 In the period from the time point 5 to point 6, until free any one of the cells is also a fluorescent dye (point 6), the solution is injected at a larger flow rate from the syringe (ii). この方式により、生細胞のアレイ全体が同定され、かつ、いずれの細胞も異物である化合物または蛍光プローブを含まない。 This scheme, the entire array of living cells have been identified, and no compound or fluorescent probes any cell also foreign matter. 以後の同定アッセイでは細胞の曝露および刺激の履歴を最小限にすることができる。 In the following identification assay makes it possible to minimize the history of cell exposure and stimulation.
【0050】 [0050]
デジタル画像の分割および分析によりコンピュータで検出された細胞種AおよびBの時間依存的反応は、次に、図4パネルBのように表示されてもよい。 Time-dependent response of cell types A and B which are detected by the computer by division and analysis of digital images may then be displayed as shown in FIG. 4 Panel B. この図では、細胞の略図が、透過光チャネル(y軸が、細胞の形状またはテクスチャを表す形態測定値を表す)および単色の蛍光チャネル(y軸が、細胞蛍光強度の平均値を表す)でコンピュータにより検出され定量化された反応に置換されている。 In this figure, schematic representation of the cells, the transmitted light channel (y-axis, cell shape or an embodiment measure representing a texture) in and monochromatic fluorescence channel (y-axis represents the mean cell fluorescence intensity) It is substituted to the quantified detected reaction by the computer. 細胞種Aの反応は実線、細胞種Bの反応は点線で示されている。 The reaction cell type A is solid, the reaction cell type B shown in dotted lines. 図4パネルBは、本発明の重要な1つの概念、すなわち、コンピュータが反応情報の各チャネル間の相関付けを行う能力を有するという事実を示している。 Figure 4 Panel B, one important concept of the present invention, that is, the fact that they have the capacity to computer performs correlation between channels of the reaction information. このような一例は図4パネルBの時点4付近にみられる。 One such example is seen in the vicinity of point 4 of FIG. 4 Panel B. すなわちこの付近では、例えば細胞膜のテクスチャの変化が、細胞からの蛍光染料の損失と相関付けされうる形態測定的反応を示している可能性がある。 That is, in the vicinity of this, for example, changes in the texture of the cell membrane is, that may indicate a loss of fluorescent dye and can be correlated with morphometric responses from cells. この現象が確認された後のアッセイでは、細胞反応の検出に蛍光染料の存在を必要としなくなる。 The assay after this phenomenon has been confirmed, no longer requires the presence of a fluorescent dye to detect cellular responses. 細胞反応は、細胞の形態測定的反応のプロフィールで同定可能となる。 Cell response is made possible identified profile of cell morphology measurement response.
【0051】 [0051]
このように、本発明は、細胞種間の差異を知識ベースで発見および最適化するための方法および装置を提供する。 Thus, the present invention provides a method and apparatus for discovering and optimizing the differences between cell types in the knowledge base. 特に本発明は前述の視覚的サーボ制御光学顕微鏡および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscopy and analysis methods described above. 本発明は、数百の個々の生細胞を経時的に詳しくモニターする手段;多チャネルにおける動的生理学的反応の定量化;リアルタイムのデジタル画像分割および分析;インテリジェントなかつ繰り返しの、コンピュータ印加による細胞ストレスおよび細胞刺激;ならびに、長期的な研究および観察において同じ細胞視野に戻ることができる能力を提供する。 The present invention, hundreds of over time closely monitored to means an individual living cells; quantification of dynamic physiological responses in a multi-channel; real-time digital image segmentation and analysis; intelligent Nakatsu repeated, cellular stress by the computer application and cell stimulation; and to provide the ability to return to the same field of cells in long-term studies and observations. 本発明はさらに、特定の細胞部分母集団用に培養条件を最適化する手段を提供する。 The present invention further provides a means for optimizing the culture conditions for a particular cell subpopulations.
【0052】 [0052]
本発明の開発以前は、顕微鏡下で多数の個々の生細胞のデジタル画像を得ることは技術的に困難であった。 Previously the development of the present invention, to obtain a digital image of a large number of individual living cells under a microscope was technically difficult. また、多数の個々の生細胞について、細胞を損傷することなく長期間にわたって細胞内の複数の生理学的反応を同時にモニターすることも困難であった。 Moreover, for a number of individual living cells, it was also difficult to simultaneously monitor a plurality of physiological responses in the cell over a long period of time without damaging the cells. 第一の制限は、主として、いかなる倍率においても視野が限られていることに由来するものであった。 First restriction was primarily derived from the field of view is limited in any ratio. 使用されるデジタルカメラの内部の固体デジタル撮像装置(すなわち、電荷結合素子;CCD)のサイズおよび分解能が限られていることも、視野をさらに制限していた。 Internal solid state digital imaging device of the digital camera used (i.e., charge-coupled device; CCD) also had further restricted field of view size and resolution is limited. 本発明では、x,y,z顕微鏡ステージのソフトウェア制御によって、複数の視野(すなわち、多数の細胞)を迅速に、自動的に、かつ繰り返しモニターすることを容易にし、これにより上述の制限を克服する。 In the present invention, x, y, by the software control of the z microscope stage, multiple fields of view (i.e., number of cells) quickly, automatically and make it easy to repeatedly monitored, thereby overcoming the limitations mentioned above to. また本発明により、中央コンピュータによる複数の顕微鏡の同時遠隔制御が容易になる。 Also the present invention facilitates the simultaneous remote control of a plurality of microscope according to the central computer. 事実、局所の顕微鏡周辺装置(例:走査ステージ、フィルタホイール、灌流ポンプ、ロボットアーム、シャッター、カメラ、等)を制御するために現在使用されているコンピュータ(すなわちクライアント)に関連する、メモリ、ソフトウェア、および処理資源の制限が本発明により克服される。 In fact, local microscope peripherals: related (eg scanning stage, filter wheel, perfusion pump, a robot arm, a shutter, the camera, etc.) a computer that is currently used to control (i.e. client), a memory, software , and limited processing resources are overcome by the present invention. 本発明により、インターネットを使用した遠隔制御と、遠隔値のユーザーから地理的に離れた場所に設置されたより強力な中央コンピュータ(サーバー)とでVSOM観察を実施することが可能になる。 The present invention, a remote control using Internet, it is possible to carry out VSOM observation de powerful central computer than installed from the user's remote value geographically remote (server). サーバーは、より処理集約的なタスクを実行または分配し、かつ、現在および過去の細胞反応を記録した非常に大規模のデータベースの中央ロケーションとして機能する。 The server performs or distribute more processing intensive tasks, and functions as a central location a large database of current and very which records a past cell response. このように、本発明のVSOMは、強力な中央サーバーへのネットワークアクセスの利点、および、単一細胞の反応に関する過去の観察結果と複数情報チャネル間の相関に関する過去の観察結果とが記録された大規模中央データベースの利点を活用するものである。 Thus, VSOM of the present invention, the advantages of network access to powerful central server, and the previous observations on correlation between past observations and more information channels for the reaction of a single cell is recorded it is intended to take advantage of large-scale central database. 特に好ましい態様においては、VSOMシステムは、細胞を繰り返し検出し、全チャネルについて観察されたすべての細胞反応を記録および分析し、現在の細胞反応を比較し、現在の各情報チャネルについて相関付けを行い、かつ、細胞反応に関する過去の観察結果および各情報チャネル間の相関に関する過去の観察結果が記録されたデータベースに対して問い合わせを行う。 In a particularly preferred embodiment, VSOM system cells repeatedly detected, the observed every cell responses were recorded and analyzed for all channels, by comparing the current cell response, performs correlation for the current of each information channel and, querying the database for historical observations regarding the correlation between past observations and the information channel for cell response was recorded. 単一の実験過程において、次にシステムは、実施中の実験の目的を達成するため、実験パラメータをどのように調整するかに関して知識ベースで一連の決定を行う。 In a single course of the experiment, then the system, in order to achieve the purpose of the experiment in the embodiment, a series of decisions in the knowledge base as to how to adjust the experimental parameters.
【0053】 [0053]
したがって、本発明により、単一の比較的短い実験過程の間に複数の完全な実験サイクルを実施することが可能となる。 Accordingly, the present invention makes it possible to implement a plurality of complete experimental cycles during a single relatively short experimental procedure. このことは、異なる細胞種間の差異を検索、発見、および最適化するプロセスを大幅に加速させる。 This search for differences between different cell types, the discovery, and greatly accelerates the process of optimization. 必要な細胞数は比較的少ない。 The number of cells required is relatively small. また、個々の細胞の反応がモニターされるため、分析用の標本は異なる種類の細胞を含んでいてもよい。 Further, since the response of the individual cells are monitored, the sample for analysis may contain different types of cells. 「細胞種」とは、ある群に含まれる各細胞が他群の細胞から識別されうる類似の特徴を有するような複数の群に一群の細胞を分けることができる任意の観察方法により達成される分類である。 A "cell type" is accomplished by any observation method can be divided a group of cells into a plurality of groups that have similar characteristics each cell can be identified from the other groups of cells contained in one group it is a classification. この分類は、個々の単一細胞レベルにおける比較的迅速な生理学的反応を繰り返し観察した結果(例:細胞内構成要素、形態学的変化、細胞分裂、細胞死、剥離などの観察)に基づいて行われるのが一般的である。 This classification is relatively quick repetitive physiological reaction observation in the individual single cell level: based on (eg intracellular components, morphological changes, cell division, cell death, the observation of peeling) it is generally carried out. しかし、この用語は、従来の組織学的基準(例:上皮細胞、腫瘍細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞など)に基づいて分類した種々の細胞種も含む。 However, the term conventional histologic criteria: including (eg epithelial cells, tumor cells, muscle cells, adipocytes, nerve cells, etc.) a variety of cell types were classified based on.
【0054】 [0054]
本発明の開発以前は、多数の細胞を対象とした場合に、実験過程中に実験パラメータをどのように変更するかに関する自動的かつ知識ベースの決定を迅速に行うことができなかった。 Previously the development of the present invention, when of a large number of cells, it was not possible to quickly perform the automatic and knowledge-based decisions as to how to change the experimental parameters during the course of the experiment. 本発明は、実験過程中に「試験/記憶/分析/学習/再設計/再試験」サイクルを多数回実行する能力を提供するものであり、この能力により、以前は実行不可能であった多くの実験および応用が可能となる。 The present invention, which provides the ability to run many times "test / storage / analytical / Learning / redesign / retest" cycle during the course of the experiment, many This capability was formerly infeasible it is possible to experiment and applications. 細胞が生存状態を維持し、かつ、実験が進行状態およびオンライン状態を維持する場合、刺激に対する過去の反応と未来の反応との相関は細胞単位で維持される。 Cells to remain viable state, and, when maintaining the experiment progress and online, the correlation between the reaction of past reaction and future to stimuli are maintained in the cell units. 比較的少量の細胞試料を使用して、単一の実験中に多様かつ繰り返しのコンピュータ生成刺激を印加および反復することができる。 Using a relatively small amount of cell sample, it can be applied and repeated diverse and repetitive computer-generated stimuli in a single experiment. このことは、細胞種間の差異を検索および最適化する際に大きな利点となる。 This is a great advantage when searching and optimize the differences between cell types. 「刺激」という用語は、単一の刺激、複数の刺激、または複数の刺激の組合せを単回、繰り返し、または連続的に与えることを意味する。 The term "stimulation" is meant to give a single stimulus, a plurality of stimulation, or a combination of stimuli single dose, repeated or continuously. 生理学的な反応を引き起こす刺激には、機械的、物理的、化学的、および生物学的な実体が含まれる。 The stimuli cause physiological reactions, mechanical, physical, chemical, and biological entities. したがって、本発明はいかなる刺激または刺激の種類にも限定されない。 Accordingly, the present invention is not limited to the type of any stimulus or stimuli.
【0055】 [0055]
生細胞は移動することができる、または形態を変化させることができる。 Viable cells can alter the movement can be or form. したがって、ある視野に戻る際、ソフトウェアは、焦点を調節し(z軸制御)、かつ視野を再取得および再登録するため横方向および縦方向にわずかな調整を行う(x,y軸制御)必要がある。 Therefore, when returning to a certain field of view, the software adjusts the focus (z-axis control), and performs a slight adjustment in the horizontal direction and the vertical direction to reacquire and re-register the field (x, y axis control) must there is. さらに、細胞の位置および形状の変化を追跡するため、個々の細胞の外形を規定する元の輪郭を修正する必要がある。 Further, for tracking the position and changes in cell shape, it is necessary to modify the original contour defining the external shape of the individual cells. したがって、1つの態様では、本発明のVSOMは画像内容の分析結果に基づいて機器の制御に関する決定を行うための手段を提供する。 Accordingly, in one aspect, VSOM of the present invention provides a means for making decisions regarding control of the equipment based on the analysis of image content. 事実、本発明は以下の手段を提供する:生細胞に刺激を繰り返しおよび/または連続的に印加するコンピュータ自動処理の手段;鏡検およびデジタル撮像を用いて、刺激に対する細胞または細胞以下レベルの1つまたは複数の生理学的反応を単一細胞レベルで繰り返しおよび/または連続的に検出およびモニターする手段;信頼性の高い細胞種同定に適した、および/または細胞種間の差異を最適化するための刺激の修正に適した基準を確立するために十分な数の個々の細胞の反応を迅速に観察する手段;細胞が観察および/または刺激に利用できる間に知識ベースの刺激制御を決定できるよう、現在の細胞反応と過去に保存された細胞反応(例:データベース情報)とを迅速に分析する手段;および、時間依存的に生じる事象間の相関を多 In fact, the present invention provides the following means: repeated stimulation to living cells and / or means of continuous computer automated process to be applied; using microscopy and digital imaging, one cell or subcellular level to stimuli One or more repeat physiological responses at the single cell level and / or continuously detecting and monitoring for means; suitable for reliable cell type identification, and / or for optimizing the differences between cell types to be able to determine the knowledge base stimulation control while the cells are available for viewing and / or stimulation; means for quickly observe the response of a sufficient number of individual cells to establish the criteria appropriate for the stimulation fixes , cellular response stored in past and present cell response (e.g. database information) and means for rapidly analyzing; and multi-correlation between a time-dependent manner resulting events ャネルにわたってモニターする手段。 It means for monitoring over Yaneru.
【0056】 [0056]
本発明はさらに、蛍光に加えて透過光を利用して生細胞の輪郭を規定するための手段を提供する。 The present invention further provides a means for defining the contour of the viable cells using transmitted light in addition to fluorescent. これにより、蛍光成分を含まない細胞の追跡が容易になる。 This facilitates the tracking of cells without fluorescent component. さらに、これにより、細胞毒性を示し得る蛍光標識化合物の使用量を少なくでき、かつ、蛍光発光を生じさせるために必要な強力な蛍光励起照射を回避することができる。 Further, thereby, possible to reduce the amount of fluorescent labeling compounds may exhibit cytotoxicity, and can avoid a strong fluorescence excitation irradiation required to produce a fluorescent emission. したがって、より長時間にわたる細胞の観察が可能となる。 Therefore, it is possible to more prolonged cell observation. さらに、特異的な挙動を示す細胞を実験の最後に個別に回収して、プール(貯蔵)、細胞株の樹立、クローニング、特定の分化状態への誘導、分析などに供することができる。 Furthermore, the cells exhibiting specific behaviors were collected individually at the end of the experiment, the pool (reservoir), established cell lines, cloning, induced to a particular differentiated state, analysis can be subjected to such.
【0057】 [0057]
本発明の機器では、撮像を透過光撮像と種々の波長の蛍光撮像とで迅速に循環させることによって、異なる生理学的反応を異なるチャネルで実質的に同時に観察することができるため、本発明により、多数の細胞をモニターすることに加えて、単一の実験中に多数の生理学的反応を観察することが可能となる。 The apparatus of the present invention, by rapidly circulated and fluorescence imaging of the transmitted light imaging and various wavelengths of imaging, it is possible to observe substantially simultaneously on different channels different physiological reactions, the present invention, in addition to monitoring the number of cells, it is possible to observe a number of physiological responses in a single experiment.
【0058】 [0058]
マルチウェル蛍光プレートリーダーを使用すると、生細胞の全母集団が発する進行中の蛍光シグナルを検出することができるが、単一の細胞の反応を観測することはできない。 With multi-well fluorescence plate reader, it is possible to detect the fluorescent signal of the ongoing total population of viable cells emitted, it can not be observed response of a single cell. しかし、本発明のVSOMの1つの態様においては、マルチウェルプレートリーダーに適した蛍光アッセイの発見および最適化が可能である。 However, in one embodiment of the VSOM of the present invention, it is possible the discovery and optimization of assays suitable for the multi-well plate reader. また、一般的な技術では、個々の生細胞が発する多チャネル蛍光シグナルをフローサイトメトリーを使用して瞬時に検出することができる。 In a general technique, it can be detected instantly using flow cytometry multichannel fluorescence signal emitted by the individual living cells. 細胞は蛍光シグナルに応じてソーティングすることができ、かつ、回収することもできる。 Cells can be sorted according to fluorescence signal, and can also be recovered. しかし、細胞は検出器を高速で通過し、得られる測定結果は単一のものである(もしくは多チャネルの可能性もある)。 However, the cells pass through the detector at a high speed, the measurement results obtained (possibly in or multi-channel) is of single. 個々の細胞が一定の長さの時間にわたって追跡されることはなく、過去の反応と現在の反応とを相関させた同一細胞の繰り返し観察も不可能である。 Never individual cells are tracked over time of a certain length, it is impossible repeated observations of past reaction the same cells were correlated with the current response. 本発明はこれらの制限を克服するものであり、フローサイトメトリーおよび活性細胞ソーティングに適した蛍光アッセイの開発および最適化を容易にする。 The present invention overcomes these limitations, facilitates the development and optimization of assays suitable for flow cytometry and active cell sorting.
【0059】 [0059]
本発明は、任意の種類の細胞(例:動物細胞、植物細胞、微生物細胞など)に有用な細胞種特異的蛍光アッセイに用途を有する。 The present invention may be any type of cells: with (eg animal cells, plant cells, microbial cells, etc.) applications useful cell type-specific fluorescence assay. したがって本発明は、いかなる種類の細胞にも、またはいかなる特定の蛍光もしくは他のアッセイシステムにも限定されるものではない。 Accordingly, the present invention relates to any type of cells, or is not limited to any particular fluorescence or other assay system. 好ましい態様ではヒトの細胞を対象としているが、他の態様では他の哺乳類ならびに植物および微生物から取得された細胞も対象となる。 Although the preferred embodiments are directed to human cells, cells obtained from other mammals, as well as plants and microorganisms of interest in the other embodiments. 例えば本発明は、組織から取得された正常細胞、前悪性細胞、悪性細胞、および/または多剤耐性癌細胞を検出および識別する手段を提供する。 For example, the present invention provides normal cells obtained from the tissue, pre-malignant cells, malignant cells, and / or the means detecting and identifying a multidrug resistant cancer cells. さらに本発明は、稀な細胞種(例:幹細胞または母体血液中の胎児細胞)を選択的に標識するプロトコルを設計するための手段を提供する。 The invention further rare cell types: provide a means for designing protocols that selectively labeled (eg fetal cells in stem cells or maternal blood). いくつかの態様においては、これらのプロトコルは放射性およびその他の標識システムとともに使用するよう修正される。 In some aspects, these protocols are modified to be used with radioactive and other labeling system. 本発明はまた、個々の患者および/または患者の個々の腫瘍に合わせた化学療法レジメン(薬剤の組合せも含めて)を確立するためのアッセイの設計および応用を容易にする。 The present invention also facilitates the design and application of the assay to establish the chemotherapy regimen tailored to individual tumor individual patient and / or patient (combination of drugs be included). さらに本発明は、医薬品、農業、バイオテクノロジーなどにおける種々の使用について、候補となる多数の薬剤、殺虫剤、除草剤、およびその他の化合物を検索するうえで有用なアッセイを提供する。 The invention further pharmaceuticals, agriculture, for various use in biotechnology, a number of agents that are candidates, insecticide provides assays useful in order to search for herbicides, and other compounds. さらに本発明は、細胞増殖、細胞毒性、および/または分化における使用について、多数の候補薬剤を検索するうえで有用なアッセイを提供する。 The invention further cell growth, for use in cytotoxicity, and / or differentiation, to provide a useful assay in order to search a large number of candidate agents.
【0060】 [0060]
本発明はさらに、関心対象の細胞種を増殖上有利にすることによって、または、培養中に存在する他の細胞種に対して細胞毒性として作用する環境条件もしくはプロトコルを設計することによって、特定の細胞種の増殖をもたらす、インビトロの組織培養条件を設計する手段を提供する。 The present invention further provides by on growing cell type of interest Advantageously, or by designing the environmental conditions or protocols act as cytotoxic to other cell types present in the culture, a particular resulting in cell types proliferation, it provides a means for designing an in vitro tissue culture conditions. したがって本発明は、インビトロでの増殖がしばしば困難である細胞を培養するための手段を提供する。 Accordingly, the present invention provides a means for culturing the cell growth in vitro is often difficult. さらに本発明は、細胞を特定の分化終点へと誘導するのに適した細胞培養条件をつくるための手段を提供する。 The present invention provides a means for making a suitable cell culture conditions to induce cell into a specific differentiation endpoint. 例えば、本発明を用いて、幹細胞または胚性細胞を所望の最終終点へと誘導するために必要な条件を開発することができる。 For example, can be developed using the present invention, the conditions necessary to induce into the stem cells or embryonic cells desired final endpoint.
【0061】 [0061]
本発明はまた、種々の迅速インビトロ検査の開発および実施に用途を有する。 The present invention also has application in the development and implementation of various rapid in vitro testing. 例えば、ある患者に対して候補となる組織または骨髄ドナーが複数存在する場合は、種々のドナーの細胞を患者の免疫細胞と混合し、免疫拒絶反応を単一細胞レベルで観察する。 For example, if the tissue or bone marrow donors as candidates for a patient there are a plurality of cells of various donors was mixed with the patient's immune cells, to observe the immunological rejection at the single cell level. したがって、その特定の患者に対する最適なドナーの同定が容易になる。 Therefore, identification of the optimal donor for that particular patient is facilitated. さらに、これらの検査は、移植拒絶を抑制するよう設計された薬剤(または薬剤候補)の存在下で実施することができ、患者に対する最適なドナーの選択とあわせて、最適な抗拒絶薬の投与レジメン(すなわち、単剤使用または多剤併用)の選択が容易になる。 Moreover, these tests may be carried out in the presence of agents designed to inhibit transplant rejection (or drug candidate), in conjunction with the selection of optimal donor for patient administration of optimal anti-rejection drugs regimen (i.e., monotherapy use or multi-drug) selection of is facilitated.
【0062】 [0062]
発明の詳細な説明本発明は、細胞種間の差異を知識ベースで発見および最適化するための方法および装置を提供する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides methods and apparatus for discovering and optimizing the differences between cell types in the knowledge base. 特に本発明は視覚的サーボ制御光学顕微鏡(VSOM)および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscope (VSOM) and analysis methods. 本発明は、数百の個々の生細胞を経時的に詳しくモニターする手段;多チャネルにおける動的生理学的反応の定量化;リアルタイムのデジタル画像分割および分析;インテリジェントなかつ繰り返しの、コンピュータ印加による細胞ストレスおよび細胞刺激;ならびに、長期的な研究および観察において同じ細胞視野に戻ることができる能力を提供する。 The present invention, hundreds of over time closely monitored to means an individual living cells; quantification of dynamic physiological responses in a multi-channel; real-time digital image segmentation and analysis; intelligent Nakatsu repeated, cellular stress by the computer application and cell stimulation; and to provide the ability to return to the same field of cells in long-term studies and observations.
【0063】 [0063]
図1および図2は、本発明の好ましい態様の主要な3つの構成要素を示した略図である。 1 and 2 are schematic diagrams showing the preferred three major components of the embodiment of the present invention. これらは(i)細胞チャンバ内の生細胞をデジタル撮像するための光学プラットフォーム、(ii)多くの場合光学プラットフォームにまたは光学プラットフォーム付近に物理的に取り付けられ、「ロボット構成要素」と呼ばれる、種々のコンピュータ制御周辺装置、および(iii)ロボット周辺装置の局所命令用に使用される局所ホストコンピュータ(「クライアント」)からなる。 They (i) optical platform for the living cells to digital imaging in the cell chamber, (ii) often physically attached near the optical platform or optical platform, referred to as "robot component", various , a computer control peripheral apparatus, and (iii) local host computer used for topical instruction of the robot peripheral device ( "the client"). 別の態様において、本発明は、VSOM機器の遠隔制御用のソフトウェアを有しかつインターネット上で処理を行う遠隔コンピュータ(すなわち「サーバー」)をさらに提供する。 In another aspect, the present invention further provides a remote computer (or "server") to perform a and processed on the Internet software for remote control of VSOM equipment.
【0064】 [0064]
A. A. 光学プラットフォーム、ロボット構成要素、および制御電子機器本発明の1つの態様において、VSOM光学プラットフォームは、顕微鏡ステージの中央に取り付けられた標本に対して透過光照明と表面蛍光照明との両方を実施するよう構成された倒立光学顕微鏡である。 In one embodiment of the optical platform, a robot components, and control electronics present invention, VSOM optical platform to implement both the transmitted light illumination and epifluorescence illumination against the specimen attached to the center of the microscope stage it is configured inverted optical microscope. 画像生成用および拡大用に、顕微鏡ステージの下に複数の対物レンズが取り付けられる。 For image generation and expansion, a plurality of objective lenses is mounted under the microscope stage. 1つの態様においては4つのロボット構成要素(すなわち、コンピュータ制御された顕微鏡周辺装置)も顕微鏡ステージ付近に配置される。 In one embodiment four robot components (i.e., a microscope peripherals computer controlled) is also located near the microscope stage. 特に好ましい態様においては、内部カメラシャッターを有するデジタルカメラが顕微鏡上の上部カメラポートの1つに取り付けられる。 In a particularly preferred embodiment, the digital camera having the camera shutter is mounted on one of the upper camera port on the microscope. 顕微鏡ステージはコンピュータ化されたXY走査ステージであり、かつ、上部シャッターが透過光照明を制御し内部の後部シャッターが表面蛍光照明を制御する2つのコンピュータ制御のシャッターの位置が含まれる。 Microscope stage is a XY scanning stage computerized and upper shutter rear shutter internal controls transmitted light illumination includes the position of the two computer-controlled shutter for controlling the surface fluorescence illumination. 内部シャッターに加えて、定義されたスペクトル成分の光で標本を照明および蛍光励起させることができる、コンピュータ制御の6位置回転光学フィルタを有する。 In addition to the internal shutter can be illuminated and fluorescence excitation samples in light of the spectral components that are defined, having a 6 position rotary optical filter of a computer control.
【0065】 [0065]
別の態様では、第二のカメラが使用される(例えばカメラポート基部に取り付けられる)。 In another aspect, (attached to a camera port base) of the second camera is used. ただし、VSOMには2つのカメラは必要ない。 However, the two cameras is not required to VSOM. xy走査ステージの調整に加えて、顕微鏡の対物レンズのz軸位置の粗調整に使用されるステップモーターのハウジングと、コンピュータ制御されたXYZ微小毛管ポジショナまたは「ロボットアーム」とが存在する。 In addition to the adjustment of the xy scanning stage, a housing stepping motor used for coarse adjustment of the z-axis position of the microscope objective lens, and the or XYZ microcapillaries positioners are computer controlled "robot arm" exists. 多くの態様において、顕微鏡の対物レンズは顕微鏡の「ステージプレート」(または標本ホルダー)の下方に直接配置される。 In many embodiments, the microscope objective lens is positioned directly below the "Stage plate" (or specimen holder) of the microscope. 実験で使用するチャンバまたは容器に応じて、種々の取り外し可能なステージプレートをxy走査ステージに挿入することができる。 Depending on the chamber or vessel used in the experiment, it is possible to insert a variety of removable stage plate xy scanning stage. 多数の標本ホルダーまたは「ステージプレート」が本発明とともに使用できる。 Numerous specimen holder or "Stage plate" can be used with the present invention. いくつかの態様においては非環境制御型の標本容器が使用される。 In some embodiments the sample containers of the non-environmental control types are used. チャンバ状にしたカバーガラス、組織培養フラスコ、細胞培養皿、およびマルチウェルプレートのためのステージプレートも本発明とともに使用できる。 Coverslips in the chamber shape, the stage plate for tissue culture flasks, cell culture dishes, and multi-well plates can be used with the present invention. 本発明のいくつかの態様では、単純に細胞インキュベータから種々の無菌標本容器を取り出し、適切なステージプレートを用いて顕微鏡に載せ、かつ、透過光のみを使用してVSOMシステムで容器内の細胞数を計数することもできる。 In some embodiments of the present invention, simply retrieve the various sterilized sample containers from the cell incubator, placed on a microscope using the appropriate stage plate, and the number of cells in the vessel at VSOM system using only the transmitted light It can also be counted. この状況下で、個々の細胞を検出しかつデジタル画像内で分割するという細胞ごとの形態学的測定も可能であるため、形状、面積、テクスチャ、および核−細胞質比など細胞の形態学的な特徴をモニターすることもできる。 In this situation, it therefore, the shape, area, texture, and nuclear also possible to detect the individual cells and morphological measurements per cell to divide in a digital image - cell morphological such cytoplasm ratio it is also possible to monitor the features.
【0066】 [0066]
いくつかの場合においては、微小環境制御した細胞チャンバが物理的にステージに取り付けられるかまたはステージプレートを介して接続される。 In some cases, micro-environmental control cells chamber is connected via the or stage plate is physically attached to the stage. 事実、任意の適切な細胞チャンバ(すなわち、分析および/または観察の対象とする細胞を入れるためのレセプタクル(receptacle))である。 In fact, it is any suitable cell chamber (i.e., a receptacle for containing a cell for analysis and / or observation (receptacle)). 様々な種類の市販の環境制御型細胞チャンバが利用可能であり、かつ、xy走査ステージとともに使用するのに適している。 A commercial environment controlled cell chambers of different types are available, and are suitable for use with the xy scanning stage. いくつかの態様では、蠕動ポンプまたは他のポンプにより余分の液体が標本容器から除去される。 In some embodiments, excess liquid is removed from the specimen container by a peristaltic pump or other pump. 他の態様では、細胞チャンバ(または標本容器)の温度がモニターされる。 In other embodiments, the temperature of the cell chamber (or specimen container) is monitored. これらの態様において、温度プローブは典型的に、チャンバ内の液体の温度またはチャンバ自体の温度を制御する制御装置に接続される。 In these embodiments, the temperature probe is typically coupled to a control device for controlling the temperature of the temperature or the chamber itself of the liquid in the chamber. 好ましい態様において、この非コンピュータ制御の独立した温度制御ユニットはコンピュータ制御可能なユニットに置換される。 In a preferred embodiment, a separate temperature control unit of the non-computer controlled is replaced in a computer controllable unit.
【0067】 [0067]
細胞チャンバの1つの追加的特徴として、定義された酸素成分のガスの流れを、細胞チャンバ内に置かれた標本容器の上方に層状に重ねる能力がある。 One additional characteristic of the cell chamber, the ability to overlay the flow of gas of defined oxygen component, as a layer above the specimen container placed within the cell chamber. この方式により、標本容器および溶液内で既知の酸素張力条件をつくること、または、標本容器上方を流れるガスに含まれるCO 量を変化させることによって重炭酸塩緩衝剤を含む溶液のpHを制御することができる。 This scheme, making known oxygen tension conditions specimen container and solution in, or control the pH of a solution containing bicarbonate buffer by changing the amount of CO 2 contained in the gas flowing through the sample container upward can do.
【0068】 [0068]
いくつかの態様においては、4つの独立制御可能なシリンジを有する、コンピュータ制御された2つのポンプが光学プラットフォームに隣接して配置される。 In some embodiments, it has four independently controllable syringe, two pumps that are computer controlled is positioned adjacent to the optical platform. 2つの各ポンプユニットには、デイジーチェーン接続された電子制御装置が組み込まれる。 The two pump units, daisy-chained electronic control device is incorporated. この様式で最大約99のポンプユニットが接続可能であり、かつ、各ポンプの2つのシリンジはそれぞれ独立に制御できる。 Up to about 99 of the pump unit in this manner are possible connections, and two syringe of each pump can be controlled independently.
【0069】 [0069]
図1および図2に示すように、周辺装置の多くは、ホストコンピュータとロボット周辺装置自体との間のインターフェースとして機能する制御ユニットを有する。 As shown in FIGS. 1 and 2, many of the peripheral devices has a control unit which functions as an interface between the host computer and the robot peripheral device itself. ホストコンピュータで実行されるカスタムソフトウェアに顕微鏡周辺装置の制御を組み込むことができるよう、基本的なソフトウェアコマンドはこれら周辺装置の製造業者によって提供される。 To the custom software running on the host computer may be incorporated to control the microscope peripherals, the basic software commands provided by the manufacturer of these peripheral devices. ホストコンピュータはリモートコンピュータで実行されるソフトウェアで制御することができる。 The host computer may be controlled by software running on the remote computer. 例えば、Z軸焦点粗調整モーター、xy走査ステージ、2つの照明シャッター、デジタルカメラ(およびその内部シャッター)、ならびに光学フィルタホイールは、いずれもこのソフトウェアを用いて制御することができる。 For example, Z-axis focus coarse adjustment motor, xy scanning stage, two illumination shutters, digital cameras (and its internal shutter), and the optical filter wheel can either be controlled using this software. いくつかの態様では、顕微鏡の対物タレットに螺入する圧電ポジショナによって顕微鏡の焦点の微調整制御が行われる。 In some embodiments, fine adjustment control of the focus of the microscope is effected by a piezoelectric positioner screwing the microscope objective turret.
【0070】 [0070]
1. 1. マイクロアレイフォーマット本発明は、特定の物質、処理、または処理セットに対する細胞/個々の細胞の生理学的反応性をより完全に評価するため、高スループットのスクリーンを介して、種々の細胞種に対して連続的な処理を行うことによって多数の化合物(例えば、薬剤または所望の生物学的活性を有する可能性がある化合物)を迅速にスクリーニングする能力を提供する。 Microarray Format invention, specific materials, processing, or for a physiological response of the cells / individual cells fuller evaluation of the processing set through the screen of the high-throughput, continuous to various cell types providing the ability to rapidly screen large numbers of compounds (e.g., compounds that may have a drug or desired biological activity) by performing processing. 既存の方法を用いた薬剤−細胞相互作用の操作および分析では、一定の時間内に分析できるバイオアッセイの数が少なく、化合物送達に必要な方法が煩雑であり、かつ、しばしば大量の化合物が試験に必要とされるため、高スループットかつ生物学的に高含量のスクリーニングを行うことができない。 Drug using conventional methods - the manipulation and analysis of cell interactions, fewer bioassay that can be analyzed in a timely, methods required compound delivery is is cumbersome and often large number of compounds tested since required for, it is impossible to perform high-throughput and biologically screening high content. したがって、本発明の好ましい態様では、高スループットのスクリーニングをマイクロアレイフォーマットで可能にする。 Thus, in a preferred embodiment of the present invention, high throughput screening to permit microarray format.
【0071】 [0071]
本発明の好ましい態様では、個々の細胞が発する光学画像信号を細胞種に応じて検出および処理する。 In a preferred embodiment of the present invention, to detect and process in accordance with optical image signal in which the individual cells are emitted to the cell type. したがって、複数の細胞種を支持体またはプレートに置き、個々の細胞の光学画像に応じてその細胞種を同定し、かつ、印加された環境刺激に対する個々の細胞または細胞種の反応性を追跡することによって、不均一なマイクロアレイをつくることができる。 Thus, placing a plurality of cell types to a support or plate, the cell type identified in accordance with the optical image of the individual cells, and to track individual cells or cell types reactive to the applied environmental stimuli by, it is possible to make non-uniform microarray. 前述の均一または不均一なマイクロアレイ上の単一の細胞からの光の検出と分析とを可能にするため、このような細胞種を適切な低い細胞密度で固定してもよい。 To allow the analysis and light detection from single cells on uniform or non-uniform microarray described above, such a cell type may be fixed at a lower appropriate cell density. 本発明の他の態様では、同じ処理を行った複数の細胞からの集合的な光信号を検出および測定する。 In another aspect of the present invention, to detect and measure the collective optical signals from a plurality of cells subjected to the same treatment.
