JP2004506688A - Treatment of injuries and other indications - Google Patents

Abstract

A method of treating an area affected by an injury, such as a corneal wound or internal injury, comprising administering to the affected area a composition comprising a polyanionic polymer in an amount effective to treat the injury. Provide a method.

Description

上式でＤは、直鎖状または分枝状アルキレンである置換基Ｅを有する、直鎖状または分枝状アルキレンであって、ＤとＥは合わせて１０個までの炭素原子を有する。ジカルボンアミノ酸は、たとえばグルタミン酸、アスパラギン酸、ポリ（グルタミン酸）またはポリ（アスパラギン酸）であってよい。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは、エステル、カルボネート、チオカルボネート、ウレタン、カルバメートおよび尿素からなる群から選択される、１つまたは複数の加水分解性の結合を含む主鎖を有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の加水分解性の結合は、ヒドロキシ酸の残基を含むことができる。α−ヒドロキシ酸は、たとえば乳酸であってよい。ポリアニオン性ポリマーの主鎖は、α，ω−ジオール、ジアミンまたはジチオールの残基を含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、エチレングリコールのビス−アクリレート、エタンジアミンのビス−アクリルアミド、またはＮ−（２−アクリロイロキシ）エチルアクリルアミドと、ビス−メルカプト末端キャップ・ポリアニオン性オリゴマーの反応によって形成され、１つまたは複数のエチレン性不飽和化合物の重合によって作製される、ポリアニオン性ポリマーの使用法を含む。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本出願の目的のために、以下に挙げた語は以下の個別の意味を有するものとする。
【００２５】
ＡＭは、発明の概要中に記載したモノマーと一致するアニオン性モノマーである。発明の概要および以下のさらなる記載を通して、ＰＡＰに寄与するすべてのモノマーが、それ自体アニオン性であるわけではない。
ＭＷは分子量である。
ＰＡＡはポリ（アクリル酸）系ポリマーである。
ＰＡＯはポリアルキレンオキシドであり、ＰＥＧはその一例である。ＰＡＯは、典型的にはＣ２〜Ｃ４繰り返し単位を有しており、Ｃ３およびＣ４繰り返し単位は典型的にはＣ２（エチレンオキシド）と配合されており、水溶解度を増大させる。ＰＡＯセグメントのサイズは、セグメントの９０％以上の分子量が５０ｋｄまたは４０ｋｄ以下であるようなサイズであることが好ましい。一実施形態では、９５％、９８％以上のセグメントが、これらのサイズ制限内にある。セグメントの平均分子量は、２０ｋｄ〜４０ｋｄ、または２５ｋｄ〜３５ｋｄであることが好ましい。ＰＡＯセグメントは、少なくとも５００、より好ましくは少なくとも１，０００の分子量平均を有することが好ましい。
ＰＡＰは、発明の概要中に記載したポリマーに従った、ポリアニオン性ポリマーである。
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。
【００２６】
酸価とは、１グラムの乾燥物質を中和するために必要とされる、水酸化カリウムのミリグラムの量のことを指す。物質が２重量％以下の水を含む場合、有機溶媒、有機モノマーを問わず、物質は乾燥している。
【００２７】
脂肪族は、他に指示しない限り、脂肪族とシクロ脂肪族の両方を含む。
【００２８】
アルキルは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルキル基を意味し、アルキル基の１つまたは複数の水素のハロゲン置換体を含む。
【００２９】
炎症性サイトカインのアンタゴニストは、炎症性サイトカインの作用を無効にする傾向がある任意の物質、たとえば生物学的な応答を誘導することなく細胞受容体に結合する薬剤を含むものとする。炎症性サイトカインは、生きている組織中の炎症応答を刺激することができる、任意のサイトカインタンパク質または生物学的因子を含むものとする。
【００３０】
開裂可能な基は、ＯＲ^４を含む部分であって、ＯＲ^４基が化学的に改変、置換、または交換することができ、したがって残基が、−ＯＨまたは−Ｏ⁻である部分を意味する。
【００３１】
除去可能な（ｃｌｅａｒａｂｌｅ）ポリマーとは、本明細書のセクション６に帰する意味を有する、ポリアニオン性ポリマーを指す。
【００３２】
累積的な損傷創傷は、身体の一部への繰り返しの作用、繰り返しのストレスまたは繰り返しの危害によって引き起こされる損傷を意味する。累積的な損傷創傷の例には、腱炎、腱鞘炎または手根管圧迫症候群があるが、これらだけには限られない。
【００３３】
有効量：「有効量」という意味は、臨床医によって理解されるであろうが、治療することが求められる１つまたは複数の病気の症状、または回避あるいは治療することが求められる状態を低下、改善または除去するための、あるいはこれ以外の場合は病気の病状または状態の臨床的に認められる変化を生み出すための有効量を含む。
【００３４】
酵素活性セグメントは、キモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、およびエラスターゼまたはエキソペプチターゼ活性の少なくとも１つを含む活性を有する、多機能性タンパク質のセグメントを意味する。
【００３５】
繊維素溶解剤：フィブリノリジン、またはプラスミノゲンをフィブリノリジンに転換する物質。これらは、血栓塞栓症において使用される細菌酵素のように、内生または外生であってよい。
【００３６】
ヒドロゲルは水と親水性ポリマーの組み合わせであり、ポリマーは直鎖状、分枝状であってよく、共有架橋、イオン架橋、物理的架橋、または水素結合によって架橋していてよい。ヒドロゲルは、５０重量％以上の水を有している。ヒドロゲルを形成する親水性ポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース、カルボキシポリメチレン、およびポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）である。
【００３７】
ヒドロラーゼは、アミド、エステルまたはエーテル結合などの脱水反応によって形成された結合を分解する酵素を意味する。この語は、トリプシンおよびキモトリプシンなどのプロテアーゼを含むが、これらだけには限られない。
【００３８】
イソ形は、同じ生物中のほぼ相同なタンパク質の、本来存在する配列の異型を意味する。イソ形は、参照配列と少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の同一性を共有することが好ましい。
【００３９】
クリル由来の多機能性タンパク質は、「Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ」という表題のセクションに記載されたタンパク質の諸性質を有するクリルから単離したタンパク質と、同じ配列を有する多機能性タンパク質を意味する。このタンパク質は、「クリル由来の多機能性ヒドロラーゼ」とも呼ばれ、このタンパク質のすべてのイソ形を含む。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６、あるいはこれらの他のイソ形、またはこれらのキメラ・ポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列は、クリル由来の多機能性タンパク質の例である。
【００４０】
不安定なスペーサー基は、酵素的または非酵素的な加水分解または酸化を受けやすい化学的官能基を含むものとする。不安定なスペーサー基は、いくつかの実施形態では、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−メチル酪酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシプロリンなどのヒドロキシカルボン酸の、１つまたは複数の残基を有することができる。不安定なスペーサー基は、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むことができる。場合によっては、加水分解性の結合は、不安定なスペーサー基で置換されている。
【００４１】
加水分解性の結合を含む連結部分とは、ポリマーの１つのセグメントと他のセグメントを連結させる、少なくとも１つの加水分解性の結合を含む化学的部分のことを指す。このような連結部分は、直鎖状ポリマーの２個の末端を結合させ、これによってポリマーを長くし得るか、または架橋剤となり得る。連結部分は、連結剤を用いて、あるいはポリマーのそれぞれのセグメント上の官能基の反応によって形成することができる。
【００４２】
ミクロゲルは、個別の粒子の粘弾性の塊を意味し、それぞれの個別粒子は架橋ポリアニオン性ポリマーを含み、それぞれの粒子は中性ｐＨでのその水性膨張状態で０．１μｍと１０００μｍの間のサイズを有する。水性の膨張ポリアニオン性ポリマーの粒子は、７０％以上の水を有し、架橋はイオン性、共有性、または水素結合によるものである。
【００４３】
ミクロ粘度は、たとえばＲ．Ｙ．Ｌｏｃｈｈｅａｄ他、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍｅｄｉａ、ｐｐ．１１３〜１４７、１９８９中の「Ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ） Ｔｈｉｃｋｅｎｅｒｓ：Ｔｈｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ Ｇｅｌ Ｍｉｃｒｏｒｈｅｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ」中に述べられた、任意の方法によって測定し、この書物は参照によってその全容を本明細書に組み込んである。１つのこのような方法は、２モデルの金のゾルに関するミクロ拡散を測定し、たとえば、中心約１０ｎｍおよび１００ｎｍのミクロ構造のミクロ拡散の測定を可能にする。
【００４４】
単糖または二糖は、糖類または二糖類（スクロースなど）を意味し、これらを還元して非還元形にすること、あるいはこれらを酸化して１つまでのカルボン酸を含ませることができる。
【００４５】
多座配位化合物は、ヒドロキシ、アミノ、またはメルカプト（チオール）から選択される２つ以上の官能基を有する化合物である。多座配位化合物の例には、エチレングリコール、アミノエタノール、ポリエチレングリコール、グリセロールおよびペンタエリスリトールがある。
【００４６】
多機能性タンパク質は、キモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、およびエラスターゼまたはエキソペプチターゼ活性の少なくとも１つ、またはアシアロＧＭ_１セラミド結合活性を含む活性、およびクリル由来の多機能性タンパク質の少なくともセグメントと実質的な相同性を有するタンパク質を意味する。
【００４７】
中性官能基は、酸または塩基によって滴定されない官能基を意味する。
【００４８】
非付加ポリマーは、ポリアニオン性ポリマー・セグメントが、第２の分子中での強い求核原子（ラジカルは除く）とエチレン性不飽和物の付加反応によって形成されないポリマーである。この条件を満たせば、非付加ポリマーは、本出願の目的のために、このようなポリアニオン性セグメントがフリーラジカル重合、カチオン重合またはアニオン重合を含めた任意の手段によって生成する任意のポリマー、ならびに縮合反応によって形成されるポリマーを含むことができる。ポリマー中に使用する、あるいはポリマーを形成するために使用する連結部分または連結剤は、このような部分または連結剤がポリマー性部分を有することができるとしても、任意の適切な化学物質によって形成することはできることが理解されるはずである。
【００４９】
非ステロイド性抗炎症剤：プロスタグランジンの生成を阻害する任意の抗炎症剤。
【００５０】
生理学的ｐＨは、６．５と７．５の間のｐＨを意味する。
【００５１】
ポリアニオン性ポリマーは、非環式骨格を有し、生理学的ｐＨで負に帯電した官能基、たとえばカルボキシレートアニオンになるイオン化可能な官能基、たとえばカルボキシ基を有するポリマーを意味する。１グラムのポリアニオン性ポリマーは、ＫＯＨで滴定することができる０．００１モル以上の官能基を有する。イオン化可能な官能基は、ポリマーの骨格に直接化学的に結合させることができるか、あるいはそれらを、主鎖に化学結合している側基または側鎖に化学的に結合させることができる。カルボキシポリメチレンは、イオン化可能な官能基が主鎖に直接結合しているポリアニオン性ポリマーの一例である。α−Ｐｏｌｙ（グルタミン酸）は、イオン化可能な官能基がエチレン基である側基に結合しているポリアニオン性ポリマーの一例である。
【００５２】
予備形成ポリマーは、対象への投与の前に、ｅｘ ｓｉｔｕで化学的に形成されるポリマーである。
【００５３】
参照タンパク質または配列は、以下に表記した配列番号１のＡＡ６４−３００または配列番号１のＡＡ１−３００である参照タンパク質の配列、または少なくとも１つの残基の違いによってこれらと異なる配列を意味する。
【表１】

