JP2004506421A - 卵巣癌のための治療化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、合成化合物、これらの化合物を認識する抗体、これらの化合物をコードするポリヌクレオチド、およびこれらのエピトープの提示に応答して産生される免疫エフェクター細胞を提供する。本発明はさらに、本発明の組成物を送達することによって、被験者に免疫応答を誘導し、免疫治療を施す方法を提供する。

Description

【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年８月１７日に提出された、米国仮特許出願第６０／２２６，２４３号に対する、米国特許法第１１９項（ｅ）の下で優先権を主張する。この出願の内容は参照として本開示に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、ヒト卵巣癌に対して有用な治療化合物の分野に関する。
【０００３】
発明の背景
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される抗原エピトープの認識は、哺乳類の免疫応答の確立、維持、および実行において中心的な役割を果たしている。体細胞および抗原提示白血球によって発現される細胞表面のＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原のＴ細胞による探査および認識は、ウイルス、細菌、および寄生虫のような感染性微生物による侵入を制御するように機能する。さらに今では、抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は特定の癌細胞抗原を認識して、これらの抗原を発現する細胞を攻撃することができることが証明されている。このＴ細胞活性は、抗癌ワクチンの新しい戦略を開発するための基礎となる。さらに、不適当なＴ細胞活性化は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、および喘息のような特定の衰弱性の自己免疫疾患において中心的な役割を果たす。このように、ＭＨＣ分子によって提示される抗原エピトープの提示および認識は、多数の病態における免疫応答の調節において中心的な役割を果たす。
【０００４】
癌患者に由来する腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍細胞に結合して溶解する。この特異性は、ＭＨＣクラスＩおよびいくつかの細胞種においてはクラスＩＩ分子が、腫瘍細胞表面に提示される短いアミノ酸配列（エピトープ）を認識できることに基づいている。これらのエピトープは、腫瘍または癌細胞において独自にまたは異常に発現されている遺伝子によってコードされる腫瘍抗原と呼ばれる細胞内タンパク質のタンパク質溶解による分解に由来する。
【０００５】
特異的抗腫瘍Ｔ細胞を利用できれば、腫瘍抗原を同定することができ、それによって抗腫瘍免疫応答を誘発するように設計された癌ワクチンを産生することができる。抗腫瘍Ｔ細胞は、血液（そこで、細胞は末梢血単核球細胞分画に認められうる）、一次および二次リンパ様組織、例えば脾臓、卵巣癌患者における腹水（腫瘍関連リンパ球もしくはＴＡＬｓ）、または腫瘍そのものの内部（腫瘍浸潤リンパ球もしくはＴＩＬ）を含む、癌患者の体内に存在する。これらの中で、ＴＩＬは、Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドの同定において最も有用であった。
【０００６】
ＴＩＬを作製する従来の方法は、腫瘍生検組織を細切して、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下でインビトロで細胞浮遊液を培養することを含む。数日間のあいだに、腫瘍細胞とＩＬ−２との混合物は、腫瘍細胞を犠牲にして腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。このようにして、Ｔ細胞集団を増殖させる。初回増殖に由来するＴ細胞をその後、マイトマイシンＣ処理または放射線照射腫瘍細胞のいずれかと混合して、インビトロでＩＬ−２と共に培養して、腫瘍反応性Ｔ細胞のさらなる増殖および濃縮を促進する。インビトロ増殖を数回行った後、強力な抗腫瘍Ｔ細胞集団を回収して、これを用いて従来の、しかし単調な発現クローニング技術によって腫瘍抗原を同定することができる。カワカニら（Ｋａｗａｋａｎｉ， Ｙ．、（１９９４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１（９）：３５１５〜３５１９）。
【０００７】
腫瘍特異的Ｔ細胞をインビトロで産生するために現在用いられている方法論は、信頼性に乏しく、この方法によって同定された抗原は必ずしも抗腫瘍免疫応答を誘導しない。抗原が成熟Ｔ細胞に出合うと、無視、アネルギー、または物理的欠乏のためにしばしば免疫寛容が誘導されることが多数の実験によって証明されている。パードル（Ｐａｒｄｏｌｌ、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４（５）：５２５〜５３１）。
【０００８】
特定のペプチドがＴ細胞エピトープとして機能するか否かは、それらがＭＨＣ分子の抗原提示ドメインに有効に結合すること、しかもＴ細胞受容体分子によって特異的に認識されうる適当なセットのアミノ酸を示す必要がある。抗原性ポリペプチドに由来する天然のＴ細胞エピトープを同定することは可能であるが、これらのペプチドは特定の免疫応答を誘導するために最適な抗原を必ずしも提示しない。実際に、その配列を変化させる一つまたは多数のアミノ酸置換体を導入することによって天然のエピトープの有効性を改善することが可能であることが示されている（バルモリ（Ｖａｌｍｏｒｉ）ら、（２０００）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４（２）：１１２５〜１１３１）。このように、注意深く最適にした合成ペプチドエピトープを送達すれば、有用な免疫応答を誘導するための改善された方法を提供する可能性がある。
【０００９】
抗原を動物に導入することは、多様な目的のために、抗原に対する免疫応答またはその欠損を調節する目的のために、広く用いられている。これらには、病原体に対するワクチン接種、癌様細胞に対する免疫応答の誘導、アレルギー反応の減少、自己免疫障害の結果として起こる、自己抗原に対する免疫応答の減少、同種異系移植片拒絶の減少、および避妊目的の自己抗原に対する免疫応答の誘導が含まれる。
【００１０】
癌の治療において、腫瘍細胞を特異的に認識して溶解する細胞障害性Ｔリンパ球集団を作製するために、多様な免疫治療的アプローチが用いられている。これらのアプローチの多くは、腫瘍特異的抗原の同定および特徴付けに一部依存している。
【００１１】
近年、特定の病原体および腫瘍関連タンパク質が、そのアミノ酸配列が病原体または腫瘍関連タンパク質の抗原決定基ドメインのアミノ酸配列に対応する合成ペプチドによって免疫学的に模倣されている。これらの進歩にもかかわらず、天然の配列に基づくペプチド免疫原は、一般的に免疫応答の誘導に関して最適とは言えない。このように、免疫調節特性が増強した改変された合成ペプチドエピトープが必要である。本発明は、この必要性を満足して、関連する長所も同様に提供する。
【００１２】
発明の開示
本発明は、新規合成治療化合物を提供する。これらの化合物は、ＭＨＣ分子との結合を増強し、その天然での相対物と比較して免疫調節特性を増強するように設計される。本発明の合成化合物は、合成および天然の化合物に対する免疫応答を調節するために有用である。
【００１３】
本発明の化合物をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む遺伝子送達媒体、およびこれらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞がさらに提供される。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の化合物および組成物を送達すること、ならびにこれらをＭＨＣ分子に結合させて送達することによって、被験者における免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００１５】
本発明の化合物はまた、これらの化合物を特異的に認識して結合する抗体を作製するためにも有用である。これらの抗体は、被験者に投与すると免疫治療にとってさらに有用である。
【００１６】
本発明はまた、ＭＨＣ分子に結合した本発明のペプチド組成物を提示する抗原提示細胞の存在下で、そして抗原提示細胞を犠牲にしてインビボまたはインビトロで産生した免疫エフェクター細胞を提供し、およびこれらの免疫エフェクター細胞の有効量を被験者に投与することを含む養子免疫治療の方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、免疫原性リガンドが天然の同じリガンドに対して免疫応答を誘発できることを個々に特徴とし、免疫原性リガンドが

からなる群より選択される、少なくとも二つの免疫原性リガンドを含む組成物を提供する。リガンドは薬学的に許容される担体のような担体中に存在しうる。
【００１８】
同様に、本発明は、免疫原性リガンドが天然の同じリガンドに対して免疫応答を誘発できることを特徴とし、免疫原性リガンドが

からなる群より選択される、少なくとも二つの免疫原性リガンドを含む宿主細胞も提供する。一つの局面において、宿主細胞は、抗原提示細胞であり、免疫原性リガンドは細胞表面に提示される。さらなる局面において、抗原提示細胞は樹状細胞である。宿主細胞は、薬学的に許容される担体のような担体中に存在しうる。
【００１９】
なお本発明はさらに、免疫原性リガンドのそれぞれが天然の同じリガンドに対して免疫応答を誘発できることを特徴として、免疫原性リガンドが

