JP2004361397A - Apparatus for measuring multiple kinds of ions - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an apparatus for measuring multiple kinds of ion in a water-based sample, capable of easily measuring the multiple kinds of ion with a single apparatus sensitively and accurately to an allowable extent. <P>SOLUTION: This apparatus for measuring the multiple kinds of ion in the water-based sample includes a substrate formed with a plurality of areas wherein a substance formed by mixing polyethylene glycol with an optode used for the measurement of an ion and the other components if the other components other than the optode are required for the measurement is immobilized on the substrate. A different optode for measuring a different ion is immobilized in each of the plurality of areas. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、水系試料中の複数種のイオンを測定できるイオン測定用器具に関する。   The present invention relates to an instrument for ion measurement that can measure a plurality of types of ions in an aqueous sample.

水道水等の飲料水、河川水や湖水等の農業用水等の水質検査の1つとして、各種イオン濃度を測定することが行われている。試料となる水が存在する野外等でその場で簡便、迅速に試料水中のイオンを測定するための手段として、水質試験紙、溶液目視比色キット及び簡易光度計等が用いられている。   BACKGROUND ART As one of water quality tests for drinking water such as tap water, agricultural water such as river water and lake water, various ion concentrations are measured. Water quality test papers, solution visual colorimetric kits, simple photometers, and the like have been used as a means for easily and quickly measuring ions in sample water in the field where water serving as a sample is present.

水質試験紙は、目的とするイオンに応答する指示薬(主に吸光試薬)を紙に塗布したものであり、試験紙を試料水に浸す又は試料水を試験紙に滴下すると、含まれるイオンの濃度に応じて試験紙の色が変化する。この変化から目視にて目的イオンの定量又は検出を行う。   Water quality test paper is a paper coated with an indicator (mainly a light absorption reagent) that responds to the target ion. When the test paper is immersed in the sample water or the sample water is dropped on the test paper, the concentration of the contained ions The color of the test paper changes according to the condition. From this change, the target ion is quantified or detected visually.

しかしながら、水質試験紙は、紙に吸着保持できる指示薬が限られている、1枚の試験紙で1種類のイオンしか測定できない、感度が低い、定量性が悪い等の欠点を有する。   However, the water quality test paper has drawbacks such that the indicator that can be absorbed and held on the paper is limited, only one type of ion can be measured with one test paper, the sensitivity is low, and the quantitativeness is poor.

これらの水質試験紙の問題を解決した水質検査用の器具として、溶液目視比色キットや、これに簡易な光度計を付加したものも用いられている。これらの器具では、膜剤と呼ばれるマトリックスに指示薬を混合したものを容器内壁に固相化し、測定時に試料及び必要な添加剤を加え、固相化した指示薬を溶出させて溶液中で反応を行う。この種の公知の水質検査器具では、膜剤としてポリ塩化ビニルが用いられている。   As an instrument for water quality inspection that has solved the problems of these water quality test papers, a solution visual colorimetric kit or a device to which a simple photometer is added is also used. In these instruments, a mixture of a matrix called a membrane agent and an indicator is immobilized on the inner wall of the container, and a sample and necessary additives are added during measurement, and the solidified indicator is eluted to perform a reaction in a solution. . In a known water quality testing instrument of this type, polyvinyl chloride is used as a film agent.

しかしながら、これらの器具では、一度に一成分のみしか測定できず、また、分析操作が測定成分毎に異なり、煩雑である。さらに、測定感度及び正確性も必ずしも満足することができない。   However, with these instruments, only one component can be measured at a time, and the analysis operation differs for each measurement component, which is complicated. Furthermore, measurement sensitivity and accuracy cannot always be satisfied.

太田宣秀、ぶんせき、661(2001)Nobuhide Ota, Bunseki, 661 (2001) 岡内完治“だれでもできるパックテストで環境しらべ”(2000),合同出版Kanji Okauchi “Environmental study with pack test that anyone can do” (2000), joint publication 東亜DKK“多項目水質計LASA1分析ハンドブック”,2002Toa DKK “Multi-item Water Quality Analyzer LASA1 Analysis Handbook”, 2002

本発明の目的は、単一の器具で複数種のイオンを簡便にかつ、許容できる程度に高感度に正確に測定することができる、水系試料中の複数種のイオン測定用器具を提供することである。   An object of the present invention is to provide an instrument for measuring multiple types of ions in an aqueous sample, which can easily and accurately measure multiple types of ions with a single instrument with high sensitivity to an acceptable level. It is.

本願発明者らは、鋭意研究の結果、膜剤としてポリエチレングリコールを用いることにより、水系試料中のイオンを許容できる程度に高感度に正確に測定することができることを見出し、さらに、測定に用いられるオプトード、及び測定に前記オプトード以外の他の成分が必要な場合には該他の成分をポリエチレングリコール中に含めて固相化することにより、複数種のイオンを簡便に測定することができ、さらに、マイクロプレートのような1枚のプレートに複数の反応領域を設けることができる基体を用いることにより、単一の器具で複数種のイオンが測定可能であることに想到し、本発明を完成した。   The present inventors have conducted intensive studies and found that, by using polyethylene glycol as a film agent, ions in an aqueous sample can be accurately measured with high sensitivity to an acceptable level, and further used for measurement. If the optode and other components other than the optode are required for the measurement, by immobilizing the other components in polyethylene glycol and immobilizing the same, it is possible to easily measure a plurality of types of ions. By using a substrate such as a microplate capable of providing a plurality of reaction regions on a single plate, the present inventors have conceived that multiple types of ions can be measured with a single instrument, and completed the present invention. .