上表中、Ｄｅｌは欠失を表す。
【００５４】
界面活性剤：液体の表面張力を低下させることを含めて、表面の性質を変える任意の表面活性剤。
【００５５】
実質的な相同性は、少なくとも約６０％の配列同一性または類似性、たとえば６０％の配列同一性を意味する。
【００５６】
セリンプロテアーゼおよび関連するこのような酵素のクリルに対する概略的な特異性に関して本明細書で使用する、多機能性ヒドロラーゼの単位（「Ｕ」）は、２５℃１分当たりでの１μｍｏｌの基質の加水分解を触媒する酵素の量として定義し、スクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）がその基質であり、加水分解は４１０ｎｍでの吸光度の変化によって監視する。ｐ−ニトロアニリドの吸光係数εは８８００Ｍ^−１ｃｍ^−１であり、したがってサンプルのｄＡ／１分をＵ／１分に転換するための増倍率は、２０μｌのサンプルを使用するときは５．６８である。
【００５７】
本発明は、哺乳動物、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの食用動物、イヌ、室内ネコ、ウマなどのコンパニオン・アニマル、ゾウ、類人猿、大型ネコ、クジラなどの外来動物を含むがこれらだけには限らない、後生動物の解剖学上の膜に対する、創傷および他の損傷を治療するための方法を提供する。膜という語は広義に使用され、硬膜および腱の表面などの組織の境界および組織の表面、角膜の前部の限られた領域、内部器官を覆っている膜、または鞘内に腱を含む器官が存在している腔の内側を覆っている膜、および内部および外部上皮および中皮を含む。本明細書では、上皮組織という語は広い意味で使用し、簡単な層状の移行性上皮、および漿膜の内皮を指すことは理解されるであろう。角膜の固有質上の表皮および結膜上皮組織は、外部上皮である。内部上皮組織は、時には腹膜、胸膜、および心膜などの内皮を表す表面、内臓、体腔壁などの内部構造および器官を覆う膜を含む。
【００５８】
損傷という語は、膜または組織表面に対する任意の創傷、傷害、または有害な刺激を含むものとする。本発明の方法によって治療される損傷は、膜または組織境界の亀裂を引き起こすか、あるいは引き起こさない可能性がある。創傷は疾患の状態、たとえば血管の機能不全または病原体に関する感染、熱傷（熱的あるいは化学的なもの）、あるいは膜または組織表面に事故あるいは手術による外力を加えることに原因がある可能性がある。有害な刺激には、熱または腐食性化学物質、たとえば酸および腐食剤の作用、および手術中の器官の操作がある。
【００５９】
角膜の創傷という語は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの食用動物、イヌ、室内ネコ、ウマなどのコンパニオン・アニマル、ゾウ、類人猿、大型ネコ、クジラなどの外来動物だけには限られないがこれらを含めた哺乳動物における、角膜に対する任意の危害、たとえば病原体による感染、角膜の剥離、角膜の潰瘍、または角膜の潰瘍を生じさせる可能性がある傷害を含むものとする。角膜の潰瘍を生じさせる可能性がある傷害は化学的なもの、たとえば腐食性化学物質への暴露であるか、あるいは物理的なもの、たとえば異物による衝撃、または角膜移植術（たとえば角膜移植）または角膜切開（たとえば根治的角膜切開）における手術による切開であってよい。
【００６０】
本発明の方法は、たとえば角膜組織の潰瘍および他の危害、および床ずれなどの皮膚の創傷、静脈の潰瘍、熱傷、または加圧による痛みを治療する際に非常に有用である。本発明の方法にしたがって角膜の潰瘍を治療することにより、潰瘍の増殖が遅れるか阻止され、未検査のままである場合は穿孔につながる可能性がある。本発明の方法にしたがって角膜の潰瘍を治療することにより、角膜または皮膚のその損傷前の状態への回復速度である治癒の速度も改善され、日和見感染のリスクが軽減し、瘢痕組織の形成を阻害するかあるいは減少させる。本発明の治療法の好ましい標的は、ヘルペス・ウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染、またはシュードモナスの１種またはモラクセラ種（ウシの角膜の潰瘍を引き起こすＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｉｓの中のもの）などの細菌感染などの感染と関連がある角膜の潰瘍である。一実施形態では、本発明の方法は、ポリアニオン性ポリマー、たとえば架橋カルボキシポリメチレンからのミクロゲルを含む組成物を角膜の冒された領域に有効量投与することを含む。本発明の方法による皮膚の創傷の治療は、皮膚の創傷によって冒された領域に、マクロ粘度とミクロ粘度の比が１０，０００以下であり、ある実施形態では多機能性であるクリル由来のヒドロラーゼを含む、ポリアニオン性組成物を施すことを含むことが好ましい。治療をする開業医であれば、皮膚の創傷に冒された領域は創傷のサイズ、位置、および激しさと共に変わるが、創傷そのものおよび創傷の周辺の領域（３ｃｍ以内など）を含むことを理解しているであろう。
【００６１】
本発明の方法は、内部の手術による創傷を含めた内的な損傷を負わせる手術手順の後に、たとえば腹膜と内臓の間あるいは腹膜の非隣接領域間でしばしば形成される癒着などの、癒着の発生または厳度を阻害または減少させるのにも非常に有用である。癒着は、最初は２つの組織表面間で繊維状のバンドとして発達する瘢痕組織であり、付加しているにもかかわらず、正常では互いに対して自由に動くことができる。癒着は、傷害または有害な刺激が対向する表面の片側または両側の無欠性に害を与えた後に、回復プロセスの結果として生じる。有害な刺激には損傷（手術によるものおよび事故的なもの）、感染、および修復応答をもたらす炎症を引き起こす可能性がある任意の物理的または化学的物質がある。癒着によって冒された表面間の正常な動きが妨げられるとき、基底器官の機能不全、または痛みが生じる可能性がある。癒着は、主に繊維から構成される薄くてしっかりとした鎖として始まり、この段階では容易に破壊される。これらは時間と共に組織化され、コラーゲンが敷かれ、血管が新生される。この段階では、手術による分割のみが癒着構造を分離するであろう。つながれた器官の機能が害されているか、あるいは生存能力にリスクがあるとき、このことが必要になる。本発明の方法は、手術後の癒着の形成を阻害することに関するので、腹膜の癒着以外の他のタイプの癒着に適用することができる。たとえば、癒着除去（癒着の除去）、腱手術、胸部手術、腹部手術、目または耳の手術、脊髄手術、神経手術、骨盤手術、婦人科手術後、および頭蓋骨、脳、および脊髄の手術後の、癒着の形成または再形成の阻害。
【００６２】
本発明の方法は、ポリアニオン性ポリマー、多機能性ヒドロラーゼまたはこの両方を含む組成物を、冒された領域に損傷を治療するのに有効な量施すことによって、損傷、たとえば手術による切開が冒した領域、またはその中あるいはその周辺、あるいは角膜の潰瘍または危害を治療することを含む。ヒドロラーゼはプロテアーゼ、特に多機能性のクリル由来のセリンプロテアーゼであってよい。好ましい実施形態では、本発明の方法は、プロテアーゼ、好ましくは多機能性のクリル由来のプロテアーゼを含むことができるポリアニオン性ポリマーを含む組成物を用いて、角膜への創傷または手術による創傷によって冒された領域を治療することを含む。
【００６３】
任意のタイプの損傷によって冒される領域（患部）は、損傷の性質、サイズ、および位置に依存することを、当業者は理解しているであろう。たとえば角膜の創傷の場合、冒される領域は、暴露された目の表面全体となることもある。損傷が体腔に関する内部の手術による創傷であるとき、冒される領域は、手術による切開（創傷）を行う体腔中の器官または組織の表面を含む。腹膜切開の場合、冒される領域は、腹腔全体および腹腔中に存在する器官であり、開胸術の場合、冒される領域は、胸腔全体および胸腔中に存在する器官である。腱の手術の場合、冒される領域は切開の領域を含み、腱鞘の切開部分から１〜２ｃｍないし１５ｃｍまで広がっており、腱およびその鞘の周囲の組織表面を含む。
【００６４】
一実施形態では、本発明の方法は、有効量のポリアニオン性ポリマーを冒された領域に施すことによって、内部損傷によって冒された領域を治療して、損傷後の癒着の形成を減少させることを含む。ポリアニオン性ポリマーは架橋することができる。典型的には、組成物中のポリアニオン性ポリマーの量は０．５重量％と２．５重量％の間である。好ましい実施形態では、組成物は１％の架橋ポリアニオン性ポリマーを有する。
【００６５】
一実施形態では本発明の方法は、ポリアニオン性ポリマーを含み、ヒドロラーゼ、好ましくはプロテアーゼ、最も好ましくは多機能性のクリル由来のセリンプロテアーゼを含むことができる組成物を、冒された領域に有効量施すことによって、床ずれなどの皮膚の創傷、静脈の潰瘍、熱傷、または加圧による痛みによって冒された領域を治療することを含む。本発明のこの実施形態の組成物の有効量は、デブリドマンを助長し、皮膚創傷の悪臭および望ましくない浸出および感染を妨げ、好ましくは単に洗浄され包帯される場合より速く創傷を癒すのに充分な量である。
【００６６】
他の実施形態では本発明の方法は、ポリアニオン性ポリマーを含み、クリル由来のプロテアーゼ、好ましくはプロテアーゼ、より好ましくは多機能性のクリル由来のプロテアーゼを含むことができる組成物を有効量施すことによって、内部損傷によって傷つけられた腹膜、心膜、心外膜、および胸膜の冒された領域を治療することを含む。
【００６７】
他の実施形態では本発明の方法は、前述のポリアニオン性ポリマーを含み、プロテアーゼ、好ましくはクリル由来のプロテアーゼを含むことができる組成物を有効量施すことによって、手術または危害によって傷つけられた、脊椎、髄膜、たとえば硬膜（神経組織の保護膜）、または神経および神経鞘の領域を治療して、癒着の形成を減少または阻害させることを含む。あるいは、このような冒された領域は、当分野で知られているように、薬剤として許容される媒体担体の形であるヒドロラーゼを用いて治療することができる。
【００６８】
他の実施形態では、本発明の方法は、内部損傷、たとえば腱形成術における手術による創傷によって冒された、腱およびその鞘の領域を治療することを含む。
【００６９】
累積的な損傷または他の損傷を受けた領域は、損傷によって冒された領域に、以下の１つまたは複数：ポリアニオン性ポリマー、またはキモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、およびエラスターゼ活性の少なくとも２つを含む活性を有するプロテアーゼを含む組成物を、損傷を治療するのに有効な量投与することによって治療することができる。本発明の方法によって治療することができる、累積的な損傷創傷の非制限的な例には、腱炎、腱鞘炎または手根管圧迫症候群がある。
【００７０】
他の実施形態では、本発明の方法は、有効量のクリル由来の多機能性プロテアーゼを冒された領域に施すことによって、内部損傷によって冒された領域を治療して、癒着の形成を減少させることを含む。クリル由来の多機能性プロテアーゼは、当分野で知られている任意の薬剤として許容される媒体の形で、冒された領域に施すことができる。薬剤として許容される媒体は、本発明の多機能性プロテアーゼなどの薬理学的に活性がある物質を投与するための担体として働くが、活性物質の作用、または物質が投与される動物の身体の機能を害することは無い。等張の生理食塩水溶液は、薬剤として許容される媒体の一例である。薬剤として許容される媒体は、デキストラン、塩化カルシウム、グリシン、クエン酸、およびソルビトール、その他いくつかなどの、当分野で知られている賦形剤を有することができる。
【００７１】
架橋ポリアニオン性ポリマーを含む本発明の組成物を、腸、胸、頭蓋、腱、および婦人科の手術によって冒された領域に施して、癒着の形成または再形成を阻害するかあるいは減少させることもできる。
【００７２】
他の実施形態では本発明は、約０．１ｍｍと約５ｍｍの間の厚さを有する組成物を含むコーティングを手術用インプラントの表面に施すことにより、ミクロゲルであってもよいポリアニオン性ポリマーを含む組成物を用いて、インプラントとインプラントの周囲の組織の領域の間、あるいはインプラントの周囲の組織の異なる領域間の癒着の形成を減少させるための、手術用インプラントを処理する方法を提供する。本発明の方法で使用することができる手術用インプラントには、内耳の人工器官を含めた義関節および義骨、頭蓋用プレート、および心臓ペースメーカー、薬剤送達用インプラントおよび留置カテーテルなどがある。
【００７３】
他の実施形態では、本発明の方法は、ポリアニオン性ポリマー、酵素、好ましくはヒドロラーゼ、あるいはこの両方を含む組成物を投与することによって、慢性関節リウマチまたは他の自己免疫異常などの、炎症性の要素と関係がある炎症性疾患または状態を治療することまたは取り扱うことを含む。この組成物は、たとえば炎症性の要素あるいはその後遺症に関する状態または疾患によって冒された領域に投与することができる。この実施形態の方法に含まれる状態の他の非制限的な例は、慢性的な変形関節炎で起こる炎症などの、局所的な慢性の炎症を含む。
【００７４】
本発明の方法で使用する架橋ポリアニオン性ポリマーは、アクリル酸バックボーン、および生理学的条件下でアニオン形にイオン化する可能性がある官能基を有する架橋ポリマーを提供する、任意の方法によって作製することができる。たとえば、本発明の方法で使用するポリアニオン性ポリマーは、エチレン性不飽和架橋剤および負に帯電することができるイオン化可能な官能基を有する少なくとも１つのモノマーを含む、混合物の重合によって得ることができる。典型的には、イオン化可能な官能基は、塩基滴定可能な官能基である。カルボキシ基は、塩基滴定可能な官能基の一例である。ポリアニオン性ポリマーは、イオン化可能な官能基に加水分解し次いで負に帯電することができる前駆体官能基を有する、前駆体ポリマーから得ることもできる。たとえば、カルボン酸エステルはカルボキシ基の前駆体であり、塩基を用いて滴定すると、負に帯電したカルボン酸アニオンになる。前駆体ポリマーは、１つまたは複数のモノマーであって、その少なくとも１つが負に帯電した状態になることができる官能基の前駆体を有しているモノマー含む、混合物の重合によって得ることができる。前駆体基は、たとえば加水分解、または前駆体基の化学的構造の調査から当業者には明らかであろう任意の他の手段によって、負に帯電した状態になることができる官能基に転換することができる。前駆体基の転換は、組成物を投与する前、投与時、あるいは投与後に行うことができる。
【００７５】
本発明の方法を実施する際に有用なポリアニオン性ポリマーの骨格、または主鎖は、構造Ｉの１つまたは複数のモノマーであって、示される二重結合が少なくともフリーラジカル重合によって重合する傾向があるモノマーの重合から誘導することができる繰り返し単位を含む。
（Ｒ^３）（Ｒ^２）Ｃ＝Ｃ（Ｒ^１）−Ｘ−Ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
構造Ｉでは、Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３、Ｘ、およびＹは、前述のように定義したものである。
【００７６】
適切なモノマーの例には、数例挙げれば、アクリル酸、メタクリル酸、アリルスルホン酸、イタコン酸、マレイン酸またはその無水物、イタコン酸、シトラコン酸が含まれる。水とミクロゲルを形成するポリアニオン性ポリマーを作製するために使用することができる、多くの他のモノマーは、Ｈｕａｎｇ他、米国特許第４，５０９，９４９号によって記載されている。これを参照により本明細書に組み込む。
【００７７】
ミクロゲルを形成することができる架橋ポリアニオン性ポリマーに関しては、骨格および主鎖という語は互換的に使用され、架橋剤から誘導されないポリマー鎖の一部分を指すことは理解されるであろう。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ミクロゲルは、６と８の間のｐＨにおいてその水性膨張状態で、１μｍと５００μｍの間の粒子サイズを有する。他の実施形態では、ミクロゲルは、６と８の間のｐＨにおいてその水性膨張状態で、１０μｍと５００μｍの間の粒子サイズを有する。
【００７９】
本発明の方法中で使用するポリアニオン性ポリマーは、構造Ｉによって記載されるただ１つのモノマーから誘導される繰り返し単位を有するホモポリマーであってよく、あるいはそれらは、構造Ｉの任意の数のモノマーの混合物の重合から誘導されるマルチポリマーであってよい。コポリマー、ターポリマー、クアトラポリマーおよび他のマルチポリマーは、イオン化可能な基または前駆体、したがってたとえばスチレンを有しておらず、構造Ｉのモノマーと共重合することができるモノマーからの繰り返し単位を含むことができる。ただし最終ポリマーは、ポリマー１グラム当たり（工業用に認められている乾燥状態で）、０．００１モル以上、好ましくは０．００１４モル以上、より好ましくは０．０１モル以上の塩基滴定官能基を有する。塩基滴定官能基は、ＫＯＨを用いて滴定することができる官能基、たとえばカルボキシ基である。
【００８０】
好ましい実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは架橋しており、水と組み合わせるとミクロゲルを形成する。好ましい架橋ポリアニオン性ポリマーは、化学的に架橋している。化学的架橋はイオン結合または共有結合によるものであってよいが、共有結合によることが好ましい。架橋はポリアニオン性ポリマー作製時に導入することができるか、あるいはポリアニオン性ポリマーを作製した後に導入することができる。化学的架橋は生理的条件下で耐久性である可能性があるか、あるいはそれらは生理的条件下で加水分解性の（不安定である）可能性がある。架橋に関しては、不安定であるとは、酵素的あるいは非酵素的な加水分解または酸化を受けやすいことを意味する。
【００８１】
共有結合による架橋は、構造Ｉによって表されるモノマーと同じ機構、好ましくはフリーラジカル機構によって重合する傾向がある、少なくとも２つのエチレン性不飽和炭素間二重結合を有する、１つまたは複数の化学架橋剤を使用することによって、ポリアニオン性ポリマー作製時に導入されることが好ましい。ポリアニオン性ポリマー作製時に導入される化学架橋剤を選択して、ポリアニオン性ポリマーを含む組成物を施した後に生理的条件下で耐久性がある共有架橋を生成させることができる。つまり、架橋剤によって導入される架橋は、生理的条件下での破断または開裂に耐性がある。ポリアニオン性ポリマー作製時に導入し、耐久性がある架橋を生成することができる架橋剤の例には、ジビニルベンゼン、および多価アルコールのアルケニルエーテル、たとえばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ２５−１７２−０）から入手可能なペンタエリスリトールのトリアリルエーテルなどがある。３つ以上のヒドロキシル基を有するこれらの多価アルコールの、市販のエチレン性不飽和エーテルまたはエステルは、いくつかのヒドロキシル基が誘導体化していない可能性がある混合物として、典型的には提供される。本明細書でのエーテル化またはエステル化の特定の度合い、たとえばトリまたはテトラを参照すると、当分野で知られているエーテル化またはエステル化した多価アルコールの市販の重要な混合物も指し、指定のエーテル化またはエステル化の度合いよりも低級あるいは高級である、微量のエーテル化またはエステル化した多価アルコールを含むことは理解されるであろう。したがって、二重結合の特定のモル分率を参照すると、この知られている誘導の度合いの変化のために予想される変化を含むことは理解されるであろう。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態、たとえば癒着を阻害する好ましい方法を実施する際に、ポリアニオン性ポリマーの鎖間の架橋は、生理学的条件下で分解する可能性がある。ある理論によれば、架橋の破断によって、治療する動物からのポリアニオン性ポリマーの最終的な除去が容易になり得る。なぜなら、分子のサイズ（分子量）が縮小した断片は、架橋が破断すると形成され、小さな断片がより容易に除去されるからである（Ｙａｍａｏｋａ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、８４、３４９（１９９５））。架橋剤の２つ以上のエチレン二重結合が官能基、たとえば加水分解する傾向があるエステルまたはアミドによって隔てられる場合、架橋の破断は容易になる。エステル結合を有する架橋剤の例には、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ペンタエリスリトール、グリセロールおよびソルビトールなどの二価および多価アルコールの、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルがある。このような架橋剤は市販されているか（たとえば、ペンタエリスリトールトリアクリレート、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ２４，６７９）、あるいは多価アルコールおよび塩化アクリロイルまたは塩化メタクリロイルから容易に調製することができる。２００と４０，０００の間の分子量を有するポリエチレングリコールのアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルも、架橋剤として使用することができる。オリゴ糖のエチレン性不飽和誘導体、またはその還元産物を架橋剤として使用することができる。このタイプの非常に好ましい架橋剤は、アリルスクロースである。それぞれのエチレン二重結合と連結剤の任意の他のエチレン二重結合の間に少なくとも１つのカルボネートまたはカルバメート基が存在する、架橋剤も使用することができる。ビス−（２’−アクリロキシエチル）カルボネート、ペンタエリスリトールトリ（２’−アクリロキシエチル）ホルメート、およびＮ−（２−アクリロキシ）エチル−（２−アクリロキシ）エチルカルバメートは、カルボネート結合型およびカルバメート結合型架橋剤の例である。加水分解性の架橋を有する架橋ポリアニオン性ポリマーも、エチレン二重結合が尿素基によって結合している架橋剤を用いて調製することができる。Ｎ，Ｎ’−ジ（２’−アクリロキシエチル）尿素は、尿素結合型架橋剤の一例である。乳酸をベースとする架橋剤も使用することができる。１−（２−アクリロキシプロパノイル）−２−アクリロキシエタンは、このような架橋剤の一例である。
【００８３】
非耐久性の共有結合による架橋は、ポリアニオン性ポリマーの作製後に、ポリアニオン性ポリマーを官能化させ、それを適切な架橋剤と反応させることによって導入することができる。たとえば、構造ＩのＹがカルボキシル基であるとき、ポリマー中の０．１％〜１０％のカルボキシル基を、たとえば塩化チオニルの作用によって酸塩化物に官能化することができる。このようにして形成した酸塩化物基を、たとえばα，ω−ジアミンまたはα，ω−ジオール、たとえばポリエチレングリコールと反応させて、異なるポリマー鎖上にアミドまたはエステル基を介して共有結合性の架橋を形成することができる。架橋は、ポリアニオン性ポリマーの形成後に、ペンダント・ヒドロキシル基をポリアニオン性ポリマーに与え、これらをビスクロロギ酸、たとえばα，ω−ジオールのビスクロロギ酸エステルと反応させることによって導入することができる。ポリアニオン性ポリマーには、構造Ｉの１つまたは複数のモノマーと酢酸ビニルを重合させ、次にアセテート基を加水分解することによって、あるいは構造Ｉの１つまたは複数のモノマーと、たとえばメタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）を共重合させることによって、ペンダント・ヒドロキシル基を与えることができる。一般に、酢酸ビニルまたは共重合させるＨＥＭＡの量は、モル・ベースで１０００個の繰り返し単位当たり０．１〜１０のヒドロキシル基を与えるのに充分であろう。
【００８４】
架橋剤の量は、少なく保つことが好ましい。好ましい架橋ポリアニオン性ポリマーは水とミクロゲルを形成し、構造Ｉの１つまたは複数のモノマーと前に論じたタイプの１つまたは複数のエチレン性不飽和架橋剤の混合物を、重合させることによって作製される。使用する１つまたは複数の架橋剤の量は、水と組み合わせるとミクロゲルを形成する架橋ポリアニオン性ポリマーを生成するのに有効である。エチレン性不飽和架橋剤を使用して、ポリアニオン性ポリマーの形成時に架橋を形成するときは、１つまたは複数のエチレン性不飽和架橋剤のエチレン二重結合は、１つまたは複数のモノマーと１つまたは複数の架橋剤を組み合わせたエチレン性不飽和二重結合全体の、０．０２未満のモル分率、好ましくは０．０１未満のモル分率を占めることが好ましい。典型的には、エチレン性不飽和架橋剤は、１つまたは複数のモノマーと１つまたは複数の架橋剤を組み合わせたエチレン性不飽和二重結合全体の、０．００１以上のモル分率を占める。これらのモル分率は、エチレン性不飽和架橋剤中のエチレン二重結合の名目上の数に基づいて計算し、前に論じた市販のエチレン性不飽和架橋剤１分子当たりの、二重結合の平均数の知られている変化を考慮して調整する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を実施する際に使用するポリアニオン性ポリマーは、少なくとも約１００、より好ましくは少なくとも約２００、さらに好ましくは少なくとも約４００、さらに好ましくは少なくとも約６００、さらに好ましくは少なくとも約７００の酸価を有しており、このときポリマーは、工業用に許容できる「乾燥した」調製物、たとえばポリマー、２％までの湿気、残存溶媒、または残存モノマーを含む調製物中にある。好ましい実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは、工業用に許容できる乾燥した配合物中のポリマー１グラム当たり、０．００１モル以上、好ましくは０．００１４モル以上、より好ましくは０．０１４モル以上の塩基滴定官能基を有する。
【００８６】
ポリアニオン性ポリマーは、０．５％ｗ／ｖの中和した水性溶液（たとえばｐＨが６と８の間）中において、好ましくは少なくとも約２，０００ｃＰ、より好ましくは少なくとも約４，０００ｃＰ（２５℃で２０ｒｐｍ）の、マクロ粘度の指標であるＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄのＲＶＦまたはＲＶＴ粘度を有する。これらの粘度のパラメータは、ポリマーの酸の形に関するものである。ポリマー溶液のマクロ粘度（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度）およびミクロ粘度に関する、Ｒ．Ｙ．Ｌｏｃｈｈｅａｄ他、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍｅｄｉａ、ｐｐ．１１３〜１４７、１９８９を参照のこと。しかしながら、一定の好ましい実施形態では、マクロ粘度はミクロ粘度の約１００，０００倍を超えず、好ましくは約１０，０００倍を超えない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、架橋ポリアニオン性ポリマーは、９３４Ｐより９７１Ｐ、９７４Ｐより９３４Ｐの順で好ましい、ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４ＰおよびＣａｒｂｏｐｏｌ９７４ＰなどのＣａｒｂｏｐｏｌの商用名で、ＢＦＧｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｂｒｅｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ）によって販売されているポリマーなどの、アクリル酸の架橋ホモポリマーまたはコポリマーである。これらのタイプのポリマーは、実質的に非環式である脂肪族のバックボーンを有しており、カルボキシポリメチレンまたはカルボマーと名づけられており、任意の適切な数のモノマーから構成されていてよく、特定の治療において、傷害により影響を受けた領域に施される調製物当たりで一定数のこのようなモノマー、または不定数のモノマーであってよい。さらにカルボキシポリメチレンは、ポリメチレンのバックボーンに結合した不定数のカルボキシル基を有することができる。連結剤として、ペンタエリスリトールのトリアリルエーテル（他のモノマーをベースとして０．１％〜２．５％、ｗ／ｗ）が適切である。
【００８８】
ミクロゲルを使用する場合、適切な塩をミクロゲルと組み合わせることができ、ミクロゲル自体は、ミクロゲルが接触する傷ついた角膜、腹膜、または任意の他の組織に害を引き起こさないという要件によって、その適性を決定する。適切な塩には、当分野で知られる生理学的濃度で提供されるときは特に、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムがあるが、これらだけには限られない。
【００８９】
本発明の方法を実施する際に使用する組成物は、グリセロール、カルボキシポリメチレン、および蒸留水を含むことができ、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基、ジイソプロパノールアミン（ＤＩＰＡ）などのアルキルアミンを使用して、ｐＨ調整する。グリセロールの濃度が適切なストック溶液は蒸留水を用いて調製することができ、その残りが蒸留水である８７％（ｗ／ｗ）グリセロール溶液が好ましい。水酸化ナトリウムなどの塩基の適切な溶液のストック溶液、たとえばその残りが水である１０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液も、蒸留水を用いて調製することができる。当分野でよく知られるように、ストック溶液の適切な希釈液を作製することによって、本発明の方法を実施する際に有用なポリマー組成物は、好ましくは以下の範囲の成分の最終濃度：（１）約０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール；（２）約０．１％〜約１０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約０．４％〜約７％、さらに好ましくは約１％〜約５％のカルボキシポリメチレンを有し、調合物の残りは蒸留水である。水酸化ナトリウム、１０％ストックはｐＨ調整のために使用し、ほぼ中性に調整されたｐＨ、より好ましくは約７〜約７．８のｐＨ、さらに好ましくは約７．２〜約７．６のｐＨが結果として生じる。
【００９０】
多機能性ヒドロラーゼを含ませることを企図するときは、ポリアニオン性ポリマー組成物は、凍結乾燥、または蒸留水による再構成、あるいはこの両方に対して多機能性ヒドロラーゼを保護することを目的とする、賦形剤を用いて調製することもできる。このような賦形剤には、たとえば塩化カルシウム、グリシン、クエン酸、ソルビトール、およびデキストランがある。たとえば５０単位の多機能性ヒドロラーゼ（この単位は前に定義した）を含むバイアルは、凍結乾燥を企図するときは、以下に与える濃度の範囲の以下の賦形剤を含むことが好ましい：（１）約０．６ｍＭから約１ｍＭの塩化カルシウム、（２）０から約１２ｍＭまで、好ましくは約６ｍＭから約１０ｍＭ、最も好ましくは約８ｍＭのグリシン、（３）０から約１２ｍＭまで、好ましくは約６ｍＭから約１０ｍＭ、最も好ましくは約８ｍＭのクエン酸、（４）約１００ｍＭから約２００ｍＭ、好ましくは約１５０ｍＭと１７０ｍＭの間、最も好ましくは約１６０ｍＭのソルビトール、（５）約１重量％から約１０重量％、好ましくは約７重量％と約８重量％の間、最も好ましくは６重量％のデキストラン。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、場合によっては適切な多機能性ヒドロラーゼと組み合わせて、前述のポリアニオン性ポリマー組成物を用いる、創傷、特に皮膚の創傷の治療を提供する。多機能性ヒドロラーゼは、キモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびエキソペプチダーゼ活性を含む群からの少なくとも１つの活性に対応する、タンパク質分解活性を有することが好ましい。多機能性ヒドロラーゼは、前記タンパク質分解活性の少なくとも２つ、より好ましくは前記タンパク質分解活性の少なくとも３つ、さらに好ましくは前記タンパク質分解活性の少なくとも４つ、最も好ましくは前記タンパク質分解活性のすべてを有することがより好ましい。
【００９２】
本発明の方法の状況において使用する組成物は、たとえば局所的に、このように治療する領域に施用することができる。ポリアニオン性ポリマー組成物は、ペースト、ゼリーとして、あるいはシートの形で施用することができ、これらは体液によってｉｎ ｓｉｔｕで予備水和または水和させることができる。
【００９３】
内部損傷、たとえば癒着を生じやすい内部の手術による創傷によって冒された領域に投与するために、ポリアニオン性ポリマー組成物は、ペースト、ゼリー、あるいは注入可能な液体調合物として投与することができる。内部損傷を治療するために、多機能性のクリル由来のタンパク質を、薬剤として許容される媒体、たとえば等張の生理食塩水溶液の中に投与することができる。多機能性タンパク質を、ポリアニオン性ポリマーを含む組成物の形で、内部の手術による創傷によって冒された領域に投与することもできる。好ましい実施形態では、多機能性タンパク質を、ミクロゲルを含む組成物の形で、手術による創傷によって冒された領域に投与する。特に好ましいミクロゲルは、架橋ポリアニオン性ポリマーを含む。架橋カルボキシポリメチレンは、有用な架橋ポリアニオン性ポリマーである。
【００９４】
膜、たとえば腹膜、胸膜、または心膜に対する損傷を治療する方法、または内部器官に対する損傷を治療する方法は、損傷した部位および冒された領域に、本発明の組成物を相互運用的に投与することを含む。手術による癒着の形成または再形成を抑制するための治療は、相互運用的に行われる。
【００９５】
角膜の創傷の治療は、標準的な薬剤の慣習にしたがって、任意の薬剤として許容される媒体中にヒドロラーゼを使用して行うことができる。媒体はミクロゲルであってよい。滴またはゲルを目に施すことによって治療を行う。目に関する投与の場合、軟膏または滴下可能な液体を、アプリケータまたは点眼びんなどの当分野で知られている目に関する送達系によって、送達することができる。角膜の創傷を治療するためのこのような組成物は、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチンなどのムコ多糖類、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルアルコール、ソルビン酸などの防腐剤、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロム、および通常量の希釈剤および／または担体を含むことができる。好ましい実施形態では、目に投与される多機能性タンパク質を含む組成物は、ポリアニオン性ポリマー組成物を含む。
【００９６】
たとえばヘルペス角膜炎感染によって引き起こされる潰瘍などの、角膜の潰瘍を治療する方法は、多機能性ヒドロラーゼを含む組成物を冒された目に投与することを含み、かつ角膜の潰瘍を治療するのに有効な量の多機能性ヒドロラーゼを投与し、多機能性ヒドロラーゼがキモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびエキソペプチダーゼ活性の少なくとも２つ、および参照配列と少なくとも約６０％の配列類似性を有している。ヒドロラーゼは、前記タンパク質分解活性の少なくとも３つ、および参照配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有することがより好ましい。ヒドロラーゼは、前記タンパク質分解活性の少なくとも３つ、および参照配列と少なくとも約９０％の配列類似性を有することがさらに好ましい。ヒドロラーゼは、前記タンパク質分解活性の少なくとも３つ、および参照配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有することがさらに好ましい。ヒドロラーゼは、前記タンパク質分解活性の少なくとも３つ、および参照配列と少なくとも約９５％の配列類似性を有することがさらに好ましい。
【００９７】
癒着を阻害することを対象とする実施形態では、本発明の方法は、コルチゾンなどのコルチコステロイドを、単独あるいは抗ヒスタミン剤と組み合わせて用いる、傷つけられた膜の予備治療または同時治療、あるいはこの両方を含むことができる。
【００９８】
前述のように、本発明の状況において使用する多機能性ヒドロラーゼは、プロテイナーゼなどのクリル由来のヒドロラーゼであることが好ましい。多機能性ヒドロラーゼは多機能性タンパク質の一部であり、非酵素的機能および酵素的機能を有することができることがより好ましい。南極地方のクリルを含めた甲殻類は、本発明の多機能性タンパク質の有用な源である。「多機能活性」を有するタンパク質は、キモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、およびエラスターゼまたはエキソペプチターゼ活性の少なくとも１つ、またはアシアロＧＭ_１セラミド結合活性を含むものとして本明細書では定義する。クリル由来の多機能性タンパク質の精製については、たとえば参照によって本明細書に組み込んである、以下の「Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ」という表題の、米国特許出願第０８／６００，２７３号（１９９６年２月８日出願）、発明者ｄｅＦａｉｒｅ他を参照のこと。
【００９９】
内部表面に対する治療を含めた局所的な治療については、１回の施用当たりの、多機能性のクリル由来のタンパク質の好ましい適切な用量は、約０．０１Ｕ／ｍｌから約１０Ｕ／ｍｌの範囲であり、典型的にはクリーム、軟膏、ポリアニオン性ポリマーなどの担体の０．５ｍｍから５ｍｍの層を施し、約０．０１Ｕ／ｍｌから約１．０Ｕ／ｍｌであることが好ましく、約０．２Ｕ／ｍｌであることがさらに好ましい。この用量範囲は、ゲル、軟膏、クリーム、液体、スプレー、エアロゾルなどの媒体に適用される。創傷のデブリドマンなどの、いくつかの実施形態では、より大きな用量を最初に使用することができる。トローチ剤は、約０．０１Ｕから約１０Ｕ、より好ましくは約０．０１Ｕから約１．０Ｕ、さらに好ましくは約０．２Ｕを送達するように設計されていることが好ましい。外的治療についてはすべて、一般にタンパク質組成物を、１日当たり約１から約１０倍、好ましくは１日当たり約２倍から約５倍施用する。当然ながらこれらの値は、医学分野の当業者は理解するように、疾患のタイプおよび重篤度、患者の年齢、体重、および医学的条件を含めた、いくつかの要因と共に変わるであろう。非常に大きな用量を、実質的な悪影響を伴わずに使用することができることが考えられる。一般に多機能性タンパク質は、有効量で投与される。
【０１００】
他の実施形態では本発明は、ポリアニオン性ポリマー（たとえばミクロゲル）を含む有効量の組成物を癒着の形成を生じやすい損傷によって冒された領域に投与することによって、そのような損傷を治療する方法を提供する。損傷が腹膜に対するものであるときは、０．５重量％から２．５重量％のポリアニオン性ポリマーを含む２００ｍｌから３００ｍｌのポリマー組成物が典型的な有効量であるが、開業医であれば、損傷の位置、サイズ、および重篤度によってこの量を変えることを理解しているであろう。
【０１０１】
ヒトは治療の好ましい対象である。しかしながら、本開示に照らすことにより当業者に理解されるように、多機能性タンパク質を多くの獣医学的状況で使用して、動物、好ましくは哺乳動物を治療することができる。
【０１０２】
投与する組成物は、ｐＨ６．５からｐＨ７．５などの、生理学的に適切なｐＨに調節することが好ましい。酵素が組成物中に含まれる場合、活性を増大させるかあるいは酵素を安定させるのに有効な量の、塩および安定剤を加えることができる。
【０１０３】
他の好ましい実施形態では、本発明の状況において使用する多機能性ヒドロラーゼは、前述のタンパク質分解活性、および参照配列と少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を有するのが好ましい。より好ましくは、多機能性ヒドロラーゼは、参照配列と少なくとも約７０％の同一性または類似性、より好ましくは参照配列と少なくとも約８０％または８５％の同一性または類似性、さらに好ましくは参照配列と少なくとも約９０％または９５％の同一性または類似性、最も好ましくは参照配列と少なくとも約９７％の同一性または類似性を有している。前述の類似性のパーセンテージが好ましいが、同一性のパーセンテージがより好ましい。
【０１０４】
徐放性調合物、リポソーム調合物、またはポリマー・マトリックスだけには限られないが、これらを含めた多くの他の投与媒体が、当業者には明らかである。
【０１０５】
多機能性ヒドロラーゼまたは抗生物質などの他の物質を含むかあるいは含まない、ポリアニオン性ポリマー組成物を投与することによって損傷を治療する方法は、適切な時間で行うことが好ましく、その適性は、たとえば冒された組織および治療する状態の種類および重篤度を調べることから、熟練した開業医には解るであろう。治療剤は、少なくとも冒された創傷の治癒が完了するまで、より好ましくはその後少なくともさらに５日間投与することが好ましい。角膜の創傷は、たとえば２日から３５日かけて治療することができる。他の場合、少なくとも約１０日間、より好ましくは少なくとも約２０日間、さらに好ましくは少なくとも約２８日または３５日間、治療を行う。ポリアニオン性ポリマー組成物および多機能性ヒドロラーゼを含む組成物を用いる、皮膚の創傷の治療は、７日から４２日であってよい。当分野で知られている目への局所施用の方法を使用して、１日当たり少なくとも１回、より好ましくは１日当たり２回から約６回までの施用によって、治療を行うことが好ましい。
【０１０６】
多機能性ヒドロラーゼは、約２０ｋｄから約４０ｋｄの好ましい分子量を有し、その分子量は約２６ｋｄから約３２ｋｄであることがより好ましい。
【０１０７】
好ましい多機能性ヒドロラーゼには、Ｐａｎａｅｕｓ ｖａｎａｍｅｉｉ １、Ｐａｎａｅｕｓ ｖａｎａｍｅｉｉ ２、Ｐａｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ−１、Ｐａｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ ｔｒｙｐｔｉｃ、Ｐａｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ−２、Ｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ酵素Ｉ、Ｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ酵素ＩＩ、Ｋａｍｃｈａｔｋａ ｃｒａｂ ＩＡ、Ｋａｍｃｈａｔｋａ ｃｒａｂ ＩＩＡ、Ｋａｍｃｈａｔｋａ ｃｒａｂ ＩＩＢ、Ｋａｍｃｈａｔｋａ ｃｒａｂ ＩＩＣ、Ｃｒａｙｆｉｓｈプロテアーゼ１、Ｓａｌｍｏｎ酵素１、Ａｔｌａｎｔｉｃ ｃｏｄ Ｉ、Ａｔｌａｎｔｉｃ ｃｏｄ ＩＩ、または第３のＡｔｌａｎｔｉｃ ｃｏｄトリプシン（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８０：８５〜９４（１９８９）ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｓ０３５７０中に記載されている）があるが、これらだけには限られない。これらの特異的な酵素は、以下のそれぞれのペプチド配列を含むことが好ましい。
「配列表１」

