JP2004352687A

JP2004352687A - Composition containing amide compound for promoting accumulation and/or suppressing decrease in collagen

Info

Publication number: JP2004352687A
Application number: JP2003154445A
Authority: JP
Inventors: Junya Takahashi; 淳也高橋; Seishi Azuma; 清史東
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2004-12-16

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a composition, etc., for promoting the accumulation and/or suppressing the decrease in collagen to meet the keen desire for the development or production of a medicine effective for improving a disease accompanying the decrease in collagen in the tissue or improving the state of the tissue. <P>SOLUTION: The composition for promoting the accumulation and/or suppressing the decrease in collagen contains an amide compound expressed by formula (I) (X is a halogen atom). <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミド化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体の中で最も大量に存在するタンパク質であるコラーゲン、特にその中で存在量の最も多いＩ型コラーゲンの主たる役割は、線維性成分としての力学的支持性である。各種臓器の構成細胞の１つである線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン等の線維状タンパク質やヒアルロン酸等のグリコサミノグルカン等を産生し、これら細胞外マトリックスが３次元的な構造を形成することにより、組織が保持、維持されている。そのため、コラーゲンの質的量的な変化は力学的支持体としてのコラーゲン線維の機能的変化をもたらし、例えば、Ｉ型コラーゲンが有機成分の中心を占める骨基質ではコラーゲン量の減少に伴い、その脆弱化が起こると考えられている。また、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわ等の組織容態や、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患においては、コラーゲン合成の低下とコラーゲン分解の促進とがそれら疾患又は組織容態の遷延に影響している（例えば、非特許文献１乃至５参照）。
実際、レチノイン酸、ビタミンＣ類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、安息香酸化合物等の公知のコラーゲン合成促進剤を外用剤として用いることにより、しわ等の組織容態が改善されることがすでに報告されている（例えば、非特許文献６及び非特許文献７、並びに特許文献１参照）。また、骨粗しょう症等の疾患を改善させるエストロゲンは、骨芽細胞のコラーゲン合成を促進し、しかもマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１（以下、ＭＭＰ−１と記載することもある。）の産生を抑制することがすでに報告されている（例えば、非特許文献８及び非特許文献９参照）。
【０００３】
組織中のコラーゲン量は、合成と分解とのバランスにより既定されるが、それらは種々の細胞増殖因子、サイトカイン、低分子化合物等によって調節されている。例えば、サイトカインの１種であるＴＧＦ−βはよく知られたコラーゲン等の細胞外マトッリクスの発現促進因子であるが、一方では、コラーゲンの分解を触媒する各種マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の発現抑制因子でもある。具体的には、例えば、ＴＧＦ−βはヒト肺線維芽細胞のＩ、ＩＩＩ、Ｖ型コラーゲンの産生や、ヒト胎児線維芽細胞のフィブロネクチンの産生を高める一方、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の産生を抑制する（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照）。
また動物個体レベルにおける研究において、ＴＧＦ−βトランスジェニックマウスでは創傷治癒の促進が起こり、さらに、ＴＧＦ−β遺伝子をリウマチモデル動物に導入したところ、当該疾患が改善したことが報告されている（例えば、非特許文献１２参照）。
以上のことから、コラーゲン合成の促進とコラーゲン分解の抑制により、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を有する低分子化合物は、しわ、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させ、その結果、当該化合物を有効成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の開発につながる。
【非特許文献１】
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，９９，（１９９９）
【非特許文献２】
ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３，６３９，（１９７５）
【非特許文献３】
Ｊ．ＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＲｅｓ．，３７，１，（２００２）
【非特許文献４】
Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７８，１９１，（１９９９）
【非特許文献５】
ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．，４４，２５０３，（２００１）
【非特許文献６】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９６，９７５，（１９９１）
【非特許文献７】
Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，８，１８，（１９８４）
【非特許文献８】
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，２５１，（２００２）
【非特許文献９】
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５，２９１，（２００１）
【非特許文献１０】
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０）
【非特許文献１１】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）
【非特許文献１２】
ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，４，５５３，（１９９７）
【特許文献１】
公開特許公報、特開平８−２０８４６３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下において、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させるような薬剤の開発・提供が切望されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、下記の式（Ｉ）で示される尿素化合物が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．式（Ｉ）

（式中、Ｘはハロゲン原子を示す。）
で示されるアミド化合物（以下、本化合物と記すこともある。）を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物（以下、本発明組成物と記すこともある）；
２．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）遺伝子の転写を抑制するための、式（Ｉ）

（式中、Ｘはハロゲン原子を示す。）
で示されるアミド化合物の使用；
組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態と診断されうる哺乳動物に対して、有効量の式（Ｉ）

（式中、Ｘはハロゲン原子を示す。）
で示されるアミド化合物を投与する工程を有することを特徴とする組織中のコラーゲン量の蓄積促進及び／又は減少抑制方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明組成物に含有される本化合物において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
本化合物のうち、Ｘが塩素原子である化合物は、ＡｓｉｎＥｘ社（モスクワ（ロシア））カタログ等に記載されており、公知である。しかしながら、当該文献には組織内におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写促進、ＭＭＰ−１遺伝子の転写抑制、ひいてはコラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制の効果に係る記載は何ら存在していない。
【０００７】
本化合物は、下記の式（ＩＩ）（式中、Ｘはハロゲン原子を示す。）で示されるカルボン酸化合物と、式（ＩＩＩ）で示されるテトラヒドロベンゾチオフェン化合物とを縮合することにより製造することができる。

上記の縮合方法としては、例えば、、薬学雑誌（１９８９），１０９，４６４等に記載された方法をあげることができる。テトラヒドロベンゾチオフェン化合物（ＩＩＩ）は、例えば、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，（１９９６），９９，９４等に記載された方法により製造することができる
表１に、化合物番号（１）〜（４）で表される本化合物を例示する。
【０００８】
本化合物

【０００９】
【表１】

【００１０】
本発明組成物は、例えば、本化合物を１種又は２種以上と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等とが混合されてなる組成物等である。本化合物自体又は本発明組成物は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有する。当該能力は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、ＭＭＰ−１遺伝子の発現量を減少させて、組織中のコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を導くことにより、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善するために重要であり、当該目的のための医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等としての利用が考えられる。
本発明組成物又は本化合物の適用可能な疾患又は組織容態としては、種々の原因により組織中のコラーゲン量が減少し、その結果、臓器・組織の機能低下をもたらす疾患又は組織容態を改善するために用いることができる。例えば、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわや、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患をあげることができる。
用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等は、前記組成物の具体的用途に応じて適宜選択することができる。また、当該組成物の形態も、具体的用途に応じて、例えば、種々の固体、液体等の形態とすることができる。
例えば、本発明組成物又は本化合物を医薬品として用いる場合には、具体的な形態として、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、カプセル剤、懸濁化剤、エマルジョン剤、エキス剤及び丸剤等の経口剤、注射剤、外用液剤、軟膏剤等の経皮吸収剤（皮膚外用剤）、坐剤及び局所等の非経口剤等をあげることができる。
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸等の担体や賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合にはヒト成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
非経口剤のうち、注射剤は、生理食塩水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、植物油、脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。外用液剤、ゲル状軟膏等の経皮吸収剤、直腸内投与のための坐剤等も通常の方法に従って製造することができる。このような非経口剤を投与するには、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与すればよい。局所剤は、例えば、本化合物をエチレンビニル酢酸ポリマー等の徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて製造することができる。このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植すればよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常は注射の場合にはヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明組成物又は本化合物を化粧品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、クリーム、ローション剤等をあげることができる。ローション剤は、例えば、懸濁剤、乳化剤、保存剤等の化粧品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明組成物又は本化合物を食品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、粉末、錠剤、飲料、摂取可能なゲル若しくはシロップとの混合液状物、例えば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、漬物、ビン缶詰、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品等の一般的な飲食物や嗜好物等をあげることができる。また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚等の飼育動物のための飼料や餌料への食品添加物等もあげられる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する。
【００１２】
実施例１（Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量を指標とした、被験化合物が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）を１２ウエルプレートに１ウエルあたり５ｘ１０^４個播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬、カタログ番号０５９１９）培地で洗浄した後、非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社、カタログ番号１５−０１０−０５００Ｖ）を０．１（ｖ／ｖ）％含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）と記す。）０．５ｍｌ添加した。その後、化合物番号（４）で示される本化合物を０．５ｍＭとなるようジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）にそれぞれ溶解させてなる溶液を添加（最終濃度１μＭ）した。また、対照としてＤＭＳＯを１μｌ、陽性対照として２．５μｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを１μｌ添加（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）した。３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で３日間培養した後、培養上清と細胞とを分離した。
分離された細胞からＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１０６）を用い、全ＲＮＡ（約３０μｌ）を抽出した。抽出された全ＲＮＡ５μｌ（５０ｎｇ）に、２０μＭオリゴｄＴ１μｌ及びＲＮａｓｅフリー蒸留水４μｌを加えて６５℃、５分間インキュベートした直後に氷冷した。当該溶液１０μｌに、５ｘバッファー４μｌ、ＭｇＣｌ_２２．４μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、ＲＮａｓｉｎ１μｌ、ＩｍｐｒｏｍＩＩ１μｌ、ＲＮａｓｅフリー蒸留水０．６μｌ（以上全てＰｒｏｍｅｇａ社）を加えて２５℃で５分間、４２℃で１時間、７０℃で１５分間の条件で逆転写反応した。
逆転写反応溶液５μｌに、配列番号１、２で示される各１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー２μｌ、配列番号３で示されるＩ型コラーゲン検出用プローブ（ＦＡＭ−ｃｔａｃｔｇｇｃｇａａａｃｃｔｇｔａｔｃｃｇｇｇｃ−ＴＡＭＲＡ）（アプライドバイオシステム社）１．２５μｌ、ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（アプライドバイオシステム社）１２．５μｌ、滅菌水２．２５μｌをＯｐｔｉｃａｌ９６−ＷｅｌｌＲｅａｃｔｉｏｎＰｌａｔｅ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）のウエル中で混合した。同様に、配列番号４、５で示されるプライマー及び配列番号６で示されるＭＭＰ−１検出用プローブ（ＦＡＭ−ｃｔａｃｔｇｇｃｇａａａｃｃｔｇｔａｔｃｃｇｇｇｃ−ＴＡＭＲＡ）（アプライドバイオシステム社）又はＧＡＰＤＨ検出用プローブ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号４３１０８８４Ｅ）を各々別々のウエル中で混合した。スタンダードとしては逆転写反応溶液５μｌの代わりに、予め調製した正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞ｃＤＮＡ５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５ｎｇ／μｌ各５μｌを用いた。その後、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオシステム社）を用いて５０℃で５分間の１サイクル、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの条件でＰＣＲ反応した。定量はスタンダード直線を作成した後、各サンプルのＩ型コラーゲン量、ＭＭＰ−１量及びＧＡＰＤＨ量を算出し、次式に従ってＩ型コラーゲン遺伝子の発現量（即ち、転写量）及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量（即ち、転写量）を算出した。
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＩ型コラーゲン遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
ＭＭＰ−１遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＭＭＰ−１遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
被験化合物が化合物番号（４）で示される本化合物である場合における、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量は表２のとおりであり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力が確認された。
【００１３】
【表２】

