JP2004500087A5 - - Google Patents
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Description
【書類名】明細書
【発明の名称】抗−脈管形成性腸ペプチド、zdint5
【特許請求の範囲】
【請求項1】a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
b)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及び
c)配列番号8に示されアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項2】配列番号11に示されるアミノ酸配列をさらに含んで成る請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項3】前記ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第2ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結されている請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項4】第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第1ポリペプチドセグメントが配列番号2に示されるアミノ酸配列を含んで成り、そして前記第2ポリヌクレオチドセグメントが1又は複数のTSP1−様ドメインをコードする第2ポリペプチドをコードし、そして前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項5】第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第1ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第2ポリペプチドセグメントが、
(a)配列番号5の残基1〜48を含んで成るポリペプチド;及び
(b)配列番号8の残基1〜59を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択された1又は複数のポリペプチドを含んで成り;
ここで前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリペプチドセグメントのアミノ末端側に位置することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項6】次の作用可能に連結された要素:
a)転写プロモーター;
b)ポリペプチドをコードするDNAセグメント、ここで前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、
i)請求項1記載のアミノ酸配列;
ii) 配列番号11に示されるようなアミノ酸配列;
から成る群から選択される;及び
c)転写ターミネーター;
を含んで成る発現ベクター。
【請求項7】請求項6記載の発現ベクターが導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項8】DNAセグメントによりコードされたポリペプチドを発現する、請求項7記載の細胞を培養し;そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項9】請求項8記載の方法により製造されるポリペプチド。
【請求項10】配列番号11に示されるようなアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【0001】
発明の背景:
細胞外マトリックス形成及び分解に関連するタンパク質、特にタンパク質分解タンパク質は、種々の疾病、例えば癌、関節炎、アルツハイマー及び種々の炎症状態において、成長の間の確立する組織構成及び組織分解において決定的である。ADAM(ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ)、MMP(マトリックスメタロプロテアーゼ)、MDC(メタロプロテアーゼ−ディスインテグリン−システインに富んでいるタンパク質)及びSVMP(ヘビ毒メタロプロテアーゼタンパク質)において同定されている亜鉛メタロプロテアーゼが、特に細胞外タンパク質に適切である。それらのタンパク質の分解活性は、マトリックス分子及び非マトリックス分子、例えば腫瘍壊死因子αについてのタンパク質分解を包含する。Hurskainen, T. など., J. Biol. Chem. 274: 25555−25563, 1999を参照のこと。
【0002】
トロンボスポンジン−1(TSP1)は、インビボでの脈管形成を阻害する能力を有する細胞外マトリックス結合されたタンパク質である。TSP1は、インビトロで、細管−様管形成及び内皮細胞増殖を阻止する。TSP1の抗−脈管形成活性は、3種のタイプ1反復体を含む領域にマッピングされている。それらの反復体の組換え及びタンパク質分解フラグメントは、ウサギ角膜嚢及び漿尿膜アッセイにおいて血管−阻害活性を示した。TSP1の第2及び第3タイプ1に由来するペプチドは、内皮細胞を阻害し、そして全身性注射される場合、腫瘍増殖を抑制する。Vazquez, F. など., J. Biol. Chem. 274: 23349−23357, 1999を参照のこと。
【0003】
ADAM−TS(メタロプロテアーゼ、及びトロンボスポンジン−1反復体を有するディスインテグリン)及びMETH (メタロプロテアーゼ、及びトロンボスポンジン−1反復タンパク質)は、ADAMに関連する。ADAMTS−1は、トロンボスポンジン型を有するディスインテグリン及びメタロプロテアーゼとして特徴づけられ、そして悪液質腫瘍選択遺伝子としても同定されている炎症関連遺伝子である(Kuno, K. など., J. Biol. Chem. 272: 556−562, 1997)。
【0004】
METH−1は、メタロプロテアーゼ及びトロンボスポンジンドメインの組み合わせであり、そして脈管形成を阻害する(Vasquez, 前記)。ADAMTSタンパク質ファミリーの追加の再考に関しては、Tang, B. L., など., FEBS Letter 445: 223−225, 1999を参照のこと。追加のADAMTSファミリーメンバー、すなわちADAMTS−2は、軟膏“アグレカナーゼ(凝集酵素)”として包含され;Flannery, C.R., など., Bioc. and Bioph. Res. Comm. 260: 318−322, 1999を参照のこと。
【0005】
治療的に有用であることが示されているタンパク質のADAMs/ADAMS−TS/MDCs/SVMPs/METHファミリーのメンバーは、急性冠状動脈血栓症候群のための抗−凝集材として有用であるeptifibatide (COR Therapeutics, Inc. 及びKey Pharmaceuticals, Inc. により製造されるIntegrilin(商標)), 及びβ2インテグリン−介在性ヒト転移性メラノーマ細胞付着を阻害し、そして実験転移を阻止し(Trikha, M. など., Cancer Research 54: 4993−4998, 1994)、そして血小板凝集を阻害する(Clark, E.A. など., J. Biol. Chem. 269 (35): 21940−21943, 1994)contortrostainを包含する。
【0006】
本発明は、ADAMs/ADAMS−TS/MDCs/SVMPs/METHファミリーの新規メンバー、及びそのしようが本明細書における教授から当業者に明らかであろう関連する組成物を提供する。
【0007】
発明の要約:
1つの観点において、本発明は、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0008】
1つの観点において、本発明は、配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号5に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号5に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0009】
1つの観点において、本発明は、配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号8に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号8に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0010】
1つの観点において、本発明は、配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号11に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号11に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0011】
1つの観点において、本発明は、a)配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;c)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びd)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドを提供し;ここで前記ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第2ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結される。
【0012】
1つの観点において、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記第1ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第2ポリペプチドセグメントが配列番号5の残基1〜48を含んで成るポリペプチド;及び配列番号8の残基1〜59を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドを含んで成り;ここで前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0013】
もう1つの観点において、本発明は、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを供給し、ここで前記第1ポリペプチドセグメントが配列番号2の残基1〜203を含んで成り、そして前記第2ポリヌクレオチドセグメントがTSP1−様ドメインである第2ポリペプチドをコードし、そして前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0014】
もう1つの観点において、本発明は、次の作用可能に連結された要素:a)転写プロモーター;b)ポリペプチドをコードするDNAセグメント、ここで前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2に示されるようなのアミノ酸配列;配列番号5に示されるようなのアミノ酸配列;配列番号8に示されるようなのアミノ酸配列;及び配列番号11に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る;及びc)転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。
【0015】
1つの観点においては、発現ベクターが導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞が供給される。もう1つの観点において、本発明は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養し;そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法を提供する。さらなる態様においては、前記方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【0016】
もう1つの態様においては、ポリペプチドと細胞とを組合すことによって細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドが、a)配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;c)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びd)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択される。細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法においては、細胞は、a)結腸からの組織;b)小腸からの組織;c)精巣からの組織;及びd)肺からの組織から成る群から選択された組織に由来する。
【0017】
もう1つの観点においては、本発明は、ポリペプチドが、抗体を生成するために動物における免疫応答を誘発するよう、前記ポリペプチドにより動物を接種し;そして前記動物から抗体を単離する段階を含んで成る、請求項31記載の方法により製造されるポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供する。1つの態様においては、前記抗体は、a)配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;c)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びd)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドに対して特異的に結合する。
【0018】
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは、配列番号11の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含んで成る。もう1つの態様においては、単離されたポリペプチドは、配列番号11の少なくとも30個の連続したアミノ酸を含んで成る。もう1つの態様においては、前記11個のアミノ酸残基は、(a)配列番号2;(b)配列番号5;及び(c)配列番号8から成る群からである。
【0019】
もう1つの態様においては、単離されたポリペプチドは、48〜1120個の長さのアミノ酸である。もう1つの態様においては、前記連続したアミノ酸残基の少なくとも9個が、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第2ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結される。
【0020】
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記11個のアミノ酸の連続した配列は、a)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びc)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択される。もう1つの態様においては、前記ポリペプチド分子は、48〜1120個の長さのアミノ酸である。
【0021】
1つの観点においては、本発明は、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記第1ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第2ポリペプチドセグメントが(a)配列番号5の残基1〜48を含んで成るポリペプチド;及び(b)配列番号8の残基1〜59を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチド分子を含んで成り;ここで前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0022】
もう1つの観点においては、本発明は、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを供給し、ここで前記第1ポリペプチドセグメントが配列番号2の残基1〜203を含んで成り、そして前記第2ポリヌクレオチドセグメントがTSP1−様ドメインである第2ポリペプチドをコードし、そして前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0023】
もう1つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素:a)転写プロモーター;b)配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドをコードするDNAセグメント;及びc)転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。1つの態様においては、前記DNAセグメントはさらに、親和性標識をコードする。
【0024】
1つの観点においては、発現ベクターが導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞が供給される。もう1つの観点において、本発明は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養し;そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法を提供する。さらなる態様においては、前記方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【0025】
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドと細胞を、インビボ又はインビトロで組合すことによって、細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法を提供する。もう1つの態様においては、細胞は、a)結腸からの組織;b)小腸からの組織;c)精巣からの組織;及びd)肺からの組織から成る群から選択された組織に由来する。もう1つの観点においては、本発明は、ポリペプチドが、抗体を生成するために動物における免疫応答を誘発するよう、請求項15記載のポリペプチドにより動物を接種し;そして前記動物から抗体を単離する段階を含んで成る、ポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供する。
【0026】
もう1つの態様においては、(a)配列番号2;(b)配列番号5;(c)配列番号8;及び(d)配列番号11から成る群から選択されたポリペプチドを含んで成るタンパク質に結合する、前記方法により生成される抗体が供給される。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の発明の特定の記載に基づいて明らかになるであろう。
【0027】
発明の特定の記載:
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる:
“親和性標識”とは、第2ポリペプチドの精製を提供し、又は基質への第2ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【0028】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンS トランスフェラーゼ(Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988), Glu−Glu親和性標識 (Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952−4, 1985)(配列番号7)、 物質P、すなわちFlagTM ペプチド(Hoppなど., Biotechnology 6: 1204−1210, 1988)、ストレプタビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質(Guan など., Gene67:31, 1988)、セルロース結合タンパク質、チオレドキシン、ユビキチン、T7ポリメラーゼ又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein Expression and Purification 2:95−107, 1991を参照のこと。DNAコード親和性標識及び他の試薬は、商品供給者(例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA; Eastman Kodak, New Heven, CT)から入手できる。
【0029】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【0030】
用語“ポリヌクレオチド分子の補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“〜に対応する”とは、配列におけるアミノ酸残基の位置に適用される場合、配列が最適に整列される場合の多くの配列における対応する位置を意味する。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、1又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して)を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【0031】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の1又は複数の起点、1又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【0032】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を参照のこと)。
【0033】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち95%以上の純度、より好ましくは99%以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【0034】
“作用可能に連結された”とは、複数の実物体が、それらがそれらの意図された目的のために機能するよう一緒に連結されることを意味する。DNAセグメントを言及する場合、その用語は、コード配列が正しい読み取り柄を整合して連結され、そして転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行することを示す。ポリペプチドを言及する場合、“作用可能に連結された”とは、配列の所望する機能が保持される、共有(例えば、ジスルフィド結合)及び非共有(例えば,水素結合、疎水性相互作用、又は塩−架橋相互作用)結合された配列を包含する。
【0035】
用語“オルト体(orthology)”又は“種相同体”(species homolog)とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、1つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
【0036】
“ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド(“nt”)、又はキロ塩基(“kb”)として表される。
【0037】
ここで、後者の2つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており;従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのような対になっていない末端は、長さ20ntを超えない。
【0038】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【0039】
用語“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され;置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【0040】
用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。
【0041】
受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり;モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL−3受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体及びIL―6受容体)であり得る。
【0042】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド(“分泌ペプチド”)をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
“セグメント”とは、特定された特性を有する大きな分子(例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド)の一部である。例えば、特定されたポリペプチドをコードするDNAセグメントは、5‘から3’の方向に読み取られる場合、その特定されたポリペプチドのアミノ酸をコードする、長いDNA分子の一部、例えばプラスミド又はプラスミドフラグメントである。
【0043】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される
【0044】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動)により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確には±10%であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
ADAM−TS及びMETHファミリーメンバーのいくつかのメンバーのドメイン構造の議論は、本発明をより詳細に例示することを助けるであろう。分泌ペプチドが上記に記載されて来た。
【0045】
プロペプチドドメインは通常、メタロプロテアーゼのアミノ−末端側であり、そしてメタロプロテアーゼドメインが一定の環境下で活性化されるよう、メタロプロテアーゼドメインのためのインビトロとして作用することができる(たぶん、システイン−スイッチ機構を通して)。この阻害は、メタロプロテアーゼドメインの活性部位を阻止することによることができる。
【0046】
プロテアーゼドメインは、活性又は不活性であり得る。ディスインテグリンファミリーのいくつかのメンバーは、システインに富んでいるドメインにおいて“システイン−スイッチ”により調節され得る“活性”亜鉛触媒部位を有する“活性”プロテアーゼドメインを有するファミリーメンバーの例は、細胞外マトリックスにおけるタンパク質のプロセッシングを通して炎症工程に関与すると思われるADAM−TS1である。そのような触媒部位を有さないこのファミリーのメンバーは、例えば腫瘍抑制に関与するADAM11を包含する。不活性プロテアーゼドメインを有することが知られている他のタンパク質ファミリーは、セリンプロテアーゼである。
【0047】
付着(ディスインテグリン)ドメインは、ディスインテグリンの特異性に依存して、多数の細胞の表面上に位置することができるインテグリン又は細胞表面受容体を結合する。このディスインテグリンドメイン内の予測される結合部位はしばしば、13又は14個のアミノ酸を含んで成るアミノ酸ループである。Wolfsberg and White, 前記を参照のこと。折りたたみに基づくこの配列のコンホメーションは、その先端でアミノ酸配列を表すヘアピンループをもたらす。この配列はしばしば、“RGD”であるが、しかし種々の他のアミノ酸残基により置換され得る(Wolfsberg and White, 前記;及びJia, J. Biol. Chem. 272: 13094−13102, 1997)。
【0048】
特定種類のディスインテグリンドメインのための受容体は、多くのディスインテグリン結合ループ配列を認識することができる。ディスインテグリンドメインは、細胞−細胞相互作用、例えばGPIIb/IIIa (フィブロネクチン受容体)及び/又はGPIa/IIa(コラーゲン受容体)を結合することによって血小板凝集の阻害を担当することが示されている。METHタンパク質は、2種のディスインテグリンドメインを有する。
【0049】
多くのディスインテグリンファミリーメンバーは、融合ドメイン、すなわち約23個のアミノ酸の比較的疎水性のドメインを有する。このドメインは、ADAMファミリーメンバーのいくつかのメンバー内に存在し、そして細胞−細胞融合及び特に、精子/卵融合及び筋肉融合に関与することが示されている。
システインに富んでいるドメインは、ADAMs/ADAMS−TS/MDCs/SVMPs/METH−様ファミリーメンバーにおいて変化し、そしてインテグリンにインテグリン−結合領域を構造的に提供することに関与すると思われる。このファミリーのディスインテグリン−様メンバーに関しては、システインに富んでいるドメインはまた、ポリペプチドの二次構造コンホメーション、特にディスインテグリンドメインとシステインドメインとの間のジスルフィド結合のためにも必要である。
【0050】
多くのADAMs/MDCs/SVMPsファミリーメンバーは、細胞膜にポリペプチドを固定するために作用するトランスメンブランドメインを有する。METHタンパク質の場合、ポリペプチドは、細胞外マトリックスへのSP1−様ドメインの結合を通して固定されると思われる。従って、METH−1及びMETH−2タンパク質は、脈管形成の効果的インヒビターであることが示されている。膜固定されたADAMs/MDCs/SVMPsファミリーメンバーは、メタロプロテアーゼドメインがもう1つのタンパク質の細胞外ドメインを分解する“タンパク質エクトドメインシェディング(protein ectodomain shedding)”と呼ばれる工程に関与している。
【0051】
それらの場合、メタロプロテアーゼは、フェルチリン(ADAMs1及び2)又はTACE(ADAM17)の場合のように、細胞表面自体に対して活性的であり、又はメタロプトテアーゼは、KUZ及びADAM10について記載されるように、分泌経路において細胞内作用することができる(Blobel, C. P., 前記;及びLammich, S. など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3922−3927, 1999)。
【0052】
それらのメンバー−固定されたメタロプロテアーゼは、それらの遺伝子が転写される組織においてたぶん、活性的であり、この場合、それらは、同じ細胞表面に結合される他のタンパク質に対してシスで作用し、他の細胞表面に結合されるタンパク質、又は膜結合されない他のタンパク質に対してトランス作用することができる。さらに、膜アンカー自体は、分解され、身体における他の部位で活性的であり得るメタロプロテアーゼ/ディスインテグリンの可溶性形がもたらされる。
【0053】
ADAMs/MDCs/SVMPsファミリーメンバーの細胞質又はシグナル化ドメインは、リン酸化のための長さ及び部位において保存される傾向がある。しかしながら、他に、それらはアミノ酸組成においてユニークである傾向がある。いくつかのディスインテグリンファミリーメンバーは、Ab1, Src, 及び/又はSrc−関連SH3ドメインのSH3ドメインに結合することによってシグナルを出すことができる。
【0054】
トロンボスポンジ−様(TSP−様)ドメインは、タンパク質のカルボキシル末端側に位置する。複数のTSP−様ドメインが存在することができる。例えばMETH−1は、3種のTSP−様ドメインを有し、そしてもう1つのMETH相同体METH−2(Vasquez, 前記)は、2種のTSP−様ドメインを有する。トロンボスポンジン−1は、細胞外マトリックスに関連し、そして脈管形成をインビボで阻害する能力を有するモデュラータンパク質である。培養条件下で、トロンポスポンジン−1は、細管−様形成及び内皮細胞増殖を阻止する。METH−1及びMETH−2の両者はまた、角膜嚢及びCAMアッセイにおける脈管形成を阻害することが示されている(Vasquez, など)。
【0055】
本発明は、zdint5と称するタンパク質のMETHサブファミリーのメンバーの新規ドメインの発現に基づかれている。zdint5のドメインは、メタロプロテアーゼドメイン及び2種のTSP1−様ドメインを包含する。メタロプロテアーゼドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号1及び2で示される。メタロプロテアーゼドメイン内に、配列番号2の残基151〜161の亜鉛結合型が存在する。第1のTSP1−様ドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号4及び5で示される。第2のTSP1−様ドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号7及び8で示される。
【0056】
メタロプロテアーゼのための縮重ポリヌクレオチド、及び第1及び第2のTSP1−様ドメインは、それぞれ、配列番号3、6及び9で示される。それらのドメインがタンパク質においていかに組合され得るのか実例は、配列番号10(ポリヌクレオチド)、配列番号11(ポリペプチド)及び配列番号に(縮重ポリヌクレオチド)に示される。配列番号2に示されるようなアミノ酸残基69及び配列番号11に示されるようなもの172;配列番号2に示されるような73及び配列番号11に示されるような176;及び配列番号11に示されるような485, 533, 560, 595及び635は、可能性あるN−結合されたグリコシル化部位である。
【0057】
zdint5の組織分布の分析は、Human Multiple Tissue and Master Dot Blotsを用いて、ノザンブロット技法により行われ得る。そのようなブロット市販されており(Clontech, Palo Alto, CA)、そして当業者に知らされている方法によりプローブされ得る。例えば、Wu W. など., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press LLC, 1997を参照のこと。さらに、本発明のポリヌクレオチドの部分は、配列データベースに質問し、そして配列が由来する組織を同定することによって同定され得る。本発明のポリヌクレオチドの部分は、結腸腺癌cDNAライブラリー、小腸cDNAライブラリー、及び胎児肺、組織及びB−細胞から製造されたcDNAライブラリーにおいて同定されている。
【0058】
ADAMsファミリーのいくつかのメンバーは、スプライシングされたイソフォームを有する。スプライシングの例は、メルトリンαとしても知られているADAM12である。プロペプチド及びメタロプロテアーゼドメインを欠いている、この分子の切断された形は、インビボで異所性筋肉形成に関連するが、しかしインビトロではそうではなく、このことは、この遺伝子を発現する細胞が隣接する前駆体細胞に対して作用する成長因子を生成することを示唆する。
【0059】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるzdint5ポリペプチドをコードするDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号3は、配列番号2のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号6は、配列番号5のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号9は、配列番号8のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号12は、配列番号11のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。
【0060】
当業者はまた、配列番号3、6、9及び12の縮重配列がUとTとを置換することによって、配列番号2、5、8及び11をコードするすべてのRNA配列も供給する。従って、配列番号3のヌクレオチド1−609;及び配列番号12のヌクレオチド1−2379を含んで成るzdint5ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのRNA相当物は、本発明により包含される。表1は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号3、6、9及び12内に使用される1文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードYはC又はTのいずれかを示し、そしてその相補体RはA又はGを示し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
【0061】
【表1】
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号3、6、9及び12に使用される縮重コドンが表2に示される。
【0062】
【表2】
【0063】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン(WSN)のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン(AGR)をコードすることができ、そしてアルギニン(MGN)のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン(AGY)をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号2、5、8及び11のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【0064】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号3、6、9及び12に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【0065】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12の類似するサイズの領域、又はそれに対して相補的配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、当業界において良く知られており、そして多くの用途のために広く使用される;例えばSambrook など., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel など., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; Berger and Kimmel, eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, 1987 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227−59, 1990、参照のこと。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、二重鎖ハイブリッドを形成する一本鎖相補的配列の能力を開発する。そのようなハイブリッドは、DNA−DNA, RNA−RNA及びDNA−RNAを包含する。
【0066】
例示されるように、変異体、zdint5ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号1, 3, 4, 6, 7, 9, 10及び12のヌクレオチド配列を有する核酸分子(又はそれら補体)により、50%ホルムアミド、5×SSC(1×SSC:0.15Mの塩化ナトリウム及び15mMのクレン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液(100×Denhardt’s溶液:2%(w/v)Ficoll 400, 2%(w/v)ポリビニルピロリドン及び2%(w/v)ウシ血清アルブミン)、10%硫酸デキストリン及び20μg/mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んで成る溶液において、42℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【0067】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動を操作することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高温で、例えば約65℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液(例えば、Express HybTM Hybridisation Solution, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)を、その製造業者の説明書に従って利用できる。
【0068】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.5×〜2×SSC溶液による55〜65%での洗浄を包含する。すなわち、変異体zdint5ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号1、3、4、6、9、10及び12のヌクレオチド配列(又はその補体)を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、55〜65℃での、0.1%SDSを含む0.5×〜2×SSC溶液、例えば55℃での、0.1%SDSを含む0.5×SSC溶液、又は65℃での0.1%SDSを含む2×SSC溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるSSCをSSPEにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【0069】
本発明はまた、2種の次の基準を用いて同定され得る変異体zdint5核酸分子を企画する:上記記載のような、配列番号2、5、8及び11のアミノ酸配列(下記に記載されるような)のコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなzdint5変異体は、(1)55〜65℃での0.1%SDSを含む0.5×〜2×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12のヌクレオチド配列(又はその補体)を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして(2)配列番号2、5、8又は11のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%又は95%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【0070】
他方では、zdint5変異体は、(1)50〜65℃での0.1%SDSを含む0.1×〜0.2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号1又は3のヌクレオチド配列(又はその補体)を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして(2)配列番号2、5、8又は11のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%又は95%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【0071】
zdint5のディスインテグリンドメインにおける高度に保存されるアミノ酸は、新規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用され得る。例えば、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)は、種々の組織源又は細胞系から得られたRNAからの保存されたディスインテグリンメインをコードする配列を増幅するために使用され得る。特に、zdint5配列から企画された高い縮重プライマーが、この目的のために有用である。
【0072】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、RNAは、多量のzdint5 RNAを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980)により同定され、そして結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞を包含する。
【0073】