【0072】 [0072]
好ましい態様において、細胞は支持体に固定状態で付着される。 In a preferred embodiment, the cells are deposited in a fixed state on the support. マイクロパターンアレイ内に細胞を付着させるのに適した方法は周知であり、例えば光化学レジストフォトリソグラフィ(photochemical Method suitable for attaching the cells to micro-patterned array are known, for example photochemical resist photolithography (photochemical
resist−photolithograpy)(MrksichおよびWhitesides、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.25:55−78、1996)などがある。 resist-photolithograpy) (Mrksich and Whitesides, Ann Rev. Biophys Biomol Struct.25:... 55-78,1996), and the like. このフォトレジスト法では、ガラス板をフォトレジストで均一にコーティングし、フォトマスクをフォトレジストコーティング上に置いて所望の「アレイ」またはパターンを規定する。 This photoresist method, was uniformly coated glass plate with photoresist to define the desired "array" or pattern at the photomask on the photoresist coating. 露光により、マスクされていない領域のフォトレジストが除去される。 By exposure, the photoresist of the unmasked areas are removed. 露出したガラスの領域とフォトレジストで覆われた領域との両方に結合する有機シランなどの疎水性物質で、フォトリソグラフで規定した表面全体を均一にコーティングする。 A hydrophobic material such as an organic silane which binds to both the exposed glass area and the photoresist-covered area, uniformly coating the entire surface defined photolithographically. 次にフォトレジストをガラス表面から剥離し、露出したガラスのスポットのアレイを露出させる。 Then the photoresist is peeled off from the glass surface to expose the glass array of spots of exposed. 次に、アミノ基など親水性または化学反応性を有する基を末端に有する有機シランでガラス板を洗浄する。 Then, washing the glass plate with an organic silane having a group having a hydrophilic or chemically reactive such as amino group at its terminal. 露出したガラスのスポットに疎水性の有機シランが結合し、その結果、疎水性表面上に、(元のフォトレジストの領域に配置された)親水性または反応性のスポットのアレイを有するガラス板が得られる。 Organosilane hydrophobic the exposed glass spots bonded, as a result, on a hydrophobic surface, a glass plate having (arranged in the region of the original photoresist) hydrophilic or reactive spots of the array can get. 親水基のスポットのアレイにより、ニューロン由来のものも含めた特定の細胞を非特異的かつ非共有結合的に結合させるための基質が得られる(Kleinfeldら、J.Neurosci. 8:4098−4120、1988)。 The array of spots of hydrophilic groups, a substrate for non-specific and non-covalently bind a particular cell also including those from neurons obtained (Kleinfeld et al., J.Neurosci 8:. 4098-4120, 1988). 同様に、シリコンウェーハ表面に対する反応性イオンエッチングも、2つの異なる種類のテクスチャでパターン形成した表面を得るために用いられている(Craigheadら、Appl.Phys. Lett. 37:653、1980; Craigheadら、J. Vac. Sci. Technol. 20:316、1982; および、Suhら、Proc.SPIE 382:199、1983)。 Similarly, the reactive ion etching to the silicon wafer surface, is used to obtain a patterned surface with two different types of textures (Craighead et al., Appl.Phys Lett 37:.. 653,1980; Craighead et al. , J Vac Sci Technol 20:.... 316,1982; and, Suh et al., Proc.SPIE 382: 199,1983).
【0073】 [0073]
細胞の均一なマイクロアレイを作製する別の方法は、特異的であるが非共有結合的な相互作用に基づくものであり、タンパク質吸着性アルカンチオールでコーティングされた金表面を得るためにフォトレジストスタンプ法が用いられている(Singhviら、Science Another method of making a uniform microarray cells are specific but is based on non-covalent interactions, photoresist stamping method to obtain a coated gold surface protein adsorptive alkanethiol have been used (Singhvi et al., Science
264:696−698、1994)。 264: 696-698,1994). 次に、末端にポリエチレンを有する、タンパク質吸着に抵抗性のアルカンチオールで金の裸面をコーティングする。 Next, a polyethylene terminated, coating the bare surface of the gold resistant alkanethiol protein adsorption. 表面全体を、細胞外マトリックス中に発見される細胞結合タンパク質であるラミニンに曝露すると、生きた肝細胞がラミニンでコーティングされた島に均一に付着しかつこの島の上で増殖できるようになる(Singhviら、1994)。 The entire surface, upon exposure to laminin cell binding proteins that are found in the extracellular matrix, living hepatocytes will be able to grow on a uniformly adherent and this island island coated with laminin ( Singhvi et al., 1994). 特定タンパク質のパターンによる金表面のコーティングには、強力なしかし非共有結合的な金属キレート化を利用した加工が用いられている(Sigalら、Anal.Chem. 68:490−497、1996)。 The coating of the gold surface by the pattern of a particular protein, using a strong but non-covalent metal chelating process has been used (Sigal et al., Anal.Chem 68:. 490-497,1996). この場合は、ニトリロ酢酸を末端に有するアルカンチオールで金表面にパターンを形成する。 In this case, to form a pattern on the gold surface with alkanethiol having an nitriloacetic acid terminated. タンパク質吸着を低減させるため、金の裸領域がトリ(エチレングリコール)でコーティングされる。 To reduce protein adsorption, bare areas of the gold is coated with tri (ethylene glycol). Ni 2+を添加すると、ヒスチジン標識した5つのタンパク質の特異的吸着が動力学的に安定するのが観察される。 The addition of Ni 2+, specific adsorption of the five proteins histidine-tagged is observed to kinetically stable.
【0074】 [0074]
より特異的な均一の細胞結合は、パターン形成した基質上の反応部位にタンパク質などの特定分子を化学架橋することによって得られる(AplinおよびHughes、Analyt.Biochem. 113:144−148、1981)。 More specific uniform cell binding is obtained by chemical crosslinking specific molecules, such as proteins in the reaction regions on the substrate that is patterned (in Aplin and Hughes, Analyt.Biochem 113:. 144-148,1981). 基質パターン形成の別の加工法では、読み取り可能スポットのアレイが作製される。 In another processing method of a substrate patterned array of readable spots are produced. ガラスに化学吸着してガラスをコーティングする有機シランでガラス板を洗浄する。 Glass chemically adsorbed washing the glass plate with an organic silane coating glass. アレイのパターンを規定する光学マスクを通して有機シランコーティングに遠紫外光を照射する。 Irradiating far ultraviolet light organosilane coating through an optical mask defining the pattern of the array. 照射によりSi−−C結合が開裂して反応性のSiラジカルが生じる。 Irradiating the Si - C bonds reactive Si radicals generated by cleavage. Siラジカルは水との反応により有極性のシラノール基を生じる。 Si radicals results in polar silanol groups by reaction with water. 参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,324,591号に記載のように、有極性のシラノール基はアレイ状のスポットを構成し、さらに修飾を受けて他の反応性分子をスポットに結合させる。 As described in patent U.S., incorporated herein by reference No. 5,324,591, the silanol groups of the polar constitutes the array of spots, receives further modified spot other reactive molecules to bond. 例えば、自由アミノ成分などの生物学的機能基を含むシランをシラノール基と反応させることが可能である。 For example, a silane containing a biological function groups such as free amino component can be reacted with the silanol groups. 次に、自由アミノ基を、タンパク質、核酸、炭水化物、および脂質などの生物分子との共有結合性付着部位として使用することができる。 Then, it is possible to use a free amino group, proteins, nucleic acids, carbohydrates, and the covalent attachment site of the biological molecules such as lipids. 細胞表面と相互作用することが知られているレクチンを、反応性のアミノ基を介して、パターン形成せずにガラス基質に共有結合的に付着させる方法が示されている(AplinおよびHughes、1981)。 Lectins are known to interact with cell surface via reaction of the amino group, methods for covalently attached to the glass substrate is shown without patterning (in Aplin and Hughes, 1981 ). 支持体上に細胞の均一なアレイを作成する光学的方法は、フォトレジスト法と比較して必要な段階が少なくかつ高速であるが、高額な光源による強力な紫外光を必要とする。 Optical method for creating a uniform array of cells on a support is necessary steps as compared with the photoresist method is less high speed, requires a strong UV light by expensive light sources.
【0075】 [0075]
別の態様においては、細胞アレイと試験刺激の印加とは、参照として本明細書に完全に組み込まれる米国特許第6,103,479号に記載の方法と構成内容とに基づく。 In another embodiment, the application of the cell array with a test stimulus, based on the configuration contents to the method described in U.S. Patent No. 6,103,479 which is fully incorporated herein by reference. 米国特許第6,103,479号は、関心対象の化合物(例えば、薬物およびその他の生物学的活性化合物)の送達が可能な小型化した細胞アレイを提供する好ましい手段を開示している。 U.S. Patent No. 6,103,479, the compound of interest (e.g., drugs and other biologically active compounds) discloses a preferred means of providing a cell array delivery miniaturized possible. 米国特許第6,103,479号は、生物学的活性化合物に対する細胞の生理学的反応を高スループットかつ高含量でスクリーニングする手段および方法を開示している。 U.S. Patent No. 6,103,479 discloses a means and method for screening a physiological response of the cells to biologically active compounds in high throughput and high content. 細胞の不均一マイクロパターンアレイとは、細胞が支持体表面上の単一の均一なコーティング内に分布されるのではなく、支持体上の各「ウェル」またはウェルの群が細胞結合選択性の面で固有であってもよいような不均一な様式で分布される、ベース上の細胞のアレイを指す。 The heterogeneous micro-patterned array of cells, the cells rather than being distributed in a single uniform coating on the support surface, the group of the "well" or well on the support cell binding selectivity a unique face are distributed in a non-uniform manner so may refer to cells in the array on the base. アレイ化する細胞種に特異的に結合できる分子がマイクロパターン化学アレイ内に存在する限り、細胞の不均一マイクロパターンアレイ上には任意の細胞種をアレイ化できる。 As long as the molecule can specifically bind to a cell type arraying is present in the micro-patterned chemical array may arraying any cell type on the heterogeneous micro-patterned array of cells. 細胞の不均一マイクロパターンアレイ用として好ましい細胞種としては、リンパ球、癌細胞、ニューロン、真菌、細菌、ならびにその他の原核生物および真核生物が含まれる。 Preferred cell types for the heterogeneous micro-patterned array of cells, lymphocytes, include cancer cells, neurons, fungi, bacteria, and other prokaryotes and eukaryotes.
【0076】 [0076]
米国特許第6,103,479号の細胞の不均一マイクロパターンアレイを作製する方法は、マイクロパターン化学アレイを準備する段階、マイクロパターン化学アレイを不均一に化学修飾する段階、および、ベース上で不均一修飾マイクロ化学パターンアレイに細胞を結合させる段階を含む。 Methods of making non-uniform micro-patterned array of U.S. Pat. No. 6,103,479 cells, preparing a micro-patterned chemical array, the step of unevenly chemically modifying the micro-patterned chemical array, and, on the basis comprising the step of coupling the cells to the non-uniform modification microchemical pattern array. ベースは、従来の光学顕微鏡用カバーガラスなどのように、ガラス、プラスチック、またはシリコンウェーハであってよいが、ベースの提供に適した他の任意の材料で作製してもよい。 Base, as in such a conventional optical microscope cover glass, glass, plastic, or may be a silicon wafer, and may be made in any other material suitable for providing the base. 本明細書に記載のように、「ウェル」という用語はベース上の特定のスポットを説明するために用いられ、特定の深さである必要はない。 As described herein, the term "well" is used to describe the specific spot on the base need not be a specific depth. このようなアレイを作製する方法は米国特許第6,103,479号に記載されている。 Methods for making such arrays is described in U.S. Patent No. 6,103,479. 特許の明細書に記載のとおり、好ましい態様において、修飾マイクロパターン化学アレイは組合せ様式で作製される。 As described in the specification of patent, in a preferred embodiment, the modified micro-patterned chemical array is fabricated by a combination manner. その結果得られるウェルは不均一である(すなわち、各ウェルまたはウェルの群が細胞結合選択性の面で固有であってもよい)。 The resulting wells are heterogeneous (i.e., the group of each well or well may be a unique in terms of cell binding selectivity). 組合せ(combinatorial)とは、ウェルが変動的に処理されることを意味する。 The combination (combinatorial), means that the well is treated variably.
【0077】 [0077]
2. 2. マイクロ流体工学フォーマット固体の基体に付着した細胞のマイクロアレイに対する効率的な溶液送達は、マイクロ流体工学のシステムにより容易になる。 Efficient solutions delivery to microarrays of cells attached to the substrate of the microfluidic formats solid is facilitated by the system of microfluidics. 少量液体試料の精密な取り扱いの方法および装置は、インク送達(米国特許第5,233,369号;米国特許第5,486,855号; 米国特許第5,502,467号、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる)、生物試料の吸引(米国特許第4,982,739号、参照として本明細書に組み入れられる)、試薬の保管および送達(米国特許第5,031,797号、参照として本明細書に組み入れられる)、ならびに、臨床診断および化学合成用の超小型電子工学的かつ流体工学的な区分装置アレイ(米国特許第5,585,069号、参照として本明細書に組み入れられる)に関して開示されている。 Small amounts method and apparatus for precision handling of liquid samples, the ink delivery (U.S. Pat. No. 5,233,369; U.S. Pat. No. 5,486,855; U.S. Pat. No. 5,502,467, see all of which as herein incorporated), the suction of a biological sample (U.S. Pat. No. 4,982,739, incorporated herein by reference), storage and delivery of reagents (U.S. Pat. No. 5,031,797, incorporated herein by reference), as well as clinical diagnosis and microelectronic engineering and fluidic partitioning device arrays for chemical synthesis (U.S. Pat. No. 5,585,069, incorporated herein by reference It has been disclosed with respect to be). さらに、少量液体試料を表面に沿って誘導するために使用できる、固体基体中に微小チャネルを形成するための方法および装置が開示されている(米国特許第5,571,410号;米国特許第5,500,071号; 米国特許第4,344,816号、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる)。 Furthermore, can be used to induce a small amount along the liquid sample to the surface, a method and apparatus for forming a micro-channel in a solid body is disclosed (U.S. Pat. No. 5,571,410; U.S. Pat. No. No. 5,500,071; U.S. Pat. No. 4,344,816, which are incorporated herein all reference). 閉鎖された光学チャンバ内で固体基体上に不均一なアレイとしてマイクロパターン形成された生細胞に溶液を送達するための方法は米国特許第6,103,479号に開示されており、特許も参照として本明細書に組み入れられる。 Method for delivering the solution into living cells is micro-patterned on a solid substrate with closed optical chamber as heterogeneous array is disclosed in U.S. Patent No. 6,103,479, see also patent which is incorporated herein by.
【0078】 [0078]
細胞の不均一マイクロパターンアレイの好ましい態様は上記に開示したとおりである。 A preferred embodiment of the heterogeneous micro-patterned array of cells is as disclosed above. 液体送達システムの好ましい態様では、チャンバが、細胞の不均一マイクロパターンアレイを含む基体と接続する。 In a preferred embodiment of the fluid delivery system, the chamber is connected to the substrate comprising a non-uniform micro-patterned array of cells. チャンバの材料は好ましくはガラス、プラスチック、またはシリコンであるが、基体を提供できる他の任意の適切な材料であってよい。 Although the material of the chamber is preferably glass, plastic or silicon, it may be any suitable material other that can provide a substrate. チャンバの1つの態様は、細胞の不均一マイクロパターンアレイ内のウェルと一致するエッチングされた領域のアレイを有する。 One embodiment of the chamber has an array of etched region that matches well the heterogeneous micro-patterned array of cells. さらに、エッチングされた領域に液体を供給するため、マイクロ流体工学チャネルがエッチングされる。 Further, for supplying the liquid to the etched region, microfluidics channels are etched. エッチングされた領域から余分の液体を除去するための一連の「廃棄物」チャネルもウェルに接続されていてよい。 A series of "waste" channel for removing excess liquid from the etched region may be connected to the well. チャンバと細胞のマイクロパターンアレイとはともにカセットを構成する。 The chamber and the cells of the micro-pattern array together constitute a cassette.
【0079】 [0079]
「液体」とは、特定の薬剤、タンパク質、リガンド、または細胞の表面発現成分と結合するもしくは細胞に取り込まれるその他の物質の溶液を含むが、これらに限定されることはない。 By "liquid", a particular drug, a protein, including a solution of the other substances to be incorporated into or cell that binds to a surface expression component of the ligand or cell, and it is not limited thereto. 細胞の不均一マイクロパターンアレイと反応させるための溶液は、薬剤を封入したリポソームも含んでいてよい。 Solution for reacting an uneven micro-patterned array of cells may also comprise liposomes encapsulating agent. 1つの態様では、露光により薬剤を放出する光反応生合成ポリマーなどの光化学材料でこのようなリポソームを形成する(WillnerおよびRubin、Chem.Int. Ed. Engl. 35:367−385、1996に概説)。 In one embodiment, forming such liposomes photochemical material such photoreactive biosynthetic polymer releases the drug upon exposure (Willner and Rubin, Chem.Int Ed Engl 35:... 367-385,1996 outlined ). 薬剤はすべてのチャネル14で同時に放出させてもよく、または、個々のチャネルもしくはチャネルの列を照明して逐次的に放出させてもよい。 Agent may also be released simultaneously on all channels 14, or, may be sequentially emitted by illuminating a column of individual channels or channel. このような薬剤の制御放出を動力学研究および生細胞研究に用いてもよい。 Controlled release of such agents may be used in kinetic studies and live cell research. 液体送達の制御は、毛管現象の当業者に既知のマイクロバルブおよびマイクロポンプの組合せにより可能である(米国特許第5,567,294号;米国特許第5,527,673号; および米国特許第5,585,069号、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる)。 Control of the liquid delivery, to those skilled in the art of capillary action is possible by combination of known microvalves and micropumps (U.S. Pat. No. 5,567,294; U.S. Pat. No. 5,527,673; and U.S. Patent No. No. 5,585,069, which are incorporated herein all reference).
【0080】 [0080]
好ましい態様では、薬剤または他の物質は以下のように送達される。 In a preferred embodiment, the drug or other substance is delivered as follows. アレイの細胞との相互作用の試験対象とする物質の溶液は、96ウェルのマイクロタイタープレートから微小毛管チューブのアレイに装填できる。 Solution of the material to be tested for interaction with the array of cells may be loaded into the array of micro capillary tubes from the 96-well microtiter plates. 微小毛管チューブのアレイはチャンバのマイクロ流体工学チャネルに1対1対応し、これにより、微小毛管チューブからチャネルへと溶液を流出させるまたはポンプ排出させることが可能となる。 An array of micro-capillary tube is one-to-one correspondence to the microfluidics channel of the chamber, thereby, the solution it is possible to or pumped to flow out from the small capillary tube into the channel. 液体が充填されたエッチング領域にウェルが浸漬するように、細胞の不均一マイクロパターンアレイを反転させる。 As the liquid is well etched region filled is immersed, to reverse the non-uniform micro-patterned array of cells. 液体と細胞の不均一マイクロパターンアレイとの相互作用が生じたら、細胞の不均一マイクロパターンアレイが発する光を、直接測定すること、ならびに、細胞のアレイの配置、除去、および処理をロボットにより自動的に誘導するための光入力に変換することができる。 If you experience interaction between the liquid and the heterogeneous micro-patterned array of cells, automatic light emitted by the non-uniform micro-patterned array of cells, be measured directly, as well as the arrangement of the cells in the array, removing, and processing by the robot it can be converted to an optical input for induced manner.
【0081】 [0081]
3. 3. 蛍光フォーマット本明細書に記載のように、特に好ましい態様は細胞の蛍光撮像を含む。 As described fluorescent format herein, a particularly preferred embodiment comprises a fluorescent imaging of cells. 顕微鏡で蛍光細胞を撮像し、かつこれらの細胞で生じている空間分布および経時変化に関する情報を抽出するための種々の方法が開発されている。 Various methods for extracting information about the spatial distribution and temporal change being imaged fluorescent cells under a microscope, and occur in these cells have been developed. これらの方法およびその応用の多くは最近開示されたものである(Taylorら、Am.Scientist 80:322−335、1992; 米国特許第6,103,479号も参照)。 Many of these methods and their applications are those disclosed recently (Taylor et al., Am.Scientist 80: 322-335,1992; see also U.S. Pat. No. 6,103,479). これらの方法は、細胞内の蛍光レポーター分子の分布、量、および生化学環境を高い空間分解能および時間分解能で画像測定することを目的として少数の標本を作製するために設計および最適化されたものである。 These methods, distribution of the fluorescent reporter molecule in a cell, the amount, and those designed and optimized to produce a small number of samples for the purpose of image measuring biochemical environment with high spatial resolution and time resolution it is.
【0082】 [0082]
染料と蛍光試薬とによる細胞の処理および細胞の撮像(Wangら、「細胞生物学における方法(In Methods in Cell Biology)」、New Processing and cell imaging of cells with the dye and a fluorescent reagent (Wang et al., "Method in cell biology (In Methods in Cell Biology)", New
York、Alan R. York, Alan R. Liss、29:1−12、1989)、ならびに、レポーター分子として修飾緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質を生成させるための細胞の遺伝子操作は有用な検出方法である。 Liss, 29: 1-12,1989), as well as cells of genetic manipulation to generate a modified green fluorescent protein (GFP) fluorescent protein such as a reporter molecule is a useful detection method. クラゲの一種であるエクオレア・ビクトリア(Aequorea Which is a kind of jellyfish Aequorea Victoria (Aequorea
Victoria)の緑色蛍光タンパク質(GFP)は395 nmに最大励起波長、510 nmに最大発光波長を有し、かつ、外因性因子を必要としない。 Victoria green fluorescent protein (GFP)) is the maximum excitation wavelength 395 nm, has a maximum emission wavelength 510 nm, and does not require an exogenous factor. GFPを使用した遺伝子発現およびタンパク質位置測定はチャルフィー(Chalfie)ら、Science Gene expression and protein position measurement using GFP is Charufi (Chalfie) et al., Science
263:802−805、1994に記載されている。 263: are described in the 802-805,1994. 野生型GFPのいくつかの特性はモリセ(Morise)ら(Biochemistry 13:2656−2662、1974)およびワード(Ward)ら(Photochem.Photobiol. 31:611−615、1980)によって開示されている。 Some characteristics Morise (Morise) et wild-type GFP (Biochemistry 13: 2656-2662,1974) and word (Ward) et (Photochem.Photobiol 31:. 611-615,1980) disclosed by. リッツト(Rizzuto)ら(Nature 358:325−327、1992)による論文では、細胞小器官を可視化するためのツールとしての野生型GFPの使用が検討されている。 Rittsuto (Rizzuto) et al in an article by the (Nature 358 325-327,1992), use of wild-type GFP of organelles as a tool for visualizing have been studied. カエサー(Kaether)およびゲルデス(Gerdes)(FEBS Kaesa (Kaether) and Gerudesu (Gerdes) (FEBS
Letters 369:267−271、1995)は、分泌系路上のタンパク質輸送の野生型GFPを用いた可視化について報告している。 Letters 369: 267-271,1995) have reported on the visualized using wild-type GFP protein trafficking secretion system path. 植物細胞におけるGFPの発現についてはフー(Hu)およびチェン(Cheng)(FEBS Fu for the expression of GFP in plant cells (Hu) and Chen (Cheng) (FEBS
Letters 369:331−334、1995)が、ショウジョウバエ(Drosophila)の胚におけるGFP発現についてはデービス(Davis)ら(Dev.Biology 170:726−729、1995)が報告している。 Letters 369: 331-334,1995) is, Drosophila (Drosophila) Davis for GFP expression in the embryo (Davis) et (Dev.Biology 170: 726-729,1995) have reported. 参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,491,084号では、他の関心対象のタンパク質と融合させたレポーター分子としてのエクオレア・ビクトリア(Aequorea As in U.S. Patent No. 5,491,084, incorporated herein reference, Aequorea victoria as a reporter molecule fused to the protein of other interest (Aequorea
Victoria)由来GFPの発現が開示されている。 Victoria) Expression of GFP from is disclosed. 参照として本明細書に組み入れられるPCT/DK96/00052は、細胞内プロセスに影響を与える細胞学的活性物質を、プロテインキナーゼ活性化部位を有するGFP構造を利用して検出する方法に関する。 PCT / DK96 / 00052, incorporated herein by reference, cytological active substances affecting intracellular processes, relates to a method for detecting using the GFP structure having a protein kinase activation site. 生物学的システムにおけるGFPタンパク質に関する文献は多数ある。 There are many references about GFP proteins in biological systems. 例えば、参照として本明細書に組み入れられるPCT/US95/10165は、GFP様タンパク質の発現を利用して関心対象の細胞を分離するシステムを開示している。 For example, PCT / US95 / 10165, incorporated herein by reference, discloses a system for separating cells of interest utilizing the expression of GFP-like proteins. 参照として本明細書に組み入れられるPCT/GB96/00481は、植物におけるGFPの発現を開示している。 PCT / GB96 / 00481, incorporated herein by reference, discloses the expression of GFP in plants. 参照として本明細書に組み入れられるPCT/US95/01425は、突然変異生成を検出するための、形質転換生物における修飾GFPタンパク質の発現を開示している。 PCT / US95 / 01425, incorporated herein by reference, for detecting mutagenesis, discloses the expression of a modified GFP protein in the transformed organism. GFP突然変異体は複数の生物学的システムで作製および使用されている(Hasselhoffら、Proc.Natl. Acad. Sci. 94:2122−2127、1997; Brejcら、Proc. Natl. Acad Sci. 94:2306−2311、1997;Chengら、Nature Biotech. 14:606−609、1996; HeimおよびTsien、Curr. Biol. 6:178−192、1996;ならびに、Ehrigら、FEBS Letters 367:163−166、1995)。 GFP mutants have been produced and used in several biological systems (Hasselhoff, et al., Proc.Natl Acad Sci 94:...... 2122-2127,1997; Brejc et, Proc Natl Acad Sci 94: 2306-2311,1997; Cheng et al., Nature Biotech 14:. 606-609,1996; Heim and Tsien, Curr Biol 6:.. 178-192,1996; and, Ehrig et al, FEBS Letters 367: 163-166,1995 ). いずれも参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,436,128号および第5,401,629号には、細胞表面受容体の活性に対して反応性を示す転写制御要素を含む受容体遺伝子構造を含みかつ細胞表面受容体を発現する組換え細胞を用いて、細胞外シグナルの細胞内変換を検出および評価するためのアッセイおよび構成を示した方法が開示されている。 U.S. Patent No. 5,436,128 and No. 5,401,629, incorporated herein by reference both, receptors, including transcriptional control elements that are reactive to the activity of cell surface receptors It includes a gene structure and using recombinant cells that express cell surface receptors, assays and methods shown an arrangement for detecting and evaluating the intracellular conversion of extracellular signals is disclosed.
【0083】 [0083]
BioDx社(米国特許出願第08/810983号)により開発されたArrayScan(商標)システムは、特定の生物学的活性について多数の化合物を検索するために、発光的に標識したレポーター分子の細胞内における分布、環境、または活性を決定する光学システムである。 BioDx Corporation (US Patent Application No. 08/810983. No.) ArrayScan developed by (TM) system, in order to search a large number of compounds for specific biological activity, in cells of the light-emitting labeled reporter molecule distribution, an optical system for determining the environment or activity. ArrayScan(商標)システムは、発光レポーター分子を含む細胞を均一な位置のアレイに提供する段階と、各位置にある多数の細胞を蛍光顕微鏡で走査する段階とを含み、走査の段階では、光学情報がデジタルデータに変換され、かつ、細胞内の発光標識したレポーター分子の分布、環境、または活性がデジタルデータを利用して決定される。 ArrayScan (TM) system includes the steps of providing a cell including a light emitting reporter molecule to a uniform position in the array, the number of cells in each position comprises the steps of scanning a fluorescence microscope, at the stage of the scanning, the optical information There is converted into digital data, and the distribution of luminescent labeled reporter molecule in a cell, environment or activity is determined utilizing the digital data. 現在使用されている均一な位置のアレイは、業界標準の96ウェルまたは384ウェルのマイクロタイタープレートである。 An array of uniform position currently used is a microtiter plate industry standard 96-well or 384-well. ArrayScan(商標)システムは、データを処理、表示、および保存するための装置とコンピュータ化された方法とを含み、したがって細胞に基づく高含量の検索を大規模のマイクロタイタープレートフォーマットで提供することによって薬剤の発見を増大させる。 ArrayScan (TM) system, process the data, display, and includes a device for storing and a computerized method, therefore by providing a search high content cell-based in large microtiter plate format increase the discovery of the drug.
【0084】 [0084]
前述の態様を組み合わせて、均一なまたは不均一なマイクロパターンアレイで多色発光読取、マイクロ流体送達、および生細胞の自動環境制御を実施するための方法および装置を提供することも可能である。 A combination of the foregoing embodiments, the multi-color emission reading at a uniform or non-uniform micro-patterned array, a microfluidic delivery, and it is also possible to provide a method and apparatus for implementing automatic environmental control of living cells.
【0085】 [0085]
1つの態様では、本発明は細胞の不均一マイクロパターンアレイとアレイを作製する方法とを含む。 In one aspect, the present invention includes a method of making a non-uniform micro-patterned array and the array of cells. アレイは、別の化合物の組合せで処理されてもよい同一の細胞種を含んでいてもよく、または、1つまたは複数の化合物で処理されてもよい細胞種の組合せを含んでいてもよい。 Array may comprise other compounds which may the same cell type be treated with a combination of, or may include one or more of good cell types of combinations be treated with a compound. 「組合せ(combinatorial)」という用語は、ウェルまたはウェルの群が変動的に処理されることを意味する。 The term "combination (combinatorial)" means that the group of wells or wells are treated variably. 本発明の別の局面は、細胞の不均一マイクロパターンアレイであって細胞が少なくとも1つの発光レポーター分子を含むアレイと細胞の不均一マイクロパターンアレイに試薬の組合せを送達させるための液体送達システムとを組み合わせて使用することによって細胞を分析する方法、ならびに、発光レポーター分子が発する発光信号を検出、記録、および分析する手段、を含む。 Another aspect of the present invention, a liquid delivery system for a non-uniform micro-patterned array of cells is cells to deliver a combination of reagents uneven micro-patterned array of arrays and cells comprising at least one light emitting reporter molecule method of analyzing the cells by using a combination of, as well as including detecting an emission signal emitting reporter molecule emitted, recording, and analyzing means. 本発明の別の局面では、細胞の不均一マイクロパターンアレイ内の発光レポーター分子が発する発光信号を検出するための発光読取機器と、発光読取機器からデータを受け取るためのデジタル検出器と、光検出器から送られたデジタルデータを受信および処理するためのコンピュータ手段とを含む細胞検索システムが開示される。 In another aspect of the present invention, a light emitting reading device for detecting a light emission signal emitted from the light emitting reporter molecule heterogeneous micro-patterned array of cells, and a digital detector for receiving data from the emission reading device, photodetector cells retrieval system including a computer means for receiving and processing digital data sent from the vessel is disclosed.
【0086】 [0086]
別の態様では、細胞は細胞の化学特性または分子特性を表す蛍光インジケータで修飾され、不均一マイクロパターン化学アレイに播種され、かつ、生きた状態で分析される。 In another embodiment, the cells are modified with fluorescent indicator representing the chemical properties or molecular characteristics of cells were seeded in heterogeneous micro-patterned chemical array, and is analyzed in a living state. このようなインジケータの例は、ギウイラノ(Giuilano)ら、Ann. Examples of such indicator, Giuirano (Giuilano) et al, Ann. Rev. Rev. Biophys. Biophys. Biomol. Biomol. Struct. Struct. 24:405−434、1995; ハルーツニアン(Harootunian)ら、Mol. 24: 405-434,1995; Harutsunian (Harootunian), et al., Mol. Biol. Biol. Cell 4:993−1002、1993; ポスト(Post)ら、Mol. Cell 4: 993-1002,1993; post (Post) et al., Mol. Biol. Biol. Cell 6:1755−1768、1995; ゴンザレス(Gonzalez)およびチエン(Tsien)、Biophys. Cell 6: 1755-1768,1995; Gonzalez (Gonzalez) and thien (Tsien), Biophys. J. J. 69:1272−1280、1995; スワミナサン(Swaminathan)ら、Biophys. 69: 1272-1280,1995; Swaminathan (Swaminathan) et al, Biophys. J. J. 72:1900−1907、1997; ならびに、チャルフィー(Chalfie)ら、Science263:802−805、1994に記載されている。 72: 1900-1907,1997; and Charufi (Chalfie) et al, Science263: are described in 802-805,1994. インジケータは、細胞をアレイに播種する前または播種した後に、種々の物理的方法の1つまたは組合せにより細胞に導入してよく、このような物理的方法としては、例えば、細胞膜を介した拡散(Haugland、「蛍光プローブと研究用化学物質のハンドブック(Handbook Indicator diffused before or after sowing to seed cells in the array may be introduced into a cell by one or a combination of a variety of physical methods, as such physical methods, for example, through the cell membrane ( Haugland, Handbook of research chemicals "fluorescent probe (Handbook
of fluorescent probes and research chemicals)」、別冊6、Molecular Probes社編、Eugene、1996に概説)、細胞膜の機械的摂動(McNeilら、J.Cell Biology 98:1556−1564、1984; ClarkeおよびMcNeil、J. Cell Science 102:533−541、1992;Clarkeら、BioTechniques 17:1118−1125、1994)、または規定された条件下において細胞内でインジケータが発現するような遺伝子操作(Chalfieら、1994)があるが、これらに限定されることはない。 of fluorescent probes and research chemicals) ", separate 6, Molecular Probes, Inc., ed., reviewed in Eugene, 1996), mechanical perturbation of the cell membrane (McNeil et al., J.Cell Biology 98: 1556-1564,1984; Clarke and McNeil, J . cell Science 102: 533-541,1992; Clarke et al., BioTechniques 17: 1118-1125,1994), or genetically engineered, such as the indicator in the cells express at defined conditions (Chalfie et al., there is 1994) but it is not limited thereto. 好ましい態様において、細胞は発光レポーター遺伝子を含むが、化学発光タンパク質をコードしている遺伝子を含めて他の種類のレポーター遺伝子も適している。 In a preferred embodiment, the cell includes a light emitting reporter gene, are also suitable other types of reporter genes, including the gene encoding the chemiluminescent protein. 生きた細胞の研究により、生活環中の発光または薬剤もしくはその他の反応性物質と接触した際の発光に基づいて、細胞の生理学的状態を分析することが可能になる。 The living cells of the study, based on the light emission when in contact with the light emitting or drug or other reactive substance in the life cycle, it is possible to analyze the physiological state of the cell.
【0087】 [0087]
本発明の別の態様では、細胞の不均一マイクロパターンアレイであって細胞が少なくとも1つの発光レポーター分子を含むアレイを作製する段階と、細胞の不均一マイクロパターンアレイに試薬を送達させることを可能にするため細胞の不均一マイクロパターンアレイを液体送達システムに接触させる段階と、細胞の個々の画像を取得できるよう適切な倍率で個々の細胞の発光画像を取得することにより高スループットの検索を実施する段階とを含む、個々の細胞を分析する方法が提供される。 In another aspect of the present invention, allows a non-uniform micro-patterned array of cells is cells of delivering the steps of preparing an array including at least one light emitting reporter molecule, the reagent uneven micro-patterned array of cells a step of the heterogeneous micro-patterned array of cells is contacted with a liquid delivery system for the, perform a search for high throughput by acquiring luminescence image of individual cells in a suitable ratio to be acquired individual images of cells method comprising the steps, analyzing the individual cells is provided. 次に、異なる生理学的特性およびスペクトル特性を有する発光試薬のセットを使用する段階と、細胞内の発光レポーター分子が発する発光信号を取得するため個々の細胞のアレイを走査する段階と、発光信号をデジタルデータに変換する段階と、デジタルデータを利用して個々の細胞内の発光レポーター分子の分布、環境、または活性を決定する段階とにより、反応したウェル内で高含量の検出が行われる。 Next, the method comprising using a set of light-emitting reagents have different physiological properties and spectral characteristics, the steps of scanning an array of individual cells for obtaining the light emission signal emitted from the light emitting reporter molecule in a cell, a light emission signal and converting the digital data, the distribution of the luminescence reporter molecule in individual cells by using the digital data, by determining an environmental or activity, detection of a high content in the reaction were the wells is carried out.
【0088】 [0088]
個々の細胞の不均一マイクロパターンアレイとチャンバとを含むカセットがVSOM光学読取機器に挿入される。 Cassette containing a heterogeneous micro-patterned array and chambers of the individual cells are inserted into VSOM optical reading apparatus. 光学読取機器は、カセットの取り扱いと、環境(例えば、生細胞にとって重要である温度)の制御と、溶液のウェルへの送達の制御と、1度に1つまたは複数の細胞について細胞のアレイから放出される発光の分析とを行う光学機械装置である。 Optical reading apparatus, and handling of the cassette, the environment (for example, an important temperature for live cells) and control, and control of the delivery of the solution of the well, for one or more cells at a time from the cells of the array an optomechanical device that performs an analysis of the emitted luminescence. 機器は、個々の細胞が発する光信号とアルゴリズムとに基づいて、溶液の添加を自動的に制御する。 Equipment, based on the optical signal and algorithms emitted by individual cells, for automatically controlling the addition of a solution. 好ましい態様において、光学読取機器は、読取装置としての蛍光顕微鏡とカセットを走査するためのマイクロロボットとを使用した集積回路検査ステーションを含む。 In a preferred embodiment, the optical reading device includes an integrated circuit test station using the microrobot for scanning fluorescence microscopy and cassettes as a reading device. カセットは保管区画に保持され、コンピュータ制御されたロボットアームによって保管区画から回収される。 Cassette is held in the storage compartment, it is recovered from the storage compartment by a computer-controlled robot arm. ロボットアームはカセットを発光読取機器に挿入する。 Robot arm is inserted into the instrument reading emit cassette. 別のロボットアームがカセットを発光読取機器から取り出し、第二の保管区画に配置する。 Another robot arm removed from the instrument reading emit cassette is placed in the second storage compartment.