からなる群より選択される、二つまたはそれ以上の有効量の免疫原性リガンドを含む組成物を、被験者に送達することによって、被験者において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００２０】
配列表の説明
配列番号：１
ヒト癌抗原プロテアーゼ活性型レセプター−３（ＰＡＲ−３）をコードするｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列である。コード領域は、ヌクレオチド１位〜ヌクレオチド３８０１位に及ぶ。
配列番号：２
天然のヒト癌抗原ＰＡＲ−３のアミノ酸配列である。本発明の化合物は、天然のペプチド７００〜７０８に基づく変種である。
配列番号：３
化合物１のアミノ酸配列である。
配列番号：４
化合物１をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：５
化合物２のアミノ酸配列である。
配列番号：６
化合物２をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：７
化合物３のアミノ酸配列である。
配列番号：８
化合物３をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：９
化合物４のアミノ酸配列である。
配列番号：１０
化合物４をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１１
ヒト癌抗原ＰＡＲ−３の天然のエピトープ。
配列番号：１２
該抗原ＰＡＲ−３をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２１】
本発明を実施する様式
本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書は、識別する引用文によって参照される。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の現状をより詳しく説明するために、本開示に参照として本明細書に組み入れられる。
【００２２】
本発明の実施は、特に明記していなければ、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を用い、それらは当業者の範囲内である。そのような技術は文献に詳しく説明されている。これらの方法は、以下の刊行物に記述されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版（１９８９）；「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ． ら編、（１９８７））；「酵素学実験法シリーズ（ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、（アカデミック出版社）；「ＰＣＲ：実践アプローチ（ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、（Ｍ． マクファーソン（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら、ＩＲＬ出版、オックスフォード大学出版（１９９１））；「ＰＣＲ ２：実践アプローチ（ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、（マクファーソン、ハームスおよびテイラー（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、 Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ、およびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ）編、（１９９５））；「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、（ハーロウおよびレーン（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ）編、（１９８８））；および「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ｒ．Ｉ． フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）ら編、（１９８７））を参照のこと。
【００２３】
定義
本明細書において用いられるように、特定の用語は以下に定義された意味を有する。
【００２４】
本明細書および請求の範囲において用いられるように、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その」には、特に文脈で明らかに明記しない限り、複数形が含まれる。例えば、「細胞」という用語には、その混合物を含む複数の細胞が含まれる。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「含む」という用語は、組成物および方法に引用された要素が含まれるが、他の要素を除外しないことを意味すると解釈される。「本質的にからなる」とは、組成物および方法を定義するために用いる場合、組み合わせに対して本質的な重要性を有する、他の任意の要素を除外することを含むことを意味する。このように、本明細書に定義する要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の混入物およびリン酸緩衝生理食塩液、保存剤等のような薬学的に許容される担体を除外しないと考えられる。「からなる」とは、他の成分の微量以上の要素を除外して、本発明の組成物を投与するための実質的な方法段階を含むことを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義される態様は本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
「天然の」または「自然の」抗原とは、自然の生物起源から単離され、被験者において抗原受容体、特にＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合することができるエピトープを含むポリペプチド、タンパク質または断片である。
【００２７】
「抗原」という用語は、当技術分野において十分に理解されており、これには免疫原性である物質、すなわち免疫原、および免疫学的無反応性、またはアネルギーを誘導する物質、すなわちアネルゲンが含まれる。
【００２８】
「改変された抗原」とは、対応する野生型抗原とは異なる一次配列を有する抗原である。改変抗原は、合成または組換え法によって作製することができ、これには例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質溶解的分解、抗体分子、膜分子または他のリガンドとの結合によって、翻訳時または翻訳後に異なるように改変される抗原性ペプチドが含まれるがこれらに限定されない。（ファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ら、（１９８８）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：２８５〜３２０）。本発明の合成または改変抗原は、天然のエピトープと同じＴＣＲに結合すると解釈される。
【００２９】
本明細書において天然の抗原または野生型抗原とも呼ばれる「自己抗原」はまた、抗原に対する自己寛容により被験者において免疫応答をほとんど、または全く誘導しない抗原性ペプチドである。自己抗原の例は、黒色腫特異抗原ｇｐ１００である。
【００３０】
「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、腫瘍に関連するまたは腫瘍に特異的な抗原を意味する。既知のＴＡＡの例には、ｇｐ１００、ＭＡＲＴおよびＭＡＧＥが含まれる。
【００３１】
「主要組織適合抗原複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、Ｔ細胞に抗原を提示するために必要な、および急性の移植片拒絶のために必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を意味する。ヒトでは、ＭＨＣは「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」複合体としても知られる。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として知られ、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ ＭＨＣ分子には、β２−ミクログロブリンと非共有結合したＭＨＣにおいてコードされるα鎖で構成される膜ヘテロ二量体タンパク質が含まれる。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞によって発現され、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対する抗原提示において機能することが示されている。クラスＩ分子には、ヒトにおけるＨＬＡ−Ａ、Ｂ、およびＣが含まれる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子には、非共有結合によって結合したαおよびβ鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質が含まれる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞において機能することが知られており、ヒトにおいて、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、およびＤＲが含まれる。好ましい態様において、本発明の組成物およびリガンドは、任意のＨＬＡ型のＭＨＣ分子と複合体を形成することができる。当業者は、ＨＬＡの血清型および遺伝子型を周知している。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａの共通閲覧頁を参照のこと。ラメンシー、バックマン、およびステバノビッチ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ， Ｈ．Ｇ．、Ｂａｃｈｍａｎ， Ｊ．、およびＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ， Ｓ．、「ＭＨＣリガンドとペプチドモチーフ（ＭＨＣ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆｓ）」、（１９９７）、チャプマン・アンド・ホール出版社）；シュリューダー（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ）Ｇ．Ｍ．Ｔｈら、「ＨＬＡ辞書（Ｔｈｅ ＨＬＡ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）」、（１９９９）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ５４：４０９〜４３７）。
【００３２】
「抗原提示マトリクス」という用語は、本明細書において用いられるように、抗原がＴ細胞表面上でＴ細胞抗原受容体に結合することができるように抗原を提示することができる分子または複数の分子を意味する。抗原提示マトリクスは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面、またはＡＰＣの小胞調製物に存在することができ、またはビーズもしくはプレートのような固相支持体上の合成マトリクスの形となりうる。合成抗原提示マトリクスの例は、固相支持体に結合した、β２−ミクログロブリンと複合体を形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子、そのような精製ＭＨＣクラスＩ分子の多量体、精製ＭＨＣクラスＩＩ分子、またはその機能的部分である。
【００３３】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識可能な抗原ＭＨＣ複合体の形で一つまたは複数の抗原を提示することができ、それによって提示される抗原または複数の抗原に対して有効な細胞免疫応答を誘導することができる細胞のクラスを意味する。多くの種類の細胞が、Ｔ細胞が認識できるようにその細胞表面上に抗原を提示できる可能性があるが、有効な量で抗原を提示でき、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応に関してＴ細胞をさらに活性化する能力を有するのは、専門的なＡＰＣに限られる。ＡＰＣは、マクロファージ、Ｂ−細胞および樹状細胞のような無傷の完全な細胞；またはβ２−ミクログロブリンと複合体を形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子のような天然もしくは合成の他の分子となりうる。
【００３４】
「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は、多様なリンパ様および非リンパ様組織において認められた形態学的に類似の細胞型の多様な集団を意味する（スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）（１９９１）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：２７１〜２９６）。樹状細胞は、生物において最も強力な好ましいＡＰＣを構成する。樹状細胞の全てではないがサブセットは骨髄前駆細胞に由来して、少数が末梢血を循環して、未成熟なランゲルハンス島細胞または最終的に分化した成熟細胞のいずれかとして現れる。樹状細胞は単球から分化することができるが、それらは異なる表現型を有する。例えば、特定の分化マーカーであるＣＤ１４抗原は、樹状細胞には存在しないが単球には存在する。同様に、成熟樹状細胞は貪食性ではないが、単球は強力な貪食細胞である。ＤＣは、Ｔ細胞活性化と増殖にとって必要な全てのシグナルを提供することが示されている。
【００３５】
「抗原提示細胞動員因子」、または「ＡＰＣ動員因子」という用語には、無傷の細胞全体と共に、抗原提示細胞を動員することができる他の分子が含まれる。適したＡＰＣ動員因子の例には、インターロイキン４（ＩＬ−４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、セプラゲルおよびマクロファージ炎症タンパク質３α（ＭＩＰ３α）のような分子が含まれる。これらは、イムネックス社、シェリングプラウ社およびＲ＆Ｄシステムズ社（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手できる。それらはまた、「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｆ．Ｍ． アウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、（１９８７）に開示される方法を用いて、組換えによって産生することができる。上記の因子と同じ生物活性を有するペプチド、タンパク質、および化合物は、本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原に結合することができ、免疫応答を媒介する細胞を意味する。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ならびに細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えばＣＴＬ細胞株、ＣＴＬクローン、および腫瘍、炎症、または他の浸潤物からのＣＴＬが含まれるがこれらに限定されない。特定の疾患を有する組織は、特異的抗原を発現して、これらの抗原に対して特異的なＣＴＬが同定されている。例えば、黒色腫の約８０％がＧＰ−１００として知られる抗原を発現する。
【００３７】
本明細書において用いられる「免疫エフェクター分子」という用語は、抗原特異的に結合することができる分子を意味し、これには抗体、Ｔ−細胞抗原受容体、ならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子が含まれる。
【００３８】
「未経験の」免疫エフェクター細胞は、その細胞を活性化することができる抗原にこれまで曝露されていない免疫エフェクター細胞である。未経験の免疫エフェクター細胞の活性化には、増殖して抗原特異性を備えるエフェクターＴ細胞に分化するために、ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識および専門的ＡＰＣによる共刺激シグナルの同時送達の双方を必要とする。
【００３９】
「免疫応答」は、広い意味において、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的反応を意味する。免疫応答を誘発することができる如何なる物質も「免疫原性」であり、「免疫原」であると呼ばれる。免疫原は全て抗原であるが、必ずしも全ての抗原が免疫原性であるわけではない。本発明の免疫応答は、液性（抗体活性を通して）または細胞性（Ｔ細胞活性化を通して）となりうる。
【００４０】
本明細書において用いられるように、「リガンド」という用語は、もう一つの分子上の特異的部位に結合する如何なる分子も意味する。言い換えれば、リガンドは、免疫エフェクター細胞との反応においてタンパク質の特異性を付与する。免疫エフェクター細胞上の相補的結合部位と直接複合体を形成するのはタンパク質内のリガンド部位である。
【００４１】
好ましい態様において、本発明のリガンドは、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような免疫エフェクター細胞上の抗原決定基またはエピトープに結合する。リガンドは、本発明の抗原、ペプチド、タンパク質、またはエピトープであってもよい。
【００４２】
本発明のリガンドは、抗体上の受容体に結合してもよい。一つの態様において、本発明のリガンドは長さがアミノ酸約４〜約８個である。
【００４３】
本発明のリガンドはＭＨＣクラスＩ分子上の受容体に結合してもよい。一つの態様において、本発明のリガンドは長さがアミノ酸約７〜約１１個である。
【００４４】
本発明のリガンドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上の受容体に結合してもよい。一つの態様において、本発明のリガンドは長さがアミノ酸約１０〜約２０個である。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「感作された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）抗原特異的免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原にこれまでに出合ったことがある上記の免疫エフェクター細胞である。その未経験の相対物とは対照的に、感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化は、共刺激シグナルを必要としない。ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識で十分である。
【００４６】
Ｔ細胞に関して用いる場合、「活性化された」とは、細胞が、Ｇ_０期を出て、一つまたは複数のサイトトキシン、サイトカイン、および細胞種（例えば、ＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋）に特徴的な他の関連する膜結合型タンパク質を産生し始め、その表面上に特定の抗原を示す任意の標的細胞を認識して結合することができ、そのエフェクター分子を放出することができることを意味する。
【００４７】
本発明の意味において、「認識される」という用語は、一つまたは複数のリガンドを含む本発明の組成物が、そのような結合が有効な免疫応答を開始する、免疫エフェクター細胞によって認識および結合されることを意味する。リガンドが免疫エフェクター細胞によって認識されるか否かを決定するアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載される。
【００４８】
「選択的に認識される」という用語は、本発明の組成物またはリガンドの特異性が、天然のリガンドを認識して結合する免疫エフェクター細胞に限定されることを意味する。
【００４９】
「交叉反応する」という用語は、機能的に重なり合う本発明の化合物を記載するために用いられる。より詳しく述べると、天然のリガンドおよび／またはそれによって活性化される免疫エフェクター細胞の免疫原性特性は、改変されたリガンドが天然のリガンドおよび／またはそれによって活性化される免疫エフェクター細胞と「交叉反応」するように、改変リガンドによってある程度共有される。本発明の目的に関して、交叉反応性は、多数のレベルで現れる：（ｉ）リガンドレベルで、例えば、改変リガンドは天然のリガンドＣＴＬのＴＣＲに結合して天然のリガンドＣＴＬを活性化することができる；（ｉｉ）Ｔ細胞レベルで、すなわち本発明の改変リガンドは、Ｔ細胞のＴＣＲに結合して、天然のリガンドを示す細胞を有効に標的としてこれを溶解することができるＴ細胞のある集団（天然のリガンドＣＴＬの集団とは異なる）を活性化する；および（ｉｉｉ）抗体レベルで、例えば、「抗」改変リガンド抗体は、天然のリガンドを検出、認識して、免疫応答においてエフェクター機構を開始させることができ、最終的に宿主から天然のリガンドが消失する。
【００５０】
本明細書において記載されるように、「被験者において免疫応答を誘導する」という用語は、当技術分野において周知の用語であり、被験者に抗原（またはエピトープ）を導入する前の免疫応答（もしあれば）と比較して、被験者に抗原（またはエピトープ）を導入した後に、抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答の少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、さらにより好ましくは少なくとも約５００倍、なおより好ましくは少なくとも約１０００倍またはそれ以上の増加を、検出または測定することができることを意味する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答には、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の産生、抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子をその表面上に発現する免疫細胞の産生が含まれるがこれらに限定されない。所定の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されるか否かを決定する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的抗体は、固定された抗原（またはエピトープ）に対する試料中の抗体の結合が、検出可能に標識した第二抗体（例えば、酵素標識マウス抗ヒトＩｇ抗体）によって検出される、ＥＬＩＳＡを含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の多様な任意のイムノアッセイを用いて検出することができる。
【００５１】
「共刺激分子」は、抗原提示細胞とＴ細胞の表面上に発現される受容体−リガンド対の相互作用に関係している。過去数年間に蓄積された研究によって、休止期のＴ細胞が、サイトカイン遺伝子発現を誘導して増殖するために、少なくとも二つのシグナルを必要とすることが確実に証明されている（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）Ｒ．Ｈ．（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１３４９〜１３５６；およびジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）Ｍ．Ｋ．（１９９２）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １３：６９〜７３）。特異性を付与する一つのシグナルは、適当なＭＨＣ／ペプチド複合体とＴＣＲ／ＣＤ３複合体との相互作用によって産生することができる。第二のシグナルは抗原特異的ではなく、「共刺激」シグナルと呼ばれる。このシグナルは、マクロファージおよび樹状細胞、いわゆる「専門的」ＡＰＣのような骨髄由来補助細胞によって提供される活性として当初定義された。いくつかの分子が共刺激活性を増強することが示されている。これらは熱安定抗原（ＨＳＡ）（リウ（Ｌｉｕ）Ｙ．ら（１９９２）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５：４３７〜４４５）、コンドロイチン硫酸改変ＭＨＣ不変鎖（Ｉｉ−ＣＳ）（ノージョカス（Ｎａｕｊｏｋａｓ）Ｍ．Ｆ．ら、（１９９３）、Ｃｅｌｌ ７４：２５７〜２６８）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（ファンセベンター（Ｖａｎ Ｓｅｖｅｎｔｅｒ）Ｇ．Ａ．、（１９９０）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：４５７９〜４５８６）、Ｂ７−１およびＢ７−２／Ｂ７０（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）Ｒ．Ｈ．（１９９２）、Ｃｅｌｌ ７１：１０６５〜１０６８）である。これらの分子は、それぞれＴ細胞上でその同種のリガンドと相互作用することによって共刺激を補助すると考えられる。共刺激分子は、正常な生理的条件で、未経験のＴ細胞を十分に活性化するために必要な共刺激シグナルを媒介する。例としての受容体−リガンド対は、ＡＰＣ表面上のＢ７共刺激分子およびＴ細胞上のその相対物受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４である（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９０９〜９１１；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、（１９９２）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：２２９およびナバビ（Ｎａｂａｖｉ）ら、（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２６６〜２６８）。その他の重要な共刺激分子は、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、およびＣＤ８６である。「共刺激分子」という用語は、Ｔ細胞表面上のＴＣＲに結合したペプチド／ＭＨＣ複合体と共に作用すると、ペプチドに結合するＴ細胞の活性化を得る共刺激作用を提供する、任意の単一分子または分子の組み合わせも含む。この用語はこのように、Ｂ７、またはペプチド／ＭＨＣ複合体と共に、同種のリガンドに結合して、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲがペプチドに特異的に結合すればＴ細胞を活性化する、ＡＰＣ、その断片（単独、他の分子と複合体を形成して、もしくは融合タンパク質の一部として）のような抗原提示マトリクス上の他の共刺激分子を含む。共刺激分子は、例えば、ベックマンコールターインク（フュラートン、カリフォルニア州）を含む多様な販売元から市販されている。必ずしも明示されていないが、野生型と類似の生物活性を有する分子、または精製された共刺激分子（例えば、組換えによって産生されたまたはその変異タンパク質）は、本発明の趣旨および範囲において用いられると解釈される。
【００５２】
