JP2004507468A - Ａｄａｍｔｓ−１のモジュレーターを含んでなる薬剤組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、メタロプロテイナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−１（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）が、肥満、アテローム性動脈硬化症、インスリン耐性症候群およびインスリン非依存性糖尿病に関与するという発見に基づく。本出願は、ＡＤＡＭＳ−１活性の特異的モジュレーターをスクリーニングする方法、および上述の疾患を治療するための前記モジュレーターの使用に関する。
Description
【０００１】
方法
本発明は、メタロプロテイナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−１（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ））が、肥満、アテローム性動脈硬化症、インスリン耐性症候群およびインスリン非依存性糖尿病と関連するという発見に基づく。
【０００２】
現在までに３０のメンバーを含有するメタロプロテイナーゼのＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ファミリーが、酵母からヒトに渡る生物で同定されてきている（Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇら、１９９８；Ｂｌｏｂｅｌ、１９９７；Ｔａｎｇ、２００１）。これらは保存されたドメイン構造を有する。ＡＤＡＭ類は、細胞表面分子の分断、並びに細胞およびマトリックスタンパク質への接着などの、多様な生物学的過程に関連付けられてきている。例えば、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ／ＴＮＦα変換酵素）は、ＴＮＦαの膜結合型を切断してそして遊離させ；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）酵素クズバニアン（ｋｕｚｂａｎｉａｎ）およびその哺乳動物相同体（ＡＤＡＭ１０）は、膜貫通受容体ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）の細胞外ドメインを切断することが示されてきている。ＡＤＡＭ１および２（ファーティリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）αおよびβ）は、受精中の精子−卵融合に必須であることが示されてきている。これらはまた、癌転移および炎症などの病的事象において、役割を果たしている可能性があることも示されてきている。
【０００３】
過去４年以内に、ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジン１型モチーフを持つディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ））として知られる、ＡＤＡＭ関連タンパク質の新規サブセットが同定されてきた；現在までに約１０の既知のメンバーがあり、このうち半数は既知の機能を持たない。ＡＤＡＭＴＳは、膜貫通ドメインを欠き、そして多様な数のトロンボスポンジンＩ型（ＴＳＰ−１）反復が存在する点で、先に知られるＡＤＡＭと異なる。第一のメンバー、ＡＤＡＭＴＳ−１は、マウス悪液質結腸亜系統からクローニングされ、そしてＩＬ−１によって誘導可能であると示されたことから、炎症関連遺伝子としての役割が示唆された（Ｋｕｎｏら、１９９７）。ＡＤＡＭＴＳ−１はまた、マウスにおいて、リポ多糖（ＬＰＳ）の静脈内投与によって、腎臓および心臓で上方制御されることも見出され、炎症反応中に該遺伝子が誘導される可能性があることが再び示唆された（Ｋｕｎｏら、１９９７；１９９８）。該タンパク質は、分泌され、そしてトロンボスポンジンおよびスペーサードメインを介して、細胞外マトリックスおよびヘパリンに結合する（Ｋｕｎｏら、１９９９）。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１は、トロンボスポンジン−１の抗血管新生１型反復を含有するタンパク質に関して検索した別のグループによって同定され、このグループは、ＭＥＴＨ−１と名づけた；ＴＳＰ−１反復は、観察された強力な抗血管新生特性に必要であることが示された（Ｖａｚｑｕｅｚら、１９９９）。ＭＥＴＨ−１はまた、ＷＯ ９９／３７６６０およびＷＯ ００／７１５７７（Ｉｒｕｌｅａ−Ａｒｉｓｐｅら）にも記載されている。系統発生的には、ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＡＤＡＭＴＳ−４およびＡＤＡＭＴＳ−８と最も相同性を有する。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ−１欠損マウスが生成されてきており；これらは生存可能であるが、成長遅延、メス受胎能障害、および腎臓の欠陥を示す（Ｓｈｉｎｄｏら、２０００）。腎臓欠陥は、正常マウスの胚腎臓における高レベルの発現と一致する；しかし、成体においては、メッセージレベルは有意に減少する（ＭＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｖａｚｑｕｅｚ、１９９９）。線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーであるＧｏｎ−１突然変異体が生成されてきており；これらは生殖腺発生に重度の欠陥を示す（ＢｌｅｌｌｏｃｋおよびＫｉｍｂｌｅ、１９９９）。ＡＤＡＭＴＳ欠損マウスおよび線虫において、目立った表現型が観察されることから、このファミリーの少なくともいくつかのメンバーが、発生中の細胞遊走／リモデリングにおいて、ある特定のそして非重複性の役割を有することが示唆される。これは、驚くほど穏やかな表現型を示す、多くのメタロプロテアーゼ欠損に関して観察されるものと対照的である。肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１−／−遺伝子型の影響は、調べられていない。
【０００５】
ＥＰ ８７４ ０５０（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ／ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）は、該出願中ではインテグリンリガンドＩＴＧＬ−ＴＳＰと称される、マウスＡＤＡＭＴＳ−１のヒト類似体に関する。ＡＤＡＭＴＳ−１と関連すると言及される徴候は、血管形成性疾患（癌、癌転移、慢性炎症性障害、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、筋変性、糖尿病網膜症）、再狭窄、アルツハイマー病および組織リモデリングに限定される。
【０００６】
ＫｕｎｏのグループからのＷＯ ９８／５５６４３（呉羽化学工業）は、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、並びに、例えば慢性関節リウマチ、肝炎、腎炎、クローン病、喘息およびＡＲＤＳなどの炎症性疾患を治療するための、白血球および血小板血算を減少させ、そして赤血球血算を増加させる剤としてのその使用を含む。
【０００７】
最近、遺伝子ターゲティングによって、ＡＤＡＭＴＳ−１−／−マウスが生成された。これらのマウスは、ヒト腎盂尿管接合部閉塞に似た、腎表現型を示す。肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１−／−遺伝子型の影響は、調べられていない。
【０００８】
現在、疾患におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割に関して知られる情報の度合いは限られており、そして一般的に推測的である。したがって、疾患におけるＡＤＡＭＴＳ−１の特定の機能をよりよく理解する必要がある。さらに、肥満、アテローム性動脈硬化症、ＩＲＳおよびＮＩＤＤＭの重要な疾患の根底にある生理機能の性質をよりよく理解する必要がある。既知の当該技術分野のいずれも、ＡＤＡＭＴＳ−１自体の発現の特定のレベルおよび肥満、アテローム性動脈硬化症またはＩＲＳの間の関連、あるいはＡＤＡＭＴＳ−１の発現レベルまたは活性を特異的に変調することによって、これらの異常を防止するかまたは治療する可能性に言及しない。
【０００９】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１が、肥満、アテローム性動脈硬化症、インスリン耐性症候群およびインスリン非依存性糖尿病に特異的に関連するという発見に基づく。
【００１０】
本発明の１つの側面にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症から独立に選択される疾患を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調可能な化合物の使用を提供する。好ましい使用は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に減少させることが可能な化合物のものである。別の態様において、好ましい使用は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に増加させることが可能な化合物のものである。本発明の別の態様は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に減少させることが可能な化合物の使用である。本発明の別の態様は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に増加させることが可能な化合物のものである。
【００１１】
用語「ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調可能な化合物」は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症に関連する、化合物の主な薬学的活性が、ＡＤＡＭＴＳ−１に対するその影響に依存することを意味する。例えば、ロシグリタゾンなどのチアゾリジノン化合物は、これらがＰＰＡＲ−γを通じた重要な薬学的活性を有するため、この定義の範囲外に属する。Ｗｉｌｌｓｏｎら（２０００）， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ４３， ５２７−５５０を参照されたい。
【００１２】
特に、ＡＤＡＭＴＳ−１の量を特異的に変調可能な化合物は、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子またはその発現；ＡＤＡＭＴＳ−１ ｍＲＮＡ、その代謝回転、プロセシング、分解または安定性；あるいはＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、その代謝回転、プロセシング、分解、または安定性に直接影響を与えることによって、ＡＤＡＭＴＳ−１の量を変調する化合物を指す。
【００１３】
特に、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に変調可能な化合物は、ＡＤＡＭ１７（ＴＮＦ−□変換酵素、ＴＡＣＥ）、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−１４（膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ）、ＭＭＰ−１９（リウマトイド関連関節炎関連ＭＭＰ）およびＰＰＡＲの活性を有意に変調することなく、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を変調する化合物を指す。しかし、例えばアグリカナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−４またはＡＤＡＭＴＳ−５などの、他のＡＤＡＭＴＳ類のいくつかに影響を有する化合物は、この定義内に属するであろうと予期される。理論的考慮に束縛されることは望ましくないが、いくつかの他のタンパク質、例えばアグリカナーゼに影響を有することは、有益でさえある可能性がある。
【００１４】
ＡＤＡＭＴＳ−１に対する化合物の活性自体は、本明細書に例示される酵素アッセイによって測定されるような、ＡＤＡＭＴＳ−１酵素活性に対する直接の影響を通じて、測定可能である。
【００１５】
本発明の別の側面にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症の治療に、潜在的に有用な化合物に関するスクリーニング法であって、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調する能力に関する化合物のアッセイを含んでなる、前記方法を提供する。好ましくは、アッセイは：
ｉ）ＡＤＡＭＴＳ−１を発現する細胞株を使用するか、または精製ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を使用する、ＡＤＡＭＴＳ−１活性の測定；および
ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ−１を発現する細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写または翻訳の測定
から独立に選択される。好ましくは、細胞株はマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞である。好ましくは、タンパク質はヒト組換えＡＤＡＭＴＳ−１である。
【００１６】
ヒトＡＤＡＭＴＳ−１のアミノ酸配列は、例えば、ＩＤ ＡＴＳ１＿ＨＵＭＡＮのように、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースから得ることが可能であり、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１をコードするＤＮＡ配列は、例えば、寄託番号ＡＦ１７００８４、ＡＦ０６０１５２、ＡＦ２０７６６４、およびＡＰ００１６９７のように、ＥＭＢＬデータベースから得ることが可能である。マウスＡＤＡＭＴＳ−１のアミノ酸配列は、例えば、ＩＤ ＡＴＳ１＿ＭＯＵＳＥのように、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースから得ることが可能であり、マウスＡＤＡＭＴＳ−１をコードするＤＮＡ配列は、例えば、寄託番号ＡＢ００１７３５およびＤ６７０７６のように、ＥＭＢＬデータベースから得ることが可能である。
【００１７】
本発明の別の側面にしたがって：
ｉ）本明細書に記載する方法にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症の治療に有用と化合物を同定し；そして
ｉｉ）該化合物または薬学的に許容しうるその塩を、薬学的に許容しうる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含んでなる、薬剤組成物調製法を提供する。
【００１８】
本発明の組成物は、経口使用（例えば錠剤、ロゼンジ、硬または軟カプセル、水性または油性懸濁物、エマルジョン、分散性粉末または顆粒、シロップまたはエリキシル剤として）、局所使用（例えばクリーム、軟膏、ゲル、あるいは水性または油性溶液または懸濁物として）、吸入による投与（例えば細分割粉末または液体エアロゾルとして）、吹入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与（例えば細分割粉末として）または非経口投与（例えば静脈内、皮下または筋内投薬のための無菌水性または油性溶液として、あるいは直腸投薬のための座薬として）に適した形であることが可能である。
【００１９】
本発明の組成物は、当該技術分野に公知の、慣用的な薬学的賦形剤を用いた慣用法によって、得ることが可能である。したがって、経口使用に意図される組成物は、例えば、１以上の着色剤、甘味剤、フレーバー剤および／または保存剤を含有することが可能である。
【００２０】
錠剤処方に適した薬学的に許容しうる賦形剤には、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチまたはアルギン酸（ａｌｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などの顆粒化および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなどの保存剤、並びにアスコルビン酸などの酸化防止剤が含まれる。錠剤処方は、未コーティングでもよいし、あるいは崩壊およびそれに続く胃腸管内での活性成分の吸収を修飾するため、または安定性および／または外見を改善するため、いずれの場合も慣用的なコーティング剤および当該技術分野に公知の方法を用いて、コーティングしてもよい。
【００２１】
経口使用のための組成物は、活性成分を不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合する硬ゼラチンカプセルの形であるか、あるいは活性成分を、水またはピーナツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などの油と混合する軟ゼラチンカプセルとして使用することが可能である。
【００２２】
水性懸濁物は、一般的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴムなどの、１以上の懸濁剤；レシチン、あるいはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合産物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合産物、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合産物、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトール由来の部分エステルの縮合産物などの、分散または湿潤剤と共に、細かく粉末化した形の活性成分を含有する。水性懸濁物はまた、１以上の保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、着色剤、フレーバー剤、および／または甘味剤（スクロース、サッカリンまたはアスパルテームなど）も含有することが可能である。
【００２３】
油性懸濁物は、植物油（ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油など）中、またはミネラルオイル（流動パラフィンなど）中に活性成分を懸濁することによって、処方可能である。油性懸濁物はまた、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの粘稠化剤も含有することが可能である。上に示したような甘味剤、およびフレーバー剤を添加して、口当たりがよい経口調製を提供することが可能である。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって、保存することが可能である。
【００２４】
水の添加による水性懸濁物の調製に適した分散性粉末および顆粒は、一般的に、活性成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１以上の保存剤と共に含有する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上に言及したものによって例示される。甘味剤、フレーバー剤および着色剤などのさらなる賦形剤もまた、存在することが可能である。
【００２５】
本発明の薬剤組成物はまた、水中油エマルジョンの形であることも可能である。油性相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油などの植物油、または例えば流動パラフィンなどのミネラルオイル、あるいはこれらのいずれかの混合物であることが可能である。適切な乳化剤は、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然存在ゴム、ダイズ（ｓｏｙａ ｂｅａｎ）レシチンなどの天然存在ホスファチド、脂肪酸および無水ヘキシトール由来のエステルまたは部分エステル（例えばモノオレイン酸ソルビタン）並びにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの、前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合産物であることが可能である。エマルジョンはまた、甘味剤、フレーバー剤および保存剤も含有することが可能である。
【００２６】
シロップおよびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースなどの甘味剤と共に処方することが可能であるし、そしてまた、粘滑剤、保存剤、フレーバー剤および／または着色剤も含有することが可能である。
【００２７】
薬剤組成物はまた、上に言及した、１以上の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、既知の方法にしたがって処方可能である、無菌注射可能水性または油性懸濁物の形であることも可能である。無菌注射可能調製はまた、非毒性非経口性の許容しうる希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または懸濁物、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であることが可能である。
【００２８】
座薬処方は、通常の温度では固体であるが、直腸温度では液体であり、そしてしたがって、直腸中で融解して薬剤を放出するであろう、適切な非刺激性賦形剤と、活性成分を混合することによって調製可能である。適切な賦形剤には、例えばカカオバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【００２９】
クリーム、軟膏、ゲルおよび水性または油性溶液または懸濁物などの局所処方は、一般的に、活性成分を、局所に許容しうる慣用的なビヒクルまたは希釈剤と、当該技術分野に公知の慣用法を用いて処方することによって、得ることが可能である。
【００３０】
吹入による投与のための組成物は、例えば３０μまたはそれよりはるかに小さい平均直径を持つ粒子を含有する、細分割粉末の形であることが可能であり、粉末自体が、活性成分を単独で、またはラクトースなどの１以上の生理学的に許容しうるキャリアーで希釈して含んでなることが可能である。その後、吹入用の粉末を、既知の剤、クロモグリク酸ナトリウムの吹入に使用されるように、ターボ吸入装置で使用するため、例えば１から５０ｍｇの活性成分を含有するカプセル中に、好適に保持する。
【００３１】
吸入による投与のための組成物は、細分割固体を含有するエアロゾルまたは液体滴いずれかとして、活性成分を分配するよう取り計らった、慣用的な加圧エアロゾルの形であることが可能である。揮発性フッ化炭化水素または炭化水素などの慣用的なエアロゾル噴射剤が使用可能であり、そしてエアロゾル装置は、測定した量の活性成分を分配するよう、好適に準備する。
【００３２】
処方に関するさらなる情報に関しては、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０、第５巻の第２５．２章を参照されたい。
【００３３】
１以上の賦形剤と合わせて、単一投薬型を生じる活性成分の量は、治療する宿主および特定の投与経路に応じて、必然的に多様であろう。例えば、ヒトへの経口投与に意図される処方は、一般的に、例えば、総組成物重量の約５から約９８パーセントの間で変化することが可能な、適切でそして好適な量の賦形剤と共に配合した、０．５ｍｇから２ｇの活性剤を含有するであろう。投薬単位型は、一般的に、約１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分を含有するであろう。投与経路および投薬措置に関するさらなる情報に関しては、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０、第５巻の第２５．３章を参照されたい。
【００３４】
化合物の療法または予防目的の用量サイズは、当然、異常の性質および重症度、動物または患者の年齢および性別、並びに投与経路にしたがい、医学の公知の原理にしたがって、多様であろう。
【００３５】
療法または予防目的に化合物を用いる際、必要な場合、分割用量で投与される、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから７５ｍｇの範囲の一日用量が与えられるように、投与されるであろう。一般的に、非経口経路を使用する場合、より低い用量が投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内投与には、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから３０ｍｇの範囲の用量を、一般的に使用するであろう。同様に、吸入による投与には、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから２５ｍｇの範囲の用量を使用するであろう。しかし、経口投与が好ましい。
【００３６】
図に言及しながら、以下の限定されない実施例に、本発明をさらに記載する。
【００３７】
【実施例】
実施例１
ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割
１．１ 材料および方法
プライマー
【００３８】
【表１】
【００３９】
動物、細胞培養および処置。９週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、３０μｍｏｌ／ｋｇ／日のロシグリタゾンで７日間処置した。薬剤は、胃管栄養法を用いて経口投与した。対照動物にはビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ）を与えた。遺伝的バックグラウンドの変動を減少させるため、オス兄弟対を用いて、一方を薬剤で処置し、そして他方をビヒクルで処置した。動物は、水および通常のマウス固形試料に自由に接近させた。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、１７５ｃｍ２フラスコ中で集密まで増殖させた。その後、２μｇ／ｍｌのデキサメタゾンおよび０．５μＭのメチルイソブチルキサンチンを培地に含ませた。この処置を２週間続けた。これは、該細胞から脂肪細胞への分化を駆動するであろう。デキサメタゾン／メチルイソブチルキサンチンを除去し、そして細胞をその後、１μＭのロシグリタゾンで２４時間処理した。対照細胞もまた、デキサメタゾン／メチルイソブチルキサンチンで処理したが、ロシグリタゾンの代わりにビヒクルで処理した。
【００４０】
組織単離およびＲＮＡ抽出。処置および対照マウスから、肝臓、腸間膜（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉａｌ）脂肪、精巣上体（ｅｐｉｄｉｄｉｍｕｓ）脂肪、褐色脂肪、四頭筋由来の白色線維（四頭筋／白）、四頭筋由来の赤色線維（四頭筋／赤）および心臓を単離した。混入組織、血液および体毛を除去するように注意を払った。動物を殺して２分以内に、すべての組織を除去し、そして液体窒素中で迅速凍結した。組織の重量を測定し、そしてＲＮＡＳＴＡＴ−６０（ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した。Ｔｕｒｒａｘブレンダーを用いて、氷上で１分間、組織をホモジナイズした。供給者のプロトコルにしたがって、総ＲＮＡを抽出した。簡潔には、１００ｍｇまでの組織量に対して、１ｍｌの抽出培地を添加し、そして組織をホモジナイズした。遠心分離によって、有機および水相を分離した。上部の水相を単離し、そして１体積のイソプロパノールでＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡペレットを７５％の氷冷エタノールで洗浄した。ＲＮＡペレットを乾燥させ、そしてＤＥＰＣ処理水に溶解した。３Ｔ３−Ｌ１細胞のＲＮＡ抽出のため、インキュベーション培地を捨て、そしてＲＮＡＳＴＡＴ−６０を添加した。ＲＮＡは上述のように抽出した。残ったＤＮＡを除去するため、総ＲＮＡ調製をＤＮアーゼで処理した。５０μｇのＲＮＡを、最終体積１００μｌ中、１０ｍＭ ＣａＣｌ２；６ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌおよび４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９中で、５Ｕ ＤＮアーゼ（ＲＱ１ ＤＮアーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）と３７℃でインキュベーションした。１５分後、４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって、反応を停止した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出で、タンパク質を除去した。ＲＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＥＰＣ処理水に再溶解し、そして２６０ｎｍのＯＤ読み取りによって定量化した。１％アガロースゲル上でもまた、ＲＮＡの品質をチェックした。
【００４１】
ディファレンシャルディスプレー。ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．（テネシー州ナッシュビル）の試薬を用いて、ディファレンシャルディスプレーを行った（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９２）。３つの並行反応において、３つの異なるアンカープライマー、Ｈ−Ｔ１１−Ａ、Ｈ−Ｔ１１−ＧおよびＨ−Ｔ１１−Ｃを用いて、総ＲＮＡを逆転写した。反応は２つ組で行った。１３．４μｌの水中、０．２μｇの総ＲＮＡを、１．６μｌの２５０μＭ ｄＮＴＰ；４μｌの５ｘＲＴ緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ８．３、１８８ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＤＴＴ）および２μｌの２μＭアンカープライマーと混合した。試料を、サーモサイクラー中で、６５℃５分間、３７℃６０分間および７５℃５分間インキュベーションした。３７℃で５分間経過後、ＭＭＬＶ逆転写酵素を添加した。生じたｃＤＮＡ、並びに３つのアンカープライマーおよび１０の異なるランダムプライマーの組み合わせを用いて、ＰＣＲをセットアップした。各プライマーの組み合わせに関して、以下の反応をセットアップした。９．２μｌの水；２μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０１％ゼラチン）；１．６μｌの２５μＭ ｄＮＴＰ；２μｌの２μＭアンカープライマー；２μｌのＲＴ反応混合物；０．２５μｌのα−［３３Ｐ］ｄＡＴＰ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌおよび０．２μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。以下の温度周期を用いて、試料をサーモサイクラー中でインキュベーションした。１． ９４℃３０秒間、２． ４０℃２分間、３． ７２℃３０秒間、４． 工程１へ、４０周期、および５． ７２℃５分間。増幅後、３．５μｌのＰＣＲ反応を２μｌの装填色素（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．０９％キシレンシアノールＦＦおよび０．０９％ブロモフェノールブルー）と混合した。尿素を含む６％ ＰＡＧＥ上に装填する直前、試料を８０℃で変性させた。処置および未処置組織／細胞由来の同一のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを、並べて装填した。より遅く移動するキシレン色素がゲルの底部に達したら、電気泳動を停止した。ゲルをろ紙に移し、そして真空ゲル乾燥装置中で乾燥させた。乾燥ゲルを、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＸＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に対して置くことによって、放射能を検出した。２つ組において、一方の組織から現れるが、他方からは現れないバンドを、メスで乾燥ゲルから切り出すことによって単離した。正しいバンドを切り出したことを確認するため、第二のオートラジオグラフィーフィルムを乾燥ゲルに曝露した。単離したバンドを１００μｌの水中で、１５分間煮沸した。ゲルおよびろ紙を回転して落とし、そして上清を新たな試験管に移した。１点を変更した以外、上述と同一のＰＣＲプロトコルを用いて、単離断片を再増幅した。再増幅中のｄＮＴＰ濃度は２０μＭであった。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で解析した。ＰＣＲが、期待されるサイズの産物を生じたら、該ＰＣＲ反応混合物を、ｐＣＲＴＲＡＰベクター（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）へのＰＣＲ産物の連結に用いた。５μｌの水を、２μｌの直線化ｐＣＲＴＲＡＰ；１μｌの１０ｘ連結緩衝液（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）；２．５μｌのＰＣＲ産物および０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１００Ｕ）と混合した。連結反応は、１６℃で一晩インキュベーションした。１０μｌの連結反応混合物で、１００μｌのＧＨコンピテント細胞（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）を形質転換した。テトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ上に、細菌を蒔いた。３７℃で一晩インキュベーションした後に現れたコロニーを収集し、そして５０μｌの溶解緩衝液（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）中、９５℃で１０分間溶解した。ベクター特異的プライマー対（Ｒｇｈ、Ｌｇｈ）でのＰＣＲを用いて、挿入物のサイズをチェックした。１０．２μｌの水を、２μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液；１．６μｌの２５０μＭ ｄＮＴＰ；２μｌの２μＭ Ｌｇｈプライマー；２μｌの２μＭ Ｒｇｈプライマー；０．２μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（１Ｕ）および２μｌのコロニー溶解物と混合した。ＰＣＲは、１． ９４℃３０秒間、２． ５２℃４０秒間、３． ７２℃１分間、４． １へ、４０周期、および５． ７２℃５分間で行った。ＰＣＲ産物を１．５％アガロース上で解析した。一般的に、５つの陽性コロニーを用いて、テトラサイクリンを含むＬＢ培地５ｍｌに接種した。培養は一晩インキュベーションした。細胞を回転して落とし、そしてペレットをＷｉｚａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミドミニプレップに用いた。
【００４２】
ＤＮＡ配列決定。色素ターミネーター周期配列決定用のサーモサイクラーキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と共に、ＲｇｈまたはＬｇｈプライマーを用いて、挿入物を配列決定した。
【００４３】
１．２ 結果
ディファレンシャルディスプレーの成果。逆転写工程において、３つの独立の反応中、３つの異なるアンカープライマーを用いた。これらのプライマーは、ｍＲＮＡの３’端のポリＡテールにハイブリダイズするであろう、ポリＴ部分を有する。最後の塩基は、Ｃ、ＧまたはＡのいずれかである。この方法は、すべてのポリＡ転写物を３つのｃＤＮＡプールに細分する。ｃＤＮＡプールの各々に関して、１０の異なるランダムプライマーを用いて、ＰＣＲをセットアップした。この方法は、ｃＤＮＡプールを、さらに細分し、そして増幅する。この研究に用いるプライマーの組み合わせは、典型的には、およそ１５０断片／プライマー組み合わせを生成する。３つの異なるアンカーおよび１０の異なるランダムプライマーを用いて、各組織に関して、総数４５００断片が生成された。文献では、細胞において、いかなる既定の瞬間にも、１５０００遺伝子が発現されると概算されている（６）。この概算を用いると、各組織中の発現遺伝子の１／３を解析したと推測することが可能である。これは、各遺伝子が１つの断片のみを生成するであろうと仮定するが、これは常にそうとは限らない可能性がある。解析した断片のうち、およそ１５０を、示差的に発現されるものとして検出し、そして単離した。個々の組織において、示差的に発現する７−２３の断片を検出し、平均はおよそ１５であった。これは、発現遺伝子のおよそ０．１％が薬剤処理によって影響を受けたことを示す。示差的に発現された断片の最高数は、褐色脂肪組織で見られ、肝臓、精巣上体脂肪、腸間膜脂肪、四頭筋／白、四頭筋／赤および心臓が続いた。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、マウス中の肝臓と同程度に影響を受けた。これは、ここで調べた組織のうち、褐色脂肪が薬剤処理によって最も影響を受け、一方、心臓が最も影響を受けないことを示す。肝臓および脂肪組織は、筋組織より影響を受ける。
【００４４】
処理によって上方−下方制御される断片が、いくつかの組織で見られた。薬剤処理後、断片の２／３で発現レベルが上方制御され、そして残りの１／３で下方制御された。調べたすべての組織で、上方および下方制御された発現両方が観察された。発現の最高相対上方制御は褐色脂肪で検出され、一方、最高相対下方制御は、心臓で検出された。
【００４５】
バイオインフォマティクス解析。ディファレンシャルディスプレー実験から得た配列を、ＤＮＡデータベースに見られる配列に比較した。ｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いて、ＥＭＢＬ非ＥＳＴ、ＥＭＢＬ ＥＳＴおよびＰａｔｓｅｑを検索した。ＥＭＢＬ非ＥＳＴデータベース中の１０−１０未満のＰ（Ｎ）値のヒットを用いて、断片を同定した。他の哺乳動物（マウス以外）のヒットは、ディファレンシャルディスプレー断片がそのｃＤＮＡ／遺伝子のコード部分に並列した場合のみ、同定に用いた。ＥＭＢＬ非ＥＳＴデータベースでヒットが得られなかった場合、ＥＭＢＬ ＥＳＴデータベースを検索した。１ｘ１０１０未満のＰ（Ｎ）のマウス由来のヒットのみを記録した。特許ＤＮＡデータベースＰａｔＳｅｑは、特許配列に関して検索した。有意な非ＥＳＴまたはＥＳＴが見出されなかった場合、ディファレンシャルディスプレー断片は、未知と称した。この研究において、データベースに対して解析すると、半数よりいくらか少ない断片が既知遺伝子を戻した。４分の１がＥＳＴとしてのみ同定され、そして４分の１が未知であった。ここで調べたすべての組織および細胞において、既知／ＥＳＴおよび未知間の比率がほぼ同じであることが観察された。
【００４６】
２ ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割の同定
ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＰＰＡＲγアゴニストの作用機構をより完全に理解し、そしてインスリン耐性症候群（ＩＲＳ）／インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に有用な新規分子標的を見出すために行った、発現プロフィール決定実験で、最初に同定された。インスリン非依存性糖尿病治療用のインスリン増感薬剤として使用する、化合物のチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）種は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンドとして作用することが知られる。対照およびロシグリタゾン処置（ＴＺＤ Ｘ１０３、ＢＲＬ４９６５３、ＡＲＨ０３６１３３）ｏｂ／ｏｂマウス由来の多様な器官および組織の対比較を用いて、ディファレンシャルディスプレー解析を行った。これらのマウスは、レプチン欠損で肥満であり、そして年齢と共にＮＩＤＤＭに似た異常を発展させ；異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）および肥満などの、これらの症状のいくつかは、統計的にアテローム性動脈硬化症を発展させる可能性がある患者によって示される。ディファレンシャルディスプレー解析の結果、既知の遺伝子、ＥＳＴおよび未知の遺伝子由来の１００を超える一次配列を同定した。同定した配列は、真の上方または下方制御遺伝子を選別するため、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いた確認過程を経た。また、確認したヒットは、時間経過および組織分布実験において、さらに認証した。確認した配列には、バイオインフォマティクスおよび文献調査を行った。１２の潜在的な標的（４つの既知の遺伝子、４つのＥＳＴおよび４つの先に未知であった遺伝子）をさらなる研究に選んだ。
【００４７】
示差的に発現された配列の１つが、マウスＡＤＡＭＴＳ−１ ｍＲＮＡに対応し、これは、腸間膜脂肪において、やせた同腹仔と比較して肥満のｏｂ／ｏｂマウスで有意に上昇した（図３）。ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージは、精巣上体脂肪組織において、ロシグリタゾン処置（毎日投与、３０μｍｏｌ／ｋｇ／日）７日後に下方制御された（図２）。同一に処置した動物の別の組由来の組織に対してリアルタイムＰＣＲ定量化を行うと、腸間膜（図１）および褐色脂肪組織（図４）においても下方制御が起こることが示された。測定は、５動物からプールしたｃＤＮＡに対して行い、したがってエラーバーが欠如していることに注目されたい。
【００４８】
続いて、ヒトにおいて、ＡＤＡＭＴＳ−１レベルが、大部分の他の組織に比較して心臓で、特に大動脈で、より高いことが見出された（図５）。プロテアーゼは、ＥＣＭタンパク質をリモデリングし、そして分解することによって、アテローム発生において、そして斑安定のため、不可欠の役割を果たしているため、ＡＤＡＭＴＳ−１は、アテローム性動脈硬化症の潜在的に興味深い標的となった。
【００４９】
結論：
１．ＡＤＡＭＴＳ−１発現は、肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスの脂肪組織および大動脈で上方制御され、そして筋肉で下方制御される。
【００５０】
２．ｏｂ／ｏｂマウスをＰＰＡＲγアゴニストで処置すると、脂肪組織における発現が正常化される（そして筋肉における発現が、ある程度、正常化される）。
【００５１】
３．ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症の観点から関連する組織分布を示す。
４．該遺伝子は入手可能な細胞系（マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞）において発現される（そしてＰＰＡＲγアゴニストに反応する）。
【００５２】
５．ＡＤＡＭＴＳ−１相同体は、適切なモデル生物に見られる（マウス、線虫およびショウジョウバエ）。
６．ＡＤＡＭＴＳ−１は、いくつかの重要な疾患において、多数の過程に関与することが見出されるプロテアーゼ／インテグリン結合タンパク質ファミリーに属する。
【００５３】
７．該タンパク質は搬出され、そしてしたがって潜在的に、発現しそして精製するのが比較的容易である。
８．ＡＤＡＭＴＳ−１分子は、薬剤ターゲティングに有用ないくつかの機能ドメイン（プロ、メタロプロテイナーゼ、インテグリン結合およびマトリックス結合ドメイン）を有する。
【００５４】
したがって、ＡＤＡＭＴＳ−１自体が、ＮＩＤＤＭ／ＩＲＳ、アテローム性動脈硬化症および肥満治療の興味深い特異的薬剤標的であることが、初めて立証された。理論的考慮に束縛されることは望ましくないが、その役割は、組織／マトリックスリモデリング、分化またはサイトカイン、増殖因子および受容体の放出／修飾にある可能性がある。
【００５５】
実施例２
アッセイ開発
完全マウスＡＤＡＭＴＳ−１ ｃＤＮＡは、精巣上体脂肪組織からクローニングされ、そして哺乳動物発現ベクター（構成性および誘導性発現両方のため）に挿入されている。タンパク質は、天然型、並びに検出および精製を単純にするため、Ｃ末端にエピトープタグ（ＦＬＡＧ）を持つ型両方で発現される。同様に、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１相同体がクローニングされ、そして発現される。ＡＤＡＭＴＳ−１分子の多様な機能ドメインに対する抗体が意図される。
【００５６】
アッセイ：
・ＡＤＡＭＴＳ−１プロテアーゼ活性（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）
・ＡＤＡＭＴＳ−１活性化（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）ＷＨＡＴ
・適切な細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写の活性化
・ＡＤＡＭＴＳ−１／（標的）タンパク質相互作用を監視するディスインテグリンアッセイ
・ペプチドライブラリー技術を介した合成基質の選択
・プロドメイン切断／ＡＤＡＭＴＳ−１活性化のアッセイ
さらなるアッセイ情報は、以下の実施例９に示す。
【００５７】
実施例３
薬剤組成物
以下は、ヒトにおける療法的または予防的使用のための、本明細書に定義するような本発明の方法を通じて調製可能な代表的な薬学的投薬型を例示する（活性成分は「化合物Ｘ」と称する）：
（ａ）錠剤Ｉ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・１８２．７５
クロスカーメロースナトリウム・・・・・・・・・・・・・１２．０
トウモロコシデンプンペースト（５％ ｗ／ｖペースト）・・２．２５
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・３．０
（ｂ）錠剤ＩＩ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５０
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・２２３．７５
クロスカーメロースナトリウム・・・・・・・・・・・・・・６．０
トウモロコシデンプン・・・・・・・・・・・・・・・・・１５．０
ポリビニルピロリドン（５％ ｗ／ｖペースト）・・・・・・２．２５
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・３．０
（ｃ）錠剤ＩＩＩ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．０
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・・９３．２５
クロスカーメロースナトリウム・・・・・・・・・・・・・・４．０
トウモロコシデンプンペースト（５％ ｗ／ｖペースト）・・０．７５
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・１．０
（ｄ）カプセル ｍｇ／カプセル
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・４８８．５
マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．５
（ｅ）注射剤Ｉ （５０ｍｇ／ｍｌ）
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５．０％ ｗ／ｖ
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液・・・・・・・・・・・・・・１５．０％ ｖ／ｖ
０．１Ｍ塩酸
（ｐＨを７．６に調整）
ポリエチレングリコール４００・・・・・・・・・・・・・４．５％ ｗ／ｖ
注射用水１００％まで
（ｆ）注射剤ＩＩ （１０ｍｇ／ｍｌ）
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．０％ ｗ／ｖ
リン酸ナトリウムＢＰ・・・・・・・・・・・・・・・・・３．６％ ｗ／ｖ
０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液・・・・・・・・・・・・１５．０％ ｖ／ｖ
注射用水１００％まで
（ｇ）注射剤ＩＩＩ （１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ６に緩衝）
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１％ ｗ／ｖ
リン酸ナトリウムＢＰ・・・・・・・・・・・・・・・・２．２６％ ｗ／ｖ
クエン酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．３８％ ｗ／ｖ
ポリエチレングリコール４００・・・・・・・・・・・・３．５％ ｗ／ｖ
注射用水１００％まで
（ｈ）エアロゾルＩ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０．０
トリオレイン酸ソルビタン・・・・・・・・・・・・・・・１３．５
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・９１０．０
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・４９０．０
（ｉ）エアロゾルＩＩ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．２
トリオレイン酸ソルビタン・・・・・・・・・・・・・・・・０．２７
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・・７０．０
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・２８０．０
ジクロロテトラフルオロエタン・・・・・・・・・・・１０９４．０
（ｊ）エアロゾルＩＩＩ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．５
トリオレイン酸ソルビタン・・・・・・・・・・・・・・・・３．３８
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・・６７．５
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・１０８６．０
ジクロロテトラフルオロエタン・・・・・・・・・・・・１９１．６
（ｋ）エアロゾルＩＶ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．５
ダイズレシチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．７
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・・６７．５
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・１０８６．０
ジクロロテトラフルオロエタン・・・・・・・・・・・・１９１．６
（ｌ）軟膏 ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４０ｍｇ
エタノール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３００μｌ
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３００μｌ
１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン・・・・・・・５０μｌ
プロピレングリコール・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｍｌまで
注
上記処方は、薬学業に公知の慣用法によって得ることが可能である。錠剤（ａ）−（ｃ）は、慣用的手段、例えば酢酸フタル酸セルロースコーティングを提供することによって腸溶コーティングすることが可能である。エアロゾル処方（ｈ）−（ｋ）は、標準的計量用量エアロゾルディスペンサーと組み合わせて使用し、そして懸濁剤、トリオレイン酸ソルビタンおよびダイズレシチンを、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ポリグリセロールオレエートまたはオレイン酸などの別の懸濁剤によって置き換えることが可能である。
【００５８】
実施例４
リアルタイムＰＣＲ、プライマーおよびプローブ
マウスＡＤＡＭＴＳ−１、第１組
【００５９】
【表２】
【００６０】
マウスＡＤＡＭＴＳ−１、第２組
【００６１】
【表３】
【００６２】
ヒトＡＤＡＭＴＳ−１
【００６３】
【表４】
【００６４】
実施例５
免疫組織化学
以下のパラフィン包埋ヒト材料を用いた。若い男性由来の脂肪線条（Ｉ型）および中程度／進行大動脈斑（ＩＩＩ−ＩＶ型）を用いた（シャルグレンスカ病院、病理学部門提供）。冠動脈は、年齢４０−８５歳の間の女性由来であった。切片は、エオジンおよびヘマトキシリンで染色し（Ｃｏｏｋ １９７４）、アテローム性動脈硬化症の構造および度合いの概観を得た。
【００６５】
平滑筋細胞の存在を研究するため、α−アクチンに対する商業的マウスモノクローナル抗体を、１：５０で用いた（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ｌａｂｓ）。ＨＡＭ−５６に対する別の商業的マウスモノクローナル抗体（Ｄａｃｏ）を、１：５０−１：１００希釈で用いて、マクロファージおよびおそらく泡沫細胞を同定した。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１スペーサードメイン由来の同一配列に対して作成した２つのウサギ抗体を評価した。どちらも同様の結果を生じた。ＡＤＡＭＴＳ−１ペプチドでの前吸収を対照として用いた。
【００６６】
免疫組織化学は、Ｄａｃｏの免疫染色装置、Ｔｅｃｈｍａｔｅで行った。一次抗体は、切片上で１２時間２５分間インキュベーションし、その後、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＲＢＳ）中の洗浄工程が続いた。二次抗体は、ＡＤＡＭＴＳ−１では、１：２５００希釈したロバ抗ウサギビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）、そしてＨＡＭ−５６およびα−アクチンでは、１：１０００希釈したロバ抗マウスビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）であった。二次抗体は切片上で１時間インキュベーションし、その後、洗浄工程が続いた。内因性ペルオキシダーゼ活性の遮断は、ＨＰ−遮断用のＤａｃｏのキットを用いて、３ｘ２．５分間行った。さらなる洗浄工程後、ＨＲＰを切片上で３０分間インキュベーションし、洗浄して、そして最後に抗原−抗体複合体を、Ｄａｃｏに供給されるＥＡＣ色素原キット、３ｘ７分間によって、視覚化した。切片を洗浄し、ヘマトキシリン中で対比染色し、洗浄し、そしてカイザーのゼラチングリセリン中でマウントした。すべての切片は、ＺｅｉｓｓまたはＯｌｙｍｐｕｓ光学顕微鏡中で調べた。
【００６７】
実施例６
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＡｐｏＥ／ＬＤＬ受容体欠損マウス由来のパラフィン包埋大動脈を本研究に用いた。調べた組織には病変は存在しなかった。マウスＡＤＡＭＴＳ−１に対する３５Ｓ放射標識５００塩基対リボプローブを生成し、そして本研究に用いた。
【００６８】
実施例７
プロテオグリカンの消化
ヒト大動脈平滑筋細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）から購入し、そして供給者にしたがって培養した。総プロテオグリカン集団（総ＰＧ）の調製のため、ＡｏＳＭＣを、ＳｍＢＭ２培地中、３０００細胞／ｃｍ２で蒔いた（４ｘ８０ｃｍ２フラスコ）。５日後、ダルベッコのＰＢＳで細胞を洗浄し、そしてＦＢＳを含むＢＭＥ−二倍体培地を細胞に添加した。１日後、ＦＢＳを含まず、３５Ｓ−サルフェート３３μＣｉ／ｍｌおよび３Ｈ−ロイシン１７μＣｉ／ｍｌを含有する、１５ｍｌ／瓶の新鮮なＤＭＥ−二倍体培地を添加し、そして３日間インキュベーションした。培地を移し、そして８Ｍ尿素、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を含有する結合緩衝液に対して４８時間透析し、そしてあらかじめ平衡化したＨｉ−Ｔｒａｐ Ｑカラムに適用した。２５ｍｌの溶出緩衝液Ａ（結合緩衝液＋０．２５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄した後、プロテオグリカン集団を直線塩勾配で溶出する：結合緩衝液中の０．２５−３Ｍ ＮａＣｌ。各分画の総カウントは、液体シンチレーション計測によってカウントした。ＰＧを含有する分画をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥し、そして使用するまで−２０℃で保存した（「総ＰＧ」）。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィーによる分離は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０を用いて行った。総ＰＧ試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、４ＭグアニジニウムＨＣｌに溶解し、そして流速０．５ｍｌ／分であらかじめ平衡化したカラム上に装填した。１ｍｌ分画を収集し、そして各分画に関して３５Ｓを測定した。