すなわち、本発明は、イオンの測定に用いられるオプトード、及び前記測定に前記オプトード以外の他の成分が必要な場合には該他の成分を、ポリエチレングリコールと混合したものを基体上に固相化した領域が複数形成された基体を含み、前記複数の各領域には、異なるイオンを測定するための異なるオプトードが固相化されている、水系試料中の複数種のイオン測定用器具を提供する。   That is, the present invention provides an optode used for measurement of ions, and when other components other than the optode are required for the measurement, a mixture of the other components with polyethylene glycol immobilized on a substrate. A plurality of types of ion measuring instruments in an aqueous sample, wherein the plurality of areas include a substrate on which a plurality of regions are formed, and a plurality of different optodes for measuring different ions are immobilized on each of the plurality of regions. .

本発明の器具を用いると、単一の器具で複数種のイオンを簡便にかつ許容できる程度に高感度に正確に測定することができる。   By using the device of the present invention, a single device can easily and accurately measure a plurality of types of ions with high sensitivity to an acceptable level.

本発明の器具を適用する試料としては、水を主成分とする水系試料であれば何ら限定されるものではなく、水道水、井戸水等の飲料水、河川水、湖水等の農業用水や、海水、さらには各種の人工飲料や食品、体液(血液、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液等)これらの希釈物、懸濁水、水溶液等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。   The sample to which the instrument of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a water-based sample containing water as a main component, and is used for drinking water such as tap water and well water, river water, agricultural water such as lake water, and sea water. Further, various artificial drinks and foods, body fluids (blood, serum, plasma, lymph, urine, saliva, tissue fluid, cerebrospinal fluid, wiping fluid, etc.), dilutions thereof, suspension water, aqueous solutions, etc. can be exemplified. It is not limited to these.

測定すべきイオンも何ら限定されるものではなく、河川水中の主なイオンであるCa2+、Mg2+、環境基準が定められているF-、BO3 3-、Cd2+、Pb2+、Cr6+、Hg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、H+、As5+、NO3 -、NH4 +、農業用水中の含有量のモニタリングが必要とされているNO2 -、PO4 3-及びK+、その他H+、Cd2+、Pb2+、Cr6+、As5+等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。なお、本発明において、「イオンの測定」とは、イオンの検出又はイオンの濃度の測定(すなわち、イオンの定量若しくは半定量)を意味する。 To be measured ions is not limited in any way, Ca 2+ is a major ions in river water, Mg 2+, environmental standards have been established F -, BO 3 3-, Cd 2+, Pb 2 +, Cr 6+, Hg 2+, Zn 2+, Fe 3+, Cu 2+, Mn 2+, H +, As 5+, NO 3 -, NH 4 +, monitoring the content of agricultural water Required NO 2 , PO 4 3− and K + , other H + , Cd 2+ , Pb 2+ , Cr 6+ , As 5+ and the like, but are not limited thereto. is not. In the present invention, “measurement of ions” means detection of ions or measurement of the concentration of ions (that is, quantitative or semi-quantitative determination of ions).

上記の通り、本発明の複数種のイオン測定用器具は、イオンの測定に用いられるオプトード及び必要な添加剤を、ポリエチレングリコールに混合したものを基体上に固相化した領域を含む。   As described above, the plural kinds of instruments for ion measurement of the present invention include a region in which an optode used for ion measurement and necessary additives are mixed with polyethylene glycol and immobilized on a substrate.

ここで、オプトードとは、測定すべきイオンと反応して、その光化学的性質(吸光、蛍光、偏光、散乱、屈折等)を変化させる物質のことであり、代表的なものはいわゆる指示薬である。目的のイオンを測定するためのオプトードは、各イオンについてそれぞれ公知であり、また、そのオプトードを用いるイオンの測定に必要な添加剤も公知であり、本発明では、公知のオプトード及び添加剤を用いることができる。また、単一のイオンを測定するために、複数のオプトードを用いてもよい。測定可能なpH域が異なる複数のオプトードを組み合わせて用いることにより、広範囲のpH域での測定が可能になる。単一のイオンを測定するために、複数のオプトードを用いる場合、該複数のオプトードは、通常、それぞれ異なる領域に固相化されるが、同一領域に固相化した場合でも検量線が作製可能なオプトードの組合せの場合には同一領域に固相化することもできる。   Here, the optode is a substance that reacts with the ion to be measured and changes its photochemical properties (absorption, fluorescence, polarization, scattering, refraction, etc.), and a typical one is a so-called indicator. . The optode for measuring the target ion is known for each ion, and additives necessary for measuring ions using the optode are also known.In the present invention, a known optode and a known additive are used. be able to. Also, multiple optodes may be used to measure a single ion. By using a plurality of optodes having different measurable pH ranges in combination, measurement in a wide range of pH ranges becomes possible. When multiple optodes are used to measure a single ion, the optodes are usually immobilized on different regions, but a calibration curve can be created even when immobilized on the same region. In the case of a suitable combination of optodes, they can be immobilized on the same region.

各イオンの測定に用いられるオプトード及び添加剤の好ましい例として、下記表1に示すものを挙げることができる。もっとも、各イオンの測定に用いることができるオプトード及び添加剤は、これらに限定されるものではない。   Preferred examples of optodes and additives used for measurement of each ion include those shown in Table 1 below. However, optodes and additives that can be used for measuring each ion are not limited to these.