【０１０８】
本発明の状況において使用する最も好ましい多機能性ヒドロラーゼは、クリルの多機能性ヒドロラーゼを精製した調製物であるＰＨＭ−１０１である。この酵素を精製する方法、および好ましい性質はＰＣＴ／ＵＳ９９／１４７５１中に記載されている。
【０１０９】
本発明の方法は、適切な抗生物質を用いる、冒された組織の予備治療または同時治療、あるいはこの両方を含むことができる。適切な抗生物質は、生理学的条件中に置かれたときに、その効能を保持している抗生物質である。いくつかの抗生物質は組織に局所的に使用するのが好ましく、これにはシプロフロキサシンなどがあるが、これだけには限られない。抗生物質は、多官能性ヒドロラーゼを用いてあるいは用いずに、ポリアニオン性ポリマーを使用して治療剤中に含ませることができる。
【０１１０】
６．加水分解性のポリマー
一実施形態では、加水分解性の結合を含むポリアニオン性ポリマーであって、２つ以上のポリアニオン性ポリマー・セグメント、ポリアニオン性ポリマー・セグメントを結合させる連結部分を含み、連結部分が以下の（Ｉ）または（ＩＩ）、あるいはその両方を含むポリアニオン性ポリマーを提供する：
（Ｉ）ポリアニオン性ポリマーのアシルまたはアシル類似体部分を取り込んでいるアミド、エステルまたはチオエステル結合を介して結合しているセグメントであって、セグメントが：（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれたオキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有するＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン（ここでのアルキレンおよびこのパラグラフ中で以下に述べるアルキレンは、Ｃ_１〜Ｃ_１０またはＣ_１〜Ｃ_５であってよい）、ただしアミド、エステルまたはチオエステル結合の少なくとも１つはエステル結合以外のものである；または（ｂ）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉ）ヒドロキシまたはチオールＣ_２〜Ｃ_５カルボン酸またはヒドロキシプロリン誘導体および（ｉｉ）｛（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、または（ｂ）α，ω−ジオールまたは鎖が延長したα，ω−ジオール｝のポリマー・セグメント；または（ｃ）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉ）１つまたは複数のヒドロキシまたはチオールＣ_２〜Ｃ_５カルボン酸またはヒドロキシプロリン誘導体、（ｉｉ）｛（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、または（ｂ）１つまたは複数のα，ω−ジオールまたは鎖が延長したα，ω−ジオール｝および（ｉｉｉ）１つまたは複数のカルボニルジオキシ部分のポリマー・セグメント；または（ｄ）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉｉ）（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、（ｉｉ）（ｂ）１つまたは複数の鎖が延長したα，ω−ジオール、および（ｉｉｉ）１つまたは複数のカルボニルジオキシ部分のポリマー・セグメント；または（ｅ）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉｉ）（ｂ）１つまたは複数の鎖が延長したα，ω−ジオール、および（ｉｉｉ）１つまたは複数のカルボニルジオキシ部分のポリマー・セグメント；または（ｆ）ポリアニオン性ポリマーの酸部分の間で形成された直接的無水物；または（ｇ）ポリアニオン性ポリマーの酸部分の間で形成された無水物架橋およびカルボニル架橋を含むセグメント；または
（ＩＩ）架橋反応後の残基であって、
（ａ）架橋反応のために利用可能な不飽和結合を提供する、２つ以上の末端アクリレートまたはメタクリレート部分；
（ｂ）アクリレートまたはメタクリレート部分のアシル結合を取り込んでいるアミド、エステルまたはチオエステル結合を介して末端アクリレートまたはメタクリレート部分を結合させるセグメントであって、セグメントは：（１）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレンであって、ただしアミド、エステルまたはチオエステル結合の少なくとも１つはエステル結合以外のものであるアルキレン；または（２）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉ）ヒドロキシまたはチオールＣ_２〜Ｃ_５カルボン酸またはヒドロキシプロリン誘導体および（ｉｉ）｛（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、または（ｂ）α，ω−ジオールまたは鎖が延長したα，ω−ジオール｝のポリマー・セグメント；または（３）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉ）１つまたは複数のヒドロキシまたはチオールＣ_２〜Ｃ_５カルボン酸またはヒドロキシプロリン誘導体、（ｉｉ）｛（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、または（ｂ）１つまたは複数のα，ω−ジオールまたは鎖が延長したα，ω−ジオール｝および（ｉｉｉ）１つまたは複数のカルボニルジオキシ部分のポリマー・セグメント；または（４）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉｉ）（ａ）アミド、エステルまたはチオエステル結合中に取り込まれている、オキシ、チオ（−Ｓ−）またはイミノ（−ＮＲ−、ＲはＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである）から選択される末端連結基を有する、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、（ｉｉ）（ｂ）１つまたは複数の鎖が延長したα，ω−ジオール、および（ｉｉｉ）１つまたは複数のカルボニルジオキシ部分のポリマー・セグメント；または（５）アミド、エステルまたはチオエステル結合が結合したポリマー・セグメントであって、（ｉｉ）（ｂ）１つまたは複数の鎖が延長したα，ω−ジオール、および（ｉｉｉ）１つまたは複数のカルボニルジオキシ部分を含むセグメントの残基。
【０１１１】
他の実施形態では、それぞれが片末端または両末端で、ヒドロキシドまたはチオール部分からの酸素またはイオウ残基である連結基で、末端形成している２つ以上のポリアニオン性ポリマー・セグメント、および連結基を連結して直鎖状ポリアニオン性ポリマーを形成する、内部アミド、エステルまたはチオエステル結合において開裂可能な連結基部分を含む、直鎖状ポリアニオン性ポリマーを提供する。ポリマーは、炭素、水素、酸素およびイオウから選択される原子からなり、炭素および水素を含むモノマー部分を含むことができる。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、（ａ）３つ以上（たとえば５または６まで）の結合ヒドロキシルまたはチオールを有するＣ_１〜Ｃ_１２（好ましくはＣ_１〜Ｃ_１０またはＣ_１〜Ｃ_５）アルキレン、あるいは３つ以上の連結性ヒドロキシルを有する単糖または二糖のコアを、（ｂ）以下の式の環式ジエステルの３当量以上（たとえば８）と反応させる：
【化４】

上式でＲ^１およびＲ^２は独立にメチレンまたはエチレンであり、２つまでのＣ_１〜Ｃ_４アルキルで置換することができる。生成する多価コアは、前記のヒドロキシルまたはチオールに置換基−Ｒ^３ _ｎを有する構造を有しており、式中ｎは０以上（０〜８など）であり、ｎ値の合計は少なくとも３〜８（３〜８など）であり、Ｒ^３は独立に以下のものである：
【化５】

Ｒ^１およびＲ^２はメチレンであり、置換できることが好ましい。置換体はＣ_１〜Ｃ_２アルキルであることが好ましい。開いた環式ジエステルからの末端ヒドロキシルが反応して、後のフリーラジカル重合に反応性があるように適合させた（したがってポリアニオン性ポリマー・セグメントを生成するように適合させた）エステルまたはエーテル結合不飽和部分でヒドロキシルを置換する。この部分は、たとえば塩化アクリロイルを用いて形成することができるような、エステル結合アクリロイル基であることが好ましい。ｎの平均は１または２であることが好ましい。コアの少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％以上の結合ヒドロキシルまたはチオールが、このように反応することが好ましい。１つの好ましいコアはペンタエリスリトールである。
【０１１３】
後のフリーラジカル重合に反応性があるように適合させた末端不飽和部分を有する、任意の多価コア（本明細書に記載される任意のもの）で始めると、後のフリーラジカル重合は、ポリアニオン性ポリマー・セグメントを９０％以上のセグメントの分子量が５０ｋｄまたは４０ｋｄ以下になるように制限するように適合させること（たとえば鎖延長停止剤によって）が好ましい。一実施形態では、９５％、９８％以上のセグメントがこれらのサイズ制限中に入る。平均分子量は２０ｋｄ〜４０ｋｄ、または２５ｋｄ〜３５ｋｄであることが好ましい。適切な連鎖停止剤は、当分野で知られている。
【０１１４】
したがって本発明の一実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは、加水分解性の結合を含む多価架橋剤によって架橋した、これらのサイズのポリアニオン性セグメントを有する。
【０１１５】
コア部分は、このような式（５２）の化合物を溶解させるのに有効な高温、ラクチドについては１２０℃において、式（５２）の化合物と反応させることができ、この反応はたとえば２０時間以上行う。後のフリーラジカル重合に反応性があるように適合させた連結部分の形成の一例は、周囲温度におけるトリエチルアミンの存在下でのジクロロメタン中での塩化アクリロイルとの反応である。
【０１１６】
他の好ましい加水分解性のポリマーであるポリアニオン性ポリマーには、２つ以上の直鎖状に結合したポリアニオン性セグメントを含む任意のポリマーがあり、これらの結合は、手法ＩＶで後述するものと同様に、ポリアニオン性セグメントの末端オキソまたはチオ部分に結合する加水分解性の連結部分を介したものである。セグメントは、ここに記載した１つまたは複数のサイズ制限内のものであることが好ましい。ポリアニオン性セグメントのこれらの直鎖状マルチマーを、加水分解性の連結部分を用いてさらに架橋させることができる。
【０１１７】
他の好ましい加水分解性のポリマーでは、カルボキシレートを提供するモノマーのサンプリング（たとえば２０個の中の１つ）用のカルボキシレートを含むポリアニオン性ポリマーを誘導体に変え、アミド、エステルまたはチオエステル結合を介して−Ｘ−Ｒ^４−Ｙ−Ｈに結合させ、ＸおよびＹは独立にＳ、ＯまたはＮＨであり、Ｒ^４は２つまでのＣ_１〜Ｃ_４アルキルで置換することができる直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１０（好ましくはＣ_１〜Ｃ_５）アルキルである。ポリアニオン性ポリマーへの一端の選択的な付加を容易にする異なる反応性を与えるために、ＸとＹは異なることが好ましい。しかしながら、ＸとＹが同じである場合でも、保護基の化学的性質（同時係属のＡｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ ３１４５７２〜１０３Ｃ中の例示を参照のこと）を使用して、この選択的な結合を得ることができる。次いで、ＹＨは、末端アクリレートまたはアクリルアミド部分を有する架橋剤（連結部分）を用いたＭｉｃｈｅａｌ付加によって反応する。したがって、連結部分は以下の構造を有する：
【化６】

上式でＹ^２はＳ、ＯまたはＮＨ（好ましくはＯまたはＮＨ）、ｎは２以上（たとえば４、５または６まで）であり、Ｒ^５はＣ、Ｈ、およびＯ、ＳまたはＮであってよい２つ以上のヘテロ原子を含む加水分解性の連結部分であり、Ｏ、ＳまたはＮ原子がすべて加水分解性の結合またはエーテルまたはチオエーテル結合と関係がある。Ｒ^５はＰＡＰ（ＰＥＧなど）のセグメントであってよいか、あるいはこれを含んでよく、前述した好ましい範囲内の分子量を有することが好ましい。ＰＡＰ以外でも、存在する可能性はないかもしれないが、Ｒ^５は５，０００未満、より好ましくは１，０００未満の分子量を有することが好ましい。Ｒ^５の多数の例を本明細書に記載する。
【０１１８】
このセクション６の前章に記載した連結部分と架橋したポリマー、または加水分解性の結合と架橋したポリマー、およびこのセクション６の前章に記載したポリアニオン性ポリマー・セグメントのサイズが「ポリマー」である。
【０１１９】
本発明の連結剤または連結部分は、以下で詳細に述べる手法などの、さまざまな手法によって得ることができる。一般に、大部分の連結剤または連結部分を使用して、以下の事項にしたがってポリマーを作製する。
【０１２０】
手法Ｉ：フリーラジカル重合中の分解性架橋ＰＡＰの形成。
カルボマーは現在、分解性架橋剤の存在下でのアクリル酸の重合によって形成されている。この手法Ｉの貢献は、加水分解によって分解可能なヒドロゲルを生成するための連結部分の設計によってもたらされる。１つまたは複数の加水分解性の結合が架橋剤の内部、たとえば重合性不飽和部位の間に位置している。これは、加水分解に安定性があるように設計されている工業用カルボマー（１）に使用される、架橋剤とは対照的である。
【化７】

これらのポリマーでは、たとえば連鎖移動剤を使用して、あるいは高濃度の重合開始剤を用いて、ＰＡＰの分子量が比較的小さい、約５０，０００以下である条件下で、アニオン性モノマーを重合させることが有利であろう。
【０１２１】
Ｉ．Ａ．：ペンタエリスリトール・コアをベースとする分解性連結部分：
分解能を得るために、エステル、アミド、カルボネート、尿素などの連結部分中で加水分解性のことが知られている結合を取り込ませることを試みる。たとえば、ペンタエリスリトールと塩化アクリロイルの反応によって調製することができる、（２）を取り込ませることができる：
【化８】

（２）より速く分解することが予想できるカルボネートとエステルの両方を含む連結剤は、ペンタエリスリトールおよびホスゲンと結合したアクリル酸ヒドロキシエチルから調製することができる：
【化９】

