JP2004508810A - Polyketide formation - Google Patents

Abstract

Recombinant Myxococcus host cells can be used to produce polypotides containing epothilones and epothilone analogs that can be purified from the fermentation broth and crystallized. The present invention relates to a recombinant expression vector comprising a recombinant expression vector encoding a heterologous PKS gene and producing a polyketide synthesized on these vectors by the PKS enzyme encoded by the gene. A recombinant host cell is provided. In a preferred embodiment, the host cell is from the genus Myxococcus or Stigmatella. In a particularly preferred embodiment, the host cells are M. Stipitatus, M .; fulbus, M .; xanthus, M .; virscens, S.M. erecta, and S.E. aurantiaca.

Description

エポシロンＡおよびＢのデゾキシ対応物（エポシロンＣ（Ｒ＝Ｈ）およびＤ（Ｒ＝ＣＨ_３）としても公知）は、新たに化学合成されたが、またＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの発酵における微量生成物としても存在する。エポシロンＣおよびＤは、エポシロンＡおよびＢよりも細胞傷害性が低く；その構造は以下に示される。
【００１５】
【化６】

他の天然に存在するエポシロンが記載されている。これらとしては、エポシロンＥおよびＦが挙げられる。ここでは、エポシロンＡおよびＢのチアゾール部分のメチル側鎖を、ヒドロキシル化し、それぞれエポシロンＥおよびＦ、ならびに多くの他のエポシロン化合物を得た（本明細書において参考として援用されている、ＰＣＴ公開番号９９／６５９１３を参照のこと）。
【００１６】
抗癌剤としてのエポシロンの使用に関する可能性の理由から、そしてネイティブのＳｏ　ｃｅ　９０株によって生成された低レベルのエポシロンの理由から、多数の研究チームは、エポシロンを合成する労力を払った。上記で注記されるように、この労力は成功した（以下を参照のこと：Ｂａｌｏｇら、１９９６、Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　（−）−ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ａ，Ａｎｇｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５（２３／２４）：２８０１−２８０３；Ｓｕら、１９９７、Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ（−）−ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ：ａｎ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｕｚｕｋｉ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６（７）：７５７〜７５９；Ｍｅｎｇら．，１９９７、Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ　ｏｆ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ＪＡＣＳ　１１９（４２）：１００７３〜１００９２；およびＢａｌｏｇら、１９９８，Ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｌｄｏｌ　ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｅｎｔｅｎａｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７（１９）：２６７５〜２６７８（各々が、本明細書において参考として援用されている））。これらの労力の成功にもかかわらず、エポシロンの化学合成は、退屈であり、時間を浪費し、そして費用がかさむ。実際、この方法は、抗癌剤としてのなんらかのエポシロンのフルスケールの薬学的開発については現実的ではないとして特徴付けられた。
【００１７】
多数のエポシロン誘導体、およびエポシロンＡ〜Ｄは、インビトロおよびインビボで研究されてきた（以下を参照のこと：Ｓｕら、１９９７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６（１９）：２０９３−２０９６；およびＣｈｏｕら、Ａｕｇ．１９９８，Ｄｅｓｏｘｙｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ：ａｎ　ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｇｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｏ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：９６４２−９６４７（それぞれが、本明細書において参考として援用されている））。さらなるエポシロン誘導体ならびにエポシロンおよびエポシロン誘導体を合成する方法は、以下のＰＣＴ公開番号００／２３４５２、００／００４８５、９９／６７２５３、９９／６７２５２、９９／６５９１３、９９／５４３３０、９９／５４３１９、９９／５４３１８、９９／４３６５３、９９／４３３２０、９９／４２６０２、９９／４００４７、９９／２７８９０、９９／０７６９２、９９／０２５１４、９９／０１１２４、９８／２５９２９、９８／２２４６１、９８／０８８４９、および９７／１９０８６；米国特許第号５，９６９，１４５；およびドイツ特許公開番号ＤＥ４１３８０４２（それぞれが、本明細書において参考として援用されている）に記載されている。
【００１８】
天然に存在するエポシロンだけでなく、その誘導体または前駆体、ならびに特性が改善されている新しいエポシロン誘導体を生成するという経済的な手段の必要性が残っている。天然のプロデューサーＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍよりも取り扱いおよび発酵が容易である、そして所望のポリケチド生成物をさらに生成する、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する宿主細胞の必要性が残っている。本発明は、高レベルでポリケチドを生成し、そしてエポシロン（本明細書に記載される新しいエポシロン誘導体を含む）だけでなく、他のポリケチドもまた生成することにおいて有用である宿主細胞を提供することによってこれらの必要性を満たしている。
【００１９】
（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、組み換え発現ベクターであって、異種ＰＫＳ遺伝子をコードし、そしてこれらのベクター上でこの遺伝子によってコードされるＰＫＳ酵素によって合成されるポリケチドを生成する組み換え発現ベクター、を含むＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の組み換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属またはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属由来である。特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｍ．ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｕｓ、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ、Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｅｒｅｃｔａ、およびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａからなる群より選択される。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、本発明の宿主細胞において、染色体組み込みまたは染色体外複製をし得る組み換えＤＮＡベクターを提供する。本発明のベクターは、ＰＫＳコード配列の少なくとも一部を含み、そして本発明の宿主細胞内で機能的なＰＫＳ酵素の発現を指向し得る。関連の実施形態において、本発明は、ポリケチド生合成についての基質（本発明の宿主細胞において、生成されないか、または低量でしか生成されないかのいずれかである）を生成するのに必要な遺伝子および遺伝子産物を含む、ベクターおよび宿主細胞を提供する。１つの実施形態において、この遺伝子および遺伝子産物は、エチルマロニルＣｏＡの合成を触媒する。別の実施形態において、この遺伝子および遺伝子産物は、ブチリルＣｏＡの合成を触媒する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の宿主細胞（この宿主細胞ではポリケチドは天然には生成されない）においてポリケチドを生成するための方法を提供する。この方法は、ベクター上でコードされるＰＫＳ遺伝子が発現され、そしてポリケチドが生成されるような条件下で、本発明の組み換えＤＮＡベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養する工程を包含する。関連の実施形態において、本発明は、高収率のポリケチドの生成を生じる、本発明の宿主細胞の発酵のための方法を提供する。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の組み換え宿主細胞は、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する。従って、本発明は、所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する組み換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、この宿主細胞は、１０ｍｇ／Ｌ以上の１つ以上のエポシロンを生成する。１つの実施形態において、本発明は、エポシロンを生成する天然に存在する生物体において生成されるレベルよりも高いレベルで１つ以上のエポシロンを生成する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、エポシロンを生成する天然に存在する生物体によって生成される混合物よりも複雑度が低いエポシロンの混合物を生成する宿主細胞を提供する。本発明の組み換え宿主細胞はまた、主要な産物として１つだけの所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する宿主細胞を含む。
【００２３】
関連の好ましい実施形態において、本発明は、エポシロンＰＫＳの全てまたは一部をコードする組み換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。従って、本発明は、本発明の宿主細胞において、エポシロンＡ，Ｂ、Ｃ、およびＤを生成するのに必要なタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明はまた、これらのタンパク質の一部をコードする組み換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明はまた、ハイブリッドタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ化合物を提供する。このハイブリッドタンパク質は、エポシロン生合成に関与するタンパク質の全てまたは一部、および別のポリケチドまたは非リボソーム由来ペプチドの生合成に関与するタンパク質の全てまたは一部を含む。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、農業、獣医学診療、および医学において有用な実質的に純粋な形態の、新規なエポシロン誘導化合物を提供する。これらの化合物としては、エポシロンＡ，Ｂ、Ｃ、およびＤの以下：１６−デスメチル；１４−メチル；１３−オキソ；１３−オキソ−１１，１２−デヒドロ；１２−エチル；１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ；１１−オキソ；１１−ヒドロキシ；１０−メチル；１０，１１−デヒドロ；９−オキソ；９−ヒドロキシ；８−デスメチル；６−デスメチル；および２−メチルのアナログ、ならびに天然に存在するエポシロンのメチルチアゾール部分が別の部分で置換されている種々のアナログが挙げられる。１つの実施形態において、この化合物は、殺真菌剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、抗がん剤として癌の化学療法において有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、エポシロンＢまたはＤと少なくとも同程度に腫瘍細胞に対して強力であるエポシロン誘導体である。別の実施形態において、この化合物は、免疫抑制剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、別の化合物の製造に有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、ヒトまたは動物に対する投与のための混合物または溶液に処方される。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、エポシロンを精製する方法を提供する。好ましい実施形態において、エポシロンは発酵ブロスから精製される。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、高度に精製された形態でエポシロン化合物を提供する。好ましい実施形態において、エポシロンは、９５％よりも純粋である。さらに好ましい実施形態において、エポシロンは、９９％よりも純粋である。特に好ましい実施形態において、本発明は、結晶形態でエポシロンを提供する。１つの特に好ましい実施形態において、本発明は結晶エポシロンＤを提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、この方法は、治療的有効量の本発明の新規エポシロン化合物を投与する工程を包含する。本発明の化合物および組成物はまた、他の過剰増殖性疾患および状態（乾癬および炎症を含むが、これらに限定されない）の処置に有用である。
【００２８】
本発明のこれらまたは他の実施形態は、以下の説明、実施例、および上記の特許請求の範囲において、より詳細に記載する。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明の範囲および本明細書中に使用される用語の定義に関する陳述は、以下に列挙される。他に特定の例において限定されない限り、個々に、またはより大きな群の一部としてのいずれかで、本明細書全体を通じて使用される場合、この定義をこの用語に適用する。
【００３０】
本発明の化合物の全ての立体異性体は、純粋な化合物ならびにその混合物として、本発明の範囲内に含まれる。個々のエナンチオマー（鏡像異性体）、ジアステレオマー、幾何異性体、ならびにそれらの組み合わせおよび混合物が全て本発明に含まれる。さらに、これらの化合物の結晶形態のいくつかが、多形として存在し得、そしてそれ自体本発明に含まれる。さらに、これらの化合物のいくつかは、水との溶媒和物（すなわち、水和物）または通常の有機溶媒との溶媒和物を形成し得、このような溶媒和物もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
本発明の化合物の保護形態が本発明の範囲内に含まれる。種々の保護基が、例えば、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９）（本明細書中においてその全体が参考として援用される）に開示される。例えば、本発明の化合物のヒドロキシ保護形態は、ヒドロキシル基の少なくとも１つがヒドロキシ保護基によって保護される形態である。例示的なヒドロキシ保護基としては、限定しないが、テトラヒドロピラニル；ベンジル；メチルチオメチル；エチルチオメチル；ピバロイル；フェニルスルホニル；トリフェニルメチル；三置換シリル（例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−ｔ−ブチルシリル、メチルジフェニルシリル、エチルジフェニルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなど）；アシルおよびアロイル（例えば、アセチル、ピバロイルベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、４−ニトロベンゾイルおよび脂肪族アシルアリールなど）が挙げられる。本発明の化合物のケト基は、同様に保護され得る。
【００３２】
本発明は、本発明の化合物のプロドラッグをその範囲内に含む。一般的に、このようなプロドラッグは、必要な化合物にインビボで容易に転換可能な化合物の機能的誘導体である。従って、本発明の処置方法において、用語「投与」は、具体的に開示される化合物を用いるか、または具体的には開示されないかもしれないがこれを必要とする被験体に投与された後にインビボで特定の化合物に転換される化合物を用いる、記載される種々の障害の処置を包含するべきである。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための慣用的な手順は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」，Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載される。
【００３３】
本明細書中において使用される場合、用語「脂肪族」とは、飽和および不飽和の直鎖、分枝鎖、環式、または多環式炭化水素（これらは、必要に応じて、１つ以上の位置で置換され得る）をいう。脂肪族基の例示的な例としては、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、シクロアルキル部分、シクロアルケニル部分、およびシクロアルキニル部分が挙げられる。用語「アルキル」とは、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素置換基をいう。「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素置換基をいう。「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素置換基をいう。
【００３４】
用語「アリール」とは、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子を含み、そして好ましくは、３〜１４個の炭素原子を含む、少なくとも１つの芳香族環構造を有する単環式基または多環式基をいう。アリール置換基は、必要に応じて、１つ以上の位置において置換され得る。アリール基の例示的な例としては、限定しないが以下が挙げられる：フラニル、イミダゾリル、インダニル、インデニル、イノドリル、イソオキサゾリル、イソキノリニル、ナフチル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、フェニル、ピラジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、キノリル、キノキサリル、テトラヒドロナフチル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｔｈｌ）、テトラゾイル、チアゾイル、チエニル、チオフェニルなど。
【００３５】
脂肪族部分（すなわち、アルキル、アルケニルなど）およびアリール部分は、必要に応じて、１つ以上の置換基、好ましくは１〜５個の置換基、より好ましくは１〜３個の置換基、そして最も好ましくは１〜２個の置換基で置換され得る。分子内の特定の位置における任意の置換基または変数の定義は、その分子の他の定義と独立する。化学的に安定であり、そして当該分野で公知の技術ならびに本明細書中に示される方法によって容易に合成され得る化合物を提供するために、本発明の化合物上の置換基および置換のパターンが当業者によって選択され得ることが理解される。適切な置換基の例としては、限定しないが以下が挙げられる：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ；トリフルオロメチル；トリフルオロメトキシ；ヒドロキシ；アルコキシ；シクロアルコキシ；ヘテロシクロオキシ；オキソ；アルカノイル（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル、「アシル」とも呼ばれる）；アリールオキシ；アルカノイルオキシ；アミノ；アルキルアミノ；アリールアミノ；アラルキルアミノ；シクロアルキルアミノ；ヘテロシクロアミノ；二置換アミン（ここで、２つのアミノ置換基がアルキル、アリール、またはアラルキルから選択される）；アルカノイルアミノ；アロイルアミノ；アラルカノイルアミノ；置換アルカノイルアミノ；置換アリールアミノ；置換アラルカノイルアミノ；チオール；アルキルチオ；アリールチオ；アラルキルチオ；シクロアルキルチオ；ヘテロシクロチオ；アルキルチオノ；アリールチオノ；アラルキルチオノ；アルキルスルホニル；アリールスルホニル；アラルキルスルホニル；スルホンアミド（例えば、ＳＯ_２ＮＨ_２）；置換スルホンアミド；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ_２）；置換カルバミル（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ’（ここで、ＲおよびＲ’は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキルなどである））；アルコキシカルボニル、アリール、置換アリール；グアニジノ、ならびにヘテロシクロ（例えば、インドイル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チオアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなど）。適用可能な場合、置換基は、さらに、例えば、アルキル、アルコキシ、アリール、アラルキル、ハロゲン、ヒドロキシなどで置換され得る。
【００３６】
用語「アルキルアリール」または「アリールアルキル」とは、脂肪族基を介して化合物に結合される脂肪族置換基を有するアリール基をいう。アルキルアリール基またはアリールアルキル基の例示的な例は、ベンジル、メチル基を介して化合物に結合されるメチル基を有するフェニル（−ＣＨ_２Ｐｈ（ここで、Ｐｈはフェニルである））である。
【００３７】
用語「アシル」とは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（ここで、Ｒは、脂肪族基、好ましくは、Ｃ_１〜Ｃ_６部分である）をいう。
【００３８】
用語「アルコキシ」とは、−ＯＲ（ここで、Ｏは酸素であり、そしてＲは、脂肪族基である）をいう。
【００３９】
用語「アミノアルキル」とは、−ＲＮＨ_２（Ｒは、脂肪族部分である）をいう。
【００４０】
用語「ハロゲン」、「ハロ」、または「ハライド」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【００４１】
用語「ハロアルキル」とは、−ＲＸ（ここで、Ｒは、脂肪族部分であり、そしてＸは、１つ以上のハロゲンである）をいう。
【００４２】
用語「ヒドロキシアルキル」とは、−ＲＯＨ（ここで、Ｒは、脂肪族部分である）をいう、
用語「オキソ」とは、カルボニル酸素（＝Ｏ）をいう。
【００４３】
上記の基における明示した置換基に加えて、本発明の化合物は、適用可能な場合、他の置換基を含み得る。例えば、ラクトンまたはラクタム骨格または骨格置換基は、さらに、１つ以上の置換基（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_５脂肪族、Ｃ_１〜Ｃ_５アルコキシ、アリール、または官能基）で置換され得る（例えば、水素の１つを置換することによるかまたは非水素基を誘導体化することによる）。適切な官能基の例示的な例としては、限定しないが以下が挙げられる：アセタール、アルコール、アルデヒド、アミド、アミン、ボロネート、カルバメート、カルボアルコキシ、カルボネート、カルボジイミド、カルボン酸、シアノヒドリン、ジスルフィド、エナミン、エステル、エーテル、ハロゲン、ヒドラジド、ヒドラゾン、イミド（ｉｍｉｄｅ）、イミド（ｉｍｉｄｏ）、イミン、イソシアネート、ケタール、ケトン、ニトロ、オキシム、ホスフィン、ホスホネート、ホスホン酸、第４級アンモニウム、スルフェニル、スルフィド、スルホン、スルホン酸、チオールなど。
【００４４】
用語「単離された」とは、本発明の化合物をいうために本明細書中で使用される場合、その天然状態から人の介入によって変化したことを意味する。例えば、この化合物が天然に存在する場合、それは、そのもとの環境から変化したかまたは取り出されたかあるいはその両方である。言いかえると、この用語が本明細書中で使用される場合、生きた生物に天然に存在する化合物は、「単離」されていないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同じ化合物は、「単離」されている。用語「単離された」はまた、夾雑物または望ましくない物質を実質的に含まない調製物中の化合物を意味し得る。天然に見出される化合物に関して、その化合物または組成物がその天然状態において関連する物質を実質的に含まない。
【００４５】
用語「精製された」は、化合物をいう場合、この化合物が調製物の主用成分を形成する（例えば、調製物の成分の約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％以上を構成する）調製物中にこの化合物があることを意味する。
【００４６】
用語「被験体」とは、本明細書中で使用される場合、動物、好ましくは、哺乳動物（処置、観察または実験の対象であった）、そして最も好ましくはヒト（処置および／または観察の対象であった）をいう。
【００４７】
用語「治療的有効量」は、本明細書中で使用される場合、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家医によって探求される、組織系、動物またはヒトにおける生物学的応答または医薬的応答（処置される疾患または障害の症状の軽減を含む）を誘発する活性な化合物または薬学的因子の量を意味する。
【００４８】
用語「組成物」は、特定の量で特定の成分を含む生成物、ならびに特定の量での特定の成分の組み合わせから直接的または間接的に生じる任意の生成物を包含することを意図する。
【００４９】
用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合物の１つ以上の塩である。化合物の適切な薬学的に受容可能な塩とは、酸付加塩が挙げられ、これは、例えば、化合物の溶液を薬学的に受容可能な酸（例えば、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸）の溶液と混合することによって形成され得る。さらに、本発明の化合物が酸性部分を有する場合、その薬学的に受容可能な塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩）；および適切な有機リガンドを用いて形成された塩（例えば、ハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、アルキルスルホネートおよびアリールスルホネートのような対アニオンを使用して形成されるアンモニウム、第４級アンモニウムおよびアミンカチオン）が挙げられ得る。薬学的に受容可能な塩の例示的な例としては、限定しないが、以下が挙げられ得る：アセテート、アジペート、アルギネート、アスコルベート、アスパルテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタータレート、ボレート、ブロミド、ブチレート、カルシウムエデテート、カンファレート、樟脳スルホネート、カンシレート、カルボネート、クロリド、シトレート、クラブラネート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ジヒドロクロリド、ドデシルスルフェート、エデテート、エジシレート（ｅｄｉｓｙｌａｔｅ）、エストレート、エシレート、エタンスルホネート、ホルメート、フマレート、グルセプテート、グルコヘプトネート、グルコネート、グルタメート、グリセロホスフェート、グリコリルアルサニレート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホネート、ヒドロキシナフトエート、ヨージド、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、ラウリルスルフェート、マレート、マレアート、マロネート、マンデレート、メシレート、メタンスルホネート、メチルスルフェート、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、２−ナフタレンスルホネート、ナプシレート、ニコチネート、ニトレート、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレエート、オキサレート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、ペクチネート、ペルスルフェート、３−フェニルプロピオネート、ホスフェート／ジホスフェート、ピクレート、ピバレート、ポリガラクツロネート、プロピオネート、サリチレート、ステアレート、スルフェート、塩基性酢酸塩、スクシネート、タンネート、タータレート、テオクレート（ｔｅｏｃｌａｔｅ）、トシレート、トリエチオダイド、ウンデカノエート、バレレートなど。
【００５０】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本発明の化合物の所望の投薬形態を調製するために使用される媒体である。薬学的に受容可能なキャリアとしては、溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル；分散または懸濁補助剤；表面活性剤；等張性剤；濃化剤または乳化剤、保存剤；固体結合剤；潤滑剤などが挙げられる。
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９７５）およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ，ｅｄ．（Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃ．２０００）（両方が本明細書中においてそれらの全体が参考として援用される）は、薬学的組成物を処方する際に使用される種々のキャリアおよびその調製のための公知の技術を開示する。
【００５１】
用語「薬学的に受容可能なエステル」は、インビボで本発明の化合物またはその塩に加水分解するエステルである。適切なエステル基の例示的な例として、例えば、薬学的に受容可能な脂肪族カルボン酸から誘導されるエステル（例えば、ホルメート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、アクリレート、およびエチルスクシネート）が挙げられる。
【００５２】
本発明は、組換え宿主細胞においてポリケチドを産生するための組換え方法および材料；ポリケチドを産生する組換え宿主細胞；エポシロンに対して構造において関連する新規なポリケチド；エポシロンを精製するための方法；ならびにエポシロンＤの結晶形態を提供する。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、異種ＰＫＳ遺伝子をコードする組換え発現ベクターを含むＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の組換え宿主細胞を提供し、それらのベクターにコードされるＰＫＳ酵素によって合成されるポリケチドを産生する。本明細書中で使用される場合、用語組換えとは、人の介入（代表的には、遺伝子またはその一部の特定の指示された操作）によって産生される細胞、化合物、または組成物をいう。Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ目における２つのうちの１つ（他方は、Ｓｏｒａｎｇｉｎｅａｅであり、これは、エポシロンプロデューサーＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍを含む）である。Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科およびＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科を含む。Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科は、Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ属（すなわち、Ａ．ｄｉｓｃｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＣｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属（すなわち、Ｃ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃ．ｃｏｒｒａｌｌｏｉｄｅｓ、およびＣ．ｅｘｉｇｕｕｓ）を含む。Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科は、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ属（すなわち、Ｃ．ｆｕｓｃｕｓ、Ｃ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ、Ｃ．ｍｉｎｏｒ、Ｃ．ｖｅｌａｔｕｓ、およびＣ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、Ｍｅｌｉｔｔａｎｇｉｕｍ属（すなわち、Ｍ．ｂｏｌｅｔｕｓおよびＭ．ｌｉｃｌｚｅｎｉｃｏｌａ）、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属（すなわち、Ｓ．ｅｒｅｃｔａおよびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ならびにＡｒｃｈａｎｇｉｕｍ属（すなわち、Ａ．ｇｅｐｈｙｒａ）を含む。本発明の特に好ましい宿主細胞は、１０〜２０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１００〜２００ｍｇ／Ｌ以上、そして最も好ましくは１〜２ｇ／Ｌ以上のポリケチドを産生する宿主細胞である。
【００５４】
好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属またはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属由来である。特に好ましい実施形態において、宿主細胞はＭ．ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｕｓ、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ、Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｅｒｅｃｔａ、およびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａからなる群から選択される。本発明の特に好ましいＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞は、１０〜２０ｍｇ／Ｌ以上のポリケチドを産生し、より好ましくは１００〜２００ｍｇ／Ｌ以上、そして最も好ましくは１〜２ｇ／Ｌ以上産生する。これらのレベルで産生するＭ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞が特に好ましい。本発明の目的のために使用され得るＭ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞として、ＤＺ１細胞株（本明細書中で参考として援用される、Ｃａｍｐｏｓら，１９７８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：１６７−１７８）、ＴＡ−産生細胞株ＡＴＣＣ　３１０４６、ＤＫ１２１９細胞株（本明細書中に参考として援用される、ＨｏｄｇｋｉｎおよびＫａｉｓｅｒ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７１：１７７−１９１，）およびＤＫ１６２２細胞株（本明細書中で参考として援用される、Ｋａｉｓｅｒ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：５９５２−５９５６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の宿主細胞は、組換えＤＮＡ発現ベクターを含み、そして別の実施形態では、本発明は、これらの宿主細胞内での染色体組込みまたは染色体外の複製が可能な組換えＤＮＡベクターを提供する。本発明のベクターは、ＰＫＳをコードする配列の少なくとも一部を含み、そして本発明の宿主細胞中で機能性ＰＫＳ酵素の発現を支持し得る。明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」は、宿主細胞内に導入され得る任意の核酸をあらわす。発現ベクターは、細胞内もしくは任意の細胞区画内の染色体もしくは他のＤＮＡ（例えば、細胞質内の複製ベクター）の一部であるか否かにかかわらず、細胞内で安定にまたは一過的に維持され得る。また、発現ベクターは細胞内または細胞抽出物内でポリケチドに翻訳されるＲＮＡの合成を支持する遺伝子を含む。従って、ベクターは、遺伝子発現を増強するためのプロモーターを含むか、遺伝子発現が得られるように染色体内の部位に組込まれるかのいずれかである。さらに、発現ベクターは、さらなる機能的成分（例えば、選択マーカーとして作用する耐性付与遺伝子およびプロモーター活性を増強するための調節遺伝子）を代表的に含む。
【００５６】
代表的に、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を同定および／または選択し得る、１以上のマーカー遺伝子を含む。本発明のベクター内で使用するための例示的な抗生物質耐性付与遺伝子として、ｅｒｍＥ耐性付与遺伝子（エリスロマイシンおよびリンコマイシンに対する耐性を与える）、ｔｓｒ耐性付与遺伝子（チオストレプトンに対する耐性を与える）、ａａｄＡ耐性付与遺伝子（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を与える）、ａａｃＣ４耐性付与遺伝子（アプラマイシン、カナマイシン、ゲンタミシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）およびネオマイシンに対する耐性を与える），ｈｙｇ耐性付与遺伝子（ハイグロマイシンに対する耐性を与える）、およびｖｐｈ耐性付与遺伝子（バイオマイシンに対する耐性を与える）が挙げられる。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ内で使用するための選択マーカーとして、カナマイシン耐性付与遺伝子、テトラサイクリン耐性付与遺伝子、クロラムフェニコール耐性付与遺伝子、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性付与遺伝子、スペクチノマイシン耐性付与遺伝子、およびストレプトマイシン耐性付与遺伝子を含む。
【００５７】
発現ベクターの種々の成分は意図されるベクターの用途に依存して広範囲に変化し得る。特に、成分は、ベクターが使用される宿主細胞および機能するために意図される様式に依存する。例えば、本発明のある好ましいベクターは組込みベクターである：宿主細胞の染色体ＤＮＡ内にベクターを組込む。このようなベクターは、ファージ結合部位または組込みを指示する宿主細胞染色体ＤＮＡのセグメントに対して相補的なＤＮＡセグメントを含み得る。さらに、本明細書中で例示されるように、このような一連のベクターは、完全なＰＫＳ遺伝子クラスターの一部分のみを含む各ベクターを用いて、宿主細胞中にＰＫＳ遺伝子クラスターを構築するために使用され得る。従って、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターはＰＫＳ遺伝子または遺伝子クラスターの一部分のみを含み得る。また、同種組換えは、宿主細胞内に前もって導入された異種ＰＫＳ遺伝子を含む遺伝子を欠失、破壊、または改変するために使用され得る。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明は発現ベクターおよび組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、好ましくはＭ．ｘａｎｔｈｕｓ（ポリケチドを産生するこれらの発現ベクターを含む宿主細胞）を提供する。現在、Ｍｘ４ファージレプリコンに基づく人工プラスミドの未公開報告はあるが、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ内で染色体外で複製するベクターは公開されていない。しかし、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体ＤＮＡ内に組込まれる公知の多くのファージ（Ｍｘ８，Ｍｘ９，Ｍｘ８１，およびＭｘ８２を含む）が存在する。これらのファージの組込み機能および結合機能は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体ＤＮＡ内でに組込まれるファージベースの発現ベクターを作製するためにプラスミド上に配置され得る。これらのうち、ファージＭｘ９およびＭｘ８は本発明の目的において好ましい。プラスミドｐＰＬＨ３４３（Ｓａｌｍｉら，１９９８年２月，Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｅ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　ｐｈａｇｅ　Ｍｘ８，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０（３）：６１４−６２１に記載）は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で複製し、結合機能および組込み機能をコードするファージＭｘ８遺伝子を含むプラスミドである。
【００５９】
本発明の好ましいＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ発現ベクターにおいて使用するための広範囲のプロモーターが入手可能である。以下の実施例８を参照のこと。例えば、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍエポシロンＰＫＳ遺伝子のプロモーター（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公開番号００／０３１２４７を参照のこと）はＭ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞中で機能する。エポシロンＰＫＳ遺伝子プロモーターは、組換え宿主細胞内での１以上のエポシロンＰＫＳ遺伝子または別のＰＫＳ遺伝子産生物の発現を推進するために使用され得る。本発明の組換えＰＫＳを発現する目的で、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞内で使用するための別の好ましいプロモーターは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓのｐｉｌＡ遺伝子のプロモーターである。このプロモーターおよびｐｉｌＡプロモーター、ｐｉｌＡ欠損株およびｐｉｌＳ欠損株によって制御された遺伝子由来の遺伝子産物を高レベルで発現するＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株は、本明細書中で参考として援用される、ＷｕおよびＫａｉｓｅｒ，１９９７年１２月，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｉｌＡ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７９（２４）：７７４８−７７５８に記載される。本発明はまた、ｐｉｌＡおよびｐｉｌＳ欠損の両方を含む組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞を提供する。別の好ましいプロモーターは飢餓性依存ｓｄｅＫ遺伝子のプロモーターである。
【００６０】
本発明は、本発明の組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ発現ベクターおよび宿主細胞の調製において使用するための好ましい発現ベクターを提供する。プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびｐＫＯＳ３５−８２．２と命名されたこれらのベクター（図２）は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において複製可能で、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの染色体ＤＮＡ内への組み込みが可能である。ベクターは、Ｍｘ８結合遺伝子および組み込み遺伝子ならびに下流に都合よく配置された制限酵素認識部位を有するｐｉｌＡプロモーターを含む。２種のベクターは単にベクター上のｐｉｌＡプロモーターの方向においてお互いに異なっており、エポシロンＰＫＳおよび本発明の修飾酵素遺伝子あるいは他のＰＫＳおよび修飾酵素遺伝子を含むために容易に修飾され得る。ベクターの構築は実施例１に記載する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、この宿主細胞中ではポリケチドが天然には産生しない亜目Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅの宿主細胞中でポリケチドを産生する方法を提供し、この方法は本発明の組換えＤＮＡベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、ベクター上でコードされたＰＫＳ遺伝子が発現し、前述のポリケチドを産生するような条件下で培養工程を包含する。この方法を用いて、モジュラーまたは反復ＰＫＳ酵素によって産生される任意の多様なポリケチドが調製され得る。さらにまた、ハイブリッドまたは他の組換えＰＫＳ遺伝子由来の新規ポリケチドがこの方法を用いて調製され得る。好ましい実施形態において、ＰＫＳ遺伝子はハイブリッドモジュラーＰＫＳをコードする。
【００６２】
多数のモジュラーＰＫＳ遺伝子は、クローン化され、そしてベクターおよび本発明の方法を用いて即時に入手可能である。ＰＫＳ酵素によって産生されるポリケチドは、ポリケチド修飾酵素（テイラーリング酵素とも呼ばれる）によって、ヒドロキシル化されたＰＫＳのポリケチド産生物、エポキシ化されたＰＫＳのポリケチド産生物、メチル化されたＰＫＳのポリケチド産生物、および／またはグリコシル化されたＰＫＳのポリケチド産生物へとしばしばさらに修飾される。また、本発明の方法に基づいて、目的の修飾されたポリケチドを調製するために、これらの遺伝子は宿主細胞に導入され得る。以下の表は例示的なＰＫＳ遺伝子および対応するＰＫＳ酵素を記載する参考文献を一覧にしたものであって、組換えＰＫＳおよび本発明のＰＫＳをコードする対応するＤＮＡ化合物の構築において利用し得る。また、本発明の組換えＤＮＡ化合物を作製するために使用し得るポリケチドテーラーリング酵素および修飾酵素ならびに対応する遺伝子を記載する種々の参考文献を示す。
（ＰＫＳおよびポリケチドテーラーリング酵素遺伝子）
（アベルメクチン）
米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第４，７０３，００９号；および欧州公報第１１８，３６７号（Ｍｅｒｃｋ）。
【００６３】
ＭａｃＮｅｉｌら，１９９３，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂａｌｔｚ，Ｈｅｇｅｍａｎ，＆Ｓｋａｔｒｕｄ，ｅｄｓ．（ＡＳＭ），２４５−２５６頁，Ａ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｓ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ　ｆｏｒ　Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ，Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ　Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ。
【００６４】
ＭａｃＮｅｉｌら，１９９２，Ｇｅｎｅ　１１５：１１９−１２５，Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ。
【００６５】
ＩｋｅｄａおよびＯｍｕｒａ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．９７：２５９９−２６０９，Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。
（カンジシジン（ＦＲ００８））
Ｈｕら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１６３−１７２。
（エポシロン）
ＰＣＴ公報第９９／６６０２８号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【００６６】
ＰＣＴ公報第００／０３１２４７号（Ｋｏｓａｎ）。
（エリスロマイシン）
ＰＣＴ公報第９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；および米国特許第５，８２４，５１３号（Ａｂｂｏｔｔ）。
【００６７】
Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：６７５−９。
【００６８】
Ｃｏｒｔｅｓら，１９９０年１１月８日，Ｎａｔｕｒｅ　３４８：１７６−８，Ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌｌｙ　ｌａｒｇｅ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ。
（グリコシル化酵素）
ＰＣＴ公報第９７／２３６３０号および米国特許第５，９９８，１９４号（Ａｂｂｏｔｔ）。
（ＦＫ−５０６）
Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９８，Ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ　ｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ　ＦＫ−５０６，Ｅｕｒ．Ｊ．ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：５２８−５３４。
【００６９】
Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ　ＦＫ−５０６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：７４−８０。
（メチルトランスフェラーゼ）
米国特許第５，２６４，３５５号および米国特許第５，６２２，８６６号（Ｍｅｒｃｋ）。
【００７０】
Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９６，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｓ　ＦＫ−５０６　ａｎｄ　ＦＫ−５２０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５２４３−５２４８。
（ＦＫ−５２０）
ＰＣＴ公報第００／２０６０１号（Ｋｏｓａｎ）。
【００７１】
Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：５７８９−９６。
（ロバスタチン）
米国特許第５，７４４，３５０号（Ｍｅｒｃｋ）。
（ネマデクチン（Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ））
ＭａｃＮｅｉｌら，１９９３，前出。
（ニダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）
ＰＣＴ公報第９８／５１６９５号（Ａｂｂｏｔｔ）。
【００７２】
Ｋａｋａｖａｓら，１９９７，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｅｌｅｓｔｉｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７５１５−７５２２。
（オレアンドマイシン）
Ｓｗａｎら，１９９４，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：３５８−３６２。
【００７３】
ＰＣＴ公報第００／０２６３４９号（Ｋｏｓａｎ）。
【００７４】
Ｏｌａｎｏら，１９９８，Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ｔｗｏ　ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ　ｒｉｎｇ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９（３）：２９９−３０８。
【００７５】
ＰＣＴ公報第９９／０５２８３号（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。
（ピクロマイシン）
ＰＣＴ公報第９９／６１５９９号（Ｋｏｓａｎ）。
【００７６】
ＰＣＴ公報第００／００６２０（ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）。
【００７７】
Ｘｕｅら，１９９８，Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅｓ　ＹＣ−１７　ａｎｄ　ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｉｋＣ−ｅｎｃｏｄｅｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５（１１）：６６１−６６７。
【００７８】
Ｘｕｅら，１９９８年１０月，Ａ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　：　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１２１１１　１２１１６。
（プラテノリド（Ｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅ））
欧州公報第７９１，６５６号；および米国特許第５，９４５，３２０号（Ｌｉｌｌｙ）。
（ラパマイシン）
Ｓｃｈｗｅｃｋｅら，１９９５年８月，Ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：７８３９−７８４３。
【００７９】
Ａｐａｒｉｃｉｏら，１９９６，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　：　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｕｌａｒ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｇｅｎｅ　１６９：９−１６。
（リファマイシン）
ＰＣＴ公報第９８／０７８６８号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【００８０】
Ａｕｇｕｓｔら，１９９８年２月１３日，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｓａｍｙｃｉｎ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｉｆａｍｙｃｉｎ：ｄｅｄｕｃｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｉｆ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　Ｓ６６９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）：６９−７９。
（ソランジウム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）ＰＫＳ）
米国特許第６，０９０，６０１号（Ｋｏｓａｎ）。
（ソラフェン（Ｓｏｒａｐｈｅｎ））
米国特許第５，７１６，８４９号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【００８１】
Ｓｃｈｕｐｐら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７７：３６７３−３６７９．Ａ　Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｇｅｎｅ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
Ｓｏｒａｐｈｅｎ　Ａ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ。
（スピノシン（Ｓｐｉｎｏｃｙｎ））
ＰＣＴ公報第９９／４６３８７号（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）。
（スピラマイシン）
米国特許第５，０９８，８３７号（Ｌｉｌｌｙ）。
（アクチベータ遺伝子）
米国特許第５，５１４，５４４号（Ｌｉｌｌｙ）。
（チロシン）
米国特許第５，８７６，９９１号；米国特許第５，６７２，４９７号；米国特許第５，１４９，６３８号；欧州公報第７９１，６５５号；および欧州公報第２３８，３２３号（Ｌｉｌｌｙ）。
【００８２】
Ｋｕｈｓｔｏｓｓら，１９９６，Ｇｅｎｅ　１８３：２３１−６．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ。
（テーラーリング（Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）酵素）
Ｍｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：３４９−３５５．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｔｙｌｏｓｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｙｌＢＡ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ　ｇｅｎｏｍｅ。
【００８３】
ポリケチド修飾のための遺伝子を含んでも含まなくてもよい上述の任意の遺伝子は、もしあれば、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクター内で使用し得る。さらに、本発明の宿主細胞は、所望のＰＫＳおよび修飾酵素遺伝子クラスターの一部を各々含む複数のベクターを用いる形質転換によって構築し得る（本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，０３３，８８３号を参照のこと）。
【００８４】
また、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞を含む本発明の宿主細胞における改良されたポリケチド産生のために、異種ホスホパンテテニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ）トランスフェラーゼを発現する細胞を形質転換し得る。ＰＫＳタンパク質は、ローディングモジュールおよび伸長モジュールのＡＣＰドメインならびに任意のＮＲＰＳのＰＣＰドメインのホスホパンテテニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）を必要とする。ホスホパンテテニル化は、ホスホパンテテニル化トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）と呼ばれる酵素によって媒介される。所望のＰＫＳ酵素上に作用し得るか、またはＰＰＴａｓｅが阻害されている宿主細胞中で機能的ＰＫＳ酵素の量を増加させ得るＰＰＴａｓｅを天然では発現しない宿主細胞において機能的ＰＫＳ酵素を産生するために、異種ＰＰＴａｓｅ（Ｓｆｐが挙げられるが、これに限定されない）を導入し得る（各々本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報第９７／１３８４５および同９８／２７２０３号、および米国特許第６，０３３，８８３に記載されている）。この目的のために使用され得る別の適切なＰＰＴａｓｅはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ由来のＭｔａＡである。
【００８５】
任意の生物（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｏｒａｎｇｉｕｍ宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されない）中でポリケチド産生を向上させる、本発明により提供される別の方法は、ストレプトマイシン、リファマイシンおよび／またはゲンタマイシンに対して耐性である細胞を選択することである。好ましい実施形態において、ポリケチド産生宿主細胞はこれらの各々の化合物（または、構造上これらに類似する化合物）を用いて連続的にチャレンジし、そしてポリケチド産生能力を高めた耐性細胞が単離され、次の選択段階で使用される。この様式において、例えば制限なしで、エポシロンまたはエポシロン誘導体を高レベルで産生し、かつストレプトマイシン、リファマイシン、およびゲンタマイシンに耐性のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞が獲得され得る。
【００８６】
本発明の宿主細胞は天然に見出されるポリケチドを産生するだけでなく、組換えＰＫＳ遺伝子および修飾酵素の産物によって産生されるポリケチドを産生するためにも使用され得る。１つの重要な実施形態において、本発明はハイブリッドＰＫＳを有する組換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明の目的のために、ハイブリッドＰＫＳは、第１ＰＫＳの１以上の伸長モジュール、ローディングモジュール、およびチオエステラーゼ／シクラーゼドメインの全部または一部ならびに第２ＰＫＳの１以上の伸長モジュール、ローディングモジュール、およびチオエステラーゼ／シクラーゼドメインの全部または一部を含む組換えＰＫＳである。
【００８７】
本発明のハイブリッドＰＫＳにおける第１もしくは第２ＰＫＳのいずれかの全部または一部は、天然に発生する供給源から単離する必要がないことを当業者は理解する。例えば、少量のＡＴドメインのみが、その特異性を決定する。本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報第００／００１８３８号を参照のこと。ＤＮＡ合成における当該分野の状況では、当業者はＰＫＳモジュールまたはドメインの有用部分を構築するために十分なサイズのデノボＤＮＡ化合物を構築し得る。本発明の目的のために、このような合成ＤＮＡ化合物がＰＫＳの一部であるとみなす。
【００８８】
上の表で説明するように、本発明のハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物を構築するために使用する、容易に入手可能なＤＮＡおよび配列情報の供給源として役立つ、広範囲のＰＫＳ遺伝子が存在する。ハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物を構築する方法は、米国特許第６，０２２，７３１号；同第５，９６２，２９０号；同第５，６７２，４９１号；ならびに同第５，７１２，１４６号およびＰＣＴ公報第９８／４９３１５号；同第９９／６１５９９号；ならびに同第００／０４７７２４号（各々本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物は、２以上のＰＫＳ遺伝子のハイブリッドであり得る。２つの遺伝子のみが使用されている場合でさえ、モジュールの全部または一部が第２ＰＫＳ遺伝子由来であるハイブリッド遺伝子中にしばしば２以上のモジュールが存在する。本発明のハイブリッドＰＫＳは、以下の型の任意のＰＫＳを含むが、これに限定されないことを当業者は理解する：（ｉ）異種モジュール由来の少なくとも１以上のドメインを有するモジュールを含むＰＫＳ；（ｉｉ）異種ＰＫＳ由来のモジュールを含むＰＫＳ；（ｉｉｉ）異種ＰＫＳ由来のタンパク質を含むＰＫＳ；および（ｉｖ）これらの組み合わせ。
【００８９】
本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素は、第１ＰＫＳ由来のモジュールの１以上のドメインのコード配列と第２ＰＫＳ由来のモジュールの１以上のドメインのコード配列とを置換して、組換えコード配列を構築することによってしばしば構築される。一般的に、ＫＲ、ＤＨ、および／またはＥＲドメインの挿入および置換に関する本明細書中の任意の参考文献は、モジュール内の関連のＫＲ、ＤＨ、またはＥＲドメインと、そのモジュール由来の対応するドメインとの置換（そのモジュールから挿入または置換されたドメインが獲得される）を含む。任意のモジュールのＫＳおよび／またはＡＣＰはまた、所望であるかまたは有益である場合、別のＫＳおよび／またはＡＣＰと交換され得る。例えば、エポシロン誘導体化合物の産生物がモジュールの改変に起因して低い場合、後続のモジュールのＫＳおよび／またはＡＣＰドメインの改変によって、産生は改良され得る。これらの交換または挿入の各々において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲまたはＡＣＰコード配列は、同一のＰＫＳもしくは異なるＰＫＳの別のモジュール由来、またはハイブリッドＰＫＳコード配列が得られる化学合成由来のコード配列からに由来し得る。
【００９０】
本発明の重要な実施形態は、ハイブリッドＰＫＳ遺伝子に関するが、本発明はまた、第２のＰＫＳ遺伝子配列は存在しないが、天然に存在するＰＫＳ遺伝子と１つ以上の変異および／または欠失だけ異なる組換えＰＫＳ遺伝子を提供する。この欠失は、１つ以上のモジュールまたはドメインを包含し得、そして／または１つ以上のモジュールまたはドメイン内の欠失に限定され得る。欠失が伸張モジュール全体（ＮＲＰＳモジュール以外）を包含する場合、得られるポリケチド誘導体は、欠失バージョンが由来するＰＫＳから生成する化合物より短い少なくとも２つの炭素に存在する。この欠失はまた、ＮＲＰＳモジュールおよび／またはローディングモジュールを包含し得る。欠失がモジュール内にある場合、この欠失は、単一のドメイン（代表的には、ＫＲドメイン、ＤＨドメインまたはＥＲドメイン）、または１つより多いドメイン（例えば、ＤＨドメインとＥＲドメインの両方、またはＫＲドメインとＤＨドメインの両方、あるいは３つ全てのＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメイン）を包含し得る。ＰＫＳのドメインはまた、変異（例えば、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発）によって機能的に「欠失」され得る。従って、本明細書中で例示される場合、ＫＲドメインは、変異によって非機能的にされ得るかまたは機能性を決して完全でなくし得る。さらに、ＡＴドメインの特異性はまた、変異（例えば、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発）によって変更され得る。
【００９１】
本発明の任意のＰＫＳを構築するために、ＰＣＴ公開番号９８／２７２０３および米国特許第６，０３３，８８３号（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）に記載される技術を使用し得、ここで、ＰＫＳの様々な遺伝子および１つ以上のポリケチド改変酵素のための任意の遺伝子は、２つ以上、しばしば３つのセグメントに分割され、このセグメントの各々は、別個の発現ベクター上に配置される（ＰＣＴ公開番号００／０６３３６１（これは本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）。このように、遺伝子の完全相補体が構築され得、そして異種発現についてより容易に操作され得、そしてこの遺伝子のセグメントの各々は変更され得、そして様々な変更されたセグメントは、単一の宿主細胞に組み込まれて本発明の組換えＰＫＳ遺伝子を提供し得る。この技術により、組換えＰＫＳ遺伝子の大きなライブラリ、これらの遺伝子を発現するためのベクター、およびこれらのベクターを含む宿主細胞の構築が、より効率的になる。このおよび他の状況において、所望のＰＫＳをコードする遺伝子は、２つ以上のベクターで提示され得るだけでなく、この遺伝子が由来するネイティブのプロデューサー生物に存在する場合とは異なって整列または配置され得る。
【００９２】
好ましい例示的な実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）またはエポシロン誘導体を産生する。天然に存在するエポシロン（エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＥおよびＦを含む）、および構造的にこのエポシロンに関連した天然に存在しない化合物（エポシロン誘導体またはエポシロンアナログ）は、真核生物細胞に対して特異的な強力な細胞障害性因子である。これらの化合物は、抗真菌剤、癌化学治療剤、および免疫抑制剤としての用途、および一般的に、炎症または任意の過剰増殖疾患（例えば、乾癬、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、およびステントの妨害）の処置のための用途を有する。エポシロンは、このエポシロンが同定された天然に存在するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ細胞において非常に低レベルで産生される。さらに、Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、非常にゆっくりと増殖し、そしてＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ株の発酵は、困難であり時間がかかる。本発明によって提供される１つの重要な利点は、非Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ宿主細胞においてエポシロンまたはエポシロン誘導体を簡単に産生する能力である。本発明の別の利点は、天然に存在するエポシロンプロデューサー細胞において可能なレベルおよび量よりも、本発明により提供される組換え宿主細胞において、より高いレベルおよびより多くの量で、エポシロンを産生する能力である。さらに別の利点は、組換え宿主細胞においてエポシロン誘導体を産生する能力である。従って、本発明は、所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生する組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、１０ｍｇ／Ｌ以上のエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生する。一実施形態において、本発明は、エポシロンを産生する天然に存在する生物において産生されるよりも高いレベルで、１つ以上のエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、エポシロンを産生する天然に存在する宿主細胞によって産生される混合物よりも複雑ではないエポシロンの混合物を産生する宿主細胞を提供する。
【００９３】
特に好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、エポシロンを産生する天然に存在する宿主細胞が産生するよりも複雑ではないエポシロンの混合物を産生する。一例として、本発明の特定の宿主細胞は、天然に存在するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍにより産生される混合物よりも複雑ではない混合物で、エポシロンＤを産生し得る。なぜなら、エポシロンＤは、本発明の宿主細胞においては主生成物であり、天然に存在する宿主細胞においては少量の生成物であるからである。エポシロンを産生する天然に存在するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ細胞は、代表的には、エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆおよび他の非常に少量の生成物の混合物を賛成し、エポシロンＡおよびＢのみが、主生成物として存在する。以下の表１は、本発明の異なる例示的な宿主細胞において産生されるエポシロンをまとめる。
【００９４】
【表１】

従って、本発明の組換え宿主細胞はまた、ただ１つの所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を、主生成物として産生する宿主細胞を含む。
【００９５】
単にエポシロンＰＫＳのドメインの分析に基づいて、ＰＫＳ酵素は、「Ｇ」および「Ｈ」と任意に命名されたエポシロン（これらの構造は以下に示される）の産生を触媒すると予想し得る：
【００９６】
【化７】

エポシロンＧ（Ｒ＝Ｈ）およびエポシロンＨ（Ｒ＝ＣＨ_３）。
【００９７】
エポシロンＧがＣ１２において水素を有し、エポシロンＨがこの位置においてメチル基を有する点で、これらの化合物は互いに異なる。Ｃ１２位における不一致は、ＰＫＳの対応するＡＴドメイン（伸長モジュール４）がマロニルＣｏＡに結合して水素を誘導する能力、またはメチルマロニルＣｏＡに結合してメチルを誘導する能力のいずれかから生じると予測される。しかし、エポシロンＧおよびエポシロンＨは、天然でも本発明の組換え宿主細胞においても観察されていない。その代わり、ＰＫＳの産物は、エポシロンＣおよびエポシロンＤと考えられ、このエポシロンＣおよびエポシロンＤは、それぞれ、Ｃ−１２〜Ｃ−１３の二重結合を有しＣ−１３のヒドロキシル置換基を欠くことだけ、エポシロンＧおよびエポシロンＨとは異なる。異種宿主細胞におけるエポシロンＰＫＳ遺伝子の発現およびこの遺伝子の遺伝子改変により産生される産物に基づいて、以下により十分に記載されるように、エポシロンＣおよびエポシロンＤにおいてＣ１２−Ｃ１３二重結合を形成する脱水反応は、エポシロンＰＫＳ自体によって行われると考えられる。エポシロンＡおよびエポシロンＢは、それぞれ、エポシロンＣおよびエポシロンＤから、ｅｐｏＫ遺伝子産物によるＣ１２−Ｃ１３二重結合のエポキシ化によって形成される。エポシロンＥおよびエポシロンＦは、以下でさらに議論されるように、それぞれ、エポシロンＡおよびエポシロンＢから、Ｃ２１のメチル基のヒドロキシル化によって、またはエポシロンＰＫＳのローディングモジュールにより、マロニルＣｏＡの代わりにヒドロキシマロニルＣｏＡを組み込むことによって形成され得る。
【００９８】
従って、エポシロンＰＫＳ遺伝子およびｅｐｏＫ遺伝子の、本発明の宿主細胞における発現は、エポシロンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの産生を導く。ｅｐｏＫ遺伝子が存在しないか、または変異によって不活性にされるかもしくは部分的に不活性にされる場合、エポシロンＣおよびエポシロンＤは、主生成物として産生される。伸長ドメイン４のＡＴドメインが、マロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴドメインで置換される場合、エポシロンＡおよびエポシロンＣが産生され、そして機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在しない場合、エポシロンＣが、主生成物として産生される。伸長モジュール４のＡＴドメインが、メチルマロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴドメインで置換される場合、エポシロンＢおよびエポシロンＤが主生成物として産生され、そして機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在しない場合、エポシロンＤが主生成物として産生される。
【００９９】
エポシロンＰＫＳおよび改変酵素遺伝子は、エポシロン産生株のＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　ＳＭＰ４４からクローン化した。総ＤＮＡを、Ｊａｏｕａら、１９９２，Ｐｌａｓｍｉｄ　２８：１５７−１６５（これは本明細書中で参考として援用される）により記載される手順を使用して、この株から調製した。コスミドライブラリーを、ｐＳｕｐｅｒｃｏｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍゲノムＤＮＡから調製した。ＰＫＳおよび改変酵素遺伝子クラスター全体を、４つの重複コスミドクローン（１９９９年２月１７日にブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９　ＵＳＡ）に寄託し、以下のようなＡＴＣＣ受託番号を割り当てられた：ｐＫＯＳ３５−７０．１Ａ２（ＡＴＣＣ　２０３７８２）、ｐＫＯＳ３５−７０．４（ＡＴＣＣ　２０３７８１）、ｐＫＯＳ３５−７０．８Ａ３（ＡＴＣＣ　２０３７８３）、およびｐＫＯＳ３５−７９．８５（ＡＴＣＣ　２０３７８０））から単離し、そしてＤＮＡ配列を、ＰＣＴ公開番号００／０３１２３７（これは本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして決定した。ＤＮＡ配列分析は、ローディング分子および９個の伸長モジュールを有するＰＫＳ遺伝子クラスターを明らかにした。ＰＫＳ配列の下流は、ｅｐｏＫと称されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、これはシトクロムＰ４５０オキシダーゼ遺伝子に対して強い相同性を示し、そしてエポシロンエポキシダーゼ改変酵素をコードする。
【０１００】
ＰＫＳ遺伝子は、６個のＯＲＦから構成される。ポリペプチドレベルにおいて、ローディングモジュールおよび伸長モジュール１（ＮＲＰＳ）、２および９は、個々のポリペプチド上に現れ；これらの対応する遺伝子は、それぞれ、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣおよびｅｐｏＦと命名される。モジュール３、４、５および６は、単一のポリペプチド（この遺伝子は、ｅｐｏＤと命名される）に含まれ、そしてモジュール７および８は、別のポリペプチド（この遺伝子は、ｅｐｏＥと命名される）に存在する。ＯＲＦ間の間隔は、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥおよびｅｐｏＦが、オペロンを構築することを示唆する。ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢおよびｅｐｏＫ遺伝子はまた、この大きなオペロンの一部であり得るが、ｅｐｏＢとｅｐｏＣとの間に約１００ｂｐの空間が存在し、そしてｅｐｏＦとプロモーターを含み得るｅｐｏＫとの間に１１５ｂｐの空間が存在する。エポシロンＰＫＳ遺伝子クラスターは、以下のスキーム１に概略的に示される。
【０１０１】
【化８】

ｅｐｏＫのすぐ下流のＰ４５０エポキシダーゼ遺伝子は、ＯＲＦ１であり、これは膜貫通ドメインを含むようでありかつエポシロン輸送に関与し得るポリペプチドをコードする。このＯＲＦは、輸送および調節に関与するタンパク質をコードし得る遺伝子を含む多数のＯＲＦに続く。このモジュールの詳細な試験は、エポシロンの生合成と一致した構成および組成を示す。以下の記載は、ポリペプチドレベルにある。ローディングモジュールおよび伸長モジュール３、４、５および９におけるＡＴドメインの配列は、マロニルローディングモジュールについてのコンセンサス配列に対する類似性を示し、それぞれ、Ｃ−１４、Ｃ−１２（エポシロンＡおよびＣ）、Ｃ−１０およびＣ−２におけるＨ側鎖の存在、ならびにローディングモジュールの存在と一致する。モジュール２、６、７および８におけるＡＴドメインは、ＡＴドメインを特定するメチルマロニルについて、コンセンサス配列を構築し、またそれぞれ、Ｃ−１６、Ｃ−８、Ｃ−６およびＣ−４におけるメチル側鎖の存在と一致する。
【０１０２】
ローディングモジュールは、通常活性部位に存在するシステイン残基がチロシンに変わったＳＫドメインを含む。このドメインは、ＫＳ^ｙと称され、そしてデカルボキシラーゼとして働き、これは、その正常な機能の一部であるが、縮合酵素として機能し得ない。従って、このローディングモジュールは、マロニルＣｏＡを負荷し、これをＡＣＰに移動し、そしてこれを脱カルボキシル化して、システインとの縮合に必要なアセチル残基を生成することが予測される。伸長モジュール１は、システインを活性化し、そしてローディングモジュール上のアセテートとの縮合を触媒する非リボソームペプチドシンセターゼである。この配列は、アミノ酸の活性化に必要なＡＴＰ結合ドメインおよびＡＴＰａｓｅドメインと非常に類似したセグメント、ホスホパンテイニル化部位、酸化ドメイン、環化ドメイン、ならびに伸長ドメインを含む。伸長ドメイン２は、Ｃ−１５〜Ｃ−１７におけるエポシロンの構造を決定する。モジュール２におけるＤＨドメインの存在は、このモジュール内のＣ−１６〜１７デヒドロ部分を生じる。モジュール３におけるドメインは、Ｃ−１４およびＣ−１５におけるエポシロンの構造と一致し；ＫＲの作用から生じるＯＨは、分子のラクトン化において用いられる。伸長モジュール４は、エポシロンＣおよびＤ内の、二重結合が見出されるＣ−１２およびＣ−１３における構造を制御する。ＡＴドメインの配列は、マロネートローディングを特定する配列と類似しているようであるが、これはまた、メチルマロネートを負荷し、それによりある程度、天然に存在する生物の発酵ブロスにおいて見出されるエポシロンの混合物の原因となる。
【０１０３】
機能の予測されるアレイからの有意な逸脱は、伸長モジュール４において見出された。このモジュールは、ＤＨドメインを含み、それによりエポシロンＣおよびＤの合成を、ＰＫＳの産物として検出すると予測された。分析は、モジュール４のＡＴドメインとＫＲドメインとの間の空間は、機能的ＤＨドメインを収容するのに十分には大きくないと評価した。従って、モジュール４における還元の程度は、伸長モジュール４によって指向される縮合後に形成されるβ−ケトのケト還元を越えて進行しないようである。本明細書中に示されるように、エポシロンＰＫＳ遺伝子単独は、本発明の宿主細胞に、エポシロンＣおよびＤを産生する能力を与えるのに十分である。エポシロンＣおよびＤの異種産生は、二重結合を導入するデヒドラターゼの機能が存在することを示す。エポシロンＰＫＳ遺伝子の異種発現および改変されたエポシロンＰＫＳ遺伝子により産生される産物に基づいて、この二重結合を形成する脱水反応は、エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５のＤＨドメイン、およびモジュール５のＥＲドメインによる還元の前の、共役したジエン前駆体の生成により媒介されると考えられる。
【０１０４】
伸長モジュール５および６の各々は、還元ドメイン（ＫＲ、ＤＨおよびＥＲ）のフルセットを有し、Ｃ−１１およびＣ−９においてメチレン官能基を生成する。伸長モジュール７および９は、ＫＲドメインを有し、Ｃ−７およびＣ−３においてヒドロキシルを生成し、そして伸長ドメイン８は、機能的ＫＲドメインを有さず、Ｃ−５におけるケト基の存在と一致する。伸長モジュール８はまた、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメインを含み、これはＣ−４におけるジェミナルなジメチル官能基の存在を生じる。伸長モジュール９はまた、ポリケチド合成を終結し、閉環反応を触媒するチオエステラーゼドメインを有する。
【０１０５】
エポシロンＰＫＳの遺伝子、タンパク質、モジュールおよびドメインを、以下の表２にまとめる。
（表２）
【０１０６】
【表２】

