【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシ胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ；ＥＳ）細胞、及びそのＥＳ細胞を用いるウシの作出方法（すなわち、製造方法）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マウスにおいては、ＥＳ細胞を用いた相同遺伝子組み換えは、外来遺伝子を動物本体に導入するのに最も適した手法であり、特定遺伝子機能を欠損させたノックアウトマウスは、発生生物学、臓器再生医学、又は免疫学等の研究に欠くことのできないモデル動物となっている。しかしながら、大動物では、そのような幹細胞を樹立し、その細胞を用いて相同遺伝子組み換えに成功した例は未だ少ないのが実情である。
【０００３】
例えば、特開平８−１１６９６６号公報（特許文献１）には、ウシＥＳ細胞及びその作成方法が開示されており、特開２００２−１７６９７３号公報（特許文献２）には、哺乳動物（ウシ、ウマ、及びラット）のＥＳ細胞、並びに前記ＥＳ細胞の樹立方法及び継代培養方法が開示されている。前記特許文献２に記載のＥＳ細胞については、体外培養系で多分化能力が証明されている（非特許文献１）。
また、ウシでＥＳ様細胞を樹立し、その細胞にβ−ガラクトシダーゼ−ネオマイシン遺伝子をマイクロインジェクション法で導入し、遺伝子導入キメラウシを生産した報告もある（非特許文献２）。
【０００４】
前記非特許文献２では、ＥＳ細胞としての細胞生物学的特徴は何ら示されておらず、キメラ胚作成時の写真も添付されていないため、不明な点が多い。
また、前記特許文献１に記載のウシＥＳ細胞は、未分化の状態で継代可能であることが示されているが、多分化能力を有するか否かについては、全く示されていない。しかも、特許文献１には、せいぜい、９代継代が可能であることの記載しかない。
更に、前記特許文献２に記載のウシＥＳ細胞は、未分化の状態で継代可能であり、しかも、多分化能力を示すことが示されているが、１１代〜１２代継代が可能であることの記載しかない。
実用的な観点から、ＥＳ細胞として必要な可能継代数は、通常、１５回以上であることが要求されており、従って、特許文献１又は特許文献２に記載の各ＥＳ細胞よりも、更に継代数の多いウシＥＳ細胞が求められていた。
【０００５】
【特許文献１】
特開平８−１１６９６６号公報
【特許文献２】
特開２００２−１７６９７３号公報
【非特許文献１】
齋藤（Ｓａｉｔｏ）ら，「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ）」，（英国），２００２年，第５３１巻，ｐ．３８９−３９６
【非特許文献２】
シベリ（Ｃｉｂｅｌｌｉ）ら，「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９９８年，第１６巻，ｐ．６４２−６４６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、実用的なＥＳ細胞として充分な回数の継代が可能なウシＥＳ細胞を提供し、更に、前記ウシＥＳ細胞を用いるウシ（ウシ胚、ウシ胎児、及びウシ個体を含む）の作出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、未分化状態及び多分化能力を維持しながら、１８回以上の継代が可能であることを特徴とする、ウシ胚性幹細胞により解決することができる。
本発明のウシＥＳ細胞の好ましい態様によれば、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１９２８８であるウシＥＳ細胞、あるいは、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１９２８９であるウシＥＳ細胞である。
【０００８】
また、本発明は、前記ウシ胚性幹細胞に、外来遺伝子を導入することにより得ることのできる、形質転換体に関する。
また、本発明は、前記ウシ胚性幹細胞又は前記形質転換体に由来する、分化細胞、分化組織、又は臓器に関する。
また、本発明は、前記ウシ胚性幹細胞又は前記形質転換体に由来する、ウシ胚、ウシ胎児、又はウシ個体に関する。
更に、本発明は、前記ウシ胚性幹細胞を用いることを特徴とする、ウシ胚、ウシ胎児、又はウシ個体の作出方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のウシＥＳ細胞は、未分化状態及び多分化能力を維持しながら、１８回以上の継代が可能である。
本発明のウシＥＳ細胞が未分化状態を維持しているか否かは、例えば、哺乳動物（例えば、マウス又はウシ）で確立されている公知の各種未分化マーカー（例えば、特開２００２−１７６９７３号公報参照）により、確認することができる。前記未分化マーカーとしては、例えば、糖鎖ＳＳＥＡ−１（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−１）抗原が発現すること、アルカリホスファターゼ活性が陽性であること、あるいは、転写因子Ｏｃｔ３／４が発現すること等を挙げることができる。これらの未分化マーカーは、例えば、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の方法により確認することができる。
【００１０】
本発明のウシＥＳ細胞が多分化能力を保持しているか否かは、例えば、哺乳動物（例えば、マウス又はウシ）で確立されている公知の各種確認方法（例えば、特開２００２−１７６９７３号公報参照）により、確認することができる。多分化能の確認方法としては、例えば、培養系で神経細胞に分化させ、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）又はネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）抗体マーカーで染色してその多分化能を確認する方法、あるいは、除核した体外培養由来の未受精卵にＥＳ細胞を核移植し、更に体外培養することにより胚盤胞に発達させ、これを受胚雌の子宮に移植することにより妊娠させることで確認する方法などを挙げることができる。これらの確認方法は、例えば、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の手順により実施することができる。