当然ながら前述したものは、１，２−エタンジオールなどのさまざまなコアから、あるいはグリセロールから、あるいはトリエタノールアミンから、あるいは当業者によって同定することができる他のコアから作製することができる。
【０１２２】
Ｉ．Ｂ．：重合の２つ以上の不飽和部位をベースとする分解性連結部分、たとえばアクリル酸ヒドロキシエチル（４）および／またはアクリル酸アミノエチル（５）からの物質：
【化１０】

たとえば、（４）および（５）とホスゲンの二量化によって、二量化対に応じて、少なくとも１つの以下のものが生成するであろう：
【化１１】

（６）が（７）よりも速く分解すること、（７）が（８）よりも速く分解することは、予想することができる。３つ以上の重合の不飽和部位を有する、類似の構造を作製することができる。
【０１２３】
Ｉ．Ｃ．：塩化アクリロイル（９）からの物質をベースとする分解性連結部分：
【化１２】

（９）と１，２−エタンジオールの二量化によって、加水分解性の（１０）が生成される：
【化１３】

（９）とエタノールアミンの二量化によって、（１０）よりもゆっくりと分解することが予想できる（１１）が生成される：
【化１４】

（９）と１，２−ジアミノエタンの二量化によって、（１１）よりもゆっくりと分解することが予想できる（１２）が生成される：
【化１５】

あるいは、（１０）よりも速く分解することが予想できる無水架橋剤を形成することができる：
【化１６】

【０１２４】
Ｉ．Ｄ．：乳酸または他のヒドロキシ酸をベースとする分解性連結部分：
Ｉ．Ｄ．１．：乳酸（１４）を、
【化１７】

塩化アクリロイルと反応させて（１５）を形成することができる：
【化１８】

次いで（１５）をアクリル酸ヒドロキシエチルと反応させて、（１６）を形成することができる：
【化１９】

３つ以上の重合の不飽和部位を有する、このような構造も作製することができる。
【０１２５】
Ｉ．Ｄ．２．：ラクチルエステル、すなわち乳酸の二量体、または他のヒドロキシ酸の二量体を使用することもできる。たとえば、アクリル酸ヒドロキシエチルを得て、非重合条件下でラクチドの環を開くためにヒドロキシルを使用して、（１７）を得ることができる：
【化２０】

１７）を塩化アクリロイルと反応させて連結剤（１８）を形成することができる：
【化２１】

３つ以上の重合の不飽和部位、および他のヒドロキシ酸を有する、同様の構造を形成することができる。
【０１２６】
Ｉ．Ｅ．：以下のいくつかの代表的な構造で例示する、ＰＡＯジオール（１９）または他の多官能性ＰＡＯ、またはＰＥＧがその代表例である他の二官能性または多官能性の水溶性ポリマーを含む連結剤：
【化２２】

このような手法は、ＰＡＯの分子量を変えて、ヒドロゲル粒子の物理的性質を調節するための第２の手法を得ることができる点で有利である。ＰＡＯの分子量が大きいことによって、低度の架橋がもたらされる。
【０１２７】
Ｉ．Ｅ．１．：ＰＡＯジオールに関するもの
カルボネート含有連結剤は、ホスゲンを有するアクリル酸ヒドロキシエチルにＰＡＯを結合させて（２０）を得ることによって、形成することができる：
【化２３】

あるいは、ＰＡＯと塩化アクリロイルを反応させて（２１）を得ることによって、エステル含有基を得ることができる：
【化２４】

ＰＡＯジオールを乳酸およびホスゲンと反応させて（２２）を形成することなどによって、乳酸エステルを取り込ませることができる：
【化２５】

（２２）の酸塩化物を形成し、アクリル酸ヒドロキシエチルと反応させて（２３）を得る：
【化２６】

ＰＡＯジオールのヒドロキシルを活性化させて、乳酸を有するエステル（２４）を形成することができる：
【化２７】

次いで（２４）を塩化アクリロイルを反応させて（２５）を得る：
【化２８】

ラクチドを用いた開環反応により（２６）を得ることによって、一対の（あるいはそれより多くの）乳酸残基を連結させることができる。
【化２９】

上式で、ｎは好ましくは１０以下、より好ましくは５以下である。（２６）をアクリル化して、（２７）を得ることができる；
【化３０】

あるいは、（２６）をアクリル酸ヒドロキシエチルに結合させて、（２８）を得ることができる：
【化３１】

【０１２８】
Ｉ．Ｅ．２．：ＰＡＯジアミンを用いて作製したポリマー：
類似のアミドおよび尿素構造を、ＰＡＯジアミンから得ることができる。一般に、これらの構造は、それらのエステルおよびカルボネート類似体よりもゆっくりと分解するであろう。
【０１２９】
手法ＩＩ：より短いＰＡＰ鎖とＰＡＯ鎖との、両者間の分解性連結剤を使用した連結または架橋：
架橋不在でのＰＡＰ鎖の重合、次いでその後のＰＡＰ鎖の架橋によって、ＰＡＰの分子量、したがって架橋ポリマー粒子の分解産物の薬力学作用が容易に調節される。
【０１３０】
ＩＩ．Ａ．：ポリ（ＡＭ−ｃｏ−アクリル酸ヒドロキシエチル）から作製したポリマー：
少量のヒドロキシルを、たとえばアニオン性モノマーとアクリル酸ヒドロキシエチル（Ｈ_２Ｃ＝ＣＨＣＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_２０Ｈ）の共重合によって、あるいは酢酸ビニルとの共重合によって、その後場合によってはアセチル側基を加水分解して追加的なアルコールを生成することによって、ＰＡＰ鎖に沿って含ませることができる。ヒドロキシル側基は、ホスゲンを用いて活性化させたＰＡＯジオールと反応させて（２９）を得ることによって、架橋させることができる：
【化３２】

【０１３１】
ＩＩ．Ｂ．：ＰＡＰから作製したポリマー：
あるいは、ＰＡＰで始めて、一部の側鎖カルボキシル基（または類似の基）をアミノエタンチオール基で誘導体とし、分解性ジアクリレート連結剤、たとえば（２１）を用いてこれらを架橋させて（３０）を得ることができる：
【化３３】

【０１３２】
ＩＩ．Ｃ．：カルボネートおよびエステル結合の両方を含むポリマー：
ＰＡＰで始めて、いくつかのカルボキシル側基（または類似の基）を酸塩化物に転換し、非架橋条件下で１，２−エタンジオールを用いてこれらを官能化することができる。この物質を、ホスゲンを用いて予め活性化させたＰＡＯジオールと架橋させて、（３１）を得ることができる：
【化３４】

（３１）はコポリマーおよびアクリル酸ヒドロキシエチルから形成することもでき、次いでホスゲンを用いたＰＡＯの活性化後にＰＡＯと結合させる。
【０１３３】
ＩＩ．Ｄ．：乳酸、または他のヒドロキシ酸を、非重合条件下でのラクチドの開環後、ヒドロキシル含有コポリマー（ここでは酢酸ビニルとのコポリマーの加水分解生成物からのものを示す）から得られる連結剤中に取り込むことによって、（３２）を得ることができる：
【化３５】

次いで（３２）をホスゲン活性化型ＰＡＯジオールと結合させて、（３３）を得ることができる：
【化３６】

ＰＡＯ末端ヒドロキシルを使用して、非重合条件下でラクチドの環を開いてジオール前駆体を生成させ、これをホスゲン活性化型ＰＡＯジオールと結合させて（３４）を得ることもできる：
【化３７】

【０１３４】
手法ＩＩＩ：ＰＡＰの架橋：
手法ＩＩと同様に、ポリマー形成反応の後に、ＰＡＰを架橋または結合させることができる。
【０１３５】
ＩＩＩ．Ａ．：たとえば、ＰＡＰで始めて、少量の酸塩化物を形成し、１，２−エタンジオールまたは同様のジオールと架橋させて（３５）を得ることができる：
【化３８】

【０１３６】
ＩＩＩ．Ｂ．：ヒドロキシル含有コポリマーで始めて、ホスゲンと架橋させて（３６）を得ることができる：
【化３９】

あるいは、無水物で連結された物質（３７）を直接得ることができる。
【化４０】

【０１３７】
ＩＩＩ．Ｃ．：たとえば１，２−エタンジオールを過剰に用いるラクチドの環を開く反応を使用して、（３８）を得ることができる：
【化４１】

（３８）を使用して、ホスゲン活性化型ホモポリマーを架橋させて（３９）を得ることができるか、あるいは酸塩化物活性化型ホモポリマーＰＡＰを用いて（４０）を得ることができる：
【化４２】

【０１３８】
手法ＩＶ：
加水分解性の（すなわち不安定な）直鎖状ＰＡＰ。
分解性部分を介した短いＰＡＰ鎖の連結を使用して、高分子量の直鎖状ＰＡＰを得ることができる。
【０１３９】
ＩＶ．Ａ．：ヒドロキシル末端化型ＰＡＰからの分解性直鎖状ＰＡＰ。
リビング重合によってアニオン性モノマーを重合させ、末端ヒドロキシル基を有する低分子量ＰＡＰ（４１）を得ることができる：
【化４３】

ヒドロキシル基をホスゲンで連結することによって、分解性カーボネート基によって連結した、延長したＰＡＰ鎖（４２）が生じる：
【化４４】

分解性ブロックのサイズは、ヒドロキシル末端化型ＰＡＰと、たとえばホスゲンによって活性化させたＰＡＯジオールを反応させて（４３）を得ることによって、増大させることができる：
【化４５】

非重合条件下でのラクチド開環反応に（４１）を使用して、（４４）を得ることもできる：
【化４６】

したがって、２つのこのようなポリマー・セグメントのヒドロキシル基を、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と反応させて（あるいはホスゲンを使用することができる）、ラクチル部分によって分けられたＰＡＰブロックから構成される高分子量ＰＡＰ、たとえば（４５）を得ることができる：
【化４７】

あるいは、（４４）をこのようにして（４１）に結合させて、（４６）を得ることができる：
【化４８】

【０１４０】
ＩＶ．Ｂ．：ＰＡＰセグメントからの分解性直鎖状ＰＡＰ。
ＩＶ．Ａと同様に、リビング重合によって、ヒドロキシル基以外の末端基、たとえばチオール基を有する分子量が小さいＰＡＰ（４７）を得ることができる：
【化４９】

これらの基を、ＩＩ．Ｂ中に記載したのと同様のジアクリル化化合物、たとえばＰＡＯ−ジアクリレート（２１）と反応させて、（４８）を得ることができる：
【化５０】

（４７）を短い分解性のブロック、たとえばＩ．Ｃ．からのジアクリレート（ｌ０）、（１１）および（１２）と反応させると、分解の受けやすさの程度が異なるポリマー（４９）、（５０）および（５１）を得ることができることは、予想することができる。
【化５１】

【０１４１】
本明細書に記載したさまざまなポリマーは、本出願と同時に出願された出願（Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ ３１４５７２−１０３Ｃ）中にさらに詳細に示す。
【０１４２】
【実施例】
この実施例では、本発明の状況において使用するヒドロゲルおよびミクロゲルを作製するための方法を述べる。ミクロゲルは単独で、あるいは本明細書でも述べたクリル由来の多機能性ヒドロラーゼなどの、他の物質と組み合わせて使用する。
【０１４３】
したがって、使用した化学物質および材料は以下の通りであった：グリセロール（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＧＥＲＭＡＮＹ）、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）ポリアニオン性ポリマー（ＢＦＧｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｂｒｅｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ）、ジイソプロパノールアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）、蒸留水、および１０％水酸化ナトリウム。成分である化学物質の最終濃度は、グリセロール・ストックは２３．５％ｗ／ｖ（これは８７％ｗ／ｗ）、所望のポリアニオン性ポリマーは０．８％ｗ／ｖであり、蒸留水および水酸化ナトリウム（１０％）またはジイソプロパノールアミンを使用して、ｐＨを７．４に調整し、体積を合わせた。
【０１４４】
標準的な滅菌手順を使用して、少量のｃａｒｂｏｐｏｌを、プロペラ型攪拌機を用いてゆっくりと攪拌しながら蒸留水と混合させた。攪拌は、粉末が溶けるまで続けた。任意の捕獲した空気を、圧力を低下させること（水作動型真空計）によって除去した。ゆっくりと攪拌しながらグリセロールを加え、ｐＨを測定し、１０％ＮａＯＨ溶液またはジイソプロパノールアミンを使用して、組成物のｐＨを７．４に調整した。ゲル化が起こり、はっきりした透明のミクロゲルが結果として生成した。生成したミクロゲルは４℃で保存した。
【０１４５】
同じ方法を使用して、ただし量の重量−重量測定によって、以下の１０ｇのバッチを作製した：
【表２】

【０１４６】
本明細書で引用した特許および特許出願を含むがこれらだけには限られない、すべての刊行物および参照文献は、それぞれ個々の刊行物または参照文献が充分に述べられているものとして参照によって本明細書に組み込まれていることが具体的かつ個別に示されるように、参照によってその全容を本明細書に組み込んである。本出願が優先権を主張する任意の特許出願も、刊行物および参照文献に関する前述の方式で参照によってその全容が組み込まれている。
【０１４７】
好ましい実施形態を強調しながら本発明を記載してきたが、好ましいデバイスおよび方法の変形形態を使用することができ、本発明を本明細書で具体的に記載した以外の方法で実施することができることが意図されることは、当業者には明らかであろう。したがって本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲中に含まれる、あらゆる変更形態を含む。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention is for treating wounds such as corneal ulcers, internal injuries, such as those caused by surgery, and for treating inflammatory diseases and sequelae, further reducing adhesions or inhibiting adhesion formation For the use of polyanionic polymers, which may be microgels, with or without some enzymes. The invention further relates to the use of the enzyme in any pharmaceutically acceptable carrier for treating inflammatory diseases, corneal wounds and for inhibiting adhesion formation.
[0002]
[Prior art]
Various treatments for tissue damage or wounds are known in the art. However, there are very few, if any, non-invasive procedures that effectively and economically reduce or prevent permanent damage to the cornea, particularly with respect to corneal ulcers or abrasions, for example. Thus, a common consequence of such harm to the cornea is partial or complete blindness of the affected eye. New non-invasive treatments will be welcome.
[0003]
The formation of adhesions, such as between internal organs and tissues, between body walls and internal organs, according to medical surgery or infection is a significant medical problem. New methods and treatments are needed to treat internal damage and inflammatory diseases to inhibit adhesion formation.
[0004]
Other wounds that have undergone improved treatment include skin wounds such as bedsores, venous ulcers, burns, or pain from pressure.
[0005]
Occasionally, a beneficial inflammatory response is unsuccessful, and agents of the inflammatory process are directed toward otherwise healthy, self-tissues. Autoimmune disorders, such as rheumatoid arthritis, exemplify this phenomenon. A similar phenomenon can occur in the case of persistent local chronic inflammation, such as occurs in chronic osteoarthritis. The methods of the present invention are very useful in treating or treating conditions that are associated with inflammatory processes, where the detrimental effects of the inflammatory response outweigh the beneficial effects.
[0006]
Problems to be Solved by the Invention and Means for Solving the Problems
The invention is particularly directed to a method of treating an area affected by damage, including damage from corneal wounds and internal damage, comprising a composition comprising an enzyme such as a polyanionic polymer or a protease or both. Administering to the affected area an effective amount to treat the injury. In some embodiments, a non-added polyanionic polymer, as defined herein below, or a microgel is used. In some embodiments, preformed polymers are preferred. Polyanionic polymers with hydrolyzable bonds can be used. Corneal wounds treated by the methods of the present invention can include corneal ulcers, corneal abrasions, or chemical or physical injuries to the cornea that are prone to corneal ulcers. Affected corneal ulcers are usefully treated by the methods of the present invention. Internal damage, such as a surgical wound, or damage to a membrane covering any of the internal organs or tissues, or the cavity in which one or more internal organs or tissues reside, is treated by the methods of the present invention. be able to. The membrane may be a serosa, such as the peritoneum, pericardium, epicardium, and pleura. The membrane may be epithelial tissue, including endothelium or meninges. The internal injury to be treated may include an injury to a tendon or tendon sheath, or a nerve or nerve sheath, or an internal surgical wound. Internal damage may be damage that is prone to adhesions, and the amount of polyanionic polymer administered is an amount effective to inhibit or reduce adhesion formation or remodeling.
[0007]
The present invention is a method of reducing or inhibiting the formation or remodeling of adhesions, wherein a polyanionic polymer, such as a non-added polyanionic polymer, or a microgel is formed in the area affected by the damage susceptible to adhesions. The method can comprise administering an effective amount of a composition comprising a polymer, more preferably a preformed non-addition polyanionic polymer. The present invention can also relate to a method of inhibiting or reducing the formation of adhesions after implantation of an implantable (implantable) device.
[0008]
In some embodiments of the present invention, there is provided a method of treating an inflammatory disease, wherein the method comprises, in an area affected by the disease, one or more of the following: a polyanionic polymer, or chymotrypsin, trypsin, The method may include administering a composition comprising a collagenase and a protease having an activity comprising at least two of the elastase activities, in an amount effective to treat an inflammatory disease. In another embodiment, the invention provides a method of treating a corneal wound, the method comprising: providing a composition comprising a protease having an activity comprising at least two of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase activity. And administering an effective amount to the designated area. Examples of inflammatory diseases are osteoarthritis, rheumatoid arthritis, cervical spine disease, cumulative injury wounds (harmful and painful conditions caused by overuse or overwork of certain parts of the musculoskeletal system) , Often due to occupation-related physical activity; which is characterized by inflammation, pain, or dysfunction of the associated joints, bones, ligaments, and nerves), endometriosis, inflammatory pelvis It can include disease, adhesive peritonitis, appendicitis, periodontitis, pericarditis or pleurisy. Examples of cumulative injury wounds can include tendinitis, tenosynovitis or carpal tunnel compression syndrome. In some embodiments, the inflammatory disease is susceptible to adhesions, and an amount effective to treat the inflammatory disease is effective to inhibit or reduce the formation of such adhesions.
[0009]
The method of the invention may comprise one or more of the following: a multifunctional hydrolase having at least two of the following activities: steroid, non-steroidal anti-inflammatory agent, streptokinase, fibrinil agent, chymotrypsin, trypsin, collagenase or elastase activity. It may include administration of an inflammatory cytokine antagonist or surfactant.
[0010]
In some embodiments, the invention provides compositions that can include a protease or hydrolase. The protease or hydrolase can have an activity that includes at least two of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase activities. The protease or hydrolase is (a) at least one residue found in the reference sequence AA64-300 of SEQ ID NO: 2 or AA1-300 of SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, or 12 A first enzyme having at least about 60% sequence similarity to a sequence differing from the above, or (b) Panaeus vanameii 1, Panaeus vanameiii 2, Panaeus monodonochronichotryponic-san, Panaeus monopodonic physiodynamics, 2. Uca pugilator enzyme I, Uca pugilator enzyme II, Kamchatka crab IA, Kamchatka crab IIA, Kam A second enzyme that is a second enzyme that is a chatka crab IIB, a Kamchatka crab IIC, a Crayfish protease 1, a Salmon enzyme 1, an Atlantic cod I, an Atlantic cod II, or a third Atlantic cod trypsin.
[0011]
In some embodiments, the invention provides polyanionic polymers and methods that can include administering such polyanionic polymers. For example, a composition comprising a non-addition polyanionic polymer (optionally a microgel) made from one or more ethylenically unsaturated compounds, wherein the chains of such polymers have hydrolyzable linkages. Can be optionally linked by at least one linking moiety comprising:
i) one or more functional groups capable of being titrated with a base to form a negatively charged functional group, or
ii) An effective amount of a composition that can have one or more precursor groups that are precursors of a functional group that can be titrated with a base, wherein the precursor group is converted to a functional group. Methods of administration are provided.
[0012]
In some embodiments, the functional group of the polymer is R⁴Is hydrogen —C (O) OR⁴, -0-S (O₂) OR⁴, -S (O₂) OR⁴Or -S (O) OR⁴Wherein the precursor group is R⁴Is a cleavable group, preferably independently C₁~ C₆-C (O) OR which is a normal or branched alkyl, phenyl or benzyl of⁴, -0-S (O₂) OR⁴, -S (O₂) OR⁴Or -S (O) OR⁴Choose from
[0013]
In some embodiments,
iii) The molar fraction of the total ethylenic double bonds contributed by the ethylenically unsaturated crosslinker in the mixture capable of forming the crosslinked polyanionic polymer is 0.02 or less, or in some embodiments Is preferably 0.01 or less.
[0014]
In some embodiments, the polyanionic polymer is a microgel (typically, meaning that it is properly cross-linked).
[0015]
In some embodiments,
iv) The ratio of the macroviscosity of the polyanionic polymer composition to the microviscosity of the polyanionic polymer composition is 10,000 or less. In some embodiments, the polymer is preformed. In some embodiments, the polymer may be a non-addition polymer as defined herein below.
[0016]
In some embodiments, the polymers of the present invention can be made from one or more ethylenically unsaturated compounds, represented by the following structure:
(R³) (R²) C = C (R¹) -XY (I)
Where Y is -C (O) OR⁴, -0-S (O₂) OR⁴, -S (O₂) OR⁴Or -S (O) OR⁴And R⁴Is hydrogen or a cleavable group, preferably C₁~ C₆A normal or branched alkyl, phenyl, or benzyl of
X is a direct bond; a linear or branched alkylene group having 2 to 6 carbon atoms, one or more of which can be replaced by an O, S or N heteroatom, An alkylene group having no heteroatom at the α-position or the β-position to Y; phenylene; a 5- or 6-membered heteroarylene having up to three heteroatoms independently selected from O, S or N, However, Y (R³) (R²) C = C (R¹) Is also a heteroarylene that is not bonded to a heteroatom (phenylene, oxazolylene, isoxazolylene, pyridazinylene, pyrimidinylene are preferred examples of arylene), and
R¹, R²And R³Is hydrogen, C₁~ C₆Alkyl (or C₁~ C₄Or C₁~ C₃Alkyl), carboxy, halogen, cyano, isocyanato, C₁~ C₆Hydroxyalkyl (or C₁~ C₄Hydroxyalkyl), alkoxyalkyl having 2 to 12 (or 2 to 6) carbon atoms, C₁~ C₆Haloalkyl (or C₁~ C₄), C₁~ C₆Cyanoalkyl (or C₁~ C₄), C₃~ C₆Cycloalkyl, C₁~ C₆Carboxyalkyl (or C₁~ C₄Carboxyalkyl), aryl, hydroxyaryl, haloaryl, cyanoaryl, C₁~ C₆Alkoxyaryl (or C₁~ C₄Alkoxyl), carboxyaryl, nitroaryl, or a group -X-Y, wherein the alkyl or alkoxy group is either linear or branched, and Q is the ring carbon in the cycloalkyl group. Any C that is the total number of atoms₃~ C₆Up to Q-2 carbon atoms of the cycloalkyl group are independently replaced with an O, S or N heteroatom, provided that any doubly bonded carbon atom is not directly bonded to O or S, and aryl is phenyl, Or a 5- or 6-membered heteroaryl group having up to three heteroatoms selected from the group consisting of O, S and N. In some embodiments of the present invention, R¹, R²And R³Is independently hydrogen or C₁~ C₃X may be a direct bond or C₁~ C₃Alkylene. The cleavable group is, in some embodiments, one or more C₁~ C₆Can include normal or branched alkyl, phenyl, or benzyl groups. In the preceding structure, aryl means phenyl or a 5- or 6-membered heteroaryl group having up to Q-2 heteroatoms independently selected from O, S or N, where Q is an atom in the ring Is the total number of
[0017]
In some embodiments, the polyanionic polymer is a cross-linked polyanionic polymer. In some embodiments, the molar fraction of ethylenically double bonds contributed by the ethylenically unsaturated crosslinker in the mixture from which the polyanionic polymer can be made is 0.02 or less, or preferably By being less than or equal to 0.01, the polymer is characterized. In some embodiments of the present invention, the ethylenically unsaturated crosslinker is an allyl ether of sucrose or allyl ether of pentaerythritol. In some embodiments, the ethylenically unsaturated crosslinker may be, for example, an allyl ether of pentaerythritol or pentaerythritol triacrylate. In some embodiments, the unsaturated cross-linking agent is an acrylate of pentaerythritol. In some embodiments, the unsaturated crosslinker may be an acrylate-pentaerythritol acrylate.
[0018]
In some embodiments, the polyanionic polymer optionally has a crosslinker and one or more pendant functional groups on the polyanionic polymer that can react with the functional groups of the crosslinker (or Crosslinking by reaction of a polyanionic polymer (which has been derivatized to have).
[0019]
In some embodiments, the methods of the present invention comprise (or are derivatized to have) one or more first pendant functional groups selected from hydroxy, acyl halide, chloroformate, and mercapto. And the crosslinking of the polyanionic polymer is by the reaction of a crosslinking agent having a second functional group that is reactive with the first functional group. Good. In some embodiments, the pendant first functional group may be a mercapto group and the second functional group may be a vinyl double bond. The crosslinking agent may be an α, ω-diol diacrylate, such as ethylene glycol or polyethylene glycol, or a chain-extended α, ω-diol diacrylate, wherein the chain extension is glycolic acid, lactic acid, 3-hydroxy. Propionic acid, hydroxylated 3-methylbutyric acid, hydroxyvaleric acid and hydroxyproline (hydroxylated C₂~ C₅Carboxylic acids and hydroxyprolines). In some embodiments, the pendant first functional group may be a hydroxyl group, the second functional group may be a carboxylic acid chloride or a chloroform group, and the crosslinker may be an α, ω-diol or a chain extended. Α, ω-diol residues. The crosslinking agent is, for example, an α, ω-diol having an extended chain (for example, ethylene glycol or polyethylene glycol) whose extension is glycolic acid, lactic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-methylbutyric acid or hydroxymethyl. Α, ω-diols, which can include residues of valeric acid and hydroxyproline, or amino acids such as glycine, alanine, glutamic acid, and aspartic acid. In some embodiments, the functionalized polyanionic polymer has at least one N- (2-mercapto) ethylcarboxamide group, and optionally also has a pendant primary functional group that is at least one mercapto group. That is polyacrylic acid.
[0020]
In some embodiments, the ethylenically unsaturated linking agent (which can be a crosslinker) comprises an ethylenically unsaturated derivative of a multidentate compound comprising two or more ethylenically unsaturated moieties, Such moieties are linked to the polydentate by hydrolyzable bonds. For example, the multidentate compound can include two or more functional groups that can be independently hydroxy, amino, or mercapto groups, and the derivative can be multidentate through an ester, thioester, or amide bond. The compound can include two or more ethylenically unsaturated moieties attached to different oxy, amino, or thio groups on the residue. The polydentate compound may be an α, ω-diol, or ethylene glycol, diethylene glycol, or polyethylene glycol. The α, ω-diol may be polyethylene glycol. The polydentate compound may be an α, ω-diamine such as ethylene diamine. In some embodiments, the polydentate compound is, for example, an amino aliphatic alcohol, an amino aliphatic diol, an amino aliphatic triol, a hydroxy aliphatic diamine, and a hydroxy aliphatic triamine, an amino aliphatic thiol, an amino aliphatic dithiol. , An aminoaliphatic trithiol, a mercaptoaliphatic diamine, or a mercaptoaliphatic triamine. The hydrolyzable linkage may, in some embodiments, include one or more residues of a hydroxycarboxylic acid, such as glycolic acid, lactic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-methylbutyric acid, hydroxyvaleric acid, or hydroxyproline. Can be formed from a group. The group forming the hydrolyzable bond may, in some embodiments, comprise a residue of at least one amino acid.
[0021]
In some embodiments, provided is a method of isolating a multifunctional protease from a biological sample, the method comprising using fresh water (fresh water) to extract the multifunctional protease. In some embodiments, the biological sample does not break down mechanically. Some embodiments provide for applying the extract with fresh water to an affinity column having the ligand aminophenyl borate. In some embodiments of the present invention, a method of isolating a multifunctional proteolytic enzyme from a biological extract is provided, wherein the biological extraction is performed on an affinity column having a ligand which may be aminophenyl boronate. A method comprising applying an object is provided.
[0022]
In some embodiments, methods are provided, wherein the composition comprises a polymer, wherein the polymer comprises a polypeptide comprising one or more residues of polycarboxylic amino acids. In some embodiments, the polymer can be a dicarboxylic amino acid having the formula:
Embedded image