本明細書において用いられるように、「固相支持体」または「固体支持体」は、互換的に用いられ、特定の種類の支持体に限定されない。むしろ多数の支持体が利用でき、当技術分野で既知である。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、ワタ、プラスチックビーズ、アルミナゲルが含まれる。本明細書において用いられるように、「固相支持体」には、合成抗原提示マトリクス、細胞、およびリポソームが含まれる。適した固相支持体は、様々なプロトコールに関して所望の目的の用途および適切性に基づいて選択してもよい。例えば、ペプチド合成に関して、固相支持体はポリスチレン（例えば、バケム社、ペニンスララボラトリーズ社等から得られるＰＡＭ−樹脂）、ポリハイプ（登録商標）樹脂（アミノテック社、カナダから得られる）、ポリアミド樹脂（ペニンスララボラトリーズ社から得られる）、ポリスチレングリコールを接合したポリスチレン樹脂（テンタゲル（登録商標）、ラップポリマー、チュービンゲン、ドイツ）、またはポリジメチルアクリルアミドゲル（ミリゲン／バイオサーチ社、カリフォルニア州から得られる）のような樹脂を適用してもよい。
【００５３】
本明細書において用いられるように「免疫調節物質」という用語は、分子、高分子複合体、または免疫応答を調節する細胞であり、単独または本明細書に記載の多様な処方の任意のものと組み合わせた本発明の合成抗原性ペプチド；本発明の合成抗原性ペプチドを含むポリペプチド；本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＡＰＣ、および合成抗原提示マトリクス（共刺激分子の存在下または非存在下で）を含む抗原提示マトリクス上のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した本発明の合成抗原性ペプチド；もう一つの分子または高分子構造と共有結合または非共有結合によって複合体を形成した本発明の合成抗原性ペプチド；ならびに本発明のペプチドに対して特異的な感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む。
【００５４】
「免疫応答を調節する」という用語には、免疫応答を誘導（増加、誘発）する、および免疫応答を減少（抑制）することが含まれる。免疫調節法（またはプロトコール）は、被験者における免疫応答を調節する方法である。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「サイトカイン」という用語は、細胞に多様な作用を及ぼす、例えば成長または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を誘導する多数の任意の要因の一つを意味する。本発明の実施において単独または組み合わせて用いてもよいサイトカインの非制限的な実施例には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１１、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ３リガンドが含まれる。本発明にはまた、一つまたは複数のサイトカインが培地から特異的に除外される培養条件が含まれる。サイトカインは、例えばゲンザイム社（フラミンガム、マサチューセッツ州）、ジェネンテック社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）、アムジェン社（サウザンドオークス、カリフォルニア州）、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）、およびイムネックス社（シアトル、ワシントン州）のようないくつかの発売元から市販されている。必ずしも明示されていないが、野生型と類似の生物活性を有するまたは精製サイトカイン（例えば、組換えによって産生されたまたはその変異体）は、本発明の精神および範囲内で用いられると解釈される。
【００５６】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合型を互換的に意味するために用いられる。ポリヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはその類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、既知または未知の任意の機能を行ってもよい。「ポリヌクレオチド」という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子は、また改変された核酸分子を含んでもよい。
【００５７】
「ペプチド」という用語は、その最も広い意味において、二つまたはそれ以上のサブユニットのアミノ酸の化合物、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体を意味する。サブユニットはペプチド結合によって結合してもよい。もう一つの態様において、サブユニットは他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって結合してもよい。本明細書において用いられるように、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを意味する。三つまたはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドは、ペプチド鎖が短ければ一般的にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長ければペプチドは一般的にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００５８】
「遺伝子改変された」という用語は、外来遺伝子または核酸配列を含むおよび／または発現して、それによって細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を改変することを意味する。言い換えれば、これは細胞の内因性のヌクレオチドに対する任意の付加、欠失、または破壊を意味する。
【００５９】
本明細書において用いられるように、「発現」とは、それによってポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を意味する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、適当な真核宿主を選択すれば、発現にはｍＲＮＡのスプライシングが含まれてもよい。発現のために必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌の発現ベクターには、ｌａｃプロモーターのようなプロモーターおよび転写開始のためのシャイン・ダルガルノ配列および開始コドンＡＵＧ（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９）、上記）が含まれる。同様に、真核細胞発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームを脱離させるための停止コドンが含まれる。そのようなベクターは、市販されているか、または当技術分野で周知の方法に記載の配列、例えば一般的なベクターを構築するために下記に記載される方法に記載の配列によって構築することができる。
【００６０】
「転写制御下」とは、当技術分野で十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に関与するかまたは転写を促進するエレメントに、機能的に結合していることに依存することを示す。「機能的に結合した」とは、エレメントがそれらが機能するように配置されている近接位置を意味する。
【００６１】
「遺伝子送達媒体」とは、宿主細胞に挿入されたポリヌクレオチドを運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム；天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子、ならびに細菌、またはバキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターならびに多様な真核および原核宿主において発現させるために記載されており、単にタンパク質発現のためのみならず、遺伝子治療のために用いてもよい、当技術分野で典型的に用いられる他の組換え媒体である。
【００６２】
本明細書において用いられる「遺伝子送達」「遺伝子移入」等は、用いる導入方法にかかわらず、宿主細胞に外因性のポリヌクレオチド（時に、「導入遺伝子」と呼ばれる）を導入することを意味する用語である。そのような方法には、ベクター媒介遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々なタンパク質に基づくまたは脂質に基づく遺伝子送達複合体による）と共に「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドを導入するために用いられる様々な他の技術）のような、多様な周知の技術が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定または一過性に維持されてもよい。安定な維持は典型的に、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製開始点を含むか、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体のような宿主細胞のレプリコンに組み入れられることを必要とする。当技術分野で既知であり、本明細書に記載されるように、多くのウイルスベクターが哺乳類細胞への遺伝子の移入を媒介できることが知られている。
【００６３】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。セムリキ森林熱ウイルスに基づくベクター、およびシンドビスウイルスに基づくベクターのようなアルファウイルスベクターも同様に、遺伝子治療および免疫治療において用いるために開発されている。シュレジンガーおよびデュベンスキー（ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ）（１９９９）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５：４３４〜４３９、およびイング（Ｙｉｎｇ）ら（１９９９）、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５（７）：８２３〜８２７を参照のこと。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される局面において、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部と、治療遺伝子とを含むポリヌクレオチドを意味する。本明細書において用いられるように、「レトロウイルス媒介遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有し、ウイルスが細胞内に入り、そのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み入れるために、それによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定に移入される過程を意味する。ウイルスは、その通常の感染機構によって宿主細胞に入ることができ、またはそれが異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合して細胞に入るように改変することができる。本明細書において用いられるように、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様の侵入機構によって細胞に外因性の核酸を導入することができるウイルス粒子を意味する。
【００６４】
レトロウイルスは、ＲＮＡの形で遺伝子情報を有する；しかし、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡをＤＮＡ型に逆転写させて、これが感染細胞のゲノムＤＮＡに組み入れられる。組み入れられたＤＮＡ型をプロウイルスと呼ぶ。
【００６５】
遺伝子移入がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなＤＮＡウイルスベクターによって媒介される局面において、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部と導入遺伝子とを含むポリヌクレオチドを意味する。アデノウイルス（Ａｄｓ）は、比較的十分に特徴が調べられ、５０血清型以上を含む均一なウイルスの群である。例えば、国際公開公報第９５／２７０７１号を参照のこと。アデノウイルスは容易に増殖して宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要がない。組換えアデノウイルス由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび増殖能を低下させたベクターも同様に構築されている。国際公開公報第９５／００６５５号および国際公開公報第９５／１１９８４号を参照のこと。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムに組み入れられる高い感染性と特異性とを有する。ハーモナトおよびムジクツカ（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ）（１９８４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６〜６４７０、ならびにレブコウスキ（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ）ら（１９８８）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８〜３９９６を参照のこと。
【００６６】
ポリヌクレオチドが機能的に結合しているプロモーターとクローニング部位とをその中に含むベクターは、当技術分野で周知である。そのようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、ストラタジーン社（ラホヤ、カリフォルニア州）およびプロメガバイオテック社（マディソン、ウィスコンシン州）から販売されている。発現および／またはインビトロ転写を最適にするために、余分のおそらく不適当なもう一つの翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳レベルで発現を妨害もしくは減少させる可能性がある他の配列を除去するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加、または変化させる必要がある可能性がある。または、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’に挿入することができる。
【００６７】
遺伝子送達媒体にはまた、ＤＮＡ／リポソーム複合体、標的化ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を含むいくつかの非ウイルスベクターが含まれる。同様に標的指向抗体またはその断片も含むリポソームを本発明の方法において用いることができる。細胞への送達を増強するために、本発明の核酸またはタンパク質を細胞表面抗原、例えばＴＣＲ、ＣＤ３、またはＣＤ４に結合する抗体またはその結合断片に結合させることができる。
【００６８】
「ハイブリダイゼーション」とは、一つまたは複数のポリヌクレオチドがヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成するように反応する反応である。水素結合は、ワトソン−クリックの塩基対形成、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合によって起こってもよく、または任意の他の配列特異的に起こってもよい。複合体は、二本鎖構造を形成する二つの鎖を含んでもよく、多重鎖複合体を形成する三つもしくはそれ以上の鎖、自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のようなより広範囲の過程における一段階を構成してもよい。
【００６９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には：インキュベーション温度約２５℃〜約３７℃；ハイブリダイゼーション緩衝液濃度約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度約０％〜約２５％；および洗浄溶液約６×ＳＳＣが含まれる。中等度のハイブリダイゼーション条件の例には：インキュベーション温度約４０℃〜約５０℃；緩衝液濃度約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度約３０％〜約５０％；および洗浄溶液約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣが含まれる。高ストリンジェンシー条件の例には：インキュベーション温度約５５℃〜約６８℃；緩衝液濃度約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度約５５％〜約７５％；および洗浄溶液約１×ＳＳＣ、約０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水が含まれる。一般的に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分〜２４時間であり、１、２、またはそれ以上の洗浄段階を行い、洗浄インキュベーション時間は約１、２または１５分である。ＳＳＣは０．１５ Ｍ ＮａＣｌおよび１５ ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を用いるＳＳＣの同等物を用いることができると理解される。
【００７０】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、もう一つの配列と「配列同一性」に関して特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）を有し、これは並置して二つの配列を比較する場合に塩基（またはアミノ酸）の百分率が同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性％または配列同一性は、例えば「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」アウスユベール（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、（１９８７）、補則３０、第７．７．１８章、表７．７．１に記載されるプログラムのような、当技術分野で既知のソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメータを用いる。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０配列；選別＝ハイスコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋スイスプロテイン＋ＳＰアップデート＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレスで見ることができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ／ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００７１】
本明細書において用いられるように、「インビボ」遺伝子送達、遺伝子移入、遺伝子治療等は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類のような生物の体内に直接外因性ポリヌクレオチドを含むベクターを導入して、それによって外因性のポリヌクレオチドがそのような生物の細胞にインビボで導入されることを意味する用語である。
【００７２】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が天然において通常結合する、構成成分、細胞およびその他から分離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、染色体において通常結合している５’および３’配列から分離されているポリヌクレオチドである。当業者に明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それを天然に存在するその相対物と区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、容積あたりの分子の濃度または数が、その天然に存在する相対物より「大きく濃縮されている」または「あまり分離されていない」という点において、その天然に存在する相対物と識別することができる。その一次配列、または例えばそのグリコシル化パターンによって天然に存在する相対物とは異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それがその一次配列によって、またはグリコシル化パターンのようなもう一つの特徴によって天然に存在する相対物とは区別できることから、単離型で存在する必要はない。本明細書に開示される本発明のそれぞれに関して明示していないが、下記に開示され、適当な条件での組成物のそれぞれに関する上記の態様の全てが本発明によって提供されると理解される。このように、天然に存在しないポリヌクレオチドは、単離された天然に存在するポリヌクレオチドとは異なる態様として提供される。細菌細胞において産生されたタンパク質は、本来産生される真核細胞から単離された天然に存在するタンパク質とは異なる態様として提供される。
【００７３】
「宿主細胞」、「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、ベクターのための、または外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質を組み入れるためのレシピエントとなりうる、またはレシピエントである任意の個々の細胞または細胞培養も含まれると解釈される。同様に、これには単一の細胞の子孫が含まれると解釈され、子孫は、天然、偶発的、または意図した変異のために、当初の親細胞と必ずしも完全に同一である（形態またはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において）必要はない。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよく、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳類細胞、例えばマウス、ラット、サル、またはヒト細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００７４】
「被験者」は脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類には、マウス、サル、ヒト、家畜動物、競技動物、およびペットが含まれるがこれらに限定されない。
【００７５】
「対照」は、比較目的のために実験において用いられるもう一つの被験者または試料である。対照は、「陽性」または「陰性」となりうる。例えば、実験の目的が特定の種類の癌と遺伝子の発現レベルの変化との相関を調べることである場合、陽性対照（そのような変化を有し、その疾患の特徴である症候群を示す被験者、または被験者からの試料）および陰性対照（発現の変化およびその疾患の臨床症状を示さない被験者または被験者からの試料）を用いることが一般的に好ましい。
【００７６】
「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は互換的に用いられ、単数形または複数形で用いられ、それらが宿主細胞に対して病原性となるような悪性の形質転換を受ける細胞を意味する。原発性癌細胞（すなわち、悪性の形質転換部位の近傍から得られた細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって非癌細胞から容易に区別することができる。本明細書において用いられるように癌細胞の定義には、原発性癌細胞のみならず、癌細胞の祖先に由来する任意の細胞も含まれる。これには、転移癌細胞、ならびにインビトロ培養および癌細胞に由来する細胞株が含まれる。通常固形癌として認められる種類の癌について言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は；例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）、Ｘ−線、超音波、または触診のような技法によって腫瘍塊に基づいて検出可能である。生化学または免疫学的知見のみでは、この定義を満たすには不十分である可能性がある。
【００７７】
腫瘍の増殖の「抑制」は、本明細書に記載の感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞と接触しない場合の増殖と比較して増殖が減少した状態を示す。腫瘍細胞の増殖は、腫瘍の大きさを測定すること、^３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いてまたは腫瘍細胞の計数によって腫瘍細胞が増殖するか否かを決定すること、を含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の任意の手段によって評価することができる。腫瘍細胞増殖の「抑制」は、以下の状態のいずれかまたは全てを意味する：腫瘍の増殖の遅れ、遅延、および「抑制」は、腫瘍の縮小と共に、腫瘍の増殖が停止した際に増殖が抑制された状態を示す。
【００７８】
「培養」という用語は、様々な種類の培地における細胞または生物のインビトロ増殖を意味する。培養において増殖させた細胞の子孫は親細胞に対して完全に同一（形態学的、遺伝学的、または表現型として）ではなくてもよいと理解される。「細胞数の拡大」とは、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
【００７９】
「組成物」とは、活性物質と、アジュバントのような不活性な（例えば検出物質または標識）または活性な、もう一つの化合物または組成物との組み合わせを意味すると解釈される。
【００８０】
「薬学的組成物」は、組成物をインビトロ、インビボ、またはエキソビボで診断または治療的に用いるために適するようにする、活性物質と不活性なまたは活性な担体との組み合わせが含まれると解釈される。
【００８１】
本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩液、水、油／水または水／油乳剤のような乳剤、および様々な種類の湿潤剤のような、標準的な任意の薬学的担体を含む。組成物はまた、安定化剤および保存剤を含みうる。担体、安定化剤、およびアジュバントの例として、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）の「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐａｒｍ． Ｓｃｉ．）」第１５版（マックパブリッシング社、イーストン（１９７５））を参照のこと。
【００８２】
「有効量」は、有用な、または所望の結果を得るために十分な量である。有効量は一つまたは複数の投与、適用、または用量において投与することができる。本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する：
【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