前記活性、又はRNA生成細胞又は組織が同定されると、全RNAは、グアニジウム HCl抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る(Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979)。ポリ(A)+ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(cDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ(A)+ RNAから調製される。他方では、ゲノムDNAが単離され得る。次に、zdint5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【0074】
zdint5をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的DNA(cDNA)クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途(例えば、トランスジェニック動物における発現)に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようcDNAクローンを修飾することが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、zdint5に対する抗体、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【0075】
本明細書に開示されるzdint5ポリヌクレオチド配列はまた、zdint5遺伝子の5’非コード領域をクローン化するためにプローブ又はプライマーとしても使用され得る。この遺伝子領域は、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞における特異的発現を提供することが予測される。従ってzdint5遺伝子からのプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子療法により処理された動物における異種遺伝子の組織−特異的発現を方向づけるために使用され得る。5’側フランキング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第5,641,670号に開示されるように、“遺伝子活性化”によるzdint5タンパク質の生成を促進する。
【0076】
手短に言及すれば、細胞における内因性zalpha11リガンド遺伝子の発現が、zdint5遺伝子中に、少なくとも1つの標的化配列、調節配列、エキソン、及びスプライスドナー部位を含んで成るDNA構造体を導入することによって変更される。前記標的化配列は、内因性zdint5遺伝子座による前記構造体の相同組換えを可能にし、それにより、前記構造体内の配列が内因性zdint5コード配列と操作可能的に連結されるようになる、zdint5 5’非コード配列である。この場合、内因性zdint5プロモーターが、増強された組織−特異的又は他方では、調節された発現を提供するために、他の調節配列により置換され得るか又はそれにより補充され得る。
【0077】
本発明のポリヌクレオチドはまた、DNA合成機を用いても合成され得る。現在、選択の方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖DNAが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的鎖が別々に製造される。短い遺伝子(60〜80bp)の生成は技術的に直接的であり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る。しかしながら、より長い遺伝子(300bp以上)の生成に関しては、化学的にDNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100%ではないので、特定の方法が所望される。
【0078】
この問題を克服するためには、合成遺伝子(二本鎖)が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。遺伝子合成方法は、当業界において良く知られている。たとえば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura など., Annu.Rev. Biochem. 53: 323−56, 1984及びClimie など., Proc. Natl. Acad. Sa. USA 87: 633−7, 1990を参照のこと。
【0079】
本発明はさらに、他の種(オルト体)からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのzdint5ポリペプチドである。ヒトzdint5ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、cDNAは、zdint5を発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化され得る。
【0080】
そのような組織は、例えば、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞を包含する。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のmRNAから調製される。次に、zdint5ポリペプチドコードのcDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトcDNAにより、又は前記開示される配列に基づく1又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。
【0081】
cDNAはまた、本明細書に開示される代表的なヒトzdint5ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)(Mullis, アメリカ特許第4,683,202号)を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、cDNAライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDNAの発現がzdint5ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム クローンの単離に適用され得る。
【0082】
当業者は、配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12に開示される配列がヒトzdint5の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号2、5、8及び11の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【0083】
zdint5ポリペプチドの性質を保持する、もう1つのスプライスされたmRNAから生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【0084】
本発明はまた、配列番号2、5、8及び11ポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質的に同一である単離されたzdint5ポリペプチドも提供する。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号2、5、8及び11又はそのオルト体に対して、少なくとも 90%、及び最も好ましくは95%又はそれ以上同一であろう。%配列同一性は、従来の方法により決定される。
【0085】
例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、2種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、1のギャップ拡張ペナルティー、及び表3(アミノ酸は標準の1文字コードにより示される)に示されるようなHenikoff and Henikoff (前記)の“blosum 62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、%同一性が次のようにして計算される:
【0086】
【数1】
【0087】
【表3】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
【0088】
当業者は、2種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体zdint5のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載される。
【0089】
手短には、FASTAがまず、問題の配列(例えば、配列番号2、5、8及び11)及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性(ktup変数が1である場合)又は対の同一性(ktup=2である場合)のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【0090】
“カットオフ”値(配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算される)よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、2種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman−Wunsch アルゴリズム(Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974)の変法を用いて整列される。
【0091】
FASTA 分析のための例示的なパラメーターは次のものである:ktup=1、ギャップ開始ペナルティー=10、ギャップ拡張ペナルティー=1及び置換マトリックス=BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラム中に導入され得る。
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、1〜6、好ましくは4〜6であり得る。
【0092】
本発明は、配列番号2、5、8及び11のアミノ酸配列に比較して、1又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。BLOSUM62表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである[Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ]。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。
【0093】
本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−1よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が0,1,2又は3のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。保存性アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、1,2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも2(例えば、2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【0094】
zdint5 遺伝子における保存性アミノ酸置換は、配列番号1, 3, 4, 6, 7, 9, 10及び12に列挙されるヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発、リンカー−走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いて突然変異誘発により得れる(Ausubel (1995), p. 8−10〜8−22; 及びMcPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL. Press 1991))。細胞−細胞相互作用を促進するそのような変異体の能力は、標準方法、例えば本明細書に記載されるアッセイを用いて決定され得る。他方では、変異体zdint5ポリペプチドは、抗−zdint5抗体を特異的に結合する能力により同定され得る。
【0095】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る(Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991)。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
【0096】
ディスインテグリン−インテグリン、プロテアーゼ、又は細胞外マトリックス相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、de Vos など.,Science 255: 306−312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899−904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59−64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連するメタロプロテアーゼ/ディスインテグリン/トロンボスポンジン−1様分子による相同体の分析からも推定され得る。
【0097】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer (science 241: 53−57, 1988)又はBowie and Sauer( Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 )により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示(例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92/06204号)、及び領域−指図された突然変異誘発(Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 )を包含する。
【0098】
開示されるzdint5 DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1994及びWIPO公開WI97/20078により開示されるように、DNA シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNAが、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。
【0099】
この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【0100】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチド(例えば、プロテアーゼ活性、又は脈管形成阻害)をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【0101】
変異体zdint5遺伝子の特定のヌクレオチド配列にかかわらず、前記遺伝子は、プロテアーゼ活性、又は脈管形成阻害により、又は抗−zdint5抗体に対して特異的に結合する能力により特徴づけられるポリペプチドをコードする。より特定には、変異体zdint5遺伝子は、本明細書に記載されるヒトzdint5遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の少なくとも50%、及び好ましくは70%、80%又は90%以上を示すポリペプチドをコードする。
【0102】
変異体zdint5ポリペプチド及び実質的に相同のzdint5ポリペプチドは、1又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換;小さな欠失、典型的には1〜約30個のアミノ酸の欠失;及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【0103】
従って、本発明は、配列番号2、5、8又は11のその対応する領域に対して、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、及びより好ましくは95%又はそれ以上の同一性を有する配列を含んでなる、18〜2000個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、zdint5ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Xa因子分解部位を含む。
【0104】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのzdint5ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表1及び2に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のzdint5変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号1, 2, 3,4,5,6,7,8,9, 10, 11及び14の少なくとも1つの配列を提供するデータ構造体によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【0105】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライイブ、ランダムアクセス記憶(RAM)チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ(DLT)、ディスクカーシ及びZIPディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク(例えば、CD−読み取りのみ記憶(ROM)、CD−再書き込みできる(RW)及びCD−再記録できる)、及びデジタル可転性/ビデオディスク(DVD)(例えば、DVD−ROM, DVD−RAM及びDVD+RW)により例示される。
【0106】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド、及び1又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えばTSP1−様ポリペプチドドメインのメタロプロテアーゼは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示されるように、ニ量体化タンパク質に融合体として調製され得る。
【0107】
これに関する好ましいニ量体化タンパク質は、他のディスインテグリンポリペプチドドメイン、TSP1−様ドメイン、ディスインテグリンポロペプチドドメインフラグメント、又はタンパク質のディスインテグリンプロテアーゼファミリーの他のメンバー、例えばMDCs, SBMPs, METHs及びADAMsのメンバーを含んで成るポリペプチドを包含する。それらのディスインテグリンポリペプチドドメイン融合体、ディスインテグリンポリペプチドドメインフラグメント融合体、又は他のディスインテグリンプロテアーゼとの融合体は、種々のマルチマーディスインテグリン−様類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。
【0108】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のzdint5と、もう1つのファミリーメンバー、例えばADAM、MDC、SVMP、ADAM−TS及びMETHからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【0109】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない:保存されたモチーフ、例えば分泌シグナル配列、プロペプチド、プロテアーゼ、ディスインテグリン及びディスインテグリンループドメイン、例えば“RGD−様及びシグナル化ドメイン。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のディスインテグリン−様ファミリータンパク質(例えば、ADAMs、MDCs、SVMPs、ADAM−TS及びMETH)と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【0110】
さらに、当業界において記載される方法を用いて、ポリペプチド融合体又はハイブリッドzdint5タンパク質が、他のディスインテグリン及びディスインテグリン−様分子(例えば、ADAM、MDC、及びSVMP)、又は異種タンパク質と組合して、本発明のzdint5の領域又はドメインを用いて構成される(Sambrook など., 前記;Altschul など., 前記;Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511−5, 1994及びそれらにおける引例)。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在性を変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【0111】
補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子(例えば、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞)に対してそれらを標的化するためにzdint5ポリペプチドに融合され得る。例えば、プロテアーゼポリペプチドドメイン、又はプロテアーゼポリペプチドフラグメント又はタンパク質が、標的細胞の表面上のインテグリンポリペプチド又はインテグリン−様ポリペプチドに特異的に結合するディスインテグリンポリペプチドドメイン又はフラグメントにzdint5ポリペプチドを融合せしめることによって、予定された細胞型に標的化され得る。そのようなディスインテグリン又はプロテアーゼポリペプチドドメイン又はフラグメントは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化−ディスインテグリンドメインに融合され得る。
【0112】
同様に、プロテアーゼポリペプチドドメイン、又はプロテアーゼポリペプチドフラグメント又はタンパク質は、細胞外マトリックスに特異的に結合するTSP1−様ポリペプチドドメイン又はフラグメントにそれを融合せしめることによって細胞外マトリックスに標的化され得る。この場合、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント及びタンパク質は、治療又は診断目的のために標的化され得る。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間に、1又は複数の切断部位を含むことができる。Tuanなど., Connective Tissue Research 34: 1−9, 1996を参照のこと。
【0113】
本発明のポリペプチドは一般に約2,000以下のアミノ酸残基、好ましくは約1,700以下のアミノ酸残基、より好ましくは約1,500以下のアミノ酸残基を含有し、そして多くの場合においてかなり小さいであろう。例えば、zdint5ポリペプチドの残基を大腸菌(E. coli)β−ガラクトシダーゼ(1,021残基;Casadaban他、J. Bacteriol. 143:971−980、1980参照)、10残基のスペーサー、および4残基の因子Xa切断部位に融合することができる。第2例において、zdint5ポリペプチドの残基をマルトース結合性タンパク質(ほぼ370残基)、4残基の切断部位、および6残基のポリヒスチジンタグに融合することができる。
【0114】
宿主細胞からのzdint5ポリペプチドの輸出(export)を指令するために、分泌ペプチド、例えば、t−PA分泌ペプチドまたはzdint5分泌ペプチドをコードする第2DNAセグメントにzdint5DNAを結合する。分泌されたポリペプチドの精製を促進するために、C末端のエクステンション、例えば、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスP、Flagペプチド(Hopp他、Bio/Technology 6:1204−1210、1988;Eastman Kodak Co.、コネチカット州ニューヘブン、から入手可能である)、マルトース結合性タンパク質、または他の特定の結合因子が利用可能である、他のポリペプチドまたはタンパク質をzdint5ポリペプチドに融合することができる。
【0115】
本発明は、また、zdint5ポリペプチドの「機能的フラグメント」およびこのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。zdint5ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために、核酸分子の日常的欠失分析を実行することができる。例示として、配列番号1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、1系列のネステッド欠失を得る。
【0116】
次いでフラグメントを発現ベクターの中に適切なリーディングフレームで挿入し、発現されたポリペプチドを単離し、プロテアーゼ活性、または血管形成阻害について、または抗zdint5抗体に結合する能力について試験する。エクソヌクレアーゼ消化に対する1つの別法は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して欠失または停止コドンを導入して、所望のフラグメントの産生を特定することである。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、zdint5遺伝子の特定のフラグメントを合成することができる。
【0117】
機能的ドメインを同定する標準的方法は当業者によく知られている。例えば、インターフェロンのいずれかまたは両方の末端におけるトランケーションについての研究は、HorisbergerおよびDi Marco、Pharmac. Ther. 66:507(1995)に要約されている。そのうえ、タンパク質の機能的分析の標準的技術は、例えば、下記の文献に記載されている:
【0118】
Treuter他、Mol. Gen. Genet. 240:113(1993)、Content他、″Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2−5A synthetase induced by human interferon″、Biological Interferon Systems,Proceedings of ISIR−TNO Meeting on Interferon Systems、Cantell(編者)、pp. 65−72(Nijihoff 1987)、Herschman、″The EGF Receptor″、Control of Animal Cell Proliferation、Vol. 1、Boynton他(編者)pp. 169−199(Academic Press 1985)、Coumailleau他、J. Biol. Chem. 270:29270(1995);Fukunaga他、J. Biol. Chem. 270:25291(1995);Yamaguchi他、Biochem. Pharmacol. 50:1295(1995)、およびMeisel他、Plant Molec. Biol. 30:1(1996)。
【0119】
本発明は、また、配列番号2、5、8および11のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するzdint5遺伝子の機能的フラグメントを意図する。前述したように、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8および9のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することによって、構造に基づいて変異型zdint5遺伝子を同定することができる。構造に基づいて変異型遺伝子を同定する別のアプローチは、前述したように、潜在的変異型zdint5遺伝子をコードする核酸分子を配列番号1、2、4、6、7、9、10および12のヌクレオチド配列を有する核酸分子に加水分解できるかどうかを決定することである。
【0120】
当業者は前述の方法を使用して、配列番号2、5、8および11の種々のポリペプチドフラグメントまたは変異型、あるいは野生型zdint5タンパク質のメタロプロテアーゼ、TSP1様、および/またはジスインテグリン活性を保持する種々のポリペプチドフラグメントまたは変異型を同定および/または調製することができる。このようなポリペプチドは、例えば、細胞内シグナリングに関係するアミノ酸を包含する、分泌ドメイン、ポリペプチドドメイン、プロテアーゼドメイン、ジスインテグリンドメイン、TSP1様ドメイン、ジスインテグリンループ(天然または合成)、トランスメンブランおよび細胞内ドメインの部分またはすべて;融合ドメイン;アフィニティータグ;およびその他からの追加のアミノ酸を含むことができる。
【0121】
本発明は、また、本明細書に記載するzdint5ポリペプチドのエピトープを支持する部分を含んでなるポリペプチドフラグメントまたはペプチドを提供する。このようなフラグメントまたはペプチドは、免疫原として全体のタンパク質を使用するとき、抗体応答を誘発するタンパク質の部分である、「免疫原性エピトープ」を含んでなることができる。免疫原性エピトープを支持するペプチドは標準的方法により同定することができる(例えば、下記の文献を参照のこと:Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998(1983))。
【0122】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは、抗体がそれに対して特異的に結合することができるタンパク質の領域である、「抗原エピトープ」を含んでなることができる。ある種のエピトープは、アミノ酸の線状または隣接ストレッチから成り、そしてこのようなエピトープの抗原性は変性因子により崩壊されない。
【0123】
タンパク質のエピトープを模擬することができる、比較的短い合成ペプチドを使用して、そのタンパク質に対する抗体の産生を刺激することができることはこの分野において知られている(例えば、下記の文献を参照のこと:Sutcliffe他、Science 219:660(1983))。したがって、本発明の抗原エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するポリペプチドに結合する抗体を発生させるために有効である。抗原エピトープを支持するペプチドは、例えば、配列番号11の残基727〜732、配列番号11の残基99〜104、配列番号11の残基726〜731、および配列番号11の残基127〜132を含む。
【0124】
抗原エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、配列番号2、5、8および11の少なくとも4〜10アミノ酸、好ましくは少なくとも10〜15アミノ酸、より好ましくは15〜30アミノ酸を含有する。このようなエピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、前述したように、zdint5ポリペプチドをフラグメント化するか、あるいは化学的にペプチドを合成することによって製造することができる。そのうえ、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイにより、エピトープを選択することができる(例えば、下記の文献を参照のこと:LaneおよびStephen、Curr. Opin. Immunol. 5:268(1993)およびCortese他、Cur. Opin. Biotechnol. 7:616(1996))。
【0125】
エピトープを同定しそしてエピトープを含んでなる小さいペプチドから抗体を産生する標準的方法は、例えば、下記の文献に記載されている:Mole、″Epitope Mapping″、Methods in Molecular Biology、Vol. 10、Manson(編者)、pp. 105−116(The Humana Press,Inc.、1992)、Price、″Production and Characterization of Synthetic Peptide−Derived Antibodies″、Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application、RitterおよびLadyman(編者)、pp. 60−84(Cambridge University Press、1995)、Current Protocols in Imunology、pp. 9.3.1−9.3.5およびpp. 9.4.1−9.4.11(John Wiley & Sons、1997)。
【0126】
例示として、zdint5中の潜在的抗原部位(配列番号2、5、8および11)は、LASERGENEのPROTEANプログラム(バージョン3.14)(DNASTAR;ウイスコンシン州マディソン)により実行される、Jameson−Wolf法、Jameson−Wolf、CABIOS 4:181(1988)に従い同定された。この解析においてデフォルトパラメーターを使用した。
【0127】
zdint5の適当な抗原は下記のものを包含する:配列番号2中に示すアミノ酸残基23〜29;配列番号2中に示す残基40〜49;配列番号2中に示す残基62〜70;配列番号2中に示す残基87〜98;配列番号2中に示す残基108〜120;配列番号2中に示す残基137〜144;配列番号2中に示す残基157〜172;配列番号2中に示す残基177〜183;配列番号2中に示す残基190〜197;配列番号2中に示す残基23〜49;配列番号2中に示す残基40〜70;配列番号2中に示す残基62〜98;配列番号2中に示す残基87〜120;配列番号2中に示す残基108〜144;配列番号2中に示す残基137〜172;配列番号2中に示す残基157〜183;
【0128】
配列番号2中に示す残基177〜197;配列番号5中に示す残基3〜24;配列番号5中に示す残基39〜45;配列番号5中に示す残基3〜45;配列番号8中に示す残基11〜18;配列番号8中に示す残基26〜37;配列番号8中に示す残基39〜59;配列番号8中に示す残基11〜37;配列番号8中に示す残基26〜59;配列番号11中に示す残基12〜20;配列番号11中に示す残基31〜42;配列番号11中に示す残基60〜67;配列番号11中に示す残基81〜108;配列番号11中に示す残基126〜132;配列番号11中に示す残基143〜152;配列番号11中に示す残基165〜173;配列番号11中に示す残基190〜203;
【0129】
配列番号11中に示す残基211〜223;配列番号11中に示す残基240〜247;配列番号11中に示す残基260〜275;配列番号11中に示す残基280〜287;配列番号11中に示す残基293〜300;配列番号11中に示す残基310〜327;配列番号11中に示す残基351〜359;配列番号11中に示す残基366〜375;配列番号11中に示す残基381〜419;配列番号11中に示す残基434〜463;配列番号11中に示す残基456〜463;配列番号11中に示す残基469〜499;配列番号11中に示す残基505〜527;配列番号11中に示す残基529〜551;配列番号11中に示す残基591〜598;配列番号11中に示す残基601〜621;
【0130】
配列番号11中に示す残基633〜639;配列番号11中に示す残基641〜657;配列番号11中に示す残基671〜690;配列番号11中に示す残基709〜715;配列番号11中に示す残基724〜735;配列番号11中に示す残基738〜761;配列番号11中に示す残基775〜781;配列番号11中に示す残基785〜793;配列番号11中に示す残基12〜42;配列番号2中に示す残基31〜67;配列番号2中に示す残基60〜108;配列番号2中に示す残基81〜132;配列番号2中に示す残基126〜152;配列番号2中に示す残基143〜173;配列番号2中に示す残基165〜203;配列番号2中に示す残基190〜223;
【0131】
配列番号2中に示す残基211〜247;配列番号2中に示す残基240〜275;配列番号2中に示す残基260〜287;配列番号2中に示す残基280〜300;配列番号2中に示す残基293〜327;配列番号2中に示す残基310〜359;配列番号2中に示す残基351〜375;配列番号2中に示す残基366〜419;配列番号2中に示す残基381〜463;配列番号2中に示す残基456〜527;配列番号2中に示す残基505〜551;配列番号2中に示す残基529〜621;配列番号2中に示す残基601〜639;配列番号2中に示す残基633〜657;配列番号2中に示す残基641〜690;配列番号2中に示す残基671〜715;配列番号2中に示す残基709〜735;配列番号2中に示す残基724〜761;配列番号2中に示す残基738〜781;配列番号2中に示す残基775〜793は抗原ペプチドである。
【0132】
また、zdint5のエピトープ、ペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するために、zdint5ポリペプチドを使用することができる。zdint5ポリペプチドまたはそのフラグメントは、動物に接種し、免疫応答を誘発するための抗原(免疫原)として働く。当業者は認識するように、抗原エピトープを支持するペプチドは、zdint5ポリペプチド(例えば、配列番号2、5、8および11)の少なくとも6、好ましくは少なくとも9、より好ましくは少なくとも15〜約30の隣接アミノ酸残基の配列を含有する。
【0133】
zdint5ポリペプチドのより大きい部分、すなわち、30〜10残基からアミノ酸配列の全長までを含んでなるポリペプチドが包含される。抗原または免疫原性エピトープは、また、本明細書において記載するように、結合したタグ、アジュバントおよび担体を含むことができる。適当な抗原は、配列番号2、5、8および11のアミノ酸番号1〜アミノ酸番号1120またはそれらの隣接9〜1170アミノ酸フラグメントによりコードされるzdint5ポリペプチドを包含する。抗原として使用するために好ましいペプチドは、親水性ペプチド、例えば、疎水性プロットから当業者が予測するペプチドである。
【0134】
zdint5親水性ペプチドは、下記のものから成る群から選択されるアミノ酸置換を含んでなるペプチドを包含する:配列番号2のアミノ酸残基20〜32;配列番号2の残基64〜69;配列番号2の残基86〜98;配列番号2の残基110〜121;配列番号2の残基154〜171;配列番号2の残基190〜199;配列番号2の残基20〜69;配列番号2の残基64〜98;配列番号2の残基86〜121;配列番号2の残基110〜171;配列番号2の残基154〜199;配列番号5の残基1〜13;配列番号5の残基15〜31;配列番号5の残基1〜31;配列番号8の残基25〜36;配列番号8の残基41〜54;配列番号8の残基25〜54;配列番号8の残基13〜19;配列番号11の残基30〜40;配列番号11の残基60〜66;
【0135】
配列番号11の残基85〜107;配列番号11の残基123〜135;配列番号11の残基167〜172;配列番号11の残基189〜201;配列番号11の残基213〜225;配列番号11の残基257〜274;配列番号11の残基293〜302;配列番号11の残基309〜327;配列番号11の残基334〜342;配列番号11の残基348〜358;配列番号11の残基366〜374;配列番号11の残基386〜408;配列番号11の残基410〜425;配列番号11の残基472〜499;配列番号11の残基509〜525;配列番号11の残基527〜551;配列番号11の残基591〜619;配列番号11の残基621〜626;配列番号11の残基635〜649;配列番号11の残基682〜690;配列番号11の残基695〜702;
【0136】
配列番号11の残基723〜734;配列番号11の残基739〜752;配列番号11の残基755〜763;配列番号11の残基786〜793。さらに、折りたたまれたタンパク質の表面上に存在すると思われる、ポリペプチドの部分に対する抗原を発生させることができる。これらの抗原は下記のものを包含する:配列番号2のアミノ酸残基22〜31;配列番号2の残基87〜97;配列番号2の残基113〜118;配列番号8の残基26〜32;配列番号8の残基44〜50;配列番号11の残基31〜39;配列番号11の残基86〜104;配列番号11の残基125〜134;配列番号11の残基190〜200;配列番号11の残基216〜221;配列番号11の残基492〜498;
【0137】
配列番号11の残基516〜522;配列番号11の残基546〜551;配列番号11の残基593〜598;配列番号11の残基724〜730;配列番号11の残基742〜748;配列番号11の残基787〜793;配列番号11の残基13〜40;配列番号11の残基30〜66;配列番号11の残基60〜107;配列番号11の残基85〜135;配列番号11の残基123〜172;配列番号11の残基167〜201;配列番号11の残基189〜225;配列番号11の残基213〜274;配列番号11の残基257〜302;配列番号11の残基293〜327;配列番号11の残基309〜342;配列番号11の残基334〜358;配列番号11の残基248〜376;配列番号11の残基366〜408;配列番号11の残基386〜425;配列番号11の残基410〜499;
【0138】
配列番号11の残基472〜525;配列番号11の残基509〜551;配列番号11の残基527〜619;配列番号11の残基621〜649;配列番号11の残基635〜690;配列番号11の残基682〜702;配列番号11の残基695〜734;配列番号11の残基723〜752;配列番号11の残基739〜763;および配列番号11の残基755〜793。これらの抗原を動物に接種することによって発生した免疫応答からの抗体を、本明細書において記載するように、単離し、精製することができる。
【0139】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造し、単離する方法はこの分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと:Current Protocols in Imunology、Cooligan他(編者)、National Institutes of Health、John Wiley & Sons,Inc.1995;Sambrook他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、NY、1989;およびHurrell、J. G. R.編、Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications、CRC Press,Inc.、Boca Raton、FL、1982。
【0140】
当業者にとって明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットにzdint5ポリペプチドまたはそのフラグメントを接種することによって、ポリクローナル抗体を発生させることができる。アジュバント、例えば、明礬(水酸化アルミニウム)またはフロインド完全アジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用することによって、zdint5ポリペプチドの免疫原性を増加させることができる。
【0141】
免疫化に有効なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例えば、zdint5またはその部分と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチドは全長の分子またはその部分であることができる。ポリペプチドの部分が「ハプテン様」である場合、このような部分は免疫化のために高分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイド)好都合に接合または結合することができる。
【0142】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性フラグメント、例えば、F(ab’)2およびFabタンパク質分解的フラグメントを包含する。遺伝子操作された無傷抗体またはフラグメント、例えば、キメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよびポリペプチドをまた包含される。
【0143】
非ヒトCDRをヒトフレームワークおよび定常領域上にグラフトするか、あるいは全体の非ヒト可変ドメインを組込む(必要に応じて暴露された残基の置換によりそれらをヒト様表面で「クローキング」する、ここで結果は「ベニヤ化抗体」である)ことによって、非ヒト抗体をヒト化することができる。ある場合において、ヒト化抗体は可変領域フレームワーク内の非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期を増加させることができ、そして投与時の悪い免疫反応の可能性を減少させる。
【0144】
ここにおいて有効な抗体を発生させまたは選択する別の技術は、zdint5タンパク質またはタンパク質に対するリンパ球のin vitro暴露、およびファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを包含する(例えば、固定化または標識化されたzdint5タンパク質またはペプチドを使用する)。ファージ上にまたは細菌、例えば、大腸菌(E. coli)上にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、潜在的zdint5ポリペプチド結合性ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。
【0145】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダム突然変異誘発およびランダムペプチド合成により得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを使用して、既知のターゲットと相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。既知のターゲットは、タンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学的または合成高分子、または有機または無機の物質であることができる。
【0146】
このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーをつくり、スクリーニングする技術はこの分野において知られおり(Ladner他、米国特許第5,223,409号;Ladner他、米国特許第4,946,778号;Ladner他、米国特許第5,403,484号およびLadner他、米国特許第5,571,698号)そしてランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、CLONTECH Laboratories,Inc.(カリフォルニア州パロアルト)、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)、New England Biolabs,Inc.(マサチュセッツ州ベバーリイ)およびPharmacia LKB Biotechnology,Inc.(ニュージャージイ州ピスカタウェイ)から商業的に入手可能である。
【0147】
本明細書に開示するzdint5を使用してランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、zdint5に結合するタンパク質を同定することができる。zdint5ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合性タンパク質」は、細胞をタグ化するために;アフィニティー精製によりホモローグポリペプチドを単離するために使用することができる;それらを薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に直接的または間接的に結合させることができる。また、これらの結合性タンパク質は分析法、例えば、発現ライブラリーをスクリーニングする方法および活性を中和する方法において使用することができる。
【0148】
結合性タンパク質は、また、ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイ;根元的病理または疾患のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出または定量する診断アッセイにおいて使用することができる。また、これらの結合性タンパク質は、in vitroおよびin vivoにおけるzdint5の結合およびシグナルトランスダクションをブロックするzdint5「アンタゴニスト」として作用することができる。これらの抗zdint5結合性タンパク質は、一般に、例えば、プロテアーゼ活性、または血管形成阻害をモジュレートするために使用されるであろう。
【0149】
抗体が対照(非zdint5)ポリペプチドに対する結合アフィニティーよりも少なくとも10倍大きい結合活性(zdint5ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに対する)の限界レベルを示す場合、抗体は特異的に結合性であると決定される。抗体の結合アフィニティーは、当業者により、例えば、スキャッチャード分析(Scatchard、G.、Ann. NY Acad. Sci. 51:660−672、1949)により、容易に測定することができる。
【0150】
zdint5タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために、当業者に知られている種々のアッセイを利用することができる。典型的なアッセイは下記の文献に詳細に記載されている:Antibodies:A Laboratory Manual、HarlowおよびLane(編者)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988。このようなアッセイの代表例は下記のものを包含する:並流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。さらに、野生型vs突然変異体zdint5タンパク質またはポリペプチドに対する結合について、抗体をスクリーニングすることができる。
【0151】
zdint5を発現する細胞をタグ化するために;アフィニティー精製によりzdint5を単離するために;zdint5ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイのために;根元的病理または疾患のマーカーとして可溶性zdint5を検出または定量するために;FACSを使用する分析法において;発現ライブラリーをスクリーニングするために;抗イディオタイプ抗体を発生させるために;そして中和性抗体としてまたはin vitroおよびin vivoにおいてzdint5をブロックするアンタゴニストとして;zdint5に対する抗体を使用することができる。
【0152】
適当な直接的タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する;ここにおける抗体は、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの接合体をin vivo診断または療法的用途に使用することができる。そのうえ、アッセイ、例えば、ウェスタンブロットまたはこの分野において知られている他のアッセイにおいて、変性されたzdint5またはそのフラグメントを検出するために、zdint5に対する抗体またはそのフラグメントをin vitroにおいて使用することができる。
【0153】
ここにおける抗体またはポリペプチドは、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの接合体をin vivo診断または療法的用途に使用することができる。例えば、対応する抗相補的分子(例えば、それぞれ、インテグリンまたは抗原)を発現する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができる。さらに詳しくは、zdint5ポリペプチドまたは抗zdint5抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリングし、抗相補的分子を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【0154】
適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこれらの分子は放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する。適当な細胞障害性分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこれらの分子は細菌または植物トキシン(例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス(Pseudomonas)エキソトキシン、リシン、アブリンおよびその他)、ならびに療法上の放射性核種、例えば、ヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90を包含する(ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合させるか、あるいは例えば、キレート化部分を通して間接的に結合させる)。
【0155】
また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシンに複合化することができる。検出可能なまたは細胞障害性分子を間接的に結合させるために、検出可能なまたは細胞障害性分子を相補的/抗相補的対の1メンバーと複合化することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体部分に結合させる。これらの目的のために、ビオチン/ストレプトアビジンは典型的な相補的/抗相補的対である。
【0156】
別実施態様では、ポリペプチド−毒素融合蛋白質又は抗体−毒素融合蛋白質は標的細胞又は組織を阻害し、又は除去するために使用することができる(例えば癌細胞又は組織の治療に)。あるいは、TSP1−様ドメインのみを含む融合蛋白質は、検出可能分子、細胞傷害性分子又は相補性分子を所望する型の細胞又は組織(即ち細胞外マトリックス)に方向付けるのに好適であろう。同様に、zdint5に対応する結合相手には検出可能又は細胞傷害性分子を結合させることができ、一般的な相補的−検出可能/細胞傷害性分子標識体に関する細胞/組織特異的運搬に適した一般的な標的ビークルを提供できる。
【0157】
別実施態様では、zdint5ポリペプチド又は抗zdint5抗体が以下器官由来の高増殖性組織を標的にするのであれば、zdint5−サイトカイン融合蛋白質又は抗体−サイトカイン融合蛋白質はインビボでの標的組織(例えば結腸、小腸、胎児肺、清掃及びB−細胞)殺滅の促進に使用できる。(一般的にHornickら、Blood 89:4437−47,1997参照)。
【0158】
かれらは作用が望まれる部位をサイトカインの標的とすることができ、それによりサイトカインの局所的濃度を高めることができる融合蛋白質を既述している。好適zdint5ポリペプチド又は抗−zdint5抗体は望ましくない細胞又は組織(即ち腫瘍又は白血病)を標的とし、融合サイトカインはエフェクター細胞による高められた標的細胞融解を伝達する。本目的に好適なサイトカインには、例えばインターロイキン2及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)が含まれる。
【0159】
ここに記載の生物活性型ポリペプチド又は抗体標識体は静脈内、動脈内又は腺管内に供給でき、あるいは作用を意図する部位に局所的に導入されるだろう。本発明のzdint5ポリペプチドは、完全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片及び融合ポリペプチドを含め、通常の技術に従い遺伝子工学宿主細胞にて産生することができる。好適宿主細胞は外来性DNAによって形質転換できる、又はトランスフェクションでき、培養により増殖可能なタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞及び培養高等真核細胞を含む。
【0160】
真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化DNA分子を操作し、外来性DNAを各種宿主細胞内に導入するための技術はSambrookら、分子クローニング:ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989,及びAusubelら、分子生物学の最新手法(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987。
【0161】
一般にzdint5ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内にて発現に必要なその他遺伝的要素と動作可能に結合しており、一般には転写プロモーター及びターミネーターを含んでいる。更に当業者はあるシステム内では選択可能マーカーが別々のベクターに備えられても良く、そして外来性DNAの複製が宿主細胞ゲノム内への組み込みにより提供されることを認識するが、一般にはベクターは1又はそれ以上の選択可能なマーカー及び1又はそれ以上の複製介し起点を含んでいる。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクター及びその他要素の選択は、当分野通常技術水準内にある一般的事項である。多くのこの様な要素は文献に記載されており、商業的供給会社より入手できる。
【0162】
zdint5ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られている)が発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列はzdint5の分泌シグナル配列でよく、又はその他分泌型蛋白質(例えばt−PA)由来、又は新たに合成されたものでも良いだろう。分泌シグナル配列はzdint5DNA配列に動作可能に結合され、即ち2配列は正確な読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞分泌経路内に導かれる様に配置される。分泌シグナル配列は一般に対象ポリペプチドをコードするDNA配列の5’側に位置するが、一部分泌シグナル配列は対象DNA配列内の別の部位に位置するだろう(Wlechら、米国特許第5,037,743号;Hollandら、米国特許第5,143,830号参照)。
【0163】
本発明のポリペプチドの未変性分泌シグナル配列は、その他ポリペプチドを分泌経路へ導くのに使用される。本発明はこの様な融合ポリペプチドを提供する。当業者既知でありここに開示されている方法を用いることで、zdint5ポリペプチド由来分泌シグナル配列が他ポリペプチドに動作可能に結合されているシグナル融合ポリペプチドが作ることができる。本発明の融合ポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は追加ペプチドとアミノ末端側に好ましく融合し、追加ペプチドを分泌経路に導く。例えばこれら新規分泌シグナル配列融合構築体は、受容体の様な一般に非分泌型である蛋白質の活性成分を分泌させることができる。この様な融合体はペプチドを分泌経路させるためにインビボ又はインビトロにて使用できるだろう。
【0164】
あるいは、zdint5のプロテアーゼドメインは異なるプロテアーゼドメインを提供する異種配列により置換することができる。この場合、融合産物は分泌でき、xdint5のTSP1−様ドメインは置換型プロテアーゼドメインを上記特異的組織に誘導できる。この置換型プロテアーゼドメインDAMs/MDCs/SVMPs/ADAM−TS/METH様ファミリー構成体により置き換えられたプロテアーゼドメイン、又はその他既知プロテアーゼ由来のドメインから選択できる。
【0165】
同様にzdint5蛋白質のTSP1−様ドメインは異なるTSP1−様ドメインを提供する異種配列により置換できる。この場合も、融合蛋白質は分泌でき、置換型TSP1−様ドメインはzdint5のプロテアーゼドメインを特定組織に誘導できる。置換型TSP1−様ドメインはADAMs/MDCs/SVMPs/METH−様ファミリー構成体のTSP1−様ドメインから選択できる。これら例では融合産物は、可溶性又は膜固定型蛋白質だろう。
【0166】
培養哺乳動物細胞は本発明の好適宿主である。哺乳動物宿主細胞に外来性DNAを導入する方法には、リン酸カルシウム伝達トランスフェクション法(Wiglerら、Cell 14: 725, 1978; CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981:GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション法(Neumannら、EMBO J, 1:841−5, 1982)、DEAE−デキストラン伝達トランスフェクション法(Ausubelら、上記)、及びリポソーム伝達トランスフェクション法(Hawley−Nelsonら、Focus 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993,及びウイルスベクター(MillerとRosman、BioTechniques 7:980−90, 1989; WangとFiner, Nature Med. 2: 714−6, 1996)。
【0167】
培養哺乳動物細胞での組換え体ポリペプチドの産生は例えばLevinsonら、米国特許第3,713,339号;Hagenら、米国特許第4,784,950号;Palmiterら、米国特許第4,579,821号;及びRingold、米国特許第4,656,134号により開示されている。好適培養哺乳動物細胞にはCOS−1(ATCC番号CRL1650)、COS−7(ATCC番号CRL1651)、BHK(ATCC番号CRL1632)、BHK570(ATCC番号CRL10314)、293(ATCC番号CRL1573;Grahamら、J. Gen. Virol.36:59−72, 1977)及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株(例えばCHO−K1;ATCC番号CCL61)が含まれる。
【0168】
その他好適細胞株が当分野既知であり、米国基準株コレクション(Manasas、VA)の様な好適寄託機構より入手できる。一般にSV−40又はサイトメガロウイルス由来プロモーターの様な強力な転写プロモーターが好ましい。例えば米国特許第4,956,288号を見よ。その他好適プロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来のもの(米国特許第4,579,821号及び第4,601,978号)及びアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。
【0169】
一般には薬物選別が使用され、外来DNAが挿入された培養哺乳動物細胞が選択される。この様な細胞は一般には“トランスフェクタント”と称される。選択薬剤存在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝えることができる細胞は“安定型トランスフェクタント”と呼ばれる。好ましい選別マーカーは抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選別はG−418等のネオマイシン型薬剤存在下に実施される。選別システムは“増幅”と呼ばれる工程である、所望遺伝子の発現レベルの向上にも利用できる。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選別薬剤存在下に培養し、続いて選別薬剤量を増加して高レベルの導入遺伝子産生を行う細胞を選別し、実施される。
【0170】
好適な増幅化能選別マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素であり、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬剤耐性遺伝子(例えば非グロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)も利用できる。緑色蛍光蛋白質、又はCD4、CD8、クラスIMHCの様な細胞表面蛋白質、胎盤アルカリフォスファターゼの様なその他表現形を導入するその他マーカーは、FACSソーティング又は磁性ビーズ分離技術の様な手法による、非トランスフェクト細胞からのトランスフェクト細胞の選別に使用できるだろう。
【0171】
植物細胞、昆虫細胞及び鳥類細胞を含むその他高等真核生物細胞も宿主として利用できる。植物右細胞内の遺伝子発現に関するベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)の使用はSinkarら、J. Biosci. (Bangalore)11:47−58, 1987にレビューされている。昆虫細胞の形質転換及びその中での外来ポリペプチドの産生はGuarinoら、米国特許第5,162,222号及びWIPO公開WO94/06463号に開示されている。
【0172】
昆虫細胞は一般にはオートグラファ・カリホルニカ(Autographa californica)nuclear polyhedrisus virus(AcNPV) 由来の組換え体バキュロウイルスで感染できる。King, L.A及びPossee, R.D.,バキュロウイルス発現系、ラボラトリーガイド(The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide), London, Chapman & Hall; O’Reilly, D.R.ら、バキュロウイルス発現ベクター;ラボラトリーマニュアル(Baculovirus Expression Vectors; A Laboratory Manual ), New York, Oxford University Press., 1994; 及びRichardson, C. D., 編、バキュロウイルス発現プロトコール、分子生物学に於ける方法(Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology), Totowa, NJ, Humana Press, 1995参照。
【0173】
組換え体zdint5バキュロウイルスを作製する第2の方法は、Luckow(Luckow、V.A,ら、J. Virol 67:4566−79, 1993)報告のトランスポゾンをベースとした系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系は、Bac−to−BacTMキット(Life Technologies, Rockville, MD)として市販されている。この系はトランスファーベクターであるTn7トランスポゾンを含むpFastBac1TM(Life Technologies)を使用し、zdint5ポリペプチドをコードするDNAを”Bacmid”と呼ばれる大型プラスミドとしてE.coli内に維持されたバキュロウイルスゲノム内に移動させる。pFastBac1TMトランスファーベクターはAcNPVポリヘドリンプロモーターを利用し所望遺伝子、本例ではzdint5の発現を誘導する。
【0174】
ポリヘドリンプロモーターは除去しバキュロウイルス感染初期に発現し、分泌蛋白質の発現に有利であることが示されているバキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーター(Pcor、p6.9又はMPプロモーターとしても知られる)で置換することができる。Hill−Perkins, M.S及びPossee, R.D., J. Gen. Virol, 71:971−6, 1990; Bonning, B.C.ら、J. Gen.Virol. 75: 1551−6, 1994;及びChazenbalk, G. D.,及びRapoport, B., J. Biol. Chem 270: 1543−9, 1995参照。これらトランスファーベクターでは、短形及び長形の塩基性蛋白質プロモーターが使用できる。
【0175】
更に、未変性zdint5分泌シグナル配列を昆虫蛋白質由来の分泌シグナル配列に置換したトランスファーベクターを構築できる。例えば、エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen、Carlsbad、CA)、又はバキュロウイスルgp67(PharMingen、San Diego, CA)由来の分泌シグナル配列を構築体内に利用し、未変性zdint5分泌シグナル配列を置換することができる。更に、トランスファーベクターは発現されたzdint5ポリペプチドのC−又はN−末端にエピトープタグ、例えばGlu−Gluエピトープタグ(Grussenmeyer,T.ら、Proc、Natl. Acad. Sci.82: 7952−4, 1985)をコードするDNAを持つ読みとり枠内融合体を含むことができる。
【0176】
当分野既知の技術を利用し、zdint5を含むトランスファーベクターはE.coli内に形質導入され、組換え体バキュロウイルスを示す中断型lacZ遺伝子を含むbacmidsに関しスクリーニングされる。組換え体バキュロウイルスゲノムを含むbacmidDNAは通常技術により単離され、例えばSf9細胞の様なスポドペトラ・フルギペルダ(Spodopetra frugiperda)細胞のトランスフェクトに利用される。引き続きzdint5を発現する組換え体ウイルスが産生される。組換え体ウイルス保存体は、当分野に通常使用さえる方法にて作成される。
【0177】
組換え体ウイルスは宿主細胞、典型的にはアワヨトウムシであるスポドフテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)由来細胞株の感染に使用される。一般的にはGlickとPasternak、分子バイオテクノロジー:組換え体DNAの原理と応用(Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA), ASM Press, Washington, DC., 1994参照。その他好適細胞株はトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)(米国特許第5,300,435号)由来のHigh FiveOTM細胞株(Invitrogen) である。市販の無血清培地を使用し細胞を増殖、維持する。
【0178】
好適培地はSf9細胞に関してはSf900ITTM(Life Technologies)又はESF921TM(Expression Systems)である;そしてT.ni細胞に関してはEx−cellO0405TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS)又はExpress FiveOTM(Life Technologies)である。細胞は培養密度約2−5×103細胞ないし密度1−2×106細胞まで増殖させ、その時点で組換え体ウイルス保存体を多重感染度(MOI)0.1ないし10、より一般的には約3で加える。使用方法は市販の研究用マニュアルに一般的に記載されている(King,L.A及びPossee, R.D.,上記;O’Reilly, D.Rら、上記;Richardson, C.D.,上記)。続く上清からのzdint5ポリペプチドの精製はここに記した方法を利用し達成できる。
【0179】
酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に使用できる。この観点に於いて特に興味深い酵母の種はサッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisiae), ピヒア・パストリス(Pichia pastoris), 及びピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica)である。サッカロミセス・セレビシエー(S.cerevisiae)を外来DNAにて形質転換する方法、及びそれより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号;Kawasakiら、米国特許第4,931,373号;Brake、米国特許第4,870,008号;Welchら、米国特許第5,037,743号及びMurrayら、米国特許第4,845,075号に開示されている。
【0180】
形質転換細胞は選別マーカー、一般には薬剤耐性又は特定栄養素(例えばロイシン)無しでの増殖能力により決定される表現形にて選別される。サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisiae)での使用に好適なベクター系はKwawakiらにより開示されたPOT1ベクター系であり(米国特許第4,931,373号)、それにより形質転換細胞をグルコース含有培地中での増殖から選別することができる。酵母での使用に好適なプロモーター及びターミネーターには、糖分解性酵素遺伝子(例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号;Kingsmanら、米国特許第4,615,974号;及びBitter、米国特許第4,977,092号)及びアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが含まれる。
【0181】
米国特許第4,990,446号;5,063,154号;第5,139,936号及び第4,661,454号も参照せよ。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe), クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis), クリイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis), ウルチラゴ・マイディス(Ustilago maydis), ピヒア・パストリス(Pichia pastoris), ピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica), ピヒア・グイレルホンディー(Pichia guillermondii)及びキャンディダ・マルトサ(Candida maltosa)を含むその他酵母に関する形質転換系は当分野既知である。例えばGleesonら、J. Gen. Microbiol. 132:3459−65, 1986及びCregg、米国特許第4,882,279号を参照のこと。
【0182】
アスペルギルス(Aspergillus)細胞はMcKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従い利用されるだろう。アクレロニウム・クリソゾナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法はSuminoら、米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換する方法はLambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。組換え体蛋白質産生の宿主としてのピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica)の使用は米国特許第5,716,808号、第5,736,383号、第5,854,039号及び第5,888,767号に開示されている。
【0183】
細菌大腸菌(Escherichia coli)、バシルス(Bacillus)及びその他属を含む前核生物宿主細胞も本発明に於ける有用な宿主細胞である。これら宿主を形質転換し、その中にクローン化されている外来DNA配列を発現する技術は当分野で良く知られている(例えばSambrookら、上記を参照)。zdint5ポリペプチドをE.coliの様な細菌内に発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性顆粒として細胞質に留まるか、又は細菌性分泌経路によりペリプラズム間隙内に運ばれるだろう。前者では、細胞は溶解され、顆粒は回収され、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を使用し変性される。
【0184】
変性されたポリペプチドは次に、例えば尿素溶液及び還元型と酸化型グルタチオンの組合せ溶液に対し透析し、齟齬の緩衝化生理食塩水に対し透析する様にして変性剤を希釈することで、再度折りたたまれダイマー形成することができる。後者の場合には、細胞を破壊し(例えば超音波処理又は浸透圧ショック)ペリプラズム間隙より可溶性の機能型としてペリプラズム間隙内容物を放出させ、蛋白質を回収することで、変性及び再折りたたみの必要性を回避しポリペプチドを回収することができる。
【0185】
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は通常の方法に従い、栄養素及び選択された宿主細胞の増殖に必要とされるその他成分を含む培地内に培養される。限定培地及び複合培地を含む各種好適培地が当分や既知であり、一般には炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地は更に成長因子又は血清の様な成分も必要に応じ含むだろう。増殖培地は一般に、例えば発現ベクターに乗り運ばれるか又は宿主細胞内に共トランスフェクションされた選別マーカーにより補完される薬剤選別または必須栄養素の欠失により、外来性に添加されたDNAを含む細胞を選別するだろう。
【0186】
ピヒア・メタノリカ(P.methanolica)細胞は炭素、窒素及び微量栄養素の適当な源を含む培地中、約25℃ないし35℃の温度にて培養される。液体培養体は小型フラスコの振とう、又はファーメンターのスパーリングの様な通常の方法により十分通気される。ピヒア・メタノリカ(P.methanolica)に関する好適培地はYEPD(2%D−グルコース、2%BactoTMペプトン(Difoc Laboratories, Detroit, MI)、1%BactoTM酵母抽出物(Difco Laboratories)、0.004%アデニン及び0.006%L−ロイシン)である。
【0187】
本発明の蛋白質は非天然に生ずるアミノ酸残基も含むことができる。非天然型に生ずるアミノ酸は、以下に限定されるものではないが、トランス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシプロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコール酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−及び4−メチルプロリン、3,3−ジメチルプロリン、t−ロイシン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン及び4−フルオロフェニルアラニンを含む。
【0188】
非天然型アミノ酸残基を蛋白質に取り込ませるための幾つかの方法が当分野で既知である。例えばナンセンス変異を化学的にアミノアシル化した抑制型tRNAを利用し抑制するインビトロ系が利用できる。アミノ酸を合成する方法及びtRNAをアミノアシル化する方法は当分野既知である。ナンセンス変異を含むプラスミド転写及び翻訳はE.coliS30抽出物及び市販の酵素ならびにその他試薬を含む無細胞系にて実施される。蛋白質はクロマトグラフィーにて精製される。例えばRobertsonら、 J. Am, Chem. Soc, 113:2722, 1991; Elimanら、Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chungら、Science 259;806−9, 1993;及びChungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145−9, 1993)を見よ。
【0189】
第2の方法では、翻訳は変異mRNA及び化学的にアミノアシル化された抑制tRNAのマイクロインジェクションにより、Xenopus卵細胞内にて実施される(Turcattiら、J. Biol. Chem. 271:19991−8, 1996)。第3の方法では、E.coli細胞は置換される天然アミノ酸(例えばフェニルアラニン)なしに、所望の非天然型アミノ酸(例えば2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン、又は4−フルオロフェニルアラニン)の存在下に培養される。
【0190】
非天然型アミノ酸はそれに対応する天然アミノ酸に代わって蛋白質内に取り込まれる。Koideら、Biochem.33:7470−6、1994参照。天然型アミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により非天然型に転換することができる。化学修飾は部位特異的突然変異誘導と組み合わせ、更に置換範囲を拡大することができる(Wynn及びRichards、Protein Sci. 2:395−403, 1993)。
Zdint5アミノ酸残基に関しては、非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に生じないアミノ酸及び非天然型アミノ酸の限定数が置換されるだろう。
【0191】
本発明のポリペプチドを80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上精製することが好ましく、特に好ましくは医薬品として純粋な状態、即ち混入高分子、特にその他蛋白質及び拡散に関して99.9%より高く純粋であり、感染性及び発熱性作用物質を含まないことが好ましい。好ましくは精製ポリペプチドはその他ポリペプチド、特に動物起源のその他ポリペプチドを実施含まないことが好ましい。
【0192】
発現組換え体zdint5蛋白質(キメラポリペプチド及び多量体蛋白質を含む)は通常の蛋白質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製される。一般的にはAffinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988;及びScopes、Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York, 1994を見よ。
【0193】
ポリヒスチジンアフィニティータグ(典型的には約6ヒスチジン残基)を含む蛋白質は、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えばHouchuliら、Bio/Technol.6: 1321−1325, 1988を見よ。Glu−Gluタグを含む蛋白質は、通常の方法に従い免疫親和性クロマトグラフィーにより精製できる。たとえばGrussenmeyerら、上記を見よ。マルトース結合蛋白質融合体は、当分野既知の方法に従いアミロースカラムにより精製される。
【0194】
本発明のポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー、分子篩い及びアフィニティークロマトグラフィーを含む方法の組み合わせにより単離できる。例えば、固定金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーを利用し、ポリヒスチジンタグを含む蛋白質を含む富ヒスチジン蛋白質を精製できる。簡単に述べると、まずゲルに2価金属イオンを加えキレートを形成させる(Sulkowski、Trends in Biochem. 3:1−7, 1985)。富ヒスチジン蛋白質は使用した金属イオンに依存し、各種親和性にてこのマトリックスに吸着され、そして競合的溶出体、pHの低下、強力なキレート形成剤の使用により溶出されるだろう。
【0195】
その他精製法には、レシチンアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化蛋白質の精製が含まれる(Methods in Enzymol., Vol.182, “Guide to Protein Purification”, M.Deutscher,(編集)、Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529−39)。発明の別の実施態様では精製を容易にするために、目的のポリペプチドとアフィニティータグ(例えばマルトース結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン)の融合体が構築されるだろう。
【0196】
Zdint5ポリペプチドは、排除固相合成法、部分固相法、断片濃縮又は古典的液層合成法を含む、当分野既知の方法による化学合成によっても調整できる。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc.85:2149, 1963; Stewartら、Solid Phase Peptide Synthesis(第2版)、Pierce Chmeical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer及びRapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986; 及びAthertonら、Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989を見よ。
当分野既知の方法を利用し、zdint5蛋白質はモノマー又は多量体として調整でき;グリコシル化又は非グリコシル化でき:ぺギル化又は非ペギル化でき;及び初期アミノ酸残基を含むことも、又は含まないこともできる。
【0197】
メタロプロテアーゼ(配列番号2)及びTSP1−様ドメイン(即ち配列番号5及び8)は結腸、小腸、小児肺、精巣及びB−細胞の疾患のアッセイ及び治療への利用に関し特に興味深い。メタロプロテアーゼドメインは感染に対する宿主防衛系の活性化に関係しているだろう。この様なメタロプロテアーゼの一つはマトリリジンである(Wilson, C.ら、Science 286: 113−117, 1999)。マトリリジンは腸内の病原性細菌の宿主防御に関係していることが示されている。Wilsonらは更にマトリリジンが上皮関連蛋白質として、小腸以外の組織に於ける防御活性化も特異的に制御している可能性を示唆している。
【0198】
同様に、zdint5メタロプロテアーゼドメイン(配列番号2)は単独、又はその他ドメイン(即ちzdint5のTSP1−様ドメイン、配列番号5及び8、又は配列番号11、又はADAM−TS及びMETH蛋白質ファミリー由来のその他TSP1−様ドメイン)と共同し、例えば結腸、小腸及び肺の上皮を侵襲する病原性細菌に対する体反応に関係しているだろう。
あるいは、メタロプロテアーゼドメイン(配列番号2)はプロテアーゼとして工業応用での利用に関する酵素的界面活性剤としても利用できる。当業者はzdint5分子の蛋白質分解機能を測定するアッセイを容易に特定できるだろう。
【0199】
メタロプロテアーゼドメインの活性を測定するための代表的アッセイは、それの血漿蛋白質分解酵素阻害剤であるα2Mへの結合能力を測定することであろう。結合域の切断がα2Mサブユニット中に立体構造変化を誘導し、これがプロテアーゼのカプセル化及びα2M内部のチオエステルの活性化を招き、その結果活性型プロテアーゼの共有交差結合が生じる。Nagase, Hら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 294−302, 1994参照。
【0200】
へパリン及びへパリン硫酸は分泌された成長因子及びその他蛋白質の細胞外マトリックスへの結合を促進する分子である。即ちヘパリン及びヘパリン硫酸に結合する分子はこれら成長因子の影響を変調するのに有用である。ヘパリン及びヘパリン結合モチーフは蛋白質のMETHやADAM−TSサブグループ中のトロンボスポンジン反復体中に認められている(Kuno、1998、上記参照)。即ちTSP1−様ドメイン(配列番号5及び/又は8)はヘパリン及びヘパリン硫酸に結合することによって成長因子の影響を変調するのに有用であろう。
【0201】
zdint5ポリペプチドの活性は、例えばプロテアーゼ活性、血管新生阻害剤;細胞外マトリックス形成又はリモデリング;転移、及びADAM/MDC/SVMP/ADAM−TS/METHファミリー構成体に関連する、あるいはアポトーシスの様なインテグリン/ディスインテグリン相互作用に関連したその他生物学的機能;又は分化を測定する各種アッセイを利用し、測定できる。特に興味深いものは、腫瘍抑制である。
【0202】
あるいはスプラシングされたペプチドを含む本発明の蛋白質は、結腸、小腸、胎児肺、清掃及びB−細胞での腫瘍抑制、生殖細胞成熟、免疫的認識、及び成長と分化に関し、単独又はその他分子(成長因子、サイトカイン等)と組合せての作用に有効である。zdint5の別スプライシングは細胞型特異的であり、特異的組織に活性を付与するだろう。
【0203】
問題のアッセイは小腸、結腸、又は肺組織の増殖、分化、及び/又は発生の変化を測定し、又は検出する。更に、プロテアーゼ活性に対すzdint5ポリペプチドの効果、又は上皮細胞、一般には腫瘍細胞の血管新生阻害に対する効果は、関心の測定対象である。更に別のアッセイは、プロテアーゼ活性及びアポトーシスの変化を検証する。
【0204】
精製は培養細胞を利用すること、又はクレームする発明の分子を適当な動物モデルに投与することで、インビボにて測定することができる。一般に、増殖効果は細胞数の増加として観察され、従ってアポトーシス及び有糸分裂誘発の阻害を含むだろう。培養細胞は、初代培養体からの結腸上皮癌細胞、精巣、胎児及び成人の肺、B細胞、メラノーマ及びヒト臍帯静脈上皮細胞を含む。細胞増殖を測定するアッセイは当分野既知である。
【0205】
例えば増殖を測定するアッセイは、色素であるニュートラルレッドに対する化学感受性(Cavanaughら、Investigational New Drugs 8: 347−354, 1990)、放射線標識ヌクレオチドの取り込み(Cookら、Analytical Biochem. 179:1−7, 1989)、増殖細胞のDNA中への5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)の取り込み(Porstmannら、J. Immunol. Methods 82; 169−179, 1985)及びテトラゾリウム塩の利用(Mosmann、 J. Immunol Methods 65:55−63, 1983; Alleyら、Cancer Res. 48:589−601, 1988; Marshallら、Growth Reg. 5: 69−84, 1995;及びScudieroら、Cancer Res. 48: 4827−4833, 1988)の様なアッセイを含む。更に、zdint5ポリペプチドは細胞接着を介して細胞増殖、移動及び血管新生に役割を果たしているだろう。
【0206】
Zdint5がインビボで化学誘因物質であるかを決定するために、zdint5は皮内又は腹膜内注射により投与できる。注射部位に蓄積した白血球の特徴は、系統特異的細胞表面マーカー及び蛍光免疫サイトメトリーを利用し、又は免疫組織化学により決定できる(Jose, J. Exp. Med. 179:881−87, 1994)。骨髄から末梢血液への特異的白血球細胞集団の放出も、zdint5注射後に測定するができる。
【0207】
分化は漸進的および動的過程であり、多分化能性幹細胞で開始し、最終分化細胞で終結する。細胞系譜へのコミットメントを伴わずに再生し得る多分化能性幹細胞は、細胞系譜へのコミットメントがなされると失われる一組の分化マーカーを発現する。前駆細胞は、細胞が細胞系譜経路を進行して成熟に向かう場合に発現され続けることもある一組の分化マーカーを発現する。成熟細胞により専ら発現される分化マーカーは、通常は細胞生成物、細胞生成物を産生するための酵素、ならびに受容体および受容体様補体分子のような機能的特性を示す。
【0208】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団中に存在するマーカーの同定によりモニタリングされる。例えば、筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および細網細胞は、共通の間充織幹細胞から生じると考えられる(Owen et al., Ciba Fdn. Symp. 136:42−46, 1988)。間充織幹細胞のためのマーカーは十分に同定されておらず(Owen et al., J. of Cell Sci. 87:731−738, 1987)、そこで同定は普通は前駆細胞および成熟細胞段階でなされる。
【0209】
ある経路を通って最終分化または脱分化に向かう特定の種類の細胞を刺激する因子は、共通前駆体または幹細胞から生じる全細胞集団に影響を及ぼす、ということを示唆する証拠がある。したがって、zdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の内分泌および外分泌細胞の抑制または増殖を刺激し得る。
分化を測定する検定としては、例えば組織の段階特異的発現に関連した細胞表面マーカーの測定、酵素活性、機能的活性または形態学的変化が挙げられる(Watt, FASEB, 5:281−284, 1991; Francis, Differentiation 57:63−75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesse, 161−171, 1989)。
【0210】
本発明のzdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞における増殖または分化を調べるために用いられ得る。本発明のこのような方法は一般に、zdint5ポリペプチド、モノクローナル抗体、そのアゴニストまたはアンタゴニストの存在下および非存在下でこれらの組織由来の細胞をインキュベートすること、ならびに細胞の増殖または分化の変化を観察することを包含する。これらの組織からの細胞株は、例えばアメリカ培養細胞コレクション(Manasas, VA)から市販されている。
【0211】
代替的にスプライスされたペプチドを含めた本発明のタンパク質および断片は、プロテアーゼ活性またはアンギオテンシン阻害を試験するのに有用である。zdint5分子、変異体および断片は、分離して、あるいは結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞中のその他の分子(成長因子、サイトカイン等)と一緒に適用され得る。
【0212】
本発明のタンパク質は、治療薬の送達に有用であり、それらの例としては、プロテアーゼ放射性核種、化学療法薬および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの治療薬の作用は、培養細胞を用いてin vitroで、組織切片上でex vivoに、あるいは適切な動物モデルに特許請求した本発明の分子を投与することにより、測定され得る。本発明のタンパク質を検定するための代替的in vivoアプローチは、ウイルス送達系を包含する。この目的のためのウイルスの例としては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ関連ウイルス(AAW)が挙げられる。
【0213】
二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは近年、異種核酸の送達のためのもっともよく研究された遺伝子運搬ベクターである(再検討のためには、T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161−89, 1994;およびJ.T.Douglas and D.T.Curiel, Science & Medicine 4:44−53, 1997参照)。アデノウイルス系は、いくつかの利点を提供する:アデノウイルスは、(i)相対的大型DNA挿入物を収容し、(ii)高力価に増殖され、(iii)広範囲の哺乳類細胞型を感染させ、そして(iv)異なるプロモーターを含有する多数の利用可能なベクターとともに用いられる。さらに、アデノウイルスは血流中で安定であるため、それらは静注により投与され得る。
【0214】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失することにより、異種DNAの大型挿入物(7 kbまで)が収容され得る。これらの挿入物は、直接結紮により、または同時トランスフェクト化プラスミドによる同種組換えにより、ウイルスDNA中に組み入れられ得る。模範的系では、必須いい1遺伝子がウイルスベクターから欠失されており、宿主細胞(ヒト293細胞株が適例である)によりE1遺伝子が提供されない限り、ウイルスは複製しない。
【0215】
無傷動物に静脈内投与した場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的にする。アデノウイルス送達系がE1遺伝子欠失を有する場合、ウイルスは宿主中で複製し得ない。しかしながら、宿主の組織(例えば肝臓)は、異種タンパク質を発現し、加工処理(そして、分泌シグナル配列が存在する場合には、分泌)する。分泌タンパク質は高度血管新生化肝臓中の循環に入りそして感染動物に及ぼす影響が確定され得る。
【0216】
さらに、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルスベクターは、ベクターに対する免疫応答を低減または排除するための試みに用いられ得る。このようなアデノウイルスはE1欠失化され、さらにE2AまたはE4の欠失を含有する(Lusky, M. et al., J. Virol. 72:2022−2032, 1998; Raper, S.E. et al., Human Gene Therapy 9:671−679, 1998)。さらに、E2bの欠失は、免疫応答を低減することが報告されている(Amalfitano, A. et al., J. Virol. 72:926−933, 1998)。
【0217】
さらに、全アデノウイルスゲノムを欠失することにより、異種DNAの非常に大きい挿入物が収容され得る。全ウイルス遺伝子が欠失されたいわゆる「中身のない」アデノウイルスの生成は、異種DNAの大型挿入物の挿入のために特に有益である(再検討のためには、Yeh, P. and Perricaudet, M., FASEB J. 11:615−623, 1997参照)。
【0218】
アデノウイルス系は、in vitroでのタンパク質産生のためにも用いられ得る。細胞が迅速に分裂中でない条件下でアデノウイルス感染非293細胞を培養することにより、細胞は長期間タンパク質を産生し得る。例えば、BHK細胞を細胞工場で集密まで成長させて、次に当該分泌タンパク質をコードするアデノウイルスベクターに曝露する。次に、有意の細胞分裂を伴わずに感染細胞を数週間生存させる無血清条件下で細胞を成長させる。あるいは、アデノウイルスベクター感染293S細胞は、相対的に高い細胞密度で懸濁培地中で成長して、有意量のタンパク質を産生し得る(参照Garnier et al., Cytotechnol. 15:145−55, 1994)。どちらかのプロトコールを用いて、発現、分泌異種タンパク質を細胞培養上清から反復的に単離し得る。感染293S細胞産生プロトコール内で、非分泌タンパク質も有効に得られ得る。
【0219】
可溶性または細胞表面タンパク質として、細胞表面タンパク質相互作用およびその後の生理学的細胞応答に関連した細胞外酸性化率または陽子排出を測定するケイ素ベースのバイオセンサーミクロフィジオメーターにより、zdint5ポリペプチドまたはzdint5が結合するペプチドの活性を測定し得る。適例装置は、Molecular Devices, Sunnyvale, CAにより製造されたサイトセンサーミクロフィジオメーターCytosenser Microphysiometerである。
【0220】
種々の細胞応答、例えば細胞増殖、鉄輸送、エネルギー産生、炎症性応答、調節および受容体活性化等を、この方法により測定し得る(例えば、McConnell, H.M. et al., Science 257:1906−1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228:84−108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49−59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87−95, 1998参照)。ミクロフィジオメーターは、接着性または非接着性真核生物または原核生物細胞を検定するために用い得る。
【0221】
長時間、細胞培地中の細胞外酸性化変化を測定することにより、ミクロフィジオメーターは、zdint5タンパク質、それらのアゴニストおよびアンタゴニストを含めた種々の刺激に対する細胞応答を直接測定する。好ましくは、ミクロフィジオメーターを用いて、zdint5ポリペプチドに応答しない対照真核生物細胞と比較した、zdint5応答性真核生物細胞の応答を測定する。zdint5応答性真核生物細胞は、zdint5に対する結合相手に関するポリヌクレオチドがトランスフェクトされてzdint5に応答性の細胞を作製する細胞、あるいはzdint5に対して天然に応答性である細胞を包含する。
【0222】
zdint5ポリペプチドに曝露された細胞の応答の変化により測定される分化は、zdint5変調細胞応答の直接測定値である。さらに、種々の刺激したで、このようなzdint5変調応答を査定し得る。本発明は、zdint5タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法であって、zdint5ポリペプチドに応答する細胞を提供し、被験化合物の非存在下で細胞の第一部分を培養し、被験化合物の存在下で細胞の第二部分を培養し、そして細胞の第一部分と比較した場合の細胞の第二部分の細胞外酸性化率の測定可能な変化を検出する方法を提供する。
【0223】
さらに、zdint5ポリペプチドの存在下および被験化合物の非存在下での細胞の第三部分の培養は、zdint5応答性細胞に関する陽性対照ならびに被験化合物のアゴニスト活性をzdint5ポリペプチドの場合と比較するための対照を提供する。zdint5のアンタゴニストは、被験化合物の存在下および非存在下でzdint5タンパク質に細胞を曝露し、それによりzdint5変調性活性の低減が被験化合物中のアゴニスト活性を示すことにより同定され得る。
【0224】
さらに、zdint5は、zdint5変調性経路に応答する細胞、組織または細胞株を同定するために用いられ得る。前記のミクロフィジオメーターを用いて、本発明のzdint5に応答性の細胞のようなzdint5結合相手を発現する細胞を迅速に同定し得る。細胞は、zdint5ポリペプチドの存在下または非存在下で培養され得る。zdint5の存在下で細胞外酸性化の測定可能変化を引き出す細胞は、zdint5に応答性である。このような細胞株は、前記のようなzdint5ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために用いられ得る。同様の方法を用いて、zdint5を発現する細胞は、zdint5シグナリング経路を刺激する細胞を同定するために用いられ得る。
【0225】
zdint5発現に関して観察される組織分布(結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞)の点から見て、アゴニスト(ネイティブプロテアーゼおよびTSP1様ドメインを含む)およびアンタゴニストは、in vitroおよびin vivo適用の両方において非常に大きい可能性を有する。zdint5アゴニストおよびアンタゴニストとして同定された化合物は、in vitroおよびin vivoでのプロテアーゼ活性、新脈管形成抑制、細胞外マトリックスタンパク質、虚血再還流および炎症の修復およびリモデリングを試験するために有用である。
【0226】
例えば、zdint5およびアゴニスト化合物は、限定細胞培地の構成成分として有用であり、そして細胞培養に一般的に用いられる血清に取って代わるために、単独でまたは他のサイトカインおよびホルモンと組合せて用いられ得る。したがって、アゴニストは、培養中の骨髄系およびリンパ系細胞系譜の細胞の成長および/または発達を特異的に促進するのに有用である。さらに、zdint5ポリペプチドおよびzdint5アゴニスト、例えば小分子は、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の拡大、分化および/またはプロテアーゼ活性、あるいは新脈管形成抑制に関する研究試薬として有用である。zdint5ポリペプチドは、これらの細胞型に関する組織培地に付加される。
【0227】
アンタゴニストも、補体/抗補体対間の相互作用の部位、ならびにプロテアーゼ活性または新脈管形成抑制の部位を特性化するための研究試薬として有用である。zdint5活性の阻害剤(zdint5アンタゴニスト)としては、抗zdint5抗体および可溶性zdint5ポリペプチド(例えば、配列番号2、5、8および11における)、ならびにその他のペプチドおよび非ペプチド剤(リボザイムを含む)が挙げられる。
【0228】
zdint5は、その活性の阻害剤(アンタゴニスト)を同定するためにも用いられ得る。被験物質が本明細書中に開示された検定に付加されて、zdint5の活性を抑制する化合物を同定する。本明細書中に開示された検定の他に、試料は、TSP1様ドメイン/細胞外マトリックス結合あるいはzdint5依存性細胞応答の刺激/抑制を測定するよう意図された種々の検定内でzdint5活性の抑制に関して試験され得る。例えば、zdint5変調化細胞株は、zdint5刺激性細胞経路に応答するレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされ得る。
【0229】
この種類のレポーター遺伝子構築物は当業界で既知であり、一般的にルシフェラーゼのような検定可能タンパク質または環状AMPのような代謝物質をコードする遺伝子に操作可能的に連結されたDNA応答素子を含む。DNA応答素子としては、環状AMP応答素子(CRE)、ホルモン応答素子(HRE)、インスリン応答素子(IRE)(Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273−7, 1990)および血清応答素子(SRE)(Shaw et al., Cell 56:563−72, 1989)が挙げられるが、これらに限定されない。環状AMP応答素子は、Roestler et al., J. Biol. Chem. 263(19):9063−6; 1988およびHabener, Molec. Endocrinol. 4(8):1087−94; 1990で検討されている。
【0230】
ホルモン応答素子は、Beato, Cell 56:335−44; 1989で検討されている。候補化合物、溶液、混合物または抽出物は、レポーター遺伝子発現のzdint5刺激の低減により立証されるように、標的細胞におけるzdint5の活性を抑制する能力に関して試験される。この種類の検定は、細胞表面タンパク質、即ち細胞外マトリックスあるいは相補体/抗相補体対の抗相補体成員と結合するzdint5を直接遮断する化合物、ならびに相補体/抗相補体結合後の細胞経路における過程を遮断する化合物を検出する。
【0231】
代替的には、化合物またはその他の試料は、検出可能標識(例えば、125I、ビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、FITC等)でタグされたzdint5を用いて、zdint5結合の直接遮断に関して試験され得る。この種類の検定内では、標識化zdint5の結合を阻害する被験試料の能力は抑制活性を示し、これは二次検定により確証され得る。
【0232】
さらに、zdint5ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞組織における創傷治癒を促すために治療的に有用であり得る。本発明のzdint5ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストにおけるこの能力の存在を立証するために、当業界で既知の手法にしたがって、創傷治癒を促すそれらの能力に関して、このようなzdint5ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを評価する。所望により、この点におけるzdint5ポリペプチド性能を、増殖因子、例えばEGF、NGF、TGF−α、TGF−β、インスリン、IGF−I、IGF−II、繊維芽細胞増殖因子(FGF)等と比較し得る。さらに、zdint5ポリペプチドあるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、共働的作用を同定するために、1つ又はそれ以上の増殖因子と組合せて評価され得る。
【0233】
zdint5ポリペプチドは、その結合相手(単数または複数)の精製のためにも用いられ得る。固体支持体、例えばアガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース系樹脂、シリカベースの樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下で安定である同様の物質上に固定される。固体支持体上にポリペプチドを連結するための方法は当業界で既知であり、その例としては、アミン化学作用、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化およびヒドラジド活性化が挙げられる。その結果生じる培地を、一般にカラムの形態で形造し、結合相手を含有する流体を1回またはそれ以上、カラムに通して、結合相手をzdint5ポリペプチドに結合させる。次に、塩濃度の変化、カオトロピック剤(グアニジンHCl)またはpHを用いて結合相手を溶離して、zdint5/結合相手結合を中断する。
【0234】
リガンド結合受容体(または補体/抗相補体対の一成員である抗体またはその他の細胞表面結合タンパク質)またはその結合断片および市販のバイオセンサー計器(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を使用する検定系は、有益に用いられ得る。このような受容体、抗体、相補体/抗相補体対または断片は、受容体チップの表面に固定される。この計器の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229−40, 1991およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554−63, 1993により開示されている。
【0235】
アミンまたはスルフヒドリル化学作用を用いて、受容体、抗体、成員、ディスインテグリンまたは断片を、フローセル内で金フィルムに付着されるデキストラン繊維と共有結合させる。被験試料をセルに通す。インテグリン、エピトープまたは補体/抗補体対の反対成員が試料中に存在する場合、それは固定化ディスインテグリン、抗体または成員とそれぞれ結合して、媒質の屈折率の変化を引き起こし、これは金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系は、結合親和性が算定され得るオン−およびオフ−速度の決定、およびその査定を可能にする。
【0236】
プロテアーゼまたはTSP1様ポリペプチドを結合するプロテアーゼ基質ポリペプチドおよびTSP1様結合ポリペプチドも、当業界で既知のその他の検定系内に用いられ得る。同様に、zdint5のTSP1様ポリペプチドと結合する細胞外マトリックスポリペプチドも、他の検定系とともに用いられ得る。このような系としては、結合親和性の決定のためのスキャッチャード分析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660−72, 1949参照)および熱量検定(Cunningham et al., Sciendce 253:545−48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821−25, 1991)が挙げられる。
【0237】
「可溶性タンパク質」とは、細胞膜に結合されないタンパク質である。可溶性タンパク質は、膜貫通および細胞質ドメインを欠く最も一般的なリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性タンパク質は、付加的アミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供するかまたは基質へのポリペプチドの付着のための部位を提供する親和性タグ、あるいはイムノグロブリン定常部配列を包含し得る。多数の細胞表面タンパク質は、タンパク質分解により産生され得るかまたは代替的スプライス化mRNAから翻訳される天然可溶性対応体を有する。タンパク質は、それぞれ膜固定またはシグナル伝達を提供するのに十分なこれらのセグメントの部分を欠く場合、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないといわれている。
【0238】
可溶性形態のzdint5ポリペプチド、例えば配列番号2、5、8および11のポリペプチドは、zdint5ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用し、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞におけるzdint5の作用を変調するのに有用である。
本発明の分子は、プロテアーゼ活性に、あるいは新脈管形成抑制に関与する細胞外マトリックスタンパク質、あるいは相補体/抗相補体対の成員を同定および単離するために用いられ得る。
【0239】
例えば、本発明のタンパク質およびペプチドは、カラム上に固定され、膜調製物がカラム上を走行する(Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992,pp.195−202)。タンパク質およびペプチドは、放射能標識され得る(Methods in Enzymol., vol. 182,”Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721−37)か、光親和性標識され(Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483−514, 1993およびFedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167−80, 1984)、そして特異的細胞表面タンパク質が同定され得る。
【0240】
本発明のポリペプチド、核酸および/または抗体は、胃腸照射、化学療法または抗体使用後の回復に関連した障害の治療に用い得る。さらに、本発明の分子は、抗感染剤および/または細胞外マトリックス修復およびリモデリングとして有用であり得る。本発明の分子は、タンパク質分解、アポトーシス、新脈管形成、感染、細胞接着、細胞融合およびシグナリングを変調するために、あるいは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞のような多様な組織における病理学的症状の発症を治療または予防するために用い得る。
【0241】
特に、ある種の疾患は、このような診断、治療または予防を受け容れ得る。本発明の分子は、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞における内皮の抑制および増殖を変調するために用い得る。zdint5ポリペプチドによる診断、治療または予防を受け容れ得る疾患としては、例えば腫瘍形成、クローン病、炎症性腸疾患、食物中毒、黒色腫および変性疾患が挙げられる。
【0242】
zdint5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zdint5活性を増大または抑制するのが望ましい遺伝子療法適用内で有用である。哺乳類が突然変異化zdint5遺伝子を有するかまたはzdint5遺伝子を有さない場合、zdint5遺伝子は哺乳類の細胞中に導入され得る。一実施態様では、zdint5ポリペプチドをコードする遺伝子は、in vivoでウイルスベクターに導入される。このようなベクターとしては、弱毒または欠陥DNAウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0243】
ウイルス遺伝子を全部またはほぼ全部欠く欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞に導入後は感染性でない。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染し得る懸念なしに、特定の局在化領域の細胞への投与を可能にする。特殊なベクターの例としては、欠陥単純ヘルペスウイルス(HSV1)ベクター(Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320−30, 1991)および弱毒アデノウイルスベクター、例えばStratford−Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626−30, 1992により記載されているようなベクター、ならびに血管アデノ関連ウイルスベクター(Samulski et al., J. Virol. 61:3096−101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822−8, 1989)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0244】
別の実施態様では、zdint5遺伝子は例えば米国特許第5,399,346号(Anderson等);Mann et al., Cell 33:153, 1983;米国特許第4,650,764号(Temin等);米国特許第4,980,289号(Temin等);Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988;米国特許第5,124,263号(Temin等);国際特許公告WO 95/07358(Dougherty等、1995年3月16日公開);およびKuo et al., Blood 82:845, 1993に記載されているように、レトロウイルスベクターに導入され得る。あるいは、ベクターは、リポソームを用いたin vivoでのリポフェクションにより導入され得る。
【0245】
合成陽イオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413−7, 1987;Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027−31, 1988)。特定器官にin vivoで外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、いくつかの実際的利点を有する。
【0246】
特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは、有益な一分野を示す。特に、特定の細胞への直接トランスフェクションは、有益な一分野を表す。例えば、特定細胞型への直接トランスフェクションは、細胞不均一性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓および脳において特に有益である。脂質は、ターゲッティングの目的のために他の分子と化学的に結合され得る。標的化ペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質)、タンパク質、例えば抗体、または非ペプチド分子は、リポソームと化学的に結合され得る。
【0247】
同様に、zdint5ポリヌクレオチド(配列番号1、3、4、6、7、9、10または12)は、特定組織、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞を標的するために用いられ得る。身体から標的細胞を除去し、裸DNAプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に身体に形質転換化細胞を再移植することができる。遺伝子療法のための裸DNAベクターは、当業界で既知の方法により、例えばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター運搬体の使用により、所望の宿主細胞中に導入され得る(例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963−7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621−4, 1988参照)。
【0248】
アンチセンスおよびリボザイム法を含めた種々の技法を用いて、例えば細胞増殖をin vivoで抑制するために、zdint5遺伝子転写および翻訳を抑制し得る。zdint5コードポリヌクレオチド(例えば、配列番号1、3、4、6、7、9、10または12で記述されるようなポリヌクレオチド)のセグメントと相補的であるポリヌクレオチドは、zdint5コードmRNAと結合し、そしてこのようなmRNAの翻訳を抑制するよう意図される。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを用いて、細胞培養中のまたは被験者におけるzdint5ポリペプチドコード遺伝子の発現を抑制する。
【0249】
「トランスジェニックマウス」と呼ばれるzdint5遺伝子を発現するよう工学処理されたマウス、および「ノックアウトマウス」と呼ばれるzdint5遺伝子機能の完全非存在を示すマウスも生成され得る(Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740−42, 1993; Capeechi, M.R., Science 244:1288−1292, 1989; Palmiter, R.D. et al., Annu Rev Genet. 20:465−499, 1986)。例えば、遍在的に、あるいは組織特異的または組織制限プロモーター下でzdint5を過剰発現するトランスジェニックマウスを用いて、過剰発現が表現型を生じるか否かを問う。
【0250】
例えば、野生型zdint5ポリペプチド、ポリペプチド断片またはその突然変異体の過剰発現は、正常細胞過程を変え、zdint5発現が機能的に関連する組織を同定し、zdint5、そのアゴニストまたはアンタゴニストに対する治療的標的を示し得る表現型を生じ得る。例えば、工学処理するためのトランスジェニックマウスは、可溶性zdint5ポリペプチド(配列番号11の約アミノ酸104〜306)を過剰発現するものである。さらに、このような過剰発現は、ヒト疾患との類似性を示す表現型をもたらす。同様に、ノックアウトzdint5マウスを用いて、zdint5がin vivoで絶対に必要とされる場合を確定し得る。
【0251】
ノックアウトマウスの表現型は、本明細書中に記載したもののようなzdint5アンタゴニストが有し得るin vivo作用を予測する。ヒトzdint5cDNAを用いて、ネズミzdint5mRNA、cDNAおよびゲノムDNAを単離し得るが、これらはその後、ノックアウトマウスを生成するために用いられる。これらのマウスは、zdint5遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質をin vivoで試験するために用いられ得るし、対応するヒト疾患のためのin vivoモデルとして用いられ得る。さらに、本明細書中に記載したzdint5に対して向けられるzdint5アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムのトランスジェニックマウス発現は、前記のトランスジェニックマウスと同様に用いられ得る。
【0252】
zdint5ポリペプチド、その変異体および断片は、プロテアーゼ活性または新脈管形成抑制に関連した障害、例えば概して免疫、炎症、受精、配偶子成熟、免疫学、外傷および上皮性障害に関連した障害に対する置換療法として有用であり得る。
組織形態形成の低広範見積決定基は、細胞再配列の過程である。細胞運動性および細胞−細胞接着はともに、形態形成的細胞再配列において中心的役割を演じると思われる。細胞は、隣接細胞との接触を迅速に破壊し、おそらくは同時的に再作製し得る必要がある(Gumbiner, B.M., Cell 69:385−387, 1992参照)。結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞中の分泌タンパク質と同様に、zdint5はこれらのおよびその他の組織中での細胞間再配列に一役を演じ得る。
【0253】
zdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の組織中で発現される。したがって、本発明のポリペプチドは、細胞接着および転移におけるその役割を調べるのに有用であり、転移、特に結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の腫瘍における転移を防止するのに有用であり得る。同様に、zdint5のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、腫瘍または罹患組織中のそれらの欠陥対応体を置換し得る。したがって、本発明のzdint5ポリペプチド製剤組成物は、これらの組織の病理学的調節または拡大に関連した障害の予防または治療に有用であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、調節可能プロモーターとともに用いられ、したがって送達タンパク質の投与を調節し得る。
【0254】
さらに、腫瘍進行および転移に及ぼすzdint5の活性および作用は、in vivoで測定され得る。いくつかの同質遺伝子マウスモデルは、腫瘍進行に及ぼすポリペプチド、化合物またはその他の治療の影響を試験するために開発された。これらのモデルでは、培養中で継代される腫瘍細胞は、腫瘍ドナーとして同一系統のマウスに移植される。細胞は、レシピエントマウス中で同様の特徴を有する主要に発達し、いくつかのモデルでは転移も起こる。腫瘍モデルとしては、中でもLewis肺癌(ATCC No. CRL−1642)およびB16黒色腫(ATCC No. CRL−6323)が挙げられる。
【0255】
これらはともに一般的に用いられる腫瘍株であって、in vitroで容易に培養および操作される、C57BL6マウスと同質遺伝子性である。これらの細胞株のいずれかの移植に起因する腫瘍は、C57BL6マウスにおいては肺に転移し得る。Lewis肺癌モデルは、新脈管形成の阻害剤を同定するために、近年マウス二重盲検散られている(O’Reilly MS, et al. Cell 79:315−328, 1994)。組換えタンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの毎日注射により、アルは組換え体アデノウイルスの1回注射により、実験的作用物質を用いてC57BL6/Jマウスを処置する。
【0256】
この処置の3日後に、105〜106細胞を背中皮膚したに移植する。あるいは、全身的というよりむしろ腫瘍部位にまたは細胞内にタンパク質が合成されるように、移植前に、細胞それ自体を組換え体アデノウイルス、例えばzdint5を発現するものに感染させ得る。マウスは、5日以内に可視的腫瘍を正常に発症する。腫瘍は3週間までの期間増殖させられ、この期間中に、それらは、対照群では1500〜1800 mm3のサイズに達し得る。実験中通して、腫瘍サイズおよび体重を注意深くモニタリングする。
屠殺時点で、腫瘍を取り出して、肺および肝臓と一緒に計量する。肺重量は、転移腫瘍重量とよく相関する。付加的測定として、肺表面転移を計数する。当業界で既知のそして本明細書中に記載した方法を用いて、組織病理学的検査、免疫組織化学的検査およびin−situハイブリダイゼーション用に、切除腫瘍、肺および肝臓を調製する。したがって、血管構造を補充し、転移を経る腫瘍の能力に及ぼす発現当該ポリペプチド、例えばzdint5の影響を査定し得る。さらに、アデノウイルスの使用の他に、移植細胞は一過性にzdint5でトランスフェクトされ得る。
【0257】
さらに、精製zdint5またはzdint5状態調節培地はこのマウスモデルに直接注入され、それゆえこの系で用いられ得る。安定zdint5トランスフェクト体の使用ならびにin vivoでのzdint5発現を活性化するための誘導可能プロモーターの使用は当業界で既知であり、転移のzdint5誘導を査定するためにこの系に用いられ得る(全般的参照のためには、O’Reilly MS, et al. Cell 79:315−328, 1994;およびRusciano D. et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349−361, 1995参照)。
【0258】
zdint5遺伝子は、欠陥zdint5遺伝子を有するヒトを同定するためのプローブとして有用であり得る。結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞におけるzdint5の強い発現は、zdint5ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがこれらの組織中での異所的増殖の指標として測定される場合に用いられ得る、ということを示唆する。したがって、zdint5のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらに対する突然変異は、これらの組織における癌の診断指標として用いられ得る。
【0259】
本発明のポリペプチドは、細胞接着および転移におけるその役割を調べるのに有用であり、転移、特に結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の腫瘍における転移を防止するのに有用であり得る。同様に、zdint5のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍または悪性組織中のそれらの欠陥対応体に取って代わるために用いられ得る。
zdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞中で発現される。したがって、本発明のzdint5ポリペプチド製剤組成物は、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の病理学的調節または拡大に関連した障害の予防または治療に有用であり得る。
【0260】
配列番号2、5、8および11のzdint5ポリヌクレオチドは、染色体9q34にマッピングされている。したがって、本発明は、診断的適用に用途を見出す試薬も提供する。例えば、zdint5遺伝子、zdint5DNAまたはRNAを含むプローブ、あるいはその亜配列を用いて、zdint5遺伝子が染色体9q34上に存在するか否か、あるいは突然変異が起きているか否かを確定し得る。
【0261】
zdint5遺伝子座での検出可能染色体異常としては、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化および再配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような異常は、分子遺伝子技法、例えば制限断片長多型(RFLP)分析、PCR技法を用いる短タンデム反復(STR)分析、ならびに当業界で既知のその他の遺伝子連鎖分析技法(Sambrook et al.、上記;Ausubel et al.、上記;Marian, Chest 108:255−65, 1995)を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出し得る。
【0262】
製薬的使用のためには、本発明のタンパク質は、経口的、非経口的(特に静脈内または皮下)、膀胱内、膣内、腹腔内、局所的(粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして)、頬内、胎内に、あるいは肺または鼻腔吸入剤として投与し得る。静脈内投与は、1〜数時間の限局期間中のボーラス注射または注入による。概して、製剤処方物は、zdint5タンパク質を、単独で、または二量体相手とともに、製薬上許容可能なビヒクル、例えば食塩水、緩衝化食塩水、水中の5%デキストロース等と組合せて含有する。処方物はさらに、1つ又はそれ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、ウイルス表面のタンパク質損失を防止するためのアルブミン等を含み得る。
【0263】
処方方法は当業界で周知であり、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示されている。治療用量は一般に、0.1〜100μg/患者の体重1kg/日、好ましくは0.5〜20 mg/kg/日の範囲であり、的確な用量は、処置される症状の性質および重症度、患者の特性等を考慮して、許容された規準にしたがって臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。
【0264】
本タンパク質は、1週間またはそれ以下、しばしば1〜3日間の短期治療のために投与され得るし、あるいは数ヶ月または数年に亘る長期治療に用いられ得る。概して、zdint5の治療的有効量とは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞における細胞外マトリックスリモデリング、瘢痕組織形成、腫瘍抑制、血小板凝集、アポトーシス、筋発生の臨床的に有意の変化を生じるのに十分な量である。同様に、zdint5の治療的有効量とは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞に関連した障害における臨床的に有意の変化を生じるのに十分な量である。
【発明の名称】抗−脈管形成性腸ペプチド、zdint5
【特許請求の範囲】
【請求項1】a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
b)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及び
c)配列番号8に示されアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項2】配列番号11に示されるアミノ酸配列をさらに含んで成る請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項3】前記ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第2ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結されている請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項4】第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第1ポリペプチドセグメントが配列番号2に示されるアミノ酸配列を含んで成り、そして前記第2ポリヌクレオチドセグメントが1又は複数のTSP1−様ドメインをコードする第2ポリペプチドをコードし、そして前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項5】第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記第1ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第2ポリペプチドセグメントが、
(a)配列番号5の残基1〜48を含んで成るポリペプチド;及び
(b)配列番号8の残基1〜59を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択された1又は複数のポリペプチドを含んで成り;
ここで前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリペプチドセグメントのアミノ末端側に位置することを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項6】次の作用可能に連結された要素:
a)転写プロモーター;
b)ポリペプチドをコードするDNAセグメント、ここで前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、
i)請求項1記載のアミノ酸配列;
ii) 配列番号11に示されるようなアミノ酸配列;
から成る群から選択される;及び
c)転写ターミネーター;
を含んで成る発現ベクター。
【請求項7】請求項6記載の発現ベクターが導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項8】DNAセグメントによりコードされたポリペプチドを発現する、請求項7記載の細胞を培養し;そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項9】請求項8記載の方法により製造されるポリペプチド。
【請求項10】配列番号11に示されるようなアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【0001】
発明の背景:
細胞外マトリックス形成及び分解に関連するタンパク質、特にタンパク質分解タンパク質は、種々の疾病、例えば癌、関節炎、アルツハイマー及び種々の炎症状態において、成長の間の確立する組織構成及び組織分解において決定的である。ADAM(ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ)、MMP(マトリックスメタロプロテアーゼ)、MDC(メタロプロテアーゼ−ディスインテグリン−システインに富んでいるタンパク質)及びSVMP(ヘビ毒メタロプロテアーゼタンパク質)において同定されている亜鉛メタロプロテアーゼが、特に細胞外タンパク質に適切である。それらのタンパク質の分解活性は、マトリックス分子及び非マトリックス分子、例えば腫瘍壊死因子αについてのタンパク質分解を包含する。Hurskainen, T. など., J. Biol. Chem. 274: 25555−25563, 1999を参照のこと。
【0002】
トロンボスポンジン−1(TSP1)は、インビボでの脈管形成を阻害する能力を有する細胞外マトリックス結合されたタンパク質である。TSP1は、インビトロで、細管−様管形成及び内皮細胞増殖を阻止する。TSP1の抗−脈管形成活性は、3種のタイプ1反復体を含む領域にマッピングされている。それらの反復体の組換え及びタンパク質分解フラグメントは、ウサギ角膜嚢及び漿尿膜アッセイにおいて血管−阻害活性を示した。TSP1の第2及び第3タイプ1に由来するペプチドは、内皮細胞を阻害し、そして全身性注射される場合、腫瘍増殖を抑制する。Vazquez, F. など., J. Biol. Chem. 274: 23349−23357, 1999を参照のこと。
【0003】
ADAM−TS(メタロプロテアーゼ、及びトロンボスポンジン−1反復体を有するディスインテグリン)及びMETH (メタロプロテアーゼ、及びトロンボスポンジン−1反復タンパク質)は、ADAMに関連する。ADAMTS−1は、トロンボスポンジン型を有するディスインテグリン及びメタロプロテアーゼとして特徴づけられ、そして悪液質腫瘍選択遺伝子としても同定されている炎症関連遺伝子である(Kuno, K. など., J. Biol. Chem. 272: 556−562, 1997)。
【0004】
METH−1は、メタロプロテアーゼ及びトロンボスポンジンドメインの組み合わせであり、そして脈管形成を阻害する(Vasquez, 前記)。ADAMTSタンパク質ファミリーの追加の再考に関しては、Tang, B. L., など., FEBS Letter 445: 223−225, 1999を参照のこと。追加のADAMTSファミリーメンバー、すなわちADAMTS−2は、軟膏“アグレカナーゼ(凝集酵素)”として包含され;Flannery, C.R., など., Bioc. and Bioph. Res. Comm. 260: 318−322, 1999を参照のこと。
【0005】
治療的に有用であることが示されているタンパク質のADAMs/ADAMS−TS/MDCs/SVMPs/METHファミリーのメンバーは、急性冠状動脈血栓症候群のための抗−凝集材として有用であるeptifibatide (COR Therapeutics, Inc. 及びKey Pharmaceuticals, Inc. により製造されるIntegrilin(商標)), 及びβ2インテグリン−介在性ヒト転移性メラノーマ細胞付着を阻害し、そして実験転移を阻止し(Trikha, M. など., Cancer Research 54: 4993−4998, 1994)、そして血小板凝集を阻害する(Clark, E.A. など., J. Biol. Chem. 269 (35): 21940−21943, 1994)contortrostainを包含する。
【0006】
本発明は、ADAMs/ADAMS−TS/MDCs/SVMPs/METHファミリーの新規メンバー、及びそのしようが本明細書における教授から当業者に明らかであろう関連する組成物を提供する。
【0007】
発明の要約:
1つの観点において、本発明は、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号2に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0008】
1つの観点において、本発明は、配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号5に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号5に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0009】
1つの観点において、本発明は、配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号8に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号8に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0010】
1つの観点において、本発明は、配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号11に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含んで成る。追加の態様においては、アミノ酸配列は、配列番号11に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、98%又は99%同一である。
【0011】
1つの観点において、本発明は、a)配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;c)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びd)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドを提供し;ここで前記ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第2ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結される。
【0012】
1つの観点において、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記第1ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第2ポリペプチドセグメントが配列番号5の残基1〜48を含んで成るポリペプチド;及び配列番号8の残基1〜59を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドを含んで成り;ここで前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0013】
もう1つの観点において、本発明は、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを供給し、ここで前記第1ポリペプチドセグメントが配列番号2の残基1〜203を含んで成り、そして前記第2ポリヌクレオチドセグメントがTSP1−様ドメインである第2ポリペプチドをコードし、そして前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0014】
もう1つの観点において、本発明は、次の作用可能に連結された要素:a)転写プロモーター;b)ポリペプチドをコードするDNAセグメント、ここで前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2に示されるようなのアミノ酸配列;配列番号5に示されるようなのアミノ酸配列;配列番号8に示されるようなのアミノ酸配列;及び配列番号11に示されるようなアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成る;及びc)転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。
【0015】
1つの観点においては、発現ベクターが導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞が供給される。もう1つの観点において、本発明は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養し;そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法を提供する。さらなる態様においては、前記方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【0016】
もう1つの態様においては、ポリペプチドと細胞とを組合すことによって細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法が提供され、ここで前記ポリペプチドが、a)配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;c)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びd)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択される。細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法においては、細胞は、a)結腸からの組織;b)小腸からの組織;c)精巣からの組織;及びd)肺からの組織から成る群から選択された組織に由来する。
【0017】
もう1つの観点においては、本発明は、ポリペプチドが、抗体を生成するために動物における免疫応答を誘発するよう、前記ポリペプチドにより動物を接種し;そして前記動物から抗体を単離する段階を含んで成る、請求項31記載の方法により製造されるポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供する。1つの態様においては、前記抗体は、a)配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;c)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びd)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドに対して特異的に結合する。
【0018】
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。1つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは、配列番号11の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含んで成る。もう1つの態様においては、単離されたポリペプチドは、配列番号11の少なくとも30個の連続したアミノ酸を含んで成る。もう1つの態様においては、前記11個のアミノ酸残基は、(a)配列番号2;(b)配列番号5;及び(c)配列番号8から成る群からである。
【0019】
もう1つの態様においては、単離されたポリペプチドは、48〜1120個の長さのアミノ酸である。もう1つの態様においては、前記連続したアミノ酸残基の少なくとも9個が、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン不変領域及びポリヒスチジン標識から成る群から選択された第2ポリペプチドに、ペプチド結合又はポリペプチドリンカーを通して作用可能に連結される。
【0020】
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記11個のアミノ酸の連続した配列は、a)配列番号5に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;b)配列番号8に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及びc)配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドから成る群から選択される。もう1つの態様においては、前記ポリペプチド分子は、48〜1120個の長さのアミノ酸である。
【0021】
1つの観点においては、本発明は、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記第1ポリペプチドセグメントがプロテアーゼドメインを含んで成り、そして前記第2ポリペプチドセグメントが(a)配列番号5の残基1〜48を含んで成るポリペプチド;及び(b)配列番号8の残基1〜59を含んで成るポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチド分子を含んで成り;ここで前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0022】
もう1つの観点においては、本発明は、第1ポリペプチドセグメント及び第2ポリペプチドセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを供給し、ここで前記第1ポリペプチドセグメントが配列番号2の残基1〜203を含んで成り、そして前記第2ポリヌクレオチドセグメントがTSP1−様ドメインである第2ポリペプチドをコードし、そして前記第1ポリペプチドセグメントが前記第2ポリヌクレオチドセグメントのアミノ末端側に位置する。
【0023】
もう1つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素:a)転写プロモーター;b)配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドをコードするDNAセグメント;及びc)転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。1つの態様においては、前記DNAセグメントはさらに、親和性標識をコードする。
【0024】
1つの観点においては、発現ベクターが導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞が供給される。もう1つの観点において、本発明は、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養し;そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドを生成するための方法を提供する。さらなる態様においては、前記方法により製造されるポリペプチドが提供される。
【0025】
もう1つの観点においては、本発明は、配列番号11の少なくとも11個の連続したアミノ酸残基を含んで成るポリペプチドと細胞を、インビボ又はインビトロで組合すことによって、細胞外マトリックス相互作用を調節するための方法を提供する。もう1つの態様においては、細胞は、a)結腸からの組織;b)小腸からの組織;c)精巣からの組織;及びd)肺からの組織から成る群から選択された組織に由来する。もう1つの観点においては、本発明は、ポリペプチドが、抗体を生成するために動物における免疫応答を誘発するよう、請求項15記載のポリペプチドにより動物を接種し;そして前記動物から抗体を単離する段階を含んで成る、ポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供する。
【0026】
もう1つの態様においては、(a)配列番号2;(b)配列番号5;(c)配列番号8;及び(d)配列番号11から成る群から選択されたポリペプチドを含んで成るタンパク質に結合する、前記方法により生成される抗体が供給される。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の発明の特定の記載に基づいて明らかになるであろう。
【0027】
発明の特定の記載:
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる:
“親和性標識”とは、第2ポリペプチドの精製を提供し、又は基質への第2ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【0028】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンS トランスフェラーゼ(Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988), Glu−Glu親和性標識 (Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952−4, 1985)(配列番号7)、 物質P、すなわちFlagTM ペプチド(Hoppなど., Biotechnology 6: 1204−1210, 1988)、ストレプタビジン結合ペプチド、マルトース結合タンパク質(Guan など., Gene67:31, 1988)、セルロース結合タンパク質、チオレドキシン、ユビキチン、T7ポリメラーゼ又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein Expression and Purification 2:95−107, 1991を参照のこと。DNAコード親和性標識及び他の試薬は、商品供給者(例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA; Eastman Kodak, New Heven, CT)から入手できる。
【0029】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【0030】
用語“ポリヌクレオチド分子の補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCACGGG 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“〜に対応する”とは、配列におけるアミノ酸残基の位置に適用される場合、配列が最適に整列される場合の多くの配列における対応する位置を意味する。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、1又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して)を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【0031】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の1又は複数の起点、1又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【0032】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を参照のこと)。
【0033】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち95%以上の純度、より好ましくは99%以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【0034】
“作用可能に連結された”とは、複数の実物体が、それらがそれらの意図された目的のために機能するよう一緒に連結されることを意味する。DNAセグメントを言及する場合、その用語は、コード配列が正しい読み取り柄を整合して連結され、そして転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行することを示す。ポリペプチドを言及する場合、“作用可能に連結された”とは、配列の所望する機能が保持される、共有(例えば、ジスルフィド結合)及び非共有(例えば,水素結合、疎水性相互作用、又は塩−架橋相互作用)結合された配列を包含する。
【0035】
用語“オルト体(orthology)”又は“種相同体”(species homolog)とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、1つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
【0036】
“ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド(“nt”)、又はキロ塩基(“kb”)として表される。
【0037】
ここで、後者の2つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており;従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのような対になっていない末端は、長さ20ntを超えない。
【0038】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【0039】
用語“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され;置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【0040】
用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。
【0041】
受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり;モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL−3受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体及びIL―6受容体)であり得る。
【0042】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド(“分泌ペプチド”)をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
“セグメント”とは、特定された特性を有する大きな分子(例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド)の一部である。例えば、特定されたポリペプチドをコードするDNAセグメントは、5‘から3’の方向に読み取られる場合、その特定されたポリペプチドのアミノ酸をコードする、長いDNA分子の一部、例えばプラスミド又はプラスミドフラグメントである。
【0043】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される
【0044】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動)により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確には±10%であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
ADAM−TS及びMETHファミリーメンバーのいくつかのメンバーのドメイン構造の議論は、本発明をより詳細に例示することを助けるであろう。分泌ペプチドが上記に記載されて来た。
【0045】
プロペプチドドメインは通常、メタロプロテアーゼのアミノ−末端側であり、そしてメタロプロテアーゼドメインが一定の環境下で活性化されるよう、メタロプロテアーゼドメインのためのインビトロとして作用することができる(たぶん、システイン−スイッチ機構を通して)。この阻害は、メタロプロテアーゼドメインの活性部位を阻止することによることができる。
【0046】
プロテアーゼドメインは、活性又は不活性であり得る。ディスインテグリンファミリーのいくつかのメンバーは、システインに富んでいるドメインにおいて“システイン−スイッチ”により調節され得る“活性”亜鉛触媒部位を有する“活性”プロテアーゼドメインを有するファミリーメンバーの例は、細胞外マトリックスにおけるタンパク質のプロセッシングを通して炎症工程に関与すると思われるADAM−TS1である。そのような触媒部位を有さないこのファミリーのメンバーは、例えば腫瘍抑制に関与するADAM11を包含する。不活性プロテアーゼドメインを有することが知られている他のタンパク質ファミリーは、セリンプロテアーゼである。
【0047】
付着(ディスインテグリン)ドメインは、ディスインテグリンの特異性に依存して、多数の細胞の表面上に位置することができるインテグリン又は細胞表面受容体を結合する。このディスインテグリンドメイン内の予測される結合部位はしばしば、13又は14個のアミノ酸を含んで成るアミノ酸ループである。Wolfsberg and White, 前記を参照のこと。折りたたみに基づくこの配列のコンホメーションは、その先端でアミノ酸配列を表すヘアピンループをもたらす。この配列はしばしば、“RGD”であるが、しかし種々の他のアミノ酸残基により置換され得る(Wolfsberg and White, 前記;及びJia, J. Biol. Chem. 272: 13094−13102, 1997)。
【0048】
特定種類のディスインテグリンドメインのための受容体は、多くのディスインテグリン結合ループ配列を認識することができる。ディスインテグリンドメインは、細胞−細胞相互作用、例えばGPIIb/IIIa (フィブロネクチン受容体)及び/又はGPIa/IIa(コラーゲン受容体)を結合することによって血小板凝集の阻害を担当することが示されている。METHタンパク質は、2種のディスインテグリンドメインを有する。
【0049】
多くのディスインテグリンファミリーメンバーは、融合ドメイン、すなわち約23個のアミノ酸の比較的疎水性のドメインを有する。このドメインは、ADAMファミリーメンバーのいくつかのメンバー内に存在し、そして細胞−細胞融合及び特に、精子/卵融合及び筋肉融合に関与することが示されている。
システインに富んでいるドメインは、ADAMs/ADAMS−TS/MDCs/SVMPs/METH−様ファミリーメンバーにおいて変化し、そしてインテグリンにインテグリン−結合領域を構造的に提供することに関与すると思われる。このファミリーのディスインテグリン−様メンバーに関しては、システインに富んでいるドメインはまた、ポリペプチドの二次構造コンホメーション、特にディスインテグリンドメインとシステインドメインとの間のジスルフィド結合のためにも必要である。
【0050】
多くのADAMs/MDCs/SVMPsファミリーメンバーは、細胞膜にポリペプチドを固定するために作用するトランスメンブランドメインを有する。METHタンパク質の場合、ポリペプチドは、細胞外マトリックスへのSP1−様ドメインの結合を通して固定されると思われる。従って、METH−1及びMETH−2タンパク質は、脈管形成の効果的インヒビターであることが示されている。膜固定されたADAMs/MDCs/SVMPsファミリーメンバーは、メタロプロテアーゼドメインがもう1つのタンパク質の細胞外ドメインを分解する“タンパク質エクトドメインシェディング(protein ectodomain shedding)”と呼ばれる工程に関与している。
【0051】
それらの場合、メタロプロテアーゼは、フェルチリン(ADAMs1及び2)又はTACE(ADAM17)の場合のように、細胞表面自体に対して活性的であり、又はメタロプトテアーゼは、KUZ及びADAM10について記載されるように、分泌経路において細胞内作用することができる(Blobel, C. P., 前記;及びLammich, S. など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3922−3927, 1999)。
【0052】
それらのメンバー−固定されたメタロプロテアーゼは、それらの遺伝子が転写される組織においてたぶん、活性的であり、この場合、それらは、同じ細胞表面に結合される他のタンパク質に対してシスで作用し、他の細胞表面に結合されるタンパク質、又は膜結合されない他のタンパク質に対してトランス作用することができる。さらに、膜アンカー自体は、分解され、身体における他の部位で活性的であり得るメタロプロテアーゼ/ディスインテグリンの可溶性形がもたらされる。
【0053】
ADAMs/MDCs/SVMPsファミリーメンバーの細胞質又はシグナル化ドメインは、リン酸化のための長さ及び部位において保存される傾向がある。しかしながら、他に、それらはアミノ酸組成においてユニークである傾向がある。いくつかのディスインテグリンファミリーメンバーは、Ab1, Src, 及び/又はSrc−関連SH3ドメインのSH3ドメインに結合することによってシグナルを出すことができる。
【0054】
トロンボスポンジ−様(TSP−様)ドメインは、タンパク質のカルボキシル末端側に位置する。複数のTSP−様ドメインが存在することができる。例えばMETH−1は、3種のTSP−様ドメインを有し、そしてもう1つのMETH相同体METH−2(Vasquez, 前記)は、2種のTSP−様ドメインを有する。トロンボスポンジン−1は、細胞外マトリックスに関連し、そして脈管形成をインビボで阻害する能力を有するモデュラータンパク質である。培養条件下で、トロンポスポンジン−1は、細管−様形成及び内皮細胞増殖を阻止する。METH−1及びMETH−2の両者はまた、角膜嚢及びCAMアッセイにおける脈管形成を阻害することが示されている(Vasquez, など)。
【0055】
本発明は、zdint5と称するタンパク質のMETHサブファミリーのメンバーの新規ドメインの発現に基づかれている。zdint5のドメインは、メタロプロテアーゼドメイン及び2種のTSP1−様ドメインを包含する。メタロプロテアーゼドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号1及び2で示される。メタロプロテアーゼドメイン内に、配列番号2の残基151〜161の亜鉛結合型が存在する。第1のTSP1−様ドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号4及び5で示される。第2のTSP1−様ドメインのためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号7及び8で示される。
【0056】
メタロプロテアーゼのための縮重ポリヌクレオチド、及び第1及び第2のTSP1−様ドメインは、それぞれ、配列番号3、6及び9で示される。それらのドメインがタンパク質においていかに組合され得るのか実例は、配列番号10(ポリヌクレオチド)、配列番号11(ポリペプチド)及び配列番号に(縮重ポリヌクレオチド)に示される。配列番号2に示されるようなアミノ酸残基69及び配列番号11に示されるようなもの172;配列番号2に示されるような73及び配列番号11に示されるような176;及び配列番号11に示されるような485, 533, 560, 595及び635は、可能性あるN−結合されたグリコシル化部位である。
【0057】
zdint5の組織分布の分析は、Human Multiple Tissue and Master Dot Blotsを用いて、ノザンブロット技法により行われ得る。そのようなブロット市販されており(Clontech, Palo Alto, CA)、そして当業者に知らされている方法によりプローブされ得る。例えば、Wu W. など., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press LLC, 1997を参照のこと。さらに、本発明のポリヌクレオチドの部分は、配列データベースに質問し、そして配列が由来する組織を同定することによって同定され得る。本発明のポリヌクレオチドの部分は、結腸腺癌cDNAライブラリー、小腸cDNAライブラリー、及び胎児肺、組織及びB−細胞から製造されたcDNAライブラリーにおいて同定されている。
【0058】
ADAMsファミリーのいくつかのメンバーは、スプライシングされたイソフォームを有する。スプライシングの例は、メルトリンαとしても知られているADAM12である。プロペプチド及びメタロプロテアーゼドメインを欠いている、この分子の切断された形は、インビボで異所性筋肉形成に関連するが、しかしインビトロではそうではなく、このことは、この遺伝子を発現する細胞が隣接する前駆体細胞に対して作用する成長因子を生成することを示唆する。
【0059】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるzdint5ポリペプチドをコードするDNA及びRNA分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号3は、配列番号2のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号6は、配列番号5のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号9は、配列番号8のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号12は、配列番号11のzdint5ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。
【0060】
当業者はまた、配列番号3、6、9及び12の縮重配列がUとTとを置換することによって、配列番号2、5、8及び11をコードするすべてのRNA配列も供給する。従って、配列番号3のヌクレオチド1−609;及び配列番号12のヌクレオチド1−2379を含んで成るzdint5ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのRNA相当物は、本発明により包含される。表1は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号3、6、9及び12内に使用される1文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードYはC又はTのいずれかを示し、そしてその相補体RはA又はGを示し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
【0061】
【表1】
与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号3、6、9及び12に使用される縮重コドンが表2に示される。
【0062】
【表2】
【0063】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン(WSN)のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン(AGR)をコードすることができ、そしてアルギニン(MGN)のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン(AGY)をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号2、5、8及び11のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【0064】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号3、6、9及び12に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【0065】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12の類似するサイズの領域、又はそれに対して相補的配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、当業界において良く知られており、そして多くの用途のために広く使用される;例えばSambrook など., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel など., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; Berger and Kimmel, eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, 1987 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227−59, 1990、参照のこと。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、二重鎖ハイブリッドを形成する一本鎖相補的配列の能力を開発する。そのようなハイブリッドは、DNA−DNA, RNA−RNA及びDNA−RNAを包含する。
【0066】
例示されるように、変異体、zdint5ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号1, 3, 4, 6, 7, 9, 10及び12のヌクレオチド配列を有する核酸分子(又はそれら補体)により、50%ホルムアミド、5×SSC(1×SSC:0.15Mの塩化ナトリウム及び15mMのクレン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液(100×Denhardt’s溶液:2%(w/v)Ficoll 400, 2%(w/v)ポリビニルピロリドン及び2%(w/v)ウシ血清アルブミン)、10%硫酸デキストリン及び20μg/mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んで成る溶液において、42℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【0067】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動を操作することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高温で、例えば約65℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液(例えば、Express HybTM Hybridisation Solution, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)を、その製造業者の説明書に従って利用できる。
【0068】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む0.5×〜2×SSC溶液による55〜65%での洗浄を包含する。すなわち、変異体zdint5ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号1、3、4、6、9、10及び12のヌクレオチド配列(又はその補体)を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、55〜65℃での、0.1%SDSを含む0.5×〜2×SSC溶液、例えば55℃での、0.1%SDSを含む0.5×SSC溶液、又は65℃での0.1%SDSを含む2×SSC溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるSSCをSSPEにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【0069】
本発明はまた、2種の次の基準を用いて同定され得る変異体zdint5核酸分子を企画する:上記記載のような、配列番号2、5、8及び11のアミノ酸配列(下記に記載されるような)のコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなzdint5変異体は、(1)55〜65℃での0.1%SDSを含む0.5×〜2×SSC溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12のヌクレオチド配列(又はその補体)を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして(2)配列番号2、5、8又は11のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%又は95%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【0070】
他方では、zdint5変異体は、(1)50〜65℃での0.1%SDSを含む0.1×〜0.2×SSC溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号1又は3のヌクレオチド配列(又はその補体)を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして(2)配列番号2、5、8又は11のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%又は95%以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【0071】
zdint5のディスインテグリンドメインにおける高度に保存されるアミノ酸は、新規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用され得る。例えば、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)は、種々の組織源又は細胞系から得られたRNAからの保存されたディスインテグリンメインをコードする配列を増幅するために使用され得る。特に、zdint5配列から企画された高い縮重プライマーが、この目的のために有用である。
【0072】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、RNAは、多量のzdint5 RNAを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980)により同定され、そして結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞を包含する。
【0073】
前記活性、又はRNA生成細胞又は組織が同定されると、全RNAは、グアニジウム HCl抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る(Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979)。ポリ(A)+ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(cDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ(A)+ RNAから調製される。他方では、ゲノムDNAが単離され得る。次に、zdint5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【0074】
zdint5をコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的DNA(cDNA)クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途(例えば、トランスジェニック動物における発現)に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようcDNAクローンを修飾することが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、zdint5に対する抗体、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【0075】
本明細書に開示されるzdint5ポリヌクレオチド配列はまた、zdint5遺伝子の5’非コード領域をクローン化するためにプローブ又はプライマーとしても使用され得る。この遺伝子領域は、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞における特異的発現を提供することが予測される。従ってzdint5遺伝子からのプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子療法により処理された動物における異種遺伝子の組織−特異的発現を方向づけるために使用され得る。5’側フランキング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第5,641,670号に開示されるように、“遺伝子活性化”によるzdint5タンパク質の生成を促進する。
【0076】
手短に言及すれば、細胞における内因性zalpha11リガンド遺伝子の発現が、zdint5遺伝子中に、少なくとも1つの標的化配列、調節配列、エキソン、及びスプライスドナー部位を含んで成るDNA構造体を導入することによって変更される。前記標的化配列は、内因性zdint5遺伝子座による前記構造体の相同組換えを可能にし、それにより、前記構造体内の配列が内因性zdint5コード配列と操作可能的に連結されるようになる、zdint5 5’非コード配列である。この場合、内因性zdint5プロモーターが、増強された組織−特異的又は他方では、調節された発現を提供するために、他の調節配列により置換され得るか又はそれにより補充され得る。
【0077】
本発明のポリヌクレオチドはまた、DNA合成機を用いても合成され得る。現在、選択の方法は、ホスホラミジット方法である。化学的に合成された二本鎖DNAが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のために必要とされる場合、個々の相補的鎖が別々に製造される。短い遺伝子(60〜80bp)の生成は技術的に直接的であり、そして相補的鎖の合成及び続いて、それらのアニーリングにより達成され得る。しかしながら、より長い遺伝子(300bp以上)の生成に関しては、化学的にDNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100%ではないので、特定の方法が所望される。
【0078】
この問題を克服するためには、合成遺伝子(二本鎖)が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントから調整形でアセンブルされる。遺伝子合成方法は、当業界において良く知られている。たとえば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura など., Annu.Rev. Biochem. 53: 323−56, 1984及びClimie など., Proc. Natl. Acad. Sa. USA 87: 633−7, 1990を参照のこと。
【0079】
本発明はさらに、他の種(オルト体)からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのzdint5ポリペプチドである。ヒトzdint5ポリペプチドのオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、cDNAは、zdint5を発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化され得る。
【0080】
そのような組織は、例えば、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞を包含する。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のmRNAから調製される。次に、zdint5ポリペプチドコードのcDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトcDNAにより、又は前記開示される配列に基づく1又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。
【0081】
cDNAはまた、本明細書に開示される代表的なヒトzdint5ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)(Mullis, アメリカ特許第4,683,202号)を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、cDNAライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDNAの発現がzdint5ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム クローンの単離に適用され得る。
【0082】
当業者は、配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12に開示される配列がヒトzdint5の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号1、3、4、6、7、9、10及び12に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号2、5、8及び11の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【0083】
zdint5ポリペプチドの性質を保持する、もう1つのスプライスされたmRNAから生成されるcDNAは、そのようなcDNA及びmRNAによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【0084】
本発明はまた、配列番号2、5、8及び11ポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実質的に同一である単離されたzdint5ポリペプチドも提供する。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号2、5、8及び11又はそのオルト体に対して、少なくとも 90%、及び最も好ましくは95%又はそれ以上同一であろう。%配列同一性は、従来の方法により決定される。
【0085】
例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、2種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、1のギャップ拡張ペナルティー、及び表3(アミノ酸は標準の1文字コードにより示される)に示されるようなHenikoff and Henikoff (前記)の“blosum 62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、%同一性が次のようにして計算される:
【0086】
【数1】
【0087】
【表3】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
【0088】
当業者は、2種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体zdint5のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載される。
【0089】
手短には、FASTAがまず、問題の配列(例えば、配列番号2、5、8及び11)及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性(ktup変数が1である場合)又は対の同一性(ktup=2である場合)のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【0090】
“カットオフ”値(配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算される)よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、2種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman−Wunsch アルゴリズム(Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974)の変法を用いて整列される。
【0091】
FASTA 分析のための例示的なパラメーターは次のものである:ktup=1、ギャップ開始ペナルティー=10、ギャップ拡張ペナルティー=1及び置換マトリックス=BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, 1990 (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラム中に導入され得る。
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、1〜6、好ましくは4〜6であり得る。
【0092】
本発明は、配列番号2、5、8及び11のアミノ酸配列に比較して、1又は複数の保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。BLOSUM62表は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである[Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ]。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。
【0093】
本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−1よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が0,1,2又は3のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。保存性アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、1,2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも2(例えば、2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【0094】
zdint5 遺伝子における保存性アミノ酸置換は、配列番号1, 3, 4, 6, 7, 9, 10及び12に列挙されるヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発、リンカー−走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いて突然変異誘発により得れる(Ausubel (1995), p. 8−10〜8−22; 及びMcPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL. Press 1991))。細胞−細胞相互作用を促進するそのような変異体の能力は、標準方法、例えば本明細書に記載されるアッセイを用いて決定され得る。他方では、変異体zdint5ポリペプチドは、抗−zdint5抗体を特異的に結合する能力により同定され得る。
【0095】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る(Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991)。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
【0096】
ディスインテグリン−インテグリン、プロテアーゼ、又は細胞外マトリックス相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定され得る。例えば、de Vos など.,Science 255: 306−312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899−904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59−64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連するメタロプロテアーゼ/ディスインテグリン/トロンボスポンジン−1様分子による相同体の分析からも推定され得る。
【0097】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer (science 241: 53−57, 1988)又はBowie and Sauer( Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 )により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示(例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92/06204号)、及び領域−指図された突然変異誘発(Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 )を包含する。
【0098】
開示されるzdint5 DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 370 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1994及びWIPO公開WI97/20078により開示されるように、DNA シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNAが、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親DNAのランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。
【0099】
この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親DNAのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はDNAを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【0100】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチド(例えば、プロテアーゼ活性、又は脈管形成阻害)をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【0101】
変異体zdint5遺伝子の特定のヌクレオチド配列にかかわらず、前記遺伝子は、プロテアーゼ活性、又は脈管形成阻害により、又は抗−zdint5抗体に対して特異的に結合する能力により特徴づけられるポリペプチドをコードする。より特定には、変異体zdint5遺伝子は、本明細書に記載されるヒトzdint5遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の少なくとも50%、及び好ましくは70%、80%又は90%以上を示すポリペプチドをコードする。
【0102】
変異体zdint5ポリペプチド及び実質的に相同のzdint5ポリペプチドは、1又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換;小さな欠失、典型的には1〜約30個のアミノ酸の欠失;及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【0103】
従って、本発明は、配列番号2、5、8又は11のその対応する領域に対して、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、及びより好ましくは95%又はそれ以上の同一性を有する配列を含んでなる、18〜2000個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、zdint5ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Xa因子分解部位を含む。
【0104】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのzdint5ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表1及び2に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を用意に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のzdint5変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号1, 2, 3,4,5,6,7,8,9, 10, 11及び14の少なくとも1つの配列を提供するデータ構造体によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【0105】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライイブ、ランダムアクセス記憶(RAM)チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ(DLT)、ディスクカーシ及びZIPディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク(例えば、CD−読み取りのみ記憶(ROM)、CD−再書き込みできる(RW)及びCD−再記録できる)、及びデジタル可転性/ビデオディスク(DVD)(例えば、DVD−ROM, DVD−RAM及びDVD+RW)により例示される。
【0106】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド、及び1又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えばTSP1−様ポリペプチドドメインのメタロプロテアーゼは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示されるように、ニ量体化タンパク質に融合体として調製され得る。
【0107】
これに関する好ましいニ量体化タンパク質は、他のディスインテグリンポリペプチドドメイン、TSP1−様ドメイン、ディスインテグリンポロペプチドドメインフラグメント、又はタンパク質のディスインテグリンプロテアーゼファミリーの他のメンバー、例えばMDCs, SBMPs, METHs及びADAMsのメンバーを含んで成るポリペプチドを包含する。それらのディスインテグリンポリペプチドドメイン融合体、ディスインテグリンポリペプチドドメインフラグメント融合体、又は他のディスインテグリンプロテアーゼとの融合体は、種々のマルチマーディスインテグリン−様類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。
【0108】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又はすべてが、本発明のzdint5と、もう1つのファミリーメンバー、例えばADAM、MDC、SVMP、ADAM−TS及びMETHからのその機能的に同等のドメインとの間で交換され得る。
【0109】
そのようなドメインは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない:保存されたモチーフ、例えば分泌シグナル配列、プロペプチド、プロテアーゼ、ディスインテグリン及びディスインテグリンループドメイン、例えば“RGD−様及びシグナル化ドメイン。そのような融合タンパク質は、構成される融合体に依存して、本発明のポリペプチド又は他の既知のディスインテグリン−様ファミリータンパク質(例えば、ADAMs、MDCs、SVMPs、ADAM−TS及びMETH)と同じか又は類似する生物学的機能プロフィールを有することが予測される。さらに、そのような融合タンパク質は、本明細書に開示されるように、他の性質も示すことができる。
【0110】
さらに、当業界において記載される方法を用いて、ポリペプチド融合体又はハイブリッドzdint5タンパク質が、他のディスインテグリン及びディスインテグリン−様分子(例えば、ADAM、MDC、及びSVMP)、又は異種タンパク質と組合して、本発明のzdint5の領域又はドメインを用いて構成される(Sambrook など., 前記;Altschul など., 前記;Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511−5, 1994及びそれらにおける引例)。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける大きなドメイン又は領域の生物学的重要性の決定を可能にする。そのようなハイブリッドは、反応運動学、結合を変更し、基質特異性を抑制し、又は拡張し、又はポリペプチドの組織及び細胞局在性を変更し、そして未知の構造のポリペプチドに適用される。
【0111】
補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子(例えば、結腸、小腸、胎児肺、精巣及びB−細胞)に対してそれらを標的化するためにzdint5ポリペプチドに融合され得る。例えば、プロテアーゼポリペプチドドメイン、又はプロテアーゼポリペプチドフラグメント又はタンパク質が、標的細胞の表面上のインテグリンポリペプチド又はインテグリン−様ポリペプチドに特異的に結合するディスインテグリンポリペプチドドメイン又はフラグメントにzdint5ポリペプチドを融合せしめることによって、予定された細胞型に標的化され得る。そのようなディスインテグリン又はプロテアーゼポリペプチドドメイン又はフラグメントは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化−ディスインテグリンドメインに融合され得る。
【0112】
同様に、プロテアーゼポリペプチドドメイン、又はプロテアーゼポリペプチドフラグメント又はタンパク質は、細胞外マトリックスに特異的に結合するTSP1−様ポリペプチドドメイン又はフラグメントにそれを融合せしめることによって細胞外マトリックスに標的化され得る。この場合、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント及びタンパク質は、治療又は診断目的のために標的化され得る。ポリペプチド融合体はまた、特にドメイン間に、1又は複数の切断部位を含むことができる。Tuanなど., Connective Tissue Research 34: 1−9, 1996を参照のこと。
【0113】
本発明のポリペプチドは一般に約2,000以下のアミノ酸残基、好ましくは約1,700以下のアミノ酸残基、より好ましくは約1,500以下のアミノ酸残基を含有し、そして多くの場合においてかなり小さいであろう。例えば、zdint5ポリペプチドの残基を大腸菌(E. coli)β−ガラクトシダーゼ(1,021残基;Casadaban他、J. Bacteriol. 143:971−980、1980参照)、10残基のスペーサー、および4残基の因子Xa切断部位に融合することができる。第2例において、zdint5ポリペプチドの残基をマルトース結合性タンパク質(ほぼ370残基)、4残基の切断部位、および6残基のポリヒスチジンタグに融合することができる。
【0114】
宿主細胞からのzdint5ポリペプチドの輸出(export)を指令するために、分泌ペプチド、例えば、t−PA分泌ペプチドまたはzdint5分泌ペプチドをコードする第2DNAセグメントにzdint5DNAを結合する。分泌されたポリペプチドの精製を促進するために、C末端のエクステンション、例えば、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスP、Flagペプチド(Hopp他、Bio/Technology 6:1204−1210、1988;Eastman Kodak Co.、コネチカット州ニューヘブン、から入手可能である)、マルトース結合性タンパク質、または他の特定の結合因子が利用可能である、他のポリペプチドまたはタンパク質をzdint5ポリペプチドに融合することができる。
【0115】
本発明は、また、zdint5ポリペプチドの「機能的フラグメント」およびこのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。zdint5ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために、核酸分子の日常的欠失分析を実行することができる。例示として、配列番号1、3、4、6、7、9、10または12のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、1系列のネステッド欠失を得る。
【0116】
次いでフラグメントを発現ベクターの中に適切なリーディングフレームで挿入し、発現されたポリペプチドを単離し、プロテアーゼ活性、または血管形成阻害について、または抗zdint5抗体に結合する能力について試験する。エクソヌクレアーゼ消化に対する1つの別法は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して欠失または停止コドンを導入して、所望のフラグメントの産生を特定することである。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、zdint5遺伝子の特定のフラグメントを合成することができる。
【0117】
機能的ドメインを同定する標準的方法は当業者によく知られている。例えば、インターフェロンのいずれかまたは両方の末端におけるトランケーションについての研究は、HorisbergerおよびDi Marco、Pharmac. Ther. 66:507(1995)に要約されている。そのうえ、タンパク質の機能的分析の標準的技術は、例えば、下記の文献に記載されている:
【0118】
Treuter他、Mol. Gen. Genet. 240:113(1993)、Content他、″Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2−5A synthetase induced by human interferon″、Biological Interferon Systems,Proceedings of ISIR−TNO Meeting on Interferon Systems、Cantell(編者)、pp. 65−72(Nijihoff 1987)、Herschman、″The EGF Receptor″、Control of Animal Cell Proliferation、Vol. 1、Boynton他(編者)pp. 169−199(Academic Press 1985)、Coumailleau他、J. Biol. Chem. 270:29270(1995);Fukunaga他、J. Biol. Chem. 270:25291(1995);Yamaguchi他、Biochem. Pharmacol. 50:1295(1995)、およびMeisel他、Plant Molec. Biol. 30:1(1996)。
【0119】
本発明は、また、配列番号2、5、8および11のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸変化を有するzdint5遺伝子の機能的フラグメントを意図する。前述したように、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8および9のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することによって、構造に基づいて変異型zdint5遺伝子を同定することができる。構造に基づいて変異型遺伝子を同定する別のアプローチは、前述したように、潜在的変異型zdint5遺伝子をコードする核酸分子を配列番号1、2、4、6、7、9、10および12のヌクレオチド配列を有する核酸分子に加水分解できるかどうかを決定することである。
【0120】
当業者は前述の方法を使用して、配列番号2、5、8および11の種々のポリペプチドフラグメントまたは変異型、あるいは野生型zdint5タンパク質のメタロプロテアーゼ、TSP1様、および/またはジスインテグリン活性を保持する種々のポリペプチドフラグメントまたは変異型を同定および/または調製することができる。このようなポリペプチドは、例えば、細胞内シグナリングに関係するアミノ酸を包含する、分泌ドメイン、ポリペプチドドメイン、プロテアーゼドメイン、ジスインテグリンドメイン、TSP1様ドメイン、ジスインテグリンループ(天然または合成)、トランスメンブランおよび細胞内ドメインの部分またはすべて;融合ドメイン;アフィニティータグ;およびその他からの追加のアミノ酸を含むことができる。
【0121】
本発明は、また、本明細書に記載するzdint5ポリペプチドのエピトープを支持する部分を含んでなるポリペプチドフラグメントまたはペプチドを提供する。このようなフラグメントまたはペプチドは、免疫原として全体のタンパク質を使用するとき、抗体応答を誘発するタンパク質の部分である、「免疫原性エピトープ」を含んでなることができる。免疫原性エピトープを支持するペプチドは標準的方法により同定することができる(例えば、下記の文献を参照のこと:Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998(1983))。
【0122】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは、抗体がそれに対して特異的に結合することができるタンパク質の領域である、「抗原エピトープ」を含んでなることができる。ある種のエピトープは、アミノ酸の線状または隣接ストレッチから成り、そしてこのようなエピトープの抗原性は変性因子により崩壊されない。
【0123】
タンパク質のエピトープを模擬することができる、比較的短い合成ペプチドを使用して、そのタンパク質に対する抗体の産生を刺激することができることはこの分野において知られている(例えば、下記の文献を参照のこと:Sutcliffe他、Science 219:660(1983))。したがって、本発明の抗原エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するポリペプチドに結合する抗体を発生させるために有効である。抗原エピトープを支持するペプチドは、例えば、配列番号11の残基727〜732、配列番号11の残基99〜104、配列番号11の残基726〜731、および配列番号11の残基127〜132を含む。
【0124】
抗原エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、配列番号2、5、8および11の少なくとも4〜10アミノ酸、好ましくは少なくとも10〜15アミノ酸、より好ましくは15〜30アミノ酸を含有する。このようなエピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、前述したように、zdint5ポリペプチドをフラグメント化するか、あるいは化学的にペプチドを合成することによって製造することができる。そのうえ、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイにより、エピトープを選択することができる(例えば、下記の文献を参照のこと:LaneおよびStephen、Curr. Opin. Immunol. 5:268(1993)およびCortese他、Cur. Opin. Biotechnol. 7:616(1996))。
【0125】
エピトープを同定しそしてエピトープを含んでなる小さいペプチドから抗体を産生する標準的方法は、例えば、下記の文献に記載されている:Mole、″Epitope Mapping″、Methods in Molecular Biology、Vol. 10、Manson(編者)、pp. 105−116(The Humana Press,Inc.、1992)、Price、″Production and Characterization of Synthetic Peptide−Derived Antibodies″、Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application、RitterおよびLadyman(編者)、pp. 60−84(Cambridge University Press、1995)、Current Protocols in Imunology、pp. 9.3.1−9.3.5およびpp. 9.4.1−9.4.11(John Wiley & Sons、1997)。
【0126】
例示として、zdint5中の潜在的抗原部位(配列番号2、5、8および11)は、LASERGENEのPROTEANプログラム(バージョン3.14)(DNASTAR;ウイスコンシン州マディソン)により実行される、Jameson−Wolf法、Jameson−Wolf、CABIOS 4:181(1988)に従い同定された。この解析においてデフォルトパラメーターを使用した。
【0127】
zdint5の適当な抗原は下記のものを包含する:配列番号2中に示すアミノ酸残基23〜29;配列番号2中に示す残基40〜49;配列番号2中に示す残基62〜70;配列番号2中に示す残基87〜98;配列番号2中に示す残基108〜120;配列番号2中に示す残基137〜144;配列番号2中に示す残基157〜172;配列番号2中に示す残基177〜183;配列番号2中に示す残基190〜197;配列番号2中に示す残基23〜49;配列番号2中に示す残基40〜70;配列番号2中に示す残基62〜98;配列番号2中に示す残基87〜120;配列番号2中に示す残基108〜144;配列番号2中に示す残基137〜172;配列番号2中に示す残基157〜183;
【0128】
配列番号2中に示す残基177〜197;配列番号5中に示す残基3〜24;配列番号5中に示す残基39〜45;配列番号5中に示す残基3〜45;配列番号8中に示す残基11〜18;配列番号8中に示す残基26〜37;配列番号8中に示す残基39〜59;配列番号8中に示す残基11〜37;配列番号8中に示す残基26〜59;配列番号11中に示す残基12〜20;配列番号11中に示す残基31〜42;配列番号11中に示す残基60〜67;配列番号11中に示す残基81〜108;配列番号11中に示す残基126〜132;配列番号11中に示す残基143〜152;配列番号11中に示す残基165〜173;配列番号11中に示す残基190〜203;
【0129】
配列番号11中に示す残基211〜223;配列番号11中に示す残基240〜247;配列番号11中に示す残基260〜275;配列番号11中に示す残基280〜287;配列番号11中に示す残基293〜300;配列番号11中に示す残基310〜327;配列番号11中に示す残基351〜359;配列番号11中に示す残基366〜375;配列番号11中に示す残基381〜419;配列番号11中に示す残基434〜463;配列番号11中に示す残基456〜463;配列番号11中に示す残基469〜499;配列番号11中に示す残基505〜527;配列番号11中に示す残基529〜551;配列番号11中に示す残基591〜598;配列番号11中に示す残基601〜621;
【0130】
配列番号11中に示す残基633〜639;配列番号11中に示す残基641〜657;配列番号11中に示す残基671〜690;配列番号11中に示す残基709〜715;配列番号11中に示す残基724〜735;配列番号11中に示す残基738〜761;配列番号11中に示す残基775〜781;配列番号11中に示す残基785〜793;配列番号11中に示す残基12〜42;配列番号2中に示す残基31〜67;配列番号2中に示す残基60〜108;配列番号2中に示す残基81〜132;配列番号2中に示す残基126〜152;配列番号2中に示す残基143〜173;配列番号2中に示す残基165〜203;配列番号2中に示す残基190〜223;
【0131】
配列番号2中に示す残基211〜247;配列番号2中に示す残基240〜275;配列番号2中に示す残基260〜287;配列番号2中に示す残基280〜300;配列番号2中に示す残基293〜327;配列番号2中に示す残基310〜359;配列番号2中に示す残基351〜375;配列番号2中に示す残基366〜419;配列番号2中に示す残基381〜463;配列番号2中に示す残基456〜527;配列番号2中に示す残基505〜551;配列番号2中に示す残基529〜621;配列番号2中に示す残基601〜639;配列番号2中に示す残基633〜657;配列番号2中に示す残基641〜690;配列番号2中に示す残基671〜715;配列番号2中に示す残基709〜735;配列番号2中に示す残基724〜761;配列番号2中に示す残基738〜781;配列番号2中に示す残基775〜793は抗原ペプチドである。
【0132】
また、zdint5のエピトープ、ペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するために、zdint5ポリペプチドを使用することができる。zdint5ポリペプチドまたはそのフラグメントは、動物に接種し、免疫応答を誘発するための抗原(免疫原)として働く。当業者は認識するように、抗原エピトープを支持するペプチドは、zdint5ポリペプチド(例えば、配列番号2、5、8および11)の少なくとも6、好ましくは少なくとも9、より好ましくは少なくとも15〜約30の隣接アミノ酸残基の配列を含有する。
【0133】
zdint5ポリペプチドのより大きい部分、すなわち、30〜10残基からアミノ酸配列の全長までを含んでなるポリペプチドが包含される。抗原または免疫原性エピトープは、また、本明細書において記載するように、結合したタグ、アジュバントおよび担体を含むことができる。適当な抗原は、配列番号2、5、8および11のアミノ酸番号1〜アミノ酸番号1120またはそれらの隣接9〜1170アミノ酸フラグメントによりコードされるzdint5ポリペプチドを包含する。抗原として使用するために好ましいペプチドは、親水性ペプチド、例えば、疎水性プロットから当業者が予測するペプチドである。
【0134】
zdint5親水性ペプチドは、下記のものから成る群から選択されるアミノ酸置換を含んでなるペプチドを包含する:配列番号2のアミノ酸残基20〜32;配列番号2の残基64〜69;配列番号2の残基86〜98;配列番号2の残基110〜121;配列番号2の残基154〜171;配列番号2の残基190〜199;配列番号2の残基20〜69;配列番号2の残基64〜98;配列番号2の残基86〜121;配列番号2の残基110〜171;配列番号2の残基154〜199;配列番号5の残基1〜13;配列番号5の残基15〜31;配列番号5の残基1〜31;配列番号8の残基25〜36;配列番号8の残基41〜54;配列番号8の残基25〜54;配列番号8の残基13〜19;配列番号11の残基30〜40;配列番号11の残基60〜66;
【0135】
配列番号11の残基85〜107;配列番号11の残基123〜135;配列番号11の残基167〜172;配列番号11の残基189〜201;配列番号11の残基213〜225;配列番号11の残基257〜274;配列番号11の残基293〜302;配列番号11の残基309〜327;配列番号11の残基334〜342;配列番号11の残基348〜358;配列番号11の残基366〜374;配列番号11の残基386〜408;配列番号11の残基410〜425;配列番号11の残基472〜499;配列番号11の残基509〜525;配列番号11の残基527〜551;配列番号11の残基591〜619;配列番号11の残基621〜626;配列番号11の残基635〜649;配列番号11の残基682〜690;配列番号11の残基695〜702;
【0136】
配列番号11の残基723〜734;配列番号11の残基739〜752;配列番号11の残基755〜763;配列番号11の残基786〜793。さらに、折りたたまれたタンパク質の表面上に存在すると思われる、ポリペプチドの部分に対する抗原を発生させることができる。これらの抗原は下記のものを包含する:配列番号2のアミノ酸残基22〜31;配列番号2の残基87〜97;配列番号2の残基113〜118;配列番号8の残基26〜32;配列番号8の残基44〜50;配列番号11の残基31〜39;配列番号11の残基86〜104;配列番号11の残基125〜134;配列番号11の残基190〜200;配列番号11の残基216〜221;配列番号11の残基492〜498;
【0137】
配列番号11の残基516〜522;配列番号11の残基546〜551;配列番号11の残基593〜598;配列番号11の残基724〜730;配列番号11の残基742〜748;配列番号11の残基787〜793;配列番号11の残基13〜40;配列番号11の残基30〜66;配列番号11の残基60〜107;配列番号11の残基85〜135;配列番号11の残基123〜172;配列番号11の残基167〜201;配列番号11の残基189〜225;配列番号11の残基213〜274;配列番号11の残基257〜302;配列番号11の残基293〜327;配列番号11の残基309〜342;配列番号11の残基334〜358;配列番号11の残基248〜376;配列番号11の残基366〜408;配列番号11の残基386〜425;配列番号11の残基410〜499;
【0138】
配列番号11の残基472〜525;配列番号11の残基509〜551;配列番号11の残基527〜619;配列番号11の残基621〜649;配列番号11の残基635〜690;配列番号11の残基682〜702;配列番号11の残基695〜734;配列番号11の残基723〜752;配列番号11の残基739〜763;および配列番号11の残基755〜793。これらの抗原を動物に接種することによって発生した免疫応答からの抗体を、本明細書において記載するように、単離し、精製することができる。
【0139】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造し、単離する方法はこの分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと:Current Protocols in Imunology、Cooligan他(編者)、National Institutes of Health、John Wiley & Sons,Inc.1995;Sambrook他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、NY、1989;およびHurrell、J. G. R.編、Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications、CRC Press,Inc.、Boca Raton、FL、1982。
【0140】
当業者にとって明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットにzdint5ポリペプチドまたはそのフラグメントを接種することによって、ポリクローナル抗体を発生させることができる。アジュバント、例えば、明礬(水酸化アルミニウム)またはフロインド完全アジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用することによって、zdint5ポリペプチドの免疫原性を増加させることができる。
【0141】
免疫化に有効なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例えば、zdint5またはその部分と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチドは全長の分子またはその部分であることができる。ポリペプチドの部分が「ハプテン様」である場合、このような部分は免疫化のために高分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイド)好都合に接合または結合することができる。
【0142】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性フラグメント、例えば、F(ab’)2およびFabタンパク質分解的フラグメントを包含する。遺伝子操作された無傷抗体またはフラグメント、例えば、キメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよびポリペプチドをまた包含される。
【0143】
非ヒトCDRをヒトフレームワークおよび定常領域上にグラフトするか、あるいは全体の非ヒト可変ドメインを組込む(必要に応じて暴露された残基の置換によりそれらをヒト様表面で「クローキング」する、ここで結果は「ベニヤ化抗体」である)ことによって、非ヒト抗体をヒト化することができる。ある場合において、ヒト化抗体は可変領域フレームワーク内の非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期を増加させることができ、そして投与時の悪い免疫反応の可能性を減少させる。
【0144】
ここにおいて有効な抗体を発生させまたは選択する別の技術は、zdint5タンパク質またはタンパク質に対するリンパ球のin vitro暴露、およびファージまたは同様なベクター中の抗体ディスプレイライブラリーを包含する(例えば、固定化または標識化されたzdint5タンパク質またはペプチドを使用する)。ファージ上にまたは細菌、例えば、大腸菌(E. coli)上にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって、潜在的zdint5ポリペプチド結合性ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。
【0145】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダム突然変異誘発およびランダムペプチド合成により得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを使用して、既知のターゲットと相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。既知のターゲットは、タンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学的または合成高分子、または有機または無機の物質であることができる。
【0146】
このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーをつくり、スクリーニングする技術はこの分野において知られおり(Ladner他、米国特許第5,223,409号;Ladner他、米国特許第4,946,778号;Ladner他、米国特許第5,403,484号およびLadner他、米国特許第5,571,698号)そしてランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、CLONTECH Laboratories,Inc.(カリフォルニア州パロアルト)、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)、New England Biolabs,Inc.(マサチュセッツ州ベバーリイ)およびPharmacia LKB Biotechnology,Inc.(ニュージャージイ州ピスカタウェイ)から商業的に入手可能である。
【0147】
本明細書に開示するzdint5を使用してランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、zdint5に結合するタンパク質を同定することができる。zdint5ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合性タンパク質」は、細胞をタグ化するために;アフィニティー精製によりホモローグポリペプチドを単離するために使用することができる;それらを薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に直接的または間接的に結合させることができる。また、これらの結合性タンパク質は分析法、例えば、発現ライブラリーをスクリーニングする方法および活性を中和する方法において使用することができる。
【0148】
結合性タンパク質は、また、ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイ;根元的病理または疾患のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出または定量する診断アッセイにおいて使用することができる。また、これらの結合性タンパク質は、in vitroおよびin vivoにおけるzdint5の結合およびシグナルトランスダクションをブロックするzdint5「アンタゴニスト」として作用することができる。これらの抗zdint5結合性タンパク質は、一般に、例えば、プロテアーゼ活性、または血管形成阻害をモジュレートするために使用されるであろう。
【0149】
抗体が対照(非zdint5)ポリペプチドに対する結合アフィニティーよりも少なくとも10倍大きい結合活性(zdint5ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに対する)の限界レベルを示す場合、抗体は特異的に結合性であると決定される。抗体の結合アフィニティーは、当業者により、例えば、スキャッチャード分析(Scatchard、G.、Ann. NY Acad. Sci. 51:660−672、1949)により、容易に測定することができる。
【0150】
zdint5タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために、当業者に知られている種々のアッセイを利用することができる。典型的なアッセイは下記の文献に詳細に記載されている:Antibodies:A Laboratory Manual、HarlowおよびLane(編者)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988。このようなアッセイの代表例は下記のものを包含する:並流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。さらに、野生型vs突然変異体zdint5タンパク質またはポリペプチドに対する結合について、抗体をスクリーニングすることができる。
【0151】
zdint5を発現する細胞をタグ化するために;アフィニティー精製によりzdint5を単離するために;zdint5ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイのために;根元的病理または疾患のマーカーとして可溶性zdint5を検出または定量するために;FACSを使用する分析法において;発現ライブラリーをスクリーニングするために;抗イディオタイプ抗体を発生させるために;そして中和性抗体としてまたはin vitroおよびin vivoにおいてzdint5をブロックするアンタゴニストとして;zdint5に対する抗体を使用することができる。
【0152】
適当な直接的タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する;ここにおける抗体は、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの接合体をin vivo診断または療法的用途に使用することができる。そのうえ、アッセイ、例えば、ウェスタンブロットまたはこの分野において知られている他のアッセイにおいて、変性されたzdint5またはそのフラグメントを検出するために、zdint5に対する抗体またはそのフラグメントをin vitroにおいて使用することができる。
【0153】
ここにおける抗体またはポリペプチドは、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの接合体をin vivo診断または療法的用途に使用することができる。例えば、対応する抗相補的分子(例えば、それぞれ、インテグリンまたは抗原)を発現する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができる。さらに詳しくは、zdint5ポリペプチドまたは抗zdint5抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリングし、抗相補的分子を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【0154】
適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこれらの分子は放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する。適当な細胞障害性分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこれらの分子は細菌または植物トキシン(例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス(Pseudomonas)エキソトキシン、リシン、アブリンおよびその他)、ならびに療法上の放射性核種、例えば、ヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90を包含する(ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合させるか、あるいは例えば、キレート化部分を通して間接的に結合させる)。
【0155】
また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシンに複合化することができる。検出可能なまたは細胞障害性分子を間接的に結合させるために、検出可能なまたは細胞障害性分子を相補的/抗相補的対の1メンバーと複合化することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体部分に結合させる。これらの目的のために、ビオチン/ストレプトアビジンは典型的な相補的/抗相補的対である。
【0156】
別実施態様では、ポリペプチド−毒素融合蛋白質又は抗体−毒素融合蛋白質は標的細胞又は組織を阻害し、又は除去するために使用することができる(例えば癌細胞又は組織の治療に)。あるいは、TSP1−様ドメインのみを含む融合蛋白質は、検出可能分子、細胞傷害性分子又は相補性分子を所望する型の細胞又は組織(即ち細胞外マトリックス)に方向付けるのに好適であろう。同様に、zdint5に対応する結合相手には検出可能又は細胞傷害性分子を結合させることができ、一般的な相補的−検出可能/細胞傷害性分子標識体に関する細胞/組織特異的運搬に適した一般的な標的ビークルを提供できる。
【0157】
別実施態様では、zdint5ポリペプチド又は抗zdint5抗体が以下器官由来の高増殖性組織を標的にするのであれば、zdint5−サイトカイン融合蛋白質又は抗体−サイトカイン融合蛋白質はインビボでの標的組織(例えば結腸、小腸、胎児肺、清掃及びB−細胞)殺滅の促進に使用できる。(一般的にHornickら、Blood 89:4437−47,1997参照)。
【0158】
かれらは作用が望まれる部位をサイトカインの標的とすることができ、それによりサイトカインの局所的濃度を高めることができる融合蛋白質を既述している。好適zdint5ポリペプチド又は抗−zdint5抗体は望ましくない細胞又は組織(即ち腫瘍又は白血病)を標的とし、融合サイトカインはエフェクター細胞による高められた標的細胞融解を伝達する。本目的に好適なサイトカインには、例えばインターロイキン2及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)が含まれる。
【0159】
ここに記載の生物活性型ポリペプチド又は抗体標識体は静脈内、動脈内又は腺管内に供給でき、あるいは作用を意図する部位に局所的に導入されるだろう。本発明のzdint5ポリペプチドは、完全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片及び融合ポリペプチドを含め、通常の技術に従い遺伝子工学宿主細胞にて産生することができる。好適宿主細胞は外来性DNAによって形質転換できる、又はトランスフェクションでき、培養により増殖可能なタイプの細胞であり、細菌、真菌細胞及び培養高等真核細胞を含む。
【0160】
真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化DNA分子を操作し、外来性DNAを各種宿主細胞内に導入するための技術はSambrookら、分子クローニング:ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989,及びAusubelら、分子生物学の最新手法(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987。
【0161】
一般にzdint5ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内にて発現に必要なその他遺伝的要素と動作可能に結合しており、一般には転写プロモーター及びターミネーターを含んでいる。更に当業者はあるシステム内では選択可能マーカーが別々のベクターに備えられても良く、そして外来性DNAの複製が宿主細胞ゲノム内への組み込みにより提供されることを認識するが、一般にはベクターは1又はそれ以上の選択可能なマーカー及び1又はそれ以上の複製介し起点を含んでいる。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクター及びその他要素の選択は、当分野通常技術水準内にある一般的事項である。多くのこの様な要素は文献に記載されており、商業的供給会社より入手できる。
【0162】
zdint5ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られている)が発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列はzdint5の分泌シグナル配列でよく、又はその他分泌型蛋白質(例えばt−PA)由来、又は新たに合成されたものでも良いだろう。分泌シグナル配列はzdint5DNA配列に動作可能に結合され、即ち2配列は正確な読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞分泌経路内に導かれる様に配置される。分泌シグナル配列は一般に対象ポリペプチドをコードするDNA配列の5’側に位置するが、一部分泌シグナル配列は対象DNA配列内の別の部位に位置するだろう(Wlechら、米国特許第5,037,743号;Hollandら、米国特許第5,143,830号参照)。
【0163】
本発明のポリペプチドの未変性分泌シグナル配列は、その他ポリペプチドを分泌経路へ導くのに使用される。本発明はこの様な融合ポリペプチドを提供する。当業者既知でありここに開示されている方法を用いることで、zdint5ポリペプチド由来分泌シグナル配列が他ポリペプチドに動作可能に結合されているシグナル融合ポリペプチドが作ることができる。本発明の融合ポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は追加ペプチドとアミノ末端側に好ましく融合し、追加ペプチドを分泌経路に導く。例えばこれら新規分泌シグナル配列融合構築体は、受容体の様な一般に非分泌型である蛋白質の活性成分を分泌させることができる。この様な融合体はペプチドを分泌経路させるためにインビボ又はインビトロにて使用できるだろう。
【0164】
あるいは、zdint5のプロテアーゼドメインは異なるプロテアーゼドメインを提供する異種配列により置換することができる。この場合、融合産物は分泌でき、xdint5のTSP1−様ドメインは置換型プロテアーゼドメインを上記特異的組織に誘導できる。この置換型プロテアーゼドメインDAMs/MDCs/SVMPs/ADAM−TS/METH様ファミリー構成体により置き換えられたプロテアーゼドメイン、又はその他既知プロテアーゼ由来のドメインから選択できる。
【0165】
同様にzdint5蛋白質のTSP1−様ドメインは異なるTSP1−様ドメインを提供する異種配列により置換できる。この場合も、融合蛋白質は分泌でき、置換型TSP1−様ドメインはzdint5のプロテアーゼドメインを特定組織に誘導できる。置換型TSP1−様ドメインはADAMs/MDCs/SVMPs/METH−様ファミリー構成体のTSP1−様ドメインから選択できる。これら例では融合産物は、可溶性又は膜固定型蛋白質だろう。
【0166】
培養哺乳動物細胞は本発明の好適宿主である。哺乳動物宿主細胞に外来性DNAを導入する方法には、リン酸カルシウム伝達トランスフェクション法(Wiglerら、Cell 14: 725, 1978; CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981:GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション法(Neumannら、EMBO J, 1:841−5, 1982)、DEAE−デキストラン伝達トランスフェクション法(Ausubelら、上記)、及びリポソーム伝達トランスフェクション法(Hawley−Nelsonら、Focus 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993,及びウイルスベクター(MillerとRosman、BioTechniques 7:980−90, 1989; WangとFiner, Nature Med. 2: 714−6, 1996)。
【0167】
培養哺乳動物細胞での組換え体ポリペプチドの産生は例えばLevinsonら、米国特許第3,713,339号;Hagenら、米国特許第4,784,950号;Palmiterら、米国特許第4,579,821号;及びRingold、米国特許第4,656,134号により開示されている。好適培養哺乳動物細胞にはCOS−1(ATCC番号CRL1650)、COS−7(ATCC番号CRL1651)、BHK(ATCC番号CRL1632)、BHK570(ATCC番号CRL10314)、293(ATCC番号CRL1573;Grahamら、J. Gen. Virol.36:59−72, 1977)及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株(例えばCHO−K1;ATCC番号CCL61)が含まれる。
【0168】
その他好適細胞株が当分野既知であり、米国基準株コレクション(Manasas、VA)の様な好適寄託機構より入手できる。一般にSV−40又はサイトメガロウイルス由来プロモーターの様な強力な転写プロモーターが好ましい。例えば米国特許第4,956,288号を見よ。その他好適プロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来のもの(米国特許第4,579,821号及び第4,601,978号)及びアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。
【0169】
一般には薬物選別が使用され、外来DNAが挿入された培養哺乳動物細胞が選択される。この様な細胞は一般には“トランスフェクタント”と称される。選択薬剤存在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝えることができる細胞は“安定型トランスフェクタント”と呼ばれる。好ましい選別マーカーは抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選別はG−418等のネオマイシン型薬剤存在下に実施される。選別システムは“増幅”と呼ばれる工程である、所望遺伝子の発現レベルの向上にも利用できる。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選別薬剤存在下に培養し、続いて選別薬剤量を増加して高レベルの導入遺伝子産生を行う細胞を選別し、実施される。
【0170】
好適な増幅化能選別マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素であり、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬剤耐性遺伝子(例えば非グロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)も利用できる。緑色蛍光蛋白質、又はCD4、CD8、クラスIMHCの様な細胞表面蛋白質、胎盤アルカリフォスファターゼの様なその他表現形を導入するその他マーカーは、FACSソーティング又は磁性ビーズ分離技術の様な手法による、非トランスフェクト細胞からのトランスフェクト細胞の選別に使用できるだろう。
【0171】
植物細胞、昆虫細胞及び鳥類細胞を含むその他高等真核生物細胞も宿主として利用できる。植物右細胞内の遺伝子発現に関するベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)の使用はSinkarら、J. Biosci. (Bangalore)11:47−58, 1987にレビューされている。昆虫細胞の形質転換及びその中での外来ポリペプチドの産生はGuarinoら、米国特許第5,162,222号及びWIPO公開WO94/06463号に開示されている。
【0172】
昆虫細胞は一般にはオートグラファ・カリホルニカ(Autographa californica)nuclear polyhedrisus virus(AcNPV) 由来の組換え体バキュロウイルスで感染できる。King, L.A及びPossee, R.D.,バキュロウイルス発現系、ラボラトリーガイド(The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide), London, Chapman & Hall; O’Reilly, D.R.ら、バキュロウイルス発現ベクター;ラボラトリーマニュアル(Baculovirus Expression Vectors; A Laboratory Manual ), New York, Oxford University Press., 1994; 及びRichardson, C. D., 編、バキュロウイルス発現プロトコール、分子生物学に於ける方法(Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology), Totowa, NJ, Humana Press, 1995参照。
【0173】
組換え体zdint5バキュロウイルスを作製する第2の方法は、Luckow(Luckow、V.A,ら、J. Virol 67:4566−79, 1993)報告のトランスポゾンをベースとした系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系は、Bac−to−BacTMキット(Life Technologies, Rockville, MD)として市販されている。この系はトランスファーベクターであるTn7トランスポゾンを含むpFastBac1TM(Life Technologies)を使用し、zdint5ポリペプチドをコードするDNAを”Bacmid”と呼ばれる大型プラスミドとしてE.coli内に維持されたバキュロウイルスゲノム内に移動させる。pFastBac1TMトランスファーベクターはAcNPVポリヘドリンプロモーターを利用し所望遺伝子、本例ではzdint5の発現を誘導する。
【0174】
ポリヘドリンプロモーターは除去しバキュロウイルス感染初期に発現し、分泌蛋白質の発現に有利であることが示されているバキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーター(Pcor、p6.9又はMPプロモーターとしても知られる)で置換することができる。Hill−Perkins, M.S及びPossee, R.D., J. Gen. Virol, 71:971−6, 1990; Bonning, B.C.ら、J. Gen.Virol. 75: 1551−6, 1994;及びChazenbalk, G. D.,及びRapoport, B., J. Biol. Chem 270: 1543−9, 1995参照。これらトランスファーベクターでは、短形及び長形の塩基性蛋白質プロモーターが使用できる。
【0175】
更に、未変性zdint5分泌シグナル配列を昆虫蛋白質由来の分泌シグナル配列に置換したトランスファーベクターを構築できる。例えば、エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen、Carlsbad、CA)、又はバキュロウイスルgp67(PharMingen、San Diego, CA)由来の分泌シグナル配列を構築体内に利用し、未変性zdint5分泌シグナル配列を置換することができる。更に、トランスファーベクターは発現されたzdint5ポリペプチドのC−又はN−末端にエピトープタグ、例えばGlu−Gluエピトープタグ(Grussenmeyer,T.ら、Proc、Natl. Acad. Sci.82: 7952−4, 1985)をコードするDNAを持つ読みとり枠内融合体を含むことができる。
【0176】
当分野既知の技術を利用し、zdint5を含むトランスファーベクターはE.coli内に形質導入され、組換え体バキュロウイルスを示す中断型lacZ遺伝子を含むbacmidsに関しスクリーニングされる。組換え体バキュロウイルスゲノムを含むbacmidDNAは通常技術により単離され、例えばSf9細胞の様なスポドペトラ・フルギペルダ(Spodopetra frugiperda)細胞のトランスフェクトに利用される。引き続きzdint5を発現する組換え体ウイルスが産生される。組換え体ウイルス保存体は、当分野に通常使用さえる方法にて作成される。
【0177】
組換え体ウイルスは宿主細胞、典型的にはアワヨトウムシであるスポドフテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)由来細胞株の感染に使用される。一般的にはGlickとPasternak、分子バイオテクノロジー:組換え体DNAの原理と応用(Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA), ASM Press, Washington, DC., 1994参照。その他好適細胞株はトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)(米国特許第5,300,435号)由来のHigh FiveOTM細胞株(Invitrogen) である。市販の無血清培地を使用し細胞を増殖、維持する。
【0178】
好適培地はSf9細胞に関してはSf900ITTM(Life Technologies)又はESF921TM(Expression Systems)である;そしてT.ni細胞に関してはEx−cellO0405TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS)又はExpress FiveOTM(Life Technologies)である。細胞は培養密度約2−5×103細胞ないし密度1−2×106細胞まで増殖させ、その時点で組換え体ウイルス保存体を多重感染度(MOI)0.1ないし10、より一般的には約3で加える。使用方法は市販の研究用マニュアルに一般的に記載されている(King,L.A及びPossee, R.D.,上記;O’Reilly, D.Rら、上記;Richardson, C.D.,上記)。続く上清からのzdint5ポリペプチドの精製はここに記した方法を利用し達成できる。
【0179】
酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に使用できる。この観点に於いて特に興味深い酵母の種はサッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisiae), ピヒア・パストリス(Pichia pastoris), 及びピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica)である。サッカロミセス・セレビシエー(S.cerevisiae)を外来DNAにて形質転換する方法、及びそれより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号;Kawasakiら、米国特許第4,931,373号;Brake、米国特許第4,870,008号;Welchら、米国特許第5,037,743号及びMurrayら、米国特許第4,845,075号に開示されている。
【0180】
形質転換細胞は選別マーカー、一般には薬剤耐性又は特定栄養素(例えばロイシン)無しでの増殖能力により決定される表現形にて選別される。サッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyces cerevisiae)での使用に好適なベクター系はKwawakiらにより開示されたPOT1ベクター系であり(米国特許第4,931,373号)、それにより形質転換細胞をグルコース含有培地中での増殖から選別することができる。酵母での使用に好適なプロモーター及びターミネーターには、糖分解性酵素遺伝子(例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号;Kingsmanら、米国特許第4,615,974号;及びBitter、米国特許第4,977,092号)及びアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが含まれる。
【0181】
米国特許第4,990,446号;5,063,154号;第5,139,936号及び第4,661,454号も参照せよ。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha), シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe), クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis), クリイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis), ウルチラゴ・マイディス(Ustilago maydis), ピヒア・パストリス(Pichia pastoris), ピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica), ピヒア・グイレルホンディー(Pichia guillermondii)及びキャンディダ・マルトサ(Candida maltosa)を含むその他酵母に関する形質転換系は当分野既知である。例えばGleesonら、J. Gen. Microbiol. 132:3459−65, 1986及びCregg、米国特許第4,882,279号を参照のこと。
【0182】
アスペルギルス(Aspergillus)細胞はMcKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従い利用されるだろう。アクレロニウム・クリソゾナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法はSuminoら、米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換する方法はLambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。組換え体蛋白質産生の宿主としてのピヒア・メタノリカ(Pichia methanolica)の使用は米国特許第5,716,808号、第5,736,383号、第5,854,039号及び第5,888,767号に開示されている。
【0183】
細菌大腸菌(Escherichia coli)、バシルス(Bacillus)及びその他属を含む前核生物宿主細胞も本発明に於ける有用な宿主細胞である。これら宿主を形質転換し、その中にクローン化されている外来DNA配列を発現する技術は当分野で良く知られている(例えばSambrookら、上記を参照)。zdint5ポリペプチドをE.coliの様な細菌内に発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性顆粒として細胞質に留まるか、又は細菌性分泌経路によりペリプラズム間隙内に運ばれるだろう。前者では、細胞は溶解され、顆粒は回収され、例えばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を使用し変性される。
【0184】
変性されたポリペプチドは次に、例えば尿素溶液及び還元型と酸化型グルタチオンの組合せ溶液に対し透析し、齟齬の緩衝化生理食塩水に対し透析する様にして変性剤を希釈することで、再度折りたたまれダイマー形成することができる。後者の場合には、細胞を破壊し(例えば超音波処理又は浸透圧ショック)ペリプラズム間隙より可溶性の機能型としてペリプラズム間隙内容物を放出させ、蛋白質を回収することで、変性及び再折りたたみの必要性を回避しポリペプチドを回収することができる。
【0185】
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は通常の方法に従い、栄養素及び選択された宿主細胞の増殖に必要とされるその他成分を含む培地内に培養される。限定培地及び複合培地を含む各種好適培地が当分や既知であり、一般には炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む。培地は更に成長因子又は血清の様な成分も必要に応じ含むだろう。増殖培地は一般に、例えば発現ベクターに乗り運ばれるか又は宿主細胞内に共トランスフェクションされた選別マーカーにより補完される薬剤選別または必須栄養素の欠失により、外来性に添加されたDNAを含む細胞を選別するだろう。
【0186】
ピヒア・メタノリカ(P.methanolica)細胞は炭素、窒素及び微量栄養素の適当な源を含む培地中、約25℃ないし35℃の温度にて培養される。液体培養体は小型フラスコの振とう、又はファーメンターのスパーリングの様な通常の方法により十分通気される。ピヒア・メタノリカ(P.methanolica)に関する好適培地はYEPD(2%D−グルコース、2%BactoTMペプトン(Difoc Laboratories, Detroit, MI)、1%BactoTM酵母抽出物(Difco Laboratories)、0.004%アデニン及び0.006%L−ロイシン)である。
【0187】
本発明の蛋白質は非天然に生ずるアミノ酸残基も含むことができる。非天然型に生ずるアミノ酸は、以下に限定されるものではないが、トランス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシプロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコール酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−及び4−メチルプロリン、3,3−ジメチルプロリン、t−ロイシン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン及び4−フルオロフェニルアラニンを含む。
【0188】
非天然型アミノ酸残基を蛋白質に取り込ませるための幾つかの方法が当分野で既知である。例えばナンセンス変異を化学的にアミノアシル化した抑制型tRNAを利用し抑制するインビトロ系が利用できる。アミノ酸を合成する方法及びtRNAをアミノアシル化する方法は当分野既知である。ナンセンス変異を含むプラスミド転写及び翻訳はE.coliS30抽出物及び市販の酵素ならびにその他試薬を含む無細胞系にて実施される。蛋白質はクロマトグラフィーにて精製される。例えばRobertsonら、 J. Am, Chem. Soc, 113:2722, 1991; Elimanら、Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chungら、Science 259;806−9, 1993;及びChungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145−9, 1993)を見よ。
【0189】
第2の方法では、翻訳は変異mRNA及び化学的にアミノアシル化された抑制tRNAのマイクロインジェクションにより、Xenopus卵細胞内にて実施される(Turcattiら、J. Biol. Chem. 271:19991−8, 1996)。第3の方法では、E.coli細胞は置換される天然アミノ酸(例えばフェニルアラニン)なしに、所望の非天然型アミノ酸(例えば2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン、又は4−フルオロフェニルアラニン)の存在下に培養される。
【0190】
非天然型アミノ酸はそれに対応する天然アミノ酸に代わって蛋白質内に取り込まれる。Koideら、Biochem.33:7470−6、1994参照。天然型アミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により非天然型に転換することができる。化学修飾は部位特異的突然変異誘導と組み合わせ、更に置換範囲を拡大することができる(Wynn及びRichards、Protein Sci. 2:395−403, 1993)。
Zdint5アミノ酸残基に関しては、非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に生じないアミノ酸及び非天然型アミノ酸の限定数が置換されるだろう。
【0191】
本発明のポリペプチドを80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上精製することが好ましく、特に好ましくは医薬品として純粋な状態、即ち混入高分子、特にその他蛋白質及び拡散に関して99.9%より高く純粋であり、感染性及び発熱性作用物質を含まないことが好ましい。好ましくは精製ポリペプチドはその他ポリペプチド、特に動物起源のその他ポリペプチドを実施含まないことが好ましい。
【0192】
発現組換え体zdint5蛋白質(キメラポリペプチド及び多量体蛋白質を含む)は通常の蛋白質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組み合わせにより精製される。一般的にはAffinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988;及びScopes、Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York, 1994を見よ。
【0193】
ポリヒスチジンアフィニティータグ(典型的には約6ヒスチジン残基)を含む蛋白質は、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。例えばHouchuliら、Bio/Technol.6: 1321−1325, 1988を見よ。Glu−Gluタグを含む蛋白質は、通常の方法に従い免疫親和性クロマトグラフィーにより精製できる。たとえばGrussenmeyerら、上記を見よ。マルトース結合蛋白質融合体は、当分野既知の方法に従いアミロースカラムにより精製される。
【0194】
本発明のポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー、分子篩い及びアフィニティークロマトグラフィーを含む方法の組み合わせにより単離できる。例えば、固定金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーを利用し、ポリヒスチジンタグを含む蛋白質を含む富ヒスチジン蛋白質を精製できる。簡単に述べると、まずゲルに2価金属イオンを加えキレートを形成させる(Sulkowski、Trends in Biochem. 3:1−7, 1985)。富ヒスチジン蛋白質は使用した金属イオンに依存し、各種親和性にてこのマトリックスに吸着され、そして競合的溶出体、pHの低下、強力なキレート形成剤の使用により溶出されるだろう。
【0195】
その他精製法には、レシチンアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化蛋白質の精製が含まれる(Methods in Enzymol., Vol.182, “Guide to Protein Purification”, M.Deutscher,(編集)、Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529−39)。発明の別の実施態様では精製を容易にするために、目的のポリペプチドとアフィニティータグ(例えばマルトース結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン)の融合体が構築されるだろう。
【0196】
Zdint5ポリペプチドは、排除固相合成法、部分固相法、断片濃縮又は古典的液層合成法を含む、当分野既知の方法による化学合成によっても調整できる。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc.85:2149, 1963; Stewartら、Solid Phase Peptide Synthesis(第2版)、Pierce Chmeical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer及びRapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986; 及びAthertonら、Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989を見よ。
当分野既知の方法を利用し、zdint5蛋白質はモノマー又は多量体として調整でき;グリコシル化又は非グリコシル化でき:ぺギル化又は非ペギル化でき;及び初期アミノ酸残基を含むことも、又は含まないこともできる。
【0197】
メタロプロテアーゼ(配列番号2)及びTSP1−様ドメイン(即ち配列番号5及び8)は結腸、小腸、小児肺、精巣及びB−細胞の疾患のアッセイ及び治療への利用に関し特に興味深い。メタロプロテアーゼドメインは感染に対する宿主防衛系の活性化に関係しているだろう。この様なメタロプロテアーゼの一つはマトリリジンである(Wilson, C.ら、Science 286: 113−117, 1999)。マトリリジンは腸内の病原性細菌の宿主防御に関係していることが示されている。Wilsonらは更にマトリリジンが上皮関連蛋白質として、小腸以外の組織に於ける防御活性化も特異的に制御している可能性を示唆している。
【0198】
同様に、zdint5メタロプロテアーゼドメイン(配列番号2)は単独、又はその他ドメイン(即ちzdint5のTSP1−様ドメイン、配列番号5及び8、又は配列番号11、又はADAM−TS及びMETH蛋白質ファミリー由来のその他TSP1−様ドメイン)と共同し、例えば結腸、小腸及び肺の上皮を侵襲する病原性細菌に対する体反応に関係しているだろう。
あるいは、メタロプロテアーゼドメイン(配列番号2)はプロテアーゼとして工業応用での利用に関する酵素的界面活性剤としても利用できる。当業者はzdint5分子の蛋白質分解機能を測定するアッセイを容易に特定できるだろう。
【0199】
メタロプロテアーゼドメインの活性を測定するための代表的アッセイは、それの血漿蛋白質分解酵素阻害剤であるα2Mへの結合能力を測定することであろう。結合域の切断がα2Mサブユニット中に立体構造変化を誘導し、これがプロテアーゼのカプセル化及びα2M内部のチオエステルの活性化を招き、その結果活性型プロテアーゼの共有交差結合が生じる。Nagase, Hら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 294−302, 1994参照。
【0200】
へパリン及びへパリン硫酸は分泌された成長因子及びその他蛋白質の細胞外マトリックスへの結合を促進する分子である。即ちヘパリン及びヘパリン硫酸に結合する分子はこれら成長因子の影響を変調するのに有用である。ヘパリン及びヘパリン結合モチーフは蛋白質のMETHやADAM−TSサブグループ中のトロンボスポンジン反復体中に認められている(Kuno、1998、上記参照)。即ちTSP1−様ドメイン(配列番号5及び/又は8)はヘパリン及びヘパリン硫酸に結合することによって成長因子の影響を変調するのに有用であろう。
【0201】
zdint5ポリペプチドの活性は、例えばプロテアーゼ活性、血管新生阻害剤;細胞外マトリックス形成又はリモデリング;転移、及びADAM/MDC/SVMP/ADAM−TS/METHファミリー構成体に関連する、あるいはアポトーシスの様なインテグリン/ディスインテグリン相互作用に関連したその他生物学的機能;又は分化を測定する各種アッセイを利用し、測定できる。特に興味深いものは、腫瘍抑制である。
【0202】
あるいはスプラシングされたペプチドを含む本発明の蛋白質は、結腸、小腸、胎児肺、清掃及びB−細胞での腫瘍抑制、生殖細胞成熟、免疫的認識、及び成長と分化に関し、単独又はその他分子(成長因子、サイトカイン等)と組合せての作用に有効である。zdint5の別スプライシングは細胞型特異的であり、特異的組織に活性を付与するだろう。
【0203】
問題のアッセイは小腸、結腸、又は肺組織の増殖、分化、及び/又は発生の変化を測定し、又は検出する。更に、プロテアーゼ活性に対すzdint5ポリペプチドの効果、又は上皮細胞、一般には腫瘍細胞の血管新生阻害に対する効果は、関心の測定対象である。更に別のアッセイは、プロテアーゼ活性及びアポトーシスの変化を検証する。
【0204】
精製は培養細胞を利用すること、又はクレームする発明の分子を適当な動物モデルに投与することで、インビボにて測定することができる。一般に、増殖効果は細胞数の増加として観察され、従ってアポトーシス及び有糸分裂誘発の阻害を含むだろう。培養細胞は、初代培養体からの結腸上皮癌細胞、精巣、胎児及び成人の肺、B細胞、メラノーマ及びヒト臍帯静脈上皮細胞を含む。細胞増殖を測定するアッセイは当分野既知である。
【0205】
例えば増殖を測定するアッセイは、色素であるニュートラルレッドに対する化学感受性(Cavanaughら、Investigational New Drugs 8: 347−354, 1990)、放射線標識ヌクレオチドの取り込み(Cookら、Analytical Biochem. 179:1−7, 1989)、増殖細胞のDNA中への5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)の取り込み(Porstmannら、J. Immunol. Methods 82; 169−179, 1985)及びテトラゾリウム塩の利用(Mosmann、 J. Immunol Methods 65:55−63, 1983; Alleyら、Cancer Res. 48:589−601, 1988; Marshallら、Growth Reg. 5: 69−84, 1995;及びScudieroら、Cancer Res. 48: 4827−4833, 1988)の様なアッセイを含む。更に、zdint5ポリペプチドは細胞接着を介して細胞増殖、移動及び血管新生に役割を果たしているだろう。
【0206】
Zdint5がインビボで化学誘因物質であるかを決定するために、zdint5は皮内又は腹膜内注射により投与できる。注射部位に蓄積した白血球の特徴は、系統特異的細胞表面マーカー及び蛍光免疫サイトメトリーを利用し、又は免疫組織化学により決定できる(Jose, J. Exp. Med. 179:881−87, 1994)。骨髄から末梢血液への特異的白血球細胞集団の放出も、zdint5注射後に測定するができる。
【0207】
分化は漸進的および動的過程であり、多分化能性幹細胞で開始し、最終分化細胞で終結する。細胞系譜へのコミットメントを伴わずに再生し得る多分化能性幹細胞は、細胞系譜へのコミットメントがなされると失われる一組の分化マーカーを発現する。前駆細胞は、細胞が細胞系譜経路を進行して成熟に向かう場合に発現され続けることもある一組の分化マーカーを発現する。成熟細胞により専ら発現される分化マーカーは、通常は細胞生成物、細胞生成物を産生するための酵素、ならびに受容体および受容体様補体分子のような機能的特性を示す。
【0208】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団中に存在するマーカーの同定によりモニタリングされる。例えば、筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および細網細胞は、共通の間充織幹細胞から生じると考えられる(Owen et al., Ciba Fdn. Symp. 136:42−46, 1988)。間充織幹細胞のためのマーカーは十分に同定されておらず(Owen et al., J. of Cell Sci. 87:731−738, 1987)、そこで同定は普通は前駆細胞および成熟細胞段階でなされる。
【0209】
ある経路を通って最終分化または脱分化に向かう特定の種類の細胞を刺激する因子は、共通前駆体または幹細胞から生じる全細胞集団に影響を及ぼす、ということを示唆する証拠がある。したがって、zdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の内分泌および外分泌細胞の抑制または増殖を刺激し得る。
分化を測定する検定としては、例えば組織の段階特異的発現に関連した細胞表面マーカーの測定、酵素活性、機能的活性または形態学的変化が挙げられる(Watt, FASEB, 5:281−284, 1991; Francis, Differentiation 57:63−75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesse, 161−171, 1989)。
【0210】
本発明のzdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞における増殖または分化を調べるために用いられ得る。本発明のこのような方法は一般に、zdint5ポリペプチド、モノクローナル抗体、そのアゴニストまたはアンタゴニストの存在下および非存在下でこれらの組織由来の細胞をインキュベートすること、ならびに細胞の増殖または分化の変化を観察することを包含する。これらの組織からの細胞株は、例えばアメリカ培養細胞コレクション(Manasas, VA)から市販されている。
【0211】
代替的にスプライスされたペプチドを含めた本発明のタンパク質および断片は、プロテアーゼ活性またはアンギオテンシン阻害を試験するのに有用である。zdint5分子、変異体および断片は、分離して、あるいは結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞中のその他の分子(成長因子、サイトカイン等)と一緒に適用され得る。
【0212】
本発明のタンパク質は、治療薬の送達に有用であり、それらの例としては、プロテアーゼ放射性核種、化学療法薬および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの治療薬の作用は、培養細胞を用いてin vitroで、組織切片上でex vivoに、あるいは適切な動物モデルに特許請求した本発明の分子を投与することにより、測定され得る。本発明のタンパク質を検定するための代替的in vivoアプローチは、ウイルス送達系を包含する。この目的のためのウイルスの例としては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ関連ウイルス(AAW)が挙げられる。
【0213】
二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは近年、異種核酸の送達のためのもっともよく研究された遺伝子運搬ベクターである(再検討のためには、T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161−89, 1994;およびJ.T.Douglas and D.T.Curiel, Science & Medicine 4:44−53, 1997参照)。アデノウイルス系は、いくつかの利点を提供する:アデノウイルスは、(i)相対的大型DNA挿入物を収容し、(ii)高力価に増殖され、(iii)広範囲の哺乳類細胞型を感染させ、そして(iv)異なるプロモーターを含有する多数の利用可能なベクターとともに用いられる。さらに、アデノウイルスは血流中で安定であるため、それらは静注により投与され得る。
【0214】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失することにより、異種DNAの大型挿入物(7 kbまで)が収容され得る。これらの挿入物は、直接結紮により、または同時トランスフェクト化プラスミドによる同種組換えにより、ウイルスDNA中に組み入れられ得る。模範的系では、必須いい1遺伝子がウイルスベクターから欠失されており、宿主細胞(ヒト293細胞株が適例である)によりE1遺伝子が提供されない限り、ウイルスは複製しない。
【0215】
無傷動物に静脈内投与した場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的にする。アデノウイルス送達系がE1遺伝子欠失を有する場合、ウイルスは宿主中で複製し得ない。しかしながら、宿主の組織(例えば肝臓)は、異種タンパク質を発現し、加工処理(そして、分泌シグナル配列が存在する場合には、分泌)する。分泌タンパク質は高度血管新生化肝臓中の循環に入りそして感染動物に及ぼす影響が確定され得る。
【0216】
さらに、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルスベクターは、ベクターに対する免疫応答を低減または排除するための試みに用いられ得る。このようなアデノウイルスはE1欠失化され、さらにE2AまたはE4の欠失を含有する(Lusky, M. et al., J. Virol. 72:2022−2032, 1998; Raper, S.E. et al., Human Gene Therapy 9:671−679, 1998)。さらに、E2bの欠失は、免疫応答を低減することが報告されている(Amalfitano, A. et al., J. Virol. 72:926−933, 1998)。
【0217】
さらに、全アデノウイルスゲノムを欠失することにより、異種DNAの非常に大きい挿入物が収容され得る。全ウイルス遺伝子が欠失されたいわゆる「中身のない」アデノウイルスの生成は、異種DNAの大型挿入物の挿入のために特に有益である(再検討のためには、Yeh, P. and Perricaudet, M., FASEB J. 11:615−623, 1997参照)。
【0218】
アデノウイルス系は、in vitroでのタンパク質産生のためにも用いられ得る。細胞が迅速に分裂中でない条件下でアデノウイルス感染非293細胞を培養することにより、細胞は長期間タンパク質を産生し得る。例えば、BHK細胞を細胞工場で集密まで成長させて、次に当該分泌タンパク質をコードするアデノウイルスベクターに曝露する。次に、有意の細胞分裂を伴わずに感染細胞を数週間生存させる無血清条件下で細胞を成長させる。あるいは、アデノウイルスベクター感染293S細胞は、相対的に高い細胞密度で懸濁培地中で成長して、有意量のタンパク質を産生し得る(参照Garnier et al., Cytotechnol. 15:145−55, 1994)。どちらかのプロトコールを用いて、発現、分泌異種タンパク質を細胞培養上清から反復的に単離し得る。感染293S細胞産生プロトコール内で、非分泌タンパク質も有効に得られ得る。
【0219】
可溶性または細胞表面タンパク質として、細胞表面タンパク質相互作用およびその後の生理学的細胞応答に関連した細胞外酸性化率または陽子排出を測定するケイ素ベースのバイオセンサーミクロフィジオメーターにより、zdint5ポリペプチドまたはzdint5が結合するペプチドの活性を測定し得る。適例装置は、Molecular Devices, Sunnyvale, CAにより製造されたサイトセンサーミクロフィジオメーターCytosenser Microphysiometerである。
【0220】
種々の細胞応答、例えば細胞増殖、鉄輸送、エネルギー産生、炎症性応答、調節および受容体活性化等を、この方法により測定し得る(例えば、McConnell, H.M. et al., Science 257:1906−1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228:84−108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49−59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87−95, 1998参照)。ミクロフィジオメーターは、接着性または非接着性真核生物または原核生物細胞を検定するために用い得る。
【0221】
長時間、細胞培地中の細胞外酸性化変化を測定することにより、ミクロフィジオメーターは、zdint5タンパク質、それらのアゴニストおよびアンタゴニストを含めた種々の刺激に対する細胞応答を直接測定する。好ましくは、ミクロフィジオメーターを用いて、zdint5ポリペプチドに応答しない対照真核生物細胞と比較した、zdint5応答性真核生物細胞の応答を測定する。zdint5応答性真核生物細胞は、zdint5に対する結合相手に関するポリヌクレオチドがトランスフェクトされてzdint5に応答性の細胞を作製する細胞、あるいはzdint5に対して天然に応答性である細胞を包含する。
【0222】
zdint5ポリペプチドに曝露された細胞の応答の変化により測定される分化は、zdint5変調細胞応答の直接測定値である。さらに、種々の刺激したで、このようなzdint5変調応答を査定し得る。本発明は、zdint5タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法であって、zdint5ポリペプチドに応答する細胞を提供し、被験化合物の非存在下で細胞の第一部分を培養し、被験化合物の存在下で細胞の第二部分を培養し、そして細胞の第一部分と比較した場合の細胞の第二部分の細胞外酸性化率の測定可能な変化を検出する方法を提供する。
【0223】
さらに、zdint5ポリペプチドの存在下および被験化合物の非存在下での細胞の第三部分の培養は、zdint5応答性細胞に関する陽性対照ならびに被験化合物のアゴニスト活性をzdint5ポリペプチドの場合と比較するための対照を提供する。zdint5のアンタゴニストは、被験化合物の存在下および非存在下でzdint5タンパク質に細胞を曝露し、それによりzdint5変調性活性の低減が被験化合物中のアゴニスト活性を示すことにより同定され得る。
【0224】
さらに、zdint5は、zdint5変調性経路に応答する細胞、組織または細胞株を同定するために用いられ得る。前記のミクロフィジオメーターを用いて、本発明のzdint5に応答性の細胞のようなzdint5結合相手を発現する細胞を迅速に同定し得る。細胞は、zdint5ポリペプチドの存在下または非存在下で培養され得る。zdint5の存在下で細胞外酸性化の測定可能変化を引き出す細胞は、zdint5に応答性である。このような細胞株は、前記のようなzdint5ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを同定するために用いられ得る。同様の方法を用いて、zdint5を発現する細胞は、zdint5シグナリング経路を刺激する細胞を同定するために用いられ得る。
【0225】
zdint5発現に関して観察される組織分布(結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞)の点から見て、アゴニスト(ネイティブプロテアーゼおよびTSP1様ドメインを含む)およびアンタゴニストは、in vitroおよびin vivo適用の両方において非常に大きい可能性を有する。zdint5アゴニストおよびアンタゴニストとして同定された化合物は、in vitroおよびin vivoでのプロテアーゼ活性、新脈管形成抑制、細胞外マトリックスタンパク質、虚血再還流および炎症の修復およびリモデリングを試験するために有用である。
【0226】
例えば、zdint5およびアゴニスト化合物は、限定細胞培地の構成成分として有用であり、そして細胞培養に一般的に用いられる血清に取って代わるために、単独でまたは他のサイトカインおよびホルモンと組合せて用いられ得る。したがって、アゴニストは、培養中の骨髄系およびリンパ系細胞系譜の細胞の成長および/または発達を特異的に促進するのに有用である。さらに、zdint5ポリペプチドおよびzdint5アゴニスト、例えば小分子は、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の拡大、分化および/またはプロテアーゼ活性、あるいは新脈管形成抑制に関する研究試薬として有用である。zdint5ポリペプチドは、これらの細胞型に関する組織培地に付加される。
【0227】
アンタゴニストも、補体/抗補体対間の相互作用の部位、ならびにプロテアーゼ活性または新脈管形成抑制の部位を特性化するための研究試薬として有用である。zdint5活性の阻害剤(zdint5アンタゴニスト)としては、抗zdint5抗体および可溶性zdint5ポリペプチド(例えば、配列番号2、5、8および11における)、ならびにその他のペプチドおよび非ペプチド剤(リボザイムを含む)が挙げられる。
【0228】
zdint5は、その活性の阻害剤(アンタゴニスト)を同定するためにも用いられ得る。被験物質が本明細書中に開示された検定に付加されて、zdint5の活性を抑制する化合物を同定する。本明細書中に開示された検定の他に、試料は、TSP1様ドメイン/細胞外マトリックス結合あるいはzdint5依存性細胞応答の刺激/抑制を測定するよう意図された種々の検定内でzdint5活性の抑制に関して試験され得る。例えば、zdint5変調化細胞株は、zdint5刺激性細胞経路に応答するレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされ得る。
【0229】
この種類のレポーター遺伝子構築物は当業界で既知であり、一般的にルシフェラーゼのような検定可能タンパク質または環状AMPのような代謝物質をコードする遺伝子に操作可能的に連結されたDNA応答素子を含む。DNA応答素子としては、環状AMP応答素子(CRE)、ホルモン応答素子(HRE)、インスリン応答素子(IRE)(Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273−7, 1990)および血清応答素子(SRE)(Shaw et al., Cell 56:563−72, 1989)が挙げられるが、これらに限定されない。環状AMP応答素子は、Roestler et al., J. Biol. Chem. 263(19):9063−6; 1988およびHabener, Molec. Endocrinol. 4(8):1087−94; 1990で検討されている。
【0230】
ホルモン応答素子は、Beato, Cell 56:335−44; 1989で検討されている。候補化合物、溶液、混合物または抽出物は、レポーター遺伝子発現のzdint5刺激の低減により立証されるように、標的細胞におけるzdint5の活性を抑制する能力に関して試験される。この種類の検定は、細胞表面タンパク質、即ち細胞外マトリックスあるいは相補体/抗相補体対の抗相補体成員と結合するzdint5を直接遮断する化合物、ならびに相補体/抗相補体結合後の細胞経路における過程を遮断する化合物を検出する。
【0231】
代替的には、化合物またはその他の試料は、検出可能標識(例えば、125I、ビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、FITC等)でタグされたzdint5を用いて、zdint5結合の直接遮断に関して試験され得る。この種類の検定内では、標識化zdint5の結合を阻害する被験試料の能力は抑制活性を示し、これは二次検定により確証され得る。
【0232】
さらに、zdint5ポリペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞組織における創傷治癒を促すために治療的に有用であり得る。本発明のzdint5ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストにおけるこの能力の存在を立証するために、当業界で既知の手法にしたがって、創傷治癒を促すそれらの能力に関して、このようなzdint5ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを評価する。所望により、この点におけるzdint5ポリペプチド性能を、増殖因子、例えばEGF、NGF、TGF−α、TGF−β、インスリン、IGF−I、IGF−II、繊維芽細胞増殖因子(FGF)等と比較し得る。さらに、zdint5ポリペプチドあるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、共働的作用を同定するために、1つ又はそれ以上の増殖因子と組合せて評価され得る。
【0233】
zdint5ポリペプチドは、その結合相手(単数または複数)の精製のためにも用いられ得る。固体支持体、例えばアガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース系樹脂、シリカベースの樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下で安定である同様の物質上に固定される。固体支持体上にポリペプチドを連結するための方法は当業界で既知であり、その例としては、アミン化学作用、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化およびヒドラジド活性化が挙げられる。その結果生じる培地を、一般にカラムの形態で形造し、結合相手を含有する流体を1回またはそれ以上、カラムに通して、結合相手をzdint5ポリペプチドに結合させる。次に、塩濃度の変化、カオトロピック剤(グアニジンHCl)またはpHを用いて結合相手を溶離して、zdint5/結合相手結合を中断する。
【0234】
リガンド結合受容体(または補体/抗相補体対の一成員である抗体またはその他の細胞表面結合タンパク質)またはその結合断片および市販のバイオセンサー計器(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を使用する検定系は、有益に用いられ得る。このような受容体、抗体、相補体/抗相補体対または断片は、受容体チップの表面に固定される。この計器の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229−40, 1991およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554−63, 1993により開示されている。
【0235】
アミンまたはスルフヒドリル化学作用を用いて、受容体、抗体、成員、ディスインテグリンまたは断片を、フローセル内で金フィルムに付着されるデキストラン繊維と共有結合させる。被験試料をセルに通す。インテグリン、エピトープまたは補体/抗補体対の反対成員が試料中に存在する場合、それは固定化ディスインテグリン、抗体または成員とそれぞれ結合して、媒質の屈折率の変化を引き起こし、これは金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。この系は、結合親和性が算定され得るオン−およびオフ−速度の決定、およびその査定を可能にする。
【0236】
プロテアーゼまたはTSP1様ポリペプチドを結合するプロテアーゼ基質ポリペプチドおよびTSP1様結合ポリペプチドも、当業界で既知のその他の検定系内に用いられ得る。同様に、zdint5のTSP1様ポリペプチドと結合する細胞外マトリックスポリペプチドも、他の検定系とともに用いられ得る。このような系としては、結合親和性の決定のためのスキャッチャード分析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660−72, 1949参照)および熱量検定(Cunningham et al., Sciendce 253:545−48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821−25, 1991)が挙げられる。
【0237】
「可溶性タンパク質」とは、細胞膜に結合されないタンパク質である。可溶性タンパク質は、膜貫通および細胞質ドメインを欠く最も一般的なリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性タンパク質は、付加的アミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供するかまたは基質へのポリペプチドの付着のための部位を提供する親和性タグ、あるいはイムノグロブリン定常部配列を包含し得る。多数の細胞表面タンパク質は、タンパク質分解により産生され得るかまたは代替的スプライス化mRNAから翻訳される天然可溶性対応体を有する。タンパク質は、それぞれ膜固定またはシグナル伝達を提供するのに十分なこれらのセグメントの部分を欠く場合、膜貫通および細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないといわれている。
【0238】
可溶性形態のzdint5ポリペプチド、例えば配列番号2、5、8および11のポリペプチドは、zdint5ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用し、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞におけるzdint5の作用を変調するのに有用である。
本発明の分子は、プロテアーゼ活性に、あるいは新脈管形成抑制に関与する細胞外マトリックスタンパク質、あるいは相補体/抗相補体対の成員を同定および単離するために用いられ得る。
【0239】
例えば、本発明のタンパク質およびペプチドは、カラム上に固定され、膜調製物がカラム上を走行する(Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992,pp.195−202)。タンパク質およびペプチドは、放射能標識され得る(Methods in Enzymol., vol. 182,”Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721−37)か、光親和性標識され(Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483−514, 1993およびFedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167−80, 1984)、そして特異的細胞表面タンパク質が同定され得る。
【0240】
本発明のポリペプチド、核酸および/または抗体は、胃腸照射、化学療法または抗体使用後の回復に関連した障害の治療に用い得る。さらに、本発明の分子は、抗感染剤および/または細胞外マトリックス修復およびリモデリングとして有用であり得る。本発明の分子は、タンパク質分解、アポトーシス、新脈管形成、感染、細胞接着、細胞融合およびシグナリングを変調するために、あるいは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞のような多様な組織における病理学的症状の発症を治療または予防するために用い得る。
【0241】
特に、ある種の疾患は、このような診断、治療または予防を受け容れ得る。本発明の分子は、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞における内皮の抑制および増殖を変調するために用い得る。zdint5ポリペプチドによる診断、治療または予防を受け容れ得る疾患としては、例えば腫瘍形成、クローン病、炎症性腸疾患、食物中毒、黒色腫および変性疾患が挙げられる。
【0242】
zdint5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zdint5活性を増大または抑制するのが望ましい遺伝子療法適用内で有用である。哺乳類が突然変異化zdint5遺伝子を有するかまたはzdint5遺伝子を有さない場合、zdint5遺伝子は哺乳類の細胞中に導入され得る。一実施態様では、zdint5ポリペプチドをコードする遺伝子は、in vivoでウイルスベクターに導入される。このようなベクターとしては、弱毒または欠陥DNAウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0243】
ウイルス遺伝子を全部またはほぼ全部欠く欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞に導入後は感染性でない。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染し得る懸念なしに、特定の局在化領域の細胞への投与を可能にする。特殊なベクターの例としては、欠陥単純ヘルペスウイルス(HSV1)ベクター(Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320−30, 1991)および弱毒アデノウイルスベクター、例えばStratford−Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626−30, 1992により記載されているようなベクター、ならびに血管アデノ関連ウイルスベクター(Samulski et al., J. Virol. 61:3096−101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822−8, 1989)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0244】
別の実施態様では、zdint5遺伝子は例えば米国特許第5,399,346号(Anderson等);Mann et al., Cell 33:153, 1983;米国特許第4,650,764号(Temin等);米国特許第4,980,289号(Temin等);Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988;米国特許第5,124,263号(Temin等);国際特許公告WO 95/07358(Dougherty等、1995年3月16日公開);およびKuo et al., Blood 82:845, 1993に記載されているように、レトロウイルスベクターに導入され得る。あるいは、ベクターは、リポソームを用いたin vivoでのリポフェクションにより導入され得る。
【0245】
合成陽イオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413−7, 1987;Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027−31, 1988)。特定器官にin vivoで外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、いくつかの実際的利点を有する。
【0246】
特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは、有益な一分野を示す。特に、特定の細胞への直接トランスフェクションは、有益な一分野を表す。例えば、特定細胞型への直接トランスフェクションは、細胞不均一性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓および脳において特に有益である。脂質は、ターゲッティングの目的のために他の分子と化学的に結合され得る。標的化ペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質)、タンパク質、例えば抗体、または非ペプチド分子は、リポソームと化学的に結合され得る。
【0247】
同様に、zdint5ポリヌクレオチド(配列番号1、3、4、6、7、9、10または12)は、特定組織、例えば結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞を標的するために用いられ得る。身体から標的細胞を除去し、裸DNAプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に身体に形質転換化細胞を再移植することができる。遺伝子療法のための裸DNAベクターは、当業界で既知の方法により、例えばトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター運搬体の使用により、所望の宿主細胞中に導入され得る(例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963−7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621−4, 1988参照)。
【0248】
アンチセンスおよびリボザイム法を含めた種々の技法を用いて、例えば細胞増殖をin vivoで抑制するために、zdint5遺伝子転写および翻訳を抑制し得る。zdint5コードポリヌクレオチド(例えば、配列番号1、3、4、6、7、9、10または12で記述されるようなポリヌクレオチド)のセグメントと相補的であるポリヌクレオチドは、zdint5コードmRNAと結合し、そしてこのようなmRNAの翻訳を抑制するよう意図される。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを用いて、細胞培養中のまたは被験者におけるzdint5ポリペプチドコード遺伝子の発現を抑制する。
【0249】
「トランスジェニックマウス」と呼ばれるzdint5遺伝子を発現するよう工学処理されたマウス、および「ノックアウトマウス」と呼ばれるzdint5遺伝子機能の完全非存在を示すマウスも生成され得る(Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740−42, 1993; Capeechi, M.R., Science 244:1288−1292, 1989; Palmiter, R.D. et al., Annu Rev Genet. 20:465−499, 1986)。例えば、遍在的に、あるいは組織特異的または組織制限プロモーター下でzdint5を過剰発現するトランスジェニックマウスを用いて、過剰発現が表現型を生じるか否かを問う。
【0250】
例えば、野生型zdint5ポリペプチド、ポリペプチド断片またはその突然変異体の過剰発現は、正常細胞過程を変え、zdint5発現が機能的に関連する組織を同定し、zdint5、そのアゴニストまたはアンタゴニストに対する治療的標的を示し得る表現型を生じ得る。例えば、工学処理するためのトランスジェニックマウスは、可溶性zdint5ポリペプチド(配列番号11の約アミノ酸104〜306)を過剰発現するものである。さらに、このような過剰発現は、ヒト疾患との類似性を示す表現型をもたらす。同様に、ノックアウトzdint5マウスを用いて、zdint5がin vivoで絶対に必要とされる場合を確定し得る。
【0251】
ノックアウトマウスの表現型は、本明細書中に記載したもののようなzdint5アンタゴニストが有し得るin vivo作用を予測する。ヒトzdint5cDNAを用いて、ネズミzdint5mRNA、cDNAおよびゲノムDNAを単離し得るが、これらはその後、ノックアウトマウスを生成するために用いられる。これらのマウスは、zdint5遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質をin vivoで試験するために用いられ得るし、対応するヒト疾患のためのin vivoモデルとして用いられ得る。さらに、本明細書中に記載したzdint5に対して向けられるzdint5アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムのトランスジェニックマウス発現は、前記のトランスジェニックマウスと同様に用いられ得る。
【0252】
zdint5ポリペプチド、その変異体および断片は、プロテアーゼ活性または新脈管形成抑制に関連した障害、例えば概して免疫、炎症、受精、配偶子成熟、免疫学、外傷および上皮性障害に関連した障害に対する置換療法として有用であり得る。
組織形態形成の低広範見積決定基は、細胞再配列の過程である。細胞運動性および細胞−細胞接着はともに、形態形成的細胞再配列において中心的役割を演じると思われる。細胞は、隣接細胞との接触を迅速に破壊し、おそらくは同時的に再作製し得る必要がある(Gumbiner, B.M., Cell 69:385−387, 1992参照)。結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞中の分泌タンパク質と同様に、zdint5はこれらのおよびその他の組織中での細胞間再配列に一役を演じ得る。
【0253】
zdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の組織中で発現される。したがって、本発明のポリペプチドは、細胞接着および転移におけるその役割を調べるのに有用であり、転移、特に結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の腫瘍における転移を防止するのに有用であり得る。同様に、zdint5のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、腫瘍または罹患組織中のそれらの欠陥対応体を置換し得る。したがって、本発明のzdint5ポリペプチド製剤組成物は、これらの組織の病理学的調節または拡大に関連した障害の予防または治療に有用であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、調節可能プロモーターとともに用いられ、したがって送達タンパク質の投与を調節し得る。
【0254】
さらに、腫瘍進行および転移に及ぼすzdint5の活性および作用は、in vivoで測定され得る。いくつかの同質遺伝子マウスモデルは、腫瘍進行に及ぼすポリペプチド、化合物またはその他の治療の影響を試験するために開発された。これらのモデルでは、培養中で継代される腫瘍細胞は、腫瘍ドナーとして同一系統のマウスに移植される。細胞は、レシピエントマウス中で同様の特徴を有する主要に発達し、いくつかのモデルでは転移も起こる。腫瘍モデルとしては、中でもLewis肺癌(ATCC No. CRL−1642)およびB16黒色腫(ATCC No. CRL−6323)が挙げられる。
【0255】
これらはともに一般的に用いられる腫瘍株であって、in vitroで容易に培養および操作される、C57BL6マウスと同質遺伝子性である。これらの細胞株のいずれかの移植に起因する腫瘍は、C57BL6マウスにおいては肺に転移し得る。Lewis肺癌モデルは、新脈管形成の阻害剤を同定するために、近年マウス二重盲検散られている(O’Reilly MS, et al. Cell 79:315−328, 1994)。組換えタンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの毎日注射により、アルは組換え体アデノウイルスの1回注射により、実験的作用物質を用いてC57BL6/Jマウスを処置する。
【0256】
この処置の3日後に、105〜106細胞を背中皮膚したに移植する。あるいは、全身的というよりむしろ腫瘍部位にまたは細胞内にタンパク質が合成されるように、移植前に、細胞それ自体を組換え体アデノウイルス、例えばzdint5を発現するものに感染させ得る。マウスは、5日以内に可視的腫瘍を正常に発症する。腫瘍は3週間までの期間増殖させられ、この期間中に、それらは、対照群では1500〜1800 mm3のサイズに達し得る。実験中通して、腫瘍サイズおよび体重を注意深くモニタリングする。
屠殺時点で、腫瘍を取り出して、肺および肝臓と一緒に計量する。肺重量は、転移腫瘍重量とよく相関する。付加的測定として、肺表面転移を計数する。当業界で既知のそして本明細書中に記載した方法を用いて、組織病理学的検査、免疫組織化学的検査およびin−situハイブリダイゼーション用に、切除腫瘍、肺および肝臓を調製する。したがって、血管構造を補充し、転移を経る腫瘍の能力に及ぼす発現当該ポリペプチド、例えばzdint5の影響を査定し得る。さらに、アデノウイルスの使用の他に、移植細胞は一過性にzdint5でトランスフェクトされ得る。
【0257】
さらに、精製zdint5またはzdint5状態調節培地はこのマウスモデルに直接注入され、それゆえこの系で用いられ得る。安定zdint5トランスフェクト体の使用ならびにin vivoでのzdint5発現を活性化するための誘導可能プロモーターの使用は当業界で既知であり、転移のzdint5誘導を査定するためにこの系に用いられ得る(全般的参照のためには、O’Reilly MS, et al. Cell 79:315−328, 1994;およびRusciano D. et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349−361, 1995参照)。
【0258】
zdint5遺伝子は、欠陥zdint5遺伝子を有するヒトを同定するためのプローブとして有用であり得る。結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞におけるzdint5の強い発現は、zdint5ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがこれらの組織中での異所的増殖の指標として測定される場合に用いられ得る、ということを示唆する。したがって、zdint5のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらに対する突然変異は、これらの組織における癌の診断指標として用いられ得る。
【0259】
本発明のポリペプチドは、細胞接着および転移におけるその役割を調べるのに有用であり、転移、特に結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の腫瘍における転移を防止するのに有用であり得る。同様に、zdint5のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍または悪性組織中のそれらの欠陥対応体に取って代わるために用いられ得る。
zdint5ポリペプチドは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞中で発現される。したがって、本発明のzdint5ポリペプチド製剤組成物は、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞の病理学的調節または拡大に関連した障害の予防または治療に有用であり得る。
【0260】
配列番号2、5、8および11のzdint5ポリヌクレオチドは、染色体9q34にマッピングされている。したがって、本発明は、診断的適用に用途を見出す試薬も提供する。例えば、zdint5遺伝子、zdint5DNAまたはRNAを含むプローブ、あるいはその亜配列を用いて、zdint5遺伝子が染色体9q34上に存在するか否か、あるいは突然変異が起きているか否かを確定し得る。
【0261】
zdint5遺伝子座での検出可能染色体異常としては、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変化および再配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような異常は、分子遺伝子技法、例えば制限断片長多型(RFLP)分析、PCR技法を用いる短タンデム反復(STR)分析、ならびに当業界で既知のその他の遺伝子連鎖分析技法(Sambrook et al.、上記;Ausubel et al.、上記;Marian, Chest 108:255−65, 1995)を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出し得る。
【0262】
製薬的使用のためには、本発明のタンパク質は、経口的、非経口的(特に静脈内または皮下)、膀胱内、膣内、腹腔内、局所的(粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして)、頬内、胎内に、あるいは肺または鼻腔吸入剤として投与し得る。静脈内投与は、1〜数時間の限局期間中のボーラス注射または注入による。概して、製剤処方物は、zdint5タンパク質を、単独で、または二量体相手とともに、製薬上許容可能なビヒクル、例えば食塩水、緩衝化食塩水、水中の5%デキストロース等と組合せて含有する。処方物はさらに、1つ又はそれ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、ウイルス表面のタンパク質損失を防止するためのアルブミン等を含み得る。
【0263】
処方方法は当業界で周知であり、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示されている。治療用量は一般に、0.1〜100μg/患者の体重1kg/日、好ましくは0.5〜20 mg/kg/日の範囲であり、的確な用量は、処置される症状の性質および重症度、患者の特性等を考慮して、許容された規準にしたがって臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。
【0264】
本タンパク質は、1週間またはそれ以下、しばしば1〜3日間の短期治療のために投与され得るし、あるいは数ヶ月または数年に亘る長期治療に用いられ得る。概して、zdint5の治療的有効量とは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞における細胞外マトリックスリモデリング、瘢痕組織形成、腫瘍抑制、血小板凝集、アポトーシス、筋発生の臨床的に有意の変化を生じるのに十分な量である。同様に、zdint5の治療的有効量とは、結腸、小腸、胎児肺、精巣およびB細胞に関連した障害における臨床的に有意の変化を生じるのに十分な量である。
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