【００１１】
本発明のウシＥＳ細胞は、未分化状態及び多分化能力を維持しながら、１８回以上（好ましくは２０回以上、より好ましくは３０回以上、更に好ましくは４０回以上、特に好ましくは５０回以上）の継代が可能である。
なお、本明細書において「継代」とは、コンフルエントな状態に達した細胞培養容器中の細胞の一部（例えば、１／５〜１／１０）を、実質的に同一の、別の細胞培養容器に移し、再度、コンフルエントな状態まで細胞増殖させることを意味し、この一連の操作を継代数として１回と規定する。なお、通常の１回の継代で、各細胞は、約５回の細胞分裂を行うことができる。
【００１２】
本発明のウシＥＳ細胞は、例えば、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の樹立方法により取得することができる。但し、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の樹立方法では、継代数が１１〜１２代のウシＥＳ細胞は比較的容易に取得することができるが、継代数が１８以上のウシＥＳ細胞の取得確率は、極端に低下する。従って、本発明のウシＥＳ細胞を樹立する方法として、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の樹立方法を概ねそのまま適用することができるが、特開２００２−１７６９７３号公報の記載よりも、そのスクリーニング数を増やすことが重要である。
【００１３】
具体的には、ウシ胚盤胞期胚の内細胞塊から得られた細胞を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する［好ましくは、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び白血病阻害因子（ＬＩＦ）を更に含有する］ＭＥＭαを培地とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞のフィーダー上で培養し、コロニーを形成させ、このコロニーを、例えば、未分化状態での増殖能、糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原の発現性、アルカリフォスファターゼ活性の有無、Ｏｃｔ３／４の発現性、及び／又は多分化能の有無などを指標にスクリーニングすることにより、ウシＥＳ細胞を樹立し、更に、この中から、１８回以上の継代が可能な細胞をスクリーニングすることにより、本発明のウシＥＳ細胞を取得することができる。
【００１４】
前記樹立方法では、マイトマイシン処理又はγ放射線照射により細胞分裂を停止させたマウスＳＴＯフィーダー細胞（通常のＥＳ細胞樹立方法において使用）の代わりに、臍帯内皮細胞をフィーダーに用いる。培養培地には、ＦＣＳを含有させ、ＬＩＦを更に含有させることが好ましい。また、ＥＧＦは、ＥＳ細胞コロニーの形成に必須ではないが、ＥＳ細胞を株化するのに顕著な効果があり、細胞の増殖因子として培養培地に添加することが重要である。臍帯細胞をフィーダーとして用い、培養培地にＥＧＦを添加することは、ＥＳ細胞の増殖に対し相乗的に働き、細胞株の樹立を可能にする。
これらの各成分の培地中への添加量は、例えば、ＦＣＳは５〜１０％、ＬＩＦは１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦは１０〜５０ｎｇ／ｍＬとすることが好ましい。培養は５％ＣＯ２条件下で３９℃前後の温度で行うことができる。
【００１５】
本発明のウシＥＳ細胞としては、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１９２８８であるウシＥＳ細胞ＳＣＴ−１、あるいは、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１９２８９であるウシＥＳ細胞ＳＣＴ−２が好ましい。前記ウシＥＳ細胞ＳＣＴ−１及びＥＳ細胞ＳＣＴ−２は、２００３年（平成１５年）４月３日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国内寄託されたものであり、その受託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８８及びＦＥＲＭ Ｐ−１９２８９である。
【００１６】
本発明には、本発明のウシＥＳ細胞に、任意の所望の外来遺伝子を導入することにより得ることができる形質転換体（すなわち、遺伝子導入ＥＳ細胞）が含まれる。本発明の形質転換体は、本発明のウシＥＳ細胞に、任意の所望の外来遺伝子を導入することにより得られた形質転換体に限定されるものではなく、それ以外の手段で得られた形質転換体であっても、任意の所望の外来遺伝子を導入することにより得ることができる形質転換体と実質的に同一である限り、本発明の範囲に含まれる。
本発明のウシＥＳ細胞への外来遺伝子の導入方法としては、公知の遺伝子導入法、例えば、市販の遺伝子導入試薬［例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎ（キアゲン）又はＦｕＧＥＮＥ（ロシュ）］を用いる方法を挙げることができる。
【００１７】
また、本発明には、本発明のウシＥＳ細胞又は形質転換体に由来する、分化細胞、分化組織、又は臓器が含まれる。前記組織又は臓器としては、例えば、神経、筋肉（例えば、骨格筋又は心筋等）、肝臓、皮膚、血球、又は血管等を挙げることができ、本発明の分化細胞、分化組織、又は臓器は、本発明のウシＥＳ細胞又は形質転換体を用いること以外は、その目的に応じて、公知の分化方法を適宜選択することにより、得ることができる。
【００１８】