【0089】 [0089]
環境制御、マイクロロボット、および光学読取機器を統合したシステムはカールツァイス(Carl Zeiss)[Jena、GmbH] などの企業により製造されている。 Environmental control, microrobot, and an optical reading system with integrated instruments Carl Zeiss (Carl Zeiss) [Jena, GmbH] manufactured by companies such as. ロボットによる取り扱い、液体の送達、および高速かつ精密な走査が容易になっていることに加えて、高含量および高スループットの2つの読取モードが用意されている。 Handling by robots, the delivery of the liquid, and high speed and in addition to precision scan has been facilitated two read modes a high content and high throughput are provided. 高含量の読取は、ArrayScanリーダー(米国特許出願第08/810983号)による読取と本質的に同じである。 Reading the high content, is essentially the same reading as by ArrayScan leader (U.S. Patent Application No. 08/810983). 高含量モードでは、細胞の不均一マイクロパターンアレイの各位置が倍率5倍〜40倍以上で撮像され、所望の統計学的分解能の測定を行うのに十分な数の視野が記録される。 The high content mode, each position of the non-uniform micro-patterned array of cells is imaged by the ratio of 5 to 40 times or more, a sufficient number of the field in the measurement of the desired statistical resolution is recorded.
【0090】 [0090]
1つの態様において、光学読取機器は、コンピュータ制御のx,y,zステージを有する正立または倒立の蛍光顕微鏡である光学機械設計と、低倍率(例えば0.5倍)の対物レンズおよび1つまたは複数のより高倍率の対物レンズを保持するコンピュータ制御の回転ノーズピースと、励起フィルタホイールを有する白色光源と、発光フィルタを有するダイクロイックフィルタシステムと、検出器(例えば冷却電荷結合素子)とを含む。 In one embodiment, the optical reading apparatus, an optical mechanical design is erected or inverted fluorescent microscope with a computer-controlled x, y, z stage, one objective lens and one of the low magnification (e.g., 0.5 times) comprising or a rotary nosepiece computer control to maintain a plurality of higher magnification of the objective lens, a white light source having an excitation filter wheel, a dichroic filter system having an emission filter, and a detector (e.g., a cooled charge-coupled device) . 別の態様において、光学読取機器は、共焦点または標準の照明モードで走査レーザービームを利用してもよい。 In another embodiment, the optical reading device may utilize scanning laser beam in a confocal or standard illumination mode. スペクトルは、カールツァイス(Carl Spectrum, Carl Zeiss (Carl
Zeiss)(Jena、GmbH、ドイツ)が製造しているようにまたはDenkら(Science 248:73、1990)が報告しているように、複数のレーザーラインかまたは個別のレーザーダイオードの群かに基づいて選択される。 Zeiss) (Jena, GmbH, Germany) is prepared to have such or Denk et al (Science 248: 73,1990) as reported by, based on whether a group of a plurality of laser lines or a separate laser diode It is selected Te. 高スループットの検索モードの別の態様では、発光励振器のアレイ(1×8、1×12など)と発光放射検出器とを有する低分解能のシステムであって細胞の不均一マイクロパターンアレイのウェルの部分集合を走査するシステムが使用される。 In another aspect of the search mode of high-throughput, light emitting exciter array (1 × 8,1 × 12 etc.) and the emission radiation detector and a low-resolution system well in heterogeneous micro-patterned array of cells with system is used to scan a subset. このシステムは、好ましい態様では光ファイバー束を有するが、発光励起光を誘導しかつ同じウェルが発する発光放射光を収集するシステムであれば任意のシステムであってよい。 This system has the fiber optic bundle in the preferred embodiment, may be any system as long as the system for collecting emission radiation induced emission excitation light and the same well emitted.
【0091】 [0091]
B. B. 局所のホストコンピュータ(またはクライアント) Local host computer (or client)
コンピュータ制御の周辺装置は局所コンピュータによって独立に制御してもよく、または、遠隔コンピュータが発行する命令のためのコンジットとして局所コンピュータを機能させてもよい。 It may peripheral device of a computer controlled independently controlled by the local computer, or may function local computer as a conduit for the instruction which the remote computer issues. 一般的な「機器」もしくは顕微鏡の遠隔制御、またはインターネット上のVSOMシステムは、後述のように複数の利点を有する。 General "equipment" or microscope remote control or VSOM system on the Internet, has several advantages as described below. 例えば、中央コンピュータは、より高い処理能力およびアーカイビング能力、ならびにより高度なデータベースおよびその他のソフトウェアパッケージを有していてもよく、これにより、これらの長所を、個々の光学プラットフォームの近くに配置された多数の局所コンピュータ上で多額の費用をかけて重複させる必要がなくなる。 For example, the central computer, higher throughput and archiving capabilities, and better have a sophisticated databases and other software packages, thereby, these advantages are disposed near the respective optical platforms need to overlap is eliminated over large costs on multiple local computers.
【0092】 [0092]
C. C. VSOM制御用の遠隔コンピュータ、ネットワークソフトウェア、データベース、インフォマティクス、および分析アルゴリズムコンピュータ科学の見地から、本発明には種々の構成要素を必要とした。 Remote computer for VSOM control, from network software, databases, bioinformatics, and analysis algorithms standpoint of computer science, the present invention required a variety of components. 特に好ましい態様では以下の構成要素が含まれる:(1)顕微鏡周辺装置のコンピュータ制御、(2)単一または複数のチャネルで撮像された細胞のセグメント化、(3)特定の実験で使用されるレシピの解題、(4)印加された刺激の関数としての細胞反応の自動分析、(5)2つの細胞種間の差異をアッセイの関数として比較するオフラインの相関技術、クラスター化技術、および学習技術、ならびに、(6)2つ以上の異なる細胞種から直接の反応を導出するためのポリシー(すなわちプロトコルまたはレシピ)を動的に制御および推測するオンラインの学習技術。 In a particularly preferred embodiment includes the following components: (1) computer controlled microscope peripherals, (2) segmentation of cells captured by a single or multiple channels are used in (3) specific experimental recipe precis, (4) automated analysis of cellular response as a function of applied stimuli, (5) off-line correlation technique to compare the differences between the two cell types as a function of the assay, clustering techniques and learning techniques and, (6) two or more different cell types policies for deriving direct reaction from (i.e. protocol or recipe) dynamically controlling and guess online learning techniques. 種々のシステム構成要素間の相互作用を図1および図2に示す。 1 and 2 the interaction between the various system components. 特に好ましい態様において、全システム構成要素の完全な統合には、専用に設計されたグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)、オンライン画像分析ソフトウェア、オフライン分析用のデータベース統合、モデルシステム内での細胞反応の効果的な可視化、ならびに、オフラインおよびオンラインの学習技術(例えばアルゴリズム)が含まれる。 In a particularly preferred embodiment, the full integration of all system components, dedicated graphical user interface designed (GUI), online image analysis software, database integration for off-line analysis, effective cellular responses in the model system such visualization, and include offline and online learning techniques (e.g., algorithms).
【0093】 [0093]
さらに、別の態様において、本発明は視覚的サーボ制御光学顕微鏡観察用の画像バイオインフォマティクスシステム(すなわち「BioSig」)を提供する。 Further, in another aspect, the present invention provides an image bioinformatics system for visual servo control optical microscopy (i.e. "BioSig"). 本発明のこれらの態様により、VSOM実験用の特定の条件および刺激の関数として細胞反応をカタログ化する基礎が提供される。 These aspects of the present invention, basis cataloging cellular response as a function of the specific conditions and stimuli for VSOM experiments is provided. 本発明は、システムアーキテクチャ、実験プロトコルを表すための機能データモデル、画像分析用の新規的アルゴリズム、および統計学的分析を提供する。 The present invention is a system architecture, providing function data model for representing experimental protocol, a new algorithm for image analysis, and statistical analysis. アーキテクチャは、少なくとも1つのVSOM機器の遠隔共有操作を提供し、かつ、機器操作を画像の取得および解題と連結させる。 Architecture provides a remote shared operation of at least one VSOM equipment, and is connected to the acquisition and synopsis of equipment manipulating images. 好ましい態様において、情報は、オブジェクトおよびその関連を永続的に保存できるオブジェクト指向データベースに保存される。 In a preferred embodiment, information is stored in an object-oriented database that can permanently store object and its related. 特に好ましい態様では、アルゴリズムは個々の細胞から細胞下レベルで生理学的情報を抽出し、それを細胞反応および最終的な生物学的帰結にマッピングする。 In a particularly preferred embodiment, the algorithm extracts the physiological information from the individual cells at the subcellular level, it maps to the cell reaction and ultimate biological consequences.
【0094】 [0094]
VSOMシステムはいくつかの好ましい態様において、定期的に画像を取得し、それらの画像をセグメント化し、数百の細胞を含む視野について細胞反応を測定し、かつ、それらの反応をアーカイブシステムに記録する、ワークフローモデルを使用する。 In VSOM system some preferred embodiments, regularly obtain images, segmenting these images, the field of view containing hundreds of cells to determine cell reaction, and to record their reactions to the archive system , to use the workflow model. これらの反応により、個々の細胞反応の有向測定および追跡が可能になる。 These reactions allows directed measurement and tracking of individual cell responses. 次に、ウェブベースのインターフェースを介してアーカイブシステムを閲覧することおよびアーカイブに問合せすることができる。 Then, it is possible to contact the possible and archive browse the archive system via a web-based interface. 生データ、セグメント化の結果、およぼ対応するメタデータ(例えば、2.5時間にわたる反応の計算結果)の閲覧の例。 Raw data, the segmentation results, adversely example of browsing corresponding metadata (e.g., calculation results of the reaction over 2.5 hours).
【0095】 [0095]
本発明によって克服された重大な課題の1つは、生物学的実験では大きな母集団による試験が必要であり、かつ、離れた特徴と解題データとを相関させる必要があるという事実に関するものである。 One of the significant challenges that have been overcome by the present invention, a biological experiment requires testing by a large population, and it relates to the fact that it is necessary to correlate the distant features and precis data . 本発明は、複数の標的に関する位置および発現の情報を位置参照および形態学的特徴とともに記録するデータベースを作成するための、統合された画像取得、解題、および階層的画像抽出用の画像バイオインフォマティクスシステムを提供する。 The present invention, for creating a database for recording information on the position and expression for a plurality of targets with the position reference and morphological characteristics, integrated image acquisition, image bioinformatics system for precis, and hierarchical image extraction I will provide a. 統計ツールおよび可視化ツールが統合され、仮説検証およびデータマイニングを可能にする。 Statistical tools and visualization tools are integrated, allowing the hypothesis testing and data mining. これは、遠隔鏡検法(telemicroscopy)開発用のインフラストラクチャを強化および拡張することにより実現される(例えば、Parvinら、「考察:分散鏡検法およびインフォマティクス用のチャネル(Deep This is achieved by reinforcing and expansion remote microscopy to (Telemicroscopy) infrastructure for development (e.g., Parvin et al., "Study: Distributed microscopy and channel for Informatics (Deep
View: A Channel for Distributed Microscopy and Informatics)」、IEEE高性能コンピューティングとネットワーキング会議(IEEE View: A Channel for Distributed Microscopy and Informatics) ", IEEE high-performance computing and networking conference (IEEE
Conf. Conf. on High Performance Computing and Networking)[1999]、および、Parvinら、「分散機器用の宣言的フロー制御(Declarative on High Performance Computing and Networking) [1999], and, Parvin et al, declarative flow control for the "Distributed equipment (Declarative
Flow Control for Distributed Instrumentation)」、IEEEグリッド・クラスターコンピューティングの国際シンポジウム(IEEE Flow Control for Distributed Instrumentation) ", IEEE grid cluster computing of the International Symposium (IEEE
Int. Int. Symposium on the Grid and Cluster Computing)、2001年5月を参照)。 Symposium on the Grid and Cluster Computing), referring to the May 2001). 本発明は、種々の新規的な構成要素を提供し、構成要素には以下のものが含まれるがこれらに限定されることはない:画像取得用の分散アーキテクチャ、細胞下レベルで構造および機能を特徴付けるための新規的アルゴリズム、特定の刺激に対する各細胞の反応のアーカイビング、ならびに、機器を特定の状態に駆動するための反応計算結果の使用。 The present invention provides various novel construction elements, components will not be but include: being limited to a distributed architecture for image acquisition, the structure and function in subcellular level new algorithms for characterizing, archiving of the reaction of each cell to a particular stimulus, as well as the use of the reaction the calculation result to drive the device in a particular state.
【0096】 [0096]
D. D. インフォマティクス特に好ましい態様において、インフォマティクスシステムは、データモデル、プレゼンテーションマネージャ、およびクエリーマネージャを含む。 In informatics particularly preferred embodiment, informatics system includes a data model, Presentation Manager and query manager. 開発、試験、および保守を容易にするためこれらのサブシステムは切り離される。 Development, test, and these subsystems for facilitating maintenance is disconnected. データモデル構成要素の目的は、必要な解題データを取得し、かつ、それらを仮説の信号および反応の経路を表す計算された画像表現と連結させることである。 The purpose of the data model components acquires precis necessary data, and is to cause them to be connected to the computed image representation representative of the path signals and the reaction hypothesis. モデルはオブジェクト指向であり、解題と測定された特徴データとの二方向追跡が可能である。 Model is object-oriented, it is possible to two-way tracking of the feature data measured and precis. プレゼンテーションマネージャは、基礎となるデータモデルの変化に関わらずユーザーインターフェースの配線が回避され、かつ実行時に構成されるインターフェースがより柔軟となるよう、データモデルとユーザーフェースとの間のマッピングを含む少なくとも2つの個別の特徴を提供する。 Presentation Manager is avoided the user interface wiring regardless of changes in the underlying data model, and to interface configured at runtime is more flexible, at least 2 that contains mappings between data model and the user face One of providing separate characteristics. さらに、テキストまたはグラフィックによる特定のクエリーの表示機能が提供される。 Further, the display functionality of a particular query by text or graphics is provided. クエリーマネージャは、高レベルのユーザークエリーを、データモデルを実行するJavaオブジェクトにマッピングする。 Query Manager, a user queries a high level, maps to a Java object that executes the data model. したがって、好ましい態様において、本発明は、データベースの詳細な操作を単純化しかつエンドユーザーから隠蔽する。 Accordingly, in a preferred embodiment, the present invention is concealed from simplified and the end user a detailed operation of the database.
【0097】 [0097]
1. 1. データモデル図6パネルAに示す態様のデータモデルはオブジェクト指向であり、特定のプロジェクトを、画像の集合から計算された特徴にリンクする。 Data model aspects shown in the data model Figure 6 panel A is object-oriented, a specific project, linking the calculated features from the set of images. リンクは二方向性であり、任意のエンドポイントから情報を追跡することが可能である。 Link is bidirectional, it is possible to track information from any endpoint. 各プロジェクトは、試験にリンクされた各自のデータベースを有する。 Each project has its own database, which is linked to the test.
【0098】 [0098]
2. 2. プレゼンテーションマネージャプレゼンテーションマネージャは、データベースの閲覧とクエリー機能の結果の可視化という2つの主たる特徴を有する。 Presentation Manager Presentation Manager has two main features of the results of visualization of the browsing and query function of the database. データベースの閲覧は、解題データ、画像、および対応する特徴を取得するあらかじめ定義されたスキーマに対して実施される。 Browse the database is precis data, image, and obtains the corresponding features is performed on the pre-defined schema. 図6パネルAに示すデータモデルはXSD(XMLスキーム)で表現され、プレゼンテーションマネージャがこの表現と対応するスタイルシート(XSL)とを用いて閲覧および更新用にデータベース内にビューを構成する。 Data model shown in FIG. 6 panel A is expressed in XSD (XML scheme), the presentation manager comprise the view in a database for viewing and updating by using the corresponding style sheet (XSL) and this expression. この態様においては、より柔軟でかつ動的に生成されたユーザーインターフェースに有利となるようGUIの配線はバイパスされる。 In this embodiment, the GUI wiring bypass so as to be advantageous for more flexible and dynamically generated user interface. 一般的には、このようなマッピングにより複雑な実行上の問題が生じる可能性がある。 In general, there can occur a complex execution problems by such mapping. しかし本発明は、プレゼンテーションシステムを単純化することによって、1つの層の閲覧と更新とを同時に行うことを可能にしている。 However, the present invention is, by simplifying the presentation system, it is made possible to perform the viewing of one layer updates and at the same time. 「層」とは、関連(association)、集合(aggregation)、および継承(inheritance)によってリンクされたオブジェクトと他のオブジェクトとの間のナビゲーションを指す。 By "layer", associated (association), it refers to the navigation between the aggregate (aggregation), and inherited objects and other links by (inheritance) object.
【0099】 [0099]
1つの態様において、各科学実験は、特定の時点における細胞の母集団に対応する数までの画像を含んでいてもよい。 In one embodiment, each scientific experiments may include an image up to the number corresponding to the population of cells at a particular point in time. 多くの場合、各時点において、そのセットの平均的な挙動を特徴付けるいくつか(2〜3)の画像を用いて画像の集合を可視化することが必要である。 Often, at each time point, it is necessary to visualize the set of images using the images of several (2-3) to characterize the average behavior of the set. 平均的な挙動は特定の特徴の観点で表現されることが多い。 Average behavior is often expressed in terms of a particular feature. 本発明により、ある時点の画像の集合の代表物に各画像が対応する、一連の画像を構成することが可能である。 The present invention, each image corresponding to the representative of the set of images of a certain point in time, it is possible to construct a series of images. さらに、プレゼンテーションマネージャはクエリー機能の結果をテキストまたはグラフィックで表示することができる。 Moreover, the presentation manager may display the results of the query feature in text or graphics. グラフィックスには、化合物の特徴を独立変数の関数として表示する用量反応プロット図および散布図が含まれる。 The graphics include a dose response plot and scatter plot displaying the characteristics as a function of the independent variables of the compounds.
【0100】 [0100]
3. 3. クエリーマネージャクエリーマネージャは、可視化および仮説検証を補助するためのあらかじめ定義されたオペレータのセットを提供する。 Query Manager query manager provides a predefined operator set of to assist visualization and hypothesis testing. これらのオペレータは、計算された特徴とそれに対応する解題データとの間のコントラストの描写を補助し、かつ、分散分析および主成分分析(PCA)など種々の統計学的方法を実行する。 These operators, to assist the depiction of contrast between the calculated feature and precis data corresponding thereto, and performs a variety of statistical methods such as variance analysis and, principal component analysis (PCA). いくつかの態様では、これらのオペレータにより細胞反応を最終的なモデル再構成用に解読することが可能である。 In some embodiments, it is possible by these operators decrypting the cell reaction for the final model reconstruction. オブジェクト指向データベースでは、計算される特徴がそれぞれそのソース(例えば細胞培養物または動物)にマッピングされる必要があるため、分散分析などの測定が単純化される。 In an object-oriented database, because the features to be calculated needs to be mapped to its source respectively (e.g. cell culture or animal), which simplifies the measurement of such analysis of variance. このような高レベルのオペレータの1例としては、独立変数に対する、計算された特定の特徴の相関付けがある。 Such as an example of high-level operator, for independent variables, there is a correlation of the calculated specific features. 本発明は、データベース操作へのユーザークエリーのマッピング、結果の計算、および計算結果のディスプレイマネージャへの転送を行うための視覚クエリーインターフェースを提供する。 The present invention provides a visual query interface for user queries mapping to database operations, calculation of results, and the calculation result transferred to the display manager. いくつかの態様において、実際の計算には、ディスプレイを目的とした分散分析(例えば、特定の測定結果を複数の独立した試料に関連付けるため)またはPCA(例えば、計算された特徴ベクトルの低次元化)が含まれる。 In some embodiments, the actual calculation, ANOVA for the purpose of display (e.g., for associating a specific measurement result into a plurality of independent samples) or PCA (e.g., dimension reduction of the calculated feature vectors ) are included.
【0101】 [0101]
4. 4. 核の抽出細胞の副区画の自動描写は、印加された刺激に対する細胞の反応をモニターする上で重要な段階である。 Automatic delineation of subcompartments nuclear extraction cells is an important step in monitoring the response of cells to applied stimuli. 一部の場合では、関心対象の細胞が互いに接触または重複し、したがってセグメント化が困難なことがある。 In some cases, the cells are in contact or overlap of interest, thus segmentation can be difficult. 本発明の開発過程で利用した従来のアプローチでは(例えば、CongおよびParvin、Patt.Recog.、33:1383−1393 [2000]; ならびに、Parvinら、「Biosig:細胞内シグナルの機構研究のためのバイオインフォマティクスシステム(Biosig:A Bioinformatic System for Studying the Mechanism of Inter−Cell Signalling)」、IEEE In the conventional approach utilized in the development process of the present invention (e.g., Cong and Parvin, Patt.Recog, 33:. 1383-1393 [2000]; and, Parvin et al., "Biosig: for mechanism study of intracellular signal bioinformatics system (Biosig: A bioinformatic system for Studying the Mechanism of Inter-Cell Signalling) ", IEEE
Inter. Inter. Sympos. Sympos. Bio−Informatics Biomed. Bio-Informatics Biomed. Engineer. Engineer. 、pages 281−288 [2000]を参照)、大域的に一貫性のある方法で核の集塊を仕切るため、ステップエッジとルーフエッジの両方を使用した。 See pages 281-288 [2000]), to partition the nucleus agglomerates with globally consistent method, using both step edges and the roof edge. ステップエッジは核と背景との間の境界に対応し、ルーフエッジは隣接する核との境界に対応する。 Step edge corresponds to the boundary between the core and the background, the roof edge corresponding to a boundary between adjacent nuclei. このシステムに固有な特徴の1つは、各仮説の超二次関数的表現と、大域一貫性のためにこの表現を用いたこととにあった。 One unique feature of this system includes a Superquadrics representation of each hypothesis, it was due to the global consistency and for the use of this expression. 大域一貫性は、動的プログラミングで最小化した費用関数によって得た。 Global consistency was obtained by minimizing the cost function by dynamic programming. 本発明は、より単純かつより強力なアプローチを提供する。 The present invention provides a simpler and more powerful approach. 以前のアプローチにおける主たる難点は、しわ境界の検出およびグループ化によりシステムの複雑性が増し、その結果信頼性が低下したことであった。 The main difficulty in the previous approach, the complexity of the system increases the detection and grouping of wrinkles boundary, the result reliability was to dropped. 画像空間におけるそれぞれの核の投影が二次関数的であると仮定している点においては本発明もモデルベースである。 In that the projection of each of the nuclei in the image space is assumed to be a quadratic function is also model-based present invention. しかし、本発明のいくつかの好ましい態様においては、ステップエッジとルーフエッジとをグループ化する代わりに、画像のゼロ交差に対応する表現から開始する。 However, in some preferred embodiments of the present invention, instead of grouping the step edge and the roof edge, starting from representation corresponding to a zero crossing of the image. 次に、ゼロ交差画像を幾何学的制約条件および照明制約条件でフィルタリングして、核の二値化集塊を生成する。 Next, filter the zero crossing image geometric constraints and illumination constraints, to produce a binarization agglomeration of nuclei. 次に、「重心変換」とよばれる過程により核集塊を複数の核に仕切る。 Next, divide the nucleus agglomerates into a plurality of nucleus by a process called "centroid conversion". 計算プロトコルの各段階を図7パネルAに示す。 Each stage of the calculation protocol shown in FIG. 7 Panel A. 重心変換は、本質的に、局所化された質量中心に輪郭上の各点を投影する。 Centroid transformation, essentially projecting each point on the contour to localized mass center. 図7パネルBに示すように、輪郭上のノイズおよびその他のアーチファクトを除去するため、解の正規化が行われる。 As shown in FIG. 7 Panel B, for removing noise and other artifacts on the contour, the normalization of the solution is carried out.
【0102】 [0102]
a. a. エッジ検出エッジの局所化は局所座標系のゼロ交差を基礎としている。 Localization of edge detection edge is based on the zero crossing of the local coordinate system. 以下に詳細に説明するように、これらのエッジは上限の最小化に対応する。 As described in detail below, these edges correspond to the minimization of the upper limit.
【0103】 [0103]
円滑化のための正規化技術の大多数は、∫ |∇f| などの積分の最小化を基礎としている。 The majority of normalization techniques for facilitation, ∫ R | ∇f | is set to minimize the basis of integration, such as 2. しかし、この式はfの局所的性質をまったく制御できない。 However, this formula can not be completely control the local nature of the f. 換言すれば、|∇f|の大局的平均が小さくてもfが局所的に急に変化する場合があり得る。 In other words, | ∇f | global average is smaller by f the can may change locally sharply. この課題を克服する1つの方法は全点において|∇f|を最小にすることであり、これによって|∇f|の上限が最小化される。 One way to overcome this problem in all points | is to a minimized, thereby | | ∇f ∇f | limit is minimized. したがって、汎関数H(f)=sup |∇f| は、一連の次式の汎関数(式1)の「限界」であるとみなすことができる。 Thus, functional H (f) = sup R | ∇f | a series of functional of the following formula (Formula 1) can be regarded as a "limit".
【数1】 [Number 1]
汎関数 H (f) を最小にするオイラーの方程式は次式(式2)で表される。 Equations functionals H N (f) a minimizing Euler is represented by the following formula (Formula 2).
【数2】 [Number 2]
式中、下付き文字は例えば次式のような導関数を表す。 Wherein the subscript represents the derivative, such as the following equation.
【数3】 [Number 3]
第一の係数を消去し、かつN→∞とすることにより、式3が得られる。 It erases the first coefficient, and by setting N → ∞, the expression 3 is obtained.
【数4】 [Number 4]
式(3)は無限ラプラス方程式(ILE)と呼ばれるもので、広く研究されている(例えば、Aronsson、Arikv. Matematik、6:551−561[1966]; Aronsson、Arikv. Matematik、7:133−151 [1967]; Aronsson、Manuscripta Math.、41:133−151[1981]; ならびに、Evans、Electron. J. Different. Equat.、[http://ejde.math.swt.edu/Volumes/1993/03−Evans/abstr.html]3:1−9 [1993]を参照)。 Equation (3) is called the infinite Laplace equation (ILE), have been extensively studied (for example, Aronsson, Arikv Matematik, 6:.. 551-561 [1966]; Aronsson, Arikv Matematik, 7: 133-151 [1967]; Aronsson, Manuscripta Math, 41:.... 133-151 [1981]; and, Evans, Electron J. Different Equat, [http://ejde.math.swt.edu/Volumes/1993/03 -Evans / abstr.html] 3: see 1-9 [1993]). 式(2)のいくつかの重要な特性は、少なくとも1つの解が存在すること、および、妥当に弱い意味で「解」が再定義されるならばC の連続解が存在することである。 Some important characteristics of the formula (2) is at least one solution exists, and is that if "solution" in a reasonable weak meaning is redefined continuous solution of C 1 exists . さらに、fの勾配の軌跡は凸曲線または直線であり、かつ、Rには停留点|∇f|=0が存在しない。 Furthermore, the trajectory of the gradient of f is convex curve or straight line, and stationary points in R | ∇f | = 0 does not exist. 局所座標系が∇fで定義される局所座標系において、式(3)がゼロ交差(f xx +f yy =0)と等価であることは興味深い。 In the local coordinate system of the local coordinate system is defined by ∇f, equation (3) it is interesting is equivalent to the zero-crossing (f xx + f yy = 0 ).
【0104】 [0104]
式(3)を生データに適用すると、ラプラス形式より安定な(すなわち、前景と背景との間の漏れがない)ゼロ交差マップが得られる。 Applying equation (3) to the raw data, stable than Laplace form (i.e., there is no leakage between the foreground and background) zero-crossing map is obtained. このゼロ交差マップは、強度制限条件およびサイズ制限条件で容易にフィルタリング可能な誤領域を有する閉鎖輪郭をもつ。 The zero crossing map has a closed contour with readily filterable erroneous area power limitation condition and size limit conditions. フィルタリングされたセグメント画像は次に重心変換に使用される。 Filtered segment image is then used to centroid transformation.
【0105】 [0105]
b. b. テンソルベースの特徴解析ベクトル場解析は、数学および物理学などの古典的分野とともにコンピュータの視覚およびパターン認識においてもよく研究されている技術である。 Tensor based feature analysis vector field analysis is a technique has also been well studied in the visual and pattern recognition computer with the classical areas of mathematics and physics. 運動ベースの用途向けに多数の概念およびツールが開発されている。 A number of concepts and tools have been developed to the motion-based applications. 本発明は、現在の最新技術を科学画像のセグメント化および解釈に拡張する。 The present invention extends the current state of the art to segmentation and interpretation of scientific images. 強度画像f (x,y)が与えられたとき、強度画像から導出される自然ベクトル場が存在し、これはπ/2の回転をもつ傾斜場に相当する: When the intensity image f 0 (x, y) is given, there is a natural vector field derived from the intensity image, which corresponds to the inclined field with rotation of [pi / 2:
【数5】 [Number 5]
ここでの問題点は、ベクトル場「v」にノイズが多く何らかの種類の正規化を導入する必要があることである。 Here the problem is that it is necessary to introduce a vector field "v" to the noisy some type of normalization. これは次式で表される: This is represented by the following formula:
【数6】 [6]
式中、uは正規化されたベクトル場である。 Wherein, u is a vector field that is normalized. 次に、反復法により楕円PDEの解が得られる。 Next, the solution of elliptic PDE is obtained by iterative methods. 次式の単純な線形(ガウス)目盛空間モデルにより一次近似を求めることができる(Lindeberg、J.Appl. Stat、pages 225−270 [1994]): The simple linear Gaussian scale space model follows can be obtained first order approximation (. Lindeberg, J.Appl Stat, pages 225-270 [1994]):
【数7】 [Equation 7]
式中、 In the formula,
【数8】 [Equation 8]
は標準偏差が【数9】 [Equation 9] standard deviation is
であるガウス核である。 It is a Gaussian kernel is.
【0106】 [0106]
次に、ベクトル場の特異点は、密なベクトル表現のコンパクトな抽象を与える。 Then, singular point of the vector field, give a compact abstract of dense vector representation. これらの特異点は点特徴または線形特徴により特徴付けることができる。 These singularities can be characterized by point features or linear features. 点特徴には速度および鞍点が含まれる。 The point features include speed and saddle points. これらのパターンが検出された後は、対応するオブジェクトの抽出が可能となる。 After these patterns is detected, it is possible to extract a corresponding object. RaoおよびJain(IEEE Rao and Jain (IEEE
Trans. Trans. Patt. Patt. Anal. Anal. Mach. Mach. Intell. Intell. 、pages 225−270 [1994])は、基礎となるベクトル場からの特徴抽出に局所ヤコビアンを用いることによって特異点を検出した。 , Pages 225-270 [1994]) was detected singularities by using local Jacobian feature extraction from vector field underlying. しかし、本発明のアプローチはより強力であり、かつ、渦のサイズ計測も可能である。 However, the approach of the present invention are more potent, and size measurement of the vortex is also possible. 渦サイズは、凸ブロブが互いに接続または接触している場合であっても凸ブロブの位置特定を補完する。 Vortex size, even when the convex blob is connected or in contact with each other to complement the localization of convex blob. これは、基礎となるベクトル場における特異点の位置を特定するジョルダンインデックス(Index)に基づく。 This is based on Jordan index (Index) for specifying the position of the singular point in the vector field underlying. F=(u,v)をベクトル場とし、Jを臨界点をもたないジョルダン曲線とする。 F = (u, v) was used as a vector field, and Jordan curve without a critical point J. Jのインデックスは次式により定義される: The index of J is defined by the following formula:
【数10】 [Number 10]
各点PにおいてP周囲の半径Rの小円(J によって表される)が選択され、Index(J )が計算される。 Small circle with a radius R of P around at each point P (represented by J R P) is selected, Index (J R P) is calculated. 次に、以下のように流れ場(u,v)を分類することができる: Then, it is possible to classify the flow field (u, v) as follows:
1. 1. 渦のインデックスが+1 に等しい(すなわち、ベクトル場中の特異点は前述のRaoおよびJainによって与えられる)場合、および2. Index of vortices is equal to +1 (i.e., singular points in the vector field is given by the above Rao and Jain) case, and 2. 鞍点のインデックスが −1 に等しい場合。 If the index of the saddle point is equal to -1.
次式のように、ベクトル場のダイバージェンスは全点においてゼロであるから、ベクトル場に節は存在しない: As in the following equation, divergence of the vector field since it is zero at all points, no sections in the vector field:
【数11】 [Number 11]
次に、単純な検索技術により渦のサイズが推定される。 Next, the size of the vortex is estimated by a simple search techniques. 点a(x,y)が渦であるならば、そのサイズR*(x,y)は次式で定義される: If the point a (x, y) is an eddy, its size R * (x, y) is defined by the following equation:
【数12】 [Number 12]
換言すると、R*(x,y)は、J (x, In other words, R * (x, y) is, J R (x, y)のインデックスが1であり続けるような最大のRである。 index y) is the maximum of R as continue to be 1. 一次偏導関数の積分であるジョルダンインデックスは、ある意味において、強度画像の関数である。 Jordan index is the integral of the primary partial derivatives, in a sense, is a function of the intensity image. これとは対照的に、他の技術は、より多くのノイズが生じやすい高次の導関数を基礎としている。 In contrast, other techniques is based on the derivative of order easily more noise occurs. 合成画像、蛍光染料で標識した核、および透過光で観察した細胞における渦および領域セグメント化の結果を種々の図に示した。 Composite image showed nuclei were labeled with a fluorescent dye, and the results of the eddy and region segmentation in cells were observed with transmitted light in the various figures.
【0107】 [0107]
図41パネルCおよびDは、蛍光染料Hoechst 33342で標識した、生細胞および溶解した細胞の核による結果を示す。 Figure 41 panels C and D, were labeled with a fluorescent dye Hoechst 33342, it shows the results of live cells and lysed cells nuclei. 図41パネルEおよびFは、20倍の位相差対物レンズと透過光とを用いて撮像した、生細胞による結果を示す。 Figure 41 panel E and F were imaged using a 20X phase contrast objective and the transmitted light, it shows the results of live cells. 個々の細胞を位置特定する従来の技術は蛍光撮影に限られており、蛍光撮影は動的実験の設計の複雑さを増加させるため、後者の結果は重要である。 Conventional techniques for locating individual cells are limited to fluorescence imaging, since fluorescence photography is to increase the complexity of the design of the dynamic experiment, the latter result is important. 本明細書に示すデジタル画像のうち、図41パネルEおよびFのみは、10×NA0.5 Zeiss Fluar対物レンズを用いずに撮影したものである。 Of the digital image shown herein, Figure 41 panel E and F only, is obtained by photographing without using the 10 × NA0.5 Zeiss Fluar objective. 画像はすべて1024×1024であり、カメラ内のCCDチップのピクセルは6.8×6.8μであった。 All images are 1024 × 1024, CCD chips pixels in the camera was 6.8 × 6.8μ. したがって、10倍で撮影したすべての画像において、視野はおよそ高さ700μ、幅700μである。 Thus, in all of images taken with 10-fold, the field of view about the height 700 microns, a width of 700 microns.
【0108】 [0108]
c. c. 正規化した重心変換I(x,y)を元の画像とする。 Normalized centroid transformation I (x, y) of the original image. 各点(x ,y )において、等高の輪郭は次式(式4)で定義される: At each point (x 0, y 0), the contour of the contour is defined by the following equation (Equation 4):
【数13】 [Number 13]
テイラー級数を用いて上式の拡張および打切りを行うと次式(式5)が得られる: Doing extension and truncation of the above equation using a Taylor series equation (Equation 5) is obtained:
【数14】 [Number 14]
上式においてu=x−x かつv=y−y であり、または、 A u = x-x 0 and v = y-y 0 In the above equation, or,
【数15】 [Number 15]
がヘッセの行列である次式の標準形(式6) But the standard form of the following equation is the Hessian matrix (Equation 6)
【数16】 [Number 16]
において【数17】 [Number 17] in
は強度の勾配であり、かつ、w=(u, v) は局所座標系における重心である。 It is the slope of the intensity, and, w = (u, v) T is the center of gravity in the local coordinate system. 式(6)で定義される二次曲線の重心が次式(式7)の線形制限条件を満たすことは周知である: The center of gravity of the quadratic curve defined by equation (6) is a linear restriction condition is satisfied that the following equation (Equation 7) are well known:
【数18】 [Number 18]
Aが特異点でないならば、重心は直接求めることができる(すなわち、次式(式8)): If A is nonsingular point, the center of gravity can be determined directly (i.e., the following equation (Equation 8)):
【数19】 [Number 19]
しかし、これは必ずしも真ではなく、一般的に次式(式9)で定義されるゼロ集合【数20】 However, this is not necessarily true, generally following formula zero set Equation 20] as defined in (Equation 9)
は非自明である。 Is a non-trivial. さらに、これは以下の2つのカテゴリーに分類することができる。 Furthermore, it can be classified into two categories:.
1. 1. 強度の勾配がゼロである領域に対応する、均一な領域。 The gradient of intensity corresponding to the region is zero, uniform areas. 二値画像の場合、情報は輪郭上のみに存在する;および、 For binary image information is present only on the contour; and,
2. 2. グレーレベル画像中の楕円形状に対応する、不均一な領域。 Corresponding to an elliptical shape in the gray-level image, uneven areas.
【0109】 [0109]
これらの点の重心は十分に定義されない。 The center of gravity of these points are not well defined. さらに、計算の安定性の観点からは、特異点のためこれらの近い点を高い信頼度で計算することができない。 Further, from the viewpoint of the stability of the computation can not be calculated points close to that of these reliably for singularity. これらの難点に対処するためには問題を正規化する必要がある。 In order to address these difficulties it is necessary to normalize the problem. (x,y)の重心を(u(x,y), (X, y) the center of gravity of the (u (x, y),
v(x,y)) で表すと、正規化モデルは以下の式10または式11で表すことができる: v (x, y)) is represented by T, normalized model can be represented by the formula 10 or formula 11 below:
【数21】 [Number 21]
または【数22】 Or [number 22]
式中、第1項および第2項は見積誤差、第3項は制限条件の平滑度であり、α(> 0)は重さである。 Wherein the first term and the second term estimated error, the third term is the smoothness of the limit conditions, alpha (> 0) is a weight. この問題の解は「正規化重心変換」(RCT)と呼ばれる。 The solution of this problem is called "normalized centroid conversion" (RCT). 変分問題である式11のオイラー−ラグランジュ方程式は次式(式12)である: Euler's formula 11, which is a variational problem - Lagrange equation is the following equation (Equation 12):
【数23】 [Number 23]
【0110】 [0110]
偏導関数の差分近似を上述の差分方程式に代入すると、次式(式13)が得られる。 When the difference approximation of the partial derivatives substituted into differential equation above, the following equation (equation 13) is obtained.
【数24】 [Number 24]
上式は次式(式14)に書き直すことができる。 The above equation can be rewritten as the following equation (equation 14).
【数25】 [Number 25]
式中、(式15) In the formula, (Equation 15)
【数26】 [Number 26]
である。 It is.
これらの係数はすべて偏導関数の関数であり、かつ、(u(x,y), v(x,y))の近傍である。 All of these factors is a function of the partial derivatives, and, in the vicinity of (u (x, y), v (x, y)). 行列式(式16): Matrix equation (Equation 16):
【数27】 [Number 27]
は常に正であり、かつ、式(14)の解は次式(式17)となる。 It is always positive, and the solution of equation (14) becomes the following equation (equation 17).
【数28】 [Number 28]
したがって、推定された偏導関数および前の推定値(u ,v )から得られた推定値の新しい集合(u n+1 ,v n+1 )は次式(式18)となる。 Therefore, a new set of estimates obtained from the estimated partial derivatives and the previous estimates (u n, v n) ( u n + 1, v n + 1) becomes the following equation (equation 18).
【数29】 [Number 29]
【0111】 [0111]
e. e. 表現および分類生細胞の撮像、および一般的に蛍光顕微鏡撮像は、構造情報と機能情報とを分離するために多スペクトルであることが多い。 Imaging of representation and classification cells, and generally fluorescence microscopy imaging are often multi-spectrum to separate the structural information and functional information. いくつかの態様においては、試料を蛍光染料で標識し、360nmでの撮像により核の情報(例えば、形状および構成)を得る。 In some embodiments, labeled sample with a fluorescent dye, to yield kernels of information by the imaging at 360 nm (e.g., shape and configuration). 反応は他の励起波長(例えば、490 nmおよび570 nm)で撮像される。 The reaction is captured by the other excitation wavelength (e.g., 490 nm and 570 nm). 本発明のいくつかの態様においては、それぞれの核は楕円および超二次関数で表現され、その反応は他のチャネルで直接読み取られる。 In some embodiments of the present invention, each of the core is represented by an ellipse and Superquadrics, the reaction is read directly by other channels.
【0112】 [0112]
楕円のフィッティングは、4ac−b =1の制約条件を受ける多項式F(a,x)=ax +bxy+cy +dx+ey+fのパラメータの推定に基づいて行われる(Fitzgibbonら、Proc.Intl. Conf. Patt. Recogn.、253−257 [1996])。 Ellipse fitting, 4ac-b 2 = 1 the restricted condition polynomial F (a, x) = ax 2 + bxy + cy 2 + dx + ey + performed based on the estimation of the parameters of f (Fitzgibbon et al., Proc.Intl. Conf. Patt. Recogn., 253-257 [1996]).
【0113】 [0113]
2Dの超二次関数(Hanson、Comp. Vision Graph. Image Proc.、44:191−210 [1988]; および、Kumarら、IEEE 2D of Superquadrics (Hanson, Comp Vision Graph Image Proc, 44:... 191-210 [1988]; and, Kumar et al., IEEE
Trans. Trans. Patt. Patt. Anal. Anal. Mach. Mach. Intell. Intell. 、17:1079−1083 [1995])は、次式(式19)で定義される閉曲線である。 , 17: 1079-1083 [1995]) is a closed curve defined by the following equation (equation 19).
【数30】 [Number 30]
γ > 0であることから(Roskelleyら、Curr. Opin. Cell Biol.、7:736−747 [1995])、次式(式20)が得られる。 Since it is γ i> 0 (Roskelley et al, Curr Opin Cell Biol, 7: ... 736-747 [1995]), the following equation (equation 20) is obtained.
【数31】 [Number 31]
上式は各iの平行線セグメントの対に対応する。 The above equation corresponds to a pair of parallel lines segments of each i. これらの線セグメントは、その中に超二次関数が制限される凸ポリトープを(大きいγについて)定義する。 These line segments are convex polytope Superquadrics is limited therein (for larger gamma) defined. この表現は、対称でなくてもよい幅広い形状について有効である。 This expression is valid for good broad shape may not be symmetrical. パラメータA およびB は結合線の傾斜を決定し、これら2つの間の距離γ とC とは形状の「直角度」を決定する。 Parameters A i and B i determines the slope of the connecting line, these two distances gamma i and C i between determining the "squareness" of the shape.
【0114】 [0114]
フィッティング問題は以下のとおりである。 Fitting problem is as follows. n個のセグメント【数32】 n segments [number 32]
のm個のデータ点P =(x , y )、j=1, 2, . The m data points P j = (x j, y j), j = 1, 2,. . . , mが与えられたとする。 , And m are given. 費用関数は次式(式21)で定義される: The cost function is defined by the following equation (equation 21):
【数33】 [Number 33]
式中、 In the formula,
【数34】 [Number 34]
∇は勾配オペレータ、λは正規化パラメータ、Q は制約条件項である(Kumarら、IEEE Trans. Patt. Anal.Mach. Intell.、17:1079−1083 [1995])。 ∇ is the gradient operator, lambda is a normalization parameter, Q i is constraint section (Kumar et al., IEEE Trans Patt Anal.Mach Intell, 17 :.... 1079-1083 [1995]). パラメータA 、B 、C 、およびγ は、レベンバーグ−マーカー(Levenberg−Marquar)の非線形最適化法(Pressら、「Cにおける数値レシピ(Numerical Parameters A i, B i, C i , and gamma i is Levenberg - nonlinear optimization method of the marker (Levenberg-Marquar) (Press et al, Numerical Recipes in "C (Numerical
Recipes in C)」、Cambridge University Press [1992])を用いて、適切な初期推測値からεを最小化することによって計算される(Kumarら、IEEE Recipes in C) ", Cambridge University Press [1992]) using, it is calculated by minimizing the ε from the appropriate initial guess (Kumar et al., IEEE
Trans. Trans. Patt. Patt. Anal. Anal. Mach. Mach. Intell. Intell. 、17:1079−1083 [1995])。 , 17: 1079-1083 [1995]). 画像中のそれぞれの核はルーメン中の位置によってさらに分類される。 Each nucleus in the image is further classified by the location in the lumen. 図8に、画像中の核の楕円フィッティングおよび分類の例を示す。 Figure 8 shows an example of an ellipse fitting and classification of nuclei in the image.
【0115】 [0115]
f. f. 正規化した重心変換の解析本発明の1つの態様において、画面内の核の抽出は周知の形態学的オペレータと異なる。 In one aspect of the analysis the present invention centroid transformation normalized extraction of nuclei within the screen differs from the known morphological operators. 1つの具体的な技術は、画像を三次元構造として捉える分水界変換である(例えば、NajmanおよびSchmidt、IEEE One specific technique is watershed transformation to capture images as a three-dimensional structure (e.g., Najman and Schmidt, IEEE
Trans. Trans. Patt. Patt. Anal. Anal. Mach. Mach. Intell. Intell. 、18:1163−1173 [1996]を参照)。 , 18: 1163-1173 see [1996]). 画像をその局所極小からフラッドさせ、かつ異なる局所極小に由来する領域の併合を抑止することによって、画像は、流域(catchment)および盆地(basin)、ならびに分水界線(wathershed Image was flood from the local minimum of and by arresting the merging of regions from different local minima, images, basins (Catchment) and basin (basin), and watershed lines (Wathershed
line)に分割される。 It is divided into line). 別の態様では、このような分割は、各エッジ点から局所極小への下流経路を発見することによってエッジから開始される。 In another aspect, such division is initiated from the edge by finding the downstream path to the local minimum from each edge point. 分水界変換は、隣接領域を併合するために複雑な形態学的オペレーションを必要とする過剰セグメント化につながる。 Watershed transformation leads to over-segmentation requiring complex morphological operations to merge neighboring regions. 対照的に、本発明の好ましい態様では、二値化した画像から開始し、続いて、核に属する境界点をつぶして単一の点にする。 In contrast, in a preferred embodiment of the present invention, starting from the binarized image, followed by a single point crush boundary points belonging to the nucleus. ただし、自然の分割を明らかにするために境界点を局所盆地に移動させるという観点からは、分水界変換および重心変換も同じ発想である。 However, from the viewpoint of moving the boundary points in a local basin to reveal the nature of the division, watershed transformation and centroid transformation are the same idea. この方法を用いると、距離変換に対応するエネルギーランドスケープは多数の局所極小を示す。 Using this method, the energy landscape corresponding to the distance conversion indicates the number of local minima. 対照的に、正規化重心変換は、単一の局所極小をもつ滑らかなエネルギーランドスケープを有する。 In contrast, the normalized centroid transformations, has a smooth energy landscape with a single local minimum.
【0116】 [0116]
重心変換は本質的に、二値ブロブを、各凸領域が核または他の副区画に対応するような別個の凸領域に分割する。 Centroid transformation is essentially a binary blob, each convex region is divided into separate convex region as corresponding to the nucleus or other sub-partition. 分割は進化的であり、かつ、自然境界に沿って生じる。 Division is evolutionary and occurs along natural boundaries. 対照的に、本発明の開発過程で実施された早期の研究では(例えば、CongおよびParvin、Patt.Recog.、33:1383−1393 [2000]を参照)、このような分割は必ずしも対象の自然境界に沿って生じなかった。 In contrast, in the study early, which is carried out during the development of the present invention (e.g., Cong and Parvin, Patt.Recog, 33:. 1383-1393 see [2000]), such division is a natural always eligible It did not occur along the boundary.
【0117】 [0117]
したがって、本発明は、生物学的反応(例えば生物学的機能)を惹起する種々の刺激(例えば外因的に印加された刺激)の結果として細胞間に発生するシグナルのより詳細な像を得るのに有用な、鏡検法および画像分析に対するバイオインフォマティクスアプローチのための方法を提供する。 Accordingly, the present invention is to obtain a more detailed image of the signal generated between the cells as a result of a variety of stimuli that elicit a biological response (e.g., biological function) (e.g., exogenously applied stimuli) useful provides methods for bioinformatics approach to microscopy method and image analysis. これらの方法は後により詳細に説明する。 These methods are described in greater detail below.
【0118】 [0118]
重要な点として、本発明のVSOMは、本発明者らの以前の研究でより詳細に報告されている分散型の鏡検法とインフォマティクスとのためのチャネルであるDeepViewとのインターフェースに適している。 Importantly, VSOM of the present invention is suitable for interfacing with DeepView a channel for the distributed microscopic examination method and informatics as reported in more detail in previous studies of the present inventors . Deep Viewは、任意の機器をそのフレームワークに追加するための拡大縮小可能なインターフェースである。 Deep View is scalable interface for adding any equipment that framework. Deep Deep
Viewはまた、ワイドエリアネットワーク上でデータを転送および閲覧するための手段も提供する。 View also provides a means for transferring and viewing data over a wide area network. システムは、その特性の広告(advertisement)を介して標的の機器と相互作用する総称GUIを有する。 System has a generic GUI that interact with a target device via the ad (Show advertisement) of its characteristics. VSOMの場合、関係する特性はコンピュータ制御のシリンジ、シャッター、およびXYステージ、Z軸フォーカスモーター、フィルタホイール、ならびにカメラ制御パラメータである。 For VSOM, relevant characteristics computer controlled syringe, shutters, and an XY stage, Z-axis focus motor, a filter wheel as well as a camera control parameter. この、機器の広告性能(機能性)の概念は、より一様なインターフェースをもたらし、かつ、ソフトウェアが再使用可能であることにより維持管理費用を低減させる。 This concept equipment ad performance (functionality) provides a more uniform interface, and software to reduce maintenance costs by reusable.
【0119】 [0119]
E. E. セグメント化前述のように、核および細胞質の自動描写は、細胞反応を特定の細胞区画にマッピングする上で重要な段階である。 As in segmented aforementioned automatic delineation of the nucleus and cytoplasm is an important step in order to map the cellular response to specific cell compartments. この計算構成要素はVSOMシステムと相互作用して1つまたは複数のチャネルから画像データを取得する(例えば、フィルタホイールを回転させるまたはシャッターを開閉させることによって)。 This calculation component acquires image data from one or more channels interact with VSOM system (e.g., by opening and closing the or shutter rotating the filter wheel). 単一のチャネルから取得した画像のセグメント化は前述のとおりである。 Segmentation of images acquired from a single channel are as described above. 以下に、多チャネルのセグメント化の概要を説明する。 Hereinafter, an outline of a segment of a multi-channel.
【0120】 [0120]
多チャネル画像の分析では、長時間を要する種類の、別のデータ収集が発生する。 Analysis of multi-channel image, the type requiring a long time, another data collection occurs. このシナリオでは、細胞の異なる構成要素を強調するため、異なる蛍光プローブを用いかつ異なる励起フィルタを使用して細胞が撮像される。 In this scenario, to emphasize different components of cells, the cells are imaged using and different excitation filters with different fluorescent probes. この場合、システムは、複数のデータのチャネルの同時分析、特定の細胞内要素の選択、および繰り返し測定が可能でなければならない。 In this case, the system, simultaneous analysis of the channel of the plurality of data must be capable of selecting a particular intracellular components, and repeated measurements. ベイズフレームワークに基づいた融像のための効率的なアプローチが開発されている。 Efficient approach for fusion based on Bayesian framework has been developed. 本発明の開発中に行われた研究で示されているように(Parvinら、AAAI As shown in studies conducted during the development of the present invention (Parvin et al., AAAI
Symp. Symp. Appln. Appln. Comp. Comp. Vis. Vis. Med. Med. Imaging [1995]を参照)、このアプローチは(共焦点鏡検法を用いた)3Dにも拡張可能である。 See Imaging [1995]), this approach can be extended to 3D where (using confocal microscopy). データ融合の目的は、セグメント化および標識のための異なる様式を補完的に処理することである。 The purpose of the data fusion is to handle the different modes for segmentation and labeling complementary manner. この見地から、セグメント化手順によりデータ領域中の各ピクセルが相応に標識される必要がある。 From this standpoint, it is necessary to each pixel in the data area is labeled correspondingly by segmentation procedure. しかし、標識処理を複雑化しうる曖昧さが多数存在する。 However, ambiguities may complicate the label process there are many. これらの曖昧さは、局所処理のみから、および、高レベルのフィードバックの不在により、生じる可能性がある。 These ambiguities are only local treatment, and, by the absence of high levels of feedback, may occur.
【0121】 [0121]
曖昧さの発生源には、ノイズによるデータの破損、局所特徴を抽出するアルゴリズムの性能の限界、および、標識タスクを妨げる不必要な特徴の存在が含まれる。 The ambiguity of the source, data corruption due to noise, the performance of the algorithm for extracting the local feature limits, and include the presence of unwanted features that prevent labeling task. 領域セグメント化の1つの局面では、ヒストグラムの分析により達成される、各領域の平均強度の推定が行われる。 In one aspect of the region segmentation is achieved by analysis of the histogram, the estimation of the average intensity of each region is performed. いくつかの態様において、ヒストグラムのピークの最初の位置が近似され、次に最小二乗近似により精密化される。 In some embodiments, the first position of the peak of the histogram is approximated, is then refined by least squares approximation. 計算過程の次の段階では、これらのピークをクラスター中心として使用して画像空間内の局所一貫性を高める。 In the next step of the calculation process, increasing the local coherence in the image space using these peaks as cluster centers. このとき、多チャネル情報に基づいて画像を標識するためにベイズフレームワークが使用される。 At this time, the Bayesian framework is used to label the image on the basis of the multi-channel information. 具体的には、本発明は3つのレベルをもつベイズ階層モデルを使用する。 Specifically, the present invention uses a Bayesian hierarchical model with three levels. 第一レベルは基本的な分類Zのモデルである。 The first level is a model of basic classification Z. 理想的な条件下では、M個の異なる様式(例えば、青、緑、および赤の蛍光発光にそれぞれ対応する3つの蛍光画像)でZを観察することにより、画像システム中の種々のノイズにより破損されるデータの理想的な表現X が特定される。 Under ideal conditions, M-number of different ways (e.g., blue, green, and respectively the fluorescent emission of the red three corresponding fluorescence image) by observing Z, the damage by various noises in the image system the ideal representation X i of the data to be is identified. 階層の第三レベルはデータY の実際の観察結果に対応する。 The third level of the hierarchy correspond to the actual observations data Y i. 第一レベルは、マルコフランダム場(MRF)を事前確率密度関数とともに、正のパラメータをもつイジング模型の形式で使用する。 First level, Markov random field a (MRF) with the prior probability density function is used in the Ising model with a positive parameter format. このパラメータは近傍ピクセル間の協力を促進する。 This parameter facilitates cooperation between neighboring pixels. ベイズフレームワークにおいて、画面の内容に関する事前の無知性(ignorance)があるという仮定を設定してもよい。 In Bayesian framework, it may be set assuming that there is pre ignorance of (ignorance) about the contents of the screen. 第二レベルは、Zが与えられたときの条件的な従属変数としてXをモデル化する(すなわち、P(X ,...,X Z)=P(X Z) ... P(X Z)。ある分類が細胞質としてラベル付けされるのであれば、緑チャネル(すなわち細胞質)および青チャネル(すなわち核)の理想的反応は互いに影響しないので、これは妥当である。階層の第三レベルであるY はガウス分布としてモデル化される。その結果、Y はX の局所的にぼやけた表現となる。完全なモデルは次式(式22)として表される: Second level models the X as conditional dependent variables when Z is given (i.e., P (X 1, ..., X M Z) = P (X 1 Z) ... P (X M Z). there classification but might be labeled as cytoplasm, since the ideal response of the green channel (i.e. cytoplasm) and blue channels (ie nuclei) do not affect each other, which is reasonable. hierarchy the Y i is the third level is modeled as a Gaussian distribution result, Y i becomes locally blurred representation of X i complete model is represented as the following equation (equation 22)..:
【数35】 [Number 35]
最大事後確率(MAP)推定を用いてXiおよびZを得る。 Obtaining Xi and Z using the maximum a posteriori (MAP) estimation. ただし、MAP計算は本来的に実行不可能であるため、反復条件モード(iterative However, MAP calculation is inherently infeasible, repetition criterion mode (iterative
conditioning modes; ICM)に基づく数値近似を用いて局所最適条件を発見する(Besag、J. Roy. Stat. Soc. B、48:259−302[1986]を参照)。 conditioning modes; ICM) to find a local optimum condition by using numerical approximations based on (Besag, J Roy Stat Soc B, 48: see 259-302 [1986]).....
【0122】 [0122]
F. F. ソフトウェア本明細書に詳細に説明しているように、本明細書に記載の実験で使用したVSOMの機能アーキテクチャは、画像取得モジュール、画像分析モジュール、サーボ制御、およびアーカイブで構成される。 As described in detail in the software herein, VSOM the functional architecture used in experiments described herein, the image acquisition module, an image analysis module, servo control, and a archive. 画像取得モジュールは、6つの励起フィルタを用いて、微速度撮影の高分解能ビデオ鏡検法の手段を提供する。 Image acquisition module uses six excitation filter, provide a means of high-resolution video microscopy of lapse. このモジュールは、種々の時間周波数および励起周波数の、手動の画像取得またはあらかじめプログラムされた画像取得を可能にするレシピマネージャを有する。 This module has a recipe manager that allows the various time frequency and excitation frequency, an image acquisition or pre-programmed images acquired manually. レシピは、意味的な相互運用性を提供するXML表記法で表現される。 Recipe is expressed in XML notation provides semantic interoperability. 分析モジュールは、サイズ、位置、反応、および境界輪郭に基づいた画像の特徴ベース要約を提供する固有のセグメント化アルゴリズムを統合する。 Analysis module size, position, to integrate the reaction, and the specific segmentation algorithm that provides a feature-based summary of the image based on the boundary contour. したがって、分析モジュールは、属性付けされたグラフモデルに基づいて画像の特徴ベース要約を提供する固有のセグメント化アルゴリズムのプールを有する。 Thus, the analysis module has a pool of unique segmentation algorithm that provides a feature-based summary of the image based on the attribute-ordered graph model. その結果、グラフ中の各節は画像中の同質の領域(例えば、核、細胞質など)に対応する。 As a result, each node in the graph corresponds to the homogeneous area of ​​the image (e.g., the nucleus, the cytoplasm, etc.).
【0123】 [0123]
各節の属性には、境界輪郭、超二次関数を用いたこの輪郭のパラメトリック表現、派生する複数の特徴、および観察下における細胞内区画の反応が含まれる。 The attributes of each node, the boundary contour, the parametric representation of the contour with Superquadrics include reaction of intracellular compartments in a plurality of features, and observed under derived. グラフ中のリンクは種々の節の間の隣接関係をコードする。 Links in the graph encodes adjacencies between the various sections. 属性付けされたグラフモデルは、各細胞およびその近隣の構造的定義を完全に表現する。 Attributed to graph model is completely expresses the structural definition of each cell and its neighbors. サーボ制御モジュールは、顕微鏡付近に位置する4つのシリンジのうち任意のシリンジの流れを制御することによって組織培養容器中の種々の化合物の濃度を制御する。 The servo control module, controlling the concentration of various compounds in the tissue culture vessel by controlling the flow of any syringe of the four syringes located near the microscope. サーボ制御は3つの操作モードを提供し、各モードはレシピマネージャで連続的に登録される。 Servo control provides three operation modes, each mode is continuously registered in the recipe manager. これらのモードには以下が含まれる:(1)各化合物の流量、その開始時点、および持続時間が特定される、静的レシピ;(2)観察下における細胞の特定の反応の関数として流量および持続時間を変化させる、動的レシピモード;ならびに、(3)指定された周波数で流れをオンおよびオフにするプログラムにより制御される、変調レシピ。 These modes include: (1) flow rate, the starting point, and duration is specified, the static recipe for each compound; flow rate and as a function of (2) the specific cellular response under observation varying the duration, dynamic recipe mode; and it is controlled by a program on and off the flow (3) specified frequency, modulation recipe. アーカイブシステムは、画像、その計算されたグラフモデル、および解題データをフラットファイル環境に保存する。 Archive system image and storing the calculated graph model, and precis data to a flat file environment. 本発明の主要な特徴の1つは、複数の位置から遠隔的に操作できることである。 One of the main features of the present invention is that it can be remotely operated from multiple locations. この固有の特徴により、研究者らは地理的に離れた位置に物理的に位置していても、与えられた実験を協力して行うことができる。 This unique feature, researchers be physically located in geographically remote locations, can be performed in cooperation given experiment.
【0124】 [0124]
本発明により、ユーザーが利用できる柔軟性が最大限となる。 The present invention, flexibility available to the user is maximized. 例えばユーザーは、細胞チャンバへの灌流速度の制御、カメラ露出時間の設定、光学フィルタホイールの位置の選択、およびデータ収集のサンプリングレートの設定を可能にする、特定の実験のためのレシピを入力することができる。 For example, a user, the control of the perfusion rate into the cell chamber, setting the camera exposure time, allowing the setting of the sampling rate selection position of the optical filter wheel, and data collection, and inputs the recipe for a particular experiment be able to. 本明細書において、画像の取得および制御のための操作可能VSOMソフトウェアパッケージの好ましい態様の1つを「VX5」と呼び、別の好ましい態様の1つを「ADR」と呼ぶ。 In this specification, one of the preferred embodiments of the operably VSOM software package for acquisition and control of the image is referred to as "VX5", another one of the preferred embodiments is referred to as "ADR". VX5はシステムの静的レシピ制御用に設計されたものであり、ADRは動的レシピの視覚サーボ制御実験を局所的にまたはネットワーク上で実行するために設計されたものである。 VX5 has been designed for static recipe control system, ADR are those designed for execution on a locally or network visual servo control experiments dynamic recipe. 図14に、Deep In Figure 14, Deep
Viewの機能的アーキテクチャの略図(パネルA)、VX5実行用のXMLレシピファイルのサンプル(図14パネルC)、ポンプログ中のデータの例(図14パネルB)、および、ICSデジタル画像ヘッダの例(図14パネルD)を示す。 Functional Architecture schematic representation of View (Panel A), sample XML recipe file for VX5 run (Figure 14 panels C), examples of the data in the pump log (Figure 14 panel B), and an example of ICS digital image header shown (Figure 14 panel D).
【0125】 [0125]
G. G. 特徴ベースの画像の保存現在、保存モデルは一般的にフラットファイル上に構築されており、フラットファイルは検索および維持が困難である。 Currently stored in the feature-based image, save models generally are built on a flat file, flat file is difficult to find and maintain. 本発明は、保存取り扱いに必要なスキーマを構築するためのアクティブバイオインフォマティクスプログラムを活用する手段を提供する。 The present invention provides a means to utilize the active bioinformatics program for constructing a schema required to store handling. 1つのスキーマの設計を図15に示す。 FIG. 15 shows one schema design. この設計は、VSOMに適応させるため、および、印加された刺激に対してどの特定の細胞内区画がどの程度「反応」したかというモデルを構築するうえで有用な、特徴ベースの空間−時間データベースをつくるために拡張されたものである。 This design, in order to accommodate VSOM, and applied which specific subcellular compartments how much useful in order to build a model of how the "reaction" to the stimulus, feature-based spatial - time database it is those that have been extended in order to create a. 図16に示す多次元データベースは、各細胞内区画の反応曲線を含む細胞反応と、1つの区画から次の区画への蛍光プローブの移動との表現を提供する。 Multidimensional database shown in FIG. 16 provides a representation of the cellular responses, including response curves of each cell compartment, from one compartment with the movement of the fluorescent probe to the next compartment.
【0126】 [0126]
好ましい態様の使用中、各実験は、標本容器(例えばぺトリ皿)中の特定の物理的位置に対応する標的フレーム(すなわち画像)を含む。 During use of preferred embodiments, each experiment contains a target frame corresponding to a specific physical location in the specimen container (eg Petri dish) (i.e. image). 細胞内の構造はセグメント化され、属性グラフとして解題データとともに保存される。 Structures within the cell are segmented and precis stored with the data as attribute graph. 次に、コンピュータ制御下で生細胞に刺激を印加しながら経時的に収集した一連のデジタル画像として、標的フレームが観察される。 Next, as a series of digital images collected over time while applying a stimulation to living cells under computer control, the target frame is observed. 各区画の反応が記録され、かつ、細胞内へまたは細胞内区画間を移動する蛍光プローブの動きが追跡される。 The reaction of each compartment is recorded, and the motion of the fluorescent probe to move between intracellular or intracellular compartments is tracked.
【0127】 [0127]
保存されたデータの機能的ビューは階層的である。 Functional view of the stored data is hierarchical. 最下レベルには、生の画像および画像の対応する物理的解題が保存される。 The lowest level, the raw image and the image corresponding physical precis is stored. 次のレベルには、属性付けされたグラフモデル(すなわち構造)、対応する反応(すなわち機能)、および環境条件の動的解題(例えば、刺激の種類、流量、濃度など)が保存される。 The next level, attributed to graph model (i.e. structure), corresponding reaction (i.e. function), and dynamic precis (e.g., the type of stimulation, flow rate, concentration, etc.) of the environmental conditions are stored. 次のレベルには、化合物が種々の細胞内区画の中で再配分する際の化合物の軌跡とともに、細胞内の各区画の時間的発現が反応カーブとして要約される。 The next level, the locus of the compounds in a compound to redistribute among various intracellular compartments, temporal expression of each compartment in the cell are summarized as the reaction curve. これらの反応は観察中の全細胞について類似していなくてもよい。 These reactions may not be similar for all cells in the observation. しかし、これらの反応は、特定の種類の細胞群または類似の生理学的状態にある細胞群に各クラスターが対応するようなクラスターを生成することが予測される。 However, these reactions are expected to produce a cluster such that each cluster group of cells in a physiological state of the cell group or similar particular type corresponding. これらのクラスターは次の相関研究のために同定されなければならない。 These clusters must be identified for the next correlation study. 各クラスターは時系列事象に対応し、時系列事象は細胞の特定の細胞内区画に対応する。 Each cluster corresponds to a time-series events, time series events corresponds to a particular subcellular compartment of a cell. 各クラスターにおけるこれら反応の平均的な挙動は単値分解により表現される。 Average behavior of these reactions in each cluster is represented by a single value decomposition. 正式には、観察される反応は次式(式28)で定義される多値関数である: Formally, the reaction is observed is a multilevel function defined by the following equation (equation 28):
【数36】 [Number 36]
式中、fは時点tにおいて特定の区画で観察される平均蛍光強度、[Dye]は染料の濃度、Channelは励起フィルタの位置、Tは温度であり、Flowは注入される化合物の流れの変化に対応する。 Mean fluorescence intensity in the formula, f is observed in a particular compartment at time t, [Dye] The concentration of the dye, Channel is the position of the excitation filter, T is the temperature, Flow change the flow of the injected compound corresponding to. 以後の知識発見用に観察結果をデータベースに保存するため、この経時変化する情報を取得するためのスキーマが開発される。 To store the observations in the database for subsequent use knowledge discovery, schema to obtain information the change over time is developed. 各実験サイクルは観察した各細胞についてフィンガープリントを生成する。 Each experiment cycle generates a fingerprint for each cell observed. これらの個々の反応から、画像空間内の細胞内活動のコンパクトな表現が得られ、これは細胞ごと、細胞母集団ごと、細胞種ごとなどに可視化することができる、 These individual reactions compact representation of intracellular activity in the image space is obtained, which can be visualized for each cell, each cell population each cell type, such as,
【0128】 [0128]
H. H. 細胞反応からの学習本発明の学習技術は細胞種間の細胞特異的な差異を最適化および発見するために使用される。 Learning techniques learning present invention from a cell reaction is used to optimize and finding cell-specific differences between cell types. この文脈において、計算された反応とその組織構造および軌跡とは、最適化された細胞種識別を検索するためのその後の段階的な検索を容易にするためのモデルの開発を補助する。 In this context, the calculated reaction and its organizational structure and trajectory assists the development of models to facilitate the subsequent stepwise search for searching an optimized cell type identification. いずれの学習アプローチにおいても、その基礎には、ポリシーと、報酬と、価値と、環境のモデルとがある。 In any of the learning approach, in its foundation, there is a policy, and reward, and value, and the environment model of. モデル再構成の目的の1つは、種々のポリシーおよび報酬関数を評価することである。 One of the objects of the model reconstruction is to evaluate the various policies and compensation functions. モデルはある細胞種と別の細胞種とで異なることが予測される。 Model that differs between cell types and other cell types that are predicted. これらのばらつきはそれ自体のメリットについて重要であり、かつ、定量化すれば貴重な妥当性確認として利用できる。 These variations are important for the benefits of its own, and can be used as a valuable validation if quantified. データベース内容は、類似性測度の評価、精密化、および局在化の根拠を提供する。 Database content, evaluation of similarity measures, refinement, and provides a basis for localization. 類似性は状態および動作に基づいてクラスターを分析することにより測定される。 Similarity is determined by analyzing the cluster based on the status and operation. これらのクラスターは、同値類を確率するための、種々の反応に関する共起統計の計算を補助する。 These clusters, for the probability of equivalence classes, to assist the calculation of co-occurrence statistics for various reactions. または、細胞反応およびその対応属性(動的解題)によりあるシーケンス中の表現が生成される。 Or, expressed in a sequence in the cell reaction and their corresponding attributes (dynamic precis) is generated. この表現は次に、そのシーケンス中の共起統計を推移確率とともに構築するのに利用される。 This representation is then used to construct co-occurrence statistics in the sequence with transition probabilities. 共起統計は、代表的な特徴の集合の二値木分類の仮説設定を補助する。 Co-occurrence statistics assists binary hypothesis set tree classification of a set of representative features. この方法は、ひとつには、相関するシーケンスの検出および分類に有用である。 This method is, in part, are useful in the detection and classification of sequences correlated. さらに、一旦モデルが確立されれば、異常値を発見する手段が共起統計により得られる。 Furthermore, once the model has been established, it means for finding an abnormal value is obtained by co-occurrence statistics. 推移確率は環境の知識を提供し、環境の知識は次に強化学習に使用することができる。 Transition probability provides a knowledge of the environment, knowledge of the environment can then be used to enhance learning. さらに、細胞反応を、経時変化する線形系としてモデル化する手段が提供される。 Further, the cell reaction, a means of modeled as a linear system which changes over time are provided. 線形系は、系の挙動を特徴付けるための単純かつ強力な方法である。 Linear systems are simple and powerful method for characterizing the behavior of the system. この文脈において、可変メモリ(遅れ)を有するシステムの状態空間表現が構築され、かつ、関連する行列のパラメータが推定および検証される。 In this context, the state space representation of a system having a variable memory (delay) is constructed, and the parameters of the associated matrix is ​​estimated and verified.
【0129】 [0129]
I. I. 強化学習この相では、どのように蛍光プローブの取込みを変動させるか、および、系統的な方法で細胞内の取込みを最適化するかを学習するための開始点として既知の知識が使用される。 Reinforcement learning in this phase, how to vary the uptake of fluorescent probes, and the known knowledge can be used as a starting point for learning how to optimize the uptake of intracellular in a systematic way. これは通常「強化学習」と呼ばれ、かつ、いくつかの態様においてはマルコフ決定過程(MDP)としてモデル化される。 This is usually referred to as "RL", and, in some embodiments be modeled as a Markov decision process (MDP). 特定のMDPは、その状態(すなわち観察された反応)と、蛍光プローブの細胞内濃度の変更(例えば、生物学的阻害剤を注入する、生理学的に重要なイオンの培地内の濃度を変更する、など)を含む動作との集合によって定義される。 Specific MDP has its state (i.e. observed reaction), changes in the intracellular concentration of the fluorescent probe (e.g., injecting a biological inhibitor, to change the concentration in the medium of physiologically important ions , it is defined by a set of operations, etc.). このような系における報酬は、計算された反応の変化またはそのエピソード的勾配の変化によって測定可能である。 Compensation in such a system can be measured by the change in the calculated response or change in the episode gradient. さらに、いくつかの態様においては、次に、データベース中の同じアッセイで得られた観察結果をもとに(MDPの)推移確率が計算される。 In addition, some in the embodiment, then, based on the observation results obtained in the same assay in the database (the MDP) transition probabilities are calculated. これらの推移確率は最適ポリシー(すなわちスケジュール)を可能にする技術を提供する。 These transition probabilities is to provide a technology that enables the best policy (ie, schedule). このようなポリシーは一般的に、動的プログラミング、モンテカルロ法、および時間差分学習(TD学習)として表現可能である。 Such a policy is in general, dynamic programming, Monte Carlo method, and can be expressed as a time difference learning (TD learning). 動的プログラミングは細胞反応のモデルを必要とする。 Dynamic programming requires a model of the cell reaction. このようなモデルはデータベースから仮説設定される。 Such a model is the hypothesis set from the database. さらに、データベースが拡張するにつれてモデルへのアクセシビリティが向上する。 Further, accessibility to the model can be improved as the database expands. モンテカルロ法はモデルを必要としないが、ステップ−バイ−ステップの増分計算に適していない。 Monte Carlo method does not require a model, step - by - not suitable for incremental computation step. 一方、時間差分学習はモデルを必要とせず、かつ、完全に増分的である。 On the other hand, the time difference learning does not require a model, and is completely incrementally. しかし、これら3つの方法はすべて本発明の態様に適用可能である。 However, it is applicable to aspects of all three methods present invention. 例えば、サンプルの推移確率(完全ではないもの)が存在するならば、1つの増分ステップ(すなわち1つのエピソード)においてモンテカルロ法が使用可能である。 For example, if a sample of transition probabilities (complete is nothing) are present, the Monte Carlo method can be used in one increment (i.e. one episode). また、時間差分法はモンテカルロ法と動的プログラミングとの組合せである(すなわち、モデルなしで生の経験から直接学習し、次に、学習した推定に一部基づいて推定を更新する。) The time difference method is a combination of Monte Carlo and dynamic programming (i.e., learned directly from raw experience without model, then updates the estimated based in part on the estimated learned.)