ＮＲＰＳ−非リボソームペプチドシンセターゼ；ＫＳ−ケトシンターゼ；ｍＡＴ−マロニルＣｏＡ特定化アシルトランスフェラーゼ；ｍｍＡＴ−メチルマロニルＣｏＡ特定化アシルトランスフェラーゼ；ＤＨ−デヒドラターゼ；ＥＲ−エノイルレダクターゼ；ＫＲ−ケトレダクターゼ；ＭＴ−メチルトランスフェラーゼ；ＴＥ−チオエステラーゼ；＊−不活性ドメイン。
【０１０７】
配列検査により、ｅｐｏＡとｅｐｏＢとの間（ローディングモジュールと伸長モジュール１　ＮＲＰＳとの間）、およびｅｐｏＣとｅｐｏＤとの間の翻訳カップリングが評価された。非常に小さなギャップは、ｅｐｏＤとｅｐｏＥとの間、およびｅｐｏＥとｅｐｏＦとの間に見出されるが、１００ｂｐを越えるギャップは、ｅｐｏＢとｅｐｏＣとの間、およびｅｐｏＦとｅｐｏＫとの間に見出される。これらの遺伝子間領域は、プロモーターを含み得る。
【０１０８】
従って、エポシロンＰＫＳは、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子の遺伝子産物からなる多タンパク質複合体である。エポシロンを産生する能力を宿主細胞に与えるために、この宿主細胞に、この宿主細胞において発現し得る本発明の組換えｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子、ならびに必要に応じて他の遺伝子（例えば、ｅｐｏＫ）を提供する。当業者は、エポシロンおよび他のＰＫＳ酵素は、本明細書中で単一の実体として言及され得るが、これらの酵素は代表的に、マルチサブユニットタンパク質であることを理解する。従って、ＰＫＳを構築する複数のタンパク質のうち１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を改変することによって、誘導体ＰＫＳ（天然に存在するＰＫＳとは欠失または変異だけ異なるＰＫＳ）またはハイブリッドＰＫＳ（２つの異なるＰＫＳ酵素の部分から構成されるＰＫＳ）を作製し得る。
【０１０９】
エポシロンのＰＫＳ後改変または変更は、複数の酵素により媒介される複数の工程を包含する。これらの酵素は、本明細書中で変更または改変酵素と称される。エポシロンＰＫＳ遺伝子のｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子の、ｅｐｏＫを発現しない本発明の宿主細胞における発現は、主生成物としてのエポシロンＣおよびＤの産生を生じ、これらのエポシロンＣおよびＤは、エポシロンＡおよびＢのＣ−１２−Ｃ−１３エポキシドを欠くが、その代わりＣ−１２−Ｃ−１３二重結合を有する。従って、エポシロンＣおよびＤは、ｅｐｏＫ遺伝子によってコードされるエポキシダーゼにより、エポシロンＡおよびＢに変換される。エポシロンＡおよびＢは、ヒドロキシラーゼ遺伝子によって、エポシロンＥおよびＦに変換され得、これは、エポシロンＰＫＳ遺伝子クラスターと関連した遺伝子によってコードされ得るか、またはＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍに対して内在性の別の遺伝子によってコードされ得る。あるいは、これらの化合物は、マロニルＣｏＡ以外のスターター単位（例えば、ヒドロキシマロニルＣｏＡ）を結合するローディングモジュールによって形成され得る。従って、本発明によって提供される１つ以上の組換え改変酵素遺伝子を有する宿主細胞を提供することによって、または改変酵素を自然に発現する（または発現しない）宿主細胞を使用することによって、および／あるいはマロニルＣｏＡ以外のスターター単位を提供することによって、この宿主細胞において、必要に応じて改変されたエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生し得る。
【０１１０】
従って、本発明は、多種多様な組換えＤＮＡ化合物、ならびに天然に存在するエポシロンＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、およびそれらの誘導体を発現するための宿主細胞を提供する。本発明はまた、エポシロンＥおよびＦと類似の様式で改変されたエポシロン誘導体を産生する組換え宿主細胞を提供する。さらに、本発明の任意のエポシロンまたはエポシロン誘導体は、ＰＣＴ公開番号００／０３９２７６（本明細書中で参考として援用される）に記載される方法に従って、対応するエポシロンＥまたはＦ誘導体に変換され得る。
【０１１１】
本発明はまた、多種多様な組換えＤＮＡ化合物、およびエポシロン誘導体を作製する宿主細胞を提供する。本明細書中で使用する場合、成句、エポシロン誘導体とは、少なくとも１つのドメインが挿入されたか、またはドメインが欠失もしくは変異によって不活性にされたか、その触媒機能を変更するように変異されたか、もしくは異なる機能を有するドメインによって置換されたかのいずれかの組換えエポシロンＰＫＳによって産生される化合物をいう。任意の場合において、このように産生されたエポシロン誘導体ＰＫＳは、エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦからなる群から選択される天然に存在するエポシロンの構造とは異なる化合物を産生するように機能する。本発明によって提供される組換えＤＮＡ化合物および宿主細胞のさらなる理解を容易にするために、エポシロンＰＫＳのローディングモジュールおよびモジュールの各々、ならびにそれらの新規の組換え誘導体の詳細な考察を、以下に示す。
【０１１２】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールは、「不活性な」ＫＳドメイン（ＫＳ^Ｙと称される）を含み、これは、「活性な」ＫＳドメイン中に見出されるシステイン残基の変わりのチロシン（Ｙ）残基の存在に起因して、活性なＫＳドメインによって媒介される縮合反応を行い得ない。このＫＳ^Ｙドメインは、ＫＳドメインによって媒介される脱カルボキシル化反応を行う。このような「不活性な」ＫＳドメインは、通常は、活性部位のシステインの代わりのグルタミン（Ｑ）残基と共に、他のＰＫＳ酵素中で見出され、そしてＫＳ^Ｑドメインと呼ばれる。ラット脂肪酸シンターゼ中のＫＳ^Ｑドメインは、縮合を行い得ないことが示されたが、脱カルボキシル化における２オーダーの大きさの増加を示す。Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉら、７　Ｓｅｐ．１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（３６）：１１６４３−１１６５０（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＫＳ^Ｑドメインは、脱カルボキシル化において、ＫＳ^Ｙドメインよりも効率的であり得、その結果、エポシロンＰＫＳ中のＫＳ^ＹドメインのＫＳ^Ｑでの置換により、いくつかの宿主細胞における、または特定の培養条件下のエポシロン生合成の効率が増加し得る。これは、以下の実施例６に記載されるように、単にコドンをチロシンコドンからグルタミンコドンに変えることによって達成され得る。これはまた、ＫＳ^Ｙドメインを、別のＰＫＳ（例えば、オレアンドリド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳまたはナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ）のＫＳ^Ｑドメインで置換することによって達成され得る（上記の表で引用される参考文献を、オレアンドロマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンＰＫＳ、ならびに改変酵素と共に参照のこと）。
【０１１３】
エポシロンローディングモジュールはまた、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメイン（これは、ＫＳ^Ｙによって脱カルボキシル化されて、アセチル基を生成すると考えられている）、およびＡＣＰドメインを含む。本発明は、組換えエポシロン誘導体ローディングモジュールまたはそれらのコードＤＮＡ配列を提供し、ここで、マロニル特異的ＡＴドメインまたはそのコード配列は、別の特異性（例えば、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、および２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ）に変更されている。エポシロンＰＫＳの他のタンパク質と共に発現される場合、このようなローディングモジュールは、エポシロンのチアゾール間のメチル置換基が、それぞれ、エチル、プロピルおよびヒドロキシメチルで置換されたエポシロンの生成を生じる。本発明は、このようなローディングモジュールを含む組換えＰＫＳ酵素、およびこのような酵素を産生するための宿主細胞、ならびにこれによって産生されるポリケチドを提供する。ＡＴドメインが、２−ヒドロキシマロニルＣｏＡを特定化するように変更される場合、対応するエポシロンＰＫＳ誘導体は、エポシロンＥおよびエポシロンＦ誘導体を産生する。２−ヒドロキシマロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴドメインは、産生されるポリケチドの対応する位置にヒドロキシル基を有するポリケチドを生じ、このヒドロキシル基は、メチル化されて、ポリケチド改変酵素によってメトキシ基を生成する。例えば、上記の表のＦＫ−５２０　ＰＫＳと共に引用される参考文献を参照のこと。従って、本明細書中の２−ヒドロキシマロニル特異的ＡＴドメインを有するＰＫＳとの言及は、ポリケチド中の対応する位置にヒドロキシル基またはメトキシ基のいずれかを有するＰＫＳにより産生されるポリケチドをいう。
【０１１４】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールはまた、ＥＲドメインを含む。このＥＲドメインは、エポシロンのチアゾール部分の二重結合のうちの１つの形成に関与し得る（その通常の反応とは逆に）が、これは非官能性であり得る。いずれの場合においても、本発明は、ＥＲ領域を有するかまたは有さないエポシロンＰＫＳローディングモジュールをコードする組換えＤＮＡ化合物、ならびにエポシロンローディングモジュールのＥＲドメインの代わりに別のＰＫＳ由来のＥＲドメイン（活性または不活性のいずれかであり、付随的なＫＲドメインおよびＤＨドメインを有するかまたは有さない）を含むハイブリッドローディングモジュールを提供する。本発明はまた、このようなローディングモジュールを含む組換えＰＫＳ酵素、ならびにこのような酵素を産生するための宿主細胞、およびこれにより産生されるポリケチドを提供する。
【０１１５】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールはまた、異種ＰＫＳ由来のローディングモジュールと置換されて、エポシロン誘導体を作製するハイブリッドＰＫＳを形成する。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳのローディングモジュールは、以下の実施例に記載されるように、ＮＲＰＳで置換される。
【０１１６】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールは、ＰＫＳの第一の伸長モジュールに続き、これは、システインに特異的な伸長ＮＲＰＳモジュールである。このＮＲＰＳモジュールは、別個のタンパク質（ｅｐｏＢ遺伝子の産物）として天然に発現される。１つの実施形態において、ＮＲＰＳモジュールコード配列の一部分は、異種コード配列とともに利用される。この実施形態において、本発明は、例えば、システインから別のアミノ酸にエポシロンＰＫＳのＮＲＰＳモジュールの特異性を変化することを提供する。この変化は、コード配列を構築することによって達成され、ここで、このエポシロンＰＫＳ　ＮＲＰＳモジュールコード配列の全てまたは一部分が、異なる特異性のＮＲＰＳモジュールのコードする配列によって置換されている。
【０１１７】
１つの例示的な実施形態において、エポシロンＮＲＰＳモジュールの特異性が、システインからセリンまたはスレオニンに変化される。このような改変ＮＲＰＳモジュールがエポシロンＰＫＳの他のタンパク質と共に発現される場合、組換えＰＫＳは、エポシロン誘導体を生成し、ここで、エポシロン（エポシロン誘導体）のチアゾール部分が、各々、オキサゾールまたは５−メチルオキサゾール部分に変換される。従って、例示的な実施形態において、本発明は、宿主細胞、ベクター、および組換えエポシロンＰＫＳ酵素を提供し、ここで、ＮＲＰＳドメインは、エポシロンＮＲＰＳのアデニル化ドメインとｅｎｔＦ遺伝子によってコードされるＮＲＰＳのアデニル化ドメインとの置換によって変更されている（セリンについて）。別の例示的な実施形態において、本発明は、宿主細胞、ベクター、および組換えエポシロンＰＫＳ酵素を提供し、ここで、ＮＲＰＳドメインは、エポシロンＮＲＰＳのアデニル化ドメインとｖｉｂＦ遺伝子によってコードされるＮＲＰＳのアデニル化ドメインとの置換によって変更されている（スレオニンについて）。１つの実施形態において、これらのＮＲＰＳ置換は、エポシロンＰＫＳにおいてなされ、このエポシロンＰＫＳはまた、オキサゾールおよびメチルオキサゾールエポシロン誘導体の１６−デスメチル誘導体を生成するために、メチルマロニルＣｏＡの代わりに、マロニルＣｏＡに結合する伸長モジュール２を含む。
【０１１８】
あるいは、本発明は、ＮＲＰＳモジュールを伴わないかまたは異種ＰＫＳ由来のＮＲＰＳモジュールを伴う、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子（またはそれらの改変されたバージョン）の産物からなる組換えＰＫＳ酵素を提供する。この異種ＮＲＰＳモジュールは、別個のタンパク質としてか、あるいはｅｐｏＡまたはｅｐｏＣ遺伝子を有する融合タンパク質として発現され得る。ＰＫＳの１つのモジュールを別のモジュールと置換する場合に、適合性のモジュール間リンカー配列を維持するかまたはそうでなければ利用することを確実にすることが重要であり得る。ＰＣＴ公開番号００／０４７７２４を参照のこと（参考として援用される）。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳ酵素および対応する組換えＤＮＡ化合物ならびにベクターを提供し、ここで、ＮＲＰＳモジュールは、不活性化されているかまたは欠失されている。従って、本発明によって提供される不活性なＮＲＰＳモジュールタンパク質およびコード配列は、ＰＣＰドメインが、完全にまたは部分的に欠失されているか、またはそうでなければ活性部位セリン（ホスホパンテテイニル化のための部位）を別のアミノ酸（例えば、アラニン）に置換することによって不活性化されているか、もしくは、アデニル化ドメインが、欠失されているかまたはそうでなければ不活性化されているものを含む。１つの実施形態において、ローディングモジュールおよびＮＲＰＳの両方が、欠失されているかまたは不活性化されている。任意の事象において、得られたエポシロンＰＫＳは、次いで、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体のためにＰＫＳの伸長モジュール２（または引き続くモジュール）のＫＳドメインに結合する基質が提供される場合にのみ、機能し得る。本発明によって提供される方法において、このように改変された細胞は、次いで、活性化アシルチオエステルを供給され、この活性化アシルチオエステルは、好ましくは、第二の、しかし潜在的に任意に引き続く、伸長モジュールによって結合され、そして新規なエポシロン誘導体に処理される。この宿主細胞は、活性化アシルチオエステルを供給されて、本発明の新規なエポシロン誘導体を生成する。ＰＫＳを発現する宿主細胞またはこれを含む抽出物を含まない細胞は、新規な前駆体分子のＮ−アシルシステアミンチオエステル（ＮＡＣＳ）を供給されるかまたはこれを補充されて、エポシロン誘導体を調製し得る。ＰＣＴ公開番号ＵＳ９９／０３９８６および００／０４４７１７（この両方は、本明細書中で参考として援用される）、および以下の実施例９および実施例１０を参照のこと。
【０１２０】
エポシロンＰＫＳの第二の（最初の非ＮＲＰＳ）伸長モジュールは、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳの第二の伸長モジュールは、ｅｐｏＣ遺伝子によって個別のタンパク質として生成される。第二の伸長モジュールコード配列の全てまたは一部分のみが、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のＰＫＳコード配列と共に使用される。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴをマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＤＨまたはＫＲもしくは両方を欠失すること；ＤＨまたはＫＲもしくは両方を、異なる立体化学に特異的なＤＨまたはＫＲもしくは両方と置換すること；ならびに／またはＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた第二の異種伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構成する他のタンパク質とともに同時発現される。あるいは、エポシロンＰＫＳの第二の伸長モジュールが欠失され得るか、またはこれが異種ＰＫＳ由来のモジュールと置換され得、これは、別個のタンパク質として、またはｅｐｏＢまたはｅｐｏＤ遺伝子産物のいずれかに融合され得る融合タンパク質として、発現され得る。
【０１２１】
本発明の例示的な組換えＰＫＳ遺伝子は、エポシロンＰＫＳの第二の伸長モジュールについてのＡＴドメインをコードする配列が、メチルマロニル特異的ＡＴからマロニル特異的ＡＴをコードするＡＴドメインを変化させるために、変更または改変されているものを含む。このようなマロニル特異的ＡＴドメインをコードする核酸が、例えば、限定されないが、ナルボノライド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ、ソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）ＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ（すなわち、伸長モジュール２および１２）、ならびにＦＫ５２０　ＰＫＳ（すなわち、伸長モジュール３、７、および８）をコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得る。このような第二のハイブリッド伸長モジュールが、エポシロンＰＫＳを構成する他のタンパク質とともに同時発現される場合、生成された得られたエポシロン誘導体は、１６−デスメチルエポシロンである。１つの実施形態において、このハイブリッドＰＫＳはまた、伸長モジュール４にメチルマロニルＣｏＡ特定的ＡＴドメインを含み、そして機能的ｅｐｏＫ遺伝子を欠く宿主細胞において発現され（ｅｐｒｅｓｓｅｄ）、その結果、生成される化合物は、１６−デスメチルエポシロンＤである。別の実施形態において、このハイブリッドＰＫＳはまた、スレオニンに特異的な変更されたＮＲＰＳを含み、これは、５−メチルオキサゾール−１６−デスメチルエポシロンの生成に導く。さらに、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳ酵素および対応する組換えタンパク質をコードするＤＮＡ化合物およびベクターを提供し、ここで、ＫＳドメインは、第二の（または引き続く）伸長モジュールのＫＳドメインが、以下の実施例９に記載されるように、不活性化されているかまたは欠失されている。好ましい実施形態において、この不活性化は、活性部位のシステインについてのコドンをアラニンコドンに変化することによって達成される。ＮＲＰＳモジュールについて上記に記載される対応する改変体と同様に、得られた組換えエポシロンＰＫＳ酵素は、残りのドメインおよび組換えＰＫＳ酵素のモジュールによって結合および伸長され得る前駆体を供給しない限り、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成し得ない。例示的な前駆体化合物は、以下の実施例１０に記載される。あるいは、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子のみを発現する宿主細胞にこのような前駆体が単に提供され得る。
【０１２２】
エポシロンＰＫＳのこの第三の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡの特異的なＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳのこの第三の伸長モジュールは、タンパク質（ｅｐｏＤ遺伝子の産物）として発現され、これはまた、モジュール４、５および６を含む。伸長モジュール３〜６のいずれかの改変に起因して、エポシロン誘導体を生成する組換えエポシロンＰＫＳを作製するために、代表的に、全ての４つの伸長モジュールを含むタンパク質が発現される。１つの実施形態において、第三の伸長モジュールコード配列の全てまたは一部分が、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のＰＫＳコード配列と共に使用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＫＲを欠失すること；ＫＲを、異なる立体化学に特異的なＫＲと置換すること；ならびに／あるいはＤＨ、またはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた第三の異種伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列とともに利用され得る。
【０１２３】
本発明の例示的な組換えＰＫＳ遺伝子は、エポシロンＰＫＳの第三の伸長モジュールについての配列をコードするＡＴドメインが、マロニル特異的ＡＴからメチルマロニル特異的ＡＴをコードするＡＴドメインを変化させるために、変更または改変されているものを含む。このようなメチルマロニル特異的ＡＴドメインをコードする核酸が、例えば、限定されないが、ＤＥＢＳをコードするＰＫＳ遺伝子、ナルボノライド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、ならびにＦＫ−５２０　ＰＫＳから単離され得る。残りのモジュールおよびエポシロンＰＫＳのタンパク質またはエポシロンＰＫＳ誘導体とともに同時発現される場合、組換えＰＫＳは、本発明の１４−メチルエポシロン誘導体を生成する。
【０１２４】
当業者は、ＰＫＳの第三の伸長モジュールのＫＲドメインが、エポシロンの環化に関連するヒドロキシル基を形成する原因であることを認識する。結果的に、第三の伸長モジュールのＫＲドメインを、破壊すること、あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲドメインを付加することが、環化を妨害し、このことは、直鎖状分子、あるいはエポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦとは異なる位置で環化される分子に導く。
【０１２５】
エポシロンＰＫＳの第四の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡのいずれかに結合し得るＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。１つの実施形態において、第四の伸長モジュールコード配列の全てまたは一部分のみが、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のＰＫＳコード配列と共に使用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡおよびメチルマロニル特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＫＲを欠失すること；ならびに／あるいは、ＫＲを置換すること（必要に応じて、異なる立体化学に特定することを含む）；ならびに／またはＤＨもしくはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた第四の異種伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成する組換えＰＫＳのタンパク質サブユニットに組み込まれる。あるいは、本発明は、エポシロンおよびエポシロン誘導体のための組換えＰＫＳ酵素を提供し、ここで、第四の伸長モジュール全体が、欠失され得るか、またはこれが異種ＰＫＳ由来のモジュールと置換され得る。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明は、メチルマロニルＣｏＡに結合するがマロニルＣｏＡに結合しない（またはマロニルＣｏＡに結合するかメチルマロニルＣｏＡに結合しない）ＡＴをコードするように改変されたエポシロンＰＫＳの第四の伸長モジュールについてのコード配列を含む組み換えＤＮＡ化合物を提供する。１つの実施形態において、特異性のこの変化は、伸長モジュール４ＡＴドメインについてのコード配列の変異によって達成される。このような変異は、変異誘発剤（例えば、ＵＶ光）を使用してか、または特異的変異誘発によって、ランダムに達成され得る。別の実施形態において、特異性のこの変化は、伸長モジュール４ＡＴドメインコード配列の全てまたは一部分を、異種ＡＴドメインについてのコード配列と置換することによって、達成される。従って、本発明は、組換えＤＮＡ化合物および発現ベクター、ならびに対応する組換えＰＫＳを提供し、ここで、第四のハイブリッド伸長モジュール（メチルマロニル特異的ＡＴを有する）が組み込まれている。このメチルマロニル特異的ＡＴコード配列は、例えば、限定されないが、オレアンドライドＰＫＳ、ＤＥＢＳ、ナルボノライドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、またはメチルマロニル特異的ＡＴドメインを含む任意の他のＰＫＳについてのコード配列から開始し得る。
【０１２７】
本発明に従って、このコード配列から発現された第四のハイブリッド伸長モジュールは、エポシロンＰＫＳ（または、エポシロン誘導体についてのＰＫＳ）に、代表的には、エポシロンＰＫＳの誘導体ｅｐｏＤ遺伝子産物（これは、改変された第四の伸長モジュール、および伸長モジュール３、５、および６を有する）として、組み込まれ得、これらのモジュールの１つ以上は、必要に応じてエポシロンＰＫＳの誘導体の形態であり得る。従って、本発明によって提供される組換えメチルマロニル特異的エポシロン第四伸長モジュールコード配列は、宿主細胞中に所望のエポシロン化合物を生成するための代替の方法を提供する。特に、このような化合物は、エポシロンＤ、Ｂ、およびＦであり、エポシロンＢまたはその誘導体の生成は、機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在する否かに依存する。
【０１２８】
本発明はまた、マロニルＣｏＡに結合するがメチルマロニルＣｏＡには結合しないＡＴをコードするように改変されたエポシロンＰＫＳの第四の伸長モジュールについてのコード配列を含む組換えＤＮＡ化合物を提供する。本発明は、組換えＤＮＡ化合物およびベクター、ならびに対応する組換えＰＫＳを提供し、ここで、この第四のハイブリッド伸長モジュールは、誘導体ｅｐｏＤ遺伝子産物に組み込まれ得る。エポシロンＰＫＳ（またはエポシロン誘導体についてのＰＫＳ）に組込まれる場合、得られた組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＣ、Ａ、およびＥを生成し、エポシロンＡの生成は、機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在するか否かに依存する。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、１２−デスメチル−１２−エチル−エポシロンＤを生成するための組換え宿主細胞を提供する。この実施形態において、本発明は、宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、組換えエポシロンＰＫＳ誘導体を発現し、ここで、伸長モジュール４のＡＴドメインは、例えば、ＦＫ　５２０またはニッダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ酵素由来の、エチルマロニルＣｏＡ特異的伸長モジュールによって置換されている。１つの実施形態において、宿主細胞は、組換え宿主細胞であり、この組換え宿主細胞は、異種宿主細胞由来の遺伝子（ｃｃｒ遺伝子）によってコードされるか、またはメチルマロニルＣｏＡの生成を増強するための異種プロモーターの制御下で、クロトニルＣｏＡレダクターゼを発現する。１つの実施形態において、宿主細胞は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞であり、このＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞から単離されたｃｃｒ遺伝子を発現する。別の実施形態において、宿主細胞は、ブチレートを輸送し、そしてこれをブチリルＣｏＡ（これは、エチルマロニルＣｏＡに変換される）に変換する、Ｅ．ｃｏｌｉ　ａｔｏＡ、Ｄ、およびＥ遺伝子を発現または過剰発現するように、改変されている。
【０１３０】
内因性ＡＴコード配列と、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴについてのコード配列との置換に加えて、ＫＲドメインコード配列はまた、別のＫＲ、ＤＨおよびＫＲ（例えば限定されないが、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０あるいはＦＫ−５２０　ＰＫＳのモジュール１または５由来）、またはＤＨ、ＫＲ、およびＥＲについてのコード配列と置換され得る。ＫＲが、別のＫＲ、もしくはＫＲおよびＤＨと置換され得、そして伸長モジュール５（またはＰＫＳの他の箇所）に変化がない場合、組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＣおよびＤを生成する。なぜなら伸長モジュール５のＤＨドメインは、エポシロンＣおよびＤのＣ−１２−Ｃ−１３二重結合の形成を媒介するからである。ＫＲが、ＫＲ、ＤＨ、およびＥＲと置換され得、そして伸長モジュール５（またはＰＫＳの他の箇所）において、変化がない場合、組換えエポシロンＰＫＳは、１２，１３−デヒドロ−エポシロンＣおよびＤを生成する。ＫＲが、不活性ＫＲと置換され得るかまたはそうでなければＫＲを不活性化する場合、組換えエポシロンＰＫＳは、１３−オキソ−１１，１２−デヒドロ−エポシロンＣおよびＤを生成する。
【０１３１】
従って、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳを提供し、伸長モジュール４のＫＲドメインが、変異、欠失、または別のＰＫＳからの非機能的ＫＲドメインによって不活性にされる。この組換えＰＫＳは、主に１３−オキソ−１１，１２−デヒドロエポシロンＢを生成し；この生物体によって生成される化合物において観測されるＣ−１１−Ｃ−１２二重結合は、伸長モジュール５のＥＲドメインによる還元の前に、伸長モジュール５のＤＨドメインによる新生ポリケチド鎖において形成される二重結合の移動に起因して、生じると考えられる。本発明はまた、宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、この新規なポリケチドを生成する。例えば、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１２２−５６（この株は、ブタベスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．　Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９　ＵＳＡに２０００年１１月２１日に寄託され、そして登録番号ＰＴＡ　２７１４で入手可能である）は、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで、モジュール４のＫＲドメインは、欠失によって、不活性にされており、そして１３−オキソエポシロンＡおよびＢならびにそのデヒドロ誘導体（主に、１３−オキソ−１１，１２−デヒドロエポシロンＢ）を生成する。本発明はまた、この株によって生成される新規なエポシロン誘導体を提供する。
【０１３２】
エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡに結合するＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲ、およびＡＣＰドメインを含む。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、エポシロン誘導体を生成するエポシロンＰＫＳまたは組換えエポシロンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入され得る。別の実施形態において、第五の伸長モジュールコード配列の一部は、他のＰＫＳコード配列とともに利用されて、ハイブリッドモジュールコード配列およびそれによってコードされるハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つ、または３つ全てを欠失すること；ならびに／またはＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つ、または３つ全てを、ＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、またはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲのいずれかと置換すること（必要に応じて、異なる立体化学を特定することを含む）を提供する。この得られた第五のハイブリッド伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列とともに利用され得る。あるいは、エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールは、異種ＰＫＳのモジュールによってその全体が欠失または置換されて、エポシロンＰＫＳまたはその誘導体の他のタンパク質と組み合せて、エポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構成するタンパク質を生成する。
【０１３３】
本発明の例示的な組換えＰＫＳ遺伝子は、組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体を含み、ここで、エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールについてのコード配列をコードするＡＴドメインが、マロニル特異的ＡＴからメチルマロニル特異的ＡＴをコードするＡＴドメインを変化させるように変更または置換され得る。このようなメチルマロニル特異的ＡＴドメインをコードする核酸は、例えば限定されないが、ＤＥＢＳをコードするＰＫＳ遺伝子、ナルボノライドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、およびＦＫ−５２０　ＰＫＳから単離され得る。このような組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、ｅｐｏＦ、および／またはｅｐｏＫ遺伝子（あるいは、その誘導体）と同時発現され、それらから構成されるＰＫＳは、１０−メチルエポシロンまたはその誘導体を生成する。本発明によって提供される別の組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、この改変モジュール５コード配列だけでなく、モジュール４コード配列（これは、メチルマロニルＣｏＡのみに結合するＡＴドメインをコードする）を含む。ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、ｅｐｏＦ、および／またはｅｐｏＫ遺伝子と共にＰＫＳが組み込まれる場合、組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体産物は、１０−メチルエポシロンＢおよび／またはＤ誘導体の生成を導く。
【０１３４】
本発明の他の例示的な組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、エポシロンＰＫＳ第五の伸長モジュールについての配列をコードするＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインの１つ以上が、以下を提供するように置換されたかまたは変異されたかのいずれかであるものを含む：（ｉ）非機能的なＥＲ、ＤＨ、またはＫＲドメイン；（ｉｉ）機能的ＫＲドメインのみ；（ｉｉｉ）機能的ＫＲおよびＤＨドメイン；または（ｉｖ）別のＰＫＳ由来の機能的ＥＲ、ＤＨ、またはＫＲドメイン。伸長モジュール５のＤＨドメインが、エポシロンＣおよびＤにおけるＣ−１２−Ｃ−１３二重結合の形成の原因であるという発見は、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含む任意の生物体（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍおよび組換え宿主細胞を含む）において、エポシロンおよびエポシロン誘導体を作製するための、本発明の新規な方法を提供する。さらに、現在、伸長モジュール６のＤＨドメインもまた、先のモジュールに結合した新生ポリケチド（これは、新規なエポシロン誘導体を作製するために、本発明の方法に従って開発され得る）のβ−カルボニル上で作用し得ることが発見されている。
【０１３５】
従って、３つの伸長モジュール５のＫＲ、ＤＨ、およびＥＲドメイン全てが欠失されるか、そうでなければ不活化される場合、組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＡおよびＢの１３−ヒドロキシ−１１−オキソアナログを生成する。ＤＨおよびＥＲドメインが欠失されるか、さもなくば不活化される場合、組換えエポシロンＰＫＳは、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ−エポシロン、主に、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ−エポシロンＤを生成する。本発明はまた、この新規なポリケチドを生成する宿主細胞を提供する、例えば、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１２２−１４８（この株は、ブタペスト条約の条項に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９　ＵＳＡに、２０００年１１月２１日に寄託され、登録番号ＰＴＡ−２７１１の下で利用可能である）は、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで伸長モジュールの５のＤＨ、ＫＲおよびＥＲドメインは、ＫＲドメインのみと置き換えられ、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ−エポシロンＤを生成する。本発明はまた、この株により生成される新規なエポシロン誘導体を提供する。ＥＲドメインのみが欠失されるか、そうでなければ不活化される場合、組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＣおよびエポシロンＤの１０，１１−デヒドロアナログ、主に、１０，１１−デヒドロエポシロンを生成する。従って、１つの局面において、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳを提供し、ここで伸長モジュール５のＥＲドメインは、欠失されるか、または変異により不活化され、そして１０，１１−デヒドロエポシロンＤを生成する。別の実施形態において、本発明は、エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５のＥＲドメインについてのコード配列における変異に起因して、１０，１１−デヒドロ−エポシロンＤを生成するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ宿主細胞を提供する。
【０１３６】
本発明のこれらの組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子とともに、または他の改変を含む（およびそれ自体がさらなる改変を含み得る）組換えｅｐｏ遺伝子とともに発現されて、対応するエポシロン誘導体を作製するＰＫＳを生成する。例えば、本発明により提供される１つの組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、メチルマロニルＣｏＡのみを結合するＡＴドメインをコードするモジュール４のコード配列を含む。上記のように、エポシロンＣ−１１誘導体を生成するための機能的に類似のｅｐｏＤ遺伝子はまた、エポシロンの５つめの伸長モジュールのＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインのうちの１つ、２つまたは３つ全ての不活化により作製され得る。任意のモジュールにおいてこのようなドメインを改変するための別の様式は、同じまたは異種のＰＫＳコード配列の別のモジュールから得た所望のドメインの完全なセットと置換することによる。この様式において、ＰＫＳの天然の構成が保存される。また、存在する場合、ネイティブのＰＫＳにおいてともに機能するＫＲおよびＤＨまたはＫＲ、ＤＨおよびＥＲドメインは、好ましくは、組換えＰＫＳにおいて用いられる。上記の置換についての例示的置換ドメインとしては、例えば、ラパマイシンＰＫＳ伸長モジュール３に由来する不活性ＫＲドメイン、ラパマイシンＰＫＳ伸長モジュール５に由来するＫＲドメイン、ならびにラパマイシンＰＫＳ伸長モジュール４に由来するＫＲドメインおよびＤＨドメインが挙げられるが、これらに限定されない。他のこのような不活性ＫＲ、活性ＫＲ、および活性ＫＲおよびＤＨドメインをコードする核酸は、例えば、ＤＥＢＳ、ナルボノリドＰＫＳ、およびＦＫ−５２０ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得るが、限定されない。得られたＰＫＳ酵素の各々は、本発明の半合成エポシロン誘導体を得るために、標準的な化学的方法論によりインビトロでさらに誘導体化され得るポリケチド化合物を生成する。
【０１３７】
エポシロンＰＫＳの第６の伸長モジュールとしては、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲおよびＡＣＰが挙げられる。１つの実施形態において、第６の伸長モジュールコード配列の一部分は、他のＰＫＳコード配列とともに利用されて、ハイブリッド分子を作成する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴをマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換するか；ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つまたは３つ全てを欠失させるか；ならびに／あるいはＥＲ、ＤＨおよびＫＲのうちのいずれか１つ、２つまたは３つ全てを、ＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、またはＫＲ、ＤＨおよびＥＲのいずれかと置換して、必要に応じて、異なる立体化学を特定することを提供する。得られた異種の第６の伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを作製するＰＫＳのタンパク質サブユニットのコード配列とともに利用され得る。あるいは、エポシロンＰＫＳの第６の伸長モジュールは、異種ＰＫＳからのモジュールによりその全体が欠失または置換されて、エポシロン誘導体についてのＰＫＳを生成し得る。
【０１３８】
本発明の例示的組換えＰＫＳ遺伝子としては、エポシロンＰＫＳの第６の伸長モジュールのＡＴドメインコード配列が、コードされるＡＴドメインを変更または置換させ、それにより、メチルマロニル特異的ＡＴからマロニル特異的ＡＴへ変化させた遺伝子が挙げられる。このようなマロニル特異的ＡＴドメインコード核酸は、例えば、ナルボノリドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、およびＦＫ−５２０ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得るが、限定されない。このようなハイブリッドモジュール６をコードする本発明の組換えｅｐｏＤ遺伝子が他のエポシロンＰＫＳ遺伝子とともに同時発現された場合、組換えＰＫＳは、８−デスメチルエポシロン誘導体を作製する。この組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、他の改変を含む組換えｅｐｏ遺伝子誘導体とともに同時発現され得るか、またはそれ自体、対応する８−デスメチルエポシロン誘導体を作製するＰＫＳを生成するようにさらに改変され得る。例えば、本発明により提供される１つの組換えｅｐｏＤ遺伝子はまた、メチルマロニルＣｏＡのみを結合するＡＴドメインをコードするモジュール４コード配列を含む。ＰＫＳにｅｐｏＡ，ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥおよびｅｐｏＦ遺伝子とともに組み込まれる場合、組換えｅｐｏＤ遺伝子産物は、エポシロンＢ（機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在するならば）およびエポシロンＤの８−デスメチル誘導体の生成を導く。
【０１３９】
本発明の他の例示的な組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体としては、エポシロンＰＫＳの６つの伸長モジュールについてのＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインコード配列が、（ｉ）ＫＲおよびＤＨドメイン；（ｉｉ）ＫＲドメイン；ならびに（ｉｉｉ）不活性のＫＲドメインをコードする配列で置換されたものが挙げられる。本発明のこれらの組換えｅｐｏＤ遺伝子は、他のエポシロンＰＫＳ遺伝子と同時発現される場合、対応する（ｉ）Ｃ−９アルケン、（ｉｉ）Ｃ−９ヒドロキシ（両方のエピマー、このうちの１つのみが、さらなるＫＳおよび／またはＡＣＰ置換が次のモジュールでなされない限り、下流モジュールによってプロセスされ得る）、ならびに（ｉｉｉ）Ｃ−９ケト（Ｃ−９−オキソ）エポシロン誘導体を作製する。機能的に等価な６つの伸長モジュールはまた、エポシロンの６つの伸長モジュールのＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインのうち、１つ、２つまたは３つ全ての相互作用によって作製され得る。例えば、本発明は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ３９−１６４（この株は、ブタペスト条約の条項に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９　ＵＳＡに、２０００年１１月２１日に寄託され、登録番号ＰＴＡ−２７１１の下で利用可能である）を提供し、これは、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで伸長モジュールの６のＫＲドメインは、変異によって不活性にされ、そしてこれは、９−ケトエポシロンＤを生成する。本発明はまた、この株により生成される新規なエポシロン誘導体を提供する。
【０１４０】
従って、この組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、他の変化を有する他の組換えｅｐｏ遺伝子誘導体と共に同時発現され得るか、またはそれ自体が、対応するＣ−９エポシロン誘導体を作製するＰＫＳを生成するようにさらに変更され得る。例えば、本発明によって提供される１つの組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、メチルマロニルＣｏＡにのみ結合するＡＴドメインをコードするモジュール４コード配列を含む。ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子と共にＰＫＳに組み込まれる場合、組換えｅｐｏＤ遺伝子産物は、機能的ｅｐｏＫが存在するか否かに依存して、エポシロンＢおよびエポシロンＤのＣ−９誘導体の産生をもたらす。
【０１４１】
上記の置換のための例示的な置換ドメインとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ケトンを形成する、ラパマイシンＰＫＳモジュール３から不活性のＫＲドメイン、アルコールを形成する、ラパマイシンＰＫＳモジュール５からＫＲドメイン、ならびにアルケンを形成する、ラパマイシンＰＫＳモジュール４からＫＲドメインおよびＤＨドメイン。他のこのような不活性ＫＲ、活性ＫＲドメイン、ならびに活性ＫＲおよびＤＨドメインコード核酸は、例えば（限定ではなく）、ＤＥＢＳ、ナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ、およびＦＫ−５２０　ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得る。得られたＰＫＳの各々は、Ｃ−９位置に官能基を含むポリケチド化合物を生成し、これは、標準的な化学的方法によってインビトロでさらに誘導されて、本発明の半合成エポシロン誘導体を生じ得る。
【０１４２】
エポシロンＰＫＳの第７の伸長モジュールは、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳのこの第７の伸長モジュールは、ｅｐｏＥ遺伝子の遺伝子産物中に含まれ、これはまた、第８の伸長モジュールを含む。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第７の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は発現されてタンパク質を形成し、このタンパク質は、他のタンパク質と一緒に、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構成する。これらおよび関連する実施形態において、エポシロンＰＫＳまたはその誘導体の第７および第８の伸長モジュールは、代表的に、単一のタンパク質として発現され、そしてｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ遺伝子またはその誘導体と同時発現されて、ＰＫＳを構成する。別の実施形態において、第７の伸長モジュールコード配列の一部または全ては、他のＰＫＳコード配列と関連して利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；ＫＲを欠失すること；ＫＲを、異なる立体化学を特定するＫＲで置換すること；および／あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた異種の第７伸長モジュールコード配列は、必要に応じて他のコード配列と関連して利用されて、タンパク質を発現し、これは、他のタンパク質と共に、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構築する。あるいは、ｅｐｏＥ遺伝子における第７伸長モジュールについてのコード配列は、欠失され得るか、または異種モジュールについてのコード配列で置換され得、組換えｅｐｏＥ遺伝子誘導体を調製し、これは、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ遺伝子と一緒に発現されて、エポシロン誘導体についてのＰＫＳを作製し得る。
【０１４３】
本発明の例示的な組換えｅｐｏＥ遺伝子誘導体としては、エポシロンＰＫＳの第７伸長モジュールについてのＡＴドメインコード配列が、コードされるＡＴドメインが変化するように変更または置換され、これによってメチルマロニル特異的ＡＴがマロニル特異的ＡＴへと変化した誘導体が挙げられる。このようなマロニル特異的ＡＴドメインコード核酸は、例えば（そして限定ではなく）、ナルボノリドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、およびＦＫ−５２０　ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得る。他のエポシロンＰＫＳ遺伝子、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ、またはそれらの誘導体と共に同時発現される場合、Ｃ−６メチルの代わりにＣ−６水素を有する、エポシロン誘導体についてのＰＫＳが生成される。従って、この遺伝子が他の変更を含まない場合、生成される化合物は、６−デスメチルエポシロンである。
【０１４４】
エポシロンＰＫＳの第８の伸長モジュールとしては、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、不活性ＫＲおよびＤＨドメイン、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメイン、ならびにＡＣＰが挙げられる。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第８の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、他のタンパク質と同時発現され、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構成する。別の実施形態において、第８伸長モジュールコード配列の一部または全ては、他のＰＫＳコード配列と関連して利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；不活性ＫＲおよび／または不活性ＤＨを欠失すること；不活性ＫＲおよび／またはＤＨを、活性なＫＲおよび／またはＤＨで置換すること；ならびに／あるいはＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られる異種の第８伸長モジュールコード配列は、１つのタンパク質として発現され、これは他のタンパク質と関連して利用されて、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構成する。あるいは、ｅｐｏＥ遺伝子における第８伸長モジュールについてのコード配列は、欠失され得るか、または異種モジュールについてのコード配列で置換され得、組換えｅｐｏＥ遺伝子を調製し、これは、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ遺伝子と一緒に発現されて、エポシロン誘導体についてのＰＫＳを作製し得る。
【０１４５】
エポシロンＰＫＳの第８伸長モジュールはまた、エポシロン前駆体をメチル化する活性を有する、メチル化またはメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメインを含む。この機能は、本発明の組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体を生成するように欠失され得、この誘導体は、第８伸長モジュールのＡＴドメインが、エポシロン分子の対応するＣ−４位置でマロニル特異的ＡＴドメインに変化されているか否かに依存して、１つまたは両方のメチル基を欠失したエポシロン誘導体を作製する、他のエポシロンＰＫＳ遺伝子またはその誘導体と共に同時発現され得る。
【０１４６】
エポシロンＰＫＳの第９の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、ＫＲ、不活性ＤＨ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳのこの第９の伸長モジュールは、１つのタンパク質（このｅｐｏＦ遺伝子の産物）として発現され、これはまた、エポシロンＰＫＳのＴＥドメインを含む。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第９の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、１つのタンパク質として発現され、他のタンパク質と一緒に、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構築する。これらの実施形態において、第９の伸長モジュールは、代表的に、１つのタンパク質として発現され、これはまた、エポシロンＰＫＳまたは異種ＰＫＳのいずれかのＴＥドメインを含む。別の実施形態において、第９伸長モジュールコード配列の一部または全ては、他のＰＫＳコード配列と関連して利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；ＫＲを欠失すること；ＫＲを、異なる立体化学を特定するＫＲで置換すること；ならびに／あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。例えば、伸長モジュール９のＡＴドメインの、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインでの置換は、本発明の組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞中で２−メチル−エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを生成する組換えエポシロンＰＫＳを生じる。得られる異種の第９伸長モジュールコード配列は、他のタンパク質と共に同時発現されて、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構成する。あるいは、本発明は、エポシロンまたはエポシロン誘導体についてのＰＫＳを提供し、ここで、この第９伸長モジュールは、異種ＰＫＳ由来のモジュールで置換されるか、またはその全体が欠失されている。後者の実施形態において、ＴＥドメインは、別個のタンパク質として発現されるか、または第８の伸長モジュールと融合される。
【０１４７】
別の実施形態において、本発明は、異種のＰＫＳ遺伝子クラスター（同じ型の、未改変の天然に存在する宿主細胞には存在しないＰＫＳ遺伝子クラスター）、ならびにチオエステラーゼＩＩ型タンパク質（「ＴＥ　ＩＩ」）をコードする遺伝子を含む、本発明の宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、このＴＥ　ＩＩ遺伝子は、このＰＫＳ遺伝子クラスターに対して異種である−−このＴＥ　ＩＩ遺伝子は、ＰＫＳと同じ遺伝子クラスター由来ではない。１つの例として、本発明の組換え宿主細胞は、１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳまたはエポシロンＰＫＳ誘導体の発現をコードする遺伝子を含む。本発明のこの局面に従って、この宿主細胞は、エポシロンＰＫＳ遺伝子クラスター以外のＰＫＳ遺伝子クラスターから単離されたＴＥ　ＩＩ遺伝子を含むように改変される。例示的な実施形態としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子クラスター由来のＴＥ　ＩＩ遺伝子、およびＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍのｔｍｂＡ　ＰＫＳ遺伝子クラスター由来のＴＥ　ＩＩ遺伝子が挙げられる（これらのＰＫＳ遺伝子クラスターは、米国特許第６，０９０，６０１号；米国特許出願番号１４４，０８５（１９９８年８月３１日出願）；および米国特許仮出願番号６０／２７１，２４５（２００１年２月１５日出願）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）において記載される）。
【０１４８】
本発明の組換えエポシロン誘導体ＰＫＳ遺伝子の例示的な例（これらは、ハイブリッドモジュール（エポシロンＰＫＳと同じ特異性を有する他のモジュール）の変化した特異性を列挙することによって同定される）としては、以下が挙げられる：
（ａ）メチルマロニル得的ＡＴ（ｍｍＡＴ）およびＫＲを有するモジュール４ならびにマロニル特異的ＡＴ（ｍＡＴ）およびＫＲを有するモジュール２；
（ｂ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍｍＡＴを有するモジュール３；
（ｃ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍｍＡＴを有するモジュール５；
（ｄ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍｍＡＴおよびＤＨおよびＫＲのみを有するモジュール５；
（ｅ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍｍＡＴおよびＫＲのみを有するモジュール５；
（ｆ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍｍＡＴおよび不活性ＫＲのみを有するモジュール５；
（ｇ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍＡＴを有するモジュール６；
（ｈ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍＡＴおよびＤＨおよびＫＲのみを有するモジュール６；
（ｉ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍＡＴおよびＫＲのみを有するモジュール６；
（ｊ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍＡＴおよび不活性ＫＲのみを有するモジュール６；
（ｋ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍＡＴを有するモジュール７；
（ｌ）ハイブリッド（ｄ）〜（ｆ）、ｍＡＴを有するモジュール５を除く；
（ｍ）ハイブリッド（ｈ）〜（ｊ）、ｍｍＡＴを有するモジュール６を除く；ならびに
（ｎ）ハイブリッド（ａ）〜（ｍ）、ｍＡＴを有するモジュール４を除く。
上記の列挙は、例示のみであり、そして本発明を限定するように解釈されるべきではなく、これらは、示されるハイブリッドモジュール以外の２つのハイブリッドモジュールを有する他の組換えエポシロンＰＫＳ遺伝子および酵素だけでなく、３つ以上のハイブリッドモジュールを有する組換えエポシロンＰＫＳ遺伝子および酵素を含む。
【０１４９】
本発明の宿主細胞は、本発明の化合物を生成するための他の目的について当該分野で公知の条件下で、増殖および発酵され得る。本発明はまた、本発明の宿主細胞を発酵するための新規な方法を提供する。本発明の化合物は、これらの培養された細胞の発酵ブロスから単離され得、そして以下の実施例３に記載されるような方法によって精製され得る。
【０１５０】
本発明は、ポリケチドおよび他の生成物の生成のための、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株の発酵に関連する多くの方法を提供する。本発明より前では、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓの発酵は、ＴＡおよびサフラマイシン（ｓａｆｒａｍｙｃｉｎ）以外の任意のポリケチドについての生成の目的では行われておらず、このＴＡおよびサフラマイシンは、特定のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株によって天然で産生される。従って、１つの局面において、本発明は、有用な生理活性化合物（ポリケチド、非リボソームペプチド、エポシロン、リパーゼ、プロテアーゼ、他のタンパク質、脂質、糖脂質、ラムノ脂質（ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）、およびポリヒドロキシアルカノエートが挙げられるがこれらに限定されない）の発酵による産生のための産生宿主としての、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓの使用を可能にする。
【０１５１】
本発明によって提供される方法の１つは、細胞バンクを調製および貯蔵する方法、ならびにＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株を発酵培地に適応する方法である。これらの方法は重要である。なぜなら、本発明より前では、油ベースの発酵培地中での産生のために適応したＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株の凍結細胞バンクは作製されておらず、そして適応の非存在下では、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株は、特に油ベースの発酵培地において、頻繁に死滅するためである。
【０１５２】
本発明はまた、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓを増殖するための発酵方法、およびこの方法において有用な発酵培地を提供する。驚くべきことに、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓおよび他のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株は、炭水化物、グリセロール、アルコール、またはＴＣＡサイクル中間体を、炭素源として利用し得ない。本発明の前では、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの発酵は、タンパク質ベースの培地中で行われた。しかし、ＮＨ_４が、タンパク質ベースの培地中で増殖に有毒なレベルまで増加し、そして発酵を制限する。本発明に従うと、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株は、油および／または脂肪酸を炭素源として含む培地中で発酵される。
【０１５３】
この方法において有用な例示的な油および脂肪酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：オレイン酸メチル；ココナツ、ラード、アブラナ、ゴマ、ダイズ、およびヒマワリ由来の油；サラダ油；Ａｇｒｉｍｕｌ　ＣｏＳ２、Ｒ５Ｏ５、およびＲ５Ｏ３のような自己乳化油；グリセロールオレエート（グリセロールモノオレエートおよびグリセロールトリオレエートを含む）；奇数鎖エステル（例えば、メチルヘプタデカノエート、メチルノナデカノエート、およびメチルペラルゴネート）；エステル鎖（例えば、プロピルオレエートおよびエチルオレエート）；植物オレイン酸メチル；メチルステアレート；メチルリノレエート；オレイン酸；ならびにホスファチジルコリン（純粋であるかあるいはダイズまたは卵黄由来であるかにかかわらず）。従って、任意の植物または穀物由来の油（例えば、ヒマワリ油またはダイズ油）、任意の動物由来の油（例えば、ラード油）、飽和および不飽和の両方の、任意の鎖長の遊離脂肪酸およびエステル化された脂肪酸、天然および合成の脂肪酸混合物（例えば、それぞれ、ホスファチジルコリンまたはメチルペラルゴネート）、ならびに工業発酵油（例えば、Ｃｏｇｎｉｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ　Ａｇｒｉｍｕｌシリーズ）が、この方法において使用され得る。好ましい実施形態において、この発酵培地は、炭素源としてオレイン酸メチルを利用する。主に分散の容易さに起因して、一般に、室温で液体である油が、固体油よりも好ましい。この発酵培地の他の重要な成分としては、微量の金属（例えば、ＦｅおよびＣｕ）が挙げられ、この金属は、複合培地および規定培地、ならびにバッチプロセスおよび供給バッチプロセスにおける、増殖および産生を改善する。オレイン酸メチルおよび微量の金属を含む培地が、エポシロンの産生のために好ましい。
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明は、減少した量の動物由来の材料を含むかまたは動物由来の材料を含まない本発明の宿主細胞のための発酵培地を提供する。感染因子（例えば、ウイルスおよびプリオン）による夾雑物の可能性、ヒトまたは動物に投与される化合物の生成のための発酵プロセスにおける動物副産物の使用に起因して、減少した量の動物由来の材料を含むかまたは動物由来の材料を含まない発酵培地の使用が、好まれ得る。このような培地は、本発明の方法における使用のために提供される。発酵培地に含まれるオイルまたは脂肪酸は、非動物供給源（例えば、植物）由来で有り得る。例えば、脊椎動物由来のオレイン酸メチルを、商業的に得ることができる。さらに、動物由来の材料を、等価であるが非動物供給源由来の非同一材料と置換し得る。例えば、乳タンパク質であるカゼインの膵臓消化物のカジトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）が、非動物供給源（例えば、植物が挙げられるが、これに限定されない）由来のタンパク質の加水分解物（例えば、野菜由来のタンパク質加水分解物）と置換され得る。
【０１５５】
一般的に、フェッドバッチプロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐｒｏｃｅｓｓ）が、発酵に好ましい。給餌によって細胞は栄養分を効率的に使用する（例えば、細胞は、毒性有機酸を生成する代わりに炭素をＣＯ_２およびＨ_２Ｏに代謝する）。高い栄養分レベルは、二次代謝を抑制し得、そして発酵が阻害の閾値より下の速度で栄養分を給餌する場合、生成量はより高くなり得る。
【０１５６】
本発明の発酵方法はまた、これらの方法に有用なエポシロンおよび発酵培地の産生に特に関連する方法を含む。１つの例として、プロピオネートおよびアセテートが、エポシロンＤ：Ｃ（またはＢ：Ａ）比および得られるエポシロンの力価に影響を与えるために使用され得る。この効果は、好ましいオレイン酸メチル／微量金属の発酵培地において最小であるが、この効果は、他の培地（例えば、ＣＴＳ培地）において極めて有意に効果的であり得る。発酵培地中のアセテート量の増加は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ増殖およびエポシロン産生を増加し得る。アセテート単独は、エポシロンＣ（またはエポシロンＡ）力価を劇的に増加し、そしてエポシロンＤ（またはエポシロンＡ）力価を減少する。プロピオネート単独は、エポシロン力価を増加せず、そして高い濃度のプロピオネートは、力価を減少し得る。しかし、プロピオネートおよびアセテートの共同では、エポシロンＣ（またはエポシロンＡ）からエポシロンＤ（またはエポシロンＢ）へ産生を移動させ得る。エポシロンＤ産生のための１つの好ましい培地は、カジトン、１０ｍＭ　アセテート、および３０ｍＭ　プロピオネートを含む。奇数鎖の脂肪酸を含む培地は、エポシロンＣおよびエポシロンＤを産生するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ細胞の発酵においてエポシロンＣの産生を減少し得る。微量金属がまた、エポシロンＤ産生を増強し得、そして発酵培地中にアセテートが存在しかついずれのオイルも存在しない下でエポシロンＤ：Ｃ比を増加し得る。
【０１５７】
本発明はまた、発酵培地からエポシロンを精製するための方法およびエポシロンの結晶形態を調製するための方法を提供する。一般的に、この精製方法は、発酵の間のＸＡＤ樹脂上へのエポシロンの捕獲、この樹脂からの溶出、固相抽出、クロマトグラフィー、および結晶化を含む。この方法は、実施例３に詳細に記載される。そして、この方法は、エポシロンＤについて好ましく、かつ例示されるが、この方法は、一般的に結晶エポシロン（他の天然に存在するエポシロンおよび本発明の宿主細胞によって産生されるエポシロンアナログを含むがこれらに限定されない）を調製するために使用され得る。
【０１５８】
従って、別の実施形態において、本発明は、農業、獣医業務、および医薬において有用な、単離され、かつ精製された形態の新規エポシロン誘導体化合物を提供する。１つの実施形態において、この化合物は、殺菌剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、癌の化学療法において有用である。別の実施形態において、この化合物は、所望されない細胞増殖の予防（炎症、自己免疫疾患、および乾癬のような過剰増殖疾患の処置を含むが、これらに限定されない）、およびステント中の細胞増殖の予防のために有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、エポシロンＢまたはエポシロンＤと同様に腫瘍細胞に対して少なくとも強力であるエポシロン誘導体である。別の実施形態において、この化合物は、免疫抑制剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、別の化合物の製造において有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、ヒトまたは動物への投与のために混合物または溶液で処方される。
【０１５９】
本発明の新規エポシロンアナログならびに本発明の宿主細胞によって産生されるエポシロンは、以下に記載されるように誘導され、そして処方され得る：ＰＣＲ特許公開番号９３／１０１２１号、同第９７／１９０８６号、同第９８／０８８４９号、同第９８／２２４６１号、同第９８／２５９２９号、同第９９／０１１２４号、同第９９／０２５１４号、同第９９／０７６９２号、同第９９／２７８９０号、同第９９／３９６９４号、同第９９／４００４７号、同第９９／４２６０２号、同第９９／４３３２０号、同第９９／４３６５３号、同第９９／５４３１８号、同第９９／５４３１９号、同第９９／５４３３０号、同第９９／６５９１３号、同第９９／６７２５２号、同第９９／６７２５３号、および同第００／００４８５、ならびに米国特許第５，９６９，１４５号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【０１６０】
本発明の化合物としては、１４−メチルエポシロン誘導体（マロニルＣｏＡの代わりにメチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール３を利用することによって作製される）；８，９−デヒドロエポシロン誘導体（ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの代わりにＤＨおよびＫＲを有する本発明のハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；１０−メチルエポシロン誘導体（マロニルＣｏＡの代わりにメチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール５を利用することによって作製される）；９−ヒドロキシエポシロン誘導体（ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの代わりにＫＲを有する本発明のハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；８−デスメチル−１４−メチルエポシロン誘導体（マロニルＣｏＡの代わりにメチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール３およびメチルマロニルＣｏＡの代わりにマロニルＣｏＡに結合するハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；８−デスメチル−８，９−デヒドロエポシロン誘導体（ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの代わりにＤＨおよびＫＲを有し、かつメチルマロニルＣｏＡの代わりにマロニルＣｏＡを特定するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；ならびに９−オキソ−エポシロンＤが挙げられる。本発明の他の好ましい新規エポシロンとしては、実施例１１および以下に記載されるものが挙げられる。
【０１６１】
本発明の１つの局面において、以下の式の化合物：
【０１６２】
【化９】

が、提供され、ここで、：
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^１１およびＲ^１２は、各々独立して水素、メチルもしくはエチルであるか；
Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、またはオキソであるか；あるいは
Ｒ^５およびＲ^６は、一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７は、水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ^８およびＲ^１０は、共に水素であるか、または一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成し；
Ａｒは、アリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ^１３であり、ここで、Ｒ^１３は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族アリールもしくはＣ_１〜Ｃ_１０脂肪族アルキルアリールである。別の実施形態において、式Ｉの化合物が提供され、ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、ＡｒおよびＷは、以前に記載されたようなものである（ただし、Ｒ^１、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^９、およびＲ^１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６３】
別の実施形態において、式Ｉの化合物が提供され、ここで、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、およびＲ^１１は、各々独立して水素もしくはメチルであり；
Ｒ^４およびＲ^９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、もしくはオキソであり；
Ｒ^５およびＲ^６は、共に水素であるかもしくは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７およびＲ^１２は、共にメチルであり；
Ｒ^８およびＲ^１０は、共に水素であるかもしくは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ａｒは、ヘテロアリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ^１３であり、ここで、Ｒ^１３は、水素またはＣ_１〜Ｃ_５アルキルであり、ただし、Ｒ^１、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^９、およびＲ^１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない。
【０１６４】
本発明の別の局面において、式：
【０１６５】
【化１０】

の化合物が提供され、ここで：
Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、またはオキソであるか；
Ｒ^５、Ｒ^１１、Ｒ^１２は、各々独立して水素、メチルもしくはエチルであるか；あるいは
Ｒ^５およびＲ^６は、一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７は、水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ^８およびＲ^１０は、共に水素であるか、または一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成し；
Ａｒは、アリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ^１３であり、ここで、Ｒ^１３は、水素またはＣ_１〜Ｃ_５アルキルである。別の実施形態において、式ＩＩの化合物が提供され、ここで、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１２、Ｒ^１３、ＡｒおよびＷは、以前に記載されたようなものである（ただし、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、およびＲ^９のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６６】
別の実施形態において、式ＩＩの化合物が提供され、ここで：
Ｒ^４およびＲ^９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、またはオキソであり；
Ｒ^５およびＲ^６は、各々水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７およびＲ^１２は、共にメチルであり；
Ｒ^８およびＲ^１０は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ａｒは、２−メチル−１，３−チアゾリニル、２−メチル−１，３−オキサゾリニル、２−ヒドロキシメチル−１，３−チアゾリニル、または２−ヒドロキシメチル−１，３−オキサゾリニルであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＨである（ただし、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、およびＲ^９のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６７】
本発明の別の局面において、式：
【０１６８】
【化１１】

の化合物が提供され、ここで、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^１１、Ｒ^１２は、各々独立して水素、メチルまたはエチルであるか；
Ｒ^６は水素であるか；あるいは
Ｒ^５およびＲ^６は、一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７は、水素、メチルまたはエチルであり；
Ａｒは、アリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ^１３であり、ここで、Ｒ^１３は、水素またはＣ_１〜Ｃ_５アルキルである。別の実施形態において、式ＩＩＩの化合物が提供され、ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、ＡｒおよびＷは、以前に記載されたようなものである（ただし、Ｒ^１、Ｒ^５、Ｒ^６、およびＲ^１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６９】
別の実施形態において、式ＩＩＩの化合物が提供され、ここで、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^１１は、各々独立して水素、メチルまたはエチルであり；
Ｒ^５およびＲ^６は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７およびＲ^１２は、共にメチルであり；
Ａｒは、２−メチル−１，３−チアゾリニル、２−メチル−１，３−オキサゾリニル、２−ヒドロキシメチル−１，３−チアゾリニル、または２−ヒドロキシメチル−１，３−オキサゾリニルであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＨである（ただし、Ｒ^１、Ｒ^５、Ｒ^６、およびＲ^１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１７０】
本発明の別の局面において、式：
【０１７１】
【化１２】

の化合物が提供され、ここで：
Ｒ^４は、水素またはオキソであり；
Ｒ^５およびＲ^６は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ^７は、水素またはメチルであり；
Ｒ^９は、水素またはヒドロキシルであり；
Ｒ^８およびＲ^１０は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成し；
Ｗは、ＯまたはＮＨであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；そして、
Ｒ^１４は、メチルまたはヒドロキシメチルである。
【０１７２】
本発明の別の局面において、化合物は以下の式の化合物である：
【０１７３】
【化１３】

ここで：
Ｒ^４は、水素またはオキソであり；
Ｒ^５およびＲ^７は、各々独立して水素またはメチルであり；
Ｒ^６は、水素であるか；
Ｒ^８およびＲ^１０は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成するか；あるいは、
Ｒ^６およびＲ^８は、一緒になって二重結合を形成し；
Ｒ^９は、水素、ヒドロキシルまたはオキソであり；
Ｗは、ＯまたはＮＨであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；そして、
Ｒ^１４は、メチルまたはヒドロキシメチルである。
【０１７４】
本発明の別の局面において、以下：
【０１７５】
【化１４】

の化合物が提供される。
【０１７６】
本発明の化合物は、細胞傷害性薬剤であり、そして任意の適切な様式（抗癌剤を含むが、これに限定されない）で使用され得る。細胞傷害性またはチューブリン重合化（ｐｏｌｙｅｒｍｉｚａｔｉｏｎ）の程度を評価するための例示的なアッセイは、実施例１２に記載される。
【０１７７】
本発明の化合物は、多数の方法を用いて作製され得る。本発明の１つの局面において、これらの化合物は、エポシロンＰＫＳを発現する組み換え宿主細胞によって産生される。１つの実施形態において、式：
【０１７８】
【化１５】

の化合物（ここで、Ｒ^１〜Ｒ^１２は、式Ｉについて以前に記載されたようなものである）が、１つ以上のモジュールにおいてＡＴ特異性を変更することによって、および／または１つ以上のモジュールにおいて酵素学的ドメインを変更することによって作製される。実施例１１は、本方法を使用して作製され得る改変の型および特異的な化合物を記載する。
【０１７９】
本発明の別の実施形態において、式Ｖのオキサゾール対応物が、式Ｖの化合物を通常作製する宿主細胞の発酵条件を調節することによって作製され得る。式Ｖの化合物のチアゾール部分が、ＮＲＰＳにおけるシステイン結合に由来する。エポシロンＨ_１およびＨ_２（これは、エポシロンＣおよびエポシロンＤのオキサゾール対応物である）が、微量の宿主細胞によって作製され、そしてこれは、エポシロンＮＲＰＳにおけるシステインの代わりの、セリンの臨時的な結合から生じると考えられる。
【０１８０】
本方法は、エポシロンＰＫＳのＮＲＰＳ結合部位におけるセリンとシステインとの明確な競合を利用し、そしてエポシロンＮＲＰＳにおいてシステインの代わりに、セリンの結合を好む培養条件を使用する。セリンを補充した（例えば、基底レベルを超えて５０倍の増加）培地中で宿主細胞を増殖させることによって、通常産生されるチアゾール含有化合物の代わりに、ほとんどオキサゾール含有化合物の産生を生じることが見出された。従って、特定のエポシロン化合物または式Ｖの化合物を作製するように操作された組み換え宿主細胞は、セリンで補充された培地中で増殖され得、その結果、この細胞はここで、オキサゾール対応物である以下の式：
【０１８１】
【化１６】

の化合物の産生を好む。
【０１８２】
言い換えると、本方法は、２つの化合物（１つは、式Ｖに対応するものおよびその一部分について式ＶＩに対応するその対応物）を獲得する単純かつ洗練された方法である。オキサゾール含有化合物を作製するためのセリン補充方法は、実施例１３により詳細に記載される。この実施例は、エポシロンＨ_２およびエポシロンＨ_１（それぞれ、エポシロンＤおよびエポシロンＣのオキサゾール対応物）の産物を好むように、Ｋ１１１−４０−１株によって通常産生されるエポシロンＤおよびエポシロンＣのレベルを減少するために使用された条件を記載する。本発明の式Ｖの他の化合物を作製する他の組み換え構築物が、式ＶＩの化合物を作製するための条件と類似の条件を使用して増殖され得る。
【０１８３】
本発明の別の局面において、化合物は、化学生合成（ｃｈｅｍｏｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と称される方法を用いて産生される。この方法は、ＰＫＳが合成前駆体を指定された部位において受容し、そして結合するような様式で変更されたエポシロンＰＫＳを使用する。次いで、この合成前駆体は、このポイントから前へと通常の様式でＰＫＳによって進行される。
【０１８４】
化学生合成に必要な変更の型の例示的な実施例は、実施例９に記載され、この実施例９は、エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣ、およびエポシロンＤを主要産物として通常産生するＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株のＫＳ２ノックアウト型の構築を記載する。ＫＳ２ノックアウトは、伸長モジュール２のＫＳドメインの不活性化といわれ、その結果、生じるＰＫＳは、以前のモジュール、ローディングドメインおよびＮＲＰＳの生成物（これは、伸長モジュール１を考慮に入れる）をロードできず、そして進行できない。従って、ＰＫＳ指向された合成は、伸長モジュール２のＡＣＰにおいて失速し、エポシロン産物は、合成前駆体の非存在下においてそのような株によって作製されない。しかし、この株に合成前駆体が提供される場合、これは、ローディングドメインおよび伸長モジュール１の産生を模倣し、その結果、伸長モジュール２のＡＣＰは、前駆体に結合し、そしてＰＫＳが、この前駆体をこのポイントから前へと進行させる。例えば、実施例９のノックアウト株を合成前駆体：
【０１８５】
【化１７】

と共に提供すると、実施例１０により詳細に記載されるように、エポシロンＢおよびエポシロンＤの産生を引起す（エポシロンＡおよびエポシロンＢがまた、産生されるが微量である）。図１をまた参照のこと。別の例において、実施例９のノックアウト株を合成前駆体、例えば、：
【０１８６】
【化１８】

（ここで、Ｒは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５ヒドロキシアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５アルコキシ、およびＣ_１〜Ｃ_５アミノアルキル、より好ましくは、水素またはメチルである）と共に提供する場合、以下のエポシロン化合物：
【０１８７】
【化１９】

ならびに、これらそれぞれの、１２，１３−エポキシド対応物を生じる。
【０１８８】
従って、合成先駆体を変更することによって、単一ＫＳ２ノックアウト株は、広範な種々の化合物を作製するために使用され得る。実際、実施例９に記載される株は、式：
【０１８９】
【化２０】

（ここで、Ａｒは、アリールであり、そしてＲ^７は、水素またはメチルである）の化合物を作製するために、式：
【０１９０】
【化２１】

（適切なＡｒ基の例示的な例としては、以下：
【０１９１】
【化２２】

（ここで、Ｒは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５ヒドロキシアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５アルコキシ、およびＣ_１〜Ｃ_５アミノアルキルである）が挙げられるが、これらに限定されない）の合成前駆体をこれに提供することによって、使用され得る。より好ましい実施形態において、Ｒは、水素またはメチルである。実施例１０は、種々の前駆体の合成ならびに化学生合成におけるそれらの使用およびそれぞれの１２，１３−エポキシド対応物を記載する。
【０１９２】
別の実施形態において、ローディングドメインノックアウトは、本発明の特定の化合物を作製するために使用される。例えば、実施例９に使用された開始物質のローディングドメインノックアウトはまた、式
【０１９３】
【化２３】

の合成前駆体を提供することによって式ＶＩＩおよびＶＩＩＩの化合物を作製するために使用され得る。
【０１９４】
他の実施形態において、本発明の他の株のＫＳ２またはローディングドメインノックアウトは、実施例１１に記載されるこれらの株を含むように作製されるが、それに限定されず、そして２−メチルチアゾール以外のアリール部分を有する化合物を作製するために使用される。例えば、優先的に９−オキソ−エポシロンＤ（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｄ）を作製する構築物のＫＳ２ノックアウトへ式ＩＸの合成前駆体を供給することは、式
【０１９５】
【化２４】

（ここで、Ａｒがアリールである）の化合物を生じる。
【０１９６】
本発明の別の局面において、エポシロンＰＫＳを発現する宿主細胞から作製される化合物は、さらに生物学的および／または合成的方法を使用して修飾され得る。１つの実施形態において、式Ｉの化合物（ここで、Ａｒが、
【０１９７】
【化２５】

である）は、微生物的に誘導されるヒドロキシラーゼを使用してＣ−２１炭素でヒドロキシル化され得る。このような形質転換を実施するためのプロトコールは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３９２７６（本明細書中にその全体が参考として援用される）、および本明細書中の実施例１４に記載される。
【０１９８】
別の実施形態において、エポシロンＡ〜ＤのＣ−１２およびＣ−１３に対応する位置で炭素−炭素二重結合を有する本発明の化合物は、ＥｐｏＫまたは別のＰ４５０エポキシダーゼを使用してエポキシド化され得る。エポキシド化のためにＥｐｏＫを使用する一般的な方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３１２４７（本明細書中にその全体が参考として援用される）の実施例５および本明細書中の実施例１５に記載される。あるいは、エポキシド化反応は、炭素−１２および炭素−１３との間の結合に対応する位置で二重結合を含むエポシロン化合物を機能的なＥｐｏＫを発現する細胞培養物と接触させることによって起こり得る。このような細胞としては、ミクソバクテリウム（ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍが挙げられる。特に好ましい実施形態において、このＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、ＥｐｏＫを発現するが、機能的エポシロンポリケチドシンターゼ（「ＰＫＳ」）遺伝子を含まない。このような株は、変異誘発によって作製され得、ここで、エポシロンＰＫＳ遺伝子における１つ以上の変異は、それを無効にする。このような変異は、天然に起こり得る（スクリーニングによって見出され得る）か、または突然変異原（例えば、化学薬品）または照射（ｉｒｒａｄａｔｉｏｎ）いずれかを使用してか、もしくは遺伝子操作によって指向され得る。無効なエポシロンＰＫＳを有する株を作製するための特に有効なストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／３１２４７に記載されるような相同組換えである。
【０１９９】
別の実施形態において、エポキシ化反応は、合成方法を使用して起こり得る。例えば、スキーム２に示されるように、本発明のデソキシ（ｄｅｓｏｘｙ）化合物は、デソキシ化合物をジメチルジオキシランと反応させることによってエポキシ相対物へ変換され得る。
【０２００】
【化２６】

実施例１６は、より詳細にこの合成方法を記載する。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明のマクロラクトンは、本発明のマクロラクタムに変換され得る。スキーム３に例示されるように、本発明のデソキシマクロラクトンは、スキーム２に前記されるようにジメチルジオキシランを使用してエポキシド化されて、オキシ相対物（ｏｘｙｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）を提供する。
【０２０２】
【化２７】

オキシ−マクロラクトンは、アジドナトリウムおよびテトラキス（ｔｅｔｒａｋｉｓ）（トリフェニルフォスリン）パラジウムで処理されて、開環してアジド酸を形成する。次いで、このアジドはトリメチルフォスフィンで還元されて、アミノカルボキシ酸を形成する。
【０２０３】
本発明のエポキシ化合物（ここで、ＷがＮＨである）は、アミノカルボキシ酸のマクロラクタム化から作製され得る。
【０２０４】
【化２８】

スキーム４に示されるように、アミノカルボキシ酸は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾールで処理されて、エポキシマクロラクタムを形成する。このデソキシ−マクロラクタムは、六塩化タングステンおよびブチルリチウムでエポキシ−マクロラクタムを処理することによって作製され得る。
【０２０５】
本発明のエポキシ化合物（ここで、ＷはＮＲ^１３であり、そしてＲ^１３は水素ではない）は、マクロラクタム化の前にアミノカルボキシ酸をアルデヒドおよびシアノホウ化水素ナトリウムで処理することによって作製され得る。
【０２０６】
【化２９】

スキーム５に示されるように、アミノカルボキシ酸は、アルデヒド、Ｒ^１３ＨＯ、およびシアノホウ化水素ナトリウムで処理されて、次いでスキーム４に前記されるようにマクロラクタム化されて、必要に応じて脱酸素される置換アミノ酸を形成して、エポキシおよびデソキシマクロラクタム（ここで、Ｒ^１３は水素ではない）を提供する。
【０２０７】
本発明のマクロラクタムを作製するための合成方法はまた、実施例１７〜１９によってより詳細に記載される。実施例１７は、例示的な開始物質として９−オキソ−エポシロンＤを使用するアミノ酸の形成を記載する。実施例１８および１９は、それぞれ９−オキソ−エポシロンＤのエポキシおよびデソキシマクロラクタムバージョンの形成を記載する。実施例２０および２１は、それぞれ９−オキソ−エポシロンＤのエポキシ置換およびデソキシ置換のマクロラクタムバージョンの形成を記載する。
【０２０８】
本発明の組成物は、一般的に本発明の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本発明の化合物は、遊離形式であり得るか、または薬学的に受容可能な誘導体（例えば、プロドラッグ、および本発明の化合物の塩およびエステル）として適切なものであり得る。
【０２０９】
この組成物は、任意の適切な形態（例えば、固体、半固体、または液体の形態）であり得る。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、第５版、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９１）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般的に、薬学的調製物は、外用、経腸、または非経口用途に適切な有機または無機キャリア賦形剤と混合して、活性成分として１つ以上の本発明の化合物を含む。この活性成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、ペッサリー、溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用に適切な任意の他の形態のために有用な非毒性、薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得る。使用され得るキャリアとしては、水、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、スターチペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、および調製物製造での使用に適切な他のキャリア（固体、半固体、液体形態で）が挙げられる。さらに、補助的な、安定化剤、増粘剤、および着色剤ならびに香料が使用され得る。
【０２１０】
１つの実施形態において、本発明の化合物を含む組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を含まない。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）（ＢＡＳＦ　Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）は、ポリエトキシル化ヒマシ油であり、これは、代表的に、溶解度の低い薬物を処方する際の界面活性剤として使用される。しかし、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）は、被験体においてアレルギー反応の原因となり得るので、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を最小にするかまたは排除する組成物が、好ましい。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を排除するエポシロンＡまたはＢの処方物は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３９６９４（本明細書中に参考として援用される）に記載され、本発明の化合物を用いる使用に適用され得る。
【０２１１】
適用可能な場合、本発明の化合物は、マイクロカプセルおよびナノパーティクルとして処方され得る。一般的なプロトコールは、たとえば、Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｘ　Ｄｏｎｂｒｏｗ編、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ（１９９２）ならびに米国特許第５，５１０，１１８号；同第５，５３４，２７０号；および同第５，６６２，８８３号（全て本明細書中に参考として援用される）に記載される。体積に対する表面積の比を増加することによって、これらの処方物は、表面積の比を増加しなければ、経口送達に従わない化合物の経口送達を可能にする。
【０２１２】
本発明の化合物はまた、溶解度の低い薬物に対して以前使用されていた他の方法を使用して処方され得る。例えば、この化合物は、ＷＯ９８／３０２０５および００／７１１６３（本明細書中に参考として援用される）に記載されるようなビタミンＥまたはそれらのＰＥＧ化誘導体を有するエマルジョンを形成し得る。代表的に、本発明の化合物は、エタノールを含む水溶液（好ましくは１％ｗ／ｖ未満）に溶解される。ビタミンＥまたはＰＥＧ化ビタミンＥが添加される。次いでエタノールは、除去されて、静脈内投与または経口経路投与のために処方され得るプレ−エマルジョンを形成する。別のストラテジーは、リポソーム中に本発明の化合物をカプセル化する工程を含む。薬物送達ビヒクルとしてリポソームを形成する方法は、当該分野で周知である。適切なプロトコールとしては、米国特許第５，６８３，７１５号；同第５，４１５，８６９号、および同第５，４２４，０７３号（相対的に溶解度の低い別の癌薬物タキソールに関する参考として本明細書中に援用される）ならびにＰＣＴ公開ＷＯ０１／１０４１２（エポシロンＢに関する参考として本明細書中に援用される）に記載されるプロトコールが挙げられる。使用され得る種々の脂質のうち、エポシロンカプセル化リポソームを作製するために特に好ましい脂質としては、ホスファチジルコリンおよびポリエチレングリコール誘導ジステアリルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。実施例２２は、９−オキソ−エポシロンＤを含むリポソームを作製するための例示的なプロトコール（本発明の他の化合物を含むリポソームを作製するために容易に適合され得る一般的な方法）を提供する。
【０２１３】
さらに別の方法は、ポリマー（バイオポリマーまたは生体適合性（合成または天然に存在する）ポリマーなど）を使用して本発明の化合物を処方する工程を包含する。生体適合性ポリマーは、生分解性および非生分解性として類別され得る。生分解性ポリマーは、インビボで化学的組成物の機能、製造方法、および移植片構造として分解する。合成ポリマーの例示的な例としては、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ酢酸、ポリグリコール酸およびそれらのポリマー）、ポリエステルポリアミドポリオルトエステルおよびいくつかのポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）が挙げられる。天然に存在するポリマーの例示的な例としては、タンパク質ならびに多糖類（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルブミン、およびゼラチン）が挙げられる。
【０２１４】
別の方法は、水溶性を高めるポリマーに本発明の化合物を結合体化する工程を包含する。適切なポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリ−（ｄ−グルタミン酸）、ポリ−（ｌ−グルタミン酸）、ポリ−（ｌ−グルタミン酸）、ポリ−（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ−（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ−（ｌ−アスパラギン酸）およびそれらのコポリマーが挙げられる。約５，０００と約１００，０００との間の分子量を有するポリグルタミン酸が、好ましく、約２０，０００と約８０，０００との間の分子量がより好ましく、そして約３０，０００と約６０，０００との間の分子量が最も好ましい。このポリマーは、米国特許第５，９７７，１６３号（本明細書中に参考として援用される）および実施例２３に本質的に記載されるプロトコールを使用してエステル結合を介して本発明のエポシロンの１つ以上のヒドロキシルに結合体化される。本発明の２１−ヒドロキシ誘導体の場合、好ましい結合体部位は、ヒドロキシルのとれた（ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｏｆｆ）炭素２１を含む。他の結合体部位は、ヒドロキシルのとれた炭素３およびヒドロキシルのとれた炭素７を含む。
【０２１５】
別の方法において、本発明の化合物は、モノクローナル抗体に結合体化される。このストラテジーは、特異的標的への本発明の化合物の標的化を可能にする。結合体化抗体の設計および使用のための一般的プロトコールは、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ編（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０２１６】
単一の投与量形態を作製するようにキャリア物質と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される被験体および投与の特定のモードに依存して変化する。例えば、静脈内使用のための処方は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲、そしてより好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬの本発明の化合物の量を含む。静脈内処方物は、使用の前に、代表的に約２倍と約３０倍との間で通常の生理食塩水または５％デキストロース溶液を用いて希釈される。
【０２１７】
本発明の１つの局面において、本発明の化合物は、癌を処置するために使用される。１つの実施形態において、本発明の化合物は、頭部および頚部の癌（頭部、頚部、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭部、喉頭、下咽頭、唾液腺、および傍神経節腫の腫瘍を含む）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、肝臓および胆道の癌（特に肝細胞癌）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、腸癌（特に結腸直腸癌）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、卵巣癌を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、小細胞および非小細胞肺癌を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、乳癌を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、肉腫（線維肉腫、悪性線維性組織球腫、胎児性横紋筋肉腫、平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｓｏｓａｒｃｏｍａ）、神経線維肉腫、骨肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、および胞状軟部肉腫を含む）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、中枢神経系の新生物（特に、脳癌）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、リンパ血漿細胞様リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、被膜細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｍａ）Ｂ−直系大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、およびＴ細胞未分化大細胞リンパ腫を含む）を処置するために使用される。
【０２１８】
この方法は、治療的に有効な量の本発明の化合物を癌に罹患する被験体に投与する工程を包含する。この方法は、癌を抑える（すなわち、さらなる増殖を予防する）ためか、または癌を除去するためのいずれかに必要な場合、繰り返され得る。臨床的に、この方法の実施は、癌性増殖のサイズもしくは数の減少、および／または関連症状（ここで適切な）の減少を生じる。病理学的に、この方法の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる、以下：癌細胞増殖の阻害、癌または腫瘍のサイズの減少、さらなる転移の予防、および腫瘍新脈管形成の阻害。
【０２１９】
本発明の化合物および組成物は、組合せ治療に使用され得る。いいかえれば、本発明の化合物および組成物は、１つ以上の他の所望される治療手順もしくは医学手段と同時に、前に、または後に投与され得る。組合せレジメンにおける治療および手順の特定の組合せは、この治療および／または手順の適合性ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れる。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明の化合物および組成物は、別の抗癌剤または手順と組み合わせて使用される。他の抗癌剤の例示的な例としては、（ｉ）アルキル化薬物（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド）；（ｉｉ）代謝拮抗物質薬（例えば、メトトレキサート）；（ｉｉｉ）微小管安定化剤（例えば、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、およびジスコデルモライド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ））；（ｉｖ）新脈管形成インヒビター；（ｖ）ならびに細胞障害性抗生物質（例えば、ドキソルビコン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｏｎ）（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、およびマイトマイシン）が挙げられるが、それらに限定されない。他の抗癌手順の例示的な例としては、（ｉ）手術；（ｉｉ）放射線治療；および（ｉｉｉ）光力学治療が挙げられる。
【０２２１】
別の実施形態において、本発明の化合物および組成物は、本発明の化合物または組成物由来の潜在的な副作用（例えば、下痢、悪心および嘔吐）を緩和する薬剤または手順と組み合わせて使用される。下痢は、抗下痢剤（例えば、オピオイド（例えば、コデイン、ジフェノキシラート、ジフェノキシン、およびロエラミド（ｌｏｅｒａｍｉｄｅ））、次サリチル酸ビスマス、ならびにオクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ））で処置され得る。悪心および嘔吐は、制吐作用剤（例えば、デキサメタゾン、メトクロプラミド、ジフェニルヒドラミン（ｄｉｐｈｅｎｙｈｙｄｒａｍｉｎｅ）、ロラゼパム、オンダンセトロン、プロクロルペラジン、チエチルペラジン、およびドロナビノール）で処置され得る。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）などのポリエトキシル化ヒマシ油を含むこれらの組成物について、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロン）ならびに／またはＨ_１アンタゴニスト（例えば、ジフェニルヒドラミンＨＣｌ）ならびに／またはＨ_２アンタゴニストでの前処置が、アナフィラキシーを緩和するために使用され得る。静脈用途のための例示的な処方および前処置レジメンは、それぞれ実施例２４および２５に記載される。
【０２２２】
本発明の別の局面において、本発明の化合物は、細胞性過剰増殖によって特徴付けられる非癌障害を処置するために使用される。１つの実施形態において、本発明の化合物は、乾癬（皮膚に蓄積して上昇した鱗片の病巣を形成するケラチノサイトの細胞性過剰増殖によって特徴付けられる状態）を処置するために使用される。この方法は、治療的に有効な量の本発明の化合物を乾癬に罹患している被験体に投与する工程を包含する。この方法は、病巣の数または重篤度を減少するためか、または病巣を除去するためのいずれかに必要な場合、繰り返され得る。臨床的に、この方法の実施は、皮膚病巣のサイズもしくは数の減少、皮膚の症状（冒された皮膚の疼痛、灼熱および出血）の減少および／または関連症状（例えば、関節赤熱状態、熱、腫脹、下痢、腹痛）の減少を生じる。病理学的に、この方法の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる、以下：ケラチノサイト増殖の阻害、皮膚炎症の減少（例えば、誘引因子および成長因子、抗原提示、反応性酸素種の生成ならびにマトリクスメタロプロテイナーゼに影響を与えることによって）、ならびに皮膚の新脈管形成の阻害。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明の化合物は、多発性硬化症（脳における進行性髄鞘脱落によって特徴付けられる状態）を処置するために使用される。ミエリンの損失に関する正確な機構は、理解されていないが、星状細胞増殖の増加およびミエリン破壊領域の累積が存在する。これらの部位では、マクロファージ様活性およびミエリン鞘の破壊に少なくとも部分的に起因する増加したプロテアーゼ活性が存在する。この方法は、治療的に有効な量の本発明の化合物を多発性硬化症に罹患している被験体に投与する工程を包含する。この方法は、星状細胞増殖を阻害するためか、および／または運動機能の損失の重篤度を少なくするおよび／または疾患の慢性進行を予防もしくは減衰するのに必要な場合、繰り返され得る。臨床的に、この方法の実施は、視覚症状（視覚損失、複視）、歩行障害（虚弱、軸不安定性、感覚の喪失、痙性、反射亢進、機敏さの損失）、上肢機能障害（虚弱、痙性、感覚の喪失）、膀胱機能不全（尿意促迫、失禁、躊躇、不完全な空）、低下、情緒不安定性、および認識障害における改善を生じる。病理学的に、この方法の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる、以下：例えば、ミエリン損失、血管脳関門の破壊、単核細胞の脈管周囲浸潤、免疫学的異常、神経膠瘢痕（ｇｌｉｏｔｉｃ　ｓｃａｒ）形成および星状細胞増殖、メタロプロテイナーゼ生成、ならびに減損電導速度。
【０２２４】
別の実施形態において、本発明の化合物は、慢性関節リウマチ（作用関節の破壊および強直（ａｎｋｙｉｏｓｉｓ）をしばしばもたらす慢性多系統（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｙｓｔｅｍ　ｃｈｒｏｎｉｃ）、再発性の炎症性疾患）を処置するために使用される。慢性関節リウマチは、関節間隙に伸長する絨毛突出、滑膜細胞整列（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ　ｌｉｎｉｎｇ）の多層化（ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｉｎｇ）（滑膜細胞増殖）、白血球（マクロファージ、リンパ球、形質細胞、およびリンパ小節；「炎症性滑膜炎」と呼ばれる）の滑膜の浸潤、ならびに滑膜内の細胞性壊死によるフィブリンの堆積を形成する滑膜のマークされた肥厚によって特徴付けられる。このプロセスの結果形成される組織は、パンヌスと呼ばれ、そして最終的には、このパンヌスは関節空隙を満たすように増殖する。このパンヌスは、滑膜の進化に必須の新脈管形成のプロセスを通して新しい血管の広いネットワークを発達させる。消化酵素（マトリクスメタロプロテイナーゼ（例えば、コラーゲナーゼ、ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ））およびパンヌス組織の細胞由来の炎症性プロセスの他の媒介物質（例えば、過酸化水素、スーパーオキシド、リソソーム酵素、およびアラキドン酸（ａｒａｃｈａｄｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）代謝の産物））の放出は、軟骨組織の進行性の破壊を導く。このパンヌスは、軟骨組織の侵食およびフラグメント化を導く関節軟骨を浸潤する。結局、関連する関節の線維性強直および最終的には骨性強直と共に肋軟骨下の骨組織の侵食が存在する。
【０２２５】
この方法は、治療的有効量の本発明の化合物を、リウマチ様動脈炎に罹患している被験体に投与する工程を包含する。この方法は、滑膜細胞増殖の阻害、および／または罹患した関節の運動の損失の重篤度の減少、および／またはこの疾患の慢性的進行の予防もしくは軽減を達成するまで、必要に応じて繰り返され得る。臨床的に、本発明の実施は、以下のうちの１つ以上を生じる：（ｉ）症状（疼痛、腫脹および罹患した関節の圧痛、衰弱、疲労、食欲不振、体重減少）の重篤度の減少；（ｉｉ）この疾患の臨床的徴候（関節包の肥厚、滑膜肥厚、関節滲出液、軟組織拘縮、運動範囲の減少、強直および関節突起間関節変形）の重篤度の減少；（ｉｉｉ）この疾患の関節外発現（リウマチ性結節、脈管炎、肺結節、間隙性線維症、心膜炎、上強膜炎、虹彩炎、フェルティ症候群、骨粗鬆症）の減少；（ｉｖ）疾患寛解／無症状期間の頻度および持続時間の増加；（ｖ）固定欠陥および障害の予防；および／または（ｖｉ）疾患の慢性的進行の予防／減少。病理学的に、本発明の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる（ｉ）炎症応答の減少；（ｉｉ）炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＴＮＦａ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ）の活性の破壊；（ｉｉｉ）滑膜増殖の阻害；（ｉｖ）マトリクスメタロプロテイナーゼ活性の阻害、および／または（ｖ）新脈管形成の阻害。
【０２２６】
別の実施形態において、本発明の化合物は、アテローム性動脈硬化症および／または再狭窄を処置するため、特に、妨害物が血管内ステントで処置され得る患者において使用される。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の正常な血管平滑筋細胞（「ＶＳＭＣ」）（これは、通常は血流を調節する血管緊張を制御する）のいくらかが、それらの性質を変え、そして「癌様」挙動を発生している慢性血管障害である。このＶＳＭＣは、異常に増殖性になり、このＶＳＭＣに侵入して内側の血管内層に拡散し得る物質（増殖因子、組織分解酵素および他のタンパク質）を分泌し、血流をブロックし、そしてこの血管を異常に、局所的な血液凝固によって完全にブロックされやすくする。再狭窄（矯正手順後の狭窄または動脈狭窄の再発）は、アテローム性動脈硬化症の促進された形態である。
【０２２７】
この方法は、治療的有効量の本発明の化合物を、ステント上にコーティングする工程、およびこのステントを、アテローム性動脈硬化症に罹患している被験体の患部動脈に送達する工程を包含する。ステントを化合物でコーティングするための方法は、例えば、米国特許第６，１５６，３７３号および同第６，１２０，８４７号により記載される。臨床的に、本発明の実施は、以下のうちの１つ以上を生じる：（ｉ）動脈血流の増加；（ｉｉ）この疾患の臨床的徴候の重篤度の減少；（ｉｉｉ）再狭窄の速度の減少；（ｉｖ）アテローム性動脈硬化症の慢性的進行の予防／減少。病理学的に、本発明の実施は、ステント移植部位において以下のうちの少なくとも１つを生じる：（ｉ）炎症応答の減少；（ｉｉ）マトリクスメタロプロテイナーゼのＶＳＭＣ脱分泌の阻害；（ｉｉｉ）平滑筋細胞蓄積の阻害；および（ｉｖ）ＶＳＭＣ表現型分化の阻害。
【０２２８】
一実施形態において、癌および細胞増殖によって特徴付けられる非癌障害に罹患した被験体に投与される投薬量レベルは、約１ｍｇ／ｍ^２〜約２００ｍｇ／ｍ^２のオーダーであり、これはボーラスとして投与され得る（投与の任意の適切な経路において）か、または連続注入（例えば、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間または７２時間）として、１週間毎、２週間毎、または３週間毎に必要に応じて投与される。しかし、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、様々な因子に依存することが理解される。これらの因子としては、用いられる特定の化合物の活性；この被験体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌；投与の時間および経路、および薬物の排泄速度；薬物の組み合わせがこの処置において用いられるか否か；ならびに処置される状態の重篤度が挙げられる。
【０２２９】
別の実施形態において、投薬量レベルは、３週間毎に１回、必要に応じてかつ許容されるように、約１０ｍｇ／ｍ^２〜約１５０ｍｇ／ｍ^２、好ましくは約１０ｍｇ／ｍ^２〜約７５ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは約１５ｍｇ／ｍ^２〜約５０ｍｇ／ｍ^２である。別の実施形態において、投薬量レベルは、２週間毎に１回、必要に応じてかつ許容されるように、約１ｍｇ／ｍ^２〜約１５０ｍｇ／ｍ^２、好ましくは約１０ｍｇ／ｍ^２〜約７５ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは約２５ｍｇ／ｍ^２〜約５０ｍｇ／ｍ^２である。別の実施形態において、投薬量レベルは、１週間毎に一回、必要に応じてかつ許容されるように、約１ｍｇ／ｍ^２〜約１００ｍｇ／ｍ^２、好ましくは約５ｍｇ／ｍ^２〜約５０ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍ^２〜約２５ｍｇ／ｍ^２である。別の実施形態において、投薬量レベルは、一日に一回、必要に応じておよび許容されるように、約０．１ｍｇ／ｍ^２〜約２５ｍｇ／ｍ^２、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍ^２〜約１５ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは約１ｍｇ／ｍ^２〜約１０ｍｇ／ｍ^２である。
【０２３０】
本発明の詳細な説明は上記に示されてきたが、以下の実施例は、本発明の例示の目的のために提供され、そして本発明の範囲および特許請求の範囲の制限であると解釈されるべきではない。
【０２３１】
（実施例１）
（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ発現ベクターの構築）
ファージＭｘ８の組込み機能および結合機能を提供するＤＮＡを、市販のｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入した。Ｓａｌｍｉら、Ｆｅｂ．１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０（３）：６１４−６１２に記載される、ｐＰＬＨ３４３由来の約２３６０ｂｐのＭｆｅＩ−ＳｍａＩを単離し、そしてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の大きなＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩ制限フラグメントに連結した。このように形成した環状ＤＮＡのサイズは、約６ｋｂであり、ｐＫＯＳ３５−７７と命名した。
【０２３２】
プラスミドｐＫＯＳ３５−７７は、エポシロンＰＫＳ遺伝子プロモーターの制御下で、本発明の組換えＰＫＳ遺伝子を発現するための従来のプラスミドとして働く。１つの例示的な実施形態において、エポシロンＰＫＳ遺伝子（その相同なプロモーターを有する）全体は、１つ以上のフラグメントにおいて、プラスミドに挿入され、本発明の発現ベクターを生成する。
【０２３３】
本発明はまた、本発明の組換えＰＫＳ遺伝子が、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓプロモーターの制御下にある発現ベクターを提供する。例示的なベクターを構築するために、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓのｐｉｌＡ遺伝子のプロモーターを、ＰＣＲ増幅産物として単離した。プラスミドｐＳＷＵ５３７（これは、ｐｉｌＡ遺伝子プロモーターを含み、そしてＷｕおよびＫａｉｓｅｒ，Ｄｅｃ．１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７９（２４）：７７４８−７７５８に記載される）を、以下のＰＣＲプライマーＳｅｑ１およびＭｘｐｉｌ１プライマー：
Ｓｅｑ１：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’；および
Ｍｘｐｉｌ１：５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＧＣＡＡＣＧＧＧＧＧＧＣ−３’、
と混合し、そして標準的なＰＣＲ条件を使用して増幅し、約８００ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントを、制限酵素ＫｐｎＩを使用して切断し、そして市販のプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の大きなＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントに連結した。得られた環状ＤＮＡは、設計されたプラスミドｐＫＯＳ３５−７１Ｂであった。
【０２３４】
プラスミドｐＫＯＳ３５−７１Ｂ由来のｐｉｌＡ遺伝子のプロモーターを、約８００ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳｎａＢＩ制限フラグメントとして単離し、そしてプラスミドｐＫＯＳ３５−７７の大きなＭｓｃＩ制限フラグメントと連結して、サイズが約６．８ｋｂの環状ＤＮＡを得た。約８００ｂｐのフラグメントは、２つの配向のいずれか一方に挿入され得たため、このライゲーションにより同じサイズの２つのプラスミドが生成し、これらをそれぞれ、プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびプラスミドｐＫＯＳ３５−８２．２と命名した。これらのプラスミドの制限部位および機能マップを、図２に示す。
【０２３５】
プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびｐＫＯＳ３５−８２．２は、組換えＰＫＳ遺伝子がＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　ｐｉｌＡ遺伝子プロモーターの制御下にある本発明のベクターの簡便な出発物質として働く。これらのプラスミドは、プロモーターの転写開始部位のすぐ下流に配置した単一のＰａｃＩ制限酵素認識配列を含む。１つの例示的な実施形態において、エポシロンＰＫＳ遺伝子（その相同なプロモーターを有さない）全体は、１つ以上のフラグメントにおいて、ＰａｃＩ部位にあるプラスミドに挿入されて、本発明の発現ベクターを生成する。
【０２３６】
これらのプラスミドにおけるｐｉｌＡプロモーターの配列を以下に示す：
【０２３７】
【化３０】

本発明の組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞を作製するために、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ細胞を、ＣＹＥ培地（ＣａｍｐｏｓおよびＺｕｓｍａｎ、１９７５，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　３’：５’−Ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ，ＡＤＰ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７２：５１８−５２２）中、３０℃、３００ｒｐｍで１００のＫｌｅｔｔまで増殖する。残りのプロトコールは、他に示されない限り、２５℃で行う。次いで、これらの細胞を、遠心分離（８０００ｒｐｍで１０分間、ＳＳ３４またはＳＡ６００ローター中で）によってペレットかし、そして脱イオン水に再懸濁する。これらの細胞を再びペレット化し、そしてもとの容量の１／１００倍に再懸濁する。
【０２３８】
ＤＮＡ（１〜２μＬ）を、室温、０．１ｃｍのキュベット中、４００ｏｈｍ、２５μＦＤ、０．６５Ｖ、８．８〜９．４の範囲の時定数でエレクトロポレーションする。このＤＮＡは、塩を含まず、蒸留した脱イオン水に再懸濁するか、または０．０２５μｍ型ＶＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で透析する。抵抗率のエレクトロポレーションについて、このＤＮＡをスポット透析し、そして増殖物はＣＹＥ中に存在する。エレクトロポレーションの直後に、１ｍＬのＣＹＥを添加し、そして５０ｍＬのエーレンマイヤーフラスコに事前に添加した追加の１．５ｍＬのＣＹＥ（全容量２．５ｍｌ）を用いて、キュベット中の細胞をプールする。これらの細胞を、３０〜３２℃、３００ｒｐｍで、４〜８時間（または一晩）増殖し、選択マーカーを発現させる。次いで、これらの細胞を、選択したプレート上のＣＹＥ軟寒天にプレートする。選択マーカーとしてカンナマイシンを用いる場合、代表的な収量は、ＤＮＡ１μｇあたり１０^３〜１０^５である。選択マーカーとしてストレプトマイシンを用いる場合、これは寒天に結合するために、上部の寒天に含まれる。
【０２３９】
この手順を用いて、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターを、本発明の組換えＰＫＳを発現するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションし、エポシロン、エポシロン誘導体およびこれらによりコードされる他の新規なポリケチドを生成する。
【０２４０】
（実施例２：Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおけるエポシロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）の発現についての染色体組み込みおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ））
異種宿主においてエポシロンＰＫＳおよび改変酵素遺伝子を発現して発酵によってエポシロンを生成するために、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍに密接に関連し、多くのクローニングベクターが利用可能であるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓを、本発明の方法に従って使用する。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓおよびＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、粘液細菌であり、そのためＭ．ｘａｎｔｈｕｓおよびＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、遺伝子発現、翻訳調節、および翻訳後修飾の共通エレメントを共有し得る。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは、遺伝子クローニングおよび発現について開発されてきた：ＤＮＡは、エレクトロポレーションによって導入され得、そして多くのベクターおよび遺伝子マーカーは、染色体中への安定な挿入を可能にするものを含む外来ＤＮＡの導入に利用可能である。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは、発酵槽中で複合培地にて比較的容易に増殖され得、そして求められる場合、遺伝子発現を増加するための操作に供され得る。
【０２４１】
エポシロン遺伝子クラスターをＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに導入するために、相同組換えを使用することによって染色体にエポシロンクラスターを構築して完全な遺伝子クラスターをアセンブリし得る。あるいは、完全なエポシロン遺伝子クラスターを、細菌人工染色体（ＢＡＣ）にクローニングし得、次いで、染色体への組み込みのためにＭ．ｘａｎｔｈｕｓに移動し得る。
【０２４２】
コスミドｐＫＯＳ３５−７０．１Ａ２、およびｐＫＯＳ３５−７９．８５から遺伝子クラスターをアセンブリするために、これらのコスミドからの相同な小領域（約２ｋｂまたはそれより大きい）を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに導入して遺伝子クラスターのより大きな小片のための組換え部位を提供する。図３に示されるように、プラスミドｐＫＯＳ３５−１５４およびｐＫＯＳ９０−２２を作製して、これらの組換え部位を導入する。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体中のエポシロン遺伝子クラスターをアセンブリするための戦略を、図４に示す。最初に、遺伝子および転写単位をいずれも破壊しない、細菌染色体中の中立部位を、選択する。このような領域の１つは、ｄｅｖＳ遺伝子の下流であり、これは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの増殖または発達に影響しないことが示されている。第１のプラスミドであるｐＫＯＳ３５−１５４を、ＤｒａＩで線状化し、そしてＭ．ｘａｎｔｈｕｓ中にエレクトロポレーションする。このプラスミドは、エポシロン遺伝子クラスターの２つのフラグメントに隣接するｄｅｖ遺伝子座の２つの領域を含む。カナマイシン耐性マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉ　ｇａｌＫ遺伝子を、ｅｐｏ遺伝子領域の間に挿入する。Ｕｅｋｉら、１９９６、Ｇｅｎｅ　１８３：１５３−１５７（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。相同な領域としてｄｅｖ配列を使用する二重組換えによってＤＮＡがｄｅｖ領域に再結合する場合、カナマイシン耐性は、コロニー中に生じる。
【０２４３】
この菌株（Ｋ３５−１５９）は、ｐＫＯＳ３５−７９．８５の組換えを可能にする、エポシロン遺伝子クラスターの小領域（約２．５ｋｂ）を含む。ｐＫＯＳ３５−７９．８５上の耐性マーカーがＫ３５−１５９におけるものと同一であるので、テトラサイクリントランスポゾンを、コスミド中に転位し、そしてカナマイシンマーカー中に挿入されたトランスポゾンを含むコスミドを、選択した。このコスミド（ｐＫＯＳ９０−２３）を、Ｋ３５−１５９中にエレクトロポレーションし、そしてオキシテトラサイクリン耐性コロニーを選択して、菌株Ｋ３５−１７４を作製した。所望でない領域をコスミドから除去しかつエポシロン遺伝子のみを残すために、細胞を、１％ガラクトースを含むＣＹＥプレート上に播いた。ｇａｌＫ遺伝子の存在は、これらの細胞を１％ガラクトースに感受性にする。Ｋ３５−１７４のガラクトース耐性コロニーは、組換えによってかまたはｇａｌＫ遺伝子中の変異によって、ｇａｌＫマーカーを損失した細胞を示す。組換え事象が生じる場合、ガラクトース耐性菌株は、カナマイシンおよびオキシテトラサイクリンに感受性である。両方の抗生物質に感受性な菌株を、サザンブロット分析によって立証する。正しい菌株を同定しＫ３５−１７５と称し、そして正しい菌株は、モジュール７からｅｐｏＫの停止コドンの下流４６８０ｂｐまでのエポシロン遺伝子クラスターを含む。
【０２４４】
モジュール１からモジュール７までを導入するために、上記のプロセスを、１度以上反復する。プラスミドｐＫＯＳ９０−２２を、ＤｒａＩで線状化し、そしてＫ３５−１７５にエレクトロポレーションしてＫ１１１−１３．２を作製する。この菌株を、テトラサイクリン耐性バージョンのｐＫＯＳ３５−７０．１Ａ２およびｐＫＯＳ９０−３８でエレクトロポレーションし、オキシテトラサイクリンに対して耐性なコロニーを、選択する。これによって、菌株Ｋ１１１−１３．２３を作製する。現在、全エポシロン遺伝子クラスターを有する組換え体を、１％ガラクトースに対する耐性によって選択する。これによって、クローンＫ１１１−３２．２５、Ｋ１１１−３２．２６およびＫ１１１−１３．３５が生じる。菌株Ｋ１１１−３２．２５を、ブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに２０００年４月１４日に寄託し、そして受託番号ＰＴＡ−１７００の下で利用可能である。この菌株は、全てのエポシロン遺伝子およびそのプロモーターを含む。
【０２４５】
５０ｍＬフラスコ中で５ｍＬのＣＹＥ（１リットル当たり１０ｇカシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）、５ｇ　酵母抽出物および１ｇ　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）に菌株を播種し、そしてこの培養物が中間対数増殖期になるまで一晩増殖させることによって、発酵を実施した。１００μＬのアリコートを、ＣＴＳプレート上に広げ、そしてプレートを３２℃で４〜５日間インキュベートした。エポシロンを抽出するために、プレートからのアガーおよび細胞を、浸軟し、５０ｍＬの円錐チューブに入れ、そしてアセトンを添加してチューブを充たした。溶液を、４〜５時間振動してインキュベートし、アセトンを吸引し、そして残った液体を、等量の酢酸エチルで２度抽出した。硫酸マグネシウムを添加することによって、酢酸エチル抽出物から水を除去した。硫酸マグネシウムを濾過し、そして液体を吸引して乾燥した。エポシロンを、２００μＬのアセトニトリル中に再懸濁し、ＬＣ／ＭＳによって分析した。この分析は、この菌株がエポシロンＡおよびＢを生成したことを示した。エポシロンＢは培養物中に約０．１ｍｇ／Ｌ存在し、そしてエポシロンＡは５〜１０倍低いレベルで存在した。
【０２４６】
この菌株をまた使用して、液体培地中にエポシロンを生成し得る。ＣＹＥを含むフラスコを、エポシロン生成菌株で播種する。次の日、細胞が中間対数増殖期にある間に、１ｍｇ／ｍＬのセリン、アラニンおよびグリシン、ならびに０．１％　ピルビン酸ナトリウムとともに、０．５％ＣＭＭ（０．５％カシトン、０．２％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．６））を含むフラスコに、５％の接種原を添加した。ピルビン酸ナトリウムを０．５％にまで添加して、エポシロンＢ生成を増加し得たが、エポシロンＢ対エポシロンＡの比が減少した。培養物を、３０℃で６０〜７２時間増殖させる。より長いインキュベーションは、エポシロンの力価の低下をもたらす。エポシロンを回収するために、培養物を、ＳＳ３４ローターにて１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を、酢酸エチルで２度抽出し、そして旋回吸引（「ロータベーポ（ｒｏｔａｖａｐｅ）」）して乾燥する。液体培養物は、プレート培養物で観察したものと類似した比の、２〜３ｍｇ／ＬのエポシロンＡおよびＢを生成した。ＸＡＤ（０．５〜２％）を培養物に添加する場合、エポシロンＣおよびＤを観察した。エポシロンＤは、０．１ｍｇ／Ｌで存在し、そしてエポシロンＣは、５〜１０倍低いレベルで存在した。
【０２４７】
１つのフラグメントとして全遺伝子クラスターをクローンするために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリを構築する。まず、ＳＭＰ４４細胞を、アガロースに包埋し、そしてＢＩＯ−ＲＡＤゲノムＤＮＡプラグキットに従って溶解する。ＤＮＡプラグを、制限酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ）で部分的に消化し、そしてＦＩＧＥゲルまたはＣＨＥＦゲル上で電気泳動する。アガロースからＤＮＡの電気抽出によってかまたはアガロースを分解するためにゲラーゼ（ｇｅｌａｓｅ）を使用して、ＤＮＡフラグメントを、単離する。フラグメントの単離するための選択法は、Ｓｔｒｏｎｇら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：３９５９−３９６１（参考として本明細書中に援用される））に記載されるような電気抽出である。ＤＮＡを、適切な酵素で切断されたＢＡＣ（ｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩ）に連結する。ｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩのマップを、図５に示す。
【０２４８】
Ｓｈｅｎｇら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３：１９９０−１９９６（参考として本明細書中に援用される）の方法によって、ＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションして、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍのゲノムライブラリーを作製する。コロニーを、エポシロンクラスターのＮＲＰＳ領域からのプローブを使用してスクリーニングする。ポジティブクローンを、拾い上げ、そしてＤＮＡを、制限分析のために単離し、完全な遺伝子クラスターの存在を確認する。このポジティブクローンを、ｐＫＯＳ３５−１７８と称する。
【０２４９】
ｐＫＯＳ３５−１７８を導入するために使用され得る菌株を作製するために、ｄｅｖ遺伝子座に隣接するエポシロン遺伝子クラスターの上流および下流である相同性領域を含み、ｐＫＯＳ９０−２２およびｐＫＯＳ３５−１５４に類似するカナマイシン耐性ｇａｌＫカセットを含む、プラスミドｐＫＯＳ３５−１６４を構築する。このプラスミドを、ＤｒａＩで線状化し、そしてＫａｆｅｓｈｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：４８３−４９４の方法に従って、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにエレクトロポレーションしてＫ３５−１８３を作製する。エレクトロポレーションによってかまたはバクテリオファージＰ１での形質導入によって、プラスミドｐＫＯＳ３５−１７８を、Ｋ３５−１８３中に導入し得、そしてクロラムフェニコール耐性コロニーを選択する。あるいは、ｐＲＰ４からの接合移入（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）の起源を含むｐＫＯＳ３５−１７８のバージョンを、Ｅ．ｃｏｌｉからＫ３５−１８３へのＤＮＡの移入のために構築し得る。このプラスミドを、ＲＰ４からのｏｒｉＴ領域およびｐＡＣＹＣ１８４からのテトラサイクリン耐性マーカーを含むトランスポゾンをまず構築して、次いで、ｐＫＯＳ３５−１７８にインビトロでかまたはインビボで転位する。このプラスミドを、Ｓ１７−１中に形質導入し、そしてＭ．ｘａｎｔｈｕｓに接合する。この菌株Ｋ３５−１９０を、１％ガラクトースの存在下で増殖させて、第２の組換え事象について選択する。この菌株は、全てのエポシロン遺伝子および全ての強力なプロモーターを含む。この菌株を発酵し、そしてエポシロンＡおよびＢの生成について試験した。
【０２５０】
あるいは、温度感受性プラスミドｐＭＡＫ７０５またはｐＫＯ３のいずれかを使用してｐＭＡＫ７０５またはｐＫＯ３のいずれかにトランスポゾンを転位し、ｔｅｔＲプラスミドおよびｃａｍＳプラスミドについて選択することによって、トランスポゾンを、ＢＡＣに組換え得る；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９年９月、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７１（９）：４６１７−４６２２およびＬｉｎｋら、１９９７年１０月、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７９（２０）：６２２８−６２３７（これらの各々が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、組換えを達成する。
【０２５１】
ｐＫＯＳ３５−１７８をｄｅｖ遺伝子座への組み込みに加えて、これをまた、ミクソファージ（ｍｙｘｏｐｈａｇｅ）Ｍｘ８またはＭｘ９から組み込み機能を使用してファージ接着部位へ組み込み得る。組み込み遺伝子、およびＭｘ８またはＭｘ９のいずれかからのａｔｔ部位をｐＡＣＹＣ１８４からのテトラサイクリン遺伝子とともに含む、トランスポゾンを構築する。このトランスポゾンの代替のバージョンは、接着部位のみを有し得る。このバージョンにおいて、次いで、組み込み遺伝子は、インテグラーゼ遺伝子を含むプラスミドとの同時エレクトロポレーションによってトランスで供給されるか、またはエレクトロポレーションされた菌株にて任意の構成的プロモーター（例えば、ｍｇｌプロモーター（Ｍａｇｒｉｎｉら、１９９９年７月、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８１（１３）：４０６２−４０７０（本明細書中に参考として援用される））を参照のこと）から発現したインテグラーゼタンパク質を有することによって供給される。一旦、トランスポゾンが構築されると、これを、ｐＫＯＳ３５−１７８に転位してｐＫＯＳ３５−１９１を作製する。このプラスミドを、上記のようにＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ中に導入する。この菌株は、全てのエポシロン遺伝子および全ての強力なプロモーターを含む。この菌株を発酵して、そしてエポシロンＡおよびＢの生成について試験する。あるいは、ａｔｔ部位およびｏｒｉＴ領域を含む菌株は、ＢＡＣに転位され得、そして生じたＢＡＣは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ中に接合され得る。
【０２５２】
一旦、エポシロン遺伝子がＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓの菌株に確立されたら、遺伝子クラスターの任意の部分の操作（例えば、プロモーターまたは交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）モジュールの変化）を、以下に記載されるように、カナマイシン耐性およびｇａｌＫカセットを使用して実施し得る。ｅｐｏ遺伝子を含むＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓの培養物を、多量の培地中で増殖させ、そしてエポシロンの生成について試験する。エポシロンの生成のレベル（特に、ＢまたはＤ）が低い場合、次いで、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ産生クローンを、以下の実施例に記載されるように、培地発生および変異ベースの菌株改善に供する。
【０２５３】
（実施例３）
（エポシロンの産生および精製のためのプロセス）
（Ａ．Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおけるエポシロンＤの異種性産生の最適化）
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおけるエポシロンＤの異種性産生を、吸着樹脂の組み込み、適切な炭素源の同定、およびフェッドバッチプロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐｒｏｃｅｓｓ）の実行により、最初の力価の０．１６ｍｇ／Ｌから１４０倍に改善した。
【０２５４】
基底培地におけるエポシロンＤの分解を減少させるために、ＸＡＤ−１６（２０ｇ／Ｌ）を添加し、細胞外生成物を安定化させた。これはその回収を大いに容易にし、そして収率を３倍に増強した。細胞増殖および生成物形成のための炭素源としての油の使用もまた、評価した。種々の油のスクリーニングから、オレイン酸メチルが、最も大きな影響を有することを示した。バッチプロセスにおける最適濃度の７ｍＬ／Ｌにおいて、最大細胞密度は、０．４ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）／Ｌから２ｇＤＣＷ／Ｌに増加した。生成物の収率は、生成物培地における痕跡元素の存在に依存した。基底培地への痕跡元素の外因的な補給により、最高エポシロンＤ力価を８倍増強した。このことは、細胞の代謝およびエポシロン生合成において金属イオンが重要な役割を果たしていることを実証した。生成物の収率をさらに増加させるために、連続的なフェッドバッチプロセスを実施し、より高い細胞密度を促進し、そして延長した生成期間を維持した。最適化されたフェッドバッチ培養は、一貫して、７ｇＤＣＷ／Ｌの細胞密度および２３ｍｇ／Ｌの平均生成物力価を生じた。
【０２５５】
エポシロンは、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの種々の株により天然に産生される二次代謝物である（Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；この実施例において引用される参考文献はこの節の最後に列挙され、そして本明細書中で参考として援用される）。それらは、微小管解重合の強力なインヒビターであり、作用機構は、抗癌薬Ｔａｘｏｌ（Ｂｏｌｌａｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）と類似する。Ｐ糖タンパク質を発現する多剤耐性腫瘍細胞株に対するそれらの細胞障害性効果は、それらを大きな商業的価値を有する強力な治療化合物にする（Ｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｋｏｗａｌｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。それらの水中での比較的高い溶解性もまた、臨床的評価のためのそれらの処方を容易にする。
【０２５６】
エポシロンＡおよびＢは、天然の宿主の主要な発酵産物である（Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。これらのポリケチド分子の大環状コアは、アセテート単位とプロピオネート単位との連続的な脱炭酸縮合により形成される（Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。エポシロンＡおよびＢは、それらの炭素骨格のＣ−１２位での単一のメチル基が異なる。この構造の相違は、エポシロンＡのアセンブリにおけるアセテートの組み込み、およびエポシロンＢのアセンブリにおけるプロピオネートの組み込みに起因する。エポシロンＣおよびＤは、それぞれ、エポシロンＡおよびＢの生合成経路における中間体である（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｎａｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。それらは、組み合わせた収率が約０．４ｍｇ／Ｌである、発酵プロセスの間の少数派の生成物として分泌される。予備的なインビボ研究は、エポシロンＤが４つの化合物の中で抗腫瘍薬として最も見込みがあることを明らかにし（Ｃｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、この分子を大量に生成することが重要な目的である。
【０２５７】
エポシロン生合成を担う遺伝子クラスターは、配列決定され（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｎａｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）、そしてＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍに緊密に関連するが遺伝子操作の影響をより受けやすい微生物宿主であるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおいてこれらの化合物を生成するために用いられる。エポシロンＤの生成を助長するために、この組換え株の欠損変異体（以下の実施例４に記載される）を構築し、それぞれエポシロンＣおよびＤからエポシロンＡおよびＢへの変換を触媒するＰ４５０エポキシダーゼを不活化した（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。この遺伝的な変更は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ発酵の単独の生成物としてのエポシロンＣおよびＤの分泌を効果的に促進した（エポシロンＤ：エポシロンＣは４：１である）。得られた変異体は、所望の生成物の回収および精製において、天然の宿主を超える顕著な利点を提供する。この実施例において、培地組成および発酵ストラテジーの改善は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓでのエポシロンＤの産生における１４０倍の増加を生じることが記載される。
【０２５８】
吸着樹脂は、少量で生成される生物学的に活性な分子の連続的な補足のために、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａの発酵において用いられる（ＲｅｉｃｈｅｎｂａｃｈおよびＨｏｆｌｅ，１９９３）。エポシロンＤの単離を容易にするために、疎水性樹脂ＸＡＤ−１６を培養培地に添加した。結合した生成物は、適切な溶媒を用いて樹脂から容易に溶出され得るので、その回収は非常に簡単であった。さらに、ＸＡＤ−１６の使用は、生成物の安定化を通じてエポシロン分解を最小化した。
【０２５９】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓは、伝統的に、主にカゼインの酵素的加水分解産物（例えば、ペプトンおよびカシトン）からなる培地中で培養され、単独の炭素源および窒素源としてのアミノ酸に依存する（ＲｅｉｃｈｅｎｂａｃｈおよびＤｗｏｒｋｉｎ，１９９１）。その結果、アンモニアが、アミノ酸分解の結果として発酵ブロス中に蓄積される。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｅｓ培養における３５〜４２ｍＭの細胞外アンモニア濃度は、細胞内での８０〜１４０ｍＭの驚くほど高いアンモニア濃度に対応することが、Ｇｅｒｔｈら（１９８６）により実証された。より重要なことは、インサイチュメンブレンプロセスを用いた過剰なアンモニアの８ｍＭ以下までの連続的な除去により、細胞質量および二次代謝産物の両方が劇的に増加することが示された（Ｈａｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０）。高レベルのアンモニアの生成は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの増殖およびエポシロンＤ産生に阻害的であると推測されるので、アミノ酸の消費を減少させるための代替の炭素源が望ましい。
【０２６０】
適応プロセスが必要とされたけれども、オレイン酸メチルをＭ．ｘａｎｔｈｕｓにより代謝され得る基質として異なる油の広範囲のスクリーニングから同定した。増殖培地に外因性痕跡元素溶液を添加し、エポシロンＤ産生を８倍に増加した（単一のバッチ発酵における収率は３．３ｍｇ／Ｌ）。このプロセスをさらに最適化するために、カシトンおよびオレイン酸メチルの断続的または連続的補給を用いるフェッドバッチアプローチを適合し、細胞の産生フェーズを延長させた。２つの異なる栄養補給ストラテジーを用いて獲得された結果の比較を、この実施例で報告する。
【０２６１】
（材料および方法）
（接種材料の調製）
オレイン酸メチルを含まない培養培地でのエポシロンＤの生成のために、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＬのＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０．１の凍結細胞を５０ｍＬガラス培養チューブ中の１０ｇ／Ｌカシトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｄｉｄｃｏ）、１ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）からなる３ｍＬのＣＹＥ培地に接種した。ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を、水酸化カリウムを用いてｐＨ７．６に滴定した。この細胞を、ロータリーシェーカー上で３０℃および１７５ｒｐｍで３日間インキュベートした。次いでそれらを、５０ｍＬのＣＹＥ培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移し、そして同一の条件下で２日間増殖させた。得られた種培養を用いて、５％（ｖ／ｖ）の接種サイズで５０ｍＬ生成物フラスコに接種した。
【０２６２】
オレイン酸メイルを含む培地中でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの培養のために、細胞が油の存在下で増殖するように適合させる必要があった。１つの凍結細胞の種バイアルを、３μＬのオレイン酸メチル（Ｅｍｅｒｅｓｔ　２３０１）（Ｃｏｇｎｉｓ　Ｃｏｒｐ）を補充した３ｍＬのＣＹＥ培地に接種した。この細胞を３０℃および１７５ｒｐｍにて２〜６日間ガラス培養中で、培養物が顕微鏡下で十分な密度になるまで増殖させた。次いでそれらを、１０ｇ／Ｌカシトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２ｍＬ／Ｌオレイン酸メチル、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）からなる５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した。増殖の２日後、細胞を、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＬアリコートとして−８０℃で凍結および保存した。
【０２６３】
オレイン酸メチルを含む培地中でのエポシロンＤの生成のために、１ｍＬの凍結油適合細胞を、ガラス培養チューブ中の３ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地に接種した。この細胞を３０℃および１７５ｒｐｍで２日間インキュベートし、そして５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移動した。得られた種培養を同一の条件下で２日間増殖させ、そして５０ｍＬ生成物フラスコに５％（ｖ／ｖ）の接種サイズで接種するために用いた。
【０２６４】
５Ｌ発酵のための接種材料を調製することにおいて、２５ｍＬの油適合種培養物を、４７５ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地を含む２．８Ｌフェルバッハフラスコに移した。この細胞を３０℃および１７５ｒｐｍで２日間増殖させた。続いて、２５０ｍＬのこの二次種培養物を４．７５Ｌの生成物培地を含む５Ｌ発酵槽に接種し、５％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にした。
【０２６５】
（振とうフラスコ生成）
オレイン酸メチルの非存在下でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０−１のバッチ培養を、以下のように調製した。１ｇのＸＡＤ−１６樹脂（ＲｏｈｍおよびＨａａｓ）を、５ｍＬの脱イオン水を加えた２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で１２１℃にて３０分間オートクレーブした。次いで、過剰な水をフラスコから除去し、そして５ｇ／Ｌカシトン、２ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）からなる５０ｍＬのＣＴＳ培地を添加した。生成培地の存在下での吸着樹脂のオートクレーブは、細胞に必要とされる必須栄養素の結合を導くので、樹脂および培地成分を別々に滅菌した。生成物フラスコを２．５ｍＬの種培養を用いて接種し、そして３０℃および１７５ｒｐｍで６日間インキュベートした。
【０２６６】
オレイン酸メチルの存在下でのバッチ培養を上述のようにして調製した。さらに、生成物培地に７ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルおよび４ｍＬ／Ｌの濾過滅菌痕跡元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ　濃縮Ｈ_２ＳＯ_４、１４．６ｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、２０ｇ／Ｌ　ＺｎＣｌ_３、１．０ｇ／Ｌ　ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、０．４３ｇ／Ｌ　ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．３１ｇ／Ｌ　Ｈ_３ＢＯ_３、０．２４ｇ／Ｌ　ＣａＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、および０．２４ｇ／Ｌ　Ｎａ_２ＭＯ_４・２Ｈ_２Ｏから構成される）を補充した。次いで、生成物フラスコを２．５ｍＬの油適合種培養で接種し、そして３０℃および１７５ｒｐｍで５日間増殖させた。
【０２６７】
カシトンおよびオレイン酸メチルを断続的に供給するフェッドバッチ培養物を以下のように調製した。１ｇのＸＡＤ−１６樹脂を、５ｍＬの脱イオン水を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で１２１℃にて３０分間オートクレーブした。滅菌後、過剰な水をフラスコから除去し、２ｍＬ／Ｌオレイン酸メチル、４ｍＬ／Ｌ痕跡元素溶液、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）を補充した５０ｍＬのＣＴＳ培地を加えた。生成物フラスコを２．５ｍＬの油適合種培養で接種し、そして３０℃および１７５ｒｐｍでインキュベートした。接種の２日後、２ｇ／Ｌのカシトンおよび３ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを、２４時間間隔で培養培地に加えた。カシトン供給物を濃縮した１００ｇ／Ｌ溶液として調製した。この培養物を１０〜１２日間、実質的な細胞溶解物を獲得するまで培養させた。
【０２６８】
全ての生成物培養物は、同一の増殖条件下で２．８Ｌフェルンバッハフラスコ中で５００ｍＬスケールにて増殖され得る。
【０２６９】
（発酵槽生成）
断続的にかまたは連続的にカシトンおよびオレイン酸メチルを供給する５Ｌスケールのフェッドバッチ発酵を、以下のように調製した。２０ｇ／ＬのＸＡＤ−１６および２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを、４．７５Ｌの脱イオン水を含む５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）中で１２１℃にて３０分間オートクレーブした。滅菌後、濃縮カシトン溶液（１５０ｇ／Ｌ）、オレイン酸メチル、および痕跡元素をバイオリアクターに無菌的に加え、それぞれ５ｇ／Ｌ、２ｍＬ／Ｌ、および４ｍＬ／Ｌの最終カシトン、オレイン酸メチル、および痕跡元素濃度を得た。次いで、培地を２５０ｍＬの油適合種培養で接種した。０．４〜０．５ｖ／ｖ／ｍの給気速度および４００ｒｐｍの初期攪拌速度で３０℃にて発酵を行った。４００〜７００ｒｐｍの間の攪拌カスケードにより、溶解酸素を５０％飽和で制御した。２．５Ｎ　ＫＯＨおよび２．５Ｍ　Ｈ_２ＳＯ_４の自動添加により培養ｐＨを７．４に維持した。接種の２４時間後、カシトン（１５０ｇ／Ｌ）およびオレイン酸メチルを、２ｇ／Ｌ／日（カシトン）および３ｍＬ／Ｌ／日（オレイン酸メチル）の供給速度で生成物培地に添加した。この供給を、２４ｈ毎の単一のボーラスとしてか、または蠕動ポンプ（Ｗ．Ｍａｒｌｏｗ）で連続的にかのいずれかで送達した。細胞を１０〜１２日間、有意な細胞溶解物が見られるまで増殖させた。
【０２７０】
（エポシロン定量）
発酵におけるＸＡＤ−１６樹脂の使用前に、１ｍＬの培養ブロスを生成物フラスコまたはバイオリアクターからサンプル採取し、そして１３，０００ｇにて１０分間遠心分離した。上清中のエポシロン生成物の定量をＨｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＨＰＬＣを用いて２５０ｎｍでのＵＶ検出で実施した。５００μＬの上清を４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）に対して注入した。次いで、１ｍＬ／分の流速でオンライン抽出を実施し、１００％水で０．５分間洗浄し、続いて１．５分間にわたり５０％アセトニトリルまでの勾配により洗浄した。溶出液を最初の２分間を廃棄液に流し、その後、より長い分離カラム（４．６×１５０ｍｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）を通過させた。エポシロンＣおよびＤの分離を、８分間にわたる５０％から１００％アセトニトリルの勾配、それに続く３分間の１００％アセトニトリルによる洗浄により実施した。これらの条件下で、エポシロンＣは、９．４分で溶出し、そしてエポシロンＤは９．８分で溶出した。
【０２７１】
ＸＡＤ−１６樹脂の使用により、５〜５０ｍＬの十分に混合された培養ブロスおよび樹脂を、生成物フラスコまたはバイオリアクターからサンプル採取した。樹脂を重力により定着させた後、培養ブロスをデカントした。５〜５０ｍＬの水を用いて樹脂を洗浄し、そして再度重力により定着させた。この水性混合物を完全に取り除き、そしてエポシロン生成物を１００％メタノールを用いて樹脂から抽出した。用いた溶媒の量は、５０％のサンプル容量と等量であった。エポシロンＣおよびＤの定量を、ＨＰＬＣ分析により２５０ｎｍでのＵＶ検出で実施した。５０μＬのメタノール抽出物を２つの４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）およびより長い４．６×１５０ｍｍカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）に対して注入した。アッセイ方法は、平等にし（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、６０％アセトニトリルおよび４０％水を用いて流速１ｍＬ／分にて１８分間溶出した。これらの条件下で、エポシロンＣを１０．３分にて検出し、そしてエポシロンＤを１３．０分にて検出した。標準を、精製エポシロンＤを用いて調製した。
【０２７２】
（細胞増殖決定）
オレイン酸メチルの非存在下での細胞増殖を、光学密度（ＯＤ）を６００ｎｍにて測定することによりモニターした。サンプルを、最終ＯＤ値が０．４未満になるまで水で希釈した。培養培地へのオレイン酸メチルの添加は、６００ｎｍでの強い吸収を有するエマルジョンの形成を生じるので、オレイン酸メチルの存在下での細胞増殖を、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）により決定した。４０ｍＬの培養ブロスを予め重量測定した試験管中で４２００ｇにて２０分間遠心分離した。次いで、ペレットを４０ｍＬの水を用いて洗浄し、重量測定前に８０℃にて２日間乾燥させた。
【０２７３】
（アンモニア決定）
１ｍＬの発酵ブロスを、１３，０００ｇでの５分間の遠心分離により明澄化した。次いで、上清を、アンモニアアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いたアンモニア分析のために使用した。サンプルを、最終濃度が８８０μＭ未満になるまで２０〜１００倍希釈した。
【０２７４】
（オレイン酸メチル決定）
１ｍＬの発酵ブロス中に残存するオレイン酸メチルを、５ｍＬのアセトニトリルを用いて抽出した。この混合物をボルテックスし、そして４２００ｇでの２０分間の遠心分離により明澄化した。オレイン酸メチルの定量を、ＨＰＬＣ分析により２１０ｎｍでのＵＶ検出で実施した。５０μＬの上清を、２つの４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）およびより長い４．６×１５０ｍｍカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）に対して注入した。このカラムをアセトニトリル−水（１：１）を用いて流速１ｍＬ／分にて２分間洗浄した。次いで、２４分間にわたる５０％〜１００％アセトニトリルの勾配、それに続く５分間の１００％アセトニトリル洗浄により溶出した。市販のオレイン酸メチルの炭素鎖長の異種性が理由で、この化合物を２５．３分と２７．１分にて検出された２つの主要ピークとして溶出した。ＸＡＤ−１６樹脂に結合したオレイン酸メチルを、同じＨＰＬＣ法を用いたメタノール抽出から定量した。オレイン酸メチルの標準を８３．３％アセトニトリル中で調製した。細胞によるオレイン酸メチルの消費を以下のようにして算出した：（添加した総オレイン酸メチル）−（培地中に残存するオレイン酸メチル）−（樹脂に結合したオレイン酸メチル）。
【０２７５】
（結果）
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１を、５ｇ／Ｌカシトン（膵臓カゼイン消化物）および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムのみからなる単純生成物培地を用いるバッチ発酵プロセスにおいて初期培養した。細胞の基準性能を図６に示す。
【０２７６】
最大細胞密度およびエポシロンＤ産生を１．６のＯＤ_６００および０．１６ｍｇ／Ｌの対応する力価での接種の３日間後に得た。細胞密度および生成物収率の両方は、その後実質的に減少した。細胞によるカシトンの消費により、アンモニウムの漸増的な蓄積もまた、生成物培地において検出した。最終アンモニア濃度は、５日間の発酵の最後で２０ｍＭに達した。
【０２７７】
（生成物の安定性に対するＸＡＤ−１６の効果）
エポシロンＤの急激な分解を防止するために、疎水性吸着樹脂ＸＡＤ−１６を生成物培地に添加し、分泌された生成物を結合および安定化させた。ＸＡＤ−１６は、微生物プロデューサーＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　Ｓｏ　ｃｅ９０の発酵からエポシロンＡおよびＢを単離することについて、Ｇｅｒｔｈら（１９９６）により以前に使用された多芳香族樹脂である。図７に示されるように、吸着樹脂の存在は、細胞の増殖に影響しなかった。しかし、それは、発酵ブロス中のエポシロンＤの損失を効果的に減少させ、この生成物の回収における３倍の増強を導いた。
【０２７８】
（培地開発）
より高い細胞密度およびエポシロン産生を支持し得る培地を開発する試みにおいて、増殖および生成物の収率に対するカシトンの影響を、生成物培地中でのその濃度を１ｇ／Ｌから４０ｇ／Ｌに変化させることにより評価した。細胞増殖は漸増濃度のカシトンにより刺激されたが、細胞の特異的な生産能は、図８に示されるように有意に減少した。エポシロンＤ生成のための最適なカシトン濃度は、５ｇ／Ｌに達し、より高い濃度が低い力価を生じた。
【０２７９】
培地の改善はカシトンの使用で限定されたので、代替の基質を基底生成物培地への補給物質として評価した。表３に要約されるように、異なる油の詳細なスクリーニングから、オレイン酸メチルを、エポシロンＤ産生において最も大きな増加を促進する炭素源として同定した。
【０２８０】
【表３】

しかし、生成物培地へのオレイン酸メチルの直接添加は、成熟前の細胞溶解を引き起こした。従って、種培養を、生成物発酵の前にオレイン酸メチルの存在下で増殖させた。興味深いことに、この適合プロセスによって、細胞は、溶解に対して感受性をより小さくした。表４に示されるように（バッチ発酵におけるＣＴＳ培地の基礎性能と比較した増殖および生成における改善）、７ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチル濃度および４ｍＬ／Ｌの痕跡元素濃度を用いて、２．１ｇ／Ｌのピークバイオマス濃度および３．３ｍｇ／ＬのエポシロンＤ力価を達成した。
【０２８１】
【表４】

さらなる力価の改善は、図９に示されるようにオレイン酸メチルのより高い濃度では観察されなかった。
【０２８２】
細胞増殖および産生に対するオレイン酸メチルの重要性を実証することに加えて、上のグラフはまた、産生培地におけるトレースエレメントの重要性を強調する。カシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）によって補充された栄養素は、活発な細胞増殖に十分ではあり得ず、微量金属の外部からの添加を、オレイン酸メチルを含む結合体中心に添加した。驚くべきことに、この補充は、増殖および産生の両方を増強するために必須であることが見出された。微量金属の添加がない場合には、最大バイオマス濃度およびエポシロンＤ力価は、それぞれ１．２ｇ／Ｌおよび０．１２ｍｇ／Ｌのみであった。この低い力価は、基礎培地を用いて得られた力価に匹敵した。
【０２８３】
（フェッドバッチの開発）
バッチ発酵プロセスに、最適な濃度のオレイン酸メチルおよびトレースエレメントが存在する場合、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の対数増殖は、接種後の最初の２日間で起こった。エポシロンＤの生成は、定常期の開始時に始まり、そして５日目のオレイン酸メチルの枯渇とともに細胞溶解が起こったときに停止した（図１０Ａおよび１０Ｂに示される）。オレイン酸メチルの消費およびアンモニア生成についての時間過程がまた示される。産生培地におけるアンモニアの濃度は、発酵の全過程にわたって４ｍＭより少なかった。
【０２８４】
フラスコ培養における細胞産生期間を延長するために、カシトンおよびオレイン酸メチルをそれぞれ２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日の割合で１日１回培地に添加した。基質フィードを接種４８時間後に開始し、その後３日間、細胞は対数的に増殖した。図１１Ａに示されるように、バイオマス濃度は、５日目にプラトーになり始め、１０日目に最大６．３ｇ／Ｌでプラトーに達した。また、エポシロンＤの産生は、定常増殖期と一致し、そして９．８ｍｇ／Ｌの最終収率は、１２日目の終わりに達成された。図１１Ｂに示されるように、オレイン酸メチルの消費およびアンモニアの生成の両方が、発酵の全過程にわたって一定の割合で増加した。
【０２８５】
オレイン酸メチルは、オレイン酸メチルがバイオリアクターにフィードされるのと同じ速度で消費され、そして３．２ｍＭ／日の速度でアンモニアが蓄積された。カシトンまたはオレイン酸メチルのより低速でのフィードは、エポチロンＤ力価を非常に減少させるが、より高速でのフィードは、有意な産生が達成される前に成熟前細胞溶解を引き起こした。
【０２８６】
大きなスケールでのフェッドバッチプロセスの効率を試験するために、カシトンおよびオレイン酸メチルを２４時間間隔で断続的に、５Ｌのバイオリアクター中の発酵物に添加した。図１２に示されるように、生じた生成物曲線は、フラスコ培養についての生成物曲線と密接に類似した。基質フィードを接種２４時間後に開始し、エポシロンの生成は、４日目に始まった。９．２ｍｇ／Ｌの最高エポシロンＤ力価は、接種後１０日目に得られた。
【０２８７】
より正確なフィーディングストラテジーの増殖および産生に対する影響を評価するために、二重のフィードをバイオリアクターに連続的に送達した。図１３Ａに示されるように、連続的なフィードの実行は、細胞増殖に影響しなかったが、その生産性がほぼ３倍まで増加した。最終エポシロンＤ力価である２７ｍｇ／Ｌは、接種後１０日目に達成された。図１３Ｂに示されるように、オレイン酸メチルは、産生培地に添加されるのと同じ速度で消費され、そしてアンモニアは、全発酵過程にわたって、一定の速度６．４ｍＭ／日で放出された。
【０２８８】
（議論）
エポシロンＤの化学的合成が、近年達せられたが（Ｈａｒｒｉｓら、１９９９；Ｍｅｎｇら、１９９８；Ｓｈｉｎｈａら、１９９８）、２０工程の複雑なプロセスは、化合物の大きなスケールでの製造のために経済的に実行可能な方法ではない。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ菌株の初期エポシロンＤに対する生産収率は、０．１６ｍｇ／Ｌであったが、本発明の改善された発酵プロセスは、産生レベルを２３ｍｇ／Ｌまで実質的に増加した。
【０２８９】
より高いエポシロンＤ力価を達成することに対する主な障害の１つは、発酵ブロス中の産物の迅速な分解であった。この問題は、培養培地に吸着樹脂を組込むことで軽減された。ＸＡＤ−１６の添加は、細胞増殖には影響しなかったが、分泌された産物の損失を最小にし、そしてその回収率を３倍まで増加した。
【０２９０】
生産収率を高めることに対する別の障害は、カシトンを主な炭素源および窒素源として使用することで力価における改善が制限されていることである。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の増殖は、カシトン濃度の増加にともなって刺激されたが、５ｇ／Ｌを超える濃度は、力価における劇的な減少を引き起こした。ペプトンまたはカシトンの高濃度での二次代謝産物のこの阻害効果は、いくつかの他のミコバクテリア発酵において以前に実証されており、そしてこのことは、培養培地中にアンモニアが蓄積することに起因している。
【０２９１】
Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは、多糖および糖を代謝し得ない（ＲｅｉｃｈｅｎｂａｃｈおよびＤｗｏｒｋｉｎ、１９９１）ので、油を炭素源として利用するためにその能力を調査した。油は、魅力的な炭素基質である。なぜなら、脂肪酸の酸化は、細胞のためのエネルギー源として役立ち得るだけでなく、分解産物としてのアセチルＣｏ−Ａの発酵は、エポシロン生合成のための前駆体を提供し得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ発酵、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ発酵、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ発酵への油の添加は、ポリケチド分子（例えば、それぞれ、エリスロマイシン、チロシン、および免疫調製物質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｎｔ）Ｌ−６８３５９０）の産生を高めることが示されている（Ｍｉｒｊａｌｉｌｉら、１９９９；Ｃｈｏｉら、１９９８；Ｊｕｎｋｅｒら、１９９８）。
【０２９２】
異なる油のスクリーニングから、オレイン酸メチルが、細胞増殖およびエポシロンＤ産生を促進する優れた候補物質として同定された。しかし、これらの改善は、産生培地へ微量金属を同時に添加した場合にのみ観察された。７ｍＬ／Ｌでのオレイン酸メチル単独での添加は、最大細胞濃度を０．４ｇ　ＤＣＷ／Ｌから１．２ｇ　ＤＣＷ／Ｌまで増加したが、産生物はベースラインレベルのままであった。４ｍＬ／Ｌのトレースエレメントを外部から補充すると、最高バイオマス濃度は、２．１ｇ　ＤＣＷ／Ｌまで増加し、そしてエポシロンＤ力価は、０．４５ｍｇ／Ｌから３．３ｍｇ／Ｌまで促進された。これらの知見は、カシトンにおける栄養成分の欠乏がＭ．ｘａｎｔｈｕｓの増殖およびエポシロンの形成に重要であり得ることを示す。
【０２９３】
バッチプロセスのための、オレイン酸メチルおよびトレースエレメントの最適濃度を確立する努力が、活発な細胞増殖を維持し、そして産生期を延長するためのフィーディングストラテジーを開発するためになされた。断続的なおよび連続的なカシトンおよびオレイン酸メチルの一定の速度でのフィードが評価され、そして両方法は、増殖プロフィールにおいて類似の改善を生じた。２つの基質の最適フィードを用いて、約６．８ｇ　ＤＣＷ／Ｌの最大細胞濃度が得られた。両方の場合において、オレイン酸メチルは、オレイン酸メチルが発酵培地に添加されるにつれて消費された。
【０２９４】
細胞増殖およびオレイン酸メチルの消費とは対照的に、エポシロン産生およびアンモニア生成は、フィーディングストラテジーの選択によって大きく影響された。連続フェッドバッチ培養において、最大エポシロンＤ力価である、２３ｍｇ／Ｌが得られた。これは、断続的なフェッドバッチ培養で得られた力価のほぼ２．５倍であった。連続的なフィードでは、細胞によって放出されたアンモニアの速度もまた、２倍高かった。このことは、より高いカシトン消費速度を示唆している。これらの結果は共に、低い力価が、断続的なフェッドバッチプロセスに関連し、アンモニアの蓄積ではなく、異化産物制御によって引き起こされ得ることを示す。さらに、これらは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の生産性が、培養培地中に存在する基質の量に対して感受性であり、そして基質制限条件下で最大であり得ることを示唆する。このことはまた、産生培地中のカシトン濃度の増加が、高い細胞濃度を生じるが、低い力価であるという観察と一致する。
【０２９５】
基礎培地でのバッチ培養と比較して、連続フェッドバッチ培養は、細胞濃度において１７倍の増加、そして力価において１４０倍の増加を生じた。このプロセスは、５Ｌ〜１０００Ｌのスケールであり、そして同等に行われることが示された。製造スケールでエポシロンＤを生産するために示されたこの結果は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓが、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ由来の他の生物学的に活性な分子の産生のための宿主として使用され得ることを実証した。
【０２９６】
（参考文献）
【０２９７】
【化３１】

（Ｂ．エポシロンＢの産生）
（フラスコ）
１ｍＬのバイアルのＫ１１１−３２−２５菌株を解凍し、内容物をガラス試験管中のＣＹＥシード培地３ｍＬに移す。この培地を３０℃で７２±１２時間インキュベートし、続いて２５０ｍＬの回り止めされたエルレンマイアーフラスコ（ｂｕｆｆｌｅｄ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　ｆｌａｓｋ）内のＣＹＥ培地５０ｍＬ中でこの試験管の培養物３ｍＬを継代培養する。このＣＹＥフラスコを３０℃で２４±８時間インキュベートし、このシードの２．５ｍＬ（５％　ｖ／ｖ）を使用してエポシロン産生フラスコ（２５０ｍＬの回り止めされたエルレンマイアーフラスコ中のＣＴＳ−ＴＡ培地５０ｍＬ）に接種した。次いでこれらのフラスコを、３０℃で４８±１２時間、開始時のｐＨ７．４の培地と共にインキュベートする。
【０２９８】
（発酵槽）
上記と同様のＫ１１１−３２−２５の接種物の拡大して、５０ｍＬのＣＹＥシードのうち２５ｍＬを５００ｍＬのＣＹＥへ継代培養するさらなる工程とともに使用する。この第二のシードを使用して、１０Ｌの発酵槽（９．５ＬのＣＴＳ−ＴＡ、および１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含む）に接種する。この発酵についてのプロセスパラメーター設定は以下である：ｐＨ−７．４；攪拌−４００ｒｐｍ；スパージ速度−０．１５ｖｖｍ。これらのパラメーターは、８０％飽和を超えるＤＯを維持するのに十分であった。ｐＨコントロールを、２．５Ｎの硫酸および２．５Ｎの水酸化ナトリウムを培養物に添加することによって提供した。最高エポシロン力価が４８±８時間で達成される。
【０２９９】
（Ｃ．エポシロンＤの産生）
（フラスコ）
Ｋ１１１−４０−１菌株（実施例４に記載される）の１ｍＬバイアルを解凍し、その内容物をガラス試験管中のＣＹＥシード倍地の３ｍＬに移す。この培養物を３０℃で７２±１２時間インキュベートし、続いてこの試験管の培養物の３ｍＬを２５０ｍＬの回り止めしたエルレンマイヤーフラスコ内の５０ｍＬのＣＹＥ培地に継代培養する。このＣＹＥフラスコを３０℃で２４±８時間インキュベートし、このシードの２．５ｍＬ（５％ｖ／ｖ）を使用してエポシロン産生フラスコに接種する（２５０ｍＬの回り止めしたエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬの１×小麦グルテン培地）。次いで、これらのフラスコを、開始時のｐＨ７．４の培地と共に３０℃で４８±１２時間インキュベートする。
【０３００】
（発酵槽）
上記と同様のＫ１１１−４０−１の接種物の拡大して、５０ｍＬのＣＹＥシードのうち２５ｍＬを５００ｍＬのＣＹＥへ継代培養するさらなる工程に使用する。この第二のシード２５０ｍＬを使用して、５Ｌの発酵槽（４．５ＬのＣＴＳ−ＴＡ、および１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム（毎日フィードする）を含む）に接種する。この発酵についてのプロセスパラメーター設定は以下である：ｐＨ−７．４；攪拌−４００ｒｐｍ；スパージ速度−０．１５ｖｖｍ。これらのパラメーターは、８０％飽和を超えるＤＯを維持するのに十分であった。ｐＨコントロールを、２．５Ｎの硫酸および２．５Ｎの水酸化ナトリウムを培養物に添加することによって提供した。最高エポシロン力価が３６±８時間で達成される。最高エポシロンＣ力価は、０．５ｍｇ／Ｌであり、そして最高エポシロンＤ力価は、１．６ｍｇ／Ｌである。
【０３０１】
表５は、使用された培地およびそれぞれの成分の要約である。
【０３０２】
【表５】

ＣＹＥシード培地およびＣＴＳ−ＴＡ産生培地を、１２１℃で３０分間の自動滅菌オートクレーブ（ａｕｔｏＳｔｅｒｉｌｉｚｅｄ　ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ）によって滅菌する。次いで、小麦グルテン産生培地を１２１℃で４５分間オートクレーブすることによって滅菌する。
【０３０３】
（Ｄ．Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓからのエポシロンＣおよびＤの産生）
１つの局面において、本発明は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ菌株（Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０−１が挙げられるが、これらに限定されない）のための改善された発酵プロセスを提供する。このプロセスにおいて、発酵培地は、アンモニアの生成なしに利用され得る炭素源を提供する。１つの好ましい実施形態において、炭素源は油（例えば、オレイン酸メチル、または類似の油）である。種々のフィード速度での振盪フラスコ試験において、これらの方法は、以下に記載のように１５〜２５ｍｇ／Ｌの範囲のレベルで、エポシロンＣおよびＤ（主には、エポシロンＤ）の産生を生じた。
【０３０４】
（シード培養）
２ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを含むＣＹＥ培地５０ｍＬ中で増殖させ、凍結した１ｍＬバイアル中のＭ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０−１細胞を使用して、滅菌ガラス試験管中の１ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを含む新しいＣＹＥ培地の３ｍＬに接種した。この試験管を３０℃で２４時間、２５０ＲＰＭの振盪にて、インキュベートした。次いで、この試験管中の培養物を、２ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを含む新しいＣＹＥ培地５０ｍＬを含む回り止めしていない２５０ｍＬのフラスコに移した。このフラスコを、３０℃で、４８時間、２５０ＲＰＭの振盪にて、インキュベートした。
【０３０５】
（産生フラスコ）
１ｇのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＸＡＤ−１６を、２５０ｍＬの回り止めしていないフラスコ中で、１２１℃、３０分間オートクレーブすることによって滅菌した。次いで、５０ｍＬの滅菌産生培地をフラスコに加えた。このフラスコをシード培養物の５％（ｖ／ｖ）で接種し、これを２５０ＲＰＭおよび３０℃で作動するインキュベーター振盪器に設置した。滅菌オレイン酸メチルの３ｍＬ／Ｌ／日のフィードを、接種後２日目に開始し、そしてカシトンの２ｇ／Ｌ／日のフィードを接種後１日目に開始した。
【０３０６】
（産物の抽出）
１４日後に、産生フラスコ中のＸＡＤ樹脂を５０ｍＬの遠心管に移した。この遠心管中の過剰の培地を、樹脂のいずれも除去されないようにデカントした。次いで、ＸＡＤ樹脂を、２５ｍＬの水で洗浄し、静置した。この遠心管中の水を、樹脂のいずれも除去されないようにデカントし、この遠心管に２０ｍＬのメタノールを加えた。遠心管を、１７５ＲＰＭ、２０〜３０分間の振盪器に設置し、樹脂からエポシロン産物を抽出した。メタノール抽出物を、貯蔵およびＬＣ／ＭＳ分析のために新しい遠心管に移した。
【０３０７】
表６は、使用された培地およびそのそれぞれの成分の要約である。
【０３０８】
【表６】

ＣＹＥ培地および産生培地を自動滅菌オートクレーブによって、１２１℃、３０分間滅菌する。トレースエレメント溶液は、濾過滅菌し；オレイン酸メチルは、別にオートクレーブする。
【０３０９】
トレースエレメント溶液を、表７の成分全てと合わせることによって作製し、この溶液に１０ｍＬ／Ｌの濃硫酸を加え、最終容量１Ｌにする。
【０３１０】
【表７】

生じた溶液を濾過滅菌する。
【０３１１】
（Ｅ．Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓからのエポシロンの発酵、産生、および精製）
（Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の詳細）
菌株Ｋ１１１−２５−１は、エポシロンＢ産生菌株であり、これはまた、エポシロンＡも産生する。菌株Ｋ１１１−４０−１はエポシロンＤ産生菌株であり、これはまた、エポシロンＣも産生する。
【０３１２】
（プレート上でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの維持）
Ｍ．ｘａｎｔｕｓ菌株をＣＹＥ寒天プレートで維持する（プレート組成物については表８を参照のこと）。コロニーは、プレートに画線接種した後、約３日で現れる。プレートを、３２℃で所望の増殖レベルまでインキュベートし、次いで、３週間まで室温で貯蔵する（プレート上４℃での保存は、細胞を死滅させる）。
【０３１３】
（表８）
【０３１４】
【表８】

＊１Ｌ寒天培地バッチを４５分間オートクレーブし、次いで、ペトリ皿中に注いだ。
【０３１５】
（細胞バンクについてのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの油順応）
３ｍＬのＣＹＥシード培地および１滴のオレイン酸メチルを入れた、５０ｍＬのガラス培養チューブ内に、ＣＹＥプレートまたは細胞の凍結バイアルから、油に順応しないコロニーを１００μＬピペットで移す。顕微鏡下で培養物が高密度に見えるまで細胞を２〜６日間増殖させる（３０℃、１７５ｒｐｍ）。これらの細胞は、常に油によく順応するわけでないため、並行していくつか（５〜７）の試験管ではじめる。
【０３１６】
（細胞バンク手順（マスター細胞バンク））
上記のように、油順応性試験管培養を開始する。試験管培養物が十分に高密度（ＯＤ＝５＋／−１）である場合、この試験管の内容物全体を、５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入った滅菌した２５０ｍＬ振盪フラスコに移す（培地の組成について以下の表を参照のこと）。振盪インキュベータ中（３０℃、１７５ｒｐｍ）において、４８±１２時間の増殖の後、このシード培養物の５ｍＬを１００ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った５００ｍＬ振盪フラスコ中に移す。この培養物を振盪インキュベータ中（３０℃、１７５ｒｐｍ）において、丸１日増殖させる。適切な増殖および混入のないことについて、培養物を顕微鏡で確認する。
【０３１７】
８０ｍＬのこのシード培養培養物と２４ｍＬの９０％滅菌グリセロールを滅菌した２５０ｍＬ振盪フラスコ中で合わせる。よく混合するよう旋回させ、１００個の滅菌した予め標識したクリオバイアルに、１ｍＬのこの混合物を等分する。これらを−８０℃フリーザー中において、バイアルをゆっくり凍結する。
【０３１８】
（細胞バンク手順（実用的（ｗｏｒｋｉｎｇ）細胞バンク））
上記のように作製されたマスター細胞バンクバイアルの１つを室温で解凍することによって、試験管培養を開始し、次いで、この内容物全部を３ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入ったガラス試験管に入れる。この試験管培養物が十分に高密度（ＯＤ＝５＋／−１）である場合、この試験管の内容物全部を５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入った２５０ｍＬ滅菌振盪フラスコに移す。４８±１２時間の増殖（３０℃、１７５ｒｐｍ）の後、このシード培養物の５ｍＬを１００ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った５００ｍＬ振盪フラスコ中に移す。この培養物を、丸１日増殖させる（３０℃、１７５ｒｐｍ）。増殖および混入について、顕微鏡で確認する。
【０３１９】
８０ｍＬのこのシード培養培養物と２４ｍＬの９０％滅菌グリセロールを滅菌した２５０ｍＬ振盪フラスコ中で合わせる。よく混合するよう旋回させ、１００個の滅菌した予め標識したクリオバイアルに、１ｍＬのこの混合物を等分する。これらを−８０℃フリーザー中において、バイアルをゆっくり凍結する。
【０３２０】
（シード培地の組成）
細胞バンクおよび細胞バンクバイアルの任意の所望の用量までの拡大のために、表９に記載されるものと同じシード培地を使用する。
【０３２１】
（表９）
【０３２２】
【表９】

＊注：オレイン酸メチルは、Ｃａｓｉｔｏｎｅ中でエマルジョンを形成し、他の成分と完全に混合しないため、他の成分を添加した後に、オレイン酸メチルを添加する。
【０３２３】
（振盪フラスコ５Ｌおよび１０００Ｌの発酵の種菌スケールアップ）
オレイン酸メチル順応細胞の凍結された実用的な細胞バンクバイアルを解凍する。３ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地が入った５０ｍＬガラス培養試験管中にバイアルの内容物全部を移す。試験管を振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中に置き、４８±２４時間増殖させる。培養試験管の内容物全部を５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入った２５０ｍＬ振盪フラスコに移す。試験管を振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中に置き、４８±２４時間増殖させる。振盪フラスコを実験に用いるために、この培養物の１０ｍＬを、５つの新しいシードフラスコ中の４０ｍＬの新鮮なＣＹＥ−ＭＯＭに、継代培養することによって、このシードを増殖する。シードフラスコを振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中で、２４±１２時間インキュベートし、フラスコ容量（３０〜１００ｍＬ）の生成培養物の種菌として使用する。４．５％の合わされた（シードおよび生成培地）最初の容量で、生成フラスコに播種する。
【０３２４】
小規模（５〜１０Ｌ）の発酵のためのシードを調製するために、これらの５０ｍＬのシードフラスコの１つの内容物全部を、５００ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った滅菌した２．８Ｌフェルンバッハフラスコに継代培養する。このフェルンバッハフラスコを振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中において、４８±２４時間インキュベートし、発酵槽種菌として使用する。約５％の合わされた最初の容量にて、生成発酵物を播種する。
【０３２５】
さらなるシードの増殖は、大規模（１０００Ｌ）発酵に必要である。ここで、１Ｌのフェルンバッハフラスコシードを用いて、９ＬのＣＹＥ−ＭＯＭを含む１０Ｌのシード発酵槽に播種する（５容量％）。２．５Ｎ水酸化カリウムおよび２．５Ｎ硫酸の添加によって発酵槽のｐＨを７．４に制御する。温度は、３０℃にセットする。４００〜７００ｒｐｍの撹拌速度カスケージングによって、溶存酸素を、５０％以上の飽和度に維持する。最初の撹拌速度を４００ｒｐｍにセットし、スパージング速度を０．１ｖ／ｖ／ｍに維持する。１０Ｌの発酵槽中で２４±１２時間の増殖の後に、培養物全部を、９０ＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った１５０Ｌの発酵槽に移す。２．５Ｎ水酸化カリウムおよび２．５Ｎ硫酸を用いてｐＨをもう一度、７．４に制御する。温度を３０℃にセットする。４００〜７００ｒｐｍの撹拌速度カスケージングによって、溶存酸素を、５０％以上の飽和度に維持する。最初の撹拌速度を４００ｒｐｍにセットし、スパージング速度を０．１ｖ／ｖ／ｍに維持する。
【０３２６】
（発酵のためのＸＡＤ−１６樹脂の調製）
所望される量のＸＡＤ−１６樹脂（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ）を、ＸＡＤ−１６樹脂重量の最低３倍の容量を有するメタノール安全容器に移す（すなわち、１．２ｋｇの樹脂は、少なくとも３．６Ｌの容器を必要とする）。樹脂を１００％メタノールを用いてよく洗浄して、未使用の樹脂上に存在する任意のモノマーを除去する。樹脂重量（ｋｇ）の２倍量のメタノール（Ｌ）を添加する（すなわち、３ｋｇのＸＡＤ−１６に対して、６Ｌのメタノール）。メタノールとＸＡＤスラリーを５分間混合して、ＸＡＤ−１６上に存在する任意のモノマーを除去する。このスラリーを穏やかに撹拌し、樹脂のフラグメント化を最小化するよう混合する。混合を止め、樹脂を１５分間以上、重力沈降させる。容器からメタノールを流し出し、０．５〜１インチのメタノールの層をＸＡＤベッドの上に残す。ＸＡＤおよびメタノールを混合容器からＡｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムに移す。上部のベッド支持体をカラムに接着し、シール調節ノブを時計回りにまわしてベッド支持体をシールする。カラム容量の５倍以上のメタノールを用いて、３００±５０ｃｍ／時間でカラム中のＸＡＤを洗浄する。溶媒廃棄容器中にメタノールの流れたものを回収する。１０カラム容量以上の脱イオン水で、ＸＡＤをカラム中において３００±５０ｃｍ／時間で洗浄する。
【０３２７】
エポシロン生成培地の組成物を、表１０に記載する。
【０３２８】
（表１０）
【０３２９】
【表１０】

＊注：オレイン酸メチルは、Ｃａｓｉｔｏｎｅ中でエマルジョンを形成し、他の成分と完全に混合しないため、他の成分を添加した後に、オレイン酸メチルを添加する。微量元素溶液は、表７に記載される通りである。
【０３３０】
（調製およびフラスコ規模（５０ｍＬ）のエポシロン生成発酵物）
１ｇのＸＡＤ−１６を２５０ｍＬ振盪中で、この樹脂を覆うのに十分な量の脱イオン水（約３ｍＬ）と共に、オートクレーブする。フラスコを３０分間、１２１℃でオートクレーブで滅菌する。以下の培地成分をフラスコに無菌的に添加する：５０ｍＬのＣＴＳ−ＭＯＭ生成培地、および２．５ｍＬの１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（水酸化カリウムを用いてｐＨ７．６に滴定する）。２．５ｍＬのＣＹＥシードフラスコ（４．５％容量／容量種菌）と共に、培養物を播種する。撹拌器上で、３０℃、１７５ｒｐｍで生成フラスコをインキュベートする。
【０３３１】
播種後２４±６時間でＣａｓｉｔｏｎｅおよびオレイン酸メチルを給餌し始める。この時点およびこの後２４±６時間毎に、１ｍＬの１００ｇ／Ｌ　Ｃａｓｉｔｏｎｅ溶液および１５０μＬのオレイン酸メチルを給餌する。この給餌レジメンを最初の給餌後の１３日目まで続けるか、細胞が溶解し始めているのが観察されるまで（１１〜１４日目）続ける。エポシロン生成反応速度を決定するため、よく混合された発酵ブロスおよびＸＡＤの例示的な５ｍＬサンプルを採取し得る。さらに、ＸＡＤを含まないブロスの小サンプル（０．２５〜０．５ｍＬ）を毎日採取して、培養物の増殖の状態を可視的に確認し得る。大量の細胞溶解が観察される場合、培養容積の残りを収集すべきである。
【０３３２】
（調製および５Ｌスケールのエポシロン生成発酵）
１００ｇのＸＡＤおよび８ｇのＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏを３．９Ｌの脱イオン水と合わせ、５ＬのＢ−Ｂｒａｕｎバイオリアクター中で滅菌（９０分、１２１℃）する。事前に滅菌したＣａｓｉｔｏｎｅ／脱イオン水溶液（１５０ｇ／Ｌ）の十分な量（１３３ｍＬ）を、無菌的に汲み出し、発酵槽中で最終のＣａｓｉｔｏｎｅ濃度が５ｇ／Ｌに達するようにする。２ｍＬ／Ｌの最初のオレイン酸メチル濃度を、１０ｍＬのオレイン酸メチルを添加することにより達成する。最終的に、１６ｍＬの事前に滅菌したトレース要素溶液を滅菌的に、播種の前に添加する。次いで、発酵層２００ｍＬのＣＹＥシード培養物（４．８％容量／容量）で播種し、２４±６時間増殖させる。この時点で、Ｃａｓｉｔｏｎｅ（２ｇ／Ｌ／日、連続給餌）およびオレイン酸メチル（計３ｍＬ／Ｌ／日、９０分毎の半連続給餌）の給餌を開始する。バイオリアクター内において、気流を０．４〜０．５ｖｖｍで一定に保つ（給餌が進行する場合の発酵容量の増加は、この変化を引き起こす）。溶存酸素濃度は、撹拌カスケード（４００〜７００ｒｐｍ）ことによって、５０％の飽和に制御される。１００％飽和の溶存酸素の較正点は、最初の撹拌を４００ｒｐｍ、最初の気流を０．５ｖｖｍにセットすることよって、確立される。７．４のｐＨセットポイントは、２．５Ｎ　Ｈ_２ＳＯ_４および２．５Ｎ　ＫＯＨの自動化された添加によって維持される。エポシロン生成は、播種後１１〜１４日間続き、細胞溶解物がブロスサンプル中に現れ、そして酸素要求（撹拌速度によって示される）が、急に減少する場合、バイオリアクターは、回収される。この発酵プロセスにおいて、エポシロンＤの力価は、一般に１８〜２５ｍｇ／Ｌに達する。
【０３３３】
（調製および１０００Ｌスケールのエポシロン生成発酵物）
１０００Ｌ発酵槽をエポシロン生成のために以下のように調製した。６００Ｌの水および１８Ｌ（１１．５７４ｋｇ）のＸＡＤ−１６を、発酵槽中で滅菌した（４５分、１２１℃）。微量金属およびＭｇＳＯ４を、直接発酵容器中にフィルター濾過（事前に滅菌した０．２μｍポリエーテルスルホン膜カプセルフィルターを通して）した。２．９Ｌの微量元素溶液および十分な量の濃縮ＭｇＳＯ_４溶液（発酵槽中、最終濃度２ｇ／Ｌまで）を同じカプセルフィルターを通して添加した。１１７ｇ／Ｌ　Ｃａｓｉｔｏｎｅおよび１７５ｍＬ／Ｌ　オレイン酸メチルの混合物約２００Ｌを２６０Ｌ給餌タンク中で滅菌した。この滅菌混合物の３２Ｌを１０００Ｌの発酵槽に添加した。水を容器中に濾過（同じカプセルフィルターを通して）して、最終容量を７１０Ｌにした。撹拌は、１００ｒｐｍであった。背圧を１００〜３００ｍｂａｒに維持した。播種後に溶存酸素（ＤＯ）が５０％に達した場合、撹拌を１５０ｒｐｍに増加した。ＤＯが再び５０％に達した場合、撹拌を２００ｒｐｍに増加した。気流をカスケード（０Ｌｐｍ〜２４０Ｌｐｍ）することによって、ＤＯを５０％飽和に制御した。２．５Ｎ　Ｈ_２ＳＯ_４および２．５Ｎ　ＫＯＨの自動化された添加によって、ｐＨのセットポイントを７．４に維持した。１５０Ｌ撹拌槽からの３８Ｌのシードを撹拌槽に播種した（５％容量／容量）。
【０３３４】
０．５７０Ｌ／時間のＣａｓｉｔｏｎｅ−オレイン酸メチル給餌溶液の添加を、ＤＯが５０％に達した後に始め（２度目については、播種後およそ１０±５時間）、撹拌槽を回収するまで続けた。バイオリアクターを播種後１０日目に回収した。最終的なエポシロンＤの力価は、約２０±５ｍｇ／Ｌであることが決定された。
【０３３５】
（発酵物の採取手順）
フラスコにおける反応速度実験について、５〜５０ｍＬのよく混合したブロスおよびＸＡＤ樹脂を２５ｍＬピペットを用いて採取し、１０または５０ｍＬのコニカルチューブ中に入れた。バイオリアクターサンプルについて、５０ｍＬのよく混合したブロスおよび樹脂のサンプルを５０ｍＬのコニカルチューブ中に入れる。次いでコニカルチューブを１０分間静置し、ＸＡＤをチューブの底に沈降させた。この時点でのブロスをＸＡＤ樹脂からデカントし得る。ＸＡＤが沈降しない場合、１０〜２５ｍＬピペットを用いてブロスを除去し得る。
【０３３６】
（エポシロン力価定量のためのＸＡＤ樹脂のメタノール抽出）
ＸＡＤ樹脂が試験管の底に重力沈降した後（採取手順により）、上清の全てを新しい５０ｍＬのコニカルチューブに移す。水をもとの５０ｍＬマークまで添加することによって、一度ＸＡＤ樹脂を洗浄し、転倒によってよく混合し、そしてＸＡＤ樹脂を再び重力沈降させる。ＸＡＤを注ぎ出さないよう、試験管から水性混合物をデカントする。最後の数ｍＬの水を、１ｍＬピペットマンを使用して、チップを試験管の底に押し下げることによって除去し得る。このチューブに２５ｍＬの点までメタノールを添加し、このチューブにフタをする。撹拌器上に３０分間（２０〜３０℃で）、水平にコニカルチューブを置いて、ＸＡＤ樹脂から全てのエポシロンを徹底的に抽出する。
【０３３７】
（エポシロン定量のためのＨＰＬＣ手順）
エポシロンＣおよびエポシロンＤの分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＨＰＬＣを用いて、ＵＶ検出を２５０ｎｍにおいて使用して、実施する。ＸＡＤ樹脂からのメタノール抽出溶液（５０μＬ）を、４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、Ｃ１８　ＯＤ　５３、５μｍ）、およびクロマトグラフ分離用の同じ材料の長いカラム（４．６×１５０ｍｍ）の２つに注入した。この方法は、１８分間の実施を通して、６０％アセトニトリルおよび４０％水を用いて、アイソクラチック溶出した。この方法を用いて、エポシロンＤは、１３分で、溶出され、エポシロンＣは、１０．３分で溶出した。標準を発酵ブロスから精製したエポシロンＤを用いて調製した。
【０３３８】
（増殖曲線のための乾燥細胞重量測定手順）
Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心機（ＳＨ−３０００バケットロータを備える）において温度を２０℃にセットする。少なくとも１日の間８０℃のオーブンに入れていた５０ｍＬコニカルチューブを重量測定する。自重重量および発酵サンプル同定物を試験管の側面に記録する。４０ｍＬのブロス（ＸＡＤを含まない）を自重を量ったチューブに注ぐか、ピペットで移す。コニカルチューブを４７００ＲＰＭ（４２００ｇ）で３０分間回転させる。沈降させた後、上清を流し出して、そして細胞ペレットを４０ｍＬの脱イオン水中に再懸濁して、このペレットを洗浄する。再び試験管を回転させる（４２００ｇ、３０分間）。上清をデカントし、試験管を８０℃の乾燥オーブン中に少なくとも２日間置く。試験管の重量を測定し、この試験管に最終的な重量を記録する。次いで、乾燥した細胞重量（ＤＣＷ）を以下の式によって計算する：
ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）＝（最終的な試験管重量（ｇ）−試験管の自重重量（ｇ））／０．０４Ｌ。
【０３３９】
（アンモニウムイオン濃度の決定）
発酵ブロスのアンモニア濃度は、エポシロン発酵物中において、慣用的に評価される。１ｍＬの発酵ブロスは、微量遠心機での遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）によって、浄化される。Ｓｉｇｍａから提供されるアンモニアアッセイキット（カタログ番号１７１−ＵＶ）は、定量に用いられ、浄化された発酵ブロスをキットプロトコールに記載される血漿の代りにする。この比色定量アッセイの直線的応答範囲は、わずか０．０１１７６〜０．８８２ｍｍｏｌ／Ｌであり、この範囲内のアンモニウム濃度をアッセイするため、浄化された発酵サンプルを、典型的には蒸留水中で２０〜１００倍に希釈する。
【０３４０】
（残渣のオレイン酸メチル濃度の決定）
発酵ブロス中に存在する残渣のオレイン酸メチル量は、メタノールを用いて発酵ブロスサンプルを抽出し、そしてこれらの抽出したブロスサンプルをＨＰＬＣにかけることによって推定され得る。オレイン酸メチル濃度の定量は、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＨＰＬＣを用いて、ＵＶ検出を２１０ｎｍにおいて使用して、実施する。全ブロスサンプル（１〜４ｍＬ）を、等容量のメタノールを用いて抽出し、１２，０００ｇで遠心分離して、任意の不溶性成分を沈降させた。浄化された上清（５０μＬ）を４．６×１０ｍｍ抽出カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、Ｃ１８　ＯＤ　５３、５μｍ）に注入し、５０％アセトニトリルで２分間洗浄し、次いで、メインカラム（４．６×１５０ｍｍ、同じ固定相および流速）にて、５０％アセトニトリルで開始し、１００％アセトニトリルで終わる２４分間の勾配で分離する。１００％アセトニトリルカラムフローを５分間維持した。この不均一性質に起因して、オレイン酸メチルは、単一の純粋な化合物としてではなく、多くの別個のピークとして溶出する。しかし、抽出可能な総オレイン酸メチルの約６４〜６７％は、２つの主だったピークに現れ、これらは、それぞれ２５．３±０．２分および２７．１±０．２分で溶出する。メタノール抽出された発酵サンプル中のオレイン酸メチルは、これら２つのピークの合計した面積を定量し、次いで、これらを、５０％水／メタノール中で調製されたオレイン酸メチルの標準でのこれら２つのピークの合計した面積に対して、基準化する。
【０３４１】
（エポシロンＤの精製および結晶化）
本発明は、エポシロンおよびエポシロンＤについての精製プロセス、ならびに高度に精製されたエポシロンＤの調製物（結晶化形態のエポシロンＤを含む）を提供する。本発明のプロセスの利点としては、アルコール（例えば、メタノール）および水のみを必要とする最初の精製工程が挙げられ、これは、生成物のプールの効果的な使用を可能にし、時間および手間のかかる蒸発工程の必要性を最小にする。本発明の方法は、単一の蒸発工程のみを必要とし、これは、１０〜１５ｇのエポシロン毎に、１Ｌのエタノールの蒸発を必要とする。このプロセスにおいて、合成ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（例えば、ＨＰ２０ＳＳ）でパックされたカラムを用いて、極性不純物および脂溶性不純物の両方を除去する。このカラムは、１０％エポシロンを含む中間生成物を生成し、非常に引火性の溶媒または毒性溶媒のいずれかを用いる液体／液体抽出の必要を排除する。
【０３４２】
別の改良は、４０〜６０μｍ粒子分布を有するＣ１８樹脂（例えば、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｃ１８）の使用に関し、これは、低圧のカラムおよびポンプ（５０ｐｓｉ未満）の使用を可能にし、費用を顕著に減少させる。Ｃ１８クロマトグラフィー工程のための出発物質は、希釈された負荷溶媒中で負荷される溶液である。溶媒は、カラムの上端にエポシロンが、高度に濃縮された密なバンドになって、とどまるのに、十分弱く、このことによりカラムは、高負荷下で（２〜５ｇエポシロン／Ｌ　樹脂）に、十分に機能し得る。典型的にカラム負荷は、１ｇ／ｌ以下であり、クロマトグラフィーは通常、精製において最も高価な工程であるため、この改善は、顕著な経費節約を生じる。さらに、本発明の方法は、クロマトグラフィー工程において、アセトニトリルの代りに、アルコール（例えば、メタノール）の使用を可能にする。エポシロンを含むプールは、二成分溶媒系から結晶化され、ここで水は、エポシロンを結晶化形態で提供するためのフォーシング（ｆｏｒｃｉｎｇ　ｓｏｌｖｅｎｔ）溶媒である。
【０３４３】
１つの実施形態において、精製プロセスは、以下の工程および材料からなる。発酵ブロス中のＸＡＤ樹脂は、（１）フィルターバケット中に集められ、（２）溶出されてＸＡＤ抽出物を提供し、これを（３）水で希釈し、そして（４）ＨＰ２０ＳＳカラムを通して、ＨＰ２０ＳＳプールを提供する。ＨＰ２０ＳＳプールを、（５）水で希釈し、（６）Ｃ１８クロマトグラフィーにかけて、エポシロンプールを提供し、これを（７）水で希釈し、そして（８）溶媒交換に供して、濃縮エポシロンプールを提供する。この濃縮エポシロンプールを、（９）木炭濾過に供し、（１０）蒸発させ、そして（１１）結晶化させて、高度に精製された材料を提供する。
【０３４４】
２回の１０００Ｌ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　発酵の実行により、合計１１ｇのエポシロンＤを（１０３１００１Ｋおよび１１１７００１Ｋ）から単離し、白色結晶粉末に精製した。最終産物の純度は、９５％を超え、エポシロンＤの回収率は、７１％であった。
【０３４５】
表１１に、精製の間に使用したＨＰＬＣの方法をまとめる。
【０３４６】
（表１１）
【０３４７】
【表１１】

この節において使用される材料は、以下の通りである。ＨＰ２０ＳＳ樹脂は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉから購入した。Ｃ１８樹脂は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｃ１８から購入（４０ｇ）し、メタノールは、Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｕｌｋ（５５ｇａｌ）から購入した。脱イオン水を用いた。
【０３４８】
（発酵の実行１０３１００１Ｋ）
（工程１　ＸＡＤ溶出（Ｋ１２５−１７３）
１７ＬのＸＡＤ−１６樹脂を１３Ｌ　１５０μｍカプセルバケットを備えたＭａｉｎｓｔｒｅａｍフィルターユニットを用いて、発酵培養物から濾過する。捕捉されたＸＡＤ樹脂を、Ａｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムにパックし、そして６５Ｌ（３．８カラム容量）の水で１．０Ｌ／分で洗浄した。次いで、２３０Ｌの８０％メタノール／水を用いてエポシロンＤ生成物を樹脂から溶出した。
【０３４９】
（工程２　固相抽出（Ｋ１２５−１７５））
７７Ｌの水を工程１の生成物プール（２３０Ｌ）に添加して、負荷溶媒を６０％メタノール／水に希釈した。得られた懸濁液（３０７Ｌ）を混合し、事前に５カラム容量の６０％メタノールで平衡化した５ＬのＨＰ２０ＳＳ樹脂でパックしたＡｍｉｃｏｎ　ＶＡ１８０カラム上に負荷した。負荷する流速は、１Ｌ／分である。負荷した後、カラムを１３Ｌの６０％メタノールで洗浄し、７７Ｌの７５％メタノールを用いて、３２５ｍＬ／分の流速で溶出した。３１個の２．５Ｌの画分を集めた。画分１０〜２６（４２．５Ｌ）は、エポシロンＤを含むことが見出され、これらの画分を一緒にプールした。
【０３５０】
（工程３　クロマトグラフィー（Ｋ１２５−１７９））
工程２の生成物プールを２つの２０−Ｌ　ｒｏｔｏｖａｐを用いて、油になるまで蒸発させた。蒸発の間、発泡を最小にするためにエタノールを添加することが必要であった。乾燥させた材料を、１．０Ｌのメタノールに再懸濁し、０．６７Ｌの水で希釈して、１．６７Ｌの６０％メタノール溶液を作製した。得られた溶液を、事前に３カラム容量の６０％メタノールで平衡化した１−Ｌ　Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５５×４．８ｃｍ）に負荷した。負荷する流速平均は、６４ｍＬ／分であった。負荷されたカラムを１Ｌの６０％メタノールで洗浄し、エポシロンＤ生成物の溶出を、７０％メタノールを用いて流速３３ｍＬ／分で、アイソクラチックに実施した。合計２７画分を集めた（最初の画分は、３．８Ｌ容量を含んでいた）。これに３つの５００ｍＬ画分および２３個の２５０ｍＬ画分が続いた。画分５〜２０を最良のプールとして採用し（Ｋ１２５−１７９−Ｄ）、これは、４．８ｇのエポシロンＤを含んでいた。画分３〜４（Ｋ１２５−１７９−Ｃ）は、１．４ｇのエポシロンＤを含んでいた。このプールはまた、高濃度のエポシロンＣを含むため、再使用のため取っておいた（工程３ｂ）。
【０３５１】
（工程４　クロマトグラフィー（Ｋ１１９−１５３）
高濃度のＣアナログをまた含む、エポシロンＤ画分を以下のように、Ｃ１８樹脂上で、以下のように再びクロマトグラフィーにかけた。２．５×５０ｃｍカラムにＣ１８樹脂をパックし、１Ｌの１００％メタノールで洗浄し、１Ｌの５５％メタノール／水で２０ｍＬ／分の流速で平衡化した。圧力低下は、１２５ｐｓｉであった。出発物質（Ｋ１２５−１７９−Ｃ、１０４０ｍＬ）を、２６０ｍＬの水で希釈して、その結果、負荷溶液は、５５％メタノール／水を含んだ。得られた溶液（１３００ｍＬ）を樹脂に負荷し、さらに２５０ｍＬの５５％メタノールをカラムに通した。カラムをはじめに５Ｌの６５％メタノールで溶出し、続いて、３Ｌの７０％メタノール／水で溶出した。６５％メタノール溶出の間に、全体で４８個の１００ｍＬ画分を回収した。７０％メタノールに切り替えた後、全体で１０個の２５０ｍＬ画分を回収した。最良のエポシロンＤプール（Ｋ１１９−１５３−Ｄ）（画分５０〜５８を含む）は、１．０ｇの所望の生成物を含んだ。
【０３５２】
（工程５ａ　結晶化（Ｋ１１９−１５８））
この工程のための開始物質を、工程３および工程４からのクロマトグラフィー生成物の組み合わせであった。最初、１２０ｍｌのエタノールを、５．５ｇのエポシロンＤを含む７．９ｇの固体に添加した。穏やかに攪拌しながら、この固体を、完全に溶解させ、そしてこの溶液を、ヒューム・フード内の攪拌プレート上に置いた４００ｍＬのビーカーに移した。Ａ１’’攪拌バーを添加し、その溶液を迅速に攪拌した。その間に、１００ｍＬの水を、約５分間かけてゆっくりと添加した。小さな白色結晶の形成を観察した場合、この溶液を、この溶液が白い固体を有して厚くなるまで、１５分以上攪拌した。次いで、このビーカーを、攪拌プレートから取り除き、アルミホイルで覆い、そして冷蔵庫（２℃）に１２時間置いた。この白色固体をＷｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過し、第１のクロップに対してさらなる洗浄を実施しなかった。この固体を、結晶皿に置き、そして真空オーブン（１５ミリバーで４０℃）内で１時間乾燥した。次いで、この物質を、オーブンから取り出し、より微細な粒子にし、そして真空オーブン内でさらに４時間乾燥した。この結晶化プロセスにより、３．４１ｇの灰色の固体を得た。Ｅｐｏ１　ＨＰＬＣ方法を、使用して、最終生成物のクロマトグラフィー純度を決定した。対応するする^１Ｈ　ＮＭＲデータおよび^１３Ｃ　ＮＭＲデータと共に、ＨＰＬＣの結果は、すべて乾燥した物質が、９５％以上のエポシロンＤを含むことを確認した。第１のクロップの回収率は、５８％であった。
【０３５３】
（工程５ｂ　結晶化（Ｋ１１９−１６７））
この工程の開始物質は、工程５ａからのエバポレートされた母液であった。最初、７０ｍｌのエタノールおよび３０ｍｌの水を、２．１ｇのエポシロンＤを含む３．４ｇの固体に添加した。この透明な溶液を、ビーカーに移し、１ｇの脱色した木炭をこれに添加した。この混合物を、中程度の設定で１０分間攪拌し、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過した。木炭を、１０ｍｌのエタノールのアリコートで２回洗浄し、そして再び濾過した。この合わせたろ液を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥し、そして固体を、５０ｍｌのエタノールに再懸濁した。この得られた溶液を、２５０ｍｌのビーカー内に置き、そしてよく攪拌しながら、５０ｍｌの水をゆっくり添加した。結晶形成を促進するために、少量の種結晶（１ｍｇ）を、混合物に添加した。数分間の攪拌後、さらなる白色固体の形成を観察した。攪拌を続けている間、窒素流を、混合物に穏やかに吹き付けるように設置した。１５分後、このビーカーを、２℃の冷蔵庫に３６時間置いた。この混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して、結晶を捕獲し、そしてさらなる７ｍｌの５０：５０　エタノール：水を、使用して、固体を洗浄した。次いで、この結晶を、真空オーブン内で４時間乾燥した。この結晶化工程により、９５％以上のエポシロンＤを含む、１、４６ｇの白色結晶を得た。
【０３５４】
（発酵の実行　１１１７００１Ｋ）
（工程１　ＸＡＤ溶出（Ｋ１２５−１８２））
１７リットル（１７Ｌ）のＸＡＤ−１６樹脂を、１３リットルの１５０μｍの捕獲バスケットを備えるメインストリーム濾過を使用して発酵培養物から濾過した。捕獲したＸＡＤ樹脂を、Ａｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムに充填し、そして１．０Ｌ／分で５８Ｌの（３．４カラム容積）の水を用いて洗浄した。次いで、エポシロンＤ生成物を、１７０Ｌの水中の８０％エタノールを使用して樹脂から溶出した。水での洗浄および第１のカラム容積の溶出の間、カラム背圧は、３００ｍＬ／分に最終流速で、３バールより大きく着実に増大した。従って、ＸＡＤ樹脂を、カラムから取り除き、代替のＡｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムに再充填した。交換後、背圧は、１バー未満に減少し、そして流速は、１．０Ｌ／分を維持した。単一１７０−Ｌ分画を、６００−Ｌステンレス鋼タンクに回収した。ＨＰＬＣ分析に基づいて、工程１の生成物プールは、８．４ｇのエポシロンＤを含むことを見出した。
【０３５５】
（工程２　固相抽出（Ｋ１４５−１５０））
５７リットル（５７Ｌ）の水を、工程１の生成物プール（１７０Ｌ）に添加して、ロード溶媒を水中の６０％メタノールに希釈した。得られた懸濁液（２２７Ｌ）を、オーバーヘッドライトニングミキサーを使用して攪拌し、そして以前にカラム容積の５倍の６０％のメタノールで平衡化した６．５ＬのＨＰ２０ＳＳ樹脂を充填したＶＡ１８０カラムにロードした。ロード流速は、１Ｌ／分であった。ロード後、このカラムを、１６Ｌの６０％メタノールで洗浄し、そして３００ｍＬ／分の流速で８４Ｌの７５％メタノールで溶出した。７つの画分を、それぞれ、１８Ｌ、６Ｌ、６Ｌ、６Ｌ、３６Ｌおよび６Ｌを回収した。全量８．８ｇのエポシロンＤを含む、画分を、一緒にプールした。
【０３５６】
（工程３　クロマトグラフィー（Ｋ１４５−１６０））
工程２の生成物プールを、２つの２０Ｌ　ｒｏｔｏｖａｐを使用して油状物になるまでエバポレートした。エバポレーションプロセスの間の起泡を最小にするために、１０Ｌのメタノールを物質に添加した。乾燥した混合物を、２．８Ｌのメタノールに再懸濁し、そして３．４Ｌの水で希釈して、６．２Ｌの４５％　メタノールを作製した。この得られた溶液を、以前に、カラム容積の５倍量の４５％　メタノールで平衡化した１−Ｌ　Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５５×４．８ｃｍ）にポンピングした。ロード流速は、１００ｍＬ／分に平均した。ロードしたカラムを、１リットルの６０％　メタノールで洗浄し、そしてエポシロンＤ生成物を、１００ｍＬ／分の流速で段階勾配を使用して樹脂から溶出した。このカラムを、５Ｌの５５％　メタノール、１１．５Ｌの６０％　メタノールおよび１３．５Ｌの６５％　メタノールを使用して溶出した。５５％　メタノール溶出の間、全部で５００ｍＬの画分を回収した。６０％　メタノールに変更後、全部で２３個の５００ｍＬの画分を回収した。最終の６５％　メタノール溶出の間、１１個の５００ｍＬの画分を回収し、その後、８個の１Ｌの画分を回収した。画分２８〜５０からなる、この最良のエポシロンＤプール（Ｋ１４５−１６０−Ｄ）は、８．３ｇの所望の生成物を含む。０．４ｇのエポシロンＣを混入した画分２６〜２７（Ｋ１４５−１６０−Ｃ）は、０．２ｇのエポシロンＤを含む。これらの２５画分のすべてを合わせた。
【０３５７】
生成物プールを、水中の４０％のメタノールに希釈するために、９．５Ｌの水を１５．８Ｌのロード溶液に添加した。次いで、この得られた溶液（２５．３Ｌ）を、以前に、カラム容積の４倍量の４０％　メタノールで平衡化した７００ｍＬのＣ１８　クロマトグラフィーカラム（９×１０ｃｍ）にポンピングした。ロード流速は、平均して３６０ｍＬ／分であった。このロードされたカラムを１リットルの４０％　メタノールで洗浄し、そしてエポシロンＤ生成物を、３．７５Ｌの１００％　メタノールを用いて樹脂から溶出した。この溶出物を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥するまでエバポレートした。この固体を、１００ｍＬのアセトンに再懸濁し、そして溶解しなかった物質を、Ｗｈａｔｍａｎ＃２ろ紙を使用して溶液から濾過した。この濾過された粒子を、さらなる１１５ｍＬのアセトンで洗浄し、そしてもう１度、濾過した。アセトン抽出後、２ｇの脱色木炭を合わせたろ液に添加した。この混合物を、中程度の設定で１時間攪拌し、そしてＷｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過した。この木炭を、１８０ｍＬのエタノールで洗浄し、そして再び濾過した。このろ液を、一緒にプールし、そして乾燥までエバポレート（ｒｏｔｏｖａｐｅ）した。
【０３５８】
（工程４　クロマトグラフィー（Ｋ１１９−１７４））
工程３からの乾燥した物質を、５．０Ｌの水中の５０％　メタノールに再懸濁し、そして以前に、カラム容積の３倍の５０％　メタノールで平衡化した１−Ｌ　Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５５×４．８ｃｍ）にロードした。ロード流速は、平均して８０ｍＬ／分であった。次いで、カラムを、１リットルの５０％　メタノールで洗浄し、エポシロンＤ生成物を、同じ流速で７０％　メタノールを使用して樹脂から一様に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）に溶出した。全部で４８の画分を、回収した（２４０ｍＬを含む最初の４７画分および１Ｌを含む最後の画分を含む）。画分２５〜４８を、７．４ｇのエポシロンＤを含む、最良のプール（Ｋ１１９−１７４−Ｄ）として得た。画分２１〜２４（Ｋ１１９−１７４−Ｄ）は、１．１ｇのエポシロンＤを含むので、このプールはまた、高濃度のエポシロンＤを含む、これは、再作業を無視した。
【０３５９】
（工程５　結晶化（Ｋ１１９−１７７））
結晶化工程の前に溶媒の交換を実施するために、３．９Ｌの水を、工程５からの６．４Ｌの最良のエポシロンＤ（Ｋ１１９−１７４−Ｄ）に添加して、水中の４０％　メタノールにロード溶液を希釈した。次いで、この得られた溶液を、以前にカラム容積の３倍の４０％　メタノールで平衡化した２００−ｍＬ　Ｃ１８　クロマトグラフィーカラム（２．５×１０ｃｍ）にロードした。このコードしたカラムを、２００ｍＬの４０％　メタノールで洗浄し、そしてエポシロンＤ生成物を、１Ｌの１００％　エタノールで樹脂から溶出した。この溶出液を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥するまでエバポレートし、そしてこの固体を、１５０ｍＬの１００％　エタノールに再懸濁した。この透明な溶液を、ビーカーに移し、そしてよく攪拌しながら、１７５ｍＬの水を、ゆっくり添加した。少しの種結晶（１ｍｇ）をまた、この溶液に添加して、結晶の形成を促進した。小さな白色結晶の形成を観察した場合、この溶液を、この溶液が白い固体を含んで厚くなるまで、１５分間以上攪拌した。次いで、ビーカーを、攪拌プレートから取り除き、アルミホイルで覆い、そして冷蔵庫（２℃）内で１２時間置いた。白色固体を、Ｗｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過し、そして第１のクロップにおいてさらなる洗浄は、実施しなかった。この固体を、結晶皿に移し、真空オーブン（１５ミリバーで４０℃）で６時間乾燥した。この結晶化プロセスにより、９５％以上のエポシロンＤを含む、６．２ｇの白色固体を得た。この第１のクロップの回収は、７４％であった。
【０３６０】
（結果）
ラン１０３１００１Ｋに関するエポシロンＤの回収は、約９７．５〜９８．８％の純度において４．８ｇの結晶物質であった。ラン１１７００１Ｋに関するエポシロンＤの回収は、約９７．７％の純度において６．２ｇの結晶物質であった。これらのランに関する不純度プロフィールを、表１２に示す。
【０３６１】
【表１２】

「Ｅｐｏ４９０」は、本発明の新規のエポシロン化合物（１０，１１−デヒドロエポシロンＤ）であり、これは、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞によって産生された。
【０３６２】
この精製方法論は、エポシロンＤ精製プロセスに対してなされる改変をスケールアップして、醗酵培地中のオレイン酸メチルの使用を適合させる努力から生じた。ＸＡＤ樹脂からのエポシロンＤ生成物の溶出を、直接的な様式で実行した。１００％のメタノールを使用する代わりに、カラム容量の１０倍の８０％　メタノールを使用して、カラムのビーズから生成物を溶出した。ＸＡＤ溶出工程の間、醗酵ブロス中の溶解した細胞の存在は、精製カラムの詰まりの原因になり得ることに留意した。１０３１００−１Ｋ醗酵ランの回収は、有意な細胞溶解が起こる前に実施したが、１１１７００−１Ｋ醗酵ランを、かなり細胞溶解が起こった後にのみ回収した。しかし、高背圧および低流速を、溶出工程後のより後のランにのみ観察した。従って、このランにおける溶解した細胞は、凝集し、次いでカラムフィルターを汚し得るようである。
【０３６３】
これらの精製ランは、エポシロンＤが、少なくとも１日間、８０％　メタノール中で室温で安定であることを示す。ＨＰＬＣ分析に基づいて、これらの条件下での生成物の分解は、検出されなかった。これらの知見は、冷蔵なしに、一晩ステンレス鋼タンクにおいてＸＡＤ溶出工程からの１７０Ｌ生成物プールの保存を可能にした。このプロセスをさらに改善するために、溶媒交換カラムを使用し、これは、消費する時間を少なくし、そしてある容積の生成物プールの濃縮におけるｒｏｔｏｖａｐの使用よりも過度の労働を少なくする。従って、当業者は、大規模なエバポレーションと溶媒交換工程とを交換し得る。
【０３６４】
有意な量の油が、ＸＡＤ溶出工程の間樹脂に結合したままであったが、相当な量がまだ、溶出物中に残っていた。ＨＰ２０ＳＳ固相抽出の後でさえ、オイル小滴は、生成物プールにおいて明らかに可視であり、そしてＣ１８　クロマトグラフィーの間、問題であることを証明した。最適なクロマトグラフィーの能力に関して、ロード溶液中のエポシロンＤの濃度は、２ｇ／Ｌ未満に維持すべきである。より高い濃度において、開始物質は、カラムにオイルオウト（ｏｉｌ　ｏｕｔ）する傾向を有する。
【０３６５】
結晶化は、供給物質が、３％より多いエポシロンＣかまたｅｐｏ４９０かのいずれかを含む場合、不可能である。これは、１１１７００１Ｋの精製の間の場合であった。第１のクロマトグラフィー工程は、５％のエポシロンＣの生成物を与えた。多数の試みの後、この物質の結晶化を達成しなかった。しかし、この物質を第２のクロマトグラフィー工程に供することは、エポシロンＣを１％に減少し、そして簡単に結晶化される供給物質を生成した。
【０３６６】
（実施例４）
（非機能的ｅｐｏＫ遺伝子を有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株の構築）
Ｋ１１１−４０−１株を、ｅｐｏＫ遺伝子の挿入不活化によってＫ１１１−３２．２５株から構築した。このｅｐｏＫ変異体を構築するために、カナマイシン耐性カセットを、ｅｐｏＫ遺伝子に挿入した。これを、ｐＫＯＳ３５−７９．８５から４８７９ｂｐフラグメントを単離することによって行った。このｐＫＯＳ３５−７９．８５は、ｅｐｏＫを含み、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋のＮｏｔＩにこれを連結した。このプラスミド（ｐＫＯＳ３５−８３．５）を、ＳｃａＩで部分的に切断し、そして７．４ｋｂフラグメントを、ｐＢＪ１８０−２（これは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑化したＤＮＡ末端を有する）からカナマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを連結して、プラスミドｐＫＯ９０−５５を得た。最後に、ｐＢＪ１８３から約４００ｂｐのＲＰ４　ｏｒｉＴ　フラグメントを、ＸｂａＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位に連結して、ｐＫＯＳ９０−６３を作製した。このプラスミドを、ＤｒａＩを直線化し、そしてＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−３２．２５にエレクトロポレーションし、そして形質転換体を、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０．１を提供するために選択した。Ｋ１１１−４０．１株を、ブダペスト条約に従って、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９．ＵＳＡに寄託し、そして登録番号ＰＴＡ−２７１２において入手可能である。
【０３６７】
マーカーのないｅｐｏＫ変異体を作製するために、ｐＫＯＳ３５−８３．５を、ＳａｃＩで切断し、そして２．９ｋｂフラグメントおよび４．３ｋｂフラグメントを、一緒に連結した。このプラスミド（ｐＫＯＳ９０−１０１）は、ｅｐｏＫにおいてインフレーム欠失を有する。次いで、ＫＧ２から３ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントおよびＮｄｅＩフラグメント（これは、ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑化したＤＮＡ末端を有し、そしてカナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子を含む）を、ｐＫＯＳ９０−１０１のＤｒａＩ部位に連結して、ｐＫＯＳ９０−１０５を作製した。このプラスミドを、Ｋ１１１−３２．２５にエレクトロポレーションし、カナマイシン耐性エレクトロポレーション物を、選択した。ｅｐｏＫの野生型コピーと欠失とを置換するために、第２の組換え現象を、ガラクトースプレート上に増殖によって選択した。これらのガラクトース耐性コロニーを、エポシロンＣおよびエポシロンＤの生成に関して試験し、そして生成した株を、Ｋ１１１−７２．４．４と命名し、そしてブダペスト条約に従って、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９．ＵＳＡに寄託し、そして登録番号ＰＴＡ−２７１３において入手可能である。
【０３６８】
（実施例５）
（ｍａｔＢＣの添加）
ｍａｔＢＣ遺伝子は、それぞれ、マロニル−ＣｏＡシンターゼおよびジカルボキシレートキャリアタンパク質をコードする。ＡｎおよびＫｉｍ．１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７：３９５−４０２（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。これらの２つのタンパク質は、細胞内の内在性のマレイン酸を、マロニル−ＣｏＡに変換する原因である。２つの遺伝子の生成物は、ジカルボン酸を移し、そしてこれらを、ＣｏＡ誘導体に変換し得る（ＰＣＴ特許出願番号ＵＳ００／２８５７３、本明細書において参考として援用される）。これら２つの遺伝子を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓの染色体に挿入して、マロニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡの細胞内濃度を増大させ、ポリケチド生成を増大し得る。これは、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩでｐＭＡＴＯＰ−２を切断し、そしてｐＫＯＳ３５−８２．１（テトラサイクリン耐性付与遺伝子、Ｍｘ８　ａｔｔ部位、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓプロモーターを含む）のＢｇｌＩＩ部位およびＳｐｅＩにこれを連結し、そして、ｍａｔＢＣの発現を駆動することによって達成される。このプラスミドを、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓにエレクトロポレーションし得る。ｐｉｌＡプロモーターは、高度に翻訳されるので、ＭａｔＢおよびＭａｔＣは、細胞増殖に影響を与え過ぎる現象においてより弱いプロモーターを挿入する必要があり得る。代替のプロモーターは、カナマイシン耐性付与遺伝子のプロモーターを含む。
【０３６９】
（実施例６）
（ロードモジュールにおけるＫＳ^Ｙの変異）
エポシロン生合成の開始の提案された機構は、ロードドメインのＡＣＰへのマロイン酸の結合、次いで、ロードＫＳドメインによるデカルボキシル化である。このロードＫＳドメインは、縮合反応を実施し得ない活性部位シトシン（ＫＳ^Ｙ）においてチロシンを含む。しかし、まだ、デカルボキシル化反応を起こすと考えられる。ラット脂肪酸シンゼターゼを用いる実験は、活性シトシン（ＫＳ^Ｑ）におけるグルタミンを含むＫＳドメインは、２オーダーの大きさのデカルボキシル化を増大し、それによって、セリン、アラニン、アスパラギン、グリシンまたはスレオニンへのこのアミノ酸の変更は、野生型と比較して増加を生じなかったことを示した。従って、ＫＳ^ＹをＫＳ^Ｑに変更することは、エポシロン生成の増加を生じるエポシロンのプライミングを増加し得る。Ｋ１１１−３２．２５株における変更を作製するために、約８５０ｂｐのエポシロンＫＳロードモジュールコード配列プラスミドを有するｐＫＯＳ３９−１４８を構築した。ＫＳ^Ｑ変異を、部位特異的突然変異誘発によってこのプラスミドにおいて生成した。Ｋ１１１−３２．２５における遺伝子置換を実施するために、ＫＧ２由来のカナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子を、ｐＫＯＳ３９−１４８のＤｒａＩ部位に挿入して、プラスミドｐＫＯＳ１１１−５６．２ＡおよびプラスミドｐＫＯＳ１１１−５６．２Ｂを作製した。プラスミドは、カナマイシン―ｇａｌＫカセットの方向とは異なる。これらのプラスミドを、Ｋ１１１−３２．２５にエレクトロポレートし、そしてカナマイシン耐性コロニーを、選択して、Ｋ１１１−６３株を作製した。野生型ロードモジュールＫＳに置換するために、Ｋ１１１−６３を、ＣＹＥガラクトースプレートにプレートし、そしてコロニーを、ＰＣＲおよび配列決定によってＫＳ^Ｑ変異体の存在についてスクリーニングした。
【０３７０】
（実施例７）
（ｍｔａＡの添加）
ホスホパンテテニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）タンパク質のレベルを増加するために、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ株ＤＷ４由来のＰＰＴａｓｅを、Ｋ１１１−３２．２５に添加し得る。これを、プライマー１１１−４４．１（ＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＧＧＣ）およびプライマー１１１−４４．４（ＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＴ）を使用するＤＷ４染色体ＤＮＡからのｍｔａＡのＰＣＲ増幅によって行った。Ｓｉｌａｋｏｗｓｋｉら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５２）：３７３９１−３７３９９（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。約８００ｂｐのフラグメントを、ＮｃｏＩで切断し、そしてＰｓｔＩで切断したｐＵＨＥ２４−２Ｂに連結し、ＤＮＡ末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑化し、そしてＮｃｏＩで切断した。このプラスミドを、ｐＫＯＳ１１１−５４と命名した。ｍｔａＡ遺伝子を、プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１（テトラサイクリン耐性付与遺伝子Ｍｘ８　ａｔｔ部位、およびＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　ｐｉｌＡプロモーターを含む）に移動させて、ｍｔａＡの発現を駆動した。このプラスミドを、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓに導入し、そしてＭｘ８ファージ結合部位に組み込んだ。
【０３７１】
（実施例８）
（プロモーター置換プラスミドの構築）
エポシロン生成レベルを改善するために、そして本発明の宿主細胞におけるＰＫＳ遺伝子を発現するために使用され得る広範の種々のプロモーターを例示するために、ベクターおよび宿主細胞のシリーズを構築して、この実施例に記載されるように、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍエポシロンＰＫＳ遺伝子を他の適切なプロモーターと置換し得る。
【０３７２】
（Ａ．下流の結合領域を有するプラスミドの構築）
コスミドｐＫＯＳ３５−７０．８Ａ３をＮｓｉＩおよびＡｖｒＩで切断した。９．５ｋｂのフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＡｖｒＩＩで切断したｐＳＬ１１９０で連結して、ｐＫＯＳ９０−１３を得た。プラスミドｐＫＯＳ９０−１３は、約１２．９ｋｂである。プラスミドｐＫＯＳ９０−１３を、ＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩを切断した。５．１ｋｂのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結して、ｐＫＯＳ９０−６４（約８．１ｋｂ）を作製した。このプラスミドは、プロモーターに関する下流隣接領域（開始コドンのｅｐｏＡおよびいくつかの配列上流）を含む。ＥｃｏＲＩ部位は、ｅｐｏＡ遺伝子に関する開始コドンから約２２０ｋｂ上流である。ＡｖｒＩＩ部位は、ＥｃｏＲＩ部位から５１００ｂｐ下流である。
【０３７３】
（Ｂ．上流隣接領域のクローニング）
プライマー９０−６６．１およびプライマー９０−６７（以下に示す）を，使用して、上流隣接領域にクローニングした。プライマー９０−６７は、ＰＣＲフラグメントの５‘末端にあり、そして９０−６６．１は、ＰＣＲフラグメントの３’末端にある。フラグメントは、ｅｐｏＡ遺伝子に関する開始コドンの前に２４８１ｂｐで終わる。約２．２ｂｐフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。クレノウポリメラーゼを添加して、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で平滑化した。このフラグメントを、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位に連結した。適切な方向でのクローン（挿入物に下流末端にＥｃｏＲＩおよび挿入物の上流末端にＨｉｎｄＩＩＩを有する）を、選択し、そしてｐＫＯＳ９０−９０と命名した。
【０３７４】
【化３２】

（Ｃ．最終プラスミドの構築）
プラスミドｐＫＯＳ９０−９０を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。２．２ｋｂのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＯＳ９０−６４と連結して、ｐＫＯＳ９０−９１（１０．３ｋｂ）を作製した。プラスミドｐＫＯＳ９０−９１は、プロモーターの上流隣接領域、続いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に下流隣接領域を含む。目的のプロモーターをクローニングするためのＰａｃＩ部位が、２つの隣接領域の間に存在する。次いで、ｇａｌＫ／ｋａｎ^ｒカセットを、組換えを可能にするようにＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに挿入した。プラスミドｐＫＯＳ９０−９１を、ＤｒａＩで切断した。ＤｒａＩは、ａｍｐ遺伝子中で一回、ベクター中で２回（ａｍｐ遺伝子のそば）切断する。プラスミドＫＧ−２を、ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを添加してフラグメントを平滑末端化した。３ｋｂのフラグメント（ｇａｌＫ／ｋａｎ^ｒ遺伝子を含む）を、ｐＫＯＳ９０−９１の約９．８ｋｂのＤｒａＩフラグメントと連結して、ｐＫＯＳ９０−１０２（１２．８ｋｂ）を作製した。
【０３７５】
（Ｄ．代替のリーダーを有するプラスミドの構築）
エポシロンＰＫＳ遺伝子のネイティブなリーダー領域を、異なるリボソーム結合部位を有するリーダーと置換し得る。プラスミドｐＫＯＳ３９−１３６（１９９９年１１月１９日に出願された、米国特許出願番号０９／４４３，５０１中に記載される）を、ＰａｃＩ／ＡｓｃＩで切断した。リーダー配列およびｅｐｏＡの一部を含む３ｋｂのフラグメントを単離し、そしてｐＫＯＳ９０−１０２の９．６ｋｂ　ＰａｃＩ／ＡｓｃＩフラグメントと連結してｐＫＯＳ９０−１０６（約１２．７ｋｂ）を作製した。
【０３７６】
（Ｅ．プロモーター置換プラスミドの構築）
（Ｉ．ＭＴＡ（ミクソチアゾール（ｍｙｘｏｔｈｉａｚｏｌ）プロモーター）　ミクソチアゾールプロモーターを、プライマー１１１−４４．３および１１１−４４．５（以下に記載される）を使用して、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ染色体ＤＮＡ（菌株ＤＷ４）からＰＣＲ増幅した。約５５４ｂｐのバンドを、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングして、ｐＫＯＳ９０−１０７を作製した。プラスミドｐＫＯＳ９０−１０７を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。５６０ｂｐのバンドを、ｐＫＯＳ９０−１０２にクローニングし、そしてｐＫＯＳ９０−１０６を、ＰａｃＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した（ＰａｃＩはｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６中で一度のみ切断する）。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ＭＴＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１４（１３．３６ｋｂ）と名付け、そしてＭＴＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１３（１３．２６ｋｂ）と名付けた。
【０３７７】
【化３３】

これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３７８】
（ＩＩ．ＴＡプロモーター）
推定の転写アンチターミネーターをコードするｔａＡと共にＴＡについての推定のプロモーターを、以下のプライマーを使用するＴＡ菌株からＰＣＲ増幅した：
【０３７９】
【化３４】

約１．１ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、そしてＢａｍＨＩで切断したｐＮＥＢ１９３に連結した。このプラスミドを、ｐＫＯＳ１１１−５６．１と名付けた。プラスミドｐＫＯＳ１１１−５６．１を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。約１．１ｋｂのバンドを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６中にクローニングして、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した（ＰａｃＩは、ｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６中で一度のみ切断する）。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ＴＡプロモーター／９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１５（１３．９ｋｂ）と名付け、ＴＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１１（１３．８ｋｂ）と名付けた。
【０３８０】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８１】
（ＩＩＩ．ｐｉｌＡプロモーター）
プラスミドｐＫＯＳ３５−７１Ｂを、ＥｃｏＲＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。８００ｂｐのフラグメントを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６にクローニングし、Ｋｌｅｎｏｗを充填した。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ｐｉｌＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２０（１３．６ｋｂ）と名付け、ｐｉｌＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２１（１３．５ｋｂ）と名付けた。
【０３８２】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８３】
（ＩＶ．ｋａｎプロモーター）
プラスミドｐＢＪ１８０−２を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。３５０ｂｐのフラグメントを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６にクローニングし、Ｋｌｅｎｏｗを充填した。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ｋａｎプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２６（１３．１５ｋｂ）と名付け、ｋａｎプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２２（１３．０５ｋｂ）と名付けた。
【０３８４】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８５】
（Ｖ．Ｓｏ　ｃｅ９０プロモーター）
Ｓｏ　ｃｅ９０プロモーターを、プライマー１１１−４４．６および１１１−４４．７（以下に示す）を使用してＳｏ　ｃｅ９０染色体ＤＮＡから増幅した。約９００ｂｐのバンドを、ＰａｃＩで切断し、そしてＰａｃＩで切断したｐＮＥＢ１９３にクローニングしてｐＫＯＳ９０−１２５を作製した。プラスミドｐＫＯＳ９０−１２５を、ＰａｃＩで切断した。９２４ｂｐのバンドを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６にクローニングした。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。Ｓｏｃｅ９０プロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２７（１３．６ｋｂ）と名付け、Ｓｏｃｅ９０プロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２８（１３．７ｋｂ）と名付けた。
【０３８６】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８７】
【化３５】

（実施例９：ＫＳ２ノックアウト菌株の構築）
本実施例は、エポシロンＰＫＳ誘導体の構築を記載する。ここで、拡張モジュール２のＫＳドメインを、活性部位のシステインコドンをアラニンコドンに変化する変異によって不活化する。得られた誘導体ＰＫＳを（以下の実施例に記載されるような）合成前駆体に提供して、本発明のエポシロン誘導体を作製する。
【０３８８】
エポシロンＰＫＳ遺伝子の下流隣接領域を、以下のプライマー：
【０３８９】
【化３６】

を使用してプラスミドｐＫＯＳ３５−７８．２からＰＣＲ増幅した。約２ｋｂのＰＣＲ産物を、ＮｓｉＩ／ＸｂａＩで切断し、そしてＮｓｉＩおよびＳｐｅＩで消化したｐＳＬ１１９０と連結してｐＫＯＳ９０−１２３（約５．４ｋｂ）を作製した。以下のプライマー：
【０３９０】
【化３７】

でｐＫＯＳ３５−７８．２ＤＮＡから増幅した約２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、ＮｓｉＩで切断し、そしてＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＶで消化したｐＫＯＳ９０−１２３と連結してｐＫＯＳ９０−１３０（約７．５ｋｂ）を作製した。このプラスミドをＮｓｉＩで切断して、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントでＤＮＡ末端を平滑末端化して再連結する場合に、プラスミドｐＫＯＳ９０−１３１を作製する。ｇａｌＫ／ｋａｎ^ｒカセットをこのプラスミドにクローニングするために、プラスミドＫＧ−２を、ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化する。３ｋｂのフラグメントを、ｐＫＯＳ９０−１３１のＤｒａＩ部位（ＤｒａＩは、このベクター中で３回切断する）にクローニングして、プラスミドｐＫＯＳ９０−１３２（１０．５ｋｂ）を作製する。ＫＳ２ノックアウトをもたらすシステインからアラニンへの所望の変化を作製する目的で、ＮｓｉＩ部位を使用する。ｐＫＯＳ９０−１３０をＮｓｉＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩからのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化して再連結する場合に、システインについてのコドンを、アラニンについてのコドンに置換する。所望の菌株を作製するために上記のプロトコールに従って、得られたプラスミドを、本発明のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ菌株に導入し得る。
【０３９１】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ９０−１３２．１．１．２を、この手順（エポシロンＡ、Ｂ、ＣおよびＤプロデューサーＫ１１１−３２．２５を使用する）によって構築し、そしてブダペスト条約の規約の下、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託し、ここから受託番号ＰＴＡ−２７１５の下に得ることができる。この株によって生成される得られたＰＫＳ産物が、適切な「ジケチド」開始単位が提供される場合にエポシロンを合成し得ることを実証するために、株Ｋ９０−１３２．１．１．２を３０℃で３日間５０ｍｌのＣＴＳおよび２０％のＸＡＤ中で増殖させ、次いで以下に示すチアゾールジケチドの２００ｍｇ／ｍＬを提供した：
【０３９２】
【化３８】

この株を、さらに５日間培養し、そしてＸＡＤを収集し、そしてエポシロンを１０％メタノールで抽出した。この抽出物を乾燥させ、そして０．２ｍＬのアセトニトリルに再懸濁し、そして０．０５ｍＬのサンプルを、ＬＣ／ＭＳによって分析し、これは予測されたようにエポシロンＢおよびＤの存在を示した。以下の実施例に議論されるように、この系を使用して種々のエポシロンアナログを生成し得る。
【０３９３】
（実施例１０）
（化学的生合成からの改変エポシロン）
本実施例は、化学的生合成を介したエポシロン誘導体の生成のための一連のチオエステルを記載する。Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ由来のエポシロンのための生合成遺伝子クラスターのＤＮＡ配列は、ＰＫＳのプライミングがポリケチドおよびアミノ酸成分の混合物を含むことを示す。プライミングは、マロニルＣｏＡを有するローディングモジュールのＰＫＳ様部分のローディング、その後の脱カルボキシル化および伸長モジュール１ＮＲＰＳ（システインを有する）のローディングを含み、次いで、酵素結合Ｎ−アセチルシステインを形成するための縮合を含む。チアゾリンを形成するための環化の後に、酵素結合２−メチルチアゾル−４−カルボキシレート（ローディングモジュールおよびＮＲＰＳの生成物）を形成するための酸化を行う。続くモジュール２のケトシンターゼによるメチルマロニルＣｏＡでの縮合は、スキーム６に示すようなジケチドの等価物を提供する。
【０３９４】
【化３９】

本発明は、ＰＣＴ公開番号９９／０３９８６および同９７／０２３５８において６−ｄＥＢおよびエリスロマイシンアナログを作製するために記載された様式と同様の様式でエポシロン誘導体を生成するための化学的生合成のための方法および試薬を提供する。供給基質の２つの型を提供する：ＮＲＰＳ生成物のアナログ、およびジケチド等価物のアナログ。ＮＲＰＳ生成物アナログを、変異ＮＲＰＳ様ドメインを有するＰＫＳ酵素と共に使用し、そしてジケチド等価物を、モジュール２中に変異ＫＳドメインを有するＰＫＳ酵素と共に使用する（実施例９に記載のように）。以下のスキーム７および８中の構造において、Ｒ、Ｒ_１およびＲ_２は、メチル、エチル、低級アルキル（Ｃ_１−Ｃ_６）、および置換された低級アルキルからなる群より独立して選択され得る。
【０３９５】
スキーム７は、例示的なローディングモジュールアナログを示す。
【０３９６】
【化４０】

ローディングモジュールアナログを、対応するカルボン酸の活性化およびＮ−アセチルシステアミンでの処理によって調製する。活性化方法は、酸塩化物の形成、混合無水物の形成、またはカルボジイミドのような縮合試薬との反応を含む。
【０３９７】
スキーム８は、例示的なジケチド等価物を示す。
【０３９８】
【化４１】

ジケチド等価物を、三段階のプロセスで調製する。第一に、対応するアルデヒドを、置換されたアクリルエステルを形成するためにＷｉｔｔｉｇ試薬または等価物で処理する。このエステルを酸にケン化し、次いで、これを活性化してＮ−アセチルシステアミンで処理する。
【０３９９】
ローディングモジュール生成物アナログおよびジケチド等価物を作製するための例示的な反応スキームが続く。ジケチド等価物を作成するために適切なさらなる化合物を、本発明の宿主細胞に供給するためのＮ−アセチルシステアミドに変換されるカルボン酸（またはカルボン酸に変換され得るアルデヒド）として図１に示す。
【０４００】
（Ａ．チオフェン−３−カルボキシレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のチオフェン−３−カルボン酸（１２８ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．５０ｍＬ）で処理した。１時間後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２５ｍＬ）を添加し、そして反応を１２時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ_４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテルの次に酢酸エチルを使用するＳｉＯ_２でのクロマトグラフィーによって純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０１】
（Ｂ．フラン−３−カルボキシレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のフラン−３−カルボン酸（１１２ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．５０ｍＬ）で処理した。１時間後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２５ｍＬ）を添加し、そして反応を１２時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ_４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテルの次に酢酸エチルを使用するＳｉＯ_２でのクロマトグラフィーによって純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０２】
（Ｃ．ピロール−２−カルボキシレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のピロール−２−カルボン酸（１１２ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．５０ｍＬ）で処理した。１時間後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２５ｍＬ）を添加し、そして反応を１２時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ_４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテルの次に酢酸エチルを使用するＳｉＯ_２でのクロマトグラフィーによって純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０３】
（Ｄ．２−メチル−３−（３−チエニル）アクリレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
（１）２−メチル−３−（３−チエニル）アクリル酸エチル：乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のチオフェン−３−カルボキサルデヒド（ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）（１．１２ｇ）および（カルベトキシエチリデン（ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｅｔｈｌｉｄｅｎｅ））トリフェニルホスホラン（４．３ｇ）の混合物を、還流で１６時間加熱した。この混合物を周辺温度まで冷却し、そして減圧下で濃縮して乾燥した。この固体残渣を１：１のエーテル／ヘキサン中に再懸濁し、そして濾過して酸化トリフェニルホスフィンを除去した。この濾過物を、１：１のエーテル／ヘキサンを使用してＳｉＯ_２のパッドを通して濾過して、淡黄色の油状物として生成物（１．７８ｇ、９１％）を提供した。
【０４０４】
（２）２−メチル−３−（３−チエニル）アクリル酸：（１）由来のエステルを、メタノール（５ｍＬ）および８Ｎ　ＫＯＨ（５ｍＬ）の混合物中に溶解し、そして還流で３０分間加熱した。この混合物を周辺温度まで冷却し、水で希釈し、そしてエーテルで２回洗浄した。この水相を、１Ｎ　ＨＣｌを使用して酸性化し、次いで等量のエーテルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して乾燥した。２：１のヘキサン／エーテルからの結晶化は、無色の針状物として生成物を提供した。
【０４０５】
（３）２−メチル−３−（３−チエニル）アクリレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル：不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中の２−メチル−３−（３−チエニル）アクリル酸（１６８ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．５６ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．４５ｍＬ）で処理した。１５分後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．１５ｍＬ）を添加し、そして反応を４時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ_４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。酢酸エチルを使用するＳｉＯ_２でのクロマトグラフィーは、純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０６】
上記の化合物を、本発明の組換えエポシロンＰＫＳを含む宿主細胞の培養物に補充し、ここで、伸長モジュール２のＮＲＰＳまたはＫＳドメインのいずれかが、本発明の対応するエポシロン誘導体を調製するために、変異によって不活化されている。
【０４０７】
（実施例１１）
（エポシロンアナログの生成）
（Ａ．１３−ケト−エポシロンアナログの生成）
エポシロンＰＫＳの伸長モジュール４におけるＫＲドメインの不活化は、１３−ケト−エポシロンの生成に有用な本発明のハイブリッドＰＫＳを生じる。伸長モジュール４ＫＲドメインを、野生型遺伝子を以下に記載の種々の欠失バージョンで置換することによって改変した。第一に、フラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂ（コスミドｐＫＯＳ３５−７０．４由来のｅｐｏＤ遺伝子のサブクローン）を使用して増幅した。欠失の左側を形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＬ３およびＴＬ４であり、以下に示す：
【０４０８】
【化４２】

欠失の右側を形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＬ５およびＴＬ６であり、以下に示す：
【０４０９】
【化４３】

ＰＣＲフラグメントをベクターＬｉｔｍｕｓ　３９にクローニングし、そして配列決定して所望のフラグメントが得られたことを確認した。次いで、ＴＬ３／ＴＬ４フラグメントを含むクローンを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして約４．６ｋｂのフラグメントを単離した。プライマーＴＬ５／ＴＬ６を使用して得られた２．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで処理し、次いで、（ｉ）「短い」ＫＲリンカーＴＬ２３およびＴＬ２４（これらは、共にアニールされて一本鎖の突出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する二本鎖のリンカーを形成する）に連結してｐＫＯＳ１２２−２９を得るか；または（ｉｉ）「長い」（ｅｐｏＤＨ３^＊）リンカー（プライマーＴＬ３３＋ＴＬ３４を使用するＰＣＲ、次いで制限酵素ＮｓｉＩおよびＳｐｅＩでの処理によって得られる）に連結し、プラスミドｐＫＯＳ１２２−３０を得るかのいずれかであった。これらのオリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーの配列を、以下に示す：
【０４１０】
【化４４】

。
【０４１１】
所望の置換を含むプラスミドを、配列決定によって確認し、次いで、制限酵素ＤｒａＩで消化した。次いで、各クローンの大きいフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子（ＫＧまたはｋａｎ−ｇａｌ）カセットに連結して送達プラスミドを提供した。この送達プラスミドを、エポシロンＢプロデューサーＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓであるＫ１１１−３２．２５にエレクトロポレーションによって形質転換した。これらの形質転換体をスクリーニングし、そしてカナマイシン感受性のガラクトース耐性生存体を選択して、ＫＧ遺伝子を除去したクローンを同定した。組換え株についてのＫＧの除去および所望の遺伝子置換の確認を、ＰＣＲによって実施した。これらの組換え株を、５０ｍＬのＣＴＳ培地および２％のＸＡＤ−１６と共にフラスコ中で５日間発酵させ、そしてエポシロンアナログを１０ｍＬのメタノールでＸＡＤから溶出した。構造決定は、ＬＣ／ＭＳスペクトルおよびＮＭＲに基づいた。１つのこのような株（Ｋ１２２−５６と名付けた）を、ブダペスト条約の規約の下に、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ　２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託し、これは受託番号ＰＴＡ−２７１４の下に入手可能である。このＫ１２２−５６株（プラスミドｐＫＯＳ１２２−２９に由来する）は、１３−ケト−１１，１２−デヒドロ−エポシロンＤを主生成物として生成し、その構造は以下に示される：
【０４１２】
【化４５】

。
【０４１３】
Ｋ１２２−５６株はまた、１３−ケト−エポシロンＣ（１３−ｋｅｔｏ−ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｃ）およびＤを微量産物として産生する。これらのそれぞれの構造を以下に示す：
【０４１４】
【化４６】

同様の結果が、プラスミドｐＫＯＳ１２２−３０から誘導されたＫ１２２−３０株から得られた。これらの化合物ならびにこれらを産生する株およびＰＫＳ酵素は、本発明の新規な化合物、株およびＰＫＳ酵素である。
【０４１５】
１３−ケト−１１，１２−デヒドロエポシロンを産生する本発明の他の株としては、ＫＲドメインが１以上の点変異によって不活性にされている株が挙げられる。例えば、ＫＲドメイン中の構成的チロシン残基をフェニルアラニンへと変異させることは、ＫＲ活性における約１０％の減少をもたらし、そしていくらかの１３−ケト−エポシロンの産生をもたらす。ＫＲドメインにおけるさらなる変異は、ＫＲ活性をより多くまたは全て除去し得るが、エポシロン産生の減少もまたもたらし得る。
【０４１６】
（Ｂ．１３−ヒドロキシ−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＰＫＳの伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）モジュール５のＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインの、異種ＫＲドメイン（例えば、ラパマイシンＰＫＳの伸長モジュール２由来のＫＲドメインまたはＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール３由来のＫＲドメイン）による置換は、１３−ヒドロキシエポシロンの産生において有用な本発明のハイブリッドＰＫＳをもたらす。この構築は、本実施例の第Ａ部に記載される様式と類似の様式で行われる。プラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂをテンプレートして用いて、ｅｐｏＤ遺伝子の所望の部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：
【０４１７】
【化４７】

プライマーＴＬ７／ＴＬ８から生成されたＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ　２８にクローニングし、得られたクローンを、制限酵素ＮｓｉＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、５．１ｋｂのフラグメントを単離し、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで処理した、ＴＬ９／ＴＬ１０から生成された２．２ｋｂのＰＣＲフラグメントに連結し、そしてＫＲカセットに連結した。ＦＫ５２０　ＰＫＳ由来のＫＲカセットを、プライマーＴＬ３１およびＴＬ３２を用いるＰＣＲによって生成し、次いで制限酵素ＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化した。これらのプライマーを以下に示す：
【０４１８】
【化４８】

残りの株構築を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋｌｌｌ−７２．４．４をレシピエントとして用いたこと以外は、本実施例の第Ａ部に記載したのと同様に進めた。ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール３のＫＲドメインが、エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５のＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインで置換された株をＫ１２２−１４８と命名し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに２０００年１１月２１日にブダペスト条約の約定の下に寄託した。この株は、登録番号ＰＴＡ−２７１１の下で入手可能である。株Ｋ１２２−１４８は、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロエポシロンＤを主な産物として産生し、そしてＣ誘導体を微量産物として産生する。これらの構造を以下に示す：
【０４１９】
【化４９】

ラパマイシンＰＫＳの伸長モジュール２のＫＲドメインが置換のために用いられた、Ｋ１２２−５２と命名された同様の株は、同じ化合物を産生した。これらの化合物ならびにこれらを産生する株およびＰＫＳ酵素は、本発明の新規な化合物、株およびＰＫＳ酵素である。
【０４２０】
（Ｃ．９−ケト−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＰＫＳの伸長モジュール６のＫＲドメインの不活化は、９−ケト−エポシロンを産生し得る本発明の新規なＰＫＳをもたらす。ＫＲドメインは、１以上の保存された残基を変更することによる部位特異的変異誘発によって不活化され得る。エポシロンＰＫＳの伸長モジュール６のＫＲドメインのＤＮＡおよびアミノ酸の配列を以下に示す：
【０４２１】
【化５０】

本発明によって提供される新規な９−ケト−エポシロンＰＫＳの伸長モジュール６の、変異し、かつ不活性なＫＲドメインのＤＮＡおよびアミノ酸の配列を以下に示す：
【０４２２】
【化５１】

この変異したＫＲドメインコード配列を含む株を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−７２．４．４をレシピエントとして用いたこと以外は、本実施例の第Ａ部に記載したように一般的に構築した。伸長モジュール６のＫＲドメインが不活化された株をＫ３９−１６４と命名し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに２０００年１１月２１日にブダペスト条約の約定の下に寄託した。この株は、登録番号ＰＴＡ−２７１６の下で入手可能である。株Ｋ３９−１６４は、９−ケト−エポシロンＤを主な産物として産生し、そしてＣ誘導体を微量産物として産生する。これらの構造を以下に示す：
【０４２３】
【化５２】

これらの化合物ならびにこれらを産生する株およびＰＫＳ酵素は、本発明の新規な化合物、株およびＰＫＳ酵素である。
【０４２４】
（Ｄ．２−メチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの２−メチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール９のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ９」）についてのコード配列を、メチルマロニルＣｏＡについて特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ＦＫＡＴ２」；本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開番号００／０２０６０１を参照のこと）；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ２」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子（「ｔｍｂＡＴ３」；米国特許第６，０９０，６０１号および２００１年２月１５日に出願された米国特許出願第６０／２７１，２４５号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される））から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４２５】
従って、ｅｐｏＡＴ９コード配列（ヌクレオチド５０９７９〜ヌクレオチド５２０２６）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ２コード配列（ヌクレオチド１２２５１〜ヌクレオチド１３２８７）またはＦＫＡＴ２コード配列またはｔｍｂＡＴ３コード配列のいずれかによって置換される。
【０４２６】
第一のＰＣＲを用いて、テンプレートとして用いたｐＫＯＳ３９−１２５のＤＮＡから約１．６ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ１と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４２７】
【化５３】

第二のＰＣＲを用いて、テンプレートとしてｐＫＯＳ３９−１２５　ＤＮＡを用いて約１．９ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＮｓｉＩ部位およびＳｐｅＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ２と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４２８】
【化５４】

次いで、プラスミドＰ１を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そして４．５ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラスミドＰ２由来の約１．９ｋｂのＮｓｉＩ−ＳｐｅＩ制限フラグメントおよびＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ２、ｅｐｏＡＴ２、ｔｍｂＡＴ３）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ３．１、Ｐ３．２およびＰ３．３を得た。置換ＡＴフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって生成する：
【０４２９】
【化５５】

次いで、プラスミドＰ３．１、Ｐ３．２およびＰ３．３を、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される産物は、２−メチル−エポシロンＤおよび２−メチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す。
【０４３０】
【化５６】

（Ｅ．６−デスメチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの６−デスメチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール７のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ７」）についてのコード配列を、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ５」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール４をコードする遺伝子（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４３１】
従って、ｅｐｏＡＴ７コード配列（ヌクレオチド３９５８５〜ヌクレオチド４０６２６）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ５コード配列（ヌクレオチド２６７９３〜ヌクレオチド２７８３３）またはＦＫＡＴ３コード配列またはｔｍｂＡＴ４コード配列のいずれかによって置換される。
【０４３２】
第一のＰＣＲを用いて、テンプレートとして用いたｐＫＯＳ３９−１２５のＤＮＡから約１．８ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＮｓｉＩ部位およびＳｐｅＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ４と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４３３】
【化５７】

第二のＰＣＲを用いて、テンプレートとしてｐＫＯＳ０３９−１１８Ｂ　ＤＮＡを用いて約２．１ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４３４】
【化５８】

このＰＣＲフラグメントを、ＬＩＴＭＵＳ２８にＥｃｏＲＶ制限部位でサブクローニングし、そして所望の配列を有するプラスミドを、配列決定によって同定し、そしてプラスミドｐＫＯＳ１２２−４と命名する。次いで、プラスミドｐＫＯＳ１２２−４を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そして４．８ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラスミドＰ４由来の約１．８ｋｂのＮｓｉＩ−Ｓｐｅｌ制限フラグメントおよびＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ３、ｅｐｏＡＴ５、ｔｍｂＡＴ４）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ５．１、Ｐ５．２およびＰ５．３を得る。置換ＡＴフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって生成する：
【０４３５】
【化５９】

次いで、プラスミドＰ５．１、Ｐ５．２およびＰ５．３を、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される化合物は、６−デスメチル−エポシロンＤおよび６−デスメチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す。
【０４３６】
【化６０】

（Ｆ．１０−メチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの１０−メチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール５のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ５」）についてのコード配列を、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（本明細書中に参考として援用される）；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ２」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４３７】
従って、ｅｐｏＡＴ５コード配列（ヌクレオチド２６７９３〜ヌクレオチド２７８３３）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ２コード配列（ヌクレオチド１２２５１〜ヌクレオチド１３２８７）またはＦＫＡＴ２コード配列またはｔｍｂＡＴ３コード配列のいずれかによって置換される。
【０４３８】
プライマーＴＬ１１およびＴＬ１２からプラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂをテンプレートとして用いて生成されたＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ　２８にクローニングする。用いたＰＣＲプライマーは以下の通りである：
【０４３９】
【化６１】

所望の挿入物を含むプラスミドを、ＤＮＡ配列決定によって同定する。次いで、このプラスミドを制限酵素ＮｓｉＩおよびＸｂａＩで消化し、そして４．６ｋｂのフラグメントを単離する。このフラグメントを、プライマーＴＬ５およびＴＬ６（本実施例の第Ａ部に記載される）から得られ、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化された２．０ｋｂのＰＣＲフラグメントおよび、ＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ２、ｅｐｏＡＴ２、ｔｍｂＡＴ３）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ６．１、Ｐ６．２およびＰ６．３を得る。次いで、これらの後者の３つのプラスミドを、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される化合物は、１０−メチル−エポシロンＤ（１０−ｍｅｔｈｙｌ−ｅｐｏｔｈｉｋｌｏｎｅ　Ｄ）および１０−メチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す：
【０４４０】
【化６２】

（Ｇ．１４−メチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの１４−メチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール３のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ３」）についてのコード配列を、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ２」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４４１】
従って、ｅｐｏＡＴ３コード配列（ヌクレオチド１７８１７〜ヌクレオチド１８８５８）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ２コード配列（ヌクレオチド１２２５１〜ヌクレオチド１３２８７）またはＦＫＡＴ２コード配列またはｔｍｂＡＴ３コード配列のいずれかによって置換される。
【０４４２】
第一のＰＣＲを用いて、テンプレートとして用いたｐＫＯＳ３９−１２４のＤＮＡから約１．８ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＸｂａＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ９と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４４３】
【化６３】

第二のＰＣＲを用いて、テンプレートとして使用したｐＫＯＳ３９−１２４　ＤＮＡを用いて約１．９ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＮｓｉＩ部位およびＳｐｅＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定した；所望の配列を有するプラスミドをＰ１０と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４４４】
【化６４】

次いで、プラスミドＰ９を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そして４．５ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラスミドＰ１０由来の約１．９ｋｂのＮｓｉＩ−ＳｐｅＩ制限フラグメントおよびＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ２、ｅｐｏＡＴ２、ｔｍｂＡＴ３）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ１１．１、Ｐ１１．２およびＰ１１．３を得る。次いで、これらの後者の３つのプラスミドを、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される化合物は、１４−メチル−エポシロンＤおよび１４−メチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す。
【０４４５】
【化６５】

（Ｈ．１０，１１−デヒドロ−エポシロンアナログの生成）
１つの実施形態において、本発明は、新規なエポシロン（１０，１１−デヒドロエポシロンＤ）およびこの化合物を産生する組換え宿主細胞を提供する。１０，１１−デヒドロエポシロンＤの構造を以下に示す。
【０４４６】
【化６６】

。
【０４４７】
別の実施形態において、本発明は、任意の１０，１１−デヒドロエポシロンアナログを、対応するエポシロンを産生するエポシロンＰＫＳの、伸長モジュール５のＥＲドメインの不活化によって作製する方法を提供する。
【０４４８】
１つの実施形態において、１０，１１−デヒドロエポシロンＤを生成する株を、伸長モジュール５のエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインを不活化することによって構築する。１つの実施形態において、このＥＲ不活化を、ＮＡＤＰＨ結合領域における２つのグリシン（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）を、アラニンおよびセリン（−Ａｌａ−Ｓｅｒ−）に変更することによって達成する。プラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂ（コスミドｐＫＯＳ３５−７０．４由来のｅｐｏＤ遺伝子のサブクローン）由来のこの２．５ｋｂ　ＢｂｖＣＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＴＬ７としてｐＬｉｔｍｕｓ２８にクローニングし、これを部位指向変異誘発（ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のためのテンプレートとして使用する。−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−をＮＡＤＰＨ結合ドメイン中の−Ａｌａ−Ｓｅｒ−変異に導入するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、以下である：
【０４４９】
【化６７】

。
【０４５０】
置換を含むＰＣＲクローンを、配列決定によって確認し、そして制限酵素ＤｒａＩで消化し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理する。次いで、それぞれのクローンの大きいフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子（ＫＧ、すなわちｋａｎ−ｇａｌ）カセットを用いて連結し、送達プラスミドを提供する。送達プラスミドは、エポシロンＤ産生株Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−７２−４．４またはＫ１１１−４０−１中に、エレクトロポレーションによって形質転換される。この形質転換体をスクリーニングし、そしてカナマイシン−感受性の生存性、ガラクトース−耐性の生存体を選択し、ＫＧ遺伝子が排除されたクローンを同定する。ＫＧ排除および組換え体株についての所望の遺伝子の置換の確認を、ＰＣＲによって行う。この組換え株を、５０ｍＬのＣＴＳ培地（カシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４、２ｇ／Ｌ；Ｌ−アラニン、１ｍｇ／Ｌ；Ｌ−セリン、１ｍｇ／Ｌ；グリシン、１ｍｇ／Ｌ；およびＨＥＰＥＳ緩衝液、５０ｍＭ）および２％のＸＡＤ−１６を有するフラスコ中で７日間発酵させ、そして１０，１１−デヒドロエポシロンＤをＸＡＤ樹脂から１０ｍＬのメタノールを用いて溶出する。
【０４５１】
（Ｉ．発酵によるオキサゾール含有エポシロンの生成）
１つの実施形態において、本発明は、オキサゾール含有エポシロン（この対応するエポシロンのチアゾール部分が、オキサゾールと置換されている）を、本発明によって提供されるエポシロン産生株（例えば、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ株またはＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株）を発酵させることによって、Ｌ−セリンで補充した培地中で得る方法を提供する。
【０４５２】
本発明のこの局面を例示するために、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０．１またはＫ１１１−７２．４．４培養物を、Ｌ−セリンがバッチ培地（２．３ｍＭ）において基底セリン濃度の１１×、５１×、１０１×および２０１×で存在する以外は、実施例３の方法に従って発酵させる。従って、このバッチ培地含有５０ｍＬ培養物は、２０ｇ／ＬのＸＡＤ−１６；５ｇ／Ｌのカシトン；２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４；７ｍＭ／Ｌのオレイン酸メチル；および４ｍＭ／Ｌの微量金属溶液を含み、適切な濃度の濾過滅菌したＬ−セリンの１．２５Ｍ溶液を添加する。基礎培地において観察されたこのバッチ力価は、Ｅｐｏ　Ｃ：０．４ｍｇ／Ｌ、Ｅｐｏ　Ｄ：２ｍｇ／Ｌ、ＥｐｏＨ１（オキサゾールのＣアナログ）：検出されず、およびＥｐｏ　Ｈ２（オキサゾールのＤアナログ）：０．０２ｍｇ／Ｌであった。セリン濃度の上昇は、ｅｐｏＣおよびｅｐｏＤ濃度を減少した（５１×の補充ではほとんど検出不可能なレベル）。従って、基礎培地における５１×補充したＬ−セリンのバッチ力価は、Ｅｐｏ　Ｃ：０．０３ｍｇ／Ｌ、Ｅｐｏ　Ｄ：０．０５ｍｇ／Ｌ、Ｅｐｏ　Ｈ１：０．１２ｍｇ／Ｌ；およびＥｐｏ　Ｈ２：０．１３ｍｇ／Ｌであった。流加培養プロトコールは、観察される力価をほぼ１０倍に上昇させ得た。
【０４５３】
（Ｊ．エポシロンアナログの構築）
１つの実施形態において、本発明は、エポシロンおよび本発明の組換えエポシロンＰＫＳ酵素によって産生されるエポシロン誘導体を提供し、このエポシロン誘導体は、（ｉ）伸長モジュール１　ＮＲＰＳの特異性が、システインから別のアミノ酸に変更され；（ｉｉ）ローディングドメインがＮＲＰＳまたはＣｏＡリガーゼに変更され；あるいは（ｉｉｉ）　（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。この実施例は、このような本発明の組換えエポシロンＰＫＳ酵素がどのようにして構築されるかを記載する；この実施例において引用される文献は、本実施例の最後に列挙され、そしてこの文章中において引用番号によって参照され、そして参考として本明細書中で援用される。
【０４５４】
エポシロンは、環化されそして酸化されてチアゾールを形成するアミノ酸システインを含む。２つの他のアミノ酸（セリンおよびスレオニン）は、同様の環化および酸化を受けて、それぞれオキサゾールおよびメチルオキサゾールを生成し得る。例えば、エポシロンＤのオキサゾール誘導体およびメチルオキサゾール誘導体を以下に示す。
【０４５５】
【化６８】

オキサゾールまたはメチルオキサゾールのいずれかを有するエポシロンのアナログを構築するために、伸長モジュール１（ＮＲＰＳモジュール）の操作を実行し得る。成長モジュールを拡張するＮＲＰＳモジュールは、最低限、アミノ酸、アデニル化ドメイン、ＰＣＰまたはペプチジルキャリアタンパク質ドメインを活性化するドメインから構成され、これはアミノ酸をＮＲＰＳおよび圧縮ドメインに連結し、この圧縮ドメインはアミノ酸を成長モジュールのカルボキシル基に圧縮してペプチド結合を形成する（５、７）。このアミノ酸の特異性を決定するための認識配列を、アデニル化ドメイン、特にＡ４コンセンサス配列とＡ５コンセンサス配列との間に見出す（４）。この領域の分析は、このタンパク質領域中の重要なアミノ酸が、どのアミノ酸がＮＲＰＳによって使用されるかを予測し得ることを示した（２、８）。完全なＮＲＰＳアデニル化領域を別のアデニル化領域と交換する実験を行い、新規なアデニル化ドメインのアミノ酸特異性を有するハイブリッドＮＲＰＳを得る（６、９）。アデニル化領域のより小さな領域（例えば、Ａ４コンセンサス配列とＡ５コンセンサス配列との間の領域）を使用する実験は、報告されていない。１つの実施形態において、本発明のハイブリッドＰＫＳは、ｖｉｂＦおよびｂｌｍＶＩＩ（これはスレオニンを利用する）由来のドメインを有し、ならびにブレオマイシン遺伝子クラスターのｂｌｍＶＩ由来のＮＲＰＳ−４領域（これはセリンを利用する）を有するｅｐｏＢ由来のアデニル化ドメインの、Ａ４コンセンサス領域とＡ５コンセンサス領域との間の領域を置換することによって構築される（３）。
【０４５６】
最近の実験は、圧縮ドメインが、不正確なアミノ酸がＰＣＰに接着しているか否かを検出し得ることを示唆する（１）。一旦、不正確なアミノ酸が検出されると、圧縮反応の効率が減少する。これを回避するために、アデニル化ドメインの交換に加えて、アデニル化ドメインの特異性を変更し、そして十分に活性なＮＲＰＳを操作するために、同族の圧縮ドメインまたを使用し得る。
【０４５７】
本発明はまた、エポシロンのオキサゾール形態およびメチルオキサゾール形態の１６個のデスメチル誘導体を産生する組換えエポシロンＰＫＳ酵素を提供する。このような酵素は、伸長モジュール２、ｅｐｏＣのＡＴドメインを、メチルマロニル特異性からマロニル特異性まで変更することによって構築される。この構築物を作製するために使用され得るＡＴドメインとしては、エポシロンクラスターの伸長モジュール５および９、ならびにソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）遺伝子クラスター由来の伸長モジュール２および４由来のドメインが挙げられる。
【０４５８】
本発明はまた、ＥｐｏＡタンパク質がＮＲＰＳによって置換されている組換えＰＫＳ酵素を提供する。本発明はまた、このような酵素によって産生された新規なエポシロンを提供する。エポシロンの生合成は、ローディングモジュール（ＥｐｏＡ）のＡＣＰ上にマロネートをロードすることによって開始する。このマロネートは、ＫＳドメインによって実質的に脱カルボキシル化され、次いでＥｐｏＢに対するアセチル部分（ＮＲＰＳモジュール）として移入される。この分子がＥｐｏＢによって影響された後、得られた化合物は２−メチルチアゾルである。
【０４５９】
チアゾール上の２位で接着されるアミノ酸を有するアナログを作製するために、ｅｐｏＡの欠失およびＮＲＰＳモジュールの挿入が必要とされる。任意のＮＲＰＳモジュールが使用され得る；しかし、ほぼ保存的な変化を作製するために、下流のＮＲＰＳモジュールと自然に連絡するｅｐｏＡを置換するＮＲＰＳモジュールを使用し得る。さらに、ｅｐｏＡを置換するＮＲＰＳがローディングモジュールであるので、圧縮ドメインは必要ではない。これは、拡張ＮＲＰＳモジュールを取ること、および圧縮ドメインを除去することまたは天然のローディングモジュールであり従って圧縮ドメインを欠くＮＲＰＳを使用することによって行なわれ得る。例示的なＮＲＰＳローディングモジュールは、ｓａｆＢ由来のローディングモジュールであり、これはアラニンを使用しそしてＭ．ｘａｎｔｈｕｓ由来である。
【０４６０】
ｅｐｏＡの位置にｓａｆＢローディングモジュールを含むＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株を構築することにおいて、新規なローディングモジュールおよびｅｐｏＢについての最適な境界を決定し得る。ＰＫＳタンパク質の間のリンカー領域は、しばしばこのＰＫＳタンパク質の間の「連絡」のために重要である。最適なリンカーを検査するための３つの異なる株を構築し得る。第１に、ＥｐｏＡのＡＣＰドメインは、ｓａｆＢのローディングドメインのアデニル化ドメインに融合される。この構築物は、ＥｐｏＡのＡＣＰがＰＣＰとして機能することを必要とする。ＰＣＰおよびＡＣＰドメイは機能的に同様ではあるが、これらは高い配列同一性を示さず、そして従って、これらが認識しそして結合し得るものに制限され得る。これらの第２の構築物は、ＳａｆＢローディングモジュールのＰＣＰドメインのＥｐｏＡ下流の最後のいくつかのアミノ酸を融合し、従ってＥｐｏＢと「連絡する」ハイブリッドローディングモジュールについてのリンカー領域の必要性を提供する。最後に、ＥｐｏＢとのＳａｆＢローディングモジュールの融合が構築される。ＳａｆＢは２つのモジュールから構成されるので、全てのＳａｆＢのローディングモジュールを取り、そして直接ＥｐｏＢと融合して融合タンパク質を得ることは可能であり、これはＳａｆＢローディングモジュールとＥｐｏＢとの間の連絡のために最適であるべきである。
【０４６１】
一旦ＳａｆＢまたは別の任意のローディングＮＲＰＳドメインが使用されて、エポシロンのチアゾール上の２−メチルがアミノ酸で置換されると、次いで新規なローディングＮＲＰＳモジュールにおいて変化が生じ得、それによって任意のアミノ酸分子が使用されてエポシロンアナログの合成を開始し得た。潜在的なアミノ酸、およびこれらの交換のために使用され得るこれらの対応するＮＲＰＳモジュールの包括的なリストは、Ｃｈａｌｌｉｓらによって提供される（２）。
【０４６２】
全ての置換は、Ｋ１１１−３２．２５（エポシロン遺伝子を含むＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株）またはＫ１１１−４０−１（エポシロン遺伝子を含むＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株であり、ｅｐｏＫ遺伝子が機能的産物を生成しない）、あるいは本発明の任意の他のエポシロン産生株またはＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍにおいて行なわれ得る。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓにおいて、適切な構築物は、プラスミド上で、ｇａｌＫおよびカナマイシン選択を使用して作製され得、そして使用されて、野生型遺伝子を操作された遺伝子で置換する。例えば、Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、セリンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、エポシロンＤの２−メチル−オキサゾール誘導体およびエポシロンＣの２−メチル−オキサゾール誘導体を、それぞれ主産物および少数の産物として作製することが予期される。これらの化合物の構造を、以下に示す：
【０４６３】
【化６９】

。
【０４６４】
Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、スレオニンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、以下の化合物ならびにそれぞれの主産物および少数の産物が予期される：
【０４６５】
【化７０】

。
【０４６６】
Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、バリン、およびチロシンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、それぞれの主産物および少数の産物として以下の化合物を作製することが、各々予期され：
【０４６７】
【化７１】

ここで、Ｒ’は、アミノ酸における特異的な側鎖に対応する（例えば、Ｒ’は、グリシンについてのアミノ酸の一般式　ＮＨ_２−ＣＨＲ’ＣＯＯＨにおいてＨであり、そしてアラニンについてはメチルであり、など）。
【０４６８】
Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、プロリンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、それぞれの主産物および少数の産物として以下の化合物を作製することが予期される：
【０４６９】
【化７２】

。
【０４７０】
この節において引用された文献は、以下の通りである。
【０４７１】
【化７３】

。
【０４７２】
（実施例１２）
（生物学的アッセイ）
１０，１１−デヒドロエポシロンＤを、４つの異なるヒト腫瘍細胞株中でスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して、抗癌活性についてスクリーニングした。１０，１１−デヒドロエポシロンＤは、ＩＣ_５０（２８ｎＭから４０ｎＭの範囲）を有する４つの全てに対して成長阻害効果を示す。作用の機能は、化合物がチューブリン重合化を促進することを明らかにする細胞ベースのチューブリン重合化アッセイによって決定された。ヒト癌細胞株ＭＣＦ−７（乳房）、ＮＣＩ／ＡＤＲ−Ｒｅｓ（乳房、ＭＤＲ）、ＳＦ−２６８（神経膠腫）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。この細胞を、５％のＣＯ_２−加湿大気中３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において維持した。
【０４７３】
１０，１１−デヒドロエポシロンＤの細胞毒性を、ＳＲＢアッセイ（Ｓｋｅｈａｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８２：１１０７〜１１１２（１９９０））（これは本明細書中で参考として援用される）によって決定した。培養細胞をトリプシン処理し、計数し、そして増殖培地で１００μｌ当たり以下の濃度まで希釈した：ＭＣＦ−７、５０００；ＮＣＩ／ＡＤＲ−Ｒｅｓ、７５００；ＮＣＩ−Ｈ４６０、５０００；およびＳＦ−２６８、７５００。この細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に１００μｌ／ウェルで播種した。２０時間後、１００μｌの１０，１１−デヒドロエポシロンＤ（増殖培地中１０００ｎＭから０．００１ｎＭまでの範囲の希釈）をそれぞれのウェルに添加した。３日間この化合物でインキュベーションした後、この細胞を１００μｌの１０％トリ塩素酸（「ＴＣＡ」）で、１時間４℃で固定化し、そして０．２％のＳＲＢ／１％の酢酸で、室温で２０分間染色した。非結合色素を、１％の酢酸でリンスして除去し、次いで結合ＳＲＢを、２００μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基によって抽出した。結合した色素の量を、ＯＤ５１５ｎｍによって決定し、これは総細胞タンパク質成分と関連がある。次いでこのデータを、Ｋａｌｅｉｄａ　ＧｒａｐｈプログラムおよびＩＣ_５０計算を使用して分析した。化学的に合成されるエポシロンＤを、比較として並行して試験した。
【０４７４】
チューブリン重合化アッセイにおいて、ＭＣＦ−７細胞を３５ｍｍ培養皿中でコンフルエントまで増殖させ、そして１μＭの１０，１１−デヒドロエポシロンＤまたは１μＭのエポシロンＤのいずれかで、０、１もしくは２時間、３７℃で処理した（Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１：１７１１８〜１７１２５（１９９７）；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７５：５７〜６３（１９９８）（これらは参考として本明細書中に援用される）。細胞をカルシウムまたはマグネシウムを含まない２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、この細胞を、３００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＰＨ６．８、１ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒビター）で、室温で５〜１０分間溶解した。この細胞を掬い取り、そしてこの溶解物を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。次いでこの溶解物を、室温で１２分間、１８０００ｇで遠心分離した。可溶性または重合化していない（細胞質ゾル）チューブリンを含む上清を、不溶性または重合化した（細胞骨格）チューブリンを含むペレットから分離し、そして新しいチューブに移した。次いでこのペレットを、３００μｌの溶解緩衝液中に再懸濁した。この細胞におけるチューブリン重合化の変化を、それぞれのサンプルのアリコートの同量をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、続いて抗チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用する免疫ブロッティングによって決定した。
【０４７５】
いくつかの実験の結果は、１０，１１−デヒドロエポシロンＤ（「Ｅｐｏ４９０」と略される）は、２８ｎＭから４０ｎＭの範囲において４つの異なるヒト腫瘍細胞株に対するＩＣ_５０を有することを示した。
【０４７６】
【表１３】

チューブリン重合アッセイは、１０，１１−デヒドロエポシロンＤはエポシロンＤと同じ作用の機構を有することを明らかにする。ＭＣＦ−７細胞において、１０，１１−デヒドロエポシロンＤは、試験される条件でチューブリン重合化を強力に促進し、エポシロンＤと同様の反応速度論および効率を有する。本発明の他の化合物を、１０，１１−デヒドロエポシロンＤについて目的の化合物を置換することによって同様の様式で試験し得る。
【０４７７】
（実施例１３）
（オキサゾール誘導体）
本実施例は、発酵条件を使用して宿主細胞によって生成されるエポシロン化合物の型を調節することを記載する。過剰のセリンで補充した宿主細胞によって、通常は宿主細胞によって生成される化合物を、オキサゾール対応物の生成を支持するような方法で調節する。例えば、式Ｖの化合物を優先的に生成する細胞を、式ＶＩの化合物に対応するオキサゾール対応物の生成を指示するように作製する。
【０４７８】
１つの実施形態において、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１（優先的にエポシロンＣおよびエポシロンＤを作製する株）を、有意にエポシロンＨ_１およびエポシロンＨ_２、エポシロンＣおよびエポシロンＤに対するオキサゾール対応物の生成を増加するように作製する。株Ｋ１１１−４０−１（ＰＴＡ−２７１２）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、１０８０１　Ｕｉｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０〜２２０９　ＵＳＡに、２０００年１１月２１日に寄託した。株Ｋ１１１−４０−１を、さらなるセリンを補充したかまたは補充していないいずれかの培地中で増殖させた。補充していない培地中のこの化合物の最終濃度は：加水分解されたカゼイン（膵臓消化、ＤｉｆｃｏからＣａｓｉｔｏｎのブランド名で購入した）、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２ｇ／Ｌ；ＸＡＤ−１６、２０ｇ／Ｌ；微量因子溶液　４ｍｌ／Ｌ；オレイン酸メチル、７ｍｌ／Ｌ；およびＨｅｐｅｓ緩衝液、４０ｍＭ（ＫＯＨでｐＨ７．６まで滴定した）であった。微量因子溶液は：濃Ｈ_２ＳＯ_４、１０ｍＬ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１４．６ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ_２、２．０ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１．０ｇ／Ｌ；ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．４２ｇ／Ｌ；Ｈ_３ＢＯ_３、０．３１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ_２／６Ｈ_２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌ；およびＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌを含む。セリンの基礎レベルを、４．８２％（重量／重量）として取り、この値は、Ｃａｓｉｔｏｎｅの特定のロットのＤｉｆｃｏのアミノ酸分析によって決定された。従って、基礎セリン濃度は２．３ｍＭであり、値は培地中のＣａｓｉｔｏｎｅの最終濃度５ｇ／Ｌから計算した。セリン補充培地は、５０倍高いセリン濃度（１１７ｍＭ）を含有した。
【０４７９】
細胞を、フラスコ中３０℃で、１２０時間、２５０ｒｐｍのコフィン振盪器上で増殖させた。発酵の間に菌株によって産生される化合物は、樹脂を捕獲し、一旦水中でこの樹脂を洗浄し、そしてこの樹脂中の化合物を３０分間２０ｍＬのメタノールに抽出することによって抽出した。試料をＨＰＬＣおよび質量分析法によって分析した。
【０４８０】
細胞によって産生された化合物の分析は、セリンレベルの５０倍増加が、セリンを補充されていない培地において増殖した細胞によって産生されたものに対して、エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）Ｈ_１の産生の３０倍増加（０．１２ｍｇ／Ｌ）およびエポシロンＨ_２の産生の５倍増加（０．１２ｍｇ／Ｌ）を生じることを示した。特に、この細胞は、検出可能な量のエポシロンＣおよびＤをほとんど産生しなかった（５０μｇ／Ｌ未満）。
【０４８１】
セリン供給由来の同時のオキサゾール含有化合物の増加およびチアゾール含有化合物の減少は、通常は、チアゾール含有対応物を形成する宿主細胞からオキサゾール化合物を得る方法を提供する。例えば、（実施例１１のサブ項目Ｃに記載されるような）９−オキソエポシロンＤを形成するための組換え構築物は、１７−デス（２−メチル−４−チアゾリル）−１７−（２−メチル−４−オキサゾリル−４−オキサゾリル）−９−オキソ−エポシロンＤ、９−オキソ−エポシロンＤに対するオキサゾール対応物を形成するために前述した条件と同様の条件で増殖され得る。同様に、実施例１１に記載される組換え構築物を含む本発明の他の組換え構築物は、対応するオキサゾール化合物を提供するために過剰のセリンを用いて増殖され得る。
【０４８２】
（実施例１４）
（Ｃ−２１メチルからＣ−２１ヒドロキシメチルへの微生物変換）
本実施例は、式Ｉの化合物のＣ−２１メチルからＣ−２１ヒドロキシメチルへの微生物変換を記載し、ここで、Ａｒは、以下：
【０４８３】
【化７４】

である。ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／３９２７６に記載されるようなＡｍｙｃｏｌａｔａ　ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ　ＡＴＣＣ３５２０３またはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．株ＰＴＡ−ＸＸＸの凍結バイアル（約２ｍｌ）を使用して、１００ｍＬの培地を含む１５００ｍｌフラスコに播種する。栄養性培地は、１リットルの脱イオン水中の、１０ｇのデキストロース、１０ｇの麦芽エキス、１０ｇの酵母抽出物、および１ｇのペプトンからなる。この栄養性培養物を、３日間、２８℃で、２５０ｒｐｍで作動する回転振盪器上でインキュベートする。１ｍＬの得られた培養物を、栄養性培地と同じ組成の変換培地を含有する６２個の５００ｍＬフラスコの各々に加える。この培養物を、２８℃で、２５０ｒｐｍで２４時間、インキュベートする。本発明の適切な化合物を、１５５ｍｌのエタノールに溶解し、この溶液を６２個のフラスコに分配する。次いで、これらのフラスコを振盪器に戻し、さらに４３時間、２８℃および２５０ｒｐｍで、インキュベートする。次いで、この反応培養物を処置し、出発化合物の２１−ヒドロキシ対応物を回収する。
【０４８４】
（実施例１５）
（ＥｐｏＫを使用するエポキシ化）
本実施例は、式Ｉの化合物の酵素的エポキシ化を記載し、ここで、Ｒ^８およびＲ^１０は、一緒になって、炭素間二重結合（本発明のデスオキシ化合物）を形成する。このｅｐｏＫ遺伝子産物を、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／３１２４７（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、ポリヒスチジンタグ（ｈｉｓ　ｔａｇ）を含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、精製した。この反応系は、１００μＭ容量中に、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２１μＭホウレンソウフェレドキシン、０．１３２ユニットのホウレンソウフェレドキシン：ＮＡＤＰ^＋オキシドレダクターゼ、０．８ユニットのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１．４ｍＭ　ＮＡＤＰ、および７．１ｍＭ　グルコース−６−リン酸、１００μＭまたは２００μＭの本発明のデスオキシ化合物、および１．７μＭアミノ末端ヒスチジンタグ化ＥｐｏＫまたは１．６μＭカルボキシ末端ヒスチジンタグ化ＥｐｏＫからなる。この反応系を、３０℃で、６７分間インキュベートし、９０℃で２分間加熱することによって停止する。不溶物質を遠心分離によって除去し、所望の産物を含有する上清５０μＬをＬＣ／ＭＳによって分析する。
【０４８５】
（実施例１６）
（化学的エポキシ化）
本実施例は、式Ｉの化合物の化学的エポキシ化を記載し、ここで、Ｒ^８およびＲ^１０は、一緒になって、炭素間二重結合（本発明のデスオキシ化合物）を形成する。ジメチルジオキシランの溶液（アセトン中０．１Ｍ、１７ｍＬ）を、−７８℃でＣＨ_２Ｃｌ_２１０ｍＬ中の本発明のデスオキシ化合物（５０５ｍｇ）の溶液に滴下する。この混合物を−５０℃まで加温し、１時間維持し、次いで、もう一部のジメチルジオキシラン溶液（５ｍＬ）を加え、この反応をさらに１．５時間、−５０℃で継続する。次いで、この反応系をＮ_２流下で、−５０℃で乾燥する。この生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４８６】
（実施例１７）
（（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸）
【０４８７】
【化７５】

工程１。９−オキソエポシロンＢ。ジメチルジオキシランの溶液（アセトン中０．１Ｍ、１７ｍＬ）を、−７８℃で１０ｍＬのＣＨ_２Ｃ１_２中の９−オキソエポシロンＤ（５０５ｍｇ）の溶液に、滴下する。この混合物を、−５０℃に昇温させて１時間維持し、次いで、もう一部のジメチルジオキシラン溶液（５ｍＬ）を加え、この反応をさらに１．５時間、−５０℃で継続させる。次いで、この反応系をＮ_２流下で、−５０℃で乾燥する。この生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４８８】
工程２。（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アジド−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸。
【０４８９】
アルゴン雰囲気下で、５５ｍＬの脱気したテトラヒドロフラン／水（１０：１ｖ／ｖ）中の９−オキソエポシロンＢ（２．６２ｇ）およびナトリウムアジド（０．４９ｇ）の溶液をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．５８ｇ）で処理する。この混合物を、４５℃で１時間維持し、次いで、５０ｍＬの水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物をＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９０】
工程３。（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸。１５ｍＬのＴＨＦ／水（１０：１ｖ／ｖ）中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アジド−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５６５ｍｇ）の溶液を、周囲温度で、アルゴン下において、２時間、トルエン（３ｍＬ）中の１．０Ｍトリメチルホスフィン溶液で処理する。この混合物を濃縮し、生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９１】
（実施例１８）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９２】
【化７６】

アセトニトリル／ジメチルホルムアミド（２０：１ｖ／ｖ，１５０ｍＬ）中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルジアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５４０ｍｇ）の溶液を、０℃に冷却し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．１３５ｇ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．５ｇ）で順次処理する。この混合物を、周囲温度まで加温し、１２時間維持し、次いで、水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、水、飽和ＮａＨＣＯ_３、およびブラインで順次洗浄し、次いで、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９３】
（実施例１９）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｚ，１６Ｓ）−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９４】
【化７７】

−７８℃でテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のタングステンヘキサクロリド（０．７６ｇ）の溶液を、ヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液（２．５ｍＬ）で処理する。この混合物を、周囲温度まで２０分にわたって、昇温させる。得られる緑色溶液の１３．８ｍＬを、周囲温度で、２ｍＬのテトラヒドロフラン中の（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−４，８−ジヒドロキシ−１３，１４−エポキシ−２，６，１０−トリオキソ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン（３６０ｍｇ）の溶液に、加える。３０分後、この反応系を０℃まで冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）で処理する。この混合物を、水で希釈し、ＣＨ_２Ｃ１_２で抽出する。この抽出物を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物をＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９５】
（実施例２０）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−ｌ−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９６】
【化７８】

工程１。（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１５−（メチルアミノ）−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸。１０ｍＬのメタノール中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５４０　ｍｇ）の溶液を、３７％水性ホルムアルデヒド（１ｍＬ）、酢酸（２５ｕＬ）、およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ）で処理する。次いで、１時間後、この混合物を、１Ｎ　ＨＣｌで処理し、次いで、酢酸エチルおよび水で希釈する。この水相を、酢酸エチルで抽出し、そして有機相を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９７】
工程２。（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン。アセトニトリル／ジメチルホルミアミド（２０：１ｖ／ｖ，１５０ｍＬ）中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１５−（メチルアミノ）−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５５４ｍｇ）の溶液を、０℃まで冷却し、そして１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．１３５ｇ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．５ｇ）で順次処理する。この混合物を、周囲温度まで加温し、１２時間維持し、次いで、水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、水、飽和ＮａＨＣＯ_３、およびブラインで順次洗浄し、次いで、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９８】
（実施例２１）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｚ，１６Ｓ）−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（ｌ−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９９】
【化７９】

−７８℃のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の六塩化タングステン（０．７６ｇ）の溶液を、ヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液（２．５ｍＬ）で処理する。この混合物を、周囲温度まで、２０分にわたって加温する。得られる緑色溶液の１３．８ｍＬ部を、周囲温度で、２ｍＬのテトラヒドロフラン中の（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（ｌ−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−ｌ−アザ−１１−シクロヘキサデセン（３７０ｍｇ）の溶液に加える。３０分後、この反応系を０℃まで冷却し、そして飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）で処理する。この混合物を、水で希釈し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。この抽出物を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ_２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０５００】
（実施例２２）
（リポソーム組成物）
本実施例は、９−オキソエポシロンを含有するリポソーム組成物を記載する。脂質および９−オキソエポシロンＤの混合物を、エタノールに溶解し、この溶液を、減圧下での回転によって薄いフィルムとして乾燥する。この得られた脂質フィルムを水相の添加によって水和し、そしてエポシロン誘導体含有リポソームの粒子サイズを、所望の範囲に調節する。好ましくは、平均粒子直径は、１０ミクロン未満であり、好ましくは、約０．５〜約４ミクロンである。この粒子サイズは、例えば、ミル（例えば、エアジェットミル、ボールミル、またはバイブレーターミル）、ミクロ沈殿（ｍｉｃｒｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、スプレイ乾燥、凍結乾燥、高圧均質化、超臨界媒体からの再結晶を使用することによって、または選択された均一な孔サイズを有する一連の膜（例えば、ポリカーボネート膜）を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことによって、所望のレベルまで減少され得る。１実施形態において、このリポソーム組成物は、以下：本発明の化合物（１．００ｍｇ）；ホスファチジルコリン（１６．２５ｍｇ）；コレステロール（３．７５ｍｇ）；ポリエチレングリコール誘導体化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（５．００ｍｇ）；ラクトース（８０．００ｍｇ）；クエン酸（４．２０ｍｇ）；酒石酸（６．００ｍｇ）；ＮａＯＨ（５．４４ｍｇ）；水（１ｍＬまで）を含む。別の実施形態において、このリポソーム組成物は、以下：本発明の化合物（１．００ｍｇ）；ホスファチジルコリン（１９．８０ｍｇ）；コレステロール（３．７５ｍｇ）；ジステアリルホスファチジルコリン（１．４５ｍｇ）；ラクトース（８０．００ｍｇ）；クエン酸（４．２０ｍｇ）；酒石酸（６．００ｍｇ）；ＮａＯＨ（５．４４ｍｇ）；水（１ｍＬまで）を含む。なお別の実施形態において、このリポソーム組成物は、以下：本発明の化合物（１．００ｍｇ）；１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１７．５０ｍｇ）；１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、Ｎａ（７．５０ｍｇ）；ラクトース（８０ｍｇ）；クエン酸（４．２０ｍｇ）；酒石酸（６．００ｍｇ）；ＮａＯＨ（５．４４ｍｇ）；水（１ｍＬまで）を含む。本発明の他の化合物を含むリポソーム組成物を、上記の条件と同様の条件を使用して、調製する。
【０５０１】
（実施例２３）
（ポリグルタミン酸複合体）
本実施例は、ポリ−グルタミン酸−２１−ヒドロキシ−９−オキソ−エポシロンＤ複合体の調製を記載する。ポリ（１−グルタミン酸）（「ＰＧ」）ナトリウム塩（ＭＷ３４Ｋ，Ｓｉｇｍａ、０．３５ｇ）を水に溶解する。この水溶液のｐＨを、０．２Ｍ　ＨＣｌを使用して、２に調節する。この沈殿物を回収し、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥して０．２９ｇのＰＧを得る（ｙｉｌｅ）。乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＰＧ（７５ｍｇ、繰り返し単位ＦＷ１７０、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、２０ｍｇの２１−ヒドロキシ−９−オキソエポシロンＤ、１５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（「ＤＣＣ」）および微量のジメチルアミノピリジンを加える。この反応を、４時間または薄層クロマトグラフィーによって完了が示されるまで、室温で進行させる。この反応混合物を、クロロホルムに注ぎ、そして得られる沈殿物を回収し、そして真空中で乾燥し、約６５ｍｇのＰＧ−２１−ヒドロキシ−９−オキソ−エポシロンＤ複合体を得る。出発物質中のＰＧに対する本発明の化合物の重量比の変化は、種々の濃度の２１−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロエポシロンＤのポリマー複合体を生じる。本発明の他の化合物の複合体を、上記の条件と同様の条件を使用して調製する。
【０５０２】
（実施例２４）
（静脈処方物）
本実施例は、９−オキソ−エポシロンＤの静脈処方物を記載する。この処方物は、以下：３０％プロピレングリコール、２０％Ｃｒｅｏｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ、および５０％エタノールを含むビヒクル中に、１０ｍｇ／ｍＬの９−オキソ−エポシロンＤを含む。このビヒクルは、スターラーバーを含むビーカーにエタノール（５９１．８ｇ）を計り取り；Ｃｒｅｏｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ（３１５．０ｇ）をこの溶液に加え、そして１０分間混合し；次いで、プロピレングリコール（４６６．２ｇ）をこの溶液に加え、そして別の１０分間混合することによって調製する。９−オキソ−エポシロンＤ（１ｇ）を、４００〜６００ｍＬのビヒクルを含む１Ｌ容量フラスコに加え、５分間混合する。１０，１１−デヒドロエポシロンＤを溶液に加えた後、容量を１Ｌにし；さらに１０分間混合し；そして０．２２μｍ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｉｐａｋ　ｆｉｌｔｅｒを通して濾過する。得られる溶液を使用して、メーター表示（ｍｅｔｅｒｅｄ）蠕動ポンプを使用して、滅菌５ｍＬバイアルを、目標の充填容量５．１５ｍＬ／バイアルまで、無菌的に充填する。この充填したバイアルに、すぐに栓をし、圧着する。
【０５０３】
１０ｍｇ／ｍＬの９−オキソ−エポシロンＤを含有するバイアルを、患者への投与のための標準生理食塩水または５％デキストロース溶液に希釈し、非−ＰＶＣ、非−ＤＥＨＰバッグおよび投与セットで投与する。この生成物を１〜６時間にわたって注入し、所望の用量を送達する。
【０５０４】
１実施形態において、この処方物を、静脈注入の前に、滅菌生理食塩水に２０倍希釈する。この最終注入濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬの本発明の化合物、１．５％プロピレングリコール、１％Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ、および２．５％エタノールであり、これを１〜６時間にわたって注入し、所望の用量を送達する。
【０５０５】
本発明の他の化合物を含む静脈処方物は、同様の様式で調製および使用され得る。
【０５０６】
（実施例２５）
（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）毒性についての前処理）
本実施例は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）毒性についての前処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を記載する。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を含む本発明の化合物の処方物は、患者において毒性を引き起こし得る。ステロイドを用いる前処置を使用して、アナフィラキシーを防止し得る。任意の適切なコルチコステロイドまたはコルチコステロイドとＨ_１アンタゴニストおよび／またはＨ_２アンタゴニストとの組み合わせが使用され得る。１実施形態において、被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物による処置の１時間前に、５０ｍｇのジフェニルヒドラミンおよび３００ｍｇのシメチジンの経口用量で前投薬する。別の実施形態において、被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物を用いる処置の少なくとも１．５時間前に、２０ｍｇのデキサメタゾンの静脈投与で前投薬する。別の実施形態において、被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物を用いる処置の少なくとも１．５時間前に、５０ｍｇのジフェニルヒドラミン、３００ｍｇのシメチジンおよび２０ｍｇのデキサメタゾンの静脈投与で前投薬する。なお別の実施形態において、被験体の体重を考慮し、この被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物を用いる処置の少なくとも１．５時間前に、ジフェニルヒドラミン（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）；シメチジン（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）；およびデキサメタゾン（１ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）の投与で前処置する。
【０５０７】
本明細書中で参照される全ての科学文献および特許公報は、本明細書により、参考として援用される。これまで本発明を記述した説明および実施例として記載してきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態で実施され得、前述の記載および実施例は、例示のためであり、前述の特許請求の範囲を限定するものではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のエポシロンＰＫＳに供給され得るＮ−アシルシステアミンチオエステル誘導体に対する、多数の前駆体化合物を示す。ここで、ＮＲＰＳ様モジュール１またはＮＲＰＳ様モジュール２のＫＳドメインが不活化されて、新規なエポシロン誘導体を生成した。このような化合物を作製するための一般的な合成手順もまた示される。
【図２】
図２は、プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびｐＫＯＳ３５−８２．２の制限部位および機能のマップを示す。
【図３】
図３は、プラスミドｐＫＯＳ３５−１５４およびｐＫＯＳ９０−２２の制限部位および機能のマップを示す。
【図４】
図４は、実施例２に記載される、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞の染色体へエポシロンＰＫＳおよび改変酵素遺伝子を導入するためのプロトコールの概略を示す。
【図５】
図５は、実施例２に記載されるｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩのマップを示す。
【図６】
図６は、５ｇ／Ｌカシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）（膵臓カゼイン消化物）および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムのみからなる単純な産生培地におけるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１の基礎的な性能を示す。説明：バッチプロセスにおける基礎的なＣＴＳ培地についての増殖（黒丸）、産生（黒四角）、およびアンモニア産生（黒三角）のプロフィール；培養条件は、実施例３の材料および方法に記載されるとおりであった。
【図７】
図７は、ＣＴＳ産生培地におけるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１の発酵性能に対するＸＡＤ−１６樹脂の効果を示す。説明：バッチプロセスにおけるＣＴＳ産生培地に対する２０ｇ／Ｌ　ＸＡＤ−１６樹脂の組み込みについての増殖（黒丸）および産生（黒四角）のプロフィール。
【図８】
図８は、増殖および産生収量に対するカシトンの影響を示す。説明：増殖（黒丸）、産生（黒四角）、および比産生性（黒三角）に対するカシトン濃度の効果。
【図９】
図９は、増殖および産生収量に対する微量元素およびより高次のオレイン酸メチルの濃度の影響を示す。説明：産生に対するオレイン酸メチル（黒丸）および微量元素（黒四角）の効果。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、バッチ発酵プロセスにおけるオレイン酸メチルおよび微量元素の最適濃度の存在下でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株の増殖および産生を示す。播種後、最初の２日間の間、指数関数的増殖が生じる。エポシロンＤの産生は、定常期の開始から始まり、そして５日目のオレイン酸メチルの枯渇とともに細胞溶解が生じるときに終わる。説明：Ａ．）バッチプロセスにおけるＣＴＳ産生培地への最適濃度のオレイン酸メチル（７ｍＬ／Ｌ）および微量元素（４ｍＬ／Ｌ）の添加についての増殖（黒丸）および産生（黒四角）のプロフィール。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、バッチ発酵プロセスにおける最適濃度のオレイン酸メチルおよび微量元素の存在下でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株の増殖および産生の間の、オレイン酸メチルの消費およびアンモニアの産生に対応する時間過程を示す。Ｂ．）オレイン酸メチル（黒丸）およびアンモニアの産生（黒四角）の消費に対応する時間経過。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ株の増殖および産生に対する断続的供給バッチプロセスの影響を示す。説明：振盪フラスコにおける断続的供給バッチプロセスについての増殖（黒丸）および産生（黒四角）のプロフィール。カシトンおよびオレイン酸メチル供給速度は、それぞれ、２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日であった。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、発酵過程の間のオレイン酸メチルの消費およびアンモニアの産生の定常速度を示す。説明：培養物へのオレイン酸メチルの添加の合計（黒丸）、オレイン酸メチルの消費の合計（黒四角）、およびアンモニアの産生（黒三角）に対応する時間経過。
【図１２】
図１２は、５Ｌバイオリアクターにおける断続的供給バッチプロセスについての産生プロフィールを示す。カシトンおよびオレイン酸メチル供給速度は、それぞれ、２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日であった。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、増殖および産生に対する連続的供給の影響を示す。説明：５Ｌバイオリアクターにおける連続的供給バッチプロセスについての増殖（黒丸）および産生（黒四角）プロフィール。カシトンおよびオレイン酸メチル供給速度は、それぞれ、２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日であった。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、連続的供給バッチプロセスの間の、オレイン酸メチルの添加および消費ならびにアンモニアの生成の時間経過を示す。説明：培養物へのオレイン酸メチルの添加の合計（黒丸）、オレイン酸メチルの消費の合計（黒四角）、およびアンモニアの産生（黒三角）に対応する時間経過；培養条件は、材料および方法に記載される通りである。[0001]
(Field of the Invention)
The present invention relates to recombinant methods and materials for producing polyketides in recombinant host cells; recombinant host cells producing polyketides; novel polyketides structurally related to epothilone; And a crystalline form of Epothilone D is provided. In a preferred embodiment, a recombinant host cell of the invention is a Cystobacterineae subfamily, preferably Myxococcus, transformed with a recombinant DNA expression vector of the invention encoding a modular or repetitive polyketide synthase (PKS) gene. And from the genus Stigmatella. The recombinant host cells produce known and novel polyketides, including, but not limited to, epothilone and epothilone derivatives. The present invention relates to the fields of agriculture, chemistry, medicinal chemistry, medicine, molecular biology, and pharmacology.
[0002]
(Background of the Invention)
Polyketides constitute a class of structurally diverse compounds that are synthesized, at least in part, by a series of Claisen-type condensations and subsequent modifications from the two carbon units that make up the block compound. Polyketides include antibiotics such as tetracycline and erythromycin, anticancer drugs such as epothilone and daunomycin, and immunosuppressants such as FK506, FK520, and rapamycin. Polyketides occur naturally in many types of organisms, including fungi and mycelium. Polyketides are synthesized in vivo by polyketide synthase enzymes, commonly referred to as PKS enzymes. The two major types of PKS are known for their differences in structure and mode of polyketide synthesis. These two types are commonly referred to as type I or modular PKS enzymes and type II or repetitive (aromatic) PKS enzymes.
[0003]
The present invention provides methods and recombinant expression vectors and host cells for the production of modular and repetitive PKS enzymes, as well as polyketides produced by these enzymes. A modular PKS enzyme is typically a complex of multiple proteins, where each protein contains multiple active sites, each of which is used only once during carbon chain association and modification. A repetitive PKS enzyme is typically a complex of multiple proteins, where each protein contains only one or at most two active sites, each of which is responsible for carbon chain association and modification. Used several times during the period. As described in more detail below, a number of genes have been cloned for both modular and aromatic PKS enzymes.
[0004]
The modular PKS gene is composed of a loading module, a number of extension modules, and a coding sequence organized to encode a free domain. As described more fully below, each of these domains and modules represents a polypeptide having one or more specific functions. Generally, the loading module is responsible for joining the first building block used to synthesize the polyketide and transferring this block to the first elongation module. The building blocks used to form the composite polyketide are typically acylthioesters, most commonly acetyl, propionyl, malonyl, methylmalonyl, hydroxymalonyl, methoxymalonyl, and ethylmalonyl CoA. Other building blocks include amino acids and amino acid-like acyl thioesters. PKS catalyzes the biosynthesis of polyketides through repeated, decarboxylating Claisen condensations between the acylthioester binding blocks. Each module is responsible for combining building blocks, performing one or more functions on that building block, and transferring the resulting compound to the next module. The next module is then responsible for gluing the next building block and transferring the growing compound to the next module until synthesis is complete. At that point, the free domain, often enzymatic thioesterase (TE) activity, cleaves the polyketide from PKS.
[0005]
A polyketide known as 6-deoxyerythronolide B (6-dEB) is synthesized by a prototype modular PKS enzyme. This gene (known as eryAI, eryAII, and eryAIII) encodes a multi-subunit protein known as deoxyerythronolide B synthase or DEBS that synthesizes 6-dEB (each subunit is known as DEBS1, DEBS2, or DEBS3). No. 5,672,491, U.S. Pat. Nos. 5,712,146 and 5,824,513, each of which is incorporated herein by reference. ing.
[0006]
The loading module of DEBS PKS consists of acyl transferase (AT) and acyl carrier protein (ACP). The AT of the DEBS loading module recognizes propionyl-CoA (other loading modules AT may recognize other acyl-CoAs (eg, acetyl, malonyl, methylmalonyl, or butyryl-CoA)) and loading it as a thioester. Transfer to module ACP. At the same time, the AT on each of the six extension modules of DEBS recognizes methylmalonyl-CoA (the other loading module AT recognizes another acyl-CoA (eg, malonyl, or alpha-substituted malonyl-CoA, ie, malonyl, ethylmalonyl). , And 2-hydroxymalonyl-CoA)) and transfer this to the ACP of the module to form a thioester. Once the DEBS is primed with propionyl ACP and methyl malonyl ACP, the acyl group of the loading module migrates to form a thioester at the KS of the first extension module (trans-esterification); 1 carries acyl-KS adjacent to methylmalonyl ACP. The acyl group from the DEBS loading module is then covalently linked to the α-carbon of the elongating group, forming a carbon-carbon bond induced by concomitant decarboxylation, and having a longer backbone two carbons than the loading unit Generate a new acyl ACP (extended or extended). The growing polyketide chain is transferred from the ACP to the next module KS of the DEBS and the process is continued.
[0007]
This polyketide chain, grown by two carbons for each module of DEBS, is subsequently passed as a covalent thioester from module to module in an assembly line-like process. The carbon chains produced by this process alone carry ketones at every other carbon atom, producing polyketones, from which the name polyketide is derived. However, in common, additional enzymatic activity modifies the β-keto group of the polyketide chain. Two carbon units are added to the β-keto group of the polyketide chain, after which the chain is transferred to the next module. Thus, in addition to the minimal module containing KS, AT, and ACP required to form a carbon-carbon bond, the module can include keto reductase (KR), which reduces the β-keto group to alcohol. The module may also include KR and dehydratase (DH), which dehydrates alcohol to double bonds. The module may also include KR, DH, and enoyl reductase (ER), which converts a double bond into a saturated single bond using the β carbon as a methylene function. DEBS modules include modules having only the KR domain, modules having only the inactive KR domain, and modules having all three of the KR, DH, and ER domains.
[0008]
Once the polyketide chain has traversed the final module of PKS, it encounters the free domain (typically a thioesterase) found at the carboxyl terminus of most modular PKS enzymes. Here, the polyketide is cleaved from the enzyme and cyclized for many (but not all) polyketides. The polyketide can be further modified by tailored enzymes or modifying enzymes: these enzymes add carbohydrate or methyl groups on the polyketide core molecule and / or its substituents, or perform other modifications (ie, , Oxidation or reduction). For example, 6-dEB is hydroxylated and glycosylated (glycosidation), and one of the glycosyl substituents is methylated to form a well-known antibiotic in Saccharopolyspora erythraea cells, where erythromycin A is naturally produced. The substance erythromycin A is obtained.
[0009]
The above generally applies to modular PKS enzymes, and specifically to DEBS, but in reality there are many variations. For example, many PKS enzymes include a loading module. This loading module, unlike the loading module of DEBS, contains an "inactive" KS domain that functions as a decarboxylase. This inactive KS is often KS ^Q , Where the superscript is a one-letter abbreviation for an amino acid (glutamine) that replaces the active site cysteine required for ketosynthase activity. Epothilone PKS loading module is KS ^Y Domain, where tyrosine replaces the active site cysteine. In addition, the synthesis of other polyketides begins with a different starting unit than the unit bound by the DEBS or epothilone loading module. Enzymes that bind to such an initiation unit include, for example, FK520, FK506, and AMP ligase as used in the biosynthesis of rapamycin, non-ribosomes as used in the biosynthesis of reinamycin. Peptide synthase (NRPS), or soluble CoA ligase.
[0010]
Another important variation in PKS enzymes relates to the type of building blocks incorporated as extension units. As for the starting unit, some PKS enzymes incorporate an amino acid-like acyl thioester building block using one or more NRPS modules as extension modules. For example, Epothilone PKS includes an NRPS module. Another such variation is found in the FK506, FK520, and rapamycin PKS enzymes, which include NRPS incorporating pipecolate residues and also serve as the free domain of PKS. Yet another variation relates to additional activity in the extension module. For example, one module of the epothilone PKS includes a methyltransferase (MT) domain that incorporates a methyl group into a polyketide.
[0011]
Recombinant methods for engineering modular and repetitive PKS genes are described in US Pat. Nos. 5,962,290; 5,672,491; 5,712,146; Nos. 830,750; and 5,843,718; and PCT Patent Publication Nos. 98/49315 and 97/02358, which are incorporated herein by reference. These and other patents describe recombinant expression vectors for heterologous production of polyketides, and recombinant PKS genes assembled by a combination of two or more different PKS genes or gene clusters that produce novel polyketides. ing. To date, Streptomyces, which naturally produces polyketides, as well as E. coli using such methods. In organisms such as E. coli and yeast (which do not naturally produce polyketides), known or novel polyketides have been produced (US Pat. No. 6,033,883, incorporated herein by reference). checking). In the latter host, polyketide production relies on heterologous expression of phosphopantetheinyl transferase, which activates the ACP domain of PKS (see PCT Publication No. 97/13845, incorporated herein by reference). thing).
[0012]
While such methods are valuable and very useful, certain polyketides are only expressed at very low levels or are toxic in the heterologous host cells used. For example, the anti-cancer agents epothilones A, B, C and D were generated in Streptomyces by heterologous expression of the epothilone PKS gene (each of which is incorporated herein by reference, Tang et al., January 28, 2000; Cloning and heterologous expression of the epothilone gene cluster, Science, 287: 640-642, and PCT, publication number 00/031247). Epothilones A and B were produced at less than about 50-100 μg / L and appeared to have deleterious effects on producer cells.
[0013]
Epothilones A and B were initially identified as antifungal activities extracted from the myxobacterium Sorangium cellulosum (Gerth et al., 1996, J. Antibiotics 49: 560-563 and German Patent No. DE 4138042, which are hereby incorporated by reference. )) And later found to have activity in tubulin polymerization assays (Bollag et al., 1995, Cancer Res. 55: 2325-2333, incorporated herein by reference). See). Epothilones A and B and certain naturally occurring and synthetic derivatives have been much more extensively studied as potential anti-tumor agents for the treatment of cancer. The chemical structure of epothilone produced by Sorangium cellulosum strain Sose90 is described by Hofle et al., 1996, Eposilone A and B-novel 16-membered macrosituation rations activity catalysis. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (13/14): 1567-1569 (hereby incorporated by reference). Epothilones A (R = H) and B (R = CH ₃ ) Has the structure shown below and exhibits extensive cytotoxic activity against eukaryotic cells, and significant activity and selectivity against breast and colon tumor cell lines.
[0014]
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Deoxy equivalents of epothilones A and B (epothilones C (R = H) and D (R = CH ₃ ) Was newly chemically synthesized, but also It is also present as a minor product in cellulosum fermentation. Epothilones C and D are less cytotoxic than Epothilones A and B; their structures are shown below.
[0015]
Embedded image

Other naturally occurring epothilones have been described. These include epothilones E and F. Here, the methyl side chains of the thiazole moiety of epothilones A and B were hydroxylated to give epothilones E and F, respectively, and many other epothilone compounds (PCT Publication No., incorporated herein by reference). 99/65513).
[0016]
Because of the potential for the use of epothilone as an anticancer agent, and because of the low levels of epothilone produced by the native Sose 90 strain, a number of research teams have labored to synthesize epothilone. As noted above, this effort was successful (see Ballog et al., 1996, Total synthesis of (-)-epothilone A, Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (23/24). ): 2801-2803; Su et al., 1997, Total synthesis of (-) - epothilone B: an extension of the Suzuki coupling method and insights into structure-activity relationships of the epothilones, Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36 (7): 757-759; Meng et al., 1997, Total synthesis of e. otilones A and B, JACS 119 (42): 10073-10092; and Barog et al., 1998, Anovel aldol condensation with with 2-methyl-4-pentenal employment reviews of an introduction to a number of applications. 37. (Ed. Engl. 37 (19): 2675-2678, each of which is incorporated herein by reference)). Despite the success of these efforts, the chemical synthesis of epothilone is tedious, time consuming, and expensive. Indeed, this method has been characterized as impractical for full-scale pharmaceutical development of some epothilones as anticancer agents.
[0017]
A number of epothilone derivatives, and epothilones AD, have been studied in vitro and in vivo (see, Su et al., 1997, Structure-activity relations of the epothilones and the first time in aviation, a first institution, a first time in aviation, a first time). Chem. Int. Ed. Engl. 36 (19): 2093-2096; and Chou et al., Aug. 1998, Desoxyepothilone B: an efficientus microvibration-targeted antivitro pimento avitro. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95: 9642-9647 (each, are incorporated herein by reference)). Additional epothilone derivatives and methods of synthesizing epothilone and epothilone derivatives are described in PCT Publication Nos. 00/23452, 00/00485, 99/67253, 99/67252, 99/65513, 99/54330, 99/54319, 99/54318. , 99/36553, 99/43320, 99/42602, 99/40047, 99/27890, 99/07692, 99/02514, 99/01124, 98/25929, 98/22461, 98/088849, and 97/19086; No. 5,969,145; and German Patent Publication No. DE 4138042, each of which is incorporated herein by reference.
[0018]
There remains a need for economical means of producing not only naturally occurring epothilones, but also their derivatives or precursors, as well as new epothilone derivatives with improved properties. There remains a need for host cells that produce epothilones or epothilone derivatives that are easier to handle and ferment than the natural producer Sorangium cellulosum, and that further produce the desired polyketide product. The present invention provides host cells that produce polyketides at high levels and are useful in producing not only epothilones (including the novel epothilone derivatives described herein), but also other polyketides. Meet these needs by:
[0019]
(Summary of the Invention)
In one embodiment, the present invention relates to recombinant expression vectors, which encode heterologous PKS genes and produce polyketides synthesized on these vectors by the PKS enzyme encoded by the gene; And a recombinant host cell of the order Cystobacterineae. In a preferred embodiment, the host cell is from the genus Myxococcus or Stigmatella. In a particularly preferred embodiment, the host cells are M. Stipitatus, M .; fulbus, M .; xanthus, M .; virscens, S.M. erecta, and S.E. aurantiaca.
[0020]
In another embodiment, the present invention provides a recombinant DNA vector capable of chromosomal integration or extrachromosomal replication in a host cell of the present invention. A vector of the invention comprises at least a portion of a PKS coding sequence and is capable of directing the expression of a functional PKS enzyme in a host cell of the invention. In a related embodiment, the invention provides a gene required to produce a substrate for polyketide biosynthesis, which is either not produced or only produced in low amounts in the host cells of the invention. And host cells comprising the gene and the gene product. In one embodiment, the gene and gene product catalyze the synthesis of ethylmalonyl-CoA. In another embodiment, the gene and gene product catalyze the synthesis of butyryl CoA.
[0021]
In another embodiment, the present invention provides a method for producing a polyketide in a host cell of the order Cystobacterineae, in which the polyketide is not naturally produced. The method involves culturing host cells transformed with the recombinant DNA vector of the present invention under conditions such that the PKS gene encoded on the vector is expressed and a polyketide is produced. In a related embodiment, the invention provides a method for fermentation of a host cell of the invention that results in the production of a high yield of a polyketide.
[0022]
In a preferred embodiment, the recombinant host cells of the present invention produce epothilone or an epothilone derivative. Thus, the present invention provides a recombinant host cell that produces the desired epothilone or epothilone derivative. In a preferred embodiment, the host cell produces 10 mg / L or more of one or more epothilones. In one embodiment, the invention provides a host cell that produces one or more epothilones at a level higher than that produced in a naturally occurring organism that produces epothilone. In another embodiment, the invention provides a host cell that produces a mixture of epothilones that is less complex than a mixture produced by a naturally occurring organism that produces epothilone. The recombinant host cells of the present invention also include those host cells that produce only one desired epothilone or epothilone derivative as the primary product.
[0023]
In a related preferred embodiment, the invention provides a recombinant DNA expression vector encoding all or a portion of epothilone PKS. Accordingly, the present invention provides a recombinant DNA expression vector encoding a protein necessary for producing epothilones A, B, C, and D in the host cell of the present invention. The present invention also provides a recombinant DNA expression vector encoding a part of these proteins. The present invention also provides a recombinant DNA compound encoding the hybrid protein. The hybrid protein includes all or a portion of a protein involved in epothilone biosynthesis, and all or a portion of a protein involved in biosynthesis of another polyketide or non-ribosome-derived peptide.
[0024]
In another embodiment, the present invention provides novel epothilone-derived compounds in substantially pure form useful in agriculture, veterinary practice, and medicine. These compounds include the following of epothilones A, B, C, and D: 16-desmethyl; 14-methyl; 13-oxo; 13-oxo-11,12-dehydro; 12-ethyl; 13-hydroxy-10, 11-dehydro; 11-oxo; 11-hydroxy; 10-methyl; 10,11-dehydro; 9-oxo; 9-hydroxy; 8-desmethyl; 6-desmethyl; and analogs of 2-methyl and naturally occurring Various analogs are provided in which the methylthiazole moiety of epothilone is replaced with another moiety. In one embodiment, the compounds are useful as fungicides. In another embodiment, the compounds are useful in cancer chemotherapy as anti-cancer agents. In a preferred embodiment, the compound is an epothilone derivative that is at least as potent on tumor cells as epothilone B or D. In another embodiment, the compounds are useful as immunosuppressants. In another embodiment, the compound is useful for making another compound. In a preferred embodiment, the compound is formulated in a mixture or solution for administration to humans or animals.
[0025]
In another embodiment, the invention provides a method for purifying epothilone. In a preferred embodiment, epothilone is purified from a fermentation broth.
[0026]
In another embodiment, the present invention provides epothilone compounds in a highly purified form. In a preferred embodiment, epothilone is more than 95% pure. In a further preferred embodiment, epothilone is more than 99% pure. In a particularly preferred embodiment, the present invention provides epothilone in crystalline form. In one particularly preferred embodiment, the present invention provides crystalline epothilone D.
[0027]
In another embodiment, the invention provides a method of treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of a novel epothilone compound of the invention. The compounds and compositions of the present invention are also useful for treating other hyperproliferative diseases and conditions, including but not limited to psoriasis and inflammation.
[0028]
These and other embodiments of the present invention are described in more detail in the following description, examples, and claims.
[0029]
(Detailed description of the invention)
Statements regarding the scope of the invention and definitions of terms used herein are listed below. Unless otherwise limited in specific instances, this definition applies to this term as it is used throughout this specification, either individually or as part of a larger group.
[0030]
All stereoisomers of the compounds of the invention are included within the scope of the invention as pure compounds as well as mixtures thereof. The individual enantiomers (enantiomers), diastereomers, geometric isomers, and combinations and mixtures thereof, are all included in the present invention. Furthermore, some of the crystalline forms for these compounds may exist as polymorphs and as such are included in the present invention. In addition, some of these compounds may form solvates with water (ie, hydrates) or solvates with common organic solvents, and such solvates are also useful in the present invention. Included in the range.
[0031]
Protected forms of the compounds of the invention are included within the scope of the invention. Various protecting groups are described, for example, in T.W. H. Greene and P.S. G. FIG. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons, New York (1999), which is hereby incorporated by reference in its entirety. For example, a hydroxy protected form of a compound of the present invention is one in which at least one of the hydroxyl groups is protected by a hydroxy protecting group. Exemplary hydroxy protecting groups include, but are not limited to, tetrahydropyranyl; benzyl; methylthiomethyl; ethylthiomethyl; pivaloyl; phenylsulfonyl; triphenylmethyl; trisubstituted silyls (eg, trimethylsilyl, triethylsilyl, tributylsilyl, tributylsilyl) Isopropylsilyl, t-butyldimethylsilyl, tri-t-butylsilyl, methyldiphenylsilyl, ethyldiphenylsilyl, t-butyldiphenylsilyl, etc.); acyl and aroyl (for example, acetyl, pivaloylbenzoyl, 4-methoxybenzoyl, -Nitrobenzoyl and aliphatic acylaryl). The keto group of the compounds of the present invention can be similarly protected.
[0032]
The present invention includes within its scope prodrugs of the compounds of this invention. In general, such prodrugs will be functional derivatives of the compounds which are readily convertible in vivo into the required compound. Thus, in the methods of treatment of the present invention, the term "administration" refers to the use of the specifically disclosed compounds or in vivo after administration to a subject which may not be specifically disclosed but in need thereof. Should include the treatment of the various disorders described using compounds that are converted to specific compounds. Conventional procedures for the selection and preparation of suitable prodrug derivatives are described, for example, in "Design of Prodrugs", H .; Bundgaard, Elsevier, 1985.
[0033]
As used herein, the term "aliphatic" refers to saturated and unsaturated, straight-chain, branched, cyclic, or polycyclic hydrocarbons, which optionally include one Can be substituted at the above positions). Illustrative examples of aliphatic groups include alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, and cycloalkynyl moieties. The term "alkyl" refers to a straight or branched chain saturated hydrocarbon substituent. "Alkenyl" refers to a straight or branched chain hydrocarbon substituent having at least one carbon-carbon double bond. "Alkynyl" refers to a straight or branched chain hydrocarbon substituent having at least one carbon-carbon triple bond.
[0034]
The term "aryl" refers to a monocyclic or polycyclic radical having at least one aromatic ring structure, optionally containing one or more heteroatoms, and preferably containing 3 to 14 carbon atoms. Refers to a formula group. Aryl substituents can be optionally substituted at one or more positions. Illustrative examples of aryl groups include, but are not limited to, furanyl, imidazolyl, indanyl, indenyl, indolyl, isoxazolyl, isoquinolinyl, naphthyl, oxazolyl, oxadiazolyl, phenyl, pyrazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolyl, pyrazolyl, Quinolyl, quinoxalyl, tetrahydronaphthyl, tetrazoyl, thiazoyl, thienyl, thiophenyl and the like.
[0035]
The aliphatic (i.e., alkyl, alkenyl, etc.) and aryl moieties are optionally substituted with one or more substituents, preferably 1-5 substituents, more preferably 1-3 substituents, and Most preferably it may be substituted with one to two substituents. The definition of any substituent or variable at a particular position in a molecule is independent of the other definitions of that molecule. Substituents and substitution patterns on compounds of the present invention are analyzed to provide compounds that are chemically stable and can be readily synthesized by techniques known in the art and the methods set forth herein. It is understood that it can be selected by the trader. Examples of suitable substituents include, but are not limited to: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, halo; trifluoromethyl; trifluoromethoxy; hydroxy; alkoxy; cycloalkoxy; heterocyclooxy; oxo; alkanoyl ( -C (= O) -alkyl, also referred to as "acyl";aryloxy;alkanoyloxy;amino;alkylamino;arylamino;aralkylamino;cycloalkylamino;heterocycloamino; An amino substituent is selected from alkyl, aryl, or aralkyl); alkanoylamino; aroylamino; aralcanoylamino; substituted alkanoylamino; substituted arylamino; substituted aralcanoylamino; thiol; Riruchio; aralkylthio; cycloalkylthio; heterocycloalkyl thio; alkylthiono; arylthiono; aralkylthio Bruno; alkylsulfonyl; arylsulfonyl; aralkylsulfonyl; sulfonamides (e.g., SO ₂ NH ₂ Substituted sulphonamides; nitro; cyano; carboxy; carbamyl (eg CONH ₂ Substituted carbamyl (e.g., -C (= O) NRR ', wherein R and R' are each independently hydrogen, alkyl, aryl, aralkyl, etc.); alkoxycarbonyl, aryl, substituted aryl Guanidino, and heterocyclo (eg, indoyl, imidazolyl, furyl, thienyl, thioazolyl, pyrrolidyl, pyridyl, pyrimidyl, and the like); Where applicable, substituents can be further substituted with, for example, alkyl, alkoxy, aryl, aralkyl, halogen, hydroxy, and the like.
[0036]
The terms "alkylaryl" or "arylalkyl" refer to an aryl group having an aliphatic substituent attached to the compound via the aliphatic group. Illustrative examples of alkylaryl or arylalkyl groups include benzyl, phenyl having a methyl group attached to the compound via a methyl group (-CH ₂ Ph (where Ph is phenyl)).
[0037]
The term “acyl” refers to —C (＝ O) R, where R is an aliphatic group, preferably ₁ ~ C ₆ Part).
[0038]
The term "alkoxy" refers to -OR where O is oxygen and R is an aliphatic group.
[0039]
The term "aminoalkyl" refers to -RNH ₂ (R is an aliphatic moiety).
[0040]
The terms "halogen", "halo", or "halide" refer to fluorine, chlorine, bromine and iodine.
[0041]
The term "haloalkyl" refers to -RX, where R is an aliphatic moiety and X is one or more halogen.
[0042]
The term "hydroxyalkyl" refers to -ROH, where R is an aliphatic moiety.
The term "oxo" refers to carbonyl oxygen (= O).
[0043]
In addition to the specified substituents on the above groups, the compounds of the invention may include other substituents where applicable. For example, a lactone or lactam backbone or backbone substituent may further comprise one or more substituents (eg, C ₁ ~ C ₅ Aliphatic, C ₁ ~ C ₅ (Eg, by substituting one of the hydrogens or derivatizing a non-hydrogen group). Illustrative examples of suitable functional groups include, but are not limited to: acetal, alcohol, aldehyde, amide, amine, boronate, carbamate, carboalkoxy, carbonate, carbodiimide, carboxylic acid, cyanohydrin, disulfide, enamine, Ester, ether, halogen, hydrazide, hydrazone, imide, imido, imine, isocyanate, ketal, ketone, nitro, oxime, phosphine, phosphonate, phosphonic acid, quaternary ammonium, sulfenyl, sulfide, sulfone , Sulfonic acid, thiol and the like.
[0044]
The term "isolated" as used herein to refer to a compound of the present invention, means to have changed from its natural state by human intervention. For example, if the compound occurs in nature, it has been changed or removed from its original environment, or both. In other words, as the term is used herein, a compound that occurs naturally in a living organism is not "isolated" but is the same compound that is separated from its coexisting material in its natural state. The compound has been "isolated." The term "isolated" can also mean a compound in a preparation that is substantially free of contaminants or unwanted substances. With respect to a compound found in nature, the compound or composition is substantially free of related substances in its natural state.
[0045]
The term "purified," when referring to a compound, forms the principal component of the preparation (eg, about 50%, about 60%, about 70%, about 80% by weight of the components of the preparation). % By weight, about 90% by weight, comprising about 95% by weight or more) means that the compound is present in the preparation.
[0046]
The term "subject" as used herein, refers to an animal, preferably a mammal (which was the subject of treatment, observation or experiment), and most preferably a human (of treatment and / or observation). Was the subject).
[0047]
The term "therapeutically effective amount", as used herein, refers to a biological response in a tissue system, animal or human, sought by a researcher, veterinarian, physician, or other clinician. It refers to the amount of active compound or pharmaceutical agent that elicits a pharmaceutical response, including alleviation of the symptoms of the disease or disorder being treated.
[0048]
The term "composition" is intended to include products that include the specified components in the specified amounts, as well as any products that result directly or indirectly from the combination of the specified components in the specified amounts.
[0049]
The term "pharmaceutically acceptable salt" is one or more salts of a compound of the present invention. Suitable pharmaceutically acceptable salts of the compounds include acid addition salts, which include, for example, converting a solution of the compound into a pharmaceutically acceptable acid (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, fumaric acid, maleic acid, Succinic acid, acetic acid, benzoic acid, citric acid, tartaric acid, carbonic acid or phosphoric acid). Furthermore, when the compound of the present invention has an acidic moiety, its pharmaceutically acceptable salts include alkali metal salts (eg, sodium or potassium salts); alkaline earth metal salts (eg, calcium salts or magnesium salts) And salts formed with the appropriate organic ligands (e.g., ammonium formed using counter anions such as halides, hydroxides, carboxylate, sulfates, phosphates, nitrates, alkylsulfonates and arylsulfonates; Quaternary ammonium and amine cations). Illustrative examples of pharmaceutically acceptable salts may include, but are not limited to, acetate, adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzenesulfonate, benzoate, bicarbonate, bisulfate, bittarate, borate, Bromide, butyrate, calcium edetate, camphorate, camphor sulfonate, cansylate, carbonate, chloride, citrate, clavulanate, cyclopentane propionate, digluconate, dihydrochloride, dodecyl sulfate, edetate, edisylate, estrate , Esylate, ethanesulfonate, formate, fumarate, gluceptate, glucoheptonate, gluconate, glutamate, glycerophosph , Glycolyl arsanylate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hexyl resorinate, hydravamin, hydrobromide, hydrochloride, hydroiodide, 2-hydroxy-ethanesulfonate, hydroxynaphthoate, iodide, Isothionate, lactate, lactobionate, laurate, lauryl sulfate, malate, maleate, malonate, mandelate, mesylate, methanesulfonate, methylsulfate, mucate, 2-naphthalenesulfonate, napsylate, nicotinate, nitrate, N-methyl Glucamine ammonium salt, oleate, oxalate, pamoate (embonate), palmitate, pantothenate, pectinate, persulfate, 3-phenyl Propionate, phosphate / diphosphate, picrate, pivalate, polygalacturonate, propionate, salicylate, stearate, sulfate, subacetate, succinate, tannate, tartrate, teoclate (teoclate), tosylate, triethiodide, undecanoate, and valerate.
[0050]
The term "pharmaceutically acceptable carrier" is a vehicle used to prepare the desired dosage form of the compound of the present invention. Pharmaceutically acceptable carriers include solvents, diluents, or other liquid vehicles; dispersing or suspending aids; surfactants; isotonic agents; thickening or emulsifying agents; preservatives; And the like.
Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E.C. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) and Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. et al. H. Kibe, ed. (Amer. Pharmaceutical Assoc. 2000), both of which are incorporated herein by reference in their entirety, are various carriers used in formulating pharmaceutical compositions and known for their preparation. Disclose the technology.
[0051]
The term "pharmaceutically acceptable ester" is an ester that hydrolyzes in vivo to a compound of the present invention or a salt thereof. Illustrative examples of suitable ester groups include, for example, esters derived from pharmaceutically acceptable aliphatic carboxylic acids (eg, formate, acetate, propionate, butyrate, acrylate, and ethyl succinate). .
[0052]
The present invention relates to recombinant methods and materials for producing polyketides in recombinant host cells; recombinant host cells producing polyketides; novel polyketides related in structure to epothilone; methods for purifying epothilone; And a crystalline form of epothilone D.
[0053]
In one embodiment, the present invention provides recombinant host cells of the order Cystobacterineae comprising recombinant expression vectors encoding a heterologous PKS gene to produce polyketides synthesized by the PKS enzymes encoded in those vectors. I do. As used herein, the term recombination refers to a cell, compound, or composition produced by human intervention, typically a specific directed manipulation of a gene or portion thereof. Say. The suborder Cystobacterineae is one of two in the order Myxococcales (the other being Sorangineae, which includes the epothilone producer Sorangium cellulosum). The suborder Cystobacterineae includes the family Myxococcaceae and the family Cystobacteraceae. The family Myxococcaceae includes the genus Angiococcus (ie, A. disciformis), the genus Myxococcus, and the genus Corallococcus (ie, C. macrosporus, C. coralloides, and C. exigus). The family Cystobacteraceae is of the genus Cystobacter (i.e., C. fuscus, C. ferrugineus, C. minor, C. velatus, and C. violaceus), the genus Melittangium (i. S. erecta and S. aurantiaca) and the genus Archangium (ie, A. gephyra). Particularly preferred host cells of the present invention are those that produce 10-20 mg / L or higher, more preferably 100-200 mg / L or higher, and most preferably 1-2 g / L or higher polyketide.
[0054]
In a preferred embodiment, the host cells of the present invention are from the genus Myxococcus or Stigmatella. In a particularly preferred embodiment, the host cell is M. Stipitatus, M .; fulbus, M .; xanthus, M .; virscens, S.M. erecta, and S.E. aurantiaca. Particularly preferred Myxococcus host cells of the invention produce polyketides of 10-20 mg / L or more, more preferably 100-200 mg / L or more, and most preferably 1-2 g / L or more. M. producing at these levels Xanthus host cells are particularly preferred. M. can be used for the purposes of the present invention. As Xanthus host cells, the DZ1 cell line (Campos et al., 1978, J. Mol. Biol. 119: 167-178, incorporated herein by reference), the TA-producing cell line ATCC 31046, the DK1219 cell line ( Hodgkin and Kaiser, 1979, Mol. Gen. Genet. 171: 177-191, and the DK1622 cell line (Kaiser, 1979, incorporated herein by reference). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5952-5956).
[0055]
The host cells of the present invention comprise a recombinant DNA expression vector, and in another embodiment, the present invention provides a recombinant DNA vector capable of chromosomal integration or extrachromosomal replication in these host cells. . A vector of the invention comprises at least a portion of a sequence encoding a PKS, and may support expression of a functional PKS enzyme in a host cell of the invention. As used herein, the term "expression vector" refers to any nucleic acid that can be introduced into a host cell. The expression vector is stably or transiently maintained in the cell, whether or not it is part of a chromosome or other DNA in the cell or in any cell compartment (eg, a replicating vector in the cytoplasm). Can be done. Expression vectors also include genes that support the synthesis of RNA that is translated into polyketides in cells or cell extracts. Thus, the vector either contains a promoter to enhance gene expression, or integrates at a site in the chromosome so that gene expression is obtained. In addition, expression vectors typically include additional functional components, such as resistance-conferring genes that act as selectable markers and regulatory genes to enhance promoter activity.
[0056]
Typically, an expression vector contains one or more marker genes that can identify and / or select a host cell containing the vector. Illustrative antibiotic resistance conferring genes for use in the vectors of the invention include the ermE resistance conferring gene (conferring resistance to erythromycin and lincomycin), the tsr resistance conferring gene (conferring resistance to thiostrepton), aadA Resistance conferring gene (conferring resistance to spectinomycin and streptomycin), aacC4 resistance conferring gene (conferring resistance to apramycin, kanamycin, gentamicin, geneticin (G418) and neomycin), hyg resistance conferring gene (conferring resistance to hygromycin) ), And a vph resistance-conferring gene (conferring resistance to biomycin). As selectable markers for use in Myxococcus xanthus, kanamycin resistance imparting gene, tetracycline resistance imparting gene, chloramphenicol resistance imparting gene, zeocin resistance imparting gene, spectinomycin resistance imparting gene, and streptomycin resistance imparting gene including.
[0057]
The various components of the expression vector can vary widely depending on the intended use of the vector. In particular, the components will depend on the host cell in which the vector is used and the manner intended to function. For example, one preferred vector of the invention is an integrating vector: integrating the vector into the chromosomal DNA of the host cell. Such vectors may contain DNA segments that are complementary to phage binding sites or segments of host cell chromosomal DNA that direct integration. Further, as exemplified herein, such a series of vectors are used to construct a PKS gene cluster in a host cell, with each vector containing only a portion of the complete PKS gene cluster. Can be done. Therefore, the recombinant DNA expression vector of the present invention may contain only a part of the PKS gene or gene cluster. Also, homologous recombination can be used to delete, disrupt, or modify a gene, including a heterologous PKS gene, previously introduced into a host cell.
[0058]
In a preferred embodiment, the invention relates to expression vectors and recombinant Myxococcus, preferably xanthus (host cells containing these expression vectors that produce polyketides). Currently, there are unpublished reports of artificial plasmids based on the Mx4 phage replicon, but M. Vectors that replicate extrachromosomally in xanthus have not been published. However, M. There are many known phages (including Mx8, Mx9, Mx81, and Mx82) that integrate into xanthus chromosomal DNA. The integration and binding functions of these phages are described in xanthus can be placed on a plasmid to create a phage-based expression vector that integrates into the chromosomal DNA. Of these, phages Mx9 and Mx8 are preferred for the purposes of the present invention. Plasmid pPLH343 (described in Salmi et al., February 1998, Genetic determinants of immunity and integration of template Myxococcus xanthus phage Mx8, J. Bact. 180 (3): 614-621.). Plasmid containing the phage Mx8 gene that replicates in E. coli and encodes binding and integration functions.
[0059]
A wide range of promoters are available for use in the preferred Myxococcus expression vectors of the present invention. See Example 8 below. For example, the promoter of the Sorangium cellulosum epothilone PKS gene (see PCT Publication No. 00/031247, which is incorporated herein by reference) is described in US Pat. It functions in xanthus host cells. The epothilone PKS gene promoter can be used to drive expression of one or more epothilone PKS genes or another PKS gene product in recombinant host cells. To express the recombinant PKS of the present invention, M. Another preferred promoter for use in Xanthus host cells is M. xanthus. Xanthus pilA gene promoter. This promoter and the pilA promoter, M. p. The Xanthus strain is described in Wu and Kaiser, December 1997, Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus, J. Xanthus, incorporated herein by reference. Bact. 179 (24): 7748-7758. The present invention also provides a recombinant Myxococcus host cell comprising both pilA and pilS deletion. Another preferred promoter is the promoter of the starvation dependent sdeK gene.
[0060]
The present invention provides the recombinant Myxococcus xanthus expression vectors of the present invention and preferred expression vectors for use in preparing host cells. These vectors, designated plasmids pKOS35-82.1 and pKOS35-82.2 (FIG. 2), is capable of replication in E. coli host cells; It is possible to integrate xanthus into chromosomal DNA. The vector contains an Mx8 binding gene and an integrated gene as well as a pilA promoter with a restriction enzyme recognition site conveniently located downstream. The two vectors differ from each other merely in the direction of the pilA promoter on the vector and can be easily modified to include epothilone PKS and the modified enzyme gene of the present invention or other PKS and modified enzyme genes. The construction of the vector is described in Example 1.
[0061]
In another embodiment, the present invention provides a method for producing a polyketide in a host cell of the order Cystobacterineae, which does not naturally produce the polyketide in the host cell, comprising the steps of: The method comprises a step of culturing the transformed host cell under conditions such that the PKS gene encoded on the vector is expressed and the above-mentioned polyketide is produced. Using this method, any of a variety of polyketides produced by modular or repetitive PKS enzymes can be prepared. Furthermore, novel polyketides from hybrid or other recombinant PKS genes can be prepared using this method. In a preferred embodiment, the PKS gene encodes a hybrid modular PKS.
[0062]
Many modular PKS genes have been cloned and are readily available using vectors and the methods of the present invention. The polyketide produced by the PKS enzyme is a polyketide product of PKS hydroxylated by a polyketide modifying enzyme (also referred to as a Taylor ring enzyme), a polyketide product of epoxidized PKS, a polyketide product of methylated PKS. , And / or is often further modified into a polyketide product of glycosylated PKS. Also, based on the method of the present invention, these genes can be introduced into host cells in order to prepare the modified polyketide of interest. The following table lists references describing exemplary PKS genes and corresponding PKS enzymes, which may be utilized in the construction of recombinant PKS and corresponding DNA compounds encoding the PKSs of the present invention. Also provided are various references describing polyketide tailoring enzymes and modifying enzymes and corresponding genes that can be used to make the recombinant DNA compounds of the present invention.
(PKS and polyketide tailoring enzyme gene)
(Avermectin)
U.S. Patent No. 5,252,474; U.S. Patent No. 4,703,009; and European Patent Publication No. 118,367 (Merck).
[0063]
See MacNeil et al., 1993, Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256, A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide Syntheses for Avermectin, Erythromycin, and Nemectin.
[0064]
MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125, Complex Organization of the Streptomyces avertimilis genes encoding the averageectin polysynthesis.
[0065]
Ikeda and Omura, 1997, Chem. Res. 97: 2599-2609, Avermectin biosynthesis.
(Candicidin (FR008))
Hu et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 163-172.
(Epothilone)
PCT Publication No. 99/66028 (Novartis).
[0066]
PCT Publication No. 00/031247 (Kosan).
(erythromycin)
PCT Publication No. 93/13663; U.S. Patent No. 6,004,787; and U.S. Patent No. 5,824,513 (Abbott).
[0067]
Donadio et al., 1991, Science 252: 675-9.
[0068]
Courtes et al., November 8, 1990, Nature 348: 176-8, An unusually large multifunctional peptide in the erythromyc rosin synthesis spore synthesis prosthesis synthesizing synthesizing synthesizing skeletal synthesizing synthesizing synthesizing synthesizing skeleton.
(Glycosylation enzyme)
PCT Publication No. 97/23630 and U.S. Patent No. 5,998,194 (Abbott).
(FK-506)
Motomedi et al., 1998, The biosynthetic gene cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK-506, Eur. J. biochem. 256: 528-534.
[0069]
Motomedi et al., 1997, Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the radiopharmaceuticals. J. Biochem. 244: 74-80.
(Methyltransferase)
U.S. Patent No. 5,264,355 and U.S. Patent No. 5,622,866 (Merck).
[0070]
Motomedi et al., 1996, Characterization of methyltransferase and hydroxyylase geneses involved in the biosynthesis of the Immunsuppressant. Bacteriol. 178: 5243-5248.
(FK-520)
PCT Publication No. 00/20601 (Kosan).
[0071]
Nielsen et al., 1991, Biochem. 30: 5789-96.
(Lovastatin)
U.S. Patent No. 5,744,350 (Merck).
(Nemadectin)
MacNeil et al., 1993, supra.
(Nidamycin)
PCT Publication No. 98/51695 (Abbott).
[0072]
Kakavas et al., 1997, Identification and Characterization of the Nidadamycin Polyketide synthase genes from Streptomyces caeletis, J. et al. Bacteriol. 179: 7515-7522.
(Oleandomycin)
Swan et al., 1994, Characterization of a Streptomyces antibioticus gene encoding a type I polyketide synthase how has an unusual coding sequence. Gen. Genet. 242: 358-362.
[0073]
PCT Publication No. 00/026349 (Kosan).
[0074]
Olano et al., 1998, Analysis of a Streptomyces antibioticus chromosomal region involved in oleandomycin biosynthesis, which encodes two glycosyltransferases responsible for glycosylation of the macrolactone ring, Mol. Gen. Genet. 259 (3): 299-308.
[0075]
PCT Publication No. 99/05283 (Hoechst).
(Picromycin)
PCT Publication No. 99/61599 (Kosan).
[0076]
PCT Publication No. 00/00620 (the University of Minnesota).
[0077]
Xue et al., 1998, Hydroxylation of macrolactones YC-17 and narbomycin is produced by the pikC-encoded cytochrome P450 in Streptomyces ven.
[0078]
Xue et al., October 1998, A gene cluster for macrolide antibiotic biosynthesis in Streptomyces venezuelae: Architecture of metabolic diversity. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12111 12116.
(Platenolide)
European Patent 791,656; and U.S. Patent No. 5,945,320 (Lilly).
(Rapamycin)
Schweke et al., August 1995, The biosynthetic gene cluster for the polyketide rapamycin, Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 92: 7839-7843.
[0079]
Aparicio et al., 1996, Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopic 9th analysis of the physic symposium.
(Rifamycin)
PCT Publication No. 98/07868 (Novartis).
[0080]
August et al., February 13, 1998, Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S669, Chemistry & Biology, 5 (2): 69-79.
(Sorangium PKS)
U.S. Patent No. 6,090,601 (Kosan).
(Soraphen)
U.S. Patent No. 5,716,849 (Novartis).
[0081]
Schupp et al., 1995, J. Am. Bacteriology 177: 3673-3679. A Sorangium cellulosum (Myxobacterium) Gene Cluster for the Biosynthesis of the Macrolide Antibiotic
Soraphen A: Cloning, Characterization, and Homology to Polynucleotide Synthase Genes from Actinomycetes.
(Spinocyn)
PCT Publication No. 99/46387 (DowElanco).
(Spiramycin)
U.S. Pat. No. 5,098,837 (Lilly).
(Activator gene)
U.S. Patent No. 5,514,544 (Lilly).
(Tyrosine)
U.S. Pat. No. 5,876,991; U.S. Pat. No. 5,672,497; U.S. Pat. No. 5,149,638; EP 791,655; and EP 238,323 (Lilly).
[0082]
Kuhstoss et al., 1996, Gene 183: 231-6. , Production of a novel polyketide through the construction of a hybrid polyketide synthase.
(Tailoring enzyme)
See Merson-Davies and Cundlife, 1994, Mol. Microbiol. 13: 349-355. Analysis of five tylosin biosynthetic genes from the tylBA region of the Streptomyces fradiae genome.
[0083]
Any of the genes described above, which may or may not include genes for polyketide modification, may be used in the recombinant DNA expression vectors of the invention. Further, host cells of the invention can be constructed by transformation with a plurality of vectors each containing a desired PKS and a portion of a modifying enzyme gene cluster (US Pat. , 033,883).
[0084]
Also, cells that express heterologous phosphopantetheinyl transferase can be transformed for improved polyketide production in host cells of the invention, including Myxococcus host cells. The PKS protein requires phosphopantethenylation of the ACP domain of the loading and extension modules and the PCP domain of any NRPS. Phosphopantethenylation is mediated by an enzyme called phosphopantethenylation transferase (PPTase). To produce a functional PKS enzyme in a host cell that does not naturally express PPTase that can act on the desired PKS enzyme or that can increase the amount of functional PKS enzyme in a host cell in which PPTase is inhibited (See PCT Publication Nos. 97/13845 and 98/27203, and U.S. Pat. No. 6,031,837), each of which is incorporated by reference herein, including, but not limited to, heterologous PPTase. , 033,883). Another suitable PPTase that can be used for this purpose is MtaA from Stigmatella aurantiaca.
[0085]
Another method provided by the present invention for enhancing polyketide production in any organism, including but not limited to Myxococcus, Streptomyces and Sorangium host cells, is provided by streptomycin, rifamycin and / or gentamicin. And select cells that are resistant. In a preferred embodiment, polyketide-producing host cells are continuously challenged with each of these compounds (or compounds similar in structure), and resistant cells with enhanced polyketide-producing ability are isolated, and Used in the selection stage. In this manner, for example, without limitation, Myxococcus xanthus host cells that produce high levels of epothilone or epothilone derivatives and are resistant to streptomycin, rifamycin, and gentamicin can be obtained.
[0086]
The host cells of the present invention not only produce polyketides found in nature, but can also be used to produce polyketides produced by the products of recombinant PKS genes and modifying enzymes. In one important embodiment, the invention provides a recombinant DNA expression vector having a hybrid PKS. For the purposes of the present invention, a hybrid PKS comprises all or part of one or more extension, loading and thioesterase / cyclase domains of a first PKS and one or more extension, loading and thiol modules of a second PKS. Recombinant PKS containing all or part of the esterase / cyclase domain.
[0087]
One skilled in the art will appreciate that all or a portion of either the first or second PKSs in the hybrid PKSs of the present invention need not be isolated from a naturally occurring source. For example, only a small amount of the AT domain determines its specificity. See PCT Publication No. 00/001838, which is incorporated herein by reference. In the context of DNA synthesis, one skilled in the art can construct de novo DNA compounds of sufficient size to construct useful portions of a PKS module or domain. For the purposes of the present invention, such synthetic DNA compounds are considered to be part of the PKS.
[0088]
As explained in the table above, there is a wide range of PKS genes that serve as sources of readily available DNA and sequence information used to construct the hybrid PKS-encoding DNA compounds of the present invention. Methods for constructing hybrid PKS-encoding DNA compounds are described in US Pat. Nos. 6,022,731; 5,962,290; 5,672,491; and 5,712,146 and PCT. Nos. 98/49315; 99/61599; and 00/47724, each of which is incorporated herein by reference. The hybrid PKS-encoding DNA compound of the present invention can be a hybrid of two or more PKS genes. Even when only two genes are used, there are often more than one module in a hybrid gene where all or some of the modules are derived from the second PKS gene. One of skill in the art will understand that the hybrid PKSs of the present invention include, but are not limited to, any of the following types of PKSs: (i) a PKS that includes a module having at least one or more domains from a heterologous module; ii) a PKS comprising a module derived from a heterologous PKS; (iii) a PKS comprising a protein derived from a heterologous PKS; and (iv) a combination thereof.
[0089]
The hybrid PKS enzyme of the present invention comprises constructing a recombinant coding sequence by replacing the coding sequence of one or more domains of a module derived from a first PKS with the coding sequence of one or more domains of a module derived from a second PKS. Often built. In general, any reference herein to KR, DH, and / or ER domain insertions and substitutions will refer to the relevant KR, DH, or ER domain within a module and the corresponding domain from that module. (The domain inserted or substituted from the module is obtained). The KS and / or ACP of any module can also be exchanged for another KS and / or ACP if desired or beneficial. For example, if the product of the epothilone derivative compound is low due to the modification of the module, production may be improved by modification of the KS and / or ACP domains of the subsequent module. In each of these exchanges or insertions, the heterologous KS, AT, DH, KR, ER or ACP coding sequence is derived from the same PKS or another module of a different PKS, or from a chemical synthesis resulting in a hybrid PKS coding sequence. From the sequence.
[0090]
Although an important embodiment of the present invention relates to a hybrid PKS gene, the present invention also provides that the second PKS gene sequence is not present, but differs from the naturally occurring PKS gene by one or more mutations and / or deletions. Provide a recombinant PKS gene. The deletion may include one or more modules or domains and / or may be limited to deletions in one or more modules or domains. If the deletion encompasses the entire extension module (other than the NRPS module), the resulting polyketide derivative is at least two carbons shorter than the compound generated from the PKS from which the deleted version was derived. The deletion may also include an NRPS module and / or a loading module. If the deletion is within a module, the deletion can be in a single domain (typically, a KR, DH or ER domain), or more than one domain (eg, both DH and ER domains). Or both KR and DH domains, or all three KR, DH and ER domains). Domains of PKSs can also be functionally "deleted" by mutations, such as random or site-directed mutagenesis. Thus, as exemplified herein, a KR domain may be rendered non-functional by mutation or may never be fully functional. In addition, the specificity of the AT domain can also be altered by mutation, such as random or site-directed mutagenesis.
[0091]
The techniques described in PCT Publication No. 98/27203 and US Pat. No. 6,033,883, each of which is incorporated herein by reference, to construct any of the PKSs of the present invention. Wherein the various genes for PKS and any genes for one or more polyketide modifying enzymes are divided into two or more, often three, segments, each of which is a separate expression vector. (See also PCT Publication No. 00/063361, which is incorporated herein by reference). In this way, the perfect complement of the gene can be constructed and manipulated more easily for heterologous expression, and each of the segments of the gene can be altered, and the various altered segments can be expressed in a single host. It can be incorporated into cells to provide the recombinant PKS gene of the present invention. This technique makes the construction of large libraries of recombinant PKS genes, vectors for expressing these genes, and host cells containing these vectors more efficient. In this and other situations, the gene encoding the desired PKS may not only be displayed in more than one vector, but may be aligned or arranged differently than if it were present in the native producer organism from which the gene was derived. obtain.
[0092]
In a preferred exemplary embodiment, the recombinant host cells of the invention produce epothilone or an epothilone derivative. Naturally occurring epothilones (including epothilones A, B, C, E, E and F) and non-naturally occurring compounds structurally related to this epothilone (epothilone derivatives or epothilone analogs) are eukaryotic cells. Is a potent cytotoxic factor specific for These compounds find use as antifungals, cancer chemotherapeutics, and immunosuppressants, and are generally associated with inflammation or any hyperproliferative disease (eg, psoriasis, multiple sclerosis, atherosclerosis, And stent obstruction). Epothilone is produced at very low levels in the naturally occurring Sorangium cellulosum cells from which this epothilone was identified. Further, S.I. cellulosum grows very slowly and Fermentation of the cellulosum strain is difficult and time consuming. One significant advantage provided by the present invention is that non-S. The ability to easily produce epothilone or an epothilone derivative in a cellulosum host cell. Another advantage of the present invention is that it produces epothilone at higher levels and higher amounts in a recombinant host cell provided by the invention than is possible in naturally occurring epothilone producer cells. Is the ability to Yet another advantage is the ability to produce epothilone derivatives in recombinant host cells. Accordingly, the present invention provides a recombinant host cell that produces the desired epothilone or epothilone derivative. In a preferred embodiment, the host cell produces 10 mg / L or more of epothilone or an epothilone derivative. In one embodiment, the invention provides a host cell that produces one or more epothilones or epothilone derivatives at a higher level than is produced in a naturally occurring organism that produces epothilone. In another embodiment, the invention provides a host cell that produces a mixture of epothilones that is less complex than a mixture produced by a naturally occurring host cell that produces epothilone.
[0093]
In a particularly preferred embodiment, the host cells of the present invention produce a less complex mixture of epothilones than does a naturally occurring host cell that produces epothilone. By way of example, certain host cells of the invention may produce epothilone D in a less complex mixture than that produced by naturally occurring Sorangium cellulosum. This is because epothilone D is a major product in the host cells of the present invention and a minor product in naturally occurring host cells. Naturally occurring Sorangium cellulosum cells that produce epothilone typically support a mixture of epothilones A, B, C, D, E, F and other very small amounts of the product, with only epothilones A and B alone. Is present as the main product. Table 1 below summarizes epothilones produced in different exemplary host cells of the invention.
[0094]
[Table 1]

Accordingly, the recombinant host cells of the present invention also include those host cells that produce only one desired epothilone or epothilone derivative as the primary product.
[0095]
Based solely on the analysis of the domains of the epothilone PKS, the PKS enzyme may be expected to catalyze the production of epothilones, arbitrarily designated "G" and "H" (their structures are shown below):
[0096]
Embedded image

Epothilone G (R = H) and Epothilone H (R = CH ₃ ).
[0097]
These compounds differ from each other in that epothilone G has a hydrogen at C12 and epothilone H has a methyl group at this position. The mismatch at position C12 is predicted to result from the ability of the corresponding AT domain of PKS (extension module 4) to bind malonyl-CoA and derive hydrogen, or to bind methylmalonyl-CoA and derive methyl. Is done. However, epothilone G and epothilone H have not been observed in nature or in the recombinant host cells of the present invention. Instead, the products of PKS are thought to be epothilone C and epothilone D, which each have a C-12 to C-13 double bond and lack a C-13 hydroxyl substituent. Only differing from epothilone G and epothilone H. Based on the expression of the epothilone PKS gene in heterologous host cells and the products produced by genetic modification of this gene, a dehydration that forms a C12-C13 double bond in epothilone C and epothilone D, as described more fully below. The reaction is believed to be performed by epothilone PKS itself. Epothilone A and epothilone B are formed from epothilone C and epothilone D, respectively, by epoxidation of the C12-C13 double bond by the epoK gene product. Epothilone E and Epothilone F can be substituted for hydroxymalonyl-CoA instead of malonyl-CoA from epothilone A and epothilone B, respectively, by hydroxylation of the methyl group of C21 or by the loading module of epothilone PKS, as discussed further below. Can be formed by incorporating
[0098]
Thus, expression of the epothilone PKS and epoK genes in the host cells of the invention leads to the production of epothilones A, B, C and D. When the epoK gene is absent, or is inactivated or partially inactivated by mutation, epothilone C and epothilone D are produced as major products. When the AT domain of extension domain 4 is replaced with an AT domain specific for malonyl CoA, epothilone A and epothilone C are produced, and in the absence of a functional epoK gene, epothilone C is the major product Produced as If the AT domain of extension module 4 is replaced with an AT domain specific for methylmalonyl-CoA, epothilone B and epothilone D will be produced as major products, and if no functional epoK gene is present, epothilone D Is produced as the main product.
[0099]
Epothilone PKS and the modified enzyme gene were cloned from the epothilone-producing strain Sorangium cellulosum SMP44. Total DNA was prepared from this strain using the procedure described by Jaoua et al., 1992, Plasmid 28: 157-165, which is incorporated herein by reference. The cosmid library was cloned into p.SuperCos (Stratagene) using S.A. prepared from cellulosum genomic DNA. The entire PKS and modified enzyme gene cluster has been deposited in four overlapping cosmid clones (American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209 USA) in accordance with the Budapest Treaty on February 17, 1999). And was assigned the following ATCC accession numbers: pKOS35-70.1A2 (ATCC 203782), pKOS35-70.4 (ATCC 203781), pKOS35-70.8A3 (ATCC 203783), and pKOS35-79.85. (ATCC 203780)) and the DNA sequence is described in PCT Publication No. 00/031237, which is incorporated herein by reference. Decided to be. DNA sequence analysis revealed a PKS gene cluster with a loading molecule and nine extension modules. Downstream of the PKS sequence is an open reading frame (ORF) called epoK, which shows strong homology to the cytochrome P450 oxidase gene and encodes an epothilone epoxidase modifying enzyme.
[0100]
The PKS gene is composed of six ORFs. At the polypeptide level, the loading and extension modules 1 (NRPS), 2 and 9 appear on individual polypeptides; their corresponding genes are named epoA, epoB, epoC and epoF, respectively. Modules 3, 4, 5 and 6 are contained in a single polypeptide (this gene is named epoD), and modules 7 and 8 contain another polypeptide (this gene is named epoE) Present). The spacing between ORFs suggests that epoC, epoD, epoE and epoF build the operon. The epoA, epoB and epoK genes may also be part of this large operon, but there is about 100 bp of space between epoB and epoC and 115 bp of space between epoF and epoK, which may contain the promoter. Exists. The epothilone PKS gene cluster is shown schematically in Scheme 1 below.
[0101]
Embedded image

The P450 epoxidase gene immediately downstream of epoK is ORF1, which encodes a polypeptide that appears to contain a transmembrane domain and may be involved in epothilone transport. This ORF is followed by a number of ORFs containing genes that can code for proteins involved in transport and regulation. Detailed testing of this module shows a composition and composition consistent with epothilone biosynthesis. The following description is at the polypeptide level. The sequences of the AT domains in the loading and extension modules 3, 4, 5 and 9 show similarity to the consensus sequence for the malonyl loading module, C-14, C-12 (Epothilones A and C), C-, respectively. Consistent with the presence of the H side chain at 10 and C-2, as well as the loading module. The AT domains in modules 2, 6, 7 and 8 build a consensus sequence for methylmalonyl, which specifies the AT domain, and the methyl side chains at C-16, C-8, C-6 and C-4, respectively. Matches the existence of
[0102]
The loading module contains an SK domain in which a cysteine residue normally present in the active site has been changed to tyrosine. This domain is KS ^y And acts as a decarboxylase, which is part of its normal function but cannot function as a condensing enzyme. Thus, the loading module is expected to load malonyl-CoA, transfer it to the ACP, and decarboxylate it to produce the acetyl residues required for condensation with cysteine. Extension module 1 is a non-ribosomal peptide synthetase that activates cysteine and catalyzes condensation with acetate on the loading module. This sequence contains segments very similar to the ATP-binding and ATPase domains required for amino acid activation, a phosphopantainylation site, an oxidation domain, a cyclization domain, and an extension domain. Extension domain 2 determines the structure of epothilones at C-15 to C-17. The presence of the DH domain in module 2 results in a C-16-17 dehydro moiety within this module. The domain in module 3 is consistent with the structure of epothilones at C-14 and C-15; OH resulting from the action of KR is used in lactonization of the molecule. Extension module 4 controls the structure at C-12 and C-13 where double bonds are found in epothilones C and D. Although the sequence of the AT domain appears to be similar to the sequence specifying malonate loading, it also loads methyl malonate, thereby to some extent epothilones found in fermentation broths of naturally occurring organisms. Cause a mixture.
[0103]
Significant deviations from the expected array of functions were found in extension module 4. This module was predicted to contain a DH domain, thereby detecting the synthesis of epothilones C and D as a product of PKS. The analysis assessed that the space between the AT and KR domains of module 4 was not large enough to accommodate a functional DH domain. Thus, the degree of reduction in module 4 does not appear to proceed beyond the keto reduction of β-keto formed after condensation directed by extension module 4. As shown herein, the epothilone PKS gene alone is sufficient to confer on the host cells of the invention the ability to produce epothilones C and D. Heterologous production of epothilones C and D indicates the presence of a dehydratase function that introduces a double bond. Based on the heterologous expression of the epothilone PKS gene and the product produced by the modified epothilone PKS gene, the dehydration reaction to form this double bond is due to the DH domain of the elongation module 5 of the epothilone PKS and the ER domain of the module 5. It is believed that it is mediated by the formation of the conjugated diene precursor prior to reduction.
[0104]
Each of extension modules 5 and 6 has a full set of reducing domains (KR, DH and ER) and produces methylene functions at C-11 and C-9. Extension modules 7 and 9 have a KR domain, generate hydroxyls at C-7 and C-3, and extension domain 8 has no functional KR domain, with the presence of a keto group at C-5. Matches. Extension module 8 also contains a methyltransferase (MT) domain, which results in the presence of a geminal dimethyl function at C-4. Extension module 9 also has a thioesterase domain that terminates polyketide synthesis and catalyzes a ring closure reaction.
[0105]
The genes, proteins, modules and domains of epothilone PKS are summarized in Table 2 below.
(Table 2)
[0106]
[Table 2]

