JP2004502418A

JP2004502418A - 新規の線維芽細胞増殖因子およびそれをコードする核酸

Info

Publication number: JP2004502418A
Application number: JP2002507876A
Authority: JP
Inventors: ジェファーズ，　マイケル; シムケッツ，　リチャード　エイ．; プラヤガ，　サンドヒルダス　ケイ．; ボルドッグ，　フェレンク　エル．; ヤン，　メイシャ; バーゲス，　キャサリン; フェルナンデス，　エルマ; ハーマン，　ジョン　エル．; ラロシェル，　ウィリアム　ジェイ．; リチェンステイン，　ヘンリ
Original assignee: キュラジェン　コーポレイション
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2004-01-29
Also published as: AU7181101A; WO2002002625A3; EP1297012A2; CA2415123A1; AU2001271811B2; WO2002002625A2

Abstract

本発明は、新規の単離されたポリペプチドおよびこれらをコードするポリヌクレオチドを提供し、これらのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、またはこれらのポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体の、任意の誘導体、改変体、変異体もしくはフラグメントを提供する。本発明はさらに、これらのポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を、広い範囲の病理学的状態の検出および処置に利用する方法、ならびに他の使用を提供する。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸およびポリペプチドに関連する。本発明は、より詳細には、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーに関連するポリペプチドをコードする核酸に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
サイトカインの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の群としては、多岐にわたる細胞性機能（例えば、増殖、生存、アポトーシス、運動性、および分化）を調節する、少なくとも２１のメンバーが挙げられる。これらの分子は、細胞表面チロシンキナーゼＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）との高い親和性の相互作用を介してシグナルを形質導入する。これらのＦＧＦレセプターは、組織培養物中のほとんどの細胞型において発現される。リガンド結合の際のＦＧＦレセプターモノマーの二量体化は、レセプターリン酸基転移に導く、キナーゼドメインの活性化に不可欠なものであると報告されている。ＦＧＦレセプター−１（ＦＧＦＲ−１）は、４つのＦＧＦレセプターのうちで最も広範な発現パターンを示し、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を備える。多くのシグナル伝達分子が、これらのリン酸化部位に異なる親和性で結合することによって影響を受ける。
【０００３】
正常な増殖および発生に関与することに加えて、公知のＦＧＦはまた、癌を含む病理状態の発生にも関連する。ＦＧＦは、腫瘍細胞の増殖を直接的に増大することによって悪性疾患に寄与し得る。例えば、同じ細胞中でのＦＧＦとＦＧＦＲとの同時発現を介するオートクライン増殖刺激は、細胞形質転換に至ることが報告されている。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーに対して相同性を有する新規のポリペプチドをコードする核酸の発見に、部分的に基づく。線維芽細胞増殖因子−ＣＸ（ＦＧＦ−ＣＸ）と呼称されるポリヌクレオチド配列が本発明に包含され、そしてその核酸配列にコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体が、本発明において特許請求される。ＦＧＦ−ＣＸ核酸の例は、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）１であり、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの例は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。このアミノ酸配列は、配列番号１の核酸配列にコードされる。
【０００５】
１局面において、本発明は、単離されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、この単離されたポリペプチドは、配列番号２または配列番号２７のアミノ酸を含む。他の実施形態において、本発明は、配列番号２の改変体を含み、この改変体において、いくつのアミノ酸残基（例えば、配列番号２または配列番号２７のアミノ酸配列のうちの１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、１０％以下、または１５％以下）が、変更される。いくつかの実施形態において、この単離されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドとしては、配列番号２または配列番号２７で与えられるアミノ酸配列の成熟形態のアミノ酸配列、または配列番号２または配列番号２７で与えられるアミノ酸配列の成熟形態の改変体が挙げられる。好ましくは、配列番号２または配列番号２７のアミノ酸配列のうちの１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、１０％以下、または１５％以下が、このアミノ酸配列の成熟形態の改変体において変更される。
【０００６】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメントが、本発明に包含され、このフラグメントは、改変体ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの改変体、ならびにＦＧＦ−ＣＸ核酸の対立遺伝子改変体および一塩基多型（ＳＮＰ）にコードされるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメントを含む。
【０００７】
別の局面において、本発明は、単離されたＦＧＦ−ＣＸ核酸分子を含む。ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子は、上記のＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ＦＧＦ−ＣＸ改変体、またはＦＧＦ−ＣＸフラグメントのいずれかをコードする配列、またはこのような核酸配列に対する相補体を含み得る。１実施形態において、この配列は、配列番号１に開示された配列を含む。他の実施形態において、この配列は、配列番号２６に開示された配列を含む。さらに他の実施形態において、このＦＧＦ−ＣＸ核酸は、配列番号１または配列番号２６で与えられた配列とは異なるヌクレオチドが組み込まれ得る配列を含む。好ましくは、これらのヌクレオチドのうちの１％以下、２％以下、３％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下または２０％以下が、そのように変更される。他の実施形態において、本発明は、これらの核酸配列のフラグメントまたは相補体を含む。ＦＧＦ−ＣＸ核酸を組み込む、ベクターおよび細胞もまた、本発明に包含される。
【０００８】
本発明はまた、本明細書中に記載のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのいずれかに免疫特異的に結合する抗体を含む。種々の実施形態におけるＦＧＦ−ＣＸ抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および／またはヒト抗体が挙げられる。
【０００９】
本発明は、さらに、本発明の、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ＦＧＦ−ＣＸ核酸、またはＦＧＦ−ＣＸ抗体を含有する薬学的組成物を提供する。本発明にまた含まれるものは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、ＦＧＦ−ＣＸ核酸、またはＦＧＦ−ＣＸ抗体を含むキットである。
【００１０】
いくつかの方法が、本発明に含まれる。例えば、サンプル中の本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの存在または量を決定するための方法が開示される。この方法は、このサンプルを、このポリペプチドに免疫特異的に結合するＦＧＦ−ＣＸ抗体と接触させる工程；およびこのポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、その結果、この抗体が、このサンプル中のポリペプチドの存在または量を示す工程を包含する。
【００１１】
同様に、本発明は、サンプル中のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の存在または量を決定するための方法を開示する。この方法は、このサンプルを、この核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；およびこの核酸分子に結合した抗体の存在または量を決定し、その結果、このプローブが、このサンプル中のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の存在または量を示す工程を包含する。
【００１２】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合する薬物を同定するための方法がまた、本発明によって提供される。この方法は、候補物質が、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を包含する。候補物質との結合は、この薬物がＦＧＦ−ＣＸポリペプチド結合剤であることを示す。
【００１３】
本発明はまた、病状を処置する用途の潜在的治療剤を同定するための方法を包含する。この病状は、例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの、異常発現、異常プロセシング、または異常な生理学的相互作用に関連する。この方法は、以下の工程を包含する：ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを発現し、そしてこのポリペプチドに起因する特性また機能を有する細胞を提供する工程；この提供された細胞を候補物質を含む組成物に接触させる工程；およびコントロール細胞と比較してこの物質がこのポリペプチドに起因する特性または機能を変更するか否かを決定する工程。任意のこのような物質が、潜在的治療剤として同定される。さらに、治療剤は、このように同定された任意の潜在的治療剤をさらなる試験に供し、この病状を処置する用途のための治療剤を同定することによって、同定され得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、この特性または機能が、細胞増殖（ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ）または細胞増殖（ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関連し、そしてこの物質は、このポリペプチドに結合し、これによって、このポリペプチドの活性を調節する。いくつかの実施形態において、この候補物質は、約１５００Ｄａを超えない分子量を有している。いくつかの実施形態において、この候補物質は、抗体である。本発明は、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して同定される任意の治療剤を提供する。
【００１５】
本発明のさらに重要な局面は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに関連する障害を処置または予防する方法に関連する。この障害は、細胞もしくは組織の不充分もしくは非効率的な増殖、または細胞もしくは組織の過形成もしくは新形成によって特徴付けられる。この方法は、被験体の障害を処置または予防するのに十分な量および持続時間で、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたは本発明のＦＧＦ−ＣＸ核酸あるいは本発明の任意の他の治療剤を、この被験体に投与する工程を包含する。重要な実施形態において、この被験体はヒトである。
【００１６】
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの、異常発現、異常プロセシング、または異常な生理学的相互作用に関連する障害に対する潜伏期または素因の調節因子についてスクリーニングする方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを組換えによって発現し、そして障害に対する危険性が増大した試験動物を提供する工程；試験化合物をこの試験動物に投与する工程；この化合物を投与した後の試験動物におけるこのポリペプチドの活性を測定する工程；および試験動物におけるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの活性と、この化合物が投与されていないコントロール動物におけるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの活性とを比較する工程。このコントロール動物に対して、この試験動物におけるこのポリペプチドの活性に変化が存在する場合、この試験化合物は、この障害の潜伏期または素因の調節因子である。
【００１７】
本発明はまた、第一の哺乳動物被験体における本発明の、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはＦＧＦ−ＣＸ核酸のレベルの変更と関連する疾患の存在またはそれに対する素因を決定する方法を提供する。本方法は、以下の工程を包含する：第一の哺乳動物被験体由来のサンプル中における、このポリペプチドの発現レベルまたは核酸の量を測定する工程；およびサンプル中のその量と、この疾患に罹患していないか、またはこの疾患に罹患する傾向を有していないことが既知の第二の哺乳動物被験体由来コントロールサンプル中に存在する量とを比較する工程。コントロールサンプルと比較した場合の、第一の被験体中の、このポリペプチドの発現レベルまたは、この核酸の量のレベルにおける変更は、この疾患の存在またはこの疾患に対する素因を示す。
【００１８】
哺乳動物における病状を処置するための方法が、本発明によってまた提供され、ここで、この病状は、本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの、異常発現、異常プロセシング、または異常な生理学的相互作用に関連する。この方法は、この病状を緩和するのに十分な量の本発明のポリペプチドをこの哺乳動物に対して投与する工程を包含し、ここで、このＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、配列番号２また配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性なフラグメントに、少なくとも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらに９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。別の関連する方法において、本発明の抗体は、哺乳動物に対して投与される。
【００１９】
別の局面において、本発明は、被験体における細胞の増殖を促進する方法を含む。この方法は、細胞増殖を促進するのに効果的な量および持続時間で本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この被験体はヒトであり、そして増殖が促進される細胞は、創傷の周辺の細胞、血管系の細胞、造血に関連する細胞、赤血球生成に関連する細胞、胃腸管の上皮における細胞、および毛包の細胞から選択され得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、被験体における細胞増殖を阻害する方法を提供し、ここで、この増殖は本発明のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの発現に関連する。この方法は、細胞増殖を阻害する組成物を被験体に投与する工程を包含する。大変重要な実施形態において、この組成物は、本発明の抗体または別の治療剤を含有する。注目に値すべきは、被験体はヒトであり、そして増殖が阻害される細胞は、形質転換された細胞、過形成性の細胞、腫瘍細胞、および新生細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｃｅｌｌ）から選択される。
【００２１】
なおさらなる局面において、本発明は、組織増殖関連障害を処置または予防または遅延する方法を提供する。この方法は、被験体における、組織増殖関連障害を処置、予防、または遅延するのに十分な量で、ＦＧＦ−ＣＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはＦＧＦ−ＣＸ抗体を、このような処置または予防または遅延が所望される被験体に投与する工程を包含する。
【００２２】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸分子、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはＦＧＦ−ＣＸ抗体を使用して、診断、処置、予防、または遅延される、組織増殖関連障害は、上皮細胞（例えば、外科手術後の眼の前方部の（ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｅｙｅ）における線維芽細胞およびケラチノサイト）を含み得る。他の組織増殖関連障害としては、例えば、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病、カポジ肉腫、の合併症および慢性関節リウマチが挙げられる。
【００２３】
別段規定されない限り、本明細書中に使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有す。本発明に記載されるような方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および参考文献は、それらの全体が参考として援用される。対立する場合は、本発明の明細書（定義を含む）が統制する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的であるのみで、限定を意図しない。
【００２４】
本発明の他の特徴および利益は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規のＦＧＦ−ＣＸ核酸配列の発見に、部分的に基づき、この配列は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする。本明細書中で使用される場合、表示「ＦＧＦ−ＣＸ」とは、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、およびこれらのうちの任意の、改変体、誘導体、およびフラグメント、ならびにこれらのクラスの化合物に免疫特異的に結合する抗体をいう。
【００２６】
ＦＧＦファミリーの以前に記載されたメンバーは、様々な細胞機能（例えば、増殖、生存、アポトーシス、運動性および分化）を調節する（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ，Ｇ．およびＦａｌｌｏｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８５、４５−１０６）。これらの分子は、細胞表面のチロシンキナーゼＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）との高い親和性の相互作用を介して、シグナルを細胞内に伝達し、これらのうち４つは、現在までに同定されている（Ｘｕ，Ｘ．、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．、Ｌｉ，Ｃ．およびＤｅｎｇ，Ｃ．（１９９９）Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ．２９６、３３−４３；Ｋｌｉｎｔ，Ｐ．およびＣｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．（１９９９）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４、１６５−１７７）。これらのＦＧＦレセプターは、組織培養物中のほとんどの細胞型で発現される。リガンドの結合に際したＦＧＦレセプター単量体の二量体化は、キナーゼドメインの活性化に必要であり、レセプターのトランスリン酸化を生じることが報告されている。４つのＦＧＦレセプターの中で最も広い発現パターンを示すＦＧＦレセプター−１（ＦＧＦＲ−１）は、少なくとも７つのチロシンリン酸化部位を含む。多数のシグナル伝達分子は、これらのリン酸化部位に対して、異なる親和性で結合することによって影響される。
【００２７】
ＦＧＦはまた、低い親和性にもかかわらず、ほとんどの細胞表面および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に存在するヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。ＦＧＦとＨＳＰＧとの間の相互作用は、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ相互作用を安定化し、そしてＦＧＦを隔離しそしてこれらを分解から保護するように働く（Ｓｚｅｂｅｎｙｉ，Ｇ．およびＦａｌｌｏｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９９））。その増殖促進能力に起因して、ＦＧＦファミリーの１つのメンバーであるＦＧＦ−７は、現在、化学療法誘導された粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）の処置のための臨床試験中である（Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ，Ｄ．Ｍ．（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７、６４−７１）。
【００２８】
正常な増殖および発達に関与することに加えて、既知のＦＧＦはまた、病理学的状態（癌を含む）の発生に関係した（Ｂａｓｉｌｉｃａ，ＣおよびＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．（１９９２）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５９、１１５−１６５）。ＦＧＦは、腫瘍細胞の増殖を直接増強することによって、悪性疾患に寄与し得る。例えば、同じ細胞におけるＦＧＦおよびＦＧＦＲの同時発現を介したオートクライン増殖刺激は、細胞の形質転換を生じる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｓ．、Ｈａｂａｓｈｉｔａ，Ｊ．、Ｎｏｍｕｒａ，Ｃ．、Ｋｕｒｏｓｈｉｍａ，Ｋ．およびＫｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７１、４４２−４５０）。同様に、変異誘発または再編成を介したＦＧＦＲの構成的活性化は、制御されない増殖を生じる（Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｍ．、Ｈｏｒｉｉ，Ｙ．、Ｙａｍａｎａｋａ，Ｒ．、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｋ．およびＭｉｋｉ，Ｔ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３、８９５６−８９６１；Ｌｉ，Ｙ．、Ｍａｎｇａｓａｒｉａｎ，Ｋ．、Ｍａｎｓｕｋｈａｎｉ，Ａ．およびＢａｓｉｌｉｃｏ，Ｃ．（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１４、１３９７−１４０６）。さらに、いくつかのＦＧＦは、脈管形成性である（Ｇｅｒｗｉｎｓ，Ｐ．、Ｓｋｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．およびＣｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，Ｌ．（２０００）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４、１８５−１９４）。このようなＦＧＦは、腫瘍増殖の維持のために必要な血液供給の発達を容易にすることによって、腫瘍形成プロセスに寄与し得る。驚くことではないが、少なくとも１つのＦＧＦは、現在、癌治療の潜在的な標的として調査中である（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，Ｇ．（１９９９）Ｄｒｕｇｓ　５８，１７−３８）。
【００２９】
出生時および成体のマウスの脳におけるＦＧＦおよびそれらのレセプターの発現が、試験されている。ＦＧＦ−４以外の全てのＦＧＦ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡは、これらの組織において検出される。ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７およびＦＧＦ−８遺伝子は、出生後の段階よりも後期胚段階におけるより高い発現を実証し、これらのメンバーが、脳発達の後期段階に関与することを示唆する。対照的に、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−５の発現は、誕生後に増大した。特に、出生時のマウスにおけるＦＧＦ−６の発現は、胚の発達中の大脳での強いシグナル、５日齢の新生仔の小脳での強いシグナルを伴って、中枢神経系および骨格筋に限定されていることが報告されている。ＦＧＦ−６の同族のレセプターであるＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）−４は、類似の時空間的発現を実証し、ＦＧＦ−６およびＦＧＦＲ−４が、リガンド−レセプター系として、神経系の成熟において重要な役割を果たすことを示唆する。Ｏｚａｗａらに従って、これらの結果は、種々のＦＧＦおよびそれらのレセプターが、脳の種々の発達プロセス（例えば、神経前駆体細胞の増殖および移動、神経分化およびグリア分化、神経突起伸長ならびにシナプス形成）の調節に関与することを強く示唆する。
【００３０】
別のＦＧＦファミリーメンバーであるグリア活性化因子（ＧＡＦ）は、ヒトグリオーマ細胞株の培養物上清から精製されたヘパリン結合増殖因子である。Ｍｉｙａｍｏｔｏら、１９９３、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１３（７）：４２５１−４２５９を参照のこと。ＧＡＦは、他の既知の増殖因子とは僅かに異なる活性範囲を示し、そしてＦＧＦ−９と称される。ヒトＦＧＦ−９　ｃＤＮＡは、２０８アミノ酸のポリペプチドをコードする。ＦＧＦファミリーの他のメンバーとの配列類似性は、約３０％と概算された。他のファミリーメンバーにおいて見出された２つのシステイン残基および他のコンセンサス配列もまた、ＦＧＦ−９配列に十分保存されていた。ＦＧＦ−９は、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦに見出されるように、Ｎ末端の代表的なシグナル配列を有さないことが見出された。
【００３１】
酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦは、従来の様式で細胞から分泌されないことが知られている。しかし、ＦＧＦ−９は、代表的なシグナル配列を欠くにもかかわらず、ｃＤＮＡがトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から効率的に分泌されることが見出された。これは、この細胞の培養培地中で排他的に検出され得た。この分泌されたタンパク質は、開始メチオニンを除いて、ｃＤＮＡ配列によって予測された残基に対して、Ｎ末端のアミノ酸残基を欠かなかった。ラットＦＧＦ−９　ｃＤＮＡもまたクローニングされ、そして構造分析は、ＦＧＦ−９遺伝子が高度に保存されていることを示した。
【００３２】
本発明は、新規ヒトＦＧＦおよびその対応するｃＤＮＡを提供する。この遺伝子のタンパク質産物は、増殖刺激および腫瘍形成特性を示すことが示された。さらに、ＦＧＦ　ｍＲＮＡの過剰発現は、特定の癌細胞株において注目された。これらの観察は、新規ＦＧＦが、ヒト悪性疾患の処置において優れた標的として働くことによって、使用され得ることを示唆する。
【００３３】
本発明はまた、成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの改変体、成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび成熟改変体ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメント、ならびにこれらのポリペプチドおよびフラグメントをコードする核酸を含む。本明細書中で使用される場合、本発明に開示されるＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドあるいは前駆体形態またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、非限定的な例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。いくつかの実施形態において、成熟形態は、本明細書中で記載されるオープンリーディングフレームによってコードされる、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質を含む。産物「成熟」形態は、遺伝子産物が生じる細胞、または宿主細胞中で発生し得る場合、１以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として発生し得る。
【００３４】
「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質を生じるそのようなプロセシング工程の例としては、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンである）を有する、ＦＧＦ−ＣＸ前駆体ポリペプチドまたは前駆体タンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に、残存する残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が、切断される）を有する、前駆体ポリペプチドまたは前駆体タンパク質から生じる成熟形態は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに、「成熟」タンパク質またはフラグメントは、開始メチオニンの除去またはシグナルペプチドの除去以外の切断事象から生じ得る。さらに本明細書中に使用される場合、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解切断事象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般的に、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質は、これらのプロセスのうちの１つのみ、またはこれらのいずれかの組み合わせの操作から生じ得る。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「同一な」残基は、２つの配列のアラインメント中の等価なヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同じ残基である場合、２つの配列間の比較においてこれらの残基に対応する。あるいは、残基は、アラインメントにおける２つの配列間の比較が、比較における等価な位置の残基が、以下に定義されるような同じアミノ酸または保存されたアミノ酸のいずれかであることを示す場合、「類似」または「ポジティブ」として記載される。
【００３６】
ＦＧＦ−ＣＸ核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドまたはその一部をコードする単離された核酸、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、これらの核酸を含むベクター、ＦＧＦ−ＣＸ核酸を用いて形質転換された宿主細胞、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体および薬学的組成物が、本発明の範囲内に含まれる。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを作製する方法、ならびにこれらの化合物を使用して状態をスクリーニング、診断、処置する方法、およびＦＧＦ−ＣＸポリペプチド活性を調節する化合物をスクリーニングする方法もまた開示される。以下の表１は、本発明全体を通して使用される配列記述子を描写する。
【００３７】
表１
配列番号　　　　配列記述子
１　　　　　　　ヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列
２　　　　　　　ヒトＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列
３　　　　　　　ＦＧＦ−ＣＸ順方向プライマー
４　　　　　　　ＦＧＦ−ＣＸ逆方向プライマー
５　　　　　　　グリア活性化因子（ＧＡＦ）
６　　　　　　　ヒトゲノムフラグメント−ｂｐ　１５９２７−１６２１４
７　　　　　　　ヒトゲノムフラグメント−ｂｐ　７２５７−７５１１
８　　　　　　　ヒトゲノムフラグメント−ｂｐ　９８３７−９９４２
９　　　　　　　ヒトＦＧＦ−９
１０　　　　　　マウスＦＧＦ−９
１１　　　　　　ラットＦＧＦ−９
１２　　　　　　Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＦＧＦ−ＣＸ
１３　　　　　　ヒトＦＧＦ−ＣＸ疎水性ドメイン（ａａ９０−１１５）
１４　　　　　　ＰＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ順方向
１５　　　　　　ＰＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ逆方向
１６　　　　　　ＰＳＥＴＡリンカー
１７　　　　　　ＰＳＥＴＡリンカー
１８　　　　　　ＴａｑＭａｎ発現分析順方向プライマー
１９　　　　　　ＴａｑＭａｎ発現分析逆方向プライマー
２０　　　　　　ＴａｑＭａｎ発現分析プローブ
２１　　　　　　ＴａｑＭａｎ発現分析順方向プライマー
２２　　　　　　ＴａｑＭａｎ発現分析逆方向プライマー
２３　　　　　　ＴａｑＭａｎ発現分析プローブ
２４　　　　　　ＰＣＲオリゴヌクレオチド
２５　　　　　　ＰＣＲオリゴヌクレオチド
２６　　　　　　繊維芽細胞増殖因子−２０様ポリヌクレオチド配列
２７　　　　　　繊維芽細胞増殖因子−２０様ポリペプチド配列。
【００３８】
本明細書中で考察されるＦＧＦ−ＣＸ核酸およびポリペプチド、ならびにＦＧＦ−ＣＸ抗体、治療剤および薬学的組成物は、組織増殖関連の障害を処置する際に特に有用である。これらの組織増殖関連の障害としては、上皮細胞に影響を与える障害（例えば、手術後の眼の前方の繊維芽細胞およびケラチノサイト）が挙げられ得る。他の組織増殖関連の障害としては、例えば、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病合併症、カポージ肉腫および慢性関節リュウマチが挙げられる。
【００３９】
繊維芽細胞増殖因子−２０Ｘ（ＦＧＦ−ＣＸ）と称される新規繊維芽細胞増殖因子をコードするヌクレオチド配列（配列番号１および配列番号２６）が、本発明に含まれる。図１は、配列番号１によって記載されるＦＧＦ−ＣＸを示す。このコード配列は、ヒトゲノムＤＮＡ配列において同定された。この開示されたＤＮＡ配列は、２１１アミノ酸残基を有することが予測されたポリペプチド（配列番号２）をコードする、６３３塩基を有する。図１および配列番号２に示される配列に基づいた、ＦＧＦ−ＣＸの予測された分子量は、２３４９８．４Ｄａである。
【００４０】
このＦＧＦ−ＣＸ核酸配列を、ＢＬＡＳＴＮ検索において問い合わせヌクレオチド配列として使用して、関連の核酸配列を同定した。このＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列は、マウス繊維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ−９）（５４３塩基のうち３２９塩基同一、すなわち７２％；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ８２０２３）およびグリア活性化因子（ＧＡＦ）をコードするヒトＤＮＡ（５５４塩基のうち３８５塩基同一、すなわち６９％；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｅ０５８２２、ＦＧＦ−９とも称される）に対して、高い類似性を有する。さらに、ＦＧＦ−ＣＸは、Ｎａｒｕｏら、日本国特許：ＪＰ１９９３３０１８９３、表題「Ｇｌｉａ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」によって開示されたＧＡＦ配列（配列番号５）に対して、匹敵する同一性の程度（４２４塩基のうち３１１塩基同一、すなわち７３％）を有することが見出された（図２を参照のこと）。
【００４１】
ゲノム採掘（ｍｉｎｉｎｇ）によって同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が正しいことを確認するため、ＰＣＲ増幅を使用して予測されたゲノムクローンに対応するｃＤＮＡを獲得した。獲得された産物のヌクレオチド配列は、予測された遺伝子の配列と正確に一致する（実施例１を参照のこと）。
【００４２】
このｃＤＮＡによってコードされたタンパク質は、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＦＧＦ−２０Ｘ（本明細書中でＸＦＧＦ−ＣＸまたはＸＦＧＦ−２０Ｘと称される）ならびにヒトＦＧＦ−９およびヒトＦＧＦ−１６に、最も密接に関連する（それぞれ、８０％、７０％および６４％のアミノ酸同一性；図４および５を参照のこと）。ＸＦＧＦ−ＣＸとの強い相同性に基づき、本発明の開示において同定された遺伝子は、そのヒトオルソログを示すと考えられ、そして本明細書中でＦＧＦ−ＣＸと称される。
【００４３】
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号２）の最初の２０８アミノ酸の、ヒトＦＧＦ−９（配列番号９）とのＢＬＡＳＴＰアラインメントを、図６に示す。グリア活性化因子前駆体（ＧＡＦ）（繊維芽細胞増殖因子−９）については、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ３１３７１；Ｍｉｙａｍｏｔｏら、１９９３　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４２５１−４２５９；およびＮａｒｕｏら、１９９３　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８５７−２８６４を参照のこと。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド（配列番号１から翻訳される配列番号２）の最初の２０８アミノ酸の、マウスＦＧＦ−９配列（配列番号１０）およびラットＦＧＦ−９配列（配列番号１１）とのＢＬＡＳＴＸアラインメントを、それぞれ、図７および８に示す。グリア活性化因子前駆体（ＧＡＦ）（繊維芽細胞増殖因子−９）については、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ５４１３０、マウスＦＧＦ−９については、Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏら、１９９６　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７２６−１７３１；そしてラットＦＧＦ−９については、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ３６３６４、グリア活性化因子前駆体（ＧＡＦ）（繊維芽細胞増殖因子−９）（ＦＧＦ−９）、Ｍｉｙａｍｏｔｏ、１９９３　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４２５１−４２５９を参照のこと。図５〜７において棒（「｜」）で示されるように、３つ全ての種のＦＧＦ−９配列は、ＦＧＦ−ＣＸ（配列番号２）と２０８残基のうち１４７残基の同一性、配列全体について７０％の同一性を有する。さらに、２０８残基のうち１７０残基が、ＦＧＦ−ＣＸ（配列番号２）の配列に対してポジティブであり、ポジティブ残基の全体の割合は８１％である。ポジティブ残基は、同一（「｜」）であるか、または整列された場合に比較された配列の同じ相対位置に保存的アミノ酸置換（「＋」）を有するかのいずれかである残基を含む。以下を参照のこと。
【００４４】
全長のＦＧＦ−ＣＸポリペプチド（配列番号２）をまた、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＸＦＧＦ−ＣＸ（配列番号１２）と共に、ＢＬＡＳＴＸによって整列させた。図９に示すように、ＦＧＦ−ＣＸは、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＸＦＧＦ−ＣＸと比較して、２１１のうち１７０の同一な残基（８０％）および２１１のうち１８９のポジティブな残基（８９％）を有する。Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＸＦＧＦ−ＣＸを、プローブとして哺乳動物のＦＧＦ−９に基づくプライマーを用いて実行される変性ＰＣＲの産物を使用して、尾芽（ｔａｉｌｂｕｄ）段階で調製したｃＤＮＡライブラリーから、最近獲得した。Ｋｏｇａら、１９９９　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２６１（３）：７５６−７６５を参照のこと。ＸＦＧＦ−ＣＸのオープンリーディングフレームの推定２０８アミノ酸の配列は、ＦＧＦファミリーに特長的なモチーフを含む。ＸＦＧＦ−ＣＸは、ＸＦＧＦ−９に対して７３．１％の全体的類似性を有するが、そのアミノ末端領域でＸＦＧＦ−９とは異なる（３３．３％の類似性）。これは、ヒトを含む種々の哺乳動物ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６の配列に関して、開示された配列番号２について現在見られる類似に類似している（上を参照のこと）。図４、５および７〜９を参照のこと。
【００４５】
図１のポリペプチド配列（配列番号２）は、プログラムＰＳＯＲＴによって、小胞体および微小体（ペルオキシソーム）の膜を介して分類するための高い可能性を有すると予測される。さらに、これは、そのＮ末端に、予測された切断可能なシグナル配列を有さないが、図１０のハイドロパシープロットは、ＦＧＦ−ＣＸが、約９０〜約１１５のアミノ酸位置（配列番号１３）で顕著な疎水性セグメントを有することを示す。この単一の疎水性領域は、ＦＧＦファミリーの他のメンバーにおける分類シグナルであることが知られている。従って、配列番号１３のアミノ酸を含むポリペプチドは、分類シグナルとして有用であり、種々の細胞の膜（例えば、小胞体、ゴルジ膜または原形質膜）を介した分泌を可能にする。
【００４６】
ＦＧＦ−ＣＸは、最も近縁のヒトファミリーメンバー（例えば、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６）のいくつかについてちょうど見出されるように、ＰＳＯＲＴコンピューターアルゴリズム（Ｎａｋａｉ，Ｋ．およびＫａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１４、８９７−９１１）およびＳＩＧＮＡＬＰコンピューターアルゴリズム（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．、Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．およびｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．１０、１−６）によって予測されるように、典型的なアミノ末端シグナル配列を欠く。それにもかかわらず、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１６の両方は分泌される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｓ．、Ｈａｂａｓｈｉｔａ，Ｊ．、Ｎｏｍｕｒａ，Ｃ．，Ｋｕｒｏｓｈｉｔａ，Ｋ．およびＫｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７１、４４２−４５０；Ｍｉｙａｋｅ，Ａ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．、Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｈ．、Ｈｅｒｎｄａｙ，Ｎ．Ａ．、Ｏｚａｋｉ，Ｋ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｍｉｋａｍｉ，Ｔ．、Ａｒａｋａｗａ，Ｔ．およびＩｔｏｈ，Ｎ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４３、１４８−１５２；Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｋ．、Ｈａｔｓｕｚａｗａ，Ｋ．、Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．、Ａｓａｄａ，Ｍ．、Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｔ．およびＩｎａｍｕｒａ，Ｔ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、２９３５２−２９３５７；Ｒｅｖｅｓｔ，Ｊ．−Ｍ．、ＤｅＭｏｅｒｌｏｏｚｅ，Ｌ．およびＤｉｃｋｓｏｎ，Ｃ．（２０００）Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、８０８３−８０９０）。ＦＧＦ−ＣＸもまた分泌されるか否かを決定するために、全長のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｐＦＧＦ−ＣＸと称される哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。ヒト胚性腎臓２９３細胞がこのベクターでトランスフェクトされる場合に発現されるタンパク質は、馴化培地中に見出され、そしてウェスタンブロットにおいて約２７ｋＤａの見かけの分子量を有して、Ｃ末端Ｖ５エピトープに対する抗体によって検出されるバンドを示す（図１１、実施例７）。発現されたタンパク質のさらなる部分は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との相互作用を阻害する基質を用いて処理することによって、２９３細胞上の隔離（ｓｅｑｕｅｔｒａｔｉｏｎ）から放出される。このように放出されるタンパク質もまた、類似のウェスタンブロットパターンを示す（図１１）。同様に、このタンパク質が、Ｉｇκシグナル配列を組み込む組換えプラスミドからＨＥＫ２９３細胞において発現される場合、バンドが、約３４ｋＤａの適切な分子量を伴って、ウェスタンブロットによって検出される（図１２、実施例５）。
【００４７】
いくつかの脊椎動物ＦＧＦ様タンパク質（配列番号２によって記載されるＦＧＦ−ＣＸを含む）についてのＣｌｕｓｔａｌＷ複数タンパク質アラインメント（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２、４６７３−４６８０）を、図４および５に示す。３つの哺乳動物タンパク質（配列番号９〜１１）は、互いに密接に類似するが、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質（配列番号２）とはかなり異なる。また、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＸＦＧＦ−ＣＸ（配列番号１２）および配列番号２の配列は、ＦＧＦ−９の配列よりも、互いに密接に類似する。ＦＧＦ−９分泌に関与する内部疎水性ドメイン（Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｋ．、Ｈａｔｓｕｚａｗａ，Ｋ．、Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．、Ａｓａｄａ，Ｍ．、Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｔ．およびＩｎａｍｕｒａ，Ｔ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、２９３５２−２９３５７）は、ＦＧＦ−９配列の残基９５〜１２０にわたる。（配列番号２によって記載されるＦＧＦ−ＣＸのハイドロパシープロットについては、図１０を参照のこと）。
【００４８】
ＸＦＧＦ−２０およびＸｅｎｏｐｕｓ　ＦＧＦ−９の発現は、互いに異なる。ＸＦＧＦ−２０　ｍＲＮＡは、二倍体細胞において、胞胚期の胚および胞胚期後の胚において、ならびに成体の胃および精巣において特異的に発現される；一方、ＸＦＧＦ−９　ｍＲＮＡは、卵において母性発現され、多くの成体組織において発現される。Ｋｏｇａら、上記。原腸形成の間のＸＦＧＦ−２０の正確な発現は、Ｘｅｎｏｐｕｓ幼生において正常な頭部構造の形成に必要であるようである。ＸＦＧＦ−２０　ｍＲＮＡが初期胚で過剰発現される場合、原腸形成は異常であり、そして前方構造の発達は抑制された。Ｋｏｇａら、上記を参照のこと。このような胚において、試験されたなかでもとりわけ、Ｘｂｒａ転写物の発現は、原腸形成の間に抑制され、Ｘｂｒａ遺伝子の発現がＸＦＧＦ−ＣＸの効果を媒介することを示した。Ｋｏｇａら、上記を参照のこと。
【００４９】
増殖中の組織（例えば、卵、精巣、胃および母カエル中の複数の組織を含む）における、関連のＦＧＦ−９ポリペプチドの発現パターンは、機能している器官において通常は再生を受ける組織の維持における、ＸＦＧＦ−２０についての役割を示唆する。
【００５０】
実施例８において、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡが、正常な小脳ならびにいくつかのヒト腫瘍細胞株（肺、胃および結腸の癌腫を含む）において発現されるが、対応する正常組織においては発現されないことが示される。正常な肺、胃および結腸におけるＦＧＦ−ＣＸ発現の欠如、ならびにこれらの組織由来の腫瘍株におけるＦＧＦ−ＣＸ発現の存在は、これらの癌細胞株が不適切な様式でＦＧＦ−ＣＸを明らかに過剰発現することを示す。ＦＧＦ−ＣＸがマップされる染色体領域は、結腸直腸、肺および胃の癌腫において共通に変更される（Ｅｍｉ，Ｍ．、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．、Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｅ．、Ｔｓｕｄａ，Ｈ．、Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｓ．、Ｍａｅｄａ，Ｙ．、Ｔｓｕｒｕｔａ，Ｋ．、Ｍｉｙａｋｉ，Ｍ．およびＮａｋａｍｕｒａ，Ｙ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，５２、５３６８−５３７２；Ｂａｆｆａ，Ｒ．、Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｒ．、Ｂｕｌｌｒｉｃｈ，Ｆ．、Ｍａｎｄｅｓ，Ｂ．、Ｉｓｈｉｉ，Ｈ．およびＣｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．６、１３７２−１３７７）。これらの細胞における、ＦＧＦ−ＣＸ駆動のオートクライン増殖ループの確立が、それらの最初の腫瘍形成変換および／または引き続く拡大に寄与することが可能である。このシナリオは、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞におけるＦＧＦ−ＣＸ駆動のオートクラインループの生成が、それらの腫瘍形成能を活性化するという発見によって、支持される（実施例１１を参照のこと）。腫瘍細胞によって分泌されるＦＧＦ−ＣＸが、間質細胞に対するパラクリン効果を介してインビボでそれらの増殖を刺激することもまた可能である。
【００５１】
ＮＩＨ　３Ｔ３細胞における異種ＦＧＦ−ＣＸの発現は、これらの形質転換および腫瘍形成能を誘導することが見出されている（実施例１１を参照のこと）。これらの効果は、ネイティブなＦＧＦ−ＣＸ（構築物ｐＦＧＦ−ＣＸ）およびアミノ末端で異種Ｉｇκシグナル配列を有して発現されるＦＧＦ−ＣＸ（構築物ｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸ）の両方によって媒介される。しかし、より高いインビトロの形質転換能（データは示さず）およびインビボの腫瘍形成能（図１９）によって明らかなように、ｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸが、ｐＦＧＦ−ＣＸよりも腫瘍形成的に活性であることに注目すべきである。ｐＦＧＦ−ＣＸに対するｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸの優れた腫瘍形成能は、ｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸが、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞中でｐＦＧＦ−ＣＸが生成するよりも、より多くの分泌されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質を有意に生成するという事実に起因する可能性が高い（図１１Ｂ）。
【００５２】
ＦＧＦ−ＣＸのように、他のＦＧＦは、異所的発現後に細胞を形質転換することが示されており、そしていくつかの場合には、ＦＧＦシグナル伝達のブロックが、細胞の形質転換を抑制することが示されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｓ．、Ｈａｂａｓｈｉｔａ，Ｊ．、Ｎｏｍｕｒａ，Ｃ．、Ｋｕｒｏｓｈｉｍａ，Ｋ．およびＫｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７１、４４２−４５０；Ｌｉ，Ｙ．、Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｃ．およびＭａｎｓｕｋｈａｎｉ，Ａ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４、７６６０−７６６９）。
【００５３】
本明細書中に記載されるＦＧＦ−ＣＸの特性、および関連のＦＧＦタンパク質について見出された効果との類似性に基づいて、ＦＧＦ−ＣＸは、ヒトの悪性疾患において重要な役割を果たすと考えられる。これらの理由のために、本明細書中に開示されるＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、核酸および抗体は、これらの組成物の存在または量を診断する方法、ＦＧＦ−ＣＸ関連の病理学に関する治療剤のスクリーニングおよび同定において、ならびに種々の種類の悪性疾患の処置の方法において、有用である。
【００５４】
（ＦＧＦ２０Ｘクローン、機能的改変体およびホモログ）
繊維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質をコードする本発明の新規核酸は、その配列が配列番号１もしくは配列番号２６によって記載される核酸またはそれらのフラグメントを含む。本発明はまた、その塩基のいずれかが表４および５に示される対応する塩基から変化され得るが、なおその繊維芽細胞増殖因子−２０様の活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする、変異体または改変体の核酸あるいはこのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、その配列がＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５３１５３−０２およびＣＧ５３１３５−０１の配列に相補的である核酸を含み、まさに記載された核酸のいずれかに相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学的な改変を含む、核酸もしくは核酸フラグメントまたはその相補体を含む。このような改変としては、非限定的な例として、改変された塩基および核酸を含み、これらの糖リン酸骨格は、改変または誘導体化されている。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実行され、その結果、これらを、例えば、被験体における治療的適用において、アンチセンス結合核酸として使用し得る。変異体または改変体の核酸およびこれらの相補体において、約３％までの塩基が、このように変化され得る。
【００５５】
本発明の新規のタンパク質は、配列番号２および配列番号２７によって記載される配列の線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質を含む。本発明はまた、そのいずれかの塩基が配列番号２および配列番号２７の配列に示される対応する残基から変更され得るが、線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質の線維芽細胞増殖因子−２０様の活性および生理的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異タンパク質または改変タンパク質、あるいはそれらのフラグメントを含む。変異タンパク質または改変タンパク質において、アミノ残基の約２％までが変更され得る。
【００５６】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明は、線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質のキメラタンパク質または融合タンパク質を含み、ここで、本発明の線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質は、第２のポリペプチドまたは本発明の新規なタンパク質と実質的に相同でないタンパク質と連結される。第２のポリペプチドは、本発明のＣＧ５３１３５−０２ポリペプチドまたはＣＧ５３１３５−０１ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに融合され得る。特定の実施形態において、第３の非相同なポリペプチドまたはタンパク質はまた、新規の線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質に融合され得、その結果第２の非相同なポリペプチドまたはタンパク質がアミノ末端で連結され、そして第３の非相同なポリペプチドまたはタンパク質が、ＣＧ５３１３５−０２ポリペプチドまたはＣＧ５３１３５−０１ポリペプチドのカルボキシル末端で連結される。第２または第３のポリペプチドあるいはタンパク質のいずれかが組み込まれ得る非相同配列の例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質のアミノ末端で融合される異種シグナル配列、免疫グロブリン配列またはドメイン、血清タンパク質またはそのドメイン（血清アルブミンのような）、抗原性エピトープ、および（Ｈｉｓ）_６のような特異的部分が挙げられる。
【００５７】
本発明はさらに、上の段落で記載された任意のキメラタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【００５８】
（抗体）
本発明はさらに、本発明の任意のタンパク質に免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２または単鎖ＦＶ構築物のような）を含む。本発明はまた、本発明の任意のタンパク質に対して高い結合親和性を有する配列を含むペプチドおよびポリペプチドを含む。このようなペプチドおよびポリペプチドとしては、バクテリオファージ粒子のような任意のキャリア粒子に融合される（またはキャリアの表面上に生物学的に発現される）ペプチドおよびポリペプチドが挙げられる。
【００５９】
（本発明の組成物の使用）
本明細書中に開示されるタンパク質類似性の情報、発現パターン、細胞の局在、ならびにタンパク質および核酸についての地図上の位置は、この線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質が、重要な構造および／または線維芽細胞増殖因子ファミリーに特有な生理的機能を有し得ることを示唆する。したがって、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、そして調査道具として有用である。これらは、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして作用することを含み、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。これらとしてはまた、以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子除去）、（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生の促進剤、ならびに（ｖｉ）生物防御兵器。
【００６０】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害の診断ならびに／または処置における適用を有する。例えば、本発明の組成物は、以下を患う患者の処置にとって有効性を有する：ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、炎症性腸疾患、憩室性疾患、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植、高カルシウム血症、潰瘍、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠陥症（ｈｅａｒｔ　ｄｅｆｅｃｔ）、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、糖尿病、自己免疫疾患、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多嚢胞性腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、癲癇、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経変性、ならびに他の疾患、障害および状態。
【００６１】
これらの材料は、診断方法および／または治療方法において用いるための、本発明の新規の物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【００６２】
（ＦＧＦ−ＣＸ核酸）
本発明の核酸としては、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはＦＧＦ−ＣＸ様タンパク質をコードする核酸が挙げられる。とりわけこれらの核酸は、図１（配列番号１、配列番号２６）に提供される配列の核酸またはそれらのフラグメントである。ＦＧＦ−ＣＸ核酸は、ゲノムＦＧＦ−ＣＸ核酸またはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有し得る。さらに、本発明としては、配列番号１または配列番号２６の核酸の変異核酸または改変核酸、あるいはそれらのフラグメントが挙げられ、任意のこれらの塩基は、配列番号１または配列番号２６の配列に示される対応する塩基から変更され得るが、ＦＧＦ−ＣＸ様の活性および生理的機能を維持するタンパク質をなおコードする。本発明としては、配列番号１または配列番号２６の核酸配列の相補体（それらのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む）がさらに挙げられる。一部分のＦＧＦ−ＣＸの相補鎖の例が、図３に示される。本発明は、その構造が化学的改変を含む、核酸または核酸フラグメントあるいはそれらの相補体をさらに含む。
【００６３】
本発明の１つの局面は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。また、ＦＧＦ−ＣＸコード核酸（例えば、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡ）を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用されるのに十分な核酸フラグメントおよびＦＧＦ−ＣＸ核酸分子の増幅または変異のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用されるフラグメントも含まれる。本明細書中で使用されるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して産生されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。この核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６４】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、使用に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長い長さのプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
【００６５】
「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されているものである。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子または合成ＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＦＧＦ−ＣＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満、５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００６６】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、配列番号２６のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の相補体は、標準的な分子生物学的技法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１または配列番号２６の核酸配列の全部または一部を使用して、ＦＧＦ−ＣＸ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、編、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるようなもの）を用いて単離され得る。
【００６７】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ得る十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはそれらの存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では、１００ｎｔより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１または配列番号２６の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【００６９】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列あるいはそのヌクレオチド配列の一部の相補体である核酸分子を含む。配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二重鎖を形成する。
【００７０】
本明細書で用いる用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドもしくは化合物または関連ポリペプチドもしくは化合物またはそれらの組合せ間の、物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介しもせず、その効果に起因して生じもしない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【００７１】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１または配列番号２６の核酸配列の一部のみ（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列よりも短いせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造を有する（しかし、同一ではない）が、特定の成分または側鎖に関してネイティブな化合物とは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。
【００７２】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸配列またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列と比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの同一性（好ましい同一性は、８０〜９９％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示のプログラムは、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設定を使用、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を使用する）を参照のこと。
【００７３】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号２または配列番号２７の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、およびＦＧＦ−ＣＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されている。相同的アミノ酸配列は、ヒトＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【００７４】
ヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＦＧＦ−ＣＸホモログ、ならびに他の哺乳動物由来のＦＧＦ−ＣＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１または配列番号２６の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１または配列番号２６のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１または配列番号２６の天然に存在する変異体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００７５】
ヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じかまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＦＧＦ−ＣＸコード核酸のレベルを測定すること（例えば、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【００７６】
「ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性（ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１または配列番号２６の一部を単離し、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＦＧＦ−ＣＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、必要に応じて、ＡＴＰ結合ドメインを含み得る。別の実施形態おいて、ＦＧＦ−ＣＸの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含む。
【００７７】
（ＦＧＦ−ＣＸの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。それにより、これらの核酸は、配列番号１または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２または配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７８】
配列番号１または配列番号２６に示されるヒトＦＧＦ−ＣＸヌクレオチド配列に加えて、ＦＧＦ−ＣＸのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、好ましくは哺乳動物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動性を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＦＧＦ−ＣＸの機能的活性を変化させない、ＦＧＦ−ＣＸ内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【００７９】
さらに、他の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１もしくは配列番号２６のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＦＧＦ−ＣＸ　ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＦＧＦ−ＣＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＦＧＦ−ＣＸ　ｃＤＮＡは、ヒトの膜結合ＦＧＦ−ＣＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜結合ヒトＦＧＦ−ＣＸ　ｃＤＮＡは、可溶性ヒトＦＧＦ−ＣＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。
【００８０】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１または２６のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図する。
【００８１】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【００８３】
上記のようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％　ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーション後に、０．２×ＳＳＣ、０．０１％　ＢＳＡ中で５０℃にて、１回以上洗浄する。ストリンジェント条件下で配列番号１の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【００８４】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【００８５】
第２の実施形態では、配列番号１もしくは２６またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％　ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中３７℃で、１回以上洗浄する。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【００８６】
第３の実施形態では、配列番号１もしくは２６、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％　ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＳＤＳ中５０℃で、１回以上洗浄する。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【００８７】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＦＧＦ−ＣＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１もしくは２６のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１または２６の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＦＧＦ−ＣＸの野生型配列から、変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。
【００８８】
さらに、図４として表される整列によって示されるように、ＦＧＦファミリーメンバー間で保存されるアミノ酸残基は、変更に対して敏感に反応しないと予想される。例えば、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＦＧＦファミリーのメンバー（すなわち、ＦＧＦ−９およびＸＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ならびにＦＧＦ−ＣＸホモログ）において代表的に保存される領域である少なくとも１つのドメインを含み得る。このようなものとして、これらの保存されるドメインは、変異に対して敏感に反応しそうにない。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＦＧＦタンパク質のメンバー間で保存的でないかまたは単に半保存的であるアミノ酸残基）は、活性について必須でなくてもよく、従って、変更に対してより敏感に反応するようである。
【００８９】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２または２７とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２または２７のアミノ酸配列に少なくとも約７５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸によってコードされるタンパク質は、配列番号２または２７に少なくとも約８０％相同であり、より好ましくは少なくとも約９０％、約９５％、約９８％相同であり、そして最も好ましくは配列番号２に対して少なくとも約９９％相同である。
【００９０】
配列番号２のタンパク質に相同なＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１もしくは２６のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【００９１】
変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１または２６に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。特定のアミノ酸は、１より多くの分類可能な特徴を有する側鎖を参照のこと有する。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、増殖因子中の推定された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、増殖因子コード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、増殖因子の生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、および２６の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【００９２】
１つの重要な実施形態では、変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（１）他のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質と、ＦＧＦ−ＣＸのレセプターとの間の複合体形成；（３）変異ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；あるいは（４）抗ＦＧＦ−ＣＸタンパク質抗体に特異的に結合する能力。
【００９３】
（アンチセンス）
本発明の別の局面は、配列番号１もしくは配列番号２６またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体のＦＧＦ−ＣＸコード鎖、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２もしくは２７のＦＧＦ−ＣＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１もしくは２６のＦＧＦ−ＣＸの核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【００９４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、配列番号２または２７に対応する、ヒトＦＧＦ−ＣＸのタンパク質コード領域）。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【００９５】
本明細書中に開示されるＦＧＦ−ＣＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１または２６）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【００９６】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００９７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ（ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【００９８】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２１５：３２７〜３３０）を含み得る。
【００９９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
このような改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０１００】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１に記載される））を使用して、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＦＧＦ−ＣＸ　ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＦＧＦ−ＣＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１０１】
あるいは、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現は、ＦＧＦ−ＣＸの調節領域（例えば、ＦＧＦ−ＣＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７〜１５を参照のこと。
【０１０２】
種々の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ　９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０１０３】
ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、使用され得る。
【０１０４】
別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＦＧＦ−ＣＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：３３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ　５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１０５】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ａｇｅｎｔ）、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０１０６】
（ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド）
本発明の新規のタンパク質は、配列が図１（配列番号２）または配列番号２７に提供されるＦＧＦ−ＣＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、その任意の残基が図１に示される対応する残基から変化しているが、そのＦＧＦ−ＣＸ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをなおコードする、変異体または改変体タンパク質を含む。この変異体または改変体タンパク質において、残基の２０％以上までが、このように変化され得る。
【０１０７】
一般に、ＦＧＦ−ＣＸ様機能を保持するＦＧＦ−ＣＸ様改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換され、そしてさらに、元のタンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および元の配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む任意の改変体を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。さらに、本発明の範囲を限定することなく、表２中の以下の位置（配列番号２において規定される番号付けを用いる）は、提示されるように置換され得て、その結果、変異体または改変体タンパク質は、提示される置換を１つ以上含み得る。示唆される置換は、所定の位置において作られ得る可能性のある置換の範囲を限定しない。
【０１０８】
（表２）
位置　可能性のある置換
６：ＧｌｕからＡｓｐ
９：ＧｌｙからＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎ
１０：ＰｈｅからＴｙｒ
１１：ＬｅｕからＰｈｅまたはＩｌｅ
１５：ＧｌｕからＡｓｐ
１６：ＧｌｙからＡｌａ
１７：ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ
１９：Ｇｌｎが欠失し得る
２１：ＶａｌからＰｈｅまたはＩｌｅ
３１：ＧｌｙからＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＡｌａ
３３：ＡｒｇからＬｙｓまたはＳｅｒ
３５：ＰｒｏからＬｅｕまたはＶａｌ
３８：ＧｌｙからＡｓｎまたはＳｅｒ
３９：ＧｌｕからＡｓｐ
４０：ＡｒｇからＬｙｓ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏ
４２：ＳｅｒからＴｈｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙ
４３：ＡｌａからＧｌｎ、Ａｓｎ、またはＳｅｒ
４８：ＡｌａからＳｅｒまたはＧｌｙ
５１：ＧｌｙからＡｌａ
５３：ＧｌｙからＡｌａまたは欠失
５４：ＡｌａからＧｌｙ、Ｖａｌ、または欠失
５５：ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒ
５６：ＧｌｎからＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｎ
５８：ＡｌａからＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕ
６１：ＨｉｓからＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ
７８：ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐ
８０：ＬｅｕからＰｈｅまたはＩｌｅ
８２：ＡｓｐからＧｌｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ
８４：ＳｅｒからＡｓｎ、Ｔｈｒ、またはＧｌｎ
８５：ＶａｌからＩｌｅ
９０：ＧｌｎからＡｓｎまたはＬｙｓ
１０３：ＶａｌからＩｌｅ
１１５：ＳｅｒからＴｈｒ
１２３：ＡｓｐからＧｌｕ
１２８：ＴｙｒからＰｈｅ
１３５：ＳｅｒからＴｈｒ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎ
１３８：ＩｌｅからＶａｌまたはＬｅｕ
１５５：ＩｌｅからＬｅｕ
１５９：ＧｌｙからＶａｌまたはＡｌａ
１６１：ＴｈｒからＳｅｒ
１６６：ＰｈｅからＴｙｒ
１７７：ＡｓｐからＧｌｕ
１８１：ＳｅｒからＡｌａまたはＴｈｒ
１９８：ＧｌｕからＡｓｐ
１９９：ＡｒｇからＬｙｓ
２０７：ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ
２０９：Ｍｅｔから任意の残基
２１１：ＴｈｒからＳｅｒ
本発明の１つの局面は、単離されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現の代わりに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０１０９】
「単離された」または「精製された」タンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が、単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、分離されているＦＧＦ−ＣＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を約５％未満有する、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の調製物を含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０１１０】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＦＧＦ−ＣＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＦＧＦ−ＣＸ化学物質を約５％未満有する、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の調製物を含む。
【０１１１】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０１１２】
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＦＧＦファミリータンパク質間で実質的に保存される、少なくとも１つの上記で同定されるドメインを含み得る。さらに、他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分が、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０１１３】
１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２または２７に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２または２７に実質的に相同であり、そして以下に詳細に記載されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２または２７のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、このＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２または２７のアミノ酸配列に少なくとも約４５％の相同性を有するアミノ酸を含むタンパク質であり、そして配列番号２または２７のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、配列番号２または２７のアミノ酸配列に少なくとも約４５％、そしてより好ましくは５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに９９％相同なアミノ酸配列を含むタンパク質であり、そして、配列番号２または２７の配列を有する対応するポリペプチドのＦＧＦ−ＣＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１１４】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、配列間の最適な整列のために、比較されるいずれかの配列に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０１１５】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ　ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１または２６に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０１１６】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）残基のパーセンテージ」は、以下により算出される：その比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、上記のように同一のアミノ酸および保存的アミノ酸置換が、両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、陽性残基のパーセンテージを導くこと。
【０１１７】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＦＧＦ−ＣＸ「キメラタンパク質」またはＦＧＦ−ＣＸ「融合タンパク質」は、非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。「ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、「非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド」は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質において、このＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態においてＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドおよび非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１１８】
例えば、１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに作動可能に連結されたＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを含む。このような融合タンパク質はさらに、ＦＧＦ−ＣＸ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイに使用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【０１１９】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質であり、ここではＦＧＦ−ＣＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＦＧＦ−ＣＸの精製を容易にし得る。
【０１２０】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列を含むＦＧＦ−ＣＸタンパク質である。例えば、ネイティブＦＧＦ−ＣＸシグナル配列（すなわち、配列番号２または２７のアミノ酸１〜２０）は、除かれて、別のタンパク質由来のシグナル配列に置き換えられ得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＦＧＦ−ＣＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０１２１】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＦＧＦ−ＣＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合された一つ以上のドメインを含む。本発明のこのＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＦＧＦ−ＣＸリガントとＦＧＦ−ＣＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＦＧＦ−ＣＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。１つの限定しない例において、考え得るＦＧＦ−ＣＸリガンドは、ＦＧＦ−ＣＸレセプターである。このＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＦＧＦ−ＣＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＦＧＦ−ＣＸリガンド／ＦＧＦ−ＣＸの相互作用の阻害は、増殖障害ならびに分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＦＧＦ−ＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＦＧＦ−ＣＸリガンドを精製し、そしてＦＧＦ−ＣＸリガンドとのＦＧＦ−ＣＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０１２２】
本発明のＦＧＦ−ＣＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端の埋め込み（ｆｉｌｌ−ｉｎ）、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結により、インフレームで一つに連結される。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施しこれらのフラグメントは次いでキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸は、この融合成分がＦＧＦ−ＣＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１２３】
（ＦＧＦ−ＣＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＦＧＦ−ＣＸアゴニスト（模倣物）として、またはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストとして機能するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の改変体に関する。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の離散した点変異または短縮）により生成され得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により誘導され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１２４】
ＦＧＦ−ＣＸアゴニスト（模倣物）として、またはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＦＧＦ−ＣＸタンパク質の改変体は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてのＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＦＧＦ−ＣＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＦＧＦ−ＣＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＦＧＦ−ＣＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＦＧＦ−ＣＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＦＧＦ−ＣＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＦＧＦ−ＣＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１２５】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＦＧＦ−ＣＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＦＧＦ−ＣＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成され得る。この方法により、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが獲得され得る。
【０１２６】
点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技法は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（Ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ　ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＦＧＦ−ＣＸ改変体を同定し得る（例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：３２７−３３１を参照のこと）。
【０１２７】
（抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦ_ａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、ヒト由来の抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの任意のクラスに関連し、これらは分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスは、同様に、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中で抗体に対する参照は、ヒト抗体種のすべてのこのようなクラス、サブクラスおよび型に対する参照を含む。
【０１２８】
抗原、またはその一部もしくはフラグメントとして役立つことが意図される本発明の単離されたタンパク質を免疫原として使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長タンパク質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２または配列番号２７に示されるアミノ酸配列）の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを含み、その結果、このペプチドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【０１２９】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＦＧＦ−ＣＸの領域、例えば、親水性領域である。ヒトＦＧＦ−ＣＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であるか、そしてそれによって、どの領域が抗体産生を標的にするために有用な表面残基をコードするようであるかを示す。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を使用してかまたは使用しないかのいずれかで、Ｋｙｔｅ　ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに特異的な抗体もまた、本明細書中で提供される。
【０１３０】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０１３１】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ，およびＬａｎｅ　Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０１３２】
（１．ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ＦＧＦ−ＣＸのネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体での１回以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、免疫されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０１３３】
免疫原性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０１３４】
（２．モノクローナル抗体）
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の唯一の分子種を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、すべての分子の集団において同一である。従って、ＭＡｂは、抗原に対する特有の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０１３５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載される方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を、代表的に、免疫剤で免疫して、この免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、またはこれらの抗体を産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１３６】
免疫剤としては、代表的に、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が望まれる場合に、末梢血リンパ球が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８６）５９〜１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖も生存も阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ））を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０１３７】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫株であり、それらを、例えば、Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）５１〜６３頁）。
【０１３８】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが、目的であり、モノクローナル抗体の治療学的適用において特に重要である。
【０１３９】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を限定することによって、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６）。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１４０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０１４１】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、コードする配列を相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインと置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３６８，８１２−１３（１９９４））か、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてもしくは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域と置換されて、キメラ二価抗体を作製し得る。
【０１４２】
（３．ヒト化抗体）
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質抗原に対して指向される抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答を引き起こさないヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯類ＣＤＲ（単数または複数）配列の置換によって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共働研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の後に達成され得る（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと）。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、すべての少なくとも１つの可変領域、および代表的には２つの可変領域を実質的に含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を必要に応じて含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１４３】
（４．ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、本質的に、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の配列全体がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関連する。このような抗体を、本明細書中で「ヒト抗体」、または「完全なヒト抗体」と呼ぶ。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して指向されるヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２０２６〜２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓを用いたヒトＢ細胞による形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁）産生され得る。
【０１４４】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体が作製され得る。チャレンジの際に、ヒト抗体産生が観察され、このことは、すべての点で（遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）ヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０，７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ　３６８　８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ　３６８，８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４，８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４，８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３　６５〜９３（１９９５））。
【０１４５】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に特異的に結合するヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体ではなく完全なヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る（ＰＣＴ刊行物ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主における重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が、宿主のゲノムに挿入される。例えば、要求性ヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子が組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を雑種することによって、子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓ^ＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的のＦＧＦ−ＣＸ免疫原での免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回復され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、１本鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０１４６】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例示される）を作製する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に記載される。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：遺伝子座の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成、および選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによって影響される欠失を防ぐために、胚性幹細胞において少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座由来のＪセグメント遺伝子を欠失させる工程；ならびにトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚性幹細胞から作製する工程。
【０１４７】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生するための方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。これは、以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１４８】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定するための方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための相関する方法は、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０１４９】
（５．Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、技術は、本発明の抗原性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０１５０】
（６．二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、モノクローナル抗体（好ましくは、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）であって、これは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には、細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０１５１】
二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここで、これら２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９（１９９１）において開示される。
【０１５２】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。この融合物中の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために、必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１５３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化し得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖に対して同一のサイズまたは同様のサイズの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０１５４】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク分解的に切断し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤ナトリウム亜ヒ酸塩の存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１５５】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロでの直接的な化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。これにより形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解性活性を誘因し得る。
【０１５６】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異的抗体フラグメントを作製し、単離するための種々の技術が記載されいる。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合される。このホモダイマー抗体は、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されてヘテロダイマー抗体を形成する。この方法はまた、ホモダイマー抗体の産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、同一鎖上の２つのドメインの間で対形成するには短すぎるリンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１５７】
２つより多い結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１５８】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に注目して、白血球（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７））、またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の誘引分子（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に結合するアームと合わされ得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞毒性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および細胞毒性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１５９】
（７．ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体で構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を要求されない細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０１６０】
（８．エフェクター機能の操作）
本発明のＦＧＦ−ＣＸ抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、それによってこの領域内での鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。このように作製されたホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの可能性および／または増加した補体媒介細胞殺傷、ならびに抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１１９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、２つのＦｃ領域を有し、それによって増強された補体溶解およびＡＤＣＣの可能性を有し得る抗体は操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１６１】
（９．免疫結合体）
本発明はまた、細胞毒性剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合したＦＧＦ−ＣＸ抗体を含む免疫結合体に関する。
【０１６２】
このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓｅｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１６３】
抗体および細胞毒性因子の結合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート　ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１６４】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない結合体が循環から除去され、次いで細胞毒性因子に順に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１６５】
（１０．免疫リポソーム）
本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記される方法）によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に記載されている。
【０１６６】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、所定の穿孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようにジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）が、必要に応じてリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１６７】
（１１．本発明のタンパク質に対する抗体の診断適用）
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対する抗体は、タンパク質の局在化および／または定量化に関連する分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的サンプル内のタンパク質のレベルを測定するための使用、診断方法における使用、タンパク質を画像化する上での使用など）において使用され得る。所定の実施形態において、タンパク質または抗原結合ドメインを含むその誘導体、フラグメントもしくはホモログに対する抗体は、薬理学的に活性な化合物として利用される（以下を参照のこと）。
【０１６８】
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対して特異的な抗体は、標準的な技術（例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によりタンパク質を単離するために使用され得る。このような抗体は、細胞からの天然のタンパク質抗原の精製、および宿主細胞において発現された組換え産生された抗体の精製を容易にし得る。さらに、このような抗体は、抗原タンパク質の生成量および発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）抗原タンパク質を検出するために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に対する抗体を診断的に使用して、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニタリングし得る。検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングする（すなわち、物理学的に連結する）ことによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族の複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが挙げられる。
【０１６９】
（１２．抗体治療剤）
本発明のＦＧＦ−ＣＸ抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。このような薬剤は、一般に被験体の疾患または病理を処置または予防するために使用される。抗体調製物（好ましくは、標的抗原に対して高度な特異性および高度な親和性を有する抗体）は、被験体に投与され、そして一般に標的との結合に起因して効果を有する。このような効果は、所定の抗体分子と問題の標的抗原との間の特異的な相互作用の性質に依存して、２種類の効果があり得る。第１の場合、抗体の投与は、天然で結合する内因性リガンドと標的との結合を抑止または阻害し得る。この場合、この抗体は、標的に結合し、そして天然に存在するリガンドの結合部位をマスクし、ここで、このリガンドはエフェクター分子として役立つ。従って、レセプターは、リガンドが応答するシグナル伝達経路を媒介する。
【０１７０】
あるいは、この効果は、この抗体が標的分子上でエフェクター結合部位と結合することによって生理学的結果を惹起する効果であり得る。この場合、この標的（疾患または病理において不在または欠損し得る内因性リガンドを有するレセプター）は、代替エフェクターリガンドとして抗体と結合し、レセプターによってレセプターベースのシグナル伝達事象を開始する。
【０１７１】
本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関連する。上記のように、これは、抗体とその標的抗体との間の結合相互作用であり得、特定の場合にこの標的の機能を妨害し、そして別の場合に生理学的応答を促進する。投与されるべき必要量は、さらに、特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、そして投与された抗体が投与される他の被験体の自由体積から除去される速度にも依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療有効用量の一般的な範囲は、非制限例であるが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な用量頻度は、例えば、１日に２回〜１週間に１回までの範囲であり得る。
【０１７２】
（１３．抗体の薬学的組成物）
本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質と特異的に結合する抗体および本明細書中に開示されるスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置のために投与され得る。このような組成物の調製に関与する原理および考察、ならびに成分の選択における手引きは、例えば、以下に提供される：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ　Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５：Ｄｒｕｇ　Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ　Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｗｏｏｄ　Ａｃａｃｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ　Ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，第４巻）１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。
【０１７３】
抗原タンパク質が細胞内に存在し、そして全抗体がインヒビターとして使用される場合、抗体を内在化することが好ましい。しかし、リポソームはまた、抗体または抗体フラグメントを細胞に送達するために使用され得る。抗体フラグメントを使用する場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列と結合する能力を保持するペプチド分子が設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得るかおよび／または組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。本明細書中の処方物はまた、必要な場合、特定の徴候を処置するのに必要とされる、１つより多い活性化合物、好ましくは、互いに不利な影響を及ぼさない相補的活性を有する１より多い活性化合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組成物は、その機能を強化する薬剤（例えば、細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤または増殖阻害剤）を含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効な量の組合せで適切に存在する。
【０１７４】
この活性成分は、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ従来の技術または界面重合化（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル中に包理され得る。
【０１７５】
インビボ投与に使用されるべき処方物は、滅菌されなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０１７６】
（ＦＧＦ−ＣＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは導入された宿主細胞中で自律的に複製し得る（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主のゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、このプラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図する。
【０１７７】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含む。これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基いて選択される１つ以上の調節配列を含むこと、および発現される核酸配列に作動可能に連結されることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはこのベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）で調節配列に連結されることを意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列として、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解されている。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０１７８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＦＧＦ−ＣＸの発現のために設計され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１７９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、コードされるタンパク質に（通常、組換えタンパク質のアミノ末端に）、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的に、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（２）組換えタンパク質の溶解度を増加させるため；および（３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質を精製する上で補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位は、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質が融合部分から分離され得るように、融合部分および組換えタンパク質の結合部分に導入される。このような酵素、およびその同族の認識配列として、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとして、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的の組換えタンパク質に融合する、それぞれ、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１８０】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０１８１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０１８２】
別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１８３】
あるいは、ＦＧＦ−ＣＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１８４】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１８５】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ　Ｊ　８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生調節性プロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　３：５３７−５４６）。
【０１８６】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１８７】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０１８８】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ヒトチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１８９】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１９０】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するマーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）が含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、増殖プロモーターをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸とともに安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１９１】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＦＧＦ−ＣＸをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＦＧＦ−ＣＸを単離する工程を包含する。
【０１９２】
（トランスジェニック動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＦＧＦ−ＣＸコード配列が導入される、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得、ここで外因性のＦＧＦ−ＣＸ配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動物（ここで内因性のＦＧＦ−ＣＸ配列が変更されている）に導入される。このような動物は、ＦＧＦ−ＣＸの機能および／または活性を研究するため、およびＦＧＦ−ＣＸの活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子は、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている。
【０１９３】
本発明のトランスジェニック動物は、ＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸を、（受精した卵母細胞の雄性前核に導入することによって例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）、およびこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号１のヒトＦＧＦ−ＣＸ　ＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＦＧＦ−ＣＸ遺伝子）は、ヒトＦＧＦ−ＣＸ　ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上述にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列は、特定の細胞に対して、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現を指向するために、ＦＧＦ−ＣＸ導入遺伝子に作動可能に連結される。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＦＧＦ−ＣＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中のＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸをコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物へと繁殖させ得る。
【０１９４】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、少なくとも、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の一部を含むベクターを調製する。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１）であり得るが、より好ましくは、ヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１のヒトＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０１９５】
あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように設計される（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変更された部分は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質と胚幹細胞中の内因性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＦＧＦ−ＣＸタンパク質核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、この導入されたＦＧＦ−ＣＸ遺伝子が、内因性ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。
【０１９６】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ　ＡＮＤ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ　１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、一定期間置く。それらの生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、この相同組換えＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０１９７】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２、ＰＮＡＳ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０１９８】
本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）を、単離し、増殖周期から抜け出し、そしてＧ_０期に入ることを誘導し得る。次いで、この静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同種動物由来の、摘出された卵母細胞へ融合し得る。次いで、この再構築された卵母細胞を培養し、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移される。この雌性フォスター動物の産生子孫は、この細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０１９９】
（薬学的組成物）
本発明のＦＧＦ−ＣＸ核酸分子、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質、および抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体（本明細書中で「活性化合物」といわれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログは、投与に適切な薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質、または抗体、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散液、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは賦形薬の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）はまた、使用され得る。薬学的に活性物質である、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。この活性化合物と不適合性である任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、組成物におけるその使用は、企図される。補足的な活性化合物はまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０２００】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合可能に処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮的（すなわち、局所的）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液としては、以下の成分が挙げられ得る：滅菌賦形薬（注射のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌性剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトラートまたはホスフェート）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入され得る。
【０２０１】
注射使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（ここで、水溶性）または分散液および滅菌注射可能な溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性であるべきであり、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒体であり得る：例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散に関しては、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０２０２】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質あるいは抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体）を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体および上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および予め滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２０３】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（スイッシュ）（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２０４】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０２０５】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２０６】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤の使用（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０２０７】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２０８】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２０９】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、任意の複数の経路（例えば、米国特許第５，７０３，０５５号に記載される）に送達され得る。従って、送達は、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ　９１：３０５４−３０５７を参照のこと）が挙げられる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２１０】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書をとともに、キット（例えば、容器、包装、またはディスペンサー）に含まれ得る。
【０２１１】
（本発明の使用および方法）
本明細書中で記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体が、以下の１つ以上の方法において使用され得る：（ａ）スクリーニングアッセイ；（ｂ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、組織タイピング、法医学生物学）；（ｃ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験モニタリング、および薬理ゲノミクス）；ならびに（ｄ）処置の方法（例えば、治療および予防）。本明細書中に記載されるように、１つの実施形態において、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＡＴＰを結合する能力を有する。
【０２１２】
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を（例えば、遺伝子治療用途における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）発現するため、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＦＧＦ−ＣＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＦＧＦ−ＣＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＦＧＦ−ＣＸの活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＦＧＦ−ＣＸタンパク質の不十分なもしくは過剰な産生によって特徴付けられる障害、あるいはＦＧＦ−ＣＸ野生型タンパク質と比較して減少したかもしくは異常な活性を有するＦＧＦ−ＣＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害（例えば、増殖障害または分化障害）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出して単離するため、およびＦＧＦ−ＣＸ活性を調節するために使用され得る。
【０２１３】
本発明は、さらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０２１４】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＦＧＦ−ＣＸ発現またはＦＧＦ−ＣＸ活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補物または試験化合物もしくは薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。
【０２１５】
１つの実施形態において、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはそれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１２：１４５）。
【０２１６】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　３７：１２３３。
【０２１７】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ（上述））において示され得る。
【０２１８】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得る。その結果、この試験化合物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体中のその標識化合物を検出することによって決定され得る。例えば、試験化合物は、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＦＧＦ−ＣＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、およびこの試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＦＧＦ−ＣＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２１９】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、およびこの試験化合物が、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＦＧＦ−ＣＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子に結合するか、またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＦＧＦ−ＣＸ標的分子は、本発明の非ＦＧＦ−ＣＸ分子あるいはＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を介した細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＦＧＦ−ＣＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＦＧＦ−ＣＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２２０】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質がＦＧＦ−ＣＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質がＦＧＦ−ＣＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ_３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＦＧＦ−ＣＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０２２１】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、これは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と試験化合物とを接触させる工程、およびその試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物のＦＧＦ−ＣＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にかのいずれかで決定され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と、ＦＧＦ−ＣＸに結合する公知の化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させる工程、およびその試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＦＧＦ−ＣＸまたはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２２２】
別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、これは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、およびその試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸの活性を調節する能力の決定は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上に記載のように決定され得る。
【０２２３】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と、ＦＧＦ−ＣＸに結合する公知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、およびこの試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＦＧＦ−ＣＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質が、ＦＧＦ−ＣＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０２２４】
本発明の無細胞アッセイは、ＦＧＦ−ＣＸの可溶性形態または膜結合形態の両方の使用を受け入れる。膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸを含む無細胞アッセイの場合には、膜結合形態のＦＧＦ−ＣＸが溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）_ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ）_ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２２５】
本発明の上記アッセイ方法の１つ以上の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸまたはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物のＦＧＦ−ＣＸへの結合、または候補化合物の存在下および非存在下でのＦＧＦ−ＣＸの標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＦＧＦ−ＣＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を導く条件下（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＦＧＦ−ＣＸの結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０２２６】
タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸまたはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して固定され得る。ビオチン化されたＦＧＦ−ＣＸまたは標的分子は、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＦＧＦ−ＣＸまたは標的分子と反応性であるが、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＦＧＦ−ＣＸが、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＦＧＦ−ＣＸまたは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＦＧＦ−ＣＸまたは標的分子に付随する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２２７】
別の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸの発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中におけるＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下での、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現のレベルは、候補化合物の不在下でのＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＦＧＦ−ＣＸの発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、その候補化合物の不在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現が、候補化合物の存在下でその候補化合物の不在下よりも小さい（統計的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中におけるＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現のレベルは、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡまたはＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出するための本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０２２８】
本発明のなお別の局面において、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され得（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、（１９９３）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＦＧＦ−ＣＸに結合するかまたはそれと相互作用する他のタンパク質（「ＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質」または「ＦＧＦ−ＣＸ−ｂｐ」）、ならびにＦＧＦ−ＣＸの活性を調節する他のタンパク質を同定する。このようなＦＧＦ−ＣＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ経路の上流または下流のエレメントとして、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質によるシグナルの伝達に関与するようである。
【０２２９】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子の調節（ｍｏｄｕｌａｒ）性質に基づく。手短には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を使用する。１つの構築物において、ＦＧＦ−ＣＸをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物において、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用し得る場合、ＦＧＦ−ＣＸ依存性複合体を形成して、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが、密接に近接される。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されるレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そしてこの機能性転写因子を含む細胞コロニーを単離および使用して、ＦＧＦ−ＣＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を獲得し得る。
【０２３０】
本発明は、さらに、上記スクリーニングアッセイによって同定される新規試薬および本明細書中に記載されるような処置のためのこれらの使用に関する。
【０２３１】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の部分またはフラグメント（および対応する完全遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列は、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングし；従って、遺伝性疾患に関連する遺伝子領域を位置決めする；（ｉｉ）わずかな生物学的サンプルから個体を同定する（組織型決定）；そして（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的同定において補助するために使用され得る。
【０２３２】
本発明のＦＧＦ−ＣＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のための独特のバンドを得るためにサザンブロット上で調査される。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２３３】
さらに、本発明の配列を用いて、個体ゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載されるＦＧＦ−ＣＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０２３４】
この様式において調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、独特の個体同定を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来のこのような同定配列を得るために使用され得る。本発明のＦＧＦ−ＣＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒトの間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると推定される。対立遺伝子変異の多くは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２３５】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体由来のＤＮＡが同定の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。配列番号１または配列番号２６の非コード配列は、上記のように、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列が使用される場合、ポジティブな個体識別のためのプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０２３６】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＦＧＦ−ＣＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定し、これによって、個体が、異常なＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているかどうか、あるいは障害を発症する危険性があるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症する危険性があるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＦＧＦ−ＣＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現もしくは活性によって特徴付けられるか、またはそれらに関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０２３７】
本発明の別の局面は、個体におけるＦＧＦ−ＣＸタンパク質、核酸の発現あるいはＦＧＦ−ＣＸの活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的薬剤（本明細書において「薬理ゲノム学」とよばれる）を選択する。薬理ゲノム学は、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２３８】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＦＧＦ−ＣＸの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０２３９】
これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０２４０】
（診断アッセイ）
線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−９は、一般に、特定の増殖因子レセプターを有する細胞において細胞増殖を促進する。ＦＧＦ増殖因子の例としては、手術後の目の前部における上皮細胞（例えば、線維芽細胞およびケラチノサイト）が挙げられる。細胞増殖が役割を果たす他の状態としては、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病合併症、カポージ肉腫および慢性関節リウマチが挙げられる。
【０２４１】
ＦＧＦ−ＣＸは、サンプル中または組織中のその対応する線維芽細胞増殖因子レセプターＣＸ（ＦＧＦＲＣＸ）を検出するための、本発明の方法において使用され得る。この方法は、サンプルまたは組織をＦＧＦ−ＣＸと接触させる工程、レセプター−リガンド対を形成させる工程、および任意のＦＧＦＲＣＸ：ＦＧＦ−ＣＸ対を検出する工程、を包含する。ＦＧＦ−ＣＸを含む組成物は、ＦＧＦＲＣＸ活性を増加させて、例えば、軟骨または骨の修復を刺激するために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸアンタゴニストまたはＦＧＦ−ＣＸ結合因子（例えば、抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体）を含む組成物は、過剰のＦＧＦ−ＣＸまたはＦＧＦ−ＣＸの過剰な活性によって引き起こされる疾患（特に、孤立性または遺伝性の多発性外骨腫症、外反母趾変形、軟骨無形成症、滑液膜軟骨腫症および軟骨腫）を処置するために使用され得る。
【０２４２】
グリア活性化因子（ＧＡＦ）およびＧＡＦをコードするＤＮＡは、グリア細胞の増殖を特異的に促進するように作用する。ＧＡＦを用いてグリア細胞活性を調節し得る、グリア関連障害のいくつかの例は、脳損傷、脳水腫、老年痴呆、アルツハイマー病、糖尿病性ニューロパシーなどである。同様に、ＦＧＦ−ＣＸが、グリア細胞関連障害の診断および処置に使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸのグリア細胞調節活性は、神経保護様活性であり得、そしてＦＧＦ−ＣＸは、神経保護因子として使用され得る。ＦＧＦ−９（これは、本来、グリア活性化因子として同定された）に対するＦＧＦ−ＣＸの密接な相同性に起因して、ＦＧＦ−ＣＸ配列もまた、グリア活性化因子であることが推測され得る。従って、ＦＧＦ−ＣＸは、グリア細胞の増殖を刺激するために使用され得、そして脳損傷の治癒を促進するために使用され得るか、あるいは脳水腫、老年痴呆、アルツハイマー病または糖尿病性ニューロパシーを処置するために使用され得る。
【０２４３】
ＦＧＦ−ＣＸはまた、線維芽細胞（火傷、創傷、潰瘍などの治癒を促進するため）、巨核球（血小板数を増加するため）、造血細胞、免疫系細胞、および血管平滑筋細胞を刺激するために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸはまた、骨形成促進活性を有することが予測され、そして骨折および骨粗しょう症を処置するために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸのポリペプチド部分または核酸部分のアッセイは、脳腫瘍の診断において有用であり得、そしてこれらに対する抗体は、このような腫瘍を処置するために使用され得る。これはまた、培養細胞の増殖を刺激するための試薬として使用され得る。推定投薬量は、１ｎｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日であるが、処置は、処置される障害の型または重篤度に依存して変化し得る。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、血小板増加因子、骨形成促進因子として使用され得るか、あるいは、脳神経疾患または肝障害（例えば、肝硬変）を処置するために使用され得る。これらはまた、抗癌剤と併用される場合、癌を処置するために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、誘導体またはアナログに対する抗体は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの生物学的活性を検出または決定するために使用され得るか、あるいは、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドを精製するために使用され得る。ＦＧＦ−ＣＸの細胞増殖活性を中和もするこれらの抗体は、抗癌剤として使用され得る。
【０２４４】
多くの（全てではないとしても）相同タンパク質が、密接に関連する機能または同一の機能を有することが当該分野で公知である。例えば、Ｌｅｗｉｎ、「Ｃｈａｐｔｅｒ　２１：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｇｅｎｅｓ　Ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　Ｆａｍｉｌｉｅｓ」：Ｇｅｎｅ　ＩＩ、１９８５、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと。ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドは、アフリカツメガエルＸＦＧＦ−ＣＸタンパク質に非常に類似する。このＸＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、高度に増殖性の組織において特異的に発現されることが以前に示されている（例えば、Ｋｏｇａら、上記、を参照のこと）。従って、ＦＧＦ−ＣＸはまた、高度に増殖性の組織において細胞活性を調節することが推測される。従って、ＦＧＦ−ＣＸは、増殖性障害の診断において、ならびに、細胞および組織の増殖が抑制または阻害されている病理学的状態を克服するための、このような細胞および組織の増殖の刺激において、特に有用であり得る。配列番号１または配列番号２６のＦＧＦ−ＣＸ核酸の任意の一部に対応するオリゴヌクレオチドが、ＦＧＦ−ＣＸ様遺伝子の発現を検出するために使用され得る。本発明のタンパク質は、これらのタンパク質に特異的に結合する抗体の産生を刺激するために使用され得る。このような抗体は、サンプル中のタンパク質の存在を検出するための免疫診断手順において使用され得る。本発明のタンパク質は、細胞増殖が望ましい状態において、このような細胞増殖を刺激するために使用され得る。一例は、例えば、造血および血小板形成、胃腸管の内膜、ならびに毛包に対する、化学療法剤の毒性の副作用を相殺することである。これらはまた、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病を含む）において、新たな細胞増殖を刺激するために使用され得る。あるいは、アンタゴニスト処置が投与され得、ここでは、本発明のＦＧＦ−ＣＸ様タンパク質に特異的に結合する抗体が、これらのタンパク質の特定の増殖誘導効果を抑止する。このような抗体は、例えば、増殖性障害（例えば、種々の腫瘍および良性の過形成を含む）の処置において有用であり得る。
【０２４５】
生物学的サンプルにおいてＦＧＦ−ＣＸの存在または非存在を検出するための例示的方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするＦＧＦ−ＣＸ核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または因子を、生物学的サンプルに接触させる工程を包含し、その結果、ＦＧＦ−ＣＸの存在が、生物学的サンプル中で検出される。ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための因子は、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長ＦＧＦ−ＣＸ核酸（例えば、配列番号１または配列番号２６の核酸）あるいはその一部（例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であり、かつ上記のように、ＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分である、オリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは、本明細書中に記載される。
【０２４６】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を検出するための因子は、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質に結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得るか、またはより好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２）が使用され得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体の直接的な標識（検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによる）、ならびに、プローブまたは抗体の間接的な標識（直接標識される別の試薬との反応性による）を包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識（その結果、これは、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得る）が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボにて、生物学的サンプル中のＦＧＦ−ＣＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＦＧＦ−ＣＸ　ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＦＧＦ−ＣＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、被験体への標識された抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体の導入が挙げられる。例えば、抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０２４７】
１つの実施形態において、生物学的サンプルは、試験被験体由来のタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験被験体由来のｍＲＮＡ分子または試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された、末梢血白血球サンプルである。
【０２４８】
別の実施形態において、本発明の方法は、コントロールの被験体からコントロールの生物学的サンプルを得る工程、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムを検出し得る化合物または因子を、コントロールサンプルに接触させる工程であって、その結果、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびコントロールサンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較する工程、を包含する。
【０２４９】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＦＧＦ−ＣＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプル中のＦＧＦ−ＣＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは因子；そのサンプル中のＦＧＦ−ＣＸの量を決定するための手段；およびそのサンプル中のＦＧＦ−ＣＸの量と標準とを比較するための手段。この化合物または因子は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質または核酸を検出するキットを使用するための指示書を備え得る。
【０２５０】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または活性に関連した疾患もしくは障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、例えば、増殖障害または分化障害（例えば、過形成、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病性合併症、または慢性関節リウマチなど）およびグリア関連障害（例えば、大脳損傷、糖尿病性神経障害、脳水腫、老年痴呆、アルツハイマー病など）において、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険に有る被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険に有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合、「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０２５１】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体が薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補物）が投与されて、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または活性に関連する疾患または障害が処置され得るか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を用いて、被験体が障害（例えば、増殖障害、分化障害グリア関連障害など）のための薬剤を用いて有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または活性に関連する障害のための薬剤を用いて被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＦＧＦ−ＣＸタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質または核酸の存在は、異常なＦＧＦ−ＣＸ発現または活性に関連する障害を処置するための薬剤を投与され得る被験体についての診断指標である）。
【０２５２】
本発明の方法はまた、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が増殖障害、分化障害、グリア関連障害などの危険性を有するかまたはこれらの障害に罹患しているか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、本発明の方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える変更の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷、あるいはＦＧＦ−ＣＸの遺伝子の誤発現の存在または非存在を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（１）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（２）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（３）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（４）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の染色体再配置；（５）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（６）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の異常な改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な改変）、（７）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の非野生型レベル、（９）ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（１０）ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、多数の公知のアッセイ技術が存在し、これらは、ＦＧＦ−ＣＸの遺伝子における損傷を検出するために使用され得る。好ましい生物学的サンプルは、従来の手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０２５３】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮＡＳ　９１：３６０−３６４を参照のこと）。後者は、ＦＧＦ−ＣＸの遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る）（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物の大きさを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されるために所望され得ることが予想される。
【０２５４】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ、ら、１９８９、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７）、または他の任意の核酸増幅方法、それに続いて、当業者に周知な技術を用いたその増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に極少数で存在する場合、核酸分子の検出のために特に有用である。
【０２５５】
代替の実施形態において、サンプル細胞由来のＦＧＦ−ＣＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差違は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２５６】
他の実施形態において、ＦＧＦ−ＣＸにおける遺伝的変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２：７５３−７５９）。例えば、ＦＧＦ−ＣＸにおける遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（上記）において記載されるような光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、第一のプローブのハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査して、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによってその配列の間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に続いて、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによって、特定の変異の特徴付けを可能にする第二のハイブリダイゼーションアレイがある。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０２５７】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルのＦＧＦ−ＣＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）ＰＮＡＳ　７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）ＰＮＡＳ　７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（Ｎａｅｖｅら、（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０２５８】
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断薬剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＦＧＦ−ＣＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロール鎖とサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理して、そのミスマッチ領域を酵素的に消化し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。次いで、そのミスマッチ領域の消化後、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさで分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０２５９】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＦＧＦ−ＣＸ　ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＦＧＦ−ＣＸ配列（例えば、野生型ＦＧＦ−ＣＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２６０】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ　２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ　Ａｎａｌ　Ｔｅｃｈ　Ａｐｐｌ　９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＦＧＦ−ＣＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が、配列の変化に対してより感受的である、（ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する（例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ　７：５を参照のこと）。
【０２６１】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５を参照のこと）。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性勾配の代わりに使用される（例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｃｈｅｍ　２６５：１２７５３を参照のこと）。
【０２６２】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる（例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：６２３０を参照のこと）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡがハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２６３】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：２４３７〜２４４８）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ　１１：２３８）。さらに、変異の領域において新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る（例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１を参照のこと）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される（例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：１８９を参照のこと）。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位で既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２６４】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０２６５】
さらに、ＦＧＦ−ＣＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０２６６】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＦＧＦ−ＣＸ活性（例えば、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、異常なＦＧＦ−ＣＸ活性に関連する障害（例えば、神経障害、癌関連障害または妊娠障害）を処置（予防的または治療的に）するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の変異内容が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０２６７】
薬理ゲノム学は、罹患された人において変更された薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝的変化を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６，Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７，Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。遺伝的状態は、薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達されるか（変更された薬物作用）、または遺伝的状態は、身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂取後の溶血である。
【０２６８】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの罹患率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０２６９】
従って、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質の活性、ＦＧＦ−ＣＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＦＧＦ−ＣＸの遺伝子の変異内容を決定されて、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＦＧＦ−ＣＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２７０】
（臨床的効果のモニタリング）
ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングおよび臨床試験においてもまた適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＦＧＦ−ＣＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加、またはＦＧＦ−ＣＸ活性をアップレギュレートする効力を、減少されたＦＧＦ−ＣＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートされたＦＧＦ−ＣＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＦＧＦ−ＣＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＦＧＦ−ＣＸの活性をダウンレギュレートする効力を、増加されたＦＧＦ−ＣＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートされたＦＧＦ−ＣＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。このような臨床試験において、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、増殖障害または神経障害に関与した他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ　ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の応答性のマーカーとして使用され得る。
【０２７１】
例えば、ＦＧＦ−ＣＸを含む遺伝子（これは、ＦＧＦ−ＣＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＦＧＦ−ＣＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＦＧＦ−ＣＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０２７２】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＦＧＦ−ＣＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較する工程；ならびに（ｖｉ）この比較に従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を増加するために（すなわち、この薬剤の効力を増加するために）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を減少するために（すなわち、この薬剤の効力を減少するために）望ましくあり得る。
【０２７３】
（処置の方法）
本発明は、ＦＧＦ−ＣＸの異常な発現または活性に関連する障害の危険性がある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。
【０２７４】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）ＦＧＦ−ＣＸペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＦＧＦ−ＣＸペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、ＦＧＦ−ＣＸペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与が、相同組換えによってＦＧＦ−ＣＸペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）ＦＧＦ−ＣＸペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０２７５】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＦＧＦ−ＣＸペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０２７６】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（またはＦＧＦ−ＣＸペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０２７７】
１つの局面において、本発明は、被験体においてＦＧＦ−ＣＸの異常な発現または活性と関連する疾患または状態を、ＦＧＦ−ＣＸの発現または少なくとも１つのＦＧＦ−ＣＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。ＦＧＦ−ＣＸの異常な発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＦＧＦ−ＣＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＦＧＦ−ＣＸ異常の型に依存して、例えば、ＦＧＦ−ＣＸアゴニスト薬剤またはＦＧＦ−ＣＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【０２７８】
本発明の別の局面は、治療目的のためにＦＧＦ−ＣＸ発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＦＧＦ−ＣＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、１つ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＦＧＦ−ＣＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＦＧＦ−ＣＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、１つ以上のＦＧＦ−ＣＸタンパク質活性を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＦＧＦ−ＣＸ核酸分子、および抗ＦＧＦ−ＣＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＦＧＦ−ＣＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＦＧＦ−ＣＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０２７９】
本発明はさらに、以下の非限定的な実施例において記載される。
【０２８０】
（実施例）
（実施例１．ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の同定）
ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＦＧＦ−ＣＸ（Ｋｏｇａ，Ｃ．，Ａｄａｔｉ，Ｎ．，Ｎａｋａｔａ，Ｋ．，Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，Ｋ．，Ｆｕｒｕｈａｔａ，Ｙ．，Ｓａｔａ，Ｓ．，Ｔｅｉ，Ｈ．，Ｓａｋａｔｉ，Ｙ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．，Ｓｈｉｏｋａｗａ，Ｋ．およびＹｏｋｏｙａｍａ，Ｋ．Ｋ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６１，７５６−７６５；登録番号ＡＢ０１２６１５）を問い合わせとして用いて、ＧｅｎｂａｎｋヒトゲノムＤＮＡ配列のＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０）検索に従って、同定した。この検索は、第８染色体における高い相同性の遺伝子座（登録番号ＡＢ０２０８５８）を同定した。イントロン／エキソン境界を、標準的なコンセンサススプライシングパラメータ（Ｍｏｕｎｔ，Ｓ．Ｍ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１，１６９０−１６９２）を既知のＦＧＦ由来の相同性と共に使用して、推定した。ＦＧＦ−ＣＸ開始コドンは、ＡＢ０２０８５８の配列のｂｐ１６２１４に局在しており、そしてこのエキソンの残りの３’部分は、ｂｐ１５９３０まで続く。ＦＧＦ−ＣＸの５’ＵＴＲを、公共のＥＳＴ（登録番号ＡＡ２３２７２９、ＡＡ２３６５２２、ＡＩ２７２８７６およびＡＩ２７２８７８）を使用して、この開始コドンの上流にさらに６０６ｂｐだけ伸長させた。ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の残りの構造は、遺伝子座ＡＢ０２０８５８に関連する場合に、以下の通りである：イントロン１（ｂｐ１５９２９〜９９４２）；エキソン２（ｂｐ９９４１〜９８３８）；イントロン２（ｂｐ９８３７〜７５００）；エキソン３（ｂｐ７４９９で開始し、そして図１３に示すように続く；３’未翻訳領域の構造は、未決定である）。
【０２８１】
前段落の手順によって発見された遺伝子は、３つのエキソンおよび２つのイントロンを含む（図１３）。ＤＮＡ配列は、開始メチオニンの１１７ｂｐ上流にインフレーム終止コドンを有する、２１１アミノ酸残基のＯＲＦを推定する。この遺伝子が由来したＤＮＡセグメントは、染色体８ｐ２１．３−ｐ２２（放射線ハイブリッド分析によって確認された位置）にマッピングされる（実施例２を参照のこと）。
【０２８２】
アミノ酸残基１２５〜１４８の間に位置する、ＰＲＯＳＩＴＥ検索（Ｂｕｃｈｅｒ，Ｐ．＆Ｂａｉｒｏｃｈ，Ａ．（１９９４）Ｉｓｍｂ．２，５３−６１）によって同定したＦＧＦシグネチャーモチーフ（Ｇ−Ｘ−［ＬＩ］−Ｘ−［ＳＴＡＧＰ］−Ｘ（６，７）−［ＤＥ］−Ｃ−Ｘ−［ＦＬＭ］−Ｘ−Ｅ−Ｘ（６）−Ｙ）に二重下線を引き、そしてイントロン／エキソン境界を、矢印で示す。イントロン１およびイントロン２は、それぞれ、５９８８ｂｐ長および２３３８ｂｐ長である。５’ＵＴＲ配列を、公開のＥＳＴから誘導し、そして、その全体は示していない。
【０２８３】
（実施例２．ＦＧＦ−ＣＸの照射ハイブリッドマッピング）
ヒト染色体マーカーを用いた照射ハイブリッドマッピンングを、ＦＧＦ−ＣＸについて実行した。使用した手順は、Ｓｔｅｅｎ，ＲＧら（Ａ　Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｌｉｎｋａｇｅ　ａｎｄ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｒａｔ，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９９（１９９９年５月２１日にオンラインで公開された）Ｖｏｌ．９，ＡＰ１−ＡＰ８，１９９９）に記載される手順と同様である。無作為化した照射誘導ヒト染色体フラグメントを含む９３個の細胞クローンのパネルを、特有の様式で探索しているクローンを同定するように設計したＰＣＲプライマーを用いて、９６ウェルプレートにおいてスクリーニングした。ＦＧＦ−ＣＸをコードするヌクレオチド配列が同定されるＤＮＡセグメントを、染色体８ｐ２１．３−ｐ２２に対するマッピングとして印をつけた。ＦＧＦ−ＣＸが、マーカーＡＦＭ１７７ＸＢ１０と重複する座位であり、かつマーカーＷＩ−５１０４から１．６ｃＲ、マーカーＷＩ−９２６２から３．２ｃＲである座位において、染色体８にマッピングすることを見出すことによって、本分析によりこの結果を正確にした。
【０２８４】
（実施例３．ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードする配列の分子クローニング）　全長ＦＧＦ−ＣＸをコードするオープンリーディングフレームを示すＤＮＡセグメントのＰＣＲによる増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。順方向プライマーは、ＢｇｌＩＩ制限部位（ＡＧＡＴＣＴ）およびコンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）を含む。逆方向プライマーは、さらなるサブクローニング目的のためにインフレームのＸｈｏＩ制限部位を含む。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方が、５’クランプ配列（ＣＴＣＧＴＣ）を含む。プライマーの配列は、以下である：
【０２８５】
【化１】

。
【０２８６】
５０μｌ容量中、総量５ｎｇのヒト前立腺ｃＤＮＡテンプレート、各１μＭのＦＧＦ−ＣＸ順方向プライマーおよびＦＧＦ−ＣＸ逆方向プライマー、５μＭ　ｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ　２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＰＣＲ反応を実行した。以下のＰＣＲ反応条件を使用した：
ａ）９６℃　３分間
ｂ）９６℃　３０秒間　変性
ｃ）７０℃　３０秒間、プライマーアニーリング（この温度は、１℃／サイクルずつ徐々に低下させた。）
ｄ）７２℃　１分間　伸長。
【０２８７】
工程（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す。
【０２８８】
ｅ）９６℃　３０秒間　変性
ｆ）６０℃　３０秒間　アニーリング
ｇ）７２℃　１分間　伸長
工程（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す。
【０２８９】
ｈ）７２℃　５分間　最終伸長。
【０２９０】
約６４０ｂｐの予想サイズを有する単一ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上での電気泳動後に単離し、そしてｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。クローン化した挿入物を、ベクター特異的Ｍ１３順方向プライマー（−４０）およびＭ１３逆方向プライマーを用いて配列決定し、これによって、このヌクレオチド配列が、上流ＢｇｌＩＩクローニング部位と下流ＸｈｏＩクローニング部位との間に直接挿入された図１（配列番号１）の配列に１００％同一であることを確認した。クローン化された配列は、推定ＦＧＦ−ＣＸ全長タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成する。このクローンを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆｌ９と呼ぶ。
【０２９１】
（実施例４．哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃの調製）
オリゴヌクレオチドプライマー、ｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ順方向（ＣＴＣＧＴ　ＣＣＴＣＧ　ＡＧＧＧＴ　ＡＡＧＣＣ　ＴＡＴＣＣ　ＣＴＡＡＣ（配列番号１４））およびｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ逆方向（ＣＴＣＧＴ　ＣＧＧＧＣ　ＣＣＣＴＧ　ＡＴＣＡＧ　ＣＧＧＧＴ　ＴＴＡＡＡ　Ｃ（配列番号１５））を、Ｖ５およびＨｉｓ６を含むｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）発現ベクターからフラグメントを増幅するように設計した。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＡｐａＩで消化したＩｇκリーダー配列を保有するｐＳｅｃＴａｇ２　Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ　ＣＡ）に連結した。インフレームでＩｇκリーダーおよびＶ５−Ｈｉｓ６を含む生じたベクター（ｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓ）の正確な構造を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。このベクターｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓを、ＰｍｅＩおよびＮｈｅＩで消化して、正確なフレームで上記のエレメントを維持するフラグメントを提供した。ＰｍｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＫｌｅｎｏｗおよびＮｈｅＩで処理したベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。生じるベクターをｐＣＥＰ４／Ｓｅｃと命名し、そしてこのベクターは、インフレームでＩｇκリーダー、目的のクローン挿入のための部位、ならびにＶ５エピトープおよび６×ＨｉｓをＰＣＭＶおよび／またはＰＴ７プロモーターの制御下で含む。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃは、任意のタンパク質をＩｇκ鎖シグナルペプチドに続くマルチクローニング部位に融合させることによって、異種タンパク質の発現および分泌を可能にする発現ベクターである。Ｃ末端のＶ５エピトープタグおよび６×Ｈｉｓ　ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在を補助として、発現されたタンパク質を検出および精製する。
【０２９２】
（実施例５．ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞におけるＦＧＦ−ＣＸの発現）
ＦＧＦ−ＣＸ配列を含むＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆ１９（実施例３）から単離し、そしてＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４／Ｓｅｃにサブクローニングして、発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸを作製した。このｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸベクターを、製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて２９３細胞にトランスフェクトした。細胞ペレットおよび上清を、トランスフェクションの７２時間後に収集し、抗Ｖ５抗体を用いたウエスタンブロッティング（還元条件）によってＦＧＦ−ＣＸ発現について調べた。図１２は、ＦＧＦ−ＣＸが２９３細胞によって分泌された約３４ｋＤａの見かけの分子量（Ｍｒ）を有するポリペプチドとして発現されることを示す。さらに、主要でないバンドが、約３１ｋａに観察される。
【０２９３】
（実施例６．Ｅ．ｃｏｌｉ．におけるＦＧＦ−ＣＸの発現）
ベクターｐＲＳＥＴＡ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素で消化した。配列　５’　ＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣＣＴＡＣ　３’（配列番号１６）および５’　ＴＣＧＡＧＴＡＧＧＣＴＧＡＣ　３’（配列番号１７）のオリゴヌクレオチドリンカーを、３７℃でアニーリングし、そしてＸｈｏＩ−ＮｃｏＩで処理したｐＲＳＥＴＡに連結した。生じるベクターを、制限分析および配列決定によって確認し、そしてｐＥＴＭＹと命名した。ＦＧＦ−ＣＸをコードする配列のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント（実施例３を参照のこと）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化したベクターｐＥＴＭＹに連結した。発現ベクターを、ｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸと命名する。このベクターにおいて、ｈＦＧＦ−ＣＸは、そのＮ末端が６×ＨｉｓタグおよびＴ７エピトープに融合していた。次いで、プラスミドｐＥＴＭＹ−ＦＧＦ−ＣＸを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にトランスフェクトし、タンパク質ＦＧＦ−ＣＸの発現を、製造業者の指示書に従って誘導した。誘導後、総細胞を収集し、そしてタンパク質を、抗ＨｉｓＧｌｙ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。図１４は、ＦＧＦ−ＣＸが約３２ｋＤａのタンパク質として発現されたことを示す。
【０２９４】
（実施例７．クローン化されたシグナルペプチド有りおよび無しでの、組み換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質の発現比較）
ａ）シグナルペプチド無しでの発現
発明の詳細な説明中で記載したように、ＦＧＦ−ＣＸは古典的アミノ末端シグナル配列を明らかに欠く。ＦＧＦ−ＣＸが哺乳動物細胞から分泌されるか否かを決定するために、全長ＦＧＦ−ＣＸタンパク質をコードするＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして得られるｃＤＮＡを、ＴＡ−ＡＢ０２０８５−Ｓ２７４−Ｆｌ９（実施例３）からＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。これは、ｐＦＧＦ−ＣＸと称される哺乳動物発現ベクターを提供する。この構築物は、Ｖ５エピトープタグおよびポリヒスチジンタグをタンパク質のカルボキシ末端に組み込み、それぞれ、このタンパク質の同定および精製を補助し、そして約２７ｋＤａのポリペプチドを生成するはずである。２９３ヒト胚性腎臓細胞に一過性トランスフェクションした後、馴化培地をトランスフェクションの４８時間後に収集した。
【０２９５】
馴化培地へのＦＧＦ−ＣＸの分泌に加えて、ＦＧＦ−ＣＸが細胞ペレット／ＥＣＭと会合することもまた、見出された（データには示さず）。ＦＧＦは、細胞表面上および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に存在する硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合することが公知であり、本発明者らは、ＦＧＦ−ＣＸがこのように隔離される可能性を調査した。このために、ＦＧＦ−ＣＸをトランスフェクトした細胞を、１００□Ｍ　スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）（増殖因子とＨＳＰＧとの間の低親和性相互作用を破壊することが公知の化合物（Ｌａ　Ｒｏｃｃａ，Ｒ．Ｖ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．＆Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．Ｅ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ　２，１０６−１１５））を含む０．５ｍｌ　ＤＭＥＭで、３０分間４℃で処理することによって抽出した。次いで、スラミン抽出した馴化培地を、収集し、そして遠心分離（５分間；２０００×ｇ）で清澄した。
【０２９６】
次いで、馴化培地およびスラミン抽出物を等容量の２×ゲルローディング緩衝液と混合した。サンプルを１０分間煮沸し、還元条件下、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＤａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、そしてニトロセルロースフィルター（Ｎｏｖｅｘ）に転写した。ウエスタン分析を、ＨＲＰ結合体化抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｎｎａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて標準的な手順に従って実行した。
【０２９７】
予想Ｍｒを有する１つのバンドを、ｐＦＧＦ−ＣＸでトランスフェクトした２９３細胞からの馴化培地中で同定した（図１１Ａ、レーン１）。コントロールベクターでトランスフェクトした細胞からの馴化培地は、抗体と反応しなかった（図１１Ａ、レーン５）。スラミン処理後、有意な量のＦＧＦ−ＣＸが実際に細胞表面／ＥＣＭから放出され得たことが見出され、このことは、ＨＳＰＧがおそらくこのタンパク質の分離に役割を果たすことを示す（図１１Ａ、レーン２）。これらの結果は、ＦＧＦ−ＣＸが古典的シグナルペプチド無しで分泌され得ることを示す。
【０２９８】
組換えＦＧＦ−ＣＸタンパク質は、ＤＮＡ合成および細胞増殖（おそらく細胞表面レセプターへのＦＧＦ−ＣＸの高い親和性結合を介して媒介され、そしてＨＳＰＧとの低い親和性相互作用を介して調節される効果）を刺激する。スラミン抽出データは、ＦＧＦ−ＣＸが細胞表面上および／またはＥＣＭに存在するＨＳＰＧに結合することを示唆する。
【０２９９】
ｂ）シグナルペプチド有りでの発現
タンパク質分泌を増強させる目的のために、ＦＧＦ−ＣＸ　ｃＤＮＡがＩｇκ遺伝子由来の切断可能なアミノ末端分泌シグナル配列とインフレームで融合している構築物（ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸ）を作製した。生じるタンパク質もまた、ｐＦＧＦ−ＣＸについて上記で記載したようなカルボキシ末端Ｖ５およびポリヒスチジンタグを含んだ。２９３細胞へのトランスフェクション後、約３１ｋＤａの予想Ｍｒを有するタンパク質産物を得て、そしてスラミンが有意な量の分離ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を放出することをまた見出した（図１１Ａ；レーン３および４）。予想したように、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸは、ｐＦＧＦ−ＣＸよりも、多くの可溶性ＦＧＦ−ＣＸタンパク質を生成した。【０３００】
２９３細胞についての上記の結果と類似した結果を、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞で得た（図１１Ｂ）。
【０３０１】
（実施例８．ＰＣＲによる、ＦＧＦ−ＣＸ核酸のリアルタイム定量発現分析）　種々のクローンの定量発現を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍで実行したリアルタイム定量ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析）によって、４１個の正常サンプルおよび５５個の腫瘍サンプルにおいて評価した（ほとんどの場合、図１５のパネルＡおよびＢに示すサンプルは、表３中に同定されるサンプルである）。表３において、以下の略語を使用する：
ｃａ．＝癌腫、
^＊＝転移から樹立された、
ｍｅｔ＝転移、
ｓ　ｃｅｌｌ　ｖａｒ＝小細胞変異体、
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小、
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮、
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水、
ｇｌｉｏ＝神経膠腫、
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０３０２】
第１に、９６ＲＮＡサンプルをβアクチンおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたは約１ｎｇポリＡ＋）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写酵素キット（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）および製造者のプロトコールに従ったランダムな６量体を使用してｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌで実施し、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコールに従って、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ　ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ試薬（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；各々、カタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、別々のプレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μｌで実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、ｌｏｇスケールを使用するＣＴ値（所与のサンプルが、蛍光の閾値レベル超えるサイクル）として記録し、所与のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差は、２のΔＣＴ乗として示した。次いで、相対発現パーセントを、このＲＮＡの差の逆数をとって１００を掛けることにより得る。βアクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られたＣＴの平均値は、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルは、β−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従ってこのサンプルと比較して希釈した。
【０３０３】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。プローブおよびプライマーを、インプットとしてクローン１０３２６２３０．０．３８の配列を使用する、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ　ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｐｏｗｅｒ　ＰＣ用のヴァージョンＩ）に従って、各アッセイに対して設定した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設計した：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融解温度（Ｔ_ｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔ_ｍ＝５９℃、プライマーの最大差＝２℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴ_ｍは、プライマーＴ_ｍよりも１０℃高くなければならない、アンプリコンサイズ７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、未反応の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを実証するために、質量分析法によって評価した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの最終濃度は、各々９００ｎＭであり、そしてプローブの濃度は、２００ｎＭであった。
【０３０４】
ＰＣＲについて、各組織および各細胞株からの正規化ＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（ＦＧＦ−ＣＸに特異的なプローブおよび内部標準として作用するための第２の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルを、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、ｄＮＴＰ（１：１：１：２の比率のｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＵ）、０．２５　Ｕ／ｍｌ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ^ＴＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌ　ＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌ　逆転写酵素と共に、１×ＴａｑＭａｎ^ＴＭ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用いて、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７７００に対して設定した。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、続いて、以下のようにＰＣＲ増幅した：９５℃　１０分間、次いで、９５℃　１５秒間、６０℃　１分間を４０サイクル。
【０３０５】
（表３．ＴａｑＭａｎ発現分析において使用した組織サンプル）
番号　組織サンプル
１　内皮細胞
２　内皮細胞（処理）
３　膵臓
４　膵臓ｃａ．　ＣＡＰＡＮ　２
５　脂肪
６　副腎
７　甲状腺
８　唾液腺
９　下垂体
１０　脳（胎児）
１１　脳（全体）
１２　脳（小脳扁桃）
１３　脳（小脳）
１４　脳（海馬）
１５　脳（視床下部）
１６　脳（黒質）
１７　脳（視床）
１８　脊髄
１９　ＣＮＳ　ｃａ．（ｇｌｉｏ／ａｓｔｒｏ）Ｕ８７−ＭＧ
ＣＮＳ　ｃａ．（ｇｌｉｏ／ａｓｔｒｏ）Ｕ−１１８−
２０　ＭＧ
２１　ＣＮＳ　ｃａ．（ａｓｔｒｏ）ＳＷ１７８３
ＣＮＳ　ｃａ．^＊（ｎｅｕｒｏ；ｍｅｔ）ＳＫ−Ｎ
２２　ＡＳ
２３　ＣＮＳ　ｃａ．（ａｓｔｒｏ）ＳＦ−５３９
２４　ＣＮＳ　ｃａ．（ａｓｔｒｏ）ＳＮＢ−７５
２５　ＣＮＳ　ｃａ．（ｇｌｉｏ）ＳＮＢ−１９
２６　ＣＮＳ　ｃａ．（ｇｌｉｏ）　Ｕ２５１
２７　ＣＮＳ　ｃａ．（ｇｌｉｏ）ＳＦ−２９５
２８　心臓
２９　骨格筋
３０　骨髄
３１　胸腺
３２　脾臓
３３　リンパ節
３４　結腸（上行）
３５　胃
３６　小腸
３７　結腸　ｃａ．ＳＷ４８０
結腸　ｃａ．^＊（ＳＷ４８０
３８　ｍｅｔ）ＳＷ６２０
３９　結腸　ｃａ．　ＨＴ２９
４０　結腸　ｃａ．ＨＣＴ−１１６
４１　結腸　ｃａ．ＣａＣｏ−２
４２　結腸　ｃａ．ＨＣＴ−１５
４３　結腸　ｃａ．ＨＣＣ−２９９８
胃　ｃａ．^＊（肝臓　ｍｅｔ）　ＮＣＩ−
４４　Ｎ８７
４５　膀胱
４６　気管
４７　腎臓
４８　腎臓（胎児）
４９　腎臓　ｃａ．７８６−０
５０　腎臓　ｃａ．Ａ４９８
５１　腎臓　ｃａ．ＲＸＦ　３９３
５２　腎臓　ｃａ．ＡＣＨＮ
５３　腎臓　ｃａ．ＵＯ−３１
５４　腎臓　ｃａ．ＴＫ−１０
５５　肝臓
５６　肝臓（胎児）
５７　肝臓　ｃａ．（肝芽腫）ＨｅｐＧ２
５８　肺
５９　肺（胎児）
６０　肺　ｃａ．（小細胞）ＬＸ−１
６１　肺　ｃａ．（小細胞）　ＮＣＩ−Ｈ６９
６２　肺　ｃａ．（ｓ．ｃｅｌｌ　ｖａｒ．）ＳＨＰ−７７
６３　肺　ｃａ．（大細胞）ＮＣＩ−Ｈ４６０
６４　肺　ｃａ．（ｎｏｎ−ｓｍ．ｃｅｌｌ）Ａ５４９
６５　肺　ｃａ．（ｎｏｎ−ｓ．ｃｅｌｌ）ＮＣＩ−Ｈ２３
６６　肺　ｃａ．（ｎｏｎ−ｓ．ｃｅｌｌ）ＨＯＰ−６２
６７　肺　ｃａ．（ｎｏｎ−ｓ．ｃｌ）ＮＣＩ−Ｈ５２２
６８　肺　ｃａ．（ｓｑｕａｍ．）ＳＷ　９００
６９　肺　ｃａ．（ｓｑｕａｍ．）ＮＣＩ−Ｈ５９６
７０　乳腺
７１　胸部　ｃａ．^＊（ｐｌ．ｅｆｆｕｓｉｏｎ）ＭＣＦ−７
７２　胸部　ｃａ．^＊（ｐｌ．ｅｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
７３　胸部　ｃａ．^＊（ｐｌ．ｅｆｆｕｓｉｏｎ）　Ｔ４７Ｄ
７４　胸部　ｃａ．ＢＴ−５４９
７５　胸部　ｃａ．ＭＤＡ−Ｎ
７６　卵巣
７７　卵巣　ｃａ．ＯＶＣＡＲ−３
７８　卵巣　ｃａ．ＯＶＣＡＲ−４
７９　卵巣　ｃａ．ＯＶＣＡＲ−５
８０　卵巣　ｃａ．ＯＶＣＡＲ−８
８１　卵巣　ｃａ．ＩＧＲＯＶ−１
８２　卵巣　ｃａ．^＊（腹水）ＳＫ−ＯＶ−３
８３　子宮筋層
８４　子宮
８５　胎盤
８６　前立腺
８７　前立腺　ｃａ．^＊（骨ｍｅｔ）ＰＣ−３
８８　精巣
８９　黒色腫　Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ
９０　黒色腫^＊（ｍｅｔ）Ｈｓ６８８（Ｂ）．Ｔ
９１　黒色腫　ＵＡＣＣ−６２
９２　黒色腫　Ｍ１４
９３　黒色腫　ＬＯＸ　ＩＭＶＩ
９４　黒色腫^＊（ｍｅｔ）ＳＫ−ＭＥＬ−５
９５　黒色腫　ＳＫ−ＭＥＬ−２８
９６　黒色腫　ＵＡＣＣ−２５７
以下のプライマーおよびプローブを設計した。各々は、ＦＧＦ−ＣＸに特異的であるように、非常に相同性であるヒトＦＧＦ−９遺伝子およびヒトＦＧＦ−１６遺伝子の対応する領域に、最少３つのミスマッチを保有する。セットＡｇ８１ｂは、図１（配列番号１）の塩基２７０〜塩基３４３の領域をカバーする。これらは、他の公知のＦＧＦファミリーのメンバーを検出すべきではない。使用したプライマーおよびプローブは以下であった。
Ａｇ８１ｂ（Ｆ）：５’−ＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＧＴＡ−３’（配列番号１８）；
Ａｇ８１ｂ（Ｒ）：５’−ＴＧＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１９）；
Ａｇ８１ｂ（Ｐ）：５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号２０）。
【０３０６】
代表的な実験からの結果を、図１５パネルＡおよび図１５パネルＢに示す。発現を、最高レベルの発現を示すサンプルのパーセンテージとしてプロットする。四連の泳動を行い、これを、種々に陰影を付けたバーで表した。試験された３９個の正常ヒト組織において、ＦＧＦ−ＣＸは、脳、特に小脳において最も高度に発現されることが見出された（図１５パネルＡおよび図１５パネルＢ）。中枢神経系の他の組織は、はるかにより弱いレベルのＦＧＦ−ＣＸを発現した。試験された５４個のヒト腫瘍細胞株のうち、ＦＧＦ−ＣＸは、肺癌腫細胞株（ＬＸ−１）、結腸癌腫細胞株（ＳＷ−４８０）、結腸癌細胞株および転移（ＳＷ４８０）、ならびに胃癌腫細胞株（ＮＣＩ−Ｎ８７；図１５パネルＡおよび図１５パネルＢを参照のこと）において、最も高度に発現されることが見出された。
【０３０７】
さらなるリアルタイム（実時間）の発現分析を、外科手術の間に得られた腫瘍組織の広範なパネルにおいて実施した。これらの組織は、それ自体実際の腫瘍由来の部分、ならびに代表的に既に炎症しており、そして形成異常の組織学的証拠を示す、「正常隣接組織（ＮＡＴ）」と称される部分を含む。ＦＧＦ−ＣＸに特異的であるように選択されたプライマー−プローブセット（Ａｇ８１）を、このような外科組織サンプルと共にＴａｑＭａｎ実験において使用した。ここでは、二連の泳動を実施した：
Ａｇ８１（Ｆ）：５’−ＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＧＡＴ−３’（配列番号２１）；
Ａｇ８１（Ｒ）：５’−ＡＧＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２２）；および
Ａｇ８１（Ｐ）：ＴＥＴ−５’−ＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号２３）。
Ｓｅｔ　Ａｇ８１は、図１（配列番号１）の塩基４７７〜塩基５５４の領域をカバーする。この複写物は、図１５パネルＣおよび図１５パネルＤにおいて、灰色および黒の陰影をつけたバーとして示される。この結果は、腫瘍およびその形成異常性ＮＡＴサンプルの多くの一致した対について、ＦＧＦ−ＣＸが、腫瘍自体ではなくＮＡＴにおいて；より詳細には、腫瘍に隣接した実質細胞において、高度に発現されることを劇的に示す。この一致したパターンを生じる例としては、卵巣癌、膀胱癌、子宮癌、肺癌、前立腺癌、および肝臓癌が挙げられる。
【０３０８】
理論によって限定されないが、図１５パネルＣおよび図１５パネルＤの結果から、ＦＧＦ−ＣＸが、宿主組織（内皮細胞、間質線維芽細胞、浸潤リンパ球および類似の細胞型）における腫瘍上皮および／または他の成分のパラクリン刺激による腫瘍進行に寄与し得ると考えられる。同様に、ＦＧＦ−ＣＸは、オートクライン様式でＦＧＦ−ＣＸを合成または分泌する宿主組織中の成分を刺激するように機能し得る。これらの宿主成分細胞は、引き続いて、腫瘍画分において作用し得る。
【０３０９】
一致しない正常組織と比較した、ＦＧＦ−ＣＸの発現プロフィールの上昇によって、ＦＧＦ−ＣＸが、腫瘍進行における予定的（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）または促進的な役割を果たすことが示唆される。従って、多くの標的化アプローチ（制限することのない例として、モノクローナル抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＦＧＦ−ＣＸと同族（ｃｏｇｎａｔｅ）レセプターとの相互作用を中和するペプチド、およびＦＧＦ−ＣＸについての未同定レセプターを調節する小分子の薬物を含む）のいずれかを使用するＦＧＦ−ＣＸの治療的標的化は、疾患進行に対してポジティブな治療的影響を有すると予期される。同様に、腫瘍進行におけるＦＧＦ−ＣＸの生物活性を調節するためのこのような薬剤の使用は、従来の化学療法および放射線療法に相乗作用を与えるか、またはそれらを増強すると予期される。ＦＧＦ−ＣＸの治療的標的化が適用され得る特定の疾患適用としては、結腸、前立腺、肺、腎臓、子宮、乳房、膀胱、卵巣の腺癌が挙げられる。
【０３１０】
（実施例９．組換えＦＧＦ−ＣＸによって取りこまれるブロモデオキシウリジンの刺激）
２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を製造業者のプロトコール（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って使用してトランスフェクトした。細胞に、トランスフェクションの５時間後、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。ＢｒｄＵおよび増殖アッセイ（実施例１０）のためのタンパク質を生成するために、細胞を洗浄し、そしてトランスフェクションの１８時間後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で給餌した。４８時間後、この培地を捨て、そしてこの細胞単層を、０．５ｍｌのＤＭＥＤ中で３０分間４℃で、１００μＭスラミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共にインキュベートした。次いで、このスラミン抽出馴化培地を取り出し、遠心分離（５分間；２０００×ｇ）によって清澄化し、そしてカルボキシ末端ポリヒスチジンタグを利用してＴＡＬＯＮ金属アフィニティークロマトグラフィーに、製造業者の指示書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）に従って供した。保持された融合タンパク質を、イミダゾールでカラムを洗浄することによって放出した。
【０３１１】
ＦＧＦ−ＣＸタンパク質濃度を、既知の濃度のＶ５タグ化タンパク質を用いて作成された検量線を使用するウェスタン分析によって推定した。ウェスタン分析のために、馴化培地をトランスフェクションの４８時間後に収集し、次いで、細胞単層を、４℃で３０分間、１００μＭスラミンを含有する０．５ｍｌ　ＤＭＥＭでインキュベートした。次いで、このスラミン含有馴化培地を収集した。
【０３１２】
コントロールタンパク質を生成するために、２９３−ＥＢＮＡ細胞に、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトし、そして上記に概要を述べた精製手順に供した。
【０３１３】
組換えＦＧＦ−ＣＸを、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイにおいてＤＮＡ合成を誘導するその能力について試験した。ＮＩＨ　３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＣＣＤ−１０７０Ｓｋ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２０９１）、またはＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４２７）を、９６ウェルプレートにおいて、約１００％コンフルエントまで培養し、ＤＭＥＭで洗浄し、そして２４時間（ＮＩＨ　３Ｔ３）または４８時間（ＣＣＤ−１０７０ＳｋおよびＭＧ−６３）、ＤＭＥＭ中で血清飢餓（ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ）させた。次いで、組換えＦＧＦ−ＣＸまたはコントロールタンパク質を、細胞に１８時間添加した。ＢｒｄＵアッセイは、５時間のＢｒｄＵ取り込み時間を使用して、製造業者の仕様書（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って実施した。
【０３１４】
ＦＧＦ−ＣＸは、約５ｎｇ／ｍｌの最大半減濃度で、ＮＩＨ　３Ｔ３マウス線維芽細胞においてＤＮＡ合成を誘導することが見出された（図１６Ａ）。対照的に、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞から精製されたタンパク質は、ＤＮＡ合成を誘導しなかった。ＢｒｄＵ取り込みによって測定された場合、ＦＧＦ−ＣＸが種々のヒト細胞株（ＣＣＤ−１０７０Ｓｋ正常ヒト皮膚線維芽細胞（図１６Ｂ）、ＣＣＤ−１１０６ケラチノサイト（図１６Ｃ）、ＭＧ−６３骨肉腫細胞（データを示さず）および乳房上皮細胞を含む）において比較できる用量レベルで、ＤＮＡ合成を誘導することもまた見出された。
【０３１５】
（実施例１０．組換えＦＧＦ−ＣＸによる細胞増殖の誘導）
組換えＦＧＦ−ＣＸが細胞増殖を誘導するか否かを決定するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を約５０％コンフルエンスまで６ウェルプレート中で培養し、ＤＭＥＭで洗浄し、そして組換えＦＧＦ−ＣＸまたはコントロールタンパク質を含有するＤＭＥＭで４８時間給餌し、次いでカウントした。細胞をトリプシン処理し、そしてそれらをＢｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｚ１シリーズ計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）でカウントすることによって、細胞数を決定した。ＦＧＦ−ＣＸは、このアッセイにおいて、コントロールタンパク質と相対的に、約３倍の細胞数増加を誘導することが見出された（図１７）。
【０３１６】
増殖における形態学的変化事象を詳述するために、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞を、ＤＭＥＭ／２％仔ウシ血清中で組換えＦＧＦ−ＣＸまたはコントロールタンパク質で４８時間処理し、そしてＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｖｅｒｔ　１００顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で写真撮影した。
【０３１７】
より高い細胞密度を達成することに加えて（図１７）、実施例９に記載のように調製されたＦＧＦ−ＣＸの存在下で培養されたＮＩＨ　３Ｔ３細胞は、無秩序な増殖パターンを示した。これは、接触阻害の欠損を示す（図１８）。さらに、個々の細胞は、細長くかつ屈曲性であることが見出された。これらの結果は、ＦＧＦ−ＣＸが、増殖因子として作用することを示し、そして組換えＦＧＦ−ＣＸが、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞の形態学的トランスフォーメーションを媒介することを示唆する。
【０３１８】
（実施例１１．ヌードマウスにおける、異所性ＦＧＦ−ＣＸトランスフェクトＮＩＨ　３Ｔ３細胞による腫瘍形成）
ＮＩＨ　３Ｔ３細胞を、製造業者（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｐｌｕｓを用いて、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸまたはコントロールベクターでトランスフェクトした。細胞に、トランスフェクションの５時間後、１０％仔ウシ血清（ＣＳ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸトランスフェクト細胞は、トランスフェクションの４８時間後までに形態学的にトランスフォーメーションされ、そしてその形態学的トランスフォーメーションを、ハイグロマイシン含有増殖培地中での２週間の選択後に維持した。対照的に、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞は、その正常な形態を維持した（データは示さず）。従って、トランスフェクトされた細胞は、例えば、実施例１０に報告された実験に基づいて予期されたように挙動する。
【０３１９】
異所性腫瘍の誘導を研究するために、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞を、種々の実験ベクターおよびコントロールベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を、ＤＭＥＭ／５％ＣＳ（ｐＦＧＦ−ＣＸトランスフェクト細胞に対して）または５００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを補充したＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−ＦＧＦ−ＣＸトランスフェクト細胞に対して）のいずれかに配置した。２週間の培養後、サブコンフルエントな細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳで中和し、ＰＢＳで洗浄し、そしてカウントした。ＰＢＳ中の１００万個の細胞を、雌性無胸腺症ヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の側方皮下組織中に注射した。
【０３２０】
ＮＩＨ　３Ｔ３細胞に、ＦＧＦ−ＣＸ発現プラスミド（ｐＦＧＦ−ＣＸおよびｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸ）またはそれらの適切なコントロールベクターでトランスフェクトした。本発明者らは、いずれかのＦＧＦ−ＣＸ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞が、トランスフェクションの４８時間後までに形態学的にトランスフォーメーションされ（データは示さず）、そして組換えＦＧＦ−ＣＸへのＮＩＨ　３Ｔ３細胞の曝露後に生じる表現型と類似の表現型を有すること（図１７）を見出した。対照的に、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞は、その正常な形態を維持した（データは示さず）。
【０３２１】
インビボでのＦＧＦ−ＣＸの異所性発現がＮＩＨ　３Ｔ３細胞の腫瘍形成性を誘導するか否かを決定するために、安定なトランスフェクト体を作製し、そしてヌードマウス中に皮下注射した。１１日目までに、ｐＦＧＦ−ＣＸトランスフェクト細胞またはｐＩｇκ−ＦＧＦ−ＣＸトランスフェクト細胞のいずれかを注射された全ての動物は、１４日目までサイズを増大させる急速増殖性腫瘍を有していたが、コントロール細胞を注射された動物はいずれも、２週間目までに腫瘍を発生しなかった（図１９）。これらの結果は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子を保有するベクターでのトランスフェクションによって形質転換された細胞が、インビボでの腫瘍の発生および増殖を促進することを示す。
【０３２２】
（実施例１２．線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質をコードする核酸を同定する方法）
本発明のさらなる線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質配列（ＦＧＦ２０Ｘ）（本明細書においてクローンＣＧ５３１３５−０２とも呼ぶ）を、この配列のインシリコ予想によって、ｃＤＮＡフラグメントの実験的クローニングによって誘導した。このＤＮＡ配列の全長またはこの配列の一部のいずれか、または両方をカバーするｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコ予想は、ＣｕｒａＧｅｎの自社の配列データベースにおいて、または公的なヒト配列データベースにおいて利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくつかの部分のいずれかを提供された。
【０３２３】
実験的クローニングは、以下にまとめられる方法の１つ以上を用いて実施された：
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ^ＴＭＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｃＤＮＡは、複数の組織型、正常状態および疾患状態、病的状態、ならびに異なるドナーからの発生状態を示す種々のヒトサンプルに由来する。サンプルは組織全体、初代細胞または組織、培養された初代細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生化学的因子または化学的因子（化合物）（例えば、増殖因子、ケモカインまたはステロイド）で処理されていてもよい。従って誘導されたｃＤＮＡを、次に、ＣｕｒａＧｅｎの自社のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を用いて配列決定した。配列トレースを、手動で評価し、そして必要に応じて補正のために編集した。各アセンブリについてコンセンサス配列を生成するためのバイオインフォマティクスのプログラムを用いて、時には公的なヒト配列を含む、全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列を一緒にアセンブルした。各アセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含まれる。別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合、配列をアセンブリのための成分として含んだ。各アセンブリは、遺伝子またはその部分を示し、そして改変体についての情報（例えば、スプライシング形態、一ヌクレオチド多形態（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列バリエーション）を含む。
【０３２４】
エキソン連結（Ｌｉｎｋｉｎｇ）：ＣＧ５３１３５−０２配列についてのｃＤＮＡコードを以下のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした：５’−ＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２４）、および５’−ＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２５）。本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長部分またはいくつかの部分（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づいてプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、以下の組織由来の、発現されたヒト配列を含むプールからｃＤＮＡを増幅した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全脳、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。
【０３２５】
各アセンブリについてコンセンサス配列を生成するためのバイオインフォマティクスのプログラムを用いて、時には公的なヒト配列を含む、複数のクローンを配列決定して、これらのフラグメントを一緒にアセンブルした。各アセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含まれる。別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合、配列をアセンブリのための成分として含んだ。各アセンブリは、遺伝子またはその部分を示し、そして改変体についての情報（例えば、スプライシング形態、一ヌクレオチド多形態（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列バリエーション）を含む。
【０３２６】
物理的クローン：エキソン連結によって誘導されたＰＣＲ産物（オープンリーディングフレーム全体をカバーする）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングして、１３７６２７：：１６００８３８７４．１０４３０１０．Ａ９を得た。
【０３２７】
改変体配列はまた、本出願に含まれる。改変体配列は、一ヌクレオチド多形態（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、ＳＮＰを含有するヌクレオチド配列がｃＤＮＡに由来することを示すために、ある場合には、「ｃＳＮＰ」と呼ばれ得る。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多様な部位における１ヌクレオチドの別のヌクレオチドでの置換に起因し得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、基準の対立遺伝子に対する、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子において特定のヌクレオチドに関してギャップを保有する部位は、多様な部位である。遺伝子内に生じるＳＮＰは、このＳＮＰの位置でこの遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更を生じ得る。遺伝子内のＳＮＰはまた、ＳＮＰを含むコドンが、この遺伝子コードの冗長性の結果として同じアミノ酸をコードする場合、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側に生じるＳＮＰ、または遺伝子内のイントロンに生じるＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列における変化も生じないが、発現パターンの調節の変化を生じ得る。例としては、一時的発現、生理学的反応調節、細胞型発現調節、発現の強度、および転写されたメッセージの安定性における変化が挙げられる。
【０３２８】
新規な線維芽細胞増殖因子−２０様遺伝子のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、エキソン連結によって得られ、そして本明細書においてクローンＣＧ５３１３５−０２として報告され、そして以下の表４および表５に示される。
【０３２９】
（表４．本発明の線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号２６））
【０３３０】
【化２】

（表５．配列番号２６によってコードされるタンパク質配列（配列番号２７））
【０３３１】
【化３】

新規な線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質をコードする５４０ヌクレオチドの新規な核酸（クローンＣＧ５３１３５−０２）を、表４に示す。ヌクレオチド１〜３で始まりそしてヌクレオチド５３８〜５４０で終わるオープンリーディングフレームが同定された。このポリペプチドは、新規の機能的な線維芽細胞増殖因子−２０様タンパク質を示す。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調する。推定非翻訳領域（下線部）（存在する場合）は、開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。１７９アミノ酸残基を有するコードされたタンパク質を、表５に一文字コードを使用して示す。
【０３３２】
（類似性）
配列データベースの検索において、例えば、本発明の核酸が、５０６塩基のうちＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０４４２７７｜ａｃｃ：ＡＢ０４４２７７．１　ｍＲＮＡ（ＦＧＦ−２０についてのＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｍＲＮＡ：完全なｃｄｓ）に同一な４９５塩基（９７％）を有することが見出された。本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、１６２アミノ酸残基のうちＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（線維芽細胞増殖因子−２０（ＦＧＦ−２０））由来の２１１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ９ＮＰ９５タンパク質に同一な１６０残基（９８％）、そして１６２アミノ酸残基のうちこれに類似した１６０残基（９８％）を有することが見出された。さらなる相同性を以下の表６に提供する。
【０３３３】
【表１】

複数配列整列を表７に与え、本発明のタンパク質を、本発明のタンパク質と関連タンパク質配列とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析において第１列に示す。この配列は、２０〜５１位に示されるように、線維芽細胞増殖因子−２０のスプライス形態を示すことに注意すること。上に示される整列において、黒い輪郭のアミノ酸残基は、配列間で同様に保存された残基（すなわち、構造的または機能的な特性を保存することが必要とされ得る残基）を示す；灰色の背景を有するアミノ酸残基（タンパク質の構造または機能を変更することなく、同等の物理的および／または化学的特性を保有する）（例えば、群Ｌ、Ｖ、Ｉ、およびＭは類似であると考えられ得る）は、配列間で互いに類似している；そして、白色の背景を有するアミノ酸残基は、配列間で保存されていないし類似もしていない。
【０３３４】
（表７．ＣＧ５３１３５−０２タンパク質と関連タンパク質とのＣｌｕｓｔａｌＷ整列）
【０３３５】
【表２】

本明細書中に開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在は、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、ＢｌｏｃｋまたはＰｒｉｎｔのようなドメインデータベースに対する検索によって決定され、次いでＩｎｔｅｒｐｒｏドメイン登録番号によって同定される。重要なドメインを表８に要約する。
【０３３６】
【表３】

ペパリン結合増殖因子ＩおよびＩＩ（ＨＢＧＦ）［１，２］（酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としてもまた公知である）は、広範な種々の中胚葉起源または神経外胚葉起源の細胞の増殖または分化を刺激する構造的に関連した分裂促進因子である。これらの２つのタンパク質は、インターロイキン−１タンパク質、Ｋｕｎｉｔｚ型ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）（参照）およびヒスタクトフィリン（ｈｉｓｔａｃｔｏｐｈｉｌｉｎ）もまた含むスーパーファミリーのメンバーである増殖因子およびオンコジーンのファミリーに属する。全てが非常に類似した構造を有し、ＨＢＧＦおよびインターロイキン−１ファミリーは、いくらかの配列類似性（約２５％［１］）を共有するが、これらは、ＳＴＩに対して全く類似性を示さない。
【０３３７】
ＨＢＧＦは、細胞の分化および増殖の制御に関連する多数の異なるプロセスに関与する［１］。ＨＢＧＦ１およびＨＢＦＧ２は、同様の効果を有する：これらは、胚発生において中胚葉の形成を誘導し、そして創傷修復、血管形成および神経増殖を媒介する；これらはまた、線維芽細胞、内皮細胞および大グリア細胞の増殖および移動を誘導する。ＨＢＧＦ３（ｉｎｔ−２）およびＨＢＧＦ４（ｈｓｔ／ｋｓ）は、それぞれ胃の腫瘍およびカポージ肉腫由来の公知のオンコジーンである。ＨＢＧＦ５およびＨＢＧＦ６はまた、オンコジーン産物である。ＨＢＧＦ７（ケラチノサイト増殖因子）は、おそらく、正常な上皮細胞増殖の主要なパラクリンエフェクターである。
【０３３８】
これらの増殖因子は、細胞内シグナル伝達を生じるこれらのチロシンキナーゼレセプターの二量体化を引き起こす。現在、線維芽細胞増殖因子について４つの既知のチロシンキナーゼレセプターが存在する。これらのレセプターは各々、このファミリー［３］のいくつかの異なるメンバーに結合し得る。
【０３３９】
ＨＢＧＦ１およびＨＢＧＦ２の結晶構造［４］が解析され、これらがインターロイキン−１およびＫｕｎｉｔｚ型ダイズトリプシンインヒビターの両方と同一の１２鎖のβシート構造を有することが示された［５］；ＨＢＧＦ１およびインターロイキン−１は、類似していることが見出され、そしてこれらは、類似の構造を有することが推定された［６］。βシートは、中央軸の周りに３つの類似の葉において配置され、６つの鎖が逆平行のβバレルを形成する。ＨＢＧＦ１のいくつかの領域（主に、β鎖１〜３および鎖８と９との間のループ）は、レセプター結合に関与する。鎖１０と１１との間のループは、結合ペパリンに関与すると考えられる。
【０３４０】
（表９：ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５３１３５−０２についてのＰＳＯＲＴ、ＳｉｇｎａｌＰおよびヒドロパシー結果）
【０３４１】
【表４】

本発明のＦＧＦ２０Ｘタンパク質をコードする新規なＦＧＦ２０Ｘ核酸またはそのフラグメントは、診断用途においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＦＧＦ２０Ｘ抗体」の節において記載されるように、疎水性チャートからの推定を使用して、当該分野で公知の方法に従って産生され得る。開示されたＦＧＦ２０Ｘタンパク質は、複数の親水性領域を有し、その各々が免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、意図されるＦＧＦ２０Ｘエピトープは、およそアミノ酸２０〜６５に由来する。別の特異的な実施形態において、ＦＧＦ２０Ｘエピトープは、およそアミノ酸８０〜１７５に由来する。
【０３４２】
このことは、本発明のＦＧＦ２０Ｘ配列が、この／これらのドメインを含むことが知られている他のタンパク質の特性と類似の特性およびこれらのドメインの特性と類似の特性を有することを示す。
【０３４３】
（染色体情報）
本発明において開示されたＦＧＦ２０Ｘ遺伝子は、染色体８ｐ２１．３−ｐ２２にマッピングされる。この割り当ては、開示された配列と配列同一性を共有する、ゲノムクローン、公の遺伝子およびＥＳＴと関連する情報、およびＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ生命情報工学ツールを使用して行なった。
【０３４４】
（組織発現）
本発明において開示される線維芽細胞増殖因子−２０様遺伝子は、少なくとも以下の組織において発現される：哺乳動物組織、結腸、肺、脳、肝臓、腎臓、および胃。発現情報は、クローンＣＧ５３１３５−０２の配列の誘導物に含まれる配列の組織供給源に由来する。
【０３４５】
【数１】

（等価物）
本発明の特定の実施形態に関する前述の詳細な説明から、核酸、ポリペプチド、抗体を含む特定の新規の組成物ならびに方法、検出そして処置が記載されていることは明らかである。これらの特定の実施形態が、本明細書中で詳細に開示されたが、これは例示目的のためのみに例としてなされ、そして上記の添付した特許請求の範囲に関して制限することを意図されない。特に、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に慣用的事象であるとして、本発明に対してなされ得ることは、本発明者らによって意図される。実際に、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明および添付の図面により当業者に明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の新規のＦＧＦ−ＣＸポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号１）および本発明の新規のＦＧＦ−ＣＸタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）の説明である。
【図２】
図２は、配列番号１の核酸配列とＦＧＦ−９様グリア活性因子（ＧＡＦ）配列（配列番号５）とのＢＬＡＳＴＮアライメントである。
【図３】
図３は、配列番号１の核酸配列の相補鎖とヒト第８染色体の長いゲノムフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０８５８）の３つの不連続なセグメント（それぞれＡ〜Ｃにおける、配列番号６〜配列番号８）のＢＬＡＳＴＮアライメントである。
【図４】
図４は、４つの脊椎動物ＦＧＦ様タンパク質（配列番号９〜１２）と、本発明のＦＧＦ−ＣＸタンパク質（配列番号２）とのＣｌｕｓｔａｌＷアライメントである。黒、灰、および白の表現は、それぞれ、アライメント中での、同一の残基、保存された残基、非保存残基である。
【図５】
図５は、ＦＧＦ−ＣＸと、３つの他のＦＧＦファミリーメンバーとのＣｌｕｓｔａｌＷである。ＦＧＦ−ＣＸは、ヒトＦＧＦ−９、ヒトＦＧＦ−１６、およびＸｅｎｏｐｕｓ　ＦＧＦ−ＣＸ（それぞれ、登録番号は、Ｄ１４８３８、ＡＢ００９３９１およびＡＢ０１２６１５である）とアライメントされた。
【図６】
図６は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号２）とヒトＦＧＦ−９（配列番号９）とのＢＬＡＳＴＰアライメントであり、同一（「｜」）およびポジティブ（「＋」）である残基を示す。
【図７】
図７は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号２）と、マウスＦＧＦ−９（配列番号１０）とのＢＬＡＳＴＸアライメントであり、同一（「｜」）およびポジティブ（「＋」）である残基を示す。
【図８】
図８は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号２）と、ラットＦＧＦ−９（配列番号１１）とのＢＬＡＳＴＸアライメントであり、同一（「｜」）およびポジティブ（「＋」）である残基を示す。
【図９】
図９は、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチド配列（配列番号２）と、Ｘｅｎｏｐｕｓ　ＸＦＧＦ−ＣＸ（配列番号１２）とのＢＬＡＳＴＸアライメントであり、同一（「｜」）およびポジティブ（「＋」）である残基を示す。
【図１０】
図１０は、１９残基のウインドウで生成された、配列番号２のＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのハイドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）の表現である。
【図１１】
図１１は、ＦＧＦ−ＣＸのウエスタン分析を示す。指定された構築物で、一過的にトランスフェクトされた、２９３細胞（パネルＡ）またはＮＩＨ　３Ｔ３細胞（パネルＢ）からのサンプルを、抗Ｖ５抗体を使用するウエスタン分析によって調べた。ＣＭ＝訓化培地、ＳＥ＝スラミン抽出訓化培地。分子量マーカを、左に示す。
【図１２】
図１２は、２９３細胞によって分泌されたＦＧＦ−ＣＸタンパク質のウエスタン分析を示す。
【図１３】
図１３は、ＦＧＦ−ＣＸ遺伝子の分析を表し、これは、ＦＧＦ−ＣＸのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号２）を含む。この開始コドンおよび終止コドンは、太字であり、そして５’ＵＴＲ中に存在するインフレーム（ｉｎ−ｆｌａｍｅ）終止コドンが下線で示される。
【図１４】
図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＦＧＦ−ＣＸ（配列番号２）タンパク質のウエスタン分析を示す。
【図１５】
図１５は、ＦＧＦ−ＣＸ特異的ＴａｑＭａｎ試薬を使用するリアルタイム定量ＰＣＲによって得られるＦＧＦ−ＣＸの発現の分析を表す。正常なヒト組織サンプル由来の規格化されたＲＮＡについての結果を、パネルＡに示し、そして腫瘍細胞株由来の規格化されたＲＮＡについての結果を、パネルＢに示す。外科手術の間に直接的に得られた腫瘍組織を使用して得られた結果を、パネルＣおよびパネルＤに示す。
【図１６】
図１６は、組換えＦＧＦ−ＣＸのＤＮＡ合成に与える影響によって表される、組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を提示する。細胞は、血清飢餓にし、指定された因子と共に１８時間インキュベートし、ＢｒｕＵ取り込みアッセイによって分析した。サンプルは、三連で実施された。パネルＡは、ＮＩＨ　３Ｔ３マウス線維芽細胞である。パネルＢは、ＣＣＤ−１０７０ヒト線維芽細胞である。パネルＣは、ＣＣＤ−１１０６ヒトケラチノサイトである。
【図１７】
図１７は、細胞増殖に与える組換えＦＧＦ−ＣＸの影響によって表される、組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を示す。ＮＩＨ　３Ｔ３細胞を、指定される因子を補充した無血清培地と共にインキュベートし、４８時間後に計数した。サンプルは、二連で実施された。
【図１８】
図１８は、細胞形態に与える組換えＦＧＦ−ＣＸの影響によって表される組換えＦＧＦ−ＣＸの生物学的活性を表す。ＮＩＨ　３Ｔ３細胞を、ＦＧＦ−ＣＸタンパク質またはコントロールタンパク質と共に４８時間インキュベートし、そして倍率×２５で写真撮影した。
【図１９】
図１９は、ＦＧＦ−ＣＸの腫瘍形成活性を表すグラフを表す。指定された構築物で安定にトランスフェクトされたＮＩＨ　３１３細胞を、胸腺欠損ヌードマウスに皮下組織に注入し、そして２週間の期間にわたって腫瘍形成について調べた。４動物の最小値を、各データポイントとして使用した。

Claims

単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または２７により規定されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または２７により規定されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、選択された配列において特定される任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、該配列のうちの１５％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；
（ｃ）配列番号２または２７により規定されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｄ）配列番号２または２７により規定されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで該選択された配列の成熟形態における任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸配列に変化しており、ただし、該成熟形態の配列のうちの１５％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の段落に記載されるアミノ酸配列のフラグメント、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドのフラグメント。
請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２または２７の天然に存在する対立遺伝子改変体である、ポリペプチド。
請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで、前記改変体が、単一のヌクレオチドの多型の翻訳産物である、ポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチド、は、改変体ポリペプチドであり、ここで、配列番号２または２７において特定される１つ以上の任意のアミノ酸が、保存的置換を提供するよう変化される、ポリペプチド。
単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号２または２７に含まれるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または２７の改変体であって、ここで、選択された配列において特定される任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、配列のうちの１５％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；
（ｃ）配列番号２または２７により規定されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｄ）配列番号２または２７により規定されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、選択された配列の成熟形態中の任意のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化しており、ただし、該成熟形態の配列のうちの１５％以下のアミノ酸残基が、このように変化している、改変体；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）において記載されるアミノ酸配列のフラグメント；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の段落中に記載される該核酸分子のいずれかの相補体、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
請求項６に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
請求項６に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のポリペプチド配列を含む改変体ポリペプチドをコードする、核酸分子。
請求項６に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、前記改変体ポリペプチドをコードする、単一のヌクレオチドの多型を含む、核酸分子。
請求項６に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１または２６により規定されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド配列であって、ここで、配列番号１によって規定されるヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドが、選択された配列によって与えられるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに変化しており、ただし、２０％以下のヌクレオチドが、このように変化している、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）に記載の配列の核酸フラグメント；
（ｄ）（ｂ）に記載の配列の核酸フラグメント；ならびに
（ｅ）該核酸分子のいずれかの相補体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
請求項６に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、ヌクレオチド配列を含み、ここで、該ヌクレオチド配列において、選択されたヌクレオチド配列のコード配列において特定される任意のヌクレオチドが、選択された配列によって規定されるヌクレオチドから異なるヌクレオチドに変化しており、ただし、選択された該コード配列における２０％以下のヌクレオチドが、このように変化している、核酸分子。
ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドのフラグメントをコードする単離された核酸分子。
前記ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが、配列番号２または２７の改変体である、請求項１２に記載の核酸分子。
前記ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが、成熟ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドである、請求項１２に記載の核酸分子。
前記ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドが、配列番号２または２７の成熟形態の改変体である、請求項１２に記載の核酸分子。
請求項６に記載の核酸分子を含む、ベクター。
請求項１６に記載のベクターを含む、細胞。
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
前記抗体がヒト化抗体または抗体である、請求項１８に記載の抗体。
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
サンプル中の請求項６に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを候補物質と接触させる工程；および
（ｂ）該候補物質が該ポリペプチドに結合するか否かを決定し、ここで結合する候補物質が該因子である工程；
を包含する、方法。
前記候補物質が、約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項２３に記載の方法。
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドと、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
病理を処置する際に使用するための潜在的な治療剤を同定するための方法であって、ここで、該病理が、請求項１に記載のポリペプチドの異常な発現、異常なプロセシングまたは異常な生理学的相互作用に関連しており、該方法が、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現し、かつ該ポリペプチドに起因する特性または機能を有する、細胞を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）において提供される該細胞を、試験因子と接触させる工程；および
（ｃ）該試験因子が該ポリペプチドに起因する特性または機能を変化させるか否かを決定し、これによって、該試験因子の存在下で観察される該ポリペプチドの特性または機能の変更が、該試験因子が、潜在的な治療剤であることを示す、工程
を包含する、方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記潜在的治療因子を、前記治療的因子を同定するためのさらなる試験に提供する工程をさらに包含する、方法。
前記候補物質が抗体であるか、または、約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
前記特性または機能が細胞の成長もしくは増殖を含む、請求項２６に記載の方法。
前記試験因子が前記ポリペプチドに結合する、請求項２９に記載の方法。
請求項２６に記載の方法に従って同定される治療的因子。
請求項２７に記載の方法を用いて同定される治療的因子。
前記因子が、抗体であるかまたは約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項３１に記載の治療的因子。
請求項１に記載されるポリペプチド関連障害を処置または予防する方法であって、ここで該障害は、細胞または組織の不十分もしくは非効率的な増殖により特徴付けられ、該方法は、被験体における該ポリペプチド関連障害を処置または予防するに十分な量および期間で、請求項１に記載のポリペプチドを、該被験体に投与する工程を包含し、ここで該被験体が、該障害に罹患しているかまたは該障害易発性であると考えられる、方法。
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
請求項１に記載されるタンパク質の、異常な発現、異常なプロセッシングまたは異常な生理学的相互作用に関連する障害を処置または予防する方法であって、ここで該障害は、細胞または組織の不十分もしくは非効率的な増殖により特徴付けられ、該方法は、被験体における該障害を処置または予防するに十分な量および期間で、請求項６に記載の核酸を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで該被験体が、該障害に罹患しているかまたは該障害易発性であると考えられる、方法。
前記被験体がヒトである、請求項３６に記載の方法。
請求項１に記載されるタンパク質の、異常な発現、異常なプロセシングまたは異常な生理学的相互作用に関連する障害を処置または予防する方法であって、ここで該障害は、細胞または組織の過形成もしくは新形成により特徴付けられ、該方法は、被験体における該障害を処置または予防するに十分な量で、治療剤を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで該被験体が、該障害に罹患しているかまたは該障害易発性であると考えられる、方法。
前記治療剤が、請求項１８に記載される抗体である、請求項３８に記載の方法。
前記被験体がヒトである、請求項３８に記載の方法。
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
請求項６に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
請求項１８に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
請求項３１に記載の治療的因子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
前記治療的因子が、約１５００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項４４に記載の薬学的組成物。
請求項４１に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
請求項４２に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
請求項４３に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
請求項１に記載されるポリペプチドの、異常な発現、異常なプロセシングまたは異常な生理学的相互作用に関連する障害に対する潜在性もしくは素因性のモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該障害に対するリスクの増大した試験動物を提供し、ここで、該試験動物が、請求項１に記載のポリペプチドを組換え発現する、工程；
ｂ）試験化合物を、該試験動物に投与する工程；
ｃ）工程（ａ）の化合物を投与した後、該試験動物における該ポリペプチドの活性を測定する工程；および
ｄ）該試験動物における該タンパク質の活性を、該化合物を投与していないコントロール動物における該ポリペプチドの活性と比較し、ここで、該試験動物における該ポリペプチドの活性の、該コントロール動物と比較した変化が、該試験化合物が該障害に対する潜在性もしくは素因性のモジュレーターであることを示す工程、
を包含する、方法。
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記試験動物が、野生型試験動物に対して増加したレベルで、試験タンパク質導入遺伝子を発現するかまたはプロモーターの制御下で該導入遺伝子を発現する、組換え試験動物であり、ここで、該プロモーターは、該導入遺伝子のネイティブな遺伝子プロモーターではない、方法。
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または素因を決定するための方法であって、該方法が、以下：
ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程であって、
ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または素因を示す、工程
を包含する、方法。
第１の哺乳動物被験体における請求項６に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または素因を決定するための方法であって、該方法が、以下：
ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
ｂ）工程ａ）の該サンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程であって、
ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または素因を示す、工程
を包含する、方法。
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、ここで、該病理が請求項１に記載されるポリペプチドの、異常な発現、異常なプロセシングまたは異常な生理学的相互作用に関連し、該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２または２７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、ここで、該病理がＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの、異常な発現、異常なプロセッシングまたは異常な生理学的相互作用に関連し、該方法は、該病理学的状態を緩和するに十分な量および期間で、請求項１８に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
被験体における細胞の増殖を促進する方法であって、請求項１に記載されるポリペプチドの投与が必要である被験体に、該ポリペプチドを、細胞の増殖を促進するのに有効な量および期間で投与する工程を包含する、方法。
前記被験体がヒトである、請求項５５に記載の方法。
請求項５５に記載の方法であって、ここで増殖が促進される前記細胞が、以下：創傷の近傍にある細胞、血管系の細胞、造血に関する細胞、赤血球形成に関する細胞、胃腸管の内側にある細胞および毛包中の細胞からなる群から選択される、方法。
被験体における細胞増殖を阻害する方法であって、ここで該増殖が、請求項１に記載されるポリペプチドの発現に関連し、該被験体に組成物を、該被験体中の細胞増殖を阻害するのに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
前記組成物が、ＦＧＦ−ＣＸポリペプチドの切断を阻害する、請求項５８に記載の方法。
前記組成物が、ａｎｔＦＧＦ−ＣＸ抗体またはＦＧＦ−ＣＸ治療的因子を含む、請求項５８に記載の方法。
前記被験体がヒトである、請求項５８に記載の方法。
請求項５８に記載の方法であって、ここで増殖が阻害される前記細胞が、以下：形質転換細胞、過形成細胞、腫瘍細胞および新形成細胞からなる群から選択される、方法。