【0130】 [0130]
J. J. 悪性および非悪性の乳房上皮細胞を識別する生理学的特徴を迅速に発見する方法原発乳房腫瘍細胞のインビトロ増殖における近年の進歩により、細針吸引(FNA)で採取した比較的少数の腫瘍細胞を培養により継代および増殖することが可能になっている(Liら、Canc.Res.、58:5271−5274 [1998])。 Recent advances in in vitro proliferation of methods primary breast tumor cells to rapidly discover physiological characteristics identifying malignant and non-malignant breast epithelial cells, cultured relatively small number of tumor cells collected with fine needle aspiration (FNA) it has become possible passaged and propagated by (Li et al., Canc.Res, 58:. 5271-5274 [1998]). 事実、悪性ヒト乳房上皮細胞(BEC)の初代培養は大きく進歩している(Bandら、Canc. Res.、50:7351−7357[1990]; Ethierら、Canc. Res.、53:627−635 [1993]; Dairkeeら、Canc. Res.、57:1590−1596[1995]; TomidaおよびTsuruo、Anti−Canc. Drug Des.、14:169−177 [1999]; ならびに、BrownおよびGiaccia、Canc.Res.、58:1408−1416 [1998])。 In fact, primary cultures of malignant human breast epithelial cells (BEC) is great progress (Band et al., Canc Res, 50:.... 7351-7357 [1990]; Ethier et al, Canc Res, 53: 627-635 [1993]; Dairkee et, Canc Res, 57:... 1590-1596 [1995]; Tomida and Tsuruo, Anti-Canc Drug Des, 14:. 169-177 [1999]; and, Brown and Giaccia, Canc. Res, 58:. 1408-1416 [1998]).
【0131】 [0131]
悪性細胞に関連したインビボ環境は、少ない酸素(すなわち低酸素)、低いpH、低レベルのグルコースレベル、および高レベルの代謝廃棄物の領域で構成されていると考えられている。 Vivo environment associated with malignant cells, less oxygen (i.e. low oxygen), low pH, are believed to be composed in the region of the low levels of glucose levels, and high levels of metabolic waste. 培養中でこれらの条件をシミュレートすると、非悪性細胞はこれらの厳しいインビトロ環境条件で生存できないため、原発乳癌細胞の比較的純粋な母集団が分離できることが示されている(Dairkeeら、前述)。 Simulating these conditions in culture, since the non-malignant cells can not survive in these harsh vitro environmental conditions, a relatively pure population of primary breast cancer cells have been shown to be separated (Dairkee et al., Supra) . 悪性のBCEは非悪性細胞より速く増殖すると広く考えられているがこれは誤解である。 BCE malignant widely believed to grow faster than the non-malignant cells but this is misleading. したがって、厳しい環境で悪性細胞の培養を提供することのもう1つの利点は、増殖速度が速い非悪性の上皮細胞が存在せずかつ腫瘍細胞を凌駕して増殖できないこことである。 Thus, another advantage of providing the culture of malignant cells in harsh environments is here and the growth rate can not grow surpasses and tumor cells there is no fast nonmalignant epithelial cells. また、腫瘍細胞の薬剤耐性は厳しい微小環境のストレスに依存するものである可能性があり、かつ、厳しい微小環境のストレスの結果である可能性がある(TomidaおよびTsuruo、前述)。 Moreover, drug resistance of tumor cells may be dependent upon the stress of severe microenvironment and may be the result of stress harsh microenvironment (Tomida and Tsuruo, above). この理由から、薬剤耐性を正確に測定するには適切な微小環境で細胞に対するアッセイを行わなけらばならない可能性があると予測されていた。 For this reason, it has been expected to accurately measure drug resistance is likely to have to have to place perform assays on cell in the appropriate microenvironment. 事実、最も成功したインビトロの化学感受性試験のいくつかでは、両端をシールし14日間インキュベートした小さな毛管で培養した細胞が使用された。 In fact, in some chemosensitivity testing of the most successful in vitro, cells cultured in small capillaries were incubated sealed at both ends 14 days were used. その結果得られた毛管内の微小環境は、サンドイッチ状態のカバーガラス法で一般的に得られるものよりさらに厳しい可能性が高い(前述のDairkeeらの文献を参照)。 Microenvironment resulting in capillary with a coverslip method sandwich state is high stricter likely than those generally obtained (see references of the above Dairkee et al).
【0132】 [0132]
さらに、培養においては、得られる細胞(最大10 個)は元の腫瘍とよく類似しており、かつ、軟寒天での増殖も含め1つまたは複数の腫瘍表現型を示す。 Further, in the culture, the cells (up to 10 7) obtained is then very similar to the original tumor, and shows growth also one including or more tumor phenotype in soft agar. 事実、乳癌中には最適以下の栄養枯渇環境が存在する(Dairkeeら、前述、TomidaおよびTsuruo前述、ならびに、BrownおよびGiaccia、前述)本発明は原発乳癌標本の培養を向上させる手段を提供する。 In fact, during breast there is suboptimal nutritional depletion environment (Dairkee et al., Supra, Tomida and Tsuruo above, as well as, Brown and Giaccia, above) the present invention provides means for improving the culture of primary breast cancer specimens. 例えば、腫瘍細胞と正常細胞とは、インキュベータのCO レベルの関数として、大きく異なるpH挙動を呈すると予測される。 For example, the tumor cells and normal cells, as a function of CO 2 levels of the incubator, is expected to exhibit significantly different pH behavior. また、各細胞腫が耐性を示すpHレンジも異なる可能性が高い。 Also, pH ranges also are likely to differ indicating each cell tumors resistant. 正味の効果としては、単一のインキュベータ内で(別々のフラスコ内で、各細胞腫が好む培地中で)これら異なる細胞種が同時に増殖できるような共通のCO レベルは存在しないことになる。 The net effect, (in separate flasks, each cell tumors in a medium like) within a single incubator so that the different cell types is not present common CO 2 levels can be simultaneously grown. 事実、正常細胞が耐性を示すpHレンジは癌細胞のそれよりはるかに狭いと予測される。 In fact, normal cells pH range resistant is expected to be much narrower than that of cancer cells. 低pH環境(<7.1)を好む正常細胞株は見つかっていない。 Normal cell lines that prefer a low pH environment (<7.1) has not been found.
【0133】 [0133]
したがって、ヒト乳癌上皮細胞の増殖成功には pH < 7.0が必要であるということが正しいならば、これまでのインビトロ化学感受性アッセイが成功しなかった理由も明らかである。 Thus, the growth success of human breast epithelial cells if the right that is required pH <7.0, why in vitro chemosensitivity assay has not been successful to date is also clear. ほとんどの培地および細胞インキュベーション条件はpH> 7.0となるよう設計されてきた。 Most media and cell incubation conditions have been designed to be pH> 7.0. したがって、ヒト腫瘍生検標本をこれらの条件下で培養すれば、付着および増殖するのは癌細胞ではなく正常細胞である。 Therefore, if cultured human tumor biopsy specimens under these conditions, is a normal cell rather than the cancer cells to adhere and proliferate. 結果として、それとは知らずに癌細胞ではなく正常細胞に対して化学感受性試験を行うことになる。 As a result, to perform the chemosensitivity test to normal cells rather than cancer cells without knowing it. これまで、臨床試験でこれらのアッセイが失敗したのはこれが理由である可能性がある。 Previously, this may be the reason for these assays fail in clinical trials. ただし、本発明を使用するには機序の理解は必要ではなく、かつ、本発明はいかなる特定の機序にも限定されない。 However, to use the invention understanding of the mechanism is not necessary, and the present invention is not limited to any particular mechanism. しかし、本発明は、正常細胞および異常細胞の形態学的形質転換をpHおよびその他の微小環境の局面の関数として(例えば、透過光中の細胞をセグメント化する能力を有するVSOMシステムによって)モニター、分析、および定量化する手段を提供する。 However, the present invention is, normal cells and abnormal morphological transformation of cells as a function of the aspect of the pH and other microenvironment (e.g., by VSOM system has the ability to segment the cells in transmitted light) monitor, analysis, and provides a means to quantify.
【0134】 [0134]
K. K. 細胞の特定視野の繰り返し観察および分析本発明はさらに、マルチウェルプレートについて本明細書に説明したのと同様の方式で、閉鎖した組織培養フラスコ内の細胞の多数の視野を繰り返し観察および撮像する手段を提供する。 Cells of a particular field of view observed repeatedly and analysis The present invention further in, for multiwell plates in a manner similar to that described herein, means for observing and capturing repeats the number of the field of view of the cells of the closed tissue culture flasks I will provide a. 透過光中で細胞をセグメント化できる能力を有することは、フラスコが顕微鏡ステージに戻されたときにVSOMシステムが細胞の同じ視野に戻り、新しい画像を取得し、かつ形態学的変化を定量化するよう、細胞の形状、位置、および相対的位置を保存できることを意味する。 To have the ability to segment the cells in transmitted light, it VSOM system when the flask is returned to the microscope stage back to the same field of cells, to obtain a new image, and to quantify the morphological changes as means that can be stored in cell shape, position, and the relative position. これは、細胞の数、相対位置、および形状に変化があった場合でもシステムが細胞の同じ視野を再度位置特定するような、視覚的サーボ制御のより機械的な用途の例である。 This number of cells, relative positions, and shapes the system even when there is a change in such a position to identify again the same field of cells, an example of a more mechanical application of visual servo control.
【0135】 [0135]
したがって、本発明のいくつかの態様において、システムは、ガラス切り用の微細仕上げホイールを使用して滅菌培養皿に軽くエッチングされた、極めて精密なグリッド(「+」)に対する相対的な位置の手段を提供する。 Thus, in some embodiments of the present invention, the system was lightly etched in a sterile culture dish using a fine finishing wheel for glass cutting, means the relative position with respect to a very fine grid ( "+") I will provide a. 培養皿は次に除去し、インキュベータに戻すかまたは適切な条件下で保管してもよい。 Culture dish was then removed, may be stored at or appropriate conditions returned to the incubator. 細胞を再撮像するときには、培養皿上の「+」を基準にしてシステムが較正され、座標(0,0)が「+」の中心に設定される。 When re-imaging the cells, the system is calibrated with respect to the "+" on the culture dish, the coordinates (0, 0) is set at the center of the "+". ユーザーは、最初の位置合わせ用に、透過光下でエッチングを容易に見ることができる。 Users for initial alignment, can be seen etching easily under transmitted light. 図52の略図に、培養皿内の細胞位置の基準となるフレームを確立する目的で、エッチングされた培養皿を使用する様子を詳しく示した。 The schematic representation of FIG. 52, in order to establish a frame of the reference cell position in the culture dish and showed in detail how to use an etched culture dish. このように、各細胞の反応を、培養皿中のその細胞の物理的位置において解題するという目的が達成される。 Thus, the response of each cell, the object is achieved that precis in the physical location of the cells in the culture dish. さらに、刺激などに対する細胞の反応を経時的にモニターするために細胞の同一視野を数時間後または数日後に観察することもエッチングにより容易になる。 Further, it facilitated by the etching observing the same field of cells to monitored over time the response of cells to such stimuli hours or days later.
【0136】 [0136]
これらの実験で使用されるシステムは、ガラス切り用の微細仕上げホイールを使用して滅菌培養皿に軽くエッチングされた、極めて精密なグリッド(「+」)に対して相対的にその位置を参照する。 System used in these experiments were lightly etched to a sterile culture dish using a fine finishing wheel for glass cutting, referring to relative its position for very precise grid ( "+") . 培養皿は次に除去し、インキュベータに戻すかまたは適切な条件下で保管してもよい。 Culture dish was then removed, may be stored at or appropriate conditions returned to the incubator. 細胞を再撮像するときには、培養皿上の「+」を基準にしてシステムが較正され、座標(0,0)が「+」の中心に設定される。 When re-imaging the cells, the system is calibrated with respect to the "+" on the culture dish, the coordinates (0, 0) is set at the center of the "+". ユーザーは、最初の位置合わせ用に、透過光下でエッチングを容易に見ることができる。 Users for initial alignment, can be seen etching easily under transmitted light. 図52の略図に、培養皿内の細胞位置の基準となるフレームを確立する目的で、エッチングされた培養皿を使用する様子を詳しく示した。 The schematic representation of FIG. 52, in order to establish a frame of the reference cell position in the culture dish and showed in detail how to use an etched culture dish. このように、各細胞の反応を、培養皿中のその細胞の物理的位置において解題するという目的が達成される。 Thus, the response of each cell, the object is achieved that precis in the physical location of the cells in the culture dish. さらに、刺激などに対する細胞の反応を経時的にモニターするために細胞の同一視野を数時間後または数日後に観察することもエッチングにより容易になる。 Further, it facilitated by the etching observing the same field of cells to monitored over time the response of cells to such stimuli hours or days later.
【0137】 [0137]
したがって本発明は、他の細胞(すなわち正常な乳腺上皮細胞)を増殖上不利にしながら特定の細胞(すなわち原発乳癌細胞)を増殖上有利にするために細胞種間の差異を同定および活用する方法およびシステムを提供するだけでなく、生細胞の増殖率を細胞ごとに定量できるVSOM蛍光アッセイも提供する。 Accordingly, the present invention is a method of identifying and utilizing the differences between cell types in order to favor the growth of certain cells (i.e. primary breast cancer cells) while other cells (i.e. normal mammary epithelial cells) disadvantage on growth and not only to provide a system also provides VSOM fluorescence assay the growth rate of viable cells can be quantitated for each cell.
【0138】 [0138]
L. L. インビトロの薬剤試験および化学感受性試験の向上本発明は、悪性細胞の増殖および分析する手段を向上させることに加えて、癌患者(例えば乳癌患者)の臨床成績を向上させるための患者志向型の治療法を容易にする、インビトロの薬剤試験および化学感受性アッセイも大幅に向上させる。 Improvement invention in vitro drug testing and chemosensitivity testing, in addition to improving the means for the proliferation of malignant cells and analysis, treatment of patients oriented for improving the clinical outcome of cancer patients (e.g., breast cancer) to facilitate law, in vitro drug testing and chemosensitivity assays also greatly improved.
【0139】 [0139]
次の名称集を用いて臨床的相関の要約を作成することができる:TP(真陽性、細胞がインビトロで感受性を示しかつ化学療法に反応する患者)、TN(真陰性、細胞がインビトロで耐性を示しかつ化学療法に反応しない患者)、FP(偽陽性、細胞がインビトロでは耐性を示すが臨床的には耐性を示す患者)、FN(偽陰性、細胞がインビトロでは耐性を示すが臨床的には反応を示す患者)、PPA(陽性予測精度)=TP/(TP−FP)、試験システムで感受性を示しかつ治療に反応した患者のパーセンテージ、および、NPA(陰性予測精度)=TN/(TN+FN)、試験システムで感受性を示しかつ治療に反応しなかった患者のパーセンテージ。 Using the following nomenclature may be create a summary of clinical correlation: TP (true positive, patient cells which respond to shown and chemotherapy sensitivity in vitro), TN (true negative, resistant cells in vitro the shown and patients who do not respond to chemotherapy), FP (false positive, the patient cells show tolerance in vitro showing a clinically tolerance), FN (false negative, resistant but clinically shown in cells in vitro patients showing a reaction), PPA (positive predictive accuracy) = TP / (TP-FP), the percentage of patients who responded to shown and treating sensitivity in a test system, and, NPA (negative predictive accuracy) = TN / (TN + FN ), the percentage of patients who did not respond to indicate the sensitive and treated in a test system.
【0140】 [0140]
インビトロの試験結果と患者の反応とのこれまでの相関データでは、総合的なPPAは72%、NPAは90%となっている。 The correlation data so far with in vitro test results and patient reactions, overall PPA is 72%, NPA has a 90%. これは、感度(すなわち、臨床的に反応性の患者を検出する能力)85%、および特異度(すなわち、非反応性の患者を検出する能力)89%に相当する。 This sensitivity (i.e., clinically reactive ability to detect patient) of 85%, and specificity (i.e., the ability to detect non-responsive patient) corresponding to 89%. これらの数値は4263名の患者を対象とした研究における7種類のアッセイの平均であり、結果は複数の個別の研究からプールされたものである(DeVita、「癌:腫瘍学の原理と実践(Cancer:Principles and Practice of Oncology)」、Lippincott−Raven、Philadelphia [1997])。 These numbers are the average of seven assays in study of patients 4263 patients, the result is one that is pooled from a plurality of individual studies (DeVita, "Cancer: Principles of oncology and Practice ( Cancer: Principles and Practice of Oncology) ", Lippincott-Raven, Philadelphia [1997]). これらのアッセイが患者の反応よりも患者の薬剤耐性を予測するのに優れていることから、これらの著者らは、これらのアッセイを「化学療法」アッセイではなく「薬剤反応性」アッセイと呼ぶことを提唱している。 Since these assays are superior to predict drug resistance of the patient than the reaction of the patient, these authors that these assays referred to as "chemotherapy" rather than assay "drug reactive" Assay It has proposed.
【0141】 [0141]
ロボット視覚技術である「視覚サーボ制御(VS)」として結合された、デジタル撮像蛍光鏡検法、デジタル画像のリアルタイム分析、およびバイオインフォマティクスデータベースは、デジタル画像の内容の分析に基づいた実験パラメータの動的操作を意味する。 Coupled as a robot vision techniques "visual servo control (VS)," Digital imaging fluorescence microscopy, real-time analysis of digital images, and bioinformatics databases, dynamic experimental parameters based on the analysis of the content of the digital image It refers to the manipulation. さらに、VSOMは複数の視野を進んでおよび戻って走査する能力を有し、かつ、これにより生細胞の非常に多数の母集団をモニターする能力を有する。 Furthermore, VSOM has the ability to willing and back scan a plurality of visual field, and has the ability to monitor a large number of populations Thus live cells.
【0142】 [0142]
前述のとおり、VSOMは、細胞単位で変化をモニターするために、関心対象の細胞の同一視野に繰り返し戻る能力をさらに提供する。 As described above, VSOM, in order to monitor changes in cell units further provides a repeating back capability in the same field of view of the cell of interest. この能力により、細胞で観察される早期の生理学的反応を、増殖かアポトーシスかまたはある細胞周期段階での停止かという細胞の将来の生物学的状態または最終運命と相関させることが容易になる。 This capability early physiological responses observed in cells, it is easy to correlate with future biological state or final fate of proliferation or apoptosis or cell that is either stopped in cell cycle stage. 事実、本発明の1つの態様は最も望ましい予測アッセイを提供する。 In fact, one aspect of the present invention provides the most desirable predictive assay. 重要な点として、これらのアッセイは動的かつ適応的である。 Importantly, these assays are dynamic and adaptive.
【0143】 [0143]
1つの態様において、適応的VSOM蛍光アッセイでは、インテリジェント的に選択されたコンピュータ制御の刺激に対する細胞の早期の生理学的反応が観察される。 In one embodiment, the adaptive VSOM assays, early physiological response of the cells to the stimulation of an intelligent manner selected computer control is observed. いくつかの好ましい態様において、これらの刺激および摂動は可逆的であり、かつ、細胞を特定の生物学的経路に永続的に付すことはない。 In some preferred embodiments, these stimuli and perturbations are reversible, and are not permanently subjected in a particular biological pathway cells. 例えば、細胞外の培地のpHを低下させながら、観察されるストレス反応に基づいて細胞の特定の部分母集団を同定する。 For example, while reducing the pH of the extracellular medium, to identify specific subpopulations of cells based on the stress response observed. システムのインテリジェント反応の1つとしては、関心対象の細胞が同定されるまで培地のpHを低下させ、次に、細胞に不可逆的な損傷が生じる前に細胞を高いpHに戻すことが考えられる。 The one intelligent reaction system, to reduce the pH of the medium to the cells of interest are identified, then it is conceivable to return to a higher pH the cells prior to irreversible damage to the cell occurs. 次に、関心対象の細胞が細胞単位で同定され、システムは、低pHの環境に対するこの差分反応を最適化および/または利用するための追加の試験を実施するために使用される。 The cells of interest are identified on a cell-by-cell basis, the system is used to conduct additional tests to optimize and / or use of the difference response to the low pH of the environment.
【0144】 [0144]
本発明はまた、抗癌剤または薬剤の組合せによって利用できる生理学的特徴を探索するため細胞を繰り返しプロービングできる能力を提供する。 The present invention also provides the ability to probing repeatedly cells to search for physiological characteristics that can be utilized by a combination of anti-cancer agents or drugs. したがって、本発明のVSOM蛍光アッセイは、好ましい態様において、細胞の複雑な混合物を用いて細胞を迅速に同定する手段であって、蛍光プローブが細胞に対して非毒性であり、印加された刺激または摂動に対する特徴的な生理学的反応に基づいて細胞が特定され、かつ、刺激または摂動が細胞に対して不可逆的影響をもたない手段を提供する。 Therefore, VSOM fluorescence assay of the present invention, in a preferred embodiment, a means for rapidly identifying cells with a complex mixture of cells, are non-toxic fluorescent probe to cells applied stimuli or characteristic cells based on physiological responses are identified to perturbations and stimuli or perturbations provides means no irreversible effects on the cells. 事実、特に好ましい態様において、本発明の予測アッセイは、インテリジェント的に選択されたコンピュータ制御の刺激に対する一連の早期の生理学的反応を観察することを含む動的かつ適応的なVSOM蛍光アッセイである。 In fact, in a particularly preferred embodiment, prognostic assays of the present invention is a dynamic and adaptive VSOM fluorescent assays comprising observing a series of early physiological responses to stimuli intelligent manner selected computer controlled. このアプローチは、このような刺激および摂動が可逆的でありかつ細胞を特定の生物学的経路に永続的に付さない場合はさらに強力である。 This approach, when such stimuli and perturbations are not permanently attached to reversible and and cells to specific biological pathway is more powerful. 比較的無害の刺激および摂動を生細胞に繰り返し印加できる能力により、抗癌剤または抗癌剤の組合せによって利用できる生理学的特徴を探索するため細胞を繰り返しプロービングすることが可能となる。 The ability to be repeatedly applying a relatively innocuous stimuli and perturbations in living cells, it is possible to probe repeatedly cells to search for physiological characteristics that can be utilized by a combination of anticancer agents or anticancer agents. 本発明のVSOM蛍光アッセイは細胞の将来の挙動および/または最終運命を良好に予測できる。 VSOM fluorescence assay of the present invention can satisfactorily predict future behavior and / or final cell fate. 例えば本発明は、細胞が増殖できるよう十分に刺激されたか、または、アポトーシスが必然となる点までストレスを受けたかを決定する手段を提供する。 For example, the present invention, or cells has been sufficiently stimulated to be grown, or apoptosis provides a means for determining a stressed to the point where the inevitable. この能力は、細胞で観察される早期の生理学的反応と、細胞の将来の生物学的状態または最終的な生物学的運命(すなわち、増殖、アポトーシス、特定の細胞周期段階での停止など)とを相関付けるのに役立つ。 This capability is a physiological response of early observed in cells, the future of the biological state or final biological fate of cells (i.e., proliferation, apoptosis, or stopping of a particular cell cycle stage) and help to correlate the.
【0145】 [0145]
本発明はさらに、以前に観察された生理学的な細胞反応の記録を含むオブジェクト指向データベースを提供する。 The present invention further provides an object-oriented database that contains a record of previously observed physiological cellular reactions. このデータベースは、VSOMアッセイの知識ベース制御を実施するうえで非常に有用な資源を提供する。 The database provides a very useful resource in the practice of the knowledge-based control of VSOM assay. このデータベースに遠隔的に(すなわち、任意のVS使用可能顕微鏡を介して)アクセスできることにより、これらの機器のインターネット上での制御が可能となり、かつ、これらの機器およびそれを操作するために必要なコンピュータの性能にかかる費用を大幅に削減しながらこれらの機器の機能性を大幅に高めることができる。 Remotely (i.e., via any VS available microscope) in the database by access enables control on the Internet of these devices, and required to operate these devices and it while significantly reducing the cost of performance of the computer can increase the functionality of these devices greatly.
【0146】 [0146]
少なくとも3つのプロスペクティブ臨床試験において、癌患者の化学療法に対する反応と生存率とを向上させるためにインビトロ化学感受性試験を使用する試みがなされている。 In at least three prospective clinical trials, an attempt to use an in vitro chemosensitivity test to improve the reaction and viability to chemotherapy in cancer patients have been made. しかし、これらの試験では、インビトロ化学感受性試験の結果に基づいて化学療法を受けた患者の生存率向上は認められなかった。 However, in these tests, survival of patients receiving chemotherapy based on the result of in vitro chemosensitivity test improvement was observed. しかし、それぞれの患者は他のどの患者とも少なくともわずかに異なる。 However, each patient differs at least slightly with any other patient. 例えば、1人の患者がある薬剤に対して有害反応を示し、別の患者が副作用をまったく経験しないということもあり得る。 For example, it shows the adverse reactions to drugs that have one patient may sometimes called another patient is not at all experienced side effects. 患者が薬剤に対して有害反応を示す場合または患者の腫瘍が薬剤に反応しない場合、医師は、効果のある薬剤を同定するため、薬剤および/または治療レジメンを変更する。 If the patient tumor cases or patients exhibit toxic responses to drugs does not respond to the drug, a physician, to identify agents which are effective to change the drug and / or therapeutic regimen. 乳癌の場合、医師は幅広い可能性の中から薬剤(または2つ以上の薬剤)を選択肢、かつ、個々の患者の腫瘍に対して最も有効でありかつ個々の患者における副作用が最小である組合せを見つけなければならない。 For breast cancer, the physician wide range of possibilities of choice of drug (or two or more agents) from, and the combined side-effects are minimal in it and the individual patient most effective against tumors of individual patients It must be found. 多くの場合、医師は各患者について一連の薬剤を試さざるを得ない(すなわち、これらは最適の治療レジメンを決定するためのインビボ薬剤反応試験である)。 Often, the physician can not but try a series of drugs for each patient (i.e., they are in vivo drug response study to determine the therapeutic regimen optimum). インビトロの薬剤反応試験には、適切な治療法を見つけるための一連の衰弱を招く試行錯誤を患者に対して行うことなしにより幅広い薬剤をより短時間で試験できるという利点が期待できる。 In vitro drug response studies advantage that trial and error causing a series of weakness to find the appropriate treatment can be tested in a short time a broad drug by without performing to the patient can be expected. したがって、40年以上にわたって、患者の体から腫瘍細胞を取り出しそれをインビトロで試験するという試みが行われてきた。 Thus, over 40 years, it attempts to test it removed tumor cells from the patient's body in vitro have been performed.
【0147】 [0147]
成功しなかったこれらの方法で使用された2つのインビトロ化学感受性アッセイは、HTCA(ヒト腫瘍クローニングアッセイ)およびDiSC(分染細胞毒性アッセイ)である。 Unsuccessful two in vitro chemosensitivity assay used in these methods are HTCA (human tumor cloning assay) and DiSC (differential staining cytotoxicity assay). これらのアッセイで使用されるインビトロの細胞培養および細胞増殖の技術、ならびに測定される生物学的エンドポイントは著しく異なる。 In vitro cell culture and cell proliferation of the techniques used in these assays biological endpoints as well as measurement, it is significantly different. HTCAでは、細切した腫瘍組織を非常に小さい毛管に入れ両端を密封し14日間インキュベートした培養物が必要である。 In HTCA, there is a need for cultures incubated sealed at both ends placed in very small capillaries tumor tissues minced 14 days. 悪性細胞と非悪性細胞とを含むこの混合物(細胞数0.2〜1.0×10 個)を毛管内に密封する前に、ヒトの血漿で観察されるピーク濃度の10分の1に相当する濃度に調整した標準的な抗癌剤に細胞を1時間曝露する。 The mixture comprising the malignant and non-malignant cells prior to sealing (cell number 0.2 to 1.0 × 10 5 cells) in the capillary, one tenth of the peak concentration observed in human plasma standard anticancer agent and adjusted to a concentration corresponding cells are exposed for 1 hour. 次に細胞を0.3%寒天に懸濁し、100μlの毛管に密封した状態で37℃かつ7%CO の環境に14日間おく。 Then the cells were suspended in 0.3% agar, put 14 days into 37 ° C. and the 7% CO 2 environment in a state of being sealed in the capillary of 100 [mu] l. 14日後に細胞を毛管から抽出し、顕微鏡を用いて手作業でコロニー数を決定する。 Cells were extracted from the capillary after 14 days, to determine the number of colonies manually using a microscope. 最初に必要な腫瘍細胞数が少なくてすみ、かつ、有意数の細胞を有するコロニーの発生が改善されたことから、この毛管クローニングシステムが使用されていた。 Corner initially small number of tumor cells required, and, since the generation of colonies was improved with a significant number of cells, the capillary cloning system was used.
【0148】 [0148]
DiSCアッセイは、試験に利用できる細胞数を増幅するために小さいポリプロピレンチューブ内で液体培地を用いて腫瘍細胞を4〜6日間培養するという非クローニング的なアッセイである。 DiSC assay is a non-cloning assays of cultured tumor cells 4-6 days using liquid medium in small polypropylene tubes to amplify the number of cells available for testing. 薬剤への曝露時間は薬剤により異なり、1時間〜4日間である。 Time of exposure to the drug varies depending on the drug, from 1 hour to 4 days. 一般的に、薬剤濃度は経験的に決定され、HTCAで使用される濃度より高い。 Generally, the drug concentration may be determined empirically, higher than the concentration used in the HTCA. 例えば、HTCAでは0.04μg/mlのドキソルビシンで1時間細胞を処理するが、DiSCでは1.2 μ/mlで1時間である。 For example, although the processing of cells for 1 hour at 0.04 [mu] g / ml of doxorubicin in HTCA, 1 hour DiSC At 1.2 mu / ml. DiSCアッセイでは、ファストグリーンを含む懸濁液中で死細胞を染色することによって細胞膜の完全性を評価する。 The DiSC assay, to assess the integrity of the cell membrane by staining the dead cells in suspension containing Fast Green. アセトアルデヒドで固定したカモ赤血球(DRBC)を内部標準として培養物に添加し、混合物全体を細胞遠心分離(cytocentrifuge)すると、生細胞は無色、死細胞およびDRBCは緑色に染色された状態で顕微鏡スライド上に収集される。 The duck erythrocytes fixed with acetaldehyde (DRBC) was added to the culture as an internal standard, whole cells centrifuged mixture (cytocentrifuge) Then, live cells colorless, dead cells and DRBC on microscope slides in a state of being stained green It is collected. 次に、生細胞を染色するためHE(ヘマトキシリン−エオシン)でスライドを対比染色する。 Then, HE to stain live cells - counterstained slides in (hematoxylin eosin). 次に、熟練技術者が顕微鏡的に細胞を腫瘍細胞または正常細胞として同定する。 Next, a skilled technician to identify microscopically cells as tumor cells or normal cells. 次に、DRBCに対する生細胞の比が決定される。 Then, the ratio of living cells to DRBC is determined.
【0149】 [0149]
上述の試験で得られるデータについて共通の一群の問題点が指摘されている。 Common set of problems have been pointed out for the data obtained in the test described above. 両アッセイとも手作業で労働集約的であり、定量化を人の判断に依存しており、かつ、これらのインビトロシステムでは一部の患者の腫瘍細胞が良好に増殖しないためしばしば結果が得られないことがある。 Labor intensive manual Both assays rely on human judgment quantification, and does not often result is obtained because the tumor cells of some in these in vitro systems patient does not grow well Sometimes. このような理由のため、これらのアッセイに対する臨床医の認知度および受容度は低い。 For this reason, awareness and acceptance of the clinician for these assays is low. したがって患者および標本の集積が困難となっている。 Therefore, the integration of the patient and the specimen is difficult. しかし、患者の腫瘍細胞に効果を示さない薬剤の同定に優れた「第二世代」の試験がこれらの試験に置き換わりつつある。 However, one study of excellent identification of agents exhibiting no effect on the tumor cells of the patient, "second generation" is being replaced by these tests. このようにいくつかの薬剤を除くことによって、医師は患者でインビボの薬剤反応試験を行う際にこれらの薬剤を考慮に入れる必要がなくなる。 By excluding some drugs this way, the physician need not take into account these agents when performing in vivo drug response studies in patients. これらの試験は、労働集約的であるものの長年利用可能となっている技術を基礎にしている。 These tests, has a technology that is a long time available but is labor-intensive to the foundation. しかし、これらの試験は労働集約的であり、かつ、人為的ミスが生じる可能性を有する。 However, these tests are labor intensive and have the potential human error occurs.
【0150】 [0150]
これまでのこうした研究が患者の反応および/または生存率に劇的な向上をもたらせなかったのは種々の要因の結果である可能性があり、こうした要因としては、微小環境(例えば、腫瘍細胞が好む微小環境がインビトロで適切にシミュレートされていなかった)、個々の細胞の生理学的反応がアッセイ中に詳しくモニターされなかった、ならびに/または、薬剤の濃度、組合せ、および曝露時間が制限されておりかつ科学的に最適化されていなかった、などがある。 Previous to this research did not cod a dramatic improvement in the reaction and / or survival of patients may be the result of various factors, as such a factor, microenvironment (e.g., tumor cells microenvironment has not been properly simulated in vitro prefers), physiological responses of individual cells was not closely monitored during the assay, and / or the concentration of the drug combination, and exposure time limit and it has been has not been scientifically optimized, and the like.
【0151】 [0151]
しかし、本発明(すなわち「第三世代」の試験の1つ)の開発中に、より進んだ細胞培養技術と、ロボット視覚およびデジタル撮像蛍光鏡検法の分野に由来する革新的な技術とが検討された。 However, during the development of the present invention (i.e. one of the test of the "third generation"), and cell culture techniques more advanced, innovative technologies derived from the field of robot vision and digital imaging fluorescence microscopy is It was investigated. 本発明の視覚サーボ制御光学顕微鏡(VSOM)は、悪性細胞と非悪性細胞(例えば乳房上皮細胞(BEC))とを識別する重要な生理学的特徴の迅速な発見などに有用である。 Visual servo control optical microscope of the present invention (VSOM) is malignant and non-malignant cells (e.g., mammary epithelial cells (BEC)) and are useful in such rapid discovery of important physiological characteristics identifying the. 前述のとおり、VSOMは、関心対象の細胞(例えば腫瘍細胞)の増殖に有利に働くインビトロの微小環境を迅速かつ自動的に生成すること、および、印加されたストレスに対する早期の生理学的反応に基づいて細胞の挙動を予測するインビトロの蛍光アッセイを生成することができる。 As described above, VSOM the in vitro microenvironment to favor the growth of cells of interest (e.g., tumor cells) to produce quickly and automatically, and, based on the early physiological responses to the applied stress cell behavior can generate a fluorescence assay in vitro to predict the Te. したがって、本発明は前述の臨床試験に関連する問題点を克服する手段を提供し、このような問題点としては、インビトロで腫瘍細胞を増殖させるうえでの困難、アッセイの過程で間隔をおいて細胞を観察する能力に限界があること、1回のアッセイで観察できる生物学的エンドポイントの数に限界があること、および、オートメーションの欠如が含まれる。 Accordingly, the present invention provides a means of overcoming the problems associated with clinical trials described above, as such problems, difficulty in growing tumor cells in vitro, at intervals during the course of the assay that there is a limit to the ability to observe the cells, that there is a limit to the number of biological endpoints can be observed in a single assay, and include the lack of automation. 本発明はまた、原発乳癌細胞(例えばヒト細胞)のインビトロ増殖と化学感受性試験とに適した微小環境条件を迅速に発見および最適化する手段を提供する。 The present invention also provides a means to quickly find and optimize microenvironment conditions suitable for in vitro proliferation and the chemosensitivity testing of primary breast cancer cells (e.g., human cells). さらに本発明は、この目的を腫瘍ごとに達成する手段を提供する。 The present invention provides a means to achieve this objective for each tumor.
【0152】 [0152]
M. M. 微小環境パラメータのモニタリング本発明は、VSOM実験に有用である重要な微小環境パラメータのオンラインモニタリングに必要なバイオセンサーおよび関連電子機器を使用する手段を提供する。 Monitoring invention microenvironment parameter provides a means of using biosensors and associated electronics required to online monitoring of critical microenvironment parameters useful for VSOM experiments. これらの実験で使用されるセンサーは灌流ラインへの直列接続に適したZABSフロースルーセンサーであると予測される。 Sensors used in these experiments are expected to be ZABS flow-through sensor suitable for series connection to the perfusion line. したがって、細胞に到達する直前の培地について複数の重要な特性を連続的にモニターおよび記録することが可能である。 Therefore, it is possible to continuously monitor and record several important characteristics for medium immediately before reaching the cell. 本発明のいくつかの態様においては、大きな透過光集光装置、温度プローブ、および真空吸引装置が存在するため、実際の細胞灌流チャンバ内にこれらのセンサーのすべてを設置するための空間が十分にない。 In some embodiments of the present invention, large transmission light condensing device, temperature probe, and since the vacuum suction device is present, the actual cell perfusion in these all space for sufficiently installation of sensor chamber Absent. したがって、培地をマイクロインキュベーションチャンバ内に連続的に灌流させながら、培地のpH、L−乳酸またはグルコース、細胞外カルシウム、およびpO をモニターする。 Thus, while continuous perfusion medium into micro-incubation chamber, to monitor the pH of the medium, L- lactic acid or glucose, extracellular calcium, and the pO 2.
【0153】 [0153]
いくつかの態様において、VSOM法では、コンピュータ制御された4つのシリンジ灌流ポンプが使用される。 In some embodiments, the VSOM method, four syringe perfusion pump is computer controlled is used. さらに、コンピュータ制御のXY走査ステージにしっかり取り付けられるようマイクロインキュベーションチャンバを改修した。 Furthermore, to repair the micro incubation chamber to be firmly attached to the XY scanning stage of computer control. 真空駆動吸引装置が余分の液体を排除し、温度プローブが温度制御用のフィードバックを提供する。 Vacuum driving suction device eliminates the excess liquid, the temperature probe to provide feedback for temperature control.