＊コントロールでの値を１００とした場合の相対値で示す。
【００１４】
実施例２（非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量を指標とした、被験化合物が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
実施例１記載の培養上清５０μｌに、２５ｍＭ酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２６２９）１μｌを添加し、３７℃、１時間インキュベートした。得られた反応液１０μｌを１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写（２５０ｍＡ、９０分間）した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で振とうさせながら３０分間インキュベートした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔと記す。）で洗浄し、１０００倍希釈したウサギ抗Ｉ型コラーゲン抗体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号２３７０６）を加えて室温、１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回、各１０分間振とうさせながら洗浄した後に、１０００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、カタログ番号ｓｃ−２００４）を加えて室温、１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を加え、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて約２００ｋＤａ及び１５０ｋＤａ部分の発光を検出し、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量した。得られた値を非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量とした。
化合物番号（４）で示される本化合物の非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量は、表３のとおりであり、コラーゲンの蓄積能力が確認された。
【００１５】
【表３】

＊コントロールでの値を１００とした場合の相対値で示す。
【００１６】
【発明の効果】
本発明により、式（Ｉ）で示されるアミド化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等が提供可能となる。
【００１７】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号５
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号６
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
【００１８】
【配列表】

[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for promoting and / or suppressing the accumulation of collagen and the like, which contains an amide compound.
[0002]
[Prior art]
A major role of collagen, the most abundant protein in the body, and particularly type I collagen, the most abundant of it, is its mechanical support as a fibrous component. Fibroblasts, one of the constituent cells of various organs, produce fibrous proteins such as collagen, elastin and fibronectin, and glycosaminoglucans such as hyaluronic acid, and these extracellular matrices have a three-dimensional structure. The formation holds and maintains the tissue. Therefore, qualitative and quantitative changes in collagen result in functional changes in collagen fibers as a mechanical support.For example, in a bone matrix in which type I collagen is the center of the organic component, as the amount of collagen decreases, its fragility increases. Is thought to occur. In addition, in tissue conditions such as wrinkles that occur in the skin due to aging and ultraviolet rays, and in diseases such as abnormal wound healing, periodontal disease, osteoporosis, and rheumatoid arthritis, a decrease in collagen synthesis and promotion of collagen degradation may occur. It affects the prolongation of those diseases or tissue conditions (for example, see Non-Patent Documents 1 to 5).
In fact, it has already been reported that the use of known collagen synthesis promoters such as retinoic acid, vitamin Cs, 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ , and benzoic acid compounds as external preparations improves tissue conditions such as wrinkles. (See, for example, Non-Patent Documents 6 and 7, and Patent Document 1). Estrogen that improves diseases such as osteoporosis promotes collagen synthesis of osteoblasts and also produces matrix metalloprotease (MMP) -1 (hereinafter sometimes referred to as MMP-1). Suppression has already been reported (for example, see Non-Patent Documents 8 and 9).
[0003]
The amount of collagen in tissues is determined by the balance between synthesis and degradation, which are regulated by various cell growth factors, cytokines, low molecular weight compounds, and the like. For example, TGF-β, one of cytokines, is a well-known factor for promoting the expression of extracellular matrix such as collagen, while, on the other hand, a factor for suppressing the expression of various matrix metalloproteases (MMPs) that catalyzes the degradation of collagen. But also. Specifically, for example, TGF-β enhances the production of type I, III, and V collagen in human lung fibroblasts and the production of fibronectin in human fetal fibroblasts, while MMP-1, MMP-2 and MMP -9 production is suppressed (for example, see Non-Patent Documents 10 and 11).
In studies at the animal individual level, it has been reported that wound healing was promoted in TGF-β transgenic mice, and that the disease was improved when the TGF-β gene was introduced into a rheumatoid model animal (for example, , Non-Patent Document 12).
Based on the above, low-molecular compounds having the effect of promoting collagen synthesis and suppressing collagen degradation to promote and / or reduce collagen accumulation can be used for wrinkles, abnormal wound healing, periodontal disease, osteoporosis, and rheumatoid arthritis. And the like, which leads to the development of drugs, quasi-drugs, cosmetics, foods and the like containing the compound as an active ingredient.
[Non-patent document 1]
Mol. Cell. Biochem. , 194, 99, (1999)
[Non-patent document 2]
British J. Dermatol. , 93, 639, (1975)
[Non-Patent Document 3]
J. Periodontal Res. , 37, 1, (2002)
[Non-patent document 4]
Ann. NY Acad. Sci. , 878, 191, (1999)
[Non-Patent Document 5]
Arthritis Rheum. , 44, 2503, (2001)
[Non-Patent Document 6]
J. Invest. Dermatol. , 96, 975, (1991).
[Non-Patent Document 7]
J. Dermatol. Sci. , 8, 18, (1984)
[Non-Patent Document 8]
J. Cell. Biochem. , 86, 251, (2002)
[Non-Patent Document 9]
Endocrine, 15, 291, (2001)
[Non-Patent Document 10]
Lab. Invest. , 63, 171, (1990).
[Non-Patent Document 11]
J. Invest. Dermatol. , 94, 365 (1990).
[Non-Patent Document 12]
Gene Ther. , 4,553, (1997)
[Patent Document 1]
Published Patent Publication, JP-A-8-208463
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Under such circumstances, development and provision of a drug capable of improving a disease or tissue condition accompanied by a decrease in the amount of collagen in a tissue has been desired.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies under such circumstances, and as a result, have found that the ability of a urea compound represented by the following formula (I) to promote the transcription of type I collagen gene and suppress the transcription of MMP-1 gene. Have been found, and the present invention has been accomplished.
That is, the present invention
1. Formula (I)

(In the formula, X represents a halogen atom.)
A composition for promoting collagen accumulation and / or inhibiting its reduction (hereinafter, also referred to as the composition of the present invention), which comprises an amide compound represented by (hereinafter, also referred to as the present compound);
2. Formula (I) for promoting the transcription of a type I collagen gene and suppressing the transcription of a matrix metalloprotease-1 (MMP-1) gene.