Wherein D is a straight or branched alkylene having a substituent E that is a straight or branched alkylene, wherein D and E together have up to 10 carbon atoms. The dicarboxylic amino acid can be, for example, glutamic acid, aspartic acid, poly (glutamic acid) or poly (aspartic acid). In some embodiments, the polyanionic polymer has a backbone that includes one or more hydrolyzable linkages selected from the group consisting of esters, carbonates, thiocarbonates, urethanes, carbamates, and ureas. In some embodiments, one or more hydrolyzable linkages can include a residue of a hydroxy acid. The α-hydroxy acid may be, for example, lactic acid. The backbone of the polyanionic polymer can include residues of α, ω-diol, diamine or dithiol.
[0023]
In some embodiments, one formed by the reaction of a bis-mercapto end-capped polyanionic oligomer with a bis-acrylate of ethylene glycol, a bis-acrylamide of ethanediamine, or N- (2-acryloyloxy) ethyl acrylamide. Or the use of polyanionic polymers made by polymerization of a plurality of ethylenically unsaturated compounds.
[0024]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
For the purposes of this application, the terms listed below shall have the following individual meanings.
[0025]
AM is an anionic monomer consistent with the monomers described in the Summary of the Invention. Throughout the Summary of the Invention and the further description below, not all monomers that contribute to PAP are themselves anionic.
MW is molecular weight.
PAA is a poly (acrylic acid) -based polymer.
PAO is a polyalkylene oxide, PEG is one example. PAOs typically have C2-C4 repeat units, and C3 and C4 repeat units are typically compounded with C2 (ethylene oxide) to increase water solubility. The size of the PAO segment is preferably such that 90% or more of the segment has a molecular weight of 50 kd or less. In one embodiment, 95%, 98% or more of the segments are within these size limits. The average molecular weight of the segments is preferably between 20 kd and 40 kd, or between 25 kd and 35 kd. Preferably, the PAO segment has a molecular weight average of at least 500, more preferably at least 1,000.
PAP is a polyanionic polymer according to the polymers described in the Summary of the Invention.
PEG is polyethylene glycol.
[0026]
The acid number refers to the amount of milligrams of potassium hydroxide required to neutralize one gram of dry matter. If the substance contains less than 2% by weight of water, the substance is dry, regardless of the organic solvent or organic monomer.
[0027]
Aliphatic includes both aliphatic and cycloaliphatic, unless otherwise indicated.
[0028]
Alkyl means a straight or branched alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, including halogen substitution of one or more hydrogens of the alkyl group.
[0029]
Antagonists of an inflammatory cytokine shall include any substance that tends to reverse the effects of the inflammatory cytokine, such as an agent that binds to a cell receptor without inducing a biological response. An inflammatory cytokine is intended to include any cytokine protein or biological factor capable of stimulating an inflammatory response in living tissue.
[0030]
The cleavable group is OR⁴And the OR⁴The group can be chemically modified, substituted, or exchanged, so that the residue is -OH or -O⁻Means a part.
[0031]
A clearable polymer refers to a polyanionic polymer having the meaning ascribed to Section 6 herein.
[0032]
Cumulatively damaged wounds refer to damage caused by repeated effects on parts of the body, repeated stress or repeated harm. Examples of cumulative injury wounds include, but are not limited to, tendinitis, tenosynovitis or carpal tunnel compression syndrome.
[0033]
Effective amount: The meaning of "effective amount", as will be understood by a clinician, is to reduce one or more of the symptoms of the condition sought to be treated or the condition sought to be avoided or treated, Includes an effective amount to ameliorate or eliminate or otherwise produce a clinically recognized change in the disease state or condition.
[0034]
Enzymatically active segment means a segment of a multifunctional protein having an activity that includes at least one of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase or exopeptidase activity.
[0035]
Fibrinolytic agent: Fibrinolidine or a substance that converts plasminogen to fibrinolidine. These may be endogenous or exogenous, such as bacterial enzymes used in thromboembolism.
[0036]
A hydrogel is a combination of water and a hydrophilic polymer, the polymer may be linear, branched, and crosslinked by covalent, ionic, physical, or hydrogen bonding. The hydrogel has more than 50% by weight of water. Examples of hydrophilic polymers that form hydrogels are carboxymethylcellulose, carboxypolymethylene, and poly (hydroxyethyl methacrylate).
[0037]
Hydrolase refers to an enzyme that breaks down bonds formed by dehydration reactions such as amide, ester or ether bonds. The term includes, but is not limited to, proteases such as trypsin and chymotrypsin.
[0038]
Isoforms refer to naturally occurring sequence variants of nearly homologous proteins in the same organism. Preferably, the isoforms share at least about 80% identity, more preferably at least about 85% identity with the reference sequence.
[0039]
Kuril-derived multifunctional protein means a multifunctional protein having the same sequence as a protein isolated from krill having the properties of the protein described in the section entitled "Preferred Characteristics of the Multifunctional Protein." . This protein is also called "multifunctional hydrolase from krill" and includes all isoforms of this protein. The amino acid sequence contained in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, or other isoforms thereof, or chimeric polypeptides thereof, is derived from krill. It is an example of a multifunctional protein.
[0040]
Unstable spacer groups shall include chemical functional groups that are susceptible to enzymatic or non-enzymatic hydrolysis or oxidation. The labile spacer group is, in some embodiments, one or more residues of a hydroxycarboxylic acid such as glycolic acid, lactic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-methylbutyric acid, hydroxyvaleric acid and hydroxyproline. Can be provided. A labile spacer group can, in some embodiments, include at least one amino acid residue. In some cases, the hydrolyzable linkage has been replaced with an unstable spacer group.
[0041]
A linking moiety that includes a hydrolyzable bond refers to a chemical moiety that includes at least one hydrolyzable bond that links one segment of the polymer to another. Such a linking moiety connects the two ends of the linear polymer, which can lengthen the polymer or can be a crosslinker. The linking moiety can be formed using a linking agent or by reaction of a functional group on each segment of the polymer.
[0042]
Microgel refers to a viscoelastic mass of individual particles, each individual particle comprising a crosslinked polyanionic polymer, each particle having a size between 0.1 μm and 1000 μm in its aqueous expanded state at neutral pH. Having. The particles of the water-based expanded polyanionic polymer have more than 70% water and the crosslinking is ionic, covalent, or by hydrogen bonding.
[0043]
The microviscosity is, for example, Y. See, Lochhead et al., Polymers in Aqueous Media, pp. 147-64. 113-147, 1989, "Poly (acrylic acid) Thickeners: The Importance of Gel Microrology and Evaluation of Hydrography, and the method described in this article is described in the following. Incorporated herein. One such method measures the microdiffusion for two models of gold sols, for example, allowing the measurement of the microdiffusion of a microstructure with a center of about 10 nm and 100 nm.
[0044]
Monosaccharide or disaccharide means a saccharide or disaccharide (such as sucrose), which can be reduced to a non-reduced form, or can be oxidized to contain up to one carboxylic acid.
[0045]
A polydentate compound is a compound having two or more functional groups selected from hydroxy, amino, or mercapto (thiol). Examples of polydentate compounds include ethylene glycol, aminoethanol, polyethylene glycol, glycerol and pentaerythritol.
[0046]
The multifunctional protein is at least one of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase or exopeptidase activity, or asialo GM₁A protein having activity including ceramide binding activity and substantial homology to at least a segment of a multifunctional protein derived from krill.
[0047]
Neutral functional group means a functional group that is not titrated by acid or base.
[0048]
Non-addition polymers are polymers in which a polyanionic polymer segment is not formed by the addition reaction of a strong nucleophile (excluding radicals) and an ethylenically unsaturated compound in a second molecule. Given this condition, the non-addition polymer is, for the purposes of this application, any polymer in which such polyanionic segments are formed by any means, including free radical, cationic or anionic polymerization, as well as condensation It may include a polymer formed by the reaction. The linking moiety or linking agent used in or used to form the polymer is formed by any suitable chemical, even if such moiety or linking agent can have a polymeric moiety. It should be understood that things can be done.
[0049]
Non-steroidal anti-inflammatory agent: Any anti-inflammatory agent that inhibits the production of prostaglandins.
[0050]
Physiological pH means a pH between 6.5 and 7.5.
[0051]
By polyanionic polymer is meant a polymer having an acyclic backbone and having a negatively charged functional group at physiological pH, such as an ionizable functional group that becomes a carboxylate anion, such as a carboxy group. One gram of polyanionic polymer has at least 0.001 mole of functional groups that can be titrated with KOH. Ionizable functional groups can be chemically bonded directly to the polymer backbone, or they can be chemically bonded to side groups or side chains that are chemically bonded to the backbone. Carboxypolymethylene is an example of a polyanionic polymer having ionizable functional groups directly attached to the main chain. α-Poly (glutamic acid) is an example of a polyanionic polymer in which an ionizable functional group is bonded to a side group that is an ethylene group.
[0052]
A preformed polymer is a polymer that is chemically formed ex situ prior to administration to a subject.
[0053]
Reference protein or sequence refers to the sequence of a reference protein that is AA64-300 of SEQ ID NO: 1 or AA1-300 of SEQ ID NO: 1 or a sequence that differs from these by at least one residue difference.
[Table 1]