更に、本発明には、本発明のウシＥＳ細胞又は形質転換体に由来する、ウシ胚、ウシ胎児、又はウシ個体（クローンウシ又はトランスジェニッククローンウシを含む）が含まれる。本明細書において「胚」とは、受精卵が分裂を開始してから出産を経て成体に至るまでの発生過程において、受精卵が分裂を開始してから子宮に着床するまでの状態を意味する。また、「胎児」とは、前記発生過程において、子宮に着床してから出産されるものでの状態を意味する。更に、「個体」とは、前記発生過程における出産以降の状態（成体の状態を含む）を意味する。
【００１９】
本発明のウシ胚、ウシ胎児、又はウシ個体は、本発明による、ウシ胚、ウシ胎児、又はウシ個体の作出方法（以下、単に、本発明の作出方法と称することがある）により得ることができる。本発明の作出方法は、ウシＥＳ細胞として、本発明のウシＥＳ細胞を用いること以外は、公知のウシ個体作出方法と同様の手順で実施することができる。前記ウシ個体の作出方法としては、例えば、ウシＥＳ細胞（遺伝子導入ウシＥＳ細胞の場合を含む）をドナー核とする核移植法、あるいは、ウシＥＳ細胞（遺伝子導入ウシＥＳ細胞の場合を含む）と受精胚とでキメラ胚を作成する方法などを挙げることができる。遺伝子導入する前のウシＥＳ細胞を用いることにより、クローンウシを作出することができ、遺伝子導入ウシＥＳ細胞を用いることにより、トランスジェニッククローンウシを作出することができる。
【００２０】
ウシＥＳ細胞（遺伝子導入ウシＥＳ細胞の場合を含む）をドナー核とする核移植法を利用する本発明の作出方法では、例えば、未受精卵子から各染色質を除去した後、その囲卵腔にウシＥＳ細胞１個を挿入し、電気パルスによりＥＳ細胞と除核卵子とを融合した後、適当な培地にて培養することにより胚盤胞まで発達させ、その胚盤胞を受胎ウシ子宮に移植することにより、ウシ個体を得ることができる。
【００２１】
ウシＥＳ細胞（遺伝子導入ウシＥＳ細胞の場合を含む）と受精胚とでキメラ胚を作成する方法を利用する本発明の作出方法では、例えば、ウシＥＳ細胞複数個（例えば、１０〜１５個）を、８〜１６細胞期の体外受精胚中の割球と囲卵腔との空隙に注入してキメラ胚を作成した後、適当な培地にて胚盤胞まで発達させ、その胚盤胞を受胎ウシ子宮に移植することにより、ウシ個体を得ることができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ウシＥＳ細胞の取得》
本実施例では、本発明のウシＥＳ細胞として、ウシＥＳ細胞ＳＣＴ−１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８８）及びウシＥＳ細胞ＳＣＴ−２（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９２８９）を樹立した。
具体的には、受精後７日目の胚盤胞期胚から、顕微手術により内細胞塊（ＩＣＭ）部分を切り出し、フィーダー細胞上で培養を行った。なお、前記フィーダー細胞としては、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の方法により調製したウシ臍帯内皮細胞を使用した。また、培養は、２０ｎｇ／ｍＬ−ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）及び２０ｎｇ／ｍＬ−ＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ）を加えたＭＥＭα（ペニシリン及びストレプトマイシン、並びに１０％ＦＣＳ含有）中で、３８．６℃及び５％ＣＯ２条件下で実施した。培地は２日に１度交換した。フィーダー上のＩＣＭは１〜２日でフィーダーに接着し、増殖を続けた。培養４〜５日後には周囲に細胞コロニーが発達してきた。更に培養を続け、コロニーの直径が３０００〜４０００μｍになった時点でピペットを用いてフィーダーより剥がし、トリプシン液でおよそ６〜７分間処理した後、ガラスピペットを用いて細胞を解離した。解離後、ＰＢＳ（−）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ；Ｃａ及びＭｇ不含）で希釈し、遠心分離を２回行って洗浄した後、得られた沈殿を上記と同じ培養条件でフィーダー細胞上に１／３濃度で蒔いた（初代培養）。
【００２３】
フィーダー細胞上でコロニーを形成する細胞について、ＥＳ細胞としての各種マーカーによるスクリーニング及び継代を、特開２００２−１７６９７３号公報に記載の手順に従って実施することにより、ウシＥＳ細胞ＳＣＴ−１及びウシＥＳ細胞ＳＣＴ−２を樹立した。
未分化マーカーとしては、（１）糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が発現していること、（２）アルカリホスファターゼ活性が陽性であること、そして、（３）転写因子Ｏｃｔ３／４が発現していることを確認した。
多分化能については、神経細胞に分化させ、星状膠細胞の細胞マーカー抗体であるＧＦＡＰ抗体と、神経幹細胞の細胞マーカー抗体であるＮｅｓｔｉｎ抗体とを用いて細胞免疫化学的に陽性であることを確認した。なお、多分化能については、更に、後述の実施例２において、ウシ個体を出産させることによる確認を実施した。
可能継代数については、少なくとも５０代までは継代可能であることを確認した。なお、それ以上の継代は実施しておらず、その上限については確認していない。
【００２４】
【実施例２】
《クローンウシの作出》
本実施例では、本発明のウシＥＳ細胞をドナー核とする核移植法により、クローンウシの作出を行った。
すなわち、実施例１で樹立したウシＥＳ細胞ＳＣＴ−１を用いて、その継代数１４、１５、及び１８の各ウシＥＳ細胞を、４ウェル皿中で３９℃にて３〜４日間培養した。コンフルエントに達した細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で３９℃にて１０分間処理した。得られた分離細胞を、核染色質を除去した未受精卵子の囲卵腔に挿入した後、微小電極を用いて、２回の電気パルス［２０Ｖ／１５０μｍ，５０μｓｅｃ；細胞融合装置ＬＦ１０１（ベックス）］により、ＥＳ細胞と除核卵子とを融合した。その後、再構築卵子を１０μｇ／ｍＬシクロヘキシミド液中で５時間培養し、更に、３％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加改変ＴＡＬＰ培地で７〜８日間培養した。供試クローン胚２２２個の内、７個が胚盤胞に発達し、それらを７頭の受胎ウシ子宮に移植したところ、５頭が妊娠し（超音波妊娠診断による）、３頭のクローン子ウシが誕生した。結果を表１に示す。
マイクロサテライトによる親子鑑別を実施した結果、３頭全てが同一ＥＳ細胞株由来のクローンであることが明らかとなった。
【００２５】
《表１》
（＊）：９０日までに流産
【００２６】
【実施例３】
《ウシＥＳ細胞への遺伝子導入》
本実施例では、本発明のウシＥＳ細胞への遺伝子導入を実施した。
遺伝子導入に使用したＤＮＡ断片は、以下の手順で調製した。すなわち、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビン配列、ネオマイシン耐性遺伝子、及び強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡを含む遺伝子ベクターを、常法によりサブクローン化した後、Ｐｖｕ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動によりベクターから分離し、精製した。精製遺伝子断片は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ液中に、１μｇ／μＬの濃度になるように溶解し、遺伝子導入に使用するまで凍結保存した。
【００２７】
実施例１で樹立したウシＥＳ細胞ＳＣＴ−１を用いて、その継代数１２のウシＥＳ細胞を凍結融解した後、４ウェル皿（Ｎｕｎｃ）３枚に播種し、脂質をベースとする市販の遺伝子導入試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎ；キアゲン）と、前記遺伝子断片との共培養により、ＥＳ細胞への遺伝子導入を実施した。すなわち、前記Ｅｆｆｅｃｔｅｎ試薬８００μＬ（バッファー、エンハンサー、及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅを含む）、先に調製した遺伝子断片５μＬ、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００μｇを、ＭＥＭα培地（Ｇｉｂｃｏ）４０００μＬとよく混和した後、各ウェルに４００μＬずつ注ぎ、３９℃にて１又は２日間共培養した。続いて、ネオマイシン系抗生物質Ｇ４１８を４００μｇ／ｍＬ濃度で含むＦＣＳ含有ＭＥＭα培地で７〜１０日間培養することにより、遺伝子導入ＥＳ細胞だけを選択した。更に、通常培地に切り替えて継代を重ねた後（継代数＝１１〜５０）、遺伝子導入ＥＳ細胞を凍結保存した。
【００２８】
【実施例４】
《遺伝子導入ＥＳ細胞の多能化能力の確認》
本実施例では、実施例３で得られたＥＧＦＰ遺伝子導入ＥＳ細胞と、動物胚とでキメラ胚を作成し、培養系で多能化能力を試験した。比較のために、予めＥＧＦＰ遺伝子が導入されたウシ子宮内膜由来の初代繊維芽細胞を、キメラ胚作成のドナー細胞として使用した。
凍結融解した継代数１４のＥＧＦＰ遺伝子導入ＥＳ細胞及び初代繊維芽細胞を１日培養した後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で５分間処理することにより、培養皿より剥離させた。蛍光顕微鏡下で、発光ＥＳ細胞又は発光繊維芽細胞を１０〜１５個ずつマイクロピペットに吸引し、８〜１６細胞期の体外受精胚中の割球と囲卵腔との空隙に注入することにより、キメラ胚を作成した。
【００２９】
ＥＳ細胞を注入した４１個のキメラ胚の内、胚盤胞まで発達したのは２７個（６６％）であり［退化胚数＝１４個（３４％）］、その胚盤胞における栄養膜と内細胞塊の両方でＥＧＦＰ遺伝子が発現するものは、１７個（４２％）認められた。一方、繊維芽細胞を注入した１２個のキメラ胚の内、胚盤胞まで発達したのは６個（５０％）であり［退化胚数＝６個（５０％）］、その胚盤胞における栄養膜と内細胞塊の両方でＥＧＦＰ遺伝子が発現するものは、１個も検出されなかった。なお、キメラ胚盤胞におけるＥＧＦＰ発現は、体外受精後７日目に観察した。
また、実施例１で樹立したウシＥＳ細胞ＳＣＴ−２についても、同様の操作を実施することにより、同様の結果を得ることができた。
この結果から、本発明のウシＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉に分化する能力を有することが明らかになった。また、本発明のウシＥＳ細胞は、効率よく遺伝子導入を行うことができ、それらの遺伝子導入細胞と初期胚とでキメラ胚を作成し、体外培養系で栄養膜及び内細胞塊細胞の両部位で遺伝子が発現することにより確認される多能性を有し、更にキメラ胚の体内移植によるキメラ動物作出が可能であることが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のウシＥＳ細胞によれば、公知のウシＥＳ細胞よりも遙かに可能な継代数が多いので、ＥＳ細胞としてより有用である。本発明のウシＥＳ細胞は、例えば、ＥＳ細胞の生体内又は生体外における分化転換制御機構解明の研究材料として、あるいは、異種間移植用臓器作成のための医療材料として用いることが可能である。また、ＥＳ細胞への遺伝子導入により、より詳細には、遺伝子導入ＥＳ細胞と受精胚とでキメラ胚を作成し、仮親に移植することで、有用医薬品のバイオリアクターとなる遺伝子組み換え動物を生産するためのドナー細胞としても有用である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a bovine embryonic stem (ES) cell and a method for producing (ie, producing) a cow using the ES cell.
[0002]
[Prior art]
In mice, homologous gene recombination using ES cells is the most suitable method for introducing a foreign gene into an animal body, and knockout mice with a specific gene function deficiency are used in developmental biology, organ regeneration medicine, Or, it is a model animal indispensable for research such as immunology. However, in the case of large animals, there are still few cases in which such stem cells have been established and homologous gene recombination has been successfully performed using the cells.
[0003]
For example, JP-A-8-116966 (Patent Document 1) discloses a bovine ES cell and a method for producing the same, and JP-A-2002-179693 (Patent Document 2) discloses a mammal (bovine, bovine, Horse and rat) ES cells and methods for establishing and subculturing the ES cells. The pluripotency of the ES cells described in Patent Document 2 has been proven in an in vitro culture system (Non-patent Document 1).
There is also a report that ES-like cells were established in cattle, and the β-galactosidase-neomycin gene was introduced into the cells by a microinjection method to produce a transgenic chimeric cow (Non-Patent Document 2).
[0004]
Non-Patent Document 2 does not disclose any cell biological characteristics as ES cells, nor does it include any photographs at the time of producing chimeric embryos, and thus has many unclear points.
Further, it is shown that the bovine ES cells described in Patent Document 1 can be passaged in an undifferentiated state, but there is no indication as to whether or not they have pluripotency. Moreover, Patent Document 1 only discloses that 9 passages are possible at most.
Furthermore, it has been shown that the bovine ES cells described in Patent Document 2 can be passaged in an undifferentiated state and exhibit pluripotency, but can be passaged for 11 to 12 passages. There is only mention that there is.
From a practical point of view, the number of possible passages required as ES cells is usually required to be 15 or more, and therefore, the number of passages is higher than that of each ES cell described in Patent Document 1 or Patent Document 2. Bovine ES cells with many algebras have been demanded.
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-8-116966 [Patent Document 2]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-176973 [Non-Patent Document 1]
Saito et al., "FEBS Letters", (UK), 2002, Vol. 531, p. 389-396
[Non-patent document 2]
Siberi et al., "Nature Biotechnology", (USA), 1998, Vol. 16, p. 642-646
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a bovine ES cell that can be passaged a sufficient number of times as a practical ES cell, and further provide a bovine (bovine embryo, bovine fetus, and bovine individual) using the bovine ES cell. The present invention is to provide a method for producing the same.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The object can be solved by a bovine embryonic stem cell according to the present invention, which is characterized in that it can be passaged 18 times or more while maintaining an undifferentiated state and a pluripotency.
According to a preferred embodiment of the bovine ES cell of the present invention, it is a bovine ES cell whose accession number is FERM P-19288, or a bovine ES cell whose accession number is FERM P-19289.
[0008]
The present invention also relates to a transformant which can be obtained by introducing a foreign gene into the bovine embryonic stem cell.
The present invention also relates to a differentiated cell, a differentiated tissue, or an organ derived from the bovine embryonic stem cell or the transformant.
The present invention also relates to a bovine embryo, a bovine fetus, or a bovine individual derived from the bovine embryonic stem cell or the transformant.
Furthermore, the present invention relates to a method for producing a bovine embryo, a bovine fetus, or a bovine individual, comprising using the bovine embryonic stem cell.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The bovine ES cells of the present invention can be passaged 18 times or more while maintaining an undifferentiated state and pluripotency.
Whether or not the bovine ES cells of the present invention maintain an undifferentiated state is determined, for example, by various known undifferentiated markers established in mammals (for example, mouse or bovine) (for example, JP-A-2002-179693). (See the publication). Examples of the undifferentiated marker include, for example, expression of a sugar chain SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1) antigen, positive alkaline phosphatase activity, or expression of a transcription factor Oct3 / 4. Can be mentioned. These undifferentiated markers can be confirmed, for example, by the method described in JP-A-2002-179693.
[0010]
Whether or not the bovine ES cell of the present invention retains the pluripotency can be determined, for example, by various known confirmation methods established in mammals (for example, mouse or bovine) (for example, JP-A-2002-179693) Reference) can be confirmed. As a method for confirming the pluripotency, for example, a method of differentiating into neural cells in a culture system and staining the same with a GFAP (grill fibrillarly acidic protein) or nestin (Nestin) antibody marker to confirm the pluripotency, or removing Nuclear transfer of ES cells to unfertilized eggs derived from nucleated in vitro culture, development into blastocysts by further in vitro culture, and confirmation by pregnancy by transplantation into the uterus of a female recipient Can be mentioned. These confirmation methods can be performed, for example, according to the procedure described in JP-A-2002-179693.
[0011]
The bovine ES cell of the present invention can maintain the undifferentiated state and the pluripotency while maintaining the undifferentiated state 18 times or more (preferably 20 times or more, more preferably 30 times or more, further preferably 40 times or more, particularly preferably 50 times or more. ) Is possible.
As used herein, the term “passage” refers to a part (for example, 1/5 to 1/10) of a cell in a cell culture vessel that has reached a confluent state, It means that the cells are transferred to a culture vessel and the cells are again grown to a confluent state. This series of operations is defined as one passage. It should be noted that each cell can undergo about 5 cell divisions in one normal passage.
[0012]
The bovine ES cells of the present invention can be obtained, for example, by the establishment method described in JP-A-2002-176973. However, in the establishment method described in JP-A-2002-176973, bovine ES cells having a passage number of 11 to 12 can be obtained relatively easily, but obtaining bovine ES cells having a passage number of 18 or more can be obtained. The probability drops extremely. Therefore, as a method for establishing the bovine ES cells of the present invention, the establishment method described in JP-A-2002-176973 can be generally applied as it is, but the screening method is more effective than the method described in JP-A-2002-176973. It is important to increase the number.
[0013]
Specifically, cells obtained from the inner cell mass of bovine blastocyst stage embryos are transformed with fetal calf serum (FCS) [preferably epidermal growth factor (EGF) and leukemia inhibitory factor (LIF). MEMα is used as a medium, and cultured on a feeder of umbilical cord endothelial cells separated from the umbilical cord to form a colony. The colony is grown, for example, in the undifferentiated state, and the sugar chain SSEA-1 antigen is expressed. Bovine ES cells were established by screening using the indicators of the sex, the presence or absence of alkaline phosphatase activity, the expression of Oct3 / 4, and / or the presence or absence of pluripotency, and the bovine ES cells were further established. The bovine ES cells of the present invention can be obtained by screening cells capable of progeny.
[0014]
In the establishment method, umbilical cord endothelial cells are used as feeders instead of mouse STO feeder cells whose cell division has been stopped by mitomycin treatment or γ-irradiation (used in a normal ES cell establishment method). It is preferable that the culture medium contains FCS and further contains LIF. In addition, EGF is not essential for the formation of ES cell colonies, but has a remarkable effect for establishing ES cells, and it is important to add EGF to the culture medium as a growth factor for cells. Using umbilical cord cells as a feeder and adding EGF to the culture medium acts synergistically on the growth of ES cells, allowing the establishment of cell lines.
The amount of each of these components added to the medium is preferably, for example, 5 to 10% for FCS, 10 to 50 ng / mL for LIF, and 10 to 50 ng / mL for EGF. The cultivation can be performed at a temperature of about 39 ° C. under 5% CO 2 conditions.
[0015]
As the bovine ES cell of the present invention, a bovine ES cell SCT-1 having a deposit number of FERM P-19288, or a bovine ES cell SCT-2 having a deposit number of FERM P-19289 is preferable. The bovine ES cell SCT-1 and the ES cell SCT-2 were obtained on April 3, 2003 (April 2003) by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary (address: 305-8566, Ibaraki, Japan) It has been deposited in Japan at 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Central No. 6), and its deposit numbers are FERM P-19288 and FERM P-19289, respectively.
[0016]
The present invention includes a transformant (ie, a transgenic ES cell) that can be obtained by introducing any desired foreign gene into the bovine ES cell of the present invention. The transformant of the present invention is not limited to a transformant obtained by introducing any desired foreign gene into the bovine ES cell of the present invention, but may be a transformant obtained by other means. Even a transformant is included in the scope of the present invention as long as it is substantially the same as a transformant that can be obtained by introducing any desired foreign gene.
Examples of the method for introducing a foreign gene into bovine ES cells of the present invention include known gene introduction methods, for example, a method using a commercially available gene introduction reagent [for example, Effecten (Qiagen) or FuGENE (Roche)]. .
[0017]
The present invention also includes a differentiated cell, a differentiated tissue, or an organ derived from the bovine ES cell or the transformant of the present invention. Examples of the tissue or organ include nerves, muscles (eg, skeletal muscle or cardiac muscle), liver, skin, blood cells, blood vessels, and the like. The differentiated cells, differentiated tissues, or organs of the present invention include: Except for using the bovine ES cell or the transformant of the present invention, it can be obtained by appropriately selecting a known differentiation method according to the purpose.
[0018]
Furthermore, the present invention includes a bovine embryo, a fetal bovine, or a bovine individual (including a cloned bovine or a transgenic cloned bovine) derived from the bovine ES cell or the transformant of the present invention. As used herein, the term “embryo” refers to a state from the start of division of a fertilized egg to its implantation into the uterus in the developmental process from the start of division of the fertilized egg to the passage of birth to an adult. I do. The term "fetus" refers to a state in which the baby is delivered after implantation in the uterus during the development process. Further, the term "individual" means a state (including an adult state) after childbirth in the developmental process.
[0019]
The bovine embryo, bovine fetus, or bovine individual of the present invention can be obtained by the method for producing a bovine embryo, bovine fetus, or bovine individual according to the present invention (hereinafter, may be simply referred to as the producing method of the present invention). it can. The production method of the present invention can be carried out in the same procedure as a known method for producing a bovine individual, except that the bovine ES cells of the present invention are used as bovine ES cells. As a method for producing the bovine individual, for example, a nuclear transfer method using bovine ES cells (including transgenic bovine ES cells) as a donor nucleus, or bovine ES cells (including transgenic bovine ES cells) And a method of preparing a chimeric embryo with the fertilized embryo. A cloned cow can be produced by using bovine ES cells before gene transfer, and a transgenic cloned bovine can be produced by using gene-transduced bovine ES cells.
[0020]
In the production method of the present invention using a nuclear transfer method using bovine ES cells (including transgenic bovine ES cells) as a donor nucleus, for example, after removing each chromatin from an unfertilized egg, the perivitelline space Into the blastocyst by fusing the ES cell and the enucleated ovum by electric pulse, and culturing in an appropriate medium, and then developing the blastocyst into the conceived bovine uterus. By transplanting, a bovine individual can be obtained.
[0021]
In the production method of the present invention using a method of producing a chimeric embryo from bovine ES cells (including transgenic bovine ES cells) and a fertilized embryo, for example, a plurality of bovine ES cells (for example, 10 to 15) Was injected into the space between the blastomere and the perivitelline space in the in vitro fertilized embryo at the 8-16 cell stage to produce a chimeric embryo, which was then developed into a blastocyst in an appropriate medium, and the blastocyst was cultured. A bovine individual can be obtained by transplantation into a conceptus bovine uterus.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
Embodiment 1
<< Acquisition of bovine ES cells >>
In this example, bovine ES cells SCT-1 (accession number: FERM P-19288) and bovine ES cells SCT-2 (accession number: FERM P-19289) were established as the bovine ES cells of the present invention.
Specifically, an inner cell mass (ICM) portion was cut out from the blastocyst stage embryo seven days after fertilization by microsurgery, and cultured on feeder cells. As the feeder cells, bovine umbilical cord endothelial cells prepared by the method described in JP-A-2002-176973 were used. The culture was performed in MEMα (containing penicillin and streptomycin and 10% FCS) supplemented with 20 ng / mL-EGF (Sigma) and 20 ng / mL-LIF (Sigma) at 38.6 ° C. and 5% CO 2. Performed below. The medium was changed once every two days. The ICM on the feeder adhered to the feeder in 1-2 days and continued to grow. After 4 to 5 days of culture, surrounding cell colonies have developed. The culture was further continued, and when the diameter of the colony reached 3000 to 4000 µm, the colony was peeled off from the feeder using a pipette, treated with a trypsin solution for about 6 to 7 minutes, and then the cells were dissociated using a glass pipette. After dissociation, the mixture was diluted with PBS (-) (Dulbecco; Ca and Mg not included), washed twice by centrifugation, and the obtained precipitate was concentrated on feeder cells under the same culture conditions as described above. (Primary culture).
[0023]
By screening and subculturing cells forming colonies on feeder cells using various markers as ES cells in accordance with the procedure described in JP-A-2002-179693, bovine ES cells SCT-1 and bovine ES cells are obtained. Cells SCT-2 were established.
As undifferentiated markers, (1) sugar chain SSEA-1 antigen is expressed, (2) alkaline phosphatase activity is positive, and (3) transcription factor Oct3 / 4 is expressed. It was confirmed.
Regarding pluripotency, the cells are differentiated into neurons, and are confirmed to be immunochemically positive using the GFAP antibody, a cell marker antibody for astrocytes, and the Nestin antibody, a cell marker antibody for neural stem cells. confirmed. The pluripotency was confirmed by giving birth to a bovine individual in Example 2 described below.
Regarding the number of possible passages, it was confirmed that passage was possible at least up to 50 generations. No further passage was performed, and the upper limit was not confirmed.
[0024]
Embodiment 2
《Creating a cloned cow》
In this example, cloned cattle were produced by a nuclear transfer method using the bovine ES cells of the present invention as donor nuclei.
That is, using the bovine ES cells SCT-1 established in Example 1, the bovine ES cells at passages 15, 15, and 18 were cultured in a 4-well dish at 39 ° C for 3 to 4 days. Cells that reached confluency were treated with 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) for 10 minutes at 39 ° C. After inserting the obtained separated cells into the perivitelline space of an unfertilized ovum from which nuclear chromatin has been removed, two electric pulses [20 V / 150 μm, 50 μsec; using a microelectrode; cell fusion device LF101 (Vex) ], The ES cell and the enucleated egg were fused. Thereafter, the reconstructed ova were cultured in a 10 μg / mL cycloheximide solution for 5 hours, and further cultured in a modified TALP medium supplemented with 3% fetal calf serum (FCS) for 7 to 8 days. Of the 222 cloned embryos tested, 7 developed into blastocysts and were transplanted into 7 gestational bovine uteri. 5 were pregnant (by ultrasound pregnancy diagnosis) and 3 cloned offspring. Cows were born. Table 1 shows the results.
As a result of parent-child discrimination using microsatellite, it was revealed that all three clones were derived from the same ES cell line.
[0025]
<< Table 1 >>
(*): Miscarriage by the 90th
Embodiment 3
<< Gene transfer into bovine ES cells >>
In this example, gene transfer into bovine ES cells of the present invention was performed.
The DNA fragment used for gene transfer was prepared by the following procedure. That is, a gene vector containing a cytomegalovirus enhancer, a chicken β-actin promoter, a rabbit β-globin sequence, a neomycin resistance gene, and an enhanced green fluorescent protein (EGFP) cDNA was subcloned by a conventional method, and then PvuI / The Hind III DNA fragment was separated from the vector by 1% agarose gel electrophoresis and purified. The purified gene fragment was dissolved in a 10 mmol / L Tris-HCl / 10 mmol / L EDTA solution to a concentration of 1 μg / μL and stored frozen until used for gene transfer.
[0027]
Bovine ES cells at passage 12 were frozen and thawed using the bovine ES cells SCT-1 established in Example 1, and then seeded on three 4-well dishes (Nunc) to obtain a commercially available lipid-based gene. Gene transfer into ES cells was carried out by co-culture of an introduction reagent (Effecten; Qiagen) and the gene fragment. That is, 800 μL of the Effecten reagent (including buffer, enhancer, and Effectene), 5 μL of the gene fragment prepared above, and 100 μg of bovine serum albumin (BSA) were thoroughly mixed with 4000 μL of MEMα medium (Gibco), and then added to each well. Each 400 μL was poured and co-cultured at 39 ° C. for 1 or 2 days. Subsequently, by culturing for 7 to 10 days in a MEMα medium containing FCS containing the neomycin antibiotic G418 at a concentration of 400 μg / mL, only the transfected ES cells were selected. Furthermore, after switching to a normal medium and repeating the passage (passage number: 11 to 50), the transfected ES cells were cryopreserved.
[0028]
Embodiment 4
《Confirmation of pluripotency of transfected ES cells》
In this example, a chimeric embryo was prepared from the EGFP gene-introduced ES cells obtained in Example 3 and an animal embryo, and the pluripotency was tested in a culture system. For comparison, primary fibroblasts derived from bovine endometrium into which the EGFP gene had been introduced in advance were used as donor cells for producing chimeric embryos.
After freeze-thawed the EGFP gene-introduced ES cells at passage number 14 and primary fibroblasts were cultured for one day, the cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) for 5 minutes to be detached from the culture dish. Under a fluorescence microscope, 10 to 15 luminescent ES cells or luminescent fibroblasts are aspirated into a micropipette at a time and injected into the space between the blastomere and the perivitelline space in the in vitro fertilized embryo at the 8-16 cell stage. A chimeric embryo was created.
[0029]
Of the 41 chimeric embryos injected with ES cells, 27 (66%) developed to blastocysts [the number of degenerate embryos = 14 (34%)]. Seventeen (42%) EGFP genes were expressed in both inner cell masses. On the other hand, among the 12 chimeric embryos injected with fibroblasts, 6 (50%) developed to blastocysts [the number of degenerate embryos = 6 (50%)]. No expression of the EGFP gene in both the trophoblast and the inner cell mass was detected. EGFP expression in the chimeric blastocysts was observed on day 7 after in vitro fertilization.
In addition, the same operation was performed on the bovine ES cell SCT-2 established in Example 1 to obtain similar results.
The results revealed that the bovine ES cells of the present invention have the ability to differentiate into endoderm, mesoderm, and ectoderm. In addition, the bovine ES cells of the present invention can efficiently carry out gene transfer. Chimeric embryos are prepared from these gene-transferred cells and early embryos, and both sites of trophoblast and inner cell mass cells are cultured in an in vitro culture system. It was confirmed that the cells had pluripotency confirmed by the expression of the gene and that chimeric animals could be produced by in vivo transplantation of chimeric embryos.
[0030]
【The invention's effect】
According to the bovine ES cells of the present invention, the number of possible passages is far greater than that of known bovine ES cells, and thus they are more useful as ES cells. The bovine ES cells of the present invention can be used, for example, as research materials for elucidating the transdifferentiation control mechanism of ES cells in vivo or in vitro, or as medical materials for preparing organs for xenotransplantation. Further, by introducing a gene into an ES cell, more specifically, a chimeric embryo is prepared from the transfected ES cell and a fertilized embryo, and transplanted into a foster mother, thereby producing a genetically modified animal serving as a bioreactor for a useful drug. Is also useful as a donor cell.