【００８３】
本発明はまた、ＭＨＣ分子への結合の増強を示し、同種の天然のリガンドおよびその対応する天然のタンパク質に対する免疫応答を調節するために有用である、組成物も提供する。
【００８４】
本発明はさらに、抗癌ワクチンの成分として有用な、およびヒト癌抗原パーティション（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）−３（ＰＡＲ−３）の発現を特徴とする癌に対して、特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させるために有用な組成物を提供する。この種類の癌の例は卵巣癌である。
【００８５】
一つの態様において、本発明の改変リガンドは、天然のリガンドと同等のＭＨＣ結合親和性を有する。ペプチド：ＭＨＣクラスＩ結合特性は、免疫原性と相関することが証明されている（セッテ（Ｓｅｔｔｅ）Ａ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３（１２）：５５８６−５５９２；ファンデルバーグ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ）Ｓ．Ｈ．ら（１９９６）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：３３０８−３３１４）。好ましい態様において、本発明の改変リガンドは「自然の」リガンドより高い親和性でＴＣＲに結合する。天然のリガンドと改変リガンドとがＭＨＣクラスＩ分子に対して同等に結合するか否かは、当技術分野で既知の方法によって測定することができ、これには、アルゴリズムに基づく親和性の計算（例えば、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら（１９９２）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３５８０〜３５８７）、および実験による結合親和性の計算（例えば、タン（Ｔａｎ）ら、（１９９７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２０９（１）：２５〜３６）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、クラスＩ分子に対するペプチドの相対的結合は、様々な濃度の被験ペプチド（例えば、１００ ｍＭ〜１ｎＭの範囲）を用いて、洗浄剤によって可溶化したＭＨＣ分子に対する放射標識標準ペプチドの結合に基づいて結合することができる。ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリンは、固定濃度（例えば、５ｎＭ）の放射標識標準（対照）ペプチド、および様々な濃度の被験ペプチドと共に、室温でプロテアーゼ阻害剤混合物の存在下で適した期間（例えば、２時間〜７２時間）、共インキュベートする。対照試験管は、標準ペプチドとＭＨＣ分子とを含むが、被験ペプチドを含まない。ＭＨＣ結合放射活性％はゲル濾過によって決定する。ＩＣ_５０（対照ペプチド結合の５０％阻害が起こる被験ペプチドの濃度）を、各ペプチドについて計算する。ＴＣＲに対する結合親和性を決定するさらなる方法は、当技術分野で既知であり、これらには、アルラマディ（ａｌ−Ｒａｍａｄｉ）ら（１９９２）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（２）：６６２〜６７３；およびズーゲル（Ｚｕｅｇｅｌ）ら（１９９８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１（４）：１７０５〜１７０９に記載される方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
もう一つの態様において、本発明の改変リガンドは、天然のリガンド相対物と同等の抗原特異的なＴ細胞の活性化を誘発する。好ましい態様において、本発明の改変リガンドは、天然のリガンド相対物と比較して、より強い抗原特異的なＴ細胞の活性化を誘発する。本発明のリガンドの免疫原性を決定する方法は当技術分野で既知であり、本明細書にさらに記載される。
【００８７】
一つの態様において、本発明の組成物は、本発明の免疫原性リガンドを二つまたはそれ以上含む。一つの局面において、そのような組成物は、単一のリガンドの二つまたはそれ以上のコピーを含んでもよい。もう一つの局面において、そのような組成物は、上記の二つまたはそれ以上のリガンドのそれぞれのリガンドが、上記の組成物における他の全てのリガンドとは異なる、二つまたはそれ以上のリガンドを含んでもよい。一つの態様において、二つまたはそれ以上の免疫原性リガンドは共有結合している。
【００８８】
本発明はまた、ＭＨＣ分子に対する結合を増強するように設計され、合成ペプチドエピトープ、およびそれらが由来する対応する天然のペプチドに対する免疫応答を調節するために有用である、新規合成抗原性ペプチドを提供する。本発明の合成抗原性ペプチドエピトープ配列は、それらが、ＭＨＣクラスＩ結合ドメインにおいて、天然の配列と比較してＭＨＣへのより強固な結合を付与するように設計される、アミノ酸配列の変化を含むという点において、その天然の相対物とは異なる。それらはさらに、推定のＴ細胞受容体結合ドメインにおいて、Ｔ細胞抗原受容体に対する親和性を増加するように設計された変異を含む。天然の配列とのこれらの差は、本発明の合成抗原性ペプチドエピトープが増強された免疫調節特性を有するという点において、天然の配列と比較して本発明の方法に長所を付与するように設計される。
【００８９】
本発明は、抗癌ワクチンの成分として有用であり、かつヒト癌抗原ＰＡＲ−３の発現を特徴とする癌に対して、特異的な免疫エフェクター細胞を増殖させるために有用である、新規合成抗原性ペプチド配列を提供する。ペプチドは、それらが推定のＨＬＡ−Ａ２結合ドメイン（アミノ酸１、２、および９）およびＴ細胞受容体結合（ＴＣＲ）ドメイン（アミノ酸残基３〜８）において変異を含み、それぞれＭＨＣおよびＴＣＲへのより強固な結合を付与するという点において、自然のエピトープとは異なる。本発明の合成抗原性ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子に対する結合は、当技術分野で既知の方法によって測定することができ、これらには、アルゴリズムに基づく親和性の計算（例えば、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）ら（１９９２）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３５８０〜３５８７）、および実験による結合親和性の計算（例えば、タン（Ｔａｎ）ら、（１９９７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２０９（１）：２５〜３６）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、クラスＩ分子に対するペプチドの相対的結合は、洗浄剤によって可溶化したＭＨＣ分子に対する、放射標識標準ペプチドの結合に基づいて測定することができる。例えば、クラスＩ分子に対するペプチドの相対的結合は、様々な濃度の被験ペプチド（例えば、１００ ｍＭ〜１ｎＭの範囲）を用いて、洗浄剤で可溶化したＭＨＣ分子に対する放射標識標準ペプチドの結合に基づいて、測定することができる。ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリンは、固定濃度（例えば、５ｎＭ）の放射標識標準（対照）ペプチド、および様々な濃度の被験ペプチドと共に、室温でプロテアーゼ阻害剤混合物の存在下で適した期間（例えば、２時間〜７２時間）、共インキュベートする。対照試験管は、標準ペプチドとＭＨＣ分子とを含むが、被験ペプチドを含まない。ＭＨＣ結合放射活性％はゲル濾過によって決定する。ＩＣ_５０（対照ペプチド結合の５０％阻害が起こる被験ペプチドの濃度）を、各ペプチドについて計算する。
【００９０】
本発明の合成ペプチドは、「自然の」配列のペプチドより高い親和性でＴＣＲに結合するように設計される。ＴＣＲに対する結合親和性を決定するさらなる方法は、当技術分野で既知であり、これらにはアルラマディ（ａｌ−Ｒａｍａｄｉ）ら（１９９２）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（２）：６６２〜６７３；およびズーゲル（Ｚｕｅｇｅｌ）ら（１９９８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１（４）：１７０５〜１７０９に記載される方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
さらに「合成抗原性ペプチド」という用語には、選択的に、介在アミノ酸配列ならびにこの配列および配列番号：３，５，７，９，および１１を有するポリペプチドを含む本発明の合成抗原性ペプチドの多量体（コンカテマー）が含まれる。本発明はまた、ポリペプチドがヒト癌抗原ＰＡＲ−３細胞障害性Ｔリンパ球によって選択的に認識される、これらの配列を含むポリペプチドを提供する。
【００９２】
本発明のペプチド配列を含むポリペプチドは、天然のヒト癌抗原ＰＡＲ−３ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの配列を変化させることによって、調製することができる。これは、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いることによって行われる。例えば、改変ポリヌクレオチドが本発明のペプチドをコードするように、ポリヌクレオチド配列に変化を導入するために、天然のヒト癌抗原ＰＡＲ−３配列をコードする組換えポリヌクレオチドに、部位特異的変異誘発を行ってもよい。
【００９３】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、アメリカ、カリフォルニア州フォスターシティのパーキン・エルマー／アプライドバイオシステムズ・インクによって製造された、モデル４３０Ａまたは４３１Ａのような市販の自動ペプチド合成機を用いて、化学合成によって得ることができる。合成されたタンパク質またはポリペプチドを沈殿させて、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製することができる。したがって、本発明はまた、アミノ酸および酵素のようなタンパク質および試薬の配列を提供する段階、ならびにアミノ酸配列を適当な方向および直線的な配列に結合させる段階によって、本発明のタンパク質を化学合成するための過程を提供する。
【００９４】
または、タンパク質およびポリペプチドは、下記の宿主系およびベクター系を用いて、本明細書に記載の周知の組換え法法を用いて得ることができる。
【００９５】
ペプチド類似体
本発明のペプチドに変化した特性を提供するために、改変を行うことができることは当業者に周知である。本明細書に記載するように、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の双方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、自然および／または人為的なまたは合成アミノ酸のいずれかを意味する。三つまたはそれ以上のアミノ酸からなるペプチドは一般的に、ペプチド鎖が短ければオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは一般的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００９６】
本発明のペプチドは、非天然アミノ酸を含むように改変することができる。このように、ペプチドはペプチドに特殊な特性を付与するように、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の複合体、ならびに様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、Ｎ−α−メチルアミノ酸等）を含んでもよい。さらに、特定のカップリング段階に特異的アミノ酸を割付することによって、α−ヘリックス、βターン、βシート、γ−ターン、および環状ペプチドを含むペプチドを作製することができる。一般的にα−ヘリックス二次構造またはランダム二次構造が好ましいと考えられている。
【００９７】
さらなる態様において、有用な化学的および構造的特性を付与するペプチドのサブユニットを選択する。例えば、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、インビボでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに対して耐性であると考えられる。Ｄ−アミノ酸を有する改変化合物は、レトロ−インバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドとして本発明のペプチドを産生するために、逆の順序に配置したアミノ酸を用いて合成してもよい。さらに本発明は、新規特性を有するペプチドを調製するために、より明確な構造的特性を有するペプチドを調製する段階、ペプチド模倣体を用いる段階、およびエステル結合のようなペプチド模倣体結合を用いる段階を想定する。もう一つの態様において、還元されたペプチド結合、すなわちＲ_１およびＲ_２がアミノ酸残基または配列である、Ｒ_１−ＣＨ_２ＮＨ−Ｒ_２を組み入れるペプチドを作製してもよい。還元型ペプチドは、ジペプチドサブユニットとして導入してもよい。そのような分子は、ペプチド結合の加水分解、例えばプロテアーゼ活性に対して耐性であると考えられる。そのような分子は、代謝的分解またはプロテアーゼ活性に対する耐性のために、インビボでの半減期の増加のような、固有の機能および活性を有するリガンドを提供すると考えられる。さらに、特定の系において束縛された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドが増強された機能的活性を示すことは周知である（ルビー（Ｈｒｕｂｙ）（１９８２）、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３１：１８９〜１９９およびルビー（Ｈｒｕｂｙ）ら（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６８：２４９〜２６２）；本発明は、他の全ての位置で無作為な配列を組み入れる、束縛されたペプチドを産生する方法を提供する。
【００９８】
立体配座の束縛を誘導する非古典的アミノ酸
特定の立体配座モチーフを導入するために、以下の非古典的アミノ酸を本発明のペプチドに組み入れてもよい：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（カズルニエルスキ（Ｋａｚｒｎｉｅｒｓｋｉ）ら（１９９１）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２２７５〜２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、および（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（カズルニエルスキおよびルビー（ＫａｚｒｎｉｅｒｓｋｉおよびＨｒｕｂｙ）、（１９９１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３２（４１）：５７６９〜５７７２）；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（ランディス（Ｌａｎｄｉｓ）（１９８９）、アリゾナ大学博士論文）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（ミヤケ（Ｍｉｙａｋｅ）ら（１９８９）、Ｊ． Ｔａｋｅｄａ Ｒｅｓ． Ｌａｂｓ． ４３：５３〜７６）；ヒスチジンイソキノリンカルボン酸（ゼケル（Ｚｅｃｈｅｌ）ら（１９９１）、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３８（２）：１３１〜１３８）；およびＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）、（ダラニプラガダ（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ）ら（１９９３）、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４２（１）：６８〜７７）および（（１９９２）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃ． Ｃｏｍｍ． ４８（ＩＶ）：１２３９〜１２４１）。
【００９９】
以下のアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を、特定の二次構造を誘導するために、またはそれらにとって有利であるように組み入れてもよい：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、β−ターン誘導ジペプチド類似体（ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８５）、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５０：５８３４〜５８３８）；β−シート誘導類似体（ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：５０８１〜５０８２）；β−ターン誘導類似体（ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：５０５７〜５０６０）；α−ヘリックス誘導類似体（ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８８）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：４９３５〜４９３８）；γ−ターン（ケンプ（Ｋｅｍｐ）ら（１９８９）、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５４：１０９〜１１５）；以下の参考文献によって提供される類似体：ナガイおよびサトウ（ＮａｇａｉおよびＳａｔｏ）（１９８５）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２６：６４７〜６５０；およびディメイオ（ＤｉＭａｉｏ）ら（１９８９）、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ、ｐ．１６８７；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体（カーン（Ｋａｈｎ）ら（１９８９）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３０：２３１７）；アミド結合同配体（クローンズ（Ｃｌｏｎｅｓ）ら（１９８５）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２９：３８５３〜３８５６）；テトラゾル（ザブロッキ（Ｚａｂｒｏｃｋｉ）ら（１９８８）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：５８７５〜５８８０）；ＤＴＣ（サマネン（Ｓａｍａｎｅｎ）ら、（１９９０）、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐ． Ｒｅｓ． ３５：５０１〜５０９）；ならびにオルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら（１９９０）、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １１２：３２３〜３３３およびガーベイ（Ｇａｒｖｅｙ）ら（１９９０）Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５（３）：４３６において教示される類似体。βターンおよびβバルジ（ｂｕｌｇｅ）の立体配座束縛模倣体、ならびにそれらを含むペプチドは、１９９５年８月８日にカーン（Ｋａｈｎ）に発行された、米国特許第５，４４０，０１３号に記載されている。
【０１００】
本発明の合成抗原性ペプチドエピトープは、意図する用途に応じて変更しうる、多様な製剤において用いることができる。
【０１０１】
本発明の合成抗原性ペプチドエピトープは、様々な他の分子に共有結合、または非共有結合（複合体を形成した）することができ、その本質は特定の目的に応じて変化する可能性がある。例えば、本発明のペプチドは、天然および合成ポリマー、タンパク質、多糖類、ポリペプチド（アミノ酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、および脂質を含むがこれらに限定されない高分子担体と共有結合または非共有結合によって複合体を形成することができる。ペプチドはリポソームに導入するために脂肪酸に結合することができる。米国特許第５，８３７，２４９号。本発明の合成ペプチドは、その多様なものが当技術分野で既知である、固相支持体と共有結合または非共有結合によって複合体を形成することができる。本発明の合成抗原性ペプチドエピトープは、下記により詳細に説明するように、共刺激分子の存在下または非存在下で、抗原提示マトリクスと結合することができる。
【０１０２】
タンパク質担体の例には、超抗原、血清アルブミン、破傷風毒素、卵白アルブミン、サイログロブリン、ミオグロブリン、および免疫グロブリンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
ペプチドタンパク質担体ポリマーは、カルボジイミドのような従来の架橋剤を用いて形成してもい。カルボジイミドの例は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、および１−エチル−３−（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。