In the above table, Del represents a deletion.
[0054]
Surfactant: Any surfactant that alters the properties of a surface, including reducing the surface tension of a liquid.
[0055]
Substantial homology means at least about 60% sequence identity or similarity, for example, 60% sequence identity.
[0056]
As used herein with respect to the approximate specificity of serine proteases and related such enzymes for krill, the unit of multifunctional hydrolase ("U") is 1 μmol of substrate per minute at 25 ° C. Succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) is its substrate and hydrolysis is the absorbance at 410 nm, defined as the amount of enzyme that catalyzes the degradation. Monitor by changes. The extinction coefficient ε of p-nitroanilide is 8800 M^-1cm^-1Therefore, the multiplication factor for converting the sample from dA / 1 min to U / 1 min is 5.68 when using a 20 μl sample.
[0057]
The present invention includes mammals, humans, cattle, pigs, sheep, edible animals such as goats, dogs, indoor cats, exotic animals such as companion animals such as horses, elephants, apes, large cats, whales, etc. A method for treating wounds and other injuries to, but not limited to, anatomical membranes of metazoan animals. The term membrane is used in a broad sense and includes tendons in and around tissue boundaries, such as the dura and tendon surfaces, limited areas in front of the cornea, membranes covering internal organs, or sheaths Includes the membrane lining the cavity in which the organ resides, and the inner and outer epithelium and mesothelium. It will be understood that the term epithelial tissue is used herein in a broad sense and refers to simple lamellar transitional epithelium and serosal endothelium. The epidermis and conjunctival epithelium on the corneal stroma is the outer epithelium. Internal epithelial tissue sometimes includes a surface that represents the endothelium, such as the peritoneum, pleura, and pericardium, and membranes that cover internal structures and organs, such as visceral, body cavity walls.
[0058]
The term damage is intended to include any wound, injury, or noxious irritation to the membrane or tissue surface. Damage treated by the methods of the present invention may or may not cause cracking of the membrane or tissue boundary. Wounds can be due to disease states, such as vascular dysfunction or pathogen-associated infections, burns (thermal or chemical), or accidental or surgical forces on membranes or tissue surfaces. Noxious stimuli include the action of heat or corrosive chemicals, such as acids and corrosives, and manipulation of organs during surgery.
[0059]
The term corneal wound is limited to edible animals such as humans, cows, pigs, sheep, goats, and exotic animals such as dogs, domestic cats, horses and other companion animals, elephants, apes, large cats and whales. It is intended to include any harm to the cornea in mammals, including, but not limited to, infection that can result in pathogen infection, corneal abrasion, corneal ulcers, or corneal ulcers. Injuries that can result in corneal ulcers are chemical, such as exposure to corrosive chemicals, or physical, such as bombardment with foreign objects, or corneal transplantation (eg, corneal transplantation) or It may be a surgical incision in a corneal incision (eg a radical corneal incision).
[0060]
The method of the present invention is very useful in treating ulcers and other harms of corneal tissue, and wounds of the skin such as bedsores, ulcers of veins, burns, or pain due to pressure. Treating corneal ulcers in accordance with the methods of the present invention may slow or prevent ulcer growth and, if left unchecked, may lead to perforation. By treating a corneal ulcer according to the methods of the present invention, the rate of healing, which is the rate of recovery of the cornea or skin to its pre-injury state, is also improved, the risk of opportunistic infection is reduced, and the formation of scar tissue is reduced. Inhibits or reduces. Preferred targets for the treatment methods of the invention are viral infections caused by the herpes virus (HSV), or bacterial infections such as one of Pseudomonas or Moraxella species (in Moraxella bovis causing ulcers of bovine corneas). Corneal ulcer associated with infection of In one embodiment, the method of the invention comprises administering an effective amount of a composition comprising a microgel from a polyanionic polymer, eg, cross-linked carboxypolymethylene, to the affected area of the cornea. The treatment of skin wounds according to the method of the present invention comprises the step of treating the area affected by the skin wound with a macroviscosity to microviscosity ratio of 10,000 or less, and in one embodiment a multifunctional krill-derived hydrolase. It is preferable to include applying a polyanionic composition containing The treating practitioner understands that the area affected by a skin wound varies with the size, location, and intensity of the wound, but includes the wound itself and the area surrounding the wound (eg, within 3 cm). Will be.
[0061]
The method of the present invention may be used to remove adhesions, such as those often formed between the peritoneum and internal organs or between non-adjacent regions of the peritoneum, after a surgical procedure that causes internal damage, including internal surgical wounds. It is also very useful for inhibiting or reducing the occurrence or severity. Adhesions are scar tissues that initially develop as fibrous bands between the two tissue surfaces and, despite the additions, can normally move freely relative to each other. Adhesion occurs as a result of the healing process after injury or noxious stimuli have harmed the integrity of one or both sides of the opposing surface. Noxious stimuli include damage (surgical and accidental), infection, and any physical or chemical substance that can cause inflammation leading to a repair response. When the adhesions prevent normal movement between the affected surfaces, dysfunction of the underlying organs or pain can occur. The adhesions begin as thin, firm chains composed primarily of fibers, which are easily broken at this stage. These are organized over time, the collagen is laid, and blood vessels are regenerated. At this stage, only a surgical split will separate the adhesion structures. This is necessary when the function of the connected organs is impaired or at risk for viability. The methods of the present invention are applicable to other types of adhesions other than peritoneal adhesions, as they relate to inhibiting the formation of post-operative adhesions. For example, after adhesion removal (removal of adhesions), tendon surgery, thoracic surgery, abdominal surgery, eye or ear surgery, spinal surgery, neurosurgery, pelvic surgery, after gynecological surgery, and after skull, brain, and spinal surgery Inhibit the formation or remodeling of adhesions.
[0062]
The method of the present invention provides that a composition comprising a polyanionic polymer, a multifunctional hydrolase, or both, is applied to an affected area in an amount effective to treat the injury, thereby effecting an injury, e.g., a surgical incision. Treating ulcers or harms of the area, or in or around it, or of the cornea. The hydrolase may be a protease, especially a multifunctional krill-derived serine protease. In a preferred embodiment, the method of the invention is affected by a wound on the cornea or a surgical wound using a composition comprising a polyanionic polymer, which can include a protease, preferably a multifunctional krill-derived protease. Treating the affected area.
[0063]
Those skilled in the art will appreciate that the area affected by any type of injury (affected area) depends on the nature, size, and location of the injury. For example, in the case of a corneal wound, the affected area may be the entire surface of the exposed eye. When the injury is an internal surgical wound on a body cavity, the affected area includes the surface of the organ or tissue in the body cavity where the surgical incision (wound) is made. In the case of a peritoneal incision, the affected area is the organ present in and throughout the abdominal cavity, and in the case of thoracotomy, the affected area is the organ present in and throughout the thoracic cavity. In the case of tendon surgery, the affected area includes the area of the incision, extending 1-2 cm to 15 cm from the incision in the tendon sheath, including the tendon and the tissue surface around the sheath.
[0064]
In one embodiment, the method of the invention comprises treating an area affected by an internal injury and reducing the formation of adhesions after the injury by applying an effective amount of a polyanionic polymer to the affected area. Including. Polyanionic polymers can be crosslinked. Typically, the amount of polyanionic polymer in the composition is between 0.5% and 2.5% by weight. In a preferred embodiment, the composition has 1% crosslinked polyanionic polymer.
[0065]
In one embodiment, the method of the present invention comprises administering to the affected area an effective amount of a composition comprising a polyanionic polymer and which may comprise a hydrolase, preferably a protease, most preferably a multifunctional krill-derived serine protease. Application includes treating areas affected by skin wounds such as bedsores, venous ulcers, burns, or pain from pressure. An effective amount of the composition of this embodiment of the present invention is sufficient to promote debridement, prevent malodour and unwanted leaching and infection of skin wounds, and preferably heal the wound faster than if simply washed and bandaged. Quantity.
[0066]
In another embodiment, the method of the invention comprises applying an effective amount of a composition comprising a polyanionic polymer and capable of containing a krill-derived protease, preferably a protease, more preferably a multifunctional krill-derived protease. Treating affected areas of the peritoneum, pericardium, epicardium, and pleura injured by internal injury.
[0067]
In another embodiment, the method of the present invention provides a spinal or injured spine wound by applying an effective amount of a composition comprising a polyanionic polymer as described above and capable of containing a protease, preferably a krill-derived protease. Treating the meninges, eg, the dura mater (protective membrane of neural tissue), or areas of nerves and nerve sheaths to reduce or inhibit the formation of adhesions. Alternatively, such affected areas can be treated with hydrolase, which is in the form of a pharmaceutically acceptable vehicle, as is known in the art.
[0068]
In another embodiment, the method of the invention comprises treating an area of the tendon and its sheath affected by an internal injury, such as a surgical wound in tendinoplasty.
[0069]
The cumulatively damaged or other damaged area is an area comprising one or more of the following: a polyanionic polymer or an activity comprising at least two of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase activity in the area affected by the damage. Can be treated by administering a composition comprising a protease having the formula: Non-limiting examples of cumulative injury wounds that can be treated by the methods of the present invention include tendinitis, tenosynovitis or carpal tunnel compression syndrome.
[0070]
In another embodiment, the method of the invention treats the area affected by internal damage and reduces the formation of adhesions by applying an effective amount of a multifunctional protease derived from krill to the area affected. Including. The krill-derived multifunctional protease can be applied to the affected area in any pharmaceutically acceptable vehicle known in the art. A pharmaceutically acceptable vehicle acts as a carrier for the administration of a pharmacologically active substance, such as a multifunctional protease of the invention, but does not act on the active substance or in the body of the animal to which the substance is administered. It does not impair the function. An isotonic saline solution is an example of a pharmaceutically acceptable medium. Pharmaceutically acceptable vehicles can have excipients known in the art, such as dextran, calcium chloride, glycine, citric acid, and sorbitol, and some others.
[0071]
Compositions of the invention comprising a cross-linked polyanionic polymer may also be applied to intestines, breasts, skulls, tendons, and areas affected by gynecological surgery to inhibit or reduce adhesion formation or remodeling. it can.
[0072]
In another embodiment, the invention comprises a polyanionic polymer, which may be a microgel, by applying a coating comprising a composition having a thickness between about 0.1 mm and about 5 mm to a surface of a surgical implant. Provided is a method of treating a surgical implant with a composition to reduce the formation of adhesions between the implant and a region of tissue surrounding the implant, or between different regions of tissue surrounding the implant. Surgical implants that can be used in the methods of the present invention include artificial joints and prostheses, including prostheses for the inner ear, cranial plates, and cardiac pacemakers, drug delivery implants and indwelling catheters.
[0073]
In another embodiment, the method of the invention provides for administering an inflammatory, such as rheumatoid arthritis or other autoimmune disorder, by administering a composition comprising a polyanionic polymer, an enzyme, preferably a hydrolase, or both. It includes treating or treating an inflammatory disease or condition associated with the factor. The composition can be administered, for example, to an area affected by a condition or disease related to an inflammatory component or sequela. Other non-limiting examples of conditions included in the methods of this embodiment include local chronic inflammation, such as that caused by chronic osteoarthritis.
[0074]
The crosslinked polyanionic polymer used in the method of the present invention can be made by any method that provides a crosslinked polymer having an acrylic acid backbone and functional groups that are capable of ionizing into anionic form under physiological conditions. it can. For example, the polyanionic polymer used in the method of the present invention can be obtained by polymerization of a mixture comprising an ethylenically unsaturated crosslinker and at least one monomer having a negatively chargeable ionizable functional group. . Typically, the ionizable functional group is a base-titrable functional group. A carboxy group is an example of a base-titrable functional group. Polyanionic polymers can also be obtained from precursor polymers that have precursor functional groups that can hydrolyze to ionizable functional groups and then be negatively charged. For example, carboxylate esters are precursors of the carboxy group and, when titrated with a base, result in negatively charged carboxylate anions. The precursor polymer can be obtained by polymerization of a mixture comprising one or more monomers, at least one of which has a precursor of a functional group capable of becoming negatively charged. . The precursor group is converted to a functional group that can become negatively charged, for example, by hydrolysis, or any other means that will be apparent to those skilled in the art from a survey of the chemical structure of the precursor group. be able to. Conversion of the precursor group can occur before, during, or after administration of the composition.
[0075]
The backbone, or backbone, of the polyanionic polymer useful in practicing the method of the present invention is one or more monomers of structure I, wherein the indicated double bond is at least prone to polymerize by free radical polymerization. Contains repeating units that can be derived from the polymerization of certain monomers.
(R³) (R²) C = C (R¹) -XY (I)
In structure I, R¹, R²And R³, X, and Y are as defined above.
[0076]
Examples of suitable monomers include acrylic acid, methacrylic acid, allylsulfonic acid, itaconic acid, maleic acid or anhydride, itaconic acid, citraconic acid, to name a few. Many other monomers that can be used to make polyanionic polymers that form microgels with water are described by Huang et al., US Pat. No. 4,509,949. This is incorporated herein by reference.
[0077]
With respect to crosslinked polyanionic polymers capable of forming a microgel, it will be understood that the terms backbone and backbone are used interchangeably and refer to a portion of the polymer chain that is not derived from a crosslinker.
[0078]
In some embodiments, the microgel has a particle size between 1 μm and 500 μm in its aqueous expanded state at a pH between 6 and 8. In another embodiment, the microgel has a particle size between 10 μm and 500 μm in its aqueous expanded state at a pH between 6 and 8.
[0079]
The polyanionic polymers used in the method of the present invention may be homopolymers having repeating units derived from only one monomer described by structure I, or they may comprise any number of monomers of structure I May be a multipolymer derived from the polymerization of a mixture of Copolymers, terpolymers, quatrapolymers and other multipolymers have repeating units from monomers that do not have ionizable groups or precursors, and thus, for example, styrene, and that can copolymerize with monomers of structure I. Can be included. However, the final polymer contains at least 0.001 mol, preferably at least 0.0014 mol, more preferably at least 0.01 mol of base titration functional groups per gram of polymer (in the dry state accepted for industrial use). Have. A base titration functional group is a functional group that can be titrated with KOH, for example, a carboxy group.
[0080]
In a preferred embodiment, the polyanionic polymer is crosslinked and forms a microgel when combined with water. Preferred crosslinked polyanionic polymers are chemically crosslinked. Chemical crosslinking may be by ionic or covalent bonds, but is preferably by covalent bonds. Crosslinking can be introduced during the preparation of the polyanionic polymer, or can be introduced after the preparation of the polyanionic polymer. Chemical crosslinks may be durable under physiological conditions, or they may be hydrolysable (unstable) under physiological conditions. With respect to crosslinking, being unstable means being susceptible to enzymatic or non-enzymatic hydrolysis or oxidation.
[0081]
The covalent cross-linking may include one or more chemical compounds having at least two ethylenically unsaturated carbon-carbon double bonds that tend to polymerize by the same mechanism as the monomer represented by Structure I, preferably by a free radical mechanism. By using a cross-linking agent, it is preferably introduced at the time of preparing the polyanionic polymer. The chemical crosslinking agent introduced during the preparation of the polyanionic polymer can be selected to produce a covalent crosslink that is durable under physiological conditions after application of the composition comprising the polyanionic polymer. That is, the crosslinking introduced by the crosslinking agent is resistant to breaking or cleavage under physiological conditions. Examples of crosslinkers that can be introduced during the preparation of the polyanionic polymer to produce durable crosslinks include divinylbenzene and alkenyl ethers of polyhydric alcohols, such as those available from Aldrich Chemical (Catalog 25-172-0). Possible triallyl ethers of pentaerythritol and the like. Commercially available ethylenically unsaturated ethers or esters of these polyhydric alcohols having three or more hydroxyl groups are typically provided as a mixture in which some hydroxyl groups may not be derivatized. . Reference to a particular degree of etherification or esterification herein, such as tri or tetra, also refers to commercially important mixtures of etherified or esterified polyhydric alcohols known in the art, It will be understood that traces of etherified or esterified polyhydric alcohols with lower or higher degrees of etherification or esterification are included. Thus, it will be appreciated that, with reference to the specific mole fraction of double bonds, includes the expected changes due to this known degree of induction change.
[0082]
In practicing some embodiments of the present invention, for example, the preferred method of inhibiting adhesions, crosslinks between the chains of the polyanionic polymer may degrade under physiological conditions. According to one theory, breaking of the crosslinks may facilitate the eventual removal of the polyanionic polymer from the treated animal. This is because fragments with reduced molecular size (molecular weight) are formed when the crosslinks break, and smaller fragments are more easily removed (Yamaoka et al., J. Pharm. Sci, 84, 349 (1995)). . If two or more ethylene double bonds of the crosslinker are separated by a functional group, such as an ester or amide, which is prone to hydrolysis, crosslink breakage is facilitated. Examples of crosslinkers having ester linkages include acrylates and methacrylates of dihydric and polyhydric alcohols such as ethylene glycol, diethylene glycol, pentaerythritol, glycerol and sorbitol. Such crosslinkers are commercially available (eg, pentaerythritol triacrylate, Aldrich Chemical Catalog 24,679) or can be readily prepared from polyhydric alcohols and acryloyl or methacryloyl chloride. Acrylic and methacrylic esters of polyethylene glycol having a molecular weight between 200 and 40,000 can also be used as crosslinking agents. Ethylenically unsaturated derivatives of oligosaccharides, or their reduced products, can be used as crosslinking agents. A highly preferred crosslinking agent of this type is allyl sucrose. Crosslinkers can also be used in which there is at least one carbonate or carbamate group between each ethylene double bond and any other ethylene double bond of the linking agent. Bis- (2′-acryloxyethyl) carbonate, pentaerythritol tri (2′-acryloxyethyl) formate, and N- (2-acryloxy) ethyl- (2-acryloxy) ethyl carbamate are carbonate-bonded and carbamate-bonded. It is an example of a type crosslinking agent. Crosslinked polyanionic polymers having hydrolyzable crosslinks can also be prepared using crosslinkers in which the ethylene double bond is linked by a urea group. N, N'-di (2'-acryloxyethyl) urea is an example of a urea-linked cross-linking agent. Crosslinkers based on lactic acid can also be used. 1- (2-acryloxypropanoyl) -2-acryloxyethane is an example of such a crosslinking agent.
[0083]
Non-durable covalent crosslinks can be introduced after the preparation of the polyanionic polymer by functionalizing the polyanionic polymer and reacting it with a suitable crosslinker. For example, when Y in Structure I is a carboxyl group, 0.1% to 10% of the carboxyl groups in the polymer can be functionalized to an acid chloride, for example, by the action of thionyl chloride. The acid chloride group thus formed is reacted with, for example, an α, ω-diamine or α, ω-diol, such as polyethylene glycol, to form a covalent crosslink via an amide or ester group on a different polymer chain. Can be formed. Crosslinking can be introduced after formation of the polyanionic polymer by providing pendant hydroxyl groups to the polyanionic polymer and reacting them with a bischloroformic acid, for example, a bischloroformate of an α, ω-diol. Polyanionic polymers may be prepared by polymerizing one or more monomers of structure I with vinyl acetate and then hydrolyzing the acetate groups, or by combining one or more monomers of structure I with, for example, hydroxyethyl methacrylate. (HEMA) can be copolymerized to provide pendant hydroxyl groups. Generally, the amount of vinyl acetate or HEMA to be copolymerized will be sufficient to provide from 0.1 to 10 hydroxyl groups per 1000 repeating units on a molar basis.
[0084]
Preferably, the amount of cross-linking agent is kept low. Preferred crosslinked polyanionic polymers form a microgel with water and are made by polymerizing a mixture of one or more monomers of structure I and one or more ethylenically unsaturated crosslinkers of the type discussed above. You. The amount of one or more crosslinking agents used is effective to produce a crosslinked polyanionic polymer that forms a microgel when combined with water. When an ethylenically unsaturated crosslinker is used to form a crosslink during the formation of the polyanionic polymer, the ethylene double bond of the one or more ethylenically unsaturated crosslinkers is one or more monomers and one or more monomers. It is preferred to account for less than 0.02, preferably less than 0.01, of the total ethylenically unsaturated double bond combining one or more crosslinkers. Typically, the ethylenically unsaturated cross-linking agent accounts for at least 0.001 mole fraction of the total ethylenically unsaturated double bonds combining one or more monomers and one or more cross-linking agents. . These mole fractions are calculated based on the nominal number of ethylene double bonds in the ethylenically unsaturated crosslinker and are calculated based on the number of double bonds per molecule of the commercially available ethylenically unsaturated crosslinker discussed above. Adjust to account for known changes in the average number of
[0085]
In some embodiments, the polyanionic polymer used in practicing the method of the present invention is at least about 100, more preferably at least about 200, even more preferably at least about 400, even more preferably at least about 600, even more preferably Has an acid number of at least about 700, wherein the polymer is in an industrially acceptable "dry" preparation, such as a polymer containing up to 2% moisture, residual solvent, or residual monomer. It is in. In a preferred embodiment, the polyanionic polymer comprises at least 0.001 mole, preferably at least 0.0014 mole, more preferably at least 0.014 mole of base per gram of polymer in an industrially acceptable dry formulation. It has a titration functional group.
[0086]
The polyanionic polymer is preferably at least about 2,000 cP, more preferably at least about 4,000 cP (at 25 ° C.) in a 0.5% w / v neutralized aqueous solution (eg, having a pH between 6 and 8). Has a Brookfield RVF or RVT viscosity which is an indicator of macroviscosity of 20 rpm). These viscosity parameters relate to the acid form of the polymer. The macroviscosity (Brookfield viscosity) and the microviscosity of polymer solutions are described in R.E. Y. See, Lochhead et al., Polymers in Aqueous Media, pp. 147-64. 113-147, 1989. However, in certain preferred embodiments, the macroviscosity does not exceed about 100,000 times the microviscosity, and preferably does not exceed about 10,000 times.
[0087]
In some embodiments, the cross-linked polyanionic polymer is a commercial name of Carbopol, such as carbopol 971P, Carbopol 934P and Carbopol 974P, in the order of 971P over 934P, 934P over 974P, under the trade name of BFGoodrichPresidential Pharmaceuticals Corporation, Specialization Digital Physiological Pharmaceuticals Corporation, A) cross-linked homopolymers or copolymers of acrylic acid, such as the polymers sold by R.I. These types of polymers have a substantially acyclic aliphatic backbone, termed carboxypolymethylene or carbomer, and may be composed of any suitable number of monomers; In certain treatments, there may be a fixed number of such monomers or a variable number of monomers per preparation applied to the area affected by the injury. In addition, carboxypolymethylene can have a variable number of carboxyl groups attached to the polymethylene backbone. Suitable coupling agents are triallyl ethers of pentaerythritol (0.1% to 2.5%, w / w, based on other monomers).
[0088]
When using a microgel, the appropriate salt can be combined with the microgel, and its suitability is determined by the requirement that the microgel itself not cause harm to the damaged cornea, peritoneum, or any other tissue with which it contacts. I do. Suitable salts include, but are not limited to, potassium chloride or sodium chloride, especially when provided at physiological concentrations known in the art.
[0089]
Compositions used in practicing the method of the present invention can include glycerol, carboxypolymethylene, and distilled water, bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, and alkyls such as diisopropanolamine (DIPA). Adjust the pH using the amine. Stock solutions with an appropriate concentration of glycerol can be prepared using distilled water, the preferred being a 87% (w / w) glycerol solution with the remainder being distilled water. Stock solutions of a suitable solution of a base such as sodium hydroxide, for example, a 10% (w / w) sodium hydroxide solution, the balance being water, can also be prepared using distilled water. As is well known in the art, by making appropriate dilutions of stock solutions, polymer compositions useful in practicing the methods of the present invention preferably have a final concentration of components in the following ranges: ( 1) about 0% to about 60% (w / w) glycerol; (2) about 0.1% to about 10% (w / w), more preferably about 0.4% to about 7%, even more preferably Has about 1% to about 5% carboxypolymethylene, with the balance of the formulation being distilled water. The sodium hydroxide, 10% stock is used for pH adjustment and is adjusted to about neutral pH, more preferably from about 7 to about 7.8, even more preferably from about 7.2 to about 7.6. PH results.
[0090]
When contemplated to include a multifunctional hydrolase, the polyanionic polymer composition is intended to protect the multifunctional hydrolase against lyophilization, or reconstitution with distilled water, or both. It can also be prepared using excipients. Such excipients include, for example, calcium chloride, glycine, citric acid, sorbitol, and dextran. For example, a vial containing 50 units of a multifunctional hydrolase (this unit is defined above) preferably contains the following excipients in a concentration range given below when lyophilization is contemplated: (1 ) About 0.6 mM to about 1 mM calcium chloride, (2) 0 to about 12 mM, preferably about 6 mM to about 10 mM, most preferably about 8 mM glycine, (3) 0 to about 12 mM, preferably about 6 mM. To about 10 mM, most preferably about 8 mM citric acid, (4) about 100 mM to about 200 mM, preferably between about 150 mM and 170 mM, most preferably about 160 mM sorbitol, (5) about 1% to about 10% by weight. %, Preferably between about 7% and about 8%, most preferably 6% by weight of dextran.
[0091]
In a preferred embodiment of the invention, there is provided the treatment of wounds, especially skin wounds, using the aforementioned polyanionic polymer compositions, optionally in combination with a suitable multifunctional hydrolase. Preferably, the multifunctional hydrolase has a proteolytic activity corresponding to at least one activity from the group comprising chymotrypsin, trypsin, collagenase, elastase and exopeptidase activities. The multifunctional hydrolase has at least two of said proteolytic activities, more preferably at least three of said proteolytic activities, even more preferably at least four of said proteolytic activities, most preferably all of said proteolytic activities. Is more preferable.
[0092]
The compositions used in the context of the method of the invention can be applied, for example, locally, to the area to be treated in this way. The polyanionic polymer composition can be applied as a paste, jelly, or in the form of a sheet, which can be pre-hydrated or hydrated by the body fluid in situ.
[0093]
The polyanionic polymer composition can be administered as a paste, jelly, or as an injectable liquid formulation for administration to areas affected by internal injury, such as internal surgical wounds that are prone to adhesions. To treat internal damage, the multifunctional krill-derived protein can be administered in a pharmaceutically acceptable vehicle, such as an isotonic saline solution. The multifunctional protein can also be administered to the area affected by an internal surgical wound in the form of a composition comprising a polyanionic polymer. In a preferred embodiment, the multifunctional protein is administered in the form of a composition comprising a microgel to the area affected by the surgical wound. Particularly preferred microgels comprise a crosslinked polyanionic polymer. Crosslinked carboxypolymethylene is a useful crosslinked polyanionic polymer.
[0094]
A method of treating damage to a membrane, for example, the peritoneum, pleura, or pericardium, or treating an internal organ, interoperably administers a composition of the invention to the site of injury and to the affected area. Including. Treatment to prevent the formation or remodeling of surgical adhesions is performed interoperably.
[0095]
Treatment of corneal wounds can be performed using hydrolase in any pharmaceutically acceptable vehicle, according to standard pharmaceutical practice. The medium may be a microgel. Treatment is performed by applying drops or gels to the eyes. For ophthalmic administration, the ointment or droppable liquid may be delivered by an ophthalmic delivery system known in the art, such as an applicator or eye dropper. Such compositions for treating corneal wounds include mucopolysaccharides such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, hydroxypropylmethylcellulose or polyvinyl alcohol, preservatives such as sorbic acid, EDTA or benzyl chromium chloride, and normal amounts of A diluent and / or carrier can be included. In a preferred embodiment, the composition comprising the multifunctional protein administered to the eye comprises a polyanionic polymer composition.
[0096]
A method of treating a corneal ulcer, for example, an ulcer caused by a herpes keratitis infection, comprises administering a composition comprising a multifunctional hydrolase to the affected eye and treating the corneal ulcer. Administering an effective amount of a multifunctional hydrolase, wherein the multifunctional hydrolase has at least two of chymotrypsin, trypsin, collagenase, elastase and exopeptidase activities, and at least about 60% sequence similarity to the reference sequence . More preferably, the hydrolase has at least three of said proteolytic activities and at least about 80% sequence identity with the reference sequence. More preferably, the hydrolase has at least three of said proteolytic activities and at least about 90% sequence similarity to a reference sequence. More preferably, the hydrolase has at least three of said proteolytic activities and at least about 90% sequence identity with the reference sequence. More preferably, the hydrolase has at least three of said proteolytic activities and at least about 95% sequence similarity to a reference sequence.
[0097]
In embodiments directed to inhibiting adhesions, the methods of the invention include pretreatment and / or concurrent treatment of the injured membrane with a corticosteroid, such as cortisone, alone or in combination with an antihistamine. Can be included.
[0098]
As mentioned above, the multifunctional hydrolase used in the context of the present invention is preferably a krill-derived hydrolase such as a proteinase. More preferably, the multifunctional hydrolase is part of a multifunctional protein and can have non-enzymatic and enzymatic functions. Crustaceans, including Antarctic krill, are useful sources of the multifunctional proteins of the present invention. Proteins having "multifunctional activity" include chymotrypsin, trypsin, collagenase, and at least one of elastase or exopeptidase activities, or asialo GM₁It is defined herein to include ceramide binding activity. For purification of multifunctional proteins from Kuril, see, for example, US Patent Application Serial No. 08 / 600,273, entitled "Multifunctional Enzyme," below, incorporated herein by reference (February 8, 1996). (Application), inventor deFaire et al.
[0099]
For topical treatments, including treatments on internal surfaces, preferred suitable doses of multifunctional krill-derived protein per application range from about 0.01 U / ml to about 10 U / ml. Yes, typically with a 0.5 mm to 5 mm layer of a carrier such as a cream, ointment, polyanionic polymer, preferably about 0.01 U / ml to about 1.0 U / ml, preferably about 0.2 U / ml. / Ml is more preferred. This dosage range applies to vehicles such as gels, ointments, creams, liquids, sprays, aerosols and the like. In some embodiments, such as wound debridement, larger doses can be used initially. Preferably, the troche is designed to deliver from about 0.01 U to about 10 U, more preferably from about 0.01 U to about 1.0 U, and even more preferably about 0.2 U. For all external treatments, the protein composition will generally be applied from about 1 to about 10 times per day, preferably from about 2 to about 5 times per day. Of course, these values will vary with a number of factors, including the type and severity of the disease, the age, weight, and medical condition of the patient, as will be appreciated by those skilled in the medical arts. It is contemplated that very large doses can be used without substantial adverse effects. Generally, the multifunctional protein will be administered in an effective amount.
[0100]
In another embodiment, the invention is directed to a method of treating such an injury by administering an effective amount of a composition comprising a polyanionic polymer (eg, a microgel) to an area affected by the injury that is susceptible to formation of an adhesion. I will provide a. When the injury is to the peritoneum, a 200 ml to 300 ml polymer composition containing 0.5% to 2.5% by weight of the polyanionic polymer is a typical effective amount, but if a practitioner, the injury is It will be appreciated that this amount will vary depending on the location, size, and severity of the DNA.
[0101]
Humans are a preferred subject for treatment. However, as will be appreciated by those of skill in the art in light of the present disclosure, multifunctional proteins can be used in many veterinary settings to treat animals, preferably mammals.
[0102]
The composition to be administered is preferably adjusted to a physiologically relevant pH, such as from pH 6.5 to pH 7.5. If an enzyme is included in the composition, salts and stabilizers in amounts effective to increase activity or stabilize the enzyme can be added.
[0103]
In another preferred embodiment, the multifunctional hydrolase used in the context of the present invention preferably has the aforementioned proteolytic activity and at least about 60% sequence identity or similarity with the reference sequence. More preferably, the multifunctional hydrolase has at least about 70% identity or similarity with the reference sequence, more preferably at least about 80% or 85% identity or similarity with the reference sequence, even more preferably with the reference sequence. It has at least about 90% or 95% identity or similarity, most preferably at least about 97% identity or similarity with the reference sequence. The percentage of similarity described above is preferred, but the percentage of identity is more preferred.
[0104]
Many other modes of administration, including but not limited to sustained release formulations, liposome formulations, or polymer matrices, will be apparent to those skilled in the art.
[0105]
The method of treating injury by administering a polyanionic polymer composition, with or without a multifunctional hydrolase or other substance such as an antibiotic, is preferably performed at a suitable time, for example, Examining the type and severity of the tissue affected and the condition being treated will be apparent to the skilled practitioner. Preferably, the therapeutic agent is administered at least until the healing of the affected wound is complete, more preferably for at least another 5 days thereafter. Corneal wounds can be treated, for example, over 2 to 35 days. In other cases, the treatment is for at least about 10 days, more preferably at least about 20 days, even more preferably at least about 28 or 35 days. Treatment of skin wounds with a composition comprising a polyanionic polymer composition and a multifunctional hydrolase may be between 7 and 42 days. It is preferred that the treatment be carried out using at least one application per day, more preferably from 2 to about 6 applications per day, using methods of topical application to the eye known in the art.
[0106]
The multifunctional hydrolase has a preferred molecular weight from about 20 kd to about 40 kd, more preferably the molecular weight is from about 26 kd to about 32 kd.
[0107]
Preferred multifunctional hydrolase, Panaeus vanameii 1, Panaeus vanameii 2, Panaeus monodon chymotryptic-1, Panaeus monodon tryptic, Panaeus monodon chymotryptic-2, Uca pugilator enzyme I, Uca pugilator enzyme II, Kamchatka crab IA, Kamchatka crab IIA, Kamchatka crab IIB, Kamchatka crab IIC, Crayfish protease 1, Salmon enzyme 1, Atlantic cod I, Atlantic cod II, or a third Atlantic cod trypsin (European J. Bio). , 180: 85~94 (1989) and Protein Resource Accession it is to have been) described in No.S03570, not limited to these. Preferably, these specific enzymes include the following respective peptide sequences:
"Sequence Listing 1"

