【０００１】
（技術分野）
本発明は本明細書中に例示されるホスホジエステラーゼ４−特異的阻害剤を投与することによる線維症性疾患の予防または治療用組成物および方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
線維芽細胞は細胞外結合組織マトリックスの主源であり、これら細胞の補充および活性化が創傷治癒および線維症の発病の両方において重要な役割を果たしていると考えられる。線維芽細胞の蓄積を遮断することのできる薬剤が線維症の制御において治療薬としての役割を果たすことができた。この度、ある種のＰＤＥ４阻害剤が線維症および線維増殖性疾患の調節において治療薬としての役割を果たすことが見出された。
【０００３】
（発明の開示）
本発明は、本明細書中に定義する特定の治癒比を有する、有効量のＰＤＥ４−特異的阻害剤を線維症性疾患の予防または治療を必要とする患者に投与することにより哺乳動物における該疾患を予防または治療する方法に関する。
【０００４】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の意図する療法は、ＰＤＥ４−特異的阻害剤を投与し、線維症性疾患の発病を防止するか、あるいは線維症性疾患を治療することを含む。これらの障害は、例えば遺伝的異常により惹起される強皮症にて、例えば肝硬変または肺線維症あるいは火傷の後の瘢痕のように環境（感染性／職業性／毒性／外傷性）物質が原因で、または血管形成術後の血管の再狭窄、癌治療後の肺線維症、眼の手術の後の瘢痕のように医療介入に対する組織応答が原因で、ある種の形態の新生児の肝線維症にて、内因的に起こり得る。他の線維症性障害は、肝線維症および硬変、腎線維症、骨髄線維症およびケロイド；または心臓組織または心臓血管系への損傷または創傷の結果として生じる可能性のある線維症を包含するが、これらに限定されるものではない。
【０００５】
塵肺症は、有機または無機粒子および化学物質のフュームおよび蒸気を吸入することにより誘発される肺での広汎性線維症性反応によって特徴付けられる一群の疾患である。線維症の発生病理は線維形成誘導性の化学伝達物質の放出によるものである。例えば、炭坑夫の塵肺症、珪肺症、石綿症およびバガス肺症がその一例である。錫、鉄およびベリリウムの金属フュームは線維症性物質である。
線維芽細胞は細胞外結合組織マトリックスの主源であり、これら細胞の補充および活性化が創傷治癒および線維症の発病の両方において重要な役割を果たしていると考えられる。線維芽細胞の蓄積を遮断することのできる薬剤が線維症の制御において治療薬としての役割を果たすことができた。ＰＤＥ４阻害剤が線維症の調節において治療薬としての役割を果たすことが見出された。また、ＰＤＥ３およびＰＤＥ５阻害剤を除いて、本明細書に記載されている阻害剤と同様のＰＤＥ４特異的阻害剤は、コラーゲンの分解、特にＴＮＦ−αに起因する分解およびヒト好中球エラスターゼ刺激分解を有意に減少させることも見出された。
【０００６】
本発明において有用なＰＤＥ４特異的阻害剤は、ＰＤＥ４酵素を阻害することが分っているか、あるいはＰＤＥ４阻害剤として作用することが見出された化合物であり、ＰＤＥ４だけの阻害剤であって、ＰＤＥ４と同様にＰＤＥファミリーの他のメンバーを阻害する化合物ではない。一般に、ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）と高いアフィニティーで結合する触媒形態のＰＤＥＩＶのＩＣ５０を、ロリプラムと低いアフィニティーで結合する形態のＩＣ５０で割った場合にＩＣ５０比が約０．１またはそれ以上であるＰＤＥ４アンタゴニストを用いることが好ましい。
【０００７】
テオフィリンおよびペントキシフィリンなどのＰＤＥ阻害剤はあらゆる組織中にあるすべてのＰＤＥイソ酵素またはほとんどすべてのＰＤＥイソ酵素を区別することなく阻害する。これらの化合物はあらゆる組織中にあるすべてのＰＤＥイソ酵素種を無差別に阻害するため、該化合物は明らかに副作用を示す。かかる化合物で標的とする疾患を効果的に治療することができるが、望ましくない別の作用があるかもしれず、もしその作用を回避または最小限にすることができるならば、この方法の全体的な治療剤としての効果は特定の疾患を治療することにまで向上するであろう。例えば、抗鬱剤として開発された、選択的ＰＤＥ４阻害剤であるロリプラムを用いての臨床試験から、ロリプラムは向精神薬活性を有するが、胃腸作用、例えば、胸焼け、吐き気および嘔吐を生じることがわかる。
【０００８】
この開示の目的のため、ＲおよびＳのロリプラムと低いアフィニティーで結合するｃＡＭＰの触媒部位を「低アフィニティー」結合部位（ＬＰＥＤ４）と称し、ロリプラムと高いアフィニティーで結合する他の形態のこの触媒部位を「高アフィニティー」結合部位（ＨＰＤＥ４）と称する。この「ＨＰＤＥ４」なる語はヒトＰＤＥ４を示すのに用いられる「ｈＰＤＥ４」なる語と混同すべきではない。
最初の実験は［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合アッセイを確立しかつ確認するために行われた。この操作の詳細を以下の実施例１に示す。
【０００９】
高アフィニティー結合活性および低アフィニティー結合活性の両方が同一の遺伝子産物に存するかどうかを測定するために、酵母を既知の方法で形質転換し、組換えＰＤＥ４の発現を６時間の発酵期間にわたって追跡した。ＰＤＥ４に拮抗する方向性の抗体を用いるウェスタンブロット分析は、ＰＤＥの発現量が時間と共に増え、３時間の増殖後に最大に達することを示した。加えて、９０％より多くの免疫反応性産物が酵母ライゼートを高速（１０００００ｘｇ）処理した上澄中にあった。［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合活性およびＰＤＥ活性を蛋白発現と一緒にモニター観察した。ＰＤＥ４活性はロリプラム結合活性と一緒に現れ、そのことは両方の機能が同じ遺伝子産物に存在することを示す。ウェスタンブロット分析の結果と同様に、８５％より大きなロリプラムを阻害することが可能なＰＤＥ活性および［３Ｈ］−ロリプラム結合活性が酵母上澄フラクション中に存在することが見出された。
【００１０】