(In the formula, X represents a halogen atom.)
Use of an amide compound represented by the formula:
An effective amount of the formula (I) for a mammal that can be diagnosed as a disease or tissue condition accompanied by a decrease in the amount of collagen in a tissue.

(In the formula, X represents a halogen atom.)
A method of accelerating and / or suppressing the accumulation of collagen in a tissue, which comprises the step of administering an amide compound represented by the formula (hereinafter, also referred to as the method of the present invention);
And so on.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present compound contained in the composition of the present invention, examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
Among the present compounds, the compounds in which X is a chlorine atom are described in catalogs of AsinEx (Moscow (Russia)) or the like and are known. However, there is no description in the literature relating to the effect of promoting transcription of the type I collagen gene in tissues, suppressing transcription of the MMP-1 gene, and further promoting and / or suppressing the accumulation of collagen.
[0007]
This compound is produced by condensing a carboxylic acid compound represented by the following formula (II) (wherein X represents a halogen atom) with a tetrahydrobenzothiophene compound represented by the formula (III). Can be.

As the above condensation method, for example, a method described in Pharmaceutical Magazine (1989), 109, 464 and the like can be mentioned. The tetrahydrobenzothiophene compound (III) is described, for example, in Chem. Ber. , (1996), 99, 94 and the like, Table 1 shows examples of the present compounds represented by compound numbers (1) to (4).
[0008]
The compound

[0009]
[Table 1]