【０１０４】
他の適した架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒドおよび無水コハク酸である。一般的に、ホモ二官能アルデヒド、ホモ二官能エポキシド、ホモ二官能イミドエステル、ホモ二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、ホモ二官能マレイミド、ホモ二官能ハロゲン化アルキル、ホモ二官能二硫化ピリジル、ホモ二官能ハロゲン化アリール、ホモ二官能ヒドラジド、ホモ二官能ジアゾニウム誘導体、およびホモ二官能光反応性化合物を含む、多くのホモ二官能物質のいずれかを用いてもよい。同様に、ヘテロ二官能化合物、例えば、アミン反応基とスルフヒドリル反応基とを有する化合物、アミン反応基と光反応基とを有する化合物、およびカルボニル反応基とスルフヒドリル反応基とを有する化合物も含まれる。
【０１０５】
そのようなホモ二官能架橋剤の特定の例には、二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジスクシニミジルスベレート、およびジスクシニミジルタータレート；二官能イミドエステルジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデート、およびジメチルスベリミデート；二官能スルフヒドリル反応性架橋剤１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドヘキサン、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン；二官能ハロゲン化アリール１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンおよび４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホネート；ビス［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィドのような二官能光反応性物質；二官能アルデヒドホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびアジパルデヒド；１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルのような二官能エポキシド；二官能ヒドラジドアジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、およびコハク酸ジヒドラジド；二官能ジアゾニウムｏ−トリジン、ジアゾ化およびビスジアゾ化ベンジジン；二官能ハロゲン化アルキルＮ１Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）と共に、ａ１ａ’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸およびトリ（２−クロロエチル）アミンのような、ハロゲン化ベンジルおよびハロマスタードがそれぞれ含まれる。
【０１０６】
タンパク質をペプチドに結合させるために用いてもよい一般的なヘテロ二官能架橋剤の例には、ＳＭＣＣ（スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＢ（スクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシニミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシニミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
架橋剤は、還元的アミノ化によって、アミン基またはヒドラジド基にカルボニル基をカップリングさせることによって行ってもよい。
【０１０８】
本発明のペプチドはまた、イオン性、吸着性、または生体特異性相互作用による、単量体の非共有結合として処方してもよい。高度に陽性または陰性に荷電した分子を有するペプチドの複合体は、脱イオン水のような低イオン強度の環境下での塩橋形成によって作製されうる。大きな複合体は、多数の陰性および陽性荷電をそれぞれ含むポリ−（Ｌ−グルタミン酸）またはポリ−（Ｌ−リジン）のような、荷電ポリマーを用いて作製することができる。ペプチドの吸着は、微粒子ラテックスビーズまたは他の疎水性ポリマーのような表面に対して行ってもよく、架橋した、または化学的に重合したタンパク質を有効に模倣する非共有結合によって結合した、ペプチド超抗原複合体を形成する。最後にペプチドは、他の分子間の生体特異的相互作用を用いて、非共有結合によって結合してもよい。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンのようなタンパク質に対する、ビオチンの強い親和性を利用して、ペプチド複合体を形成することができる。これらのビオチン結合タンパク質は、溶液中でビオチンと相互作用することができるか、またはもう一つの分子と共有結合することができる四つの結合部位を含む。ウィルチェク（Ｗｉｌｃｈｅｋ）（１９８８）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７１：１〜３２。ペプチドは、タンパク質上で利用可能なアミン基と反応する、Ｄ−ビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）のＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルのような一般的なビオチン化試薬を用いて、ビオチン基を有するように改変することができる。次に、ビオチン結合ペプチドをアビジンまたはストレプトアビジンと共にインキュベートして、大きな複合体を形成することができる。そのようなポリマーの分子量は、アビジンまたはストレプトアビジンに対するビオチン結合ペプチドのモル比を注意深く制御することによって、調節することができる。
【０１０９】
同様に、診断方法において用いるために、検出可能な試薬と結合させた本明細書に開示のペプチドおよびポリペプチドが、本出願によって提供される。例えば、検出可能に標識したペプチドおよびポリペプチドをカラムに結合させて、抗体の検出および精製のために用いることができる。それらはまた、下記のように抗体を産生するための免疫原としても有用である。
【０１１０】
本発明のペプチドはまた、滅菌溶液または水溶液のような、様々な液相担体、薬学的に許容される担体、懸濁液、および乳液と組み合わせることができる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が含まれる。抗体を調製するために用いる場合、担体にはまた、特異的免疫応答を非特異的に増強するために有用であるアジュバントが含まれうる。当業者は、アジュバントが必要であるか否かを容易に決定して、それを選択することができる。しかし、説明する目的のみのために、適したアジュバントにはフロイントの完全および不完全アジュバント、無機塩、ならびにポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明はさらに、配列（配列番号：３，５，７，９または１１）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドの相補物を提供する。本明細書において用いられるように、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸模倣体を含む。上記の配列およびその相補体の他に、本発明はまたアンチセンスポリヌクレオチド鎖、例えばこれらの配列またはその相補鎖に対するアンチセンスＲＮＡを提供する。配列番号：４、６、８、１０、および１２に提供される配列、およびファンデルクロール（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ）ら（１９８８）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８に記載された方法論を用いて、アンチセンスＲＮＡを得ることが可能である。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲを用いて複製することができる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，８００，１５９号；第４，７５４，０６５号；および第４，６８３，２０２号の主題であり、「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、（マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら編、バークハウザー出版、ボストン（１９９４））およびそこに引用されている文献に記載されている。
【０１１３】
または当業者は、ＤＮＡを複製するために本明細書に記載の配列および市販のＤＮＡ合成機を用いることができる。したがって本発明は、ポリヌクレオチドの直線配列、適当なプライマー分子、酵素のような化学物質、および複製のための指示を提供する段階、ならびにヌクレオチドを化学的に複製または適当な方向に連結することによって、ポリヌクレオチドを得る段階により、本発明のポリヌクレオチドを得る方法を提供する。異なる態様において、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。なおさらに、当業者は適した複製ベクターにポリヌクレオチドを挿入して、複製および増幅のためにベクターを適した宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に挿入することができる。そのように増幅されたＤＮＡは、当業者に周知の方法によって細胞から単離することができる。この方法によってポリヌクレオチドを得る過程は、そのように得られたポリヌクレオチドと共に本明細書においてさらに提供される。
【０１１４】
ＲＮＡは、適した宿主細胞においてＤＮＡポリヌクレオチドをまず挿入することによって得ることができる。ＤＮＡは、任意の適当な方法によって、例えば適当な遺伝子送達媒体（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）を用いることによって、またはエレクトロポレーションによって挿入することもできる。細胞が複製して、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、ＲＮＡは例えば、上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）に記載されるように、当業者に周知の方法を用いて単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）に記載される技法に従って様々な溶解性の酵素または化学溶液を用いて単離するか、または製造業者によって提供される添付の説明書に従って、核酸結合樹脂によって抽出することができる。
【０１１５】
少なくとも４個の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５個または６個の連続するヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを有し、かつ配列番号：３、５、７、９、および１１（例えば、配列番号：４、６、８、１０、または１２）に示すアミノ酸をコードする配列に、配列相補性または相同性を示すポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用性を有する。
【０１１６】
「完全にマッチした」プローブは、特異的ハイブリダイゼーションにとって必要ではないことは当技術分野において既知である。少数の塩基の置換、欠失、または挿入によって得られるプローブ配列におけるわずかな変化は、ハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼさない。一般的に、２０％程度の塩基対ミスマッチ（選択的に整列した場合）が容認されうる。好ましくは、上記のｍＲＮＡを検出するために有用なプローブは、これまでに特徴づけされた遺伝子に対応するこれまでに同定された配列（上記のように同定された）、または配列番号：１、４、６、８、１０、もしくは１２に含まれる同等の大きさの相同性領域と少なくとも約８０％同一である。より好ましくは、プローブは相同性領域のアラインメント後に、対応する遺伝子配列と８５％同一である；さらにより好ましくは９０％の同一性を示す。
【０１１７】
これらのプローブは、これらの細胞を含む様々な細胞または組織を検出またはモニターするためのラジオアッセイ（例えば、サザンおよびノザンブロット分析）において用いることができる。プローブはまた、本発明の一つまたは複数のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するための高処理能スクリーニングアッセイにおいて用いられるチップのような固相支持体またはアレイに結合することができる。したがって、本発明は、高処理能スクリーニングにおいて用いるために固相支持体に結合した、配列番号：４、６、８、１０、もしくは１２、またはこれらの配列の一つの相補体として同定される少なくとも一つのプローブを提供する。
【０１１８】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、宿主細胞へのポリヌクレオチドの形質導入を確認するために、ＡＰＣにおいて発現された遺伝子または遺伝子転写物を検出するためのプライマーとして役立ちうる。この文脈において、増幅は妥当な信頼性で標的配列を複製することができるプライマー依存的ポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのような天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素によって行ってもよい。プライマーの好ましい長さは、上記のプローブに関して同定されたものと同じである。
【０１１９】
本発明はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した単離されたポリヌクレオチドと同様に、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性または安定な発現のための他の調節配列をさらに提供する。本明細書において用いられるように、「機能的に結合した」という用語は、プロモーターがＤＮＡ分子から離れて、ＲＮＡの転写を指示するように位置することを意味する。そのようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ７である。特定の態様において、細胞特異的プロモーターは、挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的発現のために用いられる。停止コドンおよび選択マーカー配列を有し、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーと同様に、ＤＮＡの挿入片がそのプロモーターに機能的に結合することができるクローニング部位を含むベクターは、当技術分野で周知であり、市販されている。一般的な方法論およびクローニング戦略に関しては、様々な適したベクターに関するマップ、機能的特性、販売元およびＧｅｎＥＭＢＬアクセッション番号の参照を載せた、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」ゴエッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、アカデミック出版社（１９９１）、およびその中に含まれる引用文献、ならびに「ベクター：本質的なデータシリーズ（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ）」ガセサおよびラムジ（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州（１９９４）を参照のこと。好ましくは、これらのベクターはインビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができる。
【０１２０】
これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの一体化された一部として宿主細胞において複製可能でなければならないという意味である。適した発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミド等を含むウイルスベクターが含まれる。アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボの双方でその高レベル発現および細胞の効率的な形質転換のために、インビボで組織に遺伝子を導入するために特に有用である。核酸を、適した宿主細胞、例えば原核細胞または真核細胞に挿入して、宿主細胞が複製すると、タンパク質を組換え的に産生することができる。適した宿主細胞には、ベクターに依存して、周知の方法を用いて構築された哺乳類細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞が含まれうる。上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）を参照のこと。外因性の核酸を細胞に挿入するためにウイルスベクターを用いることの他に、細菌細胞の形質転換；哺乳類細胞の場合にはリン酸カルシウム沈殿を用いるトランスフェクション；ＤＥＡＥデキストラン；エレクトロポレーション；またはマイクロインジェクションのような当技術分野で周知の方法によって、核酸を宿主細胞に挿入することができる。この方法論に関しては、上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）を参照のこと。このように、本発明は宿主細胞、例えば、タンパク質、ポリペプチド、または抗体をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳類細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞、または細菌細胞のような原核細胞も同様に提供する。
【０１２１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを細胞に送達するために（インビボ、エキソビボ、またはインビトロ）適した送達媒体を提供する。本発明のポリヌクレオチドはクローニングまたは発現ベクター内に含まれうる。これらのベクター（特に発現ベクター）を次に、例えば細胞への送達を促進する、および／または細胞への流入を促進しうる、多くの任意の形態を想定して操作することができる。
【０１２２】
ベクターをインビボまたはエキソビボで遺伝子治療のために用いる場合、複製能のないレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターのような薬学的に許容されるベクターが好ましい。本発明の核酸を含む薬学的に許容されるベクターは、挿入されたポリヌクレオチドの一過性または安定な発現のためにさらに改変することができる。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容されるベクター」という用語には、分裂する細胞への核酸の選択的な標的指向能および核酸の導入能を有するベクターまたは送達媒体が含まれるがこれらに限定されない。そのようなベクターの例は、ウイルスタンパク質を産生できない点により定義され、感染宿主細胞でのベクターの核酸を妨げる、「複製能のない」ベクターである。複製能のないレトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．）ら（１９８９）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０〜９９０）である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子移入のために複製能のないレトロウイルスを用いる方法論は、十分に確立されている（コレル（Ｃｏｒｒｅｌｌ）ら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９１２；ボーディノン（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ）（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６７４８〜６８５２；カルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）Ｋ．（１９９１）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３１５５；およびリル（Ｒｉｌｌ）Ｄ．Ｒ．（１９９２）、Ｂｌｏｏｄ ７９（１０）：２６９４〜２７００）。
【０１２３】
本発明のポリヌクレオチドを含むこれらの単離された宿主細胞は、ポリヌクレオチドの組換え的複製のために、かつペプチドの組換え的産生のために有用である。または、細胞は、本明細書に記載の方法において被験者における免疫応答を誘導するために用いてもよい。宿主細胞が抗原提示細胞である場合、それらは、腫瘍浸潤リンパ球のような免疫エフェクター細胞の集団を増殖させるために用いることができ、次に養子免疫治療において有用となる。
【０１２４】
本発明のポリペプチドと複合体を特異的に形成することができる抗体も同様に本発明によって提供される。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。抗体には、マウス、ラット、およびウサギ、またはヒト抗体が含まれるがこれらに限定されない。抗体は、ポリペプチドおよびポリペプチドを発現するＡＰＣを同定および精製するために有用である。
