JP2004503201A - Methods for identifying ligand-specific binding molecules - Google Patents

Abstract

The present invention provides a method for identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand. The method comprises selectively immobilizing a diverse population of binding molecules to a solid support, contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more ligands simultaneously, and Determining at least one binding molecule that selectively binds to one or more. The invention further provides a method for identifying an antibody having a selective affinity for a tumor antigen. The method comprises selectively immobilizing a diverse population of antibodies on a solid support; contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more tumor antigens simultaneously; Determining at least one antibody that selectively binds to one or more of the following. The invention also provides an isolated binding polypeptide that is selective for a tumor antigen. Further, the present invention provides a complementarity determining region (CDR) of an antibody or a functional fragment thereof that is selective for a tumor antigen.

Description

【００２４】
^１残基の番号付けはＫａｂａｔら（前出）の命名法に従う。
^２残基の番号付けはＣｈｏｔｉａら（前出）の命名法に従う。
^３残基の番号付けはＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）の命名法に従う。
【００２５】
本明細書で使用される用語「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞を正常細胞から識別または区別するためにマーカーとして用いられ得る分子をいう。このような識別マーカーは、優先的な発現、あるいは腫瘍細胞上での独特の細胞局在化または細胞下局在化のような種々の仕方によって、それ自体明白であり得る。このような抗原が優先的にマークする腫瘍細胞は、異常に頻繁な細胞増殖または制御されない生存を被る任意の細胞であり得る。このような細胞は新生物細胞であり得、これは腫瘍またはガン細胞として完全に特徴付けおよび分類されていてもよく、あるいはされていなくても良い。
【００２６】
本発明は、リガンドに対する選択的親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。この方法は：ａ）結合分子の多様な集団を固体支持体に選択的に固定化する工程；ｂ）固体支持体上に固定化された多様な集団を２つ以上のリガンドに同時に接触させる工程；およびｃ）リガンドの１つ以上に選択的に結合する少なくとも１つの結合分子を決定する工程、を包含する。
【００２７】
本発明の方法は結合分子を固体支持体に選択的に固定化すること、および固定化された結合分子を２つ以上の目的のリガンドに対する選択的結合相互作用についてスクリーニングすることを利用する。選択的固定化は、測定される結合相互作用の感度を増大させるように機能する。なぜなら、選択された分子集団を最初に固体支持体上に固定化することは、反応物中に存在し得る無関係な分子または夾雑物との非特異的な結合相互作用を減少させるからである。例えば、選択的結合相互作用の測定の困難度は、結合アッセイの複雑さ、ならびに結合反応物内に存在する異なる種の数および多様性と共に増大する。本発明の方法はこのような困難を回避する。なぜなら、結合分子集団の選択的固定化は、無関係な分子を反応内から除去することによって、望ましくない結合相互作用の数を実質的に減少させるからである。
【００２８】
結合分子の集団を１つ以上の精製された関心のあるリガンドまたは標的に対して生成およびスクリーニングする方法は、当該分野に存在する。しかし、結合分子の集団を、リガンドの集団または複雑な組成物、例えば細胞または細胞抽出物に対してスクリーニングした場合、特異的結合事象の同定は稀である。本発明の方法は、選択的結合事象の迅速な同定のために、結合分子集団をリガンド集団に対して効率よくスクリーニングすることを可能とする。本発明の方法は、結合分子集団を固体支持体上に選択的に固定化することによって、改良された検出の感度および特異性を提供する。
【００２９】
本発明の方法は、結合分子の大集団または小集団の両方に適用可能であり、この集団は例えば、親和性技術による集団の分離によって、実質的に精製または濃縮されていてもよい。あるいは、このような多様な集団は、例えば細胞、細胞抽出物またはインビトロ由来の合成物中に含まれるような、不均一な組成物であり得る。このような集団の選択的固定化は、関心のある２つ以上のリガンドを選択的結合親和性についてスクリーニングするために適用可能となるような、集団の十分な濃縮を提供する。
【００３０】
結合分子集団の選択は、所望の結合分子のタイプ、結合分子の必要性および最終的に意図する用途に依存する。例えば、結合分子の集団は、その集団が関心のあるリガンドまたはリガンド組成物に対する選択的結合親和性を示す少なくとも１つの結合分子を含む限り、あるいはその集団が、関心のあるリガンドに対する選択的結合を示す少なくとも１つの分子をその集団が含む非常に高い蓋然性があるように十分に多様性である限りは、本質的にいかなる供給源から生産され、あるいは由来してもよい。
【００３１】
上記基準に適合する結合分子集団を得るために、少なくとも２つの一般的なアプローチが用いられ得る。１つのアプローチは、結合分子として機能することが知られている分子、あるいは結合活性を示すかまたは示すことが可能であることが知られている分子から、結合分子集団を生成することである。結合分子として機能すること、あるいは結合活性を示すことが知られている分子の特定の例は、抗体または他の免疫レパートリーのレセプターを含む。このような分子の正常な機能は本質的に無限の数の異なる抗原およびリガンドと結合することである。従って、例えば抗体レパートリーから結合分子の多様な集団を生成することは、本質的に任意の所望のリガンドに対して結合分子を同定することを可能にする。多くの他の結合分子集団もまた存在し、そして以下さらに記載される。
【００３２】
第２のアプローチは未知分子の大集団を生成することである。この集団は、関心のあるリガンド組成物に結合する分子を含むように十分多様な配列または構造を含むように生成されるべきである。このアプローチの利点は、配列、構造または機能に関する事前の知識が必要とされないことである。そのかわり、必要とされることは、集団がリガンド複合体に対する特異的結合相互作用を偶然に示す高い蓋然性を有するように、十分なサイズおよび複雑度の集団を生成することである。このような集団の具体的な例は、ペプチド、核酸および低分子化合物のランダムライブラリーである。他の多くのタイプの「ランダム」ライブラリー分子集団が存在し、そして以下さらに記載される。
【００３３】
上述のアプローチのいずれかにより得られた集団が、目的のリガンドまたは組成物についての選択的結合親和性を示す、少なくとも１つの結合分子を含有するかどうかの予備的な知識は、必要ではない。その代わりに、目的のリガンドまたはリガンド組成物に対する結合分子を含有し得るような、意図した必要性または目的について十分多様な集団を生成することが必要であるのみである。当業者は、どのようなサイズおよび多様性が、意図した目的について必要または十分であるかを認識する。
【００３４】
前に述べた様に、使用する結合分子集団の型の選択は、選択した結合分子の特定の必要性および所望の用途に依存する。例えば、高親和性相互作用を有する結合分子が所望されるならば、抗体結合分子の集団の使用が好まれ得る。免疫グロブリンスーパーファミリーのレセプターの他の結合ポリペプチドおよびレセプターもまた使用され得る。その代わりに、例えば、結合分子がレセプターについて所望されるならば、ランダムペプチドまたは核酸配列の集団の使用が所望され得る。特定の実施例は、例えば、細胞表面レセプターに特異的なペプチド結合分子を同定するためのランダムペプチド集団の使用、ステロイドレセプターのような細胞質レセプターに選択的な結合親和性を有する結合分子の同定についてのランダム低分子集団の使用、および核酸結合ポリペプチドについて選択的な結合分子の同定についてランダム核酸集団の使用を含む。当業者は、どの型のアプローチおよびどの型の結合分子集団が、意図した目的および所望の必要性について適用可能かを認識するか、または、決定し得る。
【００３５】
使用する結合分子集団のサイズおよび多様性は、例えば、選択的な結合分子が所望されるリガンド集団またはリガンド組成物、ならびに所望の選択的な結合分子の数、所望される親和性の範囲、および適切な結合分子を同定するために利用可能な期間に依存する。例えば、本発明の方法を適用することが、リガンドについて選択的親和性を有する１つまたは数個の結合分子の同定のためであるなら、限定数の結合分子が固体支持体に選択的に固定されるべき集団を構成し得る。このような限定数の結合分子は、約２〜１０程小さいが、代表的には１０個の分子を含有し得る。
【００３６】
同定されるべき結合分子の所望される数が増加するにつれ、この集団のサイズおよび多様性も増加する。同様に、リガンドについての選択的な親和性を有する結合分子の所望の親和性の範囲および同定の速度が増加するにつれ、この結合分子集団のサイズおよび多様性も増加する。さらに、結合分子の集団のサイズは同様に、選択的な結合分子が所望されるリガンド集団のリガンドの数または複雑性が増加するにつれ増加する。従って、これら因子のそれぞれが増加するにつれ、この結合分子集団のサイズおよび多様性も同様に増加し得る。
【００３７】
中程度のサイズの集団は、この集団内に数百および数千の異なる結合分子からなるのに対し、大きなサイズの結合分子集団は、数万〜数百万の異なる結合分子種からなる。より具体的には、結合分子の同定のために、結合分子の大きくかつ多様な集団は、約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、またはより多く異なる結合分子種のいずれかを含む。所望の数の結合分子を同定するために十分な結合分子集団のおおよその多様性は当業者らに認識される。
【００３８】
大きくかつ多様な集団が、目的の２つ以上のリガンドで迅速に生成およびスクリーニングされ得るので、結合分子の組換え体ライブラリーは、本発明の方法について特に有利である。結合分子集団は、例えばライブラリー集団の細胞抽出物から直接使用され得る。この結合分子集団を選択的に固定化するために使用される方法は以下にさらに議論される。さらに、発現ポリペプチドまたは核酸生成物の組換え体ライブラリーは、多数の異なる方法で操作され得、その結果、結合分子集団の固体支持体への選択的固定化を容易にするか、またはそれに直接的に作用するので、それらは本発明の方法に適用される。組換え体ライブラリー法は同様に、固体支持体へのこの集団の選択的な固定化についての特徴を固有に含む天然に生じるレパートリーからの多くの結合分子集団の生成を可能にする。それにもかかわらず、組換え体であれ、またはその他であれ、結合分子集団の本質的に任意の供給源が、この供給源が意図する目的にとって適切な異なる結合分子の十分なサイズおよび多様性を提供する限り、そして結合分子の集団が固体支持体に選択的に固定化され得る限り使用され得る。
【００３９】
従って、本発明は、リガンドに対する選択的な親和性を有する結合分子を同定する方法を提供し、ここでこの結合分子集団は、組換え体ライブラリーにより生成される。組換え体ライブラリー以外の結合分子集団もまた存在し、リガンドに選択的な親和性を有する結合分子のスクリーニングおよび同定のために同様に使用され得る。
【００４０】
結合分子集団の供給源としての組換え体ライブラリーの特定の実施例は、溶原ファージが細菌性発現結合分子ポリペプチドの放出を引き起こすファージ発現ライブラリーである。ファージ発現ライブラリーの別の型において、多くの潜在的な結合分子が、細菌細胞のペリプラズム表面上に融合ポリペプチドとして発現され得る。これらの例の両方において、この発現ポリペプチドは固体支持体上での固定化に利用可能である。酵母および高等な真核生物細胞のライブラリーもまた、存在し、そして本発明の方法に同様に適用可能である。当業者は、どの型のライブラリーが特定の目的に適用可能であるかを認識するか、または決定し得る。
【００４１】
本発明はまた、リガンドに選択的な結合分子を同定する方法を提供するが、ここでこの結合分子は抗体集団から同定される。
【００４２】
以前に述べた様に、リガンドに選択的な結合親和性を有する分子の同定のために使用するための、結合分子の開始集団を得るところの少なくとも幾つかのアプローチがある。１つのアプローチは通常結合機能を示す結合分子の集団を使用することである。抗体結合分子は、固有に結合分子として機能し、そして本質的に任意の抗原に結合特異性を示す生物学的方法および組換え法により産生され得るので、このようなアプローチに従いやすい。従って、本発明の結合分子の集団は、抗体またはその機能的なフラグメントであり得る。
【００４３】
抗体結合分子の集団は、当該者らに公知の種々の方法により産生され得る。例えば、抗体結合分子の集団は、ハイブリドーマ技術から産生され得、そしてモノクローナル抗体の集団は、例えば、リガンドについて選択的親和性を有するモノクローナル抗体結合分子を同定するための本発明の方法に使用され得る。その代わりに、抗体結合分子の大きい集団は、例えば、当該分野で公知の種々の組換え法により発現され得る。
【００４４】
ポリメラ−ゼ連鎖反応および当該者らに公知の他の関連する方法によって、特定の生物の本質的に全ての抗体レパートリーを増幅し、組替え集団として、抗体の重鎖および軽鎖またはそれらの機能的なフラグメントの多様な組合せを発現する方法が当該分野に存在する。抗体レパートリーが由来し得る生物体には、例えば、ヒト、マウス、ヒト、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、または抗体を産生し得る任意の生物が含まれる。機能的なフラグメントには、例えば、抗体分子のＦａｂ、Ｆｖ、およびＣＤＲ領域が含まれる。次に、この抗体またはその機能的なフラグメントは、固体支持体上への選択的固定化によりスクリーニングされ得る。本明細書中に記載される実施例において、ヒトＦａｂフラグメント発現ライブラリーが、腫瘍抗原について選択的親和性を有する結合分子をスクリーニングするために使用された。
【００４５】
固有の結合能力を有する結合分子集団についての開始供給源としての抗体レパートリーに加えて、この結合分子集団はまた、公知のまたは固有の結合能力を有する免疫系の他の分子に由来し得る。例えば、この結合分子は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり得る。Ｔ細胞レセプターは、２つのサブユニット、αおよびβを含み、これらは構造と機能共に抗体可変領域配列と類似している。これに関して、両サブユニットは、抗体に見い出されるＣＤＲ領域に類似のＣＤＲ領域をコードする可変領域を含有する（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｋｕｂｙ，Ｊ（編），Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．（１９９７），これは本明細書中に参考として援用される）。ＴＣＲの可変領域を含有するＣＤＲは、抗原提示細胞の細胞表面上に提示された抗原に結合し、本質的に任意の特定の抗原に結合特異性を示し得る。抗体レパートリーを用いた場合、本質的に全ＴＣＲレパートリーの増幅および組換え操作を可能にすることが公知の十分なＴＣＲ配列情報がある。従って、ＴＣＲは、結合分子として生来機能し、本質的に任意の抗原に結合特異性を示す生物学的および組換えの方法により産生され得るので、本発明の方法に従いやすい。
【００４６】
公知のまたは固有の結合機能を示す免疫系の他の例示的結合分子には、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ＣＤ４およびＣＤ８のレセプターが含まれる。抗原提示細胞とエフェクターＴ細胞との間の相互作用を媒介することにおいて、ＭＨＣは機能する。ＣＤ４およびＣＤ８レセプターは、エフェクターＴ細胞と抗原呈示細胞との間の結合相互作用において機能する。ＣＤ４およびＣＤ８は、それらが、抗体およびＴＣＲ配列が表すように、類似のＣＤＲ領域構造を表す点において、付加的な利点を有する。
【００４７】
本発明の方法における開始集団としての使用に従いやすい公知のまたは固有の結合機能を示す他の結合分子は、細胞表面レセプター、細胞質レセプター、および核レセプターのような種々のレセプターを含む。結合分子のこれらのクラスのそれぞれの特定の実施例は、以下に提供される。以下に議論される以外の結合分子もまた存在し、本発明の方法に使用し得る。このような他の分子は公知であるか、または本明細書中に提供される教示を使用して、当業者により決定され得る。
【００４８】
例えば、インテグリンは、種々の生理学的プロセス、例えば細胞付着、細胞移動、および細胞増殖に関与する細胞表面レセプターである。インテグリンは、細胞−細胞、および細胞−細胞外マトリックス付着現象の両方を仲介する。構造的にはインテグリンは、単一α鎖ポリペプチドが、非共有的に単一β鎖と結合するヘテロ二量体のポリペプチドから成る。一般的に、異なる結合特異性は、異なるαおよびβ鎖ポリペプチドの独特の組合せに由来する。例えば、ビトロネクチン結合インテグリンは、α_ｖインテグリンサブユニットを含み、α_ｖβ_３、α_ｖβ_１、およびα_ｖβ_５（これら全ては異なるリガンド結合特異性を示す）を含む。
【００４９】
結合分子集団はまた、他の細胞表面レセプターから生成され得る。これら他の細胞表面レセプターには、リガンドについての成長因子またはホルモンレセプター、例えば血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、インスリン、インスリン様成長因子、肝細胞成長因子、ならびに他の成長因子およびホルモンが含まれる。さらに、細胞表面レセプターには、サイトカインレセプター、例えばインターロイキンおよびインターフェロンについてのものを含む。
【００５０】
細胞質レセプターはさらに、本発明の方法における使用についての結合分子集団として使用され得る。細胞質レセプターは、例えば、甲状腺ホルモンレセプター、レチノイン酸レセプター、糖質コルチコイドレセプター、エストロゲンレセプターなどのようなステロイドホルモンレセプターを含む。さらに結合分子集団は、複製、転写、プロセシング、または翻訳のようなプロセスにおける公知のまたは固有の結合機能を示す、ＤＮＡまたは他の核酸結合ポリペプチドから産生され得る。
【００５１】
以前に述べたように、この結合分子集団はまた、未知の配列または構造のランダムライブラリーに由来し得る。このアプローチでは、この結合分子集団内の１つ以上の配列が目的のリガンドに選択的結合親和性を示す可能性を示すような大きく多様なライブラリーを産生するために十分である。このような集団を使用して本発明の方法を実施するのに必要な全ては、結合分子のランダム集団を固体支持体に選択的に固定化することが可能であることである。本質的に任意の結合分子の集団を固体支持体に選択的に固定化するための方法を以下に記載する。さらに、本明細書に記載した教示を使用して、結合分子の集団を固体支持体に選択的に固定化させるために他の方法を適用する方法は、当業者らに明らかである。
【００５２】
最後に、この結合分子はまた、例えば当業者らに公知のコンビナトリアルケミストリー法により産生される合成化合物であり得る。このようなコンビナトリアルケミストリーライブラリーは固体支持体上に選択的に固定され得、次にリガンドについての選択的な結合親和性を有する分子の同定のためにスクリーニングされ得る。さらに、天然のまたは合成の化合物ライブラリーのような他の化合物の大きな集団もまた、固体支持体に選択的に固定化され得る限り、結合分子集団として等しく適用可能である。
【００５３】
本発明は、リガンドについて選択的な親和性を示す結合分子を、結合分子の多様な集団から同定する方法を提供する。この結合分子は、固定化した結合分子の多様な集団を、２つ以上のリガンドと同時に接触させることにより同定される。
【００５４】
本発明の方法は、目的の２つ以上のリガンドを同時スクリーニングすることを可能にする。選択的親和性を示す結合分子は、目的の１つ以上のリガンドに対して獲得され得る。このリガンド集団は、結合分子の必要性および意図した使用、ならびにこのリガンドまたはリガンド組成物の特徴により選択される。例えば、結合分子の集団を選択的に固定化するための本発明の方法を使用して、選択的な結合因子は、腫瘍細胞または特定の組織型と同様に複雑なリガンドに対して、ならびに２つ以上の異なる種の単一リガンド集団に対して同定され得る。この方法の利点は、比較的粗製のリガンド集団の供給源が使用され得ることであり、これは全組織、腫瘍細胞、および細胞溶解物のリガンド供給源としての使用を容易にする。さらに、生化学的に良く特徴づけされていないリガンドが、本発明の方法においてさらに使用され得る。
【００５５】
このリガンド集団が、組織、細胞、細胞溶解物、および細胞区画または亜細胞区画のような複合組成物である場合、このリガンド集団を構成するのはこれらの複合組成物のそれぞれを含む個々の分子である。従って、細胞または細胞溶解物のような複合組成物を選択することにより、例えば、このリガンド集団は、固体支持体に固定化された結合分子の集団をスクリーニングするのに使用される２つ以上のリガンドを固有に含む。この集団内の少なくとも１つのリガンドに選択的な結合分子を同定することは、この複合組成物自体に選択的な結合分子を産生する。従って、本発明の方法は、例えば治療薬の選択的標的化のための、腫瘍細胞または他の細胞病理学に対する結合分子の効果的な同定に適用され得る。本発明の方法は、例えば、イメージング剤のような診断薬の選択的標的化のための正常なまたは疾患組織に対する結合分子の同定に同様に適用され得る。
【００５６】
このリガンドに対する選択的結合親和性を有する結合ポリペプチドを同定するために、結合分子の集団を選択的に固定化すること、および次に結合分子を２つ以上のリガンドと接触させることが必要である。以下にさらに記述するとおり、この集団内の結合分子の首尾良い結合は、この集団内の少なくとも１つのリガンドとの選択的な結合を示す。選択性は、例えば、ポジティブ結合因子の結合親和性を非特異的リガンドまたは対照リガンド集団と比較することにより、さらに確認され得る。所望ならば、このような比較は、対照として通常細胞および腫瘍細胞、ならびにリガンド集団それぞれを使用する同定のような結合分子の最初の同定の間に、対照として実行され得る。その代わりに、このような比較は、最初のリガンド集団か、あるいはこの結合分子または目的のリガンドのいずれかのより精製した形態のいずれかを使用して引き続いて実行され得る。
【００５７】
従って、本発明は、リガンドに対する選択的な親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。ここで、リガンドは、組織または腫瘍抗原である。本発明はまた、リガンドに対する選択的な親和性を有する結合分子を同定する方法を提供する。ここで、リガンドは、ポリペプチドまたは細胞溶解物におけるほかの高分子である。
【００５８】
粗細胞調製物または他の複合組成物由来のリガンド集団に加えて、リガンド集団はまた、実質的に精製された分子の単一な集団由来であり得る。例えば、メンバーのリガンド集団のいずれか１つのメンバーに対して選択的な結合分子を生成することが所望される場合、各、個々のメンバーは、単一の集団に合わされ得、本発明の方法を使用して同時にスクリーニングされ得る。この分子は、実質的に精製され得、または様々な量の他の無関係な種を含み得る。さらに、このような場合（ここで結合分子が集団のうち１または２〜３のメンバーに選択性であることを所望される）、個々のリガンド種が組換えまたは他の生物学的合成機構によって生成され得るならば、細胞が、このリガンドを発現するように操作され得る。次に、このリガンドは、集団中の少なくとも１つのリガンドに対して選択的である結合分子を同定するため粗細胞抽出物においてスクリーニングされ得る。そのような細胞は、個々に各リガンドを合成するよう操作され得、そして次に、細胞抽出物はスクリーニングのためプールされ得る。あるいは、細胞は、１または数個の細胞抽出物が合わされ、そしてスクリーニングされるのに必要とされるように複数のリガンドを発現するように操作され得る。
【００５９】
このリガンド集団は、異なったサイズの実質的に精製された分子または粗細胞調製物のいずれか、または他の複合組成物で構成され得る。一般に、単一集団のリガンドは、少なくとも２つの異なったリガンド種を含み、そして、３、４、５、６、７、８、９、または１０のいずれかの異なったリガンドから構成され得る。適度なリガンド集団は、約１０および数百の間の異なったリガンド種を含む。複合リガンド集団は、例えば、細胞内の異なった分子数を含む約数万個の異なったリガンド種を含む。この数は、一般に約１０^５であると考えられる。なお、さらに、１０^６、１０^７、１０^８および１０^１０以上の異なった種と同じ大きさのリガンド集団で構成され得る組替えライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーがスクリーニングされ得る。これらの各集団サイズは、選択的結合親和性を有する結合分子を同定するためのリガンド集団として使用され得る。集団サイズおよびタイプの選択は、結合分子の必要性および意図した使用に依存する。当業者は、どのサイズおよびタイプの集団が特定の必要性にとって適切かえお認識している。
【００６０】
前記のように、上記の集合を含むリガンドは、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質または他の有機化合物のような、本質的にいずれのタイプの分子でもあり得る。従って、上で結合分子として議論している分子はまた、リガンドでもあり得ることが理解される。例えば、個々のまたは群の細胞表面レセプター（例えば、インテグリン、増殖因子レセプターまたはサイトカインレセプター）は、これらのレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして使用され得る結合分子を同定するためにランダムペプチドライブラリーまたはコンビナトリアルケミカルライブラリーをスクリーニングするリガンドとして使用され得る。
【００６１】
リガンドまたはリガンド群と結合する結合分子のスクリーニングを行うために、リガンド自身は、適切な検出法で検出される。この検出法は、直接または間接的であり得、そして例えば、光発光、放射性同位元素、発色の検出またはリガンドを検出できる任意の方法を含み得る。直接検出は、適切な細胞における代謝標識化または適切な放射性アミノ酸でのインビトロ共役転写−翻訳を使用するインビトロ標識化を使用するリガンドの放射性標識化、適切な酵素（例えば、キナーゼ）を使用する放射活性基質での共有結合改変、または放射性同位元素（例えば、ヨウ素化）を使用する化学改変のような方法を含み得る。直接法はまた、リガンドに対する適切な検出分子の融合も含み得る。例えば、リガンドは、ルシフェラーゼと融合され、そして光発光で検出され得るか、またはｌａｃＺと融合され、そして適切な比色検出によって検出され得る。リガンドの集団が生物学的に誘導された検出部分を有することが望まれる場合、ルシフェラーゼおよびｌａｃＺのような検出可能分子と融合されたリガンドを含むライブラリーは、結合分子のスクリーニングをするために使用され得る。リガンドの直接検出はまた、検出され得る化学部分の組み込みによるリガンドの共有結合改変によってなしとげられ得る。例えば、ビオチンは、リガンドと共有結合し、そして、上で議論した検出方法の１つを使用して、ストレプトアビジンで引き続いて検出され得る。
【００６２】
リガンドの間接検出のため、リガンドに共有結合しない分子は、検出のために使用され得る。リガンドと相互作用することが既知の分子は、そのような間接検出法に使用される。例えば、特異的にリガンドを検出し得る既知分子（例えば、抗体）が使用され得る。既知分子は、リガンドの直接検出についての上記の方法の１つによってそのものが検出されるか、または第一の既知分子に特異的な２次分子によって検出されるかいずれかである。例えば、リガンドに特異的な抗体は、直接検出についての上記の検出法を再度使用し、リガンドに対して特異的な第１の抗体と相互作用し得る２次抗体を使用して検出され得る。
【００６３】
１つの実施態様で、リガンドは、腫瘍細胞の細胞表面に由来する。細胞表面分子は、例えば、検出可能部分（放射性同位元素またはビオチン）で標識化され得る。この標識化によってリガンドの供給源が提供され、ここで、知られる必要がある唯一の特徴は、それが細胞表面上にあるということである。実施例で記載されているように、腫瘍抗原リガンドは、乳ガン細胞の細胞表面ポリペプチドをビオチンで標識化することによって調製され、そして腫瘍細胞表面ポリペプチドに選択的なＦａｂフラグメント結合分子を同定するために使用された。他の細胞または細胞下区画由来のリガンド集団は、初期の集団内で少なくとも１つのリガンドに対して選択的親和性を示す結合分子を得るために、本発明の方法において同様に使用され得る。従って、本発明の方法は、多種のリガンド集団に適用し得、ここで選択的結合親和力が疾患の治療処置または診断に必要とされる。
【００６４】
本発明の方法は、固体支持体に結合分子の多様な集団を選択的に固定化する工程からなる。選択的な固定化に関しては、この集団を構成する結合分子の固有の特徴が選択的な結合を提供するために利用されるか、あるいは、分子が選択的固定化のために使用される特定の特徴を含むように操作されるかどちらかである。例えば、結合分子そのものは、疎水性固体（例えば、プラスチック）に対する結合分子の固定化を引き起こす疎水性化学基またはドメインを含み得、または、疎水性固体（例えば、プラスチック）に対する結合分子の固定化を引き起こす疎水性化学基またはドメインと融合され得る。他の例では、固体支持体は、結合分子集団を構成する結合分子のみに結合し、そしてこれを選択的に固定化し得るような化学部分または生分子でコーティングされ得る。例えば、この固体支持体は、結合分子に対して共通なドメインまたは配列に選択的に結合する生分子でコーティングされ得る。リンカーまたはテザー（ｔｅｔｈｅｒ）のような生分子の使用は、それらが、結合分子へのリガンド結合を妨げないように選択されるべきである。例えば、抗体の不変部に対する抗体は、抗体結合分子を選択的に固定化するために使用され得る。そのようなアプローチは、実施例に記載されたように抗ヒトκ抗体を用いてヒトＦａｂフラグメントを固定化するために使用される。または、ペプチドタグに特異的な抗体が、固体支持体上に結合分子集団を選択的に固定化するために同様に機能する。
【００６５】
選択的固定化の１つの利点は、目的の特異的結合分子を検出するために感度の増加および非特異的結合の減少を提供することである。固体支持体は、例えば、高い濃度の結合分子を固定化し得る。そのような高い濃度の結合分子は、リガンドとの低親和性相互作用の検出および低濃度でのリガンドの検出能力を増加するために貢献し得る。基本的に、任意の固体支持体は、本発明の方法における使用に受け入れられる。この支持体は、特定の必要に適合し、そして集団のすべてまたは統計的代表数の結合分子を固定化する能力を示すように選ばれるべきである。さらに、固体支持体は、より大きな密度の固定化結合分子を達成し得る多孔性材料から作製され得る。
【００６６】
固体支持体はまた、結合分子集団を保持する能力を維持したまま、所望のスクリーニングの操作性を増加させるように選択され得る。そのような操作は、非結合リガンド集団の除去のためおよび非特異的相互作用を除く洗浄のため重要であり得る。操作の容易性は、多数の結合分子の高処理能スクリーニングを行う場合、利点となり得る。
【００６７】
本発明の方法を実施するために、一度、結合分子の集団が固体支持体に固定化されると、固定化された集団を、同時に２以上のリガンドの集団と接触させる。このリガンド集団は、結合分子にリガンドを結合させるように、選択的に固定化された結合分子と共に、適切な条件下で適切な期間インキュベートされる。選択的親和性を有する結合分子は、少なくとも１つの結合分子への集団内の少なくとも１つのリガンドの結合を測定することによって同定される。当業者は、リガンドへの結合分子の選択的結合を検出する（従って、リガンドに対する選択的親和性を有する結合分子の同定を可能にする）ように、適切な条件を認識しており、そして結合分子およびリガンド間の相互作用を可能にするに十分な条件を容易に決定し得る。
【００６８】
さらに、本発明は、同定された結合分子の配列を決定するための方法を提供する。例えば、結合分子が発現ライブラリーで生成される場合、コードしている核酸は、スクリーニングで同定された結合分子を発現している選抜クローンから単離され得る。次に、このコードしている核酸は、当業者に公知の方法を使用して配列決定され得る。
【００６９】
さらに、本発明は、結合分子によって選択的に結合されているリガンドを特徴付けるための方法を提供する。一度、リガンドに対して選択的である結合分子が同定されると、このリガンドは、例えば、当業者に公知のアフィニティー法によって単離され得、そして特徴付けされ得る。この特徴付けは、スクリーニングで使用されたリガンドがよく特徴付けされていない場合、有益であり得る。リガンドの特徴付けは、ゲル電気泳動による見かけの分子量の測定のような技術を含む。リガンドを特徴付けるために適用できる他の方法は、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、またはリガンドの物理的、生化学的または機能的特性についての情報を提供する他の方法を含む。当業者は、リガンドのそのような特徴付けのための適切な方法を認識している。
【００７０】
本発明はさらに、腫瘍抗原に対する選択的親和性を有する抗体を同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程からなる：ａ）固体支持体に多様な抗体集団を選択的に固定化する工程；ｂ）固体支持体上に固定化された多様な集団を２以上の腫瘍抗原と同時に接触させる工程；およびｃ）１以上の腫瘍抗原と選択的に結合する少なくとも１つの抗体を決定する工程。
【００７１】
本発明の方法は、結合分子およびリガンド集団として抗体および腫瘍細胞をそれぞれ使用して実施され得る。抗体結合分子の集団は、例えば、発現ライブラリーで生成され得る。腫瘍細胞の細胞表面分子の標識化は、検出可能な腫瘍抗原リガンドの集団を提供する。
【００７２】
本発明の方法を使用して、抗体結合分子は、例えば、抗体結合分子の不変部に対し特異的な抗体、または特定のイソ型または抗体サブユニットに対し特異的な抗体の使用によって、固体支持体に選択的に固定化される。例えば、抗κ鎖抗体が、インタクトな抗体およびＦａｂフラグメントを固体支持体へ固定化するために使用され得る。
【００７３】
固体支持体に固定化された抗体結合分子は、腫瘍抗原を抗体結合分子に結合させるように、適切な条件下で腫瘍抗原とインキュベートされ得る。この抗原は、全細胞、細胞抽出物として、または特定の細胞画分として適用され得る。適切な期間後、非結合腫瘍抗原は、固体支持体から取り除かれ、そして選択的結合は、以前に記載のように検出される。当業者は、どの条件が抗体への腫瘍細胞リガンドの結合を可能にするかを認識しており、そして、腫瘍抗原に特異的な抗体の同定を可能にする相互作用を可能とするに十分な条件を容易に決定できる。腫瘍抗原は、腫瘍抗原と特異的に相互作用する１以上の抗体結合分子を決定するために検出される。腫瘍抗原についての抗体結合分子の選択性は、コントロールとして使用される正常細胞に対して決定され得る。従って、本発の方法は、診断または治療目的に使用され得る腫瘍抗原特異的抗体結合分子を同定するための手段を提供する。
【００７４】
腫瘍特異的リガンドに対して選択的な多数の抗体結合分子が、本発明の方法によって同定された。これらの抗体結合分子は、実施例において以下に記載される。さらに、ヌクレオチド配列は、これらの腫瘍選択的抗体結合分子のＣＤＲ領域について決定された。そのようなコード核酸は、同様に実施例において以下に記載される。従って、本発明は、ヒト抗体またはその機能的フラグメントの集団を同定する方法を提供する。
【００７５】
本明細書で提供されるのはまた、腫瘍抗原に対して選択的な単離された結合ポリペプチドである。この単離された結合ポリペプチドは、抗体フラグメントの群から選択される抗体フラグメントであり、それは、Ｆ３、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４６、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５２、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５８、Ｆ６３、Ｆ６６、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７０、Ｆ７２、Ｆ７４、Ｆ７６、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８０、Ｆ８１、Ｆ８４、Ｆ８５、Ｆ８６、Ｆ９３、Ｆ９９、Ｆ１０４、Ｆ１１１、Ｆ１１２、Ｆ１１８、Ｆ１２６、Ｆ１２９、Ｆ１３０、Ｆ１３２、Ｆ１３３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１３６、Ｆ１３８、Ｆ１５１、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１７４、Ｆ１７６、Ｆ１７７、Ｆ１８４、Ｆ１８６、Ｆ１９１、Ｆ１９７、Ｆ２００、Ｆ２０２、Ｆ２０３、Ｆ２０７、Ｆ２０８、Ｆ２１２、Ｆ２１４、Ｆ２１７、Ｆ２２４、Ｆ２３１、Ｆ２３６、Ｆ２３８、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる。このような腫瘍抗原に対して選択的な単離された結合ポリペプチドは、例えば、Ｆ３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ１３３、ＴＡ５０またはＴＡ７３抗体フラグメントであり得る。
【００７６】
腫瘍抗原に対して選択的である特に有用な単離された結合ポリペプチドは、３つの特定の軽鎖ＣＤＲ配列および３つの特定の重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有する抗体フラグメントであり得る。腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、例えば、Ｆ３に見出される３つの軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号６、２８、および５０）および３つの重鎖ＣＤＲ配列（配列番号７２、９４および１１６）を含むアミノ酸配列を有し得るか、または実質的に同様または非関連のＣＤＲによって１以上のこれらのＣＤＲが置き換えられるアミノ酸配列を有し得る。上の記述から、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６個のＦ３ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（任意の２、３、４または５個のＦ３ＣＤＲ）を有し得るか、または単一のＦ３ＣＤＲを有し得ることを理解する。腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントはまた、Ｆ１４に見出される３つの軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号８、３０および５２）および３つの重鎖ＣＤＲ配列（配列番号７４、９６および１１８）を含むアミノ酸配列を有し得るか、または実質的に同様または非関連のＣＤＲにより１以上のこれらのＣＤＲが置換されるアミノ酸配列を有し得る。上の記述から、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが、６個のＦ１４ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（２、３、４または５個のＦ１４ＣＤＲ）を有し得るか、または単一のＦ１４ＣＤＲを有し得ることを理解する。
【００７７】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ１５において見出される、配列番号１０、配列番号３２、および配列番号５４の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ１５において見出される、配列番号７６、配列番号９８および配列番号１２０の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ１５　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ１５　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ１５　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ１９において見出される、配列番号１２、配列番号３４、および配列番号５６の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ１９において見出される、配列番号７８、配列番号１００および配列番号１２２の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ１９　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ１９　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ１９　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００７８】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２１において見出される、配列番号１４、配列番号３６、および配列番号５８の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２１において見出される、配列番号８０、配列番号１０２および配列番号１２４の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２１　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２１　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２１　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２２において見出される、配列番号１６、配列番号３８、および配列番号６０の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２２において見出される、配列番号８２、配列番号１０４および配列番号１２６の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２２　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２２　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２２　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００７９】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２３において見出される、配列番号１８、配列番号４０、および配列番号６２の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２３において見出される、配列番号８４、配列番号１０６および配列番号１２８の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２３　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２３　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２３　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ２６において見出される、配列番号２０、配列番号４２、および配列番号６４の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ２６において見出される、配列番号８６、配列番号１０８および配列番号１３０の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ２６　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ２６　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ２６　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８０】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、Ｆ１３３において見出される、配列番号２２、配列番号４４、および配列番号６６の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＦ１３３において見出される、配列番号８８、配列番号１１０および配列番号１３２の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＦ１３３　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＦ１３３　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＦ１３３　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８１】
別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、ＴＡ５０において見出される、配列番号２４、配列番号４６、および配列番号６８の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＴＡ５０において見出される、配列番号９０、配列番号１１２および配列番号１３４の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＴＡ５０　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＴＡ５０　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＴＡ５０　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８２】
なお別の実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な単離された抗体フラグメントは、ＴＡ７３において見出される、配列番号２６、配列番号４８、および配列番号７０の３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ならびにＴＡ７３において見出される、配列番号９２、配列番号１１４および配列番号１３６の３つの重鎖ＣＤＲ配列を含むアミノ酸配列を有し得るか、あるいはこれらのＣＤＲの１つ以上が、実質的に類似するか、または関連しないＣＤＲに置換されるアミノ酸配列を有し得る。上記の記載より、当業者は、本発明の単離された抗体フラグメントが６つのＴＡ７３　ＣＤＲの任意のサブコンビネーション（例えば、任意の２、３、４、または５つのＴＡ７３　ＣＤＲ）を有し得るか、あるいは１つのＴＡ７３　ＣＤＲを有し得ることを、理解する。
【００８３】
さらに、腫瘍抗原に対して選択的な抗体の、ＣＤＲまたはその機能的なフラグメントが提供される。ここでこのＣＤＲは、Ｆ３、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ３０、Ｆ３１、Ｆ３２、Ｆ３３、Ｆ３４、Ｆ３５、Ｆ３６、Ｆ３７、Ｆ３８、Ｆ４０、Ｆ４１、Ｆ４２、Ｆ４６、Ｆ４９、Ｆ５０、Ｆ５２、Ｆ５４、Ｆ５５、Ｆ５８、Ｆ６３、Ｆ６６、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７０、Ｆ７２、Ｆ７４、Ｆ７６、Ｆ７８、Ｆ７９、Ｆ８０、Ｆ８１、Ｆ８４、Ｆ８５、Ｆ８６、Ｆ９３、Ｆ９９、Ｆ１０４、Ｆ１１１、Ｆ１１２、Ｆ１１８、Ｆ１２６、Ｆ１２９、Ｆ１３０、Ｆ１３２、Ｆ１３３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１３６、Ｆ１３８、Ｆ１５１、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１７４、Ｆ１７６、Ｆ１７７、Ｆ１８４、Ｆ１８６、Ｆ１９１、Ｆ１９７、Ｆ２００、Ｆ２０２、Ｆ２０３、Ｆ２０７、Ｆ２０８、Ｆ２１２、Ｆ２１４、Ｆ２１７、Ｆ２２４、Ｆ２３１、Ｆ２３６、Ｆ２３８、ＴＡ５０およびＴＡ７３からなる群から選択される抗体フラグメントより誘導される。そのようなＣＤＲは、例えば、これらの抗体フラグメントの１つをコードするアミノ酸配列のＣＤＲコード部分と、実質的に類似するか、または同一のアミノ酸配列を有し得る。
【００８４】
本発明はまた、本発明の抗体フラグメントをコードする単離された核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、または配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を、含む。
【００８５】
抗体フラグメントをコードする核酸分子は、例えば、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、または配列番号１３５として参照されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００８６】
１つの実施態様において、腫瘍抗原に対して選択的な抗体のＣＤＲまたはその機能的フラグメントは、Ｆ３、Ｆ１４、Ｆ１５、Ｆ１９、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２６、Ｆ１３３、ＴＡ５０またはＴＡ７３抗体フラグメントより誘導され得る。そのようなＣＤＲは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、または配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列を実質的に含み得る。
【００８７】
本発明はまた、本発明のＣＤＲをコードする単離された核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、または配列番号１３６として参照されるアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
ＣＤＲをコードする核酸分子は、例えば、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、または配列番号１３５として参照されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００８９】
本発明の種々の実施態様の活性に実質的に影響しない変更はまた、本明細書において提供される本発明の定義内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、説明を意図するが、本発明を限定することを意図しない。
【００９０】
（実施例Ｉ）
（ヒトＦａｂフラグメント集団を選択的に固定化する固体支持体の調製）
この実施例は、結合分子の集団の選択的固定化のための、フィルターの調製方法を記載する。
【００９１】
この実施例において選択的に固定化される結合分子の集団は、組換え的に発現されたヒトＦａｂフラグメントであった。この場合、腫瘍関連細胞表面抗原に対して反応性のキメラ抗体である、ヒトＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントを使用して、ヒトＦａｂフラグメントの結合条件を決定した。ＢＲ９６抗体は、通常リソソームに局在化する膜内在性タンパク質であるｌａｍｐ−１と主に会合するルイスＹ関連糖質（ＬｅＹ抗原）に対して、反応性である。ヒトＦａｂフラグメントの集団を、ニトロセルロースフィルターを抗ヒトκ抗体でコートすることにより、固体支持体に固定化した。抗ヒトκ抗体を、フィルターへの結合のための薬剤として使用した。なぜなら、この抗体は抗体集団に対して特異的であるからである。従って、この抗体を使用して、その集団をフィルター上に選択的に固定化または「捕獲」し得る。
【００９２】
最初に、選択的にニトロセルロースフィルター上に固定化され得る抗体の量を最適化するために、条件を決定した。ヒトＦａｂフラグメントの選択的固定化のための試薬として、種々の抗ヒトイムノグロブリン試薬を試験した。事実上、試験した抗ヒトイムノグロブリン試薬の全ては、未処理のニトロセルロースフィルターと比較して、増強したシグナルを示した。そしてアフィニティー精製したポリクローナルヤギ抗ヒトκ抗体が、ＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントの選択的固定化において最も効率的であることを決定した。このアプローチによって生成される非特異的なシグナルを、ファージに感染していない領域、および関係ない抗体を発現するファージプラークの両方にフィルターを重層することにより、決定した。このアッセイのバックグラウンドは、低く、そしてこれらのコントロールのいずれによって生成されたシグナルにおいても、差異は観察されなかった。
【００９３】
選択的固体化のために、ポリクローナル抗ヒトκ抗体を使用して、ＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントの最大の結合のための、抗ヒトκ抗体の濃度を決定した。手短には、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む溶解した０．７％アガーおよびｓｕｐＥアンバーサプレッサー株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、固めたボトムの１．５％アガーＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ培地に重層して、３７℃で３時間インキュベートした。３μｌのファージストックのアリコート（約１０^１２ファージ／ｍｌ）を、細菌の層（ｌａｗｎ）上に直接スポットして、２５℃で１５分間アガー中に染み込ませた。次に、プレートを大きなプラークが見えた時に、３７℃に３〜４時間移した。プラークに１ｃｍ^２のニトロセルロースフィルターを重層した。フィルターを取り除き、１．５ｍＭ　ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）を用いて４回リンスした。機能的ＢＲ９６　Ｆａｂの選択的固定化を検出するために、フィルターを、０．７７２μｇ／ｍｌの西洋わさびペルオキシダーゼ結合化ＬｅｗｉｓＹ抗原、５％　脱脂粉乳、０．２％　Ｔｗｅｅｎ　２０、０．０１％　消泡剤Ａエマルジョンおよび０．０１％　チメロサールを含むＰＢＳ中に置いて、２時間、４℃でインキュベートした。フィルターをＰＢＳで５回洗浄して、１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドおよび０．００３％過酸化水素を含む、５０ｍＭ　クエン酸、１００ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ５中に、配置した。反応を、Ｈ_２ＳＯ_４を、最終濃度０．３６Ｍまで添加して停止して、アリコートを取り出し、そしてＯＤ_４９０を分光計で測定した。
【００９４】
図１Ａに示すように、抗ヒトκ抗体の、約１０μｇ／ｍｌまでの漸増濃度は、より大量のＢＲ９６　Ｆａｂフラグメントを保持した。１０μｇ／ｍｌを超える抗ヒトκ抗体を用いてコートしたフィルターは、増強されていたが、最適を下回るシグナルを生成した。一方、１μｇ／ｍｌ未満の抗体を用いたコーティングは、シグナルを明らかには増幅しなかった。未処理のフィルターおよび低濃度（０．２μｇ／ｍｌ未満）の抗ヒトκ抗体でコートしたフィルターは、バックグラウンドを超えるアッセイシグナル（Ａ_４９０＝約０．０５）を生成しなかった。従って、１０μｇ／ｍｌ抗ヒトκ抗体を用いてコートされたフィルターから得られたシグナルに基づく場合（Ａ_４９０＝約０．４５）、選択的固定化フィルターリフト技術は、シグナルを少なくとも９倍まで増幅した。
【００９５】
発現され、そしてコートされたフィルターによって選択的に固定化された機能的な抗体Ｆａｂフラグメントの量を、２５℃で、０〜８時間の種々の時間に、評価した。図１Ｂに示すように、シグナルは、０〜４時間増加した。４時間の時点で、さらなるトランスファーの時間は、明らかにはシグナルを増加しなかった。
【００９６】
これらの結果に基づき、ニトロセルロースフィルターを、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトκ抗体を含む溶液中で、３時間インキュベートした。ニトロセルロース上の未反応の部位をブロックするために、ニトロセルロースフィルターをＰＢＳ中の１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液中で、２時間インキュベートした。
【００９７】
この方法で調製したフィルターを、以下の研究において使用した。
【００９８】
（実施例ＩＩ）
（ヒトＦａｂフラグメントの固体支持体への固定化は、ヒトＦａｂフラグメントの検出の感度を増強した）
この実施例は、結合分子集団の固定化が、特異的結合事象の検出の感度を増加することを実証する。
【００９９】
ＢＲ９６反応性Ｆａｂ（２４０Ｈ２）を発現するファージライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の層（ｌａｗｎ）上にプレートして、３７℃で８時間増殖させた。ニトロセルロースフィルターを、細菌の層に適用して、２２℃で４時間インキュベートすることによって、コントロールフィルターリフトを、生成した。これらのコントロールニトロセルロースフィルターを取り除いた。従って、コントロールフィルターリフトは、ファージプラークにおいて発現する結合分子を選択的には固定化しなかったが、その代わりに、結合分子を含む、全ての分泌ポリペプチドおよび溶解によって放出される全てのポリペプチドを直接固定化する。ヒトＦａｂフラグメントを選択的に固定化するために、実施例Ｉにおいて調製したように、ヤギ抗ヒトκ抗体を用いてコートされたニトロセルロースフィルターを、細菌の層（ｌａｗｎ）に適用して、２２℃で４時間インキュベートした。これらの選択的固定化フィルターリフトを取り除いた。次のステップは、コントロールフィルターリフトおよび選択的固定化フィルターリフトを用いて並行して行った。フィルターリフトを、１％　ＢＳＡ中でブロックして、西洋わさびペルオキシダーゼ結合化ＢＲ９６抗原（ＬｅＹ抗原）中でインキュベートした。フィルターを、製造業者によって記載された手順を使用し（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　ＩＬ）、増強した化学発光（ＥＣＬ）によって発色させ、３０秒間フィルムに曝露した。結果は、細菌の層（ｌａｗｎ）に適用したフィルターの順番に依存しなかった。
【０１００】
図２に示すように、ヒトＦａｂフラグメントは、選択的固定化フィルターリフト上において容易に検出された（図２において捕獲リフトと称する）、一方、コントロールフィルターリフト（図２において通常リフトと称する）は、非常に低レベルの検出可能なヒトＦａｂフラグメントを有した。選択的固定化フィルターリフトは、コントロールフィルターリフト（ニトロセルロースフィルターを直接、細菌の層（ｌａｗｎ）に適用）と比較して、腫瘍抗原ＢＲ９６を認識するヒト抗体について、非常により強いシグナルを有した。従って、目的の特異的結合分子（この場合、ヒトＦａｂフラグメント）の濃度を増加するために選択的固定化フィルターリフトを用いると、目的の結合分子の検出について、より高い感度をもたらした。
【０１０１】
これらの結果は、選択的固定化フィルターリフトが、結合分子がフィルターに直接結合されるコントロールフィルターリフトと比較して、感度を増加し、かつバックグラウンドの結合を減少することを示す。
【０１０２】
（実施例ＩＩＩ）
（ビオチン化細胞表面抗原の調製および抽出）
この実施例は、細胞表面腫瘍抗原を標識する方法を記載する。この実施例はまた、選択的に固定化された抗体の検出のために使用する場合、低いバックグラウンド結合をもたらす細胞表面腫瘍抗原抽出物の調製を記載する。
【０１０３】
Ｈ３３９６細胞を、単層で増殖させ、そして続いての４℃での操作のために、氷上にて冷却した。細胞を、３回ＰＢＳを用いてリンスした。３０分後、細胞を、ＰＢＳ中の１．５ｍｇ／ｍｌのスルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに２時間インキュベートした。細胞を１度５０ｍＭのグリシンを含むＰＢＳ中でリンスして、次に、ＰＢＳでさらに２回リンスした。細胞を、１００μＭ［４−２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド、ＨＣｌ］、１μＭ　ペプスタチンＡおよび１０μＭ　ロイペプチンヘミスルフェートを含むＰＢＳ中でスクレイピングによって収集した。タンパク質濃度を測定し、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を１０：１（重量：重量）の最終濃度まで添加して、懸濁液を回転式円盤上で４℃で、オーバーナイトインキュベートした。粒子状の物質を、１１，０００×ｇで３０分間、４℃の遠心分離、続いて、５４０，０００×ｇで７分間、４℃の超遠心分離によって除去した。上清は、可溶性のビオチン化細胞表面抗原を含む。
【０１０４】
これらの結果は、細胞表面ポリペプチドがスクリーニング方法における使用のためにビオチンを用いて標識され得ることを実証する。これらの結果はまた、ミクロソームを含む妨害する粒子状物質を欠く抽出物が低いバックグラウンド結合をともなう選択的固定化フィルターリフトのプロービングにおける使用のために調製され得ることを実証する。
【０１０５】
（実施例ＩＶ）
（コントロールフィルターリフトと比較した、選択的固定化フィルターリフトのバックグラウンドの減少）
この実施例は、選択的固定化フィルターリフトがコントロールフィルターリフトと比較して非特異的細菌タンパク質結合の減少したバックグラウンドを提供することを、実証する。
【０１０６】
ＢＲ９６反応性Ｆａｂ（２４０Ｈ２）を発現するファージを、関係のないファージストック（ＩＸ６４）（Ｆａｂを全く発現しない）と混合して、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の層（ｌａｗｎ）上にプレートして、３７℃で８時間増殖させた。４つの複製フィルターリフト（２つのコントロールフィルターリフトおよび２つの選択的固定化フィルターリフト）を、連続して細菌の層（ｌａｗｎ）とともに、４時間２２℃でインキュベートした。２つのコントロールフィルターリフト（ＡおよびＢ）ならびに２つの選択的固定化フィルターリフト（ＣおよびＤ）を、種々の試薬とインキュベートした。細菌の層（ｌａｗｎ）上に存在する全てのプラークを位置決めするために、フィルターリフトＡをウサギ抗ｆｄバクテリオファージ抗体とともに、０．１％　アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の１％　ＢＳＡ中でインキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて、アルカリホスファターゼヤギ抗ウサギ抗体中でインキュベートした。フィルターをＰＢＳで６回洗浄して、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５、０．４ｍＭ　２，２’−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリドおよび０．３８ｍＭ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェートモノ−（ｐ−トルイジニウム）塩を含むアルカリホスファターゼ比色分析試薬中のインキュベーションによって発色させた。フィルターリフトＣを、西洋わさびペルオキシダーゼ結合化ＬｅｗｉｓＹ抗原（ＢＲ９６抗原）とともに、インキュベートした。フィルターリフトＣを、ＥＣＬを用いて発色させ、そして３０秒間フィルムに曝露した。
【０１０７】
選択的固定化フィルターリフトが細胞抽出物中のリガンドを区別する能力を研究するために、Ｈ３３９６細胞をビオチン化して、膜抽出物を実施例ＩＩＩに記載のように調製した。フィルターリフトＢおよびＤを、ビオチン化細胞表面抗原（実施例ＩＩＩに記載のように調製し、ＰＢＳ中の１％　ＢＳＡ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．１４５％　ドデシル硫酸ナトリウムおよび０．１％　アジ化ナトリウム中に、４０μｇ／ｍｌに希釈した腫瘍細胞抽出タンパク質）とともに、２時間４℃でインキュベートした。フィルターリフトＢおよびＤをＰＢＳ中の０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０を用いて６回洗浄し、続いて、アルカリホスファターゼ結合化ストレプトアビジンとともにインキュベートした。プラークを、アルカリホスファターゼ比色分析試薬中の発色後に可視化した。
【０１０８】
図３に記載のように、全てのプラークを、抗ｆｄバクテリオファージ抗体を用いてフィルターＡ上で可視化した。同様に、たとえ、ＩＸ６４由来のプラークがＦａｂフラグメントを発現していなくても、コントロールリフトＢをビオチン化細胞表面抗原でプローブした場合、全てのプラークが可視化した。従って、ファージ溶菌によって放出される細菌タンパク質に起因する有意なバックグラウンドがあるようである。腫瘍細胞抽出物の非特異的結合を減少するための多数の試みがなされ、これには、以下：（１）腫瘍細胞膜を可溶化するための、種々の界面活性剤の使用、（２）よりストリンジェントな、フィルターの洗浄パラメーターの使用、（３）広範囲のブロッキング試薬の評価、および（４）ファージ発現Ｆａｂを捕獲するための、異なるタイプのマトリックスの使用、が挙げられる。これらのアプローチの全ては、バックグラウンドも減少し得ないか、またはシグナルを完全に消滅させた。
【０１０９】
直接結合した結合分子および非特異的細菌タンパク質を含むコントロールフィルターと対照的に、精製ＢＲ９６抗原を用いるか（図３、フィルターリフトＣ）、またはＢＲ９６抗原、ならびに他のビオチン化細胞表面抗原を含有する細胞膜溶解物を用いる（フィルターリフトＤ）選択的固定化フィルターリフトのプロービングは、プラーク検出の同様のパターンをもたらした。粗細胞膜溶解物をＢＲ９６抗原の供給源として使用した場合、コントロールフィルターリフト上において、全てのプラーク（ＢＲ９６特異的Ｆａｂフラグメントを発現しないプラークを含む）に対して、非特異的結合を生じた（フィルターリフトＢ）。一方、同一の抽出物を使用して、選択的固定化フィルターリフト上において、ＢＲ９６特異的Ｆａｂフラグメントを検出し得た（フィルターリフトＤ）。従って、選択的固定化フィルターリフトは、コントロールフィルターリフトよりも、細菌タンパク質に対する有意により低いバックグラウンド結合を有した。
【０１１０】
これらの結果は、ニトロセルロースフィルターに対する結合分子の選択的固定化手順が細菌タンパク質のバックグラウンド結合を減少させることを示す。従って、フィルター上に選択的に固定化された結合分子による目的の結合分子の捕獲が、細菌プラーク溶解物中の結合分子を選択的に捕獲することによって、結合分子の濃度を増加させる。さらに、非特異的細菌タンパク質の結合を減少することによって、バックグラウンドが減少した。従って、選択的固定化フィルターリフト方法は、リガンドの集団を用いて結合分子をスクリーニングする場合、増強した感度、および減少したバックグラウンドを提供する。
【０１１１】
（実施例Ｖ）
（固体支持体上の選択的な固定化によって同定される、腫瘍特異的Ｆａｂフラグメントの同定）
この実施例は、腫瘍特異的Ｆａｂフラグメントを発現するクローンの同定を実証する。
【０１１２】
Ｆａｂフラグメントライブラリーを、乳房腫瘍組織および結腸腫瘍組織を用いて生成した。大多数のＦａｂフラグメントを、細胞表面腫瘍抗原に対する特異性を用いて同定した。
【０１１３】
Ａ２、Ａ３、およびＡ４と称される、ヒトＦａｂフラグメントを発現する３つのライブラリーを、３つの異なる腫瘍の供給源から生成した。Ａ２ライブラリーを、乳ガン患者から得られた、腫瘍を排出するリンパ節組織から構築した。Ａ３ライブラリーを、ヒト結腸腫瘍組織から構築した。Ａ４ライブラリーを、前立腺腫瘍組織から構築した。そのライブラリーを、腫瘍組織サンプルにおいて存在するＢ細胞から構築した。手短には、ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、腫瘍組織から抽出した。ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成に続いて、ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖を、タッチダウンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。１本鎖ＤＮＡを単離して、２つのベクターＩＸ１０４およびＩＸ２０３中にクローン化した。ＩＸ１０４ベクターは、イムノグロブリン重鎖とｐＶＩＩＩタンパク質との間にアンバー終止コドンを含む。ＩＸ２０３ベクターは、アンバー終止コドンを取り除かれている。
【０１１４】
ヒトＦａｂライブラリーを、抗ヒトκ抗体でコートしたニトロセルロースフィルター上に選択的に固定化した（実施例Ｉのように調製）。表２に、Ｈ３３９６細胞株由来のビオチン化細胞表面ポリペプチド（実施例ＩＩＩのように調製）に対するＩＸ１０４またはＩＸ２０３ベクターのいずれかにおけるヒトＦａｂライブラリーの３つの独立したスクリーニング実験の結果の概要を述べる。選択的固定化フィルターリフト技術を用いると、ポジティブクローンの頻度は３つの独立した実験において異なっていた（表２を参照のこと）。これらの実験において定義されるように、ポジティブクローン（表２において、捕獲リフトポジティブクローンと称する）を、最初のスクリーニングにおいて同定し、採取し、再度プレートし、そして第２の選択的固定化フィルターリフトスクリーニングにおいて確認した。
【０１１５】
（表２．腫瘍細胞を用いたＦａｂライブラリースクリーニングの概要）
【０１１６】
【表２】

【０１１７】
^１１５μｇ／ｍｌ以下のＦａｂフラグメント濃度で、未反応。
【０１１８】
選択的固定化フィルターリフト技術によって同定されたポジティブクローンを単離し、そして、さらなる特徴づけのための可溶性Ｆａｂをより大量に生成する供給源として使用した。手短には、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌を２×ＹＴ培地にて、３７℃で、培養物が０．９〜１．２　ＯＤ_６００の密度に達するまで増殖させた。最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加後、培養物を、高力価ストック（＞１０^１０プラーク形成単位／ｍｌ）からの１０μｌのファージを用いて感染させ、そして１時間３７℃でインキュベートした。培養物を２５℃にシフトしてさらに１４〜１６時間増殖させた。細胞を、６０００×ｇ　１０分間でペレット化し、１００μＭ（４−２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド、ＨＣｌ）、１μＭ　ペプスタチンＡおよび１０μＭ　ロイペプチンヘミサルフェートを含む１０ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、そしてマイクロチップを備えたＢｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　４５０を用いて、１５％の出力で１分間、音波振動によって破砕した。超音波処理後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中の１０００ＵのＤＮａｓｅＩを添加し、そして溶解物を３０分間、２５℃でインキュベートした。溶解物を、１２，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、上清を取り除き、そしてＦａｂフラグメントの精製のために使用した。
【０１１９】
Ｆａｂフラグメントを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ活性化カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上への２０ｍｇへのヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆａｂのカップリングにより構築したアフィニティーカラムを使用して精製した。Ｔｗｅｅｎ　２０を、０．０５％の最終濃度まで、細菌細胞溶解物に添加し、そして溶解物を０．４５μｍフィルターを通して濾過して、アフィニティーカラムにアプライした。未結合画分を回収し、そして２回目のアプライをした。カラムを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含む緩衝液を用いて洗浄して、その後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液で洗浄した。Ｆａｂを、０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む１００ｍＭ　グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．３を用いて、１０分の１容量の１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中に溶出した。Ｆａｂフラグメントを含有する画分を、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５−Ｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。
【０１２０】
精製したＦａｂフラグメントをさらに特徴づけるために、Ｈ３３９６細胞の単層を、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドを用いて、２５℃で１５分間固定した。パラホルムアルデヒドをアスピレートして、細胞を、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。固定した細胞を、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液中でインキュベートして、Ｆａｂフラグメントをブロッキング緩衝液中に適切な濃度に希釈して、固定した細胞と２５℃で２時間インキュベートした。サンプルをアスピレートして、固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄して、細胞を０．５μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合化ヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体とともに２５℃で１時間インキュベートした。固定した細胞をＰＢＳで４回洗浄して、アルカリホスファターゼ比色分析試薬を用いて発色させた。
【０１２１】
フィルターリフト上の選択的固定によって同定されたＦａｂフラグメントの約４０〜５０％は、ビオチン化細胞膜溶解物を生成するために使用した細胞株であるＨ３３９６腫瘍細胞の、固定した単層上において滴定可能なシグナルを生成した（表２を参照のこと）。固定した単層上において滴定されなかったＦａｂフラグメントの約５０％のうちのいくつかは、パラホルムアルデヒド処理によって破壊された抗原性エピトープに依存するようである。パラホルムアルデヒド処理を使用しない異なる技術を使用して、これらの残りのＦａｂフラグメントクローンを特徴づけし得る。
【０１２２】
固体支持体上での選択的な固定化によって単離されたポジティブなＦａｂフラグメントクローン（表２において捕獲リフトポジティブクローンと称される）はまた、ＧＭ０５６５８正常ヒト線維芽細胞に対するクローン化Ｆａｂフラグメントの反応性について試験された。５０，６００のもとのクローンをスクリーニングした１つの実験において、２を超えるクローンは線維芽細胞に反応せず、そして線維芽細胞ネガティブと分類された。１３９，４００のもとのクローンをスクリーニングした第２の実験において、９を超えるクローンを、線維芽細胞ネガティブクローンとして同定した。従って、選択的な固定化は、腫瘍細胞に特異的に結合するが、正常線維芽細胞に結合しないヒトＦａｂフラグメントの同定を可能にする。
【０１２３】
選択的固定化フィルターリフト技術を使用して、表３に示すように、Ｆａｂフラグメントを発現する８１クローンを同定した。
【０１２４】
ＤＮＡをＦａｂクローンから単離し、そして軽鎖ＣＤＲ領域に対応するＤＮＡフラグメントを、ＩＸ１０４特異的プライマー　ＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧ（配列番号１）、またはＩＸ２０３特異的プライマー　ＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡ（配列番号２）を用いて配列決定した。重鎖ＣＤＲ領域に対応するＤＮＡフラグメントを、プライマー　ＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡ（配列番号３）または　ＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号４）を用いて配列決定した。表４は、クローン化Ｆａｂフラグメントの軽鎖において見出された３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列を示す。表５は、クローン化したＦａｂフラグメントの軽鎖のＣＤＲ領域のヌクレオチド配列を示す。表６は、クローン化したＦａｂフラグメントの重鎖において見出された３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列を示す。表７は、クローン化されたＦａｂフラグメントの重鎖のＣＤＲ領域に対応するヌクレオチド配列を示す。フィルター上の選択的な固定化によって同定されたＦａｂクローンの各々は、独特のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
（表３．選択的固定化フィルターリフト技術によって同定された、腫瘍特異的ヒトＦａｂクローン）
【０１２６】
【表３】

【０１２７】

【０１２８】
（表４．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの軽鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列）
【０１２９】
【表４】

【０１３０】
（表５．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの軽鎖のＣＤＲ領域のヌクレオチド配列）
【０１３１】
【表５】

【０１３２】

【０１３３】
（表６．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列）
【０１３４】
【表６】

【０１３５】

【０１３６】
（表７．選択的固定化フィルターリフト技術によって単離されたＦａｂフラグメントの重鎖のＣＤＲ領域のヌクレオチド配列）
【０１３７】
【表７】

【０１３８】

【０１３９】
選択的固定化フィルターリフト技術を用いて、発現ライブラリーにおいて生成された大多数のヒトＦａｂフラグメントを同定した。この技術は、大多数のクローンのスクリーニングを可能にする。単離されたＦａｂクローンの選ばれた数のＤＮＡ配列決定は、種々の遺伝子的に異なるＦａｂフラグメントが同定されたことを明らかにした。
【０１４０】
これらの結果は、選択的固定化フィルターリフト技術が、大多数の異なるヒトＦａｂフラグメントの同定を可能にすることを示す。
【０１４１】
（実施例ＶＩ）
（固体支持体上への選択的な固定化によって同定された腫瘍細胞特異的ヒトＦａｂフラグメントの特徴づけ）
この実施例は、固定したおよび生存する腫瘍細胞株に関する、Ｆａｂクローンの細胞特異的反応性を実証する。
【０１４２】
選択的固定化フィルターリフト技術を使用して同定されたＦａｂフラグメントを、実施例Ｖに記載されるように精製した。種々の細胞株を実施例Ｖに記載のようにパラホルムアルデヒド中で固定し、そして精製Ｆａｂフラグメントの漸増濃度（２．５×１０^−１〜３×１０^１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。実施例Ｖに記載のように、未結合のＦａｂを除去して、固定した細胞をアルカリホスファターゼ結合化抗ヒトκ抗体とともにインキュベートした。発色試薬とのインキュベートの後、ＯＤ_５６０を測定した。
【０１４３】
図４Ａにおいて、精製Ｆａｂ　Ｆ１５の滴定曲線を、２つの乳房腫瘍細胞株（Ｈ３３９６およびＨ３４６４）ならびにＧＭ０５６５８正常線維芽細胞において、示した。Ｆａｂ　Ｆ１５は、両方の乳房細胞株に対する特異的結合を示すが、正常線維芽細胞に対する特異的結合は示さない。図４Ｂにおいて、Ｆａｂ　Ｆ１３３の滴定曲線を、同一の２つの乳房細胞株およびＧＭ０５６５８正常ヒト線維芽細胞を用いて示す。Ｆａｂ　Ｆ１３３は、スクリーニング抽出物を作製するために使用したＨ３３９６細胞について特異的結合を示す。しかし、Ｆａｂ　Ｆ１３３は、第２の乳房細胞株または正常線維芽細胞に対して結合しない。
【０１４４】
精製Ｆａｂフラグメントをまた、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍでのＦＡＣＳ分析によって、生存腫瘍細胞への結合に関して特徴づけした。精製Ｆａｂ　Ｆ３をＨ３３９６細胞において、非特異的Ｆａｂフラグメントと比較した（図５Ａを参照のこと）。Ｈ３３９６細胞とＦａｂ　Ｆ３とのインキュベーションは、Ｈ３３９６細胞におけるシフトを生じ、このことは、非特異的Ｆａｂとインキュベートした細胞と比較して、細胞表面抗原との反応性を示した。Ｆａｂ　Ｆ３がシフトさせた細胞のピークはシャープであり、このことは、Ｈ３３９６細胞の集団がその抗原の発現において比較的均一であることを示す。
【０１４５】
同様のＦＡＣＳ分析を、Ｆａｂ　Ｆ１５を用いて行った。図５Ｂに示すように、Ｆａｂ　Ｆ１５は、Ｈ３３９６細胞において、Ｆａｂ　Ｆ３を用いて観察されるよりも、非特異的Ｆａｂと比較してより大きなシフトを生じた。このことは、Ｆａｂ　Ｆ１５が細胞表面抗原と反応することを示す。シフトしたＦａｂ　Ｆ１５のピークは、Ｆａｂ　Ｆ３を用いて観察されたピークよりも広く、このことは，Ｈ３３９６細胞におけるＦａｂ　Ｆ１５抗原のより不均一な発現と一致する。
【０１４６】
ＦＡＣＳ分析を、Ｆａｂ　Ｆ４０を用いてまた、行った。Ｆａｂ　Ｆ４０を、乳房細胞株Ｈ３３９６の膜抽出物を用いて同定した。興味深いことに、Ｆａｂ　Ｆ４０は、結腸ガン種細胞株Ｈ３７１９と交差反応性である（図５Ｃを参照のこと）。Ｆａｂ　Ｆ４０は、コントロールの非特異的Ｆａｂと比較して、Ｈ３７１９細胞のシフトを生じる。このことは、Ｆａｂ　Ｆ４０が、結腸ガン腫細胞株の細胞表面抗原を認識することを示す。Ｆａｂ　Ｆ４０のピークは、いくぶん広く、このことは、Ｆ４０抗原の発現がより不均一であることを示す。従って、Ｆａｂ　Ｆ４０は、腫瘍細胞の２つの異なるタイプの細胞表面抗原を認識する。
【０１４７】
選択的固定化フィルターリフト技術は、固定された生腫瘍細胞についての特異性を有する大多数のヒトＦａｂフラグメントの単離を可能とした。いくつかのＦａｂフラグメントが、乳ガン腫細胞に対して特異的であるか、または特定の乳房細胞株に対して特異的であるが、他のＦａｂフラグメントは、結腸ガン腫細胞株に対して交差反応する。これらのＦａｂフラグメントは、腫瘍細胞上の特異的な結合を提示したが、正常線維芽細胞に対しては、結合しなかった。
【０１４８】
これらの結果は、選択的固定化フィルターリフト技術が腫瘍細胞に対する特異性を有するヒトＦａｂフラグメントの同定を可能にすることを示す。
【０１４９】
上記に提供された全ての学術誌文献および参考文献は、括弧内であってもまたはそうでなくても、上記に述べられていても、述べられていなくても、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０１５０】
本発明は、上記に提供される実施例に対する参照とともに記載されてきたが、種々の変更を本発明の精神から逸脱することなくなし得ることが理解されるべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、固体支持体上に固定化されたヒトＦａｂ結合分子の最適化を示す。
【図２】
図２は、固体支持体上に選択的に固定化された結合分子を用いる、腫瘍抗原に対するヒトＦａｂ結合分子の同定を示し、そして固体支持体上に直接固定化された結合分子に対する検出効率を比較する。
【図３】
図３は、固体支持体上に選択的に固定化されたヒトＦａｂ結合分子集団を用いる検出の増大した結合特異性と減少したバックグラウンドを、直接固定化と比較して示す。
【図４】
図４は、固体支持体上の選択的固定化によって同定されたヒトＦａｂ結合分子の、腫瘍細胞単層に対する結合特異性を示す。
【図５】
図５は、固体支持体上の選択的固定化によって同定されたヒトＦａｂ結合分子による腫瘍細胞の蛍光活性化細胞選別を示す。[0001]
This application claims priority to and from U.S. patent application Ser. No. 08 / 905,825, filed Aug. 4, 1997, which has been converted to a US provisional patent application. The entirety of this application is incorporated herein by reference.
[0002]
(Background of the Invention)
The present invention relates generally to tumor cell therapy, and more particularly, to the identification of novel tumor-specific binding molecules and tumor-specific antigens.
[0003]
In recent years, there has been tremendous progress in understanding cancer development and progression. Despite this increased knowledge, little reduction in mortality from most types of cancer has been observed. The success rate of cancer treatment increases with early diagnosis. Cancer treatment generally involves treatment with therapeutic agents, which affect cancer cells as well as other cells in the body, often leading to debilitating side effects. Thus, antibodies that bind to tumor-specific targeting agents, such as tumor antigens, not only provide useful reagents for earlier diagnosis of certain types of cancer, but also minimize cancer therapy in non-tumor tissues. To provide a tumor-specific targeting factor.
[0004]
Although several tumor-specific antigens have been identified, obtaining useful tumor-specific targeting agents is still difficult. Of interest for therapeutic purposes are human antibodies, which can be used to target toxins to certain types of tumors. The advantage of using human antibodies is that they are most likely to provoke an immune response that removes antibodies and toxins from the body during cancer treatment. However, developing human antibodies that can target specific tumors has proven difficult.
[0005]
To obtain antibodies or other factors that can specifically target a tumor type, screening for a large number of possible factors is required. For example, in order to obtain a monoclonal antibody specific for a tumor antigen, it is necessary to generate and screen tens to hundreds of hybridoma cell lines. This process is difficult, time consuming, and requires additional purification or preparation of the antigen or tumor cells first.
[0006]
Many other screening approaches are currently being developed, including recombinant methods utilizing bacteria and yeast, which allow the identification of specific binding partners for specific molecules of interest . For example, it is now possible to generate large-scale display or combinatorial libraries of antibodies or other types of binding molecules. However, these methods usually involve screening the library with one or more relatively purified molecules of interest.
[0007]
Regardless of the available screening approaches, the identification and subsequent isolation of tumor-specific antigens has proven difficult over the years. Attempts to circumvent this problem by screening for specific binding molecules using cell lysates, unfortunately, resulted in molecules with inappropriate binding specificities. Thus, specific binding molecules that can be adapted for cancer diagnosis and therapy essentially lack availability.
[0008]
Therefore, there is a need for a fast and effective method for identifying specific binding molecules for tumor antigens. The present invention fulfills this need, and also provides related advantages.
[0009]
(Summary of the Invention)
The present invention provides a method for identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand. The method comprises the steps of selectively immobilizing a diverse population of binding molecules to a solid support, contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more ligands simultaneously; Determining at least one binding molecule that selectively binds to the ligand. The invention further provides a method for identifying an antibody having a selective affinity for a tumor antigen. The method comprises the steps of selectively immobilizing a diverse population of antibodies on a solid support, contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more tumor antigens simultaneously; Determining at least one antibody that selectively binds to the tumor antigen. The invention also provides an isolated binding polypeptide that is selective for a tumor antigen. Further, the present invention provides a complementarity determining region (CDR) of an antibody or a functional fragment thereof that is selective for a tumor antigen.
[0010]
(Detailed description of the invention)
The present invention provides a rapid and efficient method for identifying binding molecules that exhibit selective affinity for one or more ligands of interest. This method is advantageous in that it allows multiple binding molecules to be screened simultaneously for multiple ligands of interest. Furthermore, very little information is required regarding the identity or function of either the binding molecule or the ligand. For example, a diverse population of binding molecules can be screened simultaneously against a diverse population of ligands, and a large number of molecules exhibiting the desired binding specificity can be quickly identified. Therefore, the method of the present invention can be advantageously applied to the discovery of specific reagents for the diagnosis and treatment of human diseases.
[0011]
The term "binding molecule" as used herein is intended to indicate a molecule of sufficient size and complexity to be able to selectively bind a ligand. Such molecules are typically macromolecules such as polypeptides, nucleic acids, carbohydrates or lipids. However, derivatives, analogs and mimetic compounds, and small organic compounds are also intended to be included within the definition of this term. The size of the binding molecule is not critical as long as the molecule exhibits or can be made to exhibit selective binding activity for the ligand. For example, a binding molecule can be at least one or two, and many tens or hundreds of monomeric basic units, which make up a macromolecular binding molecule. Similarly, organic compounds can be of simple or complex structure, as long as they exhibit selective binding affinity.
[0012]
Binding molecules can include, for example, antibodies and other immune system receptor or ligand binding polypeptides. Such other molecules of the immune system include, for example, the T cell receptor (TCR), major histocompatibility complex (MHC), the CD4 receptor, and the CD8 receptor. In addition, cell surface receptors such as integrins, growth factor receptors and cytokine receptors, and cytoplasmic receptors such as steroid hormone receptors can also be substantially included within the definition of the term binding molecule. In addition, DNA binding polypeptides such as transcription factors and DNA replication factors are also included within the definition of the term binding molecule. Finally, polypeptides, nucleic acids, and chemical compounds, such as selected from random and combinatorial libraries, also exhibit such selective binding activity for ligands, or as long as they can be made to do so. , Included within the definition of the term.
[0013]
As used herein, the term "polypeptide" when used in reference to a binding molecule or ligand is intended to indicate a peptide, polypeptide or protein of two or more amino acids. The term is also intended to indicate derivatives, analogs and functional mimetics thereof.
[0014]
The term "ligand" as used herein refers to a molecule that can be selectively bound by a binding molecule. A ligand can be essentially any type of molecule, for example, a polypeptide, nucleic acid, carbohydrate, lipid, or compound from any organism. The person skilled in the art knows what is meant by the meaning of the term ligand. Particular examples of ligands are the tumor antigens described herein, which are selectively bound by the human antibody binding molecules described in the Examples.
[0015]
The term “diverse population” as used herein is intended to indicate a group of two or more different molecules. Diverse populations of binding molecules can have similar biochemical functions, as long as the function or structure of the binding molecule is not identical. A diverse population can include, for example, a population of binding molecules that are antibodies that can recognize the same or different ligands. In addition, the same binding molecule may recognize two different ligands based on the different ligand conformations. In such cases, the binding molecules are considered distinct based on function, and thus multiple molecules of the same binding molecule make up one diverse population.
[0016]
As used herein, the term "selective" or "selectively" when referring to binding of a binding molecule to a ligand, or immobilization of a population to a solid support, wherein the interaction is not desired. , Or that it can be distinguished from non-specific interactions. Discrimination can be based on, for example, affinity or avidity, and thus can be derived from multiple low affinity interactions or a small number of high affinity interactions. For example, the interaction between the binding molecule and the ligand is typically about 10 ^-4 Greater than M, preferably about 10 ^-5 M and more preferably 10 ^-6 Greater than M. High affinity interactions are typically about 10 ^-8 From M to 10 ^-9 It is greater than or greater than M.
[0017]
As used herein, the term "immobilized" or grammatical equivalents thereof refers to attachment to a solid support, such as through association of a population of binding molecules. Immobilization may be by specific interaction of the binding molecule with an agent on a solid support. An agent can be, for example, a chemical moiety that allows for sufficient covalent or non-covalent interaction to retain a population of binding molecules on a solid support. Immobilization may also be through tethers or linkers. Such a linker can be a covalent linker, a hydrolysable linker, a photodegradable linker or other linker to which a binding molecule can be selectively attached. The linker can also be a polypeptide or other biomolecule linker, such as an antibody, a lipid attachment, streptavidin, a receptor, a fusion polypeptide, or any biomolecule that can tether a binding molecule to a solid support. In addition, domains of the polypeptide can be linkers as well. For example, a hydrophobic domain that can be directly absorbed by plastic due to a particular sequence, which is a molecular tag or a recognition sequence, can be a linker for attachment of the polypeptide.
[0018]
The term "solid support" as used herein refers to a solid medium that is sufficiently stable to allow immobilization of a population of binding molecules. Solid supports can include, for example, membranes such as nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, plastic, glass, polyacrylamide, or agarose. Solid supports can also be made of essentially any size or shape so long as they support the immobilization of a population of binding molecules. For example, the solid support can be a flat, flat surface, such as a natural or synthetic membrane filter or a glass slide. Alternatively, the solid support may be of various spherical shapes, including, for example, beads made of glass, polyacrylamide or agarose. Porous media can be used as a solid support as well, and such media are encompassed within the definition of terms used herein. In addition, any solid support can be modified to include, for example, chemical functional groups that can be used directly or indirectly for attachment of a binding molecule or linker.
[0019]
As used herein, the term “antibody” refers to a polypeptide that binds a ligand, and is intended to be used in accordance with its meaning in the art. The term immunoglobulin is likewise intended to fall within the meaning of the term antibody, as is known and used in the art. A polypeptide can be an entire antibody or any functional fragment thereof that binds a ligand. The meaning of the term is intended to cover some alterations and modifications of the antibody, as long as their function remains intact. Functional fragments, eg, Fab, F (ab) ₂ , Fv, single chain Fv (scFv) and the like are also included within the definition of the term antibody. Such functional fragments are well-known to those skilled in the art. Thus, the use of these terms to describe functional fragments of an antibody is intended to correspond to the definitions well known to those skilled in the art. Such terms are described, for example, in Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, RA (eds.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Bioscience, 93; Enzymol. 178: 497-515 (1989) and Day, E.C. D. , Advanced Immunochemistry, Second Edition, Wiley-Liss, Inc. , New York, NY (1990), which are incorporated herein by reference.
[0020]
As with the above terms used to describe antibodies and functional fragments thereof, the use of terms to refer to other antibody domains, functional fragments, regions, nucleotide and amino acid sequences, and polypeptides or peptides, as well It is intended to be within the meaning of each term known and used in the art. Such terms include, for example, “heavy chain polypeptide” or “heavy chain”, “light chain polypeptide” or “light chain”, “heavy chain variable region” (V _H ) And the “light chain variable region” (V _L ) As well as the term "complementarity determining region" (CDR).
[0021]
In the event that there is a definition of two or more terms used and / or accepted in the art, the definitions of the terms as used herein are inclusive of all such terms unless explicitly stated to the contrary. It is intended to include the meaning of A specific example is the use of the term "CDR", which describes non-contiguous antigen combining sites found within the variable regions of both heavy and light chain polypeptides. This particular area is described by Kabat et al., US Department of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983), and by Chothia et al., J. Am. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), and also by MacCallum et al. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), which are incorporated herein by reference, where this definition includes overlaps or subsets of amino acid residues when compared to each other. Nevertheless, the application of any definition referring to the CDRs of an antibody or a variant thereof is intended to be within the scope of the terms defined and used herein. Suitable amino acid residues, including the CDRs defined in each of the references cited above, are shown in Table 1 below for comparison. The exact number of residues encompassing a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Given the variable region amino acid sequence of an antibody, one of ordinary skill in the art can routinely determine which residues comprise a particular CDR.
[0022]
(Table 1: Definition of CDR)
[0023]
[Table 1]

[0024]
¹ Residue numbering follows the nomenclature of Kabat et al., Supra.
² Residue numbering follows the nomenclature of Chotia et al., Supra.
³ Residue numbering follows the nomenclature of MacCallum et al., Supra.
[0025]
As used herein, the term “tumor antigen” refers to a molecule that can be used as a marker to distinguish or distinguish tumor cells from normal cells. Such a discriminating marker may be manifest itself in various ways, such as by preferential expression or unique or subcellular localization on the tumor cells. The tumor cells that such antigens preferentially mark can be any cells that undergo abnormally frequent cell growth or uncontrolled survival. Such cells may be neoplastic cells, which may or may not be fully characterized and classified as tumor or cancer cells.
[0026]
The present invention provides a method for identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand. The method includes: a) selectively immobilizing a diverse population of binding molecules on a solid support; b) simultaneously contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more ligands. And c) determining at least one binding molecule that selectively binds to one or more of the ligands.
[0027]
The method of the present invention utilizes the selective immobilization of a binding molecule to a solid support and the screening of the immobilized binding molecule for selective binding interactions for two or more ligands of interest. Selective immobilization functions to increase the sensitivity of the measured binding interaction. This is because initially immobilizing a selected population of molecules on a solid support reduces non-specific binding interactions with irrelevant molecules or contaminants that may be present in the reaction. For example, the difficulty of measuring selective binding interactions increases with the complexity of the binding assay, as well as the number and diversity of different species present in the binding reaction. The method of the present invention avoids such difficulties. This is because selective immobilization of a population of binding molecules substantially reduces the number of unwanted binding interactions by removing extraneous molecules from within the reaction.
[0028]
Methods for generating and screening a population of binding molecules against one or more purified ligands or targets of interest exist in the art. However, when a population of binding molecules is screened against a population of ligands or complex compositions, such as cells or cell extracts, the identification of specific binding events is rare. The method of the present invention allows the binding molecule population to be efficiently screened against the ligand population for rapid identification of selective binding events. The method of the present invention provides improved sensitivity and specificity of detection by selectively immobilizing a population of binding molecules on a solid support.
[0029]
The methods of the invention are applicable to both large or small populations of binding molecules, which may be substantially purified or enriched, for example, by separation of the population by affinity techniques. Alternatively, such a diverse population can be a heterogeneous composition, such as, for example, contained in cells, cell extracts or in vitro derived compositions. Selective immobilization of such a population provides sufficient enrichment of the population such that it can be applied to screen two or more ligands of interest for selective binding affinity.
[0030]
The choice of the binding molecule population depends on the type of binding molecule desired, the need for the binding molecule and ultimately the intended use. For example, the population of binding molecules can be either as long as the population contains at least one binding molecule that exhibits selective binding affinity for the ligand or ligand composition of interest, or the population can selectively bind to the ligand of interest. It can be produced or derived from essentially any source, so long as it is sufficiently diverse that the population contains the at least one molecule indicated.
[0031]
At least two general approaches can be used to obtain a binding molecule population that meets the above criteria. One approach is to generate a population of binding molecules from molecules that are known to function as binding molecules or that are known or capable of exhibiting binding activity. Particular examples of molecules known to function as binding molecules or exhibit binding activity include antibodies or receptors for other immune repertoires. The normal function of such a molecule is to bind an essentially infinite number of different antigens and ligands. Thus, for example, generating a diverse population of binding molecules from an antibody repertoire allows one to identify binding molecules for essentially any desired ligand. Many other binding molecule populations also exist, and are described further below.
[0032]
The second approach is to generate a large population of unknown molecules. This population should be generated to include sequences or structures that are diverse enough to include molecules that bind to the ligand composition of interest. The advantage of this approach is that no prior knowledge of sequence, structure or function is required. Instead, what is needed is to generate a population of sufficient size and complexity so that the population has a high likelihood of exhibiting a specific binding interaction for the ligand complex. A specific example of such a population is a random library of peptides, nucleic acids and small molecules. There are many other types of "random" library molecule populations and are described further below.
[0033]
Prior knowledge of whether the population obtained by any of the above approaches contains at least one binding molecule that exhibits selective binding affinity for the ligand or composition of interest is not required. Instead, it is only necessary to generate a population sufficiently diverse for the intended need or purpose that it may contain a binding molecule for the ligand or ligand composition of interest. One skilled in the art will recognize what size and variety is necessary or sufficient for the intended purpose.
[0034]
As mentioned earlier, the choice of the type of binding molecule population to use depends on the specific needs of the selected binding molecule and the desired application. For example, if binding molecules with high affinity interactions are desired, the use of a population of antibody binding molecules may be preferred. Other binding polypeptides and receptors of the immunoglobulin superfamily of receptors can also be used. Alternatively, it may be desirable to use a population of random peptide or nucleic acid sequences, for example, if a binding molecule is desired for the receptor. Specific examples include, for example, the use of populations of random peptides to identify peptide binding molecules specific for cell surface receptors, and the identification of binding molecules with selective binding affinity for cytoplasmic receptors such as steroid receptors. And the use of random populations of nucleic acids for identifying binding molecules selective for nucleic acid binding polypeptides. One skilled in the art will recognize or be able to determine which type of approach and which type of binding molecule population is applicable for the intended purpose and desired need.
[0035]
The size and diversity of the binding molecule population used will depend, for example, on the ligand population or ligand composition for which a selective binding molecule is desired, as well as the number of desired selective binding molecules, the desired affinity range, and Depends on the time available to identify the appropriate binding molecule. For example, if the application of the method of the invention is for the identification of one or several binding molecules having selective affinity for a ligand, a limited number of binding molecules will be selectively immobilized on a solid support. May constitute the population to be done. Such a limited number of binding molecules can be as small as about 2 to 10, but typically contain 10 molecules.
[0036]
As the desired number of binding molecules to be identified increases, the size and diversity of this population also increases. Similarly, as the range of desired affinities and the speed of identification of binding molecules having selective affinity for the ligand increase, the size and diversity of this population of binding molecules also increases. In addition, the size of the population of binding molecules also increases as the number or complexity of ligands in the ligand population for which selective binding molecules are desired. Thus, as each of these factors increases, the size and diversity of the binding molecule population may increase as well.
[0037]
The medium sized population consists of hundreds and thousands of different binding molecules within this population, while the large sized population of binding molecules consists of tens of thousands to millions of different binding molecule species. More specifically, for the identification of binding molecules, a large and diverse population of binding molecules is about 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 ⁷ , 10 ⁸ , 10 ⁹ , 10 ¹⁰ , Or more different binding species. One of skill in the art will recognize the approximate diversity of a population of binding molecules sufficient to identify the desired number of binding molecules.
[0038]
Recombinant libraries of binding molecules are particularly advantageous for the methods of the present invention, as large and diverse populations can be rapidly generated and screened with more than one ligand of interest. The binding molecule population can be used directly from, for example, cell extracts of a library population. The methods used to selectively immobilize this population of binding molecules are discussed further below. Furthermore, recombinant libraries of expressed polypeptides or nucleic acid products can be manipulated in a number of different ways, thereby facilitating or otherwise selectively immobilizing a population of binding molecules on a solid support. As they act directly, they apply to the method of the invention. Recombinant library methods also allow the generation of a large population of binding molecules from a naturally occurring repertoire that inherently includes features for the selective immobilization of this population on a solid support. Nevertheless, essentially any source of the population of binding molecules, whether recombinant or otherwise, has sufficient size and diversity of different binding molecules appropriate for the intended purpose for which the source is intended. As provided, and as long as the population of binding molecules can be selectively immobilized on a solid support.
[0039]
Accordingly, the invention provides a method of identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand, wherein the population of binding molecules is produced by a recombinant library. Populations of binding molecules other than recombinant libraries also exist and can be used as well for screening and identification of binding molecules with selective affinity for the ligand.
[0040]
A particular example of a recombinant library as a source of a binding molecule population is a phage expression library in which lysogenic phage causes the release of a bacterially expressed binding molecule polypeptide. In another type of phage expression library, many potential binding molecules can be expressed as fusion polypeptides on the periplasmic surface of bacterial cells. In both of these examples, the expressed polypeptide is available for immobilization on a solid support. Libraries of yeast and higher eukaryotic cells also exist and are equally applicable to the methods of the present invention. One skilled in the art will recognize or be able to determine which type of library is applicable for a particular purpose.
[0041]
The invention also provides a method of identifying a binding molecule that is selective for a ligand, wherein the binding molecule is identified from a population of antibodies.
[0042]
As previously mentioned, there are at least some approaches to obtaining a starting population of binding molecules for use in identifying molecules with selective binding affinity for the ligand. One approach is to use a population of binding molecules that usually display a binding function. Antibody binding molecules are amenable to such an approach because they function inherently as binding molecules and can be produced by biological and recombinant methods that exhibit binding specificity to essentially any antigen. Thus, the population of binding molecules of the invention can be an antibody or a functional fragment thereof.
[0043]
The population of antibody binding molecules can be produced by various methods known to those skilled in the art. For example, a population of antibody binding molecules can be produced from hybridoma technology, and a population of monoclonal antibodies can be used in the methods of the invention, for example, to identify monoclonal antibody binding molecules that have a selective affinity for a ligand. . Alternatively, a large population of antibody binding molecules can be expressed, for example, by various recombinant methods known in the art.
[0044]
The polymerase chain reaction and other related methods known to those skilled in the art amplify essentially all antibody repertoires of a particular organism, and as recombinant populations, the antibody heavy and light chains or their functional chains. Methods exist in the art to express various combinations of various fragments. Organisms from which the antibody repertoire can be derived include, for example, humans, mice, humans, rabbits, goats, chickens, or any organism capable of producing antibodies. Functional fragments include, for example, Fab, Fv, and CDR regions of an antibody molecule. The antibody or a functional fragment thereof can then be screened by selective immobilization on a solid support. In the examples described herein, a human Fab fragment expression library was used to screen for binding molecules with selective affinity for tumor antigens.
[0045]
In addition to the antibody repertoire as a starting source for a population of binding molecules with intrinsic binding capacity, the population of binding molecules may also be derived from other molecules of the immune system with known or intrinsic binding ability. For example, the binding molecule can be a T cell receptor (TCR). The T cell receptor contains two subunits, α and β, that are similar in structure and function to antibody variable region sequences. In this regard, both subunits contain a variable region that encodes a CDR region similar to the CDR regions found in antibodies (Immunology, Third Edition, Kuby, J (eds.), New York, WH Freeman & Co. (1997), which is incorporated herein by reference). CDRs containing the variable region of the TCR bind to antigens presented on the cell surface of antigen presenting cells and may exhibit binding specificity to essentially any particular antigen. With an antibody repertoire, there is sufficient TCR sequence information known to allow amplification and recombination of essentially the entire TCR repertoire. Thus, TCRs are amenable to the methods of the present invention because they function naturally as binding molecules and can be produced by biological and recombinant methods that exhibit binding specificity to essentially any antigen.
[0046]
Other exemplary binding molecules of the immune system that exhibit known or unique binding functions include the major histocompatibility complex (MHC), CD4 and CD8 receptors. MHC functions in mediating the interaction between antigen presenting cells and effector T cells. CD4 and CD8 receptors function in the binding interaction between effector T cells and antigen presenting cells. CD4 and CD8 have the additional advantage that they represent a similar CDR region structure, as antibody and TCR sequences do.
[0047]
Other binding molecules that exhibit a known or unique binding function that are amenable to use as a starting population in the methods of the invention include various receptors, such as cell surface receptors, cytoplasmic receptors, and nuclear receptors. Specific examples of each of these classes of binding molecules are provided below. Binding molecules other than those discussed below also exist and can be used in the methods of the invention. Such other molecules are known or can be determined by one of skill in the art using the teachings provided herein.
[0048]
For example, integrins are cell surface receptors involved in various physiological processes such as cell attachment, cell migration, and cell proliferation. Integrins mediate both cell-cell and cell-extracellular matrix attachment phenomena. Structurally, integrins consist of heterodimeric polypeptides in which a single α-chain polypeptide binds non-covalently to a single β-chain. Generally, different binding specificities derive from unique combinations of different α and β chain polypeptides. For example, vitronectin binding integrin is α _v Contains an integrin subunit, α _v β ₃ , Α _v β ₁ , And α _v β ₅ (All of which exhibit different ligand binding specificities).
[0049]
The binding molecule population can also be generated from other cell surface receptors. These other cell surface receptors include growth factor or hormone receptors for the ligand, such as platelet-derived growth factor, epidermal growth factor, insulin, insulin-like growth factor, hepatocyte growth factor, and other growth factors and hormones It is. In addition, cell surface receptors include those for cytokine receptors such as interleukins and interferons.
[0050]
Cytoplasmic receptors can further be used as a population of binding molecules for use in the methods of the invention. Cytoplasmic receptors include, for example, steroid hormone receptors such as thyroid hormone receptor, retinoic acid receptor, glucocorticoid receptor, estrogen receptor and the like. Furthermore, a population of binding molecules can be produced from DNA or other nucleic acid binding polypeptides that exhibit a known or unique binding function in processes such as replication, transcription, processing, or translation.
[0051]
As previously mentioned, this population of binding molecules may also be derived from a random library of unknown sequence or structure. This approach is sufficient to produce a large and diverse library in which one or more sequences within this population of binding molecules has the potential to exhibit selective binding affinity for the ligand of interest. All that is required to carry out the method of the invention using such a population is that it is possible to selectively immobilize a random population of binding molecules on a solid support. A method for selectively immobilizing essentially any population of binding molecules to a solid support is described below. In addition, it will be apparent to one skilled in the art how to apply other methods to selectively immobilize a population of binding molecules to a solid support using the teachings described herein.
[0052]
Finally, the binding molecule can also be a synthetic compound produced, for example, by combinatorial chemistry methods known to those skilled in the art. Such combinatorial chemistry libraries can be selectively immobilized on a solid support and then screened for identification of molecules with selective binding affinity for the ligand. In addition, large populations of other compounds, such as natural or synthetic compound libraries, are also equally applicable as binding molecule populations, as long as they can be selectively immobilized on a solid support.
[0053]
The present invention provides methods for identifying binding molecules that exhibit selective affinity for a ligand from a diverse population of binding molecules. The binding molecule is identified by contacting a diverse population of immobilized binding molecules simultaneously with two or more ligands.
[0054]
The method of the present invention allows for the simultaneous screening of two or more ligands of interest. Binding molecules that exhibit selective affinity can be obtained for one or more ligands of interest. The population of ligands is selected according to the need and intended use of the binding molecule, and the characteristics of the ligand or ligand composition. For example, using the methods of the invention to selectively immobilize a population of binding molecules, selective binding agents can be used for ligands as complex as tumor cells or specific tissue types, as well as for It can be identified for a single ligand population of one or more different species. An advantage of this method is that a relatively crude source of the ligand population can be used, which facilitates the use of whole tissues, tumor cells, and cell lysates as the ligand source. In addition, ligands that are not well characterized biochemically can be further used in the methods of the invention.
[0055]
Where the population of ligands is a composite composition such as a tissue, cell, cell lysate, and cell or subcellular compartment, the individual molecules comprising each of these composite compositions are comprised of the ligand population. It is. Thus, by selecting a complex composition, such as a cell or cell lysate, for example, the ligand population can be used to screen two or more of the binding molecules immobilized on a solid support. Includes a unique ligand. Identifying a binding molecule selective for at least one ligand in the population produces a binding molecule selective for the complex composition itself. Thus, the methods of the invention can be applied to the effective identification of binding molecules against tumor cells or other cytopathologies, for example, for selective targeting of therapeutic agents. The methods of the present invention can be similarly applied, for example, to the identification of binding molecules to normal or diseased tissues for selective targeting of diagnostic agents, such as imaging agents.
[0056]
To identify a binding polypeptide with a selective binding affinity for this ligand, it is necessary to selectively immobilize the population of binding molecules and then contact the binding molecule with two or more ligands. is there. As described further below, successful binding of a binding molecule within the population indicates selective binding to at least one ligand within the population. Selectivity can be further confirmed, for example, by comparing the binding affinity of the positive binding agent to a non-specific ligand or control ligand population. If desired, such a comparison can be performed as a control during initial identification of the binding molecule, such as identification using normal and tumor cells as a control and each of the ligand populations. Instead, such comparisons can be subsequently performed using either the initial ligand population or a more purified form of either the binding molecule or the ligand of interest.
[0057]
Accordingly, the present invention provides a method for identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand. Here, the ligand is a tissue or tumor antigen. The invention also provides a method for identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand. Here, the ligand is a polypeptide or other macromolecule in a cell lysate.
[0058]
In addition to the ligand population from a crude cell preparation or other complex composition, the ligand population can also be from a single population of substantially purified molecules. For example, if it is desired to generate a binding molecule that is selective for any one member of a member's ligand population, each individual member can be combined into a single population and the methods of the invention can be used. And can be screened simultaneously. The molecule can be substantially purified, or can include varying amounts of other unrelated species. Furthermore, in such cases (where the binding molecule is desired to be selective for one or a few members of the population), the individual ligand species may be recombined by recombinant or other biological synthesis mechanisms. If so, the cells can be engineered to express the ligand. The ligand can then be screened in the crude cell extract to identify binding molecules that are selective for at least one ligand in the population. Such cells can be individually manipulated to synthesize each ligand, and the cell extracts can then be pooled for screening. Alternatively, cells can be engineered to express multiple ligands as needed for one or several cell extracts to be combined and screened.
[0059]
The population of ligands may be composed of either differently sized substantially purified molecules or crude cell preparations, or other complex compositions. In general, a single population of ligands will include at least two different ligand species and may be comprised of any of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 different ligands. Moderate ligand populations contain between about 10 and hundreds of different ligand species. Complex ligand populations include, for example, about tens of thousands of different ligand species, including different numbers of molecules in cells. This number is generally about 10 ⁵ It is considered to be. In addition, 10 ⁶ , 10 ⁷ , 10 ⁸ And 10 ¹⁰ Recombinant and combinatorial libraries that can be composed of the same size ligand population as the different species can be screened. Each of these population sizes can be used as a ligand population to identify binding molecules with selective binding affinity. The choice of population size and type will depend on the needs and intended use of the binding molecule. Those skilled in the art will recognize which size and type of population is appropriate for a particular need.
[0060]
As mentioned above, the ligand comprising the above-described assembly can be essentially any type of molecule, such as a polypeptide, nucleic acid, carbohydrate, lipid or other organic compound. Thus, it is understood that the molecules discussed above as binding molecules may also be ligands. For example, individual or groups of cell surface receptors (eg, integrins, growth factor receptors or cytokine receptors) can be used as random peptide libraries or combinatorial chemical libraries to identify binding molecules that can be used as agonists or antagonists of these receptors. It can be used as a ligand screening rally.
[0061]
To screen for binding molecules that bind to the ligand or ligands, the ligands themselves are detected by a suitable detection method. The detection method can be direct or indirect, and can include, for example, light emission, radioisotope, chromogenic detection, or any method capable of detecting a ligand. Direct detection involves metabolic labeling in appropriate cells or radiolabeling of ligands using in vitro labeling using in vitro coupled transcription-translation with appropriate radioactive amino acids, emission using appropriate enzymes (eg, kinases). Methods may include such methods as covalent modification with an active substrate, or chemical modification using a radioisotope (eg, iodination). Direct methods may also involve the fusion of a suitable detection molecule to the ligand. For example, the ligand can be fused to luciferase and detected with light emission, or fused to lacZ and detected by appropriate colorimetric detection. If it is desired that the population of ligands have a biologically derived detection moiety, a library containing the ligands fused to a detectable molecule such as luciferase and lacZ can be used to screen for binding molecules. Can be done. Direct detection of the ligand can also be accomplished by covalent modification of the ligand by incorporation of a detectable chemical moiety. For example, biotin can be covalently linked to a ligand and subsequently detected with streptavidin using one of the detection methods discussed above.
[0062]
For indirect detection of a ligand, molecules that do not covalently bind to the ligand can be used for detection. Molecules known to interact with the ligand are used for such indirect detection methods. For example, known molecules (eg, antibodies) that can specifically detect the ligand can be used. The known molecule is either detected itself by one of the above methods for direct detection of the ligand, or by a secondary molecule specific for the first known molecule. For example, an antibody specific for a ligand can be detected again using the detection methods described above for direct detection, and using a secondary antibody that can interact with a first antibody specific for the ligand.
[0063]
In one embodiment, the ligand is derived from the cell surface of a tumor cell. Cell surface molecules can be labeled, for example, with a detectable moiety (radioisotope or biotin). This labeling provides a source of ligand, where the only feature that needs to be known is that it is on the cell surface. As described in the Examples, tumor antigen ligands are prepared by labeling breast cancer cell surface polypeptides with biotin and identify Fab fragment binding molecules that are selective for tumor cell surface polypeptides. Used for Ligand populations from other cells or subcellular compartments can likewise be used in the methods of the invention to obtain binding molecules that exhibit a selective affinity for at least one ligand within the initial population. Thus, the methods of the invention can be applied to a wide variety of ligand populations, where selective binding affinity is required for therapeutic treatment or diagnosis of disease.
[0064]
The method of the invention comprises the step of selectively immobilizing a diverse population of binding molecules on a solid support. With respect to selective immobilization, the unique characteristics of the binding molecules that make up this population may be used to provide selective binding, or the particular molecule in which the molecules are used for selective immobilization. It is either manipulated to include the feature. For example, the binding molecule itself may comprise a hydrophobic chemical group or domain that causes the immobilization of the binding molecule to a hydrophobic solid (eg, plastic), or the immobilization of the binding molecule to a hydrophobic solid (eg, plastic). It can be fused to a hydrophobic chemical group or domain that causes it. In another example, the solid support can be coated with a chemical moiety or biomolecule that binds only to the binding molecules that make up the binding molecule population and can selectively immobilize it. For example, the solid support can be coated with a biomolecule that selectively binds to a domain or sequence common to the binding molecule. The use of biomolecules such as linkers or tethers should be chosen so that they do not interfere with ligand binding to the binding molecule. For example, antibodies to the constant portion of the antibody can be used to selectively immobilize antibody binding molecules. Such an approach is used to immobilize human Fab fragments using anti-human kappa antibodies as described in the examples. Alternatively, an antibody specific for a peptide tag functions similarly to selectively immobilize a population of binding molecules on a solid support.
[0065]
One advantage of selective immobilization is that it provides increased sensitivity and reduced non-specific binding for detecting specific binding molecules of interest. A solid support may, for example, immobilize a high concentration of the binding molecule. Such high concentrations of binding molecules may contribute to detecting low affinity interactions with the ligand and increasing the ability to detect the ligand at low concentrations. Basically, any solid support is acceptable for use in the method of the present invention. The support should be chosen to meet the particular needs and to exhibit the ability to immobilize all or a statistically representative number of binding molecules in the population. Further, solid supports can be made from porous materials that can achieve higher densities of immobilized binding molecules.
[0066]
The solid support may also be selected to increase the desired screening operability while maintaining the ability to retain the binding molecule population. Such manipulations can be important for removing unbound ligand populations and for washing to remove non-specific interactions. Ease of operation can be an advantage when performing high throughput screening of large numbers of binding molecules.
[0067]
To carry out the method of the invention, once the population of binding molecules has been immobilized on a solid support, the immobilized population is simultaneously contacted with two or more populations of ligands. The ligand population is incubated with the selectively immobilized binding molecule under appropriate conditions for a suitable period of time to bind the ligand to the binding molecule. Binding molecules having a selective affinity are identified by measuring the binding of at least one ligand in the population to at least one binding molecule. One skilled in the art is aware of the appropriate conditions to detect selective binding of the binding molecule to the ligand (thus allowing for the identification of a binding molecule having selective affinity for the ligand), and Conditions sufficient to allow interaction between the molecule and the ligand can be readily determined.
[0068]
Further, the invention provides a method for determining the sequence of an identified binding molecule. For example, if the binding molecule is produced in an expression library, the encoding nucleic acid can be isolated from a selected clone expressing the binding molecule identified in the screen. The encoding nucleic acid can then be sequenced using methods known to those skilled in the art.
[0069]
Further, the present invention provides a method for characterizing a ligand that is selectively bound by a binding molecule. Once a binding molecule that is selective for a ligand is identified, the ligand can be isolated and characterized, for example, by affinity methods known to those of skill in the art. This characterization can be beneficial if the ligand used in the screen is not well characterized. Ligand characterization involves techniques such as measuring apparent molecular weight by gel electrophoresis. Other methods that can be applied to characterize the ligand include, for example, high performance liquid chromatography (HPLC), mass spectrometry, or other methods that provide information about the physical, biochemical or functional properties of the ligand. Including. Those skilled in the art are aware of suitable methods for such characterization of the ligand.
[0070]
The invention further provides a method for identifying an antibody having a selective affinity for a tumor antigen. The method comprises the steps of: a) selectively immobilizing a diverse population of antibodies on a solid support; b) combining the diverse population immobilized on a solid support with two or more tumor antigens. Contacting simultaneously; and c) determining at least one antibody that selectively binds to one or more tumor antigens.
[0071]
The methods of the invention can be practiced using antibodies and tumor cells, respectively, as binding molecules and ligand populations. A population of antibody binding molecules can be generated, for example, in an expression library. Labeling of cell surface molecules on tumor cells provides a population of detectable tumor antigen ligands.
[0072]
Using the methods of the invention, the antibody binding molecule can be solid-supported, for example, by using an antibody specific for the constant portion of the antibody binding molecule, or an antibody specific for a particular isoform or antibody subunit. It is selectively immobilized on the body. For example, anti-κ chain antibodies can be used to immobilize intact antibodies and Fab fragments on a solid support.
[0073]
The antibody binding molecule immobilized on the solid support can be incubated with the tumor antigen under appropriate conditions to bind the tumor antigen to the antibody binding molecule. The antigen may be applied as whole cells, cell extracts, or as specific cell fractions. After an appropriate period of time, unbound tumor antigen is removed from the solid support and selective binding is detected as previously described. One of skill in the art is aware of which conditions allow binding of the tumor cell ligand to the antibody and that there are sufficient interactions to allow the identification of the antibody specific for the tumor antigen. Conditions can be easily determined. Tumor antigens are detected to determine one or more antibody binding molecules that specifically interact with the tumor antigen. The selectivity of an antibody binding molecule for a tumor antigen can be determined relative to normal cells used as a control. Thus, the methods of the present invention provide a means for identifying tumor antigen-specific antibody binding molecules that can be used for diagnostic or therapeutic purposes.
[0074]
A number of antibody binding molecules selective for tumor-specific ligands have been identified by the methods of the present invention. These antibody binding molecules are described below in the Examples. In addition, nucleotide sequences have been determined for the CDR regions of these tumor-selective antibody binding molecules. Such encoding nucleic acids are also described below in the Examples. Accordingly, the present invention provides a method for identifying a population of human antibodies or functional fragments thereof.
[0075]
Also provided herein are isolated binding polypeptides that are selective for a tumor antigen. The isolated binding polypeptide is an antibody fragment selected from the group of antibody fragments, which comprises F3, F13, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F30, F31, F32, F33. , F34, F35, F36, F37, F38, F40, F41, F42, F46, F49, F50, F52, F54, F55, F58, F63, F66, F67, F68, F69, F70, F72, F74, F76, F78 , F79, F80, F81, F84, F85, F86, F93, F99, F104, F111, F112, F118, F126, F129, F130, F132, F133, F134, F135, F136, F138, F151, F158, F160, F174 , F176, F177, F184, 186, F191, F197, F200, F202, F203, F207, F208, F212, F214, F217, F224, F231, F236, F238, consisting TA50 and TA73. An isolated binding polypeptide selective for such a tumor antigen can be, for example, an F3, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F133, TA50 or TA73 antibody fragment.
[0076]
A particularly useful isolated binding polypeptide that is selective for a tumor antigen can be an antibody fragment having an amino acid sequence that includes three specific light chain CDR sequences and three specific heavy chain CDR sequences. Isolated antibody fragments selective for tumor antigens include, for example, three light chain CDR sequences found in F3 (SEQ ID NOs: 6, 28, and 50) and three heavy chain CDR sequences (SEQ ID NO: 72, 94 and 116) or may have an amino acid sequence in which one or more of these CDRs are replaced by substantially similar or unrelated CDRs. From the above description, one of skill in the art will appreciate that the isolated antibody fragment of the present invention may have any sub-combination of the six F3 CDRs (any two, three, four or five F3 CDRs), or It is understood that one may have one F3 CDR. The isolated antibody fragments selective for tumor antigens also include three light chain CDR sequences found in F14 (SEQ ID NOs: 8, 30, and 52) and three heavy chain CDR sequences (SEQ ID NOs: 74, 96 and 118), or may have an amino acid sequence in which one or more of these CDRs are replaced by substantially similar or unrelated CDRs. From the above description, one skilled in the art will recognize that an isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F14 CDRs (2, 3, 4, or 5 F14 CDRs), or It is understood that one may have a F14 CDR of
[0077]
In another embodiment, the isolated antibody fragments selective for a tumor antigen are the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 32, and SEQ ID NO: 54 found in F15, and in F15. May have the amino acid sequence found, including the three heavy chain CDR sequences of SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 98 and SEQ ID NO: 120, or one or more of these CDRs are substantially similar or related May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, one skilled in the art will appreciate that an isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F15 CDRs (eg, any two, three, four, or five F15 CDRs). , Or one F15 CDR. In another embodiment, the isolated antibody fragment selective for a tumor antigen is the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 56, found in F19, and in F19. May have the amino acid sequence comprising the three heavy chain CDR sequences found, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 100 and SEQ ID NO: 122, or one or more of these CDRs are substantially similar or related May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, those skilled in the art will appreciate that an isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F19 CDRs (eg, any two, three, four, or five F19 CDRs). , Or one F19 CDR.
[0078]
In another embodiment, the isolated antibody fragments selective for a tumor antigen are the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 36, and SEQ ID NO: 58, found in F21, and in F21. May have the amino acid sequence found, including the three heavy chain CDR sequences of SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 102 and SEQ ID NO: 124, or one or more of these CDRs are substantially similar or related May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, one of skill in the art will appreciate that the isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F21 CDRs (eg, any two, three, four, or five F21 CDRs). , Or one F21 CDR. In another embodiment, the isolated antibody fragments selective for a tumor antigen are the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 38, and SEQ ID NO: 60, found in F22, and in F22. May have the amino acid sequence found, including the three heavy chain CDR sequences of SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 104 and SEQ ID NO: 126, or one or more of these CDRs are substantially similar or related May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, one of skill in the art will appreciate that the isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F22 CDRs (eg, any two, three, four, or five F22 CDRs). , Or one F22 CDR.
[0079]
In another embodiment, the isolated antibody fragment selective for a tumor antigen is the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 40, and SEQ ID NO: 62, found in F23, and in F23. May have the amino acid sequence comprising the three heavy chain CDR sequences found, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 106 and SEQ ID NO: 128, or one or more of these CDRs are substantially similar or related. May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, one of skill in the art will appreciate that an isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F23 CDRs (eg, any two, three, four, or five F23 CDRs). , Or one F23 CDR. In another embodiment, the isolated antibody fragments selective for a tumor antigen are the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 42, and SEQ ID NO: 64, found at F26, and at F26. May have the amino acid sequence comprising the three heavy chain CDR sequences found, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 108 and SEQ ID NO: 130, or one or more of these CDRs are substantially similar or related. May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, one of skill in the art will recognize that the isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F26 CDRs (eg, any two, three, four, or five F26 CDRs). , Or one F26 CDR.
[0080]
In another embodiment, the isolated antibody fragment selective for a tumor antigen is the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 44, and SEQ ID NO: 66 found in F133, and in F133. May have the amino acid sequence comprising the three heavy chain CDR sequences found, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 110 and SEQ ID NO: 132, or one or more of these CDRs are substantially similar or related May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, those skilled in the art will appreciate that an isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six F133 CDRs (eg, any two, three, four, or five F133 CDRs). , Or one F133 CDR.
[0081]
In another embodiment, the isolated antibody fragment selective for a tumor antigen is the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 46, and SEQ ID NO: 68 found in TA50, and in TA50. May have the amino acid sequence found, including the three heavy chain CDR sequences of SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 112 and SEQ ID NO: 134, or one or more of these CDRs are substantially similar or related May have an amino acid sequence that is replaced by a CDR that does not. From the above description, one of skill in the art will appreciate that the isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six TA50 CDRs (eg, any two, three, four, or five TA50 CDRs). , Or one TA50 CDR.
[0082]
In yet another embodiment, the isolated antibody fragment selective for a tumor antigen is the three light chain CDR sequences of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 48, and SEQ ID NO: 70 found in TA73, and TA73 May have the amino acid sequence comprising the three heavy chain CDR sequences of SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 136, or one or more of these CDRs are substantially similar, or It may have an amino acid sequence that is replaced by an unrelated CDR. From the above description, one of skill in the art will appreciate that an isolated antibody fragment of the present invention may have any subcombination of the six TA73 CDRs (eg, any two, three, four, or five TA73 CDRs). , Or one TA73 CDR.
[0083]
Further provided are CDRs or functional fragments thereof of antibodies selective for tumor antigens. Here, the CDRs are F3, F13, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F30, F31, F32, F33, F34, F35, F36, F37, F38, F40, F41, F42, F46, F49, F50, F52, F54, F55, F58, F63, F66, F67, F68, F69, F70, F72, F74, F76, F78, F79, F80, F81, F84, F85, F86, F93, F99, F104, F111, F112, F118, F126, F129, F130, F132, F133, F134, F135, F136, F138, F151, F158, F160, F174, F176, F177, F184, F186, F191, F197, F200, F202, F203, F207, F208, 212, F214, F217, F224, F231, F236, F238, derived from an antibody fragment selected from the group consisting of TA50 and TA73. Such CDRs may have, for example, a substantially similar or identical amino acid sequence to the CDR-encoding portion of the amino acid sequence encoding one of these antibody fragments.
[0084]
The present invention also provides an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody fragment of the present invention. Such nucleic acid molecules include SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, Sequence No. 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, Sequence No. 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122 , SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, or SEQ ID NO: 136.
[0085]
Nucleic acid molecules encoding antibody fragments include, for example, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, Sequence No. 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, or SEQ ID NO: 135.
[0086]
In one embodiment, the CDR of an antibody or a functional fragment thereof selective for a tumor antigen is derived from an F3, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F133, TA50 or TA73 antibody fragment. obtain. Such CDRs include SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, The amino acid sequence may be substantially referred to as SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, or SEQ ID NO: 136.
[0087]
The present invention also provides an isolated nucleic acid molecule encoding a CDR of the present invention. Such nucleic acid molecules include SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, Sequence No. 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, Sequence No. 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122 , SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, or SEQ ID NO: 136.
[0088]
Nucleic acid molecules encoding CDRs include, for example, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, Sequence No. 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 , SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, or SEQ ID NO: 135.
[0089]
It is understood that changes that do not substantially affect the activity of the various embodiments of the present invention are also included within the definitions of the invention provided herein. Accordingly, the following examples are intended to illustrate but not limit the invention.
[0090]
(Example I)
(Preparation of solid support for selectively immobilizing a population of human Fab fragments)
This example describes a method of preparing a filter for the selective immobilization of a population of binding molecules.
[0091]
The population of binding molecules that were selectively immobilized in this example were recombinantly expressed human Fab fragments. In this case, the binding conditions for the human Fab fragment were determined using a human BR96 Fab fragment, a chimeric antibody reactive to tumor-associated cell surface antigens. The BR96 antibody is reactive against a Lewis Y-related carbohydrate (LeY antigen) that associates predominantly with lamp-1, an integral membrane protein normally localized in the lysosome. The population of human Fab fragments was immobilized on a solid support by coating a nitrocellulose filter with an anti-human κ antibody. Anti-human kappa antibody was used as an agent for binding to the filter. This is because the antibody is specific for the population of antibodies. Thus, the antibody can be used to selectively immobilize or “capture” the population on a filter.
[0092]
Initially, conditions were determined to optimize the amount of antibody that could be selectively immobilized on the nitrocellulose filter. Various anti-human immunoglobulin reagents were tested as reagents for the selective immobilization of human Fab fragments. Virtually all of the tested anti-human immunoglobulin reagents showed an enhanced signal compared to untreated nitrocellulose filters. It was determined that the affinity-purified polyclonal goat anti-human κ antibody was the most efficient in the selective immobilization of the BR96 Fab fragment. The non-specific signal generated by this approach was determined by overlaying the filter on both the phage uninfected region and phage plaques expressing unrelated antibodies. The background of this assay was low, and no differences were observed in the signals generated by any of these controls.
[0093]
For selective solidification, polyclonal anti-human κ antibody was used to determine the concentration of anti-human κ antibody for maximum binding of the BR96 Fab fragment. Briefly, dissolved 0.7% agar containing 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and supE amber suppressor strain XL1-Blue (Stratagene, San Diego, Calif.) Were packed with a solidified bottom. And 1.5% agar Luria Broth's medium, and incubated at 37 ° C. for 3 hours. Aliquots of 3 μl phage stock (approximately 10 ¹² (Phage / ml) was spotted directly on the bacterial lawn and allowed to soak in the agar at 25 ° C for 15 minutes. The plates were then transferred to 37 ° C for 3-4 hours when large plaques were visible. 1cm on plaque ² Of nitrocellulose filters. Remove the filter and add 1.5 mM KH ₂ PO ₄ , 8 mM Na ₂ HPO ₄ Rinse four times with 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.5 (PBS). To detect selective immobilization of functional BR96 Fab, filters were filtered with 0.772 μg / ml horseradish peroxidase-conjugated Lewis Y antigen, 5% nonfat dry milk, 0.2% Tween 20, 0.01% defoamed. Agent A Emulsion and 0.01% thimerosal in PBS and incubated for 2 hours at 4 ° C. The filter was washed 5 times with PBS and washed with 50 mM citric acid, 100 mM Na containing 1 mg / ml o-phenylenediamine dihydrochloride and 0.003% hydrogen peroxide. ₂ HPO ₄ , PH5. The reaction is ₂ SO ₄ Was stopped by adding a final concentration of 0.36 M, an aliquot was removed and the OD ₄₉₀ Was measured with a spectrometer.
[0094]
As shown in FIG. 1A, increasing concentrations of anti-human κ antibody up to about 10 μg / ml retained larger amounts of the BR96 Fab fragment. Filters coated with anti-human kappa antibodies above 10 μg / ml produced enhanced but suboptimal signals. On the other hand, coating with less than 1 μg / ml antibody did not clearly amplify the signal. Untreated filters and filters coated with low concentrations (less than 0.2 μg / ml) of anti-human κ antibody show assay signal (A ₄₉₀ = About 0.05). Therefore, based on the signal obtained from a filter coated with 10 μg / ml anti-human κ antibody (A ₄₉₀ = About 0.45), the selective immobilized filter lift technique amplified the signal by at least 9-fold.
[0095]
The amount of functional antibody Fab fragment expressed and selectively immobilized by the coated filter was evaluated at 25 ° C. at various times from 0 to 8 hours. As shown in FIG. 1B, the signal increased from 0 to 4 hours. At 4 hours, additional transfer times did not apparently increase the signal.
[0096]
Based on these results, the nitrocellulose filters were incubated for 3 hours in a solution containing 10 μg / ml goat anti-human κ antibody in PBS. To block unreacted sites on the nitrocellulose, the nitrocellulose filters were incubated in a solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 2 hours.
[0097]
Filters prepared in this way were used in the following studies.
[0098]
(Example II)
(Immobilization of the human Fab fragment on a solid support enhanced the sensitivity of detection of the human Fab fragment)
This example demonstrates that immobilization of a binding molecule population increases the sensitivity of detecting a specific binding event.
[0099]
A phage library expressing a BR96-reactive Fab (240H2) was prepared from E. coli. E. coli bacteria were plated and grown at 37 ° C. for 8 hours. A control filter lift was created by applying a nitrocellulose filter to the bacterial layer and incubating at 22 ° C. for 4 hours. These control nitrocellulose filters were removed. Thus, the control filter lift did not selectively immobilize binding molecules expressed in phage plaques, but instead replaced all secreted polypeptides, including binding molecules, and all polypeptides released by lysis. Immobilize directly. To selectively immobilize the human Fab fragment, a nitrocellulose filter coated with goat anti-human κ antibody, as prepared in Example I, was applied to the bacterial lawn, Incubated for 4 hours at ° C. These selectively immobilized filter lifts were removed. The next step was performed in parallel using a control filter lift and a selective immobilized filter lift. Filter lifts were blocked in 1% BSA and incubated in horseradish peroxidase-conjugated BR96 antigen (LeY antigen). The filters were developed by enhanced chemiluminescence (ECL) using the procedure described by the manufacturer (Amersham; Arlington Heights IL) and exposed to the film for 30 seconds. The results did not depend on the order of the filters applied to the bacterial lawn.
[0100]
As shown in FIG. 2, the human Fab fragment was easily detected on the selectively immobilized filter lift (referred to as the capture lift in FIG. 2), while the control filter lift (referred to as the normal lift in FIG. 2) was Had very low levels of detectable human Fab fragments. The selective immobilized filter lift had a much stronger signal for the human antibody recognizing the tumor antigen BR96 compared to the control filter lift (the nitrocellulose filter was applied directly to the bacterial lawn). Thus, using a selective immobilized filter lift to increase the concentration of the specific binding molecule of interest (in this case, a human Fab fragment) resulted in greater sensitivity for detection of the binding molecule of interest.
[0101]
These results indicate that selective immobilized filter lift increases sensitivity and reduces background binding as compared to a control filter lift where the binding molecules are bound directly to the filter.
[0102]
(Example III)
(Preparation and extraction of biotinylated cell surface antigen)
This example describes a method for labeling cell surface tumor antigens. This example also describes the preparation of a cell surface tumor antigen extract that results in low background binding when used for the detection of selectively immobilized antibodies.
[0103]
H3396 cells were grown in monolayer and chilled on ice for subsequent 4 ° C operation. Cells were rinsed three times with PBS. After 30 minutes, the cells were incubated with 1.5 mg / ml sulfosuccinimidyl-6- (biotinamide) hexanoate (Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate) (Pierce) in PBS for 2 hours. Cells were rinsed once in PBS containing 50 mM glycine and then twice more in PBS. Cells were collected by scraping in PBS containing 100 μM [4-2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride, HCl], 1 μM pepstatin A and 10 μM leupeptin hemisulfate. The protein concentration was measured, Triton X-100 was added to a final concentration of 10: 1 (weight: weight), and the suspension was incubated overnight at 4 ° C. on a rotating disk. Particulate matter was removed by centrifugation at 11,000 × g for 30 minutes at 4 ° C., followed by ultracentrifugation at 540,000 × g for 7 minutes at 4 ° C. The supernatant contains the soluble biotinylated cell surface antigen.
[0104]
These results demonstrate that cell surface polypeptides can be labeled with biotin for use in screening methods. These results also demonstrate that extracts lacking interfering particulates, including microsomes, can be prepared for use in probing selective immobilized filter lifts with low background binding.
[0105]
(Example IV)
(Reduced background of selectively immobilized filter lift compared to control filter lift)
This example demonstrates that selective immobilized filter lifts provide a reduced background of non-specific bacterial protein binding compared to control filter lifts.
[0106]
Phage expressing BR96-reactive Fab (240H2) were mixed with an unrelated phage stock (IX64) (which does not express any Fab), and E. coli bacteria were plated and grown at 37 ° C. for 8 hours. Four replicate filter lifts (two control filter lifts and two selective immobilized filter lifts) were sequentially incubated with the bacterial lawn for 4 hours at 22 ° C. Two control filter lifts (A and B) and two selectively immobilized filter lifts (C and D) were incubated with the various reagents. In order to locate any plaque present on the bacterial lawn, filterlift A was incubated with rabbit anti-fd bacteriophage antibody in 1% BSA in PBS containing 0.1% sodium azide. Washed three times in PBS, followed by incubation in alkaline phosphatase goat anti-rabbit antibody. The filters were washed six times with PBS and washed with 0.1 M Tris, pH 9.5, 0.4 mM 2,2'-di-p-nitrophenyl-5,5'-diphenyl-3,3 '-(3,3 Incubation in an alkaline phosphatase colorimetric reagent containing '-dimethoxy-4,4'-diphenylene) ditetrazolium chloride and 0.38 mM 5-bromo-4-chloro-3-indoxylphosphate mono- (p-toluidinium) salt Color. Filterlift C was incubated with horseradish peroxidase-conjugated Lewis Y antigen (BR96 antigen). Filter lift C was developed using ECL and exposed to film for 30 seconds.
[0107]
To study the ability of the selective immobilized filter lift to distinguish ligands in cell extracts, H3396 cells were biotinylated and membrane extracts prepared as described in Example III. Filter lifts B and D were prepared using biotinylated cell surface antigen (prepared as described in Example III, 1% BSA, 1% Triton X-100, 0.145% sodium dodecyl sulfate and 0.1% in PBS). (Tissue cell extract protein diluted to 40 μg / ml in sodium azide) for 2 hours at 4 ° C. Filter lifts B and D were washed six times with 0.1% Tween 20 in PBS, followed by incubation with alkaline phosphatase conjugated streptavidin. Plaques were visualized after color development in alkaline phosphatase colorimetric reagent.
[0108]
All plaques were visualized on filter A using an anti-fd bacteriophage antibody as described in FIG. Similarly, all plaques were visualized when control lift B was probed with biotinylated cell surface antigen, even if IX64-derived plaques did not express Fab fragments. Thus, there appears to be significant background due to bacterial proteins released by phage lysis. Numerous attempts have been made to reduce non-specific binding of tumor cell extracts, including: (1) the use of various detergents to solubilize tumor cell membranes, (2) Stringent use of filter wash parameters, (3) evaluation of a wide range of blocking reagents, and (4) use of different types of matrices to capture phage expressed Fabs. All of these approaches either failed to reduce the background or completely abolished the signal.
[0109]
Use purified BR96 antigen (FIG. 3, filter lift C) or contain BR96 antigen, as well as other biotinylated cell surface antigens, in contrast to control filters containing directly bound binding molecules and non-specific bacterial proteins Probing of the selectively immobilized filter lift with cell membrane lysate (filter lift D) resulted in a similar pattern of plaque detection. When crude cell membrane lysate was used as a source of BR96 antigen, non-specific binding occurred to all plaques (including plaques not expressing BR96-specific Fab fragments) on control filter lifts (filter Lift B). On the other hand, the BR96-specific Fab fragment could be detected on the selectively immobilized filter lift using the same extract (filter lift D). Thus, the selectively immobilized filter lift had significantly lower background binding to bacterial proteins than the control filter lift.
[0110]
These results indicate that the procedure for selective immobilization of binding molecules to nitrocellulose filters reduces background binding of bacterial proteins. Thus, the capture of the binding molecule of interest by the binding molecule selectively immobilized on the filter increases the concentration of the binding molecule by selectively capturing the binding molecule in the bacterial plaque lysate. In addition, background was reduced by reducing the binding of non-specific bacterial proteins. Thus, the selective immobilized filter lift method provides enhanced sensitivity and reduced background when screening for binding molecules using a population of ligands.
[0111]
(Example V)
(Identification of tumor-specific Fab fragments identified by selective immobilization on a solid support)
This example demonstrates the identification of clones expressing tumor-specific Fab fragments.
[0112]
Fab fragment libraries were generated using breast and colon tumor tissues. The majority of Fab fragments were identified using specificity for cell surface tumor antigens.
[0113]
Three libraries expressing human Fab fragments, designated A2, A3, and A4, were generated from three different tumor sources. An A2 library was constructed from tumor draining lymph node tissue obtained from breast cancer patients. An A3 library was constructed from human colon tumor tissue. An A4 library was constructed from prostate tumor tissue. The library was constructed from B cells present in tumor tissue samples. Briefly, RNA was extracted from tumor tissue using TRIZOL reagent (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Following synthesis of cDNA from RNA, the IgG heavy and kappa light chains were amplified by touchdown polymerase chain reaction (PCR). Single-stranded DNA was isolated and cloned into two vectors IX104 and IX203. The IX104 vector contains an amber stop codon between the immunoglobulin heavy chain and the pVIII protein. The IX203 vector has the amber stop codon removed.
[0114]
The human Fab library was selectively immobilized on nitrocellulose filters coated with anti-human κ antibody (prepared as in Example I). Table 2 summarizes the results of three independent screening experiments of a human Fab library in either the IX104 or IX203 vector against a biotinylated cell surface polypeptide from the H3396 cell line (prepared as in Example III). . Using the selective immobilized filterlift technique, the frequency of positive clones was different in three independent experiments (see Table 2). As defined in these experiments, positive clones (referred to in Table 2 as capture lift positive clones) were identified in an initial screen, picked, replated, and a second selectively immobilized filter lift. Confirmed in screening.
[0115]
(Table 2. Summary of Fab library screening using tumor cells)
[0116]
[Table 2]

[0117]
¹ No reaction at a Fab fragment concentration of 15 μg / ml or less.
[0118]
Positive clones identified by the selective immobilized filter lift technique were isolated and used as a source to produce larger quantities of soluble Fab for further characterization. Briefly, XL1-Blue bacteria were cultured in 2 × YT medium at 37 ° C. at 0.9-1.2 OD. ₆₀₀ Were grown to a density of. After addition of IPTG to a final concentration of 1 mM, cultures were harvested from high titer stocks (> 10 ¹⁰ (Plaque forming units / ml) and infected with 10 μl of phage and incubated for 1 hour at 37 ° C. Cultures were shifted to 25 ° C. and grown for an additional 14-16 hours. Cells are pelleted at 6000 × g for 10 minutes and 10 ml of 50 mM Tris, pH 8.0, containing 100 μM (4-2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride, HCl), 1 μM pepstatin A and 10 μM leupeptin hemisulphate. And suspended by sonication for 1 minute at 15% power using a Branson Sonifier 450 equipped with a microchip. After sonication, 1000 U of DNase I in 50 mM Tris, pH 8.0 was added and the lysate was incubated for 30 minutes at 25 ° C. The lysate was centrifuged at 12,000 × g for 30 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed and used for purification of the Fab fragment.
[0119]
Fab fragments were purified using an affinity column constructed by coupling goat anti-human IgG Fab to 20 mg on a 1 ml HiTrap NHS activation column (Pharmacia, Piscataway, NJ). Tween 20 was added to the bacterial cell lysate to a final concentration of 0.05%, and the lysate was filtered through a 0.45 μm filter and applied to an affinity column. Unbound fractions were collected and applied a second time. The column was washed with a buffer containing 50 mM Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl and 0.05% Tween 20, followed by a 50 mM Tris, pH 8.0 buffer. The Fab was eluted in 1/10 volume of 1 M Tris, pH 8.0 using 100 mM glycine-HCl, pH 2.3 containing 0.5 M NaCl. The fraction containing the Fab fragment was applied to a PD-10 Sephadex G25-M column (Pharmacia) equilibrated with PBS.
[0120]
To further characterize the purified Fab fragment, a monolayer of H3396 cells was fixed with 2% paraformaldehyde in PBS for 15 minutes at 25 ° C. Paraformaldehyde was aspirated and the cells were washed twice with PBS. The fixed cells were incubated in blocking buffer containing 1% BSA in PBS, the Fab fragments were diluted to the appropriate concentration in blocking buffer and incubated with the fixed cells for 2 hours at 25 ° C. . The sample was aspirated, the fixed cells were washed three times with PBS, and the cells were incubated for 1 hour at 25 ° C. with 0.5 μg / ml alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human κ light chain antibody. The fixed cells were washed four times with PBS and developed using an alkaline phosphatase colorimetric reagent.
[0121]
Approximately 40-50% of the Fab fragments identified by selective fixation on filter lifts can be titrated on fixed monolayers of H3396 tumor cells, the cell line used to generate biotinylated cell membrane lysates (See Table 2). Some of the approximately 50% of the Fab fragments not titrated on the immobilized monolayer appear to be dependent on antigenic epitopes destroyed by paraformaldehyde treatment. These remaining Fab fragment clones can be characterized using different techniques that do not use paraformaldehyde treatment.
[0122]
Positive Fab fragment clones isolated by selective immobilization on a solid support (referred to in Table 2 as capture lift positive clones) also respond to the cloned Fab fragment against GM05658 normal human fibroblasts. Tested for gender. In one experiment in which 50,600 original clones were screened, more than two clones did not respond to fibroblasts and were classified as fibroblast negative. In a second experiment screening 139,400 original clones, more than 9 clones were identified as fibroblast negative clones. Thus, selective immobilization allows the identification of human Fab fragments that specifically bind to tumor cells but do not bind to normal fibroblasts.
[0123]
Using the selective immobilized filter lift technique, 81 clones expressing Fab fragments were identified, as shown in Table 3.
[0124]
DNA was isolated from the Fab clone and the DNA fragment corresponding to the light chain CDR region was sequenced using the IX104-specific primer GCCAGTTCCAGATTTCACTG (SEQ ID NO: 1) or the IX203-specific primer CTCTGTTGACACTCTCCTGGGGA (SEQ ID NO: 2). The DNA fragment corresponding to the heavy chain CDR region was sequenced using the primers GTAGTCCTTGACCAGGGCA (SEQ ID NO: 3) or AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGC (SEQ ID NO: 4). Table 4 shows the amino acid sequences of the three CDR regions found in the light chain of the cloned Fab fragment. Table 5 shows the nucleotide sequence of the CDR region of the light chain of the cloned Fab fragment. Table 6 shows the amino acid sequences of the three CDR regions found in the heavy chain of the cloned Fab fragment. Table 7 shows the nucleotide sequence corresponding to the CDR region of the heavy chain of the cloned Fab fragment. Each of the Fab clones identified by selective immobilization on the filter contains a nucleotide sequence that encodes a unique amino acid sequence.
[0125]
(Table 3. Tumor-specific human Fab clones identified by the selective immobilization filterlift technique)
[0126]
[Table 3]

[0127]

[0128]
(Table 4. Amino acid sequence of CDR region of light chain of Fab fragment isolated by selective immobilization filter lift technique)
[0129]
[Table 4]

[0130]
Table 5. Nucleotide sequence of CDR region of light chain of Fab fragment isolated by selective immobilized filter lift technique.
[0131]
[Table 5]

[0132]

[0133]
(Table 6. Amino acid sequence of CDR region of heavy chain of Fab fragment isolated by selective immobilization filter lift technique)
[0134]
[Table 6]

[0135]

[0136]
Table 7. Nucleotide sequence of CDR region of heavy chain of Fab fragment isolated by selective immobilization filter lift technique.
[0137]
[Table 7]

[0138]

[0139]
The majority of human Fab fragments generated in the expression library were identified using the selective immobilized filterlift technique. This technique allows for the screening of the majority of clones. DNA sequencing of a selected number of the isolated Fab clones revealed that various genetically distinct Fab fragments were identified.
[0140]
These results indicate that the selective immobilized filter lift technique allows for the identification of a large number of different human Fab fragments.
[0141]
(Example VI)
Characterization of tumor cell-specific human Fab fragments identified by selective immobilization on a solid support
This example demonstrates the cell-specific reactivity of Fab clones on fixed and surviving tumor cell lines.
[0142]
Fab fragments identified using the selective immobilization filter lift technique were purified as described in Example V. Various cell lines were fixed in paraformaldehyde as described in Example V and increasing concentrations of purified Fab fragment (2.5 × 10 ^-1 ~ 3 × 10 ¹ μg / ml). Unbound Fab was removed and the fixed cells were incubated with alkaline phosphatase-conjugated anti-human κ antibody as described in Example V. After incubation with the chromogenic reagent, the OD ₅₆₀ Was measured.
[0143]
In FIG. 4A, titration curves for purified Fab F15 were shown in two breast tumor cell lines (H3396 and H3464) and GM05658 normal fibroblasts. Fab F15 shows specific binding to both breast cell lines, but not normal fibroblasts. In FIG. 4B, a titration curve for Fab F133 is shown using two identical breast cell lines and GM05658 normal human fibroblasts. Fab F133 shows specific binding for H3396 cells used to make the screening extracts. However, Fab F133 does not bind to a second breast cell line or normal fibroblasts.
[0144]
Purified Fab fragments were also characterized for binding to living tumor cells by FACS analysis on a Becton Dickinson FACSort system. Purified Fab F3 was compared to non-specific Fab fragments in H3396 cells (see FIG. 5A). Incubation of H3396 cells with Fab F3 resulted in a shift in H3396 cells, indicating reactivity with cell surface antigen compared to cells incubated with non-specific Fab. The peak of cells shifted by Fab F3 is sharp, indicating that the population of H3396 cells is relatively homogeneous in expressing its antigen.
[0145]
Similar FACS analysis was performed using Fab F15. As shown in FIG. 5B, Fab F15 caused a greater shift in H3396 cells compared to non-specific Fab as observed with Fab F3. This indicates that Fab F15 reacts with the cell surface antigen. The shifted Fab F15 peak is broader than the peak observed with Fab F3, consistent with a more heterogeneous expression of the Fab F15 antigen in H3396 cells.
[0146]
FACS analysis was also performed using Fab F40. Fab F40 was identified using a membrane extract of breast cell line H3396. Interestingly, Fab F40 is cross-reactive with colon carcinoma cell line H3719 (see Figure 5C). Fab F40 causes a shift in H3719 cells compared to control non-specific Fab. This indicates that Fab F40 recognizes a cell surface antigen of a colon carcinoma cell line. The Fab F40 peak is somewhat broad, indicating a more heterogeneous expression of the F40 antigen. Thus, Fab F40 recognizes two different types of cell surface antigens on tumor cells.
[0147]
Selective immobilization filter lift technology has enabled the isolation of a large number of human Fab fragments with specificity for fixed live tumor cells. Some Fab fragments are specific for breast carcinoma cells, or specific for specific breast cell lines, while other Fab fragments are cross-reactive for colon carcinoma cell lines. I do. These Fab fragments displayed specific binding on tumor cells, but did not bind to normal fibroblasts.
[0148]
These results indicate that the selective immobilized filter lift technique allows for the identification of human Fab fragments with specificity for tumor cells.
[0149]
All journal articles and references provided above, whether in parentheses or otherwise, whether stated or not, are incorporated herein in their entirety. Incorporated as a reference.
[0150]
Although the present invention has been described with reference to the embodiments provided above, it should be understood that various changes can be made without departing from the spirit of the invention. Accordingly, the invention is limited only by the claims.
[Brief description of the drawings]
FIG.
FIG. 1 shows the optimization of a human Fab binding molecule immobilized on a solid support.
FIG. 2
FIG. 2 shows the identification of human Fab binding molecules for tumor antigens using binding molecules selectively immobilized on a solid support, and the detection efficiency for binding molecules directly immobilized on a solid support Compare.
FIG. 3
FIG. 3 shows the increased binding specificity and reduced background of detection using a population of human Fab binding molecules selectively immobilized on a solid support compared to direct immobilization.
FIG. 4
FIG. 4 shows the binding specificity of human Fab binding molecules identified by selective immobilization on a solid support for tumor cell monolayers.
FIG. 5
FIG. 5 shows fluorescence activated cell sorting of tumor cells by human Fab binding molecules identified by selective immobilization on a solid support.

Claims (22)

A method for identifying a binding molecule having a selective affinity for a ligand, comprising:
a) selectively immobilizing a diverse population of binding molecules on a solid support;
b) simultaneously contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more ligands; and c) determining at least one binding molecule that selectively binds to one or more of the ligands. Process,
A method comprising: 2. The method of claim 1, further comprising the step of determining the sequence of the binding molecule determined in step (c). 2. The method of claim 1, further comprising characterizing the ligand that binds to the binding molecule. 2. The method of claim 1, wherein said population of binding molecules is generated in an expression library. 5. The method according to claim 4, wherein said expression library is an antibody library. 2. The method according to claim 1, wherein said ligand is a polypeptide. 7. The method of claim 6, wherein said polypeptide is a cell surface polypeptide. 7. The method of claim 6, wherein said polypeptide is a tumor antigen. 2. The method of claim 1, wherein said ligand is in a cell lysate. A method for identifying an antibody having selective affinity for a tumor antigen, comprising:
a) selectively immobilizing a diverse population of antibodies on a solid support;
b) simultaneously contacting the diverse population immobilized on the solid support with two or more tumor antigens; and c) at least one antibody that selectively binds to one or more of the tumor antigens. The process of determining,
A method comprising: 11. The method of claim 10, wherein said population of antibodies are human antibodies or functional fragments thereof. 11. The method of claim 10, wherein said population of antibodies is generated as an expression library. An isolated binding polypeptide selective for a tumor antigen, wherein said binding polypeptide is F3, F13, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F30, F31, F32, F33, F34, F35, F36, F37, F38, F40, F41, F42, F46, F49, F50, F52, F54, F55, F58, F63, F66, F67, F68, F69, F70, F72, F74, F76, F78, F79, F80, F81, F84, F85, F86, F93, F99, F104, F111, F112, F118, F126, F129, F130, F132, F133, F134, F135, F136, F138, F151, F158, F160, F174, F176, F177, F184, F186, F19 , F197, F200, F202, F203, F207, F208, F212, F214, F217, F224, F231, F236, F238, TA50 and an antibody fragment selected from the group of antibody fragments consisting of TA73, binding polypeptide. An isolated binding polypeptide selective for a tumor antigen, wherein said binding polypeptide comprises F3, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F133, TA50 and TA73. A binding polypeptide, which is an antibody fragment selected from the group of fragments. The antibody fragment according to claim 14, wherein SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, Sequence An amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences referred to as SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, and SEQ ID NO: 136 An antibody fragment substantially comprising: An isolated nucleic acid molecule encoding an antibody fragment, comprising: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, Sequence Selected from the group consisting of the amino acid sequences referred to as SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, and SEQ ID NO: 136 An isolated nucleic acid molecule encoding an antibody fragment comprising a nucleotide sequence that substantially encodes the amino acid sequence to be encoded. 17. The isolated nucleic acid molecule of claim 16, wherein SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, Sequence SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences referred to as SEQ ID NO: 135 An isolated nucleic acid molecule. A complementarity determining region (CDR) of an antibody selective for a tumor antigen or a functional fragment thereof, wherein the CDR is F3, F13, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F30, F31, F32, F33, F34, F35, F36, F37, F38, F40, F41, F42, F46, F49, F50, F52, F54, F55, F58, F63, F66, F67, F68, F69, F70, F72, F74, F76, F78, F79, F80, F81, F84, F85, F86, F93, F99, F104, F111, F112, F118, F126, F129, F130, F132, F133, F134, F135, F136, F138, F151, F158, F160, F174, F176, F177, F18 , F186, F191, F197, F200, F202, F203, F207, F208, F212, F214, F217, F224, F231, F236, F238, TA50 and TA73. Region or functional fragment thereof. A complementarity determining region (CDR) of an antibody selective for a tumor antigen or a functional fragment thereof, wherein said CDR comprises F3, F14, F15, F19, F21, F22, F23, F26, F133, TA50 and A complementarity determining region or a functional fragment thereof derived from an antibody fragment selected from the group consisting of TA73. The CDR according to claim 19, wherein SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, Sequence No. 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, An amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences referred to as SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, and SEQ ID NO: 136 CDR. SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, Sequence No. 48, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 66, SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 72 SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, An amino acid selected from the group consisting of the amino acid sequences referred to as SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, and SEQ ID NO: 136 An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that substantially encodes the sequence. 22. The isolated nucleic acid molecule according to claim 21, wherein SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, Sequence SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, and a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences referred to as SEQ ID NO: 135 An isolated nucleic acid molecule comprising:

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