Figure 2004361397
Figure 2004361397

本発明の器具では、オプトード以外の他の成分(いわゆる添加剤)が測定に必要な場合には該他の成分(添加剤)もオプトードと共に固相化される。添加剤の例としては、上記表1に示されるように、緩衝剤、他のイオンとの反応をマスクするマスキング剤、オプトードどイオンとの反応のために必要な還元剤及び結合剤、並びに発色のために必要な発色剤及び発色安定剤を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。オプトード以外の添加剤も、基体上に固相化しておくことにより、測定は水系試料を基体に添加するだけで行うことができ、簡便で好ましい。   In the device of the present invention, when other components (so-called additives) other than the optode are required for measurement, the other components (additives) are also immobilized together with the optode. Examples of the additives include a buffering agent, a masking agent for masking the reaction with other ions, a reducing agent and a binder necessary for the reaction with optode and the like, and a coloring, as shown in Table 1 above. Coloring agents and color stabilizers required for the above are not limited thereto. By immobilizing additives other than optode on the substrate, the measurement can be performed simply by adding the aqueous sample to the substrate, which is simple and preferable.

上記したオプトード及び必要な添加剤は、ポリエチレングリコールと混合し、該混合物を基体上に固相化する。ポリエチレングリコールは、いわゆる膜剤として用いるものである。膜剤としてポリエチレングリコールを用いることは本発明の重要な特徴である。ポリエチレングリコールにオプトード及び必要な添加剤を封入して基体上に固相化すると、使用前は、オプトード及び添加剤の保存性が良好であり、使用時には、ポリエチレングリコールが溶解してオプトード及び添加剤が良好に溶出し、しかも、溶解したポリエチレングリコールがオプトードとイオンとの反応を妨害せず、さらに、無色透明であるため測定も妨害せず、その結果、測定を感度良く正確に行うことができる。   The above-mentioned optode and necessary additives are mixed with polyethylene glycol, and the mixture is immobilized on a substrate. Polyethylene glycol is used as a so-called film agent. The use of polyethylene glycol as a membrane agent is an important feature of the present invention. When optode and necessary additives are encapsulated in polyethylene glycol and immobilized on a substrate, the storage stability of optode and additives is good before use, and when used, polyethylene glycol dissolves and optode and additives are used. Is well eluted, and furthermore, the dissolved polyethylene glycol does not interfere with the reaction between the optode and the ion, and furthermore, because it is colorless and transparent, does not interfere with the measurement. As a result, the measurement can be performed with high sensitivity and accuracy. .

なお、NO3 -の測定は、表1に示す成分を固相化し、これに試料を添加して行なってもよいが、試料を予め金属亜鉛で処理してNO2 -に還元し、還元処理済みの試料をNO2 -測定用の領域に添加してその光化学的変化に基づき測定を行うこともできる(下記実施例参照)。この場合、金属亜鉛として、顆粒状の金属亜鉛を用い、これをマイクロピペットのチップに充填し、このチップを用いて試料を添加することが簡便で好ましい(下記実施例参照)。 Incidentally, NO 3 - Measurements of the components shown in Table 1 immobilized, this sample may be performed by adding to it, NO 2 is treated beforehand with metallic zinc sample - it was reduced to reduction treatment the already sample NO 2 - can also be added to the region for measurement performing measurement based on the photochemical changes (see examples below). In this case, it is convenient and preferable to use granular zinc metal as the zinc metal, fill this into the tip of a micropipette, and add the sample using the tip (see Examples below).

本発明で用いるポリエチレングリコールの重合度(重縮合しているエチレングリコール単位の数)は、特に限定されないが、試薬類の保存性と水中への溶解性の観点から、500〜2000程度が好ましく、特に800〜1200程度が好ましい。   The polymerization degree (the number of polycondensed ethylene glycol units) of the polyethylene glycol used in the present invention is not particularly limited, but is preferably about 500 to 2,000 from the viewpoint of storage stability of the reagents and solubility in water. In particular, about 800 to 1200 is preferable.

固相化は、オプトード、必要な添加剤及びポリエチレングリコールを水に溶かして混合し、得られた混合液を基体上に塗布し、乾燥させることにより容易に行うことができる。固相化するオプトード及び添加剤の量は、所定量の試料に溶解した際に、各試薬が適切な濃度となる量であり、オプトード及び添加剤の種類並びに測定すべきイオンの種類に応じて、公知の情報に基づき、又はルーチンな実験により適宜設定することができる。固相化されるポリエチレングリコールの量は、特に限定されないが、所定量の試料に全量が溶解した場合の濃度が通常、0.001〜0.1重量%程度、好ましくは0.005〜0.2重量%程度になる量である。   The solid phase can be easily formed by dissolving optode, necessary additives and polyethylene glycol in water and mixing the resulting mixture, applying the resulting mixture on a substrate, and drying the mixture. The amount of the optode and additive to be immobilized is an amount such that each reagent has an appropriate concentration when dissolved in a predetermined amount of a sample, and depends on the type of optode and additive and the type of ion to be measured. It can be set as appropriate based on known information or through routine experiments. The amount of polyethylene glycol to be solid-phased is not particularly limited, but the amount is such that the concentration when the entire amount is dissolved in a predetermined amount of the sample is usually about 0.001 to 0.1% by weight, preferably about 0.005 to 0.2% by weight. is there.

