【０００１】
本発明は、β−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸に関する。
【０００２】
細菌、酵母又は哺乳動物細胞のような微生物中での異種（ｆｏｒｅｉｇｎ）蛋白質の発現は、組換え型蛋白質のバイオテクノロジー的な調製及び生成のために非常に重要である。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に基づく細菌発現系が、インシュリン、インターロイキン−２、組織プラスミノゲン、活性化物質（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プロテアーゼ又はリパーゼのような組換え型ペプチド又は蛋白質の製造に使用される。グラム陰性菌では、発現系は、ラックオペロン（ｌａｃ ｏｐｅｒｏｎ）又はトリプトファンオペロンにような遺伝的成分の使用に主に基づいている。ホストとは異種の蛋白質は、細胞内の“封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）”内で、又は周辺細胞腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）内で、β−ラクタマーゼ（ｌａｃｔａｍａｓｅ）に基づく発現系が使用される場合に生成される。周囲の発酵培地（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）内での組換え型蛋白質の精製は、確立されていない。グラム陽性菌では、今までのところ、ほぼ専用の（ａｌｍｏｓｔ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）細胞に固有な蛋白質が導入され、かつ発現されている。
【０００３】
Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロマイシス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母もまた、ヒトのＸＩＩＩａ因子、ウシのプロキモシン（ｐｒｏ−ｃｈｙｍｏｓｉｎ）、又は表面抗原のような組換え型蛋白質の非相同発現のために使用される。酵母では、発現系は、ガラクト−キナーゼ−エピメラーゼ、酸ホスファターゼ、又はアルコール脱水素酵素の遺伝的成分から構成されるシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクター（酵母及び細菌の両方を有するベクター）に基づいている。一般に、組換え型蛋白質は、細胞の細胞質内で生成される。アルファ因子のような酵母に固有のシグナル配列が使用される場合、発現された蛋白質もまた、発酵培地内に分泌され得る。分泌された蛋白質のグリコシル化は、“高マンノース（ｈｉｇｈ ｍａｎｎｏｓｅ）”型によって達成される。
【０００４】
齧歯類動物（ｒｏｄｅｎｔｓ）からの（ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞）、又はサル（ｓｉｍｉａｎｓ）からの（ベロ（ｖｅｒｏ）、ＣＶ−１又はＣＯＳ細胞）様々な細胞のような哺乳動物細胞もまた、組換え型蛋白質の非相同発現のために使用される。ここでは、発現系は、組換え型ウイルス（ＢＰＶベクター）又はシャトルベクターに基づいている。発現の調節のために、ウイルスのＳＶ４０エンハンサー／プロモーター系又は細胞のエンハンサー成分が使用される。異種遺伝子が、発現系によって理解され、かつターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）のために使用されるそれら独自のシグナル配列を通常もたらすので、エリトロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）にような組換え型蛋白質が発酵培地内へ分泌される。
【０００５】
更に、グリコシル化細胞外酵素のバイオテクノロジー的な生成のために、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のような繊毛虫（ｃｉｌｉａｔｅｓ）が使用される。繊毛虫は、標準発酵法を用いる安価な発酵培地上で成長するであろう。そのような繊毛虫の形質転換のために、繊毛虫テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）に基づくベクターが利用され得る。繊毛虫中での細菌蛋白質の非相同発現のために、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）からの遺伝子からなるＤＮＡ構成が使用される。異種蛋白質の転写、ターゲッティング、及びグリコシル化の調節のために適当な遺伝的成分が利用され得る場合、繊毛虫は、治療に役立つ組換え型蛋白質の安価な生成のために理想的な発現系である。
【０００６】
今まで使用されてきたグラム陰性菌発現系は、蛋白質の変性と共に細胞における“封入体”の形成を通常引き起こす。組換え型蛋白質を回収するためには、細胞を溶解しなければならず、かつ変性された不活性蛋白質を機能させるために折り返さなければならない。これは、更なる費用集約的な（ｃｏｓｔ−ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）方法段階をもたらし、かつ所望の蛋白質の収率を低下させる。真核生物蛋白質のために重要なグリコシル化は、完全に省略される。グラム陽性菌発現系が使用される場合、発酵培養液中での高い蛋白質分解活性による目的の蛋白質の分解は、更なる問題である。
【０００７】
非相同発現のために酵母が使用される場合、所望の目的の蛋白質は、それを細胞溶解によって取り除かなければならない場所からの細胞内だけで、しばしば生成される。細菌発現系において、これは、更なる時間及び費用集約的な方法段階をもたらす。酵母に固有なシグナルペプチドが使用される場合、異種蛋白質は、分泌のために正確には接合及びグリコシル化されない。
【０００８】
それに反して、組換え型蛋白質の生成のために哺乳動物細胞系が使用される場合、所望の蛋白質は、正確に接合及びグリコシル化され、細胞外状態で、発酵培地中に見られる。しかし、一方ここでの欠点は、ウイルスベクターによる生成細胞系のゲノム中に導入された遺伝子の不完全な処理及び非能率的な翻訳による低い発現率である。一方、哺乳動物細胞のための血清含有発酵培地は、非常に費用集約的である。また、剪断感受性（ｓｈｅａｒ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）細胞系のための発酵技術は、気泡を含まない通気（ｂｕｂｂｌｅ−ｆｒｅｅ ａｅｒａｔｉｏｎ）を構成するため、複雑であり、かつ同様に高価である。更なる問題は、マイコプラズマ及びウイルスからの細胞系に対する高い汚染危険性（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｒｉｓｋ）から生じる。概して（Ａｌｌ ｉｎ ａｌｌ）、組換え型蛋白質のバイオテクノロジー的な調製のための哺乳動物細胞の使用の結果、非常に高い費用、安全の要求及び低収率がもたらされる。
【０００９】
テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のような繊毛虫の使用には、蛋白質の生成における上記欠点は当てはまらない。従って、例えば食料粒子の消化に関連する数種の酸加水分解酵素が、複合グリコシル化（ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）によって高品質で細胞から輸送される。
【００１０】
アラン（Ａｌａｍ）らのＪ．Ｅｕｋ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（４），１９９６の２９５〜３０３ページには、テトラヒメナ・ピリフォルミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）の酸α−グルコシダーゼをコードする遺伝子のクローニングが記載されている。しかし、蛋白質の小さな部分だけが細胞から輸送される。
【００１１】
しかし、今までは、他の異種グリコシル化真核生物蛋白質を、発酵培地中にも分泌される繊毛虫における発現にもたらすことは出来なかった。これは、発現ベクターを構成するために必要な、繊毛虫に固有の分泌された酸加水分解酵素からのＤＮＡ配列が、今まで知られていなかったことによるものである。
【００１２】
本発明の目的は、繊毛虫の分泌蛋白質の発現のためのＤＮＡ配列を提供することである。ＤＮＡ配列は、繊毛虫における形質転換の後に、発酵培地内に輸送されるべき発現系中に非相同蛋白質をもたらすであろう。この系は、培養条件下において、細胞から多量に輸送される非相同蛋白質の高発現率も達成するであろう。
【００１３】
この目的は、配列番号１（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１）の配列を有し、かつβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を使用する系によって達成される。
【００１４】
特に、β−ヘキソースアミニダーゼの本発明のＤＮＡ配列は、シグナルペプチド及びプロペプチド、並びに任意に更に蛋白質のターゲッティングのための遺伝的成分を含む。ベクター中でのこれら配列の使用は、細胞から輸送され、かつそれにより細胞溶解なしに発酵培養液から精製されるべき非相同発現された蛋白質をもたらす。
【００１５】
図１は、繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を示す。図２は、配列番号１による核酸の対応する発現生成物を示す。本発明は、配列番号２によるこの蛋白質にも関する。
【００１６】
特に、本発明は、本発明による蛋白質のシグナル配列に関する。これは、好ましくは本発明による蛋白質のアミノ酸１〜１７である。本発明は、Ｎ−末端フラグメントをコードする核酸にも関する。これは、好ましくは、特に図１に記載の核酸配列１〜５１を有する本発明による核酸のフラグメントである。
【００１７】
本発明の更なる態様は、組換え型蛋白質の相同又は非相同発現のための、及び相同又は非相同組換え（“ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）、“遺伝子置換（ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）”）のための、本発明による酸加水分解酵素の核酸配列又はその一部の使用である。
【００１８】
本発明は、β−ヘキソースアミニダーゼをコードする本発明による核酸又はその一部が、相同又は非相同発現において、通常のエンハンサー、プロモーター、オペレーター、オリジン、ターミネーター、抗生物質耐性、又は他の核酸若しくはＤＮＡフラグメント、又はウイロイド（ｖｉｒｏｉｄｓ）、ウイルス、細菌、花虫類動物（ａｒｃｈｅｚｏａｎｓ）、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａｎｓ）、真菌、植物、動物若しくはヒトのいずれかの種類の配列と組み合わされる方法にも関する。
【００１９】
特に、本発明による核酸又はその一部は、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体若しくはミニクロモソーム（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、又はいずれかの種類の環状若しくは線状ＤＮＡ若しくはＲＮＡ内に挿入される。
【００２０】
当業者は、配列番号１による核酸と少なくとも４０％の相同性を有する核酸も、本発明により使用され得ることを理解するであろう。配列番号２による蛋白質もまた、その機能を損なうことなく変性され得るであろう。従って、例えば、アミノ酸のいわゆる保存的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）交換を行うこともできる。従って、例えば、疎水性アミノ酸が交換され得る。
【００２１】
繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼの精製及び単離のために、及びその配列の決定のために、以下の方法を使用することができる。これは、以下の実施例によって説明される。
【００２２】
【実施例】
実施例１
合計３．２リットルの細胞培養液から、末期の（ｌａｔｅ）対数的成長段階にある繊毛虫テトラヒメナの細胞を、４００ｍｌの飢餓培地（ｓｔａｒｖｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、細胞を攪拌しながら更に４時間インキュベートした。その後、細胞を含まない培養液の上清を採取し、孔径を小さくしたいくつかのフィルターによって濾過し、細かい（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）物質を全て取り除いた。濾液を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）超濾過セルによって濃縮し、次のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）のために、開始（ｓｔａｒｔｉｎｇ）バッファー中で再度緩衝液処理した。
【００２３】
回収されたクロマトグラフィー画分を、酸加水分解酵素、酸ホスファターゼ（ａＰＡｓｅ）及びβ−ヘキソースアミニダーゼ（β−Ｈｅｘ）に対して特異的な４−ニトロフェニル基質を用いて試験し、最も高いβ−Ｈｅｘ活性を有する画分を混合した。それらを、別のアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）超濾過によって濃縮し、アフィニティークロマトグラフィーのために開始バッファー中で再度緩衝液処理した。回収されたクロマトグラフィー画分の上記の酵素活性を試験し、酸加水分解酵素に対して最も高い活性を有する画分を混合し、リン酸塩バッファー（ＰＢ）中で再度緩衝液処理した。合計８回の精製から、加水分解酵素を含有するクロマトグラフィー画分を貯留し、濃縮し、分割し、更なる特徴化まで凍結させた。
【００２４】
このように精製された加水分解酵素の一部を、二次元ＳＤＳゲル電気泳動（合計８つのゲル）によって分離し、主なスポットをそれぞれ穴を開けて回収した。これらのゲル片に存在する蛋白質、β−Ｈｅｘを、蛋白質分解酵素トリプシンによって消化した。このように得られたペプチドフラグメントを、ゲル片から濾し出し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離した。ＨＰＬＣフラグメントの純度を、質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって試験し、純粋な画分、即ち、規定の質量のペプチドを一種のみ含有するものを、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解を用いてＮ−末端から配列決定した。
【００２５】
トリプシン消化によって得られたペプチドフラグメントの配列から、β−ヘキソースアミニダーゼに特異的なＰＣＲプライマーを得た。存在するβ−Ｈｅｘ配列との配列比較により、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーの組合せを予め選択することができた。この情報によって、ノーザンハイブリダイゼーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によってその品質を予め試験した、単離された全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを用いて最初の特異的ｃＤＮＡフラグメントを増幅して配列決定した。これらのフラグメントを用いて、更なるＰＣＲ実験に用いられる配列特異的プライマーを構成した。得られた各プライマー及び各部分配列を、データベース列（ｄａｔａ ｂａｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって確認し、更なる実験の前に、全ての見落とした（ｏｖｅｒｌｏｏｋｅｄ）ベクター配列も特に確認した。５´−及び３´−ＲＡＣＥによって、ｃＤＮＡ配列を５´−及び３´−末端で延長させた。このように完成されたβ−Ｈｅｘ ｃＤＮＡの配列は、その後、更なる配列分析の基礎として役立った。
【００２６】
繊毛虫からこのように得られたβ−ヘキソースアミニダーゼの配列は、図１に記載のように読まれる。合計で、この配列は、１６５６塩基対の長さを有するオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と共に、β−ヘキソースアミニダーゼの５´−及び３´−非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域を含む１８３６塩基対を含む。相補性アミノ酸配列は、５５１個のアミノ酸長さを有し、図２に記載のように読まれる。
【００２７】
β−ヘキソースアミニダーゼの配列は、合計９個のグリコシル化部位を有し、細胞のメカニズムの選別による酵素のターゲッティングのためのシグナルペプチド及びプロ配列（ｐｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を示す。
【図２】図１は、繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を示す（続き）。
【図３】図２は、配列番号１による核酸の対応する発現生成物を示す。[0001]
The present invention relates to nucleic acids encoding β-hexose aminidase.
[0002]
The expression of foreign proteins in microorganisms such as bacteria, yeast or mammalian cells is of great importance for the biotechnological preparation and production of recombinant proteins. Thus, bacterial expression systems based on E. coli or B. subtilis have been used to produce recombinant peptides such as insulin, interleukin-2, tissue plasminogen, activators, proteases or lipases. Or it is used for the production of proteins. In Gram-negative bacteria, the expression system is mainly based on the use of genetic components such as the lac operon or the tryptophan operon. Proteins that are heterologous to the host are produced when an expression system based on β-lactamase is used, either in intracellular “inclusion bodies” or in the periplasmic space. Is done. Purification of the recombinant protein in the surrounding fermentation medium has not been established. So far, Gram-positive bacteria have introduced and expressed proteins specific to almost exclusively cells.
[0003]
S. Yeasts such as S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis, or Pichia pastoris are also human factor XIIIa, bovine pro-chymosin, or surface antigen. It is used for heterologous expression of such a recombinant protein. In yeast, the expression system is based on a shuttle vector (a vector with both yeast and bacteria) composed of the genetic components of galacto-kinase-epimerase, acid phosphatase, or alcohol dehydrogenase. Generally, recombinant proteins are produced in the cytoplasm of a cell. If a yeast-specific signal sequence such as the alpha factor is used, the expressed protein can also be secreted into the fermentation medium. Glycosylation of secreted proteins is achieved by the "high mannose" form.
[0004]
Mammalian cells, such as various cells from rodents (CHO cells, C127 cells) or from simians (vero, CV-1 or COS cells), are also grouped. Used for heterologous expression of recombinant proteins. Here, the expression system is based on a recombinant virus (BPV vector) or a shuttle vector. For regulation of expression, the viral SV40 enhancer / promoter system or the enhancer component of the cell is used. Recombinant proteins, such as erythropoietin, are secreted into the fermentation medium because the heterologous gene usually provides their own signal sequence that is understood by the expression system and used for targeting. .
[0005]
In addition, ciliates such as Tetrahymena are used for biotechnological production of glycosylated extracellular enzymes. Ciliates will grow on inexpensive fermentation media using standard fermentation methods. For the transformation of such ciliates, vectors based on the ciliate Tetrahymena may be utilized. For heterologous expression of bacterial proteins in ciliates, a DNA construct consisting of genes from Tetrahymena is used. Where appropriate genetic components are available for the regulation of transcription, targeting, and glycosylation of heterologous proteins, ciliates are an ideal expression system for the inexpensive production of therapeutically useful recombinant proteins. is there.
[0006]
Gram-negative bacterial expression systems that have been used up to now usually cause the formation of "inclusion bodies" in cells with denaturation of the protein. In order to recover the recombinant protein, the cells must be lysed and the denatured inactive protein must be turned back to function. This results in additional cost-intensive process steps and reduces the yield of the desired protein. Glycosylation important for eukaryotic proteins is omitted altogether. When a Gram-positive bacterium expression system is used, degradation of the protein of interest by high proteolytic activity in the fermentation broth is a further problem.
[0007]
When yeast is used for heterologous expression, the desired protein of interest is often produced only inside cells, where it must be removed by cell lysis. In bacterial expression systems, this results in additional time and cost intensive method steps. If a yeast-specific signal peptide is used, the heterologous protein will not be correctly conjugated and glycosylated for secretion.
[0008]
In contrast, when a mammalian cell line is used for the production of recombinant protein, the desired protein is correctly conjugated and glycosylated, and is found in the extracellular state in the fermentation medium. The disadvantages here, however, are the incomplete treatment of the genes introduced into the genome of the production cell line by the viral vector and the low expression rate due to inefficient translation. On the other hand, serum-containing fermentation media for mammalian cells is very cost intensive. Also, fermentation techniques for shear-sensitive cell lines are complex and equally expensive because they constitute a bubble-free aeration. A further problem results from the high risk of contamination of cell lines from mycoplasmas and viruses. In general (All in all), the use of mammalian cells for biotechnological preparation of recombinant proteins results in very high costs, safety requirements and low yields.
[0009]
The use of ciliates, such as Tetrahymena, does not apply the above disadvantages in protein production. Thus, for example, some acid hydrolases involved in the digestion of food particles are transported from cells by high quality by complex glycosylation.
[0010]
Alam et al. Euk. Microbiol. 43 (4), 1996, pages 295-303, describes the cloning of a gene encoding acid α-glucosidase from Tetrahymena pyriformis. However, only a small portion of the protein is transported from the cell.
[0011]
However, until now, other heterologous glycosylated eukaryotic proteins could not be brought to expression in ciliates, which are also secreted into the fermentation medium. This is due to the fact that the DNA sequence from the secreted acid hydrolase specific to ciliates, which is necessary for constructing the expression vector, was not previously known.
[0012]
It is an object of the present invention to provide a DNA sequence for expression of ciliate secretory proteins. The DNA sequence will result in the heterologous protein in the expression system to be transported into the fermentation medium after transformation in ciliates. This system will also achieve high expression rates of heterologous proteins transported in large amounts from cells under culture conditions.
[0013]
This object is achieved by a system having the sequence of SEQ ID No. 1 (Seq. Id. No. 1) and using a nucleic acid encoding β-hexose aminidase.
[0014]
In particular, the DNA sequences according to the invention of β-hexose aminidase comprise signal and propeptides, and optionally further genetic components for protein targeting. The use of these sequences in a vector results in a heterologously expressed protein to be transported from the cell and thereby purified from the fermentation broth without cell lysis.
[0015]
FIG. 1 shows a nucleic acid encoding β-hexose aminidase from ciliates. FIG. 2 shows the corresponding expression product of the nucleic acid according to SEQ ID NO: 1. The invention also relates to this protein according to SEQ ID NO: 2.
[0016]
In particular, the invention relates to the signal sequence of the protein according to the invention. This is preferably amino acids 1 to 17 of the protein according to the invention. The present invention also relates to nucleic acids encoding the N-terminal fragment. This is preferably a fragment of a nucleic acid according to the invention, in particular having the nucleic acid sequences 1 to 51 according to FIG.
[0017]
Further aspects of the invention are for homologous or heterologous expression of recombinant proteins, and for homologous or heterologous recombination ("knock-out", "gene replacement"). Use of a nucleic acid sequence of an acid hydrolase according to the present invention or a part thereof.
[0018]
The present invention relates to a nucleic acid according to the present invention, which encodes a β-hexose aminidase, or a part thereof, which is used for homologous or heterologous expression. It also relates to methods for combining DNA fragments or sequences of any type of viroids, viruses, bacteria, archezoans, protozoans, fungi, plants, animals or humans.
[0019]
In particular, the nucleic acid according to the invention or a part thereof is inserted into a vector, plasmid, cosmid, chromosome or minichromosome, transposon, IS element, rDNA or any kind of circular or linear DNA or RNA. You.
[0020]
Those skilled in the art will appreciate that nucleic acids having at least 40% homology with the nucleic acids according to SEQ ID NO: 1 can also be used according to the invention. The protein according to SEQ ID NO: 2 could also be modified without impairing its function. Thus, for example, so-called conservative exchanges of amino acids can also be performed. Thus, for example, hydrophobic amino acids can be exchanged.
[0021]
The following methods can be used for the purification and isolation of β-hexose aminidase from ciliates and for its sequence determination. This is illustrated by the following example.
[0022]
【Example】
Example 1
From a total of 3.2 liters of cell culture, cells of the late logarithmic growth stage, Ciliate Tetrahymena, were placed in 400 ml of starving medium (10 mM Tris-HCl, pH 7.4). Washed and incubated the cells for another 4 hours with agitation. The supernatant of the cell-free culture was then collected and filtered through several filters of reduced pore size to remove any particulate material. The filtrate was concentrated by an Amicon ultrafiltration cell and re-buffered in starting buffer for the next ion exchange chromatography (IEC).
[0023]
The collected chromatographic fractions were tested using a 4-nitrophenyl substrate specific for acid hydrolase, acid phosphatase (aPAse) and β-hexose aminidase (β-Hex) and the highest β -The fractions with Hex activity were mixed. They were concentrated by another Amicon ultrafiltration and re-buffered in starting buffer for affinity chromatography. The collected chromatographic fractions were tested for the above enzymatic activity, the fractions having the highest activity for acid hydrolase were mixed and buffered again in phosphate buffer (PB). From a total of eight purifications, the chromatographic fractions containing the hydrolase were pooled, concentrated, split and frozen until further characterization.
[0024]
A part of the hydrolase thus purified was separated by two-dimensional SDS gel electrophoresis (eight gels in total), and the main spots were collected by making holes. The protein, β-Hex, present in these gel pieces was digested with the protease, trypsin. The peptide fragments thus obtained were filtered off from the gel pieces and separated by reverse phase HPLC (RP-HPLC). The purity of the HPLC fragments was tested by mass spectroscopy (MALDI-MS) and pure fractions, ie those containing only one peptide of defined mass, were separated from the N-terminus using Edman degradation. Sequenced.
[0025]
From the sequence of the peptide fragment obtained by trypsin digestion, PCR primers specific for β-hexose aminidase were obtained. Sequence comparisons with existing β-Hex sequences allowed the pre-selection of primer combinations for RT-PCR. With this information, the first specific cDNA fragment was amplified and sequenced using RT-PCR from isolated total RNA, whose quality had been previously tested by Northern hybridization. These fragments were used to construct sequence-specific primers for further PCR experiments. Each primer and each subsequence obtained was confirmed by data base alignment, and prior to further experiments, all overlooked vector sequences were also specifically confirmed. The cDNA sequence was extended at the 5'- and 3'-ends by 5'- and 3'-RACE. The sequence of the thus completed β-Hex cDNA then served as the basis for further sequence analysis.
[0026]
The sequence of β-hexose aminidase thus obtained from ciliates is read as described in FIG. In total, this sequence includes the 5'- and 3'-non-translated regions of β-hexose aminidase, with an open reading frame having a length of 1656 base pairs. Contains 1836 base pairs. The complementary amino acid sequence has a length of 551 amino acids and is read as described in FIG.
[0027]
The sequence of β-hexose aminidase has a total of 9 glycosylation sites and includes a signal peptide and prosequence for targeting the enzyme by sorting cellular mechanisms.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a nucleic acid encoding β-hexose aminidase from ciliates.
FIG. 1 shows a nucleic acid encoding β-hexose aminidase from ciliates (continued).
FIG. 2 shows the corresponding expression product of the nucleic acid according to SEQ ID NO: 1.