【0154】 [0154]
種々の態様において、電子機器パッケージが本発明とともに使用される。 In various embodiments, the electronic device package is used with the present invention. 例えば、電子機器パッケージ「PLUGSYS」がこれらの実験で使用される。 For example, electronics package "PLUGSYS" is used in these experiments. PLUGSYSはモジュール設計であり、その基本システムケースは、pH、L−乳酸またはグルコース、細胞外カルシウム、およびpO 等の測定に必要な種々の増幅モジュールを保持するためのスロットを十分に有する。 PLUGSYS are modular design, its base system case having, pH, L-lactic acid or glucose, extracellular calcium, and enough slots to hold a variety of amplification modules required for the measurement of pO 2 and the like. PLUGSYSケースはまた、使用されるデータ取得用ハードウェアとの互換性も有し、このようなハードウェアとしてはPC用のPCI PLUGSYS case also, also have compatible with the data acquisition hardware used, PCI for such as hardware PC
A/D変換基板が含まれる。 It includes A / D conversion board. この装置は、VSOMシステム制御用の重要なリアルタイムデータを提供し、かつ、VSOM実験の実施および解釈に重要な微小環境パラメータと、VSOM実験中に使用される重要な微小環境パラメータのオンラインモニタリングに必要な関連電子機器との連続的なモニタリングおよび記録を可能にする。 This device provides critical real-time data for VSOM system control, and the importance microenvironment parameters in the practice and interpretation of VSOM experiments required on-line monitoring of critical microenvironment parameters used during VSOM experiments It allows for continuous monitoring and recording of the Do associated electronics.
【0155】 [0155]
実験以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を説明しかつさらに例証することを目的として提供されるものであり、したがって本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。 EXPERIMENTAL The following examples that described and further illustrate certain preferred embodiments and aspects of the present invention are offered for the purpose and therefore should not be construed as limiting the scope of the present invention.
【0156】 [0156]
以下の実験の開示では次の略語を使用する:VS(視覚的サーボ制御);VSOM(視覚的サーボ制御光学顕微鏡/鏡検法);℃(度、摂氏);rpm(毎分回転数);BSA(ウシ血清アルブミン);H O(水);aa(アミノ酸);bp(塩基対);kb(キロ塩基対);kD(キロダルトン);gm(グラム);μg(マイクログラム);mg(ミリグラム);ng(ナノグラム);μl(マイクロリットル);ml(ミリリットル);mm(ミリメートル);nm(ナノメートル);μm(マイクロメートル);M(モル);mM(ミリモル);μM(マイクロモル);U(単位);V(ボルト);MW(分子量);sおよびsec(秒);min(s)(分);hr(s)(時間);MgCl (塩化マグネシウム);NaCl In the experimental disclosure which follows the following abbreviations are used: VS (visual servo control); VSOM (visual servo control optical microscopy / microscopy method); ° C. (degrees Celsius); rpm (revolutions per minute); BSA (bovine serum albumin); H 2 O (water); aa (amino acid); bp (base pair); kb (kilobase pairs); kD (kilodaltons); gm (grams); [mu] g (micrograms); mg (milligrams); ng (nanograms); [mu] l (microliters); ml (milliliters); mm (millimeters); nm (nanometers); [mu] m (micrometer); M (molar); mM (millimolar); [mu] M (micro mol); U (units); V (volts); MW (molecular weight); s and sec (seconds); min (s) (min); hr (s) (time); MgCl 2 (magnesium chloride); NaCl 塩化ナトリウム);OD 280 (280nmでの光学濃度);OD 600 (600 nmでの光学濃度);[Ca +2in (細胞内カルシウム濃度);[Ca +2ex (細胞外カルシウム濃度);DOX(ドキソルビシン);BEC(乳房上皮細胞);HMEC(ヒト乳腺上皮細胞);MCF−7(ヒト乳癌細胞株の1つ);MCF−7WTC(MCF−7 野生型、Cowan);HTCA(ヒト腫瘍クローニングアッセイ);DiSC(分染細胞毒性);CAM(カルセイン−AM);DRBC(カモ赤血球);DS(薬剤感受性);MDR(多剤耐性);EH(エチジウムホモ二量体);MEBM(乳腺上皮細胞基本培地);MEGM(乳腺上皮細胞増殖培地);PBS(リン酸緩衝生理食塩水);D_PBS(ダルベッコ Sodium chloride); OD 280 (optical density at 280 nm); optical density at OD 600 (600 nm); [ Ca +2] in ( intracellular calcium concentration); [Ca +2] ex (extracellular calcium concentration); DOX (doxorubicin); BEC (mammary epithelial cells); HMEC (human mammary epithelial cells); (one of the human breast cancer cell line) MCF-7; MCF-7WTC (MCF-7 wild type, Cowan); HTCA (human tumor cloning assay); DiSC (differential staining cytotoxicity); CAM (calcein -AM); DRBC (duck erythrocytes); DS (drug-sensitive); MDR (multidrug resistance); EH (ethidium homodimer); MEBM (mammary epithelium cell Basal medium); MEGM (mammary epithelial cell growth media); PBS (phosphate buffered saline); D_PBS (Dulbecco のPBS);FN(偽陰性);TN(真陰性);FP(偽陽性);TP(真陽性);NPA(陰性予測精度);PPA(陽性予測精度);PMA(ホルボール12−ミリステート13−アセテート);TRME(テトラメチルローダミンエチルエステル);TG(タプシガルギン);FURA−2−PE3(カルシウム感受性の蛍光染料の1つ);H42(Hoechst(ヘキスト)33342);LT−R(Lysotracker−Red);FNA(細針吸引);PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動);PBS(リン酸緩衝生理食塩水[150 mM NaCl、10 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2]);PCR(ポリメラーゼ連鎖反応);PEG(ポリエチレングリコール);SDS(硫酸ドデシルナトリウム Of PBS); FN (false negative); TN (true negative); FP (false positive); TP (true positive); NPA (negative predictive accuracy); PPA (positive predictive accuracy); PMA (phorbol 12-myristate 13 - acetate); TRME (tetramethylrhodamine ethyl ester); TG (thapsigargin); one fluorescent dye FURA-2-PE3 (calcium sensitive); H42 (Hoechst (Hoechst) 33342); LT-R (Lysotracker-Red ); FNA (fine needle aspiration); PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis); PBS (phosphate buffered saline [150 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2]); PCR (polymerase chain reaction); PEG (polyethylene glycol); SDS (sodium dodecyl sulphate ;Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン);DMSO(ジメチルスルホキシド);w/v(質量体積比);v/v(体積体積比);Amersham(Amersham ; Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane); DMSO (dimethyl sulfoxide); w / v (weight by volume); v / v (volume by volume); Amersham (Amersham
Life Science, Inc. Life Science, Inc. 、イリノイ州Arlington Heights);ICN(ICN Pharmaceuticals, Inc.、カリフォルニア州Costa , Illinois Arlington Heights); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., California Costa
Mesa);ATCC(American Type Culture Collection、メリーランド州Rockville);Becton Dickinson(Becton Mesa); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland); Becton Dickinson (Becton
Dickinson Labware、ニュージャージー州Lincoln Park);BioRad(BioRad、カリフォルニア州Richmond);Clonetics(Clonetics、San Dickinson Labware, NJ Lincoln Park); BioRad (BioRad, CA Richmond); Clonetics (Clonetics, San
Diego);Clontech(CLONTECH Laboratories、カリフォルニア州Palo Alto);Molecular Probes(Molecular Diego); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Molecular Probes (Molecular
Probes、オレゴン州Eugene);GIBCO BRLまたはGibco BRL(Life Technologies, Inc.、メリーランド州Gaithersburg);Invitrogen(Invitrogen Probes, Oregon Eugene); GIBCO BRL or Gibco BRL (Life Technologies, Inc., MD Gaithersburg); Invitrogen (Invitrogen
Corp. Corp. 、カリフォルニア州San Diego);New England Biolabs(New England Biolabs, Inc.、マサチューセッツ州Beverly);Novagen(Novagen,Inc.、ウィスコンシン州Madison);Pharmacia(Pharmacia, Inc.、ニュージャージー州Piscataway);Sigma(Sigma , California, San Diego); New England Biolabs (New England Biolabs, Inc., Massachusetts Beverly); Novagen (Novagen, Inc, Wisconsin Madison);. Pharmacia (Pharmacia, Inc., New Jersey Piscataway); Sigma (Sigma
Chemical Co. Chemical Co. 、ミズーリ州St. , Missouri St. Louis);Stratagene(Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州La Louis); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, California, La
Jolla);Creative Scientific Methods(Creative Scientific Methods, Inc.、www.cre8ive−sci.com);および、Zeiss(Carl Jolla); Creative Scientific Methods (Creative Scientific Methods, Inc., www.cre8ive-sci.com); and, Zeiss (Carl
Zeiss, Inc. Zeiss, Inc. 、ニューヨーク州Thornwood)。 , New York Thornwood).
【0157】 [0157]
実施例1 Example 1
同じ細胞セットに繰り返し戻るための撮像プロトコルこれらの実験では、培養中の同じ細胞セットに繰り返し戻るための方法を説明する。 The imaging protocol these experiments for repeating back to the same set of cells, a method for repeatedly return to the same set of cells in culture. これらの方法を用いることにより、可動顕微鏡ステージ上に置かれた細胞培養皿中の生細胞の1つまたは複数のセットを観察することが可能となる。 By using these methods, it is possible to observe the one or more sets of living cells in placed on a movable microscope stage cell culture dishes. 重要な点として、これにより、培養皿をステージから除去し、細胞を増殖させるためなどの目的でインキュベーに入れることが可能となる。 Importantly, this allows the culture dish was removed from the stage, it becomes possible for the purpose of for growing cells placed in incubation. 次に培養皿を顕微鏡ステージに載せ、同じ細胞セットを自動的に観察に供することが可能である。 Then place the dish on the microscope stage, it is possible to provide the same cell set automatically observed. これらの段階は所望のまたは必要な回数繰り返すことができる。 These steps can be repeated a desired or required number of times.
【0158】 [0158]
これらの実験では、種々の化合物を培養皿に灌流させながら細胞セット(倍率10Xで細胞500〜1000個)の反応をモニターすることができる。 In these experiments, it is possible to monitor the response of cells set (500-1000 cells magnification 10X) while perfused various compounds to the culture dish. 指定された数のチャネルからなる画像のスタックが、指定された長さの時間にわたって指定された間隔で1回以上取得される。 Stack of images consisting of a specified number of channels is obtained one or more times at the interval specified for the specified length of time. 編集可能な(テキストの)レシピファイルにより、使用される実験レシピが指定される。 The editable (text) recipe file, experimental recipes to be used is specified. 「スナップショット」用には1画像のみのスタックが取得され、「微速度撮影」実験用には画像の完全なスタックを規則的な間隔で取得することができる。 The for the "snapshot" is acquired a stack of only one image, for "lapse" experiments can obtain the complete stack of images at regular intervals. 連続微速度撮影実験では実験と実験との間にユーザーがステージまたは培養皿を動かさないことが好ましいため、本発明により、培養皿を動かす前に同じ細胞セットに対して連続的に複数の微速度撮影実験を行うことを容易にする。 Multiple lapse continuously to the same cell set before because it is preferable that the user does not move the stage or culture dish, the present invention, to move the dish between the experiment as a continuous lapse experiments making it easier to perform imaging experiment. 所望の分析を行った後、培養皿は顕微鏡ステージから取り除かれ、必要に応じて数時間または数日間インキュベータ内に置かれる。 After the desired analysis, culture dishes were removed from the microscope stage and placed in a few hours or days in the incubator as needed. 培養皿を顕微鏡ステージに戻したとき、細胞は生きていてもまたは死んでいても(例えば、固定または染色された細胞であっても)よい。 When returning the culture dish on the microscope stage, even if also the dead cells alive (e.g., be a fixed or stained cells) good. 無論、死細胞を使用する場合は微速度撮影実験は行われない。 Of course, lapse experiments when using the dead cells is not performed. ただし、これらの実験においては、繰り返しモニターされる単一の細胞セットが周囲の多くの細胞セットを代表していることを確認する目的で、細胞周囲の視野も「スナップショット」画像スタックを取得することによって撮像される。 However, in these experiments, for the purpose of a single set of cells to be repeatedly monitored to confirm that are representative of many cells set around the viewing pericellular also takes a "snapshot" image stack It is imaged by.
【0159】 [0159]
これらの実験では、ファイル名の中の_0、_1、_2、_3、_4、_5、および_Xによって「チャネル指示子」が指定される。 In these experiments, _0 in the file name, _1, _2, _3, _4, _5, and "channel indicator" is specified by _X. これらの数字は光学フィルタホイールの特定の位置を示し、_Xは透過光画像を示す。 These figures indicate the specific location of the optical filter wheel, _X denotes a transmitted light image. フィルタホイールの各位置の光学フィルタの識別は、波長に応じて各画像のヘッダーに記述される。 Identification of the optical filter at each position of the filter wheel is described in the header of each image according to the wavelength. 使用する透過光の種類は指定されない。 Type of transmitted light to be used is not specified. 例えば「dc122999dc2.0001.1_0ics」とはフィルタホイールの位置「0」で画像が取得されたことを表す。 For example, "dc122999dc2.0001.1_0ics" indicating that the image at the position of the filter wheel "0" is acquired. 画像ヘッダーに基づくと、この位置のフィルタは360nmの蛍光励起フィルタである。 Based on the image header, the filter of this position is 360nm fluorescence excitation filter. チャネル指示子「dc122999dc2.0001.1_X.ics」とは透過光シャッターを開放した状態で画像が取得されたことを示す。 The channel indicator "dc122999dc2.0001.1_X.ics" indicates that the image has been acquired in the open state of the transmitted light shutter. この画像は位相差像、DIC、明視野像などであってもよい。 This image phase contrast images, DIC, may be a bright-field image. これらの実験で使用されるフィルタホイールの各位置の光学フィルタの最大波長の識別は、後に詳述する編集可能なconfigテキストファイルに記述される。 Identification of the maximum wavelength of the optical filter at each position of the filter wheel used in these experiments are described in editable config text file to be described later.
【0160】 [0160]
「細胞セット」とは、特定の倍率でデジタル画像中の特定の視野内に見えるすべての細胞を指す。 A "cell set" refers to all cells that appear in a particular field of view in the digital image at a specific magnification. 数時間および数日間の過程を通じて、単独の生細胞が大きくなり分裂して2つになる、細胞が崩壊する、細胞が死んで浮流する、および個々の細胞が移動するなどの可能性がある。 During the course of several hours and several days, a single living cells is two will divide large, cells will collapse, cells Flew dead, and individual cells might like to move. 細胞セットの最初の位置は、培養皿(例えばぺトリ皿)表面に物理的にエッチングされた「+」(十字線)記号である(0,0)点に対する相対的な位置として特定される(図52参照)。 The first position of the set of cells are identified as a relative position with respect to a physically etched "+" (crosshairs) symbol (0,0) point to a culture dish (e.g., Petri dish) surface ( see FIG. 52).
【0161】 [0161]
「画像スタック」とは、単一の時点における指定された全チャネルの集合である。 The "image stack" is a collection of all the channels specified in a single point in time. 例えば、画像スタックの微速度撮影系列中の7番目のスタックは以下のようになりうる: For example, 7-th stack in lapse sequence of images stack may be as follows:
【0162】 [0162]
「レシピファイル」とは、使用するプロトコルを指定するテキストファイルである。 The "recipe file" is a text file that specifies the protocol to be used. 例えば、レシピファイルは以下のものを含む: For example, a recipe file include the following:
どの蛍光チャネルが完全画像スタックに含まれるか; Which fluorescence channels are included in the full image stacks;
各チャネルの露出時間; Exposure time for each channel;
画像チャネルが取得される順序; The order in which the image channel is acquired;
微速度撮影実験で取得される画像スタックの間隔; Spacing image stack acquired by lapse experiments;
取得するスタックの数; The number of acquisition to the stack;
フィルタホイールの各位置の励起フィルタの識別。 Identifying excitation filter at each position of the filter wheel.
【0163】 [0163]
方法の実施中、複数回の反復が可能である。 During implementation of the method, it is possible to multiple iterations. 例えば、「初回の反復」ではこれまで撮影されていない細胞の培養皿が使用される。 For example, culture dish of cells not taken so far in the "first iteration" is used. 細胞の入った培養皿にエッチングされた十字線を使用して、コンピュータ画面上で(0,0)マークが設定される。 Use crosshairs etched into culture dishes containing the cells, on the computer screen (0,0) marked is set. ユーザーは観察する細胞セットを探す。 Users Find the set of cells to be observed. この段階において、種々のシャッターが開閉され、フィルタホイールが種々の位置に動かされ、かつ、プログラムは(0,0)マークに対してユーザーが培養皿をどこに移動したかを追跡し続けなければならない。 In this phase, various shutter is opened and closed, the filter wheel is moved to various locations, and the program must keep track of whether the user has moved to where the dishes against (0,0) Mark . 次にユーザーは関心対象の細胞セットに焦点を合わせる。 The user then focuses on the set of cells of interest. 次に、レシピファイルの情報に基づいて実験が行われる。 Next, the experiment based on the information in the recipe file is performed. この初回の実験は、典型的に、生細胞の微速度撮影アッセイとして行われる。 The initial experiments are typically carried out as a lapse assay of viable cells.
【0164】 [0164]
しかし、他の態様では、固定または染色された細胞の一連の「スナップショット」が使用される。 However, in other embodiments, a "snapshot" series of fixed or stained cells are used. 次に、細胞またはステージを動かすことなく(焦点を再度合わせるのは許容される)レシピファイルが再編集され、1つまたは複数の微速度撮影実験が行われる。 Then, without moving the cell or stage (to focus again acceptable) is reedited recipe file, one or more lapse experiment is performed. 次に、細胞の入った培養皿が取り除かれ、必要時までインキュベータ(または他の保管場所)内に置かれる。 Then, removed culture dish containing cells, are placed in the incubator until needed (or other storage location). 「スナップショット」を使用するいくつかの態様では、他の細胞セットを観察するためユーザーが培養皿を動かし、追加のスナップショットが撮影される。 In some embodiments that use a "snapshot", move the user culture dish for observing the other set of cells, additional snapshot is taken.
【0165】 [0165]
「2回目の反復」では細胞セットが再度観察される。 Cell set in the "second iteration" is observed again. この細胞セットはすでに撮影され、かつ、その位置に関する情報が保存されている。 This cell set is already shot, and information about the position is stored. まず、分析する細胞の入った培養皿が顕微鏡ステージに置かれる。 First, culture dish containing cells to be analyzed is placed on the microscope stage. 十字線マークの最初の透過光画像が取得される。 The first of the transmitted light image of the crosshair mark is acquired. ユーザーは画面上の(0,0)マークを「クリック」し、どの細胞セットを観察するかをプログラムに指示する。 The user on the screen (0,0) marked "click", indicating whether to observe which cells set in the program. プログラムは視野を(0,0)マークに移動させ、次に適切な細胞視野に移動させる。 The program moves the field of view (0,0) to the mark, is then moved to the appropriate field of cells. ユーザーは細胞に焦点を合わせ、編集されたレシピファイルの情報に基づいて実験を行う。 The user focused on cells, the experiment based on the information of the edited recipe file. この段階において、ユーザーは焦点を合わせるためにシャッターを開きかつフィルタホイールを動かす。 In this step, the user opens the shutter to focus and move the filter wheel. 細胞またはステージを動かすことなく(焦点を再度合わせるのは許容される)レシピファイルが再編集され、1つまたは複数の追加の微速度撮影実験が行われる。 Without moving the cell or stage (to focus again acceptable) recipe file is re-edited, lapse experiments one or more additional takes place. スナップショット実験では、所望に応じて視野が変更され、かつ、所望の数の追加のスナップショットが取得される。 Snapshot experiments, field as desired is changed, and an additional snapshot of desired number is obtained. 実験プロトコルの最後として、細胞の培養皿がステージから取り除かれかつ保管場所(例えばインキュベータ)に戻される。 As a final experimental protocol, and returned to the culture dishes of the cells are removed from the stage and storage location (e.g., incubator). 「n回目の反復」について、生細胞のセットが繰り返し撮像されかつ細胞位置に関する情報が保存される。 For "n th iteration", information on the imaged and cellular location set of living cells is repeated is stored. 事象の順序は2回目の反復と同様である。 The order of events is similar to the second iteration.
【0166】 [0166]
実施例2 Example 2
VSOMの使用本実施例では、本発明のVSOMの装置およびその他の局面について説明する。 VSOM use in this embodiment will be described VSOM devices and other aspects of the present invention.
【0167】 [0167]
A. A. VSOMシステム光学プラットフォーム一般的に、顕微鏡が倒立型(すなわち対物レンズが上向き)の形状であるほうが細胞チャンバおよび細胞容器の設計が容易であるため、大多数の態様において、VSOMシステムは倒立型の蛍光顕微鏡を中心に構成される。 In VSOM System Optical platform generally, because more microscope is in the form of inverted (i.e. upward the objective lens) is easy to design a cell chamber and cell container, in the majority of embodiments, VSOM system of inverted fluorescence configured around a microscope. しかし、正立顕微鏡(対物レンズが下向きの顕微鏡)で使用できる細胞チャンバも存在する。 However, there are also cell chambers that can be used in upright microscope (objective lens downward microscope). 本発明のVSOMシステムはこのような光学プラットフォームとともに使用するのに適している。 VSOM system of the present invention is suitable for use with such an optical platform. カメラおよび顕微鏡周辺装置を顕微鏡に取り付けても安定するだけの十分な重量をもった、生物学研究に適した等級の蛍光顕微鏡が好ましい。 The camera and microscope peripheral has sufficient weight of only stable when attached to the microscope, preferably a fluorescent microscope grades suitable for biological studies. いくつかのVSOM実験には標準的な10倍対物レンズで十分である。 For some VSOM experiment is sufficient standard 10x objective lens. 研究用等級の顕微鏡、対物レンズ、および種々の周辺装置は、カール・ツアイス(Carl Microscopy studies grade, objective lens, and various peripherals, Carl Zeiss (Carl
Zeiss, Inc. Zeiss, Inc. 、ニューヨーク州Thornwood)およびニコンUSA(Nikon USA、ニューヨーク州Melville)など種々の製造業者により製造されている。 , Manufactured by NY Thornwood) and Nikon USA (Nikon USA, NY Melville) various manufacturers such. 環境制御細胞チャンバは、ツアイス、ハーバード・アパラタス(Harvard Environmental control cell chamber, Zeiss, Harvard Aparatasu (Harvard
Apparatus、マサチューセッツ州Holliston)およびバイオプテクス(Bioptechs, Inc.(Biological Optical Apparatus, Massachusetts Holliston) and Baioputekusu (Bioptechs, Inc. (Biological Optical
Technologies)ペンシルベニア州Butler)など種々の種々の製造業者により製造されている。 Technologies) manufactured by Pennsylvania Butler) Various various manufacturers such.
【0168】 [0168]
B. B. VSOM周辺装置本発明の好ましい態様に使用できるデジタルカメラとしては、低照度蛍光鏡検法の用途向けに設計されたもの(例えば、ローパー・サイエンティフィック(Roper The digital camera is available in the preferred embodiment of VSOM peripherals present invention, those designed for applications in low-light fluorescence microscopy (e.g., Roper Scientific (Roper
Scientific Inc. Scientific Inc. 、アリゾナ州Tucson)およびクウォンティテイティブ・イメージング(Quantitative Imaging Corp.、カナダ、Burnaby)などの企業により製造されているもの)が含まれる。 , AZ Tucson) and quantifier Thi Tay Restorative imaging (in Quantitative Imaging Corp., Canada, Burnaby) those manufactured by companies and the like). このようなカメラは、12ビットデジタル化能力を有する科学等級のCCDを有しており、かつ、約7μm×7 μmのサイズである合計約100万ピクセルを有する。 Such camera includes a CCD scientific grade with 12-bit digital capability, and has a total approximately 1 million pixels in size from about 7μm × 7 μm. このようなカメラは、C++ソースコードおよびソフトウェア開発キットを含むソフトウェア開発キット、または、ホストPC上でカメラ操作をソフトウェア、光学素子、電気素子、および機械素子(すなわち顕微鏡周辺装置)と統合するソフトウェアを記述するのに使用できるホスト接続キットとともに入手可能である。 Such cameras, software development kit including C ++ source code and software development kits, or software camera operation on the host PC, an optical element, an electric device, and a mechanical element (i.e. microscope peripherals) software that integrates with available with a host connection kit that can be used to describe. これらのカメラは、ホストコンピュータを介してカメラの機能をプログラムできるよう、PCIコンピュータインターフェースカードまたは直接接続の「ファイアワイア」(IEEE1394)ケーブル接続など、種々の業界標準のコンピュータインターフェースとともに提供されている。 These cameras, so that it can program the camera function via the host computer, such as a PCI computer interface card, or "FireWire" direct connection (IEEE1394) cable connection, are provided with various industry standard computer interface.
【0169】 [0169]
デジタルカメラに加えて他の周辺装置も本発明とともに使用でき、このような周辺装置としてはXY走査ステージ、光学フィルタホイール、Z軸焦点粗調整モーター、ならびに、透過光シャッターおよび表面蛍光シャッターが含まれる(例えば、LUDLエレクトロニクス・プロダクツ(LUDL In addition to the digital camera can be used with the present invention other peripheral devices, XY scanning stage as such peripheral devices, an optical filter wheel, Z-axis focus coarse adjustment motor, and includes the transmitted light shutter and epifluorescence shutter (for example, LUDL Electronics Products (LUDL
Electronics Products, Ltd. Electronics Products, Ltd. 、ニューヨーク州Hawthorne)などの製造業者から入手可能な周辺装置)。 , Peripheral equipment available from New York Hawthorne) manufacturers, etc.). 種々の製造業者が他の装置を提供している。 Various manufacturers have provided other devices. 例えば、シャッター・インスツルメント(Sutter For example, shutter Instruments (Sutter
Instrument Co. Instrument Co. 、カリフォルニア州Novato)は光学フィルタホイールおよびロボットマイクロマニピュレータを製造しており、シリンジポンプはハーバード・アパラタス(Harvard , CA Novato) is to produce an optical filter wheel and robotic micromanipulator, the syringe pump Harvard Aparatasu (Harvard
Apparatus、マサチューセッツ州Holliston)から、顕微鏡対物レンズナノポジショナ(圧電ポジショナ)はフィジック・インツルメンテ(Physik Apparatus, from MA Holliston), a microscope objective lens nano positioner (piezoelectric positioner) is Physic Intsurumente (Physik
Intrumente、ドイツ、Waldbronn)からそれぞれ入手可能である。 Intrumente, is available each Germany, from Waldbronn). これらの企業は、それぞれの周辺装置用に適切なプログラマブルコントローラも販売している。 These companies also sells suitable programmable controller for each peripheral device. ハーバード・アパラタスは、種々の環境センサー(酸素、乳酸、グルコース、pHなど)を操作およびホストコンピュータとインターフェースするための、PLUGSYSならびに同様の測定および制御装置も販売している。 Harvard Aparatasu a variety of environmental sensors (oxygen, lactic acid, glucose, pH, etc.) for operating and a host computer and interfaces, also sells PLUGSYS and similar measurement and control device.
【0170】 [0170]
C. C. 生物学的試薬生物学的試薬および蛍光標識などは多数の製造業者から入手可能である。 Biological reagents biological reagents and fluorescent labels, such as are available from a number of manufacturers. 例えば、生細胞用の蛍光プローブはモレキュラー・プローブズ(Molecular Probes、オレゴン州Eugene)から入手可能である。 For example, fluorescent probe for live cells are available from Molecular Probes (Molecular Probes, Oregon Eugene). 他の細胞培養培地、細胞増殖用の装置および供給品、ならびに関連する装置および供給品は、標準的な供給業者(例えばシグマ(Sigma)、フィッシャー(Fisher)など)から入手可能である。 Other cell culture media, equipment and supplies for cell proliferation, and related equipment and supplies are standard suppliers (e.g. Sigma (Sigma), Fisher (Fisher), etc.) are available from.
【0171】 [0171]
D. D. VSOMホストコンピュータ本発明の好ましい態様では、1つまたは複数の使用可能なPCIスロット(デジタルカメラがホストコンピュータとのインターフェースにPCIスロットを必要とするか否かによる)と、標準的なシリアルポートおよびパラレルポートと、OHCI互換IEEE1394ポート(ファイアワイア対応デジタルカメラが必要とする場合)と、256 MBのRAMと、1つまたは複数の18 Gbyteハードドライブと、テープバックアップユニットと、イーサネットアダプタと、32ビットカラービデオカードと、高解像度モニター(好ましくは1280×1024ピクセル)とを有し、かつ、あるバージョンのLINUXまたはMicrosoft In a preferred embodiment of VSOM host computer present invention, the one or more available PCI slot (digital camera depends on whether requiring PCI slots to interface with the host computer), a standard serial port and a parallel and the port, and OHCI-compatible IEEE1394 port (if Firewire digital camera needs), 256 and MB of RAM, and one or more of 18 Gbyte hard drive, a tape backup unit, Ethernet adapter, 32-bit color It has a video card, and a high-resolution monitor (preferably 1280 × 1024 pixels), and a version of LINUX or Microsoft
Windowsを実行する、450 MHz Pentium IIIクラスの業界標準のPCを必要とする。 To run Windows, and requires the industry standard of the PC of 450 MHz Pentium III class. オンラインの画像セグメント化および分析を行うために、デジタルカメラおよび種々の顕微鏡周辺装置の作動を前述のソフトウェアおよびアルゴリズムと統合させるため、標準的なC++コンピュータプログラミングの技術が必要である。 To perform the online image segmentation and analysis, in order to integrate the operation of the digital camera and various microscopic peripheral devices with the aforementioned software and algorithms are needed for standard C ++ computer programming techniques. したがって、標準的なC++プログラミングソフトウェア、およびMicrosoft Therefore, the standard C ++ programming software, and Microsoft
Visual Studio C++などの統合ソフトウェア開発パッケージが必要である。 There is a need for integrated software development packages, such as Visual Studio C ++. さらに、標準的なデジタル画像取得、周辺装置の制御およびオートメーション、ならびに標準的な画像処理、プロッティング、および表示操作のためのC++ライブラリを含むソフトウェアパッケージが望ましい。 Furthermore, standard digital image acquisition, control and automation, and standard image processing peripheral device, the software package that contains a C ++ library for plotting, and display operation desirable. このようなパッケージとしては、「SCIL Examples of such a package, "SCIL
Image」(TNO、オランダ、Delft)、「MetaFluor」および「Metamorph」(ユニバーサル・イメージング・コーポレーション(Universal Image "(TNO, Netherlands, Delft)," MetaFluor "and" Metamorph "(Universal Imaging Corporation (Universal
Imaging Corporation、ペンシルベニア州Downingtown))、ならびに、「Component Works++」(ナショナル・インスツルメンツ(National Imaging Corporation, Pennsylvania Downingtown)), as well as, "Component Works ++" (National Instruments (National
Instruments、テキサス州Austin))などがある。 Instruments, Texas Austin)), and the like. さらに、場合によっては、顕微鏡周辺装置の数およびVSOMシステムで制御される環境センサーの数が増加するにしたがって、ナショナル・インスツメンツが製造しているものなどの標準的なアナログ−デジタルインターフェースカードが必要となる。 Furthermore, in some cases, according to the number of environmental sensors to be controlled by the number of microscope peripherals and VSOM system increases, standard analog, such as those National Insutsumentsu it is manufactured - and requires a digital interface card Become.
【0172】 [0172]
E. E. VSOMの実施光学プラットフォームに加えて、VSOMの最小限の実施には以下のそれぞれが少なくとも1つ必要である:温度制御された細胞チャンバ、コンピュータ制御されたシリンジポンプ、照明シャッター、および、光学フィルタホイール。 In addition to VSOM exemplary optical platform, the minimal implementation of VSOM each of the following is needed at least 1: Temperature controlled cell chamber, computer controlled syringe pumps, lighting shutters, and optical filter wheel . 最小限で実施される実験には透過光を扱える能力は必要ではなく、蛍光鏡検法のみが必要となる。 The ability to handle transmitted light in experiments performed with minimal is not required, it is necessary only fluorescence microscopy. 必要である唯一の微小環境制御装置は、標本容器に挿入できる温度プローブを有する、温度を37℃に維持できる温度制御ユニットである。 The only microenvironmental control device is necessary, has a temperature probe that can be inserted into the specimen container, a temperature control unit capable of maintaining the temperature at 37 ° C.. 最小限で実施される実験では、光学プラットフォームが比較的安定であり振動がないという前提において、対物レンズのZ軸調整は必要でない。 In the experiments performed with minimal, the premise that is no vibration relatively stable optical platform, Z axis adjustment of the objective lens is not required. 観察の必要があるのは単一の細胞視野のみ(多視野ではない)であるため、XY位置決めステージも必要でない。 Because there observations need of is a single field of cells only (not a multi-view), nor require XY positioning stage. しかし、本発明がこの特定の設計形式に限定されることはない。 However, the invention is not to be limited to this particular design format.
【0173】 [0173]
1つの態様において、細胞は、標準的な細胞インキュベータ内で標準的なプラスチック性のペトリ皿の中で標準的な技術を用いて実験前に増殖される。 In one embodiment, cells are grown prior to the experiment using standard techniques in a petri dish standard plastic properties in standard cell incubator. いくつかの態様において、細胞は、生細胞に適した核染色法により実験前に標識される。 In some embodiments, cells are labeled prior to the experiment by nuclear staining suitable for living cells. 例えば、生細胞の核を染色するため、Hoechst33342(H42)が以下の方法で使用される。 For example, for dyeing living cell nucleus, Hoechst 33342 (H42) is used in the following manner. 適切なサイズの標本容器(例えば丸型の35 mm細胞培養皿)に24時間付着させた細胞を、細胞インキュベータ内で1.0μg/mLのH42に約90分間曝露する。 The appropriate size sample containers (e.g. round 35 mm cell culture dishes) to allowed to adhere for 24 hours the cells are exposed H42 to about 90 minutes of 1.0 [mu] g / mL in a cell incubator. この曝露の後、H42および細胞増殖培地中に存在するフェノールレッド指示薬を洗い流し、フェノールレッドまたは過量のウシ胎仔血清を含まない、新鮮な培地に交換する。 After this exposure, wash the phenol red indicator present in H42 and cell growth media free of fetal bovine serum phenol red or overdose, is replaced with fresh medium. 標本容器が細胞チャンバ内に置かれ、オペレータは適切な細胞視野に焦点を合わせ、次に画像出力をデジタルカメラに送る。 Specimen container is placed in the cell chamber, the operator focuses on appropriate cell field, then sends the image output to the digital camera. コンピュータ制御のシリンジの1つには蛍光プローブを含まない適切な溶液(血清またはフェノールレッドを含まない、細胞培地など)が充填され、他のシリンジには同じ溶液と生細胞に適した蛍光プローブとが充填される。 One syringe computer control (without serum or phenol red, cell medium, etc.) suitable solution without fluorescent probe is filled, the other syringe and the fluorescent probes suitable for the same solution and viable cells There is filled. たとえば、カルセイン−AM(CAM)は細胞株中の多剤耐性(MDR)の存在を示すことができる適切なプローブである。 For example, calcein -AM (CAM) is a suitable probe which may indicate the presence of a multidrug resistant cell line (MDR). 最小限のVSOM実施可能コンピュータ制御MDRアッセイでは、約1.0μMのCAM溶液が1分あたり約0.5 mLの流量で細胞チャンバ内に灌流される。 The minimal VSOM feasible computer controlled MDR assay, CAM solution of about 1.0μM are perfused into the cell chamber at a flow rate of about per 0.5 mL 1 minute. この化合物は生細胞の膜を通過し、次に代謝され、蛍光性となり、かつ、細胞内に保持される。 The compounds pass through the membrane of living cells are then metabolized, it becomes fluorescent and is retained within the cell. 当業者には周知であるように、細胞が1つまたは複数のMDRタンパク質を有するならば、その細胞はCAMを細胞外に搬出する能力を有する。 As is known to those skilled in the art, if the cell has one or more MDR protein, the cells have the ability to carry the CAM extracellularly. これらの場合、CAMの存在下において細胞が化合物を取り込む速度は低下し、かつ、CAMがチャンバから洗い流された後に細胞が保持するCAMの量は少なくなる。 In these cases, the rate at which cells in the presence of a CAM takes in compound decreases, and, CAM amount of the CAM cells retain after being flushed from the chamber is reduced.
【0174】 [0174]
VSOMシステムはCAM溶液の灌流を開始し、かつ、核内のH42の青い核蛍光信号を用いて生細胞の視野を連続的にセグメント化する。 VSOM system starts perfusion CAM solution, and continuously segmenting the field of live cells using blue nuclear fluorescence signals H42 in the nucleus. このように、核を描く輪郭が青チャネルで取得される。 Thus, the contour drawing a nucleus are obtained by the blue channel. 核領域におけるCAMの平均蛍光強度を計算するため、これらの同じ輪郭が緑チャネルでも使用される。 To calculate the mean fluorescence intensity of CAM in the nuclear region, these same contour is also used in the green channel. CAMは細胞全体に均一に分布することが多いため、核領域に加えて細胞質領域を検出する必要はない。 CAM because often evenly distributed throughout the cell, it is not necessary to detect the cytoplasmic region in addition to the nuclear region. 適切な間隔(例えば60秒ごと)で画像が取得されると同時に、このように緑チャネルにおける平均細胞内蛍光強度(MI)が各細胞の核領域について観察される。 At the same time the image at appropriate intervals (e.g., every 60 seconds) is obtained, such that the average intracellular fluorescence intensity in the green channel (MI) is observed for the nuclear area of ​​each cell.