なお、膜剤は、ポリエチレングリコールのみから成ることが好ましいが、測定の感度及び正確性に悪影響を与えない範囲ならば少量の他の成分や不純物を含有していてもよい。このような他の成分や不純物の合計量は、悪影響がない範囲であれば特に限定されないが、通常、ポリエチレングリコールに対して10重量%以下、好ましくは5重量%以下である。また、ポリエチレングリコールは、エチレングリコール単位のみが重縮合したものであることが好ましいが、測定の感度及び正確性に悪影響を与えない範囲ならば少量の他の単位が含まれていてもよい。このような他の単位の合計量は、悪影響がない範囲であれば特に限定されないが、通常、ポリエチレングリコールの全単位中、10モル%以下、好ましくは5モル%以下である。   The film agent is preferably composed only of polyethylene glycol, but may contain small amounts of other components and impurities as long as the sensitivity and accuracy of the measurement are not adversely affected. The total amount of such other components and impurities is not particularly limited as long as there is no adverse effect, but is usually 10% by weight or less, preferably 5% by weight or less based on polyethylene glycol. The polyethylene glycol is preferably a polycondensed ethylene glycol unit alone, but may contain a small amount of other units as long as the sensitivity and accuracy of the measurement are not adversely affected. The total amount of such other units is not particularly limited as long as there is no adverse effect, but is usually 10 mol% or less, preferably 5 mol% or less, in all units of the polyethylene glycol.

水質検査において、pHの測定は広く行われている項目であるので、前記したイオン測定のためのオプトードと同様に、pHを測定できるオプトードを固相化した領域を設けておくと、単一の器具でpHの測定まで行うことができるので便利である。この目的のためには、公知のpH指示薬を採用することができ、測定可能なpH範囲の異なる複数のpH指示薬を組み合わせて固相化しておくことにより、広範囲のpHが測定可能になる。また、水質検査に供される飲料水や農業用水のpHの範囲は、比較的限定されているので、検査に供される水について予測される範囲の中で、pKaが異なる複数のpH指示薬を組み合わせて用いることにより、その範囲内での測定精度を高めることができるので好ましい。このような目的に用いられる好ましい組合せの例として、ブロムクレゾールパープル(pKa 6.1)、ブロムチモールブルー(pKa7.2)及びクレゾールレッド(pKa 8.3)を挙げることができる。この組合せによれば、pH6.0〜8.5の範囲でpHを高精度に測定することができ、飲料水及び農業用水のpHは、ほとんどの場合この範囲内に入っている。なお、pH指示薬を組み合わせて用いる場合、各pH指示薬は、それぞれ別個の領域に固相化することが好ましい。pH指示薬の固相量は、特に限定されず、用いるpH指示薬の種類等に応じて適宜設定できるが、所定量の試料に全量が溶解した場合の濃度が通常、0.01〜0.1モル%程度になる量である。   In the water quality test, the measurement of pH is a widely performed item. Therefore, as in the case of the above-described optode for ion measurement, if a region in which an optode capable of measuring pH is provided is provided, a single region is provided. It is convenient because the measurement of pH can be performed with an instrument. For this purpose, a known pH indicator can be adopted, and a wide range of pH can be measured by combining and immobilizing a plurality of pH indicators having different measurable pH ranges. In addition, since the range of the pH of drinking water and agricultural water used for water quality testing is relatively limited, a plurality of pH indicators having different pKas can be used in the range expected for the water used for testing. It is preferable to use them in combination because measurement accuracy within the range can be increased. Examples of preferred combinations used for such a purpose include bromcresol purple (pKa 6.1), bromthymol blue (pKa7.2) and cresol red (pKa 8.3). According to this combination, the pH can be measured with high accuracy in the range of pH 6.0 to 8.5, and the pH of drinking water and agricultural water is almost always within this range. When a pH indicator is used in combination, it is preferable that each pH indicator is immobilized on a separate region. The amount of the solid phase of the pH indicator is not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of the pH indicator to be used, but the concentration when the entire amount is dissolved in a predetermined amount of the sample is usually about 0.01 to 0.1 mol%. Quantity.

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

実施例1 イオン及びpH測定用プレートの作製
下記表2に示す試薬類及び膜剤として重合度1000のポリエチレングリコール(Aldrich社製)を含む水溶液を、各イオン及びpH測定用の試薬類ごとにマイクロプレートのウェルに入れ(pH指示薬は、それぞれ別のウェルに入れた)、溶液の入ったマイクロプレートをデシケーター内で一晩減圧乾燥させた。作製されたプレートはプレートシールで封をし、測定までデシケーター内で保管した。なお、ウェルに入れた各試薬の量は、200μlの試料水で全量を溶解した際にそれぞれ表2に示す濃度となる量であった。また、ウェルに入れたポリエチレングリコールの量は、200μlの試料水で全量を溶解した際に0.01重量%となる量であった。なお、試薬類は全て市販のものを用いた。
Example 1 Preparation of ion and pH measurement plate An aqueous solution containing polyethylene glycol (manufactured by Aldrich) having a degree of polymerization of 1000 as a film agent and a film agent as shown in Table 2 below was applied to each ion and pH measurement reagent. The plate was placed in the wells (pH indicators were placed in separate wells), and the microplate containing the solution was dried under reduced pressure in a desiccator overnight. The prepared plate was sealed with a plate seal and stored in a desiccator until measurement. The amount of each reagent placed in the well was such that each had the concentration shown in Table 2 when the whole amount was dissolved in 200 μl of sample water. The amount of polyethylene glycol put in the well was 0.01% by weight when the whole amount was dissolved in 200 μl of sample water. All reagents used were commercially available.

Figure 2004361397
Figure 2004361397

標準イオン水溶液の測定
実施例1で作製したイオン及びpH測定用プレートを用いてイオンが測定できることを確認するために、既知の種々の濃度の測定イオンをそれぞれ1種類含む水溶液を表2に示す各イオン種について調製した。各イオンの濃度は、後述する図1ないし図7に記載されている。なお、イオン濃度の表示で、例えば「5.0E-05」という表示は、5.0 x 10-5 Mを意味する。また、表2に示す各イオン種を含む各水溶液の調製に用いた塩は、それぞれ、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、フッ化ナトリウム、ホウ酸、亜硝酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム及び塩化カリウムであった。
Measurement of Standard Ion Aqueous Solution In order to confirm that the ions prepared in Example 1 and the ions can be measured using the pH measurement plate, an aqueous solution containing one type of each of the known ions having various known concentrations is shown in Table 2. Prepared for ionic species. The concentration of each ion is described in FIGS. 1 to 7 described later. In the display of the ion concentration, for example, “5.0E-05” means 5.0 × 10 −5 M. The salts used for preparing the aqueous solutions containing the respective ionic species shown in Table 2 were calcium chloride, magnesium chloride, sodium fluoride, boric acid, sodium nitrite, potassium dihydrogen phosphate, and potassium chloride, respectively. Was.

200μlの水溶液をマイクロピペッターで取り、それぞれのイオンに対応するマイクロプレートのウェルに注入した。このとき、同じ濃度の溶液を4つのウェルに注入した。プレートをマイクロプレートリーダーの撹拌機能にて1分間撹拌し、試薬を溶解した後、5分間放置して反応を完了させた。その後、再び1分間撹拌して溶液を均一にし、マイクロプレートリーダーで吸光スペクトルを測定した。   200 μl of the aqueous solution was taken with a micropipettor and injected into the wells of the microplate corresponding to each ion. At this time, solutions of the same concentration were injected into four wells. The plate was stirred for 1 minute with a stirring function of a microplate reader to dissolve the reagent, and then left for 5 minutes to complete the reaction. Thereafter, the solution was stirred again for 1 minute to make the solution uniform, and the absorption spectrum was measured with a microplate reader.

各イオン濃度に対し、ウェルごとに定めた波長における吸光度をプロットし、検量線を描いた。吸光度は4つのウェルの平均値とし、その標準偏差値からエラーバーを作成した。検量線は、試薬と測定イオンが1対1で応答すると仮定し、理論式より描いた。この式は以下の通りである。   For each ion concentration, the absorbance at a wavelength determined for each well was plotted, and a calibration curve was drawn. The absorbance was an average value of four wells, and an error bar was created from the standard deviation value. The calibration curve was drawn from the theoretical formula, assuming that the reagent and the measured ion responded one-to-one. This equation is as follows.

指示薬Iに対し、測定イオン A が次の反応によって応答する。
I + A ⇔ IA [I: 指示薬、 A: 測定イオン]
このときの平衡定数 Ka は、
Ka = [IA] / [I][A]
指示薬およびイオンの総量は、以下のとおりである。
Itot = [I] + [IA]、 Atot = [A] + [IA]
一方、定数α を次のように定義すると、下の式が成り立つ。
α = [IA] / Itot = (Abs Absfree) / (AbsA Absfree) ・・・ (1)
[Abs: 吸光度、 Absfree: イオンフリー、 AbsA: 飽和]
Ka = α / [(1 α) (Atot α Itot)] ・・・ (2)
このときの各濃度は、
[I] = Itot [IA]、 [A] = Atot [IA]
(2)式に代入すると、錯形成定数 Ka は、
Ka = [IA] / {(Itot [IA]) (Atot [IA])} ・・・ (3)
(1)式から、
A = [IA] (AA Afree) / Itot + Afree ・・・ (4)
The measurement ion A responds to the indicator I by the following reaction.
I + A ⇔ IA [I: indicator, A: measured ion]
The equilibrium constant K a for this case,
K a = [IA] / [ I] [A]
The total amount of indicators and ions is as follows.
I tot = [I] + [IA], A tot = [A] + [IA]
On the other hand, if the constant α is defined as follows, the following equation holds.
α = [IA] / I tot = (Abs Abs free ) / (Abs A Abs free ) ・ ・ ・ (1)
[Abs: Absorbance, Abs free : Ion-free, Abs A : Saturation]
K a = α / [(1 α) (A tot α I tot )] ・ ・ ・ (2)
Each concentration at this time is
[I] = I tot [IA], [A] = A tot [IA]
(2) is substituted into equation complex formation constant K a is
K a = [IA] / {(I tot [IA]) (A tot [IA])} ・ ・ ・ (3)
From equation (1),
A = [IA] (A A A free ) / I tot + A free・ ・ ・ (4)

Lambert-Beer の法則に従って、測定された吸光度Abs、Absfree、および AbsA よりαを求め (1)、見かけの平衡定数 Ka を算出した (2)。その値をもとに (3)、(4) 式から 吸光度の理論値を計算し、検量線を描いた。
測定値のばらつき(エラーバーの大きさ)、検量線の傾き、機械の精度を考慮し、各ウェルの検量範囲を定めた。
According to the law of Lambert-Beer, measured absorbance Abs, Abs free, and Abs A more seeking alpha (1), to calculate the equilibrium constant K a for the apparent (2). Based on these values, theoretical values of absorbance were calculated from equations (3) and (4), and a calibration curve was drawn.
The calibration range of each well was determined in consideration of the dispersion of the measured values (the size of the error bar), the inclination of the calibration curve, and the precision of the machine.

結果を図1ないし図7に示す。各図には、吸光スペクトルと、検量線が描かれている。検量線のうち、プロットが実線で結ばれている領域が、上記した検量範囲である。また、それぞれの吸光スペクトルにおいて、ピーク波長における吸光度は、イオンフリー(イオン濃度0)が最低であり、イオン濃度が高いほど吸光度は大きくなった(マグネシウムイオン添加の場合、イオン濃度の増加に伴い、吸光度は減少した)。したがって、実施例1のプレートにより、各イオンが簡便に測定可能であることがわかる。   The results are shown in FIGS. Each drawing shows an absorption spectrum and a calibration curve. In the calibration curve, a region where the plots are connected by a solid line is the above-described calibration range. In each absorption spectrum, the absorbance at the peak wavelength was the lowest in ion-free (ion concentration 0), and the higher the ion concentration, the larger the absorbance (in the case of magnesium ion addition, with the increase in ion concentration, Absorbance decreased). Therefore, it is understood that each ion can be easily measured by the plate of Example 1.

pHの測定
実施例1で作製したプレートでpHを測定することが可能であることを確認するために、pH測定試験用の標準水溶液を調製した。標準水溶液は、次のとおりであった。
(1) ブロムクレゾールパープル用
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 Mクエン酸(pH 4.0〜5.4)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M MES(pH 5.8〜7.8)
(2) ブロムチモールブルー用
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 Mクエン酸(pH 5.4)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M MES(pH 5.8〜7.8)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M ホウ酸(pH 8.0〜9.0)
(3) クレゾールレッド用
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M MES(pH 6.4〜7.8)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M ホウ酸(pH 8.0〜10.0)
(TMACl: テトラメチルアンモニウムクロライド
TMAOH: テトラメチルアンモニウムヒドロキシド
MES: 2-モルフォリノエタンスルホン酸
Measurement of pH In order to confirm that it is possible to measure pH with the plate prepared in Example 1, a standard aqueous solution for a pH measurement test was prepared. The standard aqueous solution was as follows.
(1) For bromcresol purple
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M citric acid (pH 4.0-5.4)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M MES (pH 5.8-7.8)
(2) For bromthymol blue
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M citric acid (pH 5.4)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M MES (pH 5.8-7.8)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M boric acid (pH 8.0-9.0)
(3) For cresol red
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M MES (pH 6.4-7.8)
0.1 M TMACl + 0.1 M TMAOH + 0.01 M boric acid (pH 8.0 to 10.0)
(TMACl: Tetramethylammonium chloride
TMAOH: Tetramethylammonium hydroxide
MES: 2-morpholinoethanesulfonic acid

実施例2と同じ操作を行い、各ウェルの吸光スペクトルを測定した。   The same operation as in Example 2 was performed, and the absorption spectrum of each well was measured.

結果を図8〜10に示す。各図には、吸光スペクトルと、検量線が描かれている。検量線のうち、プロットが実線で結ばれている領域が、pHの測定可能域である。図8〜10において、ピークの吸光度は、いずれの場合もpHが高くなるほど大きくなっている。したがって、実施例1のプレートにより、pHが簡便に測定可能であることがわかる。また、実施例1のプレートには、pKaが異なる3種類のpH指示薬が固相化されているので、図8〜10からわかるように、pH5.0〜9.0の範囲でpH測定が可能であり、飲料水や農業用水の水質検査用には十分である。   The results are shown in FIGS. Each drawing shows an absorption spectrum and a calibration curve. In the calibration curve, the area where the plots are connected by a solid line is the pH measurable area. 8 to 10, in each case, the absorbance of the peak increases as the pH increases. Therefore, it can be seen that the pH of the plate of Example 1 can be easily measured. In addition, since three types of pH indicators having different pKas are immobilized on the plate of Example 1, the pH can be measured in the range of pH 5.0 to 9.0, as can be seen from FIGS. However, it is sufficient for water quality testing of drinking water and agricultural water.

実施例1で作製したプレートを用い、実施例2記載の方法により、実際の河川水(鶴見川及び矢上川)中の各イオン濃度及びpHを測定した。比較のため、高精度であるが操作が煩雑な公知のイオンクロマトグラフィー法(IC)によってもイオン濃度を測定した。また、pHは、ガラス電極を用いたpHメーターによっても測定した。結果を下記表3及び表4に示す。表3が鶴見川についての結果、表4が矢上川についての結果を示す。   Using the plate prepared in Example 1, the respective ion concentrations and pH in actual river water (Tsurumi River and Yagami River) were measured by the method described in Example 2. For comparison, the ion concentration was also measured by a known ion chromatography method (IC) which was highly accurate but complicated in operation. The pH was also measured by a pH meter using a glass electrode. The results are shown in Tables 3 and 4 below. Table 3 shows the results for the Tsurumi River, and Table 4 shows the results for the Yagami River.

Figure 2004361397
Figure 2004361397

Figure 2004361397
*1: IC法の検出範囲外
*2: 検出せず
Figure 2004361397
* 1: Out of detection range of IC method * 2: Not detected

以上の結果から、実施例1で作製したプレートにより、簡便に各種イオン及びpHを測定できることがわかる。   From the above results, it can be seen that various ions and pH can be easily measured using the plate prepared in Example 1.

下記表5に示す試薬類を用いることを除き、実施例1と同様にしてプレートを作製した。もっとも、NO3 -の測定に用いられる金属亜鉛は、プレートの領域に固相化したのではなく、マイクロピペットのチップ内に顆粒状の金属亜鉛を充填し、このチップを用いて試料を分注した。この場合、試料をチップ内に吸引し、そのまま室温で3分間放置して十分に還元反応を行なわせた後、固相化領域に添加した。 A plate was prepared in the same manner as in Example 1, except that the reagents shown in Table 5 below were used. However, NO 3 - is metallic zinc used in the measurement of, rather than immobilized in the region of the plate, the granular metallic zinc is filled in a micropipette tip, the sample using the chip dispensing did. In this case, the sample was aspirated into the chip, left at room temperature for 3 minutes to allow a sufficient reduction reaction, and then added to the solid-phased region.

Figure 2004361397
Figure 2004361397

測定に供した標準試料は、塩化アンモニウム水溶液及び硝酸カリウム水溶液であり、各水溶液の濃度は50mM〜1μMであった。これらの標準試料を用い、実施例2と同様にして測定を行った。ただし、マイクロプレートリーダーの撹拌機能を駆使した撹拌後の放置時間は15分間とした。また、波長350〜700nmの範囲で、4nm間隔で吸光度を測定した。   The standard samples used for the measurement were an aqueous ammonium chloride solution and an aqueous potassium nitrate solution, and the concentration of each aqueous solution was 50 mM to 1 μM. The measurement was performed in the same manner as in Example 2 using these standard samples. However, the standing time after stirring using the stirring function of the microplate reader was 15 minutes. The absorbance was measured at a wavelength of 350 to 700 nm at intervals of 4 nm.

アンモニウムイオンの測定における、各濃度の標準試料に対する波長と吸光度の関係を図11−1及び図11−2に示す。また、波長705nm及び710nmにおける、アンモニウムイオン濃度の対数と吸光度の関係を示す検量線を図12−1及び図12−2に示す。[NH4 +]=1×10-4M を境に最大吸収波長がシフトし、またこの濃度よりも低い濃度の場合は、波長=705 nm において濃度が低くなれば吸光度も低下するのだが、高い濃度の場合は、波長= 710 nm において濃度が低くなれば吸光度が増大する。そして [NH4 +]=1×10-4M のところで最大吸収をむかえる。したがってこの2つの波長それぞれの検量線をかいた(図12−1及び図12−2)。波長 710 nm と 705 nm のところの吸光度を比較し、どちらか大きい方の吸光度をしめす検量線から濃度を調べればよい。およそ 5.0 × 10-2〜 5.0 × 10-6Mの濃度範囲で測定が可能であることがわかる。 FIGS. 11A and 11B show the relationship between the wavelength and the absorbance for each concentration of the standard sample in the measurement of ammonium ions. In addition, calibration curves showing the relationship between the logarithm of the ammonium ion concentration and the absorbance at wavelengths of 705 nm and 710 nm are shown in FIGS. 12-1 and 12-2. The maximum absorption wavelength shifts around [NH 4 + ] = 1 × 10 -4 M, and when the concentration is lower than this concentration, the absorbance decreases as the concentration decreases at the wavelength of 705 nm. At higher concentrations, the absorbance increases at lower wavelengths at 710 nm. Then, maximum absorption is achieved at [NH 4 + ] = 1 × 10 −4 M. Therefore, calibration curves for these two wavelengths were drawn (FIGS. 12-1 and 12-2). The absorbance at 710 nm and 705 nm can be compared, and the concentration can be determined from the calibration curve that shows the larger absorbance. It can be seen that measurement is possible in a concentration range of about 5.0 × 10 −2 to 5.0 × 10 −6 M.

また、硝酸イオンの測定における、各濃度の標準試料に対する波長と吸光度の関係を図13−1に示す。また、波長512nmにおける、硝酸イオン濃度の対数と吸光度の関係を示す検量線を図13−2に示す。図13−2の検量線から明らかなようにおよそ 2.5 × 10-2〜 1.0 × 10-4Mの範囲内では検量線は右肩上がりであり、この範囲で硝酸イオン濃度の測定が可能であることが明らかになった。 FIG. 13A shows the relationship between the wavelength and the absorbance for the standard sample at each concentration in the measurement of nitrate ions. FIG. 13B shows a calibration curve showing the relationship between the logarithm of the nitrate ion concentration and the absorbance at a wavelength of 512 nm. As is evident from the calibration curve of FIG. 13-2, the calibration curve rises to the right within the range of about 2.5 × 10 −2 to 1.0 × 10 −4 M, and the nitrate ion concentration can be measured in this range. It became clear.

実施例1で作製したプレートを用いてCa2+を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when Ca 2+ is measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレートを用いてMg2+を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when Mg 2+ is measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレートを用いてF-を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when F is measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレートを用いてBO3 3-を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when BO 3 3- was measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレートを用いてNO2 -を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when NO 2 is measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレートを用いてPO4 3-を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when PO 4 3- was measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレートを用いてK+を測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when K + is measured using the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレート中のブロムクレゾールパープル固相化領域を用いてpHを測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when pH is measured using a bromcresol purple solid phase immobilized region in the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレート中のブロムチモールブルー固相化領域を用いてpHを測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when pH is measured using a bromthymol blue immobilized region in the plate prepared in Example 1. 実施例1で作製したプレート中のクレゾールレッド固相化領域を用いてpHを測定した場合の吸光スペクトル及び検量線を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing an absorption spectrum and a calibration curve when pH is measured using a cresol red solid phase immobilized region in the plate prepared in Example 1. 実施例5で作製したプレートを用いてアンモニウムイオンを測定した場合の吸光スペクトルを示す図である。FIG. 14 is a diagram showing an absorption spectrum when ammonium ions are measured using the plate prepared in Example 5. 実施例5で作製したプレートを用いてアンモニウムイオンを測定した場合の吸光スペクトルを示す図である。FIG. 14 is a diagram showing an absorption spectrum when ammonium ions are measured using the plate prepared in Example 5. 実施例5で作製したプレートを用いてアンモニウムイオンを測定した場合の検量線を示す図である。FIG. 14 is a diagram showing a calibration curve when ammonium ions are measured using the plate prepared in Example 5. 実施例5で作製したプレートを用いてアンモニウムイオンを測定した場合の検量線を示す図である。FIG. 14 is a diagram showing a calibration curve when ammonium ions are measured using the plate prepared in Example 5. 実施例5で作製したプレートを用いて硝酸イオンを測定した場合の吸光スペクトルを示す図である。FIG. 13 is a diagram showing an absorption spectrum when nitrate ions are measured using the plate prepared in Example 5. 実施例5で作製したプレートを用いて硝酸イオンを測定した場合の検量線を示す図である。FIG. 14 is a diagram showing a calibration curve when nitrate ions are measured using the plate prepared in Example 5.

Claims (9)

イオンの測定に用いられるオプトード、及び前記測定に前記オプトード以外の他の成分が必要な場合には該他の成分を、ポリエチレングリコールと混合したものを基体上に固相化した領域が複数形成された基体を含み、前記複数の各領域には、異なるイオンを測定するための異なるオプトードが固相化されている、水系試料中の複数種のイオン測定用器具。   When the optode used for the measurement of ions and other components other than the optode are required for the measurement, a plurality of regions in which the other components are mixed with polyethylene glycol and immobilized on the substrate are formed. A plurality of types of ion measuring instruments in an aqueous sample, wherein the plurality of regions include solid-phased different optodes for measuring different ions. 前記ポリエチレングリコールの重合度が500〜2000である請求項1記載の器具。   The device according to claim 1, wherein the degree of polymerization of the polyethylene glycol is 500 to 2,000. pHの測定に用いられるオプトードをポリエチレングリコールと混合したものを前記基体上に固相化した領域をさらに含み、pHの測定も行うことができる請求項1又は2記載の器具。   The device according to claim 1 or 2, further comprising a region in which an optode used for pH measurement mixed with polyethylene glycol is immobilized on the substrate, and the pH can be measured. 前記他の成分が、緩衝剤、マスキング剤、還元剤、結合剤、発色剤及び発色安定剤から成る群より選ばれる少なくとも1種である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の器具。   The device according to any one of claims 1 to 3, wherein the other component is at least one selected from the group consisting of a buffer, a masking agent, a reducing agent, a binder, a color former, and a color stabilizer. Ca2+、Mg2+、F-、BO3 3-、NO2 -、PO4 3-、K+及びNH4 +から成る群より選ばれる少なくとも2種のイオンを測定する領域を含む請求項1ないし4のいずれか1項に記載の器具。 Ca 2+, Mg 2+, F - , BO 3 3-, NO 2 -, PO 4 3-, claim including a region measuring at least two ion selected from K +, and the group consisting of NH 4 + The device according to any one of claims 1 to 4. 前記基体がマイクロプレートであり、前記複数の領域のそれぞれが、マイクロプレートの各ウェル内に形成されている請求項1ないし5のいずれか1項に記載の器具。   The device according to any one of claims 1 to 5, wherein the substrate is a microplate, and each of the plurality of regions is formed in each well of the microplate. 請求項1ないし7のいずれか項に記載の器具上の前記複数の領域に、水系試料を加え、該領域の光化学的性質の変化に基づき前記水系試料中の複数種のイオンを測定する、水系試料中の複数種のイオン測定方法。   An aqueous system comprising: adding an aqueous sample to the plurality of regions on the instrument according to any one of claims 1 to 7; and measuring a plurality of types of ions in the aqueous sample based on a change in photochemical properties of the region. A method for measuring multiple types of ions in a sample. 前記水系試料を亜鉛で処理することにより還元した後、得られた還元試料を、NO2 -測定用の領域に添加して水系試料中のNO3 -濃度を測定することを含む請求項7記載の方法。 After reduction by treating the aqueous sample with zinc, the resulting reduced samples, NO 2 - claim 7, comprising measuring the concentration - NO 3 of the addition to the region for measurement aqueous sample the method of. 顆粒状の金属亜鉛をマイクロピペットのチップの中に充填し、該チップを用いて前記水系試料をNO2 -測定用の領域に添加することを含む請求項8記載の方法。

9. The method according to claim 8, comprising filling granular zinc metal into a tip of a micropipette, and using the tip to add the aqueous sample to an area for NO 2 - measurement.

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