[0010]
In the composition of the present invention, for example, one or more of the present compounds are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, and / or pharmaceutical additive, food additive, cosmetic additive, or the like. And the like. The present compound itself or the composition of the present invention has the ability to promote transcription of the type I collagen gene and suppress transcription of the MMP-1 gene. The ability increases the expression level of the type I collagen gene, decreases the expression level of the MMP-1 gene, and induces the effect of promoting the accumulation of collagen in the tissue and / or suppressing the decrease in the level of collagen in the tissue. It is important for improving a disease or tissue condition accompanied by a decrease in the amount, and may be used as a drug, a quasi-drug, cosmetics, food, or the like for the purpose.
As the disease or tissue condition to which the composition of the present invention or the present compound can be applied, the amount of collagen in the tissue is reduced due to various causes, and as a result, a disease or tissue condition that causes a decrease in the function of an organ or tissue is improved. Can be used. Examples include wrinkles that occur on the skin due to aging or ultraviolet rays, abnormal wound healing, periodontal disease, osteoporosis, and diseases such as rheumatoid arthritis.
The pharmaceutically acceptable carrier, excipient, and / or pharmaceutical additive, food additive or cosmetic additive to be used can be appropriately selected depending on the specific use of the composition. In addition, the form of the composition may be, for example, various solids, liquids, and the like, depending on the specific application.
For example, when the composition of the present invention or the present compound is used as a pharmaceutical, specific forms include, for example, powders, fine granules, granules, tablets, syrups, capsules, suspending agents, emulsions, Examples include oral preparations such as extracts and pills, transdermal absorption preparations (external preparations for skin) such as injections, external preparations and ointments, and parenteral preparations such as suppositories and topical preparations.
Oral preparations include, for example, gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose, soy lecithin, sucrose, fatty acid esters, talc, magnesium stearate, Carriers and excipients such as polyethylene glycol, magnesium silicate, and silicic anhydride, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, fluidity promoters, diluents, preservatives, coloring agents, flavors, and stabilization It can be manufactured according to a usual method using pharmaceutical additives such as an agent, a humectant, a preservative, and an antioxidant.
The dosage varies depending on the age, sex, body weight, degree of disease, the type of the composition or the compound of the present invention, the dosage form, etc. of the mammal to be administered. The amount of the active ingredient may be about 1 mg to about 2 g, preferably about 5 mg to about 1 g. In addition, the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
Among parenteral preparations, injections include water-soluble solvents such as physiological saline and sterilized water Ringer's solution, non-water-soluble solvents such as vegetable oils and fatty acid esters, isotonic agents such as glucose and sodium chloride, solubilizing agents, and stabilizing agents. It can be produced according to a usual method using pharmaceutical additives such as a preservative, a preservative, a suspending agent, and an emulsifier. Liquid preparations for external use, transdermal absorbents such as gel ointments, suppositories for rectal administration, and the like can also be produced according to ordinary methods. In order to administer such a parenteral preparation, injection (subcutaneous, intravenous, etc.), transdermal administration, or rectal administration may be used. A topical agent can be produced, for example, by incorporating the present compound into pellets of a sustained-release polymer such as ethylene vinyl acetate polymer. The pellet may be surgically implanted into the tissue to be treated.
The dosage varies depending on the age, sex, body weight, degree of disease, the type of the composition or the compound of the present invention, the dosage form, etc. of the mammal to be administered. A dose of about 0.1 mg to about 500 mg may be administered. In addition, the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
When the composition of the present invention or the present compound is used as cosmetics, specific forms include, for example, creams and lotions. Lotions can be manufactured according to ordinary methods using, for example, cosmetic additives such as suspending agents, emulsifiers, and preservatives.
The dose varies depending on the age of the mammal to be administered, sex, body weight, degree of disease, the type of the composition or the compound of the present invention, the dosage form, etc., and is usually about 0.01 mg as an active ingredient in a human adult.約 50 mg may be administered. In addition, the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