【０１２５】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する実験方法は、対応する核酸配列を推定する方法と共に、当技術分野で既知であり、ハーロウおよびレーン（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ）、（１９８８）、上記、およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９）上記を参照のこと。本発明のモノクローナル抗体は、動物、例えばマウスまたはウサギにタンパク質またはその断片を導入することによって生物学的に産生することができる。動物における抗体産生細胞を単離して骨髄腫細胞またはヘテロ骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマを作製する。したがって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマも同様に提供される。
【０１２６】
このように、タンパク質またはその断片、および周知の方法を用いて、当業者は、本発明のハイブリドーマ細胞および抗体を産生して、タンパク質またはポリペプチドに対する結合能を有する抗体に関してスクリーニングすることができる。
【０１２７】
検査するモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドに結合すれば、検査する抗体と本発明のハイブリドーマによって提供された抗体とは同等である。同様に、過度の実験を行うことなく、それに対してモノクローナル抗体が正常に反応するタンパク質またはポリペプチドと本発明のモノクローナル抗体の結合を、検査する抗体が妨害するか否かの判定によって、その抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するか否かを判定することも可能である。検査する抗体が、本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、本発明のモノクローナル抗体と競合すれば、二つの抗体は同じまたは密接に関連したエピトープに結合する可能性がある。または、それが正常に反応するタンパク質と共に本発明のモノクローナル抗体を予めインキュベートして、検査するモノクローナル抗体の抗原との結合能が阻害されているか否かを判定することができる。検査するモノクローナル抗体が阻害されれば、それはおそらく本発明のモノクローナル抗体と同じ、または密接に関連したエピトープ特異性を有する。
【０１２８】
「抗体」という用語にはまた、全てのイソ型の抗体が含まれると解釈される。モノクローナル抗体の特定のイソ型は、最初の融合体から直接選択することによって調製することができ、またはステプリュースキー（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ）ら（１９８５）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：８６５３、もしくはスパイラ（Ｓｐｉｒａ）ら（１９８４）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ７４：３０７に記載される方法を用いて、クラススイッチ変種を単離するための関連する選択技術を用いて、異なるイソ型のモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することもできる。
【０１２９】
本発明はまた、上記のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生物活性断片を提供する。これらの「抗体断片」は、その抗原または免疫原との何らかの選択的結合能を保持する。そのような抗体断片には以下が含まれるがこれらに限定されない：
（１）Ｆａｂ、
（２）Ｆａｂ’、
（３）Ｆ（ａｂ’）_２、
（４）Ｆｖ、および
（５）ＳＣＡ。
【０１３０】
「生物活性抗体断片」の具体例は、抗体のＣＤＲ領域である。これらの断片を作製する方法は当技術分野で既知であり、例えばハーロウおよびレーン（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ）（１９８８）上記を参照のこと。
【０１３１】
本発明の抗体はまた、キメラ抗体およびヒト化抗体を作製するために改変することができる（オイ（Ｏｉ）ら（１９８６）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（３）：２１４）。キメラ抗体は、抗体の重鎖と軽鎖の様々なドメインが一つ以上の種からのＤＮＡによってコードされる抗体である。
【０１３２】
本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離もまた、抗イディオタイプ抗体を作製することによって、当業者は行うことができる（ヘイリン（Ｈｅｙｌｙｎ）ら、（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１００）。抗イディオタイプ抗体は、関係するハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体上に存在する独自の決定基を認識する抗体である。
【０１３３】
二つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプ同一性は、二つのモノクローナル抗体が同じエピトープ決定基の認識に関して同じであることを示す。このように、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗体を用いて、同じエピトープ特異性のモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
【０１３４】
同様に、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生するために抗イディオタイプ技術を用いることも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体が結合するエピトープの鏡像である結合ドメインを、超可変領域に有すると考えられる。したがってこの場合、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、これらの抗体を産生するための免疫に用いることができると考えられる。
【０１３５】
本発明において用いられるように、「エピトープ」という用語は、本発明のモノクローナル抗体に対する特異的親和性を有する任意の決定基が含まれることを意味する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学活性表面群からなり、特異的荷電特徴と共に特定の三次元構造特徴を有する。
【０１３６】
本発明の抗体は、検出可能な物質または標識に結合することができる。当業者に既知の多くの異なる標識および標識方法がある。
【０１３７】
抗体を低分子量ハプテンにカップリングさせることは、アッセイの感度を増加させうる。次に、ハプテンを第二の反応によって特異的に検出することができる。例えば、ビオチンのような、特異的抗ハプテン抗体と反応することができるアビジン、ジニトロフェリル、ピリドキサル、およびフルオレセインに反応するハプテンを用いることが一般的である。ハーロウおよびレーン（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ）（１９８８）上記を参照のこと。
【０１３８】
本発明のモノクローナル抗体はまた、多くの異なる担体に結合させることができる。このように、本発明はまた、抗体と活性または不活性なもう一つの物質とを含む組成物を提供する。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。担体の特性は本発明の目的にとって可溶性または不溶性となりうる。当業者は、モノクローナル抗体を結合するための他の適した担体を承知しており、または日常的な実験を行ってそれを確認することができると考えられる。
【０１３９】
抗体、その断片または抗体を産生する細胞株を含む組成物は、本発明に含まれる。これらの組成物を薬学的に用いる場合、それらは薬学的に許容される担体と組み合わせる。
【０１４０】
もう一つの態様において、本発明は、ＭＨＣ分子に結合した本発明の化合物および組成物を送達することを含む免疫応答を誘導する方法を提供する。このように、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の方法を用いて抗原提示細胞にパルスすることができる。抗原提示細胞には、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、または必要なＭＨＣ／共刺激分子を発現する他の細胞種が含まれるがこれらに限定されない。下記の方法は、最も強力であるＤＣ、好ましくはＡＰＣに対して主に重点を置いている。ポリペプチドまたはタンパク質を含むこれらの宿主細胞をさらに提供する。
【０１４１】
ＭＨＣ分子に結合した本発明のポリペプチドを提示する単離された宿主細胞は、感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を拡大および単離するためにさらに有用である。免疫エフェクター細胞、例えば、細胞障害性Ｔリンパ球は、ＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子に結合したポリペプチドを提示する抗原提示細胞と共に天然の免疫エフェクター細胞を培養することによって得られる。集団は当技術分野で既知の方法、例えばＦＡＣＳ分析またはフィコール勾配を用いて精製することができる。免疫エフェクター細胞と共にそれによって産生される集団を作製して培養する方法にも、同様に本発明者らが貢献しており、本発明である。細胞と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物は、養子免疫治療において有用である。インビボで投与する前に、免疫エフェクター細胞を、ヒト癌抗原ＰＡＲ−３を発現する腫瘍細胞、例えば卵巣癌の溶解能に関してインビトロでスクリーニングする。
【０１４２】
一つの態様において、免疫エフェクター細胞および／またはＡＰＣは遺伝子改変される。標準的な遺伝子移入を用いて、共刺激分子および／または刺激性サイトカインをコードする遺伝子を、免疫エフェクター細胞を拡大する前、同時、または後に挿入することができる。
【０１４３】
本発明はまた、ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する条件で、上記のポリペプチドの有効量を被験者に投与することを含む、被験者における免疫応答を誘導する方法を提供する。ポリペプチドは、組成物において、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子送達媒体において、または宿主細胞に挿入することによって投与することができ、次にコードされたポリペプチドを組み換え的に転写、翻訳およびプロセシングする。したがって、薬学的に許容される担体において本発明のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞は、有効なワクチンレジメのためにアジュバント、サイトカイン、または共刺激分子の適当な有効量と共に組み合わせることができる。一つの態様において、宿主細胞は、樹状細胞のようなＡＰＣである。宿主細胞は、サイトカインおよび／または共刺激分子のいずれかまたは双方の有効量をコードするポリヌクレオチドを挿入することによってさらに改変することができる。
【０１４４】
本発明の方法は、被験者にサイトカインまたは共刺激分子の有効量を同時投与することによってさらに改変することができる。
【０１４５】
本発明はまた、任意の上記のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、抗体、およびその断片と、許容される固体または液体担体とを含む組成物を提供する。組成物が薬学的に用いられる場合、それらは診断的および治療的用途のために「薬学的に許容される担体」と組み合わせる。これらの組成物はまた、癌のような疾患の診断および治療のための薬剤を調製するために用いることができる。
【０１４６】
以下の材料および方法は、本発明、上記の本発明を作製する方法および利用する方法を説明するためであって、これらに制限されない。
【０１４７】
材料および方法
本発明のポリペプチドの産生
最も好ましくは、本発明の単離されたペプチドは、適当な固相合成技法を用いて合成することができる。ステワードおよびヤング（ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ）「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、フリーマントル、サンフランシスコ、カリフォルニア州（１９６８）。好ましい方法は、メリフィールド法である。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９６７）、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ． ２３：４５１）を参照のこと。これらのペプチドの抗原性は、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて簡便に調べてもよい。
【０１４８】
本発明の単離されたペプチドが得られれば、これをクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心、示差溶解度、またはタンパク質精製に関する他の任意の標準的な技術を含む標準的な方法によって精製してもよい。免疫アフィニティクロマトグラフィーの場合、本発明のペプチド、または関連するペプチドに対して作製して、静止相に固定した抗体を含むアフィニティカラムにそれを結合させることによって、エピトープを単離してもよい。
【０１４９】
または、ヘキサ−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）、マルトース結合ドメイン（ニューイングランドバイオラブス社）、インフルエンザコート配列（コロジエジ（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ）ら、（１９９１）、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９４：５０８〜５０９）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなアフィニティタグを本発明のペプチドに結合させて、適当なアフィニティカラムを通過させることによって容易に精製することができる。単離したペプチドはまた、タンパク質溶解、核磁気共鳴、およびｘ線結晶学のような技術を用いて物理的に特徴を調べることができる。
【０１５０】
例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質溶解による切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドとの結合によって、翻訳の際または翻訳後に異なるように改変された抗原性ペプチドも同様に本発明の範囲に含まれる（ファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ら（１９８８）、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：２８５〜３２０）。
【０１５１】
樹状細胞を含むＡＰＣの単離、培養、および増殖
以下は、ＡＰＣを単離するための二つの基本的なアプローチの簡単な説明である。これらのアプローチには、（１）血液から骨髄前駆細胞（ＣＤ３４^＋）を単離して、それらを刺激してＡＰＣに分化させること；または（２）末梢血からＡＰＣ前駆細胞を回収することを含む。第一のアプローチにおいて、末梢血における循環中のＣＤ３４^＋幹細胞の数を増加させるために、患者を、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインによって処置しなければならない。
【０１５２】
ＡＰＣを単離する第二のアプローチは、血液中に既に循環している比較的多数のＡＰＣ前駆細胞を回収することである。ヒト末梢血からＡＰＣ前駆細胞を単離するこれまでの技法は、メトリザミド勾配および接着／非接着段階（フロイデンサール（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ， Ｐ．Ｓ．）ら（１９９０）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：７６９８〜７７０２）；パーコール勾配分離（メータ−ダマニ（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉ）ら（１９９４）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：９９６〜１００３）；および蛍光活性化細胞選別技術（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ， Ｒ．）ら（１９９３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：６８４０〜６８５２）のような物理的技法の組み合わせを含む。
【０１５３】
多数の細胞を互いに分離する技術の一つとして、対向流遠心エラトリエーション（ＣＣＥ）が知られる。この技術では、細胞を同時に遠心して、絶えず流速が増加している緩衝液の洗浄の流れに置く。緩衝液による絶えず増加している対向流によって、ほぼ細胞の大きさに基づく細胞の分画が分離される。
【０１５４】
本発明の一つの局面において、ＡＰＣはマウス、サル、またはヒトのような哺乳類の白血球細胞分画から単離することができる全委任（ｐｒｅｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）樹状細胞または成熟樹状細胞である（例えば、国際公開公報第９６／２３０６０号を参照のこと）。白血球細胞分画は、哺乳類の末梢血から単離することができる。この方法には以下の段階が含まれる：（ａ）ロイコフォレーシスのような当技術分野で既知の方法によって哺乳類起源から得られた白血球細胞分画を提供する段階；（ｂ）段階（ａ）の白血球分画を対向流遠心エラトリエーションによって四つまたはそれ以上の小分画に分離する段階；（ｃ）細胞をカルシウムイオノフォア、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−１３、またはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４に接触させることによって、段階（ｂ）からの一つまたは複数の分画における単球の樹状細胞への変換を刺激する段階、（ｄ）段階（ｃ）からの樹状細胞に富む分画を同定する段階；および（ｅ）段階（ｄ）の濃縮分画を好ましくは約４℃で回収する段階。樹状細胞濃縮分画を同定する一つの方法は、蛍光活性化細胞選別である。白血球分画を、組換え（ｒｈ）ｒｈＩＬ−１２、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、またはｒｈＩＬ−４のような他のサイトカインの存在下でカルシウムイオノフォアによって処置することができる。白血球分画の細胞を緩衝液において洗浄して、Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋不含培地に浮遊させてから分離段階を行う。白血球分画はロイコフォレーシスによって得ることができる。樹状細胞は、以下のマーカー：ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＢ７．２の少なくとも一つが存在することと、以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、５６、５７、およびＣＤ１９、２０が同時に存在しないことによって同定することができる。これらの細胞表面マーカーに対する特異的なモノクローナル抗体は市販されている。
【０１５５】
より具体的には、本方法では、ロイコフェレーシスから白血球と血小板に富む分画を回収して、これを対向流遠心エラトリエーション（ＣＣＥ）によってさらに分画する必要がある（アブラハムセン（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ）Ｔ．Ｇ．ら、（１９９１）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ． ６：４８〜５３）。細胞試料を特殊なエラトリエーションローターに入れる。次に、ローターを例えば３０００ ｒｐｍの一定速度で遠心する。ローターが所望の速度に達すれば、加圧空気を用いて細胞の流速を制御する。エラトリエーターにおける細胞は、同時遠心と絶えず流速が増加する緩衝液の洗浄の流れとを受ける。これによって、細胞の大きさの差にほぼ基づく、しかしそれのみではない分画細胞分離が得られる。
【０１５６】
ＡＰＣの質の制御、より詳しくはＤＣ回収と培養におけるその活性化の成否の確認は、単球、および樹状細胞亜集団の双方のみならず可能性がある混入Ｔリンパ球をモニターする同時多色ＦＡＣＳ分析技術に依存する。これは、ＤＣが以下のマーカーを発現しないという事実に基づく：ＣＤ３（Ｔ細胞）；ＣＤ１４（単球）；ＣＤ１６、５６、５７（ＮＫ／ＬＡＫ細胞）；ＣＤ１９、２０（Ｂ細胞）。同時に、ＤＣは血液中を循環する際に、大量のＨＬＡ−ＤＲ、有意なＨＬＡ−ＤＱおよびＢ７．２（しかしＢ７．１はほとんどまたは全く発現しない）を発現する（それらは他にＬｅｕ Ｍ７およびＭ９、単球および好中球によっても同様に発現される骨髄マーカーを発現する）。
【０１５７】
死細胞を分析するための第三の発色試薬、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と組み合わせると、全ての細胞亜集団の陽性同定が可能となる（表１を参照のこと）。
【０１５８】
【表１】新鮮な末梢細胞亜集団の ＦＡＣＳ 分析