[0108]
The most preferred multifunctional hydrolase for use in the context of the present invention is PHM-101, a purified preparation of a krill multifunctional hydrolase. Methods for purifying this enzyme, and preferred properties, are described in PCT / US99 / 14751.
[0109]
The methods of the invention can include pre-treatment or co-treatment of the affected tissue, or both, with an appropriate antibiotic. Suitable antibiotics are those that retain their potency when placed in physiological conditions. Some antibiotics are preferably used topically in tissues, including but not limited to ciprofloxacin. Antibiotics can be incorporated into therapeutic agents using polyanionic polymers, with or without multifunctional hydrolases.
[0110]
6. Hydrolysable polymer
In one embodiment, a polyanionic polymer comprising a hydrolyzable linkage, comprising two or more polyanionic polymer segments, a linking moiety that links the polyanionic polymer segments, wherein the linking moiety comprises the following (I) Or (II) or a polyanionic polymer comprising both:
(I) A segment linked via an amide, ester or thioester linkage incorporating an acyl or acyl analog moiety of the polyanionic polymer, wherein the segment is: (a) incorporated into the amide, ester or thioester linkage. Oxy, thio (-S-) or imino (-NR-, where R is H or C₁~ C₆C. having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂Alkylene (where alkylene and alkylene described below in this paragraph are₁~ C₁₀Or C₁~ C₅With the proviso that at least one of the amide, ester or thioester linkages is other than an ester linkage; or (b) a polymer segment having an amide, ester or thioester linkage attached thereto, and Or thiol C₂~ C₅Carboxylic acid or hydroxyproline derivatives and (ii) オ キ シ, (a) oxy, thio (—S—) or imino (—NR—, where R is H or C) incorporated in an amide, ester or thioester bond₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂An alkylene moiety, or (b) a polymer segment of α, ω-diol or α, ω-diol having an extended chain; or (c) a polymer segment having amide, ester or thioester linkages, wherein (i) ) One or more hydroxy or thiol C₂~ C₅A carboxylic acid or hydroxyproline derivative, (ii) ｛, (a) oxy, thio (-S-) or imino (-NR-, where R is H or C, incorporated in an amide, ester or thioester bond;₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂An alkylene moiety, or (b) a polymer segment of one or more α, ω-diol or chain-extended α, ω-diol} and (iii) one or more carbonyldioxy moieties; or (d) A polymer segment having amide, ester or thioester linkages attached thereto, wherein (ii) (a) oxy, thio (-S-) or imino (-NR-, R is H or C₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂An alkylene moiety, (ii) a polymer segment of (b) one or more chain-extended α, ω-diols, and (iii) one or more carbonyldioxy moieties; or (e) an amide, ester or A polymer segment having thioester bonds attached thereto, (ii) (b) one or more chain-extended α, ω-diols, and (iii) one or more carbonyldioxy moieties. Or (f) a direct anhydride formed between the acid moieties of the polyanionic polymer; or (g) a segment containing anhydride and carbonyl bridges formed between the acid moieties of the polyanionic polymer;
(II) residues after a crosslinking reaction,
(A) two or more terminal acrylate or methacrylate moieties that provide available unsaturated bonds for crosslinking reactions;
(B) a segment that connects the terminal acrylate or methacrylate moiety through an amide, ester or thioester bond incorporating an acyl bond of the acrylate or methacrylate moiety, wherein the segment is: Incorporated oxy, thio (-S-) or imino (-NR-, where R is H or C₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂Alkylene, wherein at least one of the amide, ester or thioester linkages is other than an ester linkage; or (2) a polymer segment having an amide, ester or thioester linkage attached thereto, and Or thiol C₂~ C₅Carboxylic acid or hydroxyproline derivatives and (ii) オ キ シ, (a) oxy, thio (—S—) or imino (—NR—, where R is H or C) incorporated in an amide, ester or thioester bond₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂An alkylene moiety, or (b) a polymer segment of α, ω-diol or α, ω-diol having an extended chain; or (3) a polymer segment having amide, ester or thioester linkages, wherein (i) ) One or more hydroxy or thiol C₂~ C₅A carboxylic acid or hydroxyproline derivative, (ii) ｛, (a) oxy, thio (-S-) or imino (-NR-, where R is H or C, incorporated in an amide, ester or thioester bond;₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂(4) a polymer segment of an alkylene moiety, or (b) one or more α, ω-diols or chain-extended α, ω-diols and (iii) one or more carbonyldioxy moieties; A polymer segment having amide, ester or thioester linkages attached thereto, wherein (ii) (a) oxy, thio (-S-) or imino (-NR-, R is H or C₁~ C₆Alkyl, having a terminal linking group selected from₁~ C₁₂An alkylene moiety, (ii) a polymer segment of (b) one or more chain extended α, ω-diols, and (iii) one or more carbonyldioxy moieties; or (5) an amide, ester or A polymer segment having a thioester bond attached thereto, the segment comprising (ii) (b) one or more chain-extended α, ω-diols, and (iii) one or more carbonyldioxy moieties. residue.
[0111]
In other embodiments, two or more polyanionic polymer segments terminating at one or both termini, with a linking group being an oxygen or sulfur residue from a hydroxide or thiol moiety, and linking Provided is a linear polyanionic polymer comprising a linking group moiety cleavable at an internal amide, ester or thioester bond, linking groups to form a linear polyanionic polymer. The polymer consists of atoms selected from carbon, hydrogen, oxygen and sulfur, and may include a monomeric moiety comprising carbon and hydrogen.
[0112]
In one embodiment of the present invention, (a) a C with three or more (eg, up to 5 or 6) attached hydroxyl or thiol₁~ C₁₂(Preferably C₁~ C₁₀Or C₁~ C₅A) reacting an alkylene, or a mono- or disaccharide core having three or more linking hydroxyls, with (b) 3 equivalents or more (eg 8) of a cyclic diester of the formula:
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R in the above formula¹And R²Is independently methylene or ethylene, up to two C₁~ C₄It can be substituted with alkyl. The resulting polyvalent core has a substituent -R³ _nWherein n is 0 or more (0 to 8 or the like), the total of n values is at least 3 to 8 (3 to 8 or the like), and R³Is independently:
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R¹And R²Is methylene, and can be preferably substituted. Substitute is C₁~ C₂Preferably, it is alkyl. The terminal hydroxyl from the open cyclic diester reacts to form an ester or ether linkage that is adapted to be reactive for subsequent free radical polymerization (and thus adapted to form a polyanionic polymer segment). Replace the hydroxyl with a saturated moiety. This moiety is preferably an ester-linked acryloyl group, such as can be formed using acryloyl chloride. The average of n is preferably 1 or 2. Preferably, at least 80%, 90%, 95% or 98% or more of the bound hydroxyl or thiol of the core reacts in this manner. One preferred core is pentaerythritol.
[0113]
Starting with any multivalent core (any of those described herein) having a terminal unsaturation adapted to be reactive to a subsequent free radical polymerization, the subsequent free radical polymerization is Preferably, the polyanionic polymer segments are adapted to limit the molecular weight of more than 90% of the segments to 50 kd or 40 kd or less (eg, by a chain extender). In one embodiment, 95%, 98% or more of the segments fall within these size limits. The average molecular weight is preferably from 20 kd to 40 kd, or from 25 kd to 35 kd. Suitable chain stoppers are known in the art.
[0114]
Thus, in one embodiment of the invention, the polyanionic polymer has polyanionic segments of these sizes cross-linked by a polyvalent cross-linking agent containing a hydrolyzable linkage.
[0115]
The core portion can be reacted with the compound of formula (52) at an elevated temperature effective to dissolve such a compound of formula (52), 120 ° C. for lactide, for example for at least 20 hours. . One example of the formation of a linking moiety adapted to be reactive to a subsequent free radical polymerization is the reaction with acryloyl chloride in dichloromethane in the presence of triethylamine at ambient temperature.
[0116]
Other preferred hydrolyzable polymers, polyanionic polymers, include any polymer comprising two or more linearly linked polyanionic segments, the bonds of which are similar to those described below in Procedure IV. And via a hydrolyzable linking moiety that binds to the terminal oxo or thio moiety of the polyanionic segment. Preferably, the segments are within one or more of the size limits described herein. These linear multimers of the polyanionic segment can be further cross-linked with hydrolyzable linking moieties.
[0117]
In other preferred hydrolyzable polymers, the carboxylate-containing polyanionic polymer is converted to a derivative for sampling (eg, one in 20) of the monomers providing the carboxylate, via an amide, ester or thioester linkage. -XR⁴X and Y are independently S, O or NH;⁴Is up to two C₁~ C₄Linear C which can be substituted with alkyl₁~ C₁₀(Preferably C₁~ C₅) Alkyl. X and Y are preferably different to provide different reactivities to facilitate selective addition of one end to the polyanionic polymer. However, even when X and Y are the same, the chemistry of the protecting group (see the example in co-pending Attorney Socket 314572-103C) can be used to obtain this selective linkage. . The YH is then reacted by Michelal addition using a crosslinker with a terminal acrylate or acrylamide moiety (linking moiety). Thus, the linking moiety has the following structure:
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Y in the above formula²Is S, O or NH (preferably O or NH), n is 2 or more (eg, up to 4, 5 or 6);⁵Is a hydrolysable linking moiety comprising C, H and two or more heteroatoms which may be O, S or N, wherein all O, S or N atoms are hydrolysable bonds or ether or thioether bonds Is related to R⁵May be or include a segment of PAP (such as PEG), preferably having a molecular weight within the preferred range described above. Other than PAP, it may not be possible, but R⁵Preferably has a molecular weight of less than 5,000, more preferably less than 1,000. R⁵Are described herein.
[0118]
The size of the polymer cross-linked with the linking moiety or the polymer cross-linked with a hydrolyzable bond described in the previous section of this section 6 and the size of the polyanionic polymer segment described in the previous section of this section 6 are “polymer”.
[0119]
The linking agent or linking moiety of the present invention can be obtained by various techniques, such as those described in detail below. Generally, most linking agents or moieties are used to make polymers according to the following.
[0120]
Procedure I: Formation of degradable crosslinked PAP during free radical polymerization.
Carbomers are currently formed by the polymerization of acrylic acid in the presence of a degradable crosslinker. The contribution of this approach I comes from the design of the linking parts to produce hydrolyzable hydrogels by hydrolysis. One or more hydrolyzable bonds are located within the crosslinker, for example, between sites of polymerizable unsaturation. This is in contrast to the crosslinkers used in industrial carbomer (1), which are designed to be hydrolytically stable.
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In these polymers, the anionic monomer is polymerized using, for example, a chain transfer agent or a high concentration of a polymerization initiator under conditions where the molecular weight of PAP is relatively small, up to about 50,000. It would be advantageous.
[0121]
I. A. : Degradable linking moiety based on pentaerythritol core:
In order to obtain resolution, we attempt to incorporate bonds known to be hydrolysable in the linking moieties such as esters, amides, carbonates, ureas and the like. For example, (2), which can be prepared by the reaction of pentaerythritol and acryloyl chloride, can be incorporated:
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(2) Linkers containing both carbonates and esters that can be expected to degrade faster can be prepared from hydroxyethyl acrylate combined with pentaerythritol and phosgene:
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Of course, the foregoing can be made from various cores, such as 1,2-ethanediol, or from glycerol, or from triethanolamine, or from other cores that can be identified by those skilled in the art.
[0122]
I. B. : Substances from degradable linking moieties based on two or more sites of unsaturation in the polymerization, such as hydroxyethyl acrylate (4) and / or aminoethyl acrylate (5):
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For example, dimerization of phosgene with (4) and (5) will produce at least one of the following, depending on the dimerization pair:
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It can be expected that (6) decomposes faster than (7) and that (7) decomposes faster than (8). Similar structures having more than two polymerization sites of unsaturation can be made.
[0123]
I. C. : Degradable linking moiety based on substance from acryloyl chloride (9):
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The dimerization of (9) with 1,2-ethanediol produces the hydrolyzable (10):
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Dimerization of (9) with ethanolamine produces (11), which can be expected to degrade more slowly than (10):
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Dimerization of (9) with 1,2-diaminoethane produces (12), which can be expected to degrade more slowly than (11):
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Alternatively, an anhydrous crosslinker that can be expected to degrade faster than (10) can be formed:
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[0124]
I. D. : Degradable linking moiety based on lactic acid or other hydroxy acid:
I. D. 1. : Lactic acid (14)
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It can be reacted with acryloyl chloride to form (15):
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(15) can then be reacted with hydroxyethyl acrylate to form (16):
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Such structures having three or more polymerization sites of unsaturation can also be made.
[0125]
I. D. 2. : Lactyl esters, ie, dimers of lactic acid, or dimers of other hydroxy acids, can also be used. For example, one can obtain hydroxyethyl acrylate and use hydroxyl to open the lactide ring under non-polymerizing conditions to give (17):
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17) can be reacted with acryloyl chloride to form a linking agent (18):
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Similar structures can be formed having three or more sites of unsaturation in the polymerization, and other hydroxy acids.
[0126]
I. E. FIG. : Including PAO diol (19) or other polyfunctional PAO, or other difunctional or polyfunctional water-soluble polymer of which PEG is a representative, exemplified by some representative structures below: Linking agent:
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Such an approach is advantageous in that a second approach for adjusting the physical properties of the hydrogel particles can be obtained by changing the molecular weight of the PAO. The high molecular weight of PAO results in a low degree of crosslinking.
[0127]
I. E. FIG. 1. : PAO diol
A carbonate-containing linking agent can be formed by coupling PAO to hydroxyethyl acrylate with phosgene to give (20):
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Alternatively, the ester-containing group can be obtained by reacting PAO with acryloyl chloride to give (21):
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Lactate esters can be incorporated, such as by reacting PAO diol with lactic acid and phosgene to form (22):
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The acid chloride of (22) is formed and reacted with hydroxyethyl acrylate to give (23):
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The hydroxyl of the PAO diol can be activated to form the ester with lactic acid (24):
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(24) is then reacted with acryloyl chloride to give (25):
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By obtaining (26) by a ring opening reaction using lactide, a pair (or more) of lactic acid residues can be linked.
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In the above formula, n is preferably 10 or less, more preferably 5 or less. (26) can be acrylated to give (27);
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Alternatively, (26) can be coupled to hydroxyethyl acrylate to provide (28):
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[0128]
I. E. FIG. 2. : Polymer prepared using PAO diamine:
Similar amide and urea structures can be obtained from PAO diamines. In general, these structures will degrade more slowly than their ester and carbonate analogs.
[0129]
Method II: Linking or cross-linking shorter PAP and PAO chains using a degradable linking agent between them:
Polymerization of the PAP chain in the absence of cross-linking, followed by cross-linking of the PAP chain, readily modulates the molecular weight of PAP, and thus the pharmacodynamic effects of the degradation products of the cross-linked polymer particles.
[0130]
II. A. : Polymer made from poly (AM-co-hydroxyethyl acrylate):
A small amount of hydroxyl can be added, for example, with an anionic monomer and hydroxyethyl acrylate (H₂C = CHCO₂CH₂CH₂OH) or by copolymerization with vinyl acetate, and then optionally by hydrolyzing the acetyl side groups to produce additional alcohols, which can be included along the PAP chain. The hydroxyl side groups can be cross-linked by reacting with PAO diol activated with phosgene to give (29):
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[0131]
II. B. : Polymer prepared from PAP:
Alternatively, starting with PAP, some side-chain carboxyl groups (or similar groups) may be derivatized with aminoethanethiol groups and cross-linked with a degradable diacrylate linking agent, such as (21), to form (30) You can get:
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[0132]
II. C. : A polymer containing both carbonate and ester linkages:
Starting with PAP, some carboxyl side groups (or similar groups) can be converted to acid chlorides and these can be functionalized with 1,2-ethanediol under non-crosslinking conditions. This material can be cross-linked with PAO diol preactivated with phosgene to give (31):
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(31) can also be formed from a copolymer and hydroxyethyl acrylate, which is then coupled to the PAO after activation of the PAO with phosgene.
[0133]
II. D. : Lactic acid, or other hydroxy acid, in a linking agent obtained from a hydroxyl-containing copolymer (here shown from the hydrolysis product of a copolymer with vinyl acetate) after ring opening of lactide under non-polymerizing conditions (32) can be obtained by incorporating
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(32) can then be coupled with phosgene-activated PAO diol to give (33):
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The PAO terminal hydroxyl can be used to open the lactide ring under non-polymerizing conditions to form a diol precursor, which can be coupled with a phosgene-activated PAO diol to give (34):
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[0134]
Method III: PAP Crosslinking:
Similar to approach II, the PAP can be crosslinked or bound after the polymer formation reaction.
[0135]
III. A. For example, starting with PAP, a small amount of acid chloride can be formed and cross-linked with 1,2-ethanediol or a similar diol to give (35):
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[0136]
III. B. Starting with a hydroxyl-containing copolymer, it can be cross-linked with phosgene to give (36):
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Alternatively, the substance (37) linked by an anhydride can be obtained directly.
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[0137]
III. C. Using, for example, a lactide ring opening reaction using 1,2-ethanediol in excess, (38) can be obtained:
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(38) can be used to crosslink a phosgene-activated homopolymer to give (39), or (40) using an acid chloride-activated homopolymer PAP:
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[0138]
Method IV:
Hydrolyzable (ie, unstable) linear PAP.
The linking of short PAP chains via degradable moieties can be used to obtain high molecular weight linear PAP.
[0139]
IV. A. : Degradable linear PAP from hydroxyl-terminated PAP.
Anionic monomers can be polymerized by living polymerization to obtain low molecular weight PAP (41) with terminal hydroxyl groups:
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Linking the hydroxyl group with phosgene results in an extended PAP chain (42) linked by a degradable carbonate group:
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The size of the degradable block can be increased by reacting the hydroxyl-terminated PAP with, for example, PAO diol activated by phosgene to give (43):
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Using (41) in a lactide ring opening reaction under non-polymerization conditions, (44) can also be obtained:
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Thus, the hydroxyl groups of two such polymer segments are reacted with 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) (or phosgene can be used) to remove the hydroxyl groups from the PAP block separated by a lactyl moiety. It is possible to obtain a high molecular weight PAP constituted, for example (45):
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Alternatively, (44) can be coupled to (41) in this way to give (46):
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[0140]
IV. B. : Degradable linear PAP from PAP segment.
IV. Similar to A, low molecular weight PAP (47) with terminal groups other than hydroxyl groups, such as thiol groups, can be obtained by living polymerization:
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These groups are represented by II. Reaction with a diacrylated compound similar to that described in B, for example PAO-diacrylate (21), can give (48):
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(47) is converted to a short degradable block such as I. C. It is anticipated that when reacted with diacrylates (10), (11) and (12) from, polymers (49), (50) and (51) with different degrees of susceptibility to decomposition can be obtained. be able to.
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[0141]
The various polymers described herein are shown in further detail in an application filed concurrently with the present application (Attorney Docket 314572-103C).
[0142]
【Example】
This example describes a method for making hydrogels and microgels for use in the context of the present invention. The microgels are used alone or in combination with other substances, such as the krill-derived multifunctional hydrolases described herein.
[0143]
Accordingly, the chemicals and materials used were as follows: glycerol (Merck, Darmstadt, GERMANY), Carbopol® polyanionic polymer (BF Goodrich Company, Specialty Polymers and Chemicals, Brecksnor, PA) (Aldrich), distilled water, and 10% sodium hydroxide. The final concentrations of the constituent chemicals are 23.5% w / v for the glycerol stock (87% w / w), 0.8% w / v for the desired polyanionic polymer, distilled water and The pH was adjusted to 7.4 using sodium hydroxide (10%) or diisopropanolamine and the volumes adjusted.
[0144]
Using standard sterilization procedures, a small amount of carbopol was mixed with distilled water with slow stirring using a propeller-type stirrer. Stirring was continued until the powder was dissolved. Any trapped air was removed by reducing the pressure (water-operated gauge). Glycerol was added with slow stirring, the pH was measured, and the pH of the composition was adjusted to 7.4 using a 10% NaOH solution or diisopropanolamine. Gelation occurred, resulting in a clear, transparent microgel. The resulting microgel was stored at 4 ° C.
[0145]
The following 10 g batch was made using the same method, but by weight-weight measurement of the quantity:
[Table 2]

[0146]
All publications and references, including but not limited to patents and patent applications, cited herein are each incorporated by reference as if the respective publication or reference was fully mentioned. The entire contents are hereby incorporated by reference as if specifically and individually indicated to be incorporated in the specification. Any patent application for which this application claims priority is also incorporated by reference in its entirety with reference to publications and references.
[0147]
Although the invention has been described with emphasis on the preferred embodiments, variations of the preferred devices and methods may be used, and the invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. Will be apparent to those skilled in the art. Accordingly, the present invention includes all modifications that come within the spirit and scope of the invention as defined by the following claims.

Claims (40)

A method of treating an area affected by an injury selected from corneal wounds and internal injuries, optionally a microgel, comprising a polyanionic polymer comprising a polymer chain formed from at least one ethylenically unsaturated monomer Administering to the affected area an amount effective to treat the injury, and wherein the polymer chains are linked by at least one linking moiety that includes a hydrolyzable linkage. The method of claim 1, wherein the polymer is preformed when the internal damage is susceptible to post-injury adhesions. 2. The method of claim 1, wherein the corneal wound is a corneal ulcer, corneal abrasion, or a chemical or physical injury to the cornea that is prone to corneal ulcer. Whether the internal injury is (a) an internal surgical wound, (b) a membrane covering the internal organ or tissue, or including damage to the cavity in which one or more internal organs or tissue resides; Alternatively, the method of claim 1, wherein (c) is susceptible to adhesions and the amount of polyanionic polymer administered is an amount effective to inhibit or reduce adhesion formation or remodeling. The polyanionic polymer is a preformed hydrolyzable non-addition polymer comprising a polymer chain formed from at least one ethylenically unsaturated monomer, wherein the polymer chain comprises at least one linkage comprising a hydrolyzable linkage. And at least one of the monomers is linked by a moiety
i) one or more functional groups that can be titrated with a base to form a negatively charged functional group, or ii) one that is a precursor of a functional group that can be titrated with a base Or the method of claim 1, wherein the method comprises a plurality of precursor groups, the precursor groups being converted to functional groups. The functional group ^{-C R 4} is hydrogen _{(O) OR 4, -0-} S (O 2) OR 4, selected from -S _(O 2) OR ⁴ or -S (O) OR ^4,, the precursor body group of normal or branched alkyl _C 1 _{~C 6} ^{R 4} are independently, ^-C phenyl or benzyl _{(O) oR 4, -0-} S (O 2) oR 4, -S (O ₂₎ selecting from oR ⁴ or -S (O) oR ^4,, the method of claim 5. One or more ethylenically unsaturated monomers according to the formula:
^{(R 3) (R 2)} C = C (R 1) -X-Y
In the above formula, Y is _{^{-C (O) OR 4, -0}} -S (O 2) OR 4, -S (O 2) is OR ⁴ or -S (O) OR ^4,, wherein ^{R 4} is Hydrogen or a cleavable group,
X is a direct bond; a linear or branched alkylene group having 2 to 6 carbon atoms, one or more of which can be replaced by an O, S or N heteroatom; An alkylene group having no hetero atom at the α-position or the β-position to Y; phenylene; a 5- or 6-membered heteroarylene having up to 3 heteroatoms independently selected from O, S or N; , provided that Y be ^{(R 3) (R 2)} C = C (R 1) - is also a heteroarylene not bound to a heteroatom, and ^R 1, ^{R 2} and ^{R 3} are _hydrogen, C 1 -C ₆ alkyl, carboxy, halogen, cyano, _isocyanato, C 1 -C ₆ hydroxyalkyl, alkoxyalkyl having 2 to 12 carbon _atoms, C 1 -C _{6 haloalkyl,} C 1 -C ₆ cyanoalkyl C ₃ -C _{6 cycloalkyl,} C 1 -C ₆ carboxyalkyl, select aryl, hydroxyaryl, haloaryl, cyano _aryl, C 1 -C ₆ alkoxyaryl, carboxy aryl, independently from nitro aryl or a group -X-Y, Wherein the C ₁ -C ₆ alkyl or C ₁ -C ₆ alkoxy group is either linear or branched and Q is the total number of ring carbon atoms in the cycloalkyl group. Up to Q-2 carbon atoms of the C ₃ -C ₆ cycloalkyl group of are independently replaced by O, S or N heteroatoms; provided that any doubly bonded carbon atom is directly bonded to O or S Aryl is phenyl or a 5- or 6-membered heteroaryl group having up to three heteroatoms selected from the group consisting of O, S and N The method of claim 6, wherein The polyanionic polymer has one or more pendant first functional groups selected from hydroxy, acyl halide, chloroformic acid, and mercapto, and the polyanionic polymer has a second functional group reactive with the first functional groups. The method according to claim 1, wherein the crosslinking is performed by a reaction of a crosslinking agent having a functional group. The polyanionic polymer is cross-linked using a cross-linking agent containing an ethylenically unsaturated derivative of a polydentate compound containing two or more ethylenically unsaturated moieties, each such moiety being a hydrolyzable bond. The method of claim 1, wherein the compound is linked to the polydentate compound by 2. The method of claim 1, wherein the composition further comprises an amount of a protease effective to treat the injury. A method of treating a wound, comprising administering an effective amount of a composition comprising a microgel, a preformed first polyanionic polymer, to an affected area, wherein the first polyanionic polymer comprises at least one A method comprising: a polymer chain formed from ethylenically unsaturated monomers; and wherein the polymer chains are connected by at least one linking moiety that includes a hydrolyzable bond. At least one of the monomers is
i) one or more functional groups that can be titrated with a base to form a negatively charged functional group, or ii) one that is a precursor of a functional group that can be titrated with a base Or a plurality of precursor groups, having precursor groups that are converted to functional groups, and at least one of the following:
a) The first polyanionic polymer is cross-linked by an ethylenically unsaturated cross-linking agent, and the molar fraction of the ethylenic double bonds contributed by the ethylenically unsaturated cross-linking agent in the mixture for preparing the polyanionic polymer is 0.02 or less, or
The method of claim 11, wherein b) the truth of the ratio of the macroviscosity of the microgel to the microviscosity of the microgel is not more than 10,000. A method of reducing or inhibiting the formation or remodeling of adhesions, optionally a microgel, comprising a composition comprising a polyanionic polymer comprising a polymer chain formed from at least one ethylenically unsaturated monomer. Administering an amount to the area affected by the adhesion prone damage, and wherein the polymer chains are linked by at least one linking moiety comprising a hydrolyzable linkage. A method of inhibiting or reducing the formation of adhesions after implantation of an implantable device, optionally a microgel, comprising a polyanionic polymer comprising a polymer chain formed from at least one ethylenically unsaturated monomer A method comprising treating a surgical implant with the composition and wherein the polymer chains are linked by at least one linking moiety comprising a hydrolyzable linkage. A method of treating an area affected by an injury selected from a corneal wound and internal injury, comprising: (a) a preformed hydrolyzable non-addition polyanionic polymer that is not a microgel; or (b) removable. Administering to the affected area an effective amount of a composition comprising a polyanionic polymer that is a suitable polymer. The removable polymer is a preformed hydrolyzable polyanionic polymer, wherein the polymer comprises:
At least one linking moiety comprising a hydrolyzable bond, and at least two polyanionic polymer segments linked to the linking moiety, and all polyanionic polymer segments in the polymer are linked together by said linking moiety. Wherein the polyanionic polymer segments in the composition have a molecular weight of 50 kd or less;
The method according to claim 15. The removable polymer is a preformed hydrolyzable polyanionic polymer,
90% or more of the polyanionic polymer segments in the composition include a segment having a molecular weight of 50 kd or less, and the polyanionic segment has at least one linking moiety attached thereto, and the linking moiety has three or more (a) A C ₁ -C ₁₂ alkylene having a terminal oxy or thio group (preferably C ₁ -C ₁₀ or C ₁ -C ₅ ), or a monosaccharide or disaccharide having three or more terminal oxy groups,
(B) —R ³ _n — bonded to each terminal oxy or thio, where n is 0 or more, the sum of the n values is at least 3, and the R ³ group is independently of the following formula: Selected,

Wherein the carbonyl group is attached to the terminal oxy or thio, R ¹ and R ² are independently methylene or ethylene, and can be substituted with up to two C ₁ -C ₄ alkyls; and (c) comprising residues after incorporation into polyanionic polymer segment in the unsaturated portion of an ester or ether bound by oxy R ^3, a method according to claim 15. The removable polymer,
Two or more linearly linked polyanionic polymer segments linked via a terminal oxo or thio moiety derived from a hydroxide or thiol moiety, and to form a linear polyanionic polymer segment 16. The method of claim 15, wherein the linking agent is a hydrolyzable polyanionic polymer that includes a linking moiety cleavable at an internal amide, ester or thioester bond. 16. The method of claim 15, wherein the linearly linked polyanionic segments are crosslinked hydrolyzable linking moieties. 16. The method of claim 15, wherein the removable polymer is a preformed hydrolyzable polyanionic polymer. 16. The method of claim 15, wherein the corneal wound is a corneal ulcer, corneal abrasion, or a chemical or physical injury to the cornea that is susceptible to corneal ulceration. Whether the internal damage is (a) an internal surgical wound, (b) a membrane covering the internal organ or tissue, or includes damage to the cavity in which one or more internal organs or tissue resides; or 17. The method of claim 15, wherein (c) is prone to adhesions and the amount of polyanionic polymer administered is an amount effective to inhibit or reduce adhesion formation or remodeling. The method according to claim 15, wherein the polyanionic polymer is a microgel. The polyanionic polymer is a preformed hydrolyzable non-addition polymer comprising a polymer chain formed from at least one ethylenically unsaturated monomer, and the polymer chain comprises at least one hydrolyzable linkage. Linked by a linking moiety, and wherein at least one of the monomers is
i) one or more functional groups that can be titrated with a base to form a negatively charged functional group, or ii) one that is a precursor of a functional group that can be titrated with a base 16. The method of claim 15, wherein the method has a precursor group that is converted to a functional group. The functional group ^{-C R 4} is hydrogen _{(O) OR 4, -0-} S (O 2) OR 4, selected from -S _(O 2) OR ⁴ or -S (O) OR ^4,, the precursor body group of normal or branched alkyl _C 1 _{~C 6} ^{R 4} are independently, ^-C phenyl or benzyl _{(O) oR 4, -0-} S (O 2) oR 4, -S (O ₂₎ selecting from oR ⁴ or -S (O) oR ^4,, the method of claim 24. One or more ethylenically unsaturated monomers according to the formula:
^{(R 3) (R 2)} C = C (R 1) -X-Y
In the above formula, Y is _{^{-C (O) OR 4, -0}} -S (O 2) OR 4, -S (O 2) is OR ⁴ or -S (O) OR ^4,, wherein ^{R 4} is Hydrogen or a cleavable group,
X is a direct bond; a linear or branched alkylene group having 2 to 6 carbon atoms, one or more of which can be replaced by an O, S or N heteroatom, An alkylene group having no hetero atom at the α-position or the β-position to Y; phenylene; a 5- or 6-membered heteroarylene having up to 3 heteroatoms independently selected from O, S or N, However, neither Y nor (R ³ ) (R ² ) C ＝ C (R ¹ )-is a heteroarylene not bonded to a hetero atom, and R ¹ , R ² and R ³ are hydrogen, C ₁ -C ₆ alkyl , carboxy, halogen, cyano, _isocyanato, C 1 -C ₆ hydroxyalkyl, alkoxyalkyl having 2 to 12 carbon _atoms, C 1 -C _{6 haloalkyl,} C 1 -C ₆ cyanoalkyl, ₃ -C _{6 cycloalkyl,} C 1 -C ₆ carboxyalkyl, aryl, hydroxyaryl, haloaryl, cyano _aryl, C 1 -C ₆ alkoxyaryl, carboxy aryl, nitro aryl, or group -X-Y, independently Wherein the C ₁ -C ₆ alkyl or C ₁ -C ₆ alkoxy group is either linear or branched and Q is the total number of ring carbon atoms in the cycloalkyl group C ₃ -C ₆ replaced by a cycloalkyl group Q-2 and up to O, S or N heteroatom carbon atom independently of, but also not bind directly to the O or S any carbon atom bonded to the double , Aryl is phenyl or a 5- or 6-membered heteroaryl group having up to three heteroatoms selected from the group consisting of O, S and N 26. The method of claim 25. The polyanionic polymer has one or more pendant first functional groups selected from hydroxy, acyl halide, chloroformic acid, and mercapto, and the polyanionic polymer has a second functional group reactive with the first functional groups. The method according to claim 15, wherein the crosslinking is performed by a reaction of a crosslinking agent having a functional group. The polyanionic polymer is cross-linked using a cross-linking agent containing an ethylenically unsaturated derivative of a polydentate compound containing two or more ethylenically unsaturated moieties, each such moiety being a hydrolyzable bond. 16. The method of claim 15, wherein the method is linked to the polydentate compound by 17. The method of claim 15, wherein the composition further comprises a protease in an amount effective to treat the injury. A method of treating a wound, wherein the composition comprises (a) a preformed hydrolyzable polyanionic polymer that is not a microgel, or (b) a first polymer that is a removable polymer. Administering to the area an effective amount. The first polymer is (a) a preformed hydrolyzable first polyanionic polymer, wherein the first polyanionic polymer comprises a polymer chain formed from at least one ethylenically unsaturated monomer. And (b) one or more ethylenically unsaturated crosslinkers and one or more ethylenically unsaturated monomers, wherein the polymer chains are linked by at least one linking moiety containing a hydrolyzable bond A microgel comprising a crosslinked second polyanionic polymer made by polymerization of
And with respect to (a) and (b), at least one of the monomers is
i) one or more functional groups that can be titrated with a base to form a negatively charged functional group, or ii) one that is a precursor of a functional group that can be titrated with a base Or a plurality of precursor groups, having precursor groups that are converted to functional groups, and at least one of the following:
a) The moles of ethylenic double bonds contributed by the ethylenically unsaturated cross-linking agent in the mixture forming the polyanionic polymer, wherein the first or second polyanionic polymer is cross-linked by the ethylenically unsaturated cross-linking agent. The fraction is 0.02 or less, or
31. The method of claim 30, wherein b) the first or second polyanionic polymer is a microgel and the truth is that the ratio of the macroviscosity of the microgel to the microviscosity of the microgel is less than or equal to 10,000. A method of treating an inflammatory disease comprising treating a composition comprising a protease having an activity comprising at least two of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase activities, to treat an inflammatory disease in an area affected by the disease. An inflammatory disorder comprising cervical spine disease, cumulative injury or injury, endometriosis, pelvic inflammatory disease, adhesive peritonitis, appendicitis, periodontitis, pericarditis or A method comprising having pleurisy. A method of treating a corneal wound, comprising administering to a affected area an effective amount of a composition comprising a protease having an activity comprising at least two of chymotrypsin, trypsin, collagenase, and elastase activity. A method of isolating a multifunctional protease from a biological sample, comprising extracting the multifunctional protease using fresh water, and extracting the biological sample with fresh water without mechanically destroying the biological sample. Further comprising applying the resulting product to an affinity column having the ligand aminophenylboronate. A method of treating an inflammatory disease, comprising administering a composition comprising a polyanionic polymer to an area affected by the disease in an amount effective to treat the inflammatory disease. 36. The method of claim 35, wherein the composition comprises a hydrolyzable polyanionic polymer. A method of reducing or inhibiting the formation or remodeling of adhesions, comprising: (a) a preformed hydrolyzable polyanionic polymer that is not a microgel, or (b) a polyanionic polymer that is a removable polymer. Administering an effective amount of a composition comprising the composition to an area affected by an injury prone to adhesions. A method of inhibiting or reducing the formation of adhesions after implantation of an implantable device, comprising: (a) a preformed hydrolyzable polyanionic polymer that is not a microgel; or (b) a removable polymer. A method comprising treating a surgical implant with a composition. A method of treating an inflammatory disease, comprising: administering a composition comprising a polymer to an area affected by the disease in an amount effective to treat the inflammatory disease, wherein the polymer comprises one or more polymers. A method comprising a polypeptide comprising a carboxylic amino acid residue. The dicarboxylic amino acid has the formula:

Wherein D is a straight or branched alkyl or alkylene having a substituent E which is a straight or branched alkyl or alkylene, wherein D and E are up to 10 carbon atoms in total 40. The method of claim 39, comprising: