JP2004504809A - Compounds and methods for modulating desmosome-mediated functions - Google Patents

Abstract

Modulators for inhibiting or enhancing desmosome-mediated cell adhesion are provided. The modulator comprises one or more of the following: a) a peptide sequence that is at least 50% identical to the desmosome cadherin CAR sequence; b) a non-peptidomimetic of the desmosome cadherin CAR sequence; c) specific for the desmosome cadherin CAR And / or d) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the desmosome cadherin CAR sequence or an analog thereof. In various contexts, methods of using such modulators to modulate desmosome cadherin-mediated cell adhesion are also provided.

Description

を有し得、ここで、Ｗは、ＮＱＫ、ＮＲＮ、ＮＫＤ、ＥＫＤ、ＥＲＤ、ＲＡＬ、ＹＡＬ、ＹＡＴ、ＦＡＴ、およびＹＡＳからなる群より選択されるトリペプチドであり；ここで、Ｘ_１およびＸ_２は、任意であり、存在するならば、独立して、残基がペプチド結合に連結するアミノ酸残基およびその組み合わせからなる群より選択され、そしてここで、Ｘ_１およびＸ_２は、独立して、０〜１０残基のサイズの範囲であり、その結果、Ｘ_１およびＸ_２に含まれる残基の合計が、１〜１２の範囲であり；ここで、Ｙ_１およびＹ_２は、独立して、アミノ酸残基からなる群より選択され、そしてここで、共有結合がＹ_１とＹ_２との間に形成され；そしてＺ_１およびＺ_２が、任意であり、存在するならば、独立して、残基がペプチド結合に連結するアミノ酸残基およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
本発明の他の局面において、上記調節剤をコードするポリヌクレオチドが、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞とともに提供される。
【００２１】
本発明は、さらに、上記ｄｓｇ　ＣＡＲ配列またはｄｓｃ　ＣＡＲ配列に特異的に結合し、そしてデスモソームカドヘリン媒介機能を調節する抗体またはその抗体結合フラグメントを含む調節剤を提供する。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、上に提供されるデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列の任意の１つの非ペプチド模倣物を含む調節剤を提供する。
【００２３】
特定の実施形態において、調節剤は、薬物、検出マーカー、標的薬剤および／または支持材料に連結され得る。調節剤はまた、または代替として、以下の１つ以上を含む：（ａ）ｄｓｃ　ＣＡＲ配列またはｄｓｇ　ＣＡＲ配列以外の細胞接着認識配列；および／または（ｂ）ｄｓｃ　ＣＡＲ配列またはｄｓｇ　ＣＡＲ配列以外のＣＡＲ配列に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。例えば、このような接着分子は、古典的カドヘリン、非古典的カドヘリン、インテグリン、オクルディン、クラウディン（ｃｌａｕｄｉｎ）、Ｎ−ＣＡＭ、フィブロネクチン、ラミニンまたは他の細胞外マトリクスタンパク質であり得る。
【００２４】
さらなる局面において、薬学的に受容可能なキャリアとともに、上記調節剤を含む薬学的組成物が提供される。このような組成物は、さらに、薬物ならびに／あるいは（ａ）ｄｓｃ　ＣＡＲ配列もしくはｄｓｇ　ＣＡＲ配列以外の細胞接着認識配列を含むペプチド；および／または（ｂ）ｄｓｃ　ＣＡＲ配列もしくはｄｓｇ　ＣＡＲ配列以外のＣＡＲ配列に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの１つ以上を含み得る。
【００２５】
本発明はさらに、他の局面において、１つ以上のデスモソームカドヘリン媒介機能を調節するための方法を提供する。このような方法は、一般的に、ｄｓｃ発原細胞またはｄｓｃ発現細胞を上記のような調節剤と接触させる工程を包含する。適切な細胞としては、限定しないが、上皮細胞、内皮細胞および腫瘍細胞が挙げられる。このような方法において、調節剤は、必要ではないが、上記薬学的組成物内に存在する。
【００２６】
本発明は、さらに、他の局面において、細胞接着を調節するための方法を提供し、この方法は、ｄｓｃ発現細胞および／またはｄｓｇ発現細胞を上記の調節剤または薬学的組成物と接触させる工程を包含する。このような調節剤および組成物は、細胞接着を阻害または増強し得る。
【００２７】
他の局面において、本発明は、哺乳動物においてｄｓｃ発現細胞および／またはｄｓｇ発現細胞の接着を阻害するための方法を提供し、この方法は、哺乳動物に上記調節剤を投与する工程を包含し、ここで、この調節剤は、ｄｓｃ媒介細胞接着および／またはｄｓｇ媒介細胞接着を阻害する。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物の皮膚を通る薬物の送達を増強するための方法を提供し、この方法は、哺乳動物の上皮細胞を上記薬物および調節剤と接触させる工程を包含し、ここで、この接触工程は、上皮細胞を横切る薬物の通過を可能にするのに十分な条件および時間で実施され、そしてこの調節剤は、ｄｓｇ媒介細胞接着および／またはｄｓｃ媒介細胞接着を阻害する。このような調節剤は、哺乳動物の血流に通過し得る。特定の実施形態において、調節剤は、薬物に連結される。この接触工程は、必要ではないが、調節剤および薬物を含む皮膚パッチを介して実行され得、そしてこのような皮膚パッチは、さらに本明細書中に提供される。
【００２９】
哺乳動物での血液サンプリングを容易にするための方法がさらに提供され、この方法は、哺乳動物の上皮細胞を上記調節剤と接触させる工程を包含し、ここで、この調節剤が、ｄｓｇ媒介細胞接着および／またはｄｓｃ媒介細胞接着を阻害し、そしてこの接触工程が、上皮細胞を横切る１つ以上の血液成分の通過を可能にするのに十分な条件および時間で実施される。接触工程は、調節剤および（必要に応じて）目的の血液成分を検出するための試薬を含む皮膚パッチを介して実行され得、このようなキットは、本明細書中で具体的に提供される。特定の実施形態において、上皮細胞は、皮膚細胞であるかまたは歯肉細胞である。
【００３０】
さらなる局面において、哺乳動物の腫瘍への薬物の送達を増強するための方法が提供され、この方法は、上記調節剤を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、この調節剤は、ｄｓｇ媒介細胞接着またはｄｓｃ媒介細胞接着を阻害する。適切な腫瘍としては、限定しないが、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、胃腫瘍および腎臓が挙げられ、そして調節剤は、腫瘍に局所的に投与され得るかまたは全身的に投与され得る。
【００３１】
他の局面において、本発明は、哺乳動物における癌を処置するための方法を提供し、この方法は、上記調節剤を哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、この調節剤は、ｄｓｇ媒介細胞接着またはｄｓｃ媒介細胞接着を阻害する。この哺乳動物は、癌腫、白血病または黒色腫のような癌に冒され得、この調節剤は、腫瘍にまたは全身的に投与され得る。
【００３２】
本発明は、さらに、他の局面において、デスモソームカドヘリン発現細胞におけるアポトーシスを誘導するための方法を提供し、この方法は、デスモソームカドヘリン発現細胞を上記調節剤と接触させる工程を包含し、この調節剤は、デスモソームカドヘリン媒介細胞接着を阻害する。
【００３３】
他の局面において、本発明は、デスモソームカドヘリン発現細胞の接着を増強するための方法を提供し、この方法は、ｄｓｇ発現細胞またはｄｓｃ発現細胞を上記薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、この調節剤は、ｄｓｃ媒介細胞接着またはｄｓｇ媒介細胞接着を増強し、ここで、この接触工程は、細胞の接着を検出可能に増強するのに十分な条件および時間で実施される。特定の実施形態において、このような方法における使用のための調節剤は、支持分子または固体支持体に連結される。
【００３４】
関連する局面において、本発明は、哺乳動物において創傷治癒を容易にするためおよび／または瘢痕組織を減少させるための方法を提供し、この方法は、哺乳動物における創傷を上記調節剤と接触させる工程を包含し、ここでこの調節剤は、デスモソームカドヘリン媒介細胞接着を増強する。特定の実施形態において、このような方法における使用のための調節剤は、支持分子または固体支持体に連結される。
【００３５】
他の局面において、哺乳動物に移植された外来組織の接着を増強するための方法が提供され、この方法は、哺乳動物中の外来組織の移植部位を上記調節剤と接触させる工程を包含し、この調節剤は、ｄｓｇ媒介細胞接着またはｄｓｃ媒介細胞接着を増強する。このような外来組織は、皮膚移植片または器官移植であり得る。特定の実施形態において、このような方法における使用のための調節剤は、支持体分子または固体支持体に連結される。
【００３６】
さらなる局面において、哺乳動物における自己免疫性水疱形成障害を処置するための方法が提供され、この方法は、哺乳動物に上記調節剤を投与する工程を包含し、ここで、この調節剤は、デスモソームカドヘリン媒介細胞接着を増強する。特定の実施形態において、このような薬剤は、局所的に水疱に投与され得る。このような方法における使用のための調節剤は、支持分子または固体支持体に連結され得る。
【００３７】
本発明は、さらに、サンプル中のデスモソーム発現細胞の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）サンプルを上記ｄｓｇ　ＣＡＲ配列またはｄｓｃ　ＣＡＲ配列に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと、抗体カドヘリン複合体の形成を可能にする条件および時間で接触させる工程；および（ｂ）抗体カドヘリン複合体のレベルを検出し、そしてそれからサンプル中のデスモソームカドヘリン発現細胞の存在を検出する工程を包含する。この抗体は、支持材料または検出マーカー（例えば、蛍光マーカー）に連結され得る。特定の実施形態において、この検出工程は、蛍光活性化細胞分類を使用して実行される。
【００３８】
サンプル中のｄｓｇ発現細胞またはｄｓｃ発現細胞の存在を検出するためのキットがまた提供される。このようなキットは、（ａ）デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；および検出試薬を含み得る。
【００３９】
他の局面において、本発明は、デスモソームカドヘリン媒介機能を調節し得る化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記ｄｓｇ　ＣＡＲ配列またはｄｓｃ　ＣＡＲ配列に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを試験化合物と接触させる工程；および（ｂ）試験化合物に結合する抗体またはフラグメントのレベルを検出して、そしてそれからデスモソームカドヘリン媒介細胞接着を調製し得る化合物を同定する工程を包含する。
【００４０】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明かとなる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、それぞれが個々に援用されるかのように全体において参考として本明細書によって援用される。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、デスモソームカドヘリン媒介機能（例えば、細胞接着）を調節するための方法を提供する。本発明は、デスモソームカドヘリンに存在する以前は未知であった細胞接着認識（ＣＡＲ）配列の同定に、一部基づく。調節剤は、以下に記載されるように、１以上のさらなる細胞接着分子ＣＡＲ配列を含むか、または含まない、１以上のこのようなデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列（またはそのアナログもしくは模倣物）を含み得る。ペプチドＣＡＲ配列は、線状ペプチドまたは環状ペプチド内に存在し得る。あるいは、またはさらに、調節剤は、１以上のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得、そして／または調節剤は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に特異的に結合する配列（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を含み得る。
【００４２】
一般に、デスモソームカドヘリン媒介機能を調節するために、デスモソームカドヘリンを発現する細胞は、インビボまたはインビトロのいずれかで、調節剤と接触させる。特定の局面において、本明細書中で提供される方法は、デスモソームカドヘリン媒介機能を阻害する。このような方法としては、例えば、所望されない細胞接着によって特徴付けられる疾患または他の症状を処置するための方法、または特定の組織または腫瘍への薬物送達を容易にするための方法が挙げられる。特定の方法は、細胞接着（例えば、癌細胞接着）を阻害し得る。あるいは、調節剤は、例えば、リンカーを介して、マトリクスまたは別の調節剤に連結される場合に、デスモソームカドヘリン媒介機能（例えば、細胞接着）を増強するために使用され得る。このような結合体は、例えば、創傷治癒または移植片の接着を容易にするために使用され得る。
（調節剤）
本明細書中で使用される場合、用語「調節剤」は、以下の成分の少なくとも１つを含む分子を言及する：
（ａ）デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列と少なくとも５０％同一である、線状ペプチド配列または環状ペプチド配列（すなわち、少なくとも５０％の配列同一性を保持する、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列またはそのアナログ）；
（ｂ）デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列の模倣物（例えば、ペプチド模倣物または小分子模倣物）；
（ｃ）デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に特異的に結合する物質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）；および／または
（ｄ）デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列またはそのアナログを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００４３】
調節剤は、全体として、上記エレメントの１以上からなり得るか、あるいはペプチド領域および／または非ペプイド領域をさらに含み得る。さらなるペプチド領域は、デスモソームカドヘリン（好ましくは、ＣＡＲ配列を含む細胞外ドメイン）由来であり得、そして／または異種であり得る。特定の好ましい実施形態において、調節剤は、デスモソームカドヘリン内に存在する、８５以下の連続的アミノ酸残基、および好ましくは、５０以下の連続的アミノ酸残基を含む。
【００４４】
調節剤は、デスモソームカドヘリンによって媒介された機能をさらに調製し得る。このような活性は、一般に、例えば、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して評価され得る。特定の調節剤は、デスモソームカドヘリン分子間および／またはデスモソームカドヘリンと異なる接着分子との間の相互作用を阻害する。全長デスモソームカドヘリンによって阻害される機能（例えば、細胞接着）に関して、このような調節剤は、全長デスモソームカドヘリンに比べて実質的に減少されない活性を有する機能を阻害し得る（すなわち、この調節剤は、カドヘリンを発現する細胞と接触する場合に、可溶性カドヘリンと少なくとも同程度良好に機能を阻害する）。例えば、調節剤は、デスモソームカドヘリン発現細胞の接着を防止および／または崩壊する際に、可溶性デスモソームカドヘリンと同程度有効であり得る。あるいは、デスモソームカドヘリン発現細胞の接着を増強するために、調節剤は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、および／または支持材料に連結される複数のペプチドもしくは模倣物を含む。このような調節剤は、デスモソームカドヘリン発現細胞と結合する生物学的な接着剤として機能し得、そして細胞接着の検出可能な増強（好ましくは、カドヘリンに対して固定化されたデスモソームカドヘリンまたはこのカドヘリンに対して指向された抗体について観測されたものと少なくとも同程度強力な増強）が得られるべきである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「非古典的カドヘリン」は、特徴的なカドヘリンの繰り返しを含むが、ＨＡＶ　ＣＡＲ配列を含まない、ポリペプチドを言及する。本明細書中で使用される場合、「カドヘリンの繰り返し」は、約１１０アミノ酸残基長（一般に、１００〜１２０残基、好ましくは、１０５〜１１５残基）であり、細胞外ドメインを含み、そして同一のオーダーで、ほぼ同一の位置に、３種のカルシウム結合モチーフ（ＤＸＤ、ＸＤＸＥおよびＤＸＸＤＸ；それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＳ：３３２および３３３）を含む、アミノ酸配列を言及する（例えば、図２を参照のこと）。細胞外ドメインの存在は、例えば、以下の１以上が存在するような周知の技術を使用して、一般に決定され得る：親水性配列、抗体によって認識される領域、トリプシンによって切断される領域および／またはグリコシル化モチーフを有する強力なグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）。第２のカルシウム結合モチーフは、一般に、配列ＬＤＲＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を有するが、保存的な置換基を有する配列の変異体がまた観測され、これらには、以下が挙げられる：ＭＤＲＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３４）、ＬＤＦＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３５）、ＬＤＹＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３６）、ＩＤＲＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３７）、ＶＤＲＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３８）およびＩＤＦＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３９）。ほどんどのカドヘリン繰り返し内で、この第３のカドヘリン結合モチーフは、配列［Ｌ，Ｉ，Ｖ］−Ｘ−［Ｌ，Ｉ，Ｖ］−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｎ−Ｄ−［Ｎ，Ｈ］−Ｘ−Ｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４０）を有し、ここで、括弧内に示された残基は、引用された残基のいずれか１つであり得る。好ましい第３のカルシウム結合モチーフは、配列ＤＸＮＤＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）を有するが、Ｄ残基の一方または両方は、Ｅによって置換され得る。カドヘリン繰り返し内の相同性は、ＡＬＩＧＮアルゴリズム（Ｍｙｅｒｓ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７、１９８８）によって決定されるように、一般的に、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％である。ほどんどのカドヘリンは、図１Ｂ〜１ＡＡに示されるように、原形質膜を横切る疎水性ドメイン、および必要に応じて、１つ以上の細胞質ドメインと共に、少なくとも５つのカドヘリン繰り返しを含む。しかし、時折、カドヘリンは、モチーフと結合する３つより少ないカルシウムを含む細胞外ドメインを、１以上のカドヘリン繰り返しで置換し得る。例えば、図２に示されるように、ＬＩ−カドヘリンの第２の細胞外ドメインは、第１のカルシウム結合モチーフ（ＤＸＤ）のみを含む。上記のように、異型またはＩＩ型のカドヘリンとしては、カドヘリン−５（ＶＥ−カドヘリン）、カドヘリン−６（Ｋ−カドヘリン）、カドヘリン−７、カドヘリン−８、カドヘリン−１１（ＯＢカドヘリン）、カドヘリン−１２、カドヘリン−１４、カドヘリン−１５およびＰＢ−カドヘリンが挙げられる。ＩＩＩ〜Ｘ型としては、ＬＩ−カドヘリン、Ｔ−カドヘリン、プロトカドヘリン（例えば、プロトカドヘリン４２、４３および６８）、デスモコリン（ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ）（例えば、デスモコリン１、２、３および４）、デスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）（例えば、デスモグレイン１および２）、およびカドヘリン関連ニューロンレセプターが挙げられる。
【００４６】
用語「デスモソームカドヘリン」は、デスモソームとして公知の細胞間連結内に存在する、非古典的なカドヘリンを言及する。デスモソームカドヘリンとしては、デスモグレインおよびデスモコリンが挙げられる（例えば、Ｋｉｎｇら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１８：１８５−１９４、１９９３；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１０４３８−１０４４５、１９９１；Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０５：３１４−３２１、１９９５；Ｋａｗａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６２９５−２６３０２、１９９４；Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：４７９６−４８００；およびＫｏｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５５：２００−２０８、１９９１を参照のこと）。デスモグレインおよびデスモコリンは、デスモソームを有する細胞（例えば、上皮細胞、心筋細胞および髄膜細胞）によって発現される。これらのカドヘリンは、このような細胞の細胞内接着に関連し、そしてヘテロタイプの様式で機能し得、これにより、デスモコリンのイソ型およびデスモグレインのイソ型の両方は、接着のために必要とされる。デスモグレインおよびデスモコリンは、多数の自己免疫水疱形成障害（例えば、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡および細胞間ＩｇＡ皮膚疾患）に関連し、そしていくらかのヒトの癌における発現を減少させることが示されている。公知のデスモソームカドヘリンの種々の細胞外ドメインの配列は、図２および３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ４〜４３およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ４４〜５７）に示されている。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列は、本明細書中に記載されるように、天然に存在するデスモソームカドヘリン内に存在し、そしてデスモソームカドヘリン媒介機能（例えば、細胞接着）を検出可能に調節し得る、アミノ酸配列である。言い換えれば、デスモソームカドヘリン発現細胞とＣＡＲ配列を含むペプチドとの接触により、本明細書に提供される代表的なアッセイの少なくとも１つを使用して、デスモソームカドヘリン媒介機能の検出可能な変化が生じる。ＣＡＲ配列は、一般に、デスモソームカドヘリンまたは他の接着分子（すなわち、細胞表面上のレセプターを介して細胞接着を媒介する分子）により、インビボで認識され、そして最大の異好性相互作用および／または同種親和性相互作用に必要である。ＣＡＲ配列は、任意の長さであり得るが、一般に、少なくとも３個のアミノ酸残基、好ましくは、４〜１６個のアミノン酸残基、そしてより好ましくは、５〜９個のアミノ酸残基を含む。ペプチド調節剤は、任意の数のアミノ酸残基を含み得るが、好ましい調節剤は、３〜５０個の残基、好ましくは、４〜１６個の残基、そしてより好ましくは、６〜１５個の残基を含む。
【００４８】
本発明の文脈の中で、特定の非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列は、以下のコンセンサス配列を共有することが、見出されている：
Ａａａ−Ｐｈｅ−Ｂａａ−Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｖａｌ−Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ−Ｃａａ−Ｄａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）。
【００４９】
コンセンサス配列内の、Ａａａ、Ｂａａ、ＣａａおよびＤａａは、独立して選択されたアミノ酸残基を示し、「Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｖａｌ」は、イソロイシン、ロイシンまたはバリンであるアミノ酸を示し；「Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ」は、アスパラギン酸、アスパラギンまたはグルタミン酸であるアミノ酸を示し；そして「Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｓｎ」は、セリン、トレオニンまたはアスパラギンであるアミノ酸を示す。代表的なデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列および他の非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列は、表Ｉ内に提供されている。本明細書中で具体的に提供されているＣＡＲ配列は、このような代表的なＣＡＲ配列の一部、およびこのような配列の少なくとも一部を含むより長いポリペプチドをさらに含む。さらなる非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列は、本明細書に提供されている非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列に対する配列相同性に基づいて、そして本明細書中に記載の代表的なアッセイにおける、このような配列を含むペプチドの、非古典的なカドヘリン媒介機能を調節する能力に基づいて同定され得る。特定の実施形態において、調節剤は、上記コンセンサス配列を満足するデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列の、少なくとも３個の連続する残基、好ましくは、少なくとも５個の連続する残基、およびより好ましくは、少なくとも７個の連続する残基を含む。同様に、異なる非古典的なカドヘリンのＣＡＲ配列が、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列と組み合わせて使用される場合、このようなＣＡＲ配列は、上記コンセンサス配列を満足するデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列の、少なくとも３個の連続する残基、好ましくは、少なくとも５個の連続する残基、そしてより好ましくは、少なくとも７個の連続する残基を含むべきである。
（表Ｉ代表的な非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列）
【００５０】
【表１】

非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列は、一般に、物理的に接着分子の結合部位内またはその部位近くの、カドヘリン分子内（すなわち、１０個のアミノ酸内、そして好ましくは、５個のアミノ酸内）に配置される。結合部位の配置は、一般に、周知の技術（例えば、非古典的なカドヘリンの一部の、同一の非古典的なカドヘリンまたは別の接着分子に結合する能力を評価する技術）を使用して決定され得る。任意の標準的な結合アッセイは、このような評価のために使用され得る。非古典的なカドヘリンまたは他の接着分子によるＣＡＲ配列の認識により、接着分子の機能（例えば、細胞接着）での測定可能な効果が得られる。ＣＡＲ配列を含むペプチドは、一般に、本明細書中に記載されるように連結されない場合、このような機能を阻害し、接着分子の機能のエンハンサーを形成する。
【００５１】
特定の好ましいデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列は、表Ｉに提供されるデスモグレイン配列またはデスモコリン配列の、３〜９個のアミノ酸残基を含む。例えば、ＣＡＲ配列は、表Ｉの９個のアミノ酸配列中、３、４または５個の残基を含み得る。特定の実施形態において、ＣＡＲ配列は、表Ｉの配列の少なくとも５〜７個の残基を含み得る。デスモグレインＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１以上を含み得る：ＮＱＫ、ＮＱＫＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３）、ＮＱＫＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：６４）、ＩＮＱＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６５）、ＩＮＱＫＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６）、ＩＮＱＫＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７）、ＶＩＮＱＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６８）、ＶＩＮＱＫＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６９）、ＶＩＮＱＫＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：７０）、ＦＶＩＮＱＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７１）、ＦＶＩＮＱＫＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７２）、ＦＶＩＮＱＫＴＧ（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：７３）、ＩＦＶＩＮＱＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７４）、ＩＦＶＩＮＱＫＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７５）、ＩＦＶＩＮＱＫＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６）、ＮＲＮ、ＮＲＮＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７７）、ＮＲＮＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７８）、ＩＮＲＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９）、ＩＮＲＮＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８０）、ＩＮＲＮＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１）、ＩＩＮＲＮ（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：８２）、ＩＩＮＲＮＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８３）、ＩＩＮＲＮＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８４）、ＦＩＩＮＲＮ（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：８５）、ＦＩＩＮＲＮＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８６）、ＦＩＩＮＲＮＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８７）、ＭＦＩＩＮＲＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８）、ＭＦＩＩＮＲＮＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８９）、ＭＦＩＩＮＲＮＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０）、ＮＫＤ、ＮＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１）、ＮＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９２）、ＬＮＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９３）、ＬＮＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４）、ＬＮＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９５）、ＹＬＮＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６）、ＹＬＮＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７）、ＹＬＮＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９８）、ＦＹＬＮＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９９）、ＦＹＬＮＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００）、ＦＹＬＮＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０１）、ＶＦＹＬＮＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０２）、ＶＦＹＬＮＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３）およびＶＦＹＬＮＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０４）。このような配列を有する線状ペプチドは、以下のペプチドのようにＮ−末端および／またはＣ末端で改変され得る：Ｎ−Ａｃ−ＩＦＶＩＮＱＫＴＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５）、Ｎ−Ａｃ−ＭＦＩＩＮＲＮＴＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６）およびＮ−Ａｃ−ＶＦＹＬＮＫＤＴＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０７）。
【００５２】
デスモコリンＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＥＫＤ、ＥＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８）、ＥＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９）、ＩＥＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１０）、ＩＥＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１１）、ＩＥＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２）、ＹＩＥＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１３）、ＹＩＥＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１４）、ＹＩＥＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５）、ＦＹＩＥＫＤ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１６）、ＦＹＩＥＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１７）、ＦＹＩＥＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８）、ＬＦＹＩＥＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１９）、ＬＦＹＩＥＫＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２０）、ＬＦＹＩＥＫＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１）、ＥＲＤ、ＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２２）、ＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２３）、ＶＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４）、ＶＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２５）、ＶＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２６）、ＹＶＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７）、ＹＶＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２８）、ＹＶＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２９）、ＦＹＶＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０）、ＦＹＶＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３１）、ＦＹＶＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３２）、ＬＦＹＶＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３）、ＬＦＹＶＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３４）、ＬＦＹＶＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３５）、ＩＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６）、ＩＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３７）、ＩＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３８）、ＹＩＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９）、ＹＩＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４０）、ＹＩＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４１）、ＦＹＩＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２）、ＦＹＩＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４３）、ＦＹＩＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４）、ＬＦＹＩＥＲＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５）、ＬＦＹＩＥＲＤＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４６）およびＬＦＹＩＥＲＤＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４７）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＬＦＹＩＥＫＤＴＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８）、Ｎ−Ａｃ−ＬＦＹＶＥＲＤＴＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４９）およびＮ−Ａｃ−ＬＦＹＩＥＲＤＴＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５０）におけるように、Ｎ末端および／またＣ末端で改変され得る。
【００５３】
さらなるデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列は、図３に示されるＥＣ１ドメイン由来である。デスモグレイン−１ＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＲＡＬ、ＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１）、ＲＡＬＮＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５２）、ＲＡＬＮＳＭ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５３）、ＲＡＬＮＳＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４）、ＲＡＬＮＳＭＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５５）、ＲＡＬＮＳＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５６）、ＣＲＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５７）、ＣＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５８）、ＣＲＡＬＮＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５９）、ＣＲＡＬＮＳＭ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６０）、ＣＲＡＬＮＳＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６１）、ＣＲＡＬＮＳＭＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６２）、ＣＲＡＬＮＳＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６３）、ＹＣＲＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６４）、ＹＣＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６５）、ＹＣＲＡＬＮＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６６）、ＹＣＲＡＬＮＳＭ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６７）、ＹＣＲＡＬＮＳＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６８）、ＹＣＲＡＬＮＳＭＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６９）、ＹＣＲＡＬＮＳＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７０）、ＩＹＲＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７１）、ＩＹＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７２）、ＩＹＲＡＬＮＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７３）、ＩＹＲＡＬＮＳＭ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７４）、ＩＹＲＡＬＮＳＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７５）、ＩＹＲＡＬＮＳＭＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７６）およびＩＹＲＡＬＮＳＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７７）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＩＹＲＡＬＮＳＭＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７８）およびＮ−Ａｃ−ＩＹＲＡＬＮＳＬＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７９）におけるように、Ｎ末端および／またＣ末端で改変され得る。
【００５４】
デスモグレイン−２ＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＹＡＬ、ＹＡＬＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８０）、ＹＡＬＤＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８１）、ＹＡＬＤＡＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８２）、ＹＡＬＤＡＲＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８３）、ＧＹＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８４）、ＧＹＡＬＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８５）、ＧＹＡＬＤＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８６）、ＧＹＡＬＤＡＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８７）、ＧＹＡＬＤＡＲＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８８）、ＴＧＹＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８９）、ＴＧＹＡＬＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９０）、ＴＧＹＡＬＤＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９１）、ＴＧＹＡＬＤＡＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９２）、ＴＧＹＡＬＤＡＲＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９３）、ＬＴＧＹＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１９４）、ＬＴＧＹＡＬＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９５）、ＬＴＧＹＡＬＤＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９６）、ＬＴＧＹＡＬＤＡＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９７）、ＬＴＧＹＡＬＤＡＲＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９８）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＬＴＧＹＡＬＤＡＲＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９９）におけるように、Ｎ末端および／またはＣ末端において改変され得る。
【００５５】
デスモグレイン−３ＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＲＡＬ、ＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１）、ＲＡＬＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２００）、ＲＡＬＮＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０１）、ＲＡＬＮＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０２）、ＲＡＬＮＡＱＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０３）、ＲＡＬＮＡＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０４）、ＣＲＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５７）、ＣＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５８）、ＣＲＡＬＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０５）、ＣＲＡＬＮＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０６）、ＣＲＡＬＮＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０７）、ＣＲＡＬＮＡＱＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０８）、ＣＲＡＬＮＡＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０９）、ＴＣＲＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１０）、ＴＣＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１１）、ＴＣＲＡＬＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１２）、ＴＣＲＡＬＮＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１３）、ＴＣＲＡＬＮＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１４）、ＴＣＲＡＬＮＡＱＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１５）、ＴＣＲＡＬＮＡＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１６）、ＩＴＣＲＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１７）、ＩＴＣＲＡＬＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１８）、ＩＴＣＲＡＬＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１９）、ＩＴＣＲＡＬＮＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２０）、ＩＴＣＲＡＬＮＡＬ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２１）、ＩＴＣＲＡＬＮＡＱＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２２）、ＩＴＣＲＡＬＮＡＬＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＩＴＣＲＡＬＮＡＱＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２４）およびＮ−Ａｃ−ＩＴＣＲＡＬＮＡＬＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２５）におけるように、Ｎ末端および／またＣ末端で改変され得る。
【００５６】
デスモコリン−１ＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＹＡＴ、ＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６）、ＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２７）、ＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２８）、ＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２９）、ＧＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３０）、ＧＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３１）、ＧＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３２）、ＧＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３３）、ＧＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３４）、ＡＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３５）、ＡＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３６）、ＡＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３７）、ＡＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３８）、ＡＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３９）、ＹＧＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４０）、ＹＧＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４１）、ＹＧＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４２）、ＹＧＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４３）、ＹＧＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４４）、ＹＡＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４５）、ＹＡＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４６）、ＹＡＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４７）、ＹＡＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４８）、ＹＡＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４９）、ＬＹＧＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５０）、ＬＹＧＹＡＴＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５１）、ＬＹＧＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５２）、ＬＹＧＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５３）、ＬＹＧＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５４）、ＬＹＡＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５５）、ＬＹＡＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５６）、ＬＹＡＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５７）、ＬＹＡＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５８）、ＬＹＡＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５９）、ＶＹＧＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６０）、ＶＹＧＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６１）、ＶＹＧＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６２）、ＶＹＧＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６３）、ＶＹＧＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６４）、ＶＹＡＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６５）、ＶＹＡＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６６）、ＶＹＡＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６７）、ＶＹＡＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６８）、ＶＹＡＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６９）、ＩＹＧＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７０）、ＩＹＧＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７１）、ＩＹＧＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７２）、ＩＹＧＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７３）、ＩＹＧＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７４）、ＩＹＡＹＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７５）、ＩＹＡＹＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７６）、ＩＹＡＹＡＴＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７７）、ＩＹＡＹＡＴＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７８）およびＩＹＡＹＡＴＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７９）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＬＹＧＹＡＴＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８０）、Ｎ−Ａｃ−ＬＹＡＹＡＴＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８１）、Ｎ−Ａｃ−ＶＹＧＹＡＴＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８２）、Ｎ−Ａｃ−ＶＹＡＹＡＴＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８３）、Ｎ−Ａｃ−ＩＹＧＹＡＴＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８４）およびＮ−Ａｃ−ＩＹＡＹＡＴＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８５）におけるように、Ｎ末端および／またＣ末端で改変され得る。
【００５７】
デスモコリン−２　ＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＦＡＴ、ＦＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８６）、ＦＡＴＴＰ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８７）、ＦＡＴＴＰＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８８）、ＦＡＴＴＰＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８９）、ＡＦＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９０）、ＡＦＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９１）、ＡＦＡＴＴＰ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９２）、ＡＦＡＴＴＰＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９３）、ＡＦＡＴＴＰＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９４）、ＩＡＦＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９５）、ＩＡＦＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９６）、ＩＡＦＡＴＴＰ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９７）、ＩＡＦＡＴＴＰＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９８）、ＩＡＦＡＴＴＰＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９９）、ＩＩＡＦＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３００）、ＩＩＡＦＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０１）、ＩＩＡＦＡＴＴＰ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０２）、ＩＩＡＦＡＴＴＰＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０３）、ＩＩＡＦＡＴＴＰＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０４）、ＬＩＡＦＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０５）、ＬＩＡＦＡＴＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０６）、ＬＩＡＦＡＴＴＰ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０７）、ＬＩＡＦＡＴＴＰＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０８）、ＬＩＡＦＡＴＴＰＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０９）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＩＩＡＦＡＴＴＰＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１０）およびＮ−Ａｃ−ＬＩＡＦＡＴＴＰＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１１）におけるように、Ｎ末端および／またはＣ末端で改変され得る。
【００５８】
デスモコリン−３またはデスモコリン−４ＣＡＲ配列は、例えば、以下の配列の１つ以上を含み得る：ＹＡＳ、ＹＡＳＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１２）、ＹＡＳＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１３）、ＹＡＳＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１４）、ＹＡＳＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１５）、ＡＹＡＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１６）、ＡＹＡＳＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１７）、ＡＹＡＳＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１８）、ＡＹＡＳＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１９）、ＡＹＡＳＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２０）、ＩＡＹＡＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２１）、ＩＡＹＡＳＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２２）、ＩＡＹＡＳＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２３）、ＩＡＹＡＳＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２４）、ＩＡＹＡＳＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２５）、ＬＩＡＹＡＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２６）、ＬＩＡＹＡＳＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２７）、ＬＩＡＹＡＳＴＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２８）、ＬＩＡＹＡＳＴＡＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２９）、ＬＩＡＹＡＳＴＡＤＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３０）。このような配列を有する直鎖状ペプチドは、ペプチドＮ−Ａｃ−ＬＩＡＹＡＳＴＡＤＧ−ＮＨ_２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０：３３１）におけるように、Ｎ末端および／またはＣ末端で改変され得る。
【００５９】
当業者は、類似のペプチド配列が、上記のようなＣＡＲ配列の同定の後に、他のカドヘリンによって媒介される機能を調節するように設計され得ることを認識する。
【００６０】
上記の特定のペプチド配列は、複数の非古典的なカドヘリンによって媒介される機能を調節し得ることが明らかである。一般に、デスモソームカドヘリン由来の多数の保存的残基を含むペプチドは、そのカドヘリンに対してより大きな特異性を有する。さらに、さらなる隣接配列が、特異性を増強するように含まれ得る。このような隣接配列が、図２および３に提供される配列に基づいて、または公開された配列に基づいて同定され得る。特異性（すなわち、異なるカドヘリンによって媒介される機能の調節に対して増強されるデスモソームカドヘリン機能の調節）を達成するために、２〜５個の隣接残基（好ましくは、ＣＡＲ配列のいずれかの側方の少なくとも１つの残基）の添加が、一般的に十分である。
【００６１】
上記のように、本明細書中に提供された調節剤は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のアナログまたは模倣物を含み得る。アナログは、一般的に、ネイティブなデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に対する少なくとも５０％の同一性を保持し、そして本明細書中に記載されるようなデスモソームカドヘリン媒介機能を調節する。このようなアナログは、好ましくは、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列の少なくとも３つの保存的残基およびより好ましくは少なくとも５つの保存的残基を含む。アナログは、種々のアミノ酸置換、付加、欠失、および／または改変（例えば、側鎖改変）のいずれかを含み得る。好ましいアミノ酸置換は保存的である。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー特性が実質的に変化しないことを予期する。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的な変化を表し得るアミノ酸の他の群としては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列アナログの重要な決定特徴は、デスモソームカドヘリン媒介機能を調節する能力であり、これは、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、評価され得る。
【００６２】
模倣物は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列にコンホメーション的に類似する非ペプチジル化合物であり、その結果、これは、以下に記載されるようなデスモソームカドヘリン媒介機能を調節する。このような模倣物は、ペプチドの三次元構造を評価する技術に基づいて設計され得る。例えば、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）および計算技術を使用して、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のコンホメーションを決定し得る。ＮＭＲは、ペプチジルおよび非ペプチジル化合物の両方の構造分析のために広く使用される。核オーバーハウザ増分（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）（ＮＯＥ）、カップリング定数、および化学シフトは、化合物のコンホメーションに依存する。ＮＯＥデータは、空間を介するプロトン間のプロトン間距離を提供し、そしてデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に対する最も低いエネルギーのコンホメーションを計算するために使用され得る。次いでこの情報は、好ましいコンホメーションの模倣物を設計するために使用され得る。溶液中の直鎖状ペプチドは、多くのコンホメーションで存在する。コンホメーション的な制限技術を使用することによって、活性なコンホメーションにこのペプチドを固定することが可能である。コンホメーション的な制限は、ｉ）自由な結合回転を立体的に制限するメチル基のようなアルキル基の導入；ｉｉ）末端置換基とジェミナル置換基との相対的な位置を固定する不飽和の導入；および／またはｉｉｉ）環化（これは、側鎖の相対位置を固定する）によって達成され得る。模倣物は、１つ以上のアミド結合が、同じサイズまたは体積を有するアイソスター、置換基または基（例えば、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＳＮＨ−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＯＮＭｅ−など）によって置換されている、模倣物が合成され得る。これらの骨格アミド結合はまた、環構造（例えば、ラクタム）の一部分であり得る。デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列の１つ以上の側鎖官能基が、同じサイズまたは体積を有する必要はないが、類似の生物学的応答を生成する類似の化学的および／または物理的特性を有する基によって置換される模倣物が、設計され得る。他の模倣物は、低分子模倣物であり得、これは、ＣＡＲ配列の三次元構造に基づいて、低分子ライブラリーから容易に同定され得る。以下に記載される実施形態において、アナログまたは模倣物は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列について置換され得ることが理解されるべきである。
【００６３】
調節剤またはそのペプチド部分は、直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドであり得る。用語「環状ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、以下を含むペプチドまたはその塩をいう：（１）２つの非隣接残基間の分子内共有結合および（２）少なくとも１つのデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列またはそのアナログ。この分子内結合は、骨格から骨格へ、側鎖から骨格へ、または側鎖から側鎖への結合であり得る（すなわち、直鎖状ペプチドの末端官能基および／または末端残基または内部残基の側鎖官能基が環化を達成するために連結され得る）。好ましい分子内結合としては、ジスルフィド結合、アミド結合およびチオエーテル結合が挙げれらるが、これらに限定されない。上記デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のいずれかの１つ以上、あるいはそれらのアナログまたは模倣物が、１つ以上の他の接着分子結合部位を有してかまたは有さずに、環状ペプチドに組み込まれ得る。さらなる接着分子結合部位は、以下により詳細に記載される。
【００６４】
環状ペプチド環の大きさは、一般的に、５〜約１５残基、好ましくは５〜１０残基の範囲である。さらなる残基は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のＮ末端側および／もしくはＣ末端側上に存在し得、そしてアミノ酸置換ならびに／または他の改変を伴ってかまたは伴わず、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に隣接する配列から誘導され得る。あるいは、ＣＡＲ配列の一方または両方の側方に存在するさらなる残基は、内因性配列（例えば、環化、精製、または他の操作を容易にする残基および／または標的化または他の機能を有する残基）と関係しなくてもよい。
【００６５】
特定の実施形態において、調節剤は、表Ｉに提供されるようなデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列（または、このようなＣＡＲ配列の一部分）を含む環状ペプチドを含み得る。特定の環状ペプチドは、以下の式：
【００６６】
【化７】

を有する。
【００６７】
この式において、Ｗは、ＮＱＫ、ＮＲＮ、ＮＫＤ、ＥＫＤ、ＥＲＤ、ＲＡＬ、ＹＡＬ、ＹＡＴ、ＦＡＴ、およびＹＡＳからなる群から選択されるトリペプチドであり；Ｘ_１およびＸ_２は任意であり、そして存在する場合、アミノ酸残基およびこれらの残基がペプチド結合によって連結されるそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、そしてここで、Ｘ_１およびＸ_２は、独立して、０〜１０残基の大きさの範囲であり、その結果、Ｘ_１およびＸ_２に含まれる残基の合計は、１〜１２個の範囲であり；Ｙ_１およびＹ_２は、独立して、アミノ酸残基からなる群から選択され、ここで、残基Ｙ_１とＹ_２との間に共有結合が形成され；そしてＺ_１およびＺ_２は任意であり、そして存在する場合、独立して、アミノ酸残基およびこれらの残基がペプチド結合によって連結されるそれらの組合わせからなる群から選択される。
【００６８】
環状ペプチドは、上記のＣＡＲ配列のいずれかを含み得る。このような環状ペプチドは、改変することなく調節剤として使用され得るか、または調節剤に組み込まれ得る。
【００６９】
デスモグレインＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７０】
【数１】

デスモコリンＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７１】
【数２】

デスモグレイン−１　ＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７２】
【数３】

デスモグレイン−２　ＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７３】
【数４】

デスモグレイン−３　ＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７４】
【数５】

デスモコリン−１　ＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７５】
【数６】

デスモコリン−２　ＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７６】
【数７】

デスモコリン−３またはデスモコリン−４　ＣＡＲ配列を含む代表的な環状ペプチドとしては、以下が挙げられる：
【００７７】
【数８】

上記のように、特定の好ましい調節剤は、ペプチド（デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列またはそれのアナログを含む）を含む。このペプチドのうち、少なくとも１つの末端アミノ酸残基が改変される（例えば、Ｎ末端アミノ基が、例えば、アセチル化もしくはアルコキシベンジル化によって改変され、そして／またはアミドもしくはエステルがＣ末端で形成される）。本発明に関連して、直鎖または環状ペプチド調節剤への少なくとも１つのこのような基の付加が、この因子のデスモソームカドヘリン媒介機能を調節する能力を改善し得ることが見出されている。特定の好ましい調節剤は、Ｎ末端残基およびＣ末端残基での改変体（例えば、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化）を含む。
【００７８】
本発明はさらに、他の生物体由来のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を意図する。このようなＣＡＲ配列は、本明細書中で提供される配列への類似性、およびデスモソームカドヘリン媒介機能を調節する能力に基づいて同定され得る（例えば、本明細書中に記載されるように確認され得る）。
【００７９】
特定の実施形態において、以下で議論するように、小さなＣＡＲ配列を含む環状ペプチド（例えば、重要なフランキング配列のない３残基）が、デスモソームカドヘリン媒介機能を調節するために好まれる。このようなペプチドは、Ｎアセチル基およびＣアミド基を含み得る。小さな環状ペプチドは、一般的に使用されて、以下に議論するように、このペプチドへ標的因子を連結しようとしまいと、局所投与によってかまたは全身性投与によって癌および／もしくは他の細胞型の接着を特異的に調節し得る。
【００８０】
デスモソームカドヘリン相互作用の阻害が所望される実施形態において、調節剤は、１つのデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列、または複数のＣＡＲ配列を含み得る。この配列は、いずれか（すなわち、介在配列なし）または非常に近くで（すなわち、デスモソームＣＡＲ配列間に距離（約０．１〜４００ｎｍの範囲）を与えるためにペプチドリンカーおよび／または非ペプチドリンカーによって分離される）隣接する。リンカーは、任意の分子であり得る（ペプチドおよび／または非ペプチド配列を含む）。この分子は、ＣＡＲ配列を含まず、そして少なくとも２つのペプチド配列に供給結合的に連結され得る。リンカーを使用して、ペプチドおよび他のペプチドを含むＣＡＲ配列またはタンパク質配列は、末端と末端で（すなわち、このリンカーは、各ペプチド配列のカルボキシル基もしくはアミノ基に共有結合的に結合され得る）、および／または側鎖を介して連結され得る。このような目的のために使用され得る１つのリンカーは、（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_ｎＣＯ_２Ｈ）であり、またはそれらの誘導体であり、ここでｎは１〜４の範囲である。使用され得る他のリンカーは、当業者にとって明らかである。ペプチドリンカーおよび非ペプチドリンカーは、一般的に当該分野で公知の適切な方法を使用して調節剤に組み込まれ得る。
【００８１】
デスモソームカドヘリンによって媒介される細胞接着の向上が所望される実施形態において、調節剤は、複数のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列、または上記のようにリンカーによって結合されるこのような配列に特異的に結合する抗体を含み得る。カドヘリン機能の向上のために、リンカー距離は、一般的に４００〜１０，０００ｎｍであるべきである。このような目的のために使用され得る１つのリンカーは、（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_ｎＣＯ_２Ｈ）_ｍであり、またはそれらの誘導体であり、ここでｎは１〜１０の範囲であり、ｍは１〜４０００の範囲である。例えば、グリシン（Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ）またはその多量体がリンカーとして使用され、各グリシン単位は、分子モデル技術を使用して他のアミノ酸に連結する場合、その最も低いエネルギー配座の計算によって決定されるように、２．４５オングストローム、すなわち０．２４５ｎｍの結合距離に対応する。同様に、アミノプロピオン酸は、３．７３オングストローム、アミノ酪酸は、４．９６オングストローム、アミノペンタン酸は６．３０オングストローム、そしてアミノヘキサン酸は６．１２オングストロームの結合距離に対応する。細胞接着の向上はまた、下でさらに議論するように、複数の調節剤の支持体材料への結合によって達成され得る。
【００８２】
特定の好ましい調節剤は、デスモコリンＣＡＲ配列と組み合わせてデスモグレインＣＡＲ配列を含み得る。ＣＡＲ配列が上記のようにリンカーによって結合される場合、このような因子は使用されて、例えば、種々の情況において細胞接着を促進し得る。実施例によって、このような因子は、ｄｓｃ−２　ＣＡＲ配列ＦＡＴと組み合わせてｄｓｇ−２　ＣＡＲ配列ＹＡＬを含み得た。
【００８３】
本明細書中で記載されるような調節剤は、そのうえ、１つ以上の異なる接着分子（非古典型的カドヘリンおよび他のＣＡＭを含むが、これらに限定されない）ならびに／または１つ以上の基質（例えば、このような配列に結合する抗体もしくはそのフラグメント）に対して１つ以上のＣＡＲ配列を含み得る。リンカーは、使用されて、このようなＣＡＲ配列および／またはこのＣＡＲ配列由来の抗体配列および／または各々を分離し得るが、必ずしも必要ではない。このような調節剤は、所望され得る方法内で一般的に使用されて、複数の接着分子によって媒介される機能を同時に粉砕し得る。本明細書中で使用される場合、「接着分子」は、細胞の表面上のレセプターを介して細胞接着を媒介する任意の分子である。接着分子として、細胞接着タンパク質（例えば、Ｎ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリンなどのカドヘリン遺伝子スーパーファミリーの他のメンバー）；インテグリン、細胞外マトリクスタンパク質（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、エンタクチンおよびテネイシン）；ならびに免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーの膜（例えば、Ｎ−ＣＡＭ）が挙げられる。調節剤に含まれる好ましいＣＡＲ配列としては、古典型的カドヘリンＣＡＲ配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ（ＨＡＶ）；Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）（インテグリンによって結合される（Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３１５９−６４，１９９２））；Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）（これは、α６β１インテグリンによって結合される）；ＫＹＳＦＮＹＤＧＳＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）（これは、Ｎ−ＣＡＭによって結合される）、；Ｎ−ＣＡＭ硫酸へパリン結合部位ＩＷＫＨＫＧＲＤＶＩＬＫＫＤＶＲＦ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）；推定クラウディンＣＡＲ配列ＩＹＳＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）および／またはオクルディンＣＡＲ配列ＬＹＨＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）が挙げられる。
【００８４】
調節剤に含まれる他の好ましいＣＡＲ配列としては、ＯＢ−カドヘリンＣＡＲ配列（例えば、ＤＤＫ、ＩＤＤＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＤＤＫＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＩＤＤＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＤＤＫＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＩＤＤＫＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＤＤＫＳＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＤＤＫＳＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＩＤＤＫＳＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＶＩＤＤＫ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＶＩＤＤＫＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＶＩＤＤＫＳＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＦＶＩＤＤＫ（（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＦＶＩＤＤＫＳ（（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＦＶＩＤＤＫＳＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＥＥＹ、ＩＥＥＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＥＥＹＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＩＥＥＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＥＥＹＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＩＥＥＹＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＥＥＹＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＩＥＥＹＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＩＥＥＹＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＶＩＥＥＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＶＩＥＥＹＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＶＩＥＥＹＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＦＶＩＥＥＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＦＶＩＥＥＹＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＦＶＩＥＥＹＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＥＡＱ、ＶＥＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＥＡＱＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＳＶＥＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＥＡＱＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＳＶＥＡＱＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＥＡＱＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＥＡＱＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＳＶＥＡＱＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＳＶＥＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＳＶＥＡＱＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＳＶＥＡＱＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＹＦＳＶＥＡＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＹＦＳＶＥＡＱＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）およびＹＦＳＶＥＡＱＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿））が挙げられる。
【００８５】
調節剤に含まれ得るまださらなるＣＡＲ配列は、カドヘリン−５　ＣＡＲ配列（例えば、ＤＡＥ、ＶＤＡＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＤＡＥＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＲＶＤＡＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＤＡＥＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＲＶＤＡＥＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＤＡＥＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＤＡＥＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＲＶＤＡＥＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＲＶＤＡＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＲＶＤＡＥＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＦＲＶＤＡＥＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＦＲＶＤＡＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＶＦＲＶＤＡＥＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）およびＶＦＲＶＤＡＥＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿））である。
【００８６】
リンカーを使用する場合、このような調節剤は、直鎖構造または分枝構造を形成し得る。１つの実施形態において、分枝構造を有する調節剤は、４つの異なるＣＡＲ配列（例えば、ＩＦＶＩＤＤＫＳＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．：＿）およびＨＡＶ）を含む。リンカーを介して古典型的カドヘリンＣＡＲ配列に結合されるデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含む二機能性調節剤はまた、特定の実施形態として好ましい。上記のように、リンカーは、好ましくは、０．１〜１０，０００ｎｍの範囲、より好ましくは０．１〜４００ｎｍの範囲のＣＡＲ配列間の距離を生成する。認識部位間の分離距離は、一般的に、調節剤の所望の機能に従って決定され得る。
【００８７】
調節剤内に存在するＣＡＲ配列の総数（１つ以上の異なる接着分枝由来の他のＣＡＲ配列を有しているかまたは有していないデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含む）は、１個〜多数（例えば１００個）、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個の範囲であり得る。複数のＣＡＲ配列を含むペプチド調節剤は、代表的に、６アミノ酸残基〜約１０００アミノ酸残基、好ましくは、６残基〜５０残基を含む。非ペプチドリンカーが使用され、調節剤の各ＣＡＲ配列は、一般的に３残基長〜５０残基長、好ましくは４残基〜２５残基、そしてより好ましくは、５残基〜１５残基のサイズの範囲であるペプチド内に存在する。
【００８８】
上記のように、調節剤は、ペプチド結合のみで連結されたアミノ酸残基のみを含むポリペプチドまたはそれらの塩であり得、そして、非ペプチド領域（例えば、リンカー）を含み得る。調節剤のペプチド領域は、Ｌ−アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸残基、または任意のそれらの残基の組合せを含み得る。アミノ酸は、少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つのカルボキシル基が分子内に存在する場合、天然供給源または非天然供給源由来であり得、αアミノ酸およびβアミノ酸が一般的に好まれる。一般的にタンパク質に見出される２０個のＬ−アミノ酸が、慣用的な３文字略記または１文字略記によって本明細書中で同定され、そして対応するＤ−アミノ酸は、小文字の１文字記号で示される。
【００８９】
調節剤はまた、まれなアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシリジン）、有機酸またはアミドおよび／あるいは一般的なアミノ酸の誘導体（例えば、Ｃ末端カルボキシル化エステル化（例えば、ベンジルエステル、メチルエステルもしくはエチルエステル）またはアミド化を有するアミノ酸および／あるいはＮ末端アミノ基の改変（例えば、アセチル化もしくはアルコキシカルボニル化）を有するアミノ酸、任意の広く多様な側鎖改変および／もしくは置換（例えば、メチル化、ベンジル化、ｔ−ブチル化、トシル化、アルコキシカルボニル化など）を有するかまたは有さないアミノ酸）を含み得る。好ましい誘導体は、Ｃ末端アミド基を有するアミノ酸を含む。調節剤と共に存在し得る一般的なアミノ酸以外の残基としては、２−メルカプトアニリン、２−メルカプトプロリン、オルニチン、ジアミノ酪酸、α−アミノアジピン酸、ｍ−アミノメチル安息香酸およびα、β−ジアミノプロピオン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書中で記載されるペプチド調節剤（および調節剤のペプチド部分）は、当該分野で周知の方法（化学合成および組換えＤＮＡ方法を含む）によって合成され得る。約５０残基長までの調節剤について、化学合成が、溶液または固相ペプチド合成技術を使用して実施され得る。この技術において、ペプチド結合は、水分子の放出によって他のアミノ酸のα−カルボキシ基と１つのアミノ酸のα−アミノ基との直接縮合を介して生じる。上で形成されるような直接縮合によるペプチド結合合成は、第１のアミノ酸のアミノ基および第２のアミノ酸のカルボキシル基の反応性特徴の抑制を必要とする。マスキング置換基は、不安定なペプチド分子の破壊を誘発せずに、その迅速な除去を可能にしなければならない。
【００９１】
溶液相合成において、広範な種々のカップリング方法および保護基が使用され得る（ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、「Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ」１〜４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９７９）；ＢｏｄａｎｓｋｙおよびＢｏｄａｎｓｋｙ，「Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）を参照のこと）。さらに、中間体精製および線形スケールアップが可能である。当業者は、溶液合成が、主鎖および側鎖の保護基ならびに活性化方法の考慮を必要とすることを理解する。さらに、セグメント縮合の間にラセミ化を最小化するために、注意深いセグメント選択が必要である。溶解度の考慮もまた、要因である。
【００９２】
固相ペプチド合成は、有機合成の間に支持体としての不溶性ポリマーを使用する。ポリマー支持のペプチド鎖は、中間工程での骨の折れる精製の代わりに簡単な洗浄工程およびろ過工程の使用を可能にする。固相ペプチド合成は、一般にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３の方法に従って行なわれ得るが、この方法は、保護されたアミノ酸を使用する樹脂支持体上で直鎖状ペプチド鎖をアセンブリする工程を包含する。固相ペプチド合成は、代表的にＢｏｃまたはＦｍｏｃストラテジーのいずれかを利用する。Ｂｏｃストラテジーは、１％の架橋ポリスチレン樹脂を使用する。αアミノ官能基のための標準的な保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基である。この基は、２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような強酸の希釈溶液を用いて除去され得る。次のＢｏｃ−アミノ酸は、代表的に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用してアミノアシル樹脂に結合される。アセンブリの完了後、このペプチド樹脂を、無水ＨＦで処理して、ベンジルエステル結合を切断し、そして遊離ペプチドを遊離する。側鎖官能基は、ＨＦによってまた切断されるベンジル誘導されたブロック基による合成の間に、通常ブロックされる。次いで、遊離ペプチドは、適切な溶媒を用いて樹脂から抽出され、精製され、そして特徴付けられる。新しく合成されたペプチドは、例えば、ゲルろ過、ＨＰＬＣ、分配クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製され得、そして、例えば、質量分析法またはアミノ酸配列分析によって特徴付けられ得る。Ｂｏｃストラテジーにおいて、Ｃ末端アミド化ペプチドは、ベンズヒドリルアミンまたはメチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用して得られ得、これは、ＨＦを用いる切断の際にペプチドアミドを直接生じる。
【００９３】
上記の手順において、側鎖ブロック基およびペプチド樹脂連結の選択性は、酸分解性（ａｃｉｄｏｌｙｔｉｃ）切断の速度の差異に依存する。側鎖ブロック基およびペプチド樹脂連結が、合成の各工程でα保護基を除去するために使用される試薬に対して完全に安定している、直交性（ｏｒｔｈｏｇａｎｏｌ）システムが、導入されている。これらの方法のうちで最も一般的な方法は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アプローチを包含する。この方法において、側鎖保護基およびペプチド樹脂連結は、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ基を切断するために使用される２次アミンに対して完全に安定している。側鎖保護およびペプチド樹脂連結は、穏やかな酸分解によって切断される。塩基との繰り返された接触は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を、Ｆｍｏｃ化学について不適切とし、そして樹脂に連結されたｐ−アルコキシベンジルエステルが、一般的に使用される。脱保護および切断は、一般的にＴＦＡを使用して達成される。
【００９４】
当業者は、固相合成、脱保護およびカップリングにおいて、反応が完了しなければならず、そして側鎖保護基は、全ての合成の間中安定していなければならないことを理解する。さらに、固相合成は、ペプチドが小規模で作製される場合に、一般に最も適している。
【００９５】
Ｎ末端のアセチル化は、樹脂からの切断の前に、最終ペプチドと無水酢酸とを反応させることによって達成され得る。Ｃアミド化は、Ｂｏｃ技術を使用して、メチルベンズヒドルアミン樹脂のような適切な樹脂を使用して達成され得る。
【００９６】
直鎖状ペプチドの合成後、所望の場合、当該分野で周知の種々の技術のいずれかによって、Ｎアセチル化および／またはＣアミド化を用いてかまたは用いずに、環化が達成され得る。１つの実施形態において、結合は、反応性アミノ酸側鎖間で生成し得る。例えば、ジスルフィド架橋は、種々の方法のいずれかを使用して、ペプチドの酸化によって、２つのチオール含有残基を含む直鎖状ペプチドから形成され得る。１つのこのような方法において、チオールの空気酸化は、塩基性または中性の水性培地のいずれかを使用して、何日かの期間にわたって、ジスルフィド結合を生成し得る。このペプチドは、高い希釈で使用され、凝縮および分子間副反応を最小化する。この方法は、緩徐であるという不利益に苦しむが、副産物としてＨ_２Ｏのみを生成するという利点を有する。あるいは、Ｉ_２およびＫ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６のような強酸化剤を使用して、ジスルフィド結合を形成し得る。当業者は、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓの感受性側鎖を酸化しないように注意しなければならないことを認識する。この方法によって生成される環状ペプチドは、標準的な技術を使用する精製を必要とするが、この酸化は、酸性のｐＨにおいて適用可能である。酸化剤はまた、適切なＳ保護された直鎖状前駆体の同時の脱保護／酸化が、遊離システインの成熟前の非特異的な酸化を避けることを可能にする。
【００９７】
Ｉ_２およびＫ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６とは異なり、ＤＭＳＯは、上記の求核性アミノ酸の酸化的な副反応を引き起こさない穏やかな酸化剤である。ＤＭＳＯは、全ての濃度においてＨ_２Ｏと混和性であり、そして酸化が、無害な副産物を有して、酸性ｐＨから中性ｐＨにおいて行なわれ得る。メチルトリクロロシラン−ジフェニルスルホキシドは、他の求核性アミノ酸に影響を与えることなく、Ｓ−Ａｃｍ、Ｓ−ＴａｃｍまたはＳ−ｔ−Ｂｕの同時の脱保護／酸化のために、酸化剤として代替的に使用され得る。分子間ジスルフィド結合構造から重合体産物は全く生じない。このような酸化方法における使用のための適切なチオール含有残基としては、以下を含むがこれらに限定されない：システイン、β，β−ジメチルシステイン（ペニシルアミンすなわちＰｅｎ）、β，β−テトラメチレンシステイン（Ｔｍｃ）、β，β−ペンタメチレンシステイン（Ｐｍｃ）、β−メルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）、β，β−ペンタメチレン−β−メルカプトプロピオン酸（Ｐｍｐ）、２−メルカプトベンゼン、２−メルカプトアニリンおよび２−メルカプトプロリン。このような残基を含むペプチドは、以下の代表的な式によって例示されるが、この式において、デスモソームカドヘリンはデスモグレインであり、下線部は環化され、Ｎ−アセチル基はＮ−Ａｃによって示され、そしてＣ末端アミド基はＮＨ_２によって示される：
【００９８】
【数９】

これらの代表的な式の各々において、任意の上記チオール含有残基が、示されるチオール含有残基の１つまたは両方の代わりに使用され得ることが当業者に容易に明らかである。異なる非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列を含む同様の処方物は、本明細書中に提供されるＣＡＲ配列に基づいて、当業者によって作製される。
【００９９】
別の実施形態において、環化は、アミド結合構造によって達成され得る。例えば、ペプチド結合は、末端官能基（すなわち、環化の前に直鎖状ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端）間で形成され得る。デスモグレインＣＡＲ配列を含むこのような環状ペプチドの１つは、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミドを有するかまたは有さないＩＮＱＫＴＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　）である。別のこのような実施形態において、直鎖状ペプチドは、Ｄ−アミノ酸（例えば、ＮＱＫｔＳ；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　）を含む。あるいは、環化は、ＫＮＱＫＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　）またはＫＩＮＱＫＴＧＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　）におけるように、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミドを有するかまたは有さない、１つの末端および残基の側鎖を連結することによってかまたは２つの側鎖を使用することによって達成され得る。ラクタム結合を形成し得る残基としては、リジン、オルニチン（Ｏｒｎ）、α−アミノアジピン酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸が挙げられる。
【０１００】
アミド結合を形成するための方法は、当該分野で周知であり、そして化学反応性の十分に確立された原理に基づいている。１つのこのような方法において、カルボジイミド媒介ラクタム形成は、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＡＣまたはＤＣＣＩを用いるカルボン酸の反応によって達成され得、遊離アミノ基と直ぐに反応して環化を完了し得るＯ−アシルウレアの形成を生じる。Ｏ→Ｎの転移から生じる不活性Ｎ−アシルウレアの形成は、１−ヒドロキシルベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシノルボルネンカルボキサミドまたはエチル２−ヒドロキシイミノ−２−シアノアセテートのようなＮ−ヒドロキシ化合物を用いる反応によって活性エステルにＯ−アシルウレアを変換することによって、回避され得る。Ｏ→Ｎ転移を最小化することに加えて、これらの添加物はまた、環化の間触媒として役立ち、そしてラセミ化を低下させるための補助となる。あるいは、環化は、アジ化合物方法を用いて行なわれ得、この方法において、反応性アジ化合物中間体は、ヒドラジドを介してアルキルエステルから生成される。末端エステルのヒドラジン分解は、アシル化成分における側鎖カルボキシル官能基の保護のためのｔ−ブチル基の使用を必要とする。この制限は、ジフェニルホスホリル酸（ＤＰＰＡ）を使用することによって克服され得、これは、カルボキシル基との反応の際に直接アジ化合物を提供する。アジ化合物の緩徐な反応性およびそれらの不均一化によるイソシアン塩の形成は、この方法の有用性を制限する。ラクタム形成の混合無水物方法は、反応副産物の容易な除去のために、広範に使用される。無水物は、カルボン酸アニオンのクロロギ酸アルキルまたは塩化ピバロイルとの反応の際に形成される。次いで、アミノ成分の攻撃は、アルコキシ基の電子供与効果または塩化ピバロイルｔ−ブチル基の立体的なバルク（これは、誤ったカルボニル基の攻撃を妨げる）によって、アシル化成分のカルボニル炭素に導かれる。リン酸誘導体との混合無水物はまた、首尾良く使用されている。あるいは、環化は、活性化エステルを使用して達成され得る。エステルのアルコキシ炭素の電子除去置換の存在は、アミノ分解に対するそれらの感受性を増加する。ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ化合物およびポリハロゲン化フェノールの高反応性のエステルは、アミド結合の合成において有用であるこれらの「活性エステル」を作製してきた。最近数年、有利なカップリング試薬としてのベンゾトリアゾリルオキシトリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＢＯＰ）およびその同族種の発見を目にしてきた。これらの性質は、十分に確立されたカルボジイミドアミド結合形成反応の性能に対して、一般に優れている。
【０１０１】
さらなる実施形態において、チオエーテル結合は、チオールを含む残基の側鎖と、適切に誘導されたαアミノ酸との間で形成され得る。例として、リジン側鎖は、カルボジイミド結合方法（ＤＣＣ、ＥＤＡＣ）を介してブロモ酢酸に結合し得、次いで、上に記載のチオール含有残基のいずれかの側鎖と反応してチオエーテル結合を形成する。ジチオエーテルを形成するために、任意の２つのチオール含有側鎖は、ＤＭＦ中でジブロモエタンおよびジイソプロピルアミンと反応し得る。チオールを含む結合の例は、以下に示される：
【０１０２】
【化８】

環化はまた、δ_１，δ_１−ジトリプトファン（例えば、Ａｃ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ）（配列番号：　）を用いて達成され得る。
【０１０３】
本明細書中に列挙される構造および式は、例示の目的としてのみ提供され、そして本明細書中で記載される環状ペプチドの範囲を限定することを意図されない。
【０１０４】
より長い調節剤について、組換え方法は、合成に好ましい。このような方法で、特定の宿主細胞に適切であることが当業者に公知の種々の発現ベクターのいずれかを用いて、調節剤の全てまたは一部を生きた細胞内で合成し得る。適切な宿主細胞は、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、および他の動物細胞（例えば、ハイブリドーマ、ＣＨＯ、骨髄腫）を含み得る。この様式で発現されるＤＮＡ配列は、デスモソームのカドヘリンもしくは他の接着分子の部分をコードし得るか、またはデスモソームのカドヘリンのアナログもしくはデスモソームのカドヘリンＣＡＲ配列に特異的に結合する抗体フラグメントを含むペプチドをコードし得る。このようなＤＮＡ配列は、または公知のｃＤＮＡまたは遺伝子配列に基づいて調製され得るか、公知のデスモソームのカドヘリンの配列に基づいて設計したプローブを用いて適切なライブラリーをスクリーニングすることによって単離された配列から調製され得る。このようなスクリーニングは、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９（およびこれらにおいて列挙される参考文献）において記載されるように実施され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はまた、当該分野で周知の方法においてオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、利用されて、内在性の接着分子の全てまた一部をコードする核酸分子を単離し得る。所望の調節剤をコードする核酸分子を生成するために、内在性のカドヘリン配列を周知の技術を用いて改変し得る。例えば、１つ以上のＣＡＲ配列をコードする部分を、上記のようにリンカーをコードする核酸配列によって分離することで、あるいは分離しないことで結合し得る。あるいは、所望の核酸配列の部分は、周知の技術を用いて合成され得、次いで、共に連結して、調節剤をコードする配列を形成され得る。
【０１０５】
上記のように、ポリヌクレオチドはまた、調節剤として機能し得る。一般に、このようなポリヌクレオチドは、哺乳動物への投与後に、ポリペプチド調節剤の発現を可能にするように処方されるべきである。このような処方物は、以下に記載のような治療目的に対して特に有用である。当業者は、哺乳動物においてポリヌクレオチドの発現を達成するための多くの方法が存在し、そして任意の適切な方法が用いられ得ることを理解する。例えば、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアウイルス、または他のポックスウイルス（例えば、鳥類ポックスウイルス）であるが、これらに限定されない）に取り込まれ得る。ＤＮＡをこのようなベクターに取り込むための技術は、当業者に周知である。レトロウイルスベクターは、さらに選択マーカー（トランスフェクトされた細胞の同定または選択を補助するために）および／または標的化部分（例えば、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子）に対する遺伝子を転写するか取り込み、ベクターを標的特異的にし得る。標的化はまた、当業者に公知の方法によって、抗体を用いることによって達成され得る。治療目的のポリヌクレオチドのための他の処方は、コロイド分散系（例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む））を含む。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソームである（すなわち、人工膜ビヒクル）。このような系の調製および使用は、当該分野で周知である。
【０１０６】
さらに、またはあるいは、上記のように、調節剤は、デスモソームのカドヘリンＣＡＲ配列特異的に結合する抗体またはこれの抗原結合フラグメントのような物質を含み得る。本明細書に記載される場合、物質がデスモソームのカドヘリンＣＡＲ配列を含むペプチドと検出可能なレベルで反応し、かつ異なるＣＡＲ配列あるいはカドヘリンＣＡＲ配列および／または隣接する配列におけるアミノ酸残基の順序が変化した配列を含むペプチドと検出可能に反応しない場合、物質は、（隣接するアミノ酸を伴ってか、伴わずに）配列に「特異的に結合」するといわれる。このような抗体結合特性は、一般にＥＬＩＳＡ（これは、当業者によって容易に実施され得ることが、例えば、Ｎｅｗｔｏｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ　１９７：１〜１３、１９９３に記載される）を用いて、評価され得る。
【０１０７】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、慣用的な技術を用いて、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に対して惹起され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。１つのこのような技術において、ＣＡＲ配列を含む免疫原は、最初に広範な種々の哺乳動物のいずれか（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）に注入される。より小さい免疫原（すなわち、約２０アミノ酸未満）は、キャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合されるべきである。１回以上の注入に続いて、動物は定期的に採血される。次いで、ＣＡＲ配列に特異的なポリクローナル抗体は、このような抗血清から、例えば、適切な固体支持体に結合した調節剤またはこれの抗原部分を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【０１０８】
デスモソームのカドヘリン配列に対して特異的なモノクローナル抗体を、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９、１９７６の技術、ならびにこれの改善を用いて調製し得る。簡潔には、これらの方法は、上記のような免疫された動物から得られる脾臓細胞由来の所望の特異性を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を含む。脾臓細胞は、例えば、（好ましくは、免疫された動物に同質遺伝的である）骨髄腫細胞融合パートナーと融合させることによって不死化する。単一のコロニーを選択し、そしてこれらの培養上清を、調節剤またはこれの抗原部位に対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１０９】
モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマのコロニーの上清から、収率を上げるための当該分野で公知の種々の技術を使用してか、または使用せずに、単離され得る。混入物は、慣用的技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降、および抽出）によって抗体から除去され得る。所望の活性を有する抗体は、一般に、組織片、細胞または標的カドヘリンが局在する他のサンプルの免疫蛍光分析を用いて同定され得る。
【０１１０】
特定の実施形態で、抗体の抗原結合フラグメントの使用は、好ましくあり得る。このようなフラグメントは、Ｆａｂフラグメントを含み、これは、標準的技術を用いて調製され得る。簡潔には、免疫グロブリンは、プロテインＡビーズカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって、ウサギ血清から精製され得（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８；特に３０９頁を参考のこと）、そしてパパインで消化してＦａｂおよびＦｃフラグメントを産生し得る。ＦａｂおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって、分離され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、６２８〜２９頁）。
【０１１１】
（調節剤活性の評価）
上記の調節剤は、１つ以上のデスモソームのカドヘリン媒介機能を改変し得る。このような活性の最初のスクリーニングは、当業者に公知の任意の結合アッセイを用いて、デスモソームのカドヘリンに結合する調節剤の能力を評価することによって実施され得る。例えば、Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１１：５２０〜２７、１９９１において議論されるように、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ機器を用い得る。例えば、調節剤は、デスモソームのカドヘリンに結合するＣＡＲ配列を含み得る。分子とペプチドの相互作用を測定する技術の特定の例は、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２２３４９〜２２３５４、１９９７において見出され得る。あるいは、リアルタイムＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、光学現象である表面プラズモン共鳴を用いて、生体分子の相互作用をモニターする。検出は、生物特異的界面での高分子の質量濃度における変化に依存し、これは同様に、バイオセンサーチップの表面への試験分子またはペプチド（リガンドとされる）の固定化に依存し、これに続いて、相互作用する分子（分析物とされる）のリガンドへの結合が起こる。チップへの結合は，リアルタイムに共鳴の任意の単位（ＲＵ）で測定される。
【０１１２】
例としては、表面プラズモン共鳴実験は、ＢＩＡｃｏｒｅ　Ｘ^ＴＭバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、ＢｉＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて実施され得る。ＣＭ５センサーチップの並列フローセルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中のストレプトアビジン（２００μｇ／ｍｌ）で製造者のプロトコールにしたがって、アミンカップリング方法を用いて誘導体化され得る。リガンドの約２１００〜２６００共鳴単位（ＲＵ）は、固定化され、約２．１〜２．６ｎｇ／ｍｍ^２の濃度に相当する。次いでチップは、ビオチンに誘導体化したデスモソームのカドヘリンを用いて、被覆され得る。任意の非特異的結合タンパク質は、除去される。
【０１１３】
結合を決定するため、試験分析物（例えば、デスモソームのカドヘリンＣＡＲ配列を含むペプチド）は、ランニング緩衝液中に入れられ、試験用フローセルおよびコントロール用フローセルに同時に流される。一定期間の遊離緩衝液流後に、表面に結合したままの任意の分析物は、例えば、０．１％ＳＤＳのパルスで除去され得、シグナルをベースラインまでもどす。誘導化されたセンサーチップに対する特異的な結合は、反応からコントロール用フローセルの試験用フローセルの反応を差し引くことによって、この系により自動で決定され得る。一般に、このようなアッセイにおいて、調節剤は、デスモソームのカドヘリンに、検出可能なレベルで結合する。結合のレベルは、好ましくは少なくとも、同様の条件下で全長のデスモソームのカドヘリンに対して観察されるレベルである。
【０１１４】
デスモソームのカドヘリン媒介機能を調節する能力は、一般にデスモソームのカドヘリンによって媒介される応答におけるペプチドの影響を測定するために設計された種々のインビトロアッセイのいずれかを用いて評価され得る。上記のように、調節剤は、デスモソームのカドヘリン媒介機能を増大または阻害可能であり得る。
【０１１５】
特定のデスモソームのカドヘリンは、特定の細胞型（例えば、上皮細胞）の接着に関する。細胞接着を調節する因子の能力は、一般にインビトロで、適切な細胞間での接着の影響をアッセイすることにより評価され得る。一般に、調節剤と試験細胞との接触が認識可能な細胞接着の崩壊を生じる場合、調節剤は、細胞接着のインヒビターである。これらが細胞接着を促進し得る場合（支持材料（例えば、組織培養プラスチック）に接着した調節剤に対する細胞接着を評価するプレートアッセイによって判断されるように）、細胞接着を増大する調節剤（例えば、複数のデスモソームのカドヘリンＣＡＲ配列および／または支持材料に結合したデスモソームのカドヘリンＣＡＲ配列を含む因子）は、細胞接着の調節剤として考えられる。
【０１１６】
特定の細胞接着アッセイで、デスモソームのカドヘリンを発現する細胞への調節剤の添加は、細胞接着の崩壊を生じる。本明細書で用いられる「デスモソームのカドヘリン発現細胞」は、免疫細胞化学プロトコールのような標準技術を用いて検出可能なレベルでデスモソームのカドヘリンを発現する細胞の任意の型であり得る（例えば、ＢｌａｓｃｈｕｋおよびＦａｒｏｏｋｈｉ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３６：５６４〜５６７、１９８９）。例えば、このような細胞は、調節剤の非存在下で、細胞接着を可能にする標準条件下でプレーティングされ得る。調節剤の存在下（例えば、１ｍｇ／ｍＬ）で、細胞接着の崩壊は、２４時間で可視的に（互いからおよび基層からの細胞の退縮を観察することによって）決定され得る。
【０１１７】
このようなアッセイで用いるための適切な細胞は、目的のデスモソームのカドヘリンを発現する種々の細胞のいずれかであり得る。特定の細胞は、１つ以上のカドヘリンを内在的に発現する。一般に、ＭＤＣＫ細胞またはケラチノサイトを用いて、デスモコリンまたはデスモグレイン媒介の細胞接着を評価し得る。他の細胞もまた、このようなアッセイで用いられ、目的のデスモソームのカドヘリンを発現する細胞を提供し得ることが明らかである。
【０１１８】
あるいは、カドヘリンを天然に発現しない細胞は、このようなアッセイで用いられ得る。このような細胞は、１つ以上の目的のカドヘリンをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）で安定にトランスフェクトされ得、その結果、カドヘリンは、細胞表面に発現される。例えば、上記のように、デスモグレインおよびデスモコリンの両方は、最適な細胞接着に必要とされ得、そしてこのようなアッセイは、これらのデスモソームのカドヘリンの両方をコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞を用いて実施され得る。カドヘリンの発現は、目的のカドヘリンに対して指向された抗体を用いた免疫細胞化学的技術の組み合せでトランスフェクトされた細胞の接着を評価することによって確認され得る。光学顕微鏡で判断されるように、形質転換後に凝集した安定にトランスフェクトされた細胞は、デスモソームのカドヘリンを十分なレベルで発現する。このようなアッセイでの使用に好ましい細胞は、Ｌ細胞を含み、これは、検出可能に接着せず、いずれのカドヘリンも発現しない（Ｎａｇａｆｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２９：３４１〜３４３、１９８７）。１つ以上のカドヘリンをコードするｃＤＮＡでのＬ細胞の形質転換後に、凝集が観察される。このような凝集を検出可能に阻害する調節剤を用いて、カドヘリンによって媒介される機能を調節し得る。このようなアッセイは、多くの非古典的カドヘリン（ＯＢ−カドヘリン（Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２０９２〜９８、１９９４）、カドヘリン−５（Ｂｒｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ　８７：６３０〜６４１、１９９６）、カドヘリン−６（Ｍｂａｌａｖｉｅｌｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４１：１４６７〜１４７６、１９９８）、カドヘリン−８（Ｋｉｄｏら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４８：１８６〜１９４、１９９８）、カドヘリン−１５（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１００１１〜１００１８、１９９８）、ＰＢ−カドヘリン（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１５４８〜１１５５６、１９９６）、ＬＩ−カドヘリン（Ｋｒｅｆｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３６：１１０９〜１１２１、１９９７）、プロトカドヘリン　４２および４３（Ｓａｎｏら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１２：２２４９〜２２５６、１９９３）、ならびにデスモソームカドヘリン（Ｍａｒｃｏｚｚｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１：４９５〜５０９、１９９８；Ｔｓｅｌｅｐｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：８０６４〜８０６９、１９９８）を含む）に対して用いられてきた。アッセイが、他のカドヘリンに対して同様の様式で実施され得ることは、当業者に明らかである。
【０１１９】
細胞接着アッセイに使用するための細胞のトランスフェクションは、標準技術および公開されたカドヘリン配列を用いて実施され得る。例えば、デスモソームカドヘリン配列は、本明細書中に列挙された参考文献中およびＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見出され得る。特定のデスモソームカドヘリンに関するＧｅｎＢａｎｋ受託番号としては、以下が挙げられる：Ｘ５６６５４（ヒト　デスモグレイン　１（ｈｕｍａｎ　ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　１））；Ｚ２６３１７およびＳ６４２７３（ヒト　デスモグレイン　２）；Ｘ７２９２５（ヒト　デスモコリン　１（ｈｕｍａｎ　ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ　１））；Ｘ５６８０７（ヒト　デスモコリン　２）；Ｘ８３９２９（ヒト　デスモコリン　３）；ならびにＤ１７４２７（ヒト　デスモコリン　４）。
【０１２０】
例として、デスモソームカドヘリン媒介機能を阻害する能力について調節剤を評価するためのアッセイは、細胞の単層を横切る電気抵抗に対する調節剤の影響を評価し得る。例えば、Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙのイヌの腎臓（ＭＤＣＫ）細胞は、培地に溶解した調節剤（例えば、２４時間の０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度）に曝され得る。電気抵抗に対する影響は、標準技術を用いて測定され得る。このアッセイは、上皮細胞における密接な接合部形成に対する調節剤の影響を評価する。一般に、５００μｇ／ｍＬの調節剤の存在が、２４時間後の統計学的に有意な電気抵抗の減少を生じる。
【０１２１】
他のアッセイは、標準技術を用いた、細胞接着の視覚的評価に関する。一般的に、特定のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列由来の調節剤（すなわち、このようなＣＡＲ配列、またはそのアナログもしくは模倣物、あるいはこのようなＣＡＲ配列を特異的に認識する抗体）、および類似のデスモソームカドヘリンを発現する細胞の接着を検出可能に調節する調節剤は、デスモソームカドヘリンによって媒介される機能を調節すると考えられる。
【０１２２】
他のアッセイを使用して、特異的なデスモソームカドヘリン媒介機能に対する調節剤の影響を評価し得る。例えば、デスモグレインとデスモコリンとの相互作用を阻害する調節剤は、皮膚透過性を増大させ得る。この能力は、例えば、接着上皮細胞層および／または接着内皮細胞層（例えば、ヒトの皮膚）の透過性に対する調節剤の影響を評価することによって、評価され得る。このような皮膚は、天然の供給源由来であり得るか、または合成の供給源由来であり得る。このようなアッセイに使用するためのヒトの腹部の皮膚は、一般的に、死から２４時間以内に検死解剖されたヒトから獲得され得る。簡潔には、調節剤（例えば、５００μｇ／ｍｌ）および試験マーカー（例えば、蛍光マーカーＯｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ^ＴＭおよびＲｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ　Ｄｅｘｔｒａｎ）は、滅菌緩衝液（例えば、ホスフェート緩衝液、ｐＨ７．２）中に溶解され得、そして皮膚を通ってレセプター流体内（例えば、リン酸緩衝液）に浸透するマーカーの能力が、Ｆｒａｎｚ　Ｃｅｌｌ装置を使用して測定され得る（Ｆｒａｎｚ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７：５８〜６８，１９７８；Ｆｒａｎｚ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６４：１９０〜１９５，１９７５）。皮膚を通るマーカーの透過は、例えば、実験開始から６時間、１２時間、２４時間、３６時間または４８時間後に評価され得る。一般的に、ヒトの皮膚の透過性を増大させる調節剤は、５００μｇ／ｍＬの調節剤の存在下で６〜４８時間後のレセプター画分におけるマーカー量を統計学的に有意に増加させる。
【０１２３】
（調節剤修飾および処方物）
本明細書中に記載されるような調節剤は、１つ以上のさらなる分子に連結し得るが、その必要はない。詳細には、以下で議論されるように、複数の調節剤（これらは、同一であり得るが、その必要はない）を、支持体物質（例えば、単分子（例えば、キーホールカサガイヘモシニアン））、あるいは固体支持体（例えば、重合体マトリクス（これは、超薄膜のような膜または微細構造として処方され得る）、容器表面（例えば、組織培養プレート表面または生物反応器の内部表面）、あるいはビーズまたは他の粒子（これは、ガラス、プラスチックまたはセラミックを含む種々の物質から調製され得る）に連結することは、特定の適用のために有益であり得る。特定の適用について、生分解性支持体物質は、例えば、セルロースおよびその誘導体、コラーゲン、クモ糸状絹（ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ）または種々のポリエステル（例えば、ヒドロキシ酸および／またはラクトン由来のポリエステル）のいずれか、あるいは縫合糸（米国特許第５，２４５，０１２号を参照のこと）が好ましい。特定の実施形態内において、調節剤および他のＣＡＲ配列を含む分子（例えば、ＨＡＶもしくはＲＧＤ配列、または上記のようなＯＢ−カドヘリンもしくはカドヘリン−５　ＣＡＲ配列）は、好ましくは代替のパターンにおいて、重合体マトリクスのような支持体に連結され得る。
【０１２４】
調節剤を支持体物質に結合する適切な方法は、この支持体の組成および意図される用途に依存し、そして当業者に容易に明らかである。連結は、一般に、非共有会合（例えば、吸着または親和力）を介してか、または好ましくは、共有連結（これは、調節剤と支持体の官能基との間の直接結合であるか、または架橋剤による連結であり得る）を介して達成され得る。吸着による調節剤の結合は、適切な緩衝液中で、適切な時間、固体支持体と接触させることによって達成され得る。この接触時間は、温度に伴って変化するが、一般には、約５秒と１日との間であり、そして代表的には、約１０秒と１時間との間である。
【０１２５】
分子または固体支持体への調節剤の共有連結は、一般には、支持体物質と二官能性試薬（これは、調節剤のヒドロキシル基またはアミノ基のような官能基ともまた反応する）とを最初に反応させることによって達成され得る。例えば、調節剤は、ポリマー支持体のアルデヒド基と調節剤のアミンおよび活性水素との縮合によってか、または支持体のアミノ基と調節剤のカルボン酸との縮合によって、ベンゾキノンを用いてポリマー支持体またはコーティングに結合され得る。連結を生じさせる好ましい方法は、グルタルアルデヒドを用いてアミノ基を介す。調節剤は、エステル結合を介してセルロースに連結され得る。同様に、アミド結合は、キーホールカサガイヘモシニアンのような他の分子または他の支持体物質に連結するのに適切であり得る。複数の調節剤および／または他のＣＡＲ配列を含む分子は、例えば、ランダムなカップリング（ここで、このような等モル量の分子が、マトリクス支持体と混合され、そしてランダムに結合するのを可能にする）によって結合され得る。
【０１２６】
本明細書中に記載されるような調節剤は、優先的に、特定の組織または細胞に結合し得、従って、インビボでの所望の部位を標的化するのに十分であり得るが、特定の適用のために、さらなる標的化剤を含むことが有益であり得る。従って、標的化剤はまた、またはあるいは、調節剤に結合して、１つ以上の特定の組織を標的化するのを容易にし得る。本明細書中で使用される場合、「標的化剤」は、調節剤に結合する場合に、調節剤の標的細胞への輸送を増大し、それによってこの調節剤の局所濃度を増加させる任意の物質（例えば、化合物または細胞）であり得る。標的化剤としては、抗体またはそれらのフラグメント、レセプター、リガンドおよび標的組織の細胞に結合するか、または標的組織の近傍に結合する他の分子が挙げられる。公知の標的化剤としては、血清ホルモン、細胞表面抗原に対する抗体、レクチン、接着分子、腫瘍細胞表面結合リガンド、ステロイド、コレステロール、リンホカイン、線維素溶解性酵素ならびに所望の標的部位に結合するそれらの薬物およびタンパク質が挙げられる。多数のモノクローナル抗体の中で、標的化剤として作用し得るモノクローナル抗体は、抗ＴＡＣ、または他のインターロイキン−２レセプター抗体；９．２．２７およびＮＲ−ＭＬ−０５（２５０キロダルトンのヒト黒色腫に関連するプロテオグリカンと反応的である）；ならびにＮＲ−ＬＵ−１０（汎癌（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）糖タンパク質と反応的である）である。抗体標的化剤は、インタクトな（全ての）分子、そのフラグメントまたはその機能的等価物であり得る。抗体フラグメントの例は、Ｆ（ａｂ’）２、−Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ［ｖ］フラグメントであり、これらは、従来の方法によってか、またはゲノム工学もしくはタンパク質工学によって生成され得る。結合は、一般的に、共有結合であり、そして例えば、直接的な縮合もしくは他の反応によってか、または二官能性リンカーもしくは多官能性リンカーによって達成され得る。
【０１２７】
特定の実施形態について、薬物を調節剤に連結することがまた、またはあるいは有益であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「薬物」は、哺乳動物に投与して、疾患または他の望ましくない状態を防止または処置することが意図される、任意の生物活性剤をいう。薬物としては、ホルモン、増殖因子、タンパク質、ペプチドおよび他の化合物が挙げられる。本発明の文脈中のある特定の薬物の使用が、以下で議論される。
【０１２８】
本明細書中に記載されるような調節剤は、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアまたは生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、１つ以上の調節剤を含有する。このような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート化剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／あるいは保存剤、を含有し得る。なお他の実施形態内において、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。１つ以上の調節剤（単独でか、または標的化剤および／もしくは薬剤と組み合わせて）は、周知の技術を使用して、リポソーム内にカプセル化され得るが、その必要はない。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所的投与、経口投与、鼻内投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与）で処方され得る。
【０１２９】
特定の実施形態について、以下に記載されるように、薬学的組成物は、特定のデスモソームカドヘリン以外の、１つ以上の分子によって媒介される細胞接着の修飾因子をさらに含有し得る。このような修飾因子は、一般に、１つ以上のＣＡＲ配列および／またはそれに対する抗体を使用して、上記のように調製され得る。このような組成物は、複数の細胞接着分子（例えば、古典的カドヘリン（例えば、Ｎ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリン）；非古典的カドヘリン、インテグリン；オクルディン；クラウディン；Ｎ−ＣＡＭおよび／または細胞外マトリクスタンパク質（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、エンタクチンおよびテネイシン）のようなカドヘリン遺伝子スーパーファミリーの他のメンバー）によって媒介される細胞接着を阻害することが望まれる状況で、特に有用である。
【０１３０】
薬学的組成物はまた、またはあるいは、１つ以上の薬物を含み得、この薬物は、調節剤に連結し得るか、またはこの組成物内で遊離状態であり得る。実質的に、任意の薬物は、以下に記載されるような種々の目的のために、本明細書中に記載されるような調節剤と組み合わせて投与され得る。調節剤と共に投与され得る薬物型の例としては、以下が挙げられる：鎮痛薬、麻酔薬、抗狭心症薬、抗真菌薬、抗生物質、抗癌剤（例えば、タキソールまたはマイトマイシンＣ）、抗炎症薬（例えば、イブプロフェンおよびインドメタシン）、駆虫薬、抗鬱薬、解毒薬、制吐剤、抗ヒスタミン薬、抗高血圧薬、抗マラリア薬、微小管阻害薬（例えば、コルヒチンまたはビンカアルカロイド類）、抗片頭痛剤（ａｎｔｉｍｉｇｒａｉｎｅ　ａｇｅｎｔ）、抗菌剤、抗精神病薬（ａｎｔｉｐｈｓｙｃｈｏｔｉｃ）、解熱剤、防腐薬、抗シグナル送達剤（ａｎｔｉ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（例えば、タンパク質キナーゼＣインヒビターまたは細胞内カルシウム動員のインヒビター）、抗関節炎薬、抗トロンビン剤、抗結核薬、鎮咳薬、抗ウイルス剤、食欲抑制剤、心臓作用薬、化学依存性剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ　ｄｒｕｇ）、瀉下薬、化学療法薬剤、冠動脈、大脳または末梢神経の血管拡張薬、避妊薬、抑制剤、利尿薬、去痰薬、増殖因子、ホルモン剤、催眠薬、免疫抑制剤、麻薬拮抗薬、副交感神経作動薬、鎮痛剤、興奮剤、交感神経模倣薬、毒素（例えば、コレラ毒素）、精神安定薬および尿抗感染薬（ｕｒｉｎａｒｙ　ａｎｔｉｉｎｆｅｃｔｉｖｅ）。
【０１３１】
画像化目的のために、種々の診断剤のいずれかが、調節剤に連結されるかまたはこの組成内で遊離状態のいずれかで薬学的組成物に組み込まれ得る。診断剤としては、患者内部の生理学的機能を解明するために投与されるが、他の生理学的機能を、一般的に無影響のままにする任意の物質が挙げられる。診断剤としては、以下が挙げられる：金属、放射活性同位体および放射線不透物質（ｒａｄｉｏｏｐａｑｕｅ　ａｇｅｎｔ（例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素およびリン含有化合物）、放射線透過剤、造影剤、色素（例えば、蛍光色素および発色団）および比色定量反応または蛍光定量反応に触媒作用を及ぼす酵素。一般に、このような因子は、上記のような種々の技術を使用して結合され得、そして任意の配向で存在し得る。
【０１３２】
本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に調節剤の緩やかな放出をもたらすカプセルまたはスポンジのような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術を用いて調製され得、そして例えば、経口移植、直腸移植もしくは皮下移植によってか、または所望の標的部位での移植によって投与され得る。除放性処方物は、キャリアマトリクス中に分散され、そして／または律速膜によって囲まれたレザバ中に含まれた調節剤を含み得る（例えば欧州特許出願７１０，４９１　Ａを参照のこと）。このような処方物内で使用するためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生体分解性でもあり得る；好ましくは、この処方物は、調節剤の比較的一定の放出レベルを提供する。除放性処方物内に含まれる調節剤の量は、移植部位、放出速度および放出の予測される持続時間、ならびに処置または防止されるべき状態の性質に依存する。
【０１３３】
本発明の薬学的組成物は、処置（または予防）されるべき疾患に適切な様式で投与され得る。適切な投与量および適した持続時間ならびに投与の頻度は、その患者の状態、その患者の疾患の型および重症度ならびに投与の方法のような要素によって決定され得る。一般に、適切な投与量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利益を提供するのに十分な量で調節剤を提供する。本発明の特に好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるような調節剤または薬学的組成物は、毎日の単回投与または複数回投与のレジメンにおける、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で投与され得る。局所投与について、クリームは、代表的に０．００００１％〜１％、好ましくは０．０００１％〜０．００２％の範囲の量の調節剤を含む。流体組成物は、代表的に、約１０ｎｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０μｇ〜２ｍｇ／ｍＬの調節剤を含む。適切な投与量は、一般に、実験モデルおよび／または臨床試験を使用して決定される。一般に、効果的な治療を提供するのに十分な、最低投与量の使用が好ましい。患者は、一般に処置または予防される状態のために適したアッセイを使用して治療効果についてモニターされ得、これは当業者に公知である。
【０１３４】
（調節剤の方法の使用）
一般に、本明細書中に記載される調節剤および組成物は、デスモソームカドヘリン発現細胞の、細胞接着のような機能を調節するために使用され得る。このような調節は、インビボおよび／またはインビトロで、好ましくはヒトのような哺乳動物で、この調節剤とデスモソームカドヘリン発現細胞とを接触させる任意の方法を使用して実行され得る。上述のように、デスモソームカドヘリン介在細胞接着の破壊に関する目的のための調節剤は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列、複数デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を密接して近位に、および／またはデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を認識する物質（例えば、それらの抗体または抗原結合フラグメント）を含み得る。他の接着分子によって介在される細胞接着を破壊することがまた望ましい場合、調節剤はさらに、このような接着分子により結合される１つ以上のＣＡＲ配列（および／またはこのような配列に結合する、それらの抗体またはフラグメント）を含み得、好ましくは、リンカーによってお互いに分離し、そしてデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列から分離される、１つ以上のＣＡＲ配列を含み得る。上述のように、このようなリンカーは、１つ以上のアミノ酸を含んでも良いし、含まなくても良い。細胞接着を増強するために、調節剤は、１つ以上のデスモソームカドヘリンまたは抗体（もしくはフラグメント）に由来する複数のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列、好ましくはリンカーによって分離されるデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含み得、そして／または単分子か、または上記のような支持材料に結合され得る。他の接着分子によって介在される細胞接着を増強することがまた所望される場合、調節剤は、このような接着分子によって結合される１つ以上のＣＡＲ配列（および／またはこれらの配列に結合する、それらの抗体またはフラグメント）、好ましくは、お互いに分離され、そしてリンカーによってデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列から分離されるＣＡＲ配列をさらに含み得る。
【０１３５】
本明細書中に記載されるような細胞接着の破壊を含む特定の方法は、腫瘍細胞接着を遮断することにおいて先行技術を越える利点を有する。以下により詳細に記載されるように、本明細書中に記載されるような調節剤はまた、種々の他の文脈において、細胞接着を破壊または増強するために使用され得る。本明細書中に記載されるそれぞれの方法において、１つ以上の調節剤は一般に、単独で投与されても良いし、または薬学的組成物中で投与されても良い。本明細書中に記載されるそれぞれの特異的な方法において、上記のように、標的因子が使用されて、その標的部位で調節剤の局所濃度を増加させ得る。
【０１３６】
１つの局面において、細胞接着が減少される方法が提供される。このような１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載されるような調節剤を投与することによって、哺乳動物において望まない細胞接着を減少するための方法を提供する。望まない細胞接着は、例えば、腫瘍細胞との間か、腫瘍細胞と正常細胞との間か、あるいは手術、損傷、化学療法、疾患、炎症、または細胞成長度もしくは機能を危機にする他の状態の結果としての正常細胞との間で生じ得る。１つの特に好ましい実施形態において、調節剤はさらに、複数の接着分子によって介在される細胞接着を破壊し得る。このような因子には、１つ以上のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に加えて、古典的なカドヘリンＣＡＲ配列ＨＡＶ配列のようなＣＡＲ配列、ＲＧＤ配列が挙げられ得、これは、インテグリン、ＯＢ−カドヘリンまたは上記のようなカドヘリン−５ＣＡＲ配列、咬合ＣＡＲ配列ＬＹＨＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＿）および／またはクラウディン（ｃｌａｕｄｉｎ）ＣＡＲ配列ＩＹＳＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＿）により結合され、好ましくはリンカーを介してデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列から分離される。あるいは、他の接着分子によって介在される細胞接着の分離修飾因子は、調節剤と結合して、同じ薬学的組成物と一緒にかまたは別々のいずれかで投与され得る。
【０１３７】
調節剤の局所的な投与は一般に好ましいが、しかし他の手段もまた使用され得る。好ましくは、局所投与のための流体組成物（例えば、生理学的な生理食塩水を含む）は、上記の量の調節剤を含み、そしてより好ましくは、１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの量を含む。クリームは、一般に上記のように処方され得る。手術領域における局所投与は、創傷の潅水すなわち、手術後に外科的なドレインを伴う断続的もしくは連続的な潅水によってか、または手術が実行される必要のない場合、炎症の領域、損傷もしくは疾患において特異的に挿入されるドレインの使用によって、手術の目的で１度に与えられ得る。あるいは、非経口的または経皮的な投与もまた、同様の結果を達成するために使用され得る。
【０１３８】
本明細書中で提供されるような特定の調節剤を使用して、経皮的な薬物送達を促進し得る。薬物の経皮的な送達は、薬物の相対的な定常血液レベルを維持するために使用され得る簡便でかつ非侵襲性方法である。一般に、皮膚を介する薬物送達を促進するために、上皮細胞（ケラチノサイト）と微小血管の内皮細胞との間の接着をかき乱す必要がある。現在利用可能な技術を使用して、小さく、非荷電の分子のみが、インビボで皮膚を横切って送達され得る。本明細書中に記載される方法は、同程度の限定に供されない。従って、種々広範の薬物は、全身性または局所的投与のために、皮膚の上皮細胞層および内皮細胞層を横切って輸送され得る。このような薬物は、黒色腫に送達されても良いし、または身体中のほかの部位に送達するために哺乳動物の血流中に入れられても良い。
【０１３９】
皮膚を通る薬物の送達を増強するために、本明細書中に記載されるような調節剤および薬物が、皮膚表面と接触される。複数の非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列を含む多機能な調節剤（例えば、ＯＢ−カドヘリンまたはカドヘリン−５に由来するＣＡＲ配列との組み合わせにおけるデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列）もまた、使用され得る。このような調節剤はまた、もしくはあるいは、古典的カドヘリンＣＡＲ配列ＨＡＶ、フィブロネクチンＣＡＲ配列ＲＧＤを含み得、これはインテグリン、および／または咬合ＣＡＲ配列ＬＹＨＹ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＿）によって認識され得る。あるいは、細胞接着の分離修飾因子は、調節剤と組み合わせて、同じ薬学的組成物でかまたは別々にかのいずれかで、投与され得る。
【０１４０】
接触は、調節剤の直接的な適用によって、一般にクリームもしくはゲルとして処方される組成物中で、または経皮適用のための種々の皮膚接触デバイス（欧州特許出願第５６６，８１６Ａ号；米国特許第５，６１３，９５８号；米国特許第５，５０５，９５６号に記載されるようなデバイス）のいずれかを使用して、達成され得る。皮膚パッチは、投与の簡便な方法（特に徐放性処方のため）を提供する。このようなパッチは、薬物が拡散する皮膚を通る膜によって、この皮膚から分離される調節剤および薬物の貯蔵庫を含み得る。他のパッチの設計において、この調節剤および薬物は、ポリマーまたは接着性マトリクス中に溶解または懸濁され得、このポリマーまたは接着性マトリクスは次いで、患者の皮膚と直接接触して配置される。次いで、この調節剤および薬物は、マトリクスから皮膚中に拡散し得る。調節剤および薬物は、同じ組成物もしくは皮膚パッチ中に含まれていても良いし、または別々に投与されても良いが、同時でかつ同じ部位での投与が好ましい。一般に、皮膚を介して投与される調節剤の量は、処置または予防され得る状態の性質で変化するが、上記のように変化し得る。このようなレベルは、使用されるデバイスに対する適切な調整によってか、または上記のように処方されるクリームを適用することによって達成され得る。皮膚を横切り標的組織への薬物の伝達は、例えば、Ｆｒａｎｚ細胞装置を使用するインビトロ研究に基づいて予想され得、そして当該分野で明らかである適切な手段によってインビボで評価され得る。例として、時間経過にわたって投与された薬物の血清レベルをモニターすることは、皮膚を横切る薬物の容易な伝達の測定を提供する。
【０１４１】
本明細書中に記載される経皮的な薬物の伝達は、薬物伝達の一定の速度が所望される場合、薬物の血液レベルの変動を避けるために特に有用である。例えば、モルヒネは、通常は手術後直ちに使用される鎮痛薬である。非経口的形態（筋肉内、静脈内）で断続的に与えられる場合、患者は通常、最初の１時間の間眠気を感じ、続く２時間の間は良くなり、そして最後の時間の間は痛みである。なぜなら血液レベルが注射後に急激に上昇し、そして再注射が達成されるための４時間の間隔の前に、所望されるレベル未満まで減少するからである。本明細書中に記載される経皮的な投与は、長時間（例えば、日）の一定レベルの維持を可能にし、これは適切な痛みのコントロールおよび同時に精神的な敏捷性を可能にする。インスリンは、別のこのような例を提供する。多くの糖尿病患者が、インスリンの一定の基底レベルの維持を必要とし、このインスリンレベルは食事の時間でその必要性が異なる。この基底レベルは、本明細書中に記載されるように、インスリンの経皮投与を使用して維持され得る。抗生物質はまた、一定速度で投与され得、適切な細菌血液レベルを維持し、一方毒性についてしばしば応答する高レベル（例えば、代表的に腎臓毒性を生じるあまりに高いゲンタマイシンのレベル）を避ける。
【０１４２】
本発明の方法による薬物伝達はまた、薬物投与のより簡便な方法を提供する。例えば、非経口的な薬物を、新生児および乳児に投与することは、カテーテルを入れる受容可能な口径の血管を探すことに関する困難性に起因して、しばしば特に難しい。しかし、新生児および乳児はしばしば、大人と比較して比較的広い皮膚面積を有する。経皮的薬剤伝達は、このような患者のより簡単な管理を可能にし、そして現在病院でのみ与えられ得るケアの特定の型を、家で与えることを可能にする。代表的に、静脈にカテーテルを入れることに同様の困難性を有する患者は、化学療法を受ける患者または透析を受ける患者である。さらに、長期治療を受ける患者について、本明細書中に記載されるような経皮的な投与は、非経口的な投与よりも、より簡便である。
【０１４３】
本明細書中に記載の経皮的投与はまた、非経口的な使用が実用的でない状況において、胃腸管が回避されることを可能にする。例えば、治療的小ペプチドおよび治療的タンパク質（これらは、代表的には胃腸管で消化される）の投与に適した方法に対する要求が増している。本明細書中に記載の方法は、このような化合物の投与を可能にし、そして長期間に及ぶ容易な投与を可能にする。薬物摂取を制限する長期間の腸閉塞または特定の胃腸管疾患に起因するそれらの胃腸管からの吸収に関する問題を有する患者はまた、本明細書中に記載の経皮的適用のために処方された薬物からの利益を得得る。
【０１４４】
さらに、コンプライアンスを維持することが困難な多くの臨床的な状況が存在する。例えば、精神的問題を抱えた患者（例えば、アルツハイマー疾患または精神病の患者）は、１日の特定の時間に彼らの医薬品を摂取する能力に依存する必要はなく薬物の定常的な送達速度が提供される場合に、より容易に管理される。処方された薬物を摂取することを単に忘れる患者はまた、周期的（例えば、３日おき）に皮膚用パッチ剤を単に身につけ無ければならない場合、より忘れにくくなる。高血圧患者のような症状がない疾患を抱えた患者は特に、彼らに処方された医薬品を摂取することを忘れる恐れがある。
【０１４５】
複数の薬物を摂取する患者にとって、皮膚用パッチ剤のような経皮的適用に対するデバイスは、頻繁に一緒に使用される薬物の組合せで処方され得る。例えば、多くの心不全患者は、ジゴキシンをフロセミドと組み合せて与えられる。単一の皮膚用パッチ剤中への両方の薬物の組合せは、投与を促進して、誤用による危険を減少させ（適切な時間に正しい丸剤を摂取することはしばしば、老人にとって困惑することである）、「大変多くの丸剤」を摂取するという心理的緊張を減少し、不規則な活動に起因して投薬量を抜かしてしまうことを減少し、そしてコンプライアンスを改善する。
【０１４６】
本明細書中に記載の方法は、特にヒトに対して適用可能であるが、しかしまた、様々な獣医学的な使用もある（例えば、（例えば、受胎制限のため）動物への成長因子またはホルモンの投与）。
【０１４７】
上記のように、広範な種々の薬物が本明細書中に提供された方法に従って、投与され得る。経皮的に投与され得る薬物カテゴリーのいくつかの例は、（例えば、関節炎および他の状況における）抗炎症薬剤（例えば、全てのＮＳＡＩＤ、インドメタシン、プレドニゾン等）；モルヒネ、コデイン、Ｄｅｍｅｒｏｌ、アセトアミノフェン（ａｃｅｔｏａｍｉｎｏｐｈｅｎ）およびこれらの組み合わせ（例えば、コデインにアセトアミノフェンに加えたもの）を含む鎮痛薬（特に経口吸収が可能でない場合（例えば、手術後）、および非経口投与が簡便でないかまたは所望されない場合）；抗生物質（例えば、バンコマイシン（これはＧＩ管によって吸収されず、そしてしばしば静脈内に与えられる）または（例えば、結核に対する）ＩＮＨとリファンピシンとの組合せ）；抗凝固薬（例えば、ヘパリン（これは、ＧＩ管に十分に吸収されず、一般に非経口的に与えられ、高レベルにおける出血の危険性の増大および低レベルにおける無効能の危険性を伴う血液レベルにおける変動を生じる）およびワルファリン（これは、ＧＩ管によって吸収されるが、外科手術の手順後の正常な腸閉塞のために腹部の外科手術直後に投与され得ない））；（例えば、コンプライアンスがアルツハイマー疾患におけるように重要な問題である状況においてか、または安定な血液レベルを維持することが抗コリン作用副作用の有意な減少および患者における良好な耐性を生じるような場合における）抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎ）、イミプラミン、プロザック（ｐｒｏｚａｃ）等）；（例えば、コプライアンスを改善し、そして血液レベルの変動に関する副作用を減少するための）抗高血圧薬（例えば、利尿薬およびβブロッカー（これは同じパッチで投与され得る；例えば、フロセミドおよびプロパノールオール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）））；（例えば、コンプライアンスを促進し、介護者および家族の構成員が、この薬物が投与されたことを確認することを容易にするための）抗精神病薬（例えば、ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）およびクロルプロマジン）；ならびに（例えば、経口投与後の高い血液レベルに関連する機敏性の減少を避けるための、および治療レベルを一定に維持することによって１日を通して連続的な利益を可能にするための）抗不安薬または鎮静薬。
【０１４８】
天然に存在するホルモンおよび合成ホルモン、増殖因子、タンパク質およびペプチドを含む多くの他の薬物を本明細書中に記載のように投与し得る。例えば、インシュリンおよびヒト成長ホルモン、エリトロポイエチンのような増殖因子、インターロイキンならびにインターフェロンが、皮膚を介して送達され得る。
【０１４９】
哺乳類の皮膚を介する薬物の投与のためのキットはまた、本発明において提供される。このようなキットは、１つ以上の調節剤と組合せてかまたは１つ以上の調節剤を染み込ませた、経皮投与のためのデバイス（例えば、皮膚用パッチ剤）を一般的に含む。薬物がさらにこのようのキットに含まれ得る。
【０１５０】
関連する局面において、本明細書中に記載のされたを調節剤は内皮細胞層および上皮細胞層の透過性を増大するために使用され得、これらによって受動的な拡散による血液画分のサンプリングを促進する。このような方法は、血液中を循環する特定分子のレベルの検出および／または測定を可能にする。一般に、血液画分をサンプリングするために、微小血管の、上皮細胞（ケラチノサイト）と内皮細胞との間の付着に摂動を与えることが必要である。現在利用可能な技術を用いて、小さい、非荷電分子のみがインビボの皮膚を通して検出され得る。本明細書中に記載の方法は、同程度の限界に供さない。従って、広範な種々の血液成分が上皮細胞層と内皮細胞層とを通してサンプリングされ得る。このようなサンプリングは、任意のこのような細胞層（例えば、皮膚および歯肉を含む）を通して達成され得る。
【０１５１】
例えば、本明細書中に記載の皮膚用パッチ剤を通して、１つ以上の調節剤を皮膚に塗布することが、このパッチが血清の代表的なサンプルを含む少量の流体を蓄積するスポンジのように機能することを可能にする。次いで、このパッチは、特定時間後に取り除かれ、そして目的の化合物（例えば、医薬品、ホルモン、増殖因子、代謝産物またはマーカー）に対して適切な技術によって分析される。あるいは、パッチは特定の物質（例えば、酵素）が検出された場合に変色することを可能にする試薬を染み込ませ得る。このような様式で検出され得る物質としては、コカインのような違法薬物、ＨＩＶ酵素、グルコースおよびＰＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。この技術は、在宅試験キットに対して特に利益がある。
【０１５２】
患者の血液のサンプリングを容易にするために、薬物伝達を増強するための上記のような調節剤が皮膚表面と接触される。調節剤および血液成分をアッセイするための試薬が（必要ではないが）、同じ組成物または皮膚用パッチ剤中に含まれ得る。一般に皮膚を介して投与される調節剤の量は、上記のように変化し得る。このようなレベルが、用いられるデバイスに対する適切な調整または上記のように処方されたクリームの塗布によって達成され得る。皮膚を通しての血液成分の移動は、例えば、フランツ（Ｆｒａｎｚ）細胞装置を使用してインビトロ研究に基づいて予想され得、そして当業者にとって明らかである適切な手段によってインビボで評価される。
【０１５３】
例えば、哺乳動物の皮膚または歯肉を介しての血液成分サンプリングのためのキットはまた、本発明として提供される。このようなキットとしては、一般に、１つ以上の調節剤と組合せたかまたは１つ以上の調節剤を染み込ませた、経皮投与のためのデバイス（すなわち、皮膚用パッチ剤）が一般的に挙げられる。血液成分の検出のための試薬は、さらにこのようなキット中に含まれ得る。
【０１５４】
さらなる局面において、哺乳動物の腫瘍に対する薬物の送達の増強のための方法が、提供され、この方法は、腫瘍を保有する哺乳動物に薬物と組み合わせた調節剤を投与する工程を包含する。このような調節薬剤はデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のみを含むか、あるいは１つ以上の他の非古典的または古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（例えば、ＯＢカドヘリン、カドヘリン−５、カドヘリン−６、Ｅ−カドヘリンおよび／またはＮ−カドヘリン（例えば、ＨＡＶ、ＳＨＡＶＳＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＿）、ＡＨＡＶＤＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：＿）またはこのような配列のアナログ）に由来するＣＡＲ配列）をさらに含み得る。デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列に対してリンカーを介して連結した、隣接Ｅ−カドヘリン特異的配列または隣接Ｎ−カドヘリン特異的配列のいずれかを伴ったデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含む二官能性調節剤もまた、好ましい。好ましくは、調節剤のペプチド部分は、６〜１６個のアミノ酸を含む。なぜなら、より長いペプチドは、水溶液に溶解することが難しく、そしてペプチダーゼにより分解され得るからである。
【０１５５】
１つの特に好ましい実施形態において、調節剤は、複数の接着分子によって媒介される細胞接着を崩壊し得る。例えば、単一の分枝した調節剤（または、単一の分子または支持材料に結合された複数の因子）は、デスモソームカドヘリンによって媒介される接着ならびにＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、オクルディン、クラウディンおよびインテグリン媒介細胞接着を崩壊し得る。このような因子は、細胞接着の多機能ディスラプターとして役立つ。あるいは、別のモジュレーターは、同じ薬学的組成物内かまたは別々にかのいずれかで、調節剤と組み合わせて投与され得る。好ましい抗体調節剤は、上記のような、非古典的または古典的なカドヘリンＣＡＲ配列に対して指向されるＦａｂフラグメントを含む。Ｆａｂフラグメントは、調節剤に組み込まれ得るかまたは同時に投与される別のモジュレーター内に存在し得る。
【０１５６】
好ましくは、調節剤および薬剤は、投与される前に、同じ組成物または薬剤送達デバイスにおいて処方される。一般に、調節剤は、任意の腫瘍（例えば、乳癌、胃腫瘍、卵巣腫瘍または腎臓腫瘍）への薬剤送達を増大し得、そして投与の方法は、標的の腫瘍の型に基づいて選択され得る。例えば、上記のような注射または局所投与は、黒色腫および他のアクセス可能な腫瘍にとって好ましいものであり得る（例えば、原発性卵巣腫瘍からの転移は、組成物を用いる腹腔のフラッシングによって処置され得る）。他の腫瘍（例えば、乳癌）は、腫瘍の部位への調節剤および薬剤（例えば、マイトマイシンＣ）の注射によって処置され得る。他の例において、この組成物は、全身に投与され得、そして種々の特定の標的因子のいずれかを使用して腫瘍を標的とし得る。適切な薬剤は、処置されるべき癌の型に基づいて同業者によって同定され得る（例えば、乳癌に対するタキソール）。一般に、投与される調節剤の量は、投与方法および腫瘍の性質と共に変化し、上で提供される古典的な範囲内で、好ましくは約１μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬおよびさらに好ましくは約１０μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの範囲内である。標的腫瘍への薬剤の移動は、当業者に明白な適切な手段によって評価され得る。薬物はまた、標識化されて（例えば、放射性核種を使用して）、標準的な画像化技術を使用して標的腫瘍への移動の直接観察を可能にし得る。
【０１５７】
関連する局面において、本発明は、哺乳動物における癌を処置するための方法を提供する。このような調節剤は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のみを含み得、または１つ以上の他の非古典的かまたは古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（例えば、ＯＢ−カドヘリン、カドヘリン−５、カドヘリン−６、Ｅ−カドヘリンおよび／またはＮ−カドヘリン由来のＣＡＲ配列）をさらに含み得る。インテングリン媒介細胞接着に関連するＣＡＲ配列（例えば、ＲＧＤ）はまた、使用され得る。例えば、このような調節剤は、ＨＡＶ、ＳＨＡＶＳＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）、ＡＨＡＶＤＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）またはこのような配列の誘導体のような配列をさらに含み得る。好ましくは、このような調節剤のペプチド部分は、６〜１６個のアミノ酸を含む。好ましい抗体調節剤は、非古典的または古典的なカドヘリンＣＡＲ配列に対して指向されるＦａｂフラグメントを含む。Ｆａｂフラグメントは、調節剤に組み込まれ得るかまたは同時に投与される別のモジュレーター内に存在し得るかのいずれかである。
【０１５８】
調節剤は、単独（例えば、皮膚を介して）かまたは薬学的組成物内において投与され得る。黒色腫および他の特定のアクセス可能な腫瘍に関して、注射または上記のような局所投与が、好まれ得る。他の腫瘍（例えば、膀胱腫瘍、気管支腫瘍または気管腫瘍）は、腔への調節剤の注射によって処置され得る。他の例において、組成物は、全身に投与され得、そして上記のような、種々の特定の標的因子のいずれかを使用して腫瘍を標的にされ得る。好ましくは、腫瘍は、乳癌、胃腫瘍または腎臓腫瘍である。一般に、投与される調節剤の量は、投与の方法および癌の性質に依存して変化するが、上で同定される範囲内で変化し得る。癌処置の有効性は、周知の臨床的な観察（例えば、血清腫瘍マーカー（例えば、ＣＥＡまたはＰＳＡ）のレベルをモニタする）を使用して評価され得る。
【０１５９】
特に投与が、全身性である場合、上記のような標的薬剤を追加することは、有益であり得る。適切な投与の形態および用量は、予防または処置されるべき状態に依存するが、一般に、注射による投与が適切である。用量は、上記されるように変化し得る。阻害の有効性は、腫瘍が、増殖を維持することができないことを評価することによっておおまかに評価され得、そして腫瘍の末梢における神経の非存在を観察することによって微視的に評価され得る。
【０１６０】
なお別の関連する局面において、本発明は、デスモソームカドヘリン発現細胞におけるアポトーシスを誘導するための方法を提供する。このような調節剤は、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列のみを含み得るか、または１つ以上の他の非古典的かまたは古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（例えば、ＨＡＶ、ＳＨＡＶＳＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）、ＡＨＡＶＤＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）またはこのような配列のアナログ）をさらに含み得る。好ましくは、このような調節剤のペプチド部分は、６〜１６個のアミノ酸を含む。好ましい抗体調節剤は、非古典的または古典的なカドヘリンＣＡＲ配列に対して指向されるＦａｂフラグメントを含む。Ｆａｂフラグメントは、調節剤に組み込まれ得るかまたは同時に投与される別のモジュレーター内に存在し得るかのいずれかである。投与は、局所的、注射を介してまたは他の手段によってであり得、そして特に投与が、全身性である場合、標的薬剤の追加は、有益であり得る。適切な投与の形態および用量は、アポトーシスの誘導が、所望される細胞の位置および性質に依存するが、一般に、用量は、上記のように変化し得る。生検は、アポトーシスの誘導のレベルを評価するために実施され得る。
【０１６１】
特定の他の局面において、本発明は、デスモソームカドヘリン発現細胞の接着を増大する方法を提供する。特定の実施形態において、調節剤は、固体支持体に結合し得、複数の調節剤を含むマトリクスを生じる。１つのこのような実施形態において、この支持体は、重合体のマトリクスであり、他のＣＡＲ配列を含む調節剤および分子は、重合体マトリクスに結合する（例えば、ＨＡＶ配列またはＲＧＤ配列のいずれかを含む調節剤および分子は、同じマトリクスに、好ましくは交互のパターンにおいて結合され得る）。このようなマトリクスは、複数の細胞接着分子によって媒介される接着を増大することが所望される前後関係において使用され得る。あるいは、調節剤自身は、上記のようにリンカーによって分離された、複数のデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列または抗体（もしくはそのフラグメント）を含み得る。いずれかの方法で、調節剤は、種々の前後関係において複数のデスモソームカドヘリン発現細胞に結合する「生物学的な接着剤」として機能する。
【０１６２】
１つのこのような局面において、デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列調節剤を含むおよび／または単一の分子もしくは支持体材料に結合される複数の調節薬剤は、哺乳動物において創傷治癒を促進するためおよび／または瘢痕組織を軽減することに使用され得る。このような調節剤は、１つのデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含み得るか、または複数のこのような配列（例えば、デスモグレインＣＡＲ配列およびデスモコリンＣＡＲ配列）を含み得る。必要に応じて、調節剤は、１つ以上の他の非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（例えば、ＯＢ−カドヘリンもしくはカドヘリン−５由来のＣＡＲ配列および／または１以上の古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（ＨＡＶ、ＳＨＡＶＳＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）、ＡＨＡＶＤＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）を含む）またはこのような配列のアナログ）を含む。好ましい抗体調節剤は、非古典的なカドヘリンまたはＥ−カドヘリンＣＡＲ配列のいずれかに対して指向されるＦａｂフラグメントを含む。セルロースまたはコラーゲンのような生体適合性および生体分解性マトリクスに結合される調節剤は、特に好ましい。このような方法における使用に関して、調節剤は、遊離のアミノ基またはヒドロキシル基を有するべきである。調節剤は、一般的に、創傷に局所的に投与され、この創傷において、この調節剤は、創傷の閉鎖を促進し得、そして縫合を強化し得、または取って代わりさえし得る。同様に、マトリクス結合化調節剤の投与は、皮膚移植片および人工器官の移植における細胞接着を促進し得、そしてコラーゲン注射の持続時間および有用性を延長し得る。一般に、創傷、移植片または移植部位に投与されるマトリクス結合化調節剤の量は、創傷の重症度および／または創傷、移植片（ｇｒａｆｔ）もしくは移植片（ｉｍｐｌａｎｔ）の性質と共に変化するが、上記されるように変化し得る。デスモソームカドヘリン配列、古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（ＨＡＶ）および特定のインテグリン（ＲＧＤ）によって結合されるＣＡＲ配列を含む多機能調節剤はまた、創傷治癒の強力な刺激物質としておよび／または瘢痕組織を減少するために使用され得る。あるいは、古典的なカドヘリン媒介細胞接着または古典的なインテグリン媒介細胞接着の１つまたそれより多い別のモジュレーターは、同じ薬学的組成物においてかまたは別のいずれかで、調節剤を組み合わせて投与され得る。
【０１６３】
さらなる局面において、調節剤は、自己免疫性水泡形成障害（例えば、尋常天疱瘡、落葉状天疱瘡および細胞間ＩｇＡ皮膚病）の処置に使用され得る。これらの障害は、１つ以上のデスモソームカドヘリンに対する抗体を患者が発達させ始める病理学的な状態である。その結果、皮膚細胞の接着は、失敗し始め、種々の種類の水泡形成を生じる。デスモソームカドヘリン媒介細胞接着を増大するための調節剤の使用は、このような障害の症状を緩和し得る。必要に応じて、このような方法は、抗カドヘリン抗体を除去するための方法と組み合わせて実施される。このような治療における使用のための調節剤は、１つのデスモソームカドヘリンＣＡＲ配列を含み得るか、または好ましくは、デスモグレインＣＡＲ配列およびデスモコリンＣＡＲ配列を含み得る。必要に応じて、調節剤は、１つよりも多い他の非古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（例えば、ＯＢ−カドヘリンまたはカドヘリン−５由来のＣＡＲ配列および／または１以上の古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（ＨＡＶ、ＳＨＡＶＳＳ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）、ＡＨＡＶＤＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＿）を含む）またはこのような配列のアナログ）をさらに含む。好ましい抗体調節剤は、非古典的なカドヘリンまたはＥ−カドヘリンＣＡＲ配列のいずれかに対する指向されるＦａｂフラグメントを含む。セルロースまたはコラーゲンのような生体適合性および生体分解性マトリクスに結合される調節剤は、特に好ましい。このような方法における使用に関して、調節剤は、遊離のアミノ基またはヒドロキシル基を有するべきである。調節剤は、一般的に、水泡部位に局所的に投与される。一般的に、水泡部位に投与されるマトリクス結合化調節剤の量は、状態の重症度と共に変化し、そして一般に的に上で議論されるような範囲である。１つ以上のデスモソームカドヘリン配列、古典的なカドヘリンＣＡＲ配列（ＨＡＶ）および特定のインテグリン（ＲＧＤ）によって結合されるＣＡＲ配列を含む多機能調節剤もまた使用され得る。あるいは、古典的なカドヘリン媒介細胞接着またはインテグリン媒介細胞接着に結合される１つ以上のモジュレーターが、同じ薬学的組成物おいてかまたは別のいずれかで、調節剤を組み合わせて投与され得る。
【０１６４】
別の局面において、１つ以上の調節剤は、例えば、バイオリアクタにおける使用に関して、組織培養プレートまたは他の細胞培養支持体の内側表面に結合し得る。このような結合は、上記されるように任意の適切な技術によって実施され得る。この形式において結合される調節剤は、一般に、カドヘリン発現細胞を固定化するために使用され得る。例えば、１つ以上の調節剤でコートされたディッシュまたはプレートは、種々のアッセイおよびスクリーニングにおいてカドヘリン発現細胞を固定化するために使用され得る。バイオリアクタ内において（すなわち、細胞またはオルガノイドの大規模生産のための系）、調節剤は、一般に、細胞付着を改善し、そして細胞増殖を安定化するために使用され得る。調節剤はまた、バイオリアクタ内で使用されて、例えば、胎性の哺乳動物細胞の散在する集団由来の高度に分化したオルガノイドの形成および機能を支持し得る。調節剤のバイオマトリクスを含むバイオリアクタはまた、特定のタンパク質の生産を促進するために使用され得る。
【０１６５】
本明細書に記載されるような調節剤は、種々のバイオリアクター配置内で使用され得る。一般に、バイオリアクターは、多数の付着する細胞を支持するに十分な内部表面積を有して設計される。この表面積は、膜、チューブ、マイクロタイターウェル、カラム、中空線維、ローラー瓶、プレート、皿、ビーズ、またはこれらの組み合わせを使用して提供され得る。バイオリアクターは、区画分けされ得る。バイオリアクター内の支持体材料は、当該分野で公知の任意の適切な材料であり得る；好ましくは、この支持体材料は、水中で不溶かまたは膨張しない。好ましい支持体材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：合成ポリマー（例えば、アクリル、ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンおよびポリ（エチレンテレフタラート））；セラミック；ガラスならびにシリカ。
【０１６６】
本発明の他の局面は、診断およびアッセイの目的でデスモソームのＣＡＲ配列に対して惹起される抗体を使用する方法を提供する。アッセイは、代表的には、デスモソームカドヘリン（遊離または細胞表面上の）の存在もしくは非存在、または適切な生物学的サンプル（例えば、患者から得られる腫瘍もしくは正常な組織生検、血液、リンパ節、血清もしくは尿サンプル、または他の組織、ホモジネート、あるいはこれらの抽出物）における１以上のＥＣドメインを含むタンパク質溶解フラグメントを検出するための抗体の使用を含む。
【０１６７】
サンプルにおける標的分子を検出するための抗体を使用する、当業者に公知の種々のアッセイ様式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。例えば、このアッセイは、ウェスタンブロット様式で実行され、ここで、生物学的サンプル由来のタンパク質調製物は、ゲル電気泳動にかけられ、適切な膜に転移されて抗体と反応させられる。次いで、膜上の抗体の存在は、以下に記載のような適切な検出試薬を使用して検出され得る。
【０１６８】
別の実施形態において、このアッセイは、標的カドヘリン、または細胞外ドメインを含み、かつＣＡＲ配列を含むタンパク分解フラグメントに結合するための、固体支持体上に固定された抗体の使用に関し、そしてサンプルの残りから抗体を除去する。次いで、結合したカドヘリンは、レポーター基を含む第二の抗体または試薬を使用して検出され得る。あるいは、競合アッセイが使用され得、ここで、カドヘリンがレポーター基で標識され、そしてサンプルとの抗体のインキュベーション後に固定された抗体に結合することが可能になる。サンプルの成分が抗体に対する標識カドヘリンの結合を阻害する程度は、固定された抗体とのサンプルの反応性を示し、そして結果として、サンプルにおけるカドヘリンのレベルを示す。
【０１６９】
抗体が付着され得る固体支持体は、当業者に公知の任意の材料であり得る（例えば、マイクロタイタープレート中の試験ウェル、ニトロセルロースフィルター、または別の適切な膜）。あるいは、この支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、繊維ガラス、ラテックスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル））であり得る。この抗体は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これらの技術は、特許および科学文献中に十分に記載されている。
【０１７０】
特定の実施形態において、サンプル中のデスモソームカドヘリンを検出するためのアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、まず固体支持体（一般には、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定された抗体を生物学的サンプルに接触させることによって実行され得、それによってサンプル内のデスモソームカドヘリンは、固定された抗体に結合できる（室温で３０分のインキュベーションが、一般に十分である）。次いで、非結合サンプルを、固定されたカドヘリン−抗体複合体から除去し、そしてカドヘリン上の異なる部位に結合し得る第二の抗体（酵素、色素、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチンのようなレポーター基を含む）が、添加される。次いで、固体支持体上への結合を保持する第二の抗体の量が、特異的なレポーター基に適切な方法を使用して、決定される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性核種基の場合、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が一般に適する。分光学的方法が使用されて、色素、発光基および蛍光基が検出され得る。ビオチンは、アビジンを使用して検出され、異なるレポーター基（一般には、放射性基もしくは蛍光基または酵素）に連結され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加、続いて反応産物の分光学的分析または他の分析によって（一般には特定の期間で）検出され得る。周知の技術を使用する基準および標準的な添加を使用して、サンプル中のカドヘリンのレベルを検出し得る。
【０１７１】
例えば、このようなイムノアッセイを使用して、異常なデスモソームカドヘリン発現に関連する状態を診断し、かつモニターし得る。上記のように、このような状態としては、自己免疫水疱形成障害（例えば、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡）および細胞間ＩｇＡ皮膚病が挙げられる。一般に、患者におけるこのような状態の存在または非存在は、以下によって検出され得る：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを抗体またはその抗原結合フラグメントに接触させる工程；（ｂ）抗体またはそのフラグメントに結合した、サンプル中のポリペプチドのレベルまたはパターンを検出する工程；ならびに（ｃ）ペプチドのレベルまたはパターンを予め決定されたカットオフ値または正常なパターンと比較する工程。一般に、これらの疾患は、デスモソームカドヘリンに対する自己免疫応答に関連し、この自己免疫応答は、これらのカドヘリンの内在化を生じる。このような内在化は、病変および病変周囲のケラチノサイトの染色生検切片における斑点状の細胞質顆粒として可視化され得る（Ｉｗａｔｓｕｋｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４０：３５−４３を参照のこと）。これらの顆粒は、正常な患者においては検出されない。
【０１７２】
イムノアッセイはさらに、良性の皮膚病変（例えば、角化棘細胞腫）と扁平上皮癌との間を区別するために使用され得る。特に、デスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）染色の位置を使用して、角化棘細胞腫と癌腫との間を区別し得る（Ｋｒｕｎｉｃら、Ａｃｔａ　Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．７６：３９４−３９８、１９９６を参照のこと）。一般に、広範囲の細胞周囲の染色は、角化棘細胞腫を示す。局所的な細胞周囲の染色は、角化棘細胞腫または十分分化した扁平上皮癌を示す。非染色または傍核（ｊｕｘｔａｎｕｃｌｅａｒ）染色は、あまり分化していない扁平上皮癌を示す。従って、細胞周囲の染色の減少（視覚的にまたは定量的に決定されるように、５０％の減少として）は、扁平上皮癌を示す。
【０１７３】
本発明はまた、このようなイムノアッセイにおける使用のためのキットを提供する。このようなキットは、一般に、上記のような１以上の抗体を含む。さらに、キットの１以上のさらなる区画または容器は、一般に、イムノアッセイにおいて使用されるべき構成要素（例えば、試薬、緩衝液および／または洗浄溶液）を同封する。
【０１７４】
さらなる局面において、調節剤もしくは抗体（またはこれらのフラグメント）は、細胞の同定およびインビトロの分類またはインビボの画像処理を容易にするために使用され得、デスモソームカドヘリン（または異なるデスモソームカドヘリンレベル）を発現する細胞の選択を可能にする。好ましくは、このような方法における使用のための調節剤または抗体は、検出可能なマーカーに連結され得る。適切なマーカーは、当該分野で周知であり、これらとしては、放射性核種、発光基、蛍光基、酵素、色素、免疫グロブリン定常ドメインおよびビオチンが挙げられる。１つの好ましい実施形態において、フルオレセインのような蛍光マーカーに連結された調節剤は、細胞に接触され、次いで、この細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析される。
【０１７５】
抗体またはそのフラグメントはまた、デスモソームカドヘリン媒介細胞接着を改変し得る他の化合物を同定するために、組み合わせのライブラリーまたは他の非ペプチドベースのライブラリーのスクリーニングにおいて使用され得る。このようなスクリーニングは、一般に、ＥＬＩＳＡ、または調節剤の形状および構造に類似の形状および構造を有する化合物を検出する、当業者に周知の他の方法を使用して実行され得る。一般に、このようなスクリーニングは、試験化合物を生成する発現ライブラリーを抗体に接触させる工程、および候補化合物に結合した抗体のレベルを検出する工程を包含する。抗体が高い親和性を有する化合物はさらに、ＯＢ−カドヘリン媒介細胞接着を改変する能力を評価するために、本明細書に記載のように特徴付けられ得る。
【０１７６】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためではない。
【０１７７】
（実施例）
（代表的な調節剤の調製）
この実施例は、代表的なペプチド調節剤の固相合成を例示する。
【０１７８】
これらのペプチドを、４３１Ａ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成機上で、ｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂および標準的なＦｍｏｃ化学を使用して合成した。合成および脱保護の後、これらのペプチドを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０カラムで脱塩し、そして凍結乾燥した。これらのペプチドを、精製のために分析的ＨＰＬＣによって分析し、そして各場合において、単一のピークを観察した。ペプチドを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または水中に１０〜２５ｍｇ／ｍＬのストック溶液として作製し、そして使用前は−２０℃で貯蔵した。
【０１７９】
上記から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的で本明細書中に記載されてきたが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定される以外は、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１ＡＡは、古典的なカドヘリン（図１Ａ）および非古典的なカドヘリン（図１Ｂ〜１ＡＡ）の構造を示す図である。細胞外ドメインは、大部分のカドヘリンについてＥＣ１〜ＥＣ５と示され；プロトカドヘリンおよびｃｎｒについてＥＣ１〜ＥＣ６と示される。形質膜（ＰＭ）を横切る疎水性ドメインは、ＴＭによって表され、そして種々の数の細胞質ドメインがＣＰによって表される。古典的カドヘリンについてのカルシウム結合モチーフは、ＤＸＮＤＮ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、ＤＸＤ、ＬＤＲＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）、ＤＸＥ、およびＤＶＮＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４１）により図１Ａに示され、そして他のカドヘリンのカルシウム結合モチーフはまた、細胞外ドメイン上に示される。細胞外ドメインの下に、９個のアミノ酸ＣＡＲ配列が示される。
【図２】
図２は、示される（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４−４３）ように、代表的な哺乳動物非古典的なカドヘリン細胞外ドメインのアミノ酸配列を提供する。カルシウム結合モチーフは、ボールドで示され、そして代表的なＣＡＲ配列がボールドおよび下線で示される。
【図３】
図３は、示されるように、代表的な哺乳動物デスモソームカドヘリンＥＣ１ドメインのアミノ酸配列を提供する。アミノ酸は、それらのＩＵＰＡＣコードによって表され、−はギャップを表す。デスモソームカドヘリンＣＡＲ配列が、ボールドで示される。
【図４】
図４は、代表的な環式ペプチド調節剤の構造を示す。[0001]
(Technical field)
The present invention relates generally to methods for modulating desmosome cadherin-mediated functions, and more particularly to such desmosomes of desmocholine cell adhesion recognition sequences and modulators derived from desmoglein cell adhesion recognition sequences. It relates to the use for inhibiting or enhancing cadherin-mediated functions.
[0002]
(Background of the Invention)
Cadherins are a rapidly expanding superfamily of calcium-dependent cell adhesion molecules (CAMs) (for a review, see Munro et al., Cell, Adhesion, and Invasion, in Cancer, Metastasis, P. Brodt, 17-34). RG Landes Co., Austin TX, 1996). All cadherins are generally membranes that promote cell adhesion via allospecific affinity interactions (one cadherin on the surface of one cell binds to the same cadherin on the surface of another cell) Although appearing to be glycoproteins, cadherins also appear to be able to form heterogeneous complexes with each other under certain circumstances and with lower affinity.
[0003]
There are many different types of cadherins. The most widely studied group of cadherins is known as classical (ie type I) cadherins. Classical cadherins have been shown to regulate epithelial, endothelial, neuronal and cancer cell adhesion with different cadherins expressed in different cell types. All classic cadherins have a similar structure. As shown in FIG. 1A, classical cadherin has five extracellular domains (EC1-EC5), a single hydrophobic domain (TM) across the plasma membrane (PM), and two cytoplasmic domains (CP1 and CP1). CP2). The calcium binding motif DXNDN (SEQ ID NO: 1), DXD and LDRE (SEQ ID NO: 2) are scattered throughout the extracellular domain, and each 110 amino acid region containing such a motif is a cadherin repeat. it is conceivable that. The first extracellular domain (EC1) has a CAR sequence HAV (His-Ala-Val) along with flanking sequences on either side of the cell adhesion recognition (CAR) sequence that play a role in conferring specificity. including. Synthetic peptides containing HAV sequences and antibodies to such peptides have been shown to inhibit classical cadherin-dependent processes (Munro et al., Supra; Blaschuk et al., J. Mol. Biol. 211: 679-82, 1990; Blaschuk et al., Develop. Biol. 139: 227-29, 1990; Alexander et al., J. Cell. Physiol. 156: 610-18, 1993).
[0004]
Cadherins containing a calcium-binding motif within the extracellular domain cadherin repeats but not the HAVＨCAR sequence are considered non-classical cadherins (shown in FIGS. 1B-1AA). To date, nine groups of non-classical cadherins have been identified (types II-X). These cadherins are also membrane glycoproteins. Type II (ie, atypical) cadherins include: OB-Cadherin (Cadherin-11; Getsios et al., Developmental Dynamics 211: 238-247, 1998; Simoneau et al., Cell Adications). Okazaki et al., J. Biological {Chemistry # 269: 12092-12098, 1994), Cadherin-5 (VE-Cadherin; Navarro et al., J. Cell {Biology} 140: 1475-1484, 1998). Cadherin-6 (K-cadherin; Shimoyama et al., Cancer @ Re). Shimazui et al., Cancer Research 56: 3234-3237, 1996; Inoue et al., Developmental Dynamics {211: 338-351, 1998; Getsios et al., Dev. Cadherin-7 (see Nakagawa et al., Development # 121: 1321-1332, 1995), Cadherin-8 (see Suzuki et al., Cell Regulation # 2: 261-270, 1991), Cadherin-12 ( Br-cadherin; Tanihara et al., Cell Adhesion and Commun. cadherin-14 (see Shibata et al., J. Biological {Chemistry} 272: 5236-5240, 1997), cadherin-15 (M-cadherin; Shimoyama et al., J. Biologic Chemistry 273: 10011-10018, 1998), and PB-cadherin (see Sugimoto et al., J. Biological Chemistry 271: 11548-11556, 1996). For a general review of atypical cadherins, see Rides and Takeichi, Developmental Biology 180: 413-423, 1996 and Suzuki et al., Cell Regulation 2: 261-270, 1991.
[0005]
Types III-X include the following: LI-cadherin (type III; see Berndorfff et al., J. Cell {Biology} 125: 1353-1369, 1994), T-cadherin (type IV; Ranscht, U.S. Patent). Tkachuk et al., FEBS @ Lett. 421: 208-212, 1998; Ranscht et al., Neuron @ 7: 391-402, 1991; Sacristan et al., J. Neuroscience @ Research @ 34: 664-680, 1993; And Ranscht, J. Cell {Biology} 119: 451-461, 1992; Fredette and Ranscht, J. Neuroscience @ 14: 7. 31-7346, 1994; Ranscht and Bronner-Fraser, Development # 111: 15-22, 1991), protocadherin (type V; e.g., protocadherins 42, 43 and 68; Sano et al., EMBO @ J. 12: 2249-2256, 1993; GenBank accession number AF029343), desmocholine (type VI; e.g., desmocholine 1, 2, 3, and 4; King et al., Genomics @ 18: 185-194, 1993; Parker et al., J. Biol. Chem.266: 10438-10445,1991; King et al., J. Invest.Dermatol.105: 314-321,1995; Kawamura et al., J.Biol.Ch. m. 269: 26295-26302, 1994), desmoglein (type VII; e.g., desmogleins 1 and 2; Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA {88: 4796-4800; Koch et al. Eur. J. Cell. Biol. 55: 200-208, 1991), and cadherin-related neuronal receptors (Type X; see Kohmura et al., Neuron 20: 1137-1151, 1998).
[0006]
Most studies of non-classical cadherins have focused on atypical (ie, type II) cadherins. The structure of such cadherins is similar to that of type I cadherins, but they do not include the CAR sequence (HAV) (FIG. 1B). Atypical cadherins appear to mediate a wide variety of functions. Further modifications are found in the structure of cadherins of type III-X. Although not well studied, such cadherins also appear to play a role in various functions. For example, desmosome cadherins reside in desmosomes, intercellular junctions that provide adhesion and membrane anchors to the intermediate filament cytoskeleton. These cadherins (eg, desmoglein and desmocholine) play a role in desmosome adhesion, which is very important for normal tissue architecture and epidermal structure. Aberrant desmosomes appear in certain types of carcinomas and other skin disorders (see Chidgey, Histol. Histopathol. 12: 1159-1168, 1997).
[0007]
Despite these recent advances, the function of non-classical cadherins remains poorly understood at the biological and molecular levels. Thus, there is a need in the art to identify sequences involved in regulating non-classical cadherin-dependent functions (eg, cell adhesion mediated by desmosome cadherins), and the use of such sequences for cell adhesion There is a need to develop methods to inhibit such processes. The present invention fulfills these needs, and further provides other related advantages.
[0008]
(Summary of the Invention)
Briefly, the present invention provides compositions and methods for modulating desmosome cadherin-mediated functions (eg, cell adhesion). In certain aspects, a modulator is provided. Such factors may modulate (ie, inhibit or enhance) one or more functions mediated by the desmosome cadherins desmoglein (dsg) or desmocholine (dsc). The modulator may include at least one of the following: (a) a native dsc or dsg CAR sequence; (b) an analog of the CAR sequence such that it can mediate dsc or dsg mediated cell adhesion; ( c) a non-peptide that is a peptidomimetic of dsg or dsg CAR sequence, capable of modulating dsc or dsg mediated cell adhesion; (d) an antibody or antigen binding thereof that specifically binds dsc or dsg CAR sequence And / or (e) a polynucleotide encoding a native dsc or dsgｓCAR sequence or analog thereof, which is capable of modulating dsc or dsg-mediated cell adhesion. Certain preferred modulators include desmoglein-1, desmoglein-2, desmoglein-3, desmocholine-1, desmocholine-2, desmocholine-3 or desmocholine-4ΔCAR sequences, or analogs of any of the above CAR sequences. Including. Analogs are generally at least 50% identical to a dsg or dsc CAR sequence and (i) detectably inhibit a function regulated by dsg or dsc; or (ii) express dsg or dsc. Is a peptide sequence that detectably amplifies the adhesion of the cell to which it occurs. The modulator preferably comprises no more than 85, and preferably no more than 50 contiguous amino acid residues present in the dsg or dsc. Particular modulators include dsg or dsc @ CAR sequences and are 3 to 16 amino acid residues long. In certain specific embodiments, the modulator as described above is a peptide ranging in size from 3 to 50, preferably 4 to 16 amino acid residues.
[0009]
For certain modulators, the dsg or dsc @ CAR sequence has the following formula:
Aaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu-Caa-Daa-Ser / Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3)
Where Aaa, Baa, Caa and Daa are independently selected amino acid residues; Ile / Leu / Val is an amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine and valine, and Asp / Asn / Glu is an amino acid selected from the group consisting of aspartic acid, asparagine and glutamic acid; and Ser / Thr / Asn is an amino acid selected from the group consisting of serine, threonine and asparagine. For other modulators as described above, the dsg or dsc @ CAR sequence may comprise at least three consecutive amino acid residues, and preferably at least five consecutive amino acid residues, of the region of dsg or dsc having the formula described above. Consists of
[0010]
In certain specific embodiments, modulators as provided herein include: (a) NQK (NQKT (SEQ ID NO: 63), NQKTG (SEQ ID NO: 64), INQK (SEQ ID NO: 65), INQKT (SEQ ID NO: 66), INQKTG (SEQ ID NO: 67), VINQK (SEQ ID NO: 68), VINQKT (SEQ ID NO: 69), VINQKTG (SEQ ID NO) : 70), FVINQK (SEQ ID NO: 71), FVINQKT (SEQ ID NO: 72), FVINQKTG (SEQ ID NO: 73), IFVINQK (SEQ ID NO: 74), IFVINQKT (SEQ ID NO: 75), IFVINQTGG (SE ID NO: 76), NRN (NRNT (SEQ ID NO: 77), NRNTG (SEQ ID NO: 78), INRN (SEQ ID NO: 79), INRNT (SEQ ID NO: 80), INRNTG (SEQ ID NO) : 81), IIRNN (SEQ ID NO: 82), IINRNT (SEQ ID NO: 83), IINRNTG (SEQ ID NO: 84), FIINRN (SEQ ID NO: 85), FIINRN (SEQ ID NO: 86), FIINRNTG (SEQ ID NO: 87), MFIINRN (SEQ ID NO: 88), MFIIRNT (SEQ ID NO: 89), MFIIRNTTG (SEQ ID NO: 90), NKD (NKDT (SEQ ID NO) 91), NKDTG (SEQ ID NO: 92), LNKD (SEQ ID NO: 93), LNKDT (SEQ ID NO: 94), LNKDTG (SEQ ID NO: 95), YLNKD (SEQ ID NO: 96), YLNKDT ( SEQ ID NO: 97), YLNKDTG (SEQ ID NO: 98), FYLNKD (SEQ ID NO: 99), FYLNKDT (SEQ ID NO: 100), FYLNKDTG (SEQ ID NO: 101), VFYLNKD (SEQ ID NO: 102) ), One or more CAR sequences selected from the group consisting of VFYLNKDT (SEQ ID NO: 103) and VFYLNKDTG (SEQ ID NO: 104); or (b) one or more positions. An analog of any of the above sequences wherein the substitutions, deletions, additions and / or insertions are different, such that the ability of the analog to modulate desmoglein-mediated function is not significantly reduced. For example, this factor has the sequence N-Ac-IFVINQKTG-NH₂(SEQ ID NO: 105), N-Ac-MFIINRNTG-NH₂(SEQ ID NO: 106) or N-Ac-VFYLNKDTG-NH₂(SEQ ID NO: 107). The desmoglein CAR sequence may be, but is not necessarily, present in the cyclic peptide.
[0011]
In other specific embodiments, modulators as provided herein may include: (a) EKD (EKDT (SEQ ID NO: 108), EKDTG (SEQ ID NO: 109), IEKD (SEQ ID NO: 110), IEKDT (SEQ ID NO: 111), IEKDTG (SEQ ID NO: 112), YIEKD (SEQ ID NO: 113), YIEKDT (SEQ ID NO: 114), YIEKDTG (SEQ ID NO) : 115), FYIEKD (SEQ ID NO: 116), FYIEKDT (SEQ ID NO: 117), FYIEKDTG (SEQ ID NO: 118), LFYIEKD (SEQ ID NO: 119), LFYIEKDT (SEQ ID NO: 120) LFYIEKDTG (SEQ ID NO: 121), ERD (ERDT (SEQ ID NO: 122), ERDTG (SEQ ID NO: 123), VERD (SEQ ID NO: 124), VERDT (SEQ ID NO: 125), VERDTG ( SEQ ID NO: 126), YVERD (SEQ ID NO: 127), YVERDT (SEQ ID NO: 128), YVERDTG (SEQ ID NO: 129), FYVERD (SEQ ID NO: 130), FYVERDT (SEQ ID NO: 131) ), FYVERDTG (SEQ ID NO: 132), LFYVERD (SEQ ID NO: 133), LFYVERDT (SEQ ID NO: 134), LFYVERDTG (SEQ ID) NO: 135), IERD (SEQ ID NO: 136), IERDT (SEQ ID NO: 137), IERDTG (SEQ ID NO: 138), YIERD (SEQ ID NO: 139), YIERDT (SEQ ID NO: 140), YIERDTG (SEQ ID NO: 141), FYIERD (SEQ ID NO: 142), FYIERDT (SEQ ID NO: 143), FYIERDTG (SEQ ID NO: 144), LFYIERD (SEQ ID NO: 145), LFYERDT (SEQ ID NO) One or more desmocholine CAR sequences selected from the group consisting of: 146) and {LFYIERDTG (SEQ ID NO: 147)); or (b) one or more substitutions, deletions, additions and An analog of any of the above sequences, wherein the insertion is different, such that the ability of the analog to modulate desmocholine-mediated function is not significantly reduced. For example, this factor has the sequence N-Ac-LFYIEKDTG-NH₂(SEQ ID NO: 148), N-Ac-LFYVERDTG-NH₂(SEQ ID NO: 149) or N-Ac-LFYIERDTG-NH₂(SEQ ID NO: 150). The desmocholine CAR sequence may, but need not be, present within the cyclic peptide.
[0012]
In other specific embodiments, modulators as provided herein can include: (a) RAL (RALN (SEQ ID NO: 151), RALNS (SEQ ID NO: 152). , RALNSM (SEQ ID NO: 153), RALNSL (SEQ ID NO: 154), RALNSMG (SEQ ID NO: 155), RALNSLG (SEQ ID NO: 156), CRAL (SEQ ID NO: 157), CRALN (SEQ ID) NO: 158), CRALNS (SEQ ID NO: 159), CRALNSM (SEQ ID NO: 160), CRALNSL (SEQ ID NO: 161), CRALNSMG (SEQ ID NO: 162), CRALNSLG (SEQ ID NO: 1) 3), YCRAL (SEQ ID NO: 164), YCRALN (SEQ ID NO: 165), YCRALNS (SEQ ID NO: 166), YCRALNSM (SEQ ID NO: 167), YCRALNSL (SEQ ID NO: 168), YCRALSMMG ( SEQ ID NO: 169), YCRALNSLG (SEQ ID NO: 170), IYRAL (SEQ ID NO: 171), IYRALN (SEQ ID NO: 172), IYRALNS (SEQ ID NO: 173), IYRALNSM (SEQ ID NO: 174) ), IYRALNSL (SEQ ID NO: 175), IYRALNSMG (SEQ ID NO: 176) or IYRALNSLG (SEQ ID NO: 177) One or more desmoglein-1 CAR sequences selected from the group consisting of: or (b) one or more substitutions, deletions, additions and / or insertions that differ, thereby resulting in a function mediated by desmoglein. An analogue of any of the above arrangements, wherein the ability of the analogue to regulate is not significantly reduced. A linear peptide having such a sequence may have a peptide N-Ac-IYRALNSMG-NH at the N-terminal and / or C-terminal.₂(SEQ ID NO: 178) and N-Ac-IYRALNSLG-NH₂(SEQ ID NO: 179).
[0013]
In other specific embodiments, modulators as provided herein may include: (a) YAL (YALD (SEQ ID NO: 180), YALDA (SEQ ID NO: 181). , YALDAR (SEQ ID NO: 182), YALDARG (SEQ ID NO: 183), GYAL (SEQ ID NO: 184), GYALD (SEQ ID NO: 185), GYALDA (SEQ ID NO: 186), GYALDA (SEQ ID) NO: 187), GYALDARG (SEQ ID NO: 188), TGYAL (SEQ ID NO: 189), TGYALD (SEQ ID NO: 190), TGYALDA (SEQ ID NO: 191), TGYALDAR (SEQ ID NO: 192) , TGYALDARG (SEQ ID NO: 193), LTGYAL (SEQ ID NO: 194), LTGYALD (SEQ ID NO: 195), LTGYALDA (SEQ ID NO: 196), LTGYARDAR (SEQ ID NO: 197) or LTGYALDARG NO: 198)), one or more desmoglein-2ΔCAR sequences selected from the group consisting of; or (b) one or more substitutions, deletions, additions and / or insertions, resulting in desmoglein An analog of any of the above sequences, wherein the ability of the analog to modulate a function mediated by is not significantly reduced. A linear peptide having such a sequence may have the peptide N-Ac-LTGYALDARG-NH at the N-terminal and / or C-terminal.₂(SEQ ID NO: 199).
[0014]
In other specific embodiments, modulators as provided herein can include: (a) RAL (RALN (SEQ ID NO: 151), RALNA (SEQ ID NO: 200). , RALNAQ (SEQ ID NO: 201), RALNAL (SEQ ID NO: 202), RALNAQG (SEQ ID NO: 203), RALNALG (SEQ ID NO: 204), CRAL (SEQ ID NO: 157), CRALN (SEQ ID) NO: 158), CRALNA (SEQ ID NO: 205), CRALNAQ (SEQ ID NO: 206), CRALNAL (SEQ ID NO: 207), CRALNAQG (SEQ ID NO: 208), CRALNALG (SEQ ID NO: 2) 9), TCRAL (SEQ ID NO: 210), TCRALN (SEQ ID NO: 211), TCRALNA (SEQ ID NO: 212), TCRALNAQ (SEQ ID NO: 213), TCRALAL (SEQ ID NO: 214), TCRALNAQG ( SEQ ID NO: 215), TCRALNALG (SEQ ID NO: 216), ITCRAL (SEQ ID NO: 217), ITCRALN (SEQ ID NO: 218), ITCRALNA (SEQ ID NO: 219), ITCRALNAQ (SEQ ID NO: 220) ), ITCRALNAL (SEQ ID NO: 221), ITCRALNAQG (SEQ ID NO: 222), ITCRALNG (SEQ ID NO) One or more desmoglein-3 モ CAR sequences selected from the group consisting of: 223)); or (b) one or more of the substitutions, deletions, additions and / or insertions, so that they are mediated by desmoglein An analog of any of the above arrangements, wherein the ability of the analog to modulate the function performed is not significantly reduced. A linear peptide having such a sequence is obtained at the N-terminal and / or C-terminal at the peptide N-Ac-ITCRALNAQG-NH₂(SEQ ID NO: 224) and N-Ac-ITCRALNALG-NH₂(SEQ ID NO: 225).
[0015]
In certain other embodiments, the modulators provided herein include (a) YAT, YATT (SEQ ID NO: 226), YATTA (SEQ ID NO: 227), YATTAD (SEQ ID NO: 228), YATTADG (SEQ ID NO: 229), GYAT (SEQ ID NO: 230), GYATT (SEQ ID NO: 231), GYATTA (SEQ ID NO: 232), GYATTAD (SEQ ID NO: 233), GYATTAD ( SEQ ID NO: 234), AYAT (SEQ ID NO: 235), AYATT (SEQ ID NO: 236), AYATTA (SEQ ID NO: 237), AYATTAD (SEQ ID NO: 238), AYATTADG (SE ID NO: 239), YGYAT (SEQ ID NO: 240), YGYATT (SEQ ID NO: 241), YGYATTA (SEQ ID NO: 242), YGYATTAD (SEQ ID NO: 243), YGYATTADG (SEQ ID NO: 244) , YAYAT (SEQ ID NO: 245), YAYATT (SEQ ID NO: 246), YAYATTA (SEQ ID NO: 247), YAYATTAD (SEQ ID NO: 248), YAYATTADG (SEQ ID NO: 249), LYGYATSEQ NO: 250), LYGYATT (SEQ ID NO: 251), LYGYATTA (SEQ ID NO: 252), LYGYATTAD (SEQ ID NO: 2) 3), LYGYATTADDG (SEQ ID NO: 254), LYAYAT (SEQ ID NO: 255), LYAYATT (SEQ ID NO: 256), LYAYATTA (SEQ ID NO: 257), LYYATTAD (SEQ ID NO: 258AT, LYATAD, LYATAD) SEQ ID NO: 259), VYGYAT (SEQ ID NO: 260), VYGYATT (SEQ ID NO: 261), VYGYATTA (SEQ ID NO: 262), VYGYATTAD (SEQ ID NO: 263), VYGYATTADG (SEQ ID NO: 26ID) ), VYAYAT (SEQ ID NO: 265), VYAYATT (SEQ ID NO: 266), VYAYAATTA (SEQ ID NO: 267), VYAYATTAD (SEQ ID NO: 268), VYAYAATTADG (SEQ ID NO: 269), IYGYAT (SEQ ID NO: 270), IYGYATT (SEQ ID NO: 271), IYGATTA (SEQ ID NO: YAT, 272AT) SEQ ID NO: 273), IYGATTADDG (SEQ ID NO: 274), IYAYAT (SEQ ID NO: 275), IYAYATT (SEQ ID NO: 276), IYAYATTA (SEQ ID NO: 277), IYAATT NODE ID: SEQ ID NO: 78 ) Or one or more Desmocollin-1 CAR sequences selected from the group consisting of IYAYATTADG (SEQ ID NO: 279) Or (b) 1 or more substituents, different in deletions, additions and / or insertions, such that the ability to modulate desmocollins mediated function is not substantially reduced, any analog of the sequence may be mentioned. A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-LYGYATTADG-NH₂(SEQ ID NO: 280) N-Ac-LYAYATTADDG-NH₂(SEQ ID NO: 281) N-Ac-VYGYATTADDG-NH₂(SEQ ID NO: 282) N-Ac-VYAYATTADDG-NH₂(SEQ ID NO: 283) N-Ac-IYGYATTADG-NH₂(SEQ ID NO: 284) and N-Ac-IYAYATTADDG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 285).
[0016]
In other specific embodiments, the modulators provided herein include (a) FAT, FATT (SEQ ID NO: 286), FATTP (SEQ ID NO: 287), FATTPD (SEQ ID NO: 288), FATTPDG (SEQ ID NO: 289), AFAT (SEQ ID NO: 290), AFATT (SEQ ID NO: 291), AFATTP (SEQ ID NO: 292), AFATTPD (SEQ ID NO: 293), AFATTPDG ( SEQ ID NO: 294), IAFAT (SEQ ID NO: 295), IAFATT (SEQ ID NO: 296), IAFATTP (SEQ ID NO: 297), IAFATTPD (SEQ ID NO: 298), IAFATTP G (SEQ ID NO: 299), IIAFAT (SEQ ID NO: 300), IIAFATT (SEQ ID NO: 301), IIAFATTP (SEQ ID NO: 302), IIAFATTPD (SEQ ID NO: 303), IIAFATTPDG (SEQ ID NO) : 304), LIAFAT (SEQ ID NO: 305), LIAFATT (SEQ ID NO: 306), LIAFATTP (SEQ ID NO: 307), LIAFATTPD (SEQ ID NO: 308), and LIAFATTPDG (SEQ ID NO: 309). One or more Desmocollin-2ΔCAR sequences selected from the group; or (b) differing in one or more substitutions, deletions, additions and / or insertions, Fruit, ability to modulate desmocollins mediated function is not substantially reduced, any analog of the sequence may be mentioned. A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-IIAFATTPDG-NH₂(SEQ ID NO: 310) and N-Ac-LIAFATTPDG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 311).
[0017]
In other specific embodiments, the modulators provided herein include (a) YAS, YAST (SEQ ID NO: 312), YASTA (SEQ ID NO: 313), YASTAD (SEQ ID NO: 314), YASTADG (SEQ ID NO: 315), AYAS (SEQ ID NO: 316), AYAST (SEQ ID NO: 317), AYASTA (SEQ ID NO: 318), AYASTAD (SEQ ID NO: 319), AYASTADG ( (SEQ ID NO: 320), IAYAS (SEQ ID NO: 321), IAYAST (SEQ ID NO: 322), IAYASTA (SEQ ID NO: 323), IAYASTAD (SEQ ID NO: 324), IAYASTA G (SEQ ID NO: 325), LIYAS (SEQ ID NO: 326), LIYAST (SEQ ID NO: 327), LIYASTA (SEQ ID NO: 328), LIYASTAD (SEQ ID NO: 329), LIYASTAD NO : 330) one or more Desmocollin-3ΔCAR or desmocholine-4 sequences selected from the group consisting of: or (b) differing in one or more substitutions, deletions, additions and / or insertions, such that desmocholine Any analog of the above sequences may be included, wherein the ability to modulate a mediating function is not substantially reduced. A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-LIAYASTADG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 331).
[0018]
In other embodiments, the modulator comprises a dsc @ CAR sequence or a dsg @ CAR sequence present in a cyclic peptide. Such cyclic peptides have the formula:
[0019]
Embedded image

Wherein W is a tripeptide selected from the group consisting of NQK, NRN, NKD, EKD, ERD, RAL, YAL, YAT, FAT, and YAS;₁And X₂Is optional and, if present, is independently selected from the group consisting of amino acid residues and combinations thereof in which the residues are linked to peptide bonds, and wherein X₁And X₂Are independently in the size range of 0 to 10 residues such that X₁And X₂Is in the range of 1 to 12;₁And Y₂Are independently selected from the group consisting of amino acid residues, wherein the covalent bond is Y₁And Y₂And Z; and Z₁And Z₂Is optional and, if present, is independently selected from the group consisting of amino acid residues linked to peptide bonds and combinations thereof.
[0020]
In another aspect of the invention, a polynucleotide encoding the above-described modulator is provided with an expression vector comprising such a polynucleotide and a host cell transformed or transfected with such an expression vector.
[0021]
The present invention further provides a modulator comprising an antibody or an antibody-binding fragment thereof that specifically binds to the dsg @ CAR sequence or dsc @ CAR sequence and regulates desmosome cadherin-mediated functions.
[0022]
In a further aspect, the invention provides a modulator comprising any one non-peptidomimetic of the desmosome cadherin CAR sequence provided above.
[0023]
In certain embodiments, a modulating agent can be linked to a drug, a detection marker, a targeting agent, and / or a support material. The modulator may also or alternatively include one or more of the following: (a) a cell adhesion recognition sequence other than a dsc @ CAR or dsg @ CAR sequence; and / or (b) a CAR other than a dsc @ CAR or dsg @ CAR sequence. An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a sequence. For example, such an adhesion molecule can be classic cadherin, non-classical cadherin, integrins, occludin, claudin, N-CAM, fibronectin, laminin or other extracellular matrix proteins.
[0024]
In a further aspect, there is provided a pharmaceutical composition comprising the above modulator together with a pharmaceutically acceptable carrier. Such compositions may further comprise a drug and / or (a) a peptide comprising a cell adhesion recognition sequence other than the dsc @ CAR or dsg @ CAR sequence; and / or (b) a CAR sequence other than the dsc @ CAR or dsg @ CAR sequence. Or one or more of the antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to
[0025]
The invention further provides, in another aspect, a method for modulating one or more desmosome cadherin-mediated functions. Such methods generally include the step of contacting the dsc progenitor or dsc-expressing cells with a modulator as described above. Suitable cells include, but are not limited to, epithelial cells, endothelial cells and tumor cells. In such a method, a modulator is not required, but is present in the pharmaceutical composition.
[0026]
The invention further provides, in another aspect, a method for modulating cell adhesion, comprising contacting a dsc-expressing cell and / or a dsg-expressing cell with a modulator or pharmaceutical composition as described above. Is included. Such modulators and compositions can inhibit or enhance cell adhesion.
[0027]
In another aspect, the present invention provides a method for inhibiting the adhesion of dsc-expressing cells and / or dsg-expressing cells in a mammal, the method comprising the step of administering the above-mentioned modulator to the mammal. Wherein the modulator inhibits dsc- and / or dsg-mediated cell adhesion.
[0028]
In a further aspect, the invention provides a method for enhancing the delivery of a drug through the skin of a mammal, comprising contacting epithelial cells of the mammal with the drug and a modulator. Here, the contacting step is performed under conditions and for a time sufficient to allow passage of the drug across the epithelial cells, and the modulator inhibits dsg- and / or dsc-mediated cell adhesion. . Such modulators can pass into the blood stream of a mammal. In certain embodiments, a modulator is linked to a drug. This contacting step may, but need not, be performed via a skin patch comprising the modulator and the drug, and such skin patches are further provided herein.
[0029]
Further provided is a method for facilitating blood sampling in a mammal, the method comprising contacting a mammalian epithelial cell with the modulator, wherein the modulator comprises a dsg-mediated cell. The contacting step is performed under conditions and for a time sufficient to inhibit adhesion and / or dsc-mediated cell adhesion and allow passage of one or more blood components across the epithelial cells. The contacting step may be performed via a skin patch comprising a modulator and (optionally) reagents for detecting a blood component of interest, such kits being specifically provided herein. You. In certain embodiments, the epithelial cells are skin cells or gingival cells.
[0030]
In a further aspect, there is provided a method for enhancing delivery of a drug to a tumor in a mammal, the method comprising administering the modulator to a mammal, wherein the modulator comprises dsg. Inhibits cell-mediated or dsc-mediated cell adhesion. Suitable tumors include, but are not limited to, bladder tumors, ovarian tumors, breast tumors, gastric tumors, and kidneys, and the modulator can be administered locally to the tumor or systemically.
[0031]
In another aspect, the invention provides a method for treating cancer in a mammal, the method comprising administering to the mammal the modulator, wherein the modulator comprises dsg. Inhibits cell-mediated or dsc-mediated cell adhesion. The mammal may be afflicted with a cancer, such as a carcinoma, leukemia or melanoma, and the modulator may be administered to the tumor or systemically.
[0032]
The present invention further provides, in another aspect, a method for inducing apoptosis in desmosome cadherin-expressing cells, the method comprising the step of contacting desmosome cadherin-expressing cells with the above-mentioned modulator. Inhibits desmosome cadherin-mediated cell adhesion.
[0033]
In another aspect, the invention provides a method for enhancing the adhesion of desmosome cadherin-expressing cells, comprising contacting a dsg-expressing cell or a dsc-expressing cell with the agent, wherein: The modulator enhances dsc- or dsg-mediated cell adhesion, wherein the contacting step is performed under conditions and for a time sufficient to detectably enhance cell adhesion. In certain embodiments, a modulator for use in such a method is linked to a support molecule or solid support.
[0034]
In a related aspect, the invention provides a method for facilitating wound healing and / or reducing scar tissue in a mammal, the method comprising contacting a wound in a mammal with the modulator. Wherein the modulator enhances desmosome cadherin-mediated cell adhesion. In certain embodiments, a modulator for use in such a method is linked to a support molecule or solid support.
[0035]
In another aspect, there is provided a method for enhancing the adhesion of a foreign tissue transplanted to a mammal, the method comprising the steps of contacting the transplantation site of the foreign tissue in the mammal with the modulator. The modulator enhances dsg- or dsc-mediated cell adhesion. Such foreign tissue may be a skin graft or an organ graft. In certain embodiments, a modulator for use in such a method is linked to a support molecule or a solid support.
[0036]
In a further aspect, there is provided a method for treating an autoimmune blistering disorder in a mammal, the method comprising administering to the mammal the modulator, wherein the modulator comprises a desmosome. Enhances cadherin-mediated cell adhesion. In certain embodiments, such an agent may be administered topically to the blister. Modulators for use in such methods can be linked to a supporting molecule or solid support.
[0037]
The present invention further provides a method for detecting the presence of desmosome-expressing cells in a sample, the method comprising: (a) an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds a sample to the dsg CAR sequence or dsc CAR sequence. And contacting under conditions and for a time to allow formation of the antibody cadherin complex; and (b) detecting the level of the antibody cadherin complex and then detecting the presence of desmosome cadherin-expressing cells in the sample. Include. The antibody can be linked to a support material or a detection marker (eg, a fluorescent marker). In certain embodiments, this detecting step is performed using fluorescence activated cell sorting.
[0038]
Kits for detecting the presence of dsg-expressing cells or dsc-expressing cells in a sample are also provided. Such a kit may include (a) an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the desmosome cadherin CAR sequence; and a detection reagent.
[0039]
In another aspect, the present invention provides a method for identifying a compound capable of modulating desmosome cadherin-mediated function, comprising: (a) an antibody that specifically binds to the dsgｓCAR sequence or dscｄCAR sequence described above. Or contacting an antigen-binding fragment thereof with a test compound; and (b) detecting the level of antibody or fragment that binds the test compound and identifying a compound from which desmosome cadherin-mediated cell adhesion can be prepared. I do.
[0040]
These and other aspects of the present invention will become apparent with reference to the following detailed description and accompanying drawings. All references disclosed herein are hereby incorporated by reference in their entirety as if each were individually incorporated.
[0041]
(Detailed description of the invention)
As noted above, the present invention provides methods for modulating desmosome cadherin-mediated functions (eg, cell adhesion). The present invention is based, in part, on the identification of a previously unknown cell adhesion recognition (CAR) sequence present on desmosome cadherins. A modulator may include one or more such desmosome cadherin CAR sequences (or analogs or mimetics thereof) with or without one or more additional cell adhesion molecule CAR sequences, as described below. . Peptide CAR sequences can be present in linear or cyclic peptides. Alternatively or additionally, the modulator may comprise a polynucleotide encoding a polypeptide comprising one or more desmosome cadherin CAR sequences, and / or the modulator may bind to a sequence that specifically binds to the desmosome cadherin CAR sequence (eg, Antibodies or antigen-binding fragments thereof).
[0042]
Generally, to modulate desmosome cadherin-mediated function, cells expressing desmosome cadherin are contacted with a modulator, either in vivo or in vitro. In certain aspects, the methods provided herein inhibit desmosome cadherin-mediated function. Such methods include, for example, a method for treating a disease or other condition characterized by unwanted cell adhesion, or a method for facilitating drug delivery to a particular tissue or tumor. Certain methods can inhibit cell adhesion (eg, cancer cell adhesion). Alternatively, modulators can be used to enhance desmosome cadherin-mediated functions (eg, cell adhesion), eg, when linked to a matrix or another modulator via a linker. Such conjugates can be used, for example, to facilitate wound healing or graft adhesion.
(Regulator)
As used herein, the term "modulator" refers to a molecule that includes at least one of the following components:
(A) a linear or cyclic peptide sequence that is at least 50% identical to the desmosome cadherin CAR sequence (ie, a desmosome cadherin CAR sequence or analog thereof that retains at least 50% sequence identity);
(B) a mimetic of the desmosome cadherin CAR sequence (eg, a peptidomimetic or small molecule mimetic);
(C) a substance (eg, an antibody or antigen-binding fragment thereof) that specifically binds to the desmosome cadherin CAR sequence; and / or
(D) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the desmosome cadherin CAR sequence or an analog thereof.
[0043]
The modulator may consist entirely of one or more of the above elements, or may further comprise a peptide region and / or a non-peptidic region. The additional peptide region may be derived from desmosome cadherin, preferably the extracellular domain containing the CAR sequence, and / or may be heterologous. In certain preferred embodiments, the modulator comprises no more than 85 contiguous amino acid residues, and preferably no more than 50 contiguous amino acid residues, present in desmosome cadherins.
[0044]
Modulators may further modulate desmosome cadherin-mediated functions. Such activity can generally be assessed, for example, using the representative assays provided herein. Certain modulators inhibit interactions between desmosome cadherins and / or between desmosome cadherins and different adhesion molecules. With respect to functions that are inhibited by full-length desmosome cadherin (eg, cell adhesion), such modulators can inhibit functions that have substantially no reduced activity compared to full-length desmosome cadherin (ie, the modulator can Inhibits function at least as well as soluble cadherin when in contact with cells that express cadherin). For example, a modulator may be as effective as soluble desmosome cadherin in preventing and / or disrupting adhesion of desmosome cadherin-expressing cells. Alternatively, to enhance adhesion of desmosome cadherin-expressing cells, the modulator comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof and / or a plurality of peptides or mimetics linked to a support material. Such modulators can function as a biological adhesive that binds to desmosome cadherin-expressing cells and detectably enhance cell adhesion (preferably, desmosome cadherin immobilized to cadherin or the cadherin or cadherin). At least as strong as those observed for antibodies directed against).
[0045]
As used herein, the term "non-classical cadherin" refers to a polypeptide that includes characteristic cadherin repeats but does not include the HAV @ CAR sequence. As used herein, a “cadherin repeat” is about 110 amino acid residues long (generally 100 to 120 residues, preferably 105 to 115 residues), including an extracellular domain, And, in the same order and at almost the same position, reference is made to an amino acid sequence containing three calcium binding motifs (DXD, XDXE and DXXDX; SEQ ID NOS: 332 and 333, respectively) (see for example FIG. 2). thing). The presence of an extracellular domain can generally be determined using well-known techniques, for example, where one or more of the following are present: hydrophilic sequences, regions recognized by antibodies, regions cleaved by trypsin, and / or Or a strong glycosylation site with a glycosylation motif (Asn-X-Ser / Thr). The second calcium binding motif generally has the sequence LDRE (SEQ ID NO: 2), but variants of the sequence with conservative substitutions have also been observed, including the following: MDRE ( SEQ ID NO: 334), LDFE (SEQ ID NO: 335), LDYE (SEQ ID NO: 336), IDRE (SEQ ID NO: 337), VDRE (SEQ ID NO: 338) and IDFE (SEQ ID NO: 339) ). Within most cadherin repeats, this third cadherin binding motif has the sequence [L, I, V] -X- [L, I, V] -XXD-XND- [N, H ] -XP (SEQ ID NO: 340), wherein the residue shown in parentheses can be any one of the cited residues. A preferred third calcium binding motif has the sequence DXNDN (SEQ ID NO: 1), but one or both of the D residues can be replaced by E. Homology within a cadherin repeat is generally at least 20%, preferably at least 30%, as determined by the ALIGN algorithm (Myers and Miller, CABIOS 4: 11-17, 1988). Most cadherins contain at least five cadherin repeats, as shown in FIGS. 1B-1AA, with a hydrophobic domain across the plasma membrane and, optionally, one or more cytoplasmic domains. However, occasionally, cadherins can replace the extracellular domain containing less than three calcium binding motifs with one or more cadherin repeats. For example, as shown in FIG. 2, the second extracellular domain of LI-cadherin contains only a first calcium binding motif (DXD). As described above, atypical or type II cadherins include cadherin-5 (VE-cadherin), cadherin-6 (K-cadherin), cadherin-7, cadherin-8, cadherin-11 (OB-cadherin), cadherin- 12, cadherin-14, cadherin-15 and PB-cadherin. Types III-X include LI-cadherin, T-cadherin, protocadherin (e.g., protocadherins 42, 43 and 68), desmocollin (e.g., desmocholine 1, 2, 3, and 4), desmoglein (e.g., desmoglein). ) (Eg, desmogleins 1 and 2), and cadherin-related neuronal receptors.
[0046]
The term "desmosome cadherin" refers to a non-classical cadherin that exists within an intercellular junction known as the desmosome. Desmosome cadherins include desmoglein and desmocholine (e.g., King et al., Genomics # 18: 185-194, 1993; Parker et al., J. Biol. Chem. 266: 10438-10445, 1991; King et al., J. Invest. Kawamura et al., J. Biol. Chem. 269: 26295-26302, 1994; Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA {88: 4796-4800; and Koch et al., Dermatol.105: 314-321, 1995; Eur. J. Cell. Biol. 55: 200-208, 1991). Desmoglein and desmocholine are expressed by cells having desmosomes (eg, epithelial cells, cardiomyocytes and meningeal cells). These cadherins are involved in the intracellular adhesion of such cells and may function in a heterotypic manner, whereby both the desmocholine isoform and the desmoglein isoform are required for adhesion. Is done. Desmoglein and desmocholine have been associated with a number of autoimmune blistering disorders (eg, pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus and intercellular IgA skin disease) and have been shown to reduce expression in some human cancers Have been. The sequences of various extracellular domains of known desmosome cadherins are shown in FIGS. 2 and 3 (SEQ ID NO4-43 and SEQ ID NO 44-57).
[0047]
As used herein, a desmosome cadherin CAR sequence is present within a naturally occurring desmosome cadherin, as described herein, and has a role in desmosome cadherin-mediated functions (eg, cell adhesion). An amino acid sequence that can be detectably adjusted. In other words, contacting a desmosome cadherin expressing cell with a peptide comprising a CAR sequence results in a detectable change in desmosome cadherin-mediated function using at least one of the exemplary assays provided herein. CAR sequences are generally recognized in vivo by desmosome cadherins or other adhesion molecules (ie, molecules that mediate cell adhesion through receptors on the cell surface), and have the greatest heterophilic interactions and / or homologs. Required for affinity interaction. The CAR sequence can be of any length, but generally comprises at least 3 amino acid residues, preferably 4-16 amino acid residues, and more preferably 5-9 amino acid residues. Including. Although the peptide modulator may comprise any number of amino acid residues, preferred modulators are 3-50 residues, preferably 4-16 residues, and more preferably 6-15 residues. Residues.
[0048]
Within the context of the present invention, certain non-classical cadherin CAR sequences have been found to share the following consensus sequences:
Aaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu-Caa-Daa-Ser / Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3).
[0049]
In the consensus sequence, Aaa, Baa, Caa and Daa indicate independently selected amino acid residues, "Ile / Leu / Val" indicates amino acids that are isoleucine, leucine or valine; "Asp / Asn "/ Glu" indicates an amino acid that is aspartic acid, asparagine or glutamic acid; and "Ser / Thr / Asn" indicates an amino acid that is serine, threonine or asparagine. Representative desmosome cadherin CAR sequences and other non-classical cadherin CAR sequences are provided in Table I. The CAR sequences specifically provided herein further include portions of such representative CAR sequences and longer polypeptides comprising at least a portion of such sequences. Additional non-classical cadherin CAR sequences are based on sequence homology to the non-classical cadherin CAR sequences provided herein and in such representative assays as described herein. Sequence-containing peptides can be identified based on their ability to modulate non-classical cadherin-mediated functions. In certain embodiments, the modulator is at least 3 contiguous residues, preferably at least 5 contiguous residues, and more preferably at least 7 contiguous residues of the desmosome cadherin CAR sequence that satisfies the consensus sequence. Contiguous residues. Similarly, if different non-classical cadherin CAR sequences are used in combination with desmosome cadherin CAR sequences, then such CAR sequences will be at least three contiguous sequences of desmosome cadherin CAR sequences that satisfy the consensus sequence. Should preferably comprise at least five consecutive residues, and more preferably at least seven consecutive residues.
Table I Representative non-classical cadherin CAR sequences
[0050]
[Table 1]

Non-classical cadherin CAR sequences are generally located physically within the cadherin molecule (ie, within 10 amino acids, and preferably within 5 amino acids) within or near the binding site of the adhesion molecule. Is done. The location of the binding site is generally determined using well-known techniques, such as techniques that evaluate the ability of a non-classical cadherin to bind to the same non-classical cadherin or another adhesion molecule. Can be done. Any standard binding assay can be used for such evaluation. Recognition of the CAR sequence by non-classical cadherins or other adhesion molecules has a measurable effect on the function of the adhesion molecule (eg, cell adhesion). Peptides containing a CAR sequence, if not ligated as described herein, generally inhibit such function and form enhancers of the function of the adhesion molecule.
[0051]
Certain preferred desmosome cadherin CAR sequences comprise from 3 to 9 amino acid residues of the desmoglein or desmocholine sequences provided in Table I. For example, the CAR sequence may include 3, 4 or 5 residues in the 9 amino acid sequence of Table I. In certain embodiments, the CAR sequence may include at least 5 to 7 residues of the sequence in Table I. The desmoglein CAR sequence may include, for example, one or more of the following sequences: NQK, NQKT (SEQ ID NO: 63), NQKTG (SEQ ID NO: 64), INQK (SEQ ID NO: 65), INQKT (SEQ ID NO: 66), INQKTG (SEQ ID NO: 67), VINQK (SEQ ID NO: 68), VINQKT (SEQ ID NO: 69), VINQKTG (SEQ IDNO: 70), FVINQK (SEQ ID NO: 71), FVINQKT (SEQ ID NO: 72), FVINQKTG (SEQ ID NO: 73), IFVINQK (SEQ ID NO: 74), IFVINQKT (SEQ ID NO: 75), IFVINQKTG (SEQ ID NO: 76), NR , NRNT (SEQ ID NO: 77), NRNTG (SEQ ID NO: 78), INRN (SEQ ID NO: 79), INRNT (SEQ ID NO: 80), INRNTG (SEQ ID NO: 81), IIRNN (SEQ ID NO) : 82), IINRNT (SEQ ID NO: 83), IINRNTG (SEQ ID NO: 84), FIINRN (SEQ ID NO: 85), FIINRNNT (SEQ ID NO: 86), FIINRNTG (SEQ ID NO: 87), MFIINRN ( SEQ ID NO: 88), MFIINRNT (SEQ ID NO: 89), MFIINRNTG (SEQ ID NO: 90), NKD, NKDT (SEQ ID NO: 91), NKDTG (SEQ ID ID) O: 92), LNKD (SEQ ID NO: 93), LNKDT (SEQ ID NO: 94), LNKDTG (SEQ ID NO: 95), YLNKD (SEQ ID NO: 96), YLNKDT (SEQ ID NO: 97), YLNKDTG (SEQ ID NO: 98), FYLNKD (SEQ ID NO: 99), FYLNKDT (SEQ ID NO: 100), FYLNKDTG (SEQ ID NO: 101), VFYLNKD (SEQ ID NO: 102), VFYLNKDTSE : 103) and VFYLNKDTG (SEQ ID NO: 104). A linear peptide having such a sequence can be modified at the N-terminus and / or C-terminus as follows: N-Ac-IFVINQKTG-NH₂(SEQ ID NO: 105), N-Ac-MFIINRNTG-NH₂(SEQ ID NO: 106) and N-Ac-VFYLNKDTG-NH₂(SEQ ID NO: 107).
[0052]
The desmocholine CAR sequence may include, for example, one or more of the following sequences: EKD, EKDT (SEQ ID NO: 108), EKDTG (SEQ ID NO: 109), IEKD (SEQ ID NO: 110), IEKDT (SEQ ID NO: 111), IEKDTG (SEQ ID NO: 112), YIEKD (SEQ ID NO: 113), YIEKDT (SEQ ID NO: 114), YIEKDTG (SEQ ID NO: 115), FYIKD (SEQ ID NO: 116) , FYIEKDT (SEQ ID NO: 117), FYIEKDTG (SEQ ID NO: 118), LFYIEKD (SEQ ID NO: 119), LFYIEKDT (SEQ ID NO: 120), LFYIEK DTG SEQ ID NO: 121), ERD, ERDT (SEQ ID NO: 122), ERDTG (SEQ ID NO: 123), VERD (SEQ ID NO: 124), VERDT (SEQ ID NO: 125), VERDTG (SEQ ID NO) : 126), YVERD (SEQ ID NO: 127), YVERDT (SEQ ID NO: 128), YVERDTG (SEQ ID NO: 129), FYVERD (SEQ ID NO: 130), FYVERDT (SEQ ID NO: 131), FYVERDTG (SEQ ID NO: 132), LFYVERD (SEQ ID NO: 133), LFYVERDT (SEQ ID NO: 134), LFYVERDTG (SEQ ID NO: 135), IE D (SEQ ID NO: 136), IERDT (SEQ ID NO: 137), IERDTG (SEQ ID NO: 138), YIERD (SEQ ID NO: 139), YIERDT (SEQ ID NO: 140), YIERDTG (SEQ ID NO) 141), FYIERD (SEQ ID NO: 142), FYIERDT (SEQ ID NO: 143), FYIERDTG (SEQ ID NO: 144), LFYIERD (SEQ ID NO: 145), LFYERDT (SEQ ID NO: 146) and LFYERDTG (SEQ ID NO: 147). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-LFYIEKDTG-NH₂(SEQ ID NO: 148), N-Ac-LFYVERDTG-NH₂(SEQ ID NO: 149) and N-Ac-LFYIERDTG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 150).
[0053]
Additional desmosome cadherin CAR sequences are from the EC1 domain shown in FIG. The desmoglein-1 CAR sequence can include, for example, one or more of the following sequences: RAL, RALN (SEQ ID NO: 151), RALNS (SEQ ID NO: 152), RALNSM (SEQ ID NO: 153), RALNSL. (SEQ ID NO: 154), RALNSMG (SEQ ID NO: 155), RALNSLG (SEQ ID NO: 156), CRAL (SEQ ID NO: 157), CRALN (SEQ ID NO: 158), CRALNS (SEQ ID NO: 159), CRALNSM (SEQ ID NO: 160), CRALNSL (SEQ ID NO: 161), CRALNSMG (SEQ ID NO: 162), CRALNSLG (SEQ ID NO: 163), YCRAL SEQ ID NO: 164), YCRALN (SEQ ID NO: 165), YCRALNS (SEQ ID NO: 166), YCRALNSM (SEQ ID NO: 167), YCRALNSL (SEQ ID NO: 168), YCRALNSMG (SEQ ID NO: 169) ), YCRALNSLG (SEQ ID NO: 170), IYRAL (SEQ ID NO: 171), IYRALN (SEQ ID NO: 172), IYRALNS (SEQ ID NO: 173), IYRALNSM (SEQ ID NO: 174), IYRALNSL (SEQ) ID No .: 175), IYRALNSMG (SEQ ID NO: 176) and IYRALNSLG (SEQ ID NO: 177). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-IYRALNSMG-NH₂(SEQ ID NO: 178) and N-Ac-IYRALNSLG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 179).
[0054]
The desmoglein-2 CAR sequence can include, for example, one or more of the following sequences: YAL, YALD (SEQ ID NO: 180), YALDA (SEQ ID NO: 181), YALDAR (SEQ ID NO: 182), YALDARG. (SEQ ID NO: 183), GYAL (SEQ ID NO: 184), GYALD (SEQ ID NO: 185), GYALDA (SEQ ID NO: 186), GYALDAR (SEQ ID NO: 187), GYALDARG (SEQ ID NO: 188), TGYAL (SEQ ID NO: 189), TGYALD (SEQ ID NO: 190), TGYALDA (SEQ ID NO: 191), TGYALDAR (SEQ ID NO: 192), TGYALDA G (SEQ ID NO: 193), LTGYAL (SEQ ID NO: 194), LTGYALD (SEQ ID NO: 195), LTGYALDA (SEQ ID NO: 196), LTGYALDAR (SEQ ID NO: 197), LTGYALDARG (SEQ ID NO: 198). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-LTGYALDARG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 199).
[0055]
The desmoglein-3 CAR sequence can include, for example, one or more of the following sequences: RAL, RALN (SEQ ID NO: 151), RALNA (SEQ ID NO: 200), RALNAQ (SEQ ID NO: 201), RALNAL. (SEQ ID NO: 202), RALNAQG (SEQ ID NO: 203), RALNALG (SEQ ID NO: 204), CRAL (SEQ ID NO: 157), CRALN (SEQ ID NO: 158), CRALNA (SEQ ID NO: 205), CRALNAQ (SEQ ID NO: 206), CRALNAL (SEQ ID NO: 207), CRALNAQG (SEQ ID NO: 208), CRALNALG (SEQ ID NO: 209), TCRAL SEQ ID NO: 210), TCRALN (SEQ ID NO: 211), TCRALNA (SEQ ID NO: 212), TCRALNAQ (SEQ ID NO: 213), TCRALAL (SEQ ID NO: 214), TCRALNAQG (SEQ ID NO: 215) ), TCRALALG (SEQ ID NO: 216), ITCRAL (SEQ ID NO: 217), ITCRALN (SEQ ID NO: 218), ITCRALNA (SEQ ID NO: 219), ITCRALNAQ (SEQ ID NO: 220), ITCRALAL (SEQ) ID No. 221), ITCRALNAQG (SEQ ID NO: 222), ITCRALNALG (SEQ ID NO: 223). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-ITCRALNAQG-NH₂(SEQ ID NO: 224) and N-Ac-ITCRALNALG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 225).
[0056]
The desmocholine-1 CAR sequence may include, for example, one or more of the following sequences: YAT, YATT (SEQ ID NO: 226), YATTA (SEQ ID NO: 227), YATTAD (SEQ ID NO: 228), YATTADG ( SEQ ID NO: 229), GYAT (SEQ ID NO: 230), GYATT (SEQ ID NO: 231), GYATTA (SEQ ID NO: 232), GYATTAD (SEQ ID NO: 233), GYATTADG (SEQ ID NO: 234) ), AYAT (SEQ ID NO: 235), AYATT (SEQ ID NO: 236), AYATTA (SEQ ID NO: 237), AYATTAD (SEQ ID NO: 238), AYATTADG (SEQ ID NO: 239), YGYAT (SEQ ID NO: 240), YGYATT (SEQ ID NO: 241), YGYATTA (SEQ ID NO: 242), YGYATTAD (SEQ ID NO: 243), YGYATTADG (SEQ ID NO: 244) , YAYAT (SEQ ID NO: 245), YAYATT (SEQ ID NO: 246), YAYATTA (SEQ ID NO: 247), YAYATTAD (SEQ ID NO: 248), YAYATTADG (SEQ ID NO: 249), LYGYATSEQ NO: 250), LYGYATT (SEQ ID NO: 251), LYGYATTA (SEQ ID NO: 252), LYGYATTAD (SEQ ID NO: 2) 3), LYGYATTADDG (SEQ ID NO: 254), LYAYAT (SEQ ID NO: 255), LYAYATT (SEQ ID NO: 256), LYAYATTA (SEQ ID NO: 257), LYYATTAD (SEQ ID NO: 258AT, LYATAD, LYATAD) SEQ ID NO: 259), VYGYAT (SEQ ID NO: 260), VYGYATT (SEQ ID NO: 261), VYGYATTA (SEQ ID NO: 262), VYGYATTAD (SEQ ID NO: 263), VYGYATTADG (SEQ ID NO: 26ID) ), VYAYAT (SEQ ID NO: 265), VYAYATT (SEQ ID NO: 266), VYAYAATTA (SEQ ID NO: 267), VYAYATTAD (SEQ ID NO: 268), VYAYAATTADG (SEQ ID NO: 269), IYGYAT (SEQ ID NO: 270), IYGYATT (SEQ ID NO: 271), IYGATTA (SEQ ID NO: YAT, 272AT) SEQ ID NO: 273), IYGATTADDG (SEQ ID NO: 274), IYAYAT (SEQ ID NO: 275), IYAYATT (SEQ ID NO: 276), IYAYATTA (SEQ ID NO: 277), IYAYATTAD (SEQ ID NO: 78ID) ) And IYAYATTADG (SEQ ID NO: 279). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-LYGYATTADG-NH₂(SEQ ID NO: 280), N-Ac-LYAYATTADDG-NH₂(SEQ ID NO: 281), N-Ac-VYGYATTADG-NH₂(SEQ ID NO: 282), N-Ac-VYAYAATTADG-NH₂(SEQ ID NO: 283), N-Ac-IYGYATTADDG-NH₂(SEQ ID NO: 284) and N-Ac-IYAYATTADDG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 285).
[0057]
The desmocholine-2 @ CAR sequence may include, for example, one or more of the following sequences: FAT, FATT (SEQ ID NO: 286), FATTP (SEQ ID NO: 287), FATTPD (SEQ ID NO: 288), FATTPDG. (SEQ ID NO: 289), AFAT (SEQ ID NO: 290), AFATT (SEQ ID NO: 291), AFATTP (SEQ ID NO: 292), AFATTPD (SEQ ID NO: 293), AFATTPDG (SEQ ID NO: 294), IAFAT (SEQ ID NO: 295), IAFATT (SEQ ID NO: 296), IAFATTP (SEQ ID NO: 297), IAFATTPD (SEQ ID NO: 298), IAFATT DG (SEQ ID NO: 299), IIAFAT (SEQ ID NO: 300), IIAFATT (SEQ ID NO: 301), IIAFATTP (SEQ ID NO: 302), IIAFATTPD (SEQ ID NO: 303), IIAFATTPDG (SEQ ID NO) LIAFATT (SEQ ID NO: 305), LIAFATT (SEQ ID NO: 306), LIAFATTP (SEQ ID NO: 307), LIAFATTPD (SEQ ID NO: 308), LIAFATTPDG (SEQ ID NO: 309). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-IIAFATTPDG-NH₂(SEQ ID NO: 310) and N-Ac-LIAFATTPDG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID NO: 311).
[0058]
The desmocholine-3 or desmocholine-4 CAR sequence can include, for example, one or more of the following sequences: YAS, YAST (SEQ ID NO: 312), YASTA (SEQ ID NO: 313), YASTAD (SEQ ID NO: 314). ), YASTADG (SEQ ID NO: 315), AYAS (SEQ ID NO: 316), AYAST (SEQ ID NO: 317), AYASTA (SEQ ID NO: 318), AYASTAD (SEQ ID NO: 319), AYASTADG (SEQ) ID No .: 320), IAYAS (SEQ ID No .: 321), IAYAST (SEQ ID No .: 322), IAYASTA (SEQ ID NO: 323), IAYASTAD (SEQ ID NO: 32) ), IAYASTADDG (SEQ ID NO: 325), LIYAS (SEQ ID NO: 326), LIYAST (SEQ ID NO: 327), LIYASTA (SEQ ID NO: 328), LIYASTAD (SEQ ID NO: 329A, LIASTAD) ID @ NO: 330). A linear peptide having such a sequence is the peptide N-Ac-LIAYASTADG-NH₂It can be modified at the N-terminus and / or C-terminus, as in (SEQ ID ID NO: 331).
[0059]
One skilled in the art will recognize that similar peptide sequences can be designed to modulate other cadherin-mediated functions following identification of the CAR sequence as described above.
[0060]
It is clear that certain peptide sequences described above may regulate functions mediated by multiple non-classical cadherins. Generally, peptides containing a large number of conserved residues from desmosome cadherins have greater specificity for their cadherins. In addition, additional flanking sequences may be included to enhance specificity. Such flanking sequences can be identified based on the sequences provided in FIGS. 2 and 3 or based on the published sequences. To achieve specificity (i.e., modulation of desmosome cadherin function that is enhanced relative to modulation of function mediated by different cadherins), two to five contiguous residues (preferably any of the CAR sequences). The addition of at least one lateral residue) is generally sufficient.
[0061]
As noted above, modulators provided herein can include analogs or mimetics of the desmosome cadherin CAR sequence. Analogs generally retain at least 50% identity to the native desmosome cadherin CAR sequence and modulate desmosome cadherin-mediated functions as described herein. Such analogs preferably contain at least three and more preferably at least five conserved residues of the desmosome cadherin CAR sequence. Analogs can include any of a variety of amino acid substitutions, additions, deletions, and / or modifications (eg, side chain modifications). Preferred amino acid substitutions are conservative. A "conservative substitution" is one in which an amino acid is replaced with another amino acid having similar properties, so that those skilled in peptide chemistry will substantially alter the secondary structure and hydropathic properties of a polypeptide. Expect not to. Amino acid substitutions generally can be made based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathic nature of the residues. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and have an uncharged polar head group with similar hydrophilicity values Amino acids include leucine, isoleucine and valine; glycine and alanine; asparagine and glutamine; and serine, threonine, phenylalanine and tyrosine. Other groups of amino acids that can represent conservative changes include: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his. An important determining feature of a desmosome cadherin CAR sequence analog is the ability to modulate desmosome cadherin-mediated functions, which can be assessed using the representative assays provided herein.
[0062]
A mimetic is a non-peptidyl compound that is conformationally similar to the desmosome cadherin CAR sequence, so that it modulates desmosome cadherin-mediated functions as described below. Such mimetics can be designed based on techniques for evaluating the three-dimensional structure of a peptide. For example, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and computational techniques can be used to determine the conformation of the desmosome cadherin CAR sequence. NMR is widely used for structural analysis of both peptidyl and non-peptidyl compounds. Nuclear \ Overhauser \ Enhancement (NOE), coupling constants, and chemical shifts depend on the conformation of the compound. The NOE data provides the interproton distance between protons through space and can be used to calculate the lowest energy conformation for the desmosome cadherin CAR sequence. This information can then be used to design a mimetic of the preferred conformation. Linear peptides in solution exist in many conformations. By using conformational restriction techniques, it is possible to immobilize this peptide in an active conformation. Conformational restrictions include i) the introduction of an alkyl group such as a methyl group that sterically restricts free bond rotation; ii) unsaturation that fixes the relative position of the terminal and geminal substituents. And / or iii) cyclization, which fixes the relative position of the side chains. Mimetics are those in which one or more amide bonds have the same size or volume in isosteres, substituents or groups (eg, -CH₂NH-, -CSNH-, -CH₂S-, -CH = CH-, -CH₂CH₂-, -CONMe-), etc., can be synthesized. These backbone amide bonds can also be part of a ring structure (eg, a lactam). One or more side-chain functional groups of the desmosome cadherin CAR sequence need not have the same size or volume, but are replaced by groups having similar chemical and / or physical properties that produce a similar biological response. Mimics that can be designed can be designed. Other mimetics can be small molecule mimetics, which can be easily identified from small molecule libraries based on the three-dimensional structure of the CAR sequence. It should be understood that in the embodiments described below, analogs or mimetics can be substituted for the desmosome cadherin CAR sequence.
[0063]
The modulator or peptide portion thereof can be a linear peptide or a cyclic peptide. The term “cyclic peptide” as used herein refers to a peptide or a salt thereof that comprises: (1) an intramolecular covalent bond between two non-adjacent residues and (2) at least one desmosome Cadherin CAR sequence or analog thereof. The intramolecular bond may be a backbone-to-backbone, side-chain-to-backbone, or side-chain-to-side-chain bond (ie, a terminal functional group and / or terminal residue or internal residue of a linear peptide Side chain functional groups can be linked to achieve cyclization). Preferred intramolecular bonds include, but are not limited to, disulfide bonds, amide bonds and thioether bonds. One or more of any of the desmosome cadherin CAR sequences, or analogs or mimetics thereof, may be incorporated into a cyclic peptide, with or without one or more other adhesion molecule binding sites. Additional adhesion molecule binding sites are described in more detail below.
[0064]
The size of the cyclic peptide ring generally ranges from 5 to about 15 residues, preferably 5 to 10 residues. Additional residues may be present on the N-terminal and / or C-terminal side of the desmosome cadherin CAR sequence, and sequences flanking the desmosome cadherin CAR sequence, with or without amino acid substitutions and / or other modifications. Can be derived from Alternatively, additional residues flanking one or both of the CAR sequences may include endogenous sequences (eg, residues that facilitate cyclization, purification, or other manipulation and / or targeting or other functions. Residue).
[0065]
In certain embodiments, the modulator may comprise a cyclic peptide comprising a desmosome cadherin CAR sequence as provided in Table I (or a portion of such a CAR sequence). Particular cyclic peptides have the formula:
[0066]
Embedded image

Having.
[0067]
In this formula, W is a tripeptide selected from the group consisting of NQK, NRN, NKD, EKD, ERD, RAL, YAL, YAT, FAT, and YAS;₁And X₂Is optional and, if present, is independently selected from the group consisting of amino acid residues and combinations thereof in which these residues are linked by peptide bonds, wherein X₁And X₂Are independently in the range of 0 to 10 residues in size, such that X₁And X₂Are in the range from 1 to 12; Y₁And Y₂Are independently selected from the group consisting of amino acid residues, wherein residue Y₁And Y₂And a covalent bond is formed between₁And Z₂Is optional and, if present, is independently selected from the group consisting of amino acid residues and combinations thereof in which these residues are linked by peptide bonds.
[0068]
Cyclic peptides can include any of the CAR sequences described above. Such cyclic peptides can be used without modification or incorporated into a modulator.
[0069]
Representative cyclic peptides containing a desmoglein CAR sequence include:
[0070]
(Equation 1)

Representative cyclic peptides containing the desmocholine CAR sequence include:
[0071]
(Equation 2)

Representative cyclic peptides containing the desmoglein-1 CAR sequence include:
[0072]
(Equation 3)

Representative cyclic peptides containing the desmoglein-2 CAR sequence include:
[0073]
(Equation 4)

Representative cyclic peptides containing the desmoglein-3 CAR sequence include:
[0074]
(Equation 5)

Representative cyclic peptides containing the desmocholine-1 CAR sequence include:
[0075]
(Equation 6)

Representative cyclic peptides containing the desmocholine-2 CAR sequence include:
[0076]
(Equation 7)

Representative cyclic peptides containing the desmocholine-3 or desmocholine-4 @ CAR sequence include:
[0077]
(Equation 8)

As noted above, certain preferred modulators include peptides, including desmosome cadherin CAR sequences or analogs thereof. In this peptide, at least one terminal amino acid residue is modified (eg, the N-terminal amino group is modified, eg, by acetylation or alkoxybenzylation, and / or an amide or ester is formed at the C-terminus) ). In the context of the present invention, it has been found that the addition of at least one such group to a linear or cyclic peptide modulator can improve the ability of this agent to modulate desmosome cadherin-mediated function. Certain preferred modulators include variants at the N- and C-terminal residues (eg, N-terminal acetylation and / or C-terminal amidation).
[0078]
The invention further contemplates desmosome cadherin CAR sequences from other organisms. Such CAR sequences can be identified based on similarities to the sequences provided herein and the ability to modulate desmosome cadherin-mediated functions (e.g., as described herein). Can be).
[0079]
In certain embodiments, as discussed below, cyclic peptides containing a small CAR sequence (eg, three residues without important flanking sequences) are preferred for modulating desmosome cadherin-mediated functions. Such a peptide may contain an N-acetyl group and a C-amide group. Small cyclic peptides are commonly used to attach cancer and / or other cell types, either locally or systemically, to try to link a targeting agent to the peptide, as discussed below. Can be specifically regulated.
[0080]
In embodiments where inhibition of desmosome cadherin interaction is desired, the modulator may comprise one desmosome cadherin CAR sequence, or multiple CAR sequences. This sequence may be modified by a peptide linker and / or a non-peptide linker to provide distance (either without intervening sequences) or very close (ie, between desmosome CAR sequences) (in the range of about 0.1-400 nm). Separated) adjacent. The linker can be any molecule (including peptide and / or non-peptide sequences). The molecule does not contain a CAR sequence and can be covalently linked to at least two peptide sequences. Using a linker, the CAR or protein sequence containing the peptide and other peptides is terminated end-to-end (ie, the linker can be covalently attached to the carboxyl or amino group of each peptide sequence). And / or linked via side chains. One linker that can be used for such a purpose is (H₂N (CH₂)_nCO₂H) or derivatives thereof, wherein n ranges from 1-4. Other linkers that can be used will be apparent to those skilled in the art. Peptide linkers and non-peptide linkers can be incorporated into modulators using suitable methods generally known in the art.
[0081]
In embodiments where desmosomal cadherin-mediated enhancement of cell adhesion is desired, the modulator is an antibody that specifically binds to a plurality of desmosomal cadherin CAR sequences, or such sequences bound by a linker as described above. May be included. For improved cadherin function, the linker distance should generally be between 400 and 10,000 nm. One linker that can be used for such a purpose is (H₂N (CH₂)_nCO₂H)_mOr a derivative thereof, wherein n ranges from 1 to 10 and m ranges from 1 to 4000. For example, glycine (H₂NCH₂CO₂H) or its multimer is used as a linker, and each glycine unit, when linked to other amino acids using molecular modeling techniques, as determined by calculation of its lowest energy conformation, 2.45. Angstroms, ie, corresponds to a coupling distance of 0.245 nm. Similarly, aminopropionic acid corresponds to a bond length of 3.73 Å, aminobutyric acid corresponds to a bond length of 4.96 Å, aminopentanoic acid corresponds to a bond length of 6.30 Å, and aminohexanoic acid corresponds to a bond distance of 6.12 Å. Enhanced cell adhesion can also be achieved by the attachment of multiple modulators to the support material, as discussed further below.
[0082]
Certain preferred modulators may include a desmoglein CAR sequence in combination with a desmocholine CAR sequence. If the CAR sequences are linked by a linker as described above, such factors may be used, for example, to promote cell adhesion in various contexts. According to an example, such an agent could include the dsg-2 CAR sequence YAL in combination with the dsc-2 CAR sequence FAT.
[0083]
Modulators as described herein may further comprise one or more different adhesion molecules (including but not limited to non-classical cadherins and other CAMs) and / or one or more substrates. (Eg, an antibody or fragment thereof that binds to such a sequence) may include one or more CAR sequences. A linker may be used, but is not necessary, to separate such CAR sequences and / or antibody sequences and / or each from the CAR sequences. Such modifiers are commonly used in a manner that may be desirable to simultaneously disrupt functions mediated by multiple adhesion molecules. As used herein, an “adhesion molecule” is any molecule that mediates cell adhesion via a receptor on the surface of a cell. As adhesion molecules, cell adhesion proteins (eg, other members of the cadherin gene superfamily such as N-cadherin and E-cadherin); integrins, extracellular matrix proteins (eg, laminin, fibronectin, collagen, vitronectin, entactin and tenascin). And membranes of the immunoglobulin supergene family (eg, N-CAM). Preferred CAR sequences included in the modulator include classical cadherin CAR sequences His-Ala-Val (HAV); Arg-Gly-Asp (RGD) (bound by integrins (Cardarelli et al., J. Biol. Chem. 267: 23159-64, 1992)); Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR; SEQ ID NO.:_) (which is bound by α6β1 integrin); KYSFNYDGSE (SEQ ID NO.:_). (It is bound by N-CAM); N-CAM sulfate heparin binding site IWHKKGRDVILKKDVRF (SEQ ID NO :: _); putative claudin CAR sequence IYSY (SEQ ID NO :: _) and / or occludin. CA R array LYHY (SEQ ID NO :: _).
[0084]
Other preferred CAR sequences included in the modulator include OB-cadherin CAR sequences (eg, DDK, IDDK (SEQ ID NO.:_), DDKS (SEQ ID NO.:_), VIDDK (SEQ ID NO. :). _), IDDKS (SEQ ID NO.:_), VIDDKS (SEQ ID NO.:_), DDKSG (SEQ ID NO.:_), IDDKSG (SEQ ID NO.:_), VIDDSG (SEQ ID NO.:_). _), FVIDDK (SEQ ID NO .: _), FVIDDKS (SEQ ID NO .: _), FVIDDKSG (SEQ ID NO .: _), IFVIDDK ((SEQ ID NO .: _), IFVIDKS ((SEQ ID NO .: _), IFVIDDKSG (SE ID @ NO.: _), EEY, IEEY (SEQ ID NO.:_), EEYT (SEQ ID NO.:_), VIEYY (SEQ ID NO.:_), IEEYT (SEQ ID NO.:_), VIEYT (SEQ ID NO.:_), EEYTG (SEQ ID NO.:_), IEYTG (SEQ ID NO.:_), VIEYTG (SEQ ID NO.:_), FVIEWY (SEQ ID NO.:_), FVIEYT (SEQ ID NO .: _), FVIEYTG (SEQ ID NO .: _), FFVIEWY (SEQ ID NO .: _), FFVIEYT (SEQ ID NO .: _), FFVIEWYTG (SEQ ID NO .: _), EAQ , VEAQ (SEQ ID NO .: ), EAQT (SEQ ID NO .: _), SVEAQ (SEQ ID NO .: _), VEAQT (SEQ ID NO .: _), SVEAQT (SEQ ID NO .: _), EAQTG (SEQ ID NO .: _) ), VEAQTG (SEQ ID NO.:_), SVEAQTG (SEQ ID NO.:_), FSVEAQ (SEQ ID NO.:_), FSVEAQT (SEQ ID NO.:_), FSVEQTG (SEQ ID NO.:_) ), YFSVEAQ (SEQ ID NO.:_), YFSVEAQT (SEQ ID NO.:_), and YFSVEAQTG (SEQ ID NO.:_).
[0085]
Still further CAR sequences that may be included in the modulator include cadherin-5 @ CAR sequences (e.g., DAE, VDAE (SEQ ID NO.:_), DAET (SEQ ID NO.:_), RVDAE (SEQ ID NO.:_). ), VDAET (SEQ ID NO.:_), RVDAET (SEQ ID NO.:_), DAETG (SEQ ID NO.:_), VDAETG (SEQ ID NO.:_), RVDAETG (SEQ ID NO.:_) ), FRVDAE (SEQ ID NO.:_), FRVDAET (SEQ ID NO.:_), FRVDAETG (SEQ ID NO.:_), VFRVDAE (SEQ ID NO.:_), VFRVDAET (SEQ ID NO.:_) ) And VFRVDAETG (SEQ) A D NO.:_)).
[0086]
If a linker is used, such modulators may form a linear or branched structure. In one embodiment, a modulator having a branched structure comprises four different CAR sequences (eg, IFVIDDKSG (SEQ ID NO :: _), RGD, YIGSR (SEQ ID NO :: _), and HAV). Bifunctional modulators comprising a desmosomal cadherin CAR sequence linked to a classical cadherin CAR sequence via a linker are also preferred in certain embodiments. As mentioned above, the linker preferably creates a distance between the CAR sequences in the range 0.1-10,000 nm, more preferably in the range 0.1-400 nm. The separation distance between recognition sites can generally be determined according to the desired function of the modulator.
[0087]
The total number of CAR sequences present in the modulator (including desmosome cadherin CAR sequences with or without other CAR sequences from one or more different adhesion branches) can range from one to many (eg, 100), preferably 1-10, more preferably 1-5. Peptide modulators comprising a plurality of CAR sequences typically comprise from 6 amino acid residues to about 1000 amino acid residues, preferably 6 to 50 residues. Non-peptide linkers are used, and each CAR sequence of the modulator generally has a length of 3 to 50 residues, preferably 4 to 25 residues, and more preferably 5 to 15 residues. Present in peptides that range in size.
[0088]
As noted above, the modulator can be a polypeptide comprising only amino acid residues linked by peptide bonds only, or a salt thereof, and can comprise a non-peptide region (eg, a linker). The peptide region of the modulator may comprise L-amino acid residues, D-amino acid residues, or a combination of any of those residues. Amino acids can be from natural or non-natural sources when at least one amino group and at least one carboxyl group are present in the molecule, with alpha and beta amino acids being generally preferred. The 20 L-amino acids commonly found in proteins are identified herein by conventional three-letter or one-letter abbreviations, and the corresponding D-amino acids are indicated by a lowercase one-letter symbol. .
[0089]
Modulators can also include rare amino acids (eg, 4-hydroxyproline or hydroxylysine), organic acids or amides and / or derivatives of common amino acids (eg, C-terminal carboxylated esterification (eg, benzyl ester, methyl ester). Or amino acids with amidation and / or amino acids with modifications of the N-terminal amino group (eg, acetylation or alkoxycarbonylation), any of a wide variety of side chain modifications and / or substitutions (eg, methylation Benzylation, t-butylation, tosylation, alkoxycarbonylation, etc.). Preferred derivatives include amino acids having a C-terminal amide group. Residues other than the common amino acids that may be present with the modulator include 2-mercaptoaniline, 2-mercaptoproline, ornithine, diaminobutyric acid, α-aminoadipic acid, m-aminomethylbenzoic acid and α, β-diamino But not limited to propionic acid.
[0090]
The peptide modulators (and peptide moieties of the modulators) described herein can be synthesized by methods well known in the art, including chemical synthesis and recombinant DNA methods. For modulators up to about 50 residues in length, chemical synthesis can be performed using solution or solid phase peptide synthesis techniques. In this technique, peptide bonds occur via the direct condensation of the α-carboxy group of another amino acid with the α-amino group of one amino acid by release of a water molecule. Peptide bond synthesis by direct condensation as formed above requires suppression of the reactive characteristics of the amino group of the first amino acid and the carboxyl group of the second amino acid. The masking substituent must allow its rapid removal without inducing destruction of the unstable peptide molecule.
[0091]
In solution phase synthesis, a wide variety of coupling methods and protecting groups may be used (Gross and Meienhofer, eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1-4 (Academic Press, 1979); Bodansky and Boydky, Boyd. See "The Practice of Peptide Synthesis", 2nd edition (Springer Verlag, 1994). In addition, intermediate purification and linear scale-up are possible. Those skilled in the art understand that solution synthesis requires consideration of backbone and side chain protecting groups and activation methods. In addition, careful segment selection is required to minimize racemization during segment condensation. Solubility considerations are also a factor.
[0092]
Solid phase peptide synthesis uses an insoluble polymer as a support during organic synthesis. Polymer-supported peptide chains allow the use of simple washing and filtration steps instead of the laborious purification of intermediate steps. Solid phase peptide synthesis is generally described in Merrifield et al. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963, which involves assembling a linear peptide chain on a resin support using protected amino acids. Solid phase peptide synthesis typically utilizes either the Boc or Fmoc strategy. The Boc strategy uses 1% cross-linked polystyrene resin. A standard protecting group for the α-amino function is the tert-butyloxycarbonyl (Boc) group. This group can be removed using a dilute solution of a strong acid such as 25% trifluoroacetic acid (TFA). The next Boc-amino acid is typically coupled to the aminoacyl resin using dicyclohexylcarbodiimide (DCC). After completion of assembly, the peptide resin is treated with anhydrous HF to cleave the benzyl ester bond and release the free peptide. Side chain functionalities are usually blocked during synthesis with benzyl-derived blocking groups that are also cleaved by HF. The free peptide is then extracted from the resin using a suitable solvent, purified and characterized. The newly synthesized peptide can be purified, for example, by gel filtration, HPLC, partition chromatography and / or ion exchange chromatography, and can be characterized by, for example, mass spectrometry or amino acid sequence analysis. In the Boc strategy, a C-terminal amidated peptide can be obtained using a benzhydrylamine or methylbenzhydrylamine resin, which directly yields the peptide amide upon cleavage with HF.
[0093]
In the above procedure, the selectivity of the side chain blocking group and the peptide resin linkage depends on the difference in the rate of acidolytic cleavage. Orthoganol systems have been introduced in which side-chain blocking groups and peptide resin linkages are completely stable to the reagents used to remove the α-protecting group at each step of the synthesis. The most common of these methods involves the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) approach. In this way, the side chain protecting groups and the peptide resin linkage are completely stable to the secondary amine used to cleave the N-α-Fmoc group. Side chain protection and peptide resin ligation are cleaved by mild acidolysis. Repeated contact with a base renders Merrifield resin unsuitable for Fmoc chemistry, and p-alkoxybenzyl esters linked to the resin are commonly used. Deprotection and cleavage are generally achieved using TFA.
[0094]
Those skilled in the art understand that in solid phase synthesis, deprotection and coupling, the reaction must be completed and the side chain protecting groups must be stable throughout the entire synthesis. Furthermore, solid phase synthesis is generally best suited when the peptides are made on a small scale.
[0095]
N-terminal acetylation may be achieved by reacting the final peptide with acetic anhydride before cleavage from the resin. C-amidation can be achieved using a suitable resin, such as methylbenzhydramine resin, using Boc technology.
[0096]
Following synthesis of the linear peptide, if desired, cyclization can be achieved with or without N-acetylation and / or C-amidation by any of a variety of techniques well known in the art. In one embodiment, linkages can be made between reactive amino acid side chains. For example, a disulfide bridge can be formed from a linear peptide containing two thiol-containing residues by oxidation of the peptide using any of a variety of methods. In one such method, aerial oxidation of thiols can generate disulfide bonds over a period of several days using either basic or neutral aqueous media. This peptide is used at high dilution to minimize condensation and intermolecular side reactions. Although this method suffers from the disadvantage of being slow, H₂It has the advantage of producing only O. Or I₂And K₃Fe (CN)₆A strong oxidizing agent such as can be used to form a disulfide bond. One skilled in the art will recognize that care must be taken not to oxidize the sensitive side chains of Met, Tyr, Trp or His. The cyclic peptide produced by this method requires purification using standard techniques, but the oxidation is applicable at acidic pH. The oxidizing agent also allows the simultaneous deprotection / oxidation of the appropriate S-protected linear precursor to avoid premature non-specific oxidation of free cysteine.
[0097]
I₂And K₃Fe (CN)₆Unlike DMSO, DMSO is a mild oxidant that does not cause the oxidative side reactions of the nucleophilic amino acids described above. DMSO is H₂Miscible with O and oxidation can be performed at acidic to neutral pH with harmless by-products. Methyltrichlorosilane-diphenylsulfoxide is an alternative oxidizing agent for the simultaneous deprotection / oxidation of S-Acm, S-Tacm or St-Bu without affecting other nucleophilic amino acids. Can be used for No polymer product results from the intermolecular disulfide bond structure. Suitable thiol-containing residues for use in such oxidation methods include, but are not limited to, cysteine, β, β-dimethylcysteine (penicylamine or Pen), β, β-tetramethylenecysteine ( Tmc), β, β-pentamethylenecysteine (Pmc), β-mercaptopropionic acid (Mpr), β, β-pentamethylene-β-mercaptopropionic acid (Pmp), 2-mercaptobenzene, 2-mercaptoaniline and 2 -Mercaptoproline. Peptides containing such residues are exemplified by the following representative formula, where desmosome cadherin is desmoglein, the underline is cyclized, and the N-acetyl group is And the C-terminal amide group is NH₂Indicated by:
[0098]
(Equation 9)

It will be readily apparent to one skilled in the art that in each of these exemplary formulas, any of the above thiol-containing residues may be used in place of one or both of the thiol-containing residues shown. Similar formulations containing different non-classical cadherin CAR sequences will be made by one of skill in the art based on the CAR sequences provided herein.
[0099]
In another embodiment, cyclization may be achieved by an amide bond structure. For example, a peptide bond can be formed between terminal functional groups (ie, the amino and carboxy termini of a linear peptide prior to cyclization). One such cyclic peptide containing a desmoglein CAR sequence may or may not have an N-terminal acetyl group and / or a C-terminal amide.INQKTG(SEQ ID NO:　). In another such embodiment, the linear peptide is a D-amino acid (eg,NQKtS;SEQ ID NO:　)including. Alternatively, the cyclizationKNQKD(SEQ ID NO:　) OrKINQKTGD(SEQ ID NO:　), By linking one end and the side chains of residues with or without an N-terminal acetyl group and / or a C-terminal amide, or by using two side chains. obtain. Residues capable of forming a lactam bond include lysine, ornithine (Orn), α-aminoadipic acid, m-aminomethylbenzoic acid, α, β-diaminopropionic acid, glutamic acid or aspartic acid.
[0100]
Methods for forming amide bonds are well known in the art and are based on well-established principles of chemical reactivity. In one such method, carbodiimide-mediated lactam formation can be achieved by reaction of the carboxylic acid with DCC, DIC, EDAC or DCCI, which can react immediately with free amino groups to complete cyclization of the O-acylurea. Causes formation. The formation of an inert N-acyl urea resulting from the O → N transition involves the formation of N-hydroxy compounds such as 1-hydroxylbenzotriazole, 1-hydroxysuccinimide, 1-hydroxynorbornenecarboxamide or ethyl 2-hydroxyimino-2-cyanoacetate. Can be avoided by converting the O-acyl urea to an active ester by reaction with In addition to minimizing the O → N transition, these additives also serve as catalysts during cyclization and aid in reducing racemization. Alternatively, the cyclization can be performed using an azide method, in which a reactive azide intermediate is generated from an alkyl ester via a hydrazide. Hydrazinolysis of the terminal ester requires the use of a t-butyl group for protection of the side chain carboxyl functionality in the acylation component. This limitation can be overcome by using diphenylphosphoric acid (DPPA), which provides the azide compound directly upon reaction with the carboxyl group. The slow reactivity of azide compounds and the formation of isocyanate salts due to their heterogeneity limit the usefulness of this method. The mixed anhydride method of lactam formation is widely used for easy removal of reaction by-products. Anhydrides are formed upon reaction of the carboxylate anion with alkyl chloroformate or pivaloyl chloride. The attack of the amino component is then directed to the carbonyl carbon of the acylating component by the electron donating effect of the alkoxy group or the steric bulk of the pivaloyl t-butyl chloride group, which prevents the wrong carbonyl group from attacking. . Mixed anhydrides with phosphoric acid derivatives have also been used successfully. Alternatively, cyclization can be achieved using an activated ester. The presence of electron scavenging substitutions on the alkoxy carbons of the esters increases their susceptibility to aminolysis. Highly reactive esters of p-nitrophenol, N-hydroxy compounds and polyhalogenated phenols have made these "active esters" useful in the synthesis of amide bonds. In recent years, we have seen the discovery of benzotriazolyloxytris- (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and its congeners as an advantageous coupling reagent. These properties are generally superior to the performance of well-established carbodiimidamide bond formation reactions.
[0101]
In a further embodiment, a thioether bond may be formed between the side chain of the residue containing the thiol and the appropriately derived α-amino acid. As an example, a lysine side chain can be attached to bromoacetic acid via the carbodiimide coupling method (DCC, EDAC), and then react with any of the thiol-containing residues described above to form a thioether bond. I do. Any two thiol-containing side chains can be reacted with dibromoethane and diisopropylamine in DMF to form a dithioether. Examples of thiol-containing linkages are shown below:
[0102]
Embedded image

The cyclization also involves δ₁, Δ₁-Ditryptophan (for example, Ac-Trp-Asn-Gln-Lys-Trp-OMe) (SEQ ID NO:　) Can be achieved.
[0103]
The structures and formulas listed herein are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the cyclic peptides described herein.
[0104]
For longer modulators, recombinant methods are preferred for synthesis. In this manner, all or a portion of the modulator may be synthesized in living cells using any of a variety of expression vectors known to those of skill in the art to be appropriate for the particular host cell. Suitable host cells can include bacteria, yeast cells, mammalian cells, insect cells, plant cells, algal cells, and other animal cells (eg, hybridomas, CHOs, myeloma). The DNA sequence expressed in this manner can encode a portion of a desmosome cadherin or other adhesion molecule, or a peptide comprising an antibody fragment that specifically binds to a desmosome cadherin analog or desmosome cadherin CAR sequence. Can code. Such DNA sequences can be prepared based on known cDNA or gene sequences, or isolated by screening appropriate libraries using probes designed based on known desmosomal cadherin sequences. Prepared from the sequence. Such screening can be performed as described generally in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (and references listed therein). Polymerase chain reaction (PCR) can also be employed using oligonucleotide primers in methods well known in the art to isolate nucleic acid molecules encoding all or part of the endogenous adhesion molecule. The endogenous cadherin sequence may be modified using well-known techniques to produce a nucleic acid molecule that encodes the desired modulator. For example, moieties encoding one or more CAR sequences may be linked with or without separation by a nucleic acid sequence encoding a linker, as described above. Alternatively, portions of the desired nucleic acid sequence can be synthesized using well-known techniques, and then linked together to form a sequence encoding a modulator.
[0105]
As noted above, polynucleotides may also function as modulators. Generally, such polynucleotides should be formulated so as to allow expression of the polypeptide modulator after administration to the mammal. Such formulations are particularly useful for therapeutic purposes as described below. One of skill in the art understands that there are many ways to achieve expression of a polynucleotide in a mammal, and that any suitable method can be used. For example, the polynucleotide can be incorporated into a viral vector, such as, but not limited to, an adenovirus, an adeno-associated virus, a retrovirus, or a vaccinia virus, or another poxvirus, such as an avian poxvirus. . Techniques for incorporating DNA into such vectors are well known to those skilled in the art. Retroviral vectors may further comprise a gene for a selectable marker (to aid in the identification or selection of the transfected cells) and / or a targeting moiety (eg, a gene encoding a ligand for a receptor on a particular target cell). It can be transcribed or incorporated, making the vector target-specific. Targeting can also be achieved by using antibodies, by methods known to those skilled in the art. Other formulations for polynucleotides for therapeutic purposes include colloidal dispersion systems (eg, polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems (oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes). )). A preferred colloidal system for use as an in vitro and in vivo delivery vehicle is a liposome (ie, an artificial membrane vehicle). The preparation and use of such systems is well-known in the art.
[0106]
Additionally or alternatively, as described above, the modulator may comprise a substance such as an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the cadherin CAR sequence of the desmosome. As described herein, a substance reacts at a detectable level with a peptide comprising a cadherin CAR sequence of a desmosome and alters the order of amino acid residues in different CAR sequences or cadherin CAR sequences and / or adjacent sequences. A substance is said to "specifically bind" to a sequence (with or without adjacent amino acids) if it does not detectably react with a peptide containing the sequence. Such antibody binding properties are generally evaluated using an ELISA, which can be readily performed by those skilled in the art, for example, as described in Newton et al., Develop. Dynamics @ 197: 1-13, 1993. Can be done.
[0107]
Polyclonal and monoclonal antibodies can be raised against the desmosome cadherin CAR sequence using conventional techniques. See, e.g., Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In one such technique, an immunogen comprising a CAR sequence is first injected into any of a wide variety of mammals (eg, a mouse, rat, rabbit, sheep, or goat). Smaller immunogens (ie, less than about 20 amino acids) should be conjugated to a carrier protein (eg, bovine serum albumin or keyhole limpet hemocyanin). Following one or more injections, the animals are bled periodically. Polyclonal antibodies specific for the CAR sequence can then be purified from such antisera, for example, by affinity chromatography using a modulator or antigenic portion thereof attached to a suitable solid support.
[0108]
Monoclonal antibodies specific for the cadherin sequence of the desmosome are described, for example, in Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, as well as improvements thereof. Briefly, these methods involve the preparation of an immortalized cell line that can produce antibodies of the desired specificity from spleen cells obtained from the immunized animal as described above. The spleen cells are immortalized, for example, by fusion with a myeloma cell fusion partner (preferably isogenic to the immunized animal). Single colonies are selected and these culture supernatants are tested for binding activity to the modulator or its antigenic site. Hybridomas with high reactivity and specificity are preferred.
[0109]
Monoclonal antibodies can be isolated from supernatants of growing hybridoma colonies, with or without various techniques known in the art to increase yield. Contaminants can be removed from the antibody by conventional techniques such as chromatography, gel filtration, sedimentation, and extraction. Antibodies with the desired activity can generally be identified using immunofluorescence analysis of tissue sections, cells or other samples in which the target cadherin is located.
[0110]
In certain embodiments, the use of an antigen binding fragment of an antibody may be preferred. Such fragments include Fab fragments, which can be prepared using standard techniques. Briefly, immunoglobulins can be purified from rabbit serum by affinity chromatography on a protein A bead column (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Laboratory, 1988; see especially page 309). And digested with papain to produce Fab and Fc fragments. Fab and Fc fragments can be separated by affinity chromatography on a Protein A bead column (Harlow and Lane, 1988, 628-29).
[0111]
(Evaluation of modulator activity)
The above modulators may alter the cadherin-mediated function of one or more desmosomes. Initial screening for such activity can be performed by evaluating the ability of the modulator to bind desmosome cadherin using any binding assay known to those of skill in the art. For example, a Pharmacia Biosensor instrument may be used as discussed in Jonsson et al., Biotechniques 11: 520-27, 1991. For example, the modulator may include a CAR sequence that binds to cadherin of the desmosome. Specific examples of techniques for measuring the interaction of molecules with peptides are described in Williams et al. Biol. Chem. 272, 22349-22354, 1997. Alternatively, real-time BIA (Biomolecular @ Interaction @ Analysis) monitors the interaction of biomolecules using surface plasmon resonance, which is an optical phenomenon. Detection relies on changes in the mass concentration of macromolecules at the biospecific interface, which in turn relies on immobilization of test molecules or peptides (referred to as ligands) to the surface of the biosensor chip, Is followed by the binding of the interacting molecule, which is referred to as the analyte, to the ligand. The binding to the chip is measured in real time in arbitrary units (RU) of resonance.
[0112]
As an example, surface plasmon resonance experiments were performed using BIAcore @ X^TMIt can be performed using a biosensor (Pharmacia Ltd., BiAcore, Uppsala, Sweden). The parallel flow cell of the CM5 sensor chip can be derivatized with streptavidin (200 μg / ml) in 10 mM sodium acetate (pH 4.0) using the amine coupling method according to the manufacturer's protocol. About 2100-2600 resonance units (RU) of the ligand are immobilized and about 2.1-2.6 ng / mm²Corresponding to the concentration of The chip can then be coated with desmosome cadherin derivatized to biotin. Any non-specific binding proteins are removed.
[0113]
To determine binding, a test analyte (eg, a peptide containing the cadherin CAR sequence of the desmosome) is placed in running buffer and co-flowed through the test and control flow cells. After a period of free buffer flow, any analyte that remains bound to the surface can be removed, for example, with a pulse of 0.1% SDS, returning the signal to baseline. Specific binding to the derivatized sensor chip can be determined automatically by this system by subtracting the reaction of the control flow cell from the test flow cell from the reaction. Generally, in such assays, the modulator binds to cadherin of the desmosome at detectable levels. The level of binding is preferably at least the level observed for full-length desmosome cadherin under similar conditions.
[0114]
The ability of desmosomes to modulate cadherin-mediated function can be assessed using any of a variety of in vitro assays designed to measure the effect of peptides on cadherin-mediated responses of desmosomes in general. As noted above, the modulator may be capable of increasing or inhibiting the cadherin-mediated function of the desmosome.
[0115]
Certain cadherins of certain desmosomes are involved in adhesion of certain cell types (eg, epithelial cells). The ability of factors to modulate cell adhesion can be assessed, generally in vitro, by assaying the effect of adhesion between appropriate cells. In general, a modulator is an inhibitor of cell adhesion when contact between the modulator and the test cell results in appreciable disruption of cell adhesion. If they can promote cell adhesion (as determined by a plate assay assessing cell adhesion to a modulator attached to a support material (eg, tissue culture plastic)), modulators that increase cell adhesion (eg, Factors comprising the desmosome cadherin CAR sequences and / or desmosome cadherin CAR sequences bound to a support material) are considered as modulators of cell adhesion.
[0116]
In certain cell adhesion assays, the addition of a modulator to cells expressing desmosome cadherins results in disruption of cell adhesion. As used herein, a "desmosome cadherin-expressing cell" can be any type of cell that expresses desmosome cadherin at a detectable level using standard techniques, such as immunocytochemical protocols (eg, Blaschuk). And Farookhi, Dev. Biol. 136: 564-567, 1989). For example, such cells can be plated in the absence of a modulator under standard conditions that allow cell attachment. In the presence of a modulator (eg, 1 mg / mL), disruption of cell adhesion can be determined visually (by observing regression of cells from each other and from the substratum) at 24 hours.
[0117]
Suitable cells for use in such assays can be any of a variety of cells that express the desmosome cadherin of interest. Certain cells express one or more cadherins endogenously. In general, MDCK cells or keratinocytes can be used to assess desmocholine or desmoglein-mediated cell adhesion. It is clear that other cells can also be used in such assays to provide cells expressing the desmosome cadherin of interest.
[0118]
Alternatively, cells that do not naturally express cadherin can be used in such assays. Such cells can be stably transfected with a polynucleotide (eg, cDNA) encoding one or more cadherins of interest, such that cadherin is expressed on the cell surface. For example, as described above, both desmoglein and desmocholine may be required for optimal cell adhesion, and such assays are performed on cells transformed with polynucleotides encoding both of these desmosome cadherins. Can be implemented. Cadherin expression can be confirmed by assessing the adhesion of transfected cells with a combination of immunocytochemical techniques using antibodies directed against the cadherin of interest. As determined by light microscopy, stably transfected cells aggregated after transformation express sufficient levels of desmosome cadherin. Preferred cells for use in such assays include L cells, which do not detectably adhere and do not express any cadherin (Nagafuchi et al., Nature 329: 341-343, 1987). Aggregation is observed after transformation of L cells with a cDNA encoding one or more cadherins. Modulators that detectably inhibit such aggregation can be used to modulate cadherin-mediated functions. Such assays include a number of non-classical cadherins (OB-cadherin (Okazaki et al., J. Biol. Chem. 269: 12092-98, 1994), cadherin-5 (Breier et al., Blood # 87: 630-641, 1996). ), Cadherin-6 (Mbalaviele et al., J. Cell. Biol. 141: 1467-1476, 1998), cadherin-8 (Kido et al., Genomics # 48: 186-194, 1998), cadherin-15 (Shimoyama et al., J. Am. Biol. Chem. 273: 10011-10018, 1998), PB-cadherin (Sugimoto et al., J. Biol. Chem. 271: 11548-11556, 1996), LI-cadherin (Kreft et al., J. Cell). Biol. 136: 1109-1121, 1997), protocadherins # 42 and 43 (Sano et al., EMBO {J. 12: 2249-2256, 1993), and desmosome cadherins (Marcozzi et al., J. Cell. Sci. 111: 495-509). , 1998; Tselepis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8064-8069, 1998). It will be apparent to one of skill in the art that the assay can be performed in a similar manner on other cadherins.
[0119]
Transfection of cells for use in cell adhesion assays can be performed using standard techniques and published cadherin sequences. For example, desmosome cadherin sequences can be found in the references listed herein and in the GenBank database. GenBank accession numbers for specific desmosome cadherins include: X56654 (human desmoglein 1); Z26317 and S64273 (human desmoglein 2); X72925 (human desmocholine 1) X56807 (human desmocholine 2); X83929 (human desmocholine 3); and D17427 (human desmocholine 4).
[0120]
By way of example, assays to assess modulators for their ability to inhibit desmosome cadherin-mediated function may assess the effect of modulators on electrical resistance across a cell monolayer. For example, Madin @ Darby canine kidney (MDCK) cells can be exposed to a modulator dissolved in medium (eg, 0.5 mg / ml final concentration for 24 hours). The effect on electrical resistance can be measured using standard techniques. This assay evaluates the effect of modulators on close junction formation in epithelial cells. Generally, the presence of the modulator at 500 μg / mL results in a statistically significant decrease in electrical resistance after 24 hours.
[0121]
Other assays involve visual assessment of cell adhesion using standard techniques. In general, modulators from a particular desmosome cadherin CAR sequence (ie, such CAR sequences, or analogs or mimetics thereof, or antibodies that specifically recognize such CAR sequences), and similar desmosome cadherins Modulators that detectably modulate the adhesion of cells that express TGF2 are thought to modulate desmosome cadherin-mediated functions.
[0122]
Other assays can be used to assess the effect of a modulator on specific desmosome cadherin-mediated functions. For example, modulators that inhibit the interaction between desmoglein and desmocholine may increase skin permeability. This ability can be assessed, for example, by assessing the effect of a modulator on the permeability of the adherent epithelial and / or endothelial cell layers (eg, human skin). Such skin can be from natural sources or from synthetic sources. Human abdominal skin for use in such assays can generally be obtained from a necropsied human within 24 hours of death. Briefly, modulators (eg, 500 μg / ml) and test markers (eg, the fluorescent marker Oregon @ Green)^TMAnd Rhodamine @ Green^TMDextran) can be dissolved in a sterile buffer (eg, phosphate buffer, pH 7.2) and the ability of the marker to penetrate through the skin and into the receptor fluid (eg, phosphate buffer) is determined by Franz @ Cell It can be measured using an instrument (Franz, Curr. Prob. Dermatol. 7: 58-68, 1978; Franz, J. Invest. Dermatol. 64: 190-195, 1975). Permeation of the marker through the skin can be assessed, for example, 6, 12, 24, 36 or 48 hours after the start of the experiment. Generally, modulators that increase the permeability of human skin statistically significantly increase the amount of markers in the receptor fraction after 6 to 48 hours in the presence of 500 μg / mL of the modulator.
[0123]
(Modifier modification and formulation)
A modulator as described herein can be, but need not be, linked to one or more additional molecules. In particular, as discussed below, a plurality of modulators (which may be, but need not be, the same) are coupled to a support material (eg, a single molecule (eg, keyhole limpet hemocyanin). )), Or a solid support (eg, a polymer matrix, which can be formulated as a membrane or microstructure, such as an ultrathin film), a container surface (eg, a tissue culture plate surface or the interior surface of a bioreactor), Alternatively, linking to beads or other particles, which can be prepared from a variety of materials including glass, plastic or ceramic, can be beneficial for certain applications. The support material can be, for example, cellulose and its derivatives, collagen, spider silk, or various polyesters (eg, hydrids). Xylates and / or lactone derived polyesters) or sutures (see US Patent No. 5,245,012) Within certain embodiments, modulators and other CAR sequences may be used. The containing molecule (eg, a HAV or RGD sequence, or an OB-cadherin or cadherin-5 ヘ CAR sequence as described above) may be linked to a support, such as a polymer matrix, preferably in an alternative pattern.
[0124]
Suitable methods of attaching the modulator to the support material will depend on the composition of the support and the intended use, and will be readily apparent to those skilled in the art. The linkage is generally via a non-covalent association (eg, adsorption or affinity) or, preferably, a covalent linkage, which is a direct bond between the modulator and a functional group of the support, or a bridge. (Which can be agent linked). Binding of the modulator by adsorption can be achieved by contacting the solid support in a suitable buffer for a suitable time. This contact time varies with temperature, but is generally between about 5 seconds and 1 day, and typically between about 10 seconds and 1 hour.
[0125]
Covalent attachment of a modulator to a molecule or solid support generally involves initially linking the support material with a bifunctional reagent, which also reacts with a functional group such as a hydroxyl or amino group of the modulator. Can be achieved. For example, the modulator can be prepared using a benzoquinone using a benzoquinone, by condensation of an aldehyde group of the polymer support with an amine and active hydrogen of the regulator, or by condensation of an amino group of the support with a carboxylic acid of the regulator. Or it may be bonded to a coating. A preferred method of creating the linkage is through the amino group using glutaraldehyde. Modulators can be linked to cellulose via ester linkages. Similarly, the amide bond may be suitable for linking to other molecules such as keyhole limpet hemocyanin or other support material. Molecules containing multiple modulators and / or other CAR sequences can be used, for example, in a random coupling where such equimolar amounts of the molecules are mixed with a matrix support and bind randomly. Enable).
[0126]
Modulators as described herein may preferentially bind to specific tissues or cells, and thus may be sufficient to target a desired site in vivo, For applications, it may be beneficial to include additional targeting agents. Thus, the targeting agent may also, or alternatively, bind to a modulator to facilitate targeting one or more specific tissues. As used herein, a “targeting agent” is any compound that, when bound to a modulator, increases transport of the modulator to a target cell, thereby increasing the local concentration of the modulator. It can be a substance (eg, a compound or a cell). Targeting agents include antibodies or fragments thereof, receptors, ligands, and other molecules that bind to cells in or near the target tissue. Known targeting agents include serum hormones, antibodies to cell surface antigens, lectins, adhesion molecules, tumor cell surface binding ligands, steroids, cholesterol, lymphokines, fibrinolytic enzymes, and those drugs that bind to desired target sites And proteins. Among many monoclonal antibodies, monoclonal antibodies that can act as targeting agents include anti-TAC, or other interleukin-2 receptor antibodies; 9.2.27 and NR-ML-05 (250 kilodalton human black). Reactive with proteoglycans associated with tumors); and NR-LU-10 (reactive with pancarcinoma glycoprotein). The antibody targeting agent can be an intact (all) molecule, a fragment thereof, or a functional equivalent thereof. Examples of antibody fragments are F (ab ') 2, -Fab', Fab and F [v] fragments, which can be produced by conventional methods or by genomic or protein engineering. Attachment is generally covalent and may be achieved, for example, by direct condensation or other reactions, or by bifunctional or multifunctional linkers.
[0127]
For certain embodiments, linking the drug to the modulator may also or alternatively be beneficial. As used herein, the term "drug" refers to any bioactive agent that is intended to be administered to a mammal to prevent or treat a disease or other undesirable condition. Drugs include hormones, growth factors, proteins, peptides and other compounds. The use of certain drugs in the context of the present invention is discussed below.
[0128]
A modulator as described herein can be present in a pharmaceutical composition. Pharmaceutical compositions contain one or more modulators in combination with one or more pharmaceutically or physiologically acceptable carriers, diluents or excipients. Such compositions may include buffers (eg, neutral buffered saline or phosphate buffered saline), carbohydrates (eg, glucose, mannose, sucrose or dextran), mannitol, proteins, polypeptides or glycine. Amino acids, antioxidants, chelating agents such as EDTA or glutathione, adjuvants (eg, aluminum hydroxide) and / or preservatives. Within yet other embodiments, the compositions of the present invention may be formulated as a lyophilizate. One or more modulators (alone or in combination with targeting agents and / or agents) can, but need not, be encapsulated in liposomes using well-known techniques. The compositions of the invention may be formulated in any suitable mode of administration, such as topical, oral, nasal, intravenous, intracranial, intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular administration. .
[0129]
For certain embodiments, as described below, the pharmaceutical composition may further contain one or more molecule-mediated modulators of cell adhesion other than the specific desmosome cadherins. Such modulators can generally be prepared as described above using one or more CAR sequences and / or antibodies thereto. Such compositions comprise a plurality of cell adhesion molecules (eg, classical cadherins (eg, N-cadherin and E-cadherin); non-classical cadherins, integrins; occludin; claudin; N-CAM and / or extracellular It is particularly useful in situations where it is desired to inhibit cell adhesion mediated by matrix proteins (eg, laminin, fibronectin, collagen, vitronectin, entactin and tenascin) and other members of the cadherin gene superfamily.
[0130]
The pharmaceutical composition may also, or alternatively, include one or more drugs, which may be linked to a modulator or may be free within the composition. Virtually any drug may be administered in combination with a modulator as described herein for a variety of purposes, as described below. Examples of drug types that can be administered with the modulator include: analgesics, anesthetics, antianginals, antifungals, antibiotics, anticancer agents (eg, taxol or mitomycin C), anti-inflammatory agents (Eg, ibuprofen and indomethacin), anthelmintics, antidepressants, antidotes, antiemetics, antihistamines, antihypertensives, antimalarials, microtubule inhibitors (eg, colchicine or vinca alkaloids), antimigraine agents Antimicrobial agents, antipsychotics, antipyretics, preservatives, anti-signaling agents (eg, inhibitors of protein kinase C or intracellular calcium mobilization), anti-arthritic agents, Antithrombin, antituberculous, antitussive, Viral, appetite suppressant, cardioagonist, chemical dependent drug, laxative, chemotherapeutic, coronary artery, cerebral or peripheral nerve vasodilator, contraceptive, suppressant, diuretic, expectorant , Growth factors, hormonal agents, hypnotics, immunosuppressants, narcotic antagonists, parasympathomimetics, analgesics, stimulants, sympathomimetics, toxins (eg, cholera toxin), tranquilizers and urinary anti-infectives (Urinary @ antiinfective).
[0131]
For imaging purposes, any of a variety of diagnostic agents can be incorporated into pharmaceutical compositions, either linked to modulators or free within this composition. Diagnostic agents include any substance that is administered to elucidate a physiological function within a patient, but that leaves other physiological functions generally unaffected. Diagnostic agents include the following: metals, radioactive isotopes and radiopaque agents (eg, gallium, technetium, indium, strontium, iodine, barium, bromine and phosphorus containing compounds), radiolucent agents, Contrast agents, dyes (eg, fluorescent dyes and chromophores) and enzymes that catalyze colorimetric or fluorometric reactions, generally such factors are coupled using various techniques as described above. And can be in any orientation.
[0132]
The compositions described herein can be administered as part of a sustained release formulation (ie, a formulation such as a capsule or sponge that provides for a slow release of modulator after administration). Such formulations may generally be prepared using well-known techniques and may be administered, for example, by oral, rectal or subcutaneous implantation, or by implantation at a desired target site. Sustained-release preparations may include a modulator dispersed in a carrier matrix and / or contained in a reservoir surrounded by a rate controlling membrane (see, eg, European Patent Application 710,491ΔA). Carriers for use in such formulations are biocompatible and may also be biodegradable; preferably, the formulations provide a relatively constant release level of the modulator. The amount of modulator included in a sustained release formulation depends upon the site of implantation, the rate of release and the expected duration of release, and the nature of the condition to be treated or prevented.
[0133]
The pharmaceutical compositions of the invention may be administered in a manner appropriate to the disease to be treated (or prevented). The appropriate dosage and duration and frequency of administration can be determined by such factors as the condition of the patient, the type and severity of the patient's disease, and the mode of administration. In general, a suitable dosage and treatment regime will provide the modulator in an amount sufficient to provide a therapeutic and / or prophylactic benefit. In a particularly preferred embodiment of the invention, the modulator or pharmaceutical composition as described herein comprises 0.001 to 50 mg / kg body weight of a daily single or multiple dose regimen. The dose can be administered in a range of doses, preferably in the range of 0.1 to 20 mg / kg body weight. For topical administration, creams will contain the modulator in an amount typically ranging from 0.00001% to 1%, preferably 0.0001% to 0.002%. Fluid compositions typically contain about 10 ng / ml to 5 mg / ml, preferably about 10 μg to 2 mg / ml of modulator. Appropriate dosages are generally determined using experimental models and / or clinical trials. In general, the use of the lowest dose sufficient to provide effective treatment is preferred. Patients can generally be monitored for therapeutic effect using assays appropriate for the condition to be treated or prevented, which are known to those of skill in the art.
[0134]
(Use of regulator method)
In general, the modulators and compositions described herein can be used to modulate functions, such as cell adhesion, of desmosome cadherin-expressing cells. Such modulation can be performed in vivo and / or in vitro, preferably in a mammal such as a human, using any method of contacting the modulator with desmosome cadherin-expressing cells. As noted above, modulators for the purpose of disrupting desmosome cadherin-mediated cell adhesion include agents that recognize the desmosomal cadherin CAR sequence, multiple proximal desmosome cadherin CAR sequences, and / or recognize the desmosome cadherin CAR sequence. (Eg, antibodies or antigen-binding fragments thereof). Where it is also desirable to disrupt cell adhesion mediated by other adhesion molecules, the modulator may further bind one or more CAR sequences (and / or bind to such sequences) bound by such adhesion molecules. , Their antibodies or fragments), and preferably comprises one or more CAR sequences separated from each other by a linker and separated from the desmosome cadherin CAR sequence. As mentioned above, such a linker may or may not include one or more amino acids. To enhance cell adhesion, the modulator may comprise one or more desmosomal cadherin CAR sequences derived from one or more desmosome cadherins or antibodies (or fragments), preferably desmosome cadherin CAR sequences separated by a linker, and And / or can be bound to a single molecule or a support material as described above. If it is also desired to enhance cell adhesion mediated by other adhesion molecules, the modulator will bind to one or more CAR sequences (and / or to these sequences) bound by such adhesion molecules , Their antibodies or fragments), preferably, further comprising a CAR sequence separated from each other and separated from the desmosome cadherin CAR sequence by a linker.
[0135]
Certain methods involving disruption of cell adhesion as described herein have advantages over the prior art in blocking tumor cell adhesion. As described in more detail below, modulators as described herein may also be used in various other contexts to disrupt or enhance cell adhesion. In each of the methods described herein, one or more modulators may generally be administered alone or in a pharmaceutical composition. In each of the specific methods described herein, as described above, a targeting agent may be used to increase the local concentration of the modulator at its target site.
[0136]
In one aspect, a method is provided wherein cell adhesion is reduced. In one such aspect, the invention provides a method for reducing unwanted cell adhesion in a mammal by administering a modulatory agent as described herein. Unwanted cell adhesion, for example, between tumor cells, between tumor cells and normal cells, or surgery, injury, chemotherapy, disease, inflammation, or other conditions that endanger cell growth or function Can occur with normal cells as a result of In one particularly preferred embodiment, the modulator can further disrupt cell adhesion mediated by multiple adhesion molecules. Such factors may include, in addition to one or more desmosome cadherin CAR sequences, a CAR sequence, such as the classic cadherin CAR sequence HAV sequence, an RGD sequence, which may be an integrin, OB-cadherin or the above. Cadherin-5 CAR sequence, such as occlusal CAR sequence LYHY (SEQ ID NO: _) and / or claudin CAR sequence IYSY (SEQ ID NO: _), preferably desmosome cadherin CAR via a linker Separated from the array. Alternatively, dissociative modulators of cell adhesion mediated by other adhesion molecules can be combined with the modulator and administered either together or separately with the same pharmaceutical composition.
[0137]
Topical administration of modulators is generally preferred, but other means may also be used. Preferably, the fluid composition for topical administration (including, for example, physiological saline) comprises the above amount of modulator, and more preferably comprises an amount of 10 μg / mL to 1 mg / mL. . Creams may generally be formulated as described above. Topical administration in the operative area may be specific to the irrigation of the wound, i.e., intermittent or continuous irrigation with a surgical drain after surgery, or if no surgery needs to be performed, in areas of inflammation, injury or disease. It can be given at once for surgical purposes by the use of a drain that is inserted manually. Alternatively, parenteral or transdermal administration can also be used to achieve similar results.
[0138]
Certain modulators as provided herein can be used to facilitate transdermal drug delivery. Transdermal delivery of drugs is a simple and non-invasive method that can be used to maintain relative steady blood levels of the drug. Generally, to facilitate drug delivery through the skin, it is necessary to disrupt the adhesion between epithelial cells (keratinocytes) and microvascular endothelial cells. Using currently available technology, only small, uncharged molecules can be delivered across the skin in vivo. The methods described herein are not subject to comparable limitations. Thus, a wide variety of drugs can be transported across the epithelial and endothelial cell layers of the skin for systemic or local administration. Such drugs may be delivered to the melanoma or may be placed in the blood stream of the mammal for delivery to other sites in the body.
[0139]
Modulators and drugs as described herein are contacted with the skin surface to enhance delivery of the drug through the skin. Multifunctional modulators comprising multiple non-classical cadherin CAR sequences, such as desmosome cadherin CAR sequences in combination with CAR sequences derived from OB-cadherin or cadherin-5, may also be used. Such modulators may also or alternatively include the classical cadherin CAR sequence HAV, fibronectin CAR sequence RGD, which may be recognized by integrins and / or occlusal CAR sequence LYHY (SEQ ID NO: _). Alternatively, a separate modulator of cell adhesion can be administered either in the same pharmaceutical composition or separately, in combination with a modulator.
[0140]
Contact can be by direct application of a modulating agent, in a composition generally formulated as a cream or gel, or by various skin contacting devices for transdermal application (European Patent Application 566,816A; US Pat. 5,613,958; devices as described in US Pat. No. 5,505,956). Skin patches provide a convenient means of administration, particularly for sustained release formulations. Such patches may include a reservoir of modulator and drug separated from the skin by a membrane through the skin where the drug diffuses. In other patch designs, the modulator and drug can be dissolved or suspended in a polymer or adhesive matrix, which is then placed in direct contact with the patient's skin. The modulator and drug can then diffuse from the matrix into the skin. The modulator and drug may be included in the same composition or skin patch, or may be administered separately, but are preferably administered simultaneously and at the same site. In general, the amount of modulator administered through the skin will vary with the nature of the condition, which can be treated or prevented, but can vary as described above. Such a level may be achieved by appropriate adjustments to the device used, or by applying a cream formulated as described above. Delivery of the drug across the skin to the target tissue can be predicted, for example, based on in vitro studies using the Franz cell device, and can be assessed in vivo by appropriate means apparent in the art. As an example, monitoring the serum level of a drug administered over time provides a measure of the easy transmission of the drug across the skin.
[0141]
The transdermal drug delivery described herein is particularly useful to avoid fluctuations in drug blood levels if a constant rate of drug delivery is desired. For example, morphine is an analgesic usually used immediately after surgery. When given intermittently in parenteral form (intramuscular, intravenous), patients usually feel drowsy during the first hour, get better during the next two hours, and ache during the last hour It is. This is because blood levels rise sharply after injection and decrease below the desired level before the four hour interval for reinjection to be achieved. The transdermal administration described herein allows for maintenance of a constant level for an extended period of time (eg, days), which allows for adequate pain control and at the same time mental agility. Insulin provides another such example. Many diabetics require maintenance of a constant basal level of insulin, which varies in need during mealtimes. This basal level can be maintained using transdermal administration of insulin, as described herein. Antibiotics can also be administered at a constant rate to maintain adequate bacterial blood levels, while avoiding high levels that frequently respond to toxicity (eg, too high a level of gentamicin that typically results in nephrotoxicity).
[0142]
Drug delivery by the method of the present invention also provides a more convenient method of drug administration. For example, administering parenteral drugs to newborns and infants is often particularly difficult due to the difficulty in locating an acceptable caliber vessel for the catheter. However, newborns and infants often have relatively large skin areas compared to adults. Percutaneous drug delivery allows for easier management of such patients, and allows for certain types of care to be provided at home, which can now only be provided in hospitals. Typically, patients with similar difficulties in catheterizing a vein are patients receiving chemotherapy or dialysis. Further, for patients receiving long-term treatment, transdermal administration as described herein is more convenient than parenteral administration.
[0143]
The transdermal administration described herein also allows the gastrointestinal tract to be avoided in situations where parenteral use is impractical. For example, there is an increasing need for methods suitable for the administration of small therapeutic peptides and proteins, which are typically digested in the gastrointestinal tract. The methods described herein allow for the administration of such compounds and allow for easy administration over extended periods of time. Patients having problems with their gastrointestinal absorption due to prolonged bowel obstruction or certain gastrointestinal disorders that limit drug intake were also prescribed for the transdermal application described herein Get benefits from drugs.
[0144]
In addition, there are many clinical situations where it is difficult to maintain compliance. For example, patients with mental problems (eg, patients with Alzheimer's disease or psychiatric illness) do not need to rely on their ability to take their medication at a particular time of day, but provide a steady rate of drug delivery. Is more easily managed when done. Patients who simply forget to take the prescribed medication will also be more difficult to remember if they simply have to wear a skin patch periodically (eg, every three days). Patients with asymptomatic diseases, such as hypertensive patients, may especially forget to take their prescribed medication.
[0145]
For patients taking multiple drugs, devices for transdermal applications such as dermal patches may be formulated with the combination of drugs often used together. For example, many heart failure patients are given digoxin in combination with furosemide. The combination of both drugs in a single dermal patch facilitates administration and reduces the risk of misuse (taking the right pills at the right time is often a nuisance to the elderly. A) reduce the psychological tension of taking "too many pills", reduce overdose due to irregular activity, and improve compliance.
[0146]
The methods described herein are particularly applicable to humans, but also have various veterinary uses (e.g., growth factors or Administration of hormones).
[0147]
As noted above, a wide variety of drugs can be administered according to the methods provided herein. Some examples of drug categories that can be administered transdermally include anti-inflammatory drugs (eg, in arthritis and other situations) (eg, all NSAIDs, indomethacin, prednisone, etc.); morphine, codeine, Demerol, acetaminoine. Analgesics containing acetoaminophen and combinations thereof (eg, codeine plus acetaminophen), especially when oral absorption is not possible (eg, after surgery), and parenteral administration is not convenient or desirable Antibiotics (eg, vancomycin, which is not absorbed by the GI tract and is often given intravenously) or a combination of INH and rifampicin (eg, for tuberculosis)); anticoagulants (eg, heparin) (This is well absorbed by the GI tract And generally given parenterally, resulting in fluctuations in blood levels with an increased risk of bleeding at high levels and a risk of ineffectiveness at low levels) and warfarin, which is absorbed by the GI tract (Cannot be administered immediately after abdominal surgery due to normal bowel obstruction after the surgical procedure)); (eg, in situations where compliance is a critical issue as in Alzheimer's disease, or stable blood levels Antidepressants (e.g., where amitriptyline, imipramine, prozac, and the like), where maintenance of the drug results in significant reduction of anticholinergic side effects and good tolerance in the patient. Improve compliance and improve blood levels Antihypertensives (e.g., diuretics and beta blockers, which can be administered in the same patch; e.g., furosemide and propanolol); (e.g., to promote compliance, Antipsychotics (eg, haloperidol and chlorpromazine); and (eg, high blood levels after oral administration) to facilitate and confirm that family members have received this drug. Anxiolytics or sedatives to avoid loss of agility associated with and to allow continuous benefit throughout the day by maintaining a constant level of treatment.
[0148]
Many other drugs, including naturally occurring and synthetic hormones, growth factors, proteins and peptides, can be administered as described herein. For example, insulin and human growth hormone, growth factors such as erythropoietin, interleukins and interferons can be delivered through the skin.
[0149]
Kits for the administration of a drug through the skin of a mammal are also provided in the present invention. Such kits typically include a device for transdermal administration (eg, a skin patch) in combination with or impregnated with one or more modulators. Drugs can further be included in such kits.
[0150]
In a related aspect, the modulators described herein can be used to increase the permeability of the endothelial and epithelial cell layers, thereby allowing for the sampling of blood fractions by passive diffusion. Facilitate. Such methods allow for the detection and / or measurement of the level of specific molecules circulating in the blood. Generally, in order to sample the blood fraction, it is necessary to perturb the attachment of microvessels between epithelial cells (keratinocytes) and endothelial cells. Using currently available techniques, only small, uncharged molecules can be detected through the skin in vivo. The methods described herein do not suffer from the same limitations. Thus, a wide variety of blood components can be sampled through the epithelial and endothelial cell layers. Such sampling can be achieved through any such cell layer, including, for example, skin and gingiva.
[0151]
For example, application of one or more modulating agents to the skin through a skin patch described herein may cause the patch to accumulate a small amount of fluid containing a representative sample of serum, such as a sponge. Enable to work. The patch is then removed after a specific time and analyzed by a technique appropriate for the compound of interest (eg, pharmaceutical, hormone, growth factor, metabolite or marker). Alternatively, the patch may be impregnated with a reagent that allows the color to change if a particular substance (eg, an enzyme) is detected. Substances that can be detected in such a manner include, but are not limited to, illicit drugs such as cocaine, HIV enzymes, glucose and PSA. This technique has particular benefits for home test kits.
[0152]
To facilitate sampling of the patient's blood, a modulator as described above to enhance drug delivery is contacted with the skin surface. Modulators and reagents for assaying blood components may (but need not) be included in the same composition or dermal patch. Generally, the amount of modulator administered through the skin can vary as described above. Such a level can be achieved by appropriate adjustment to the device used or application of a cream formulated as described above. Movement of blood components through the skin can be predicted, for example, based on in vitro studies using a Franz cell device, and assessed in vivo by appropriate means that will be apparent to those skilled in the art.
[0153]
For example, kits for blood component sampling through mammalian skin or gingiva are also provided as the present invention. Such kits generally include devices for transdermal administration (ie, skin patches) that are combined with or impregnated with one or more modulators. Can be Reagents for the detection of blood components can be further included in such kits.
[0154]
In a further aspect, a method is provided for enhancing delivery of a drug to a tumor in a mammal, the method comprising administering to the tumor-bearing mammal a modulator in combination with the drug. Such modulatory agents may include only the desmosomal cadherin CAR sequence or one or more other non-classical or classical cadherin CAR sequences (eg, OB cadherin, cadherin-5, cadherin-6, E-cadherin and And / or N-cadherin (eg, a CAR sequence derived from HAV, SHAVSS (SEQ ID NO: _), AHAVDI (SEQ ID NO: _ or an analog of such a sequence)). Bifunctional modulators comprising a desmosome cadherin CAR sequence with either an adjacent E-cadherin-specific sequence or an adjacent N-cadherin-specific sequence linked via a linker to the desmosome cadherin CAR sequence are also preferred. . Preferably, the peptide portion of the modulator comprises 6 to 16 amino acids. This is because longer peptides are difficult to dissolve in aqueous solutions and can be degraded by peptidases.
[0155]
In one particularly preferred embodiment, the modulator can disrupt cell adhesion mediated by multiple adhesion molecules. For example, a single branched modulator (or multiple factors bound to a single molecule or support material) may be responsible for desmosome cadherin-mediated adhesion as well as E-cadherin, N-cadherin, occludin, claudin. And can disrupt integrin-mediated cell adhesion. Such factors serve as multifunctional disruptors of cell adhesion. Alternatively, another modulator may be administered in combination with the modulator, either within the same pharmaceutical composition or separately. Preferred antibody modulators include Fab fragments directed against a non-classical or classical cadherin CAR sequence, as described above. The Fab fragment may be incorporated into a modulator or may be present in another modulator administered at the same time.
[0156]
Preferably, the modulator and the drug are formulated in the same composition or drug delivery device before being administered. In general, modulators can increase drug delivery to any tumor, such as breast, gastric, ovarian or renal tumors, and the method of administration can be selected based on the target tumor type. For example, injection or local administration as described above may be preferable for melanoma and other accessible tumors (eg, metastases from primary ovarian tumors may be treated by flushing the peritoneal cavity with the composition) ). Other tumors, such as breast cancer, can be treated by injection of modulators and drugs, such as mitomycin C, at the site of the tumor. In other examples, the composition can be administered systemically and can target the tumor using any of a variety of specific targeting agents. Suitable agents can be identified by those skilled in the art based on the type of cancer to be treated (eg, Taxol for breast cancer). In general, the amount of modulator administered will vary with the mode of administration and the nature of the tumor, and is within the classical ranges provided above, preferably from about 1 μg / mL to about 2 mg / mL and more preferably about 10 μg. / ML to about 1 mg / mL. Drug transfer to the target tumor can be assessed by any suitable means apparent to one of skill in the art. The drug may also be labeled (eg, using a radionuclide) to allow direct observation of migration to the target tumor using standard imaging techniques.
[0157]
In a related aspect, the invention provides a method for treating cancer in a mammal. Such modulators may include only desmosome cadherin CAR sequences, or one or more other non-classical or classic cadherin CAR sequences (eg, OB-cadherin, cadherin-5, cadherin-6, E -Cadherin and / or CAR sequences from N-cadherin). CAR sequences (eg, RGD) that are involved in integrin-mediated cell adhesion can also be used. For example, such modulators may further comprise sequences such as HAV, SHAVSS (SEQ ID NO), AHAVDI (SEQ ID NO), RGD, YIGSR (SEQ ID NO_) or derivatives of such sequences. Preferably, the peptide portion of such a modulator comprises 6 to 16 amino acids. Preferred antibody modulators include Fab fragments directed against a non-classical or classical cadherin CAR sequence. Fab fragments can either be incorporated into a modulator or be present in a separate modulator that is administered at the same time.
[0158]
Modulators can be administered alone (eg, via the skin) or in a pharmaceutical composition. For melanoma and other certain accessible tumors, injection or local administration as described above may be preferred. Other tumors, such as bladder, bronchial or tracheal tumors, can be treated by injection of a modulating agent into the cavity. In other examples, the composition may be administered systemically and targeted to a tumor using any of a variety of specific targeting agents, as described above. Preferably, the tumor is a breast, gastric or kidney tumor. Generally, the amount of modulator administered will vary depending on the mode of administration and the nature of the cancer, but can vary within the ranges identified above. The effectiveness of a cancer treatment can be assessed using well-known clinical observations, such as monitoring the level of a serum tumor marker, such as CEA or PSA.
[0159]
The addition of a targeting agent as described above may be beneficial, especially if the administration is systemic. The appropriate form of administration and dosage depends on the condition to be prevented or treated, but generally, administration by injection is appropriate. The dose can vary as described above. The effectiveness of the inhibition can be roughly assessed by assessing that the tumor is unable to sustain growth and can be assessed microscopically by observing the absence of nerves in the periphery of the tumor.
[0160]
In yet another related aspect, the invention provides a method for inducing apoptosis in desmosome cadherin-expressing cells. Such modulators may include only desmosome cadherin CAR sequences or one or more other non-classical or classical cadherin CAR sequences (eg, HAV, SHAVSS (SEQ ID NO NO), AHAVDI (SEQ ID @ NO_), RGD, YIGSR (SEQ @ ID @ NO_) or an analog of such an arrangement). Preferably, the peptide portion of such a modulator comprises 6 to 16 amino acids. Preferred antibody modulators include Fab fragments directed against a non-classical or classical cadherin CAR sequence. Fab fragments can either be incorporated into a modulator or be present in a separate modulator that is administered at the same time. Administration can be topical, via injection or by other means, and addition of the targeted agent can be beneficial, especially if administration is systemic. The appropriate form and dosage of administration will depend on the location and nature of the cells for which induction of apoptosis is desired, but in general, the dose may vary as described above. Biopsies can be performed to assess the level of induction of apoptosis.
[0161]
In certain other aspects, the invention provides methods for increasing adhesion of desmosome cadherin-expressing cells. In certain embodiments, the modulator can be attached to a solid support, resulting in a matrix comprising a plurality of modulators. In one such embodiment, the support is a polymer matrix and the modulators and molecules, including other CAR sequences, bind to the polymer matrix (eg, either the HAV sequence or the RGD sequence). Modulators and molecules comprising can be bound to the same matrix, preferably in an alternating pattern). Such matrices can be used in the context in which it is desired to increase adhesion mediated by multiple cell adhesion molecules. Alternatively, the modulator itself may comprise a plurality of desmosome cadherin CAR sequences or antibodies (or fragments thereof) separated by a linker as described above. In either way, the modulator functions as a "biological adhesive" that binds to multiple desmosome cadherin-expressing cells in various contexts.
[0162]
In one such aspect, the plurality of modulating agents comprising a desmosome cadherin CAR sequence modulator and / or bound to a single molecule or support material are used to promote wound healing and / or scarring in a mammal. Can be used to mitigate tissue. Such a modulator may include one desmosome cadherin CAR sequence or may include a plurality of such sequences, such as a desmoglein CAR sequence and a desmocholine CAR sequence. Optionally, the modulator comprises one or more other non-classical cadherin CAR sequences (eg, a CAR sequence from OB-cadherin or cadherin-5 and / or one or more classic cadherin CAR sequences (HAV , SHAVSS (including SEQ @ ID @ NO_), AHAVDI (including SEQ @ ID @ NO_)) or analogs of such an arrangement. Preferred antibody modulators include Fab fragments directed against either the non-classical cadherin or E-cadherin CAR sequence. Modulators that are bound to biocompatible and biodegradable matrices, such as cellulose or collagen, are particularly preferred. For use in such a method, the modulator should have a free amino or hydroxyl group. The modulating agent is generally administered topically to the wound, where the modulating agent may promote wound closure and strengthen the suture, or may even replace it. Similarly, administration of matrix-binding modulators can promote cell adhesion in skin graft and prosthesis transplantation and can extend the duration and usefulness of collagen injections. In general, the amount of matrix-binding modulator administered to a wound, graft or implantation site will vary with the severity of the wound and / or the nature of the wound, graft or implant. Can be varied as Multifunctional modulators, including desmosome cadherin sequences, classical cadherin CAR sequences (HAV) and CAR sequences bound by specific integrins (RGD), are also potent stimulators of wound healing and / or reduce scar tissue Can be used to Alternatively, one or more other modulators of classical cadherin-mediated cell adhesion or classical integrin-mediated cell adhesion are administered in combination with the modulator, either in the same pharmaceutical composition or another. obtain.
[0163]
In a further aspect, modulators can be used in the treatment of autoimmune blistering disorders such as pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus and intercellular IgA dermatosis. These disorders are pathological conditions in which patients begin to develop antibodies to one or more desmosome cadherins. As a result, the adhesion of skin cells begins to fail, resulting in various types of blister formation. The use of modulators to increase desmosome cadherin-mediated cell adhesion may alleviate the symptoms of such disorders. Optionally, such methods are performed in combination with methods for removing anti-cadherin antibodies. Modulators for use in such treatments can include one desmosome cadherin CAR sequence or, preferably, can include a desmoglein CAR sequence and a desmocholine CAR sequence. Optionally, the modulator may comprise more than one other non-classical cadherin CAR sequence (eg, a CAR sequence from OB-cadherin or cadherin-5 and / or one or more classic cadherin CAR sequences ( HAV, SHAVSS (including SEQ ID NO NO), AHAVDI (including SEQ ID NO NO), or analogs of such an arrangement). Preferred antibody modulators include Fab fragments directed against either the non-classical cadherin or E-cadherin CAR sequence. Modulators that are bound to biocompatible and biodegradable matrices, such as cellulose or collagen, are particularly preferred. For use in such a method, the modulator should have a free amino or hydroxyl group. Modulators are generally administered topically at the blister site. Generally, the amount of matrix-associated modulator administered to the blister site will vary with the severity of the condition and will generally be in the range as discussed above. Multifunctional modulators can also be used, including one or more desmosomal cadherin sequences, a classic cadherin CAR sequence (HAV) and a CAR sequence bound by a particular integrin (RGD). Alternatively, one or more modulators linked to classical cadherin-mediated or integrin-mediated cell adhesion can be administered in combination with the modulator, either in the same pharmaceutical composition or separately.
[0164]
In another aspect, one or more modulating agents can be attached to the inner surface of a tissue culture plate or other cell culture support, eg, for use in a bioreactor. Such coupling may be performed by any suitable technique, as described above. Modulators that are bound in this format can generally be used to immobilize cadherin-expressing cells. For example, dishes or plates coated with one or more modulators can be used to immobilize cadherin-expressing cells in various assays and screens. In a bioreactor (ie, a system for large-scale production of cells or organoids), modulators can generally be used to improve cell attachment and stabilize cell growth. Modulators can also be used in bioreactors to support the formation and function of highly differentiated organoids, for example, from scattered populations of fetal mammalian cells. A bioreactor containing a modulator biomatrix can also be used to enhance the production of a particular protein.
[0165]
Modulators as described herein can be used in various bioreactor configurations. Generally, bioreactors are designed with sufficient internal surface area to support large numbers of attached cells. This surface area can be provided using membranes, tubes, microtiter wells, columns, hollow fibers, roller bottles, plates, dishes, beads, or combinations thereof. Bioreactors can be compartmentalized. The support material in the bioreactor can be any suitable material known in the art; preferably, the support material is insoluble or does not swell in water. Preferred support materials include, but are not limited to, synthetic polymers such as acrylic, vinyl, polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene, nylon, polyurethane, polyamide, polysulfone, and poly (ethylene terephthalate). ); Ceramics; glass and silica.
[0166]
Another aspect of the present invention provides a method of using an antibody raised against the CAR sequence of the desmosome for diagnostic and assay purposes. Assays typically involve the presence or absence of desmosome cadherin (free or on the cell surface), or a suitable biological sample (eg, a tumor or normal tissue biopsy obtained from a patient, blood, lymph nodes). , Serum or urine samples, or other tissues, homogenates, or extracts thereof) using antibodies to detect proteolytic fragments containing one or more EC domains.
[0167]
There are various assay formats known to those skilled in the art that use antibodies to detect target molecules in a sample. See, e.g., Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. For example, the assay is performed in a Western blot format, where a protein preparation from a biological sample is subjected to gel electrophoresis, transferred to a suitable membrane and reacted with an antibody. The presence of the antibody on the membrane can then be detected using a suitable detection reagent as described below.
[0168]
In another embodiment, the assay involves the use of an antibody immobilized on a solid support to bind to a target cadherin, or a proteolytic fragment comprising an extracellular domain and comprising a CAR sequence, and Remove the antibody from the rest. The bound cadherin can then be detected using a second antibody or reagent that includes a reporter group. Alternatively, a competition assay may be used, where cadherin is labeled with a reporter group and allowed to bind to the immobilized antibody after incubation of the antibody with a sample. The extent to which components of the sample inhibit the binding of labeled cadherin to the antibody indicates the reactivity of the sample with the immobilized antibody, and consequently indicates the level of cadherin in the sample.
[0169]
The solid support to which the antibody can be attached can be any material known to those of skill in the art (eg, a test well in a microtiter plate, a nitrocellulose filter, or another suitable membrane). Alternatively, the support can be a bead or a disc (eg, glass, fiberglass, latex or plastic (eg, polystyrene or polyvinyl chloride)). The antibody can be immobilized on a solid support using various techniques known to those of skill in the art, and these techniques are fully described in the patent and scientific literature.
[0170]
In certain embodiments, the assay for detecting desmosome cadherin in a sample is a two-antibody sandwich assay. The assay may be performed by first contacting the antibody immobilized on a solid support (generally the wells of a microtiter plate) with a biological sample, whereby the desmosome cadherin in the sample is immobilized. Can bind to the antibody (30 minutes incubation at room temperature is generally sufficient). The unbound sample is then removed from the immobilized cadherin-antibody complex and a second antibody (such as an enzyme, dye, radionuclide, luminescent group, fluorescent group or biotin) capable of binding to a different site on cadherin. (Including the appropriate reporter group). The amount of second antibody that retains binding on the solid support is then determined using methods appropriate for the specific reporter group. The method used to detect the reporter group depends on the nature of the reporter group. In the case of radionuclide groups, scintillation counting or autoradiographic methods are generally suitable. Spectroscopic methods can be used to detect dyes, luminescent and fluorescent groups. Biotin can be detected using avidin and linked to a different reporter group, generally a radioactive or fluorescent group or an enzyme. Enzyme reporter groups can generally be detected (typically at specific times) by the addition of a substrate, followed by spectroscopic or other analysis of the reaction product. Cadherin levels in a sample can be detected using standards and standard additions using well known techniques.
[0171]
For example, such immunoassays can be used to diagnose and monitor conditions associated with abnormal desmosome cadherin expression. As noted above, such conditions include autoimmune blistering disorders (eg, pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus) and intercellular IgA dermatosis. Generally, the presence or absence of such a condition in a patient can be detected by: (a) contacting a biological sample obtained from the patient with the antibody or antigen-binding fragment thereof; Detecting the level or pattern of the polypeptide in the sample bound to the fragment; and (c) comparing the level or pattern of the peptide to a predetermined cutoff value or normal pattern. Generally, these diseases are associated with an autoimmune response to desmosome cadherins, which results in the internalization of these cadherins. Such internalization can be visualized as speckled cytoplasmic granules in stained biopsy sections of lesions and keratinocytes around the lesions (see Iwatsuki, et al., Br. J. Dermatol. 140: 35-43). These granules are not detected in normal patients.
[0172]
Immunoassays can further be used to distinguish between benign skin lesions (eg, keratoblastomas) and squamous cell carcinomas. In particular, the location of desmoglein staining can be used to distinguish between keratokeratomas and carcinomas (see Krunic et al., Acta @ Derm. Venereol. 76: 394-398, 1996). . In general, extensive pericellular staining indicates keratocytoma. Local pericellular staining indicates keratokeratoma or well-differentiated squamous cell carcinoma. Unstained or juxtanuclear staining indicates poorly differentiated squamous cell carcinoma. Thus, a decrease in pericellular staining (as a 50% decrease, as determined visually or quantitatively) indicates squamous cell carcinoma.
[0173]
The present invention also provides kits for use in such immunoassays. Such kits generally include one or more antibodies as described above. In addition, one or more additional compartments or containers of the kit generally enclose components (eg, reagents, buffers and / or wash solutions) to be used in the immunoassay.
[0174]
In a further aspect, modulators or antibodies (or fragments thereof) can be used to facilitate cell identification and in vitro classification or in vivo imaging and express desmosome cadherin (or different desmosome cadherin levels). Enables cell selection. Preferably, the modulator or antibody for use in such a method can be linked to a detectable marker. Suitable markers are well known in the art and include radionuclides, luminescent groups, fluorescent groups, enzymes, dyes, immunoglobulin constant domains and biotin. In one preferred embodiment, a modulator linked to a fluorescent marker, such as fluorescein, is contacted with a cell, which is then analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS).
[0175]
The antibodies or fragments thereof can also be used in screening combinatorial libraries or other non-peptide based libraries to identify other compounds that can alter desmosome cadherin-mediated cell adhesion. Such screening can generally be performed using ELISA or other methods well known to those skilled in the art to detect compounds having a shape and structure similar to that of the modulator. Generally, such screening involves contacting an expression library that produces a test compound with the antibody, and detecting the level of antibody that has bound to the candidate compound. Compounds where the antibody has a high affinity may be further characterized as described herein to assess the ability to modify OB-cadherin-mediated cell adhesion.
[0176]
The following examples are provided by way of illustration and not by way of limitation.
[0177]
(Example)
(Preparation of representative regulator)
This example illustrates the solid phase synthesis of a representative peptide modulator.
[0178]
These peptides were synthesized on a 431A Applied Biosystems peptide synthesizer using p-hydroxymethylphenoxymethyl polystyrene (HMP) resin and standard Fmoc chemistry. After synthesis and deprotection, the peptides were desalted on a Sephadex® G-10 column and lyophilized. These peptides were analyzed by analytical HPLC for purification, and in each case a single peak was observed. Peptides were made as a 10-25 mg / mL stock solution in dimethyl sulfoxide (DMSO) or water and stored at -20 C before use.
[0179]
From the foregoing, while particular embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration, it will be apparent that various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. . Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
1A-1AA show the structure of classical cadherin (FIG. 1A) and non-classical cadherin (FIGS. 1B-1AA). The extracellular domain is designated EC1-EC5 for most cadherins; EC1-EC6 for protocadherin and cnr. The hydrophobic domain that crosses the plasma membrane (PM) is represented by TM, and various numbers of cytoplasmic domains are represented by CP. The calcium binding motif for classical cadherin is shown in FIG. 1A by DXNDN (SEQ ID NO: 1), DXD, LDRE (SEQ ID NO: 2), DXE, and DVNE (SEQ ID NO: 341), and others. The cadherin calcium binding motif is also displayed on the extracellular domain. Below the extracellular domain, the nine amino acid CAR sequence is shown.
FIG. 2
FIG. 2 provides the amino acid sequence of a representative mammalian non-classical cadherin extracellular domain, as shown (SEQ ID NO: 4-43). Calcium binding motifs are shown in bold and representative CAR sequences are shown in bold and underlined.
FIG. 3
FIG. 3, as shown, provides the amino acid sequence of a representative mammalian desmosome cadherin EC1 domain. Amino acids are represented by their IUPAC code,-represents a gap. The desmosome cadherin CAR sequence is shown in bold.
FIG. 4
FIG. 4 shows the structure of a representative cyclic peptide modulator.

Claims (70)

A modulator, which is:
(A) comprising a desmosome cadherin CAR sequence; and (b) comprising 3-16 amino acid residues linked by peptide bonds.
Regulator. A modulator, which is:
(A) having the following formula: Aaaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu-Caa-Daa-Ser / Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3) Comprising at least five conserved amino acid residues of the desmosome cadherin CAR sequence;
Where Aaa, Baa, Caa and Daa are independently selected amino acid residues; Ile / Leu / Val is an amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine, and valine; Asn / Glu is one amino acid selected from the group consisting of aspartate, asparagine, and glutamate; and Ser / Thr / Asn is one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, and asparagine; And (b) contains only 50 conserved amino acid residues present in the desmosome cadherin,
Regulator. A modulator, which is:
(A) including a desmosome cadherin CAR sequence having the following formula: Aaaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu-Caa-Daa-Ser / Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3). ,
Wherein Aaa, Baa, Caa, and Daa are independently selected amino acid residues; Ile / Leu / Val is one amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine, and valine. , Asp / Asn / Glu is one amino acid selected from the group consisting of aspartate, asparagine, and glutamate; and Ser / Thr / Asn is one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, or asparagine. And (b) contains no more than 50 conserved amino acid residues present in the desmosome cadherin;
Regulator. A modulator, which is:
(A) comprising at least nine conserved amino acid residues of desmosome cadherin, wherein the nine conserved amino acid residues have the following formula: Aaaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu -A desmosome cadherin CAR sequence having -Caa-Daa-Ser / Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3),
Wherein Aaa, Baa, Caa, and Daa are independently selected amino acid residues; Ile / Leu / Val is one amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine, and valine. , Asp / Asn / Glu is one amino acid selected from the group consisting of aspartate, asparagine, and glutamate; and Ser / Thr / Asn is one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, and asparagine. And (b) contains no more than 50 conserved amino acid residues present in the desmosome cadherin;
Regulator. A modulator comprising a desomosome cadherin CAR sequence selected from the group consisting of: NQK, NRN, NKD, EKD, ERD, RAL, YAL, YAT, FAT, and YAS, wherein the factor comprises: Contains only up to 50 conserved amino acid residues present in the desmosome cadherin,
Regulator. The modulator according to any one of claims 2 to 5, wherein the modulator is a peptide having a size ranging from 3 to 50 amino acid residues. The modulator according to any one of claims 1 to 5, wherein the modulator is a peptide having a size ranging from 4 to 16 amino acid residues. The modulator according to any one of claims 1 to 5, wherein the CAR sequence is present in a cyclic peptide. 9. The modulator of claim 8, wherein the cyclic peptide has the formula:

Has,
Wherein W is a tripeptide selected from the group consisting of NQK, NRN, NKD, EKD, ERD, RAL, YAL, YAT, FAT, and YAS;
Wherein X ₁ and X ₂ are optional and, when present, are independently selected from the group consisting of amino acid residues and combinations thereof linked by peptide bonds, wherein X ₁ and X ₂ the over size independently 0 residue over resulting sum of residues contained in _{X 1} and _X in the ₂ to 12 range;
Wherein Y ₁ and Y ₂ are independently selected from the group consisting of amino acid residues, wherein a covalent bond is formed between residues Y ₁ and Y ₂ ; and wherein Z ₁ and Y ₂ Z ₂ is optional and, when present, is independently selected from the group consisting of the amino acid residues and combinations thereof linked by peptide bonds;
Regulator. A polynucleotide encoding the modulator according to any one of claims 1 to 5. An expression vector comprising the polynucleotide according to claim 10. A host cell transformed or transfected with the expression vector according to claim 11. A modulator comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to a desmosome cadherin CAR sequence and modulates desmosome cadherin-mediated function, wherein the desmosome cadherin CAR sequence Has the following formula: Aaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu-Caa-Daa-Ser / Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3),
Wherein Aaa, Baa, Caa and Daa are independently selected amino acid residues; Ile / Leu / Val is an amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine and valine, and Asp / Asn / Glu is one amino acid selected from the group consisting of aspartate, asparagine, and glutamate; and Ser / Thr / Asn is one amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, and asparagine; And wherein the modulator inhibits or enhances a function mediated by desmosome cadherin,
Regulator. A modulator comprising a mimetic of the desomosome cadherin CAR sequence, wherein the mimetic has the following formula: Aaaa-Phe-Baa-Ile / Leu / Val-Asp / Asn / Glu-Caa-Daa-Ser / Comprising at least three consecutive amino acid residues of a desmosome cadherin CAR sequence having Thr / Asn-Gly (SEQ ID NO: 3),
Wherein Aaa, Baa, Caa, and Daa are independently selected amino acid residues; Ile / Leu / Val is an amino acid selected from the group consisting of isoleucine, leucine, and valine; Asp / Asn / Glu is an amino acid selected from the group consisting of aspartate, asparagine, and glutamate; and Ser / Thr / Asn is an amino acid selected from the group consisting of serine, threonine, or asparagine;
Wherein the mimetic may modulate desmosome cadherin-mediated function,
Regulator. The modulator according to any one of claims 1 to 5, wherein the modulator comprises:

A modulator comprising one or more desmoglein CAR sequences selected from the group consisting of: A modulating agent according to claim 15, wherein the modifier following sequence: N-Ac-IFVINQKTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 105), N-Ac- MFIINRNTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 106), _{N-Ac-VFYLNKDTG-NH 2} ( SEQ ID NO: 107), N-Ac- IYRALNSMG-NH 2 ( SEQ ID NO: 178), N-Ac- IYRALNSLG-NH 2 ( SEQ ID NO: 179), N-Ac- LTGYALDARG -NH ₂ (SEQ ID NO: 199), N-Ac- ITCRALNAQG-NH 2 ( SEQ ID NO: 244), and _{N-Ac-ITCRALNALG-NH 2} ( SEQ ID NO: 225) comprising a linear peptide having the modifier . 16. The modulator of claim 15, wherein the desmoglein CAR sequence is present in a cyclic peptide. 18. The modulator of claim 17, wherein the cyclic peptide comprises:

A modulator comprising a sequence selected from the group consisting of: A modulator comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the modulator comprises:
(A) The following: N-Ac-IFVINQKTG-NH ₂ (SEQ ID NO: 105), N-Ac-MFIINRNTG-NH ₂ (SEQ ID NO: 106), N-Ac-VFYLNKDTG-NH ₂ (SEQ ID NO: 107) , N-Ac-IYRALNSMG-NH 2 ( SEQ ID NO: 178), N-Ac- IYRALNSLG-NH 2 ( SEQ ID NO: 179), N-Ac- LTGYALDARG-NH 2 ( SEQ ID NO: 199), N-Ac- ITCRALNAQG-NH ₂ (SEQ ID NO: 244), and _{N-Ac-ITCRALNALG-NH 2} ( SEQ ID NO: 225) binds specifically to desmoglein CAR sequence selected from the group consisting of; and (b) desmoglein Regulate mediation,
, Regulators. The regulator according to any one of claims 1 to 5, wherein the regulator is:

Comprising one or more desmocholine CAR sequences selected from the group consisting of:
Regulator. A modulating agent according to claim 1, wherein the modifier, the following sequence: N-Ac-LFYIEKDTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 148), N-Ac-LFYVERDTG -NH 2 (SEQ ID NO: 149), N-Ac- LFYIERDTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 150), N-Ac-LYGYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 280), N-Ac- LYAYATTADG-NH 2 ( SEQ ID NO: 281), _{N-Ac-VYGYATTADG-NH 2} ( SEQ ID NO: 282), N-Ac- VYAYATTADG-NH 2 ( SEQ ID NO: 283), N-Ac-IYGYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 284), N-Ac-IYAYATTADG -NH ₂ (SEQ ID NO: 285), N-Ac- IIAFATTPDG-NH 2 ( SEQ ID NO: 31 ), N-Ac-LIAFATTPDG- NH 2 ( SEQ ID NO: 311), or _{N-Ac-LIAYASTADG-NH 2} ( SEQ ID NO: 331) comprising a linear peptide having the modifier. 21. The modulator of claim 20, wherein the desmocholine CAR sequence is present in a cyclic peptide. The cyclic peptide is as follows:

23. The modulator of claim 22, comprising a sequence selected from the group consisting of: A modulator comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
(A) the following: LFYIEKDTG (SEQ ID NO: 121), LFYVERDTG (SEQ ID NO: 135) and LFYIERDTG (SEQ ID NO: 147), N-Ac-LYGYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 280), N-Ac- LYAYATTADG-NH 2 ( SEQ ID NO: 281), N-Ac-VYGYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 282), N-Ac- VYAYATTADG-NH 2 ( SEQ ID NO: 283), N-Ac-IYGYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 284), N- Ac-IYAYATTADG-NH ₂ (SEQ ID NO: 285), N-Ac- IIAFATTPDG-NH 2 ( SEQ ID NO: 310), N-Ac- LIAFATTPDG-NH 2 ( SEQ ID NO: 311), and N-Ac-LIAYASTADG- NH ₂ (array No.: 331) binds specifically to desmocollin CAR sequence selected from the group consisting of, and modulate (b) desmocollins mediated functions,
Regulator. 15. A modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14, wherein the modulator is linked to a detectable marker. A modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14, which is linked to a targeting agent. A modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14, which is linked to a support substance. 28. The modulator of claim 27, wherein said support material is a polymer matrix. 28. The modulator of claim 27, wherein the support material is selected from the group consisting of plastic dishes, plastic tubes, sutures, membranes, ultra-thin films, bioreactors, and microparticles. A modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14, further comprising one or more of the following:
(A) a CAR sequence specifically recognized by an adhesion molecule other than desmosome cadherin; and / or (b) an antibody or a specific binding to a CAR sequence that is specifically recognized by an adhesion molecule other than desmosome cadherin. An antigen-binding fragment thereof. 31. The modulator of claim 30, wherein the adhesion molecule is from classical cadherin, integrin, occludin, claudin, non-classical cadherin, fibronectin, laminin, claudin, and other extracellular matrix proteins. A regulator selected from the group consisting of: A pharmaceutical composition comprising a modulator according to any one of claims 1 to 5, or 13 to 14 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 33. The composition of claim 32, further comprising a drug. 33. The composition of claim 32, wherein said modulator is in a sustained release formulation. 33. The pharmaceutical composition according to claim 32, further comprising one or more of the following:
(A) a CAR sequence specifically recognized by an adhesion molecule other than desmosome cadherin; and / or (b) an antibody or a specific binding to a CAR sequence that is specifically recognized by an adhesion molecule other than desmosome cadherin. Its antigen binding fragment,
Including, including a cell adhesion regulator,
Regulator. 36. The pharmaceutical composition of claim 35, wherein the adhesion molecule consists of classic cadherin, integrin, occludin, claudin, non-classical cadherin, fibronectin, laminin, and other extracellular matrix proteins. A regulator selected from the group. A method for modulating desmosome cadherin-mediated function, comprising: a desmoglein-expressing cell and / or a desmocholine-expressing cell; and the modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14. Contacting, thereby modulating desmosome cadherin-mediated function. 38. The method of claim 37, wherein said cells are selected from the group consisting of epithelial cells, endothelial cells, and tumor cells. 38. The method of claim 37, wherein the modulator is present in a pharmaceutical composition in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. A method for regulating cell adhesion, the method comprising: contacting a desmosome cadherin-expressing cell with the regulator according to any one of claims 1 to 5, or 13 to 14, thereby regulating cell adhesion. A method comprising: 41. The method of claim 40, wherein said cells are selected from the group consisting of epithelial cells, endothelial cells and tumor cells. 41. The method of claim 40, wherein the modulator is present in a pharmaceutical composition in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 41. The method of claim 40, wherein cell adhesion is inhibited. 41. The method of claim 40, wherein cell adhesion is enhanced. A method for inhibiting adhesion of desmosome cadherin-expressing cells in a mammal, comprising a step of administering the modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14 to the mammal. And wherein the modulator inhibits desmocholine-mediated cell adhesion and / or desmoglein-mediated cell adhesion. 46. The method of claim 45, wherein said modulator is present in a pharmaceutical composition in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 46. The method of claim 45, wherein cell adhesion is inhibited. 46. The method of claim 45, wherein cell adhesion is enhanced. A method for enhancing the delivery of a drug through the skin of a mammal, comprising modulating the epithelial cells of the mammal with the drug and any one of claims 1-5, or any of claims 13-14. Contacting the agent with an agent, wherein the contacting step is performed under conditions and for a time sufficient to allow the drug to pass across the epithelial cells, and wherein the modulator is Inhibiting desmocholine-mediated cell adhesion and / or desmoglein-mediated cell adhesion. 50. The method of claim 49, wherein the modulator passes into the mammal's bloodstream. 50. The method of claim 49, wherein said modulator is conjugated to said drug. 50. The method of claim 49, wherein said contacting step is performed via a skin patch comprising said modulator and said drug. Claims: 1. A method for facilitating blood sampling in a mammal, comprising the steps of: transfecting a mammalian epithelial cell with the modulator of any one of claims 1-5, or 13-14. Contacting, wherein the modulator inhibits desmocholine-mediated cell adhesion and / or desmoglein-mediated cell adhesion, and wherein the contacting step comprises passing one or more blood components across the epithelial cells. The method is performed under conditions and for a time sufficient to allow 54. The method of claim 53, wherein said contacting step is performed via a skin patch containing said modulator. 55. The method of claim 54, wherein the skin patch further comprises a reagent for detecting a blood component of interest. 54. The method of claim 53, wherein the epithelial cells are skin cells or gingival cells. A method for enhancing the adhesion of desmosome cadherin-expressing cells, comprising: desmocholine-expressing cells and / or desmoglein-expressing cells;
Contacting with a modulator according to any one of claims 1 to 5, or 13 to 14, wherein the modulator modulates desmocholine-mediated cell adhesion and / or desmoglein-mediated cell adhesion. The method, wherein the contacting step is performed under conditions and for a time sufficient to detectably enhance the cell adhesion. 58. The method of claim 57, wherein said cells are selected from the group consisting of epithelial cells, endothelial cells and tumor cells. 58. The method of claim 57, wherein the modulator is linked to a support molecule or a solid support. 15. A method for promoting wound healing and / or reduction of scar tissue in a mammal, comprising modulating the wound of a mammal according to any one of claims 1-5 or 13-14. Contacting with an agent, wherein the modulator enhances desmosome cadherin-mediated cell adhesion. 61. The method of claim 60, wherein said modulator is linked to a support molecule or a solid support. A method for enhancing adhesion of a foreign tissue transplanted to a mammal, wherein the site of the foreign tissue transplant of the mammal is the site of any one of claims 1 to 5 or claims 13 to 14. Contacting a modulator of the invention, wherein the modulator enhances desmosome cadherin-mediated cell adhesion. 63. The method of claim 62, wherein the foreign tissue is a skin graft or organ implant. 63. The method of claim 62, wherein the modulator is linked to a support molecule or a solid support. A method for treating an autoimmune blister disorder in a mammal, comprising the step of administering the modulator according to any one of claims 1 to 5 or 13 to 14 to the mammal. And wherein the modulator enhances desmosome cadherin-mediated cell adhesion. 66. The method of claim 65, wherein the modulator is typically administered to a blister. 66. The method of claim 65, wherein said modulator is linked to a support molecule or a solid support. A method for identifying a compound capable of modulating desmosome cadherin-mediated function, comprising: (a) contacting an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a desmosome cadherin CAR sequence with a test compound; and ( b) detecting the level of antibody or fragment that binds to the test compound and identifying therefrom a compound capable of modulating desmosome cadherin-mediated cell adhesion.
Method. The method of claim 68, wherein the antibody or antigen-binding fragment, the following: N-Ac-IFVINQKTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 105), N-Ac- MFIINRNTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 106) , N-Ac-VFYLNKDTG-NH 2 ( SEQ ID NO: 107), N-Ac- IYRALNSMG-NH 2 ( SEQ ID NO: 178), N-Ac- IYRALNSLG-NH 2 ( SEQ ID NO: 179), N-Ac- LTGYALDARG-NH ₂ (SEQ ID NO: 199), N-Ac- ITCRALNAQG-NH 2 ( SEQ ID NO: 244), and _{N-Ac-ITCRALNALG-NH 2} ( SEQ ID NO: 225) desmoglein selected from the group consisting of A method that specifically binds to a CAR sequence. The method of claim 68, wherein the antibody or antigen-binding fragment, the following: LFYIEKDTG (SEQ ID NO: 121), LFYVERDTG (SEQ ID NO: 135) and LFYIERDTG (SEQ ID NO: 147), N-Ac-LYGYATTADG -NH 2 (SEQ ID NO: 280), N-Ac- LYAYATTADG-NH 2 ( SEQ ID NO: 281), N-Ac-VYGYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 282), N-Ac- VYAYATTADG-NH 2 ( SEQ ID NO: 283), _{N-Ac-IYGYATTADG-NH 2} ( SEQ ID NO: 284), N-Ac-IYAYATTADG -NH 2 ( SEQ ID NO: 285), N-Ac- IIAFATTPDG-NH 2 ( SEQ ID NO: 310), N-Ac- LIAFATTPDG- NH ₂ (SEQ ID NO: : 311), and _{N-Ac-LIAYASTADG-NH 2} ( SEQ ID NO: 331) that specifically binds to desmocollin CAR sequence selected from the group consisting of a method.

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