NRPS-nonribosomal peptide synthetase; KS-keto synthase; mAT-malonyl-CoA specific acyltransferase; mmAT-methylmalonyl-CoA specific acyltransferase; DH-dehydratase; ER-enoyl reductase; KR-keto reductase; Transferase; TE-thioesterase; * -inactive domain.
[0107]
Sequence inspection assessed the translational coupling between epoA and epoB (between the loading module and the extension module 1 NRPS) and between epoC and epoD. Very small gaps are found between epoD and epoE and between epoE and epoF, while gaps over 100 bp are found between epoB and epoC and between epoF and epoK. These intergenic regions can include a promoter.
[0108]
Thus, epothilone PKS is a multiprotein complex consisting of the gene products of the epoA, epoB, epoC, epoD, epoE, and epoF genes. In order to confer on the host cell the ability to produce epothilone, the host cell is provided with the recombinant epoA, epoB, epoC, epoD, epoE, and epoF genes of the present invention that can be expressed in the host cell, and optionally other genes. (Eg, epoK). One of skill in the art understands that epothilone and other PKS enzymes may be referred to herein as a single entity, but that these enzymes are typically multi-subunit proteins. Thus, by altering one or more genes encoding one or more of a plurality of proteins that make up a PKS, a derivative PKS (a PKS that differs by a deletion or mutation from a naturally occurring PKS) or a hybrid PKS ( PKS), which is composed of parts of two different PKS enzymes.
[0109]
Post-PKS modification or alteration of epothilones involves multiple steps mediated by multiple enzymes. These enzymes are referred to herein as altered or modified enzymes. Expression of the epothilone PKS genes epoA, epoB, epoC, epoD, epoE, and epoF in the host cells of the present invention that do not express epoK results in the production of epothilones C and D as major products, And D lack the C-12-C-13 epoxide of epothilones A and B, but instead have a C-12-C-13 double bond. Thus, epothilones C and D are converted to epothilones A and B by the epoxidase encoded by the epoK gene. Epothilones A and B can be converted to epothilones E and F by the hydroxylase gene, which can be encoded by a gene associated with the epothilone PKS gene cluster or by another gene endogenous to Sorangium cellulosum. Can be coded. Alternatively, these compounds may be formed by a loading module that binds a starter unit other than malonyl-CoA, such as hydroxymalonyl-CoA. Thus, by providing a host cell having one or more recombinant modifying enzyme genes provided by the invention, or by using a host cell that naturally expresses (or does not express) the modifying enzyme, and / or Alternatively, by providing a starter unit other than malonyl-CoA, an optionally modified epothilone or epothilone derivative may be produced in this host cell.
[0110]
Accordingly, the present invention provides a wide variety of recombinant DNA compounds and host cells for expressing naturally occurring epothilones A, B, C and D, and derivatives thereof. The present invention also provides recombinant host cells that produce modified epothilone derivatives in a manner similar to epothilones E and F. Further, any epothilone or epothilone derivative of the invention can be converted to the corresponding epothilone E or F derivative according to the methods described in PCT Publication No. 00/039276, which is incorporated herein by reference.
[0111]
The present invention also provides a wide variety of recombinant DNA compounds and host cells for producing epothilone derivatives. As used herein, the phrase, epothilone derivative, refers to whether at least one domain has been inserted, or a domain has been rendered inactive by deletion or mutation, or mutated to alter its catalytic function. Or a compound produced by a recombinant Epothilone PKS, either substituted by a domain having a different function. In any case, the epothilone derivative PKS thus produced may produce a compound that differs from the structure of a naturally occurring epothilone selected from the group consisting of epothilones A, B, C, D, E and F. To work. To facilitate further understanding of the recombinant DNA compounds and host cells provided by the present invention, a detailed discussion of each of the epothilone PKS loading modules and modules, and their novel recombinant derivatives, is provided below. .
[0112]
The loading module of Epothilone PKS contains an "inactive" KS domain (KS ^Y ), Which is a condensation reaction mediated by an active KS domain due to the presence of a tyrosine (Y) residue instead of a cysteine residue found in the "active" KS domain. Cannot be performed. This KS ^Y The domain performs a decarboxylation reaction mediated by the KS domain. Such "inactive" KS domains are usually found in other PKS enzymes, with glutamine (Q) residues in place of the active site cysteine, and ^Q Called a domain. KS in rat fatty acid synthase ^Q The domain was shown to be unable to undergo condensation, but shows a two order of magnitude increase in decarboxylation. Witkowski et al., 7 Sep. 1999, Biochem. 38 (36): 11643-11650, incorporated herein by reference. KS ^Q The domain, upon decarboxylation, is KS ^Y Can be more efficient than the domain, resulting in KS in epothilone PKS ^Y Domain KS ^Q May increase the efficiency of epothilone biosynthesis in some host cells or under certain culture conditions. This can be achieved by simply changing the codon from a tyrosine codon to a glutamine codon, as described in Example 6 below. This is also KS ^Y The domain can be identified by the KS of another PKS (eg, oleandolide PKS or narvonolide PKS). ^Q (See references cited in the above table along with oleandromycin, nalbomycin and picromycin PKS, and modified enzymes).
[0113]
The epothilone loading module also provides an AT domain specific for malonyl CoA (which is ^Y Deacetylation to produce acetyl groups), and ACP domains. The present invention provides recombinant epothilone derivative loading modules or their encoding DNA sequences, wherein the malonyl-specific AT domain or its coding sequence has another specificity (eg, methylmalonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, and 2-hydroxymalonyl-CoA). When expressed with other proteins of epothilone PKS, such a loading module results in the production of epothilone in which the methyl substituent between the thiazoles of epothilone is replaced by ethyl, propyl and hydroxymethyl, respectively. The present invention provides a recombinant PKS enzyme comprising such a loading module, and a host cell for producing such an enzyme, and a polyketide produced thereby. If the AT domain is altered to specify 2-hydroxymalonyl CoA, the corresponding epothilone PKS derivatives will produce epothilone E and epothilone F derivatives. An AT domain specific for 2-hydroxymalonyl-CoA results in a polyketide having a hydroxyl group at the corresponding position of the produced polyketide, which is methylated to produce a methoxy group by the polyketide modifying enzyme. I do. See, for example, the references cited with FK-520 PKS in the table above. Thus, reference herein to a PKS having a 2-hydroxymalonyl-specific AT domain refers to a polyketide produced by a PKS having either a hydroxyl or methoxy group at the corresponding position in the polyketide.
[0114]
The epothilone PKS loading module also contains the ER domain. The ER domain may be involved in the formation of one of the double bonds of the thiazole moiety of epothilone (as opposed to its normal reaction), but it may be non-functional. In each case, the invention relates to a recombinant DNA compound encoding an epothilone PKS loading module with or without an ER region, as well as an ER domain from another PKS in place of the ER domain of the epothilone loading module ( A hybrid loading module that is either active or inactive, with or without accompanying KR and DH domains. The present invention also provides a recombinant PKS enzyme comprising such a loading module, and a host cell for producing such an enzyme, and a polyketide produced thereby.
[0115]
The epothilone PKS loading module is also replaced with a heterologous PKS-derived loading module to form a hybrid PKS that creates an epothilone derivative. In one embodiment, the loading module of epothilone PKS is replaced with NRPS, as described in the examples below.
[0116]
The loading module of Epothilone PKS follows the first extension module of PKS, which is a cysteine-specific extended NRPS module. This NRPS module is naturally expressed as a separate protein (product of the epoB gene). In one embodiment, a portion of the NRPS module coding sequence is utilized with a heterologous coding sequence. In this embodiment, the invention provides, for example, changing the specificity of the NRPS module of epothilone PKS from cysteine to another amino acid. This change is achieved by constructing a coding sequence, wherein all or part of the epothilone PKS NRPS module coding sequence has been replaced by a NRPS module coding sequence of a different specificity.
[0117]
In one exemplary embodiment, the specificity of the epothilone NRPS module is changed from cysteine to serine or threonine. If such a modified NRPS module is expressed with other proteins of epothilone PKS, the recombinant PKS will produce an epothilone derivative, where the thiazole moiety of epothilone (the epothilone derivative) is oxazole or 5-methyl, respectively. Converted to oxazole moiety. Accordingly, in an exemplary embodiment, the invention provides host cells, vectors, and recombinant epothilone PKS enzymes, wherein the NRPS domain comprises the adenylation domain of epothilone NRPS and the NRPS encoded by the entF gene. Altered by substitution with an adenylation domain (for serine). In another exemplary embodiment, the invention provides a host cell, a vector, and a recombinant epothilone PKS enzyme, wherein the NRPS domain comprises the adenylation domain of the epothilone NRPS and the NRPS encoded by the vibF gene. Altered by substitution with an adenylation domain (for threonine). In one embodiment, these NRPS substitutions are made in epothilone PKS, which is also substituted with malonyl-CoA instead of methylmalonyl-CoA to produce 16-desmethyl derivatives of oxazole and methyloxazole epothilone derivatives. And an extension module 2 coupled to
[0118]
Alternatively, the present invention provides a recombinant PKS enzyme comprising the product of the epoA, epoC, epoD, epoE, and epoF genes (or modified versions thereof) without the NRPS module or with the NRPS module from a heterologous PKS. I will provide a. The heterologous NRPS module can be expressed as a separate protein or as a fusion protein with the epoA or epoC gene. When replacing one module of a PKS with another, it can be important to ensure that compatible inter-module linker sequences are maintained or otherwise utilized. See PCT Publication No. 00/047724 (incorporated by reference).
[0119]
In another embodiment, the present invention provides a recombinant epothilone PKS enzyme and a corresponding recombinant DNA compound and vector, wherein the NRPS module is inactivated or deleted. Thus, the inactive NRPS module proteins and coding sequences provided by the present invention may be those in which the PCP domain has been completely or partially deleted, or otherwise has an active site serine (for phosphopantethenylation). Site) has been inactivated by replacing the amino acid with another amino acid (eg, alanine), or the adenylation domain has been deleted or otherwise inactivated. Including. In one embodiment, both the loading module and the NRPS are deleted or inactivated. In any event, the resulting epothilone PKS can then only function if a substrate is provided that binds to the KS domain of the extension module 2 (or subsequent module) of PKS for epothilone PKS or an epothilone derivative. . In the method provided by the present invention, the cells so modified are then provided with an activated acyl thioester, which is preferably a second, but potentially optionally subsequent, It is bound by an extension module and processed into a new epothilone derivative. The host cell is supplied with an activated acyl thioester to produce the novel epothilone derivatives of the present invention. Host cells expressing PKS or cells without extracts containing the same can be supplied with or supplemented with the novel precursor molecule N-acylcysteamine thioester (NACS) to prepare epothilone derivatives. . See PCT Publication Nos. US99 / 03986 and 00/444717, both of which are incorporated herein by reference, and Examples 9 and 10 below.
[0120]
The second (first non-NRPS) extension module of epothilone PKS includes KS, AT specific for methylmalonyl CoA, DH, KR, and ACP. The second elongation module of epothilone PKS is produced as a separate protein by the epoC gene. All or only a portion of the second extension module coding sequence is used with another PKS coding sequence to create a hybrid module. In this embodiment, the invention provides, for example, replacing methylmalonyl-CoA-specific AT with malonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; deleting DH or KR or both; Replacing DH or KR or both with DH or KR or both specific for different stereochemistry; and / or inserting an ER. The resulting second heterologous extension module coding sequence is co-expressed with epothilone, an epothilone derivative, or another protein that constitutes a PKS that synthesizes another polyketide. Alternatively, the second elongation module of epothilone PKS can be deleted or replaced with a module from a heterologous PKS, which can be fused as a separate protein or to either the epoB or epoD gene product It can be expressed as a fusion protein.
[0121]
An exemplary recombinant PKS gene of the invention is characterized in that the sequence encoding the AT domain for the second elongation module of epothilone PKS changes the AT domain encoding a malonyl-specific AT from a methylmalonyl-specific AT. , Including those that have been changed or modified. Nucleic acids encoding such malonyl-specific AT domains include, but are not limited to, narvonolide PKS, soraphen PKS, rapamycin PKS (ie, extension modules 2 and 12), and FK520 PKS (ie, It can be isolated from the PKS gene encoding the extension modules 3, 7, and 8). If such a second hybrid extension module is co-expressed with other proteins that make up epothilone PKS, the resulting epothilone derivative generated is 16-desmethylepothilone. In one embodiment, the hybrid PKS also includes a methylmalonyl-CoA specific AT domain in extension module 4 and is expressed in a host cell lacking a functional epoK gene, resulting in a compound that is produced , 16-desmethylepothilone D. In another embodiment, the hybrid PKS also includes an altered NRPS specific for threonine, which leads to the production of 5-methyloxazole-16-desmethylepothilone. Further, the present invention provides DNA compounds and vectors encoding the recombinant epothilone PKS enzyme and the corresponding recombinant protein, wherein the KS domain comprises a second (or subsequent) extension module comprising the following: Have been inactivated or deleted, as described in Example 9 of In a preferred embodiment, this inactivation is achieved by changing the codon for cysteine in the active site to an alanine codon. Similar to the corresponding variants described above for the NRPS module, the resulting recombinant epothilone PKS enzyme is epothilone unless it supplies the remaining domains and precursors that can be bound and extended by the module of the recombinant PKS enzyme. Or, it cannot produce an epothilone derivative. Exemplary precursor compounds are described in Example 10 below. Alternatively, such precursors may simply be provided to a host cell expressing only the epoD, epoE, and epoF genes.
[0122]
This third extension module of epothilone PKS contains KS, malonyl-CoA specific AT, KR, and ACP. This third extension module of epothilone PKS is expressed as a protein (the product of the epoD gene), which also includes modules 4, 5 and 6. Due to the modification of any of extension modules 3-6, a protein containing all four extension modules is typically expressed to create a recombinant epothilone PKS that produces an epothilone derivative. In one embodiment, all or a portion of the third extension module coding sequence is used with another PKS coding sequence to create a hybrid module. In this embodiment, the invention provides, for example, substituting a malonyl-CoA-specific AT with a methylmalonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; deleting the KR; Either replacing with a KR specific for different stereochemistry; and / or inserting DH, or DH and ER. The resulting third heterologous extension module coding sequence can be utilized with a coding sequence for PKS that synthesizes epothilone, an epothilone derivative, or another polyketide.
[0123]
An exemplary recombinant PKS gene of the invention is such that the AT domain encoding the sequence for the third elongation module of epothilone PKS changes the AT domain encoding a malonyl-specific AT from a malonyl-specific AT. , Including those that have been changed or modified. Nucleic acids encoding such a methylmalonyl-specific AT domain can be isolated, for example, but not limited to, from the PKS gene encoding DEBS, narvonolide PKS, rapamycin PKS, and FK-520 PKS. When co-expressed with the remaining modules and a protein of epothilone PKS or an epothilone PKS derivative, the recombinant PKS produces a 14-methyl epothilone derivative of the invention.
[0124]
One of skill in the art will recognize that the KR domain of the third extension module of PKS is responsible for forming the hydroxyl groups involved in epothilone cyclization. Consequently, disrupting the KR domain of the third extension module, or adding the DH or DH and ER domains, prevents cyclization, which means that the linear molecule, or epothilone A, B, C, D, E, and F lead to molecules that are cyclized at different positions.
[0125]
The fourth elongation module of epothilone PKS includes AT, KR, and ACP that can bind to either KS, malonyl-CoA or methylmalonyl-CoA. In one embodiment, all or only a portion of the fourth extension module coding sequence is used with other PKS coding sequences to create a hybrid module. In this embodiment, the invention provides, for example, replacing malonyl-CoA and methylmalonyl-specific AT with malonyl-CoA, methylmalonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; And / or substituting KR (including, if necessary, specifying different stereochemistry); and / or inserting DH or DH and ER. The resulting fourth heterologous extension module coding sequence is incorporated into a protein subunit of a recombinant PKS that synthesizes epothilone, an epothilone derivative, or another polyketide. Alternatively, the invention provides a recombinant PKS enzyme for epothilone and epothilone derivatives, wherein the entire fourth extension module can be deleted or replaced with a module derived from a heterologous PKS.
[0126]
In a preferred embodiment, the invention relates to a fourth epothilone PKS modified to encode an AT that binds methylmalonyl-CoA but does not bind malonyl-CoA (or binds malonyl-CoA or does not bind methylmalonyl-CoA). A recombinant DNA compound comprising a coding sequence for an extension module of In one embodiment, this change in specificity is achieved by mutation of the coding sequence for the extension module 4AT domain. Such mutations can be achieved randomly using a mutagen (eg, UV light) or by specific mutagenesis. In another embodiment, this change in specificity is achieved by replacing all or a portion of the extension module 4AT domain coding sequence with a coding sequence for a heterologous AT domain. Accordingly, the present invention provides recombinant DNA compounds and expression vectors, and corresponding recombinant PKSs, wherein a fourth hybrid extension module (with a methylmalonyl-specific AT) is incorporated. The methylmalonyl-specific AT coding sequence may begin with, for example, but not limited to, the coding sequence for oleandride PKS, DEBS, narvonolide PKS, rapamycin PKS, or any other PKS that includes a methylmalonyl-specific AT domain. obtain.
[0127]
In accordance with the present invention, a fourth hybrid extension module expressed from this coding sequence is an epothilone PKS (or PKS for an epothilone derivative), typically a derivative epoD gene product of epothilone PKS, which is a modified epoD gene product. (With a fourth extension module, and extension modules 3, 5, and 6), one or more of which may optionally be in the form of a derivative of epothilone PKS. Thus, the recombinant methylmalonyl-specific epothilone quaternary extension module coding sequence provided by the present invention provides an alternative method for producing a desired epothilone compound in a host cell. In particular, such compounds are epothilones D, B, and F, and the production of epothilone B or a derivative thereof depends on the presence or absence of a functional epoK gene.
[0128]
The present invention also provides a recombinant DNA compound comprising a coding sequence for a fourth elongation module of epothilone PKS that has been modified to encode an AT that binds malonyl-CoA but does not bind methylmalonyl-CoA. The present invention provides recombinant DNA compounds and vectors, and corresponding recombinant PKSs, wherein the fourth hybrid extension module can be incorporated into a derivative epoD gene product. When incorporated into epothilone PKS (or PKS for epothilone derivatives), the resulting recombinant epothilone PKS produces epothilone C, A, and E, and epothilone A production depends on whether a functional epoK gene is present. Depends on
[0129]
In another embodiment, the present invention provides a recombinant host cell for producing 12-desmethyl-12-ethyl-epothilone D. In this embodiment, the invention provides a host cell, wherein the host cell expresses a recombinant epothilone PKS derivative, wherein the AT domain of the extension module 4 is, for example, FK520 or niddamycin PKS. It has been replaced by an ethylmalonyl-CoA-specific extension module from the enzyme. In one embodiment, the host cell is a recombinant host cell, which is encoded by a gene from a heterologous host cell (ccr gene) or to enhance the production of methylmalonyl-CoA. Expresses Crotonyl-CoA reductase under the control of a heterologous promoter. In one embodiment, the host cell is a Myxococcus host cell, which expresses the ccr gene isolated from a Streptomyces host cell. In another embodiment, the host cell transports butyrate and converts it to butyryl-CoA, which is converted to ethylmalonyl-CoA. E. coli have been modified to express or overexpress the A, D, and E genes.
[0130]
In addition to replacing the endogenous AT coding sequence with a coding sequence for an AT specific for methylmalonyl-CoA, the KR domain coding sequence may also include another KR, DH and KR (eg, but not limited to, a module for rapamycin PKS). 10 or from module 1 or 5 of FK-520 PKS), or the coding sequence for DH, KR, and ER. If KR can be replaced with another KR, or KR and DH, and if the extension module 5 (or elsewhere in the PKS) remains unchanged, the recombinant epothilone PKS will produce epothilones C and D. This is because the DH domain of extension module 5 mediates the formation of the C-12-C-13 double bond of epothilones C and D. If KR can be replaced with KR, DH, and ER, and if there is no change in extension module 5 (or elsewhere in PKS), recombinant epothilone PKS will replace 12,13-dehydro-epothilone C and D Generate. If KR can be replaced with or otherwise inactivate inactive KR, recombinant epothilone PKS produces 13-oxo-11,12-dehydro-epothilones C and D.
[0131]
Thus, the present invention provides a recombinant epothilone PKS, wherein the KR domain of extension module 4 is inactivated by mutation, deletion or a non-functional KR domain from another PKS. This recombinant PKS produces mainly 13-oxo-11,12-dehydroepothilone B; the C-11-C-12 double bond observed in the compounds produced by this organism is an extension module. It is believed that this occurs before reduction by the ER domain of extension module 5 due to the transfer of double bonds formed in the nascent polyketide chain by the DH domain of extension module 5. The present invention also provides a host cell, which produces the novel polyketide. For example, Myxococcus xanthus strain K122-56 (this strain was deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA on Nov. 21, 2000, number A, November 21, 2000, in accordance with the Butavest Treaty, and registered on November 21, 2000, on November 21, 2000. (Available) contains the epothilone PKS gene, wherein the KR domain of module 4 has been inactivated by deletion and 13-oxoepothilones A and B and their dehydro derivatives (mainly 13 -Oxo-11,12-dehydroepothilone B). The present invention also provides novel epothilone derivatives produced by this strain.
[0132]
The fifth elongation module of epothilone PKS contains KS, AT, DH, ER, KR, and ACP domains that bind malonyl CoA. In one embodiment, a DNA compound comprising a sequence encoding the fifth elongation module of epothilone PKS can be inserted into a DNA compound comprising a coding sequence for epothilone PKS or a recombinant epothilone PKS that produces an epothilone derivative. In another embodiment, a portion of the fifth extension module coding sequence is utilized with other PKS coding sequences to create a hybrid module coding sequence and a hybrid module encoded thereby. In this embodiment, the invention relates to, for example, replacing malonyl-CoA specific AT with methylmalonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; any of ER, DH, and KR Or deleting one, two, or all three; and / or deleting any one, two, or all three of ER, DH, and KR, KR, DH, and KR, or Substitution with any of KR, DH, and ER is provided, including, if necessary, identifying different stereochemistry. The resulting fifth hybrid extension module coding sequence can be utilized with a coding sequence for PKS that synthesizes epothilone, an epothilone derivative, or another polyketide. Alternatively, the fifth elongation module of epothilone PKS is a protein that constitutes a PKS that is deleted or substituted in its entirety by a module of heterologous PKS and combined with other proteins of epothilone PKS or a derivative thereof to produce an epothilone derivative. Generate
[0133]
Exemplary recombinant PKS genes of the present invention include recombinant epoD gene derivatives, wherein the AT domain encoding the coding sequence for the fifth elongation module of epothilone PKS is modified from a malonyl-specific AT to a methylmalonyl-specific It can be changed or substituted to change the AT domain encoding the target AT. Nucleic acids encoding such methylmalonyl-specific AT domains can be isolated from, for example, but not limited to, the PKS gene encoding DEBS, nalvonolide PKS, rapamycin PKS, and FK-520 PKS. Such a recombinant epoD gene derivative is co-expressed with the epoA, epoB, epoC, epoE, epoF, and / or epoK gene (or a derivative thereof), and the PKS composed thereof is 10-methylepothilone or Produces its derivatives. Another recombinant epoD gene derivative provided by the present invention comprises this modified Module 5 coding sequence as well as Module 4 coding sequence, which encodes an AT domain that binds only methylmalonyl-CoA. When PKS is integrated with the epoA, epoB, epoC, epoE, epoF, and / or epoK genes, the recombinant epoD gene derivative product leads to the production of 10-methyl epothilone B and / or D derivatives.
[0134]
Another exemplary recombinant epoD gene derivative of the invention is wherein one or more of the ER, DH, and KR domains encoding the sequence for the epothilone PKS fifth extension module have been replaced to provide: Or mutated, including: (i) a non-functional ER, DH, or KR domain; (ii) a functional KR domain only; (iii) a functional KR and DH domain; or (iv) A functional ER, DH, or KR domain from another PKS. The discovery that the DH domain of the extension module 5 is responsible for the formation of the C-12-C-13 double bond in epothilones C and D is based on the finding that any organism containing the epothilone PKS gene (Sorangium cellulosum and recombinant host cells). The present invention provides a novel method of the present invention for producing epothilone and epothilone derivatives. In addition, now, the DH domain of extension module 6 is also present on the β-carbonyl of a nascent polyketide, which can be developed according to the method of the invention to make new epothilone derivatives, attached to the previous module. It has been found that it can work.
[0135]
Thus, if the KR, DH, and ER domains of all three extension modules 5 are deleted or otherwise inactivated, the recombinant epothilone PKS will produce the 13-hydroxy-11 of epothilones A and B. Generate oxo analogs. If the DH and ER domains are deleted or otherwise inactivated, the recombinant epothilone PKS is 13-hydroxy-10,11-dehydro-epothilone, mainly 13-hydroxy-10,11-dehydro. Producing epothilone D; The present invention also provides host cells that produce this novel polyketide, for example, Myxococcus xanthus strain K122-148 (this strain is in accordance with the terms of the Budapest Treaty, American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110). -2209 USA, deposited on November 21, 2000 and available under accession number PTA-2711) contains the epothilone PKS gene, where the 5 DH, KR and ER domains of the extension module are , KR domain alone to produce 13-hydroxy-10,11-dehydro-epothilone D. The present invention also provides novel epothilone derivatives produced by this strain. If only the ER domain is deleted or otherwise inactivated, the recombinant epothilone PKS replaces the 10,11-dehydro analogs of epothilone C and epothilone D, mainly 10,11-dehydroepothilone. Generate. Thus, in one aspect, the invention provides a recombinant epothilone PKS, wherein the ER domain of the extension module 5 has been deleted or inactivated by mutation, and 10,11-dehydroepothilone. Generate D. In another embodiment, the present invention provides a Sorangium cellulosum host cell that produces 10,11-dehydro-epothilone D due to a mutation in the coding sequence for the ER domain of elongation module 5 of epothilone PKS.
[0136]
These recombinant epoD gene derivatives of the present invention can be expressed with the epoA, epoB, epoC, epoE, and epoF genes or with the recombinant epo gene containing other modifications (and which itself may contain further modifications). , To produce a PKS that produces the corresponding epothilone derivative. For example, one recombinant epoD gene derivative provided by the present invention also comprises the coding sequence of module 4, which encodes an AT domain that binds only methylmalonyl CoA. As described above, the functionally similar epoD gene for producing epothilone C-11 derivatives also contains one, two or three of the ER, DH, and KR domains of the fifth elongation module of epothilone. All inactivated. Another way to modify such domains in any module is by replacing the complete set of desired domains from another module with the same or heterologous PKS coding sequence. In this manner, the natural composition of PKS is preserved. Also, when present, the KR and DH or KR, DH and ER domains that function together in the native PKS are preferably used in a recombinant PKS. Exemplary substitution domains for the above substitutions include, for example, an inactive KR domain from the rapamycin PKS extension module 3, a KR domain from the rapamycin PKS extension module 5, and a KR domain from the rapamycin PKS extension module 4. DH domains, but are not limited to these. Nucleic acids encoding other such inactive KRs, active KRs, and active KRs and DH domains can be, but are not limited to, for example, PKS genes encoding DEBS, narvonolide PKS, and FK-520PKS. Each of the resulting PKS enzymes produces a polyketide compound that can be further derivatized in vitro by standard chemical methodologies to obtain the semi-synthetic epothilone derivatives of the present invention.
[0137]
The sixth elongation module of epothilone PKS includes KS, AT, DH, ER, KR and ACP that bind to methylmalonyl CoA. In one embodiment, a portion of the sixth extension module coding sequence is utilized with another PKS coding sequence to create a hybrid molecule. In this embodiment, the invention relates to, for example, replacing a methylmalonyl-CoA-specific AT with a malonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; any of ER, DH, and KR Deleting one, two or all three; and / or replacing any one, two or all three of ER, DH and KR with KR, DH and KR, or KR, DH and It provides for substitution of any of the ERs to specify different stereochemistry where appropriate. The resulting heterologous sixth extension module coding sequence can be utilized with the coding sequence of the protein subunit of PKS to make epothilone, an epothilone derivative, or another polyketide. Alternatively, the sixth elongation module of epothilone PKS may be deleted or substituted in its entirety by a module from a heterologous PKS to generate a PKS for the epothilone derivative.
[0138]
Exemplary recombinant PKS genes of the invention include the AT domain coding sequence of the sixth elongation module of epothilone PKS, which alters or replaces the encoded AT domain, thereby changing from a methylmalonyl-specific AT to a malonyl-specific A gene changed to AT is mentioned. Such malonyl-specific AT domain-encoding nucleic acids can be isolated from, but not limited to, the PKS genes encoding, for example, narvonolide PKS, rapamycin PKS, and FK-520PKS. When the recombinant epoD gene of the present invention encoding such a hybrid module 6 is co-expressed with another epothilone PKS gene, the recombinant PKS produces an 8-desmethylepothilone derivative. This recombinant epoD gene derivative may also be co-expressed with a recombinant epo gene derivative containing other modifications, or may itself be further modified to produce a PKS that makes the corresponding 8-desmethylepothilone derivative. Can be done. For example, one recombinant epoD gene provided by the present invention also includes a module 4 coding sequence that encodes an AT domain that binds only methylmalonyl CoA. When incorporated into a PKS with the epoA, epoB, epoC, epoE and epoF genes, the recombinant epoD gene product leads to the production of epothilone B (if a functional epoK gene is present) and 8-desmethyl derivatives of epothilone D.
[0139]
Other exemplary recombinant epoD gene derivatives of the present invention include the ER, DH, and KR domain coding sequences for the six elongation modules of epothilone PKS, including (i) KR and DH domains; (ii) KR domain; And (iii) those substituted with a sequence encoding an inactive KR domain. These recombinant epoD genes of the invention, when co-expressed with other epothilone PKS genes, have the corresponding (i) C-9 alkene, (ii) C-9 hydroxy (both epimers, one of which) Only make further KS and / or ACP substitutions that can be processed by downstream modules unless made in the next module), and (iii) make C-9 keto (C-9-oxo) epothilone derivatives. Six functionally equivalent extension modules can also be created by the interaction of one, two or all three of the ER, DH, and KR domains of the six epothilone extension modules. For example, the present invention relates to Myxococcus xanthus strain K39-164, which was deposited on November 21, 2000, with the American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209 USA, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty. Available under accession number PTA-2711), which contains the epothilone PKS gene, wherein the six KR domains of the extension module have been inactivated by mutation and -Produce ketoepothilone D. The present invention also provides novel epothilone derivatives produced by this strain.
[0140]
Thus, this recombinant epoD gene derivative may also be co-expressed with other recombinant epo gene derivatives with other changes, or may itself produce a PKS that makes the corresponding C-9 epothilone derivative. Can be further changed. For example, one recombinant epoD gene derivative provided by the present invention also includes a module 4 coding sequence that encodes an AT domain that binds only to methylmalonyl CoA. When incorporated into a PKS together with the epoA, epoB, epoC, epoE, and epoF genes, the recombinant epoD gene product, depending on whether or not functional epoK is present, is a derivative of epothilone B and the C-9 derivative of epothilone D. Results in production.
[0141]
Exemplary substitution domains for the above substitutions include, but are not limited to: a KR domain that forms a ketone, an inactive KR domain from a rapamycin PKS module 3, an alcohol that forms, from a rapamycin PKS module 5 KR domain, and KR and DH domains from rapamycin PKS module 4 forming alkene. Other such inactive KR, active KR domains, and active KR and DH domain-encoding nucleic acids include, but are not limited to, the PKS genes encoding DEBS, narbonolide PKS, and FK-520 PKS. Can be separated. Each of the resulting PKSs produces a polyketide compound containing a functional group at the C-9 position, which can be further derived in vitro by standard chemical methods to yield the semi-synthetic epothilone derivatives of the present invention. .
[0142]
The seventh elongation module of epothilone PKS includes KS, AT specific for methylmalonyl CoA, KR, and ACP. This seventh extension module of epothilone PKS is contained in the gene product of the epoE gene, which also contains the eighth extension module. In one embodiment, a DNA compound comprising a sequence encoding the seventh elongation module of epothilone PKS is expressed to form a protein that, along with other proteins, produces an epothilone PKS or epothilone derivative. Configure PKS. In these and related embodiments, the seventh and eighth extension modules of epothilone PKS or a derivative thereof are typically expressed as a single protein and are expressed as epoA, epoB, epoC, epoD, and epoF genes, or Co-expressed with the derivative to constitute PKS. In another embodiment, some or all of the seventh extension module coding sequence is utilized in conjunction with other PKS coding sequences to generate a hybrid module. In this embodiment, the invention provides, for example, replacing a methylmalonyl-CoA-specific AT with a malonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; deleting the KR; Either replacing with a KR specifying a different stereochemistry; and / or inserting DH or DH and ER. The resulting heterologous seventh extension module coding sequence is utilized, optionally in conjunction with other coding sequences, to express a protein, which, along with the other protein, may be epothilone, an epothilone derivative, or another epothilone derivative. Construct PKS to synthesize polyketide. Alternatively, the coding sequence for the seventh extension module in the epoE gene can be deleted or replaced with the coding sequence for a heterologous module to prepare a recombinant epoE gene derivative, which comprises epoA, epoB, epoC , EpoD, and epoF genes can be expressed to make PKS for epothilone derivatives.
[0143]
Exemplary recombinant epoE gene derivatives of the present invention include those in which the AT domain coding sequence for the seventh extension module of epothilone PKS is altered or substituted such that the encoded AT domain is altered, thereby providing methylmalonyl-specific Derivatives in which AT has been converted to malonyl-specific AT. Such malonyl-specific AT domain-encoding nucleic acids can be isolated, for example (and without limitation), from the PKS genes encoding narvonolide PKS, rapamycin PKS, and FK-520 PKS. When co-expressed with other epothilone PKS genes, epoA, epoB, epoC, epoD, and epoF, or derivatives thereof, PKSs are generated for epothilone derivatives having C-6 hydrogen instead of C-6 methyl. You. Thus, if this gene contains no other alterations, the compound produced is 6-desmethylepothilone.
[0144]
The eighth elongation module of epothilone PKS includes KS, AT specific for methylmalonyl CoA, inactive KR and DH domains, methyltransferase (MT) domain, and ACP. In one embodiment, a DNA compound comprising a sequence encoding the eighth elongation module of epothilone PKS constitutes a PKS that is co-expressed with other proteins to produce epothilone PKS or an epothilone derivative. In another embodiment, some or all of the eighth extension module coding sequence is utilized in conjunction with other PKS coding sequences to generate a hybrid module. In this embodiment, the invention provides, for example, replacing a methylmalonyl-CoA-specific AT with a malonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; replacing inactive KR and / or inactive DH Deletion; replacing inactive KR and / or DH with active KR and / or DH; and / or inserting an ER. The resulting heterologous eighth extension module coding sequence is expressed as one protein, which is utilized in conjunction with other proteins to constitute a PKS that synthesizes epothilone, an epothilone derivative, or another polyketide. Alternatively, the coding sequence for the eighth extension module in the epoE gene can be deleted or replaced with the coding sequence for a heterologous module to prepare a recombinant epoE gene, which contains epoA, epoB, epoC, It can be expressed together with the epoD and epoF genes to make PKS for epothilone derivatives.
[0145]
The eighth elongation module of epothilone PKS also contains a methylation or methyltransferase (MT) domain that has the activity of methylating epothilone precursors. This function can be deleted to produce a recombinant epoD gene derivative of the invention, wherein the AT domain of the eighth extension module has a malonyl-specific AT domain at the corresponding C-4 position of the epothilone molecule. Can be co-expressed with other epothilone PKS genes or derivatives thereof, creating an epothilone derivative lacking one or both methyl groups, depending on whether or not it has been altered.
[0146]
The ninth extension module of epothilone PKS includes KS, AT specific for malonyl CoA, KR, inactive DH, and ACP. This ninth extension module of epothilone PKS is expressed as one protein (the product of this epoF gene), which also contains the TE domain of epothilone PKS. In one embodiment, a DNA compound comprising a sequence encoding the ninth extension module of epothilone PKS is expressed as one protein and, together with the other protein, constructs a PKS that produces epothilone PKS or an epothilone derivative. . In these embodiments, the ninth extension module is typically expressed as one protein, which also includes the TE domain of either epothilone PKS or heterologous PKS. In another embodiment, some or all of the ninth extension module coding sequence is utilized in conjunction with other PKS coding sequences to generate a hybrid module. In this embodiment, the invention provides, for example, substituting a malonyl-CoA-specific AT with a methylmalonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA, or 2-hydroxymalonyl-CoA-specific AT; deleting the KR; Replacing with a KR that specifies a different stereochemistry; and / or inserting DH or DH and ER. For example, replacement of the AT domain of extension module 9 with an AT domain specific for methylmalonyl-CoA generates 2-methyl-epothilones A, B, C, and D in a recombinant Myxococcus host cell of the invention. This results in a recombinant epothilone PKS. The resulting heterologous ninth extension module coding sequence constitutes a PKS that is co-expressed with other proteins to synthesize epothilone, an epothilone derivative, or another polyketide. Alternatively, the invention provides a PKS for epothilone or an epothilone derivative, wherein the ninth extension module has been replaced by a heterologous PKS-derived module or deleted in its entirety. In the latter embodiment, the TE domain is expressed as a separate protein or fused with an eighth extension module.
[0147]
In another embodiment, the invention relates to heterologous PKS gene clusters (PKS gene clusters of the same type that are not found in unmodified naturally occurring host cells), as well as thioesterase type II proteins ("TE II"). The present invention provides a host cell comprising a gene encoding In a preferred embodiment, the TE II gene is heterologous to the PKS gene cluster--the TE II gene is not from the same gene cluster as PKS. As one example, a recombinant host cell of the invention, in one embodiment, comprises a gene encoding expression of epothilone PKS or an epothilone PKS derivative. According to this aspect of the invention, the host cell is modified to include a TE II gene isolated from a PKS gene cluster other than the epothilone PKS gene cluster. Exemplary embodiments include, for example, the TE II gene from the picromycin PKS gene cluster of Streptomyces venezuelae and the TE II gene from the tmbA PKS gene cluster of Sorangium cellulosum (these PKS gene clusters include: U.S. Patent No. 6,090,601; U.S. Patent Application No. 144,085 (filed August 31, 1998); and U.S. Provisional Application No. 60 / 271,245 (filed February 15, 2001), Each of which is described herein).
[0148]
Illustrative examples of the recombinant epothilone derivative PKS genes of the present invention, which are identified by listing the altered specificity of a hybrid module (another module having the same specificity as epothilone PKS), include: These include:
(A) Module 4 with methylmalonyl-derived AT (mmAT) and KR and Module 2 with malonyl-specific AT (mAT) and KR;
(B) module 4 with mmAT and module 3 with mmAT;
(C) module 4 with mmAT and module 5 with mmAT;
(D) module 4 with mmAT and module 5 with only mmAT and DH and KR;
(E) module 4 with mmAT and module 5 with only mmAT and KR;
(F) module 4 with mmAT and module 5 with only mmAT and inactive KR;
(G) module 4 with mmAT and module 6 with mAT;
(H) module 4 with mmAT and module 6 with only mAT and DH and KR;
(I) module 4 with mmAT and module 6 with only mAT and KR;
(J) module 4 with mmAT and module 6 with only mAT and inactive KR;
(K) module 4 with mmAT and module 7 with mAT;
(L) hybrids (d)-(f), excluding module 5 with mAT;
(M) hybrids (h)-(j), excluding module 6 with mmAT;
(N) Excluding modules 4 having hybrids (a) to (m) and mAT.
The above list is exemplary only, and should not be construed as limiting the invention, as these are only other recombinant epothilone PKS genes and enzymes having two hybrid modules other than the hybrid module shown. But not recombinant Epothilone PKS genes and enzymes with three or more hybrid modules.
[0149]
A host cell of the invention can be grown and fermented under conditions known in the art for other purposes to produce a compound of the invention. The present invention also provides a novel method for fermenting the host cells of the present invention. Compounds of the present invention can be isolated from the fermentation broth of these cultured cells and purified by a method as described in Example 3 below.
[0150]
The present invention provides a number of methods related to the fermentation of Myxococcus strains for the production of polyketides and other products. Prior to the present invention, the fermentation of Myxococcus was not performed for the purpose of production for TA and any polyketides other than saframycin, which TA and saframycin were naturally produced by certain Myxococcus strains. Is done. Thus, in one aspect, the present invention provides useful bioactive compounds (polyketides, non-ribosomal peptides, epothilones, lipases, proteases, other proteins, lipids, glycolipids, rhamnolipids, and polyhydroxyalkanoates). (Including, but not limited to) Myxococcus as a production host for production by fermentation.
[0151]
One of the methods provided by the present invention is a method of preparing and storing a cell bank, and a method of adapting a Myxococcus strain to a fermentation medium. These methods are important. Because, prior to the present invention, a frozen cell bank of Myxococcus strains adapted for production in an oil-based fermentation medium has not been created, and in the absence of adaptation, Myxococcus strains, especially oil-based This is because the fermentation medium frequently kills.
[0152]
The present invention also provides a fermentation method for growing Myxococcus, and a fermentation medium useful in the method. Surprisingly, Myxococcus xanthus and other Myxococcus strains cannot utilize carbohydrates, glycerol, alcohols, or TCA cycle intermediates as carbon sources. Prior to the present invention, M.P. Xanthus fermentation was performed in a protein-based medium. However, NH ₄ Increases to a level toxic to growth in protein-based media and limits fermentation. According to the invention, the Myxococcus strain is fermented in a medium containing oil and / or fatty acids as a carbon source.
[0153]
Exemplary oils and fatty acids useful in this method include, but are not limited to, methyl oleate; oils from coconut, lard, rape, sesame, soybean, and sunflower; salad oils; Agrimul CoS2, R5O5 And self-emulsifying oils such as R5O3; glycerol oleate (including glycerol monooleate and glycerol trioleate); odd chain esters (e.g., methylheptadecanoate, methylnonadecanoate, and methylperargonate); Ester chains (eg, propyl oleate and ethyl oleate); plant methyl oleate; methyl stearate; methyl linoleate; oleic acid; and phosphatidylcholine (pure or derived from soy or egg yolk) Or whatever). Thus, oils of any plant or grain (eg, sunflower or soybean oil), oils of any animal (eg, lard oil), free fatty acids and esters of any chain length, both saturated and unsaturated Fatty acids, mixtures of natural and synthetic fatty acids (eg, phosphatidylcholine or methylpelargonate, respectively), and industrial fermented oils (eg, the Cognis Corporation's Agrimul series) can be used in this method. In a preferred embodiment, the fermentation medium utilizes methyl oleate as a carbon source. Generally, oils that are liquid at room temperature are preferred over solid oils, mainly due to the ease of dispersion. Other important components of the fermentation medium include trace metals, such as Fe and Cu, which improve growth and production in complex and defined media, and batch and fed-batch processes. I do. Medium containing methyl oleate and trace metals is preferred for epothilone production.
[0154]
In one embodiment, the invention provides a fermentation medium for a host cell of the invention that comprises a reduced amount of animal-derived material or no animal-derived material. Due to the potential for contaminants by infectious agents (eg, viruses and prions), reduced amounts of animal-derived material are used due to the use of animal by-products in the fermentation process for the production of compounds for human or animal administration. The use of fermentation media with or without animal-derived material may be preferred. Such a medium is provided for use in the method of the invention. The oil or fatty acid contained in the fermentation medium can be from a non-animal source, such as a plant. For example, methyl oleate from vertebrates can be obtained commercially. In addition, animal-derived material can be replaced with non-identical material from an equivalent but non-animal source. For example, casitone, a pancreatic digest of the milk protein casein, is a hydrolyzate of protein from non-animal sources, including, but not limited to, plants, such as protein from vegetables. (Hydrolysate).
[0155]
Generally, a fed-batch process is preferred for fermentation. Feeding allows the cells to use nutrients efficiently (eg, the cells use carbon instead of producing toxic organic acids). ₂ And H ₂ Metabolized to O). High nutrient levels may suppress secondary metabolism, and production may be higher if the fermentation feeds nutrients at a rate below the threshold of inhibition.
[0156]
The fermentation methods of the present invention also include those particularly relevant to the production of epothilones and fermentation media useful in these methods. As one example, propionate and acetate can be used to affect the epothilone D: C (or B: A) ratio and the resulting epothilone potency. Although this effect is minimal in the preferred methyl oleate / trace metal fermentation medium, this effect can be quite significant in other media (eg, CTS medium). Increasing the amount of acetate in the fermentation medium can increase Myxococcus growth and epothilone production. Acetate alone dramatically increases epothilone C (or epothilone A) titers and decreases epothilone D (or epothilone A) titers. Propionate alone does not increase epothilone titers, and high concentrations of propionate may decrease titers. However, the combination of propionate and acetate may shift production from epothilone C (or epothilone A) to epothilone D (or epothilone B). One preferred medium for epothilone D production contains kaziton, 10 mM acetate, and 30 mM propionate. Media containing odd-chain fatty acids can reduce epothilone C production in fermentation of Myxococcus xanthus cells producing epothilone C and epothilone D. Trace metals may also enhance epothilone D production and increase the epothilone D: C ratio in the presence of acetate and no oil in the fermentation medium.
[0157]
The present invention also provides a method for purifying epothilone from a fermentation medium and a method for preparing a crystalline form of epothilone. Generally, this purification method involves the capture of epothilone on XAD resin during fermentation, elution from this resin, solid phase extraction, chromatography, and crystallization. This method is described in detail in Example 3. And while this method is preferred and exemplified for epothilone D, it generally involves crystalline epothilones (including other naturally occurring epothilones and epothilone analogs produced by the host cells of the present invention). (Not limited to these).
[0158]
Thus, in another embodiment, the present invention provides isolated and purified forms of the novel epothilone derivative compounds useful in agriculture, veterinary practice, and medicine. In one embodiment, the compounds are useful as fungicides. In another embodiment, the compounds are useful in cancer chemotherapy. In another embodiment, the compound is used to prevent unwanted cell proliferation, including, but not limited to, treatment of inflammation, autoimmune diseases, and hyperproliferative diseases such as psoriasis, and to inhibit cell proliferation in stents. Useful for prevention. In a preferred embodiment, the compound is an epothilone derivative that is at least as potent on tumor cells as epothilone B or epothilone D. In another embodiment, the compounds are useful as immunosuppressants. In another embodiment, the compound is useful in making another compound. In a preferred embodiment, the compounds are formulated in a mixture or solution for administration to humans or animals.
[0159]
The novel epothilone analogs of the present invention, as well as epothilones produced by the host cells of the present invention, can be derived and formulated as described below: PCR Patent Publication Nos. 93/10121, 97/19086. Nos. 98/088849, 98/22461, 98/25929, 99/01124, 99/02514, 99/07692, 99/27890, and 99/27890, No. 99/39694, No. 99/40047, No. 99/42602, No. 99/43320, No. 99/43653, No. 99/54318, No. 99/54319, No. Nos. 99/54330, 99/65513, 99/67252, 99/67253, and 00/00485, and U.S. Patent No. 5,969,145 (each of which is incorporated herein by reference).
[0160]
The compounds of the present invention include 14-methylepothilone derivatives (made by utilizing the hybrid module 3 of the present invention having an AT that binds to methylmalonyl-CoA instead of malonyl-CoA); Siron derivatives (made by using the hybrid module 6 of the present invention having DH and KR instead of ER, DH, and KR); 10-methylepothilone derivatives (AT binding to methylmalonyl-CoA instead of malonyl-CoA) 9-hydroxyepothilone derivative (made by using the hybrid module 6 of the present invention having KR instead of ER, DH, and KR). 8-desmethyl-14-methyle; Siron derivatives (made by using hybrid module 3 of the invention having an AT that binds to methylmalonyl-CoA instead of malonyl-CoA and hybrid module 6 that binds to malonyl-CoA instead of methylmalonyl-CoA); 8-desmethyl- 8,9-dehydroepothilone derivatives (prepared by using the hybrid module 6 of the present invention having DH and KR instead of ER, DH, and KR, and having AT specifying malonyl-CoA instead of methylmalonyl-CoA) And 9-oxo-epothilone D. Other preferred novel epothilones of the present invention include those described in Example 11 and below.
[0161]
In one aspect of the invention, a compound of the formula:
[0162]
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Is provided, where:
R ¹ , R ² , R ³ , R ⁵ , R ¹¹ And R ¹² Are each independently hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁴ , R ⁶ And R ⁹ Are each independently hydrogen, hydroxyl, or oxo; or
R ⁵ And R ⁶ Together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ Is hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁸ And R ¹⁰ Are both hydrogen or together form a carbon-carbon double bond or epoxide;
Ar is aryl; and
W is O or NR ^Thirteen Where R ^Thirteen Is hydrogen, C ₁ ~ C ₁₀ Aliphatic aryl or C ₁ ~ C ₁₀ It is an aliphatic alkylaryl. In another embodiment, there is provided a compound of formula I, wherein R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹¹ , R ¹² , R ^Thirteen , Ar and W are as previously described, with the proviso that R ¹ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁹ , And R ¹¹ At least one is not hydrogen).
[0163]
In another embodiment, there is provided a compound of formula I, wherein:
R ¹ , R ² , R ³ , And R ¹¹ Are each independently hydrogen or methyl;
R ⁴ And R ⁹ Are each independently hydrogen, hydroxyl, or oxo;
R ⁵ And R ⁶ Are together hydrogen or together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ And R ¹² Are both methyl;
R ⁸ And R ¹⁰ Are together hydrogen or together form a carbon-carbon double bond;
Ar is heteroaryl; and
W is O or NR ^Thirteen Where R ^Thirteen Is hydrogen or C ₁ ~ C ₅ Alkyl, provided that R ¹ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁹ , And R ¹¹ At least one is not hydrogen.
[0164]
In another aspect of the invention, the formula:
[0165]
Embedded image

The compound is provided, where:
R ⁴ , R ⁶ And R ⁹ Are each independently hydrogen, hydroxyl, or oxo;
R ⁵ , R ¹¹ , R ¹² Are each independently hydrogen, methyl or ethyl; or
R ⁵ And R ⁶ Together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ Is hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁸ And R ¹⁰ Are both hydrogen or together form a carbon-carbon double bond or epoxide;
Ar is aryl; and
W is O or NR ^Thirteen Where R ^Thirteen Is hydrogen or C ₁ ~ C ₅ Alkyl. In another embodiment, there is provided a compound of formula II, wherein R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ , R ¹⁰ , R ¹² , R ^Thirteen , Ar and W are as previously described, with the proviso that R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , And R ⁹ At least one is not hydrogen).
[0166]
In another embodiment, there is provided a compound of formula II, wherein:
R ⁴ And R ⁹ Are each independently hydrogen, hydroxyl, or oxo;
R ⁵ And R ⁶ Are each hydrogen or together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ And R ¹² Are both methyl;
R ⁸ And R ¹⁰ Are together hydrogen or together form a carbon-carbon double bond;
Ar is 2-methyl-1,3-thiazolinyl, 2-methyl-1,3-oxazolinyl, 2-hydroxymethyl-1,3-thiazolinyl, or 2-hydroxymethyl-1,3-oxazolinyl; and
W is O or NH (provided that R is ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , And R ⁹ At least one is not hydrogen).
[0167]
In another aspect of the invention, the formula:
[0168]
Embedded image

Is provided, wherein:
R ¹ , R ² , R ³ , R ⁵ , R ¹¹ , R ¹² Are each independently hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁶ Is hydrogen; or
R ⁵ And R ⁶ Together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ Is hydrogen, methyl or ethyl;
Ar is aryl; and
W is O or NR ^Thirteen Where R ^Thirteen Is hydrogen or C ₁ ~ C ₅ Alkyl. In another embodiment, there is provided a compound of formula III, wherein R ¹ , R ² , R ³ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ¹¹ , R ¹² , R ^Thirteen , Ar and W are as previously described, with the proviso that R ¹ , R ⁵ , R ⁶ , And R ¹¹ At least one is not hydrogen).
[0169]
In another embodiment, provided is a compound of Formula III, wherein:
R ¹ , R ² , R ³ , R ¹¹ Are each independently hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁵ And R ⁶ Are together hydrogen or together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ And R ¹² Are both methyl;
Ar is 2-methyl-1,3-thiazolinyl, 2-methyl-1,3-oxazolinyl, 2-hydroxymethyl-1,3-thiazolinyl, or 2-hydroxymethyl-1,3-oxazolinyl; and
W is O or NH (provided that R is ¹ , R ⁵ , R ⁶ , And R ¹¹ At least one is not hydrogen).
[0170]
In another aspect of the invention, the formula:
[0171]
Embedded image

The compound is provided, where:
R ⁴ Is hydrogen or oxo;
R ⁵ And R ⁶ Are together hydrogen or together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ Is hydrogen or methyl;
R ⁹ Is hydrogen or hydroxyl;
R ⁸ And R ¹⁰ Are together hydrogen or together form a carbon-carbon double bond or epoxide;
W is O or NH;
X is O or S; and
R ¹⁴ Is methyl or hydroxymethyl.
[0172]
In another aspect of the invention, the compound is of the formula:
[0173]
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here:
R ⁴ Is hydrogen or oxo;
R ⁵ And R ⁷ Are each independently hydrogen or methyl;
R ⁶ Is hydrogen;
R ⁸ And R ¹⁰ Are either hydrogen or together form a carbon-carbon double bond or an epoxide; or
R ⁶ And R ⁸ Together form a double bond;
R ⁹ Is hydrogen, hydroxyl or oxo;
W is O or NH;
X is O or S; and
R ¹⁴ Is methyl or hydroxymethyl.
[0174]
In another aspect of the invention, the following:
[0175]
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Are provided.
[0176]
The compounds of the invention are cytotoxic agents and can be used in any suitable manner, including but not limited to anti-cancer agents. An exemplary assay for assessing the degree of cytotoxicity or tubulin polymerization is described in Example 12.
[0177]
The compounds of the present invention can be made using a number of methods. In one aspect of the invention, these compounds are produced by a recombinant host cell that expresses epothilone PKS. In one embodiment, the formula:
[0178]
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(Wherein R ¹ ~ R ¹² Is as previously described for Formula I), but by altering the AT specificity in one or more modules and / or altering the enzymatic domain in one or more modules Produced by Example 11 describes the types of modifications and specific compounds that can be made using this method.
[0179]
In another embodiment of the present invention, the oxazole counterpart of Formula V can be made by adjusting the fermentation conditions of the host cell that normally makes the compound of Formula V. The thiazole moiety of the compound of formula V is derived from a cysteine bond in the NRPS. Epothilone H ₁ And H ₂ (This is the oxazole counterpart of epothilone C and epothilone D) is produced by trace amounts of host cells, and is thought to result from the extraordinary binding of serine instead of cysteine in epothilone NRPS.
[0180]
The method takes advantage of the distinct competition between serine and cysteine at the NRPS binding site of epothilone PKS, and uses culture conditions that prefer serine binding instead of cysteine at epothilone NRPS. It has been found that growing host cells in media supplemented with serine (eg, a 50-fold increase over basal levels) results in the production of mostly oxazole-containing compounds instead of the normally produced thiazole-containing compounds. Was issued. Thus, a recombinant host cell engineered to produce a particular epothilone compound or compound of formula V can be grown in media supplemented with serine, such that the cell is now an oxazole counterpart The following formula:
[0181]
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Prefers the production of compounds.
[0182]
In other words, the method is a simple and sophisticated method of obtaining two compounds, one corresponding to Formula V and its counterpart corresponding to Formula VI for a portion thereof. The serine replenishment method for making oxazole-containing compounds is described in more detail in Example 13. This example demonstrates epothilone H ₂ And epothilone H ₁ (Oxazole counterparts of Epothilone D and Epothilone C, respectively) Describes the conditions used to reduce the levels of Epothilone D and Epothilone C normally produced by strain K111-40-1 to favor the product. Other recombinant constructs that make other compounds of Formula V of the present invention can be grown using conditions similar to those for making compounds of Formula VI.
[0183]
In another aspect of the invention, the compounds are produced using a method called chembiosynthesis. This method uses an epothilone PKS that has been modified in such a way that the PKS accepts and binds the synthetic precursor at the designated site. The synthesis precursor is then advanced from this point forward by PKS in the usual manner.
[0184]
An illustrative example of the type of modification required for chemical student synthesis is described in Example 9, which is a M that normally produces Epothilone A, Epothilone B, Epothilone C, and Epothilone D as major products. . The construction of the KS2 knockout type of xanthus strain is described. KS2 knockout is referred to as inactivation of the KS domain of extension module 2, so that the resulting PKS can load the previous module, the loading domain, and the product of the NRPS (which takes into account extension module 1). No, and can not proceed. Thus, PKS-directed synthesis stalls in the ACP of extension module 2, and epothilone products are not produced by such strains in the absence of synthetic precursors. However, if the strain is provided with a synthetic precursor, this mimics the production of the loading domain and extension module 1, so that the ACP of extension module 2 binds to the precursor and PKS binds this precursor. The precursor is advanced from this point forward. For example, the knockout strain of Example 9 was synthesized with a synthetic precursor:
[0185]
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When provided with, it causes the production of epothilone B and epothilone D, as described in more detail in Example 10 (epothilone A and epothilone B are also produced but in trace amounts). See also FIG. In another example, the knockout strain of Example 9 is synthesized with a synthetic precursor, for example:
[0186]
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(Where R is hydrogen, hydroxy, halogen, amino, C ₁ ~ C ₅ Alkyl, C ₁ ~ C ₅ Hydroxyalkyl, C ₁ ~ C ₅ Alkoxy, and C ₁ ~ C ₅ The following epothilone compounds when provided with an aminoalkyl, more preferably hydrogen or methyl):
[0187]
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As well as their respective 12,13-epoxide counterparts.
[0188]
Thus, by altering the synthetic precursor, a single KS2 knockout strain can be used to make a wide variety of compounds. In fact, the strain described in Example 9 has the formula:
[0189]
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(Where Ar is aryl and R ⁷ Is hydrogen or methyl) to produce a compound of the formula:
[0190]
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(Exemplary examples of suitable Ar groups include:
[0191]
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(Where R is hydrogen, hydroxy, halogen, amino, C ₁ ~ C ₅ Alkyl, C ₁ ~ C ₅ Hydroxyalkyl, C ₁ ~ C ₅ Alkoxy, and C ₁ ~ C ₅ Aminoalkyl) can be used by providing it with synthetic precursors thereof. In a more preferred embodiment, R is hydrogen or methyl. Example 10 describes the synthesis of various precursors and their use in chemical synthesis and their respective 12,13-epoxide counterparts.
[0192]
In another embodiment, loading domain knockouts are used to make certain compounds of the invention. For example, the loading domain knockout of the starting material used in Example 9 also has the formula
[0193]
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Can be used to make compounds of formulas VII and VIII by providing a synthetic precursor of
[0194]
In other embodiments, KS2 or loading domain knockouts of other strains of the invention are made to include, but are not limited to, those strains described in Example 11 and other than 2-methylthiazole. Used to make compounds having an aryl moiety. For example, providing a synthetic precursor of Formula IX to the KS2 knockout of a construct that preferentially produces 9-oxo-epothilone D is represented by the formula
[0195]
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(Where Ar is aryl).
[0196]
In another aspect of the invention, compounds made from host cells that express epothilone PKS may be further modified using biological and / or synthetic methods. In one embodiment, the compound of Formula I wherein Ar is
[0197]
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Can be hydroxylated at the C-21 carbon using a microbially-derived hydroxylase. Protocols for performing such transformations are described, for example, in PCT Publication No. WO 00/39276, which is hereby incorporated by reference in its entirety, and Example 14 herein. .
[0198]
In another embodiment, compounds of the invention having a carbon-carbon double bond at positions corresponding to C-12 and C-13 of epothilones AD are epoxidized using EpoK or another P450 epoxidase. Can be done. A general method of using EpoK for epoxidation is described in Example 5 of PCT Publication No. WO 00/31247 (herein incorporated by reference in its entirety) and Example 15 herein. be written. Alternatively, the epoxidation reaction may occur by contacting an epothilone compound containing a double bond at a position corresponding to the bond between carbon-12 and carbon-13 with a cell culture expressing functional EpoK. Such cells include myxobacterium Sorangium cellulosum. In a particularly preferred embodiment, the Sorangium cellulosum expresses EpoK but does not contain a functional epothilone polyketide synthase ("PKS") gene. Such a strain can be created by mutagenesis, wherein one or more mutations in the epothilone PKS gene abolish it. Such mutations can occur naturally (can be found by screening), or can be directed using either mutagens (eg, chemicals) or irradiation, or by genetic engineering. . A particularly effective strategy for generating strains with invalid epothilone PKS is homologous recombination as described in PCT Publication WO 00/31247.
[0199]
In another embodiment, the epoxidation reaction can occur using synthetic methods. For example, as shown in Scheme 2, a desoxy compound of the present invention can be converted to an epoxy counterpart by reacting the desoxy compound with dimethyldioxirane.
[0200]
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Example 16 describes this synthesis method in more detail.
[0201]
In another embodiment, a macrolactone of the invention can be converted to a macrolactam of the invention. As illustrated in Scheme 3, the desoxy macrolactone of the present invention is epoxidized using dimethyldioxirane as described above in Scheme 2 to provide an oxycounterpart.
[0202]
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Oxy-macrolactone is treated with sodium azide and tetrakis (triphenylphosphine) palladium to open the ring to form azido acid. This azide is then reduced with trimethylphosphine to form an amino carboxylic acid.
[0203]
The epoxy compounds of the present invention, where W is NH, can be made from the macrolactamization of amino carboxylic acids.
[0204]
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As shown in Scheme 4, an amino carboxylic acid is treated with 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl-carbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole to form an epoxy macrolactam. The desoxy-macrolactam can be made by treating the epoxy-macrolactam with tungsten hexachloride and butyllithium.
[0205]
The epoxy compound of the present invention (where W is NR ^Thirteen And R ^Thirteen Is not hydrogen) can be made by treating the amino carboxylic acid with an aldehyde and sodium cyanoborohydride prior to macrolactamization.
[0206]
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As shown in Scheme 5, the amino carboxylic acid is an aldehyde, R ^Thirteen HO and treated with sodium cyanoborohydride and then macrolactamized as described above in Scheme 4 to form substituted amino acids that are optionally deoxygenated to form epoxy and desoxy macrolactams (here And R ^Thirteen Is not hydrogen).
[0207]
Synthetic methods for making the macrolactams of the present invention are also described in more detail by Examples 17-19. Example 17 describes the formation of amino acids using 9-oxo-epothilone D as an exemplary starting material. Examples 18 and 19 describe the formation of epoxy and desoxy macrolactam versions of 9-oxo-epothilone D, respectively. Examples 20 and 21 describe the formation of epoxy- and desoxy-substituted macrolactam versions of 9-oxo-epothilone D, respectively.
[0208]
Compositions of the invention generally comprise a compound of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The compounds of the invention may be in free form or may be suitable as pharmaceutically acceptable derivatives (eg, prodrugs, and salts and esters of the compounds of the invention).
[0209]
The composition can be in any suitable form, for example, a solid, semi-solid, or liquid form. See Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th edition, Lippicott Williams & Wilkins (1991), incorporated herein by reference. Generally, pharmaceutical preparations contain one or more compounds of the present invention as active ingredients, in admixture with organic or inorganic carrier excipients suitable for topical, enteral, or parenteral use. The active ingredient is non-toxic, pharmaceutically acceptable, for example, useful for tablets, pellets, capsules, suppositories, pessaries, solutions, emulsions, suspensions, and any other form suitable for use. Can be combined with a carrier. Carriers that can be used include water, glucose, lactose, gum acacia, gelatin, mannitol, starch paste, magnesium trisilicate, talc, corn starch, keratin, colloidal silica, potato starch, urea, and use in preparation manufacture Other suitable carriers (in solid, semi-solid, liquid form). In addition, auxiliary, stabilizing, thickening and coloring agents and perfumes may be used.
[0210]
In one embodiment, a composition comprising a compound of the present invention does not include Cremophor®. Cremophor® (BASF Aktiengesellschaft) is a polyethoxylated castor oil, which is typically used as a surfactant in formulating poorly soluble drugs. However, since Cremophor® can cause an allergic reaction in a subject, compositions that minimize or eliminate Cremophor® are preferred. Formulations of Epothilone A or B that exclude Cremophor® are described, for example, in PCT Publication No. WO 99/39694, incorporated herein by reference, and are adapted for use with the compounds of the present invention. obtain.
[0211]
Where applicable, the compounds of the invention can be formulated as microcapsules and nanoparticles. General protocols are described, for example, in Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, edited by Max Donbrow, CRC Press (1992) and U.S. Patent Nos. 5,510,118; 5,534,270; 662,883, all incorporated herein by reference. By increasing the ratio of surface area to volume, these formulations allow oral delivery of compounds that do not follow oral delivery without increasing the ratio of surface area.
[0212]
The compounds of the invention may also be formulated using other methods previously used for poorly soluble drugs. For example, the compound may form an emulsion with Vitamin E or a PEGylated derivative thereof as described in WO 98/30205 and 00/71163, incorporated herein by reference. Typically, the compounds of the invention are dissolved in an aqueous solution comprising ethanol (preferably less than 1% w / v). Vitamin E or PEGylated vitamin E is added. The ethanol is then removed to form a pre-emulsion that can be formulated for intravenous or oral administration. Another strategy involves encapsulating the compound of the invention in liposomes. Methods for forming liposomes as drug delivery vehicles are well known in the art. Suitable protocols include U.S. Patent Nos. 5,683,715; 5,415,869, and 5,424,073, which are incorporated herein by reference for another relatively poorly soluble cancer drug, taxol. And the protocols described in PCT Publication WO 01/10412 (herein incorporated by reference for Epothilone B). Among the various lipids that can be used, particularly preferred lipids for making epothilone-encapsulated liposomes include phosphatidylcholine and polyethylene glycol-derived distearylphosphatidylethanolamine. Example 22 provides an exemplary protocol for making liposomes containing 9-oxo-epothilone D, a general method that can be readily adapted to make liposomes containing other compounds of the present invention. I do.
[0213]
Yet another method involves formulating a compound of the present invention using a polymer, such as a biopolymer or a biocompatible (synthetic or naturally occurring) polymer. Biocompatible polymers can be categorized as biodegradable and non-biodegradable. Biodegradable polymers degrade in vivo as a function of chemical compositions, methods of manufacture, and implant structures. Illustrative examples of synthetic polymers include polyanhydrides, polyhydroxy acids (eg, polyacetic acid, polyglycolic acid and their polymers), polyester polyamide polyorthoesters, and some polyphosphazenes. Illustrative examples of naturally occurring polymers include proteins and polysaccharides such as collagen, hyaluronic acid, albumin, and gelatin.
[0214]
Another method involves conjugating a compound of the present invention to a polymer that enhances water solubility. Examples of suitable polymers include polyethylene glycol, poly- (d-glutamic acid), poly- (l-glutamic acid), poly- (l-glutamic acid), poly- (d-aspartic acid), poly- (l-asparagine). Acid), poly- (1-aspartic acid) and copolymers thereof. Polyglutamic acids having a molecular weight between about 5,000 and about 100,000 are preferred, molecular weights between about 20,000 and about 80,000 are more preferred, and about 30,000 and about 60,000. Is most preferred. This polymer was prepared according to the present invention via an ester linkage using the protocol essentially described in US Pat. No. 5,977,163 (hereby incorporated by reference) and Example 23. Is conjugated to one or more hydroxyls. For the 21-hydroxy derivatives of the present invention, a preferred conjugate site comprises a hydroxyl off carbon 21. Other conjugate sites include carbon 3 with hydroxyl and carbon 7 with hydroxyl.
[0215]
In another method, the compounds of the invention are conjugated to a monoclonal antibody. This strategy allows for targeting of the compounds of the invention to specific targets. General protocols for the design and use of conjugated antibodies are described in Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer, Michael L. et al. Glossbard (eds. 1998), which is incorporated herein by reference.
[0216]
The amount of active ingredient that can be combined with the carrier materials to produce a single dosage form will vary depending upon the subject being treated and the particular mode of administration. For example, formulations for intravenous use may range from about 1 mg / mL to about 25 mg / mL, preferably from about 5 mg / mL to 15 mg / mL, and more preferably about 10 mg / mL of a compound of the invention. Including quantity. Intravenous formulations are typically diluted prior to use, typically between about 2x and about 30x, with normal saline or 5% dextrose solution.
[0219]
In one aspect of the invention, the compounds of the invention are used to treat cancer. In one embodiment, the compounds of the invention are useful for treating head and neck cancer (head, neck, nasal cavity, sinuses, nasopharynx, oral cavity, oropharynx, larynx, hypopharynx, salivary gland, and paraganglioma) (Including tumors). In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat cancer of the liver and biliary tract, especially hepatocellular carcinoma. In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat bowel cancer, especially colorectal cancer. In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat ovarian cancer. In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat small cell and non-small cell lung cancer. In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat breast cancer. In another embodiment, the compound of the invention is a sarcoma (fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, fetal rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma), neurofibrosarcoma, osteosarcoma, synovial sarcoma, Sarcomas, and soft tissue sarcomas). In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat neoplasms of the central nervous system, especially brain cancer. In another embodiment, the compound of the invention is a lymphoma (Hodgkin's lymphoma, lymphoplasmacytoid lymphoma, follicular lymphoma, mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma, mantle cell lymphoma B-direct large large cell lymphoma, Burkitt) Lymphoma, and T cell anaplastic large cell lymphoma).
[0218]
The method comprises administering a therapeutically effective amount of a compound of the present invention to a subject suffering from cancer. This method can be repeated if necessary to either suppress the cancer (ie, prevent further growth) or to eliminate the cancer. Clinically, practicing this method results in a reduction in the size or number of cancerous growths and / or a reduction in the relevant symptoms (where appropriate). Pathologically, implementation of this method results in at least one of the following: inhibiting cancer cell growth, reducing the size of a cancer or tumor, preventing further metastasis, and inhibiting tumor angiogenesis .
[0219]
The compounds and compositions of the present invention may be used in combination therapy. In other words, the compounds and compositions of the present invention can be administered concurrently with, before, or after one or more other desired therapeutic procedures or medical measures. The particular combination of treatment and procedure in the combination regimen will take into account the suitability of this treatment and / or procedure and the desired therapeutic effect to be achieved.
[0220]
In one embodiment, the compounds and compositions of the invention are used in combination with another anti-cancer agent or procedure. Illustrative examples of other anti-cancer agents include (i) alkylating drugs (eg, mechlorethamine, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, ifosfamide); (ii) antimetabolites drugs (eg, methotrexate); (iii) ) Microtubule stabilizers (eg, vinblastine, paclitaxel, docetaxel, and discodermolide); (iv) angiogenesis inhibitors; (v) and cytotoxic antibiotics (eg, doxorubicon ( doxorubicon) (adriamycin), bleomycin, and mitomycin). Illustrative examples of other anti-cancer procedures include (i) surgery; (ii) radiation therapy; and (iii) photodynamic therapy.
[0221]
In another embodiment, the compounds and compositions of the invention are used in combination with agents or procedures that reduce potential side effects (eg, diarrhea, nausea and vomiting) from the compounds or compositions of the invention. Diarrhea can be treated with anti-diarrheal agents, such as opioids such as codeine, diphenoxylate, diphenoxine, and loeramide, bismuth subsalicylate, and octreotide. Nausea and vomiting can be treated with antiemetic agents such as dexamethasone, metoclopramide, diphenylhydramine, lorazepam, ondansetron, prochlorperazine, thiethylperazine, and dronabinol. For those compositions comprising polyethoxylated castor oil, such as Cremophor®, corticosteroids (eg, dexamethasone and methylprednisolone) and / or H ₁ Antagonists (eg, diphenylhydramine HCl) and / or H ₂ Pretreatment with an antagonist can be used to alleviate anaphylaxis. Exemplary formulations and pretreatment regimens for intravenous use are described in Examples 24 and 25, respectively.
[0222]
In another aspect of the invention, the compounds of the invention are used to treat a non-cancerous disorder characterized by cellular hyperproliferation. In one embodiment, the compounds of the invention are used to treat psoriasis, a condition characterized by cellular hyperproliferation of keratinocytes that accumulate in the skin and form elevated scale lesions. The method comprises administering a therapeutically effective amount of a compound of the invention to a subject suffering from psoriasis. This method can be repeated if necessary to either reduce the number or severity of the lesions, or to eliminate the lesions. Clinically, the practice of this method may include reducing the size or number of skin lesions, reducing skin symptoms (affected skin pain, burning and bleeding) and / or related symptoms (eg, glowing joints, fever, Swelling, diarrhea, abdominal pain). Pathologically, implementation of this method results in at least one of the following: inhibiting keratinocyte proliferation, reducing skin inflammation (eg, attracting and growth factors, antigen presentation, generation of reactive oxygen species) And by affecting matrix metalloproteinases), as well as inhibition of skin angiogenesis.
[0223]
In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat multiple sclerosis, a condition characterized by progressive demyelination in the brain. The exact mechanism for myelin loss is not understood, but there is an increase in astrocyte proliferation and an accumulation of areas of myelin destruction. At these sites, there is increased macrophage-like activity and increased protease activity due at least in part to disruption of the myelin sheath. The method comprises the step of administering a therapeutically effective amount of a compound of the present invention to a subject suffering from multiple sclerosis. This method can be repeated as needed to inhibit astrocyte proliferation and / or to reduce the severity of loss of motor function and / or prevent or attenuate the chronic progression of the disease. Clinically, the practice of this method may include visual symptoms (visual loss, diplopia), impaired gait (weakness, axial instability, loss of sensation, spasticity, hyperreflexia, loss of agility), impaired upper limb function (weakness, It results in improvements in spasticity, loss of sensation, bladder dysfunction (urgency, incontinence, hesitation, incomplete emptying), depression, emotional instability, and cognitive impairment. Pathologically, implementation of this method results in at least one of the following: for example, myelin loss, disruption of the blood-brain barrier, perivascular infiltration of mononuclear cells, immunological abnormalities, glia Gliotic scar formation and astrocyte proliferation, metalloproteinase production, and impaired conduction rates.
[0224]
In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat rheumatoid arthritis (a multiple system chronic, recurrent inflammatory disease that often results in destruction and ankyosis of working joints). You. Rheumatoid arthritis consists of villous protrusions extending into the joint space, synoviocyte lining multilayering (synovial cell proliferation), leukocytes (macrophages, lymphocytes, plasma cells, and lymph nodes; Synovitis), as well as marked hyperplasia of the synovium forming fibrin deposits due to cellular necrosis within the synovium. The tissue formed as a result of this process is called pannus, and ultimately the pannus grows to fill the joint space. This pannus develops a broad network of new blood vessels through the angiogenic process essential for synovial evolution. Digestive enzymes (eg, matrix metalloproteinases (eg, collagenase, stromelysin)) and other mediators of inflammatory processes derived from cells of pannus tissue (eg, hydrogen peroxide, superoxide, lysosomal enzymes, and arachadonic acid) The release of acid) products of metabolism) leads to the progressive destruction of cartilage tissue. This pannus infiltrates articular cartilage which leads to erosion and fragmentation of cartilage tissue. Eventually, there is an erosion of the subchondral bone tissue with fibrous ankylosis of the associated joint and ultimately osseous ankylosis.
[0225]
The method comprises administering a therapeutically effective amount of a compound of the present invention to a subject suffering from rheumatoid arthritis. The method may optionally be used to inhibit synovial cell proliferation and / or reduce the severity of loss of movement of the affected joint and / or prevent or reduce the chronic progression of the disease, as needed. Can be repeated. Clinically, practice of the invention results in one or more of the following: (i) the severity of symptoms (pain, swelling and tenderness of affected joints, weakness, fatigue, anorexia, weight loss); (Ii) decrease in the severity of clinical signs of this disease (thickening of the capsule, thickening of the synovium, joint effusion, soft tissue contracture, reduced range of motion, ankylosis and interarticular process deformity); iii) Reduction of extra-articular manifestations of this disease (rheumatic nodules, vasculitis, pulmonary nodules, interstitial fibrosis, pericarditis, episcleritis, iritis, Felty syndrome, osteoporosis); (iv) disease remission / Increased frequency and duration of asymptomatic periods; (v) prevention of fixation defects and disorders; and / or (vi) prevention / reduction of chronic progression of the disease. Pathologically, practice of the present invention results in at least one of the following: (i) a reduction in the inflammatory response; (ii) the activity of an inflammatory cytokine (eg, IL-I, TNFa, FGF, VEGF). Disruption; (iii) inhibition of synovial proliferation; (iv) inhibition of matrix metalloproteinase activity, and / or (v) inhibition of angiogenesis.
[0226]
In another embodiment, the compounds of the invention are used to treat atherosclerosis and / or restenosis, especially in patients whose obstruction can be treated with an endovascular stent. Atherosclerosis is that some of the normal vascular smooth muscle cells ("VSMC") in the arterial wall, which control vascular tone, which normally regulates blood flow, change their properties and " A chronic vascular disorder that is developing "cancer-like" behavior. The VSMC becomes abnormally proliferative, secretes substances (growth factors, tissue degrading enzymes and other proteins) that can enter the VSMC and diffuse into the inner vascular lining, block blood flow, and Makes blood vessels abnormal and more likely to be completely blocked by local blood clotting. Restenosis (reoccurrence of stenosis or arterial stenosis after a corrective procedure) is an accelerated form of atherosclerosis.
[0227]
The method includes coating a therapeutically effective amount of a compound of the present invention on a stent, and delivering the stent to the affected artery of a subject suffering from atherosclerosis. Methods for coating stents with compounds are described, for example, by U.S. Patent Nos. 6,156,373 and 6,120,847. Clinically, practice of the present invention results in one or more of the following: (i) increased arterial blood flow; (ii) reduced severity of clinical signs of the disease; (iii) restenosis (Iv) Prevention / reduction of the chronic progression of atherosclerosis. Pathologically, the practice of the present invention results in at least one of the following at the site of the stent implantation: (i) reduced inflammatory response; (ii) inhibition of VSMC desecretion of matrix metalloproteinase; (iii) blunting Inhibition of myocyte accumulation; and (iv) inhibition of VSMC phenotypic differentiation.
[0228]
In one embodiment, the dosage level administered to a subject suffering from a non-cancer disorder characterized by cancer and cell proliferation is about 1 mg / m ² ~ 200mg / m ² Which can be administered as a bolus (in any suitable route of administration) or as a continuous infusion (eg, 1 hour, 3 hours, 6 hours, 24 hours, 48 hours or 72 hours) It is administered as needed every week, every two weeks, or every three weeks. However, it will be understood that the particular dose level for any particular patient will depend on various factors. These factors include the activity of the particular compound used; the age, weight, general health, sex, and diet of the subject; time and route of administration, and rate of excretion of the drug; Or not, as well as the severity of the condition being treated.
[0229]
In another embodiment, the dosage level is about 10 mg / m3 once every three weeks, as needed and tolerated. ² ~ 150mg / m ² , Preferably about 10 mg / m ² ~ About 75mg / m ² , More preferably about 15 mg / m ² ~ About 50mg / m ² It is. In another embodiment, the dosage level is about 1 mg / m2 once every two weeks, as needed and as acceptable. ² ~ 150mg / m ² , Preferably about 10 mg / m ² ~ About 75mg / m ² , More preferably about 25 mg / m ² ~ About 50mg / m ² It is. In another embodiment, the dosage level is about 1 mg / m1 once a week, as needed and as acceptable. ² ~ 100mg / m ² , Preferably about 5 mg / m ² ~ About 50mg / m ² , More preferably about 10 mg / m ² ~ About 25mg / m ² It is. In another embodiment, the dosage level is about 0.1 mg / m once daily, as needed and as acceptable. ² ~ About 25mg / m ² , Preferably about 0.5 mg / m ² ~ 15mg / m ² , More preferably about 1 mg / m ² ~ About 10mg / m ² It is.
[0230]
While the detailed description of the invention has been presented above, the following examples are provided for illustrative purposes of the invention and are to be construed as limiting the scope of the invention and the claims. Should not be.
[0231]
(Example 1)
(Construction of Myxococcus xanthus expression vector)
DNA providing the integration and binding functions of phage Mx8 was inserted into commercially available pACYC184 (New England Biolabs). Salmi et al., Feb. 1998, J.A. Bact. 180 (3): 614-612, an approximately 2360 bp MfeI-SmaI from pPLH343 was isolated and ligated to the large EcoRI-XmnI restriction fragment of plasmid pACYC184. The size of the circular DNA thus formed was about 6 kb and was named pKOS35-77.
[0232]
Plasmid pKOS35-77 serves as a conventional plasmid for expressing the recombinant PKS gene of the present invention under the control of the epothilone PKS gene promoter. In one exemplary embodiment, the entire epothilone PKS gene (having its homologous promoter) is inserted into a plasmid in one or more fragments, producing an expression vector of the invention.
[0233]
The present invention also provides an expression vector wherein the recombinant PKS gene of the present invention is under the control of a Myxococcus xanthus promoter. To construct an exemplary vector, M.I. The promoter of the xanthus pilA gene was isolated as a PCR amplification product. Plasmid pSWU537, which contains the pilA gene promoter and is described in Wu and Kaiser, Dec. 1997, J. Bact. 179 (24): 7748-7758, was replaced with the following PCR primers Seq1 and Mxpil1 primers:
Seq1: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3 '; and
Mxpil1: 5'-TTAATTAAGAGAAGGTTGCAACGGGGGGGC-3 ',
And amplified using standard PCR conditions, resulting in an approximately 800 bp fragment. This fragment was cut using the restriction enzyme KpnI and ligated to the large KpnI-EcoRV restriction fragment of the commercially available plasmid pLitmus28 (New England Biolabs). The resulting circular DNA was the designed plasmid pKOS35-71B.
[0234]
The promoter of the pilA gene from plasmid pKOS35-71B was isolated as an approximately 800 bp EcoRV-SnaBI restriction fragment and ligated with the large MscI restriction fragment of plasmid pKOS35-77 to obtain a circular DNA of approximately 6.8 kb in size. Was. Since the approximately 800 bp fragment could be inserted in either of the two orientations, this ligation produced two plasmids of the same size, which were combined with plasmids pKOS35-82.1 and pKOS35-82.2, respectively. Named. The restriction sites and function maps of these plasmids are shown in FIG.
[0235]
Plasmids pKOS35-82.1 and pKOS35-82.2 serve as convenient starting materials for the vectors of the invention in which the recombinant PKS gene is under the control of the Myxococcus xanthus pilA gene promoter. These plasmids contain a single PacI restriction enzyme recognition sequence located immediately downstream of the transcription start site of the promoter. In one exemplary embodiment, the entire epothilone PKS gene (without its homologous promoter) is inserted in one or more fragments into a plasmid at the Pad site to produce an expression vector of the invention. .
[0236]
The sequence of the pilA promoter in these plasmids is shown below:
[0237]
Embedded image

To produce the recombinant Myxococcus xanthus host cells of the present invention, M. xanthus cells were cultured in CYE medium (Campos and Zusman, 1975, Regulation of Development in Myxococcus xanthus: effect of 3 ': 5'-Cyclic AMP, ADP and Nutrition. Medium, grows to 100 Klett at 30 ° C., 300 rpm. The remaining protocols are performed at 25 ° C unless otherwise indicated. The cells are then pelleted by centrifugation (8000 rpm for 10 minutes in an SS34 or SA600 rotor) and resuspended in deionized water. The cells are pelleted again and resuspended to 1/100 of their original volume.
[0238]
DNA (1-2 μL) is electroporated in a 0.1 cm cuvette at room temperature, 400 ohm, 25 μFD, 0.65 V, time constant ranging from 8.8-9.4. The DNA is resuspended in salt-free, distilled, deionized water or dialyzed against a 0.025 μm VS membrane (Millipore). The DNA was spot dialyzed for resistivity electroporation and the growths were in CYE. Immediately after electroporation, 1 mL of CYE is added, and the cells in the cuvette are pooled using an additional 1.5 mL of CYE (2.5 ml total volume) previously added to a 50 mL Erlenmeyer flask. . These cells are grown at 30-32 ° C., 300 rpm for 4-8 hours (or overnight) to express the selectable marker. The cells are then plated on CYE soft agar on selected plates. When using cannamycin as a selectable marker, a typical yield is 10 ³ -10 ⁵ It is. If streptomycin is used as a selectable marker, it is included in the upper agar to bind to the agar.
[0239]
Using this procedure, a recombinant DNA expression vector of the present invention is electroporated into a Myxococcus host cell expressing a recombinant PKS of the present invention to produce epothilones, epothilone derivatives and other novel polyketides encoded thereby. Generate.
[0240]
(Example 2: Chromosomal integration and bacterial artificial chromosome (BAC) for expression of Epothilone in Myxococcus xanthus)
To express epothilone PKS and a modified enzyme gene in a heterologous host to produce epothilone by fermentation, Myxococcus xanthus, closely related to Sorangium cellulosum and having many cloning vectors available, is used according to the method of the present invention. . M. xanthus and S. xanthus. cellulosum is a slime bacterium; xanthus and S. xanthus. cellulosum may share common elements of gene expression, translational regulation, and post-translational modification. M. Xanthus has been developed for gene cloning and expression: DNA can be introduced by electroporation, and many vectors and genetic markers contain foreign DNA, including those that allow for stable insertion into the chromosome. Available for introduction. M. Xanthus can be grown relatively easily in a complex medium in a fermentor and, if required, can be subjected to manipulations to increase gene expression.
[0241]
In order to introduce the epothilone gene cluster into Myxococcus xanthus, an epothilone cluster can be constructed on the chromosome by using homologous recombination to assemble a complete gene cluster. Alternatively, the complete epothilone gene cluster can be cloned into a bacterial artificial chromosome (BAC), and then transformed into a M. mori for integration into the chromosome. xanthus.
[0242]
To assemble gene clusters from cosmids pKOS35-70.1A2, and pKOS35-79.85, homologous small regions (about 2 kb or larger) from these cosmids were introduced into Myxococcus xanthus to Provides a recombination site for larger pieces. As shown in FIG. 3, plasmids pKOS35-154 and pKOS90-22 are made to introduce these recombination sites. M. The strategy for assembling the epothilone gene cluster in the xanthus chromosome is shown in FIG. First, a neutral site in the bacterial chromosome that does not destroy either the gene or the transcription unit is selected. One such region is downstream of the devS gene; It has been shown not to affect the growth or development of Xanthus. The first plasmid, pKOS35-154, was linearized with DraI, and Electroporate in xanthus. This plasmid contains two regions of the dev locus flanking two fragments of the epothilone gene cluster. Kanamycin resistance marker and E. coli. The E. coli galK gene is inserted between the epo gene regions. See Ueki et al., 1996, Gene 183: 153-157, which is incorporated herein by reference. If the DNA rejoins the dev region by double recombination using the dev sequence as a homologous region, kanamycin resistance develops in the colony.
[0243]
This strain (K35-159) contains a small region (approximately 2.5 kb) of the epothilone gene cluster that allows recombination of pKOS35-79.85. Since the resistance marker on pKOS35-79.85 was identical to that in K35-159, the tetracycline transposon was transposed into the cosmid and the cosmid containing the transposon inserted in the kanamycin marker was selected. This cosmid (pKOS90-23) was electroporated into K35-159 and oxytetracycline resistant colonies were selected to generate strain K35-174. Cells were plated on CYE plates containing 1% galactose to remove unwanted areas from the cosmid and leave only the epothilone gene. The presence of the galK gene renders these cells sensitive to 1% galactose. Galactose resistant colonies of K35-174 indicate cells that have lost the galK marker, either by recombination or by mutations in the galK gene. If a recombination event occurs, the galactose-resistant strain is sensitive to kanamycin and oxytetracycline. Strains sensitive to both antibiotics are verified by Southern blot analysis. The correct strain was identified and designated K35-175, and the correct strain contains the epothilone gene cluster from module 7 to 4680 bp downstream of the stop codon for epoK.
[0244]
The above process is repeated one or more times to introduce modules 1 through 7. Plasmid pKOS90-22 is linearized with DraI and electroporated into K35-175 to create K111-13.2. This strain is electroporated with tetracycline resistant versions of pKOS35-70.1A2 and pKOS90-38, and colonies resistant to oxytetracycline are selected. This produces strain K111-13.23. Currently, recombinants with the entire epothilone gene cluster are selected by resistance to 1% galactose. This results in clones K111-32.25, K111-32.26 and K111-13.35. Strain K111-32.25 has been deposited with the American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA on April 14, 2000 according to the Budapest Treaty and is available under accession number PTA-1700. This strain contains all the epothilone genes and their promoters.
[0245]
5 mL of CYE (10 g Casitone per liter, 5 g yeast extract and 1 g MgSO4 in a 50 mL flask) ₄ ・ 7H ₂ Fermentation was performed by inoculating strain O) and growing the culture overnight until mid-log phase. A 100 μL aliquot was spread on a CTS plate and the plate was incubated at 32 ° C. for 4-5 days. To extract epothilone, agar and cells from the plate were macerated, placed in a 50 mL conical tube, and acetone was added to fill the tube. The solution was incubated with shaking for 4-5 hours, the acetone was aspirated and the remaining liquid was extracted twice with an equal volume of ethyl acetate. Water was removed from the ethyl acetate extract by adding magnesium sulfate. The magnesium sulfate was filtered and the liquid was aspirated to dryness. Epothilone was resuspended in 200 μL of acetonitrile and analyzed by LC / MS. This analysis indicated that this strain produced epothilones A and B. Epothilone B was present at about 0.1 mg / L in the culture and Epothilone A was present at 5-10 fold lower levels.
[0246]
This strain can also be used to produce epothilone in liquid media. The flask containing the CYE is inoculated with the epothilone producing strain. The next day, while the cells are in mid-log phase, 0.5% CMM (0.5% Casitone, 0.2%) with 1 mg / mL serine, alanine and glycine and 0.1% sodium pyruvate % MgSO ₄ ・ 7H ₂ O, 10 mM MOPS (pH 7.6)) was added with 5% inoculum. Addition of sodium pyruvate to 0.5% could increase epothilone B production, but reduced the ratio of epothilone B to epothilone A. The culture is grown at 30 ° C. for 60-72 hours. Longer incubations result in reduced titers of epothilone. To recover the epothilones, the culture is centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes in an SS34 rotor. The supernatant is extracted twice with ethyl acetate and swirled aspirated ("rotavape") to dry. The liquid culture produced 2-3 mg / L of epothilones A and B in a ratio similar to that observed in the plate culture. When XAD (0.5-2%) was added to the culture, epothilones C and D were observed. Epothilone D was present at 0.1 mg / L and Epothilone C was present at 5-10 fold lower levels.
[0247]
A bacterial artificial chromosome (BAC) library is constructed to clone the entire gene cluster as one fragment. First, SMP44 cells are embedded in agarose and lysed according to the BIO-RAD genomic DNA plug kit. The DNA plug is partially digested with a restriction enzyme (eg, Sau3AI or HindIII) and electrophoresed on a FIGE gel or CHEF gel. DNA fragments are isolated by electroextraction of DNA from agarose or using gelase to degrade agarose. Selection methods for isolating fragments are described in Strong et al., 1997, Nucleic Acids Res. 19: 3959-3961 (incorporated herein by reference)). The DNA is ligated to BAC (pBeloBACII) that has been cut with the appropriate enzymes. The map of pBeloBACII is shown in FIG.
[0248]
Sheng et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 1990-1996 (incorporated herein by reference), DNA is electroporated into DH10B cells to create a genomic library of Sorangium cellulosum. Colonies are screened using probes from the NRPS region of the epothilone cluster. Positive clones are picked and DNA is isolated for restriction analysis to confirm the presence of the complete gene cluster. This positive clone is called pKOS35-178.
[0249]
To create strains that can be used to introduce pKOS35-178, kanamycin containing regions of homology upstream and downstream of the epothilone gene cluster adjacent to the dev locus and similar to pKOS90-22 and pKOS35-154 Construct plasmid pKOS35-164, which contains the resistant galK cassette. This plasmid was linearized with DraI and described in Kafeshi et al., 1995, Mol. Microbiol. 15: 483-494. Electroporate Myxococcus xanthus to produce K35-183. Plasmid pKOS35-178 can be introduced into K35-183 by electroporation or by transduction with bacteriophage P1, and chloramphenicol resistant colonies are selected. Alternatively, a version of pKOS35-178 containing the origin of the conjugative transfer from pRP4 was purchased from E. coli. and can be constructed for transfer of DNA from E. coli to K35-183. This plasmid is first constructed with a transposon containing the oriT region from RP4 and the tetracycline resistance marker from pACYC184, and then transposed to pKOS35-178 in vitro or in vivo. This plasmid was transduced into S17-1 and Xanthus. This strain K35-190 is grown in the presence of 1% galactose to select for a second recombination event. This strain contains all epothilone genes and all strong promoters. This strain was fermented and tested for epothilone A and B production.
[0250]
Alternatively, the transposon can be recombined into BAC by transposing the transposon into either pMAK705 or pKO3 using either the temperature sensitive plasmid pMAK705 or pKO3 and selecting for the tetR and camS plasmids; Hamilton et al. September 1989, J.M. Bact. 171 (9): 4617-4622 and Link et al., October 1997, J. Am. Bact. 179 (20): 6228-6237, each of which is accomplished by recombination, as described herein.
[0251]
In addition to integrating pKOS35-178 into the dev locus, it can also be integrated into the phage attachment site using the integration function from myxophage Mx8 or Mx9. A transposon is constructed that contains the integrated gene and the att site from either Mx8 or Mx9 along with the tetracycline gene from pACYC184. Alternative versions of this transposon may have only attachment sites. In this version, the integrated gene is then supplied in trans by co-electroporation with a plasmid containing the integrase gene, or any constitutive promoter in the electroporated strain (eg, the mgl promoter ( See, eg, Magrini et al., July 1999, J. Bact. 181 (13): 4062-4070, which is incorporated herein by reference). You. Once the transposon is constructed, it is rearranged into pKOS35-178 to create pKOS35-191. This plasmid is introduced into Myxococcus xanthus as described above. This strain contains all epothilone genes and all strong promoters. This strain is fermented and tested for the production of epothilones A and B. Alternatively, a strain containing the att site and the oriT region can be transposed to BAC, and the resulting BAC is xanthus.
[0252]
Once the epothilone gene has been established in a strain of Myxococcus xanthus, manipulation of any part of the gene cluster (eg, alteration of a promoter or swapping module) can be performed as described below for kanamycin resistance and the galK cassette. Can be performed. Cultures of Myxococcus xanthus containing the epo gene are grown in large volumes of medium and tested for epothilone production. If the level of production of epothilones (especially B or D) is low then M. Xanthus-producing clones are subjected to media development and mutation-based strain improvement, as described in the Examples below.
[0253]
(Example 3)
(Process for production and purification of epothilone)
(A. Optimization of Heterogeneous Production of Epothilone D in Myxococcus xanthus)
Heterogeneous production of Epothilone D in Myxococcus xanthus was demonstrated by incorporating adsorbent resin, identifying a suitable carbon source, and performing a fed-batch process from 0.16 mg / L to 140 times the initial titer. Improved.
[0254]
To reduce the degradation of epothilone D in the basal medium, XAD-16 (20 g / L) was added to stabilize extracellular products. This greatly facilitated its recovery and increased the yield by a factor of three. The use of oil as a carbon source for cell growth and product formation was also evaluated. Screening of various oils showed that methyl oleate had the greatest effect. At the optimal concentration of 7 mL / L in the batch process, the maximum cell density increased from 0.4 g dry cell weight (DCW) / L to 2 g DCW / L. Product yield was dependent on the presence of trace elements in the product medium. Exogenous supplementation of the basal medium with trace elements enhanced the maximum epothilone D titer by a factor of eight. This demonstrated that metal ions play important roles in cell metabolism and epothilone biosynthesis. To further increase product yield, a continuous fed-batch process was performed to promote higher cell densities and maintain an extended production period. Optimized fed-batch cultures consistently yielded a cell density of 7 g DCW / L and an average product titer of 23 mg / L.
[0255]
Epothilone is a secondary metabolite produced naturally by various strains of myxobacterium sorangium cellulosum (Gerth et al., 1996; Gerth et al., 2001; the references cited in this example are at the end of this section. And is incorporated herein by reference). They are potent inhibitors of microtubule depolymerization, and the mechanism of action is similar to the anticancer drug Taxol (Bollag et al., 1995). Their cytotoxic effect on multidrug resistant tumor cell lines expressing P-glycoprotein makes them powerful therapeutic compounds with great commercial value (Su et al., 1997; Kowalski et al., 1997). . Their relatively high solubility in water also facilitates their formulation for clinical evaluation.
[0256]
Epothilones A and B are the major fermentation products of the natural host (Gerth et al., 1996). The macrocyclic core of these polyketide molecules is formed by the continuous decarboxylation condensation of acetate and propionate units (Gerth et al., 2000). Epothilones A and B differ in a single methyl group at the C-12 position of their carbon skeleton. This difference in structure is due to the incorporation of acetate in the assembly of epothilone A and of propionate in the assembly of epothilone B. Epothilones C and D are intermediates in the biosynthetic pathway of epothilones A and B, respectively (Tang et al., 2000; Molnar et al., 2000). They are secreted as a minority product during the fermentation process, with a combined yield of about 0.4 mg / L. Preliminary in vivo studies have revealed that epothilone D is the most promising of the four compounds as an anti-tumor agent (Chou et al., 1998), and that the production of this molecule in large quantities is an important goal. is there.
[0257]
The gene cluster responsible for epothilone biosynthesis has been sequenced (Tang et al., 2000; Molnar et al., 2000) and S. et al. It is used to produce these compounds in Myxococcus xanthus, a microbial host that is closely related to cellulosum but more susceptible to genetic manipulation. To facilitate the production of epothilone D, a deficient mutant of this recombinant strain (described in Example 4 below) was constructed and P450 catalyzes the conversion of epothilones C and D to epothilones A and B, respectively. The epoxidase was inactivated (Tang et al., 2000). This genetic alteration is described in It effectively enhanced the secretion of epothilones C and D as the sole product of the xanthus fermentation (epothilone D: epothilone C is 4: 1). The resulting variants offer significant advantages over the native host in the recovery and purification of the desired product. In this example, improvements in media composition and fermentation strategy were described in It is described to produce a 140-fold increase in epothilone D production in xanthus.
[0258]
Adsorption resins are used in fermentation of myxobacteria for continuous capture of biologically active molecules produced in small quantities (Reichenbach and Hofle, 1993). To facilitate the isolation of epothilone D, the hydrophobic resin XAD-16 was added to the culture medium. The recovery was very simple as the bound product could be easily eluted from the resin with a suitable solvent. Furthermore, the use of XAD-16 minimized epothilone degradation through product stabilization.
[0259]
Myxococcus xanthus has traditionally been cultured in media consisting primarily of enzymatic hydrolysis products of casein (eg, peptone and cacitone) and relies on amino acids as sole carbon and nitrogen sources (Reichenbach and Dworkin, 1991). As a result, ammonia accumulates in the fermentation broth as a result of amino acid degradation. Gerth et al. (1986) demonstrated that an extracellular ammonia concentration of 35-42 mM in a Myxococcus virescenes culture corresponds to a surprisingly high ammonia concentration of 80-140 mM in cells. More importantly, continuous removal of excess ammonia to below 8 mM using an in situ membrane process has been shown to dramatically increase both cell mass and secondary metabolites (Hacht et al.). , 1990). The production of high levels of ammonia is described in An alternative carbon source to reduce amino acid consumption is desirable because it is presumed to be inhibitory to xanthus growth and epothilone D production.
[0260]
Methyl oleate was added to M.E. Xanthus identified from extensive screening of different oils as substrates that could be metabolized. Addition of the exogenous trace element solution to the growth medium increased epothilone D production 8-fold (yield in a single batch fermentation of 3.3 mg / L). To further optimize the process, a fed-batch approach with intermittent or continuous supplementation of cacitone and methyl oleate was adapted to extend the production phase of the cells. A comparison of the results obtained with two different feeding strategies is reported in this example.
[0261]
(Materials and methods)
(Preparation of inoculum)
For production of epothilone D in culture medium without methyl oleate, 1 mL of Myxococcus xanthus strain K111-40.1 frozen cells in 20% (v / v) glycerol was added to 10 g / 50 g in a 50 mL glass culture tube. L Cassiton (Difco), 5 g / L yeast extract (Didco), 1 g / L MgSO ₄ ・ 7H ₂ 3 mL of CYE medium consisting of O and 50 mM HEPES (pH 7.6) was inoculated. The HEPES buffer solution was titrated to pH 7.6 with potassium hydroxide. The cells were incubated on a rotary shaker at 30 ° C. and 175 rpm for 3 days. They were then transferred to a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL CYE medium and grown under identical conditions for 2 days. The resulting seed culture was used to inoculate a 50 mL product flask with a 5% (v / v) inoculum size.
[0262]
M. in a medium containing mail oleate. For cultivation of xanthus, cells had to be adapted to grow in the presence of oil. One frozen cell seed vial was inoculated into 3 mL of CYE medium supplemented with 3 μL of methyl oleate (Emerest 2301) (Cognis Corp). The cells were grown in glass culture at 30 ° C. and 175 rpm for 2-6 days until the culture was grown to a sufficient density under a microscope. They were then combined with 10 g / L Cassiton (Difco), 5 g / L yeast extract (Difco), 1 g / L MgSO ₄ ・ 7H ₂ O was transferred to a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL CYE-MOM medium consisting of 2 mL / L methyl oleate and 50 mM HEPES (pH 7.6). Two days after growth, cells were frozen and stored at -80 C as 1 mL aliquots in 20% (v / v) glycerol.
[0263]
For production of epothilone D in media containing methyl oleate, 1 mL of frozen oil-compatible cells were inoculated into 3 mL of CYE-MOM media in glass culture tubes. The cells were incubated at 30 ° C. and 175 rpm for 2 days and transferred to a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of CYE-MOM medium. The resulting seed culture was grown under identical conditions for 2 days and used to inoculate a 50 mL product flask with a 5% (v / v) inoculum size.
[0264]
In preparing the inoculum for the 5 L fermentation, 25 mL of the oil-compatible seed culture was transferred to a 2.8 L Fellbach flask containing 475 mL of CYE-MOM medium. The cells were grown at 30 ° C. and 175 rpm for 2 days. Subsequently, 250 mL of this secondary seed culture was inoculated into a 5 L fermentor containing 4.75 L of product medium to a final inoculation concentration of 5% (v / v).
[0265]
(Shaking flask generation)
M. in the absence of methyl oleate. A batch culture of xanthus K111-40-1 was prepared as follows. 1 g of XAD-16 resin (Rohm and Haas) was autoclaved in a 250 mL Erlenmeyer flask with 5 mL of deionized water at 121 ° C. for 30 minutes. The excess water was then removed from the flask and 5 g / L Cassiton, 2 g / L MgSO ₄ ・ 7H ₂ O and 50 mL of CTS medium consisting of 50 mM HEPES (pH 7.6) were added. Autoclave of the adsorbed resin in the presence of production medium led to the binding of the essential nutrients required by the cells, so the resin and medium components were separately sterilized. The product flask was inoculated with 2.5 mL of the seed culture and incubated at 30 ° C. and 175 rpm for 6 days.
[0266]
Batch cultures in the presence of methyl oleate were prepared as described above. In addition, 7 mL / L methyl oleate and 4 mL / L sterile filtered trace element solution (10 mL / L concentrated H ₂ SO ₄ , 14.6 g / L FeCl ₃ ・ 6H ₂ O, 20 g / L ZnCl ₃ , 1.0 g / L MnCl ₂ ・ 4H ₂ O, 0.43 g / L CuCl ₂ ・ 2H ₂ O, 0.31 g / L H ₃ BO ₃ , 0.24 g / L CaCl ₂ ・ 6H ₂ O, and 0.24 g / L Na ₂ MO ₄ ・ 2H ₂ O). The product flask was then inoculated with 2.5 mL of an oil-compatible seed culture and grown for 5 days at 30 ° C. and 175 rpm.
[0267]
Fed-batch cultures providing intermittent feeding of cacitone and methyl oleate were prepared as follows. 1 g of XAD-16 resin was autoclaved in a 250 mL Erlenmeyer flask containing 5 mL of deionized water at 121 ° C. for 30 minutes. After sterilization, excess water was removed from the flask and 50 mL of CTS medium supplemented with 2 mL / L methyl oleate, 4 mL / L trace element solution, and 50 mM HEPES (pH 7.6) was added. The product flask was inoculated with 2.5 mL of an oil-compatible seed culture and incubated at 30 ° C. and 175 rpm. Two days after inoculation, 2 g / L cacitone and 3 mL / L methyl oleate were added to the culture medium at 24 hour intervals. Casitone feed was prepared as a concentrated 100 g / L solution. The culture was cultured for 10-12 days until a substantial cell lysate was obtained.
[0268]
All product cultures can be grown on a 500 mL scale in 2.8 L Fernbach flasks under the same growth conditions.
[0269]
(Fermentation tank generation)
A 5 L scale fed-batch fermentation providing intermittent or continuous feeding of cacitone and methyl oleate was prepared as follows. 20 g / L XAD-16 and 2 g / L MgSO ₄ ・ 7H ₂ O was autoclaved in a 5 L fermentor (B. Braun) containing 4.75 L of deionized water at 121 ° C. for 30 minutes. After sterilization, the concentrated cacitone solution (150 g / L), methyl oleate, and trace elements are aseptically added to the bioreactor and 5 g / L, 2 mL / L, and 4 mL / L final cacitone, methyl oleate, and Trace element concentrations were obtained. The medium was then inoculated with 250 mL of an oil-compatible seed culture. The fermentation was performed at 30 ° C. with an air supply rate of 0.4-0.5 v / v / m and an initial stirring speed of 400 rpm. The dissolved oxygen was controlled at 50% saturation by a stirring cascade between 400-700 rpm. 2.5N KOH and 2.5MH ₂ SO ₄ The culture pH was maintained at 7.4 by automatic addition of. Twenty-four hours after inoculation, cacitone (150 g / L) and methyl oleate were added to the product medium at a feed rate of 2 g / L / day (casitone) and 3 mL / L / day (methyl oleate). The feed was delivered either as a single bolus every 24 h or continuously with a peristaltic pump (W. Marlow). Cells were grown for 10-12 days until significant cell lysate was seen.
[0270]
(Epothilone determination)
Prior to using XAD-16 resin in the fermentation, 1 mL of culture broth was sampled from the product flask or bioreactor and centrifuged at 13,000 g for 10 minutes. Quantification of the epothilone product in the supernatant was performed using a Hewlett Packard 1090 HPLC with UV detection at 250 nm. 500 μL of the supernatant was injected onto a 4.6 × 10 mm guard column (Inertsil, ODS-3, 5 μm). An online extraction was then performed at a flow rate of 1 mL / min, washing with 100% water for 0.5 minutes, followed by a 1.5 minute gradient to 50% acetonitrile. The eluate was flushed through the waste for the first 2 minutes and then passed through a longer separation column (4.6 × 150 mm, Inertsil, ODS-3, 5 μm). Separation of epothilones C and D was performed by a gradient of 50% to 100% acetonitrile over 8 minutes followed by a 3 minute wash with 100% acetonitrile. Under these conditions, epothilone C eluted at 9.4 minutes and epothilone D eluted at 9.8 minutes.
[0271]
With the use of XAD-16 resin, 5-50 mL of well-mixed culture broth and resin were sampled from the product flask or bioreactor. After the resin was settled by gravity, the culture broth was decanted. The resin was washed with 5-50 mL of water and fixed again by gravity. The aqueous mixture was completely removed and the epothilone product was extracted from the resin with 100% methanol. The amount of solvent used was equivalent to 50% sample volume. Quantification of epothilones C and D was performed by HPLC analysis with UV detection at 250 nm. 50 μL of the methanol extract was injected onto two 4.6 × 10 mm guard columns (Inertsil, ODS-3, 5 μm) and a longer 4.6 × 150 mm column (Inertsil, ODS-3, 5 μm). The assay method was isocratic and eluted with 60% acetonitrile and 40% water at a flow rate of 1 mL / min for 18 minutes. Under these conditions, epothilone C was detected at 10.3 minutes and epothilone D was detected at 13.0 minutes. Standards were prepared using purified epothilone D.
[0272]
(Determining cell proliferation)
Cell growth in the absence of methyl oleate was monitored by measuring optical density (OD) at 600 nm. The sample was diluted with water until the final OD value was less than 0.4. Cell growth in the presence of methyl oleate was determined by dry cell weight (DCW), as addition of methyl oleate to the culture medium resulted in the formation of an emulsion with strong absorption at 600 nm. 40 mL of culture broth was centrifuged at 4200 g for 20 minutes in a pre-weighed test tube. The pellet was then washed with 40 mL of water and dried at 80 ° C. for 2 days before weighing.
[0273]
(Ammonia determination)
One mL of the fermentation broth was clarified by centrifugation at 13,000 g for 5 minutes. The supernatant was then used for ammonia analysis using an ammonia assay kit (Sigma). Samples were diluted 20-100 fold until the final concentration was less than 880 μM.
[0274]
(Methyl oleate determination)
Methyl oleate remaining in 1 mL of fermentation broth was extracted with 5 mL of acetonitrile. The mixture was vortexed and clarified by centrifugation at 4200 g for 20 minutes. Quantification of methyl oleate was performed with UV detection at 210 nm by HPLC analysis. 50 μL of the supernatant was injected onto two 4.6 × 10 mm guard columns (Inertsil, ODS-3, 5 μm) and a longer 4.6 × 150 mm column (Inertsil, ODS-3, 5 μm). The column was washed with acetonitrile-water (1: 1) at a flow rate of 1 mL / min for 2 minutes. Elution was then carried out with a gradient of 50% to 100% acetonitrile over 24 minutes followed by a 5 minute 100% acetonitrile wash. Due to the carbon chain length heterogeneity of commercially available methyl oleate, this compound eluted as two major peaks detected at 25.3 minutes and 27.1 minutes. Methyl oleate bound to XAD-16 resin was quantified from methanol extraction using the same HPLC method. Methyl oleate standards were prepared in 83.3% acetonitrile. The consumption of methyl oleate by the cells was calculated as follows: (total methyl oleate added)-(methyl oleate remaining in the medium)-(methyl oleate bound to resin).
[0275]
(result)
Myxococcus xanthus strain K111-40-1 was initially cultured in a batch fermentation process using a simple product medium consisting only of 5 g / L cacitone (pancreatic casein digest) and 2 g / L magnesium sulfate. The reference performance of the cells is shown in FIG.
[0276]
The maximum cell density and epothilone D production was OD of 1.6. ₆₀₀ And 3 days after inoculation at a corresponding titer of 0.16 mg / L. Both cell density and product yield have subsequently decreased substantially. With the consumption of cacitone by the cells, an increasing accumulation of ammonium was also detected in the product medium. The final ammonia concentration reached 20 mM at the end of the 5 day fermentation.
[0277]
(Effect of XAD-16 on product stability)
To prevent the rapid degradation of Epothilone D, a hydrophobic adsorption resin XAD-16 was added to the product medium to bind and stabilize the secreted product. XAD-16 is a polyaromatic resin previously used by Gerth et al. (1996) for isolating epothilones A and B from fermentations of the microorganism producer Sorangium cellulosum Sose 90. As shown in FIG. 7, the presence of the adsorption resin did not affect cell growth. However, it effectively reduced the loss of epothilone D in the fermentation broth, leading to a three-fold enhancement in recovery of this product.
[0278]
(Media development)
In an attempt to develop a medium that can support higher cell density and epothilone production, the effect of caciton on growth and product yield is changed from 1 g / L to 40 g / L in the product medium. It was evaluated by: Cell proliferation was stimulated by increasing concentrations of cacitone, but the specific productivity of the cells was significantly reduced as shown in FIG. The optimal cacitone concentration for epothilone D production reached 5 g / L, with higher concentrations resulting in lower titers.
[0279]
Since substrate improvement was limited by the use of casiton, an alternative substrate was evaluated as a supplement to the basal product media. As summarized in Table 3, detailed screening of different oils identified methyl oleate as the carbon source that promoted the largest increase in epothilone D production.
[0280]
[Table 3]

However, direct addition of methyl oleate to the product medium caused premature cell lysis. Therefore, seed cultures were grown in the presence of methyl oleate prior to product fermentation. Interestingly, this adaptation process made the cells less sensitive to lysis. As shown in Table 4 (improvement in growth and production compared to the basal performance of CTS medium in batch fermentation), using a methyl oleate concentration of 7 mL / L and a trace element concentration of 4 mL / L, 2.1 g / L A peak biomass concentration of L and an epothilone D titer of 3.3 mg / L were achieved.
[0281]
[Table 4]

No further improvement in titer was observed at higher concentrations of methyl oleate, as shown in FIG.
[0282]
In addition to demonstrating the importance of methyl oleate on cell growth and production, the above graph also highlights the importance of trace elements in production media. Nutrients supplemented by Casitone could not be sufficient for active cell growth and extraneous addition of trace metals was added to the conjugate center containing methyl oleate. Surprisingly, it has been found that this supplementation is essential for enhancing both growth and production. Without the addition of trace metals, the maximum biomass concentration and epothilone D titer were only 1.2 g / L and 0.12 mg / L, respectively. This low titer was comparable to that obtained with the basal medium.
[0283]
(Development of Fed Batch)
If optimal concentrations of methyl oleate and trace elements are present in the batch fermentation process, Logarithmic growth of the xanthus strain occurred in the first two days after inoculation. Epothilone D production began at the onset of the stationary phase and ceased when cell lysis occurred with methyl oleate depletion on day 5 (shown in FIGS. 10A and 10B). The time course for methyl oleate consumption and ammonia production is also shown. The concentration of ammonia in the production medium was less than 4 mM over the course of the fermentation.
[0284]
In order to extend the cell production period in flask cultures, cacitone and methyl oleate were added to the medium once a day at 2 g / L / day and 3 mL / L / day, respectively. Substrate feed was started 48 hours after inoculation, and cells grew exponentially for 3 days thereafter. As shown in FIG. 11A, the biomass concentration began to plateau on day 5 and reached a plateau on day 10 with a maximum of 6.3 g / L. Also, production of epothilone D was consistent with the stationary growth phase, and a final yield of 9.8 mg / L was achieved at the end of day 12. As shown in FIG. 11B, both methyl oleate consumption and ammonia production increased at a constant rate throughout the fermentation.
[0285]
Methyl oleate was consumed at the same rate as methyl oleate was fed to the bioreactor, and ammonia accumulated at a rate of 3.2 mM / day. Slower feeds of cacitone or methyl oleate greatly reduced epothilone D titers, whereas higher feed rates caused premature cell lysis before significant production was achieved.
[0286]
To test the efficiency of the fed-batch process on a large scale, cacitone and methyl oleate were added intermittently at 24 hour intervals to the fermentation in a 5 L bioreactor. As shown in FIG. 12, the resulting product curves closely resembled those for flask cultures. Substrate feed was started 24 hours after inoculation and epothilone production began on day 4. A maximum epothilone D titer of 9.2 mg / L was obtained 10 days after inoculation.
[0287]
To assess the effects of more accurate feeding strategies on growth and production, dual feeds were continuously delivered to the bioreactor. As shown in FIG. 13A, running a continuous feed did not affect cell growth, but increased its productivity almost three-fold. A final epothilone D titer of 27 mg / L was achieved 10 days after inoculation. As shown in FIG. 13B, methyl oleate was consumed at the same rate as added to the production medium, and ammonia was released at a constant rate of 6.4 mM / day throughout the entire fermentation process.
[0288]
(Discussion)
Although the chemical synthesis of epothilone D has recently been achieved (Harris et al., 1999; Meng et al., 1998; Shinha et al., 1998), a 20-step complex process is economical for large-scale production of compounds. Not a viable method. Although the production yield of Myxococcus xanthus strain on initial epothilone D was 0.16 mg / L, the improved fermentation process of the present invention substantially increased the production level to 23 mg / L.
[0289]
One of the major obstacles to achieving higher epothilone D titers was the rapid degradation of the product in the fermentation broth. This problem was alleviated by incorporating the adsorption resin into the culture medium. Addition of XAD-16 did not affect cell growth, but minimized the loss of secreted product and increased its recovery by a factor of three.
[0290]
Another obstacle to increasing the production yield is the limited improvement in titer by using casiton as the main carbon and nitrogen source. M. Growth of the xanthus strain was stimulated with increasing concentrations of cacitone, but concentrations above 5 g / L caused a dramatic decrease in titer. This inhibitory effect of secondary metabolites at high concentrations of peptone or cacitone has been previously demonstrated in several other mycobacterial fermentations, and is due to the accumulation of ammonia in the culture medium. are doing.
[0291]
M. Since Xanthus is unable to metabolize polysaccharides and sugars (Reichenbach and Dworkin, 1991), it investigated its ability to utilize oil as a carbon source. Oil is an attractive carbon substrate. Because the oxidation of fatty acids can serve not only as an energy source for cells, but also the fermentation of acetyl-Co-A as a degradation product can provide a precursor for epothilone biosynthesis. Addition of oil to Saccharopolyspora erythraea fermentation, Streptomyces fradiae fermentation, and Streptomyces hygroscopicus fermentation increases the production of polyketide molecules (eg, erythromycin, tyrosine, and immunomodulator (immunoLug) to increase the amount of erythromycin, tyrosine, and immunoprecipitate (35), respectively). (Mirjarili et al., 1999; Choi et al., 1998; Junker et al., 1998).
[0292]
Screening of different oils identified methyl oleate as a good candidate to promote cell growth and epothilone D production. However, these improvements were only observed when the trace metals were simultaneously added to the production medium. Addition of methyl oleate alone at 7 mL / L increased the maximum cell concentration from 0.4 g DCW / L to 1.2 g DCW / L, but the product remained at baseline levels. When 4 mL / L of trace element was supplemented externally, the highest biomass concentration increased to 2.1 g DCW / L and the epothilone D titer was enhanced from 0.45 mg / L to 3.3 mg / L. These findings indicate that nutrient deficiencies in caskton are due to M. Figure 4 shows that xanthus may be important for growth and epothilone formation.
[0293]
Efforts have been made to establish optimal concentrations of methyl oleate and trace elements for the batch process to maintain a vigorous cell growth and develop a feeding strategy to extend the production phase. Intermittent and continuous feeds of cacitone and methyl oleate at a constant rate were evaluated, and both methods produced similar improvements in growth profiles. With an optimal feed of the two substrates, a maximum cell concentration of about 6.8 g DCW / L was obtained. In both cases, methyl oleate was consumed as methyl oleate was added to the fermentation medium.
[0294]
In contrast to cell growth and methyl oleate consumption, epothilone production and ammonia production were greatly influenced by the choice of feeding strategy. In continuous fed-batch culture, a maximum epothilone D titer of 23 mg / L was obtained. This was approximately 2.5 times the titer obtained with intermittent fed-batch culture. With a continuous feed, the rate of ammonia released by the cells was also twice as high. This suggests a higher rate of casiton consumption. Together, these results indicate that low titers are associated with intermittent fed-batch processes and can be caused by catabolic product control rather than ammonia accumulation. Further, they are described in M.E. It suggests that the productivity of the xanthus strain is sensitive to the amount of substrate present in the culture medium and may be maximal under substrate limiting conditions. This is also consistent with the observation that increasing the concentration of cacitone in the production medium results in a higher cell concentration but lower titers.
[0295]
As compared to batch culture in basal medium, continuous fed-batch culture resulted in a 17-fold increase in cell concentration and a 140-fold increase in titer. This process is on a scale of 5L-1000L and has been shown to perform equally. This result, shown to produce epothilone D on a production scale, was It has been demonstrated that xanthus can be used as a host for the production of other biologically active molecules from myxobacteria.
[0296]
(References)
[0297]
Embedded image

(B. Production of Epothilone B)
(flask)
Thaw the K111-32-25 strain in a 1 mL vial and transfer the contents to 3 mL of CYE seed medium in a glass tube. The medium is incubated at 30 ° C. for 72 ± 12 hours, followed by subculturing 3 mL of this tube culture in 50 mL of CYE medium in a 250 mL baffled Erlenmeyer flask. The CYE flask was incubated at 30 ° C. for 24 ± 8 hours, and 2.5 mL (5% v / v) of the seed was used to form an epothilone production flask (CTS-TA in a 250 mL detented Erlenmeyer flask). Medium (50 mL). The flasks are then incubated with the starting pH 7.4 medium at 30 ° C. for 48 ± 12 hours.
[0298]
(Fermenter)
The K111-32-25 inoculum is expanded as above and used with an additional step of subculturing 25 mL of 50 mL CYE seeds to 500 mL CYE. The second seed is used to inoculate a 10 L fermentor containing 9.5 L of CTS-TA and 1 g / L of sodium pyruvate. The process parameter settings for this fermentation are as follows: pH-7.4; agitation-400 rpm; sparge rate-0.15 vvm. These parameters were sufficient to maintain DO above 80% saturation. pH control was provided by adding 2.5N sulfuric acid and 2.5N sodium hydroxide to the culture. Maximum epothilone titers are achieved in 48 ± 8 hours.
[0299]
(C. Production of Epothilone D)
(flask)
Thaw a 1 mL vial of strain K111-40-1 (described in Example 4) and transfer the contents to 3 mL of CYE seed medium in a glass test tube. The culture is incubated at 30 ° C. for 72 ± 12 hours, followed by subculturing 3 mL of the test tube culture into 50 mL CYE medium in a 250 mL detented Erlenmeyer flask. Incubate the CYE flask at 30 ° C. for 24 ± 8 hours and inoculate an epothilone production flask using 2.5 mL (5% v / v) of the seed (50 mL in a 250 mL detented Erlenmeyer flask). 1 × wheat gluten medium). The flasks are then incubated with the starting pH 7.4 medium at 30 ° C. for 48 ± 12 hours.
[0300]
(Fermenter)
The K111-40-1 inoculum is expanded as above and used for a further step of subculturing 25 mL of the 50 mL CYE seed to 500 mL CYE. 250 mL of this second seed is used to inoculate a 5 L fermentor containing 4.5 L CTS-TA and 1 g / L sodium pyruvate (feed daily). The process parameter settings for this fermentation are as follows: pH-7.4; agitation-400 rpm; sparge rate-0.15 vvm. These parameters were sufficient to maintain DO above 80% saturation. pH control was provided by adding 2.5N sulfuric acid and 2.5N sodium hydroxide to the culture. Maximum epothilone titers are achieved in 36 ± 8 hours. The highest epothilone C titer is 0.5 mg / L and the highest epothilone D titer is 1.6 mg / L.
[0301]
Table 5 is a summary of the media used and their respective components.
[0302]
[Table 5]

The CYE seed medium and CTS-TA production medium are sterilized by an autosterilized autoclave at 121 ° C. for 30 minutes. The wheat gluten production medium is then sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 45 minutes.
[0303]
(D. Production of Epothilones C and D from Myxococcus xanthus)
In one aspect, the invention provides an improved fermentation process for a Myxococcus strain, including but not limited to M. xanthus K111-40-1. In this process, the fermentation medium provides a carbon source that can be utilized without the production of ammonia. In one preferred embodiment, the carbon source is an oil (eg, methyl oleate, or a similar oil). In shake flask tests at various feed rates, these methods resulted in the production of epothilones C and D (mainly epothilone D) at levels ranging from 15 to 25 mg / L as described below. .
[0304]
(Seed culture)
Grow in 50 mL of CYE medium containing 2 mL / L methyl oleate, and place the M. in a frozen 1 mL vial. Xanthus K111-40-1 cells were used to inoculate 3 mL of fresh CYE medium containing 1 mL / L methyl oleate in sterile glass tubes. The tubes were incubated at 30 ° C. for 24 hours with shaking at 250 RPM. The culture in this tube was then transferred to a non-rotating 250 mL flask containing 50 mL of fresh CYE medium containing 2 mL / L methyl oleate. The flask was incubated at 30 ° C. for 48 hours with shaking at 250 RPM.
[0305]
(Production flask)
1 g of Amberlite XAD-16 was sterilized by autoclaving in a 250 mL non-rotating flask at 121 ° C. for 30 minutes. Then, 50 mL of sterile production medium was added to the flask. The flask was inoculated with 5% (v / v) of the seed culture and placed on an incubator shaker operating at 250 RPM and 30 ° C. A 3 mL / L / day feed of sterile methyl oleate was started 2 days after inoculation, and a 2 g / L / day feed of cacitone was started 1 day after inoculation.
[0306]
(Product extraction)
After 14 days, the XAD resin in the production flask was transferred to a 50 mL centrifuge tube. Excess medium in the centrifuge tube was decanted so that none of the resin was removed. Then, the XAD resin was washed with 25 mL of water and allowed to stand. The water in the tube was decanted so that none of the resin was removed, and 20 mL of methanol was added to the tube. The centrifuge tube was placed on a shaker at 175 RPM for 20-30 minutes to extract the epothilone product from the resin. The methanol extract was transferred to a new centrifuge tube for storage and LC / MS analysis.
[0307]
Table 6 is a summary of the media used and their respective components.
[0308]
[Table 6]

The CYE medium and the production medium are sterilized in an automatic sterilization autoclave at 121 ° C. for 30 minutes. Trace element solution is filter sterilized; methyl oleate is autoclaved separately.
[0309]
A trace element solution is made by combining all of the components in Table 7 and adding 10 mL / L concentrated sulfuric acid to a final volume of 1 L.
[0310]
[Table 7]

The resulting solution is filter sterilized.
[0311]
(Fermentation, Production, and Purification of Epothilone from E. Myxococcus xanthus)
(Details of M. xanthus strain)
Strain K111-25-1 is an epothilone B producing strain, which also produces epothilone A. Strain K111-40-1 is an epothilone D producing strain, which also produces epothilone C.
[0312]
(Maintenance of M. xanthus on plate)
M. The xantus strain is maintained on CYE agar plates (see Table 8 for plate composition). Colonies appear approximately 3 days after the plates are streaked. Plates are incubated at 32 ° C. to the desired growth level and then stored at room temperature for up to 3 weeks (storage at 4 ° C. on plates kills cells).
[0313]
(Table 8)
[0314]
[Table 8]

* The 1 L agar batch was autoclaved for 45 minutes and then poured into Petri dishes.
[0315]
(M. xanthus oil adaptation for cell banks)
From a CYE plate or frozen vial of cells, transfer a 100 μL pipette of non-oil-adapted colonies into a 50 mL glass culture tube containing 3 mL of CYE seed medium and 1 drop of methyl oleate. The cells are grown for 2-6 days until the culture appears dense under a microscope (30 ° C., 175 rpm). Since these cells do not always adapt well to the oil, start with several (5-7) tubes in parallel.
[0316]
(Cell bank procedure (master cell bank))
Initiate an oil-adaptive test tube culture as described above. If the test tube culture is sufficiently dense (OD = 5 +/- 1), transfer the entire contents of the test tube to a sterile 250 mL shake flask containing 50 mL of CYE-MOM seed medium. See table below for composition). After 48 ± 12 hours of growth in a shaking incubator (30 ° C., 175 rpm), 5 mL of this seed culture is transferred into a 500 mL shake flask containing 100 mL of CYE-MOM. The culture is grown for a full day in a shaking incubator (30 ° C., 175 rpm). The culture is checked microscopically for proper growth and lack of contamination.
[0317]
Combine 80 mL of this seed culture with 24 mL of 90% sterile glycerol in a sterile 250 mL shake flask. Swirl to mix well and aliquot 1 mL of this mixture into 100 sterile pre-labeled cryovials. These are slowly frozen in vials in a -80 ° C freezer.
[0318]
(Cell bank procedure (working cell bank))
Test tube culture is initiated by thawing one of the master cell bank vials prepared as described above at room temperature, and then transferring the entire contents to a glass test tube containing 3 mL of CYE-MOM seed medium. Put in. If the tube culture is sufficiently dense (OD = 5 +/- 1), transfer the entire contents of the tube to a 250 mL sterile shake flask containing 50 mL of CYE-MOM seed medium. After 48 ± 12 hours of growth (30 ° C., 175 rpm), 5 mL of this seed culture is transferred into a 500 mL shake flask containing 100 mL of CYE-MOM. The culture is grown for a whole day (30 ° C., 175 rpm). Check for growth and contamination with a microscope.
[0319]
Combine 80 mL of this seed culture with 24 mL of 90% sterile glycerol in a sterile 250 mL shake flask. Swirl to mix well and aliquot 1 mL of this mixture into 100 sterile pre-labeled cryovials. These are slowly frozen in vials in a -80 ° C freezer.
[0320]
(Composition of seed medium)
For expansion of cell banks and cell bank vials to any desired dose, use the same seed medium as described in Table 9.
[0321]
(Table 9)
[0322]
[Table 9]

* Note: Methyl oleate is added after the other components are added because methyl oleate forms an emulsion in the Castone and does not mix completely with the other components.
[0323]
(Inoculation of 5 L and 1000 L shake flasks for fermentation)
Thaw a frozen working cell bank vial of methyl oleate adapted cells. Transfer the entire contents of the vial into a 50 mL glass culture tube containing 3 mL of CYE-MOM seed medium. Place tubes in shaker (30 ° C., 175 rpm) and grow for 48 ± 24 hours. Transfer the entire contents of the culture tube to a 250 mL shake flask containing 50 mL of CYE-MOM seed medium. Place tubes in shaker (30 ° C., 175 rpm) and grow for 48 ± 24 hours. To use the shake flask for the experiment, the seed is propagated by subculturing 10 mL of this culture into 40 mL of fresh CYE-MOM in five new seed flasks. The seed flask is incubated for 24 ± 12 hours in a shaker (30 ° C., 175 rpm) and used as inoculum for the flask culture (30-100 mL) of the resulting culture. Inoculate the production flask at 4.5% combined (seed and production medium) initial volume.
[0324]
To prepare seeds for small-scale (5-10 L) fermentations, the entire contents of one of these 50 mL seed flasks was transferred to a sterile 2.8 L Fernbach flask containing 500 mL CYE-MOM. Subculture. The Fernbach flask is incubated for 48 ± 24 hours in a shaker (30 ° C., 175 rpm) and used as a fermenter inoculum. The resulting fermentation is seeded at a combined initial volume of about 5%.
[0325]
Further seed propagation is required for large-scale (1000 L) fermentation. Here, 1 L of Fernbach flask seed is used to inoculate a 10 L seed fermenter containing 9 L of CYE-MOM (5% by volume). The pH of the fermenter is controlled at 7.4 by the addition of 2.5N potassium hydroxide and 2.5N sulfuric acid. The temperature is set at 30 ° C. Dissolved oxygen is maintained at a saturation of 50% or more by agitation speed cascading of 400-700 rpm. Set the initial stirring speed to 400 rpm and keep the sparging speed at 0.1 v / v / m. After 24 ± 12 hours of growth in a 10 L fermentor, the entire culture is transferred to a 150 L fermentor containing 90 L of CYE-MOM. The pH is again adjusted to 7.4 with 2.5N potassium hydroxide and 2.5N sulfuric acid. Set the temperature to 30 ° C. Dissolved oxygen is maintained at a saturation of 50% or more by agitation speed cascading of 400-700 rpm. Set the initial stirring speed to 400 rpm and keep the sparging speed at 0.1 v / v / m.
[0326]
(Preparation of XAD-16 resin for fermentation)
Transfer the desired amount of XAD-16 resin (Rohm & Haas) to a methanol safety container having a capacity at least three times the weight of the XAD-16 resin (ie, 1.2 kg of resin requires at least a 3.6 L container) And). The resin is thoroughly washed with 100% methanol to remove any monomer present on the unused resin. Add twice as much methanol (L) as resin weight (kg) (ie, 6 L methanol for 3 kg XAD-16). The methanol and XAD slurry are mixed for 5 minutes to remove any monomer present on XAD-16. The slurry is gently agitated and mixed to minimize resin fragmentation. Stop mixing and allow resin to settle by gravity for at least 15 minutes. Drain the methanol from the vessel, leaving a 0.5-1 inch layer of methanol on the XAD bed. Transfer XAD and methanol from the mixing vessel to an Amicon VA250 column. Glue the top bed support to the column and turn the seal adjustment knob clockwise to seal the bed support. The XAD in the column is washed at 300 ± 50 cm / hour with methanol at least 5 times the column volume. Collect the methanol flow in the solvent waste container. The XAD is washed in the column at 300 ± 50 cm / hr with 10 column volumes or more of deionized water.
[0327]
The composition of the epothilone producing medium is described in Table 10.
[0328]
(Table 10)
[0329]
[Table 10]

* Note: Methyl oleate is added after the other components are added because methyl oleate forms an emulsion in the Castone and does not mix completely with the other components. Trace element solutions are as described in Table 7.
[0330]
(Preparation and flask-scale (50 mL) epothilone-producing fermentation product)
Autoclave 1 g of XAD-16 in a 250 mL shaker with enough deionized water (about 3 mL) to cover the resin. The flask is autoclaved for 30 minutes at 121 ° C. The following media components are added aseptically to the flask: 50 mL of CTS-MOM production medium, and 2.5 mL of 1 M HEPES buffer (titrated to pH 7.6 with potassium hydroxide). Seed the culture with a 2.5 mL CYE seed flask (4.5% v / v seed). Incubate the production flask on a shaker at 30 ° C. and 175 rpm.
[0331]
Start feeding Castone and methyl oleate 24 ± 6 hours after seeding. At this point and every 24 ± 6 hours thereafter, feed 1 mL of the 100 g / L Castone solution and 150 μL of methyl oleate. This feeding regimen continues until day 13 after the first feeding or until cells are observed to start lysing (days 11-14). An exemplary 5 mL sample of well mixed fermentation broth and XAD may be taken to determine the epothilone production kinetics. In addition, small samples (0.25-0.5 mL) of XAD-free broth can be taken daily to visually confirm the state of growth of the culture. If large amounts of cell lysis are observed, the rest of the culture volume should be collected.
[0332]
(Preparation and 5L scale epothilone producing fermentation)
100 g XAD and 8 g MgSO ₄ -7H ₂ Combine O with 3.9 L of deionized water and sterilize (90 min, 121 ° C.) in a 5 L B-Braun bioreactor. A sufficient amount (133 mL) of pre-sterilized Castone / deionized aqueous solution (150 g / L) is aseptically pumped to reach a final Castone concentration of 5 g / L in the fermentor. An initial methyl oleate concentration of 2 mL / L is achieved by adding 10 mL of methyl oleate. Finally, 16 mL of the pre-sterilized trace element solution is added aseptically before seeding. The fermentation layer is then inoculated with a 200 mL CYE seed culture (4.8% volume / volume) and grown for 24 ± 6 hours. At this point, feeding with Castone (2 g / L / day, continuous feeding) and methyl oleate (3 mL / L / day, semi-continuous feeding every 90 minutes) is started. In the bioreactor, the airflow is kept constant at 0.4-0.5 vvm (increase in fermentation capacity as feeding progresses causes this change). The dissolved oxygen concentration is controlled to 50% saturation by a stirring cascade (400-700 rpm). The calibration point for 100% saturated dissolved oxygen is established by setting the initial agitation to 400 rpm and the initial air flow to 0.5 vvm. The pH set point of 7.4 is 2.5 NH ₂ SO ₄ And is maintained by automated addition of 2.5N KOH. Epothilone production lasts 11 to 14 days after seeding, and if cell lysate appears in the broth sample and the oxygen demand (indicated by the agitation speed) decreases rapidly, the bioreactor is harvested. In this fermentation process, the titer of epothilone D generally reaches 18-25 mg / L.
[0333]
(Preparation and 1000L scale epothilone producing fermented product)
A 1000 L fermentor was prepared for epothilone production as follows. 600 L of water and 18 L (11.574 kg) of XAD-16 were sterilized in a fermentor (45 min, 121 ° C.). Trace metals and MgSO4 were filtered directly through a 0.2 μm polyethersulfone membrane capsule filter into the fermentation vessel. 2.9 L of trace element solution and sufficient amount of concentrated MgSO ₄ The solution (in the fermentor, up to a final concentration of 2 g / L) was added through the same capsule filter. About 200 L of a mixture of 117 g / L Castone and 175 mL / L methyl oleate was sterilized in a 260 L feeding tank. 32 L of this sterilized mixture was added to a 1000 L fermentor. The water was filtered into the vessel (through the same capsule filter) to a final volume of 710 L. Stirring was at 100 rpm. Back pressure was maintained at 100-300 mbar. If the dissolved oxygen (DO) reached 50% after seeding, the agitation was increased to 150 rpm. When the DO reached 50% again, the agitation was increased to 200 rpm. The DO was controlled to 50% saturation by cascading the airflow (0 Lpm to 240 Lpm). 2.5N H ₂ SO ₄ The pH set point was maintained at 7.4 by automated addition of 2.5N KOH. 38 L of seed from a 150 L stirred tank were seeded into the stirred tank (5% volume / volume).
[0334]
Addition of the 0.570 L / hour Castone-methyl oleate feeding solution began after the DO reached 50% (for the second time, approximately 10 ± 5 hours after seeding) and continued until the stirred tank was collected. The bioreactor was collected 10 days after seeding. The final epothilone D titer was determined to be about 20 ± 5 mg / L.
[0335]
(Procedure for collecting fermented products)
For kinetic experiments in flasks, 5-50 mL of the well-mixed broth and XAD resin were collected using a 25 mL pipette and placed in 10 or 50 mL conical tubes. For bioreactor samples, place 50 mL of the well-mixed broth and resin samples into a 50 mL conical tube. The conical tube was then allowed to settle for 10 minutes, allowing XAD to settle to the bottom of the tube. The broth at this point can be decanted from the XAD resin. If XAD does not settle, the broth can be removed using a 10-25 mL pipette.
[0336]
(Methanol extraction of XAD resin for epothilone titer determination)
After the XAD resin has settled to the bottom of the tube by gravity (by the harvest procedure), transfer all of the supernatant to a new 50 mL conical tube. Wash the XAD resin once by adding water to the original 50 mL mark, mix well by inversion, and let the XAD resin gravity settle again. Decant the aqueous mixture from the test tube so that the XAD does not pour out. The last few mL of water can be removed by using a 1 mL Pipetman to push the tip down to the bottom of the test tube. Add methanol to the 25 mL point to the tube and cap the tube. Place the conical tube horizontally on a shaker for 30 minutes (at 20-30 ° C.) to thoroughly extract all epothilones from the XAD resin.
[0337]
(HPLC procedure for epothilone quantification)
Analysis of epothilone C and epothilone D is performed using a Hewlett Packard 1090 HPLC, using UV detection at 250 nm. The methanol extraction solution (50 μL) from the XAD resin was applied to two columns, a 4.6 × 10 mm guard column (Inertsil, C18 OD 53, 5 μm) and a long column (4.6 × 150 mm) of the same material for chromatographic separation. Was injected. The method was isocratic eluted with 60% acetonitrile and 40% water throughout the 18 minute run. Using this method, epothilone D eluted at 13 minutes and epothilone C eluted at 10.3 minutes. Standards were prepared using epothilone D purified from fermentation broth.
[0338]
(Procedure for measuring dry cell weight for growth curve)
Set the temperature to 20 ° C. in a Sorvall RC5B centrifuge (with SH-3000 bucket rotor). Weigh 50 mL conical tubes that have been in an 80 ° C. oven for at least one day. Record the dead weight and fermentation sample identification on the side of the test tube. Pour 40 mL of broth (without XAD) into a weighed tube or pipet. Spin the conical tube at 4700 RPM (4200 g) for 30 minutes. After settling, the supernatant is drained off and the cell pellet is resuspended in 40 mL of deionized water to wash the pellet. Rotate the tube again (4200 g, 30 minutes). The supernatant is decanted and the tube is placed in a drying oven at 80 ° C. for at least 2 days. Measure the weight of the test tube and record the final weight on the test tube. The dry cell weight (DCW) is then calculated by the following formula:
DCW (g / L) = (final test tube weight (g) -self weight of test tube (g)) / 0.04 L.
[0339]
(Determination of ammonium ion concentration)
The ammonia concentration of the fermentation broth is conventionally evaluated in epothilone fermentations. 1 mL of fermentation broth is clarified by centrifugation in a microcentrifuge (5 minutes, 12000 rpm). An ammonia assay kit (catalog number 171-UV) provided by Sigma is used for quantification and the clarified fermentation broth replaces the plasma described in the kit protocol. The linear response range of this colorimetric assay is only 0.01176-0.882 mmol / L, and to assay for ammonium concentrations within this range, clarified fermentation samples are typically prepared in distilled water. Dilute 20-100 times.
[0340]
(Determination of the concentration of methyl oleate in the residue)
The amount of residual methyl oleate present in the fermentation broth can be estimated by extracting the fermentation broth samples using methanol and subjecting these extracted broth samples to HPLC. Quantification of methyl oleate concentration is performed using a Hewlett Packard 1090 HPLC using UV detection at 210 nm. All broth samples (1-4 mL) were extracted using an equal volume of methanol and centrifuged at 12,000 g to sediment any insoluble components. The clarified supernatant (50 μL) is injected onto a 4.6 × 10 mm extraction column (Inertsil, C18 OD 53, 5 μm), washed with 50% acetonitrile for 2 minutes, and then the main column (4.6 × 150 mm, same as above). (Stationary phase and flow rate) with a 24 minute gradient starting with 50% acetonitrile and ending with 100% acetonitrile. The 100% acetonitrile column flow was maintained for 5 minutes. Due to this heterogeneous nature, methyl oleate elutes not as a single pure compound but as many separate peaks. However, about 64-67% of the total extractable methyl oleate appears in two major peaks, which elute at 25.3 ± 0.2 min and 27.1 ± 0.2 min, respectively. . Methyl oleate in the methanol-extracted fermentation samples quantified the sum of the areas of these two peaks, and then compared them with the standard of methyl oleate prepared in 50% water / methanol. Normalize to the total area of the peaks.
[0341]
(Purification and crystallization of Epothilone D)
The present invention provides purification processes for epothilone and epothilone D, as well as highly purified preparations of epothilone D, including crystalline forms of epothilone D. Advantages of the process of the present invention include an initial purification step that requires only alcohol (eg, methanol) and water, which allows for efficient use of the product pool, time and labor. Minimizing the need for such an evaporation step. The method of the present invention requires only a single evaporation step, which requires evaporation of 1 L of ethanol for every 10-15 g of epothilone. In this process, a column packed with synthetic polystyrene-divinylbenzene resin (eg, HP20SS) is used to remove both polar and lipophilic impurities. This column produces an intermediate product containing 10% epothilone, eliminating the need for liquid / liquid extraction with either highly flammable or toxic solvents.
[0342]
Another improvement relates to the use of C18 resin having a 40-60 μm particle distribution (eg, Bakerbond C18), which allows the use of low pressure columns and pumps (less than 50 psi), significantly reducing costs. The starting material for the C18 chromatography step is a solution that is loaded in a diluted loading solvent. The solvent was weak enough to remain in a highly concentrated dense band of epothilone at the top of the column, which caused the column to under high load (2-5 g epothilone / L resin) Can work well. This improvement results in significant cost savings, since column loads are typically less than 1 g / l and chromatography is usually the most expensive step in purification. Further, the method of the present invention allows for the use of an alcohol (eg, methanol) instead of acetonitrile in the chromatography step. The pool containing epothilone is crystallized from a binary solvent system, where water is the forcing solvent to provide epothilone in crystalline form.
[0343]
In one embodiment, the purification process consists of the following steps and materials. The XAD resin in the fermentation broth was (1) collected in a filter bucket, (2) eluted to provide an XAD extract, (3) diluted with water, and (4) passed through an HP20SS column Provide a pool. The HP20SS pool is (5) diluted with water and (6) subjected to C18 chromatography to provide an epothilone pool, which is (7) diluted with water and (8) subjected to a solvent exchange to provide concentrated epothilone. Provide a pool. This concentrated epothilone pool is (9) subjected to charcoal filtration, (10) evaporated and (11) crystallized to provide a highly purified material.
[0344]
By performing two 1000 L Myxococcus xanthus fermentations, a total of 11 g of epothilone D was isolated from (1031001K and 1117001K) and purified to a white crystalline powder. The purity of the final product was over 95% and the recovery of epothilone D was 71%.
[0345]
Table 11 summarizes the HPLC methods used during the purification.
[0346]
(Table 11)
[0347]
[Table 11]

The materials used in this section are as follows. HP20SS resin was purchased from Mitsubishi. C18 resin was purchased from Bakerbond C18 (40 g) and methanol was purchased from Fisher Bulk (55 gal). Deionized water was used.
[0348]
(Execution of fermentation 1031001K)
(Step 1 XAD elution (K125-173)
17 L of XAD-16 resin is filtered from the fermentation culture using a Mainstream filter unit equipped with a 13 L 150 μm capsule bucket. The captured XAD resin was packed into an Amicon VA250 column and washed with 65 L (3.8 column volumes) of water at 1.0 L / min. The epothilone D product was then eluted from the resin using 230 L of 80% methanol / water.
[0349]
(Step 2 solid phase extraction (K125-175))
77 L of water was added to the product pool from step 1 (230 L) to dilute the loading solvent to 60% methanol / water. The resulting suspension (307 L) was mixed and loaded onto an Amicon VA180 column packed with 5 L of HP20SS resin previously equilibrated with 5 column volumes of 60% methanol. The loading flow rate is 1 L / min. After loading, the column was washed with 13 L of 60% methanol and eluted with 77 L of 75% methanol at a flow rate of 325 mL / min. Thirty-one 2.5 L fractions were collected. Fractions 10-26 (42.5 L) were found to contain epothilone D and these fractions were pooled together.
[0350]
(Step 3 chromatography (K125-179))
The product pool from step 2 was evaporated to an oil using two 20-L rotovaps. During evaporation, it was necessary to add ethanol to minimize foaming. The dried material was resuspended in 1.0 L of methanol and diluted with 0.67 L of water to make 1.67 L of a 60% methanol solution. The resulting solution was loaded onto a 1-LC18 chromatography column (55 x 4.8 cm) that had been previously equilibrated with 3 column volumes of 60% methanol. The average flow rate applied was 64 mL / min. The loaded column was washed with 1 L of 60% methanol and elution of the epothilone D product was performed isocratically with 70% methanol at a flow rate of 33 mL / min. A total of 27 fractions were collected (the first fraction contained a 3.8 L volume). This was followed by three 500 mL fractions and 23 250 mL fractions. Fractions 5 to 20 were taken as the best pool (K125-179-D) and contained 4.8 g of epothilone D. Fractions 3-4 (K125-179-C) contained 1.4 g of epothilone D. This pool also contained a high concentration of epothilone C and was saved for reuse (step 3b).
[0351]
(Step 4 chromatography (K119-153)
The epothilone D fraction, which also contained a high concentration of the C analog, was rechromatographed on C18 resin as follows. The C18 resin was packed into a 2.5 × 50 cm column, washed with 1 L of 100% methanol, and equilibrated with 1 L of 55% methanol / water at a flow rate of 20 mL / min. The pressure drop was 125 psi. The starting material (K125-179-C, 1040 mL) was diluted with 260 mL of water, so that the loading solution contained 55% methanol / water. The resulting solution (1300 mL) was loaded on the resin and an additional 250 mL of 55% methanol was passed through the column. The column was eluted first with 5 L of 65% methanol, followed by 3 L of 70% methanol / water. A total of 48 100 mL fractions were collected during the 65% methanol elution. After switching to 70% methanol, a total of ten 250 mL fractions were collected. The best epothilone D pool (K119-153-D) (including fractions 50-58) contained 1.0 g of the desired product.
[0352]
(Step 5a Crystallization (K119-158))
The starting material for this step was a combination of the chromatographic products from steps 3 and 4. Initially, 120 ml of ethanol was added to 7.9 g of solid containing 5.5 g of epothilone D. With gentle stirring, the solid was completely dissolved and the solution was transferred to a 400 mL beaker placed on a stir plate in a fume hood. A1 '' stir bar was added and the solution was stirred rapidly. Meanwhile, 100 mL of water was added slowly over about 5 minutes. When the formation of small white crystals was observed, the solution was stirred for more than 15 minutes until the solution was thick with a white solid. The beaker was then removed from the stir plate, covered with aluminum foil, and placed in a refrigerator (2 ° C.) for 12 hours. The white solid was filtered using Whatman # 50 filter paper and no further washing was performed on the first crop. The solid was placed in a crystallizing dish and dried in a vacuum oven (40 ° C. at 15 mbar) for 1 hour. The material was then removed from the oven, to finer particles, and dried in a vacuum oven for an additional 4 hours. This crystallization process yielded 3.41 g of a gray solid. The Epo1 HPLC method was used to determine the chromatographic purity of the final product. Corresponding ¹ 1 H NMR data and ^Thirteen HPLC results, along with the C NMR data, confirmed that all dried material contained 95% or more of epothilone D. The recovery of the first crop was 58%.
[0353]
(Step 5b Crystallization (K119-167))
The starting material for this step was the evaporated mother liquor from step 5a. Initially, 70 ml of ethanol and 30 ml of water were added to 3.4 g of solid containing 2.1 g of epothilone D. The clear solution was transferred to a beaker and 1 g of decolorized charcoal was added thereto. The mixture was stirred for 10 minutes on a medium setting and then filtered using Whatman # 50 filter paper. The charcoal was washed twice with 10 ml aliquots of ethanol and filtered again. The combined filtrate was dried using rotovap and the solid was resuspended in 50 ml of ethanol. The resulting solution was placed in a 250 ml beaker and 50 ml of water was added slowly with good stirring. A small amount of seed crystals (1 mg) was added to the mixture to promote crystal formation. After stirring for several minutes, the formation of additional white solid was observed. While continuing to stir, a stream of nitrogen was set up to gently blow the mixture. After 15 minutes, the beaker was placed in a refrigerator at 2 ° C. for 36 hours. The mixture was used to capture the crystals using Whatman # 50 filter paper and the solid washed using an additional 7 ml of 50:50 ethanol: water. The crystals were then dried in a vacuum oven for 4 hours. Through this crystallization step, 1,46 g of white crystals containing 95% or more of epothilone D were obtained.
[0354]
(Execution of fermentation 1117001K)
(Step 1 XAD elution (K125-182))
17 liters (17 L) of XAD-16 resin was filtered from the fermentation culture using mainstream filtration with a 13 liter 150 μm capture basket. The captured XAD resin was loaded onto an Amicon VA250 column and washed with 58 L (3.4 column volumes) of water at 1.0 L / min. The epothilone D product was then eluted from the resin using 170 L of 80% ethanol in water. During washing with water and elution of the first column volume, the column back pressure steadily increased to more than 3 bar at a final flow rate of 300 mL / min. Therefore, the XAD resin was removed from the column and refilled on an alternative Amicon VA250 column. After the exchange, the back pressure was reduced to less than 1 bar and the flow rate was maintained at 1.0 L / min. A single 170-L fraction was collected in a 600-L stainless steel tank. Based on HPLC analysis, the product pool of step 1 was found to contain 8.4 g of epothilone D.
[0355]
(Step 2 solid phase extraction (K145-150))
57 liters (57 L) of water was added to the product pool of Step 1 (170 L) to dilute the loading solvent in 60% methanol in water. The resulting suspension (227 L) was stirred using an overhead lightning mixer and applied to a VA180 column packed with 6.5 L of HP20SS resin previously equilibrated with 5 column volumes of 60% methanol. Loaded. The load flow rate was 1 L / min. After loading, the column was washed with 16 L of 60% methanol and eluted with 84 L of 75% methanol at a flow rate of 300 mL / min. Seven fractions were collected at 18L, 6L, 6L, 6L, 36L and 6L, respectively. Fractions containing a total of 8.8 g of epothilone D were pooled together.
[0356]
(Step 3 chromatography (K145-160))
The product pool from step 2 was evaporated to an oil using two 20 L rotovaps. To minimize frothing during the evaporation process, 10 L of methanol was added to the material. The dried mixture was resuspended in 2.8 L of methanol and diluted with 3.4 L of water to make 6.2 L of 45% methanol. The resulting solution was pumped onto a 1-LC18 chromatography column (55 x 4.8 cm) previously equilibrated with 5 column volumes of 45% methanol. Load flow rates were averaged to 100 mL / min. The loaded column was washed with 1 liter of 60% methanol and the epothilone D product was eluted from the resin using a step gradient at a flow rate of 100 mL / min. The column was eluted using 5 L of 55% methanol, 11.5 L of 60% methanol and 13.5 L of 65% methanol. A total of 500 mL fractions were collected during the 55% methanol elution. After changing to 60% methanol, a total of 23 500 mL fractions were collected. During the final 65% methanol elution, eleven 500 mL fractions were collected, followed by eight 1 L fractions. This best epothilone D pool (K145-160-D), consisting of fractions 28-50, contains 8.3 g of the desired product. Fractions 26-27 (K145-160-C) contaminated with 0.4 g of epothilone C contain 0.2 g of epothilone D. All of these 25 fractions were combined.
[0357]
To dilute the product pool to 40% methanol in water, 9.5 L of water was added to 15.8 L of loading solution. The resulting solution (25.3 L) was then pumped onto a 700 mL C18 chromatography column (9 × 10 cm) previously equilibrated with 4 column volumes of 40% methanol. The load flow rate was 360 mL / min on average. The loaded column was washed with 1 liter of 40% methanol and the epothilone D product was eluted from the resin with 3.75 L of 100% methanol. The eluate was evaporated to dryness using a rotovap. This solid was resuspended in 100 mL of acetone and the undissolved material was filtered from the solution using Whatman # 2 filter paper. The filtered particles were washed with an additional 115 mL of acetone and filtered again. After acetone extraction, 2 g of decolorized charcoal was added to the combined filtrate. The mixture was stirred at medium setting for 1 hour and filtered using Whatman # 50 filter paper. The charcoal was washed with 180 mL of ethanol and filtered again. The filtrates were pooled together and rotovaped to dryness.
[0358]
(Step 4 chromatography (K119-174))
The dried material from step 3 was resuspended in 5.0 L of 50% methanol in water and previously equilibrated with 3 column volumes of 50% methanol, a 1-L C18 chromatography column (55 × 4.8 cm). The load flow rate averaged 80 mL / min. The column was then washed with 1 liter of 50% methanol and the epothilone D product was eluted isocratically from the resin using 70% methanol at the same flow rate. A total of 48 fractions were collected (including the first 47 containing 240 mL and the last containing 1 L). Fractions 25-48 were obtained as the best pool (K119-174-D) containing 7.4 g of epothilone D. Since fractions 21-24 (K119-174-D) contain 1.1 g of epothilone D, this pool also contains a high concentration of epothilone D, which neglected rework.
[0359]
(Step 5 crystallization (K119-177))
To perform the solvent exchange prior to the crystallization step, add 3.9 L of water to 6.4 L of the best epothilone D (K119-174-D) from step 5 and add 40% The load solution was diluted in methanol. The resulting solution was then loaded onto a 200-mL C18 chromatography column (2.5 × 10 cm) previously equilibrated with 3 column volumes of 40% methanol. The encoded column was washed with 200 mL of 40% methanol and the epothilone D product was eluted from the resin with 1 L of 100% ethanol. The eluate was evaporated to dryness using a rotovap and the solid was resuspended in 150 mL of 100% ethanol. The clear solution was transferred to a beaker and 175 mL of water was added slowly with good stirring. Some seed crystals (1 mg) were also added to this solution to promote crystal formation. When the formation of small white crystals was observed, the solution was stirred for more than 15 minutes until the solution was thick with a white solid. The beaker was then removed from the stir plate, covered with aluminum foil and placed in a refrigerator (2 ° C.) for 12 hours. The white solid was filtered using Whatman # 50 filter paper and no further washing was performed on the first crop. The solid was transferred to a crystallizing dish and dried in a vacuum oven (40C at 15 mbar) for 6 hours. The crystallization process yielded 6.2 g of a white solid containing 95% or more of epothilone D. The recovery of this first crop was 74%.
[0360]
(result)
Epothilone D recovery for run 1031001K was 4.8 g of crystalline material at a purity of about 97.5-98.8%. Recovery of epothilone D for run 117001K was 6.2 g of crystalline material at approximately 97.7% purity. The impurity profiles for these runs are shown in Table 12.
[0361]
[Table 12]

"Epo490" is a novel epothilone compound of the invention (10,11-dehydroepothilone D), which was produced by Myxococcus host cells.
[0362]
This purification methodology resulted from efforts to scale up the modifications made to the epothilone D purification process to accommodate the use of methyl oleate in fermentation media. Elution of the epothilone D product from the XAD resin was performed in a straightforward manner. Instead of using 100% methanol, the product was eluted from the beads on the column using 10 column volumes of 80% methanol. It was noted that during the XAD elution step, the presence of lysed cells in the fermentation broth could cause clogging of the purification column. The recovery of the 103100-1K fermentation run was performed before significant cell lysis occurred, while the 111700-1K fermentation run was collected only after significant cell lysis had occurred. However, high back pressure and low flow rates were only observed in later runs after the elution step. Thus, the lysed cells in this run are likely to clump and then foul the column filter.
[0363]
These purified runs show that epothilone D is stable in 80% methanol at room temperature for at least one day. Based on HPLC analysis, no degradation of the product under these conditions was detected. These findings allowed the storage of the 170 L product pool from the XAD elution step in a stainless steel tank overnight without refrigeration. To further improve this process, a solvent exchange column is used, which consumes less time and requires less labor than the use of rotovap in concentrating a volume of product pool. Thus, one skilled in the art can exchange large-scale evaporation and solvent exchange steps.
[0364]
Significant amounts of oil remained bound to the resin during the XAD elution step, but significant amounts still remained in the eluate. Even after HP20SS solid phase extraction, oil droplets were clearly visible in the product pool and proved to be a problem during C18 chromatography. For optimal chromatographic performance, the concentration of Epothilone D in the loading solution should be kept below 2 g / L. At higher concentrations, the starting material has a tendency to oil out the column.
[0365]
Crystallization is not possible if the feed contains more than 3% of either epothilone C or epo490. This was the case during the 1117001K purification. The first chromatography step provided 5% of the product of epothilone C. After numerous attempts, crystallization of this material was not achieved. However, subjecting this material to a second chromatography step reduced epothilone C to 1% and produced a readily crystallized feed.
[0366]
(Example 4)
(Construction of Myxococcus strain having non-functional epoK gene)
Strain K111-40-1 was constructed from strain K111-32.25 by insertional inactivation of the epoK gene. To construct this epoK mutant, a kanamycin resistance cassette was inserted into the epoK gene. This was done by isolating the 4879 bp fragment from pKOS35-79.85. The pKOS35-79.85 contained epoK and ligated it to NotI of pBluescript SKII +. This plasmid (pKOS35-83.5) was partially digested with ScaI and the 7.4 kb fragment was converted from pBJ180-2, which has blunted DNA ends with the Klenow fragment of DNA polymerase I. The 1.5 kb EcoRI-BamHI fragment containing the kanamycin resistance gene was ligated to obtain plasmid pKO90-55. Finally, an RP4 oriT fragment of about 400 bp from pBJ183 was ligated into the XbaI and EcoRI sites to create pKOS90-63. This plasmid was linearized with DraI and electroporated into Myxococcus xanthus strain K111-32.25, and transformants were transformed into M. lactis. xanthus strain K111-40.1 was selected to provide. The K111-40.1 strain was transformed on November 21, 2000, American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209., According to the Budapest Treaty. Deposited with the USA and is available under accession number PTA-2712.
[0367]
To create a markerless epoK mutant, pKOS35-83.5 was cut with SacI and the 2.9 kb and 4.3 kb fragments were ligated together. This plasmid (pKOS90-101) has an in-frame deletion at epoK. A 3 kb BamHI and NdeI fragment from KG2 (which has a DNA end blunted with the Klenow fragment of polymerase I and contains the kanamycin resistance gene and the galK gene) was then inserted into the DraI site of pKOS90-101. Ligation produced pKOS90-105. This plasmid was electroporated into K111-32.25 and kanamycin-resistant electroporates were selected. To replace the wild-type copy of epoK with the deletion, a second recombination event was selected by growth on galactose plates. These galactose-resistant colonies were tested for the production of epothilone C and epothilone D, and the resulting strain was named K111-72.4.4, and according to the Budapest Treaty, on November 21, 2000, American Type Culture. Collection, Manassas, VA 20110-2209. Deposited with the USA and is available under accession number PTA-2713.
[0368]
(Example 5)
(Addition of matBC)
The matBC gene encodes malonyl-CoA synthase and dicarboxylate carrier protein, respectively. An and Kim. 1998, Eur. J. Biochem. 257: 395-402, which is incorporated herein by reference. These two proteins are responsible for converting endogenous maleic acid in cells to malonyl-CoA. The products of the two genes can transfer dicarboxylic acids and convert them to CoA derivatives (PCT Patent Application No. US 00/28573, incorporated herein by reference). These two genes can be inserted into the chromosome of Myxococcus xanthus to increase intracellular concentrations of malonyl-CoA and methylmalonyl-CoA and increase polyketide production. This cleaves pMATOP-2 with BglII and SpeI and ligates it to the BglII site and SpeI of pKOS35-82.1 (including the tetracycline resistance conferring gene, Mx8 att site, M. xanthus promoter), and It is achieved by driving the expression of matBC. This plasmid was designated xanthus can be electroporated. Since the pilA promoter is highly translated, MatB and MatC may need to insert a weaker promoter in phenomena that too affect cell growth. Alternative promoters include those of the kanamycin resistance conferring gene.
[0369]
(Example 6)
(KS in load module ^Y Mutation)
The proposed mechanism of initiation of epothilone biosynthesis is the binding of malonate to the ACP of the load domain, followed by decarboxylation by the load KS domain. This loaded KS domain is an active site cytosine (KS) that cannot perform condensation reactions. ^Y ) Includes tyrosine. However, it is still believed that a decarboxylation reaction occurs. Experiments using rat fatty acid synthase showed that active cytosine (KS ^Q The glutamine-containing KS domain in ()) increases the order of magnitude of decarboxylation by two orders of magnitude, whereby a change of this amino acid to serine, alanine, asparagine, glycine or threonine increases the increase compared to wild type. It did not occur. Therefore, KS ^Y KS ^Q Changing to can increase priming of epothilones resulting in increased epothilone production. To make the changes in strain K111-32.25, pKOS39-148 was constructed with an approximately 850 bp epothilone KS load module coding sequence plasmid. KS ^Q Mutations were generated in this plasmid by site-directed mutagenesis. To perform the gene replacement in K111-32.25, the kanamycin resistance gene from KG2 and the galK gene were inserted into the DraI site of pKOS39-148 to convert plasmids pKOS111-56.2A and pKOS111-56.2B. Produced. The plasmid is different from the orientation of the kanamycin-galK cassette. These plasmids were electroporated into K111-32.25 and kanamycin resistant colonies were selected to create strain K111-63. To replace the wild-type load module KS, K111-63 was plated on a CYE galactose plate and colonies were cloned by PCR and sequencing. ^Q Screened for the presence of the mutant.
[0370]
(Example 7)
(Addition of mtaA)
To increase the level of phosphopantethenyl transferase (PPTase) protein, PPTase from Stigmatella aurantica strain DW4 can be added to K111-32.25. This was performed by PCR amplification of mtaA from DW4 chromosomal DNA using primers 111-44.1 (AAAAGCTTCGGGGCAACCTCCTGGCTGTTCGGC) and primers 111-44.4 (GGTTAATTAATCACCCTCCTCCCACCCCGGGGCAT). Silakowski et al., 1999, J. Am. Biol. Chem. 274 (52): 37391-37399 (hereby incorporated by reference). The approximately 800 bp fragment was cut with NcoI and ligated into pUHE24-2B cut with PstI, the DNA ends were blunted with the Klenow fragment of DNA polymerase I and cut with NcoI. This plasmid was designated as pKOS111-54. The mtaA gene was transferred to plasmid pKOS35-82.1 (containing the Mx8 att site for the tetracycline resistance conferring gene and the Myxococcus xanthus pilA promoter) to drive expression of mtaA. This plasmid was designated xanthus and integrated into the Mx8 phage binding site.
[0371]
(Example 8)
(Construction of promoter replacement plasmid)
To improve the level of epothilone production and to illustrate the wide variety of promoters that can be used to express the PKS gene in the host cells of the present invention, a series of vectors and host cells have been constructed to As described in the examples, the Sorangium cellulosum epothilone PKS gene can be replaced with another suitable promoter.
[0372]
(A. Construction of plasmid having downstream binding region)
The cosmid pKOS35-70.8A3 was cut with NsiI and AvrI. The 9.5 kb fragment was ligated with pSL1190 cut with PstI and AvrII to give pKOS90-13. Plasmid pKOS90-13 is approximately 12.9 kb. Plasmid pKOS90-13 was cut with EcoRI / AvrII. The 5.1 kb fragment was ligated into pBluescript digested with EcoRI / SpeI to create pKOS90-64 (about 8.1 kb). This plasmid contains the downstream flanking region for the promoter (epoA of the start codon and some sequence upstream). The EcoRI site is approximately 220 kb upstream from the start codon for the epoA gene. The AvrII site is 5100 bp downstream from the EcoRI site.
[0373]
(B. Cloning of the upstream flanking region)
Primers 90-66.1 and 90-67 (shown below) were used to clone into the upstream flanking region. Primers 90-67 are at the 5 'end of the PCR fragment and 90-66.1 is at the 3' end of the PCR fragment. The fragment ends at 2481 bp before the start codon for the epoA gene. The approximately 2.2 bp fragment was cut with HindIII. Klenow polymerase was added to blunt at the HindIII site. This fragment was ligated into the HincII site of pNEB193. A clone in the proper orientation (with EcoRI at the downstream end of the insert and HindIII at the upstream end of the insert) was selected and named pKOS90-90.
[0374]
Embedded image

(C. Construction of final plasmid)
Plasmid pKOS90-90 was cut with EcoRI and HindIII. The 2.2 kb fragment was ligated with EcoRI / HindIII digested pKOS90-64 to create pKOS90-91 (10.3 kb). Plasmid pKOS90-91 contains the upstream flanking region of the promoter, followed by the downstream flanking region in pBluescript. A Pad site for cloning the promoter of interest is between the two adjacent regions. Then, galK / kan ^r The cassette was inserted into Myxococcus xanthus to allow recombination. Plasmid pKOS90-91 was cut with DraI. DraI cuts once in the amp gene and twice in the vector (near the amp gene). Plasmid KG-2 was cut with BamHI / NdeI and Klenow polymerase was added to blunt-end the fragment. A 3 kb fragment (galK / kan) ^r Gene (including the gene) was ligated with the approximately 9.8 kb DraI fragment of pKOS90-91 to create pKOS90-102 (12.8 kb).
[0375]
(D. Construction of plasmid with alternative leader)
The native leader region of the epothilone PKS gene can be replaced with a leader having a different ribosome binding site. Plasmid pKOS39-136 (described in US patent application Ser. No. 09 / 443,501, filed Nov. 19, 1999) was cut with PacI / AscI. A 3 kb fragment containing the leader sequence and part of epoA was isolated and ligated with the 9.6 kb PacI / AscI fragment of pKOS90-102 to create pKOS90-106 (about 12.7 kb).
[0376]
(E. Construction of promoter replacement plasmid)
(I. MTA (myxothiazole promoter)) The myxothiazole promoter was converted from Stigmatella aurantiaca chromosomal DNA (strain DW4) using primers 111-44.3 and 111-44.5 (described below). The approximately 554 bp band was cloned into the HincII site of pNEB193 to create pKOS90-107.The plasmid pKOS90-107 was cut with PstI and XbaI and filled in with Klenow. It was cloned into pKOS90-102 and pKOS90-106 was cut with PacI and filled with Klenow (PacI was pKOS90-102 and pKOS90-1). The plasmid was screened for the correct orientation: the MTA promoter / pKOS90-102 plasmid was named pKOS90-114 (13.36 kb) and the MTA promoter / pKOS90-106 plasmid was named pKOS90. -113 (13.26 kb).
[0377]
Embedded image

These plasmids were electroporated into Myxococcus host cells containing the epothilone PKS gene and kanamycin resistant transformants were selected to identify single cross-recombinants. These transformants are selected for galactose resistance to identify double cross-over recombinants. It is screened by Southern analysis and PCR to identify those containing the desired recombination event. The desired recombinant is grown and tested for epothilone production.
[0378]
(II. TA promoter)
A putative promoter for TA along with taA encoding a putative transcriptional anti-terminator was PCR amplified from a TA strain using the following primers:
[0379]
Embedded image

The approximately 1.1 kb fragment was cut with BamHI and BglII and ligated into BNEHI cut pNEB193. This plasmid was named pKOS111-56.1. Plasmid pKOS111-56.1 was cut with EcoRI and HindIII and filled with Klenow. The approximately 1.1 kb band was cloned into PacOS cut pKOS90-102 and pKOS90-106 and filled with Klenow (PacI cuts only once in pKOS90-102 and pKOS90-106). Plasmids were screened for the correct orientation. The TA promoter / 90-102 plasmid was named pKOS90-115 (13.9 kb), and the TA promoter / pKOS90-106 plasmid was named pKOS90-111 (13.8 kb).
[0380]
These plasmids were electroporated into Myxococcus host cells containing the epothilone PKS gene and kanamycin resistant transformants were selected to identify single cross-recombinants. These transformants are selected for galactose resistance to identify double cross-over recombinants. It is screened by Southern analysis and PCR to identify those containing the desired recombination event. The desired recombinant is grown and tested for epothilone production.
[0381]
(III. PilA promoter)
Plasmid pKOS35-71B was cut with EcoRI and filled with Klenow. The 800 bp fragment was cloned into pKOS90-102 and pKOS90-106 cut with PacI and filled with Klenow. Plasmids were screened for the correct orientation. The pilA promoter / pKOS90-102 plasmid was named pKOS90-120 (13.6 kb) and the pilA promoter / pKOS90-106 plasmid was named pKOS90-121 (13.5 kb).
[0382]
These plasmids were electroporated into Myxococcus host cells containing the epothilone PKS gene and kanamycin resistant transformants were selected to identify single cross-recombinants. These transformants are selected for galactose resistance to identify double cross-over recombinants. It is screened by Southern analysis and PCR to identify those containing the desired recombination event. The desired recombinant is grown and tested for epothilone production.
[0383]
(IV. Kan promoter)
Plasmid pBJ180-2 was cut with BamHI / BglII and filled with Klenow. The 350 bp fragment was cloned into pKOS90-102 and pKOS90-106 cut with PacI and filled in with Klenow. Plasmids were screened for the correct orientation. The kan promoter / pKOS90-102 plasmid was named pKOS90-126 (13.15 kb), and the kan promoter / pKOS90-106 plasmid was named pKOS90-122 (13.0 kb).
[0384]
These plasmids were electroporated into Myxococcus host cells containing the epothilone PKS gene and kanamycin resistant transformants were selected to identify single cross-recombinants. These transformants are selected for galactose resistance to identify double cross-over recombinants. It is screened by Southern analysis and PCR to identify those containing the desired recombination event. The desired recombinant is grown and tested for epothilone production.
[0385]
(V. Sose90 promoter)
The Sose90 promoter was amplified from Sose90 chromosomal DNA using primers 111-44.6 and 111-44.7 (shown below). The approximately 900 bp band was cut with PacI and cloned into PNEI193 cut with PacI to create pKOS90-125. Plasmid pKOS90-125 was cut with PacI. The 924 bp band was cloned into pKOS90-102 and pKOS90-106 cut with PacI. Plasmids were screened for the correct orientation. The Sose90 promoter / pKOS90-102 plasmid was named pKOS90-127 (13.6 kb) and the Sose90 promoter / pKOS90-106 plasmid was named pKOS90-128 (13.7 kb).
[0386]
These plasmids were electroporated into Myxococcus host cells containing the epothilone PKS gene and kanamycin resistant transformants were selected to identify single cross-recombinants. These transformants are selected for galactose resistance to identify double cross-over recombinants. It is screened by Southern analysis and PCR to identify those containing the desired recombination event. The desired recombinant is grown and tested for epothilone production.
[0387]
Embedded image

(Example 9: Construction of KS2 knockout strain)
This example describes the construction of an epothilone PKS derivative. Here, the KS domain of the extension module 2 is inactivated by a mutation that changes a cysteine codon in the active site to an alanine codon. The resulting derivative PKS is provided to a synthetic precursor (as described in the Examples below) to make an epothilone derivative of the invention.
[0388]
The downstream flanking region of the epothilone PKS gene was replaced with the following primers:
[0389]
Embedded image

Was used to PCR amplify from plasmid pKOS35-78.2. The approximately 2 kb PCR product was cut with NsiI / XbaI and ligated with pSL1190 digested with NsiI and SpeI to create pKOS90-123 (about 5.4 kb). The following primers:
[0390]
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The approximately 2 kb PCR fragment amplified from pKOS35-78.2 DNA was digested with NsiI and ligated with Nsil / EcoRV digested pKOS90-123 to create pKOS90-130 (about 7.5 kb). Plasmid pKOS90-131 is made when this plasmid is cut with NsiI and the DNA ends are blunt-ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I and religated. galK / kan ^r To clone the cassette into this plasmid, plasmid KG-2 is cut with BamHI / NdeI and blunt-ended with the Klenow fragment of DNA polymerase I. The 3 kb fragment is cloned into the DraI site of pKOS90-131 (DraI cuts three times in this vector) to create plasmid pKOS90-132 (10.5 kb). The NsiI site is used to create the desired cysteine to alanine change that results in KS2 knockout. When pKOS90-130 is cut with NsiI, blunt-ended with the Klenow fragment from DNA polymerase I and religated, the codon for cysteine is replaced with the codon for alanine. The resulting plasmid can be introduced into a Myxococcus xanthus strain of the present invention according to the protocol described above to generate the desired strain.
[0391]
The Myxococcus xanthus strain K90-132.1.1.2 was constructed by this procedure (using Epothilone A, B, C and D producers K111-32.25) and under the terms of the Budapest Treaty, November 2000. Deposited with the American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA on March 21, which can be obtained under accession number PTA-2715. To demonstrate that the resulting PKS product produced by this strain is capable of synthesizing epothilones when provided with the appropriate "diketide" starting unit, 30 strains K90-132.1.1.2 were used. Grow for 3 days at 50 ° C. in 50 ml CTS and 20% XAD, then provided 200 mg / mL of the thiazole diketide shown below:
[0392]
Embedded image

The strain was cultured for an additional 5 days and the XAD was collected and epothilone was extracted with 10% methanol. The extract was dried and resuspended in 0.2 mL of acetonitrile, and a 0.05 mL sample was analyzed by LC / MS, which indicated the presence of epothilones B and D as expected. As discussed in the examples below, this system can be used to produce various epothilone analogs.
[0393]
(Example 10)
(Modified epothilone from chemical biosynthesis)
This example describes a series of thioesters for the production of epothilone derivatives via chemical biosynthesis. The DNA sequence of the biosynthetic gene cluster for epothilone from Sorangium cellulosum indicates that priming of PKS involves a mixture of polyketide and amino acid components. Priming involves loading the PKS-like portion of the loading module with malonyl-CoA, followed by decarboxylation and loading of the extension module 1NRPS (with cysteine), followed by condensation to form enzyme-linked N-acetylcysteine. Including. Cyclization to form thiazoline is followed by oxidation to form enzyme-linked 2-methylthiazol-4-carboxylate (the product of the loading module and NRPS). Subsequent condensation with methylmalonyl-CoA by the keto synthase of module 2 provides the equivalent of a diketide as shown in Scheme 6.
[0394]
Embedded image

The present invention relates to chemical biosynthesis to produce epothilone derivatives to produce 6-dEB and erythromycin analogs in a manner similar to that described in PCT Publication Nos. 99/03986 and 97/02358. Methods and reagents are provided. Provides two types of feed substrates: an analog of the NRPS product, and an analog of the diketide equivalent. The NRPS product analog is used with a PKS enzyme having a mutated NRPS-like domain, and a diketide equivalent is used with a PKS enzyme having a mutated KS domain in module 2 (as described in Example 9). In the structures in Schemes 7 and 8 below, R, R ₁ And R ₂ Is methyl, ethyl, lower alkyl (C ₁ -C ₆ ), And substituted lower alkyl.
[0395]
Scheme 7 shows an exemplary loading module analog.
[0396]
Embedded image

The loading module analog is prepared by activation of the corresponding carboxylic acid and treatment with N-acetylcysteamine. Activation methods include the formation of acid chlorides, the formation of mixed anhydrides, or the reaction with a condensing reagent such as carbodiimide.
[0397]
Scheme 8 shows an exemplary diketide equivalent.
[0398]
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The diketide equivalent is prepared in a three step process. First, the corresponding aldehyde is treated with a Wittig reagent or equivalent to form a substituted acrylic ester. The ester is saponified to an acid, which is then activated and treated with N-acetylcysteamine.
[0399]
An exemplary reaction scheme for making loading module product analogs and diketide equivalents follows. Additional compounds suitable for making diketide equivalents are shown in FIG. 1 as carboxylic acids (or aldehydes that can be converted to carboxylic acids) that are converted to N-acetylcysteamide for delivery to host cells of the invention. .
[0400]
(A. Thiophene-3-carboxylate N-acetylcysteamine thioester)
Under an inert atmosphere, a solution of thiophene-3-carboxylic acid (128 mg) in 2 mL of dry tetrahydrofuran was treated with triethylamine (0.25 mL) and diphenylphosphoryl azide (0.50 mL). After 1 hour, N-acetylcysteamine (0.25 mL) was added and the reaction was allowed to proceed for 12 hours. The mixture was poured into water and extracted three times with an equal volume of ethyl acetate. The combined organic extracts were combined with water, 1N HCl, saturated CuSO ₄ And brine, followed by MgSO ₄ , Filtered and concentrated under reduced pressure. SiO using ether followed by ethyl acetate ₂ Provided a pure product, which crystallized on standing.
[0401]
(B. Furan-3-carboxylate N-acetylcysteamine thioester)
Under an inert atmosphere, a solution of furan-3-carboxylic acid (112 mg) in 2 mL of dry tetrahydrofuran was treated with triethylamine (0.25 mL) and diphenylphosphoryl azide (0.50 mL). After 1 hour, N-acetylcysteamine (0.25 mL) was added and the reaction was allowed to proceed for 12 hours. The mixture was poured into water and extracted three times with an equal volume of ethyl acetate. The combined organic extracts were combined with water, 1N HCl, saturated CuSO ₄ And brine, followed by MgSO ₄ , Filtered and concentrated under reduced pressure. SiO using ether followed by ethyl acetate ₂ Provided a pure product, which crystallized on standing.
[0402]
(C. Pyrrole-2-carboxylate N-acetylcysteamine thioester)
Under an inert atmosphere, a solution of pyrrole-2-carboxylic acid (112 mg) in 2 mL of dry tetrahydrofuran was treated with triethylamine (0.25 mL) and diphenylphosphoryl azide (0.50 mL). After 1 hour, N-acetylcysteamine (0.25 mL) was added and the reaction was allowed to proceed for 12 hours. The mixture was poured into water and extracted three times with an equal volume of ethyl acetate. The combined organic extracts were combined with water, 1N HCl, saturated CuSO ₄ And brine, followed by MgSO ₄ , Filtered and concentrated under reduced pressure. SiO using ether followed by ethyl acetate ₂ Provided a pure product, which crystallized on standing.
[0403]
(D. 2-Methyl-3- (3-thienyl) acrylate N-acetylcysteamine thioester)
(1) Ethyl 2-methyl-3- (3-thienyl) acrylate: thiophene-3-carboxaldehyde (1.12 g) and (carbethoxyethylidene) tris in dry tetrahydrofuran (20 mL) A mixture of phenylphosphorane (4.3 g) was heated at reflux for 16 hours. The mixture was cooled to ambient temperature and concentrated under reduced pressure to dryness. The solid residue was resuspended in 1: 1 ether / hexane and filtered to remove triphenylphosphine oxide. The filtrate is purified using 1: 1 ether / hexane to form ₂ Filtration through a pad of afforded the product (1.78 g, 91%) as a pale yellow oil.
[0404]
(2) 2-Methyl-3- (3-thienyl) acrylic acid: The ester from (1) was dissolved in a mixture of methanol (5 mL) and 8N KOH (5 mL) and heated at reflux for 30 minutes. The mixture was cooled to ambient temperature, diluted with water and washed twice with ether. The aqueous phase was acidified using 1N HCl and then extracted three times with an equal volume of ether. Combine the organic extracts and add MgSO ₄ , Filtered and concentrated to dryness under reduced pressure. Crystallization from 2: 1 hexane / ether provided the product as colorless needles.
[0405]
(3) 2-Methyl-3- (3-thienyl) acrylate N-acetylcysteamine thioester: a solution of 2-methyl-3- (3-thienyl) acrylic acid (168 mg) in 2 mL of dry tetrahydrofuran under an inert atmosphere Was treated with triethylamine (0.56 mL) and diphenylphosphoryl azide (0.45 mL). After 15 minutes, N-acetylcysteamine (0.15 mL) was added and the reaction was allowed to proceed for 4 hours. The mixture was poured into water and extracted three times with an equal volume of ethyl acetate. The combined organic extracts were combined with water, 1N HCl, saturated CuSO ₄ And brine, followed by MgSO ₄ , Filtered and concentrated under reduced pressure. SiO using ethyl acetate ₂ Chromatography provided a pure product, which crystallized on standing.
[0406]
The above compounds are supplemented to a culture of a host cell containing the recombinant epothilone PKS of the present invention, wherein either the NRPS or KS domain of the extension module 2 prepares the corresponding epothilone derivative of the present invention. In addition, it has been inactivated by mutation.
[0407]
(Example 11)
(Generation of epothilone analog)
(A. Generation of 13-keto-epothilone analog)
Inactivation of the KR domain in the epothilone PKS extension module 4 results in a hybrid PKS of the present invention useful for the production of 13-keto-epothilone. The extension module 4KR domain was modified by replacing the wild-type gene with various deletion versions described below. First, the fragment was amplified using plasmid pKOS39-118B (a subclone of the epoD gene from cosmid pKOS35-70.4) as a template. Oligonucleotide primers to form the left side of the deletion are TL3 and TL4 and are shown below:
[0408]
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Oligonucleotide primers for forming the right side of the deletion are TL5 and TL6 and are shown below:
[0409]
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The PCR fragment was cloned into the vector Litmus 39 and sequenced to confirm that the desired fragment was obtained. The clone containing the TL3 / TL4 fragment was then digested with the restriction enzymes PstI and BamHI, and the approximately 4.6 kb fragment was isolated. The 2.0 kb PCR fragment obtained using primers TL5 / TL6 was treated with the restriction enzymes BglII and XbaI, then (i) the "short" KR linkers TL23 and TL24 (which were annealed together to (To form a double-stranded linker with an overhang of the main strand) to yield pKOS122-29; or (ii) "long" (epoDH3). ^* ) Linker (obtained by PCR using primers TL33 + TL34, followed by treatment with restriction enzymes NsiI and SpeI) to obtain plasmid pKOS122-30. The sequences of these oligonucleotide linkers and primers are shown below:
[0410]
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.
[0411]
Plasmids containing the desired substitutions were confirmed by sequencing and then digested with the restriction enzyme DraI. The large fragment of each clone was then ligated into the kanamycin resistance gene and galK gene (KG or kan-gal) cassette to provide the delivery plasmid. This delivery plasmid was transformed by electroporation into the epothilone B producer Myxococcus xanthus K111-32.25. These transformants were screened and kanamycin sensitive galactose resistant survivors were selected to identify clones that had the KG gene deleted. Removal of KG and confirmation of the desired gene replacement for the recombinant strain was performed by PCR. These recombinant strains were fermented in a flask with 50 mL of CTS medium and 2% XAD-16 for 5 days, and the epothilone analog was eluted from XAD with 10 mL of methanol. Structure determination was based on LC / MS spectra and NMR. One such strain, termed K122-56, was deposited with the American Type Culture Collection, Manassa, VA 20110-2209, USA on November 21, 2000, under the terms of the Budapest Treaty, which was Available under accession number PTA-2714. This strain K122-56 (derived from plasmid pKOS122-29) produces 13-keto-11,12-dehydro-epothilone D as the main product, the structure of which is shown below:
[0412]
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.
[0413]
K122-56 strain also produces 13-keto-epothilone C and D as trace products. The structure of each of these is shown below:
[0414]
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Similar results were obtained from strain K122-30 derived from plasmid pKOS122-30. These compounds and the strains and PKS enzymes that produce them are novel compounds, strains and PKS enzymes of the present invention.
[0415]
Other strains of the invention that produce 13-keto-11,12-dehydroepothilone include strains in which the KR domain has been rendered inactive by one or more point mutations. For example, mutating a constitutive tyrosine residue in the KR domain to phenylalanine results in an approximately 10% decrease in KR activity and results in the production of some 13-keto-epothilone. Additional mutations in the KR domain may remove more or all KR activity, but may also result in reduced epothilone production.
[0416]
(B. Production of 13-hydroxy-epothilone analog)
Replacement of the KR, DH, and ER domains of the extender module 5 of epothilone PKS with a heterologous KR domain (eg, a KR domain from the extension module 2 of rapamycin PKS or a KR domain from the extension module 3 of FK520 PKS). Provides hybrid PKSs of the invention useful in the production of 13-hydroxyepothilone. This construction is performed in a manner similar to that described in Part A of this example. Oligonucleotide primers for amplifying the desired portion of the epoD gene using plasmid pKOS39-118B as a template were as follows:
[0417]
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The PCR fragment generated from primers TL7 / TL8 was cloned into vector LITMUS 28, the resulting clone was digested with restriction enzymes NsiI and BglII, a 5.1 kb fragment was isolated and treated with restriction enzymes BglII and XbaI. Was ligated to the 2.2 kb PCR fragment generated from TL9 / TL10 and ligated to the KR cassette. The KR cassette from FK520 PKS was generated by PCR using primers TL31 and TL32, and then digested with restriction enzymes XbaI and PstI. These primers are shown below:
[0418]
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The remaining strain construction proceeded as described in Part A of this example, except that Myxococcus xanthus Kll-72.4.4 was used as the recipient. A strain in which the KR domain of the extension module 3 of FK520 PKS was replaced with the KR domain, DH domain and ER domain of the extension module 5 of epothilone PKS was named K122-148, and was named American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110- 2209, deposited with the USA on 21 November 2000 under the terms of the Budapest Treaty. This strain is available under accession number PTA-2711. Strain K122-148 produces 13-hydroxy-10,11-dehydroepothilone D as the major product and the C derivative as a minor product. These structures are shown below:
[0419]
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A similar strain, designated K122-52, in which the KR domain of the extension module 2 of rapamycin PKS was used for substitution, produced the same compound. These compounds and the strains and PKS enzymes that produce them are novel compounds, strains and PKS enzymes of the present invention.
[0420]
(C. Production of 9-keto-epothilone analog)
Inactivation of the KR domain of elongation module 6 of epothilone PKS results in a novel PKS of the present invention that can produce 9-keto-epothilone. The KR domain can be inactivated by site-directed mutagenesis by changing one or more conserved residues. The DNA and amino acid sequences of the KR domain of elongation module 6 of epothilone PKS are shown below:
[0421]
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The mutated and inactive KR domain DNA and amino acid sequences of the novel 9-keto-epothilone PKS extension module 6 provided by the present invention are shown below:
[0422]
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Strains containing this mutated KR domain coding sequence were generally constructed as described in Part A of this example, except that Myxococcus xanthus K111-72.4.4 was used as the recipient. The strain in which the KR domain of extension module 6 has been inactivated is designated K39-164 and deposited with the American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209, USA on November 21, 2000 under the terms of the Budapest Treaty. did. This strain is available under accession number PTA-2716. Strain K39-164 produces 9-keto-epothilone D as the major product and C derivative as a minor product. These structures are shown below:
[0423]
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These compounds and the strains and PKS enzymes that produce them are novel compounds, strains and PKS enzymes of the present invention.
[0424]
(D. Production of 2-methyl-epothilone analog)
The 2-methyl-epothilone analogs of epothilone A, epothilone B, epothilone C and epothilone D encode the coding sequence for the AT domain of extension module 9 ("epoAT9") and the code for the AT domain specific for methylmalonyl-CoA. Can be constructed by substitution with a sequence. Accordingly, suitable replacement AT domain coding sequences include, for example, the gene encoding extension module 2 of FK520 PKS ("FKAT2"; see PCT Publication No. 00/020601, incorporated herein by reference); Gene encoding the elongation module 2 of epothilone PKS ("epoAT2"); and the gene encoding the extension module 3 of PKS encoded by the tmbA gene ("tmbAT3"; U.S. Patent Nos. 6,090,601 and 2001 No. 60 / 271,245, filed on Mar. 15, each of which is incorporated herein by reference. Substitutions are generally made as described above, and the particular epothilone produced depends only on which epothilone is produced by the Myxococcus host in which the substitution is made.
[0425]
Thus, the epoAT9 coding sequence (nucleotide 50979 to nucleotide 52026) is an epoAT2 coding sequence (nucleotide 12251 to nucleotide 13287) or FKAT2 coding with an engineered BglII (AGATCT) and NsiI (ATGCAT) restriction enzyme recognition sequence at the junction. Replaced by either the sequence or the tmbAT3 coding sequence.
[0426]
The first PCR is used to generate an approximately 1.6 kb fragment from the pKOS39-125 DNA used as a template. This PCR fragment is subcloned into the vector LITMUS28 at the HindIII and BglII sites and sequenced; the plasmid with the desired sequence is named P1. The oligonucleotides used in this PCR are as follows:
[0427]
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A second PCR is used to generate an approximately 1.9 kb fragment using pKOS39-125 DNA as a template. This PCR fragment is subcloned into the vector LITMUS28 at the NsiI and SpeI sites and sequenced; the plasmid with the desired sequence is named P2. The oligonucleotides used in this PCR are as follows:
[0428]
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Plasmid P1 was then digested with restriction enzymes BglII and SpeI, and a 4.5 kb fragment was isolated and isolated as an approximately 1.9 kb NsiI-SpeI and NsiI-BglII restriction fragment from plasmid P2. Ligation with one of the three substituted AT fragments (FKAT2, epoAT2, tmbAT3) resulted in plasmids P3.1, P3.2 and P3.3. The substituted AT fragment is generated by PCR using the following oligonucleotide primers:
[0429]
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Plasmids P3.1, P3.2 and P3.3 are then modified by insertion at the DraI site of the kan-gal cassette. The resulting plasmid is transformed into an epothilone-producing Myxococcus xanthus host cell of the invention (ie, K111-72.4.4), and the cells are cultured and selected for double crossover recombination events as described above. I do. The selected colonies are screened by PCR. Colonies that exhibit the desired recombination event are cultured in a 50 mL culture and screened by LC / MS for production of the desired compound. The expected products are 2-methyl-epothilone D and 2-methyl-epothilone C. These structures are shown below.
[0430]
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(E. Production of 6-desmethyl-epothilone analog)
The 6-desmethyl-epothilone analogs of epothilone A, epothilone B, epothilone C and epothilone D consist of the coding sequence for the AT domain of elongation module 7 ("epoAT7") and the coding sequence for the malonyl-CoA specific AT domain. Can be constructed by substituting Thus, suitable replacement AT domain coding sequences include, for example, the gene encoding the extension module 3 of FK520 PKS; the gene encoding the extension module 5 of epothilone PKS ("epoAT5"); and the extension of PKS encoded by the tmbA gene. It can be obtained from the gene encoding Module 4, each of which is incorporated herein by reference. Substitutions are generally made as described above, and the particular epothilone produced depends only on which epothilone is produced by the Myxococcus host in which the substitution is made.
[0431]
Thus, the epoAT7 coding sequence (nucleotide 39585-nucleotide 40626) may have an epoAT5 coding sequence (nucleotide 26793-nucleotide 27833) or FKAT3 coding with an engineered BglII (AGATCT) and NsiI (ATGCAT) restriction enzyme recognition sequence at the junction. Replaced by either the sequence or the tmbAT4 coding sequence.
[0432]
The first PCR is used to generate an approximately 1.8 kb fragment from the pKOS39-125 DNA used as a template. This PCR fragment is subcloned into the vector LITMUS28 at the NsiI and SpeI sites and sequenced; the plasmid with the desired sequence is named P4. The oligonucleotides used in this PCR are as follows:
[0433]
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A second PCR is used to generate an approximately 2.1 kb fragment using pKOS039-118B DNA as a template. The oligonucleotides used in this PCR are as follows:
[0434]
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This PCR fragment was subcloned into LITMUS28 at the EcoRV restriction site, and the plasmid with the desired sequence was identified by sequencing and named plasmid pKOS122-4. Plasmid pKOS122-4 was then digested with the restriction enzymes BglII and SpeI, and the 4.8 kb fragment was isolated and isolated as the approximately 1.8 kb NsiI-Spel and NsiI-BglII restriction fragments from plasmid P4. Ligation with one of the three substituted AT fragments (FKAT3, epoAT5, tmbAT4) yields plasmids P5.1, P5.2 and P5.3. The substituted AT fragment is generated by PCR using the following oligonucleotide primers:
[0435]
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The plasmids P5.1, P5.2 and P5.3 are then modified by insertion at the DraI site of the kan-gal cassette. The resulting plasmid is transformed into an epothilone-producing Myxococcus xanthus host cell of the invention (ie, K111-72.4.4), and the cells are cultured and selected for double crossover recombination events as described above. I do. The selected colonies are screened by PCR. Colonies that exhibit the desired recombination event are cultured in a 50 mL culture and screened by LC / MS for production of the desired compound. The expected compounds are 6-desmethyl-epothilone D and 6-desmethyl-epothilone C. These structures are shown below.
[0436]
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(F. Production of 10-methyl-epothilone analog)
The 10-methyl-epothilone analogs of epothilone A, epothilone B, epothilone C and epothilone D encode the coding sequence for the AT domain of elongation module 5 ("epoAT5") and the code for the AT domain specific for methylmalonyl-CoA. Can be constructed by substitution with a sequence. Accordingly, suitable replacement AT domain coding sequences include, for example, the gene encoding the extension module 2 of FK520 PKS (hereby incorporated by reference); the gene encoding the extension module 2 of epothilone PKS ("epoAT2"). ); And from the gene encoding the extension module 3 of PKS encoded by the tmbA gene. Substitutions are generally made as described above, and the particular epothilone produced depends only on which epothilone is produced by the Myxococcus host in which the substitution is made.
[0437]
Thus, the epoAT5 coding sequence (nucleotide 26793 to nucleotide 27833) has an epoAT2 coding sequence (nucleotide 12251 to nucleotide 13287) or FKAT2 coding with an engineered BglII (AGATCT) and NsiI (ATGCAT) restriction enzyme recognition sequence at the junction. Replaced by either the sequence or the tmbAT3 coding sequence.
[0438]
The PCR fragment generated from the primers TL11 and TL12 using the plasmid pKOS39-118B as a template is cloned into the vector LITMUS28. The PCR primers used are as follows:
[0439]
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Plasmids containing the desired insert are identified by DNA sequencing. The plasmid is then digested with the restriction enzymes NsiI and XbaI and the 4.6 kb fragment is isolated. This fragment was obtained from primers TL5 and TL6 (described in Part A of this example) and isolated as a 2.0 kb PCR fragment digested with restriction enzymes BglII and XbaI and an NsiI-BglII restriction fragment. Ligation with one of the three substituted AT fragments (FKAT2, epoAT2, tmbAT3) yields plasmids P6.1, P6.2 and P6.3. These latter three plasmids are then modified by insertion of the kan-gal cassette at the DraI site. The resulting plasmid is transformed into an epothilone-producing Myxococcus xanthus host cell of the invention (ie, K111-72.4.4), and the cells are cultured and selected for double crossover recombination events as described above. I do. The selected colonies are screened by PCR. Colonies that exhibit the desired recombination event are cultured in a 50 mL culture and screened by LC / MS for production of the desired compound. Expected compounds are 10-methyl-epothilone D and 10-methyl-epothilone C. These structures are shown below:
[0440]
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(G. Production of 14-methyl-epothilone analog)
The 14-methyl-epothilone analogs of epothilone A, epothilone B, epothilone C and epothilone D encode the coding sequence for the AT domain of extension module 3 ("epoAT3") and the code for the AT domain specific for methylmalonyl-CoA. Can be constructed by substitution with a sequence. Thus, suitable substituted AT domain coding sequences include, for example, the gene encoding the extension module 2 of FK520 PKS; the gene encoding the extension module 2 of epothilone PKS ("epoAT2"); and the extension of PKS encoded by the tmbA gene. It can be obtained from the gene encoding module 3. Substitutions are generally made as described above, and the particular epothilone produced depends only on which epothilone is produced by the Myxococcus host in which the substitution is made.
[0441]
Thus, the epoAT3 coding sequence (nucleotide 17817 to nucleotide 18858) has an epoAT2 coding sequence (nucleotide 12251 to nucleotide 13287) or FKAT2 coding with an engineered BglII (AGATCT) and NsiI (ATGCAT) restriction enzyme recognition sequence at the junction. Replaced by either the sequence or the tmbAT3 coding sequence.
[0442]
The first PCR is used to generate an approximately 1.8 kb fragment from the pKOS39-124 DNA used as a template. This PCR fragment is subcloned into the vector LITMUS28 at the XbaI and BglII sites and sequenced; the plasmid with the desired sequence is named P9. The oligonucleotides used in this PCR are as follows:
[0443]
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A second PCR is used to generate an approximately 1.9 kb fragment using pKOS39-124 DNA used as a template. This PCR fragment was subcloned into the vector LITMUS28 at the NsiI and SpeI sites and sequenced; the plasmid with the desired sequence was named P10. The oligonucleotides used in this PCR are as follows:
[0444]
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Plasmid P9 was then digested with restriction enzymes BglII and SpeI, and a 4.5 kb fragment was isolated and isolated as an approximately 1.9 kb NsiI-SpeI and NsiI-BglII restriction fragment from plasmid P10. Ligation with one of the three substituted AT fragments (FKAT2, epoAT2, tmbAT3) gives plasmids P11.1, P11.2 and P11.3. These latter three plasmids are then modified by insertion of the kan-gal cassette at the DraI site. The resulting plasmid is transformed into an epothilone-producing Myxococcus xanthus host cell of the invention (i.e., K111-72.4.4) and the cells are cultured and selected for double crossover recombination events as described above. I do. The selected colonies are screened by PCR. Colonies showing the desired recombination event are grown in a 50 mL culture and screened by LC / MS for production of the desired compound. Expected compounds are 14-methyl-epothilone D and 14-methyl-epothilone C. These structures are shown below.
[0445]
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(H. Production of 10,11-dehydro-epothilone analog)
In one embodiment, the invention provides a novel epothilone (10,11-dehydroepothilone D) and a recombinant host cell that produces the compound. The structure of 10,11-dehydroepothilone D is shown below.
[0446]
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.
[0447]
In another embodiment, the invention provides a method of making any 10,11-dehydroepothilone analog by inactivating the ER domain of the elongation module 5 of the corresponding epothilone-producing epothilone PKS.
[0448]
In one embodiment, a strain producing 10,11-dehydroepothilone D is constructed by inactivating the enoyl reductase (ER) domain of extension module 5. In one embodiment, this ER inactivation is achieved by changing the two glycines (-Gly-Gly-) in the NADPH binding region to alanine and serine (-Ala-Ser-). This 2.5 kb BbvCI-HindIII fragment from plasmid pKOS39-118B (a subclone of the epoD gene from cosmid pKOS35-70.4) was cloned into pLitmus28 as pTL7, which was used for site-directed mutagenesis. Use as a template for Oligonucleotide primers for introducing -Gly-Gly- to the -Ala-Ser- mutation in the NADPH binding domain are as follows:
[0449]
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.
[0450]
The PCR clone containing the substitution is confirmed by sequencing and digested with the restriction enzyme DraI and treated with shrimp alkaline phosphatase. The large fragment of each clone is then ligated using a kanamycin resistance gene and a galK gene (KG, kan-gal) cassette to provide a delivery plasmid. The delivery plasmid was Epothilone D producing strain M. Xanthus K111-72-4.4 or K111-40-1 is transformed by electroporation. The transformants are screened and kanamycin-sensitive, galactose-resistant survivors are selected to identify clones in which the KG gene has been eliminated. Confirmation of KG exclusion and replacement of the desired gene for the recombinant strain is performed by PCR. This recombinant strain was combined with 50 mL of CTS medium (casitone, 5 g / L; MgSO ₄ L-alanine, 1 mg / L; L-serine, 1 mg / L; glycine, 1 mg / L; and HEPES buffer, 50 mM) and fermentation in a flask with 2% XAD-16 for 7 days. And 10,11-dehydroepothilone D is eluted from the XAD resin using 10 mL of methanol.
[0451]
(I. Production of oxazole-containing epothilone by fermentation)
In one embodiment, the present invention relates to an oxazole-containing epothilone (in which the corresponding thiazole moiety of epothilone is replaced with oxazole), the epothilone-producing strain provided by the present invention (eg, a Sorangium cellulosum or Myxococcus strain). ) Is obtained by fermentation in a medium supplemented with L-serine.
[0452]
To exemplify this aspect of the invention, a culture of Myxococcus xanthus strain K111-40.1 or K111-72.4.4 was prepared by adding L-serine to a basal serine concentration of 11 ×, Fermentation is carried out according to the method of Example 3, except that it is present at 51 ×, 101 × and 201 ×. Thus, this 50 mL culture containing the batch medium contains 20 g / L of XAD-16; 5 g / L of cacitone; 2 g / L of MgSO4. ₄ A 1.25 M solution of filter-sterilized L-serine at the appropriate concentration, containing 7 mM / L methyl oleate; and 4 mM / L trace metal solution, is added. The batch titers observed in the basal medium are: Epo C: 0.4 mg / L, Epo D: 2 mg / L, EpoH1 (C analog of oxazole): not detected, and Epo H2 (D analog of oxazole): It was 0.02 mg / L. Increasing serine concentrations decreased epoC and epoD concentrations (almost undetectable levels with 51 × supplementation). Therefore, the batch titers of 51X supplemented L-serine in basal medium are: Epo C: 0.03 mg / L, Epo D: 0.05 mg / L, Epo H: 0.12 mg / L; and Epo H2: 0 .13 mg / L. The fed-batch culture protocol could increase the observed titer almost 10-fold.
[0453]
(Construction of J. Epothilone analog)
In one embodiment, the present invention provides epothilones and epothilone derivatives produced by the recombinant epothilone PKS enzymes of the present invention, wherein the epothilone derivatives are characterized in that (i) the specificity of the extension module 1 NRPS is different from cysteine. (Ii) the loading domain is changed to NRPS or CoA ligase; or (iii) both (i) and (ii). This example describes how such a recombinant epothilone PKS enzyme of the present invention is constructed; the references cited in this example are listed at the end of this example, and It is referred to by reference numbers in the text and is incorporated herein by reference.
[0454]
Epothilone contains the amino acid cysteine, which is cyclized and oxidized to form a thiazole. Two other amino acids (serine and threonine) can undergo similar cyclization and oxidation to produce oxazole and methyl oxazole, respectively. For example, oxazole derivatives and methyl oxazole derivatives of epothilone D are shown below.
[0455]
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To construct an analog of epothilone with either oxazole or methyl oxazole, the operation of the extension module 1 (NRPS module) can be performed. The NRPS module that extends the growth module consists, at a minimum, of a domain that activates an amino acid, an adenylation domain, a PCP or a peptidyl carrier protein domain, which links the amino acid to the NRPS and the compression domain, where the compression domain Is compressed into the carboxyl group of the growth module to form a peptide bond (5, 7). A recognition sequence to determine the specificity of this amino acid is found between the adenylation domain, particularly between the A4 and A5 consensus sequences (4). Analysis of this region indicated that key amino acids in this protein region could predict which amino acids would be used by NRPS (2,8). Experiments are performed to replace the complete NRPS adenylation region with another adenylation region to obtain hybrid NRPSs with the amino acid specificity of the novel adenylation domain (6, 9). Experiments using smaller regions of the adenylation region (eg, the region between the A4 and A5 consensus sequences) have not been reported. In one embodiment, the hybrid PKSs of the invention have domains from vibF and blmVII, which utilize threonine, and the NRPS-4 region from blmVI of the bleomycin gene cluster, which utilizes serine. ) Is constructed by replacing the region between the A4 and A5 consensus regions of the adenylation domain from epoB with (3).
[0456]
Recent experiments suggest that the compression domain can detect whether incorrect amino acids are attached to PCP (1). Once an incorrect amino acid is detected, the efficiency of the compression reaction decreases. To circumvent this, in addition to exchanging the adenylation domain, the cognate compression domain can also be used to alter the specificity of the adenylation domain and to manipulate the fully active NRPS.
[0457]
The present invention also provides a recombinant epothilone PKS enzyme that produces 16 desmethyl derivatives of the oxazole and methyl oxazole forms of epothilone. Such enzymes are constructed by changing the AT domain of extension module 2, epoC, from methylmalonyl specificity to malonyl specificity. AT domains that can be used to make this construct include the elongation modules 5 and 9 of the epothilone cluster, and the domains from extension modules 2 and 4 from the soraphen gene cluster.
[0458]
The present invention also provides a recombinant PKS enzyme in which the EpoA protein has been replaced by NRPS. The present invention also provides novel epothilones produced by such enzymes. Epothilone biosynthesis is initiated by loading malonate onto the ACP of the loading module (EpoA). This malonate is substantially decarboxylated by the KS domain and then imported as an acetyl moiety to EpoB (NRPS module). After this molecule has been affected by EpoB, the resulting compound is 2-methylthiazole.
[0459]
To make an analog with the amino acid attached at position 2 on the thiazole, deletion of epoA and insertion of the NRPS module is required. Any NRPS module can be used; however, an NRPS module that replaces epoA, which naturally communicates with the downstream NRPS module, can be used to create nearly conservative changes. In addition, a compression domain is not required since the NRPS replacing epoA is a loading module. This can be done by taking an extended NRPS module and removing the compression domain or using an NRPS that is a natural loading module and thus lacks the compression domain. An exemplary NRPS loading module is the loading module from safB, which uses alanine and xanthus.
[0460]
M. e. containing a safB loading module at epoA. In constructing the xanthus strain, one can determine the optimal boundaries for new loading modules and epoB. The linker region between PKS proteins is often important for "communication" between the PKS proteins. Three different strains can be constructed to test for the optimal linker. First, the ACP domain of EpoA is fused to the adenylation domain of the loading domain of safB. This construct requires that the ACP of EpoA function as a PCP. Although PCP and ACP domains are functionally similar, they do not show high sequence identity and can therefore be restricted to what they can recognize and bind. These second constructs fuse the last few amino acids downstream of EpoA in the PCP domain of the SafB loading module, thus providing the need for a linker region for a hybrid loading module that "communicates" with EpoB. Finally, a fusion of the SafB loading module with EpoB is constructed. Since SafB is composed of two modules, it is possible to take the entire SafB loading module and fuse directly with EpoB to obtain a fusion protein, which is the communication between the SafB loading module and EpoB. Should be optimal for
[0461]
Once SafB or another optional loading NRPS domain is used and the 2-methyl on the thiazole of epothilone is replaced with an amino acid, then a change can occur in the novel loading NRPS module, whereby any amino acid molecule is It could be used to initiate the synthesis of the epothilone analog. A comprehensive list of potential amino acids and their corresponding NRPS modules that can be used for these exchanges is provided by Challis et al. (2).
[0462]
All substitutions are K111-32.25 (M. xanthus strain containing the epothilone gene) or K111-40-1 (M. xanthus strain containing the epothilone gene, where the epoK gene does not produce a functional product), or It can be performed in any other epothilone-producing strain of the invention or Sorangium cellulosum. In Myxococcus, a suitable construct can be made on a plasmid using galK and kanamycin selection and used to replace the wild-type gene with the engineered gene. For example, replacing the NRPS in K111-40-1 with an NRPS that is specific for serine would reduce the 2-methyl-oxazole derivative of epothilone D and the 2-methyl-oxazole derivative of epothilone C to the major and minor products, respectively. It is expected to produce as a product of. The structures of these compounds are shown below:
[0463]
Embedded image

.
[0464]
Replacing the NRPS in K111-40-1 with an NRPS that is specific for threonine is expected for the following compounds and their major and minor products:
[0465]
Embedded image

.
[0466]
Replacing the NRPS in K111-40-1 with an NRPS that is specific for glycine, alanine, glutamic acid, aspartic acid, phenylalanine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, glutamine, arginine, valine, and tyrosine, It is expected to make the following compounds as each major and minor product, respectively:
[0467]
Embedded image

Where R ′ corresponds to a specific side chain in an amino acid (eg, R ′ is the general amino acid formula for glycine NH ₂ H for -CHR'COOH and methyl for alanine, etc.).
[0468]
Replacing the NRPS in K111-40-1 with an NRPS that is specific for proline is expected to produce the following compounds as the respective major and minor products:
[0469]
Embedded image

.
[0470]
The references cited in this section are as follows:
[0471]
Embedded image

.
[0472]
(Example 12)
(Biological assay)
10,11-Dehydroepothilone D was screened for anti-cancer activity using a sulforhodamine B (SRB) assay in four different human tumor cell lines. 10,11-dehydroepothilone D has an IC ₅₀ (In the range of 28 nM to 40 nM) show growth inhibitory effects on all four. The function of action was determined by a cell-based tubulin polymerization assay that revealed that the compound promoted tubulin polymerization. The human cancer cell lines MCF-7 (breast), NCI / ADR-Res (breast, MDR), SF-268 (glioma), NCI-H460 (lung) were obtained from the National Cancer Institute. The cells are reduced to 5% CO ₂ -Maintained in RPMI 1640 medium (Life Technology) supplemented with 10% fetal calf serum (Hyclone) and 2 mM L-glutamine at 37 ° C in a humidified atmosphere.
[0473]
The cytotoxicity of 10,11-dehydroepothilone D was determined by the SRB assay (Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990)), which is hereby incorporated by reference. Were determined. Cultures were trypsinized, counted and diluted in growth medium to the following concentrations per 100 μl: MCF-7,5000; NCI / ADR-Res, 7500; NCI-H460,5000; and SF-268,7500. The cells were seeded at 100 μl / well in a 96-well microtiter plate. Twenty hours later, 100 μl of 10,11-dehydroepothilone D (dilution ranging from 1000 nM to 0.001 nM in growth medium) was added to each well. After incubation with the compound for 3 days, the cells were fixed with 100 μl of 10% trichloric acid (“TCA”) for 1 hour at 4 ° C., and 0.2% SRB / 1% acetic acid at room temperature. Stained for 20 minutes. Unbound dye was removed by rinsing with 1% acetic acid, and then bound SRB was extracted with 200 μl of 10 mM Tris base. The amount of dye bound was determined by OD 515 nm, which is related to the total cellular protein component. This data is then transferred to the Kaleida Graph program and IC ₅₀ Analyzed using calculations. Chemically synthesized epothilone D was tested in parallel as a comparison.
[0474]
In tubulin polymerization assays, MCF-7 cells are grown to confluence in 35 mm culture dishes and incubated with either 1 μM 10,11-dehydroepothilone D or 1 μM epothilone D for 0, 1 or 2 hours. Treated at 37 ° C. (Giannakakuu et al., J. Biol. Chem, 271: 17118-17125 (1997); Int. J. Cancer 75: 57-63 (1998)), which are incorporated herein by reference. After washing the cells twice with 2 ml of PBS without calcium or magnesium, the cells were washed with 300 μl of lysis buffer (20 mM Tris, PH 6.8, 1 mM MgCl 2). ₂ , 2 mM EGTA, 1% Triton X-100 and protease inhibitor) at room temperature for 5-10 minutes. The cells were scooped and the lysate was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube. The lysate was then centrifuged at 18000 g for 12 minutes at room temperature. Supernatants containing soluble or non-polymerized (cytosolic) tubulin were separated from pellets containing insoluble or polymerized (cytoskeletal) tubulin and transferred to new tubes. The pellet was then resuspended in 300 μl lysis buffer. Changes in tubulin polymerization in the cells were determined by analyzing an equal amount of an aliquot of each sample using SDS-PAGE, followed by immunoblotting using an anti-tubulin antibody (Sigma).
[0475]
The results of several experiments indicate that 10,11-dehydroepothilone D (abbreviated as "Epo490") has an IC against four different human tumor cell lines in the range of 28 nM to 40 nM. ₅₀ Has been shown.
[0476]
[Table 13]

Tubulin polymerization assay reveals that 10,11-dehydroepothilone D has the same mechanism of action as epothilone D. In MCF-7 cells, 10,11-dehydroepothilone D strongly promotes tubulin polymerization under the conditions tested and has similar kinetics and efficiency as epothilone D. Other compounds of the invention can be tested in a similar manner by substituting the compound of interest for 10,11-dehydroepothilone D.
[0477]
(Example 13)
(Oxazole derivative)
This example describes using fermentation conditions to regulate the type of epothilone compound produced by a host cell. With the host cells supplemented with excess serine, the compounds normally produced by the host cells are modulated in such a way as to favor the production of the oxazole counterpart. For example, cells that preferentially produce the compound of Formula V are made to direct the production of an oxazole counterpart corresponding to the compound of Formula VI.
[0478]
In one embodiment, M.P. xanthus strain K111-40-1 (strain producing epothilone C and epothilone D preferentially) was significantly changed to epothilone H ₁ And epothilone H ₂ , Epothilone C and Epothilone D are made to increase production of their oxazole counterparts. Strain K111-40-1 (PTA-2712) was purchased from American Type Culture Collection ("ATCC"), 10801 University Blvd. , Manassas, VA, 20112209 USA, deposited on November 21, 2000. Strain K111-40-1 was grown in media either supplemented with or without additional serine. The final concentration of this compound in unsupplemented medium is: hydrolyzed casein (pancreatic digestion, purchased from Difco under the Casiton brand name), 5 g / L; MgSO ₄ ・ 7H ₂ O, 2 g / L; XAD-16, 20 g / L; trace factor solution 4 ml / L; methyl oleate, 7 ml / L; and Hepes buffer, 40 mM (titrated with KOH to pH 7.6). Trace factor solution: concentrated H ₂ SO ₄ , 10mL / L, FeCl ₃ ・ 6H ₂ O, 14.6 g / L; ZnCl ₂ , 2.0 g / L; MnCl ₂ ・ 4H ₂ O, 1.0 g / L; CuCl ₂ ・ 2H ₂ O, 0.42 g / L; H ₃ BO ₃ , 0.31 g / L; CaCl ₂ / 6H ₂ O, 0.24 g / L; and Na ₂ MoO ₄ ・ 2H ₂ O, containing 0.24 g / L. The basal level of serine was taken as 4.82% (w / w) and this value was determined by Difco amino acid analysis of a particular lot of Castonet. Therefore, the basal serine concentration was 2.3 mM and the value was calculated from the final concentration of Castone in the medium of 5 g / L. The serine supplemented medium contained a 50-fold higher serine concentration (117 mM).
[0479]
The cells were grown in flasks at 30 ° C. for 120 hours on a 250 rpm coffin shaker. Compounds produced by the strain during the fermentation were extracted by capturing the resin, washing the resin once in water, and extracting the compound in the resin into 20 mL of methanol for 30 minutes. Samples were analyzed by HPLC and mass spectrometry.
[0480]
Analysis of the compounds produced by the cells showed that a 50-fold increase in serine levels was greater than that produced by cells grown in media without serine supplementation, compared to epothilone H. ₁ -Fold increase (0.12 mg / L) in the production of epothilone H ₂ Resulted in a 5-fold increase in the production of (0.12 mg / L). In particular, the cells produced little detectable amounts of epothilones C and D (less than 50 μg / L).
[0481]
Simultaneous increase of oxazole-containing compounds and decrease of thiazole-containing compounds from serine supply usually provide a way to obtain oxazole compounds from host cells that form thiazole-containing counterparts. For example, a recombinant construct to form 9-oxoepothilone D (as described in Example 11, subsection C) is a 17-des (2-methyl-4-thiazolyl) -17- (2-methyl -4-Oxazolyl-4-oxazolyl) -9-oxo-epothilone D, which can be grown under conditions similar to those described above to form the oxazole counterpart to 9-oxo-epothilone D. Similarly, other recombinant constructs of the invention, including the recombinant constructs described in Example 11, can be grown with an excess of serine to provide the corresponding oxazole compound.
[0482]
(Example 14)
(Microbial conversion of C-21 methyl to C-21 hydroxymethyl)
This example describes the microbial conversion of a compound of formula I from C-21 methyl to C-21 hydroxymethyl, where Ar is:
[0483]
Embedded image

It is. Amycolata autotrophica ATCC 35203 or Actinomyces sp. As described in PCT Publication WO 00/39276. Using a frozen vial (approximately 2 ml) of strain PTA-XXX, inoculate a 1500 ml flask containing 100 mL of medium. The nutrient medium consists of 10 g dextrose, 10 g malt extract, 10 g yeast extract, and 1 g peptone in 1 liter of deionized water. The vegetative culture is incubated for 3 days at 28 ° C. on a rotary shaker operating at 250 rpm. Add 1 mL of the resulting culture to each of 62 500 mL flasks containing the conversion medium of the same composition as the nutrient medium. The culture is incubated at 28 ° C. and 250 rpm for 24 hours. Dissolve the appropriate compound of the invention in 155 ml of ethanol and dispense this solution into 62 flasks. The flasks are then returned to the shaker and incubated for a further 43 hours at 28 ° C. and 250 rpm. The reaction culture is then treated to recover the 21-hydroxy counterpart of the starting compound.
[0484]
(Example 15)
(Epoxidation using EpoK)
This example describes the enzymatic epoxidation of a compound of formula I, where R ⁸ And R ¹⁰ Together form a carbon-carbon double bond (desoxy compound of the present invention). This epoK gene product was transformed into E. coli as a fusion protein containing a polyhistidine tag (his tag), as described in PCT Publication WO 00/31247, incorporated herein by reference. E. coli and purified. This reaction system contains 50 mM Tris (pH 7.5), 21 μM spinach ferredoxin, 0.132 units of spinach ferredoxin: NADP in a 100 μM volume. ⁺ Oxidoreductase, 0.8 units of glucose-6-phosphate dehydrogenase, 1.4 mM NADP, and 7.1 mM glucose-6-phosphate, 100 μM or 200 μM of the desoxy compound of the present invention, and a 1.7 μM amino-terminal histidine tag. Consists of conjugated EpoK or 1.6 μM carboxy-terminal histidine-tagged EpoK. The reaction is incubated at 30 ° C. for 67 minutes and stopped by heating at 90 ° C. for 2 minutes. The insoluble material is removed by centrifugation and 50 μL of the supernatant containing the desired product is analyzed by LC / MS.
[0485]
(Example 16)
(Chemical epoxidation)
This example describes the chemical epoxidation of a compound of formula I, where R ⁸ And R ¹⁰ Together form a carbon-carbon double bond (desoxy compound of the present invention). A solution of dimethyldioxirane (0.1 M in acetone, 17 mL) was added at -78 ° C in CH ₂ Cl ₂ Add dropwise to a solution of the desoxy compound of the invention (505 mg) in 10 mL. The mixture is warmed to −50 ° C. and maintained for 1 hour, then another portion of the dimethyldioxirane solution (5 mL) is added and the reaction is continued at −50 ° C. for another 1.5 hours. Then, the reaction system was ₂ Dry at -50 ° C under flowing. This product is converted to SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0486]
(Example 17)
((3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -15-amino-3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,13-epoxy-4,4,6,8,12 , 16-Hexamethyl-17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid)
[0487]
Embedded image

Step 1. 9-oxoepothilone B. A solution of dimethyldioxirane (0.1 M in acetone, 17 mL) was added at −78 ° C. to 10 mL of CH. ₂ C1 ₂ Add dropwise to a solution of 9-oxoepothilone D (505 mg) therein. The mixture is warmed to −50 ° C. and maintained for 1 hour, then another portion of the dimethyldioxirane solution (5 mL) is added and the reaction is continued at −50 ° C. for another 1.5 hours. Then, the reaction system was ₂ Dry at -50 ° C under flowing. This product is converted to SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0488]
Step 2. (3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -15-azido-3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,13-epoxy-4,4,6,8,12, 16-Hexamethyl-17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid.
[0489]
Under an argon atmosphere, a solution of 9-oxoepothilone B (2.62 g) and sodium azide (0.49 g) in 55 mL of degassed tetrahydrofuran / water (10: 1 v / v) was treated with tetrakis (triphenylphosphine) palladium ( 0.58 g). The mixture is maintained at 45 ° C. for 1 hour, then diluted with 50 mL of water and extracted with ethyl acetate. The extract is washed with brine, Na ₂ SO ₄ , Filter, and evaporate. This product is converted to SiO ₂ Purify by flash chromatography above.
[0490]
Step 3. (3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -15-amino-3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,13-epoxy-4,4,6,8,12, 16-Hexamethyl-17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid. (3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -15-azido-3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,15 mL of THF / water (10: 1 v / v). A solution of 13-epoxy-4,4,6,8,12,16-hexamethyl-17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid (565 mg) was added under argon at ambient temperature under argon. Treat with a 1.0 M solution of trimethylphosphine in toluene (3 mL) for hours. The mixture is concentrated, and the product is treated with SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0490]
(Example 18)
((4S, 7R, 8S, 9R, 13R, 14S, 16S) -13,14-epoxy-4,8-dihydroxy-2,6,10-trioxo-5,5,7,9,13-pentamethyl-16 -(1- (2-methylthiazol-4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene)
[0492]
Embedded image

(3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -15-amino-3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12 in acetonitrile / dimethylformamide (20: 1 v / v, 150 mL). , 13-Epoxy-4,4,6,8,12,16-hexamethyl-17- (2-methyldiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid (540 mg) was cooled to 0 ° C. Treat sequentially with hydroxybenzotriazole (0.135 g) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (0.5 g). The mixture is warmed to ambient temperature and maintained for 12 hours, then diluted with water and extracted with ethyl acetate. This extract is combined with water, saturated NaHCO ₃ , And brine, then Na ₂ SO ₄ , Filter, and evaporate. This product is converted to SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0493]
(Example 19)
((4S, 7R, 8S, 9R, 13Z, 16S) -4,8-dihydroxy-2,6,10-trioxo-5,5,7,9,13-pentamethyl-16- (1- (2-methylthiazole -4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene)
[0494]
Embedded image

At −78 ° C., a solution of tungsten hexachloride (0.76 g) in tetrahydrofuran (20 mL) is treated with a 1.6 M solution of n-butyllithium in hexane (2.5 mL). The mixture is allowed to warm to ambient temperature over 20 minutes. 13.8 mL of the resulting green solution is added at ambient temperature to (4S, 7R, 8S, 9R, 13R, 14S, 16S) -4,8-dihydroxy-13,14-epoxy-2,6 in 2 mL of tetrahydrofuran. Of 10,10-trioxo-5,5,7,9,13-pentamethyl-16- (1- (2-methylthiazol-4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene (360 mg) Add to the solution. After 30 minutes, the reaction was cooled to 0 ° C and saturated NaHCO ₃ (10 mL). The mixture is diluted with water and CH ₂ C1 ₂ Extract with This extract is ₂ SO ₄ , Filter, and evaporate. This product is converted to SiO ₂ Purify by flash chromatography above.
[0495]
(Example 20)
((4S, 7R, 8S, 9R, 13R, 14S, 16S) -13,14-epoxy-4,8-dihydroxy-2,6,10-trioxo-1,5,5,7,9,13-hexamethyl -16- (1- (2-Methylthiazol-4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene)
[0496]
Embedded image

Step 1. (3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,13-epoxy-4,4,6,8,12,16-hexamethyl- 15- (Methylamino) -17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid. (3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -15-amino-3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,13-epoxy-4,4,6 in 10 mL of methanol. Of a solution of, 8,12,16-hexamethyl-17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid (540 mg) in 37% aqueous formaldehyde (1 mL), acetic acid (25 uL), and cyanohydrogenation Treat with sodium borohydride (100 mg). Then, after 1 hour, the mixture is treated with 1N HCl and then diluted with ethyl acetate and water. The aqueous phase is extracted with ethyl acetate and the organic phases are combined and Na ₂ SO ₄ , Filter, and evaporate. This product is converted to SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0497]
Step 2. (4S, 7R, 8S, 9R, 13R, 14S, 16S) -13,14-epoxy-4,8-dihydroxy-2,6,10-trioxo-1,5,5,7,9,13-hexamethyl- 16- (1- (2-Methylthiazol-4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene. (3S, 6R, 7S, 8R, 12R, 13S, 15S, 16E) -3,7-dihydroxy-5,9-dioxo-12,13 in acetonitrile / dimethylformamide (20: 1 v / v, 150 mL). A solution of epoxy-4,4,6,8,12,16-hexamethyl-15- (methylamino) -17- (2-methylthiazol-4-yl) -16-heptadecenoic acid (554 mg) up to 0 ° C. Cool and treat sequentially with 1-hydroxybenzotriazole (0.135 g) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (0.5 g). The mixture is warmed to ambient temperature and maintained for 12 hours, then diluted with water and extracted with ethyl acetate. This extract is combined with water, saturated NaHCO ₃ , And brine, then Na ₂ SO ₄ , Filter, and evaporate. This product is converted to SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0498]
(Example 21)
((4S, 7R, 8S, 9R, 13Z, 16S) -4,8-dihydroxy-2,6,10-trioxo-1,5,5,7,9,13-hexamethyl-16- (1- (2 -Methylthiazol-4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene)
[0499]
Embedded image

A solution of tungsten hexachloride (0.76 g) in tetrahydrofuran (20 mL) at −78 ° C. is treated with a 1.6 M solution of n-butyllithium in hexane (2.5 mL). The mixture is warmed to ambient temperature over 20 minutes. A 13.8 mL portion of the resulting green solution was added at ambient temperature to (4S, 7R, 8S, 9R, 13R, 14S, 16S) -13,14-epoxy-4,8-dihydroxy-2, in 2 mL of tetrahydrofuran. 6,10-trioxo-1,5,5,7,9,13-hexamethyl-16- (1- (2-methylthiazol-4-yl) propen-2-yl) -1-aza-11-cyclohexadecene ( 370 mg). After 30 minutes, the reaction was cooled to 0 ° C and saturated NaHCO ₃ (10 mL). The mixture is diluted with water and CH ₂ Cl ₂ Extract with This extract is ₂ SO ₄ , Filter, and evaporate. This product is converted to SiO 2 ₂ Purify by flash chromatography above.
[0500]
(Example 22)
(Liposome composition)
This example describes a liposome composition containing 9-oxoepothilone. The mixture of lipid and 9-oxoepothilone D is dissolved in ethanol and the solution is dried as a thin film by spinning under reduced pressure. The resulting lipid film is hydrated by the addition of an aqueous phase and the particle size of the epothilone derivative-containing liposomes is adjusted to the desired range. Preferably, the average particle diameter is less than 10 microns, preferably from about 0.5 to about 4 microns. The particle size can be determined, for example, by using a mill (eg, an air jet mill, a ball mill, or a vibrator mill), microprecipitation, spray drying, freeze drying, high pressure homogenization, recrystallization from a supercritical medium. Or by extruding an aqueous suspension of liposomes through a series of membranes having a selected uniform pore size (eg, a polycarbonate membrane). In one embodiment, the liposome composition comprises: a compound of the invention (1.00 mg); phosphatidylcholine (16.25 mg); cholesterol (3.75 mg); polyethylene glycol-derivatized distearyl phosphatidylethanolamine (5.00 mg). Lactose (80.00 mg); citric acid (4.20 mg); tartaric acid (6.00 mg); NaOH (5.44 mg); water (up to 1 mL). In another embodiment, the liposome composition comprises: a compound of the invention (1.00 mg); phosphatidylcholine (19.80 mg); cholesterol (3.75 mg); distearyl phosphatidylcholine (1.45 mg); lactose (80 Citric acid (4.20 mg); tartaric acid (6.00 mg); NaOH (5.44 mg); water (up to 1 mL). In yet another embodiment, the liposome composition comprises: a compound of the invention (1.00 mg); 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17.50 mg); 1-palmitoyl- 2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol, Na (7.50 mg); lactose (80 mg); citric acid (4.20 mg); tartaric acid (6.00 mg); NaOH (5.44 mg); water (1 mL) Up to). Liposomal compositions containing other compounds of the present invention are prepared using conditions similar to those described above.
[0501]
(Example 23)
(Polyglutamic acid complex)
This example describes the preparation of poly-glutamic acid-21-hydroxy-9-oxo-epothilone D conjugate. Poly (1-glutamic acid) ("PG") sodium salt (MW34K, Sigma, 0.35 g) is dissolved in water. The pH of the aqueous solution is adjusted to 2 using 0.2 M HCl. The precipitate is collected, dialyzed against distilled water and lyophilized to yield 0.29 g PG (yile). To a solution of PG (75 mg, repeating unit FW 170, 0.44 mmol) in dry DMF (1.5 mL) was added 20 mg of 21-hydroxy-9-oxoepothilone D, 15 mg of dicyclohexylcarbodiimide ("DCC") and traces of dimethylamino. Add pyridine. The reaction is allowed to proceed at room temperature for 4 hours or until indicated by thin layer chromatography. The reaction mixture is poured into chloroform and the resulting precipitate is collected and dried in vacuo to give about 65 mg of PG-21-hydroxy-9-oxo-epothilone D complex. Changing the weight ratio of the compound of the invention to PG in the starting material results in polymer conjugates of various concentrations of 21-hydroxy-10,11-dehydroepothilone D. Conjugates of other compounds of the invention are prepared using conditions similar to those described above.
[0502]
(Example 24)
(Intravenous formulation)
This example describes an intravenous formulation of 9-oxo-epothilone D. This formulation contains 10 mg / mL 9-oxo-Epothilone D in a vehicle containing the following: 30% propylene glycol, 20% Creomophor EL, and 50% ethanol. The vehicle weighs ethanol (591.8 g) into a beaker containing a stir bar; Creomophor EL (315.0 g) is added to the solution and mixed for 10 minutes; then propylene glycol (466.2 g) is added to the solution. Prepare by adding to the solution and mixing for another 10 minutes. Add 9-oxo-epothilone D (1 g) to a 1 L volumetric flask containing 400-600 mL of vehicle and mix for 5 minutes. After adding 10,11-dehydroepothilone D to the solution, bring the volume to 1 L; mix for an additional 10 minutes; and filter through a 0.22 μm Millipore Millipak filter. Using the resulting solution, aseptically fill a sterile 5 mL vial to a target fill volume of 5.15 mL / vial using a metered peristaltic pump. The filled vial is immediately stoppered and crimped.
[0503]
Vials containing 10 mg / mL 9-oxo-epothilone D are diluted in standard saline or 5% dextrose solution for administration to patients and administered in non-PVC, non-DEHP bags and dosing sets. . The product is infused over 1-6 hours to deliver the desired dose.
[0504]
In one embodiment, the formulation is diluted 20-fold in sterile saline prior to intravenous infusion. The final infusion concentration is 0.5 mg / mL of the compound of the invention, 1.5% propylene glycol, 1% Chromophor EL, and 2.5% ethanol, which is infused over 1-6 hours and the desired Deliver the dose.
[0505]
Intravenous formulations containing other compounds of the present invention may be prepared and used in a similar manner.
[0506]
(Example 25)
(Pre-treatment for Cremophor® toxicity)
This example describes a pretreatment regimen for Cremophor® toxicity. Formulations of the compounds of the present invention, including Cremophor®, can cause toxicity in patients. Pretreatment with steroids can be used to prevent anaphylaxis. Any suitable corticosteroid or corticosteroid and H ₁ Antagonist and / or H ₂ Combinations with antagonists may be used. In one embodiment, the subject is premedicated with an oral dose of 50 mg diphenylhydramine and 300 mg cimetidine 1 hour prior to treatment with a compound of the present invention in a Cremophor®-containing formulation. In another embodiment, the subject is premedicated with 20 mg of dexamethasone intravenously at least 1.5 hours prior to treatment with a compound of the present invention in a Cremophor®-containing formulation. In another embodiment, the subject is treated with 50 mg of diphenylhydramine, 300 mg of cimetidine and 20 mg of dexamethasone at least 1.5 hours prior to treatment with a compound of the invention in a Cremophor® containing formulation. Premedication by intravenous administration. In yet another embodiment, taking into account the subject's body weight, the subject is treated with diphenylhydramine (Diphenylhydramine) at least 1.5 hours prior to treatment with a compound of the present invention in a Cremophor®-containing formulation. Pretreated with administration of cimetidine (5 mg / kg, i.v.); and dexamethasone (1 mg / kg, i.m.).
[0507]
All scientific and patent publications referred to herein are hereby incorporated by reference. While the invention has been described and described by way of illustration and example, those skilled in the art will recognize that the invention may be embodied in various embodiments and that the foregoing description and examples are by way of illustration and are not intended to be limiting. It should be understood that they do not limit the scope of the claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows a number of precursor compounds for N-acylcysteamine thioester derivatives that can be provided to the epothilone PKSs of the present invention. Here, the KS domain of NRPS-like module 1 or NRPS-like module 2 was inactivated to generate a novel epothilone derivative. General synthetic procedures for making such compounds are also provided.
FIG. 2
FIG. 2 shows a map of the restriction sites and functions of plasmids pKOS35-82.1 and pKOS35-82.2.
FIG. 3
FIG. 3 shows a map of the restriction sites and functions of plasmids pKOS35-154 and pKOS90-22.
FIG. 4
FIG. 4 shows an outline of a protocol described in Example 2 for introducing epothilone PKS and a modified enzyme gene into a chromosome of a Myxococcus xanthus host cell.
FIG. 5
FIG. 5 shows a map of pBeloBACII described in Example 2.
FIG. 6
FIG. 6 shows the basic performance of Myxococcus xanthus strain K111-40-1 in a simple production medium consisting only of 5 g / L Casitone (pancreatic casein digest) and 2 g / L magnesium sulfate. Description: Growth (solid circles), production (solid squares), and ammonia production (solid triangles) profiles for basic CTS media in a batch process; culture conditions are as described in Materials and Methods of Example 3. there were.
FIG. 7
FIG. 7 shows the effect of XAD-16 resin on the fermentation performance of Myxococcus xanthus strain K111-40-1 in a CTS production medium. Description: Growth (solid circles) and production (solid squares) profiles for incorporation of 20 g / L XAD-16 resin into CTS production medium in a batch process.
FIG. 8
FIG. 8 shows the effect of Cassiton on growth and production yield. Description: Effect of casiton concentration on growth (solid circles), production (solid squares), and specific productivity (solid triangles).
FIG. 9
FIG. 9 shows the effect of trace element and higher methyl oleate concentrations on growth and production yield. Description: Effect of methyl oleate (solid circles) and trace elements (solid squares) on production.
FIG. 10A
FIG. 10A shows M. oleate in the presence of optimal concentrations of methyl oleate and trace elements in a batch fermentation process. 1 shows the growth and production of xanthus strains. Exponential growth occurs during the first two days after seeding. Epothilone D production begins at the onset of the stationary phase and ends when cell lysis occurs with methyl oleate depletion on day 5. Description: A. 3.) Growth (solid circles) and production (solid squares) profiles for the addition of optimal concentrations of methyl oleate (7 mL / L) and trace elements (4 mL / L) to the CTS production medium in a batch process.
FIG. 10B
FIG. 10B shows M. oleate in the presence of optimal concentrations of methyl oleate and trace elements in a batch fermentation process. Figure 4 shows the time course corresponding to the consumption of methyl oleate and the production of ammonia during growth and production of the xanthus strain. B. ) Time course corresponding to consumption of methyl oleate (solid circles) and production of ammonia (solid squares).
FIG. 11A
FIG. 2 shows the effect of an intermittent feeding batch process on the growth and production of xanthus strains. Description: Growth (solid circles) and production (solid squares) profiles for an intermittent fed batch process in shake flasks. Casitone and methyl oleate feed rates were 2 g / L / day and 3 mL / L / day, respectively.
FIG. 11B
FIG. 11B shows the steady rate of methyl oleate consumption and ammonia production during the fermentation process. Description: Time course corresponding to the total addition of methyl oleate to the culture (solid circles), the total consumption of methyl oleate (solid squares), and the production of ammonia (solid triangles).
FIG.
FIG. 12 shows the production profile for an intermittent feed batch process in a 5 L bioreactor. Casitone and methyl oleate feed rates were 2 g / L / day and 3 mL / L / day, respectively.
FIG. 13A
FIG. 13A shows the effect of continuous feeding on growth and production. Description: Growth (solid circles) and production (solid squares) profiles for a continuous feed batch process in a 5 L bioreactor. Casitone and methyl oleate feed rates were 2 g / L / day and 3 mL / L / day, respectively.
FIG. 13B
FIG. 13B shows the time course of methyl oleate addition and consumption and ammonia production during a continuous feed batch process. Description: Time course corresponding to the total addition of methyl oleate to the culture (solid circles), the total consumption of methyl oleate (solid squares), and the production of ammonia (solid triangles); As described in

Claims (47)

A recombinant host cell of the order Cystobacterineae, comprising a recombinant expression vector, wherein said vector encodes a heterologous polyketide synthase (PKS) gene and comprises a polyketide synthesized by a PKS enzyme encoded on said vector. The resulting recombinant host cell. 2. The host cell according to claim 1, wherein the host cell is selected from the family Myxococcaceae. 2. The host cell according to claim 1, wherein the host cell is selected from the family Cystobacteraceae. 3. The host cell according to claim 2, wherein the host cell is selected from the genus selected from the group consisting of Angiococcus, Myxococcus and Corallococcus. 4. The host cell according to claim 3, wherein the host cell is selected from the genus selected from the group consisting of Cystobacter, Melittangium, Stigmatella and Archangium. 5. The host cell according to claim 4, wherein the host cell is selected from the genus Myxococcus. The host cell according to claim 5, which is selected from the genus Stigmatella. M. Stipitatus, M .; fulbus, M .; xanthus and M.P. 7. The host cell according to claim 6, wherein the host cell is selected from the group consisting of viralscens. S. erecta and S.E. The host cell of claim 7, wherein the host cell is selected from the group consisting of aurantiaca. 9. The host cell according to claim 8, which is Myxococcus @ xanthus. A method for producing a polyketide in a host cell of the suborder Cystobacterineae, wherein said polyketide is not naturally produced in said host cell, said method comprising expressing a PKS gene encoded on said vector. And culturing the host cell of claim 1 under conditions such that the polyketide is produced. The recombinant host cell according to claim 1, which produces epothilone or an epothilone derivative. 11. The host cell according to claim 10, which produces epothilone or an epothilone derivative. 14. The host cell of claim 13, which produces epothilone A, epothilone B, epothilone C, and epothilone D. 15. The host cell according to claim 14, which is Myxococcus @ xanthus @ K111-32.25. 15. The host cell according to claim 14, which produces epothilone A and epothilone B as main products and epothilone C and epothilone D as by-products. 14. The host cell according to claim 13, which produces epothilone C and epothilone D as major products. 18. The host cell of claim 17, wherein the host cell either does not contain an epoK gene or does not express a fully functional epoK gene product. 19. The host cell according to claim 18, which is Myxococcus @ xanthus @ K111-40.1. 19. The host cell according to claim 18, which is Myxococcus @ xanthus @ K111-72.4.4. 14. The host cell of claim 13, comprising the epothilone PKS gene, wherein the coding sequence for a module of the PKS has been altered by mutation, deletion or substitution. 22. The host cell according to claim 21, wherein said module is an extension module 6. 23. The host cell according to claim 22, wherein said module lacks a functional ketoreductase domain and produces 9-keto epothilone. 22. The host cell according to claim 21, wherein said module is an extension module 5. 25. The host cell according to claim 24, wherein said module 5 lacks a functional dehydratase domain and produces 13-hydroxyepothilone. 22. The host cell according to claim 21, wherein said module is an extension module 4. 27. The host cell according to claim 26, wherein said module lacks a functional ketoreductase domain and produces 13-keto epothilone. 22. The host cell of claim 21, wherein the module is an extension module 2, wherein the coding sequence for the ketoreductase domain has been altered by a mutation to change the active site cysteine to another amino acid, and The host cell, wherein the host cell must be provided with a diketone equivalent compound to produce epothilone or an epothilone derivative. 29. The host cell according to claim 28, which is Myxococcus xanthus strain K90-132.1.1.2. 22. The host cell according to claim 21, wherein said module is an extension module 1. 31. The host cell of claim 30, wherein the module is altered such that the module binds to an amino acid other than cysteine. 22. The host cell according to claim 21, wherein said module is a load module. 33. The host cell of claim 32, wherein said module has been replaced with a module that binds to an amino acid. The following formula:

Wherein the derivative has the following formula:

Produced by culturing the host cell of claim 28 using a diketone equivalent compound of
Where R ⁷ is hydrogen or methyl, and Ar is:

Aryl selected from the group consisting of
Wherein R is hydrogen, hydroxy, halogen, amino, C ₁ C ₅ alkyl, C ₁ -C ₅ hydroxyalkyl, C ₁ -C ₅ alkoxy, and C ₁ -C ₅ aminoalkyl, wherein the epothilone derivative. 2. The host cell according to claim 1, wherein the host cell is an enzyme that transports a compound into the cell used in biosynthesis of the polyketide, and an enzyme that synthesizes a compound used in biosynthesis of the polyketide. A host cell further comprising a heterologous gene encoding an enzyme selected from the group consisting of: and an enzyme that phosphopantethenylates PKS. 36. The host cell according to claim 35, wherein said enzyme is MatB. 36. The host cell according to claim 35, wherein said enzyme is MatC. 36. The host cell according to claim 35, wherein said enzyme is MtaA. 14. The host cell of claim 13, wherein the epothilone or epothilone derivative is S. aureus. Control of a promoter selected from the group consisting of a cellulosum epothilone PKS gene-derived promoter, a myxothiazole biosynthesis gene-derived promoter, a TA biosynthesis gene-derived promoter, a pilA promoter, a kanamycin resistance-conferring gene-derived promoter, and a So ce90 promoter. Below, a host cell produced by the PSK gene. A method for purifying epothilone from cells that produce epothilone, comprising: culturing the cell in the presence of an XAD resin; eluting epothilone from the resin; epothilone eluted from the resin. And e) performing chromatography on epothilone obtained from the solid-phase resin extraction. 37. The method of claim 36, further comprising a crystallization step. Crystalline epothilone D. A method for fermentation of a Myxococcus host cell, the method comprising culturing the cell in a liquid medium containing a fatty acid or oil as a carbon source. 44. The method of claim 43, wherein said fermentation is a fed-batch fermentation. 44. The method of claim 43, wherein the Myxococcus host cell produces epothilone or an epothilone derivative. 46. The method of claim 45, wherein said host cell produces an epothilone derivative comprising oxazole instead of thiazole, and wherein said liquid medium comprises L-serine. The following formula:

An isolated compound of the formula
here,
R ¹ , R ² , R ³ , R ⁵ , R ¹¹ and R ¹² are each independently hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁴ , R ⁶ and R ⁹ are each independently hydrogen, hydroxyl or oxo;
R ⁵ and R ⁶ together form a carbon-carbon double bond;
R ⁷ is hydrogen, methyl or ethyl;
R ⁸ and R ¹⁰ are both hydrogen or together form a carbon-carbon double bond or epoxide;
Ar is aryl; and
An isolated compound, wherein W is O or NR ¹³ , wherein R ¹³ is hydrogen, C ₁ -C ₁₀ aliphatic, aryl or alkylaryl.

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