【００７０】
実施例８
ＴＨＰ−１細胞におけるｈＡＤＡＭＴＳ−１の発現
ＴＨＰ−１細胞は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）は、エタノールに溶解し、そして最終濃度１６０ｎＭに培地で希釈した。ＬＤＬはＰＢＳ中で平衡化し、そして４００μｇ／ｍｌに希釈し、そして１０μＭ ＣｕＳＯ４で、３７℃で２．５時間酸化した。穏やかに酸化したＬＤＬをＲＰＭＩ１６４０中で平衡化し、そしてフィルター滅菌した。
【００７１】
ＴＨＰ−１細胞は、ＰＭＡを含有する培地中で、０、２、４、８、および８＋１日間培養した。別の組のプレートを、最後の日に穏やかに酸化したＬＤＬもまた含み、ＰＭＡと８＋１日間インキュベーションした。ＲＮＡを抽出し、そしてリアルタイムＰＣＲによってＡＤＡＭＴＳ−１メッセージを解析した。
【００７２】
実施例９
アッセイ開発
完全マウスＡＤＡＭＴＳ−１ ｃＤＮＡは、精巣上体脂肪組織からクローニングされ、そして哺乳動物発現ベクター（構成性および誘導性発現両方のため）に挿入されている。タンパク質は、天然型で発現される。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１相同体は、天然型、並びに検出および精製を単純にするため、Ｃ末端に切断可能エピトープタグ（ｈｉｓ６）を持つ型両方でクローニングされ、そして発現されている。マウスおよびヒト両方のＡＤＡＭＴＳ−１分子の多様な機能ドメインに対する抗体が生成されている。
【００７３】
適切なアッセイの例：
・ＡＤＡＭＴＳ−１プロテアーゼ活性（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）
・ＡＤＡＭＴＳ−１活性化（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）
・適切な細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写の活性化
・ＡＤＡＭＴＳ−１／（標的）タンパク質相互作用を監視するディスインテグリンアッセイ
・高処理スクリーニングのためのペプチド基質の選択。全長または組換えメタロプロテアーゼドメインを用いて、化合物をスクリーニングすることが可能である。現在、我々は、プロテオグリカン・アグリカン上の公表された切断部位由来の３８アミノ酸ペプチドを有し、これは高処理スクリーニングに適した基質として使用可能である。組換えＡＤＡＭＴＳ−１による該ペプチドの切断は、ＨＰＬＣ解析によって確認している。該ペプチドを蛍光マーカーで標識し、ＦＲＥＴ／消光型アッセイによってスクリーニングすることが可能である。あるいは、該ペプチドを一端で標識し、そして他端でプレートまたはビーズに固定し、そして標識切断産物の放出によって、切断を監視することが可能である。ペプチド配列：ＴＳＥＬＶＥＧＶＴＥＰＴＶＳＱＥ＾ＬＧＱＲＰＰＶＴＹＴＰＱＬＦＥＳＳＧＥＡＳＣ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２５：（＾はＡＤＡＭＴＳ−１による切断部位を示す）
・プロドメイン切断／ＡＤＡＭＴＳ−１活性化のアッセイ
・マトリックスコーティングフィルターを渡る大動脈平滑筋細胞の遊走のような、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を測定する、細胞遊走アッセイを確立中である。外因性組換えＡＤＡＭＴＳ−１の影響を試験して、より高いレベルのプロテアーゼが遊走に影響を与えることが可能であるかどうか決定されるであろう。化合物が入手可能になったとき、これらを試験して、減少したプロテアーゼ活性が活性に影響を及ぼすことが可能であるかどうか決定されるであろう。
【００７４】
実施例１０
ＡＤＡＭＴＳ−１：アテローム性動脈硬化症におけるプロテアーゼの役割
ヒト大動脈において、ＡＤＡＭＴＳ−１は、通常、中膜において、免疫組織化学によって、かろうじて検出可能であるレベルで発現されるが、初期脂肪線条の泡沫様および平滑筋細胞では、そしてＩＩＩ−ＩＶ型病変の基部のマトリックス様コアでは、実質的により高いレベルで発現される（図６、７）。ＡＤＡＭＴＳ−１抗体での染色は、平滑筋細胞（□−アクチン）染色と共局在する（図６ａ、ｄおよび７ａ、ｄ）。初期脂肪線条において、ＡＤＡＭＴＳ−１染色はまた、マクロファージマーカー、ＨＡＭ−５６で観察される染色とも共局在する（図６ａ、ｃ）。抗体を生成するのに用いたペプチドでの前吸収は、ＡＤＡＭＴＳ−１抗体を用いた染色の大部分を除去した（図６ｂ、７ｂ）。ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージが剪断ストレス下のヒト臍静脈内皮細胞および心臓微小血管内皮細胞において、実質的に上方制御されることもまた観察されてきており、これは、流動依存血管リモデリングにおける潜在的な役割を示唆する（Ｂｏｎｇｒａｚｉｏら、２０００）。さらに、ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＬＤＬ受容体／ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈斑において、検出される。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験によって、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージが、通常、ＬＤＬ受容体／ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈中膜（平滑筋層）および内皮細胞両方に発現されることが示唆され、これは、両細胞種がＡＤＡＭＴＳ−１を産生可能であることを示唆する（図８）。メッセージレベルは低い；が、病変を含まない大動脈の切片に対して染色を行った。ヒト単球／マクロファージ様細胞株（ＴＨＰ−１細胞）を用いた実験では、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージは、リアルタイムＰＣＲによって測定されるように、単球のマクロファージへの成熟を誘導することが知られる試薬、ＰＭＡで誘導される（図９）。穏やかに酸化されたＬＤＬへの曝露は、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージのレベルを有意に変化させなかった。
【００７５】
ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＧＡＧ部分（コンドロイチン硫酸）を含有するプロテオグリカンであるアグリカンを切断可能であり；欠失実験によって、アグリカンの切断には、コンドロイチン硫酸ドメインへの結合が必要であることが示唆される（Ｉｏｚｚｏ、１９９８；Ｋｕｎｏら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９）。さらに、ＡＤＡＭＴＳ−１は、同一遺伝子ファミリーに属する別のプロテオグリカン、バーシカンを切断可能であり、バーシカンは、アテローム性動脈硬化病変において、主にＶＳＭＣによって高レベルで発現される（Ｅｖａｎｋｏら、１９９８；Ｓａｎｄｙら、２００１）。図１０を参照されたい。総プロテオグリカンを、初代大動脈平滑筋細胞から単離し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーによる分離前に、ＡＤＡＭＴＳ−１を含み、または含まず、インキュベーションした。ＡＤＡＭＴＳ−１の存在下で、主にバーシカンで構成される、大きいプロテオグリカン集団のサイズが減少し、そしてより小さいサイズのプロテオグリカン集団に対応するピークのサイズが増加することから、ＡＤＡＭＴＳ−１がバーシカンを切断し、そしてそのサイズを減少させることが可能であると示される。
【００７６】
中膜層に隣接する、ＩＩＩ−ＩＶ型斑の基部でのＡＤＡＭＴＳ−１の局在は、ＡＤＡＭＴＳ−１が血管壁から病変へのＶＳＭＣの遊走を促進するのに役割を果たしている可能性を示唆する。ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージに関するリアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）解析は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、集密細胞に比較して、増殖中の初代大動脈ＶＳＭＣで、該メッセージが、より高いレベルで発現されることを示し、これは、アテローム性動脈硬化症において、ＳＭＣ遊走を促進する際のその潜在的な役割と一致する（図１１）。興味深いことに、動脈平滑筋および内皮細胞両方によって発現され、そして核にターゲティングした際、分裂促進性であることが知られるホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質は、骨において、ＡＤＡＭＴＳ−１の発現を誘導可能である（Ｍｉｌｅｓら、２０００；Ｍａｓｓｆｅｌｄｅｒら、１９９７）。ＡＤＡＭＴＳファミリーの線虫メンバー、ｇｏｎ−１は、おそらく基底膜構成要素を修飾することによって、生殖腺形態形成中、遠位先端細胞の遊走に必須の役割を果たしていることが示されている（Ｂｌｅｌｌｏｃｋら、１９９９；ＢｌｅｌｌｏｃｋおよびＫｉｍｂｌｅ、１９９９）。野生型導入遺伝子は、突然変異表現型を救出可能であるが、プロテアーゼ欠損突然変異体はこれを救出不能であるため、正常遠位先端細胞遊走および生殖腺発生には、プロテアーゼ活性が必須である。線虫には、アグリカンまたはバーシカンの相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）が存在しないが、ＧＯＮ−１の基質である可能性がある、いくつかの性質決定されていないコンドロイチン硫酸プロテオグリカンがある。さらに、アグリカンおよびバーシカンはどちらも、トリ神経冠遊走に役割を有することが示されている（Ｐｅｒｉｓｓｉｎｏｔｔｏら、２０００）。我々は、アテローム発生におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割をさらに調べる計画の一部として、ＡＤＡＭＴＳ−１の導入遺伝子を過剰発現するマウスを生成した。
【００７７】
正常大動脈血管を通じた横断切片において、細胞およびマトリックスの別個の層が観察される。バーシカンは、テネイシンおよびヒアルロン酸などの他のＥＣＭタンパク質、並びに細胞表面糖タンパク質（例えばＶＳＭＣ上に検出されるＣＤ−４４様タンパク質）に結合し、そして軟骨中のアグリカンによく似た、膨張可能であるが弾力性がある、水和凝集物を形成可能である（Ｈｕｒｔ−Ｃａｍｅｊｏ、１９９９）。ＶＳＭＣは、このプロテオグリカン／ＥＣＭリッチな環境を要する可能性があるが、後者はまた、移動を妨げる物理的障壁としても作用する可能性がある。正常大動脈または血管において、ＶＳＭＣは、よく線引きされた中膜層にとどまることを好む；しかし疾患組織では、内膜内に遊走する。ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＶＳＭＣによる浸潤に対して、内膜をより「許容性」にするのに関与している可能性がある。さらに、プロテオグリカンの切断は、増殖因子およびサイトカインの放出を導き、中膜から内膜へのＳＭＣ遊走を促進する可能性がある。
参考文献
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Ｓｈｉｎｄｏ， Ｔ．， Ｋｕｒｉｈａｒａ， Ｈ．， Ｋｕｎｏ， Ｋ．， Ｙｏｋｏｈａｍａ， Ｈ．， Ｗａｄａ Ｔ．， Ｋｕｒｉｈａｒａ， Ｙ．， Ｉｍａｉ Ｙ．， Ｏｇａｔａ， Ｍ．， Ｎｉｓｈｉｍａｔｓｕ， Ｈ．， Ｍｏｒｉｙａｍａ， Ｎ．， Ｏｈ−ｈａｓｈｉ， Ｙ．， Ｍｏｒｉｔａ， Ｈ．， Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｔ．， Ｎａｇａｉ， Ｒ．， Ｙａｚａｋｉ， Ｙ．およびＭａｔｓｕｓｈｉｍａ， Ｋ．（２０００） ＡＤＡＭＴＳ−１：正常増殖、受胎能、、並びに器官形態および機能に必須のメタロプロテイナーゼ−ディスインテグリン． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０５， １３４５−１３５２．
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【図面の簡単な説明】
【図１】やせたマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、およびロシグリタゾンで処置したｏｂ／ｏｂマウスを比較する、リアルタイムＰＣＲ。
やせたマウス（１ａ）、未処置ｏｂ／ｏｂマウス（ｂ）およびロシグリタゾンで７日間処置したｏｂ／ｏｂマウス（ｃ）由来の腸間膜脂肪におけるＡＤＡＭＴＳ−１発現の比較（群あたり５動物）。ＡＤＡＭＴＳ−１ ｍＲＮＡレベルは、やせた（−／ｏｂ）動物（ｂ）と比較して、肥満（ｏｂ／ｏｂ）動物（ａ）で有意に上昇する。ロシグリタゾンでの処置は、肥満マウスにおける発現を、やせた動物で見られるレベル近くまで減少させる（ｃ）。
【図２】ロシグリタゾンで処置したマウスの精巣上体脂肪のリアルタイムＰＣＲ解析。
毎日ロシグリタゾンで処置した、時間経過研究（群あたり３動物）。第０日、第１日、第３日、および第７日に、精巣上体脂肪におけるＡＤＡＭＴＳ−１発現のリアルタイムＰＣＲ定量化を行った。ロシグリタゾンをｏｂ／ｏｂマウスに最初に投与した後、精巣上体脂肪における発現レベルが実質的に減少し、そして７日間の期間に渡って、さらに減少する。ＡＤＡＭＴＳ−１の下方制御は、血漿グルコースおよびトリグリセリドに対する影響に先行し、これらは、ロシグリタゾンの最初の投与によっては低下しない。
【図３】多様な組織のリアルタイムＰＣＲ解析。
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、やせたマウスにおけるメッセージレベルを比較する、ＡＤＡＭＴＳ−１発現レベルの解析は、マウスＡＤＡＭＴＳ−１の組織分布を示す。３動物からプールしたｃＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ定量化を、内部対照（リボソームタンパク質３６Ｂ４）に対して規準化した。肥満動物において、いくつかの組織で発現が上方制御される。腸間膜脂肪に加え、上方制御は、肝臓、肺で、最も顕著であり、そして大動脈で顕著である。
【図４】処置マウスの多様な組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベル。
ロシグリタゾンで７日間処置したマウスの多様な組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベルは、やせたマウス（ａ）、未処置ｏｂ／ｏｂマウス（ｂ）およびロシグリタゾンで７日間処置したｏｂ／ｏｂマウス（ｃ）由来の多様な組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１発現の比較を示す（群あたり５動物）。各群の組織は、左から右の順に以下のとおりであった：骨髄；肝臓；四頭筋；白色脂肪；および褐色脂肪。
【図５】多様なヒト組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１レベル
内部対照（リボソームタンパク質３６Ｂ４）に対して規準化した、数人の個体からプールしたｃＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ定量化は、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１の組織分布を示す。ＡＤＡＭＴＳ−１発現は、大部分の他の組織より、心臓で有意により高く、特に大動脈で、より高い。
【図６】Ｉ型大動脈病変の免疫組織化学。
初期脂肪線条（Ｉ型病変）におけるＡＤＡＭＴＳ−１、α−アクチン、およびマクロファージに対する抗体での免疫組織化学。Ａ．ＡＤＡＭＴＳ−１標識が、泡沫様細胞（矢印）および平滑筋細胞に見られる。Ｂ．前吸収対照。Ｃ．マクロファージ様免疫反応性（ＨＡＭ−５６）。いくつかの染色は、ＡＤＡＭＴＳ−１染色と共局在する（矢印）。Ｄ．平滑筋標識（□−アクチン）。
【図７】免疫組織化学。
大動脈（Ａ）または冠動脈（Ｂ−Ｅ）中の進行斑（ＩＩＩ−ＩＶ型）におけるヒトＡＤＡＭＴＳ−１、α−アクチン、およびマクロファージに対する抗体での免疫組織化学。Ａ．大動脈斑の基部のマトリックス様コアに、ＡＤＡＭＴＳ−１様免疫反応性が見られる（矢印）。Ｂ．中膜近く、斑の基部のＡＤＡＭＴＳ−１様免疫反応性（矢印）。Ｃ．ＡＤＡＭＴＳ−１染色に対する前吸収抗体対照。Ｄ．マクロファージ（ＨＡＭ−５６）標識。Ｅ．中膜平滑筋細胞および斑基部に、アクチン様免疫反応性が見られる。矢印は、染色がＡＤＡＭＴＳ−１と共局在することを示す。
【図８】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。
ＡｐｏＥ／ＬＤＬ受容体欠損マウスの大動脈におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージに関するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。染色が、内皮および平滑筋細胞層両方に観察されることに注目されたい（矢印）。６０Ｘ。
【図９】ＴＨＰ−１細胞におけるｈＡＤＡＭＴＳ−１の発現。
第０日、第２日、第４日、第８日、８日＋２４時間（８日＋２４時間、穏やかに酸化したＬＤＬと）の、ＰＭＡで処置したＴＨＰ−１細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベルに関するリアルタイムＰＣＲ解析。
【図１０】ＡＳＭＣ由来のプロテオグリカンのサイズ排除クロマトグラフィー。
Ａ．３５Ｓおよび３Ｈと培養した初代大動脈平滑筋細胞に分泌される総プロテオグリカンの解析。サイズ排除クロマトグラフィーによって、サイズにしたがって、２つのプロテオグリカン集団が分離可能である。大きいプロテオグリカン集団は、主にバーシカンで構成される。Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィーによって分離する前に、総プロテオグリカン集団をＡＤＡＭＴＳ−１とインキュベーションすると、大きいプロテオグリカンピークのサイズが減少し、そしてより小さいプロテオグリカン集団のサイズが増加する。
【図１１】大動脈ＳＭＣのリアルタイムＰＣＲ解析。
Ｂ）休止集密ヒト大動脈平滑筋細胞に比較した、Ａ）増殖中の初代ヒト大動脈平滑筋細胞における、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベルに関するリアルタイムＰＣＲ解析。
方法
本発明は、メタロプロテイナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−１（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ））が、肥満、アテローム性動脈硬化症、インスリン耐性症候群およびインスリン非依存性糖尿病と関連するという発見に基づく。
【０００２】
現在までに３０のメンバーを含有するメタロプロテイナーゼのＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ファミリーが、酵母からヒトに渡る生物で同定されてきている（Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇら、１９９８；Ｂｌｏｂｅｌ、１９９７；Ｔａｎｇ、２００１）。これらは保存されたドメイン構造を有する。ＡＤＡＭ類は、細胞表面分子の分断、並びに細胞およびマトリックスタンパク質への接着などの、多様な生物学的過程に関連付けられてきている。例えば、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ／ＴＮＦα変換酵素）は、ＴＮＦαの膜結合型を切断してそして遊離させ；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）酵素クズバニアン（ｋｕｚｂａｎｉａｎ）およびその哺乳動物相同体（ＡＤＡＭ１０）は、膜貫通受容体ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）の細胞外ドメインを切断することが示されてきている。ＡＤＡＭ１および２（ファーティリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）αおよびβ）は、受精中の精子−卵融合に必須であることが示されてきている。これらはまた、癌転移および炎症などの病的事象において、役割を果たしている可能性があることも示されてきている。
【０００３】
過去４年以内に、ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジン１型モチーフを持つディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｌｉｋｅ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｔｙｐｅ １ ｍｏｔｉｆ））として知られる、ＡＤＡＭ関連タンパク質の新規サブセットが同定されてきた；現在までに約１０の既知のメンバーがあり、このうち半数は既知の機能を持たない。ＡＤＡＭＴＳは、膜貫通ドメインを欠き、そして多様な数のトロンボスポンジンＩ型（ＴＳＰ−１）反復が存在する点で、先に知られるＡＤＡＭと異なる。第一のメンバー、ＡＤＡＭＴＳ−１は、マウス悪液質結腸亜系統からクローニングされ、そしてＩＬ−１によって誘導可能であると示されたことから、炎症関連遺伝子としての役割が示唆された（Ｋｕｎｏら、１９９７）。ＡＤＡＭＴＳ−１はまた、マウスにおいて、リポ多糖（ＬＰＳ）の静脈内投与によって、腎臓および心臓で上方制御されることも見出され、炎症反応中に該遺伝子が誘導される可能性があることが再び示唆された（Ｋｕｎｏら、１９９７；１９９８）。該タンパク質は、分泌され、そしてトロンボスポンジンおよびスペーサードメインを介して、細胞外マトリックスおよびヘパリンに結合する（Ｋｕｎｏら、１９９９）。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１は、トロンボスポンジン−１の抗血管新生１型反復を含有するタンパク質に関して検索した別のグループによって同定され、このグループは、ＭＥＴＨ−１と名づけた；ＴＳＰ−１反復は、観察された強力な抗血管新生特性に必要であることが示された（Ｖａｚｑｕｅｚら、１９９９）。ＭＥＴＨ−１はまた、ＷＯ ９９／３７６６０およびＷＯ ００／７１５７７（Ｉｒｕｌｅａ−Ａｒｉｓｐｅら）にも記載されている。系統発生的には、ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＡＤＡＭＴＳ−４およびＡＤＡＭＴＳ−８と最も相同性を有する。
【０００４】
ＡＤＡＭＴＳ−１欠損マウスが生成されてきており；これらは生存可能であるが、成長遅延、メス受胎能障害、および腎臓の欠陥を示す（Ｓｈｉｎｄｏら、２０００）。腎臓欠陥は、正常マウスの胚腎臓における高レベルの発現と一致する；しかし、成体においては、メッセージレベルは有意に減少する（ＭＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｖａｚｑｕｅｚ、１９９９）。線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーであるＧｏｎ−１突然変異体が生成されてきており；これらは生殖腺発生に重度の欠陥を示す（ＢｌｅｌｌｏｃｋおよびＫｉｍｂｌｅ、１９９９）。ＡＤＡＭＴＳ欠損マウスおよび線虫において、目立った表現型が観察されることから、このファミリーの少なくともいくつかのメンバーが、発生中の細胞遊走／リモデリングにおいて、ある特定のそして非重複性の役割を有することが示唆される。これは、驚くほど穏やかな表現型を示す、多くのメタロプロテアーゼ欠損に関して観察されるものと対照的である。肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１−／−遺伝子型の影響は、調べられていない。
【０００５】
ＥＰ ８７４ ０５０（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ／ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）は、該出願中ではインテグリンリガンドＩＴＧＬ−ＴＳＰと称される、マウスＡＤＡＭＴＳ−１のヒト類似体に関する。ＡＤＡＭＴＳ−１と関連すると言及される徴候は、血管形成性疾患（癌、癌転移、慢性炎症性障害、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、筋変性、糖尿病網膜症）、再狭窄、アルツハイマー病および組織リモデリングに限定される。
【０００６】
ＫｕｎｏのグループからのＷＯ ９８／５５６４３（呉羽化学工業）は、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、並びに、例えば慢性関節リウマチ、肝炎、腎炎、クローン病、喘息およびＡＲＤＳなどの炎症性疾患を治療するための、白血球および血小板血算を減少させ、そして赤血球血算を増加させる剤としてのその使用を含む。
【０００７】
最近、遺伝子ターゲティングによって、ＡＤＡＭＴＳ−１−／−マウスが生成された。これらのマウスは、ヒト腎盂尿管接合部閉塞に似た、腎表現型を示す。肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１−／−遺伝子型の影響は、調べられていない。
【０００８】
現在、疾患におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割に関して知られる情報の度合いは限られており、そして一般的に推測的である。したがって、疾患におけるＡＤＡＭＴＳ−１の特定の機能をよりよく理解する必要がある。さらに、肥満、アテローム性動脈硬化症、ＩＲＳおよびＮＩＤＤＭの重要な疾患の根底にある生理機能の性質をよりよく理解する必要がある。既知の当該技術分野のいずれも、ＡＤＡＭＴＳ−１自体の発現の特定のレベルおよび肥満、アテローム性動脈硬化症またはＩＲＳの間の関連、あるいはＡＤＡＭＴＳ−１の発現レベルまたは活性を特異的に変調することによって、これらの異常を防止するかまたは治療する可能性に言及しない。
【０００９】
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１が、肥満、アテローム性動脈硬化症、インスリン耐性症候群およびインスリン非依存性糖尿病に特異的に関連するという発見に基づく。
【００１０】
本発明の１つの側面にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症から独立に選択される疾患を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調可能な化合物の使用を提供する。好ましい使用は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に減少させることが可能な化合物のものである。別の態様において、好ましい使用は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に増加させることが可能な化合物のものである。本発明の別の態様は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に減少させることが可能な化合物の使用である。本発明の別の態様は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に増加させることが可能な化合物のものである。
【００１１】
用語「ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調可能な化合物」は、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症に関連する、化合物の主な薬学的活性が、ＡＤＡＭＴＳ−１に対するその影響に依存することを意味する。例えば、ロシグリタゾンなどのチアゾリジノン化合物は、これらがＰＰＡＲ−γを通じた重要な薬学的活性を有するため、この定義の範囲外に属する。Ｗｉｌｌｓｏｎら（２０００）， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ４３， ５２７−５５０を参照されたい。
【００１２】
特に、ＡＤＡＭＴＳ−１の量を特異的に変調可能な化合物は、ＡＤＡＭＴＳ−１遺伝子またはその発現；ＡＤＡＭＴＳ−１ ｍＲＮＡ、その代謝回転、プロセシング、分解または安定性；あるいはＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質、その代謝回転、プロセシング、分解、または安定性に直接影響を与えることによって、ＡＤＡＭＴＳ−１の量を変調する化合物を指す。
【００１３】
特に、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に変調可能な化合物は、ＡＤＡＭ１７（ＴＮＦ−□変換酵素、ＴＡＣＥ）、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−１４（膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ）、ＭＭＰ−１９（リウマトイド関連関節炎関連ＭＭＰ）およびＰＰＡＲの活性を有意に変調することなく、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を変調する化合物を指す。しかし、例えばアグリカナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ−４またはＡＤＡＭＴＳ−５などの、他のＡＤＡＭＴＳ類のいくつかに影響を有する化合物は、この定義内に属するであろうと予期される。理論的考慮に束縛されることは望ましくないが、いくつかの他のタンパク質、例えばアグリカナーゼに影響を有することは、有益でさえある可能性がある。
【００１４】
ＡＤＡＭＴＳ−１に対する化合物の活性自体は、本明細書に例示される酵素アッセイによって測定されるような、ＡＤＡＭＴＳ−１酵素活性に対する直接の影響を通じて、測定可能である。
【００１５】
本発明の別の側面にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症の治療に、潜在的に有用な化合物に関するスクリーニング法であって、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調する能力に関する化合物のアッセイを含んでなる、前記方法を提供する。好ましくは、アッセイは：
ｉ）ＡＤＡＭＴＳ−１を発現する細胞株を使用するか、または精製ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を使用する、ＡＤＡＭＴＳ−１活性の測定；および
ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ−１を発現する細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写または翻訳の測定
から独立に選択される。好ましくは、細胞株はマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞である。好ましくは、タンパク質はヒト組換えＡＤＡＭＴＳ−１である。
【００１６】
ヒトＡＤＡＭＴＳ−１のアミノ酸配列は、例えば、ＩＤ ＡＴＳ１＿ＨＵＭＡＮのように、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースから得ることが可能であり、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１をコードするＤＮＡ配列は、例えば、寄託番号ＡＦ１７００８４、ＡＦ０６０１５２、ＡＦ２０７６６４、およびＡＰ００１６９７のように、ＥＭＢＬデータベースから得ることが可能である。マウスＡＤＡＭＴＳ−１のアミノ酸配列は、例えば、ＩＤ ＡＴＳ１＿ＭＯＵＳＥのように、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースから得ることが可能であり、マウスＡＤＡＭＴＳ−１をコードするＤＮＡ配列は、例えば、寄託番号ＡＢ００１７３５およびＤ６７０７６のように、ＥＭＢＬデータベースから得ることが可能である。
【００１７】
本発明の別の側面にしたがって：
ｉ）本明細書に記載する方法にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症の治療に有用と化合物を同定し；そして
ｉｉ）該化合物または薬学的に許容しうるその塩を、薬学的に許容しうる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含んでなる、薬剤組成物調製法を提供する。
【００１８】
本発明の組成物は、経口使用（例えば錠剤、ロゼンジ、硬または軟カプセル、水性または油性懸濁物、エマルジョン、分散性粉末または顆粒、シロップまたはエリキシル剤として）、局所使用（例えばクリーム、軟膏、ゲル、あるいは水性または油性溶液または懸濁物として）、吸入による投与（例えば細分割粉末または液体エアロゾルとして）、吹入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与（例えば細分割粉末として）または非経口投与（例えば静脈内、皮下または筋内投薬のための無菌水性または油性溶液として、あるいは直腸投薬のための座薬として）に適した形であることが可能である。
【００１９】
本発明の組成物は、当該技術分野に公知の、慣用的な薬学的賦形剤を用いた慣用法によって、得ることが可能である。したがって、経口使用に意図される組成物は、例えば、１以上の着色剤、甘味剤、フレーバー剤および／または保存剤を含有することが可能である。
【００２０】
錠剤処方に適した薬学的に許容しうる賦形剤には、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチまたはアルギン酸（ａｌｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などの顆粒化および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなどの保存剤、並びにアスコルビン酸などの酸化防止剤が含まれる。錠剤処方は、未コーティングでもよいし、あるいは崩壊およびそれに続く胃腸管内での活性成分の吸収を修飾するため、または安定性および／または外見を改善するため、いずれの場合も慣用的なコーティング剤および当該技術分野に公知の方法を用いて、コーティングしてもよい。
【００２１】
経口使用のための組成物は、活性成分を不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合する硬ゼラチンカプセルの形であるか、あるいは活性成分を、水またはピーナツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などの油と混合する軟ゼラチンカプセルとして使用することが可能である。
【００２２】
水性懸濁物は、一般的に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴムなどの、１以上の懸濁剤；レシチン、あるいはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合産物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合産物、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合産物、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトール由来の部分エステルの縮合産物などの、分散または湿潤剤と共に、細かく粉末化した形の活性成分を含有する。水性懸濁物はまた、１以上の保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、着色剤、フレーバー剤、および／または甘味剤（スクロース、サッカリンまたはアスパルテームなど）も含有することが可能である。
【００２３】
油性懸濁物は、植物油（ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナツ油など）中、またはミネラルオイル（流動パラフィンなど）中に活性成分を懸濁することによって、処方可能である。油性懸濁物はまた、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの粘稠化剤も含有することが可能である。上に示したような甘味剤、およびフレーバー剤を添加して、口当たりがよい経口調製を提供することが可能である。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって、保存することが可能である。
【００２４】
水の添加による水性懸濁物の調製に適した分散性粉末および顆粒は、一般的に、活性成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１以上の保存剤と共に含有する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上に言及したものによって例示される。甘味剤、フレーバー剤および着色剤などのさらなる賦形剤もまた、存在することが可能である。
【００２５】
本発明の薬剤組成物はまた、水中油エマルジョンの形であることも可能である。油性相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油などの植物油、または例えば流動パラフィンなどのミネラルオイル、あるいはこれらのいずれかの混合物であることが可能である。適切な乳化剤は、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然存在ゴム、ダイズ（ｓｏｙａ ｂｅａｎ）レシチンなどの天然存在ホスファチド、脂肪酸および無水ヘキシトール由来のエステルまたは部分エステル（例えばモノオレイン酸ソルビタン）並びにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの、前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合産物であることが可能である。エマルジョンはまた、甘味剤、フレーバー剤および保存剤も含有することが可能である。
【００２６】
シロップおよびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースなどの甘味剤と共に処方することが可能であるし、そしてまた、粘滑剤、保存剤、フレーバー剤および／または着色剤も含有することが可能である。
【００２７】
薬剤組成物はまた、上に言及した、１以上の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、既知の方法にしたがって処方可能である、無菌注射可能水性または油性懸濁物の形であることも可能である。無菌注射可能調製はまた、非毒性非経口性の許容しうる希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または懸濁物、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であることが可能である。
【００２８】
座薬処方は、通常の温度では固体であるが、直腸温度では液体であり、そしてしたがって、直腸中で融解して薬剤を放出するであろう、適切な非刺激性賦形剤と、活性成分を混合することによって調製可能である。適切な賦形剤には、例えばカカオバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【００２９】
クリーム、軟膏、ゲルおよび水性または油性溶液または懸濁物などの局所処方は、一般的に、活性成分を、局所に許容しうる慣用的なビヒクルまたは希釈剤と、当該技術分野に公知の慣用法を用いて処方することによって、得ることが可能である。
【００３０】
吹入による投与のための組成物は、例えば３０μまたはそれよりはるかに小さい平均直径を持つ粒子を含有する、細分割粉末の形であることが可能であり、粉末自体が、活性成分を単独で、またはラクトースなどの１以上の生理学的に許容しうるキャリアーで希釈して含んでなることが可能である。その後、吹入用の粉末を、既知の剤、クロモグリク酸ナトリウムの吹入に使用されるように、ターボ吸入装置で使用するため、例えば１から５０ｍｇの活性成分を含有するカプセル中に、好適に保持する。
【００３１】
吸入による投与のための組成物は、細分割固体を含有するエアロゾルまたは液体滴いずれかとして、活性成分を分配するよう取り計らった、慣用的な加圧エアロゾルの形であることが可能である。揮発性フッ化炭化水素または炭化水素などの慣用的なエアロゾル噴射剤が使用可能であり、そしてエアロゾル装置は、測定した量の活性成分を分配するよう、好適に準備する。
【００３２】
処方に関するさらなる情報に関しては、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０、第５巻の第２５．２章を参照されたい。
【００３３】
１以上の賦形剤と合わせて、単一投薬型を生じる活性成分の量は、治療する宿主および特定の投与経路に応じて、必然的に多様であろう。例えば、ヒトへの経口投与に意図される処方は、一般的に、例えば、総組成物重量の約５から約９８パーセントの間で変化することが可能な、適切でそして好適な量の賦形剤と共に配合した、０．５ｍｇから２ｇの活性剤を含有するであろう。投薬単位型は、一般的に、約１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分を含有するであろう。投与経路および投薬措置に関するさらなる情報に関しては、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；編集委員長）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０、第５巻の第２５．３章を参照されたい。
【００３４】
化合物の療法または予防目的の用量サイズは、当然、異常の性質および重症度、動物または患者の年齢および性別、並びに投与経路にしたがい、医学の公知の原理にしたがって、多様であろう。
【００３５】
療法または予防目的に化合物を用いる際、必要な場合、分割用量で投与される、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから７５ｍｇの範囲の一日用量が与えられるように、投与されるであろう。一般的に、非経口経路を使用する場合、より低い用量が投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内投与には、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから３０ｍｇの範囲の用量を、一般的に使用するであろう。同様に、吸入による投与には、例えば、ｋｇ体重あたり０．５ｍｇから２５ｍｇの範囲の用量を使用するであろう。しかし、経口投与が好ましい。
【００３６】
図に言及しながら、以下の限定されない実施例に、本発明をさらに記載する。
【００３７】
【実施例】
実施例１
ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割
１．１ 材料および方法
プライマー
【００３８】
【表１】
動物、細胞培養および処置。９週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、３０μｍｏｌ／ｋｇ／日のロシグリタゾンで７日間処置した。薬剤は、胃管栄養法を用いて経口投与した。対照動物にはビヒクル（０．１％ ＤＭＳＯ）を与えた。遺伝的バックグラウンドの変動を減少させるため、オス兄弟対を用いて、一方を薬剤で処置し、そして他方をビヒクルで処置した。動物は、水および通常のマウス固形試料に自由に接近させた。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、１７５ｃｍ２フラスコ中で集密まで増殖させた。その後、２μｇ／ｍｌのデキサメタゾンおよび０．５μＭのメチルイソブチルキサンチンを培地に含ませた。この処置を２週間続けた。これは、該細胞から脂肪細胞への分化を駆動するであろう。デキサメタゾン／メチルイソブチルキサンチンを除去し、そして細胞をその後、１μＭのロシグリタゾンで２４時間処理した。対照細胞もまた、デキサメタゾン／メチルイソブチルキサンチンで処理したが、ロシグリタゾンの代わりにビヒクルで処理した。
【００４０】
組織単離およびＲＮＡ抽出。処置および対照マウスから、肝臓、腸間膜（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉａｌ）脂肪、精巣上体（ｅｐｉｄｉｄｉｍｕｓ）脂肪、褐色脂肪、四頭筋由来の白色線維（四頭筋／白）、四頭筋由来の赤色線維（四頭筋／赤）および心臓を単離した。混入組織、血液および体毛を除去するように注意を払った。動物を殺して２分以内に、すべての組織を除去し、そして液体窒素中で迅速凍結した。組織の重量を測定し、そしてＲＮＡＳＴＡＴ−６０（ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した。Ｔｕｒｒａｘブレンダーを用いて、氷上で１分間、組織をホモジナイズした。供給者のプロトコルにしたがって、総ＲＮＡを抽出した。簡潔には、１００ｍｇまでの組織量に対して、１ｍｌの抽出培地を添加し、そして組織をホモジナイズした。遠心分離によって、有機および水相を分離した。上部の水相を単離し、そして１体積のイソプロパノールでＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡペレットを７５％の氷冷エタノールで洗浄した。ＲＮＡペレットを乾燥させ、そしてＤＥＰＣ処理水に溶解した。３Ｔ３−Ｌ１細胞のＲＮＡ抽出のため、インキュベーション培地を捨て、そしてＲＮＡＳＴＡＴ−６０を添加した。ＲＮＡは上述のように抽出した。残ったＤＮＡを除去するため、総ＲＮＡ調製をＤＮアーゼで処理した。５０μｇのＲＮＡを、最終体積１００μｌ中、１０ｍＭ ＣａＣｌ２；６ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＮａＣｌおよび４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９中で、５Ｕ ＤＮアーゼ（ＲＱ１ ＤＮアーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ）と３７℃でインキュベーションした。１５分後、４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって、反応を停止した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出で、タンパク質を除去した。ＲＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＥＰＣ処理水に再溶解し、そして２６０ｎｍのＯＤ読み取りによって定量化した。１％アガロースゲル上でもまた、ＲＮＡの品質をチェックした。
【００４１】
ディファレンシャルディスプレー。ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．（テネシー州ナッシュビル）の試薬を用いて、ディファレンシャルディスプレーを行った（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９２）。３つの並行反応において、３つの異なるアンカープライマー、Ｈ−Ｔ１１−Ａ、Ｈ−Ｔ１１−ＧおよびＨ−Ｔ１１−Ｃを用いて、総ＲＮＡを逆転写した。反応は２つ組で行った。１３．４μｌの水中、０．２μｇの総ＲＮＡを、１．６μｌの２５０μＭ ｄＮＴＰ；４μｌの５ｘＲＴ緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ８．３、１８８ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＤＴＴ）および２μｌの２μＭアンカープライマーと混合した。試料を、サーモサイクラー中で、６５℃５分間、３７℃６０分間および７５℃５分間インキュベーションした。３７℃で５分間経過後、ＭＭＬＶ逆転写酵素を添加した。生じたｃＤＮＡ、並びに３つのアンカープライマーおよび１０の異なるランダムプライマーの組み合わせを用いて、ＰＣＲをセットアップした。各プライマーの組み合わせに関して、以下の反応をセットアップした。９．２μｌの水；２μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０１％ゼラチン）；１．６μｌの２５μＭ ｄＮＴＰ；２μｌの２μＭアンカープライマー；２μｌのＲＴ反応混合物；０．２５μｌのα−［３３Ｐ］ｄＡＴＰ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌおよび０．２μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。以下の温度周期を用いて、試料をサーモサイクラー中でインキュベーションした。１． ９４℃３０秒間、２． ４０℃２分間、３． ７２℃３０秒間、４． 工程１へ、４０周期、および５． ７２℃５分間。増幅後、３．５μｌのＰＣＲ反応を２μｌの装填色素（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．０９％キシレンシアノールＦＦおよび０．０９％ブロモフェノールブルー）と混合した。尿素を含む６％ ＰＡＧＥ上に装填する直前、試料を８０℃で変性させた。処置および未処置組織／細胞由来の同一のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲを、並べて装填した。より遅く移動するキシレン色素がゲルの底部に達したら、電気泳動を停止した。ゲルをろ紙に移し、そして真空ゲル乾燥装置中で乾燥させた。乾燥ゲルを、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＸＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に対して置くことによって、放射能を検出した。２つ組において、一方の組織から現れるが、他方からは現れないバンドを、メスで乾燥ゲルから切り出すことによって単離した。正しいバンドを切り出したことを確認するため、第二のオートラジオグラフィーフィルムを乾燥ゲルに曝露した。単離したバンドを１００μｌの水中で、１５分間煮沸した。ゲルおよびろ紙を回転して落とし、そして上清を新たな試験管に移した。１点を変更した以外、上述と同一のＰＣＲプロトコルを用いて、単離断片を再増幅した。再増幅中のｄＮＴＰ濃度は２０μＭであった。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で解析した。ＰＣＲが、期待されるサイズの産物を生じたら、該ＰＣＲ反応混合物を、ｐＣＲＴＲＡＰベクター（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）へのＰＣＲ産物の連結に用いた。５μｌの水を、２μｌの直線化ｐＣＲＴＲＡＰ；１μｌの１０ｘ連結緩衝液（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）；２．５μｌのＰＣＲ産物および０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１００Ｕ）と混合した。連結反応は、１６℃で一晩インキュベーションした。１０μｌの連結反応混合物で、１００μｌのＧＨコンピテント細胞（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）を形質転換した。テトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ上に、細菌を蒔いた。３７℃で一晩インキュベーションした後に現れたコロニーを収集し、そして５０μｌの溶解緩衝液（ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ）中、９５℃で１０分間溶解した。ベクター特異的プライマー対（Ｒｇｈ、Ｌｇｈ）でのＰＣＲを用いて、挿入物のサイズをチェックした。１０．２μｌの水を、２μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液；１．６μｌの２５０μＭ ｄＮＴＰ；２μｌの２μＭ Ｌｇｈプライマー；２μｌの２μＭ Ｒｇｈプライマー；０．２μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（１Ｕ）および２μｌのコロニー溶解物と混合した。ＰＣＲは、１． ９４℃３０秒間、２． ５２℃４０秒間、３． ７２℃１分間、４． １へ、４０周期、および５． ７２℃５分間で行った。ＰＣＲ産物を１．５％アガロース上で解析した。一般的に、５つの陽性コロニーを用いて、テトラサイクリンを含むＬＢ培地５ｍｌに接種した。培養は一晩インキュベーションした。細胞を回転して落とし、そしてペレットをＷｉｚａｒｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミドミニプレップに用いた。
【００４２】
ＤＮＡ配列決定。色素ターミネーター周期配列決定用のサーモサイクラーキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と共に、ＲｇｈまたはＬｇｈプライマーを用いて、挿入物を配列決定した。
【００４３】
１．２ 結果
ディファレンシャルディスプレーの成果。逆転写工程において、３つの独立の反応中、３つの異なるアンカープライマーを用いた。これらのプライマーは、ｍＲＮＡの３’端のポリＡテールにハイブリダイズするであろう、ポリＴ部分を有する。最後の塩基は、Ｃ、ＧまたはＡのいずれかである。この方法は、すべてのポリＡ転写物を３つのｃＤＮＡプールに細分する。ｃＤＮＡプールの各々に関して、１０の異なるランダムプライマーを用いて、ＰＣＲをセットアップした。この方法は、ｃＤＮＡプールを、さらに細分し、そして増幅する。この研究に用いるプライマーの組み合わせは、典型的には、およそ１５０断片／プライマー組み合わせを生成する。３つの異なるアンカーおよび１０の異なるランダムプライマーを用いて、各組織に関して、総数４５００断片が生成された。文献では、細胞において、いかなる既定の瞬間にも、１５０００遺伝子が発現されると概算されている（６）。この概算を用いると、各組織中の発現遺伝子の１／３を解析したと推測することが可能である。これは、各遺伝子が１つの断片のみを生成するであろうと仮定するが、これは常にそうとは限らない可能性がある。解析した断片のうち、およそ１５０を、示差的に発現されるものとして検出し、そして単離した。個々の組織において、示差的に発現する７−２３の断片を検出し、平均はおよそ１５であった。これは、発現遺伝子のおよそ０．１％が薬剤処理によって影響を受けたことを示す。示差的に発現された断片の最高数は、褐色脂肪組織で見られ、肝臓、精巣上体脂肪、腸間膜脂肪、四頭筋／白、四頭筋／赤および心臓が続いた。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、マウス中の肝臓と同程度に影響を受けた。これは、ここで調べた組織のうち、褐色脂肪が薬剤処理によって最も影響を受け、一方、心臓が最も影響を受けないことを示す。肝臓および脂肪組織は、筋組織より影響を受ける。
【００４４】
処理によって上方−下方制御される断片が、いくつかの組織で見られた。薬剤処理後、断片の２／３で発現レベルが上方制御され、そして残りの１／３で下方制御された。調べたすべての組織で、上方および下方制御された発現両方が観察された。発現の最高相対上方制御は褐色脂肪で検出され、一方、最高相対下方制御は、心臓で検出された。
【００４５】
バイオインフォマティクス解析。ディファレンシャルディスプレー実験から得た配列を、ＤＮＡデータベースに見られる配列に比較した。ｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いて、ＥＭＢＬ非ＥＳＴ、ＥＭＢＬ ＥＳＴおよびＰａｔｓｅｑを検索した。ＥＭＢＬ非ＥＳＴデータベース中の１０−１０未満のＰ（Ｎ）値のヒットを用いて、断片を同定した。他の哺乳動物（マウス以外）のヒットは、ディファレンシャルディスプレー断片がそのｃＤＮＡ／遺伝子のコード部分に並列した場合のみ、同定に用いた。ＥＭＢＬ非ＥＳＴデータベースでヒットが得られなかった場合、ＥＭＢＬ ＥＳＴデータベースを検索した。１ｘ１０１０未満のＰ（Ｎ）のマウス由来のヒットのみを記録した。特許ＤＮＡデータベースＰａｔＳｅｑは、特許配列に関して検索した。有意な非ＥＳＴまたはＥＳＴが見出されなかった場合、ディファレンシャルディスプレー断片は、未知と称した。この研究において、データベースに対して解析すると、半数よりいくらか少ない断片が既知遺伝子を戻した。４分の１がＥＳＴとしてのみ同定され、そして４分の１が未知であった。ここで調べたすべての組織および細胞において、既知／ＥＳＴおよび未知間の比率がほぼ同じであることが観察された。
【００４６】
２ ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割の同定
ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＰＰＡＲγアゴニストの作用機構をより完全に理解し、そしてインスリン耐性症候群（ＩＲＳ）／インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に有用な新規分子標的を見出すために行った、発現プロフィール決定実験で、最初に同定された。インスリン非依存性糖尿病治療用のインスリン増感薬剤として使用する、化合物のチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）種は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）のリガンドとして作用することが知られる。対照およびロシグリタゾン処置（ＴＺＤ Ｘ１０３、ＢＲＬ４９６５３、ＡＲＨ０３６１３３）ｏｂ／ｏｂマウス由来の多様な器官および組織の対比較を用いて、ディファレンシャルディスプレー解析を行った。これらのマウスは、レプチン欠損で肥満であり、そして年齢と共にＮＩＤＤＭに似た異常を発展させ；異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）および肥満などの、これらの症状のいくつかは、統計的にアテローム性動脈硬化症を発展させる可能性がある患者によって示される。ディファレンシャルディスプレー解析の結果、既知の遺伝子、ＥＳＴおよび未知の遺伝子由来の１００を超える一次配列を同定した。同定した配列は、真の上方または下方制御遺伝子を選別するため、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いた確認過程を経た。また、確認したヒットは、時間経過および組織分布実験において、さらに認証した。確認した配列には、バイオインフォマティクスおよび文献調査を行った。１２の潜在的な標的（４つの既知の遺伝子、４つのＥＳＴおよび４つの先に未知であった遺伝子）をさらなる研究に選んだ。
【００４７】
示差的に発現された配列の１つが、マウスＡＤＡＭＴＳ−１ ｍＲＮＡに対応し、これは、腸間膜脂肪において、やせた同腹仔と比較して肥満のｏｂ／ｏｂマウスで有意に上昇した（図３）。ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージは、精巣上体脂肪組織において、ロシグリタゾン処置（毎日投与、３０μｍｏｌ／ｋｇ／日）７日後に下方制御された（図２）。同一に処置した動物の別の組由来の組織に対してリアルタイムＰＣＲ定量化を行うと、腸間膜（図１）および褐色脂肪組織（図４）においても下方制御が起こることが示された。測定は、５動物からプールしたｃＤＮＡに対して行い、したがってエラーバーが欠如していることに注目されたい。
【００４８】
続いて、ヒトにおいて、ＡＤＡＭＴＳ−１レベルが、大部分の他の組織に比較して心臓で、特に大動脈で、より高いことが見出された（図５）。プロテアーゼは、ＥＣＭタンパク質をリモデリングし、そして分解することによって、アテローム発生において、そして斑安定のため、不可欠の役割を果たしているため、ＡＤＡＭＴＳ−１は、アテローム性動脈硬化症の潜在的に興味深い標的となった。
【００４９】
結論：
１．ＡＤＡＭＴＳ−１発現は、肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスの脂肪組織および大動脈で上方制御され、そして筋肉で下方制御される。
【００５０】
２．ｏｂ／ｏｂマウスをＰＰＡＲγアゴニストで処置すると、脂肪組織における発現が正常化される（そして筋肉における発現が、ある程度、正常化される）。
【００５１】
３．ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＮＩＤＤＭ、肥満およびアテローム性動脈硬化症の観点から関連する組織分布を示す。
４．該遺伝子は入手可能な細胞系（マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞）において発現される（そしてＰＰＡＲγアゴニストに反応する）。
【００５２】
５．ＡＤＡＭＴＳ−１相同体は、適切なモデル生物に見られる（マウス、線虫およびショウジョウバエ）。
６．ＡＤＡＭＴＳ−１は、いくつかの重要な疾患において、多数の過程に関与することが見出されるプロテアーゼ／インテグリン結合タンパク質ファミリーに属する。
【００５３】
７．該タンパク質は搬出され、そしてしたがって潜在的に、発現しそして精製するのが比較的容易である。
８．ＡＤＡＭＴＳ−１分子は、薬剤ターゲティングに有用ないくつかの機能ドメイン（プロ、メタロプロテイナーゼ、インテグリン結合およびマトリックス結合ドメイン）を有する。
【００５４】
したがって、ＡＤＡＭＴＳ−１自体が、ＮＩＤＤＭ／ＩＲＳ、アテローム性動脈硬化症および肥満治療の興味深い特異的薬剤標的であることが、初めて立証された。理論的考慮に束縛されることは望ましくないが、その役割は、組織／マトリックスリモデリング、分化またはサイトカイン、増殖因子および受容体の放出／修飾にある可能性がある。
【００５５】
実施例２
アッセイ開発
完全マウスＡＤＡＭＴＳ−１ ｃＤＮＡは、精巣上体脂肪組織からクローニングされ、そして哺乳動物発現ベクター（構成性および誘導性発現両方のため）に挿入されている。タンパク質は、天然型、並びに検出および精製を単純にするため、Ｃ末端にエピトープタグ（ＦＬＡＧ）を持つ型両方で発現される。同様に、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１相同体がクローニングされ、そして発現される。ＡＤＡＭＴＳ−１分子の多様な機能ドメインに対する抗体が意図される。
【００５６】
アッセイ：
・ＡＤＡＭＴＳ−１プロテアーゼ活性（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）
・ＡＤＡＭＴＳ−１活性化（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）ＷＨＡＴ
・適切な細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写の活性化
・ＡＤＡＭＴＳ−１／（標的）タンパク質相互作用を監視するディスインテグリンアッセイ
・ペプチドライブラリー技術を介した合成基質の選択
・プロドメイン切断／ＡＤＡＭＴＳ−１活性化のアッセイ
さらなるアッセイ情報は、以下の実施例９に示す。
【００５７】
実施例３
薬剤組成物
以下は、ヒトにおける療法的または予防的使用のための、本明細書に定義するような本発明の方法を通じて調製可能な代表的な薬学的投薬型を例示する（活性成分は「化合物Ｘ」と称する）：
（ａ）錠剤Ｉ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１００
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・１８２．７５
クロスカーメロースナトリウム・・・・・・・・・・・・・１２．０
トウモロコシデンプンペースト（５％ ｗ／ｖペースト）・・２．２５
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・３．０
（ｂ）錠剤ＩＩ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５０
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・２２３．７５
クロスカーメロースナトリウム・・・・・・・・・・・・・・６．０
トウモロコシデンプン・・・・・・・・・・・・・・・・・１５．０
ポリビニルピロリドン（５％ ｗ／ｖペースト）・・・・・・２．２５
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・３．０
（ｃ）錠剤ＩＩＩ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．０
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・・９３．２５
クロスカーメロースナトリウム・・・・・・・・・・・・・・４．０
トウモロコシデンプンペースト（５％ ｗ／ｖペースト）・・０．７５
ステアリン酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・１．０
（ｄ）カプセル ｍｇ／カプセル
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０
ラクトースＰｈ．Ｅｕｒ・・・・・・・・・・・・・・・４８８．５
マグネシウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．５
（ｅ）注射剤Ｉ （５０ｍｇ／ｍｌ）
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５．０％ ｗ／ｖ
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液・・・・・・・・・・・・・・１５．０％ ｖ／ｖ
０．１Ｍ塩酸
（ｐＨを７．６に調整）
ポリエチレングリコール４００・・・・・・・・・・・・・４．５％ ｗ／ｖ
注射用水１００％まで
（ｆ）注射剤ＩＩ （１０ｍｇ／ｍｌ）
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．０％ ｗ／ｖ
リン酸ナトリウムＢＰ・・・・・・・・・・・・・・・・・３．６％ ｗ／ｖ
０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液・・・・・・・・・・・・１５．０％ ｖ／ｖ
注射用水１００％まで
（ｇ）注射剤ＩＩＩ （１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ６に緩衝）
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１％ ｗ／ｖ
リン酸ナトリウムＢＰ・・・・・・・・・・・・・・・・２．２６％ ｗ／ｖ
クエン酸・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．３８％ ｗ／ｖ
ポリエチレングリコール４００・・・・・・・・・・・・３．５％ ｗ／ｖ
注射用水１００％まで
（ｈ）エアロゾルＩ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０．０
トリオレイン酸ソルビタン・・・・・・・・・・・・・・・１３．５
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・９１０．０
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・４９０．０
（ｉ）エアロゾルＩＩ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．２
トリオレイン酸ソルビタン・・・・・・・・・・・・・・・・０．２７
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・・７０．０
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・２８０．０
ジクロロテトラフルオロエタン・・・・・・・・・・・１０９４．０
（ｊ）エアロゾルＩＩＩ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．５
トリオレイン酸ソルビタン・・・・・・・・・・・・・・・・３．３８
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・・６７．５
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・１０８６．０
ジクロロテトラフルオロエタン・・・・・・・・・・・・１９１．６
（ｋ）エアロゾルＩＶ ｍｇ／ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．５
ダイズレシチン・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．７
トリクロロフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・・・６７．５
ジクロロジフルオロメタン・・・・・・・・・・・・・１０８６．０
ジクロロテトラフルオロエタン・・・・・・・・・・・・１９１．６
（ｌ）軟膏 ｍｌ
化合物Ｘ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４０ｍｇ
エタノール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３００μｌ
水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３００μｌ
１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン・・・・・・・５０μｌ
プロピレングリコール・・・・・・・・・・・・・・・・・１ｍｌまで
注
上記処方は、薬学業に公知の慣用法によって得ることが可能である。錠剤（ａ）−（ｃ）は、慣用的手段、例えば酢酸フタル酸セルロースコーティングを提供することによって腸溶コーティングすることが可能である。エアロゾル処方（ｈ）−（ｋ）は、標準的計量用量エアロゾルディスペンサーと組み合わせて使用し、そして懸濁剤、トリオレイン酸ソルビタンおよびダイズレシチンを、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ポリグリセロールオレエートまたはオレイン酸などの別の懸濁剤によって置き換えることが可能である。
【００５８】
実施例４
リアルタイムＰＣＲ、プライマーおよびプローブ
マウスＡＤＡＭＴＳ−１、第１組
【００５９】
【表２】
マウスＡＤＡＭＴＳ−１、第２組
【００６１】
【表３】
ヒトＡＤＡＭＴＳ−１
【００６３】
【表４】
実施例５
免疫組織化学
以下のパラフィン包埋ヒト材料を用いた。若い男性由来の脂肪線条（Ｉ型）および中程度／進行大動脈斑（ＩＩＩ−ＩＶ型）を用いた（シャルグレンスカ病院、病理学部門提供）。冠動脈は、年齢４０−８５歳の間の女性由来であった。切片は、エオジンおよびヘマトキシリンで染色し（Ｃｏｏｋ １９７４）、アテローム性動脈硬化症の構造および度合いの概観を得た。
【００６５】
平滑筋細胞の存在を研究するため、α−アクチンに対する商業的マウスモノクローナル抗体を、１：５０で用いた（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ｌａｂｓ）。ＨＡＭ−５６に対する別の商業的マウスモノクローナル抗体（Ｄａｃｏ）を、１：５０−１：１００希釈で用いて、マクロファージおよびおそらく泡沫細胞を同定した。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１スペーサードメイン由来の同一配列に対して作成した２つのウサギ抗体を評価した。どちらも同様の結果を生じた。ＡＤＡＭＴＳ−１ペプチドでの前吸収を対照として用いた。
【００６６】
免疫組織化学は、Ｄａｃｏの免疫染色装置、Ｔｅｃｈｍａｔｅで行った。一次抗体は、切片上で１２時間２５分間インキュベーションし、その後、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＲＢＳ）中の洗浄工程が続いた。二次抗体は、ＡＤＡＭＴＳ−１では、１：２５００希釈したロバ抗ウサギビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）、そしてＨＡＭ−５６およびα−アクチンでは、１：１０００希釈したロバ抗マウスビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）であった。二次抗体は切片上で１時間インキュベーションし、その後、洗浄工程が続いた。内因性ペルオキシダーゼ活性の遮断は、ＨＰ−遮断用のＤａｃｏのキットを用いて、３ｘ２．５分間行った。さらなる洗浄工程後、ＨＲＰを切片上で３０分間インキュベーションし、洗浄して、そして最後に抗原−抗体複合体を、Ｄａｃｏに供給されるＥＡＣ色素原キット、３ｘ７分間によって、視覚化した。切片を洗浄し、ヘマトキシリン中で対比染色し、洗浄し、そしてカイザーのゼラチングリセリン中でマウントした。すべての切片は、ＺｅｉｓｓまたはＯｌｙｍｐｕｓ光学顕微鏡中で調べた。
【００６７】
実施例６
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＡｐｏＥ／ＬＤＬ受容体欠損マウス由来のパラフィン包埋大動脈を本研究に用いた。調べた組織には病変は存在しなかった。マウスＡＤＡＭＴＳ−１に対する３５Ｓ放射標識５００塩基対リボプローブを生成し、そして本研究に用いた。
【００６８】
実施例７
プロテオグリカンの消化
ヒト大動脈平滑筋細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）から購入し、そして供給者にしたがって培養した。総プロテオグリカン集団（総ＰＧ）の調製のため、ＡｏＳＭＣを、ＳｍＢＭ２培地中、３０００細胞／ｃｍ２で蒔いた（４ｘ８０ｃｍ２フラスコ）。５日後、ダルベッコのＰＢＳで細胞を洗浄し、そしてＦＢＳを含むＢＭＥ−二倍体培地を細胞に添加した。１日後、ＦＢＳを含まず、３５Ｓ−サルフェート３３μＣｉ／ｍｌおよび３Ｈ−ロイシン１７μＣｉ／ｍｌを含有する、１５ｍｌ／瓶の新鮮なＤＭＥ−二倍体培地を添加し、そして３日間インキュベーションした。培地を移し、そして８Ｍ尿素、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を含有する結合緩衝液に対して４８時間透析し、そしてあらかじめ平衡化したＨｉ−Ｔｒａｐ Ｑカラムに適用した。２５ｍｌの溶出緩衝液Ａ（結合緩衝液＋０．２５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄した後、プロテオグリカン集団を直線塩勾配で溶出する：結合緩衝液中の０．２５−３Ｍ ＮａＣｌ。各分画の総カウントは、液体シンチレーション計測によってカウントした。ＰＧを含有する分画をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥し、そして使用するまで−２０℃で保存した（「総ＰＧ」）。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィーによる分離は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０を用いて行った。総ＰＧ試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、４ＭグアニジニウムＨＣｌに溶解し、そして流速０．５ｍｌ／分であらかじめ平衡化したカラム上に装填した。１ｍｌ分画を収集し、そして各分画に関して３５Ｓを測定した。
【００７０】
実施例８
ＴＨＰ−１細胞におけるｈＡＤＡＭＴＳ−１の発現
ＴＨＰ−１細胞は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）は、エタノールに溶解し、そして最終濃度１６０ｎＭに培地で希釈した。ＬＤＬはＰＢＳ中で平衡化し、そして４００μｇ／ｍｌに希釈し、そして１０μＭ ＣｕＳＯ４で、３７℃で２．５時間酸化した。穏やかに酸化したＬＤＬをＲＰＭＩ１６４０中で平衡化し、そしてフィルター滅菌した。
【００７１】
ＴＨＰ−１細胞は、ＰＭＡを含有する培地中で、０、２、４、８、および８＋１日間培養した。別の組のプレートを、最後の日に穏やかに酸化したＬＤＬもまた含み、ＰＭＡと８＋１日間インキュベーションした。ＲＮＡを抽出し、そしてリアルタイムＰＣＲによってＡＤＡＭＴＳ−１メッセージを解析した。
【００７２】
実施例９
アッセイ開発
完全マウスＡＤＡＭＴＳ−１ ｃＤＮＡは、精巣上体脂肪組織からクローニングされ、そして哺乳動物発現ベクター（構成性および誘導性発現両方のため）に挿入されている。タンパク質は、天然型で発現される。ヒトＡＤＡＭＴＳ−１相同体は、天然型、並びに検出および精製を単純にするため、Ｃ末端に切断可能エピトープタグ（ｈｉｓ６）を持つ型両方でクローニングされ、そして発現されている。マウスおよびヒト両方のＡＤＡＭＴＳ−１分子の多様な機能ドメインに対する抗体が生成されている。
【００７３】
適切なアッセイの例：
・ＡＤＡＭＴＳ−１プロテアーゼ活性（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）
・ＡＤＡＭＴＳ−１活性化（細胞に基づくかまたは精製組換えタンパク質を用いる）
・適切な細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写の活性化
・ＡＤＡＭＴＳ−１／（標的）タンパク質相互作用を監視するディスインテグリンアッセイ
・高処理スクリーニングのためのペプチド基質の選択。全長または組換えメタロプロテアーゼドメインを用いて、化合物をスクリーニングすることが可能である。現在、我々は、プロテオグリカン・アグリカン上の公表された切断部位由来の３８アミノ酸ペプチドを有し、これは高処理スクリーニングに適した基質として使用可能である。組換えＡＤＡＭＴＳ−１による該ペプチドの切断は、ＨＰＬＣ解析によって確認している。該ペプチドを蛍光マーカーで標識し、ＦＲＥＴ／消光型アッセイによってスクリーニングすることが可能である。あるいは、該ペプチドを一端で標識し、そして他端でプレートまたはビーズに固定し、そして標識切断産物の放出によって、切断を監視することが可能である。ペプチド配列：ＴＳＥＬＶＥＧＶＴＥＰＴＶＳＱＥ＾ＬＧＱＲＰＰＶＴＹＴＰＱＬＦＥＳＳＧＥＡＳＣ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２５：（＾はＡＤＡＭＴＳ−１による切断部位を示す）
・プロドメイン切断／ＡＤＡＭＴＳ−１活性化のアッセイ
・マトリックスコーティングフィルターを渡る大動脈平滑筋細胞の遊走のような、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を測定する、細胞遊走アッセイを確立中である。外因性組換えＡＤＡＭＴＳ−１の影響を試験して、より高いレベルのプロテアーゼが遊走に影響を与えることが可能であるかどうか決定されるであろう。化合物が入手可能になったとき、これらを試験して、減少したプロテアーゼ活性が活性に影響を及ぼすことが可能であるかどうか決定されるであろう。
【００７４】
実施例１０
ＡＤＡＭＴＳ−１：アテローム性動脈硬化症におけるプロテアーゼの役割
ヒト大動脈において、ＡＤＡＭＴＳ−１は、通常、中膜において、免疫組織化学によって、かろうじて検出可能であるレベルで発現されるが、初期脂肪線条の泡沫様および平滑筋細胞では、そしてＩＩＩ−ＩＶ型病変の基部のマトリックス様コアでは、実質的により高いレベルで発現される（図６、７）。ＡＤＡＭＴＳ−１抗体での染色は、平滑筋細胞（□−アクチン）染色と共局在する（図６ａ、ｄおよび７ａ、ｄ）。初期脂肪線条において、ＡＤＡＭＴＳ−１染色はまた、マクロファージマーカー、ＨＡＭ−５６で観察される染色とも共局在する（図６ａ、ｃ）。抗体を生成するのに用いたペプチドでの前吸収は、ＡＤＡＭＴＳ−１抗体を用いた染色の大部分を除去した（図６ｂ、７ｂ）。ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージが剪断ストレス下のヒト臍静脈内皮細胞および心臓微小血管内皮細胞において、実質的に上方制御されることもまた観察されてきており、これは、流動依存血管リモデリングにおける潜在的な役割を示唆する（Ｂｏｎｇｒａｚｉｏら、２０００）。さらに、ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＬＤＬ受容体／ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈斑において、検出される。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験によって、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージが、通常、ＬＤＬ受容体／ＡｐｏＥ欠損マウスの大動脈中膜（平滑筋層）および内皮細胞両方に発現されることが示唆され、これは、両細胞種がＡＤＡＭＴＳ−１を産生可能であることを示唆する（図８）。メッセージレベルは低い；が、病変を含まない大動脈の切片に対して染色を行った。ヒト単球／マクロファージ様細胞株（ＴＨＰ−１細胞）を用いた実験では、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージは、リアルタイムＰＣＲによって測定されるように、単球のマクロファージへの成熟を誘導することが知られる試薬、ＰＭＡで誘導される（図９）。穏やかに酸化されたＬＤＬへの曝露は、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージのレベルを有意に変化させなかった。
【００７５】
ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＧＡＧ部分（コンドロイチン硫酸）を含有するプロテオグリカンであるアグリカンを切断可能であり；欠失実験によって、アグリカンの切断には、コンドロイチン硫酸ドメインへの結合が必要であることが示唆される（Ｉｏｚｚｏ、１９９８；Ｋｕｎｏら、２０００；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９）。さらに、ＡＤＡＭＴＳ−１は、同一遺伝子ファミリーに属する別のプロテオグリカン、バーシカンを切断可能であり、バーシカンは、アテローム性動脈硬化病変において、主にＶＳＭＣによって高レベルで発現される（Ｅｖａｎｋｏら、１９９８；Ｓａｎｄｙら、２００１）。図１０を参照されたい。総プロテオグリカンを、初代大動脈平滑筋細胞から単離し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーによる分離前に、ＡＤＡＭＴＳ−１を含み、または含まず、インキュベーションした。ＡＤＡＭＴＳ−１の存在下で、主にバーシカンで構成される、大きいプロテオグリカン集団のサイズが減少し、そしてより小さいサイズのプロテオグリカン集団に対応するピークのサイズが増加することから、ＡＤＡＭＴＳ−１がバーシカンを切断し、そしてそのサイズを減少させることが可能であると示される。
【００７６】
中膜層に隣接する、ＩＩＩ−ＩＶ型斑の基部でのＡＤＡＭＴＳ−１の局在は、ＡＤＡＭＴＳ−１が血管壁から病変へのＶＳＭＣの遊走を促進するのに役割を果たしている可能性を示唆する。ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージに関するリアルタイムＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）解析は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、集密細胞に比較して、増殖中の初代大動脈ＶＳＭＣで、該メッセージが、より高いレベルで発現されることを示し、これは、アテローム性動脈硬化症において、ＳＭＣ遊走を促進する際のその潜在的な役割と一致する（図１１）。興味深いことに、動脈平滑筋および内皮細胞両方によって発現され、そして核にターゲティングした際、分裂促進性であることが知られるホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質は、骨において、ＡＤＡＭＴＳ−１の発現を誘導可能である（Ｍｉｌｅｓら、２０００；Ｍａｓｓｆｅｌｄｅｒら、１９９７）。ＡＤＡＭＴＳファミリーの線虫メンバー、ｇｏｎ−１は、おそらく基底膜構成要素を修飾することによって、生殖腺形態形成中、遠位先端細胞の遊走に必須の役割を果たしていることが示されている（Ｂｌｅｌｌｏｃｋら、１９９９；ＢｌｅｌｌｏｃｋおよびＫｉｍｂｌｅ、１９９９）。野生型導入遺伝子は、突然変異表現型を救出可能であるが、プロテアーゼ欠損突然変異体はこれを救出不能であるため、正常遠位先端細胞遊走および生殖腺発生には、プロテアーゼ活性が必須である。線虫には、アグリカンまたはバーシカンの相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）が存在しないが、ＧＯＮ−１の基質である可能性がある、いくつかの性質決定されていないコンドロイチン硫酸プロテオグリカンがある。さらに、アグリカンおよびバーシカンはどちらも、トリ神経冠遊走に役割を有することが示されている（Ｐｅｒｉｓｓｉｎｏｔｔｏら、２０００）。我々は、アテローム発生におけるＡＤＡＭＴＳ−１の役割をさらに調べる計画の一部として、ＡＤＡＭＴＳ−１の導入遺伝子を過剰発現するマウスを生成した。
【００７７】
正常大動脈血管を通じた横断切片において、細胞およびマトリックスの別個の層が観察される。バーシカンは、テネイシンおよびヒアルロン酸などの他のＥＣＭタンパク質、並びに細胞表面糖タンパク質（例えばＶＳＭＣ上に検出されるＣＤ−４４様タンパク質）に結合し、そして軟骨中のアグリカンによく似た、膨張可能であるが弾力性がある、水和凝集物を形成可能である（Ｈｕｒｔ−Ｃａｍｅｊｏ、１９９９）。ＶＳＭＣは、このプロテオグリカン／ＥＣＭリッチな環境を要する可能性があるが、後者はまた、移動を妨げる物理的障壁としても作用する可能性がある。正常大動脈または血管において、ＶＳＭＣは、よく線引きされた中膜層にとどまることを好む；しかし疾患組織では、内膜内に遊走する。ＡＤＡＭＴＳ−１は、ＶＳＭＣによる浸潤に対して、内膜をより「許容性」にするのに関与している可能性がある。さらに、プロテオグリカンの切断は、増殖因子およびサイトカインの放出を導き、中膜から内膜へのＳＭＣ遊走を促進する可能性がある。
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】やせたマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、およびロシグリタゾンで処置したｏｂ／ｏｂマウスを比較する、リアルタイムＰＣＲ。
やせたマウス（１ａ）、未処置ｏｂ／ｏｂマウス（ｂ）およびロシグリタゾンで７日間処置したｏｂ／ｏｂマウス（ｃ）由来の腸間膜脂肪におけるＡＤＡＭＴＳ−１発現の比較（群あたり５動物）。ＡＤＡＭＴＳ−１ ｍＲＮＡレベルは、やせた（−／ｏｂ）動物（ｂ）と比較して、肥満（ｏｂ／ｏｂ）動物（ａ）で有意に上昇する。ロシグリタゾンでの処置は、肥満マウスにおける発現を、やせた動物で見られるレベル近くまで減少させる（ｃ）。
【図２】ロシグリタゾンで処置したマウスの精巣上体脂肪のリアルタイムＰＣＲ解析。
毎日ロシグリタゾンで処置した、時間経過研究（群あたり３動物）。第０日、第１日、第３日、および第７日に、精巣上体脂肪におけるＡＤＡＭＴＳ−１発現のリアルタイムＰＣＲ定量化を行った。ロシグリタゾンをｏｂ／ｏｂマウスに最初に投与した後、精巣上体脂肪における発現レベルが実質的に減少し、そして７日間の期間に渡って、さらに減少する。ＡＤＡＭＴＳ−１の下方制御は、血漿グルコースおよびトリグリセリドに対する影響に先行し、これらは、ロシグリタゾンの最初の投与によっては低下しない。
【図３】多様な組織のリアルタイムＰＣＲ解析。
ｏｂ／ｏｂマウスに対し、やせたマウスにおけるメッセージレベルを比較する、ＡＤＡＭＴＳ−１発現レベルの解析は、マウスＡＤＡＭＴＳ−１の組織分布を示す。３動物からプールしたｃＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ定量化を、内部対照（リボソームタンパク質３６Ｂ４）に対して規準化した。肥満動物において、いくつかの組織で発現が上方制御される。腸間膜脂肪に加え、上方制御は、肝臓、肺で、最も顕著であり、そして大動脈で顕著である。
【図４】処置マウスの多様な組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベル。
ロシグリタゾンで７日間処置したマウスの多様な組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベルは、やせたマウス（ａ）、未処置ｏｂ／ｏｂマウス（ｂ）およびロシグリタゾンで７日間処置したｏｂ／ｏｂマウス（ｃ）由来の多様な組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１発現の比較を示す（群あたり５動物）。各群の組織は、左から右の順に以下のとおりであった：骨髄；肝臓；四頭筋；白色脂肪；および褐色脂肪。
【図５】多様なヒト組織におけるＡＤＡＭＴＳ−１レベル
内部対照（リボソームタンパク質３６Ｂ４）に対して規準化した、数人の個体からプールしたｃＤＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ定量化は、ヒトＡＤＡＭＴＳ−１の組織分布を示す。ＡＤＡＭＴＳ−１発現は、大部分の他の組織より、心臓で有意により高く、特に大動脈で、より高い。
【図６】Ｉ型大動脈病変の免疫組織化学。
初期脂肪線条（Ｉ型病変）におけるＡＤＡＭＴＳ−１、α−アクチン、およびマクロファージに対する抗体での免疫組織化学。Ａ．ＡＤＡＭＴＳ−１標識が、泡沫様細胞（矢印）および平滑筋細胞に見られる。Ｂ．前吸収対照。Ｃ．マクロファージ様免疫反応性（ＨＡＭ−５６）。いくつかの染色は、ＡＤＡＭＴＳ−１染色と共局在する（矢印）。Ｄ．平滑筋標識（□−アクチン）。
【図７】免疫組織化学。
大動脈（Ａ）または冠動脈（Ｂ−Ｅ）中の進行斑（ＩＩＩ−ＩＶ型）におけるヒトＡＤＡＭＴＳ−１、α−アクチン、およびマクロファージに対する抗体での免疫組織化学。Ａ．大動脈斑の基部のマトリックス様コアに、ＡＤＡＭＴＳ−１様免疫反応性が見られる（矢印）。Ｂ．中膜近く、斑の基部のＡＤＡＭＴＳ−１様免疫反応性（矢印）。Ｃ．ＡＤＡＭＴＳ−１染色に対する前吸収抗体対照。Ｄ．マクロファージ（ＨＡＭ−５６）標識。Ｅ．中膜平滑筋細胞および斑基部に、アクチン様免疫反応性が見られる。矢印は、染色がＡＤＡＭＴＳ−１と共局在することを示す。
【図８】ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。
ＡｐｏＥ／ＬＤＬ受容体欠損マウスの大動脈におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージに関するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。染色が、内皮および平滑筋細胞層両方に観察されることに注目されたい（矢印）。６０Ｘ。
【図９】ＴＨＰ−１細胞におけるｈＡＤＡＭＴＳ−１の発現。
第０日、第２日、第４日、第８日、８日＋２４時間（８日＋２４時間、穏やかに酸化したＬＤＬと）の、ＰＭＡで処置したＴＨＰ−１細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベルに関するリアルタイムＰＣＲ解析。
【図１０】ＡＳＭＣ由来のプロテオグリカンのサイズ排除クロマトグラフィー。
Ａ．３５Ｓおよび３Ｈと培養した初代大動脈平滑筋細胞に分泌される総プロテオグリカンの解析。サイズ排除クロマトグラフィーによって、サイズにしたがって、２つのプロテオグリカン集団が分離可能である。大きいプロテオグリカン集団は、主にバーシカンで構成される。Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィーによって分離する前に、総プロテオグリカン集団をＡＤＡＭＴＳ−１とインキュベーションすると、大きいプロテオグリカンピークのサイズが減少し、そしてより小さいプロテオグリカン集団のサイズが増加する。
【図１１】大動脈ＳＭＣのリアルタイムＰＣＲ解析。
Ｂ）休止集密ヒト大動脈平滑筋細胞に比較した、Ａ）増殖中の初代ヒト大動脈平滑筋細胞における、ＡＤＡＭＴＳ−１メッセージレベルに関するリアルタイムＰＣＲ解析。
Claims (10)
- 肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症から独立に選択される疾患を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調可能な化合物の使用。
- 肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に減少させることが可能な化合物の、請求項１記載の使用。
- 肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に増加させることが可能な化合物の、請求項１記載の使用。
- 肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に減少させることが可能な化合物の、請求項１記載の使用。
- 肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品調製における、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性を特異的に増加させることが可能な化合物の、請求項１記載の使用。
- 肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症の治療に、潜在的に有用な化合物に関するスクリーニング法であって、ＡＤＡＭＴＳ−１の活性または量を特異的に変調する能力に関する化合物のアッセイを含んでなる、前記方法。
- アッセイが：
ｉ）ＡＤＡＭＴＳ−１を発現する細胞株を使用するか、または精製ＡＤＡＭＴＳ−１タンパク質を使用する、ＡＤＡＭＴＳ−１活性の測定；および
ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ−１を発現する細胞株におけるＡＤＡＭＴＳ−１転写または翻訳の測定
から独立に選択される、請求項６記載の方法。 - 細胞株がマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞である、請求項７記載の方法。
- タンパク質がヒト組換えＡＤＡＭＴＳ−１である、請求項７記載の方法。
- ｉ）請求項６−９のいずれか１つの方法にしたがって、肥満、ＩＲＳ、ＮＩＤＤＭまたはアテローム性動脈硬化症の治療に有用と化合物を同定し；
ｉｉ）該化合物または薬学的に許容しうるその塩を、薬学的に許容しうる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含んでなる、薬剤組成物調製法。
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