【0175】 [0175]
次に、下記のような方法で細胞チャンバ内のCAM量を調整するため、コンピュータアルゴリズムが以下のサーボループオペレーションを実行する。 Next, in order to adjust the CAM amount in the cell chamber in a manner as described below, computer algorithm performs the following servo loop operations. 各画像取得点について全細胞の平均MI(前述に定義のとおり)がモニターされ、次に以下が実行される: Average MI of total cells for each image acquisition points (aforementioned as defined) is monitored, then the following are performed:
a)視野内の全細胞の平均MIがユーザー定義の閾値に達すると、CAMの入ったシリンジが遮断され、かつ、CAMの入っていないシリンジがオンになる;または、 If the average MI of all cells in a) within the field of view reaches a user-defined threshold, the syringe containing the CAM is turned off, and the syringe containing no CAM is turned on; or,
b)視野内の全細胞の平均MIが、(a)で達した最大平均MIからユーザー定義のパーセンテージ分減少すると、CAMの入っていないシリンジが遮断される; b) the average MI of all cells in the field of view, (when the percentage reduction of the user-defined from its maximum mean MI reached in a), a syringe containing no CAM is cut off;
c)実験終了。 c) the end of the experiment.
【0176】 [0176]
このような最小限の実験において、CAMの取込みおよび保持の個々の率が細胞ごとに取得される。 In such a minimal experimentation, uptake and retention of individual rates of CAM is obtained for each cell. システムは次に、実験の最後に、視野内においてMDRを示した細胞の数(またはパーセンテージ)を報告することができる。 The system then can report the end of the experiment, the number of cells showing the MDR in the field of view (or percentage). さらに、このような細胞はこれによって同定され、かつ、MDRを変化させる化合物を試験する次の試験に供することができる。 Moreover, such cells are identified by this, and can be subjected to the following tests for testing a compound that alters the MDR. しかし、本発明がこの特定のシステム、形式、細胞などに限定されることはない。 However, the invention is not to be limited this particular system, format, etc. to the cell. 事実、本発明は実験デザインの面においてユーザーに最大限の柔軟性を提供する。 In fact, the present invention provides maximum flexibility to the user in terms of experimental design.
【0177】 [0177]
実施例3 Example 3
VSOM実験本実施例では、実施例2の説明に以下に記載の変更点を加えて実施したVSOM実験について説明する。 In VSOM experiments This example describes VSOM experiments carried out by adding changes described below in the description of the second embodiment.
【0178】 [0178]
使用した光学プラットフォームは、透過光鏡検法(位相差法およびDIC法)および多色蛍光鏡検法用の装備を有するTV倒立顕微鏡、Zeiss Axiovert135 H/DICである。 Optical platform used was, TV inverted microscope with equipment for transmitting light microscopy (phase difference method and DIC method) and multicolor fluorescence microscopy, a Zeiss Axiovert 135 H / DIC. 顕微鏡には、コンピュータ制御のXY走査ステージ、Z軸ステップモーター、および6位置フィルタホイール(LUDLエレクトロニック・プロダクツ(LUDL Microscopically, XY scanning stage of computer control, Z-axis step motor, and 6-position filter wheel (Ludl Electronic Products (Ludl
Electronic Products, Ltd. Electronic Products, Ltd. 、ニューヨーク州Hawthorne))を装備した。 , Equipped with a New York Hawthorne)). これらの研究では、Kodak KAF−1400 CCDチップ(1317×1035ピクセル、7×7ミクロンピクセルサイズ)を有する12ビットのXillix In these studies, Kodak KAF-1400 CCD chip (1317 × 1035 pixels, 7 × 7 micron pixel size) of 12 bits having a Xillix
CCDカメラ(キシリックス・テクノロジーズ(Xillix Technologies、ブリティッシュコロンビア州Vancouver))を使用した。 CCD camera (Kishirikkusu Technologies (Xillix Technologies, British Columbia Vancouver)) was used. このカメラは8MHz(すなわち、1セットあたりフルサイズ画像約4枚)の読み出し速度を有する。 The camera has a read speed of 8 MHz (i.e., full-size image about four per set). ホストコンピュータはマルチタスクUNIXワークステーションであるSparcstation The host computer is a multi-task UNIX workstation Sparcstation
Ultra 1とし、コンピュータカメラから出力された画像をホストコンピュータに直接読み取らせた。 And Ultra 1, was directly read the image output from the computer camera to the host computer.
【0179】 [0179]
さらに、ペルティエ温度制御マイクロ灌流チャンバ(TC−202二極式温度制御装置を有するPDMI−2開放チャンバ、ハーバード・アパラタス/メディカル・システムズ・リサーチ・プロダクツ(Harvard Further, Peltier temperature control micro perfusion chamber (TC-202 PDMI-2 open chamber having a bipolar temperature controller, Harvard Aparatasu / Medical Systems Research Products (Harvard
Apparatus/Medical Systems Research Products、マサチューセッツ州Holliston))およびデュアルシリンジポンプ(Pump−33、ハーバード・アパラタス)を使用した。 Apparatus / Medical Systems Research Products, MA Holliston)) and dual syringe pump (Pump-33, using the Harvard Aparatasu). これらのシリンジは、同じサイズである必要はなく、かつ、灌流速度が独立に制御できるよう各シリンジがそれぞれコンピュータ制御のブロックを有する。 These syringes need not be the same size, and has a respective syringes each computer control block so that the perfusion rate can be controlled independently. 「浴槽」タイプのサーミスタ(BSC−T3、計36Kオーム)をPDMI−2とともに使用した。 "Bathtub" type of the thermistor (BSC-T3, a total of 36K ohms) was used in conjunction with PDMI-2.
【0180】 [0180]
いくつかの好ましい態様において顕微鏡の設計が倒立式であることによって、生細胞の灌流が可能となり、不動化された細胞が下から撮像された。 By microscope design is upside-down in some preferred embodiments, enables the perfusion of a living cell, immobilized cells were captured from below. 本発明のいくつかの態様では油浸対物レンズが使用できる。 Oil immersion objective lens may be used in some embodiments of the present invention. また、細胞は、いくつかの態様では35mmペトリ皿の中で、他の態様では円形のカバーガラス上で増殖され、下から観察される。 Further, cells in a 35mm petri dish in some embodiments, in other embodiments is grown on a circular cover glass is observed from below. この倒立顕微鏡の構成により、ユーザーは蛍光から透過光検出(位相差またはDIC)に切り替えることができ、かつ、細胞の位置および形態を確認することができる。 This configuration of the inverted microscope, the user can switch to the transmitted light detected from fluorescence (phase difference or DIC), and it is possible to confirm the position and form of the cells. これはコンピュータ制御の透過光シャッターにより実現される。 This is realized by the transmitted light shutter computer control. フィルタホイールにあるコンピュータ制御の表面蛍光シャッターも使用可能である(LUDL)。 Epifluorescence shutter computer control in the filter wheel can be used (Ludl). これらの実験において、システムの自動視覚サーボ制御オペレーション(すなわち、ポンプ、照明シャッター、フィルタホイール、およびXillixカメラの制御)はプログラム「ADR」で実施した。 In these experiments, the system automated vision servo control operations (i.e., pumps, lighting shutters, filter wheels, and control the Xillix camera) was performed with the program "ADR". あらかじめプログラムされたレシピを使用して実施したVSOM実験ではプログラム「VX5」を使用した。 Using the program "VX5" in VSOM experiments were carried out using a pre-programmed recipes.
【0181】 [0181]
A. A. ADR視覚サーボ制御実験MCF−7 WTC細胞を35 mm細胞培養皿で増殖させ、H42で前染色した。 The ADR visual servo control experiments MCF-7 WTC cells were grown in 35 mm cell culture dishes were pre-stained with H42. H42とともに約1時間プレインキュベーションした後、細胞をDPBSGPですすぎ、温めた顕微鏡チャンバに入れた。 After about 1 hour preincubation with H42, cells were rinsed with DPBSGP, placed in a microscope chamber warm. ADRプログラムは以下の要領で問題なく動作した。 ADR program was operating without problems in the following manner. この実験中、指定した一定の間隔で3枚のデジタル画像(360nm励起、490 nm励起、および透過光、明視野)が取得され、かつ、次の撮像間隔より前に、H42で染色されたすべての核が検出およびセグメント化された。 During this experiment, three digital images at regular specified intervals (360 nm excitation, 490 nm excitation, and the transmitted light, bright field) are acquired, and all prior next imaging interval, and stained with H42 nuclei are detected and segmentation. 青チャネルで描出された各核の輪郭を用いて、平均細胞蛍光強度の値が緑チャネルから算出された(MI)。 With contours of the nuclei are visualized in blue channel, the value of the mean cell fluorescence intensity was calculated from the green channel (MI). DBPSGP溶液のみ(シリンジ#1)による最初の灌流を1.0mL/分で8.3分間実施し(ユーザーの指定による)、次にシリンジ#1が停止された。 DBPSGP solution only (syringe # 1) a first perfusion was carried 8.3 min at 1.0 mL / min by (Specifying the user), then the syringe # 1 is stopped. 次に、1 μMのCAMを含むDBPSGP溶液(シリンジ#2)の灌流を0.5mL/分で開始した。 Then began perfusion DBPSGP solution (syringe # 2) including the CAM of 1 [mu] M in 0.5 mL / min. 全細胞の平均MIが指定の閾値に達したときに、正常な視覚サーボ制御によりシリンジ#2が停止された。 When the average MI of all the cells reaches a specified threshold, the syringe # 2 is stopped by the normal visual servo control. 細胞が十分量のCAMを蓄積しかつシステムが十分量の細胞内CAMを(核領域で)検出し、システムが正常にシリンジ#2を停止させかつシリンジ#1を再始動させるまでに、13.9分を要した。 Cells a sufficient amount of accumulated CAM and system to detect intracellular CAM sufficient amount (the nuclear region), until the system is properly restart the syringe # and syringe # 1 2 is stopped, 13. It took 9 minutes. 11.4分後(ユーザーの指定による)に、システムは再度シリンジ#1を停止させた。 After 11.4 minutes (according to the specified user), the system was stopped syringe # 1 again. システムは引き続きチャンバ内の細胞をモニターし(ユーザーの指定による)、流れがない状態でさらに24.9分間が経過した。 System (as specified users) will continue to monitor the cells within the chamber, further 24.9 minutes with no flow has elapsed. 次に、実験終了時にシステムは画像取得を停止した。 Next, the system was stopped image acquisition at the end of the experiment.
【0182】 [0182]
実施例4 Example 4
MDRアッセイ−試験キットおよびVSOM実験本明細書に記載のとおり、VSOM実験においてMDRアッセイβ試験キットの試験も行った。 MDR assay - as described in the test kit and VSOM experiments herein were also tested for MDR Assay β test kit in VSOM experiments. 図11にこのVSOM実験の略図を示す。 Figure 11 shows a schematic representation of this VSOM experiment. 各ポンプは、あらかじめプログラムされたレシピに従って、または個々の細胞反応のリアルタイム分析に基づいて、指定された流量でオンおよびオフになる。 Each pump is based on pre-according to a programmed recipe or real-time analysis of individual cell response, it turns on and off at a specified flow rate. 使用したCAM、V、MKの濃度を図中に示した。 CAM used, V, the concentration of MK shown in FIG. CAMへの3回の曝露はそれぞれ900秒間(20分間)であり、したがってCAMへの総曝露時間は60分間であった。 3 exposures to the CAM is 900 seconds, respectively (20 min), thus the total exposure time to CAM was 60 minutes. 本図の下部の黒い窓は視野内の全細胞の反応の平均を示す。 Lower black windows of the drawing shows the average response of all cells in the field of view. この平均反応プロットはVSOM実験中コンピュータ画面に表示され、かつ、1つまたは複数のチャネルのデジタルイメージも画面に表示される(通常、表示されるチャネルの1つは透過光である)。 The mean response plot is displayed on the computer screen during VSOM experiment, and one or digital images of the plurality of channels is also displayed on the screen (usually, one of the channels to be displayed is transmitted light).
【0183】 [0183]
実験中、プロットおよび画像は継続的に再描画および更新される。 During the experiment, plots and images are redrawn and updated continuously. MCF−7(DS、実行(run)#1)およびMCF−7 ADR(MDR、実行#2)について記録された2つのプロットにおいて、DS細胞のカルセインの蓄積量(240± 82、N=336)はMDR細胞の蓄積量(103 ± 80、N=161)より多いことが見出された。 MCF-7 (DS, execution (the run) # 1) and MCF-7 ADR (MDR, run # 2) in the two plots recorded for the accumulation of calcein DS cells (240 ± 82, N = 336) it has been found that the greater than accumulation of MDR cells (103 ± 80, N = 161). このことは、多数の細胞の平均を表すマルチウェルプレート実験で観察される、DS細胞とMDR細胞とのカルセイン蓄積の相対的な差異と一致する(前述の表1参照:1658/4822=0.34、1965/6598=0.30、VSOM:103/240=0.43)。 This is observed in a multi-well plate experiments representing the average of a number of cells, consistent with the relative difference in calcein accumulation of the DS cells and MDR cells (see Table 1 above: 1658/4822 = 0. 34,1965 / 6598 = 0.30, VSOM: 103/240 = 0.43). しかし、VSOM実験では各細胞の平均細胞蛍光がモニターされ、かつ、平均値からの逸脱の検出が容易であった。 However, the mean cell fluorescence of each cell is monitored in VSOM experiment, and was easy deviation detection from the mean value. 例えば、複数の細胞が生存率および原形質膜完全性を失い始めた。 For example, a plurality of cells began to lose viability and plasma membrane integrity. このような細胞はカルセインを保持することができず、カルセインが漏出してその結果蛍光信号が低下する。 Such cells can not be held calcein, calcein leaks resulting fluorescence signal decreases. これは、前述のDMSOの毒性に関連した影響である可能性がある。 This may be the related effects toxicity of the aforementioned DMSO. しかし、本発明を使用する上で機序の理解は必要ではなく、かつ、本発明が特定の機序に限定されることはない。 However, an understanding of the mechanism on the use of the present invention is not necessary, and, but the present invention is limited to a particular mechanism. それでもなお、単一の細胞の死がみとめられた時点で容易に曝露/灌流を終了させる能力を現在のVSOMシステムが有することは注意を要する。 Nevertheless, to have the ability to terminate readily exposed / perfusion when the death of single cells was observed the current VSOM systems require attention.
【0184】 [0184]
図13は、本実施例の実行#2の結果から、選択した4つの細胞の細胞反応を示したものである。 13, the result of execution # 2 of the present embodiment, there is shown a cellular response of four cells selected. これらの反応曲線はβ試験キットの基礎をなす原理を示すよい例である。 These response curves are a good example showing the principle underlying the β test kit. 反応曲線のうち2つでは(図13)、シリンジ#5の作動中に(図11)ベラパミル(V)に曝露されるまで細胞はカルセインを蓄積しない。 In two of the response curve (FIG. 13), cells to be exposed to during operation of the syringe # 5 (FIG. 11) verapamil (V) does not accumulate calcein. PgpポンプはMK−571(MK)で阻害されないことから、これらの細胞はPgpポンプのみを発現していると解釈することができる。 Pgp pump since it is not inhibited by MK-571 (MK), can be interpreted as these cells express only Pgp pump. DS細胞の母集団中にこれらの細胞のいずれも存在しないことは明らかである(図12)。 Both it is clear that the absence of these cells in the population of DS cells (Figure 12). さらに、CAM+V曝露後、1つの細胞は、その平均細胞蛍光が、DS細胞で観察される平均細胞反応の一方の標準偏差の範囲内に達するまで急速にカルセインを蓄積した(図12)。 Furthermore, CAM + V after exposure, a single cell, the mean cell fluorescence was rapidly accumulate calcein until within the one standard deviation of the average cell responses observed in DS cells (Figure 12). 他のすべての要因が同じであると仮定すると、第二の細胞はPgp分子の含有量が少ないと予測できる。 If all other factors are assumed to be the same, the second cell can be predicted to have a low content of Pgp molecules. 残る2つの曲線(図13)は、CAM(のみ)およびCAM+MKの曝露中に別の反応を示しており、これはさらなる分析を要する。 Two curves remain (Fig. 13) shows a separate reaction during exposure CAM (only) and CAM + MK, which requires further analysis. 観察された曲線は、内在化したカルセインを排出する能力をもたない2種類のポンプのみの存在または不在の観点からは説明できない。 The observed curve can not be explained in terms of the presence or absence of only two types of pumps that do not have the ability to discharge the internalized calcein. しかし、本発明を使用する上で機序の理解は必要ではなく、かつ、本発明が特定の機序に限定されることはない。 However, an understanding of the mechanism on the use of the present invention is not necessary, and, but the present invention is limited to a particular mechanism. これは、フローサイトメトリーアッセイおよびマルチウェルプレートアッセイでは得られない種類の詳細な生理学的情報である。 This is the flow cytometry assay and multi-well plate assay is a detailed physiological information obtained not type. 対照的に、本明細書に示したVSOM技術はこれらの能力を有している。 In contrast, VSOM technique illustrated herein has these capabilities.
【0185】 [0185]
例えば、カルセインの蓄積および保持に関する詳細な率の情報がVSOM実験全体を通して利用可能である。 For example, the information detailed rate about accumulation and retention of calcein is available throughout the VSOM experiments. いくつかの反応曲線について、3回のCAM灌流中のカルセイン蓄積率を計算することができる。 For some response curve can be calculated calcein accumulation rate in three CAM perfusion. さらに、BUFF灌流中のカルセイン保持率も計算することができる。 Furthermore, it is possible to calcein retention in BUFF perfusion also calculated. カルセイン蓄積は1500秒、3500秒、および5500秒の時点で生じたことが見出され、かつ、良好なカルセイン保持に対応するプラトーは2500秒、4500秒、および6500秒のインターバルで観察された。 Calcein accumulation 1500 seconds was found to be caused at the time of 3500 seconds, and 5500 seconds, and plateau 2500 seconds corresponding to good calcein retention was observed at intervals of 4500 seconds, and 6500 seconds. 前述のとおり、いくつかのMDRポンプはカルセインが細胞内に内在化された後にこれを排出する能力をもっている。 As mentioned above, some of the MDR pump have the ability to discharge this after the calcein is internalized into the cell. 内在化されたカルセインを排出するDS細胞の能力は、BUFF灌流に対応する2500秒の期間中に顕著である(図12参照)。 The ability of DS cells to discharge internalized calcein is remarkable for the duration of 2500 seconds corresponding to BUFF perfusion (see Figure 12). しかし、2つのMDR細胞(図13)はこの能力をもたない。 However, the two MDR cells (FIG. 13) do not have this capability.
【0186】 [0186]
さらに、前述の教示を使用すると、コンピュータが判断を行うあらかじめプログラムされたマニピュレーションは視覚的サーボ制御オペレーションに適している。 Furthermore, the use of the above teachings, the computer preprogrammed manipulation to make decisions is suitable for visual servo control operations.
【0187】 [0187]
実施例5 Example 5
修飾試薬を用いたデジタル撮像蛍光法VSOMを使用して、デジタル撮像蛍光顕微鏡を自動化することができる。 Using digital imaging fluorescence method VSOM using modifying reagent, it is possible to automate the digital imaging fluorescence microscopy. 例えば、修飾試薬MK−571(10 μM)またはベラパミル(50 μM)を含むカルセイン−AM(CAM、0.25μM)をマイクロ灌流チャンバに灌流させることができる。 For example, it is possible to perfusion modifying reagent MK-571 (10 μM) or verapamil (50 [mu] M) calcein containing -AM (CAM, 0.25 [mu] M) to the micro-perfusion chamber. MK−571は膜貫通タンパク質MRPに対する特異的な阻害剤であり、一方、ベラパミルはMRPを阻害するとともに膜貫通タンパク質PgPも阻害する。 MK-571 is a specific inhibitor for the transmembrane protein MRP, whereas, verapamil also inhibits transmembrane proteins PgP with inhibiting MRP. これらの膜貫通タンパク質はいずれも外来性の化合物を排出し、これらタンパク質は多剤耐性に関与していると考えられている。 All of these transmembrane proteins are discharged exogenous compounds, these proteins are believed to be involved in multidrug resistance. これら2つの異なるタンパク質をコードしているのは別々の遺伝子である。 The encoding these two different proteins are separate genes. これらタンパク質の薬剤交差耐性プロフィール(スペクトル)は、重複するものの完全に同じではない。 Drug cross-resistance profiles of these proteins (spectra) are not exactly the same thing that overlap. さらに、前述のとおり、これらタンパク質は種々の阻害剤に対して異なる感受性を有する。 Further, as described above, these proteins have different sensitivity to various inhibitors.
【0188】 [0188]
Hoechst 33342で標識したMCF−7ADR細胞を35℃で観察し、細胞ごとの平均蛍光強度(MI、カルセイン)を求めた。 Labeled MCF-7ADR cells was observed at 35 ° C. with Hoechst 33342, calculated mean fluorescence intensity of each cells (MI, calcein). 細胞ごとの平均蛍光強度(MI、カルセイン)はリアルタイムで計算され、シリンジポンプのソフトウェアオペレーションはこれらの計算結果に基づいて実行される(すなわち視覚的サーボ制御)。 Mean fluorescence intensity per cell (MI, calcein) is calculated in real time, software operations of the syringe pump is executed based on these calculation results (i.e. visual servo control). これらの実験で使用されるプロトコルは、前述のMDRベータ試験キット(モレキュラー・プローブズ)を基礎にしている。 The protocol used in these experiments are described above in MDR beta test kit (Molecular Probes) in the foundation. 画像は以下の3つの灌流インターバル中に取得される:(1)0〜2100秒、CAM;(2)8600〜11,000秒、CAM+MK−751;および(3)14,000〜16,000秒、CAM+ベラパミル。 Images are acquired in the following three perfusion interval: (1) 0-2100 seconds, CAM; (2) 8600~11,000 seconds, CAM + MK-751; and (3) 14,000~16,000 seconds , CAM + verapamil. 典型的には、3番目の灌流インターバルまでにすべての細胞が反応する。 Typically, all cells respond to up to the third perfusion interval. MRPおよび/またはPgPを発現している部分母集団は、以下のように、MI> 200となる反応に基づいて推論される:(a)1で反応(PgPおよびMK−571のいずれも発現なし)、(b)2まで反応しない(MRP)、および(c)1または2、のいずれでも反応しない(PgPのみ)。 Subpopulations expressing MRP and / or PgP, as follows is inferred based on the reaction of the MI> 200: (a) 1 in the reaction (either PgP and MK-571 No expression ), (b) it does not react to 2 (MRP), and (c) 1 or 2, of either do not react (PgP only). インターバル1の間はPgPおよびMK−571のいずれの発現も観察されなかったが、インターバル2ではMRPの発現が観察された。 During the interval 1 it was not observed any expression of PgP and MK-571, but the expression of the interval 2 MRP was observed. MK−571によるMRP阻害のため、30個の細胞においてカルセイン蓄積によるMIの増加が200を上回った。 For MRP inhibition by MK-571, an increase in MI by calcein accumulation exceeds 200 in 30 cells. 3枚のデジタル画像(各チャネルは60秒ごとに取得された)。 3 digital images (each channel is acquired every 60 seconds). 例えば、細胞#10のMIは、この2400秒の灌流インターバル中に30から760に増加した。 For example, MI cell # 10 was increased from 30 to 760 during perfusion interval of 2400 seconds.
【0189】 [0189]
実施例6 Example 6
生細胞用のBrdU増殖アッセイ本実施例では、生細胞用のBrdU増殖アッセイシステムについて説明する。 The BrdU proliferation assay embodiment for live cells, described BrdU proliferation assay system for live cells. 特定の細胞反応を特定の生物学的エンドポイントに相関付けできるならば、任意のVSOM予測アッセイの予測力が向上する。 If a specific cell response can be correlated with the particular biological endpoint, the predictive power of any VSOM prognostic assays can be improved. アポトーシス用の蛍光アッセイは複数存在するが、DNA合成または細胞増殖の定量化に使用できるBrdU取込みなどの重要なパラメータを測定できる生細胞用の蛍光アッセイはほとんどない。 Fluorescence assay for apoptosis are several exist, fluorescence assay is little for live cells capable of measuring critical parameters such as BrdU incorporation that can be used for quantification of DNA synthesis or cell growth. これらの実験において、BrdU取込み量を定量化することによって生細胞の増殖状態を検出するための画像比演算技術が開発された。 In these experiments, the image ratio calculation techniques to detect the proliferative state of a living cell has been developed by quantifying BrdU incorporation. このアッセイのためのプロトコルは、発表されているDr. Protocol for this assay, Dr. that have been published Paul Yaswen(Stampferら、Exp. Cell Res.、208:175−188 [1993])のプロトコルをもとに適合させたものである。 Paul Yaswen (Stampfer et al., Exp Cell Res, 208:.. 175-188 [1993]) protocols are those adapted to the original. 細胞株および培地は同じものを用いた。 Cell lines and media were the same as those used. しかし、DNA合成アッセイ用として、[ H]−チミジンの代わりに5−ブロモ−2'−デオキシ−ウリジン(BrdU)を使用した。 However, for the DNA synthesis assay, [3 H] - using uridine (BrdU) - in place of thymidine 5-bromo-2'-deoxy. これらの実験は、5−ブロモ−2'−デオキシ−ウリジン標識および検出キット(No.1296736、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim))を使用して行った。 These experiments, 5-bromo-2'-deoxy - uridine labeling and detection kit was performed using (Nanba1296736, Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim)). VSOM実験の後、細胞を固定し、かつ、従来の間接免疫蛍光アッセイを用いてデジタル画像比演算に基づいてVSOMの結果を確認した。 After VSOM experiments, cells were fixed, and results were confirmed VSOM based on the digital image ratio calculated using the conventional indirect immunofluorescence assay.
【0190】 [0190]
増殖するよう刺激を与えた細胞は、細胞分裂の準備においてDNAの相補鎖を通常の2倍合成する。 Cells stimulated to grow, usually twice synthesize the complementary strand of DNA in preparation for cell division. 活発に増殖するこれらの細胞は、細胞外の培地からA、T、C、およびGのヌクレオチドを取り込み、これらをDNAの合成に使うことができる。 These cells actively proliferating, A from the extracellular medium, the uptake T, C, and G nucleotides, they can be used for the synthesis of DNA. しかし、BrdUの存在下ではTの代わりにBudUがDNA合成に使われる。 However, in the presence of BrdU BudU instead of T it is used for DNA synthesis. したがって、細胞の母集団を短時間(例えば1時間)BrdUに曝露すると、その1時間の曝露中にDNAを合成した細胞の部分母集団ではほとんどのBrdUがその核のDNAに組み込まれる。 Thus, exposure of the population of cells a short period of time (for example 1 hour) to BrdU, most of BrdU in subpopulations of the synthesized cells DNA during exposure of 1 hour is incorporated into the DNA of the nucleus. これは「パルスラベル」実験と呼ばれる。 This is called "pulse label" experiments. この実験は、Hoechst33342(H42)およびSyto 16(S16)の蛍光発光強度の比が、BrdU取込み量を細胞単位で決定する上で有用か否かを決定することを目的に実施した。 This experiment, the ratio of the fluorescence emission intensity of Hoechst 33342 (H42) and Syto 16 (S16) has a BrdU uptake was conducted for the purpose of determining whether useful in determining the cell units.
【0191】 [0191]
H42およびS16は生細胞のまたは固定された細胞の核を染色する。 H42 and S16 are stained nuclei of living cells or fixed cells. H42の蛍光発光はDNAにBrdUが組み込まれていると消失(減少)する。 Fluorescence of H42 is lost and BrdU is incorporated into DNA (decreases). しかし、S16の蛍光発光は組み込まれたBrdUの存在による影響を受けない。 However, the fluorescence emission in S16 is not affected by the presence of BrdU incorporated. したがって、H42/S16蛍光強度の比(デジタル画像を用いてピクセルごとに計算される)は、各細胞のDNAに組み込まれたBrdUの量に比例すると考えられる。 Therefore, (calculated for each pixel by using the digital image) ratio of H42 / S16 fluorescence intensity is considered to be proportional to the amount of BrdU incorporated into the DNA of each cell.
【0192】 [0192]
これを決定するため、これらの実験では184B5細胞の3つの培養皿を使用した。 To determine this, in these experiments using three dishes of 184B5 cells. 最初の48時間、2つの培養皿には無血清のMEBM(乳腺上皮細胞基本培地、CC−3151、クロンティックス(Clonetics))を使用し、3番目の培養皿には無血清のMEGM(乳腺上皮細胞増殖培地、MEGM、CC−3051、クロンティックス(Clonetics))を使用した。 The first 48 hours, two dishes of serum MEBM (mammary epithelial cell basal medium, CC-3151, Kron ticks (Clonetics)) using, the third of the culture dish serum MEGM (mammary epithelial cell growth medium, MEGM, CC-3051, was used Klong ticks (Clonetics)). MEGMはウシ下垂体抽出物(BPE)、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮成長因子(EGF)、およびインシュリンを含むが、MEBMはこれらを含まない。 MEGM bovine pituitary extract (BPE), hydrocortisone, human epidermal growth factor (EGF), and including insulin, MEBM does not include them. したがって、最初の48時間、培養皿3には増殖に一般的に必要な因子がすべて存在したが、培養皿1および2にはこれらが存在しなかった。 Thus, the first 48 hours, but the culture dish 3 was present all generally necessary factors for growth, these did not exist in the culture dish 1 and 2. MEBMは細胞を基礎代謝レベルで支持するのみであり、細胞の付着または増殖を支持するよう意図されたものではない。 MEBM is only support cell at the basal metabolic level, not intended to support the attachment or growth of cells. 48時間後、培養皿2にはMEGMを添加し(この2段階処理を「MEBM+EGF」と呼ぶ)、培養皿3にもMEGMを添加したが、培養皿1にはMEGM−hEGF(BPE、ヒドロコルチゾン、およびインシュリンは存在)を添加した。 After 48 hours, the culture dish 2 was added MEGM (called the two-step process as "MEBM + EGF"), was added MEGM to culture dish 3, the culture dish 1 MEGM-hEGF (BPE, hydrocortisone, and insulin is present) was added. 培養皿1の処理を「MEBM−EGF」と呼ぶ。 The processing of the culture dish 1 is referred to as "MEBM-EGF".
【0193】 [0193]
Stampferらの図4で示されているように、184B5細胞では供給から約18時間後にDNA合成がピークに達し、DNA合成量はMEGM細胞が最大となり、MEBM+EGF細胞ではそれより少なかった。 As shown in Figure 4 Stampfer et al, in 184B5 cells peaked DNA synthesis about 18 hours after feeding, DNA synthesis amount MEGM cells is maximized, in MEBM + EGF cells was less than that. MEBM−EGFに維持した細胞ではDNA合成がほとんど認められなかった。 The cells were maintained in MEBM-EGF was observed most of DNA synthesis. これらの結果は[ H]−チミジンを用いて得られたものである。 These results [3 H] - were obtained using thymidine. 本発明の開発中に実施した実験では、BrdUによるパルスラベルを1時間行い、次に生細胞をH42およびS16で二重染色した。 In the experiments conducted during the development of the present invention, for 1 hour pulse label by BrdU, then viable cells were double-stained with H42 and S16. 細胞のデジタル画像を360nm励起(H42信号)で1枚取得し、かつ、490 nm励起(S16信号)で第二の画像を取得した。 The digital image of the cell acquired one by a 360nm excitation (H42 signal), and obtains the second image at 490 nm excitation (S16 signal). これらの画像を処理し、ピクセルごとに比を計算した。 Processing these images, and calculating a ratio for each pixel. 次に、分析の便宜のため、得られた比の値をカラーコード化した。 Then, for the convenience of analysis, the obtained value of the ratio was color coded. これらの結果は、従来の[ H]−チミジン組込みアッセイで得られたものと一致していた。 These results are conventional [3 H] - were consistent with those obtained with thymidine incorporation assay. BrdU組込みの程度はMEGM細胞(培養皿3)が最も大きく、次に大きかったのがMEBM+EGF細胞(培養皿2)であり、MEBM−EGF細胞(培養皿1)ではBrdU組込みがほとんどみとめられなかった。 The degree of BrdU incorporation MEGM cells (dish 3) is the largest, the next larger is MEBM + EGF cells (dish 2), MEBM-EGF cells (dish 1), the BrdU incorporation was hardly observed .
【0194】 [0194]
これらの観察結果をさらに確認するため、70%エタノールおよび50 mMグリシンで、pH 2.0、−30℃で細胞を固定し、間接免疫蛍光染色を行った。 To confirm these observations further, with 70% ethanol and 50 mM glycine, pH 2.0, the cells were fixed with -30 ° C., was indirect immunofluorescence staining. この染色後、抗BrdU抗体で標識された固定細胞にBrdU消失を示すH42蛍光の低下もみとめられるか否かを決定するため、H42およびS16で細胞を再染色した。 After this staining, in order to determine H42 whether decrease in fluorescence is also observed showing a BrdU lost fixed cells labeled with anti-BrdU antibody, were re-stained cells with H42 and S16. 実際にこの影響を示す証拠がいくつか存在した。 In fact evidence of this effect there were several. MEGM細胞が最大量のBrdU染色を示した。 MEGM cells showed BrdU staining of the maximum amount. 同細胞を青チャネルで調べたところ、BudUで染色される細胞はH42蛍光信号が低いという一般的な傾向がみとめられた。 Examination of the same cell in the blue channel, cells that are stained with BudU was observed a general trend of H42 fluorescence signal is low. BrdU取込みを定量化する方法は2つある。 Method for quantifying BrdU incorporation is twofold. 第一は抗BrdU抗体検出であり、これは赤色の蛍光の強度で表される。 The first is an anti-BrdU antibody detection, which is represented by the intensity of the red fluorescence. 第二は、青色の核蛍光強度(H42)を緑色の核蛍光強度(S16)で除した比を細胞ごとに計算するものである(すなわち画像比演算)。 Second is to calculate the ratio by dividing the blue nuclei fluorescence intensity (H42) with a green nuclear fluorescence intensity (S16) for each cell (that is, the image ratio calculation). BudU取込みによってH42は消光するがS16は消光しないため、赤色を示す核は青チャネルにおいてH42蛍光の低下を示すと考えられる。 Since H42 by BudU uptake is quenched S16, do not extinguish, nuclei exhibiting red is considered to show reduced H42 fluorescence in the blue channel.
【0195】 [0195]
実施例7 Example 7
mRNA転写の画像化本実施例では、VSOM実験の長所を示す実験について説明する。 The imaging embodiment of mRNA transcripts, described experiments showing the advantages of VSOM experiments. このような実験は、アンチセンス化合物、送達システム、および信号増幅法の開発の補助として、組織培養中のmRNA転写をリアルタイムで画像化する手段を提供すると予測される。 Such experiments, antisense compounds, delivery systems, and as an aid in the development of the signal amplification method is expected to provide a means of imaging in real-time mRNA transcripts in tissue culture. リアルタイム医用画像技術に適した放射線標識アンチセンス化合物を提供する実験についても説明する。 Providing radiolabeled antisense compounds suitable for real-time medical imaging techniques are also described experiment.
【0196】 [0196]
これらのVSOM実験では、bcl−2タンパク質をコードしているmRNAとともに、モデル系としてヒト乳癌細胞株BT−474が使用される。 In these VSOM experiments, together with the mRNA encoding the bcl-2 protein, human breast cancer cell line BT-474 is used as a model system. 個々の細胞内の蛍光標識したアンチセンス化合物が追跡され、細胞内の適切な標的mRNAに誘導され、かつ、個々の細胞が予測された方式で影響されているか否かが決定される。 Antisense compounds fluorescently labeled in the individual cells are tracked, is induced to the appropriate target mRNA in the cell, and whether the individual cells have been affected by the expected scheme is determined. デジタル画像蛍光鏡検法、新規性のある計算技術、およびバイオインフォマティクスツールの使用により1つのチャネルで蛍光アンチセンス化合物が追跡され、別のチャネルでは他の細胞反応(例えばアポトーシス)がモニターされる。 Digital image fluorescence microscopy, novel resistant some calculation techniques, and fluorescent antisense compounds in a single channel by using bioinformatics tools are tracked, other cellular reactions in another channel (e.g., apoptosis) is monitored. bcl−2のmRNAレベルでの発現が、時間、細胞外ストレス、およびアンチセンス化合物の構造の関数として画像化される。 Expression at the mRNA level of bcl-2 is the time, is imaged as a function of the structure of the extracellular stress, and antisense compounds. これらの観察結果は各細胞内のbcl−2タンパク質レベルおよび各細胞の最終運命と相関付けられる。 These observations are correlated with the final fate of bcl-2 protein levels and each cell in each cell. したがって、これらの実験は、PETで遺伝子発現を画像化するためのアンチセンス化合物のインテリジェント設計に有用な、特定のアンチセンス化合物の生物物理学的特性に関する詳細な情報を提供する。 Accordingly, these experiments are useful for intelligent design of antisense compounds for imaging of gene expression in PET, which provides detailed information about the biophysical properties of the particular antisense compound. 事実、本発明のインビトロ技術により、インビボ研究(例えば、異種腫瘍細胞株BT−474を移植したヌードマウスにおける研究)の場合よりも多くの化合物修飾を試験することが可能となる。 In fact, the in vitro technique of the present invention, in vivo studies (for example, studies in nude mice transplanted with heterologous tumor cell line BT-474) it is possible to test many compounds modified than in.
【0197】 [0197]
いくつかの態様において、VSOM実験とインビボPET撮影試験の両方が可能となるよう、同じ配列だが5'末端を修飾したAS−ODN化合物を使用した。 In some embodiments, as both VSOM experiments and in vivo PET imaging test can be performed, but the same sequence was used an AS-ODN compound having a modified 5 'end. VSOM実験では蛍光色素を使用し、PET撮影試験では2つのフッ化放射性成分の1つを使用した。 Using fluorescent dyes in VSOM experiment, in PET imaging study using one of the two fluorinated radioactive components. いずれの場合も、蛍光色素および放射性標識の付着を容易にするため5'末端にヘキシルアミンリンカーを結合させた。 In both cases, the 5 'end was bound hexylamine linker to facilitate attachment of fluorochromes and radioactive labels. 追加の実験では、送達ビークルとしてリポソームおよびイムノリポソームを用いた。 In additional experiments, using liposomes and immunoliposomes as delivery vehicles. いくつかの実験では、放射線標識試験で使用したフッ化成分の非蛍光、非放射性のバージョンを生物学的エンドポイントの基礎とした。 In some experiments, non-fluorescent fluoride components used in radiolabeled test, a non-radioactive version the basis of biological endpoints. この方式により、AS−ODNの5'末端における種々の置換基の結果を決定した。 This scheme was determined results of the various substituents in the 5 'end of the AS-ODN. さらに、β−ガラクトシダーゼプロトコルで得られる信号増幅の量を本発明とともに使用することができる。 Furthermore, the amount of signal amplification obtained in the β- galactosidase protocol can be used with the present invention. 他の態様ではペプチド核酸が使用される。 In other embodiments the peptide nucleic acids are employed. ペプチド核酸(PNA)は、デオキシリボース骨格全体がポリアミド(ペプチド)鎖で置換された、修飾オリゴヌクレオチドである(Gewirtzら、Blood92:36 [1998]; ならびに、TemsamaniおよびGuinot、Biotechnol. Appl. Biochem.、26:65−71[1997])。 Peptide nucleic acid (PNA), the entire deoxyribose backbone has been replaced with a polyamide (peptide) chain, a modified oligonucleotide (Gewirtz et al, Blood92:.. 36 [1998]; and, Temsamani and Guinot, Biotechnol Appl Biochem. , 26: 65-71 [1997]).
【0198】 [0198]
1つの態様では以下のASD−ODN配列を使用した。 In one embodiment using the ASD-ODN sequences below.
【0199】 [0199]
bcl−2のオープンリーディングフレームの最初の6コドンに対するアンチセンス配列を有する、配列番号:1に示した18−merの完全なホスホロチオエートは、重症免疫不全マウスに移植したDoHH2リンパ腫に対する有効性が認められている(Raynaudら、[1997])。 Having the antisense sequence to the first 6 codons of the open reading frame of bcl-2, SEQ ID NO: complete phosphorothioate 18-mer indicated in 1, efficacy was observed for DoHH2 lymphoma transplanted into severe immunodeficient mice and that (Raynaud et al., [1997]). 15−merの2つのPNA−ODN(配列番号:2および3)は無細胞系でのインビトロ評価が行われている(Mologniら、[1999])。 Two PNA-ODN of 15-mer (SEQ ID NO: 2 and 3) in vitro evaluation in a cell-free system has been performed (Mologni et al., [1999]). 特に興味深いのは、mRNA転写が完全に阻害されるのは両方のPNA−ODNが同時に存在する場合のみであるということである。 Of particular interest are the mRNA transcription is completely inhibited both PNA-ODN is that only if simultaneously present.
【0200】 [0200]
蛍光標識したPT−G3139、PNA−1、およびPNA−4を市販の供給源から入手した(例えばGenset、http://www.gensetoligos.com)。 Was obtained fluorescently labeled PT-G3139, PNA-1, and the PNA-4 from commercial sources (e.g. Genset, http: //www.gensetoligos.com). これらAS−ODNの修飾物であり骨格がPD、PT、MP、またはPNAの骨格結合で完全に構成されるもの、ならびに、骨格結合に種々の置換および混合を有する化合物も使用した。 These things are modifications of AS-ODN which skeleton PD, PT, is composed entirely of backbone linkages of MP or PNA,, and, also using compounds having various substituents and mixed backbone linkages.
【0201】 [0201]
最初の実験を行い、一連の単一細胞の反応としてデータベースに記録した。 Make the first experiment were recorded in the database as a reaction of a series of single cells. 前述のように骨格結合に種々の修飾を有する、蛍光標識したAS−ODNのセットを使用した。 With various modifications backbone linkages, as described above, was used a set of fluorescently labeled AS-ODN. ベースラインとなるVSOM実行のセットを行った。 It was carried out a set of VSOM execution as a base line. これらの実行において、細胞は顕微鏡カバーグラス上で増殖させ、かつ、細胞観察用に63×NA1.3油浸対物レンズを使用した。 In these runs, the cells grown on microscope cover glass, and was used 63 × NA 1.3 oil immersion objective lens for cell observation. 細胞を温度管理した微小灌流チャンバに入れた。 The cells were placed in a small perfusion chamber and temperature management. 細胞質区画、核質区画、およびミトコンドリア区画の最初のセグメント化を以下の要領で行った。 Cytoplasmic compartments was performed nucleoplasm compartments, and the first segment of the mitochondrial compartment in the following manner.
【0202】 [0202]
カルシウム、マグネシウム、グルコース、およびピルビン酸塩を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D−PBS)に溶解した蛍光化合物TMRE(テトラメチル・ローダミン・エチルエステル;モレキュラー・プローブズ)をコンピュータ制御のシリンジポンプにより細胞チャンバに注入する。 Calcium, magnesium, glucose, and Dulbecco's phosphate buffered saline containing pyruvate (D-PBS) fluorescent compound was dissolved in TMRE; of (tetramethyl-rhodamine ethyl ester Molecular Probes) a computer-controlled syringe pumps by injection into the cell chamber. 化合物TMREは、Nerstの式(Farkasら、前述)によってミトコンドリアの膜電位を決定するために使用される、再配分型のカチオン染料である。 Compound TMRE the formula Nerst (Farkas et al., Supra) are used to determine the mitochondrial membrane potential by a cationic dye of redistribution. ミトコンドリア染料であるローダミン123と異なり、TMREは迅速かつ可逆的にミトコンドリア内で平衡し、かつ、程度はより少ないものの細胞質でも平衡する。 Unlike Rhodamine 123 is a mitochondrial dye, TMRE quickly and equilibrated with reversibly within mitochondria, and the degree is equilibrated in the cytoplasm of fewer ones. 核質区画はTMREで染色されない。 Nucleoplasm compartment is not stained with TMRE.
【0203】 [0203]
次に、緩衝液のみが入ったコンピュータ制御のシリンジを使用して細胞からTMREを洗い流す。 Then, wash the TMRE from cells using a computer-controlled buffer only has entered the syringe. TMREは細胞から容易に洗い流すことができる。 TMRE can be washed off easily from the cell. 次に、別のコンピュータ制御シリンジを使用して、蛍光標識AS−ODNを微小灌流チャンバに注入する。 Then, using another computer controlled syringe, injecting the fluorescent-labeled AS-ODN to microperfusion chamber. AS−ODNが発する蛍光信号が可視状態になるときの濃度が記録され、かつ、AS−ODNの灌流が自動的に停止される。 The fluorescence signal emitted by the AS-ODN is recorded concentration at which become visible, and perfusion of AS-ODN is stopped automatically. これがVSOM実行の前半の終了である。 This is the end of the first half of the VSOM execution.
【0204】 [0204]
VSOMオペレーションを確認するための再生ができるよう、すべてのデジタル画像がデータベースに追加される。 To allow playback for confirming the VSOM operations, all of the digital image is added to the database. このように、多チャネルデジタル画像、実験パラメータ、および、コンピュータ制御の化合物灌流に対する単一細胞の反応(63×で細胞5〜10個)がデータベースの一部となる。 Thus, the multi-channel digital image, experimental parameters, and, (5 to 10 cells in 63 ×) reaction of a single cell to the compound perfusion computer control is part of the database.
【0205】 [0205]
最初のVSOM実行の後半では、蛍光標識AS−ODNの蛍光分布パターンと、細胞小器官特異的蛍光染料(モレキュラー・プローブズ)を用いて同じ細胞種について以前に取得された蛍光分布パターンまたは蛍光AS−ODNと細胞小器官特異的蛍光染料とで二重染色した現在観察中の細胞について別の蛍光チャネルで取得した現在の蛍光パターンとの比較が行われる。 In the second half of the first VSOM execution, the fluorescence distribution pattern of fluorescent-labeled AS-ODN, the fluorescence distribution pattern or fluorescence obtained for the same cell type previously with organelle-specific fluorescent dye (Molecular Probes) AS- comparison with current fluorescence pattern acquired by another fluorescent channel is performed for ODN and organelle-specific fluorescent dye and double stained cells currently observed. VSOMは、細胞内のAS−ODNの位置を決定し終えると、適切なシリンジから適切な化合物を添加して細胞内のAS−ODN分布に対する影響を観察する。 VSOM, when finished to determine the position of the AS-ODN in the cell, with the addition of suitable compounds to observe the effect on AS-ODN distribution in the cell from a suitable syringe.
【0206】 [0206]
蛍光標識AS−ODNのリソソーム隔離が生じる場合は、リソソームを選択的に透過化することが知られている化合物が、コンピュータ制御の灌流シリンジにより制御された流量でチャンバ内に灌流される。 If lysosomal isolation of fluorescently labeled AS-ODN occurs, compounds which are known for selectively transmitting the lysosomes is perfused into the chamber at a rate controlled by perfusion syringe computer control. モネンシンプロトンイオノフォアナトリウムなど複数の化合物が、ヒト乳癌細胞の酸性小胞内に捕捉された蛍光化合物を解放することが明らかになっている(Schindlerら、[1996]を参照)。 (See Schindler et al., [1996]) in which a plurality of compounds such as monensin proton ionophore sodium, that release the fluorescent compounds trapped in the acidic vesicles of human breast cancer cells has been clarified. 蛍光標識AS−ODNを解放するのに必要な(例えば)モネンシンの量がデータベースに記録される。 The amount of (for example) monensin needed to release the fluorescent-labeled AS-ODN is recorded in the database. 隣接区画(例えば核)への再分布に要した時間およびその結果生じた核内の染色パターンも記録される。 The staining pattern of time spent redistribution to adjacent compartment (e.g. nuclear) and the resulting nucleus is also recorded.
【0207】 [0207]
核からAS−ODNを除去するためのVSOM摂動は、当業者には周知である「クランピング」技術を使用して実施される。 VSOM perturbation to remove AS-ODN from nuclei, one skilled in the art will be implemented using the "clamping" technique is well known. これらの技術により、ユーザーは、単純に周囲の細胞外培地のイオン(例えばカリウム)の濃度を変化させることにより細胞内のカリウム濃度を変化させることができる(Negulescuら、前述)。 These technologies, users simply can be changed potassium concentration in the cell by varying the concentration of the surrounding extracellular medium of the ion (e.g., potassium) (Negulescu, et al., Supra). これと同じ方法を使用することによって細胞内のカルシウムレベルを変化させることができる。 It is possible to change the level of intracellular calcium by using this same method. VSOMシステムは、核の塩基性タンパク質に対するAS−ODNの結合に干渉するため、細胞内のこのようなイオンの濃度を漸増させる。 VSOM system for interfering with the binding of AS-ODN against basic protein nuclear thereby increasing the concentration of such ions in the cell. この場合も、核環境から化合物を解放させるのに必要な濃度およびその他の環境条件が記録される。 Again, concentration and other environmental conditions needed to release the compound from the nuclear environment are recorded. この方法が成功しない場合は、オンラインの低張細胞溶解が実行され、かつ、以後の実験ではより厳しい環境条件が使用される。 If this method is not successful, hypotonic lysis online is performed, and, more stringent environmental conditions are used in subsequent experiments.
【0208】 [0208]
いくつかの態様において、VSOMは、細胞膜に結合したAS−ODNを解放するため、非生理学的なpHの緩衝液によるすすぎまたはトリプシン含有緩衝液によるすすぎによって摂動を与える。 In some embodiments, VSOM in order to release the AS-ODN bound to the cell membranes, perturbing by rinsing with rinsing or trypsin-containing buffer with a non-physiological pH buffers. この場合も、蛍光標識AS−ODNの解放に必要な摂動の大きさに関する定量的データが細胞ごとに記録され、かつ、現在使用中のAS−ODNの化学構造と相関付けられる。 Again, quantitative data on the size of the perturbation required for the release of the fluorescent-labeled AS-ODN is recorded for each cell, and is correlated with the chemical structure of AS-ODN currently in use.
【0209】 [0209]
好ましい態様において、(蛍光性および非蛍光性の)AS−ODNの生理学的影響が複数の方法で評価される。 In a preferred embodiment, the physiological effects of (fluorescent and non-fluorescent) AS-ODN are evaluated in several ways. 多くの場合はアポトーシス誘発性細胞外ストレス(例えば、紫外光、抗癌剤、カルシウムイオノフォアなど)が印加される。 Apoptosis-inducing extracellular stress (e.g., ultraviolet light, anticancer agents, calcium ionophores, etc.) in many cases is applied. AS−ODNによるBT−474細胞中のbcl−2タンパク質量の低減が成功した場合は、bcl−2タンパク質の減少およびこれらの細胞のアポトーシスに対する抵抗能力が観察される。 If reduction of bcl-2 protein content in BT-474 cells by AS-ODN is successful, the resistance capacity is observed for the reduced and apoptosis of these cells of bcl-2 protein. 最も直接的な方法では、VSOM実験の後に細胞が固定され、bcl−2タンパク質に対する抗体を使用した間接免疫蛍光分析が行われ、続いて、同じ細胞視野に戻ってbcl−2タンパク質の定量が行われる(これは、細胞ごとに観察される蛍光信号と比例する)。 The most direct way, the cells are fixed after the VSOM experiments, indirect immunofluorescence analysis using antibodies is performed for bcl-2 protein, followed by quantification of bcl-2 protein back to the same field of cells row dividing (which is proportional to the fluorescence signal observed for each cell). しかし、本発明が特定の段階のセットに限定されることはなく、当業者には他の方法も本発明との関連で使用するのに適していることが理解されるものと思われる。 However, the present invention is not limited to a particular set of steps, to those skilled in the art is believed to be understood to be suitable for use in connection with also the present invention other methods.
【0210】 [0210]
当業者に周知の他の多くのアポトーシスマーカーも本発明とともに使用可能である。 Many apoptotic markers other well known to those skilled in the art can also be used with the present invention. これらの方法には形態学的アッセイシステムおよび蛍光アッセイシステムが含まれる。 These methods include morphological assay systems and fluorescent assay systems. 例えば、VSOM実験で収集されるチャネルの1つは透過光チャネルであり、このチャネルを介して膜のブレブを観察することができる。 For example, one of the channels to be collected by VSOM experiments are transparent optical channel, it is possible to observe the blebs of the membrane through the channels. また、アポトーシスに特徴的な核断片化を明らかにできる、種々の抗タンパク質(例えばアネキシンV)抗体およびDNA染料も存在する。 Also, it can reveal the characteristic nuclear fragmentation in apoptosis, also present various anti-protein (e.g. annexin V) antibody and DNA dyes. さらに、すでに詳述したように、細胞膜完全性(例えば細胞の生存率)を示すカルセイン−AMなどの染料も、VSOM実験中に蛍光チャネルの1つで使用するのに適している。 Further, as already described, dyes such as calcein -AM showing cell membrane integrity (e.g. cell viability) are also suitable for use in one of the fluorescent channels during VSOM experiments. さらに、LDS−751で染色した185b5細胞についてすでに詳述したように、アポトーシスの早期に生じるミトコンドリアの膜電位の消失もアポトーシスの指標として有用である。 Further, as already described in detail 185b5 cells stained with LDS-751, loss of mitochondrial membrane potential that occurs early in apoptosis are also useful as an indicator of apoptosis.
【0211】 [0211]
以上より、本発明が細胞種間の差異に関する知識ベースの発見および最適化のための改良された方法およびシステムを提供することは明らかであると思われる。 As described above, the present invention is believed it is clear that it provides an improved method and system for the discovery and optimization of knowledge base differences between cell types. 特に本発明は視覚的サーボ制御光学顕微鏡および分析方法を提供する。 In particular, the present invention provides a visual servo control optical microscopy and analytical methods. 本発明は、数百の個々の生細胞を経時的に詳しくモニターする手段;多チャネルにおける動的生理学的反応の定量化;リアルタイムのデジタル画像セグメント化および分析;インテリジェントなかつ繰り返しの、コンピュータ印加による細胞ストレスおよび細胞刺激;ならびに、長期的な研究および観察において同じ細胞視野に戻ることができる能力を提供する。 The present invention, hundreds of over time closely monitored to means an individual living cells; quantification of dynamic physiological responses in a multi-channel; real-time digital image segmentation and analysis; intelligent Nakatsu repeated, the cells of the computer application stress and cell stimulation; and to provide the ability to return to the same field of cells in long-term studies and observations. 本発明はさらに、特定の細胞部分母集団用に培養条件を最適化する手段を提供する。 The present invention further provides a means for optimizing the culture conditions for a particular cell subpopulations.
【0212】 [0212]
本明細書で言及した発表物および特許はすべて参照として本明細書に組み入れられる。 Published and patents mentioned herein are incorporated herein all reference. 当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に記載された本発明の方法およびシステムに種々の改変および変形を行い得ることが明らかであると思われる。 To those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the present invention, it appears to be clear that the method and system of the present invention described herein may make various modifications and variations. 特定の好ましい態様に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲で請求されている本発明がこのような特定の態様に不当に限定されることはないと理解されるべきである。 While the invention has been described with respect to certain preferred embodiments, the invention as claimed in the appended claims is to be understood that not to be unduly limited to such specific embodiments. 事実、本発明を実行するための本明細書に記載の方式に対する、当業者に明白である種々の改変は、本明細書に記載の特許請求の範囲に含まれるものと意図される。 In fact, for the system described herein for carrying out the present invention, various modifications which are obvious to those skilled in the art are intended to be within the scope of the claims described herein.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】本発明のマイクロプロセッサ/コンピュータ、ロボット、および光学システム、ならびにシステムのその他の構成要素間の関係を示す図である。 [1] a microprocessor / computer of the present invention showing the robot, and an optical system, and the relationship between other components of the system.
【図2】本発明の代替的態様を示す別の図である。 Is another diagram showing an alternative embodiment of the present invention; FIG.
【図3】Blob ManagerおよびInstrument Managerの主要なオブジェクトの関係を示す図である。 FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the main object of the Blob Manager and Instrument Manager. 追加の機器はそれぞれControlSourceおよびBlobSource用のプラグインを必要とする。 Additional equipment each of which requires a plug-in for ControlSource and BlobSource. ControlSourceおよびBlobSourceの詳細はIDLレベルで隠されている。 ControlSource and BlobSource details are hidden in the IDL level.
【図4Aおよび図4B】VSOM実験の1つの態様を示す略図である。 Figure 4A and 4B are schematic diagrams showing an embodiment of VSOM experiments.
【図5】多視野(MF)VSOM実験の1つの態様を示す略図である。 5 is a schematic representation of one embodiment of the multi-view (MF) VSOM experiments.
【図6】2つのデータモデルを提供する。 [6] provides two data models. パネルAはバイオインフォマティクスシステム用の完全データモデルであり、パネルBはインビボ処置用の詳細な内訳(breakdown)である。 Panel A is a complete data model for bioinformatics systems, panel B is a detailed breakdown for in vivo treatment (breakdown).
【図7】分割の過程を示す。 Figure 7 shows the process of division. パネルAは、組織および細胞培養物から個々の核を抽出するためのプロトコルを提供する。 Panel A provides a protocol for extracting individual nuclei from tissues and cell cultures. パネルBは、隣接する2つの核を用いた重心の変換の様子を示す。 Panel B shows the state of transformation of the center of gravity using two adjacent nuclei.
【図8】元の細胞を示す写真である。 FIG. 8 is a photograph showing the original cell.
【図9】DAPIにおける分割の結果を示す。 Figure 9 shows the results of division in DAPI.
【図10】本発明の知識ベースのVSOMの1つの態様における種々の構成要素の相互作用を示す図である。 Is a diagram illustrating the interaction of the various components in one embodiment of the knowledge base VSOM of the present invention; FIG. この図において、イタリック体の項目は全体のシステムアーキテクチャ(architecture)で定義されるサービスを指す。 In this figure, items in italics refer to services that are defined by the overall system architecture (: architecture).
【図11】本明細書に記載されたVSOM実験(実施例5を参照)のいくつかで使用される、シリンジ、シリンジ内の溶液中の組成物、流速、および灌流間隔に関する詳細情報の図である。 [Figure 11] is used in some VSOM experiments described herein (see Example 5), a syringe, the composition in solution in the syringe, flow rate, and in view of the detailed information on the perfusion intervals is there. 両方の実行(run)においてポンプスケジュールを用いた。 Using pump scheduled in both execution (the run). 2回の実行を(同じ日に続けて)行った後、コンピュータ画面に表示されたプロット図を保存した。 2 times of the execution (followed on the same day) after, was to save the plot, which is displayed on the computer screen. 図の下部の黒いウィンドウは、実行1および実行2のプロット図である。 Lower black window drawing is a plot of execution 1 and the execution 2. 各場合における赤い線は全視野中のすべての細胞反応の平均を表す。 The red line in each case represents the mean of all the cell response in the entire field of view. MCF−7WTC(DS、実行1)およびMCF−7(MDR、実行2)について記録されたこれら2つのプロット図中で示されているように、DS細胞(上方のプロット)のカルセイン蓄積量(240±82、N=336)はMDR細胞の蓄積量(103±80、N=161)より多かった。 Calcein accumulation of MCF-7WTC (DS, run 1) and MCF-7 (MDR, run 2) as indicated by these in two plots recorded for, DS cells (upper plot) (240 ± 82, N = 336) was higher than the accumulated amount of MDR cells (103 ± 80, N = 161). このことは、多数の細胞での平均を表すマルチウェルプレート実験で同じDS細胞およびMDR細胞について観察されるカルセイン蓄積量の相対的差異と一致する。 This is consistent with the relative difference calcein accumulation observed for the same DS cells and MDR cells in multiwell plates experiment represents the average of a number of cells.
【図12】実施例4の実行1における各DS細胞の個々の細胞反応を示したグラフである。 12 is a graph showing the individual cell response of each DS cells in run 1 of Example 4. 全細胞の反応の平均±標準偏差を黒色で重ねて示す。 Mean ± standard deviation of the response of whole cell shown superimposed in black. 個々の反応は本グラフ中の個々のラインで示す。 Each reaction shown in each line in the graph. VSOM実験中、各細胞の細胞蛍光の平均値をモニターし、母集団平均からの偏差を検出した。 During VSOM experiments to monitor the average value of the cell fluorescence of each cell was detected deviation from the population mean. 例えば、矢印は、生存率および原形質膜完全性を失い始めた複数の細胞を示している。 For example, arrows indicate the plurality of cells began to lose viability and plasma membrane integrity. このような細胞はカルセインを保持することができず、蛍光信号が減少する。 Such cells can not be held calcein fluorescence signal decreases.
【図13】実行2(実施例4)で選択した4つの細胞について個々の細胞反応の測定結果を示す。 [13] for the four cells selected in Run 2 (Example 4) shows the measurement results of the individual cell response. これは、フローサイトメトリーおよびマルチウェルプレートアッセイでは得られない種類の詳細な生理学的情報の典型であり、本発明のVSOM技術が望ましい能力を有していることを示す。 This is a typical detailed physiological information types which can not be obtained by flow cytometry and multi-well plate assay, indicating that VSOM technique of the present invention has a desirable capability. 示されているように、カルセインの蓄積および保持に関する詳細な比率情報は、VSOM実験全体にわたって入手可能である。 As shown, detailed ratio information about the accumulation and retention of calcein is available throughout VSOM experiments.
【図14】本発明の1つの態様の図である。 14 is a diagram of one embodiment of the present invention. パネルAはDeepView Bioinformaticsシステムの機能アーキテクチャの図である。 Panel A is a diagram of the functional architecture of DeepView Bioinformatics system. パネルBはポンプログ(pump Panel B pump log (pump
log)の例を示し、パネルCはXMLレシピファイルの例を提供し、パネルDはICSイメージヘッダーを提供する。 An example of a log), Panel C provides an example of XML recipe file, Panel D provides ICS image header.
【図15】インビボ実験およびインビトロ実験のフローチャートである。 15 is a flowchart of in vivo experiments and in vitro experiments.
【図16】細胞の各区画について計算した構造および機能の特徴(feature)ベースの階層保存を示す略図である。 16 is a schematic diagram showing a hierarchical storage characteristics (Description feature) based calculations structure and function for each compartment of a cell. 各実験は、微速度ビデオ撮影および、必要とされる灌流ポンプの操作とで構成される(図には示していない)。 Each experiment (not shown) composed of a lapse video recording and an operation of the perfusion pump required. 画像は最下層レベルに保存される。 Image is stored in the lowest level. 次のレベルには、細胞内の解剖学的組織の構造および機能が属性グラフとして保存される。 The next level, the structure and function of the anatomy of the cells are stored as attribute graph. 第三のレベルでは、特定の位置に対応する反応曲線および、化合物の予想軌跡とが構成される。 In the third level, response curve corresponds to a particular location and, constitute a predicted locus of the compound. 第四の層は、実験間の相互相関試験とともに推移確率を構築するための機構を提供する。 The fourth layer provides a mechanism for building a transition probability together with the cross-correlation test between experiments.
【図17】培養皿中の細胞局在性の基準となるフレームを確立するための、エッチングを施した培養皿の使用を示した、拡大(close−up)略図である。 [Figure 17] for establishing a frame as a cellular localization of a reference in the culture dish, demonstrated the use of a culture dish etched, an enlarged (close-up) schematic.

Claims (39)

  1. 以下の段階を含む方法: Said method comprising the steps of:
    (a)細胞または細胞の細胞内構成要素をモニターする検出装置から細胞画像データを受け取る段階; (A) comprises receiving the cell image data from the detector for monitoring the intracellular components of the cell or cells;
    (b)細胞画像データを分析する段階;および(c)分析された細胞画像データに応じて細胞または細胞内構成要素を刺激するよう適合された複数の刺激装置を自動的に作動させる段階。 Step (b) analyzing the cell image data; and (c) analyzed cell image data depending on the step of automatically operating a plurality of stimulation device adapted to stimulate a cell or subcellular components.
  2. (c)が、分析された細胞画像データに応じて細胞を刺激するための複数の刺激装置を自動的かつ独立的に作動させる段階を含む、請求項1記載の方法。 (C) comprises the step of actuating a plurality of stimulation devices for stimulating cellular according to the analysis cell image data automatically and independently, the method of claim 1.
  3. 細胞画像データを分析する段階が、細胞の形態測定結果の分析、細胞の色の分析、および細胞の動きの分析からなる群より選択される少なくとも1つの分析を含む、請求項1記載の方法。 Step of analyzing the cell image data, analysis of cell morphology measurements, color analysis of the cell, and at least one analysis selected from the group consisting of analysis of cell movement, the process of claim 1.
  4. 細胞画像データが細胞情報の基準データベースと比較される、請求項1記載の方法。 Cell image data is compared with a reference database of cellular information, The method of claim 1, wherein.
  5. 細胞画像データが細胞情報の遠隔(remote)基準データベースと比較される、請求項1記載の方法。 Cell image data is compared with the remote (remote) reference database of cellular information, The method of claim 1, wherein.
  6. 検出装置が顕微鏡を含む、請求項1記載の方法であり、以下の段階を更に含む方法: Detecting device comprises a microscope, a method according to claim 1, wherein, the method further comprising the steps of:
    VSOMを使用して細胞をモニターする段階。 Stage to monitor the cells using VSOM.
  7. 刺激装置がシリンジである、請求項1記載の方法。 Stimulator is a syringe, the process of claim 1.
  8. 以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法: Further comprising the steps of claim 1, wherein the method:
    (d)細胞画像データを時間の関数として保存する段階。 Step (d) be stored as a function of the cell image data time.
  9. 細胞が生存しており、かつ、細胞内構成要素が生細胞内に存在する、請求項1記載の方法。 Cells were alive and subcellular components present in the living cell, the method of claim 1.
  10. 以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法: Further comprising the steps of claim 1, wherein the method:
    (d)段階(a)から(c)までを繰り返す段階。 Step (d) repeating the steps (a) to (c).
  11. 細胞アレイを分析する方法であり、以下の段階を含む方法: A method of analyzing cells array, the method comprising the steps of:
    a)i)細胞アレイ、ii)光学システム、iii)計算手段、iv)少なくとも1つの試験刺激、およびv)ロボットシステムを提供する段階; a) i) cell array, ii) an optical system, iii) calculating means, iv) at least one test stimulus, and v) providing a robotic system;
    b)第一の信号を提供するため、細胞アレイが発する光を光学システムを用いて検出する段階; b) for providing a first signal, detecting the light emitted from the cell array using an optical system;
    c)細胞アレイが発する光に対応する第一の信号を計算手段に提供する段階; c) providing a first signal corresponding to the cell array emits light to the calculating means;
    d)第二の信号を生成するために第一の信号を使用する段階であって、刺激された細胞アレイを提供するための、細胞アレイに対する少なくとも1つの試験刺激の送達を、第二の信号が制御する段階;ならびにe)試験刺激を送達する段階であって、刺激された細胞アレイが発する光を光学システムがさらに検出する段階。 d) a step of using the first signal to generate a second signal, for providing stimulated cells arrays, the delivery of at least one test stimulus to the cell array, a second signal there step controls; a step of delivering a and e) test stimulus, stimulated cell stage array light optical system further detection emanating.
  12. 試験刺激が第一の信号に従って自動的に細胞アレイに印加される、請求項11記載の方法。 Test stimulus is automatically applied to the cell array in accordance with a first signal, The method of claim 11.
  13. ロボットシステムが少なくとも2つの微量液体チャネルを介して試験刺激を細胞アレイに送達する、請求項11記載の方法。 Robotic system for delivering a test stimulation via at least two microfluidic channels to the cells array 12. The method of claim 11, wherein.
  14. 光学システムが少なくとも1つの顕微鏡を含む、請求項11記載の方法。 The optical system comprises at least one microscope method of claim 11.
  15. 顕微鏡が、共焦点顕微鏡および蛍光顕微鏡からなる群より選択される、請求項14記載の方法。 Microscope is selected from the group consisting of confocal microscopy and fluorescence microscopy The method of claim 14, wherein.
  16. 細胞アレイが少なくとも2つの細胞種を含む、請求項11記載の方法。 Cell array comprises at least two cell types, The method of claim 11.
  17. 光学システムが、細胞アレイに含まれる細胞種の中の細胞内構成要素を検出するために細胞アレイを走査する、請求項16記載の方法。 Optical system, to scan the cell array in order to detect intracellular components in a cell type included in cell array 17. The method of claim 16, wherein.
  18. 細胞内構成要素が、核、核小体、ミトコンドリア、リソソーム、ファゴリソソーム、および貯蔵小胞からなる群より選択される、請求項17記載の方法。 Intracellular components, nuclear, nucleolar, mitochondria, lysosomes, phagolysosomes, and storage is selected from the group consisting of vesicles The method of claim 17.
  19. 少なくとも1つの細胞内構成要素が標識される、請求項17記載の方法。 At least one cellular component is labeled, The method of claim 17.
  20. 細胞内構成要素が試験刺激により標識される、請求項18記載の方法。 Intracellular component is labeled by test stimuli method of claim 18, wherein.
  21. 細胞内構成要素が、蛍光染料、放射性化合物、酵素、および生体染料(vital dye)からなる群より選択される少なくとも1つの化合物で標識される、請求項17記載の方法。 Intracellular components, fluorescent dyes, radioactive compounds, enzymes, and are labeled by at least one compound selected from the group consisting of vital dye (Vital dye), The method of claim 17.
  22. 光学システムが標識をデジタルデータに変換する、請求項11記載の方法。 The optical system converts the label into digital data, The method of claim 11.
  23. ロボットシステムが、生物学的活性成分の細胞アレイへの送達を自動的に調整するためにデジタルデータを利用する、請求項11記載の方法。 Robotic system utilizes digital data to automatically adjust the delivery to the cell array of biologically active components, The method of claim 11.
  24. 細胞情報プロフィールを作製するために、刺激された細胞アレイが発する光を分析する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。 To generate cell information profile further comprises the step of analyzing the light emitted by the stimulated cells array 12. The method of claim 11, wherein.
  25. 細胞情報プロフィールを細胞情報の基準データベースと比較する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。 Cell information profile further includes the step of comparing a reference database of cellular information, 25. The method of claim 24.
  26. 細胞アレイを分析するためのシステムであって、以下を含むシステム: A system for analyzing cellular array, the system comprising:
    少なくとも1つの細胞アレイ、細胞アレイが発する光を検出するための光検出手段を有する光学システム、ロボットシステム、ならびに、光学システムからの入力を受け取る手段を有する第一のプログラム環境およびロボットシステムへの出力を提供する手段を有する第二のプログラム環境を含むコンピュータシステム。 At least one cell array, an optical system having an optical detecting means for detecting light emitted by the cell array, a robotic system, and the output of the first program environment and robot system having means for receiving input from the optical system computer system comprising a second program environment having a means for providing.
  27. ロボットシステムが少なくとも2つの試験刺激源をさらに含む、請求項26記載のシステム。 Further comprising The system of claim 26, wherein the robotic system at least two test stimulus sources.
  28. 少なくとも2つの試験刺激源が生物学的活性組成物を含む、請求項26記載のシステム。 Comprising at least two test stimulus source biologically active composition system of claim 26, wherein.
  29. 少なくとも2つの試験刺激源が少なくとも1つの細胞アレイと流体接触状態(in fluidic communication)にある、請求項26記載のシステム。 At least two test stimulus source is at least one cell array and fluid contact (in fluidic communication), the system according to claim 26.
  30. 細胞アレイが少なくとも2つの細胞種を含む、請求項26記載のシステム。 Cells containing the array of at least two cell types, the system of claim 26, wherein.
  31. コンピュータシステムを遠隔操作する手段をさらに含む、請求項26記載のシステム。 Further comprising The system of claim 26, wherein the means for remotely operating the computer system.
  32. 光学システムが顕微鏡を含む、請求項26記載のシステム。 The optical system includes a microscope system of claim 26, wherein.
  33. 以下を含む、コンピュータ読み取り可能媒体: Including: computer-readable medium:
    (a)細胞または細胞内構成要素をモニターする検出装置から細胞画像データを受け取るためのコード(code); (A) cells or subcellular components code for receiving the cell image data from the detector for monitoring the (code);
    (b)細胞画像データを分析するためのコード;および(c)分析された細胞画像データに応じて細胞または細胞内構成要素を刺激するよう適合された複数の刺激装置を自動的に調整するためのコード。 To automatically adjust the plurality of stimulation device adapted to stimulate a cell or subcellular components in accordance with and (c) analyzed cell image data; (b) code for analyzing a cell image data of the code.
  34. 以下をさらに含む、請求項33記載のコンピュータ読み取り可能媒体。 Hereinafter, further comprising a claim 33, wherein the computer readable medium.
    (d)細胞をモニターする視覚的サーボ制御光学顕微鏡(VSOM)を制御するためのコード。 (D) code for controlling the visual servo control optical microscope (VSOM) to monitor cell.
  35. 以下のうち少なくとも1つをさらに含む、請求項33記載のコンピュータ読み取り可能媒体: Further comprising at least one of the following, claim 33 of the computer-readable media:
    (d)細胞のサイズを分析するためのコード、細胞の色を分析するためのコード、および細胞の動きを分析するためのコード。 (D) cell size code for analyzing the cell code for analyzing the color, and the cells code for analyzing the motion of.
  36. 以下をさらに含む、請求項33記載のコンピュータ読み取り可能媒体。 Hereinafter, further comprising a claim 33, wherein the computer readable medium.
    (d)分析された細胞画像データに応じて細胞を刺激するための複数の刺激装置を自動的かつ独立的に作動させるためのコード。 (D) automatically and independently code for operating a plurality of stimulation devices for stimulating cellular according to the analysis cell image data.
  37. 刺激装置がシリンジである、請求項33記載のコンピュータ読み取り可能媒体。 Stimulator is a syringe, according to claim 33, wherein the computer readable medium.
  38. 細胞画像データを時間の関数として保存するためのコードをさらに含む、請求項33記載のコンピュータ読み取り可能媒体。 Cells further comprising code for storing the image data as a function of time, according to claim 33, wherein the computer readable medium.
  39. 細胞が生存しており、かつ、細胞内構成要素が生細胞内に存在する、請求項33記載のコンピュータ読み取り可能媒体。 Cells were alive and subcellular components present in the living cell, according to claim 33, wherein the computer readable medium.
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