When the composition of the present invention or the present compound is used as a food, specific forms include, for example, powders, tablets, beverages, mixed liquids with ingestible gels or syrups, for example, seasonings, Japanese confectionery, Western confectionery , Frozen desserts, beverages, spreads, pastes, pickles, canned bottles, processed meat, processed fish and fishery products, processed milk and eggs, processed vegetables, processed fruits, processed cereals, etc. Things can be given. In addition, food additives for feed and feed for breeding animals such as livestock, poultry, bees, silkworms, fish and the like can be mentioned.
The dosage varies depending on the age of the mammal to be administered, sex, body weight, degree of disease, the type of the composition or the compound of the present invention, the dosage form, etc., and is usually about 0.1 mg as an active ingredient in a human adult.約 500 mg may be administered. In addition, the above-mentioned daily dose can be administered once or in several divided doses.
[0011]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0012]
Example 1 (Measurement of the effect of promoting and / or suppressing the accumulation of collagen of a test compound using the expression level of type I collagen gene and the expression level of MMP-1 gene as indices)
Normal human fetal skin fibroblasts (Clontech, catalog number CC-2509) were seeded at 5 × 10 ⁴ cells per well in a 12-well plate and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO ₂ atmosphere. The cultured cells were washed with Dulbecco's-MEM (Nissui Pharmaceutical, Catalog No. 05919) medium, and then inactivated with fetal bovine serum (hereinafter, referred to as FBS; ThermoTrace, Catalog No. 15-010-0500V) at 0. 0.5 ml of Dulbecco's-MEM medium containing 0.1% (v / v)% (hereinafter referred to as D-MEM (0.1%)) was added. Thereafter, a solution obtained by dissolving the present compound represented by the compound number (4) in dimethyl sulfoxide (hereinafter, referred to as DMSO) to a concentration of 0.5 mM was added (final concentration: 1 μM). In addition, 1 μl of DMSO was added as a control, and 1 μl of 2.5 μg / ml TGF-β was added as a positive control (final concentration: 5 ng / ml). After culturing at 37 ° C. in a 5% CO ₂ atmosphere for 3 days, the culture supernatant was separated from the cells.
Total RNA (about 30 μl) was extracted from the separated cells using the RNeasy Mini kit (QIAGEN, catalog number 74106). To 5 μl (50 ng) of the extracted total RNA, 1 μl of 20 μM oligo dT and 4 μl of RNase-free distilled water were added, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 5 minutes and immediately cooled with ice. To 10 μl of the solution, 4 μl of 5 × buffer, 2.4 μl of MgCl ₂ , 1 μl of 10 mM dNTP, 1 μl of RNasin, 1 μl of ImpromII, 0.6 μl of RNase-free distilled water (all of them are Promega) were added at 25 ° C. for 5 minutes at 42 ° C. for 5 minutes. The reverse transcription reaction was performed for 1 hour at 70 ° C. for 15 minutes.
In 5 μl of the reverse transcription reaction solution, 2 μl of each 10 pmol / μl primer represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 and a probe for detecting type I collagen represented by SEQ ID NO: 3 (FAM-ctactggcga aacctgtatc cggggc-TAMRA) (Applied Biosystems) 1 .25 μl, 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), and 2.25 μl of sterile water were mixed in a well of Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems, Catalog No. N801-0560). Similarly, the primers represented by SEQ ID NOs: 4 and 5 and the probe for detecting MMP-1 represented by SEQ ID NO: 6 (FAM-ctactggcga acctgtatc cgggg-TAMRA) (Applied Biosystems) or a probe for detecting GAPDH (Applied Biosystems) , Cat. No. 4310884E) were each mixed in a separate well. As a standard, 5 μl of each prepared normal human fetal skin fibroblast cDNA 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ng / μl was used instead of 5 μl of the reverse transcription reaction solution. Thereafter, PCR was performed using Gene Amp 5700 (Applied Biosystems) under the conditions of one cycle of 50 ° C for 5 minutes, 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute. For quantification, after preparing a standard line, the amount of type I collagen, the amount of MMP-1 and the amount of GAPDH of each sample were calculated, and the expression amount of type I collagen gene (that is, the transcription amount) and the amount of MMP-1 gene The expression level (ie, transcription level) was calculated.
Expression amount of type I collagen gene (correction value) = measured expression amount of type I collagen gene / GAPDH amount Expression amount of MMP-1 gene (correction value) = measured expression amount of MMP-1 gene / GAPDH amount When the test compound is the present compound represented by the compound number (4), the expression level of the type I collagen gene and the expression level of the MMP-1 gene are as shown in Table 2, and promote the transcription of the type I collagen gene. , The ability to suppress the transcription of the MMP-1 gene was confirmed.
[0013]
[Table 2]