さらに分析するために追加のマーカーを代用することができる：
色＃１：ＣＤ３のみ、ＣＤ１４のみ等；Ｌｅｕ Ｍ７またはＬｅｕ Ｍ９；抗クラスＩ等。
色＃２：ＨＬＡ−ＤＱ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ２５（ＩＬ２ｒ）、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−３等。
【０１５９】
回収時のＦＡＣＳ分析の目標は、ＤＣが予想される分画中で濃縮されることを確認すること、好中球の混入をモニターすること、および適当なマーカーが発現されることを確認することである。ヒト末梢血から、臨床応用に適した濃縮ＤＣをこのように迅速に大量に回収することは、品質管理に関して先に記述した分析的ＦＡＣＳ技術に完全に依存する。必要であれば、成熟ＤＣを「カクテル陰性」細胞に関する蛍光選別によって、この時点で単球から直ちに分離することができる。下記に詳細に説明するように、単球自身は培養においてＤＣまたは機能的ＤＣ様細胞になおも分化することができるために、ＤＣを単球から日常的に分離する必要はない可能性がある。
【０１６０】
回収すれば、ＤＣ濃縮／単球ＡＰＣ分画（通常１５０〜１９０）をプールして、今後使用するために凍結保存することができるか、または直ちに短期間培養に入れることができる。
【０１６１】
または、樹状細胞を上方制御（活性化する）して、単球を活性化樹状細胞表現型に変換する方法が報告されている。この方法は、単球を活性化樹状細胞に変換するために、培養培地へのカルシウムイオノフォアの添加を伴う。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７を例えば２４〜４８時間の培養期間の最初に加えると、均一な活性化が起こり、プールされた「単球プラスＤＣ」分画が樹状細胞表現型に変換された：特徴的に、活性化集団は、等しくＣＤ１４（Ｌｅｕ Ｍ３）陰性となり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＢ７．２を上方制御する。さらに、この活性化バルク集団は、さらに精製される少数の基礎としても機能する。
【０１６２】
サイトカインの特定の組み合わせは、カルシウムイオノフォアによって得られる活性化／変換を首尾よく増幅（または部分的に置換）するために用いられている：これらのサイトカインには、精製または組換え（「ｒｈ」）ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＩＬ−２、およびｒｈＩＬ−４が含まれるがこれらに限定されない。それぞれのサイトカインは、単独で投与すると最適な上方制御には不適当である。
【０１６３】
ＡＰＣに対する抗原の提示
免役する目的のために、抗原性ペプチド（３、５、７、９、および１１）は、タンパク質／ペプチドとして、またはタンパク質／ペプチドをコードするｃＤＮＡの形で抗原提示細胞に送達することができる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、または必要なＭＨＣ／共刺激分子を発現する他の細胞種からなりうる。下記の方法は、最も強力なＤＣ、好ましくはＡＰＣに主に焦点を当てる。
【０１６４】
パルスは、ＡＰＣを、本発明の抗原性タンパク質またはペプチドに曝露することによって、インビトロ／エキソビボで行われる。タンパク質またはペプチドは１〜１０ μｍの濃度で約３時間ＡＰＣに加える。次に、パルスしたＡＰＣを静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内投与経路を通して宿主に投与することができる。
【０１６５】
タンパク質／ペプチド抗原はまた、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内投与経路を通してアジュバントと共にインビボで送達することができる。
【０１６６】
パグリア（Ｐａｇｌｉａ）ら（１９９６、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３：３１７〜３２２）は、インビトロでタンパク質全体と共にインキュベートしたＡＰＣが、ＭＨＣクラスＩ拘束（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＣＴＬによって認識されること、およびこれらのＡＰＣで動物を免疫すると、インビボで抗原特異的ＣＴＬが産生されることを示した。さらに、ＤＣのようなＡＰＣのサイトゾルにおいて抗原を発現させる、いくつかの異なる技術が説明されている。これらには、（１）腫瘍から単離されたＲＮＡのＡＰＣへの導入、（２）抗原の内因性発現を誘導するための組換えベクターによるＡＰＣの感染、および（３）リポソームを用いた、腫瘍抗原のＤＣサイトゾルへの導入が含まれる。（ボクズコウスキー（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ， Ｄ．）ら、（１９９６）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８４：４６５〜４７２；ロウス（Ｒｏｕｓｅ）ら（１９９４）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：５６８５〜５６８９；およびネイア（Ｎａｉｒ）ら（１９９２）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５：６０９〜６１２を参照のこと）。
【０１６７】
フォスター抗原提示細胞
フォスター抗原提示細胞は標的細胞として特に有用である。フォスターＡＰＣは、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子と内因性ペプチドとの結合を制限する抗原プロセシング経路に変異を含む、Ｔ２と呼ばれるヒト細胞株１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２に由来する（ツウェリンク（Ｚｗｅｅｒｉｎｋ）ら（１９９３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：１７６３〜１７７１）。これは、ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８^＋ ＣＴＬに抗原を提示するために必要な、遺伝子ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ１、およびＬＭＰ２を含む、ＭＨＣクラスＩＩ領域における大きなホモ接合欠失のためである。実質的に、「空の」ＭＨＣクラスＩ分子のみがこれらの細胞の表面に提示される。培養培地に加えられた外因性ペプチドは、ペプチドが対立遺伝子特異的結合モチーフを含むならば、これらのＭＨＣ分子に結合する。これらのＴ２細胞は、本明細書において「フォスター」ＡＰＣと呼ぶ。それらは、抗原を提示するために本発明と組み合わせて用いることができる。
【０１６８】
Ｔ２細胞に特異的な組換えＭＨＣ対立遺伝子を形質導入すると、ＭＨＣ拘束プロフィールの再指示が可能になる。組換え対立遺伝子に合わせて作製されたライブラリーは、結合残基が内因性対立遺伝子との有効な結合を妨げるため、それらによって選択的に提示されると考えられる。
【０１６９】
ＭＨＣ分子の高レベル発現によって、ＡＰＣはＣＴＬに対してより目立つようになる。強力な転写プロモーターを用いたＴ２細胞における、関係するＭＨＣ対立遺伝子の発現によって、より反応性のＡＰＣが得られる（細胞表面上でのより高い濃度の反応性ＭＨＣ−ペプチド複合体による可能性が最も高い）。
【０１７０】
免疫原性アッセイ
本発明のリガンドの免疫原性は、下記に例示するものを含むがこれらに限定されない、周知の方法論によって決定することができる。一つの態様において、そのような方法論は、対応する天然のリガンドと本発明の改変リガンドとを比較するために用いてもよい。例えば改変リガンドは、以下のアッセイのいずれか一つにおいて天然のリガンドの活性と同程度であれば、「より活性である」と見なされると考えられる。いくつかの目的に関して、すなわち、治療および／または診断目的のために、当業者はもう一つの免疫原性リガンドより高い活性を示す、免疫原性リガンドを選択すると考えられる。しかし適応によっては、天然のリガンドと同等である免疫原性リガンドを用いることが適している。他の状況では、より活性が弱い免疫原性リガンドを利用することが望ましいかも知れない。そのような活性レベルは、免疫原性レベルと正の相関をすることが示唆されている。
【０１７１】
１． ^５１ Ｃｒ− 放出溶解アッセイ
ペプチドパルス^５１Ｃｒ−標識標的の抗原特異的Ｔ細胞による溶解を、天然のまたは改変リガンドのいずれかによってパルスした、標的細胞に関して比較することができる。機能的に増強されたリガンドは、時間の関数としてより大きな標的溶解を示すと考えられる。溶解の速度論と共に、固定時間（例えば、４時間）での全標的溶解を用いて、リガンドの性能を評価してもよい（ウェア（Ｗａｒｅ）Ｃ．Ｆ．ら（１９８３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１：１３１２）。
【０１７２】
２．サイトカイン放出アッセイ
リガンドパルス標的と接触させた場合にＴ細胞によって分泌されるサイトカインの種類および量の分析は、機能的活性の測定となりうる。サイトカインは、サイトカイン産生の速度および全量を決定するためにＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定することができる（フジハシ（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ）Ｋ．ら、（１９９３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １６０：１８１；タンケイおよびキリオン（Ｔａｎｑｕａｙ， Ｓ．およびＫｉｌｌｉｏｎ， Ｊ．Ｊ．）、（１９９４）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ． １３：２５９）。
【０１７３】
３．インビトロ Ｔ 細胞学習
本発明のリガンドは、正常なドナーまたは患者に由来するＰＢＭＣからのリガンド反応性Ｔ細胞集団の誘発能に関して、対応する天然のリガンドと比較することができる。この系において、誘発されたＴ細胞は、溶解活性、サイトカイン放出、ポリクローン性、および天然のリガンドに対する交叉反応性に関して調べることができる（パークハースト（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ）Ｍ．Ｒ．ら、（１９９６）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：２５３９）。
【０１７４】
４．トランスジェニック動物モデル
本発明のリガンドまたは天然のリガンドのいずれかをＨＬＡトランスジェニックマウスにワクチン接種して、誘導された免疫応答の性質および程度を決定することによって、免疫原性をインビボで評価することができる。または、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの養子移入によってマウスにおけるヒト免疫系の再構築を可能にする。これらの動物は、リガンドをワクチン接種して、先に述べたように免疫応答に関して分析してもよい（シライ（Ｓｈｉｒａｉ）Ｍ．ら（１９９５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２７３３；モシエ（Ｍｏｓｉｅｒ）Ｄ．Ｅ．ら（１９９３）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：２４４３）。
【０１７５】
５．増殖
Ｔ細胞は、反応性リガンドに反応して増殖すると考えられる。増殖は、例えば^３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによって、定量的にモニターすることができる（カルソ（Ｃａｒｕｓｏ）Ａ．ら、（１９９７）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２７：７１）。
【０１７６】
６．四量体染色
ＭＨＣ四量体は、個々のリガンドをローディングして、適当なエフェクターＴ細胞集団との相対的結合能に関して調べることができる（アルトマン（Ａｌｔｍａｎ）Ｊ．Ｄ．ら（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４（５２８４）：９４−９６。
【０１７７】
７．ＭＨＣ 安定化
Ｔ２細胞のような特定の細胞株をＨＬＡ結合リガンドに曝露すると、細胞表面上のＭＨＣ複合体の安定化が起こる。細胞表面上のＭＨＣ複合体の定量は、安定化されるＨＬＡ対立遺伝子に関するリガンドの親和性と相関している。このように、この技術は、リガンドエピトープの相対的ＨＬＡ親和性を決定することができる（スツバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｇ．ら、（１９９５）、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：６５３）。
【０１７８】
８．ＭＨＣ 競合
参照リガンドおよびその同種のＴ細胞エフェクターの機能的活性をリガンドが妨害する能力は、リガンドがどれほどＭＨＣ結合に関して競合できるかの尺度である。阻害の相対レベルの測定は、ＭＨＣ親和性の指標である（フェルトカンプ（Ｆｅｌｔｋａｍｐ）Ｍ．Ｃ．ら（１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ４７：１）。
【０１７９】
９．霊長類モデル
最近記載されたヒト以外の霊長類（チンパンジー）モデル系は、ＨＬＡ拘束リガンドのインビボ免疫原性をモニターするために利用することができる。チンパンジーは、ヒトＭＨＣ分子と重なり合うＭＨＣリガンド特異性を共有し、このため相対的インビボ免疫原性に関して、ＨＬＡ拘束リガンドを調べることができる（ベルトーニ（Ｂｅｒｔｏｎｉ）Ｒ．ら（１９９８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：４４４７）。
【０１８０】
１０．ＴＣＲ シグナル伝達事象のモニタリング
いくつかの細胞内シグナル伝達事象（例えば、リン酸化）は、ＭＨＣリガンド複合体によるＴＣＲ関与の成功に関係している。これらの事象の定量的および定性的分析は、リガンドがＴＣＲ関与を通してエフェクター細胞を活性化する相対的な能力に相関している（サラザー（Ｓａｌａｚａｒ）Ｅ．ら（２０００）、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８５：８２９；イサコフ（Ｉｓａｋｏｖ）Ｎ．ら（１９９５）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１：３７５）。
【０１８１】
免疫エフェクター細胞の増殖
本発明は、これらのＡＰＣを利用して抗原特異的免疫エフェクター細胞の濃縮集団の産生を刺激する。抗原特異的免疫エフェクター細胞は、ＡＰＣを犠牲にして増殖し、ＡＰＣは培養において死滅する。未経験の免疫エフェクター細胞が他の細胞によって感作される過程は、クーリー（Ｃｏｕｌｉｅ）（（１９９７）、Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ３：２６１〜２６８）に本質的に記載されている。
【０１８２】
上記のように調製したＡＰＣを未経験の免疫エフェクター細胞と混合する。好ましくは、細胞をサイトカイン、例えばＩＬ−２の存在下で培養してもよい。樹状細胞はＩＬ−１２のような強力な免疫刺激サイトカインを分泌するため、増大の最初およびその後の回のあいだに追加のサイトカインを加える必要はないかも知れない。いずれにせよ、培養条件は、抗原特異的免疫エフェクター細胞が、ＡＰＣよりかなり速い速度で増大する（すなわち増殖する）条件である。抗原特異的細胞の集団をさらに増殖させるために、ＡＰＣと選択的サイトカインの多数回の注入を行うことができる。
【０１８３】
一つの態様において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。異なる態様において、免疫エフェクター細胞は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１１、またはＩＬ−１３をコードする導入遺伝子の形質導入によって遺伝子改変することができる。導入遺伝子をインビトロ、エキソビボ、およびインビボで導入する方法は、当技術分野で周知である。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）上記を参照のこと。
【０１８４】
遺伝子改変において有用なベクター
一般的に、本発明において用いられる細胞の遺伝子改変は、異種または改変抗原をコードする、ポリペプチドまたは導入遺伝子を含むベクターを導入することによって得られる。非ウイルス系と共にウイルス系を含む、多様な異なる遺伝子移入ベクターを用いることができる。本発明の遺伝子改変において有用なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−レトロウイルスキメラベクターが含まれるが、これらに限定されない。ＡＰＣおよび免疫エフェクター細胞は、下記の方法を用いて、または当技術分野で既知の他の任意の適当な方法によって、改変することができる。
【０１８５】
組換えアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターの構築
本発明の遺伝子改変において有用なアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、当技術分野で既に教示された方法に従って産生してもよい。例えば、カールソンら（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）（１９９２）、ＥＭＢＯ Ｊ． ５：２３７７）；カーター（Ｃａｒｔｅｒ、（１９９２）、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：５３３〜５３９；ムジズカ（Ｍｕｚｃｙｚｋａ）（１９９２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７〜１２９；「遺伝子のターゲティング：実践アプローチ（Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（１９９２）、Ａ．Ｌ．ジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）編、オックスフォード大学出版、ニューヨーク州）を参照のこと。いくつかの異なるアプローチが実施可能である。ヘルパー非依存性複製欠損ヒトアデノウイルス系が好ましい。
【０１８６】
ヒトアデノウイルス５に基づく組換えアデノウイルスベクター（ＭｃＧｒｏｒｙ， Ｗ．Ｔ．ら、（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：６１４〜６１７）は、アデノウイルスゲノムから必須の初期遺伝子（通常、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）が欠失しており、したがって、イントランスで欠失している遺伝子産物を提供する、許容性の細胞株において増殖させなければ複製することができない。欠失しているアデノウイルスゲノム配列の代わりに、関係する導入遺伝子を、複製欠損アデノウイルスに感染した細胞においてクローニングおよび発現することができる。アデノウイルスに基づく遺伝子移入では、宿主ゲノムへの導入遺伝子の組み込みが起こらず（宿主ＤＮＡに導入遺伝子が組み込まれるのは、アデノウイルス媒介トランスフェクションの０．１％未満である）、したがって、安定ではないが、アデノウイルスベクターはより高い力価で増殖して、非複製細胞をトランスフェクトすることができる。アデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子によって形質転換した、ヒト胎児腎細胞であるヒト２９３細胞は、有用な許容性細胞株の典型である。しかし、複製欠損アデノウイルスベクターがその中で増殖することができる、ＨｅＬａ細胞を含む他の細胞株を用いることができる。
【０１８７】
本発明の方法において用いることができるアデノウイルスベクターおよび他のウイルスベクターを記載するさらなる引用文献には、以下が含まれる：ホルビッツ（Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｍ．Ｓ．、「アデノウイルス科とその複製（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）Ｂ．ら編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 第２巻、レイブン出版、ニューヨーク州、１６７９〜１７２１頁（１９９０）；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）Ｂ．ら、「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第７巻、「遺伝子移入と発現プロトコール（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ミュレイ（Ｍｕｒａｙ， Ｅ．）編、ヒュマナ出版、クリフトン、ニュージャージー州（１９９１）の１０９〜１２８頁；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）Ｎ．ら、（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１９０〜１９９）；シュレイアー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ， Ｈ．、（１９９４）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ａｃｔａ Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ ６８：１４５〜１５９：シュナイダーおよびフレンチ（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒｅｎｃｈ、（１９９３）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：１９３７〜１９４２）；キュリエル（Ｃｕｒｉｅｌ）Ｄ．Ｔ．ら、（１９９２）、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：１４７〜１５４；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）Ｆ．Ｌ．ら、国際公開公報第９５／００６５５号（１９９５年１月５日）；ファルク−ペダーセン（Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）Ｅ．Ｓ．、国際公開公報第９５／１６７７２号（１９９５年６月２２日）；デネフル（Ｄｅｎｅｆｌｅ）Ｐ．ら、国際公開公報第９５／２３８６７号（１９９５年９月８日）；ハッダダ（Ｈａｄｄａｄａ）Ｈ．ら、国際公開公報第９４／２６９１４号（１９９４年１１月２４日）；ペリカウデ（Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ）Ｍ．ら、国際公開公報第９５／０２６９７号（１９９５年１月２６日）；ザン（Ｚｈａｎｇ）Ｗ．ら、国際公開公報第９５／２５０７１号（１９９５年１０月１２日）。多様なアデノウイルスプラスミドも同様に例えば、オンタリオ州トロントのマイクロビクスバイオシステムズ社（例えば、マイクロビクス製品情報シート：アデノウイルスベクター構築のためのプラスミド、１９９６年を参照のこと）を含む販売元から入手できる。同様に、遺伝子改変のために用いることができるアデノ−レトロウイルスキメラベクターの構築および使用に関して記述している、バイル（Ｖｉｌｅ）ら、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８４０〜８４１）；およびフェングら（Ｆｅｎｇ、（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６〜８７０）による論文を参照のこと。
【０１８８】
本発明の方法において用いることができるＡＡＶベクターを記述するさらなる参考文献には、以下が含まれる：カーター（Ｃａｒｔｅｒ）Ｂ．、「パルボウイルスハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）」、第Ｉ巻１６９〜２２８頁、１９９０；バーンズ（Ｂｅｒｎｓ、「ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、１７４３〜１７６４頁（レイブン出版、１９９０）；カーター（Ｃａｒｔｅｒ）Ｂ．、（１９９２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：５３３〜５３９；ムジズカ（Ｍｕｚｃｙｚｋａ）、（１９９２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９２〜１２９；フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）Ｔ．Ｒ．ら、（１９９２）、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７：３４９〜３５６；チャタリー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら、（１９９５）、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７０：７９〜９０；フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）Ｔ．Ｒ．ら、国際公開公報第９５／１３３６５号（１９９５年５月１８日）；トレンペ（Ｔｒｅｍｐｅ）Ｊ．Ｐ．ら、国際公開公報第９５／１３３９２号（１９９５年５月１８日）；コチン（Ｋｏｔｉｎ）Ｒ．、（１９９４）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：７９３〜８０１）；フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）Ｔ．Ｒ．ら、（１９９５）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３５７〜３６２；アレン（Ａｌｌｅｎ）Ｊ．Ｍ．、国際公開公報第９６／１７９４７号（１９９６年６月１３日）；およびデュ（Ｄｕ）ら（１９９６）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２５４〜２６１。
【０１８９】
ＡＰＣは、関連するポリペプチドをコードするウイルスベクターによって形質導入することができる。最も一般的なウイルスベクターには、ワクシニアおよび鶏痘ウイルス（ブロンテ（Ｂｒｏｎｔｅ）ら、（１９９７）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３１８３〜３１８８；キム（Ｋｉｍ）ら、（１９９７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０：２７６〜２８６）のような組換えポックスウイルスが含まれ、好ましくはアデノウイルス（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、（１９９７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：１３９３〜１４０３；ワン（Ｗａｎｇ）ら（１９９７）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１３５５〜１３６３；ヒュアン（Ｈｕａｎｇ）ら、（１９９５）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：２２５７〜２２６３）が含まれる。ヒトＡＰＣの形質導入のためにレトロウイルスも同様に用いてもよい（マリン（Ｍａｒｉｎ）ら（１９９６）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：２９５７〜２９６２）。
【０１９０】
インビトロ／エキソビボでヒトＤＣを、最少量の血清不含培地において感染多重度（ＭＯＩ）５００で、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターに１６〜２４時間曝露すると、ＤＣの９０〜１００％でて導入遺伝子の発現を確実に生じる。ＤＣまたは他のＡＰＣの形質導入効率は、発現される腫瘍抗原に対して特異的な蛍光抗体を用いて、免疫蛍光によって評価することができる（キム（Ｋｉｍ）ら、（１９９７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０：２７６〜２８６）。または抗体は、基質と反応すると着色産物を生じる酵素（例えば、ＨＲＰ）と結合させることができる。ＡＰＣによって発現される抗原性ポリペプチドの実際の量は、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。
【０１９１】
形質導入したＡＰＣは、その後静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路によって宿主に投与することができる。
【０１９２】
ＤＣまたは他のＡＰＣのインビボ形質導入は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮下送達を含む異なる経路によって、Ａｄ（または他のウイルスベクター）の投与によって行うことができる。好ましい方法は、総量約１×１０^１０〜１×１０^１２ ｉ．ｕ．を用いる多数の部位でのＡｄベクターの皮下送達である。インビボ形質導入レベルは、発現されるＡＰＣマーカーとＴＡＡに対する抗体による共染色によっておおよそ評価することができる。染色技法は、投与部位からの生検試料、またはＡＰＣ（特にＤＣ）が遊走している可能性がある、排液リンパ節もしくは他の臓器からの細胞について行うことができる（コンドン（Ｃｏｎｄｏｎ）ら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２：１１２２〜１１２８およびワン（Ｗａｎ）ら、（１９９７）、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８：１３５５〜１３６３）。注射部位または形質導入されたＡＰＣが遊走する可能性がある他の臓器において発現される抗原の量は、組織ホモジネートに対するＥＬＩＳＡによって評価することができる。
【０１９３】
ウイルス遺伝子送達はより効率的であるが、ＤＣはまた、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、または陽イオン脂質／プラスミドＤＮＡ複合体のような、非ウイルス遺伝子送達法によって、インビトロ／エキソビボで形質導入することができる（アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）ら、（１９９７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４：１７〜２５）。次に、形質導入されたＡＰＣは、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路によって宿主に投与することができる。
【０１９４】
ＤＣまたは他のＡＰＣのインビボ形質転換は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮下投与経路によって送達される、陽イオン脂質／プラスミドＤＮＡ複合体の投与によって、おそらく行うことができる。遺伝子銃送達または裸のプラスミドＤＮＡの皮膚への注入によっても、ＤＣが形質転換される（コンドン（Ｃｏｎｄｏｎ）ら（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２：１１２２〜１１２８；ラズ（Ｒａｚ）ら、（１９９４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９５１９〜９５２３）。プラスミドＤＮＡの筋肉内送達はまた、免疫のために用いてもよい（ロサト（Ｒｏｓａｔｏ）ら、（１９９７）、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８：１４５１〜１４５８）。
【０１９５】
形質転換効率および導入遺伝子発現レベルは、ウイルスベクターに関して上記のように評価することができる。
【０１９６】
養子免疫治療とワクチン
本発明の抗原特異的免疫エフェクター細胞の増殖集団も同様に、養子免疫治療法において、およびワクチンとして用いられる。
【０１９７】
養子免疫治療は、一つの局面において、未経験の免疫エフェクター細胞を上記のようにＡＰＣと共に培養することによって、感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の実質的に純粋な集団を、被験者に投与する段階を含む。好ましくは、ＡＰＣは樹状細胞である。
【０１９８】
一つの態様において、本明細書に記載の養子免疫治療方法は自己由来である。この場合、ＡＰＣは一人の被験者から単離した親細胞を用いて作製する。増殖した集団はまた、その被験者から単離されたＴ細胞を用いる。最後に、抗原特異的細胞の増殖集団を同じ患者に投与する。
【０１９９】
さらなる態様において、ＡＰＣまたは免疫エフェクター細胞は、ＩＬ−２または共刺激分子のような、刺激性サイトカインの有効量と共に投与する。
【０２００】
本明細書において、その意図する目的に関して有効であると同定された作用物質は、ヒト癌腫瘍抗原ＰＡＲ−３を発現する腫瘍を有する被験者と同様に、そのような腫瘍に感受性があるかまたは発症する危険性を有する個体に投与することができる。物質をマウス、ラット、またはヒト患者のような被験者に投与する場合、物質を薬学的に許容される担体に加えて、全身または局所的に被験者に投与することができる。治療から利益が得られうる患者を決定するために、腫瘍の退縮をアッセイすることができる。治療量は経験的に決定して、治療すべき病態、治療すべき被験者、ならびに治療の有効性および毒性に応じて変化すると考えられる。
【０２０１】
インビボでの投与は、１回の投与で、治療の過程を通して連続的に、または間欠的に行うことができる。最も有効な手段および投与用量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に用いられる組成物、治療の目的、治療される標的細胞、および治療される被験者に応じて変化すると考えられる。１回または多数回の投与を、治療する医師によって選択された用量レベルおよび様式で行うことができる。適した用量製剤および物質を投与する方法は下記に見出されうる。
【０２０２】
本発明の作用物質および組成物は、薬学的組成物における活性成分のように、従来の方法に従って投与することによって、医薬品の製造ならびにヒトおよび他の動物の治療のために用いることができる。
【０２０３】
より詳細には、本明細書において活性成分であると呼ばれる本発明の作用物質はまた、鼻腔内、局所（経皮、エアロゾル、口腔内、舌下を含む）、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）ならびに肺内経路を含む、任意の適した経路によって治療のために投与してもよい。同様に、好ましい経路はレシピエントの状態および年齢、ならびに治療される疾患に応じて変化すると考えられる。
【０２０４】
先の説明および実施例は、当技術分野の単なる説明と解釈される。当業者に明らかであるように、様々な変更を上記に行ってもよく、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれうる。

Claims (38)

1. 以下の構造を有する化合物：
   

   
2. 以下の構造を有する化合物：
   

   
3. 以下の構造を有する化合物：
   

   
4. 以下の構造を有する化合物：
   

   
5. 以下の構造を有する化合物：
   

   
6. アミノ酸の７００、７０１、７０２、７０４、および７０６位が、それぞれＦ、Ｌ、Ｔ、ＥおよびＭである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
7. アミノ酸の７００、７０１、７０２、７０４、７０５、および７０６位が、それぞれＦ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ａ、ＲおよびＳである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
8. アミノ酸の７００、７０１、７０２、７０４、７０５、および７０６位が、それぞれＦ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＭおよびＲである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
9. アミノ酸の７００、７０１、７０２、７０４、７０５、７０６および７０７位が、それぞれＦ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｉ、ＴおよびＦである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
10. 配列番号：３のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
11. 配列番号：５のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
12. 配列番号：７のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
13. 配列番号：９のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
14. 配列番号：１１のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
15. 請求項６〜９のいずれか一項記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
16. 請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物を特異的に認識し、かつ結合する抗体。
17. 請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物の有効量を、被験者に送達する段階を含む、被験者における免疫応答を誘導する方法。
18. 化合物がＭＨＣ分子と共に（ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ａｎ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）送達される、請求項１７記載の方法。
19. ＭＨＣ分子が抗原提示細胞の表面上に化合物を提示する、請求項１７記載の方法。
20. 化合物が該化合物をコードするポリヌクレオチドとして送達される、請求項１７記載の方法。
21. 請求項１６記載の抗体の有効量を、被験者に投与する段階を含む、免疫治療方法。
22. ＭＨＣ分子と共に請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物を提示する抗原提示細胞の存在下で、該抗原提示細胞を犠牲にして、インビトロまたはインビボで産生される、免疫エフェクター細胞。
23. 請求項２２記載の免疫エフェクター細胞の有効量を投与する段階を含む、養子免疫治療の方法。
24. 少なくとも二つの免疫原性リガンドを含む組成物であって、該免疫原性リガンド、同じ天然のリガンドに対して免疫応答を誘発できることを個々に特徴とし、かつ該免疫原性リガンドは、
    

    

    からなる群より選択される、化合物。
25. 免疫原性リガンドに結合した生物活性免疫グロブリンの可変ドメインをさらに含む、請求項２４記載の組成物。
26. 免疫原性リガンドに結合したＭＨＣ分子をさらに含む、請求項２４記載の組成物。
27. 免疫原性リガンドが共有結合する、請求項２４記載の組成物。
28. 免疫原性リガンドに共有結合した作用物質をさらに含み、該作用物質が抗原提示細胞に該免疫原性リガンドを標的指向させることができる、請求項２４記載の組成物。
29. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２８記載の組成物。
30. ＭＨＣクラスＩＩ結合ヘルパーペプチドをさらに含む、請求項２４記載の組成物。
31. 担体をさらに含む、請求項２４〜３０のいずれか一項記載の組成物。
32. 担体が薬学的に許容される担体である、請求項３１記載の組成物。
33. 少なくとも二つの免疫原性リガンドを含む宿主細胞であって、該免疫原性リガンドは、同じ天然のリガンドに対して免疫応答を誘発できることを個々に特徴とし、かつ該免疫原性リガンドは
    

    

    からなる群より選択される、宿主細胞。
34. 宿主細胞が抗原提示細胞であって、かつ免疫原性リガンドが該細胞の表面に提示される、請求項３３記載の宿主細胞。
35. 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項３４記載の宿主細胞。
36. 請求項３３〜３５のいずれか一項記載の宿主細胞を含む、組成物。
37. 担体が薬学的に許容される担体である、請求項３６記載の組成物。
38. 二つまたはそれ以上の免疫原性リガンドの有効量を含む組成物を、被験者に送達する段階を含む、被験者において免疫応答を誘導する方法であって、該免疫原性リガンドのそれぞれが、同じ天然のリガンドに対して免疫応答を誘発できることを個々に特徴とし、かつ該免疫原性リガンドが
    

    

    からなる群より選択される方法。