全般的に、この系にて発現される組換えＰＤＥ４の大部分はＬＰＤＥ４として存在し、ほんのわずかなフラクションがＨＰＤＥ４として存在する。その結果、組換えＰＤＥ４触媒活性の阻害は主に化合物のＬＰＤＥ４での作用を反映することとなる。かくして、ＰＤＥ４触媒活性の阻害は化合物のＬＰＤＥ４での効能の指標として用いることができる。化合物のＨＰＤＥ４での効能は［３Ｈ］Ｒ−ロリプラムに対するその競合する能力を試験することにより評価することができる。低アフィニティーと高アフィニティーの両方のロリプラム結合部位についてのＳＡＲを明らかにするために、選択された化合物の効能を２つのアッセイ系して測定した。標準化合物を用いる実験からの結果を表にした。予想通り、他の部位（その部位ではロリプラムは低アフィニティー結合剤である）と比較した場合にロリプラムが高アフィニティー結合を示す部位にて、特定の化合物が［３Ｈ］Ｒ−ロリプラムとの競合においてより強力であることは明らかである。高アフィニティー結合と低アフィニティー結合との間のＳＡＲ相関性は乏しく、高アフィニティーの［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合を阻害するためのＳＡＲは低アフィニティーのロリプラムの結合部位に結合させるためのＳＡＲと異なると結論付けられた。
【００１１】
阻害剤が相互作用するヒト単球組換えＰＤＥ４（ｈＰＤＥ４）には少なくとも２つの結合形態のあることは現在では公知である。これらの観察を説明する１つがｈＰＤＥ４が２つの異なる形態にて存在するということである。一方の形態はロリプラムおよびデンブフィリンなどと高いアフィニティーで結合するが、他方はこれら化合物と低いアフィニティーで結合する。本発明における使用に好ましいＰＤＥ４阻害剤は、有益な治癒比を有する化合物、すなわち、ｃＡＭＰ触媒活性を優先的に阻害する化合物であって、この酵素はロリプラムと低いアフィニティーで結合し、そのためにロリプラムと高いアフィニティーで結合する形態の阻害と関連していると思われる副作用は減少するであろう。言いかえれば、好ましい化合物とは、ロリプラムと高いアフィニティーで結合するＰＤＥＩＶ触媒形態についてのＩＣ５０を、ロリプラムと低いアフィニティーで結合する形態についてのＩＣ５０で割った場合に約０．１またはそれ以上のＩＣ５０比を有するものである。
【００１２】
この基準のさらに微細な点はＰＤＥ４阻害剤が約０．１またはそれより大きなＩＣ５０比を有するものである点にあり；その比とは１ｎＭの［３Ｈ］Ｒ−ロリプラムが高いアフィニティーでロリプラムと結合する一の形態のＰＤＥ４に結合することと競合することについてのＩＣ５０値の、１μＭ［３Ｈ］−ｃＡＭＰを基質として用いてロリプラムが低いアフィニティーで結合する一の形態のＰＤＥＩＶ触媒活性を阻害することについてのＩＣ５０に対する比である。この試験についてのさらなる説明は同時係続している米国特許第５９９８４２８号に見ることができ、本発明を実施するのに不可欠である内容についてはそのテキストを出典明示することにより本明細書の一部とする。
【００１３】
最も好ましいのは、０．５よりも大きなＩＣ５０比を有するＰＤＥ４阻害剤、特に１．０よりも大きな比を有する化合物である。好ましい化合物はシス−４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（アリフロ（登録商標）（Ａｒｉｆｌｏ））である。加えて、以下のＰＤＥ４阻害剤：アストラ（Ａｓｔｒａ）からのＡＷＤ−１２−２８１（Ｈｏｆｇｅｎ，Ｎ．ら、１５ｔｈ ＥＦＭＣ Ｉｎｔ Ｓｙｍｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（９月６日ないし１０日、エディンバラ）１９９８、要約９８頁）；ＮＣＳ−６１３と称される９−ベンジルアデニン誘導体（ＩＮＳＥＲＭ）；キロサイエンス・アンド・シェアリング−プラウ（Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）からのＤ−４４１８；ＣＩ−１０１８と同定されたベンゾジアゼピンＰＤＥ４阻害剤（ＰＤ−１６８７８７；パルケ−ダビス／ワーナー−ランバート（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ／Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＷＯ９９１６７６６に開示の協和発酵のベンゾジオキソール誘導体；ナップ（Ｎａｐｐ）からのＶ−１１２９４Ａ（Ｌａｎｄｅｌｌｓ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐ Ｊ［Ａｎｎｕ Ｃｏｎｇ Ｅｕｒ Ｒｅｓｐ Ｓｏｃ（９月１９日ないし２３日、ジェノバ）１９９８］１９９８、１２（Ｓｕｐｐｌ． ２８）：要約２３９３頁）；ロフルミラスト（ＣＡＳ照合番号１６２４０１−３２−３）およびフタラジノン（ＷＯ９９４７５０５）（Ｂｙｋ−グルデン（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ）から由来）；またはＴ−４４０と同定された化合物（田辺製薬；Ｆｕｊｉ，Ｋ．ら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、１９９８、２８４（１）：１６２）も本発明の実施に有用である。
【００１４】
適当に投与することで、臨床疾患の改善が得られ、特に線維細胞性瘢痕組織の大きさが阻止または縮小し、あるいは血清中のプロコラーゲンペプチドのレベルなどのその分泌する生成物が減少する。治療すべき線維増殖性瘢痕組織を解剖学的に位置選定することは、これら化合物の投与方法および医薬調製物にとって唯一の最も重要な決定因子である。肝線維症および肝硬変は胃から出て肝門部の血液から肝臓により速やかに抽出される経口的に活性な化合物を必要とする。他方で、肺線維症は静脈内投与された薬剤によってより直接的に処理され、あるいはエアロゾル化された化合物の吸引を組み合わせるが、肺線維症の治療にある種のＰＤＥ４−特異的阻害剤を経口投与することができる。血管再狭窄または皮膚瘢痕は局所塗布方法により処理することができる。
【００１５】
本発明の化合物および経口投与した場合に活性である医薬上許容される塩は、シロップ、錠剤、カプセル、放出制御製剤またはロゼンジとして処方することができる。シロップ処方は、一般に、該化合物または塩の、矯味矯臭剤または着色剤を含む、液体担体、例えば、エタノール、落花生油、オリーブ油、グリセリンまたは水中の懸濁液または溶液からなる。該組成物が錠剤の形態である場合、固体処方の調製に慣用的に使用される医薬担体を用いることができる。かかる担体として、例えば、ステアリン酸マグネシウム、白土、タルク、ゼラチン、アカシア、ステアリン酸、澱粉、ラクトースおよびシュークロースが挙げられる。該組成物がカプセルの形態である場合、例えば、上記した担体をハードゼラチンカプセル殻中に用いる、いずれの慣用的なカプセル化も適している。該組成物がソフトゼラチンカプセル殻のカプセルの形態である場合、分散液または懸濁液を調製するのに慣用的に使用されるいずれの医薬担体、例えば水性ガム、セルロース、シリケートまたは油を考慮し、それらをソフトゼラチンカプセル殻中に配合することができる。
【００１６】
典型的な非経口用組成物は、化合物または塩の、所望により非経口的に許容される油、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油またはゴマ油を含有していてもよい滅菌水性または非水性担体中の溶液または懸濁液からなる。
吸入用の典型的組成物は、乾燥粉末として、または慣用的な噴射剤、例えばトリクロロフルオロメタンなどのフッ素化炭化水素を用いる
好ましくは、ＰＤＥ４阻害剤の組成物は、錠剤またはカプセルなどの単位剤形あるいは放出制御調製物である。
所望の活性を示すのに十分な量にて、活性成分を一日に１ないし６回投与することができる。好ましくは、その活性成分を一日に約１回または２回、より好ましくは一日に２回投与する。
薬剤の投与量については、ＰＤＥ４阻害剤に関して、成人当たり一日に１ないし２００ｍｇの量にて投与されると考えられる。
次に実施例を用いて本発明を説明するが、何ら本発明を制限するものではない。
【００１７】
（実施例）
実施例１
アリフロを用いる線維芽細胞の化学走性の弱化
ホスホジエステラーゼ４阻害剤である、シス４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（アリフロ（登録商標））が走化性因子であるフィブロネクチンに向かう線維芽細胞の化学走性を弱めうることが見出された。ＰＤＥ４阻害剤の活性は内因的環状ＡＭＰレベルに依存するはずであるから、内因的プロスタグランジンの産生により細胞がアリフロの作用に敏感となるかどうかを測定するように実験を設計した。この操作を行うために、ヒト胎児肺線維芽細胞を培養し、全面成長に達した後、インドメタシン（２ｘ１０−６Ｍ）と共におよび無しで６０分間インキュベートし、シクロオキシゲナーゼを阻害した。ついで、線維芽細胞をトリプシン処理に付し、ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）のブラインドウェルの化学走性チャンバーの上部に置いた。フィブロネクチン、２０μｇ／ｍｌを、走化性因子として、該チャンバーの下部に置いた。インドメタシン（２ｘ１０−６Ｍ）を該化学走性チャンバーの上側に加えた。インドメタシンは単独で、わずかではあるが、可変的な化学走性の刺激をもたらした（対照と比べて１５９±３３％、ｐ＜０．０５）。線維芽細胞を制御するのに加えられたアリフロは濃度依存的に化学走性を阻害した。３回の別々の実験で、化学走性を５０％まで阻害するのに必要なアリフロの濃度は４．９±２．５μｇ／ｍｌであった。インドメタシンの存在下では、１０μｇ／ｍｌの高濃度で試験したアリフロだけが化学走性を阻害し、その応答をインドメタシンと比べて対照の５８．７±２１．０％（ｐ＜０．００５）まで減少させた。したがって、この実験で、ＰＤＥ４阻害剤であるアリフロは、少なくとも部分的に、線維芽細胞の化学走性に対して阻害効果を発揮するために、内因的シクロオキシゲナーゼ活性、そしておそらくはＰＧＥ産生に依存していることが明らかにされた。インドメタシンの存在下であってもアリフロが活性であるということは、環状ＡＭＰを刺激する別の機構がまた一定の役割を果たしていることを示唆する。シクロオキシゲナーゼ活性およびプロスタグランジン産生は炎症環境にある種々の伝達物質により調節され得るため、そのような環境下にある線維芽細胞は特にアリフロの阻害作用に対して感受的である可能性がある。かかる作用は線維症性障害において治療価値がある。
【００１８】
実施例２−ホスホジエステラーゼおよびロリプラム結合アッセイ
実施例２Ａ
単離したヒト単球ＰＤＥ４およびｈｒＰＤＥ（ヒト組換えＰＤＥ４）は主に低アフィニティー形態にて存在することが測定された。かくして、試験化合物の低アフィニティー形態のＰＤＥ４に対する活性は、基質として１μＭの［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いるＰＤＥ４触媒活性についての標準的アッセイにて評価することができる（Ｔｏｒｐｈｙら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７巻、Ｎｏ．３、１７９８−１８０４頁、１９９２）。
ラット脳を高速処理した上澄を蛋白源として用い、比活性が２５．６Ｃｉ／ミリモルまでの［３Ｈ］−ロリプラムの両方のエナンチオマーを調製した。標準的なアッセイ条件は、５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｎＭの［３Ｈ］−ロリプラムとする、最後のｃＡＭＰを除き、ＰＤＥアッセイ条件と同じ公開操作を修飾した（Ｔｏｒｐｈｙら、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７巻、Ｎｏ．３、１７９８−１８０４頁、１９９２）。該アッセイを３０℃で１時間行った。反応を終え、結合したリガンドをブランデル細胞収穫装置を用いて遊離リガンドと分離した。高アフィニティー結合部位についての競合作用を、［３Ｈ］−ｃＡＭＰおよび５’ＡＭＰがないことを除き、低アフィニティーＤＰＥ活性を測定するために使用した条件と同じ条件下で評価した。
【００１９】
実施例２Ｂ
ホスホジエステラーゼ活性の測定
ＰＤＥ活性を供給者（アメルシャム・ライフ・サイエンス）が記載の［３Ｈ］ｃＡＭＰ ＳＰＡまたは［３Ｈ］ｃＧＭＰシンチレーション近接分析（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＰＡ）酵素アッセイを用いてアッセイした。反応を、９６−ウェルプレート上、室温で、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、８．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．７ｍＭ ＥＧＴＡ、［３Ｈ］ｃＡＭＰまたは［３Ｈ］ｃＧＭＰ（略２０００ｄｐｍ／ピコモル）、酵素および種々の濃度の阻害剤を（最終濃度にて）含有する０．１ｍｌの反応緩衝液中で行った。このアッセイを１時間続行し、硫酸亜鉛の存在下で５０μｌのＳＰＡイットリウムシリケートビーズを添加してアッセイを終了した。プレートを振盪し、室温で２０分間放置した。シンチレーション分光測定法により放射性標識した産物の形成を評価した。ＰＤＥ３およびＰＤＥ７の活性を０．０５μＭ［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いて評価したのに対して、ＰＤＥ４を基質として１μＭ［３Ｈ］ｃＡＭＰを用いて評価した。ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１Ｃ、ＰＤＥ２およびＰＤＥ５の活性を基質として１μＭ［３Ｈ］ｃＧＭＰを用いて評価した。
【００２０】
［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合アッセイ
［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合アッセイをシュナイダーおよびその共同研究者らの方法を修飾することにより行った。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、１２巻、１９−２７頁（１９９１）およびＭｃＨａｌｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９巻、１０９−１１３頁（１９９１）を参照のこと。Ｒ−ロリプラムはＰＤＥ４の触媒部位に結合する。Ｔｏｒｐｈｙら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９巻、３７６−３８４頁（１９９１）を参照のこと。したがって、［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム結合についての競合作用は標識されていない競合物質のＰＤＥ４阻害剤の効能の独立した確認を提供する。該アッセイを、３０℃で１時間、（最終濃度の）５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ウシ血清アルブミン、２ｎＭ［３Ｈ］Ｒ−ロリプラム（５．７ｘ１０４ｄｐｍ／ピコモル）および種々の濃度の非放射性標識の阻害剤を含有する０．５μｌの緩衝液中で行った。２．５ｍｌの氷冷反応緩衝液（［３Ｈ］−Ｒ−ロリプラム不含）を添加し、０．３％ポリエチレンイミンに浸したホワットマンＧＦ／Ｂフィルターを通す急速真空濾過（ブランデル・セル・ハーベスター）により反応を停止した。フィルターをさらに７．５ｍｌの冷緩衝液で洗浄し、乾燥し、液体シンチレーション分光測定法により計数した。
【００２１】
実施例３−放出制御した錠剤の調製
放出制御した処方を表に示す成分を用いて調製した。
【表１】
【００２２】
ブレンドおよび圧縮方法
ブレンド方法
賦形剤および薬物をブレンダーの中に入れ、混合した。ついで、ステアリン酸マグネシウムを加え、さらに３分間混合した。ブレンド操作の間、賦形剤および薬物を混合し、スクリーンに通し、再度混合する。
圧縮方法
各々約３５０ｍｇの混合物を打錠する。標的とする打錠強度として１０ｋｐを用いた。
オパドライホワイトを精製水に懸濁させ、その懸濁液を用いて錠剤を被覆し；その被覆操作の間に水を除去し、最終製品の一部を形成させなかった。
【００２３】
実施例４−即時放出錠剤の調製
表２に示す成分を含有する即時放出錠剤を標準的手段により調製した。
【表２】
【００２４】
実施例５−塵肺炎の治療
珪肺症と診断された患者に実施例２に従って調製した３０ｍｇのアリフロを含有する放出制御した錠剤を一日に２回投与する。病理発生の原因である線維形成誘導性化学伝達媒体の放出を処理するのに適当であると顧問医が考える期間、治療を続ける。[0001]
(Technical field)
The present invention relates to compositions and methods for preventing or treating fibrotic diseases by administering a phosphodiesterase 4-specific inhibitor exemplified herein.
[0002]
(Prior art)
Fibroblasts are the primary source of extracellular connective tissue matrix, and the recruitment and activation of these cells appears to play an important role in both wound healing and the development of fibrosis. Drugs capable of blocking fibroblast accumulation could play a therapeutic role in controlling fibrosis. It has now been discovered that certain PDE4 inhibitors play a therapeutic role in regulating fibrosis and fibroproliferative disorders.
[0003]
(Disclosure of the Invention)
The present invention provides a method for administering a PDE4-specific inhibitor to a mammal in need thereof which has a specific cure ratio as defined herein to a patient in need of prevention or treatment of a fibrotic disorder. It relates to a method for preventing or treating a disease.
[0004]
(Best Mode for Carrying Out the Invention)
The contemplated therapies of the present invention include administering a PDE4-specific inhibitor to prevent the onset of a fibrotic disease or to treat a fibrotic disease. These disorders are caused by environmental (infectious / occupational / toxic / traumatic) substances such as scleroderma caused by genetic abnormalities, such as cirrhosis or pulmonary fibrosis or scars after burns. Certain forms of neonatal liver fibrosis due to tissue response to medical intervention, such as restenosis of blood vessels after angioplasty, pulmonary fibrosis after cancer treatment, scarring after eye surgery At the end. Other fibrotic disorders include liver fibrosis and cirrhosis, renal fibrosis, myelofibrosis and keloids; or fibrosis that may result from damage to or injury to cardiac tissue or the cardiovascular system However, the present invention is not limited to these.
[0005]
Pneumoconiosis is a group of diseases characterized by a diffuse fibrotic response in the lungs induced by inhaling fumes and vapors of organic or inorganic particles and chemicals. The pathogenesis of fibrosis is due to the release of fibrogenesis-inducing chemical mediators. For example, coal miners pneumoconiosis, silicosis, asbestosis and bagasse pulmonary disease are examples. Tin, iron and beryllium metal fumes are fibrotic substances.
Fibroblasts are the primary source of extracellular connective tissue matrix, and the recruitment and activation of these cells appears to play an important role in both wound healing and the development of fibrosis. Drugs capable of blocking fibroblast accumulation could play a therapeutic role in controlling fibrosis. PDE4 inhibitors have been found to play a therapeutic role in regulating fibrosis. Also, except for the PDE3 and PDE5 inhibitors, PDE4-specific inhibitors similar to the inhibitors described herein are used to degrade collagen, particularly those due to TNF-α and to stimulate human neutrophil elastase. It was also found to significantly reduce degradation.
[0006]
PDE4-specific inhibitors useful in the present invention are compounds that have been found to inhibit the PDE4 enzyme or have been found to act as PDE4 inhibitors, and are PDE4-only inhibitors, Like PDE4, it is not a compound that inhibits other members of the PDE family. In general, the catalyst form IC 50 of PDEIV of which bind with high affinity and rolipram (rolipram), IC 50 ratio of about 0.1 or greater when divided by the IC 50 of the form that binds rolipram with a low affinity Preferably, a PDE4 antagonist is used.
[0007]
PDE inhibitors, such as theophylline and pentoxifylline, inhibit without distinction all or almost all PDE isozymes in any tissue. Since these compounds indiscriminately inhibit all PDE isoenzyme species in any tissue, they clearly show side effects. While such compounds can effectively treat the targeted disease, there may be other undesirable effects, and if that effect could be avoided or minimized, the overall approach of this method would be The therapeutic effect will be improved to treat certain diseases. For example, clinical trials with rolipram, a selective PDE4 inhibitor developed as an antidepressant, show that rolipram has psychotropic activity but produces gastrointestinal effects such as heartburn, nausea and vomiting .
[0008]
For the purposes of this disclosure, the catalytic site of cAMP that binds R and S rolipram with low affinity is referred to as the “low affinity” binding site (LPED4), and other forms of this catalytic site that bind rolipram with high affinity are referred to as “low affinity” binding sites. Called the "high affinity" binding site (HPDE4). The term "HPDE4" should not be confused with the term "hPDE4" used to indicate human PDE4.
Initial experiments were conducted to and and check establishes [3 H] R- rolipram binding assay. Details of this operation are shown in Example 1 below.
[0009]
To determine whether both high and low affinity binding activities were present in the same gene product, yeast was transformed in a known manner and recombinant PDE4 expression was followed over a 6 hour fermentation period. . Western blot analysis using directional antibodies that antagonize PDE4 showed that PDE expression increased over time and reached a maximum after 3 hours of growth. In addition, more than 90% of the immunoreactive products were in the supernatant treated with the yeast lysate at high speed (100,000 × g). [ 3 H] R-rolipram binding activity and PDE activity were monitored together with protein expression. PDE4 activity appears together with rolipram binding activity, indicating that both functions are present in the same gene product. Similar to the results of Western blot analysis, PDE activity and capable of inhibiting a large rolipram than 85% [3 H] - Rolipram binding activity was found to be present in the yeast supernatant fraction.
[0010]
Overall, most of the recombinant PDE4 expressed in this system is present as LPDE4 and only a small fraction is present as HPDE4. As a result, inhibition of the recombinant PDE4 catalytic activity will primarily reflect the action of the compound on LPDE4. Thus, inhibition of PDE4 catalytic activity can be used as an indicator of a compound's efficacy at LPDE4. Efficacy in HPDE4 compounds may be evaluated by testing its ability to compete for [3 H] R- rolipram. To determine the SAR for both low-affinity and high-affinity rolipram binding sites, the potency of selected compounds was measured in two assay systems. The results from experiments using standard compounds were tabulated. As expected, at the sites where rolipram exhibits high affinity binding when compared to other sites where rolipram is a low affinity binder, certain compounds may compete in competition with [< 3 > H] R-rolipram. Obviously it is more powerful. SAR correlation between high affinity binding and low affinity binding is poor, SAR for inhibiting [3 H] R- rolipram binding with high affinity different from the SAR for binding to the binding site of low affinity rolipram It was concluded.
[0011]
It is now known that there are at least two binding forms of human monocyte recombinant PDE4 (hPDE4) with which the inhibitor interacts. One explanation for these observations is that hPDE4 exists in two different forms. One form binds with high affinity to rolipram and denbuphyrin and the like, while the other binds these compounds with low affinity. Preferred PDE4 inhibitors for use in the present invention are compounds having beneficial healing ratios, ie, compounds that preferentially inhibit cAMP catalytic activity, which bind rolipram with low affinity and thus bind rolipram to rolipram. Side effects that would be associated with inhibition of the high affinity binding form will be reduced. In other words, a preferred compound is about 0.1 or more when the IC 50 for the PDEIV catalytic form that binds rolipram with high affinity divided by the IC 50 for the form that binds rolipram with low affinity. It has an IC 50 ratio.
[0012]
A further refinement of this criterion is that PDE4 inhibitors have an IC 50 ratio of about 0.1 or greater; that ratio is that 1 nM [ 3 H] R-rolipram has high affinity for rolipram with high affinity. One form of PDEIV catalytic activity, in which rolipram binds with low affinity using 1 μM [ 3 H] -cAMP as a substrate, has an IC 50 value for competing with binding to one form of PDE4 that binds to The ratio to the IC 50 for inhibiting. A further description of this test can be found in co-pending U.S. Patent No. 5,998,428, the contents of which are essential for practicing the invention, the text of which is hereby incorporated by reference. Department.
[0013]
Most preferred are PDE4 inhibitors having an IC 50 ratio of greater than 0.5, especially compounds having a ratio of greater than 1.0. A preferred compound is cis-4-cyano-4- (3-cyclopentyloxy-4-methoxyphenyl) cyclohexane-1-carboxylic acid (Ariflo®). In addition, the following PDE4 inhibitors: AWD-12-281 from Astra (Hofgen, N., et al., 15th EFMC Int Symp Med Chem (September 6-10, Edinburgh) 1998, Abstract 98). A 9-benzyladenine derivative (INSERM), designated NCS-613; D-4418 from Chiloscience and Schering-Plough; a benzodiazepine PDE4 inhibitor identified as CI-1018; (PD-168787; Parke-Davis / Warner-Lambert); a benzodioxole derivative of Kyowa Hakko as disclosed in WO9916766; from Napp. V-11294A (Landells, LJ. Et al., Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (September 19 to 23, Genoa) 1998] 1998, 12 (Suppl. 28): Abstract 2393); Roflumilast ( CAS reference number 162401-32-3) and phthalazinone (WO9947475) (derived from Byk-Gulden); or a compound identified as T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al., J Pharmacol Exp Ther). , 1998, 284 (1): 162) are also useful in the practice of the present invention.
[0014]
Proper administration results in amelioration of a clinical disease, in particular in reducing or reducing the size of fibrocellular scar tissue or reducing its secreted products, such as the level of procollagen peptide in serum. Anatomically locating the fibroproliferative scar tissue to be treated is the single most important determinant for the method of administration and pharmaceutical preparation of these compounds. Liver fibrosis and cirrhosis require orally active compounds that leave the stomach and are rapidly extracted by the liver from the hilar blood. Pulmonary fibrosis, on the other hand, is more directly treated by intravenously administered drugs, or combines inhalation of aerosolized compounds, but with certain PDE4-specific inhibitors in the treatment of pulmonary fibrosis. Can be administered. Vascular restenosis or skin scarring can be treated by topical application methods.
[0015]
The compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts that are active when administered orally can be formulated as syrups, tablets, capsules, controlled release formulations or lozenges. A syrup formulation will generally consist of a suspension or solution of the compound or salt in a liquid carrier, eg, ethanol, peanut oil, olive oil, glycerin or water, containing a flavoring or coloring agent. When the composition is in the form of a tablet, pharmaceutical carriers routinely used for preparing solid formulations can be used. Such carriers include, for example, magnesium stearate, terra alba, talc, gelatin, acacia, stearic acid, starch, lactose and sucrose. Where the composition is in the form of a capsule, any conventional encapsulation is suitable, for example using the aforementioned carriers in a hard gelatin capsule shell. When the composition is in the form of a capsule in soft gelatin capsule shell, consider any pharmaceutical carrier routinely used to prepare dispersions or suspensions, such as aqueous gums, celluloses, silicates or oils. , They can be incorporated into soft gelatin capsule shells.
[0016]
A typical parenteral composition is a sterile aqueous or optionally parenterally acceptable oil of a compound or salt, for example polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, lecithin, peanut oil or sesame oil. Consists of a solution or suspension in a non-aqueous carrier.
A typical composition for inhalation is as a dry powder or using a conventional propellant, for example a fluorinated hydrocarbon such as trichlorofluoromethane. Preferably, the composition of the PDE4 inhibitor is a unit such as a tablet or capsule. It is a form or controlled release preparation.
The active ingredient can be administered 1 to 6 times daily in an amount sufficient to exhibit the desired activity. Preferably, the active ingredient is administered about once or twice a day, more preferably twice a day.
For the dosage of the drug, it is expected that the PDE4 inhibitor will be administered in an amount of 1 to 200 mg per adult per day.
Next, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
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(Example)
Example 1
Cis 4-cyano-4- (3-cyclopentyloxy-4-methoxyphenyl) cyclohexane-1-carboxylic acid (Ariflo®), a phosphodiesterase 4 inhibitor that attenuates the chemotaxis of fibroblasts using Aliflo Can reduce the chemotaxis of fibroblasts towards the chemotactic factor fibronectin. Since the activity of the PDE4 inhibitor should depend on endogenous cyclic AMP levels, the experiment was designed to determine whether the production of endogenous prostaglandins renders cells sensitive to the effects of alifl. To do this, human fetal lung fibroblasts were cultured and, after reaching confluence, were incubated with and without indomethacin (2 × 10 −6 M) for 60 minutes to inhibit cyclooxygenase. The fibroblasts were then subjected to trypsinization and placed in the upper part of the chemotaxis chamber of a Boyden blind well. Fibronectin, 20 μg / ml, was placed at the bottom of the chamber as a chemotactic factor. Indomethacin (2 × 10 −6 M) was added to the top of the chemotaxis chamber. Indomethacin alone caused a slight but variable stimulation of chemotaxis (159 ± 33% compared to control, p <0.05). Aliflo added to control fibroblasts inhibited chemotaxis in a concentration-dependent manner. In three separate experiments, the concentration of Aliflo required to inhibit chemotaxis by 50% was 4.9 ± 2.5 μg / ml. In the presence of indomethacin, only aliflo, tested at a high concentration of 10 μg / ml, inhibited chemotaxis, reducing the response to 58.7 ± 21.0% of control compared to indomethacin (p <0.005). Reduced. Thus, in this experiment, the PDE4 inhibitor aliflo is dependent, at least in part, on endogenous cyclooxygenase activity, and possibly PGE production, to exert an inhibitory effect on fibroblast chemotaxis. It was revealed. The fact that Aliflo is active even in the presence of indomethacin suggests that another mechanism that stimulates cyclic AMP also plays a role. Since cyclooxygenase activity and prostaglandin production can be regulated by various mediators in an inflammatory environment, fibroblasts in such an environment may be particularly susceptible to the inhibitory effects of alifl. Such effects are of therapeutic value in fibrotic disorders.
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Example 2-Phosphodiesterase and rolipram binding assay Example 2A
The isolated human monocytes PDE4 and hrPDE (human recombinant PDE4) were determined to be present primarily in a low affinity form. Thus, the activity of test compounds on the low affinity form of PDE4 can be assessed in a standard assay for PDE4 catalytic activity using 1 μM [ 3 H] cAMP as a substrate (Torphy et al., J. of Biol. Chem. , 267, No. 3, pp. 1798-1804, 1992).
Using the supernatant obtained by rapidly processing rat brain as a protein source, both enantiomers of [ 3 H] -rolipram having a specific activity of up to 25.6 Ci / mmol were prepared. Standard assay conditions were the same as the PDE assay conditions, except for the final cAMP, which was 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 and 1 nM [ 3 H] -Rolipram (Torphy et al. , J. of Biol. Chem., 267, No. 3, pp. 1798-1804, 1992). The assay was performed at 30 ° C. for 1 hour. After the reaction was completed, the bound ligand was separated from the free ligand using a Brandel cell harvester. Competition for high affinity binding sites was evaluated under the same conditions used to measure low affinity DPE activity except for the absence of [< 3 > H] -cAMP and 5'AMP.
[0019]
Example 2B
Suppliers measure PDE activity of phosphodiesterase activity (Amersham Life Sciences) was assayed using a [3 H] cAMP SPA or [3 H] cGMP scintillation proximity assay (scintillation proximity analysis) (SPA) enzyme assay described. Reactions were performed on a 96-well plate at room temperature at room temperature with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8.3 mM MgCl 2 , 1.7 mM EGTA, [ 3 H] cAMP or [ 3 H] cGMP (approximately 2000 dpm / picomolar). , Enzyme and various concentrations of inhibitor (at final concentration) in 0.1 ml reaction buffer. The assay was continued for 1 hour and the assay was terminated by the addition of 50 μl SPA yttrium silicate beads in the presence of zinc sulfate. The plate was shaken and left at room temperature for 20 minutes. The formation of radiolabeled product was assessed by scintillation spectroscopy. PDE3 and activity of PDE7 whereas was assessed using 0.05μM [3 H] cAMP, it was evaluated using 1μM [3 H] cAMP to PDE4 as a substrate. The activity of PDE1B, PDE1C, PDE2 and PDE5 was evaluated using 1 μM [ 3 H] cGMP as a substrate.
[0020]
[ 3 H] R-Rolipram Binding Assay [ 3 H] R-rolipram binding assay was performed by modifying the method of Schneider and coworkers. Nicholson et al., Trends Pharmacol. Sci. 12, Vol. 19-27 (1991) and McHale et al., Mol. Pharmacol. 39, 109-113 (1991). R-Rolipram binds to the catalytic site of PDE4. Torphy et al., Mol. Pharmacol. 39, 376-384 (1991). Thus, competition for [ 3 H] R-rolipram binding provides an independent confirmation of the potency of the unlabeled competitor PDE4 inhibitor. The assay was performed at 30 ° C. for 1 hour at 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 0.05% bovine serum albumin, 2 nM [ 3 H] R-rolipram (5.7 × 10 4). dpm / picomolar) and 0.5 μl of buffer containing various concentrations of non-radioactive inhibitor. 2.5 ml of ice-cold reaction buffer (without [ 3 H] -R-rolipram) was added and rapid vacuum filtration through Whatman GF / B filters soaked in 0.3% polyethyleneimine (Brandel Cell. (Harvester). The filters were washed with an additional 7.5 ml of cold buffer, dried and counted by liquid scintillation spectroscopy.
[0021]
Example 3-Preparation of a controlled release tablet A controlled release formulation was prepared using the ingredients shown in the table.
[Table 1]
[0022]
Blending and Compression Method Blending Method The excipient and drug were placed in a blender and mixed. Then, magnesium stearate was added and mixed for another 3 minutes. During the blending operation, the excipient and drug are mixed, passed through a screen, and mixed again.
Compression methods Approximately 350 mg of the mixture is tabletted each. 10 kp was used as the target tableting strength.
Opadry white was suspended in purified water and the suspension was used to coat tablets; water was removed during the coating operation and did not form part of the final product.
[0023]
Example 4 Preparation of Immediate Release Tablets Immediate release tablets containing the ingredients shown in Table 2 were prepared by standard means.
[Table 2]
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Example 5-Treatment of pneumo pneumonia A patient diagnosed with silicosis is dosed twice daily with a controlled release tablet containing 30 mg of Aliflo prepared according to Example 2. Treatment is continued for as long as the consulting physician considers appropriate to address the release of the fibrogenesis-inducing chemical transfer medium responsible for the pathogenesis.