* Shown as a relative value when the control value is 100.
[0014]
Example 2 (measurement of the effect of promoting and / or suppressing the accumulation of collagen contained in a test compound using the amount of non-degraded type I collagen as an index)
To 50 µl of the culture supernatant described in Example 1, 1 µl of 25 mM p-aminophenylmercuric acetate (Amersham Pharmacia, catalog number RPN2629) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. After 10 μl of the obtained reaction solution was subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis, it was transferred to a PVDF membrane (250 mA, 90 minutes). After incubating the protein-transferred PVDF membrane in a 5% skim milk solution for 30 minutes while shaking, it is washed with a PBS solution containing 0.1% Tween 20 (hereinafter referred to as PBS-T) and diluted 1000-fold. Rabbit anti-type I collagen antibody (Polyscience, Cat. No. 23706) was added and incubated at room temperature for 1 hour. Next, after washing with shaking 3 times with PBS-T for 10 minutes each, a 1000-fold diluted goat anti-rabbit IgG antibody-HRP (Santa Cruz, catalog number sc-2004) was added, and the mixture was added at room temperature for 1 hour. Incubated. After washing three times with PBS-T, ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham Pharmacia, catalog number RPN2106) was added, and about 200 kDa and 150 kDa portions were detected using a lumino image analyzer LAS-1000plus (FUJIFILM). And quantified using Image Gauge (FUJIFILM). The obtained value was defined as the amount of non-degraded type I collagen protein.
The protein amount of the non-degraded type I collagen of the present compound represented by the compound number (4) is as shown in Table 3, and the ability to accumulate collagen was confirmed.
[0015]
[Table 3]

* Shown as a relative value when the control value is 100.
[0016]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the composition etc. for promoting collagen accumulation and / or suppressing reduction containing the amide compound shown by Formula (I) can be provided.
[0017]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 1
Oligonucleotide primer designed to detect type I collagen gene SEQ ID NO: 2
Oligonucleotide primer designed to detect type I collagen gene SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide probe designed to detect type I collagen gene SEQ ID NO: 4
Oligonucleotide primer designed to detect MMP-1 gene SEQ ID NO: 5
Oligonucleotide primer designed to detect MMP-1 gene SEQ ID NO: 6
Oligonucleotide probe designed to detect MMP-1 gene
[Sequence list]

Claims

Formula (I)

(In the formula, X represents a halogen atom.)
A composition for promoting collagen accumulation and / or suppressing reduction, comprising an amide compound represented by the formula:

Formula (I) for promoting the transcription of a type I collagen gene and suppressing the transcription of a matrix metalloprotease-1 (MMP-1) gene.

(In the formula, X represents a halogen atom.)
Use of an amide compound represented by

An effective amount of the formula (I) for a mammal that can be diagnosed as a disease or tissue condition accompanied by a decrease in the amount of collagen in a tissue.

(In the formula, X represents a halogen atom.)
A method for promoting accumulation and / or suppressing decrease in the amount of collagen in tissues, which comprises the step of administering an amide compound represented by the formula: